JP2024501286A - アンカー改変型抗体をコードする核酸およびその使用 - Google Patents

アンカー改変型抗体をコードする核酸およびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書において、アンカー改変型免疫グロブリンポリペプチドが記述され、当該アンカーは、当該免疫グロブリンポリペプチドを対象の受容体に固定する。アンカー改変型免疫グロブリンポリペプチドは概して、アンカーが付されたＮ末端を特徴とし、当該アンカーは、例えば受容体に結合するリガンドの受容体結合部分である。アンカー改変型免疫グロブリンポリペプチドをコードする組み換え免疫グロブリンセグメントで遺伝子改変された非ヒト動物は、アンカー改変型免疫グロブリンポリペプチドを産生することができる。そのような非ヒト動物も提供され、それとともに当該非ヒト動物を作製および使用する方法ならびに組成物も提供される。非ヒト動物からアンカー改変型免疫グロブリンを作製する方法、ならびにそこから作製されたアンカー改変型免疫グロブリンも提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の定めのもと、２０２０年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，８９３号、および２０２１年７月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２１９，４０２号の利益を主張するものであり、これらの出願はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
１０５０７ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔファイルに記述されている配列表は４７キロバイトであり、２０２１年１２月１７日に作成され、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
モノクローナル抗体製品は、バイオ医薬業界に革命を起こし、いくつかの疾患治療において大きな進歩を遂げた。治療用途のモノクローナル抗体を使用することによって得られたこれら進歩や知識があるにも関わらず、モノクローナル抗体が結合し、および／またはアクセスすることが困難な標的と関連する疾患は未だ存在し、効果的な治療法を開発するためには異なるアプローチが必要であるとみられている。
本明細書において、様々な疾患の治療に使用することができる、新たな抗体ベースの治療薬、一部の実施形態では抗体（例えば、モノクローナル抗体および／またはその断片）を特定し、開発するための改良型インビボシステムとして非ヒト動物を操作することが望ましいという認識が開示される。本明細書に開示される核酸、非ヒト動物、方法、およびポリペプチドは、アンカー改変型免疫グロブリンに関する。本明細書に記載のアンカーは概して、同族受容体に結合する非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を含む。免疫グロブリンに付加されたアンカーは、当該アンカーの同族受容体に対する免疫グロブリンのアフィニティの増加に役立ち、それに伴い、当該免疫グロブリンの結合特性が改善される。本明細書において、アンカー改変型免疫グロブリンをコードする核酸分子、および／または非ヒト動物を改変して当該非ヒト動物がアンカー改変型免疫グロブリンを新たに生成し得るように使用され得る核酸分子が記載される。
本明細書に記載されるアンカー改変型免疫グロブリンは、少なくとも部分的に、Ｉｇリーダー配列、ならびに生殖系列のＶセグメントのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）の間に、およびそれらと動作可能な連結でアンカーをコードするように改変された、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖可変領域（ＶＨ）セグメントまたは軽鎖可変領域（ＶＬ）セグメントなどの可変領域（Ｖ）セグメントによってコードされてもよい。
したがって、再構成されていない、または再構成された改変型Ｉｇ Ｖセグメントを含む、標的化ベクターおよび非ヒト動物ゲノムを含む核酸分子も記載される。また本明細書において、本明細書に記載される核酸分子を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物も記載される。
本明細書に記載の組換え核酸分子は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドをコードする改変型免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）セグメントを含んでもよく、この場合において当該改変型Ｉｇ Ｖセグメントは、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ１）、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含み、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、ならびに（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３を含み、この場合において当該アンカーは、同族受容体に結合する対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を含み、任意でこの場合において当該組換え核酸分子は、任意の他のＶセグメントを欠いている。本明細書に記載される組換え核酸分子は、一つ以上の（非）再構成Ｉｇ多様性（Ｄ）セグメント、一つ以上の（非）再構成Ｉｇ結合（Ｊ）セグメント、および／または一つ以上のＩｇ定常領域（Ｃ）の遺伝子を含んでもよい。
一部の実施形態では、Ｉｇシグナルペプチドは、生殖系列のＩｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＩｇシグナルペプチドである。一部の実施形態では、Ｉｇシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号７）を含む。一部の実施形態では、アンカーは、リンカーを含み、当該リンカーは、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を、生殖系列のＩｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３に連結する。一部のリンカーの実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
一部の実施形態では、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のＩｇ重鎖可変（ＶＨ）セグメントまたはそのバリアントであり、例えば、ヒト（ｈ）生殖系列のＩｇ Ｖセグメントまたはそのバリアント、例えば、生殖系列のヒト（ｈ）ＶＨ１－２セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－３セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－８セグメント、生殖系列のｈＶＨ１ １８セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－２４セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－４５セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－４６セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－５８セグメント、生殖系列のｈＶＨ１－６９セグメント、生殖系列のｈＶＨ２－５セグメント、生殖系列のｈＶＨ２－２６セグメント、生殖系列のｈＶＨ２－７０セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－７セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－９セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－１１セグメント、生殖系列のｈＶＨ３ １３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－１５セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－１６セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－２０セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－２１セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－２３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３０セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３０－３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３０－５セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３５セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－３８セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－４３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－４８セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－４９セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－５３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－６４セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－６６セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－７２セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－７３セグメント、生殖系列のｈＶＨ３－７４セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－４セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－２８セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－３０－１セグメント、生殖系列のｈＶＨ４ ３０－２セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－３０－４セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－３１セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－３４セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－３９セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－５９セグメント、生殖系列のｈＶＨ４－６１セグメント、生殖系列のｈＶＨ５－５１セグメント、生殖系列のｈＶＨ６－１セグメント、生殖系列のｈＶＨ７－４－１セグメント、生殖系列のｈＶＨ７－８１セグメント、またはそれらのバリアントである。一部の実施形態では、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のｈＶＨ１－６９セグメントまたはそのバリアントである。一部の実施形態では、バリアントは、アレルバリアントである。
一部の実施形態では、組換え核酸分子は、重鎖可変領域の座位を含んでもよく、例えば、動作可能な連結で、５’から３’に向かって以下を含んでもよい：（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＨセグメント、（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖多様性（ＤＨ）セグメント、および（ＩＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖結合（ＪＨ）セグメント。一部の実施形態では、（ＩＩ）のＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数は、ヒトＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つ、複数の、またはすべてを含み、および／または（ＩＩＩ）のＩｇ ＪＨセグメントのうちの一つまたは複数は、ヒトＩｇ ＪＨセグメントのうちの一つ、複数、またはすべてを含む。一部の実施形態では、（ＩＩ）のＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数、および（ＩＩＩ）のＩｇ ＪＨ遺伝子セグメントのうちの一つまたは複数が、組み替えられ、再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列を形成する。それにより、組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって以下を含む：改変されたＩｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列。
