JP6293702B2 - 重鎖抗体を作製するマウス - Google Patents
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Description
本発明の分野は、重鎖抗体が作製される遺伝子改変された非ヒト動物、特に、免疫グロブリンγ(IgG)遺伝子のCH1ドメイン(またはCH1ドメインとヒンジ領域)をコードしている配列内にヌクレオチド配列の欠失を含むが、機能性CH1ドメインを欠いていないIgMを発現できる遺伝子改変された動物、特に、野生型IgM分子(すなわち、CH1ドメインを有する)の作製能を有するが、機能性CH1ドメイン(またはCH1ドメインとヒンジ領域)が欠如している重鎖IgG抗体が作製されるマウスである。
ほとんどの動物では、正常な免疫グロブリン重鎖は、その同系の(cognate)軽鎖とカップリングされている場合でのみ良好に発現される。ヒトでは、重鎖可変部、CH1、または重鎖可変部とCH1ドメインの配列を欠いている機能不全性の重鎖によって症状発現する重鎖病で孤立重鎖が見られる。軽鎖が欠如している重鎖は、特定の種の魚類およびラクダに見られる。かかる重鎖は、機能性CH1ドメインを欠いており、重鎖可変ドメインにおいて非ヒト特徴を有する。ラクダまたは特定の種の魚類に見られるVHHドメインを模倣するラクダ化遺伝子を発現するようにマウスを改変することにより(一部において、IgMおよびIgG CH1ドメインを除去し、重鎖可変領域をラクダおよび/または特定の種の魚類のものと類似するように適合させることにより)、ラクダ化抗体を作製する試みがなされている。しかしながら、ラクダ化抗体では、非ラクダ動物において免疫応答が誘導されることが予測される。
遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、非ヒト動物ならびにそれらを作製および使用するための方法および組成物を提供する。ここで、該動物は、免疫グロブリンG(IgG)において機能性CH1配列を欠くように遺伝子改変され、任意選択で、該改変IgGにおいて機能性IgGヒンジ領域を欠くように改変され、ここで、該細胞、胚および動物には機能性IgM CH1配列が含まれている。一部の態様では、該マウスは、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの1つ以上または全部の、1つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。一部の態様では、内因性マウスV、DおよびJ遺伝子セグメントの全部が、1つ以上のヒトV、1つ以上のヒトDおよび1つ以上のヒトJ遺伝子セグメントで置き換えられている。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
生殖系列遺伝子改変を含むマウスであって、該生殖系列遺伝子改変は、IgGのCH1をコードしているヌクレオチド配列の欠失を含み、該マウスは、
CH1ドメインを含むIgMを発現し、
CH1ドメインおよび軽鎖を欠いているIgG抗体を血清中で発現し、かつ
CH1ドメインをコードしている配列を含むIgG mRNAを発現できない、
マウス。
(項目2)
前記CH1をコードしている前記ヌクレオチド配列の前記欠失が、IgG1遺伝子内に存在している、項目1に記載のマウス。
(項目3)
機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座を含む、項目1に記載のマウス。
(項目4)
軽鎖を欠いている前記IgG抗体が、ヒト可変ドメインと、CH1ドメインを欠いているマウス定常ドメインとを含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目5)
軽鎖を欠いている前記IgG抗体が、マウス可変ドメインと、CH1ドメインを欠いているマウス定常ドメインとを含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目6)
IgG2a遺伝子の欠失を含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目7)
IgG2b遺伝子の欠失を含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目8)
IgG2a遺伝子の欠失およびIgG2b遺伝子の欠失を含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目9)
IgG2a遺伝子の欠失およびIgG2b遺伝子の欠失を含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目10)
1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目11)
前記1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントがヒトVH1ファミリー遺伝子セグメントである、項目10に記載の遺伝子改変マウス。
(項目12)
前記VH1ファミリー遺伝子セグメントが、ヒトVH遺伝子セグメント1−8、1−18、および1−69のFR1、FR2およびFR3遺伝子セグメントと少なくとも90%同一であるFR1、FR2およびFR3領域を含む、項目11に記載の遺伝子改変マウス。
(項目13)
さらに、ヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJ遺伝子セグメントを含む、項目11に記載の遺伝子改変マウス。
(項目14)
項目11に記載の遺伝子改変マウスであって、該マウスが、FR4をコードしている再構成免疫グロブリン遺伝子を含み、該FR4が、ヒトD1−7/J4、D3−16/J6、D4−4/J4、D6−6/J4、D6−6/J2、D6−7/J4、またはD6−19/J6によってコードされたFR4と少なくとも90%同一である、遺伝子改変マウス。
(項目15)
1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの1つ以上のラクダ化ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む、項目1に記載の遺伝子改変マウス。