一部の実施形態では、改変されたＩｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列が、組み替えられ、再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、当該配列がアンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインをコードし、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインは、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、および（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされるＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ１）、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む。
一部の実施形態では、改変されたＩｇ ＶＨセグメントは、再構成されていない改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組み換え核酸は、Ｉｇ重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列をさらに含み、この場合においてＩｇ ＣＨをコードする核酸配列は、（Ｉ）改変されたＩｇ ＶＨセグメント、（ＩＩ）Ｉｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数、および（ＩＩＩ）Ｉｇ ＪＨセグメントのうちの一つまたは複数、の下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される。一部の実施形態では、Ｉｇ ＣＨをコードする核酸配列は、ＩｇＭアイソタイプをコードするＩｇμ遺伝子、ＩｇＤアイソタイプをコードするＩｇδ遺伝子、ＩｇＧアイソタイプをコードするＩｇγ遺伝子、ＩｇＡアイソタイプをコードするＩｇα遺伝子、および／またはＩｇＥアイソタイプをコードするＩｇε遺伝子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、アンカー改変型Ｉｇ重鎖をコードする核酸配列を含み、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ重鎖は、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ重鎖可変ドメイン、ならびに（ｉｖ）Ｉｇ ＣＨ、を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ ＣＨは、非ヒトＩｇ ＣＨ、例えば齧歯類のＩｇ ＣＨ、例えばラットのＩｇ ＣＨまたはマウスのＩｇ ＣＨである。
一部の実施形態では、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のＩｇ軽鎖可変（ＶＬ）セグメントまたはそのバリアントである。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、軽鎖可変領域の座位を含んでもよく、例えば、動作可能な連結で、５’から３’に向かって以下を含んでもよい：（Ｉ）改変されたＩｇ ＶＬセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントのうちの一つまたは複数。
一部の実施形態では、改変されたＩｇ ＶＬセグメント、およびＩｇ ＪＬセグメントのうちの一つまたは複数が組み替えられ、再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列を形成する。当該配列は、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインをコードし、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインは、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、および（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む。
一部の実施形態では、組換え核酸分子は、軽鎖可変領域座位、およびＩｇ軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含んでもよく、この場合において当該Ｉｇ ＣＬをコードする核酸配列は、以下の下流にあり、それらに動作可能に連結されている：（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖は、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ軽鎖可変ドメイン、および（ｉｖ）Ｉｇ ＣＬ、を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ ＣＬは、非ヒトＩｇ ＣＬ、例えば齧歯類のＩｇ ＣＬ、例えばラットのＩｇ ＣＬまたはマウスのＩｇ ＣＬである。
一部の軽鎖可変領域座位の実施形態では、生殖系列のＩｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のＩｇ軽鎖可変カッパ（Ｖκ）セグメントまたはそのバリアントである。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖκセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合カッパ（Ｊκ）セグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖκセグメント、（ＩＩ）Ｉｇ 軽鎖結合カッパ（Ｊｋ）のうちの一つまたは複数、および（ＩＩＩ）Ｉｇ軽鎖定常カッパ領域（Ｃκ）をコードする核酸配列。
一部の軽鎖可変領域座位の実施形態では、生殖系列のＩｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のＩｇ軽鎖可変ラムダ（Ｖλ）セグメントまたはそのバリアントである。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖλセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合ラムダ（Ｊλ）セグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖλセグメント、（ＩＩ）Ｉｇ 軽鎖結合ラムダ（Ｊλ）セグメントのうちの一つまたは複数、およびＩｇ軽鎖定常ラムダ領域（Ｃλ）をコードする核酸配列。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、配列番号８として記載される配列もしくはその縮重バリアント、または配列番号１０もしくはその縮重バリアントを含む。
核酸分子を含む、標的化ベクター、非ヒト動物細胞（例えば、宿主細胞、胚性幹細胞など）、および非ヒト動物も記述される。
本明細書に開示される組換え核酸分子の実施形態を含む標的化ベクターも記述される。一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターはさらに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべてまたはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される組換え核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、齧歯類または齧歯類細胞（例えば、齧歯類胚性幹細胞）中の内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、すべての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、すべての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する。一部の実施形態では、５’相同アームは、配列番号１１として記載される配列を含み、および／または３’相同アームは、配列番号１２として記載される配列を含む。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、当該Ｉｇ軽鎖座位で非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、当該Ｉｇ軽鎖κ座位で非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位が、組換え核酸分子を、当該Ｉｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメント、すべてのＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖λ座位が、組換え核酸分子を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する。
本明細書において、本明細書に記載される組換え核酸分子および／または標的化ベクターを含む非ヒト動物ゲノムも記述される。一部の非ヒト動物ゲノムの実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、当該非ヒト動物ゲノムの内因性Ｉｇ座位で本明細書に記載される組換え核酸分子を含み、例えば、当該非ヒト動物ゲノムは、本明細書に記載される標的化ベクターを含み、この場合において当該標的化ベクターは、内因性Ｉｇ座位を標的とする５’および３’相同アームを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、齧歯類のゲノムである。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、ラットのゲノムである。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、マウスのゲノムである。
本明細書において、本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化ベクター、および／もしくは非ヒト動物ゲノムを含む非ヒト動物または非ヒト動物細胞ゲノムも記述される。一部の非ヒト動物の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えば、生殖細胞などのその生殖系列において本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化ベクター、または非ヒト動物ゲノムを含み、例えば、その子孫に、本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化ベクター、および／または非ヒト動物ゲノムを渡すことができる。
また、本明細書に記載される標的化ベクターなどの組換え核酸分子をインビトロで使用して、非ヒト細胞、非ヒト胚、および／または非ヒト動物を作製する方法も記述される。一部の実施形態では、単離細胞を改変するインビトロでの方法は、当該単離細胞に、例えば、本明細書に記載される標的化ベクターと細胞を接触させることによって、本明細書に記載の組換え核酸分子を導入することを含む。一部の方法の実施形態では、細胞は、宿主細胞である。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の方法に従って作製された細胞は、齧歯類細胞であり、例えば、この場合において当該齧歯類細胞は、ラット細胞またはマウス細胞である。
また、本明細書に記載の核酸分子、非ヒト細胞、および／または非ヒト動物を使用して、アンカー改変型抗原結合タンパク質を作製する方法も記述されている。また、本明細書に記載される胚性幹細胞を含み得る、および／または本明細書に記載される胚性幹細胞から開発（例えば、生成）され得る非ヒト動物胚および非ヒト動物も記述されている。そのような胚または非ヒト動物は、本明細書に記載されるＥＳ細胞を胚に移植すること、および／またはＥＳ細胞を含む胚を適切な宿主に移植すること、ならびに当該ＥＳ細胞または当該胚の発生中に適切な条件下で宿主を生存可能な子孫へと維持することを含む方法によって開発され得る。
本明細書に記載される一部の非ヒト動物の実施形態では（例えば、 非ヒト動物が、本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化ベクター、および／またはゲノムを含み、ならびに／または本明細書に記載される方法に従って生成される実施形態）、非ヒト動物は、対照非ヒト動物と比較して、以下を含む：（ａ）脾臓中に同等の数の成熟Ｂ細胞、（ｂ）脾臓中に同等の数のカッパ陽性Ｂ細胞、（ｃ）脾臓中に同等の数のラムダ陽性Ｂ細胞、（ｄ）同等レベルの血清ＩｇＧ、および／または（ｅ）同等レベルの血清ＩｇＭ。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、対照非ヒト動物に匹敵する免疫反応を開始することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、複数の抗原結合タンパク質を含み、当該タンパク質はそれぞれアンカーを含み、および／または本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化ベクター、および／または非ヒト動物に由来する。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物はさらに、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体を含み、その対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分は、アンカーとして機能する。一部の非ヒト動物の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、複数の抗原結合タンパク質を含み、当該タンパク質はそれぞれ当該対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体に特異的に結合し、その対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分は、アンカーとして機能する。
本明細書に記載されるように、対象の非免疫グロブリンポリペプチド（その対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分は、アンカーとして機能する）は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ：ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含み得る。一部の実施形態では、ＡＮＰのｃ末端尾部（例えば、ＮＳＦＲＹ（配列番号３））は、同族受容体のアンカーとして機能し得る。一部の実施形態では、同族受容体は、ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ：ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、例えば、ＮＰＲ３、またはその一部を含む。
一部の非ヒト動物の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物が、その受容体結合部分（例えば、ＮＳＦＲＹ（配列番号３））が本明細書に記載されるアンカーとして機能する対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体（任意選択的にこの場合において当該同族受容体はナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）、例えば、ＮＰＲ３）を含む）で免疫化される場合、本明細書に記載される非ヒト動物はさらに複数の抗原結合タンパク質を含み、当該タンパク質は同族受容体に結合し、当該受容体はそれぞれ、１ｘ１０９未満のＫＤおよび／または３０分超のｔ１／２を備える。一部の実施形態では、複数の抗原結合タンパク質のうちの少なくとも１５％は、対象の非免疫グロブリンポリペプチドへの同族受容体の結合を遮断することができ、および／または遮断する。一部の実施形態では、複数の抗原結合タンパク質のうちの５０％超が、細胞表面上に発現される同族受容体に結合する。
本明細書に記載される一部の非ヒト動物の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類である。本明細書に記載される一部の非ヒト動物の実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一部の非ヒトの実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。
また、本明細書に記載される核酸分子によってコードされる、または本明細書に記載の非ヒト動物によって生成される、アンカー改変型抗原結合タンパク質も記述される。
本明細書において、抗原結合タンパク質を作製する方法、または同タンパク質をコードする核酸を取得する方法が記述され、当該方法は、（ｉ）抗原（例えば、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体であって、当該対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分は、アンカーとしての機能を果たすもの）を用いて、本明細書に記載される非ヒト動物を免疫化すること、または本明細書に記載される方法に従って作製される非ヒト動物（例えば、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドをコードする改変免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）セグメントを含む非ヒト動物）を免疫化すること、および（ｉｉ）抗原に結合する抗体、または同抗体をコードする核酸を含む、当該抗原に対する免疫反応を当該非ヒト動物に生じさせること、を含む。一部の実施形態はさらに、非ヒト動物または例えばＢ細胞などの非ヒト動物細胞から、抗原結合タンパク質または同タンパク質をコードする核酸を回収すること、任意選択的に当該Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成することを含む。一部の実施形態はさらに、回収された核酸を発現構築物にクローニングすること、および任意選択的に宿主細胞中で当該発現構築物を発現させること、を含む。一部のクローニングの実施形態では、当該方法はさらに、回収された核酸をクローニングすることを含み、この場合において当該回収された核酸は、ヒトＩｇ定常領域をコードする配列とインフレームでＩｇ可変ドメインをコードする。また本明細書において、Ｂ細胞、Ｂ細胞と融合されたハイブリドーマ、またはＢ細胞から回収された核酸を発現する宿主細胞も記述される。一部の実施形態では、各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものである。一部の実施形態では、各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される。一部の実施形態では、各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される。
また本明細書において、（ａ）本明細書に記載される組換え核酸分子、本明細書に記載される標的化ベクター、または本明細書に記載される非ヒト動物ゲノム、によってコードされ、（ｂ）本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト動物細胞によって発現され、（ｃ）本明細書に記載される方法に従い作製される非ヒト動物または非ヒト動物細胞によって発現され、および／または（ｄ）本明細書に記載される方法のいずれかによって作製される、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドも記述される。
本明細書に開示される非ヒト動物、細胞、核酸、および組成物のその他の特徴、目的、および利点は、以下に示す特定の実施形態の詳細説明で明らかになる。しかしながら、以下の詳細説明は特定の実施形態を示すが、単に例示のためになされるものであり、限定するものではないことを理解すべきである。
以下の図から構成される本明細書に含まれる図面は、例示のみを目的としており、限定を目的とはしていない。
図１は、Ｃａｓ９／ＧＡ改変用のドナーＤＮＡとして有用なＡＮＰ改変型ＶＨ遺伝子セグメントの実施形態の非限定的な例の正確な縮尺ではない図を示す。また、制限酵素認識部位（ＸｈｏＩ、Ｍｒｅｌ、ＥｃｏＲＩ、ＡｖｒＩＩ、Ｍｒｅｌ）およびスペクチノマイシン耐性遺伝子（ＳＰＥＣ）も示されている。この非限定的な実施形態では、ヒトＶＨ１－６９遺伝子セグメントは、心房性ナトリウム利尿タンパク質（ＡＮＰ）のＣ末端尾部（ＮＳＦＲＹ、配列番号３）をコードする配列で改変され、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９遺伝子セグメントを含むドナーＤＮＡを形成する。概して、塗りつぶされていないものはヒト配列を表し、塗りつぶされたものはマウス配列を表している。点描のものは非ヒトで非マウスの配列を表す。
図２は、ＢＡＣクローンＶＩ５０４中のＶＨ１－６９遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡドナー（配列番号１０として記載される）の非限定的な実施形態の例を示す。以下の特性が示されている：－以下を含むセンスＤＮＡ配列：（ａ）生殖系列のヒトＶＨ１－６９セグメントによりコードされる二分構成のシグナルペプチド（「シグナルペプチド」トラベルされた分割矢印を参照）の最後の７個のコドン；シグナルポリペプチド全体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６として記載され；およびシグナルポリペプチド全治のアミノ酸配列は、配列番号７として記載される、（ｂ）エクソン１、イントロン１、およびエクソン２を含む生殖系列のＩｇ ＶＨ１－６９セグメント（ＤＮＡ配列のすぐ上の「ＶＨ」トラベルされた分割矢印を参照）、（ｃ）生殖系列のＩｇ ＶＨ１－６９セグメントのイントロン１（「イントロン」）、（ｄ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）のＣ末端尾部（配列番号３）およびＧ４Ｓリンカー（配列番号５）をコードするヌクレオチド配列、（ｅ）ＦＲ１、ＣＤＲ１（模様のあるボックス）、ＦＲ２、ＣＤＲ２（模様のあるボックス）、ＦＲ３、およびＣＤＲ３（模様のあるボックス）をコードする生殖系列のＶＨ１－６９セグメントの部分、および同部分のアミノ酸配列（ＩｇＨＶ１－６９とラベルされた分割矢印を参照）、ならびに（ｅ）２３ｍｅｒの組み換えシグナル配列（ＲＳ－２３分割）、－リーダー配列を含むＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメント（ＡＮＰ－Ｇ４Ｓ－ＶＨ１－６９とラベルされる）の概念的翻訳、－インビトロでＣａｓ９を用いてＶＩ５０４を切断するために使用されるｃｒＲＮＡ結合部位（５’ＶＨ１－６９ Ｃａｓ９およびＰＡＭとラベルされる）、－ＶＩ５０４とドナーのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用される５’および３’の重複（それぞれ「５’ＶＨ１－６９重複」および「３’ＶＨ１－６９」とラベルされた黒色の矢印の線）－配列の下の斜線のボックスで示される制限酵素部位：ドナーにスペクチノマイシン耐性カセットをライゲーションするために使用されるＥｃｏＲＩ部位およびＡｖｒＩＩ部位、ｐＵＣベクター骨格からドナーを除去するために使用されるＸｈｏＩ部位、およびジョイナーオリゴ介在型Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによるシームレスな修復の前に、改変されたＢＡＣからＳｐｅｃカセットを除去するために使用されるＭｒｅＩ部位。 同上。
図３は、実施例１に従ってＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントをＢＡＣクローンＶＩ５０４に挿入して、標的化ベクターＶＩ７４８を作製した非限定的な例示的実施形態の正確な縮尺ではない図を示す。概して、塗りつぶされていないものはヒト配列を表し（例えば、塗りつぶされていない三角は、ヒトＶＨ１－６９セグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを表す）、塗りつぶされたものはマウス配列を表し（例えば、塗りつぶされた三角は、内因性マウスＶＨセグメント（ラベルなし）を表し、塗りつぶされた矢印はマウスのＡｄａｍ６ａ「ａ」遺伝子およびＡｄａｍ６ｂ「ｂ」遺伝子を表し、塗りつぶされた卵形は、Ｉｇエンハンサーを表し、そして塗りつぶされた矢印は、マウスＩｇμ遺伝子「ＩｇＭ」を表す）、点描のものは非ヒトおよび非マウスの配列を表す（例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子「ＣＭ」、部位特異的リコンビナーゼ認識部位の「Ｆｒｔ」部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子の「ＨＹＧ」、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の「ＳＰＥＣ」）。
図４は、エレクトロポレーション法によってマウスＥＳ細胞のゲノム内の免疫グロブリン重鎖可変領域座位に標的化ベクターを挿入する非限定的な実施形態の例の正確な縮尺ではない図を示す。エレクトロポレーションの後、この非限定的な実施形態の例は、Ａｄａｍ６ａ（「ａ」）遺伝子の上流の塗りつぶされた三角として示される内因性ＶＨセグメントを保持している。概して、塗りつぶされていないものはヒト配列を表し（例えば、塗りつぶされていない三角は、ヒトＶＨ１－６９セグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを表す）、塗りつぶされたものはマウス配列を表し（例えば、塗りつぶされた三角は、内因性マウスＶＨセグメント（ラベルなし）を表し、塗りつぶされた矢印はマウスのＡｄａｍ６ａ「ａ」遺伝子およびＡｄａｍ６ｂ「ｂ」遺伝子を表し、塗りつぶされた卵形は、Ｉｇエンハンサーを表し、そして塗りつぶされた矢印は、マウスＩｇμ遺伝子「ＩｇＭ」を表す）、点描のものは非ヒトおよび非マウスの配列を表す（例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子「ＣＭ」、部位特異的リコンビナーゼ認識部位の「Ｆｒｔ」部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子の「ＨＹＧ」、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子の「ＳＰＥＣ」）。