(項目16)
マウスにおいて体細胞変異重鎖抗体を作製するための方法であって、該方法は、
a.マウスを抗原で免疫化する工程であって、ここで、該マウスは、再構成されていないヒトまたはマウス重鎖免疫グロブリンの可変領域遺伝子セグメントを含み、機能性IgG CH1ドメインをコードする少なくとも1つの対立遺伝子のヌクレオチド配列を欠いており、かつCH1ドメインを含むIgMを発現する、工程;
b.該マウスを、該抗原に対する免疫応答が起こるのに充分な条件下で維持する工程;および
c.該マウスから体細胞変異重鎖抗体を単離する工程であって、ここで、該体細胞変異重鎖抗体は、該ヒトまたはマウス重鎖免疫グロブリンの可変領域遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含み、かつ該抗原に特異的に結合する、工程
を含む、方法。
(項目17)
V、DおよびJ遺伝子セグメントの全部または実質的に全部の1つ以上のヒトV、ヒトDおよびヒトJ遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変マウスであって、該1つ以上のヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントは、内因性マウス遺伝子座でマウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座に作動可能に連結されており、該マウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座は、完全長IgM遺伝子、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびその組合せから選択されるIgG遺伝子内のCH1ドメインをコードしているヌクレオチド配列内に欠失を含むIgG遺伝子を含み、該マウスは、CH1領域を有するIgMを含むB細胞受容体を発現し、該IgMは、同系のλまたはκ軽鎖と会合している重鎖を含む、遺伝子改変マウス。
(項目18)
前記1つ以上のヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントが、VH1、VH3、VH4およびその組合せから選択される可変領域ファミリー由来のヒト遺伝子セグメントを含む、項目17に記載の遺伝子改変マウス。
(項目19)
前記1つ以上のヒト遺伝子セグメントが、1−2、1−8、1−18、1−46、1−69、3−21、3−72、4−59およびその組合せから選択される、項目18に記載の遺伝子改変マウス。
(項目20)
前記1つ以上のヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントが、D1−7、D3−16、D4−4、D6−6、D6−7、D6−19、J2、J3、J4およびその組合せを含む、項目18に記載の遺伝子改変マウス。
詳細説明
本発明は記載の特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は種々であり得る。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものでない。
CH1ドメインを欠いている抗体、例えば、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を欠いている抗体を作製する遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。該遺伝子改変された非ヒト動物は、機能性免疫グロブリン重鎖ドメイン(CH1ドメイン)、例えば、IgG1 CH1ドメインの欠如を含む遺伝子改変を含むものであり、一部の実施形態では、機能性CH1ドメインを欠いている該免疫グロブリン重鎖においてヒンジ領域の欠失を含むさらなる改変を含むものであり、該非ヒト動物は機能性IgMを発現する。他の改変としては、IgG1およびIgM以外のアイソタイプを非機能性にすること、例えば、IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgAおよびIgEに対して遺伝子における欠失、または遺伝子の欠失を行なうことが挙げられる。また、遺伝子改変された非ヒト胚、細胞、ならびに非ヒト動物、非ヒト胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供する。
ラクダ類、特定の魚類および病的状態における観察結果により、ある状況下では、同系の軽鎖の非存在下において、重鎖定常領域のCH1ドメインを欠いている抗体が発現され得ることが示されているが、抗体産生B細胞の正常な発生には、一般的にCH1ドメインの存在が必要とされる。IgMを含む重鎖アイソタイプにはすべてCH1ドメインが含まれている。サロゲート軽鎖および同系の軽鎖はともに、IgMの状況の重鎖のCH1ドメインを介して所与の重鎖と相互作用すると考えられる。重鎖抗体の発生が構造の完全性またはIgMアイソタイプ重鎖の機能性に依存する範囲では、IgMの構造の完全性または機能の破壊は望ましくないであろう。
対象免疫原で非ヒト動物を免疫化することによる抗体の作製に充分な多様性をもたらすために、B細胞発生中に提示されたときにIgMの状況で有効に選択に残り得る適当な数の再構成された重鎖可変領域が維持されていることが望ましい。したがって、免疫グロブリン重鎖に非機能性CH1ドメインまたは非機能性CH1ドメインと非機能性ヒンジ領域を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、両方のIgM対立遺伝子にCH1欠失を含むべきではない。
抗体はヒト治療薬として有用である。また、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を欠いている抗体もヒト治療薬として有用である。重鎖抗体は軽鎖を欠いているため小型になり、したがって、軽鎖を含む抗体よりも良好な組織浸透を示すが、従来の抗体と比較すると類似した、またはより有利な薬物動態プロフィールを有し、類似したエフェクター機能が保持されていることが予測される。また、重鎖抗体は小型になるため、所与の容量でより高い用量での投与が可能になる。よく使用される抗体投与方法は皮下注射であり、所与の投薬量の抗体に対する投与容量の低減により、患者に有益性がもたらされ、大容量の皮下注射による合併症および痛みが回避され得る。