図５Ａ～５Ｆは、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスからの脾臓細胞集団を、対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと比較したグラフを示す。図５Ａ～Ｂは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ａ）脾臓当たりの細胞の総数（ｙ軸）、ＣＤ１９＋細胞の数／脾臓（ｙ軸）であり、または（Ｂ）脾臓当たりのリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）の割合（ｙ軸）を示す。図５Ｃ～５Ｄは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ｃ）脾臓当たりの成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉＩｇＭｉｎｔ）および移行性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）の総数（ｙ軸）または（Ｄ）脾臓当たりの成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉＩｇＭｉｎｔ）および移行性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｉｎｔＩｇＭｈｉ）の割合（ｙ軸）を示す。図５Ｅ～Ｆは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ｅ）脾臓当たりのＣＤ１９＋カッパ＋細胞とＣＤ１９＋ラムダ＋細胞の総数（ｙ軸）、または（Ｆ）脾臓当たりのＣＤ１９＋κ＋細胞とＣＤ１９＋λ＋細胞の割合（ｙ軸）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａ～６Ｆは、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス大腿骨から単離された骨髄細胞集団を、対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと比較したグラフを示す。図６Ａ～Ｂは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ａ）大腿骨当たりの細胞の総数（ｙ軸）、および大腿骨当たりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数（ｙ軸）であり、または（Ｂ）大腿骨当たりのリンパ球（ＣＤ１９＋細胞）の割合（ｙ軸）を示す。図６Ｃ～Ｄは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ｃ）大腿骨当たりのＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋プロＢ細胞の総数（ｙ軸）、および大腿骨当たりのＣＤ４３－ｃｋｉｔ－プレＢ細胞の数（ｙ軸）、または（Ｄ）大腿骨当たりのＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋プロ－Ｂ細胞またはＣＤ４３－ｃｋｉｔ－プレ－Ｂ細胞の割合を示す。図６Ｅ～Ｆは、ＡＮＰ改変型ＶＨ１－６９セグメントで改変されたマウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）の、（Ｅ）大腿骨当たりの非成熟Ｂ細胞と成熟Ｂ細胞の総数（ｙ軸）、または（Ｆ）大腿骨当たりの非成熟Ｂ細胞と成熟Ｂ細胞の割合（ｙ軸）を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図７は、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ウェスタンブロット解析により分析された、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変動物からの血清ＩｇＧレベルと、対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）の対照動物との血清ＩｇＧレベルを示す。
図８Ａ～Ｂは、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変動物（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）から単離された（Ａ）血清マウス（ｍ）ＩｇＧ、または（Ｂ）血清ｍＩｇＭの濃度（μｇ／ｍＬ、ｙ軸）を示す。 同上。
図９は、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変動物（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）における、タンパク質抗原に対する免疫反応（抗体価、ｙ軸）を比較したグラフを示す。試験された血清のうち、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスについては、３個のサンプルは３回目のブースト後の採血に由来し、１個のサンプルは５回目のブースト後の採血に由来する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスについては、２個の血清サンプルは、６回目のブースト後の採血に由来し、１個のサンプルは９回目のブースト後の採血に由来する。
図１０は、本発明の非限定的な実施形態に関連した結果である、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変動物（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）における、タンパク質抗原に対する免疫反応（抗体価、ｙ軸）を比較したグラフを示す。試験された血清のうち、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスについては、３個のサンプルは３回目のブースト後の採血に由来し、１個のサンプルは５回目のブースト後の採血に由来する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスについては、２個の血清サンプルは、６回目のブースト後の採血に由来し、１個のサンプルは９回目のブースト後の採血に由来する。
図１１は、本発明の非限定的実施形態に関連した結果である、２５℃でのタンパク質抗原に対する、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）から単離されたＮＰＲ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）へのｈＮＰＲ３－ＭＭＨ結合のＫＤ値（ｙ軸）を比較した、箱ひげプロットを使用した図を示す。
図１２は、本発明の非限定的実施形態に関連した結果である、２５℃でのタンパク質抗原に対する、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス（ＡＮＰ）、またはヒト化Ｉｇ座位を含む対照のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）動物（対照）から単離されたＮＰＲ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）へのｈＮＰＲ３－ＭＭＨ結合のｔ１／２値（ｙ軸）を比較した、箱ひげプロットを使用した図を示す。
定義
本発明の範囲は、本明細書に添付される請求の範囲により規定されるものであり、本明細書に記載される特定の実施形態により限定されない。当分野の当業者は、本開示を読むことで、かかる記載される実施形態に対し均等であり得る様々な改変、または別の手段で請求の範囲内にあり得る様々な改変を認識するであろう。概して、専門用語は、明確な別段の示唆がない限り、当技術分野で理解されている意味に従う。特定の用語の明示的な定義は、本明細書におよび以下に提供されるが、本明細書全体にわたる特定の例におけるこれらの用語および他の用語の意味は、文脈から当業者に明らかとなるであろう。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。本明細書内またはその関連部分内に引用されている参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
請求項で請求項を変更するための「第一の」、「第二の」、「第三の」などの順序の用語の使用は、それ自体は一つの請求項要素の別の要素に対する優位性、先行、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を暗示せず、特定の名称を持つ一つの請求項要素を（順序の用語の使用以外は）同じ名称を持つ別の要素から区別して請求項要素を区別するための標識としてのみ使用される。
本明細書および本特許請求の範囲において、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、そうではないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。群の一つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記述は、そうではないことが示されるかまたはそうでなければ文脈から明らかでない限り、一つ、二つ以上、または群のすべての要素が、所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する場合に満足される。本発明は、群の正確に一つの要素が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態を含む。本発明は、二つ以上、または群の要素全体が所定の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、別途指定されない限り、または矛盾または不一致が起こることが当業者には明らかでない限り、変形、組み合わせ、および記載された請求項の一つ以上からの一つ以上の限定、要素、句、記述用語などが、同じ基礎請求項に依存する別の請求項（または関連する任意のその他の請求項）に導入される並べ替えすべてを網羅することを理解すべきである。記載されたような要素が存在する場合（例えば、マーカッシュ群または類似の形式で）、要素の各サブグループも開示され、任意の要素を群から除去することができる。当然のことながら、一般的に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などから成る、または実質的にそれらから成る。簡潔にするために、これらの実施形態はすべての場合において、多くの言葉では本明細書に特に記述されていない。これも当然のことながら、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書に列挙されているかどうかにかかわらず、請求項から明示的に除外される可能性がある。
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は同意義として使用される。約／およその有無に関わらず、本明細書で使用される任意の数字は、当業者によって理解される任意の正常変動、例えば、＋／－５％を網羅することが意図される。
投与：対象またはシステム（例えば、細胞、器官、組織、生物体、または関連構成要素もしくはその構成要素群）に対する組成物の投与を意味する。当業者であれば、投与経路は、例えば、その組成物が投与される対象またはシステム、組成物の性質、投与目的などに応じて異なり得ることを認識するであろう。
例えば、一部の実施形態では、動物対象（例えば、ヒトまたは齧歯類）への投与は、気管支投与（気管支注入を含む）、口腔投与、腸内投与、皮間投与、動脈内投与、皮内投与、胃内投与、髄内投与、筋肉内投与、鼻内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、静脈内投与、心室内投与、粘膜投与、経鼻投与、経口投与、直腸投与、皮下投与、舌下投与、局所投与、気管投与（気管内注入を含む）、経皮投与、膣投与、および／または硝子体投与であってもよい。。一部の実施形態では、投与は、間欠投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体は、対象（例えば、ヒト対象または齧歯類）に投与され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、緩衝液、希釈剤、賦形剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物によって産生される抗体を含む医薬組成物は、例えば、バイアル、シリンジ（例えば、ＩＶシリンジ）、またはバッグ（例えば、ＩＶバッグ）などの保存または投与用の容器に含まれ得る。
アフィニティとは、抗原結合タンパク質とその結合パートナーとの間の相互作用、例えば、抗体と特異的エピトープとの間の相互作用の強度を指す。エピトープに特異的に結合する抗体は、典型的には、その標的エピトープに関して、約１０－９Ｍ以下（例えば、約１ｘ１０－９Ｍ、１ｘ１０－１０Ｍ、１ｘ１０－１１Ｍ、または約１ｘ１０－１２Ｍ）のＫＤを有する。ＫＤは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または他の公知の方法によって測定され得る。
抗体とは、免疫グロブリン抗原結合タンパク質を指す。四量体抗体は、四つのポリペプチド免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続された二つのＩｇ重鎖（Ｈ）と二つのＩｇ軽鎖（Ｌ）を含む。各重鎖は、Ｉｇ重鎖可変ドメインとＩｇ重鎖定常領域またはドメイン（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の三つのドメインを含む。各軽鎖は、Ｉｇ軽鎖可変ドメインとＩｇ軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
Ｉｇ重鎖可変ドメインおよびＩｇ軽鎖可変ドメインはそれぞれさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に差し込まれている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に細分化され得る。Ｉｇ重鎖可変ドメインとおよび軽鎖可変ドメインはそれぞれ、三つのＣＤＲと四つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配列される。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
抗原結合タンパク質とは、例えば、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ミニボディ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片などの免疫グロブリン、抗体、結合タンパク質を指す。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語はまた、米国特許２００７０００４９０９に開示される共有結合ダイアボディ、および例えば米国特許２００９００６０９１０に開示されるＩｇ－ＤＡＲＴＳなども指し、それら出願公開は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
生物学的活性とは、生物系、インビトロまたはインビボ（例えば、生物中）で活性を持つ任意の剤の特徴を指す。例えば、剤が生物内に存在する場合、その生物内で生物学的効果を持つ剤は、生物学的に活性であるとみなされる。
特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性な場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を与えるそのタンパク質またはポリペプチドの一部は、「生物学的に活性」な部分と一般的に呼ばれる。
同族とは、典型的には相互作用する二つの生体分子（例えば、受容体とそのリガンド）を指す。