本発明者らは、通常のヒトまたはマウス重鎖可変領域(hVRまたはmVR)が、機能性CH1ドメインを欠いているIgGの状況のインビトロ系において発現され得ることを確立した。本発明者らは、野生型マウスIgMを有するマウスの再構成されていないhVRミニ遺伝子座からhVRを発現させた。発現されたhVRはCH1ドメインを欠いているIgG2b上にクローニングされ(その結果、hVR−IgG2bΔCH1が発現される)、hVR−IgG2bΔCH1構築物で一過的にトランスフェクトしたCHO細胞によって分泌され、野生型IgMを有するマウスにおいて選択されたhVRは、機能性CH1ドメインを欠いているIgGにスイッチされると、すなわち、重鎖抗体として細胞によって発現され分泌され得ることが有効に確立された。
本発明の重鎖抗体のヒト化型を生成させるためには、該改変についてホモ接合性である動物を抗原で免疫化し、動物の特異的免疫応答が確立されたら、該免疫化動物の脾臓の細胞を適当な不死細胞(例えば、骨髄腫細胞)と融合させてハイブリドーマ細胞を得る。あるいはまた、該免疫化動物のB細胞から直接抗体を得てもよい。ハイブリドーマ細胞(または例えば、単離したB細胞)由来の上清みを、酵素免疫測定法(ELISA)によって抗体の存在についてスクリーニングし、抗原に特異的な抗体が所望の特徴に基づいて選択され得る。
1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.;Ausubelら
1995.Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons)。VH核酸配列が決定されたら、推定アミノ酸配列を得、他のヒトVH配列と比較し、類似した配列を有する一群の関連するVH配列を同定することができる。関連するVH配列は、当業者に利用可能な抗体データベース、例えば、The International ImMunoGeneTics Information System(登録商標)(IMGT(登録商標))を用いて得ることができる。この比較は、目によって、あるいはまた電子的にアラインメントプログラム(例えば、CLUSTAL)の使用によってのいずれかでなされる配列のアラインメントによって行なわれ得る。この比較において、相補性決定領域(CDR)とフレームワーク領域(FR)が特定される。CDRおよびFR残基は、標準的な配列規定(例えば、Kabatら 1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of
Health,Bethesda Md.;ChothiaおよびLesk,1987.J.Mol Biol.196:901−917)に従って決定される。当業者には、場合によっては免疫グロブリン重鎖のCDR領域およびFR領域の配列の番号付けおよび決定の方法に不一致が存在することがあり得ることは認識されよう。かかる場合では、構造による定義が好ましいが、配列定義法によって同定される残基を、重鎖配列の比較に基づいてどのフレームワーク残基を置き換えるかを決定するのに重要なFR残基とみなす。
重鎖抗体が発現される動物を作製するための遺伝子改変は、実例としての該マウスを使用することにより簡便に示される。本発明による遺伝子改変マウスはさまざまな様式で作製され得、その具体的な実施形態を以下に論考する。
実施例1:重鎖抗体のインビトロ発現
分子生物学的手法(例えば、Maniatisら 1982.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory参照)を用いてヒト可変領域とマウスIgG2b(mIgG2b)定常領域と融合させ、キメラ重鎖構築物を作製した。各構築物のヒト可変遺伝子セグメントは、両方のエキソン(すなわち、リーダー配列+成熟配列)、(内因性マウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座の3つのhVR遺伝子セグメントでの置き換えを含むナイーブRAGマウスから単離されたIgMのhVRから同定)、全hDH遺伝子セグメント、および全hJH遺伝子セグメントを含む完全長ヒト可変遺伝子セグメントとした。IgM抗体の軽鎖はマウス軽鎖とした。
A.マウスIgG1−CH1−ヒンジ標的化ベクター(図3)の調製
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(後述)のES細胞由来のC57BL/6対立遺伝子に対して、マウスIgG1定常ドメインのCH1とヒンジ領域の欠失を導入するための標的化構築物を構築した。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(後述)のES細胞由来の129/SvEvTac対立遺伝子に対してマウスIgG1定常ドメインのCH1の欠失を導入するための第2の標的化構築物を、この実施例のセクションAに記載のものと同様の様式で構築した。
A.IgG1−CH1−ヒンジ標的化ベクターでのマウスES細胞の標的化
マウスES細胞を、上記の標的化構築物(すなわち、IgG1遺伝子のCH1とヒンジ領域の欠失を導入する標的化構築物)で標的化した。ES細胞はVELOCIMMUNE(登録商標)マウス由来のものとした。このマウスは、129系統とC57BL/6系統の50/50混合型であり、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントの再構成されていないヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変を有する。C57BL/6との交配に使用した129系統は、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントのヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む系統である。