同等とは、互いに同一ではない場合があるが、観察された差異または類似性に基づき合理的に結論を下すことができるような比較を可能にするのに十分類似性がある、二つ以上の薬剤、実体、状況、条件群などを意味する。当業者であれば、文脈内において、同等とみなされるために二つ以上のこのような薬剤、実体、状況、条件群などに対して、ある所定の状況でどの程度の同一性が必要かを理解するであろう。
保存的とは、保存的アミノ酸置換、すなわち、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖Ｒ基を持つ別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。一般的に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能特性、例えば、その同族受容体に結合する対象非免疫グロブリンポリペプチドの能力を実質的に変化させない。類似の化学特性を備えた側鎖を持つアミノ酸群の例には次のものが含まれる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリンおよびスレオニンなどの脂肪族－ヒドロキシル側鎖、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどの塩基性側鎖、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖、ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘導などで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性がある。一部の実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５（この文献はその全体が参照により本明細書に援用される）に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を持つ保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、この場合において該置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで負ではない値を有する。
対照とは、結果が比較される基準となる「対照」という当技術分野で公知の意味を指す。一般的に、対照は、変数についての結論を出すために、このような変数を分離することによって実験の完全性を増加させるのに使用される。一部の実施形態では、対照は、コンパレーターを提供するために、試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」とは、「対照動物」を指す場合がある。「対照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。ある実験では、「試験」（すなわち、試験されている変数）が適用される。その「対照」である第二の実験では、その試験されている変数が適用されない。対照は、陽性対照または陰性対照である場合がある。
一部の実施形態では、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験またはアッセイの、または以前に知られた量または結果）である。一部の実施形態では、対照は印刷されたかまたはそれ以外の方法で保存された記録であるか、またはそれを含む。
参照核酸分子の縮重バリアントは、参照核酸によりコードされるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有し、参照核酸分子と実質的に同一の核酸配列を有するが、遺伝コードの縮重による差異を有するポリペプチドをコードする。
破壊とは、ＤＮＡ分子（例えば、遺伝子または座位などの内因性相同配列）との相同組換え事象の結果を意味する。
一部の実施形態では、破損は、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体、遺伝子のフラグメント（例えば、エクソン）の挿入を含む場合があり、これらは内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であるか、または対象の特定の遺伝子に由来もしくは該遺伝子から単離したコード配列であってもよい。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）発現および／または活性を増加する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破壊は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）の配列を変える場合がある。一部の実施形態では、破損は、ゲノム内の染色体または染色体位置の配列を変化させ得る。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）を切断またはフラグメント化する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物を伸長させる場合がある。一部のかかる実施形態では、破壊は融合タンパク質のアセンブリを実現する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響するが、その活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するが、そのレベルには影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、有意な効果は、例えば、限定されないが、ＳｔｕｄｅｎｔＴ検定により測定することができる。
内因性座位または内因性遺伝子とは、本明細書に記載の変更、破壊、欠失、挿入、改変、置換または交換を導入する前に、親または参照の生物（または細胞）において存在する遺伝子の座位を意味する。
一部の実施形態では、内因性座位は自然界で見られる配列を全体的にまたは部分的に含む。一部の実施形態では、内因性座位は野生型座位である。一部の実施形態では、参照生物は野生型生物である。一部の実施形態では、参照生物は遺伝子操作された生物である。一部の実施形態では、参照生物は実験室で繁殖された生物（野生型または遺伝子操作型）である。
内因性プロモーターとは、例えば野生型の生物において、内因性の遺伝子または遺伝子座位と自然に関連付けられるプロモーターを指す。
操作された、とは概して、ヒトの手により操作された態様を意味する。一般的なことであり、当技術分野の当業者に理解されているとおり、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫物も通常、実際の操作は過去の実体に対して行われていたのだとしても、「操作された」とみなされる。さらに、当技術分野の当業者により認識されているように、様々な技法が利用可能であり、それらを介して、本明細書に記載される「操作」を行うことができる。ポリヌクレオチドは、自然界での順序では一緒に連結されていない二つ以上の配列がヒトの手により操作され、操作されたポリヌクレオチド中で互いに直接連結された場合に、「操作された」とみなされ得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、自然界で第一のコード配列と作動的に結合しているが、第二のコード配列とは作動的に結合せずに存在し、ヒトの手により連結されて第二のコード配列と作動的に結合した制御配列を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では、第一の核酸配列と第二の核酸配列であって、その各々が、自然界では互いに連結されていないポリペプチド要素またはドメインをコードする、該第一の核酸配列と第二の核酸配列とが、単一の操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに連結されていてもよい。同様に、一部の実施形態では、細胞または生物体が操作され、それによりその遺伝情報が改変された（例えば、従前には存在していなかった新たな遺伝物質が導入されたり、または従前には存在していた遺伝物質が変更もしくは除去された）場合に、「操作された」とみなされ得る。
例えば、一部の実施形態では、「操作」には、分析または比較を行うようプログラムされた、または推奨された配列および／もしくは選択された配列を別手段により分析するようプログラムされた、コンピューターシステムの使用を介して（例えば核酸配列、ポリペプチド配列、細胞、組織および／または生物体の）選択または設計を行うことを含んでもよい。あるいは、またはさらに、一部の実施形態では「操作」には、インビトロ化学合成技術の使用、および／もしくは組み換え核酸技術、例えば（例としてポリメラーゼ鎖反応などを介した）核酸増幅ハイブリダイゼーション、突然変異、形質転換、トランスフェクションなどの使用が含まれてもよく、ならびに／または様々な任意の制御交配法の使用が含まれてもよい。当技術分野の当業者に認識されているように、確立されている様々なこうした技術（例えば組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法など））が当技術分野に公知であり、様々な概説および詳説の参照文献中に記載されており、それらは本明細書全体を通じて引用および／または考察されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９（参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
遺伝子とは、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする、染色体中のＤＮＡ配列を意味する。明確化のため、用語「遺伝子」は、概してポリペプチドをコードする核酸の一部を意味し；当該用語は任意選択的に制御配列を包含する場合があり、これは当技術分野の当業者には文脈から明らかであるはずである。この定義は、「遺伝子」という用語を非タンパク質をコードする発現単位に適用することを除外する意図はなく、本明細書に使用される当該用語は、多くの場合においてはポリペプチドをコードする核酸を指すことを明らかにすることを意図している。
一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、コード配列（例えばエクソン配列）と非コード配列（例えばイントロン配列）の両方を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、一つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでもよく、および／または例えば、遺伝子発現（例えば、細胞型特異的発現、誘導発現など）の一つ以上の態様を制御することができる、もしくは影響を与えることができるイントロン配列を含んでもよい。
例えば抗体などの免疫グロブリン抗原受容体の可変ドメインは、遺伝子セグメントのセットによりコードされ、本明細書において「セグメント」とも呼称される。セグメントは染色体に沿って連続的に配置され、体細胞組み換えを経て完全な可変ドメインエクソンを形成する。遺伝するヒト遺伝子セグメントの構成、例えば、ヒト遺伝子セグメントの生殖系列配置、例えば、ヒトの生殖系列ゲノム（例えば、次世代に受け継がれるゲノム）におけるヒト遺伝子セグメントの順序は、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１００－１１６（２００１）において見いだされ、それはその全体が参照により本明細書に組込まれ、生殖系列配置においてヒト免疫グロブリン重鎖座位内で見出される機能的遺伝子セグメントおよび偽遺伝子も示す。遺伝子セグメントは、可変（Ｖ）遺伝子セグメント（それら各々は個々にＶセグメントとも呼称され得る）、多様性（Ｄ）遺伝子セグメント（それら各々は個々にＤセグメントとも呼称され得る）、または結合（Ｊ）セグメント（それら各々は個々にＪセグメントとも呼称され得る）として分類される。生殖細胞系列のＤＮＡには各タイプの遺伝子セグメントのコピーが複数あるが、受容体担持リンパ球において、一つのみが各タイプの受容体鎖に対して発現される。
いくつかの遺伝子成分が関与する、一連の組み換え現象は、遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、ＤおよびＪ）の順序付けられた配列から免疫グロブリンをアセンブルするのを助ける。遺伝子セグメントのこのアセンブリは、不正確であるとして知られ、それ故に、免疫グロブリン多様性は、異なる遺伝子セグメントの組み合わせ、および不正確な結合を通じた固有の結合の形成の両方により達成される。さらに、多様性は、免疫グロブリンの可変領域配列が、抗原に対する親和性および特異性を増加させるよう改変されている、体細胞超変異として知られるプロセスを通して生成される。本明細書のＩｇ遺伝子セグメント、例えばＩｇ Ｖセグメントとは、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントのバリアントを含む。生殖系列のＩｇセグメントのバリアント、例えば、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントのバリアントは、多形を含み、例えば、アレル、そのバリアント、その体細胞超変異バリアント、その組み換えバリアント、およびその縮重バリアントを含む。