同様の様式で、マウスES細胞を、実施例2のセクションB(図2も参照のこと)に記載のCH1標的化構築物で標的化した。ES細胞はVELOCIMMUNE(登録商標)マウス(129/SvEvTac系統とC57BL/6系統の50/50混合型であり、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントの再構成されていないヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変を有するマウス)由来のものとした。C57BL/6との交配に使用した129/SvEvTac系統は、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントのヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む系統である。
A.IgG1−CH1−ヒンジ欠失を有するマウス
上記の標的とされるES細胞をドナーES細胞として使用し、8細胞期のマウス胚にVELOCIMOUSE(登録商標)での方法によって導入した(例えば、米国特許第7,294,754号およびPoueymirouら(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene−targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91−99参照)。標的とされるC57BL/6 IgG1対立遺伝子を有するVELOCIMICE(登録商標)(完全にドナーES細胞に由来するF0マウス)を、欠失しているヒンジおよびCH1領域の上流および下流に位置する配列の存在を検出する変形型の対立遺伝子アッセイ(Valenzuelaら,上掲)を用いて遺伝子型分類することにより確認した。
同様の様式で、IgG1 CH1領域の欠失を有する標的とされるES細胞をドナーES細胞として使用し、8細胞期のマウス胚にVELOCIMOUSE(登録商標)での方法によって導入した(例えば、米国特許第7,294,754号およびPoueymirouら(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene−targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25(1):91−99参照)。標的とされる129SvEv/Tac対立遺伝子を有するVELOCIMICE(登録商標)(完全にドナーES細胞に由来するF0マウス)を、欠失しているCH1領域の上流および下流に位置する配列の存在を検出する変形型の対立遺伝子アッセイ(Valenzuelaら,上掲)を用いて遺伝子型分類することにより確認した。
A.IgG1−ΔCH1−Δヒンジマウス
CH1とヒンジの欠失を含むと上記で確認されたマウス幼獣と野生型幼獣を交配し、交配マウス由来の血清をウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのIgGを、抗mIgG1抗体を用いて同定した。簡単には、マウス血清の10μLの1:100希釈物を還元性SDS−PAGEに使用し、ゲルをPVDF膜に移した。ブロットを0.05%Tween−20を含む5%脱脂乳含有Tris緩衝生理食塩水(TBST;Sigma)で一晩ブロックし、TBSTで4回洗浄し(1回あたり5分間の洗浄)、次いで、一次抗体(HRPにコンジュゲートさせたヤギ抗mIgG1,Southern Biotech)(1%脱脂乳含有TBST中で1:1,000に希釈)に室温で2時間曝露した。ブロットを6回洗浄した(1回あたり5分間の洗浄)。ブロットを5分間、SuperSignal(商標) West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)を用いて発色させ、次いでフィルムに1分間露光した。
同様の様式で、CH1欠失についてホモ接合性のマウス幼獣と野生型幼獣を交配した。交配マウス由来の血漿および血清(5匹のホモ接合型;2匹の野生型について)をウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのIgGを、抗mIgG1抗体を用いて同定した(上記のとおりに)。IgG1−ΔCH1欠失についてホモ接合性のマウス由来の血清および血漿のウエスタンブロットでは、混合物バンド:約45kD(CH1ドメインを欠いている一本鎖IgG1の予測サイズ)のバンド1つ、および約75kD(CH1ドメインを欠いている二量体IgGの予測サイズ)にバンド1つが示された(データ表示せず)。この結果は、一方または両方いずれかの重鎖の遺伝子座に由来するIgG1−ΔCH1重鎖が発現されるホモ接合性のVELOCIMICE(登録商標)と整合している。この結果により、機能性IgM遺伝子とCH1ドメインを欠いているIgG遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、該動物の免疫系の末梢リンパ球画分において重鎖抗体を発現できることが確立される。
CH1−ヒンジ欠失についてヘテロ接合性のVELOCIMICE(登録商標)同士を交配し、該欠失についてホモ接合性のマウスを得た。4匹のマウス幼獣が、IgG1 ΔCH1−Δヒンジについてホモ接合性であると確認された。これらの4匹のマウスと野生型マウスを交配し、交配マウス由来の血清を、ウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのIgGを、抗mIgG1抗体を用いて同定した(上記のとおりに)。図9は、この実験で使用したPVDF膜から発色させたフィルムを示す。血清を1:5および1:10に希釈し、10μLの各希釈物を各マウスに対して並列でゲルに負荷した。ゲル画像の上部において、レーンに各マウスならびにIgG1(1)およびIgG2a(2a)対照の表示をしている。
A.IgG1−CH1−ヒンジ欠失についてホモ接合性のマウス
IgG1 ΔCH1−Δヒンジについてホモ接合性のマウス改変を、V−D−J組換えおよび重鎖遺伝子の使用について、脾細胞から単離されたRNAを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって解析した。
同様の様式で、IgG1 ΔCH1改変についてホモ接合性のマウスを、V−D−J組換えおよびヒト重鎖遺伝子の使用について、脾細胞から単離されたRNAを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって解析した。
Claims (70)
- 生殖系列ゲノムを含むマウスであって、該生殖系列ゲノムは、
内因性重鎖の遺伝子座に内因性IgG1定常領域遺伝子の改変を含み、該改変によってIgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失および該IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失がもたらされ;
ここで、該内因性重鎖の遺伝子座は、機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子を含む、マウス。 - 機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座をさらに含む、請求項1に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座がκ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項2に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座がλ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項2に記載のマウス。
- 前記マウスが、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体をさらに含み、該CH1ドメインを欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体が、
(a)ヒト可変ドメインと、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているマウスIgG1定常領域とを;または
(b)マウス可変ドメインと、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているマウスIgG1定常領域とを、
含む、請求項1に記載のマウス。 - 前記マウスが、前記内因性重鎖の遺伝子座において、
(a)IgG2a定常領域遺伝子;
(b)IgG2b定常領域遺伝子;または
(c)IgG2a定常領域遺伝子およびIgG2b定常領域遺伝子
の欠失をさらに含む、請求項1に記載のマウス。 - 前記IgG1定常領域が前記CH1ドメインを完全に欠いていることを特徴とする、請求項1に記載のマウス。
- 前記内因性重鎖の遺伝子座において、1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの、1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置き換えをさらに含み、ここで該1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、組み換えられて、内因性マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された再構成されたヒト可変領域遺伝子を形成することができる、請求項1に記載のマウス。
- 前記1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントがヒトのVH1、VH3またはVH4ファミリーの遺伝子セグメントである、請求項8に記載のマウス。
- 前記ヒト重鎖可変遺伝子セグメントが、ヒトVH遺伝子セグメントVH1−2、VH1−8、VH1−18、VH1−46、VH1−69、VH3−21、VH3−72、およびVH4−59からなる群より選択される遺伝子セグメントである、請求項9に記載のマウス。
- 前記内因性マウスVH遺伝子セグメントのすべてが18、39または81個のヒト可変領域VH遺伝子セグメントによって置き換えられている、請求項9に記載のマウス。
- 前記ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、VH1−8、VH1−18およびVH1−69からなる群より選択される、請求項9に記載のマウス。
- 前記マウスがさらに、前記ヒト可変領域遺伝子由来のヒト可変ドメイン、および前記内因性IgG1定常領域遺伝子由来の定常領域を含むIgG抗体を含み、該内因性IgG1定常領域遺伝子がIgG1 CH2ドメイン、およびIgG1 CH3ドメインをコードしている、請求項8に記載のマウス。
- 前記マウスが、
(a)野生型IgG3タンパク質;
(b)野生型IgG2aタンパク質;および
(c)野生型lgG2bタンパク質
をさらに発現することを特徴とする、請求項1に記載のマウス。 - 前記マウスが、
(e)野生型IgMタンパク質;
(f)野生型IgDタンパク質;
(g)野生型IgAタンパク質;および
(h)野生型IgEタンパク質
を発現することをさらに特徴とする、請求項14に記載のマウス。 - 前記マウスが、129系統、C57BL/6系統、および混合型129×C57BL/6系統からなる群より選択される系統に由来する、請求項1に記載のマウス。
- 前記マウスが50%129および50%C57BL/6である、請求項16に記載のマウス。
- 前記内因性重鎖の遺伝子座において、1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの、1つ以上のラクダ化ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置き換えを含む、請求項1に記載のマウス。