Ｉｇセグメントのコード領域の配列多型、例えば、生殖系列のＩｇセグメントのアレルバリアントの配列は、Ｐａｌｌａｒｅｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１５，８－１８；Ｂａｒｂｉｅ，Ｖ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１５，１７１－１８３；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１５，１８４－１９３；Ｐａｌｌａｒｅｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１６，３６－６０（１９９９）、およびＲｕｉｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１６，１７３－１８４に記載されている。それら各参照文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。アレル生殖系列Ｉｇセグメントの表現は、ウェブ上のｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／＃Ｂおよびｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／＃Ｃでの二つのフォーマットでも見出すことができる。前者はアレル＊０１との比較によって様々なアレルに割り当てられたすべての公知の配列のアライメントを提示し、後者は、アレル＊０１との比較によって、様々なアレルのヌクレオチド変異および対応するアミノ酸変化に関する説明を提供している。また欧州特許第３１２８００９号も参照のこと。当該特許は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３のうちの一つ以上の領域に関し、生殖系列のセグメントに対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の核酸配列相同性を含み、当該生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸をコードする場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。
一部の実施形態では、Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列セグメントに対し８０％～９９％の核酸配列相同性を有する場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。一部の実施形態では、Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列セグメントに対し８５％～９９％の核酸配列相同性を有する場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。一部の実施形態では、Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列セグメントに対し９０％～９９％の核酸配列相同性を有する場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。一部の実施形態では、Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列セグメントに対し９５％～９９％の核酸配列相同性を有する場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。
Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列に対し、８０％～９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸をコードする場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列に対し、８５％～９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸をコードする場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列に対し、９０％～９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸をコードする場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。Ｉｇ Ｖセグメントは、ＦＲ１、ＦＲ２および／またはＦＲ３の内の一つ以上の領域に関し、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントによりコードされるアミノ酸配列に対し、９５％～９９％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸をコードする場合、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントの組換え型または体細胞超変異型のバリアントとみなされ得る。
免疫グロブリン分子は、二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖とから構成されるＹ字型のポリペプチドであり、その各々は、二つの構造成分、一つの可変ドメインおよび一つの定常ドメインを有する。それは、遺伝子セグメントのアセンブリによって形成される重鎖および軽鎖の可変ドメインである一方、定常ドメインは、ＲＮＡスプライシングを通じて可変ドメインに融合される。遺伝子セグメントをアセンブル（または結合）する機序は、重鎖および軽鎖について類似するが、一回の結合現象のみが、軽鎖（すなわち、ＶからＪ）に必要となる一方、二回の現象が、重鎖に必要となる（すなわち、ＤからＪおよびＶからＤＪ）。
概して、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント（ＤＨセグメントとも呼称される）および免疫グロブリン重鎖結合ＪＨ遺伝子セグメント（ＪＨセグメントとも呼称される）とともに組み替えられる免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント（ＶＨセグメントとも呼称される）の体細胞組み換えによって形成される可変ドメインエクソンによりコードされる。概して、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメント（ＪＬセグメントとも呼称される）とともに免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメント（ＶＬセグメントとも呼称される）を体細胞組み換えすることによって形成される可変ドメインエクソンによりコードされる。
重鎖および軽鎖可変領域についての遺伝子セグメントのアセンブリ（それぞれ、ＶＤＪ組み換えおよびＶＪ組み換えとして言及される）は、Ｖ、ＤおよびＪコード配列と比べ正確な位置でＤＮＡ再構成を確実にする、組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）と呼ばれる、各遺伝子セグメントに隣接する保存された非コードＤＮＡ配列により誘導される（例えば、Ｒａｍｓｄｅｎ，Ｄ．Ａ．ら、１９９４年、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１０）：１７８５～９６を参照のこと；その全体が参照により本明細書に組込まれる）。各ＲＳＳは、コード配列（例えば、Ｖ、ＤまたはＪセグメント）、続いてスペーサー（１２ｂｐまたは２３ｂｐのいずれか）と連続する７個のヌクレオチド（ヘプタマー）の保存されたブロック、および９個のヌクレオチド（ノナマー）の第二の保存されたブロックからなる。個体間で１２ｂｐまたは２３ｂｐのスペーサーにおいて相当な配列相違が許容されるが、これらの配列の長さは、典型的には変動しない。免疫グロブリン遺伝子セグメント間の組み換えは、一般的に１２／２３ルールとして言及されるルールに従い、ここで、１２ｂｐのスペーサー（または１２ｍｅｒ）を有するＲＳＳが隣接した遺伝子セグメントは、２３ｂｐのスペーサー（あるいは２３ｍｅｒ、例えば、全体が参照により本明細書に組込まれる、Ｈｉｏｍ，Ｋ．ａｎｄ Ｍ．Ｇｅｌｌｅｒｔ、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、１（７）：１０１１～９を参照のこと）が隣接した遺伝子セグメントと典型的に結合する。
別段の指示がない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかである場合を除き、ＲＳＳを参照することなく、再構成されていない遺伝子セグメントは、遺伝子セグメントが自然に関連している、例えば、隣接している、場合により、動作可能に結合されているなどの二つのＲＳＳを含むと推定される。一部の実施形態では、本明細書における再構成されていない遺伝子セグメントは、各々、両方の端で２３ｍｅｒのＲＳＳが隣接する、その生殖系列（例えば、野生型）構成の遺伝子セグメント、例えば、生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントおよび生殖系列ＪＨ遺伝子セグメントを含んでもよい。対照的に、生殖系列ＤＨ遺伝子セグメント、例えば、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメントは、各々の端で１２ｍｅｒのＲＳＳが隣接する。
したがって、再構成されていない遺伝子セグメントはまた、かかる生殖系列配置と関連する任意のＲＳＳを含む、その生殖系列配置の遺伝子セグメントを指す。さらに、その生殖系列配置における複数の遺伝子セグメントは、概して、その生殖系列（例えば、再構成されていない）構成の各々の個々の遺伝子セグメントだけでなく、機能的遺伝子セグメントの順序および／または位置も指す。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．－Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．、１８、１００～１１６（２００１年）を参照のこと。当該文献は、ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの生殖系列配置について、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
各Ｖセグメントは、免疫グロブリン可変ドメインのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３の一部をコードする核酸配列に動作可能に結合されたＩｇシグナルまたはＩｇリーダー（Ｌ）ペプチドをコードする核酸配列を含む。各Ｄ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＣＤＲ３に寄与する。各Ｊ遺伝子セグメントも、免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲ３およびＦＲ４に寄与する。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４のアミノ酸位置は、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７に記載される固有ナンバリングに基づき、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇでも閲覧することができる。
異種：異なる供給源からの物質または実体を意味する。例えば、特定の細胞もしくは生物体に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関連して使用されるとき、当該用語は、関連ポリペプチドもしくはそのフラグメント、遺伝子もしくはそのフラグメント、または遺伝子産物もしくはそのフラグメントが、（１）ヒトの手によって遺伝子操作されたこと、（２）ヒトの手によって（例えば、遺伝子操作によって）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと、および／または（３）関連細胞または生物（例えば、関連細胞タイプまたは生物タイプ）によって自然には生成されない、またはその中に存在しないことを明確にする。別の例には、自然には関連付けられておらず、一部の実施形態では非内因性である調節要素（例えば、プロモーター）の制御下で、特定の天然の細胞または生物体中に通常存在するが、例えば突然変異または置換により改変されている、ポリペプチドもしくはそのフラグメント、遺伝子もしくはそのフラグメント、または遺伝子産物もしくはそのフラグメントも含まれる。
宿主細胞とは、細胞の中に異種（例えば、外来性）核酸またはタンパク質が導入された細胞を意味する。当業者が本開示を読めば、このような用語が特定の主題細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう。特定の改変は突然変異または環境の影響のために後続世代にも起こる可能性があるので、このような子孫は親細胞と同一でない場合があるが、それでも「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳類細胞であるか、またはそれを含む。一般的に、宿主細胞は、細胞が指定される種に関わらず、異種核酸またはタンパク質の受け入れおよび／または生産に適した任意の細胞である。細胞の例としては、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）など）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）など）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。
一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、単離細胞であるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
ヒト化とは、起源は非ヒトであり、それに対する部分が、改変（例えば、ヒト化）分子が、その生物学的機能を保持し、および／または当該保持された生物学的機能を遂行する構造が維持されるように、対応するヒト分子の対応する部分で置換された分子（例えば、核酸、タンパク質など）を指す。対照的に、「ヒト」などは、ヒト起源のみ、例えば、ヒトのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のみをそれぞれ含有するヒトのヌクレオチドまたはタンパク質を有する分子を包含する。「ヒト（ヒト化）」という用語は、当該ヒト（ヒト化）分子が、（ａ）ヒト分子であり得る、または（ｂ）ヒト化された分子であり得ることを反映するために使用される。
同一性：配列の比較に関連し、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用できる当技術分野で公知の多種アルゴリズムによって決定される同一性を意味する。
一部の実施形態では、本明細書に記述された同一性は、１０．０のギャップ開始ペナルティ、０．１のギャップ延長ペナルティを用い、Ｇｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８年）を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用して決定される。
免疫グロブリンとは、血清中に存在する、または免疫系のＢ細胞上に発現され、例えば抗原結合タンパク質などの抗体として機能する、ある種のポリペプチド、および当該ポリペプチドをコードする核酸を指す。
非免疫グロブリンポリペプチドとは、同族受容体に結合する例えばポリペプチドなどのリガンドを指す。例示的および公知の非免疫グロブリンポリペプチド：同族受容体のペアとしては限定されないが、例えば、同族Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合する非免疫グロブリンポリペプチドが挙げられる。ＧＰＣＲの例としては限定されないが、ケモカイン受容体、グルカゴン受容体（例えば、ＧＬＰ１：ＧＬＰ１Ｒ）、カルシトニン受容体、メラノコルチン受容体が挙げられる。同受容体に結合する非免疫グロブリンポリペプチドを含む、これら、および他の同族ＧＰＣＲは当分野で公知である。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９：２７２６－４５を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。追加的な非限定的、および例示的な非免疫グロブリンポリペプチド（リガンド）：同族受容体のペアとしては、以下が挙げられる：
ａ．同族受容体のチロシンキナーゼに結合するリガンド、例えば限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などのリガンド、
ｂ．ＤＬＬ：Ｎｏｔｃｈ受容体ペア、
ｃ．Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＬＴＡ４／ＰＤ１受容体ペア、
ｄ．セマフォリン：プレキシン（ｐｌｅｘｉｎ）受容体ペア、
ｅ．ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲペア、
ｆ．ＨＬＡ：ＬＩＬＲペア、
ｇ．ＨＬＡ：ＫＩＲペア、
ｈ．ＲＧＤ－リガンド：インテグリンペア、
ｉ．アミリン：ＣＡＬＣＲ／ＲＡＭＰ、例えばＲＡＭＰ１／２／３のペア
ｊ．ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰなど）：ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ、ＮＰＲ３など）のペア。
リガンド：受容体ペアには、プロテアーゼと阻害剤も含まれ得る。
インビトロとは、多細胞生物体内ではなく、例えば試験管または反応容器、細胞培養などの人工的環境において発生する事象を意味する。
インビボとは、例えばヒトおよび／または非ヒト動物などの多細胞生物体内で発生する事象を意味する。細胞ベース系の文脈において、当該用語を使用して、（例えばインビトロシステムとは対照的に）生細胞内で発生する事象を意味する場合もある。
単離されたとは、（１）（天然環境および／または実験環境のいずれかで）最初に生成された時に関連していた成分の少なくとも一部から分離された物質および／もしくは実体、ならびに／または（２）人の手によって設計、生成、調製、および／もしくは製造された物質および／もしくは実体を意味する。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連付けられた約１０種以上の他の構成要素のから分離されてもよい。一部の実施形態では、単離された因子は、少なくとも約８０％以上純粋である。物質は、それにその他の成分が実質的に含まれない場合、「純粋」である。一部の実施形態では、当業者であれば理解するように、例えば、一つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）などの特定のその他の成分と組み合わされた後でも、物質はまだ「単離された」または「純粋」とさえもみなされる場合があり、このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントはこのような担体または賦形剤を含めることなく計算される。
一例を挙げると、一部の実施形態では、自然界に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、（ａ）導出の起源またはソースが、自然界の天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべてと関連していない時、（ｂ）それが、自然界でそれを生産する種と同じ種のその他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない時、または（ｃ）自然界でそれを生産する種ではない細胞またはその他の発現系によって発現されるか、またはそうでなければそれからの成分と関連している時、「単離された」とみなされる。従って、例えば、一部の実施形態では、化学的に合成された、または自然界でそれを生産するものとは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなされる。あるいはまたは追加的に、一部の実施形態では、一つ以上の精製技術を受けたポリペプチドは、それが、ａ）それが自然界で関連している、および／またはｂ）最初に生産された時にそれが関連していたその他の成分から分離されている限りは「単離された」ポリペプチドとみなされることができる。
リーダー配列またはシグナルペプチドとは、免疫グロブリンシグナルまたはリーダー（Ｌ）ペプチドを指し、それらは小胞体に免疫グロブリン重鎖または軽鎖を誘導し、続いて最終抗体のアセンブリの前に重鎖または軽鎖から切断される。また、シグナルペプチドまたはリーダーペプチドをコードする核酸配列を指す場合もある。各Ｖ遺伝子セグメントは、生殖系列Ｉｇ ＶセグメントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３をコードするエクソン２配列のすぐ上流にある、セグメントのエクソン１およびエクソン２によってコードされるリーダー配列（例えば、図２を参照）を含む。 Ｉｇシグナル配列またはＩｇリーダー配列は、当分野で公知である。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。またウェブ上でｉｍｇｔ．ｏｒｇのアドレスでも閲覧することができる。Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２０２０）Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ８（９）：１－１１７も参照のこと。
非ヒト動物とは、ヒトではない任意の脊椎生物体を意味する。非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥でもあり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類でもあり得る。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスでもあり得る。
核酸とは、その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれ、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指し、一般に核酸分子、核酸配列、ヌクレオチド分子、ヌクレオチド分子と交換可能であり、これらの用語は交換可能である。
一部の実施形態では、「核酸」とはオリゴヌクレオチド鎖であるか、またはホスホジエステル結合でオリゴヌクレオチド鎖組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかであるように一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、一部の実施形態では、「核酸」とは個別の核酸残基を備えるオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるかまたはそれを含み、一部の実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の天然核酸残基を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上の核酸類似体を含むかまたはそれらから成る。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で「核酸」とは異なる。例えば、一部の実施形態では、「核酸」は、当技術分野では知られており、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、一つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それらを含むか、またはそれらから成り、それらは本発明の範囲内であるとみなされる。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、一つ以上のホスホロチオエートおよび／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は一つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、または一つ以上の天然ヌクレオシドから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５ プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、およびそれらの組み合わせ）であるか、またはそれらから成る。一部の実施形態では、「核酸」は、天然核酸のものと比べて、一つ以上の改変された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドフラグメント（例えば、ペプチド）をコードするヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のイントロンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のエクソンを含む。一部の実施形態では、「核酸」は、一つ以上のコード配列を含む。一部の実施形態では、「核酸」は、天然起源物からの単離、相補的鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または系での複製、および化学合成の一つ以上によって調製される。一部の実施形態では、「核酸」は、少なくとも３個以上の残基の長さである。一部の実施形態では、「核酸」は一本鎖であり、一部の実施形態では、「核酸」は二重鎖である。一部の実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドもしくはそのフラグメントをコードするか、またはコードする配列の補体である、少なくとも一つの要素を含むヌクレオチド配列を持つ。一部の実施形態では、「核酸」は酵素活性を持つ。
動作可能に結合されたとは、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある近位を意味する。
他の実施形態では、動作可能な連結は、連続性を必要としない。例えば、互いに「動作可能に結合された」再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、再構成されて、再構成された可変領域遺伝子を形成することができ、当該再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、必ずしも互いに連続しているとは限らない。互いに、および連続する定常領域遺伝子に動作可能に結合された再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として定常領域遺伝子と結合して発現される再構成された可変領域遺伝子を形成するよう再構成する能力がある。コード配列に「動作可能に連結した」対照配列は、対照配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように結合されている。「動作可能に連結した」配列には、関心の遺伝子と隣接する発現制御配列および、トランスにまたは距離を置いて作用して対象の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。
「発現制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。「発現制御配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を強化する配列（すなわち、コザック配列）、タンパク質安定性を強化する配列、および望ましい場合、タンパク質分泌を強化する配列を含む。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、こうした制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む一方、真核生物では、こうした制御配列は典型的に、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングのために必須である要素を含むことを意図しており、その存在が有利である追加的要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
生理学的条件は、細胞または生物体が生存および／または繁殖する条件に関する当分野で公知の意味を含む。一部の実施形態では、この用語は、生物体または細胞系に対し自然界で発生し得る外的環境または内的環境の条件を意味する。一部の実施形態では、生理学的条件は、ヒトまたは非ヒト動物の身体内にある条件であり、特に手術部位の、および／または手術部位内の条件である。生理学的条件は、典型的には、例えば２０～４０℃の範囲の温度、１気圧、ｐＨ６～８、１～２０ｍＭのグルコース濃度、大気レベルの酸素濃度、および地球上で生じる重力などを含む。一部の実施形態では、実験室での条件は操作され、および／または生理学的条件に維持される。一部の実施形態では、生理学的条件は、生物体（例えば、非ヒト動物）内に生じるものである。