- VH、DH、およびJH遺伝子セグメントの少なくとも1つまたは全部の、1つ以上のヒトVH、ヒトDH、およびヒトJHの遺伝子セグメントによる置き換えを含む、遺伝子改変マウスであって、該1つ以上のヒトVH、DH、およびJHの遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座に対して作動可能に連結されており、ここで、該内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座が、機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子と、内因性IgG1定常領域遺伝子の改変とを含み、ここで、該改変によって該内因性IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失および該IgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失がもたらされ;ここで、該マウスが、機能性CH1領域を有するIgMを含むB細胞受容体を発現し、ここで、該IgMが、同系のλまたはκ軽鎖と会合している重鎖を含む、遺伝子改変マウス。
- 前記1つ以上のヒトVH、DH、およびJHの遺伝子セグメントが、VH1、VH3、VH4、およびその組合せからなる群より選択される可変領域ファミリー由来のヒト遺伝子セグメントを含む、請求項19に記載の遺伝子改変マウス。
- 前記1つ以上のヒト遺伝子セグメントが、VH1−2、VH1−8、VH1−18、VH1−46、VH1−69、VH3−21、VH3−72、VH4−59、およびその組合せからなる群より選択される、請求項20に記載の遺伝子改変マウス。
- 前記1つ以上のヒトVH、DH、およびJHの遺伝子セグメントが、D1−7、D3−16、D4−4、D6−6、D6−7、D6−19、J2、J3、J4、およびその組合せからなる群より選択される、請求項20に記載の遺伝子改変マウス。
- 生殖系列ゲノムを含む単離されたマウス細胞であって、該生殖系列ゲノムは、内因性重鎖の遺伝子座に改変を含む内因性IgG1定常領域遺伝子を含み、該改変によってIgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失および該IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失がもたらされ;
ここで、該細胞は、(i)該内因性重鎖の遺伝子座に機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子も含み、かつ/または(ii)請求項1〜22のいずれか1項に記載のマウスから単離される、単離されたマウス細胞。 - 前記細胞が、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座をさらに含む、請求項23に記載の単離された細胞。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座がκ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項24に記載の単離された細胞。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座がλ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項24に記載の単離された細胞。
- 前記細胞が、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体をさらに含み、該CH1ドメインを欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体が、
(a)ヒト可変ドメインと、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているマウスIgG1定常領域とを;または
(b)マウス可変ドメインと、CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているマウスIgG1定常領域とを、
含む、請求項23に記載の単離された細胞。 - 前記IgG1定常領域が、CH1ドメインをコードしているヌクレオチド配列の少なくとも一部の欠失を含む前記IgG1定常領域遺伝子のヒンジ領域の欠失をさらに含む、請求項23に記載の単離された細胞。
- 前記細胞が、IgG1抗体をさらに含み、IgG1抗体が前記CH1ドメインを完全に欠いていることを特徴とする、請求項23に記載の単離された細胞。
- 前記内因性重鎖の遺伝座における1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントが、1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによって置き換えられており、ここで、該1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが組み換えられて、内因性マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された再構成されたヒト可変領域遺伝子を形成する、請求項23に記載の単離された細胞。
- 前記1つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、ヒトVH1、VH3またはVH4ファミリーの遺伝子セグメントである、請求項30に記載の単離された細胞。
- 前記ヒト重鎖可変遺伝子セグメントが、ヒトVH遺伝子セグメントVH1−2、VH1−8、VH1−18、VH1−46、VH1−69、VH3−21、VH3−72およびVH4−59からなる群より選択される遺伝子セグメントである、請求項31に記載の単離された細胞。
- 前記内因性マウスVH遺伝子セグメントの全部が、18、39または81個のヒトVH遺伝子セグメントによって置き換えられている、請求項31に記載の単離された細胞。
- 前記ヒト遺伝子セグメントが、VH1−8、VH1−18およびVH1−69からなる群より選択される、請求項31に記載の単離された細胞。
- 前記細胞がIgG1抗体をさらに含み、該IgG1抗体が、
(a)前記ヒト可変領域遺伝子に由来するヒト可変ドメイン、および
(b)前記内因性定常領域遺伝子に由来する内因性定常領域であって、ここで、該定常領域が、IgG1 CH2ドメイン、およびIgG1 CH3ドメインを含む、内因性定常領域、
を含む、請求項30に記載の単離された細胞。 - 前記マウスが
(a)野生型IgG3タンパク質;
(b)野生型IgG2aタンパク質;および
(c)野生型IgG2bタンパク質
をさらに発現する、請求項23に記載の単離された細胞。 - 前記マウスが、
(e)野生型IgMタンパク質;
(f)野生型IgDタンパク質;
(g)野生型IgAタンパク質;および
(h)野生型IgEタンパク質
をさらに発現する、請求項36に記載の単離された細胞。 - 前記細胞が、129系統、C57BL/6系統、および混合型129×C57BL/6系統からなる群より選択されるマウス系統に由来する、請求項23に記載の単離された細胞。
- 前記細胞が50%129および50%C57BL/6である、請求項38に記載の単離された細胞。
- 前記内因性重鎖の遺伝子座において、1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの、1つ以上のラクダ化ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによる置き換えを含む、請求項23に記載の単離された細胞。
- 単離されたマウスまたはラットの胚性幹(ES)細胞またはB細胞であって、該細胞が、内因性重鎖の遺伝子座に改変を含む内因性IgG1定常領域遺伝子を含む生殖系列ゲノムを含み、該改変によってIgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失および該IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失がもたらされ;該細胞は、該内因性重鎖の遺伝子座に機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子も含み;該B細胞は、機能性CH1ドメインを欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体を発現する、単離された細胞。
- VH、DH、およびJHの遺伝子セグメントの全部の、前記1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントによる置き換えを含む、請求項41に記載の単離されたマウスまたはラットの細胞。
- 前記1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントが、VH1、VH3、VH4、およびその組合せからなる群より選択される可変領域ファミリー由来のヒト遺伝子セグメントを含む、請求項42に記載の単離された細胞。
- 前記1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントが、VH1−2、VH1−8、VH1−18、VH1−46、VH1−69、VH3−21、VH3−72、VH4−59、およびその組合せからなる群より選択される、請求項43に記載の単離された細胞。
- 前記1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントが、D1−7、D3−16、D4−4、D6−6、D6−7、D6−19、J2、J3、J4、およびその組合せからなる群より選択される、請求項43に記載の単離された細胞。
- 前記内因性重鎖の遺伝子座における1つ以上の内因性マウス重鎖可変領域の遺伝子セグメントが、1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントで置き換えられており、該1つ以上のヒト重鎖可変領域の遺伝子セグメントが、組み換えられて、内因性マウス定常領域遺伝子に作動可能に連結された再構成されたヒト可変領域遺伝子を形成する、請求項41に記載の単離された細胞。
- 機能性CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体を発現し、かつまた2つの軽鎖および2つの重鎖から構成されるIgM抗体を発現するマウスを提供する方法であって、該IgMの重鎖は、各々、機能性CH1ドメインを含み、該方法は、
内因性重鎖の遺伝子座で内因性IgG1定常領域遺伝子を改変するステップであって、該改変によってIgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失および該IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失がもたらされる、ステップ、および
ゲノムにおいて、機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子を含む内因性重鎖の遺伝子座を維持するステップ
を含む、方法。 - 機能性CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1抗体を生成する方法であって、該方法は、
(a)マウスを提供するステップであって、該マウスの生殖系列は、
(i)内因性重鎖の遺伝子座での内因性IgG1定常領域遺伝子の改変であって、該改変によってIgG1定常領域のCH1ドメインが軽鎖と会合する機能の喪失および該IgG1定常領域のヒンジ領域の欠失がもたらされる、改変;および
(ii)機能性CH1ドメインをコードしている内因性IgM定常領域遺伝子を含む内因性重鎖の遺伝子座、
を含む、ステップ;ならびに
(b)該マウスが、
(i)各々のIgM重鎖が機能性CH1ドメインを含む2つのIgM重鎖と2つの同系の軽鎖とから構成されるIgM抗体;ならびに
(ii)CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いているIgG1重鎖から構成されているIgG1抗体、
を発現するように該マウスを維持するステップ
を包含する、方法。 - 前記方法が、
(a)前記マウスを抗原で免疫するステップ;
(b)該マウスを、前記抗原に対する免疫応答が起こるのに十分な条件下で維持するステップ;ならびに
(c)該マウスから、該抗原に特異的に結合する細胞またはタンパク質を単離するステップであって、該細胞またはタンパク質は、(i)CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いており、かつ(ii)該抗原に特異的に結合する体細胞変異されたIgG1抗体を含む、ステップ
をさらに包含する、請求項48に記載の方法。 - 前記マウスが、(a)野生型IgG3タンパク質;(b)野生型IgG2aタンパク質;および(c)野生型IgG2bタンパク質をさらに発現する、請求項49に記載の方法。
- 前記マウスが、(d)野生型IgMタンパク質;(e)野生型IgDタンパク質;(f)野生型IgAタンパク質;および(h)野生型IgEタンパク質をさらに発現する、請求項50に記載の方法。
- 前記IgG1抗体が、前記CH1ドメインを完全に欠いている、請求項49に記載の方法。
- 前記IgG1抗体が、IgG1 CH2ドメイン、およびIgG1 CH3ドメインを含む、請求項52に記載の方法。
- 前記マウスが、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がκ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項54に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がλ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項54に記載の方法。
- 前記マウスが、129系統、C57BL/6系統、および混合型129×C57BL/6系統からなる群より選択される系統である、請求項53に記載の方法。
- 前記マウスが50%129および50%C57BL/6である、請求項57に記載の方法。
- 前記マウスが、内因性マウスVH、DH、およびJHの遺伝子セグメントの少なくとも1つまたは全部の、1つ以上のヒトVH、ヒトDH、およびヒトJHの遺伝子セグメントによる置き換えをさらに含み、ここで、該1つ以上のヒトVH、DH、およびJHの遺伝子セグメントが、該内因性マウス遺伝子座においてマウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座へと作動可能に連結されており、そしてここで、前記マウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座が、機能性CH1ドメインを有するIgM定常領域遺伝子と、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびその組合せからなる群より選択されるIgG遺伝子におけるCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部の欠失を含むIgG遺伝子とを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記CH1ドメインを完全にまたは一部欠いているIgG1抗体が、ヒト重鎖可変領域を含む、請求項59に記載の方法。
- (a)前記マウスを抗原で免疫するステップ;
(b)該マウスを、該抗原に対する免疫応答が起こるのに十分な条件下で維持するステップ;
(c)該マウスから細胞を単離するステップであって、該細胞は、(i)CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いており、かつ(ii)該抗原に特異的に結合する体細胞変異されたIgG1抗体を含む、ステップ;ならびに
(d)重鎖可変領域核酸を、(c)において単離された細胞から単離するステップ
をさらに含む、請求項60に記載の方法。 - 最終ステップとして、(e)前記CH1ドメインの少なくとも一部が欠失しているヒト重鎖定常領域遺伝子へと作動可能に連結された第2の核酸を含むベクターで細胞をトランスフェクトするステップであって、ここで、該核酸は、ステップ(d)において単離された重鎖核酸と同一である、ステップ、および(f)該細胞を、該ベクターの発現に十分な条件で培養するステップをさらに含む、請求項61に記載の方法。
- 前記重鎖定常領域遺伝子が、IgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3からなる群より選択されるヒトIgGである、請求項62に記載の方法。
- ステップとして、(d)重鎖可変領域核酸を、(c)において単離された細胞から単離するステップをさらに含む、請求項49に記載の方法。
- 最終ステップとして、(e)前記CH1ドメインの少なくとも一部が欠失している重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第2の核酸を含むベクターで細胞をトランスフェクトするステップであって、ここで、該核酸が、ステップ(d)において単離された重鎖核酸と同一である、ステップ、および(f)該細胞を、該ベクターの発現に十分な条件で培養するステップをさらに包含する、請求項64に記載の方法。
- (d)(c)において単離された細胞からハイブリドーマを生成するステップ;
(e)該ハイブリドーマを培養するステップ;および
(f)(e)において得た培養上清から(i)CH1ドメインを完全にまたは一部欠きそしてヒンジ領域を欠いており、かつ(ii)前記抗原に特異的であるIgG1抗体を選択するステップ
をさらに包含する、請求項49に記載の方法。 - ステップとして、(g)(d)において生成されたハイブリドーマから重鎖可変領域の核酸を単離するステップをさらに含む、請求項66に記載の方法。
- 最終ステップとして、
(h)前記CH1ドメインの少なくとも一部が欠失されている重鎖定常領域遺伝子へと作動可能に連結された第2の核酸を含むベクターで細胞をトランスフェクトするステップであって、ここで、該核酸が、ステップ(g)において単離された重鎖核酸と同一である、ステップ;
(i)該細胞を、該ベクターの発現に十分な条件で培養するステップ;および
(j)該ベクターによってコードされるタンパク質を単離するステップ
をさらに包含する、請求項67に記載の方法。 - 前記重鎖定常領域遺伝子が、IgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3からなる群より選択されるヒトIgGである、請求項68に記載の方法。
- 請求項66に記載の方法に従って形成されたハイブリドーマ。
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