ポリペプチドとは、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在するアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、自然界に存在しないアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、お互いに別々に自然界に存在する部分を含むアミノ酸配列を持つ（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分など、二つ以上の異なる生物からのもの）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、それが人の手の作用を通して、設計および／または生産されるという点で、遺伝子操作されたアミノ酸配列を持つ。一部の実施形態では、ポリペプチドは、複数のフラグメントを含有してもよく、または複数のフラグメントからなっていてもよく、それらフラグメントの各々は、対象のポリペプチドに見られる場合とは相互に異なる空間配置で同一の親ポリペプチドに見られるものであり（例えば、親ポリペプチドでは直接連結されていたフラグメントが、対象のポリペプチドでは空間的に分離されている場合、もしくはその逆の場合もあり、および／またはフラグメントが、対象のポリペプチドにおいて親ポリペプチドとは異なる順序で存在している場合もある）、したがって、対象のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体となる。
組み換えとは、組み換え手段によって設計、操作、調製、発現、生成または単離された核酸および／またはポリペプチドを意味し、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ．，１９９７ ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２－７０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．，ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３７１－３７８；Ａｚｚａｚｙ Ｈ．，ａｎｄ Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ Ｗ．Ｅ．，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５－４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．，２００２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８－１４５）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５；Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：３６４－３７０；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ Ｌ．Ｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５９３－５９７；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３－５１５８を参照のこと、その各々が、その全体が参照により本明細書に援用される）、または選択された配列要素の相互スプライシングを伴うその他の任意の手段によって調製、発現、生成もしくは単離されたポリペプチドを意味する。
一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上は自然界に存在する。一部の実施形態では、このような選択された配列要素の一つ以上はインシリコで設計される。一部の実施形態では、一つ以上のこのような選択配列要素は、例えば、天然または合成起源の既知の配列要素の変異誘導（例えば、インビボまたはインビトロ）から生じる。例えば、一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、対象のソース生物体（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノム（またはポリペプチド）に見られる配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、二つの異なる生物体（例えば、ヒトおよび非ヒト生物体）において相互に別々に自然界で生じる（すなわち、例えば、ヒトおよび非ヒト部分などの二つ以上の異なる生物体に由来する）配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、変異誘導（例えば、非ヒト動物での、インビトロまたはインビボ）から生じるアミノ酸配列を持ち、したがって、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列に由来しかつポリペプチド配列に関連するが、インビボで非ヒト動物のゲノム内に自然には存在しない可能性がある配列である。
参照とは、対象の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値が比較される、標準または対照の剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を指す。「参照」または「対照」とは、「参照動物」または「対照動物」を指す場合もある。「参照動物」は本明細書に記述された改変、本明細書に記述されたものとは異なる改変を持つか、または未改変（すなわち、野生型動物）である場合がある。一般的には、当業者には理解されるであろうように、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、動物（例えば、哺乳類）、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値を決定または特徴付けるために利用されるものと同等の条件下で決定または特徴付けられる。
一部の実施形態では、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、対象の薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値の試験または算出と実質的に同時に試験および／または算出される。一部の実施形態では、参照薬剤、動物、コホート、個人、集団、サンプル、配列または値は、場合により、有形媒体で具現化された公知の参照である。一部の実施形態では、参照とは、対照を指す場合がある。「ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照」など、例えば参照動物としての「対照ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）」または「対照」とは、ヒト化重鎖およびカッパ可変領域座位を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを指し、この場合において当該マウスは交配することができる。これらのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１ ：５１４７～５２および補足情報において概説されている。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
体細胞組み換えとは、免疫グロブリン重鎖座位でのＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントの組み換え、または免疫グロブリン軽鎖座位でのＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの組み換えを指す。体細胞組み換えは、骨髄中でのＢ細胞の発生中の抗原接触の前に発生する。重鎖座位では、Ｄ－Ｊ結合と呼ばれるプロセスにおいて一つのＤＨと一つのＪＨが無作為に再結合され、全ての介在ＤＮＡは除去される。次に、無作為なＶＨセグメントが、再構成されたＤＨＪＨセグメントに再結合される。免疫グロブリン軽鎖座位での組み換えも同様の方法で起こる。Ｖ－Ｊ結合と呼ばれるプロセス中にＶＬ遺伝子セグメントとＪＬ遺伝子セグメントが結合され、再結合されて、それらの間のすべてのＤＮＡが除去される。
実質的に、とは、対象となる特徴または特性の完全またはほぼ完全な範囲または程度を示す定性的条件を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象はあったとしても、完了まで進む、および／または完全な状態まで進行する、または絶対的な結果を達成または避けることは稀であることを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性をとらえるために使用される。
実質的な相同性とは、アミノ酸配列または核酸配列間の類似を意味する。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある。あるいは、相同残基は、適度に類似した構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基であってもよい。例えば、当業者には公知であるように、一般的には特定のアミノ酸は「疎水性」もしくは「親水性」のアミノ酸として分類され、および／または「極性」もしくは「非極性」の側鎖を持つものとして分類される。しばしば一つのアミノ酸と、同タイプの別のアミノ酸との置換は、「相同的な」置換とみなされ得る。一般的なアミノ酸分類が下記に要約される。
Figure 2024501286000002
Figure 2024501286000003
当技術分野で公知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０－８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．およびＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８に記載されている。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは典型的には相同性の程度の指標を提供する。
一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも９５％以上が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９個以上の残基である。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿って不連続な残基を含み、例えばポリペプチドまたはその一部のフォールディングされた構造により引き合わされた非隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０個以上の残基である。
実質的な同一性とは、アミノ酸または核酸配列間の類似を意味する。当業者であれば理解するように、二つの配列は、対応する位置で同一の残基を含有する場合、概して「実質的に同一である」とみなされる。当技術分野で公知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０－８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．およびＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；ａｎｄ Ｍｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８に記載されている。同一配列を特定することに加えて、上述のプログラムは典型的には同一性の程度の指標を提供する。
一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも９５％以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０個以上の残基である。
標的化ベクターまたは標的化構築物とは、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を意味する。標的化領域は、標的細胞、組織または動物の配列と同一または実質的に同一の配列を含み、相同組換えにより、標的化構築物を、細胞、組織または動物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用して標的とする標的化領域も含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の標的化構築物は、特に対象となる核酸配列または遺伝子と、選択可能マーカーと、制御配列およびまたは調整配列と、こうした配列が関与する組み換えを補助または促進するタンパク質を外部から付加することにより仲介する組み換えを可能にする、その他の核酸配列とをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象の遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする異種遺伝子である。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は対象のヒト化遺伝子の全部または一部をさらに含み、対象のヒト化遺伝子は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を持つポリペプチドの全部または一部をコードする。一部の実施形態では、標的化構築物（または標的化ベクター）は、人の手によって操作された核酸配列を含み得る。例えば一部の実施形態では、標的化構築物（または標的化ベクター）は、自然界での状態では互いに結合されていないが、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドにおいて互いに直接結合されるように人の手により操作されている二つ以上の配列を含む、操作されたポリヌクレオチドまたは組み換えポリヌクレオチドを含むように構築され得る。
導入遺伝子または導入遺伝子構築物とは、ヒトの手を用いて（例えば、本明細書に記載の方法を用いて）細胞に導入された核酸配列（例えば、対象のポリペプチドの全部または一部をコードする配列）を意味する。導入遺伝子は、部分的または全体的に異種、すなわち、導入されるトランスジェニック動物または細胞に対して外来性であってもよい。導入遺伝子は、例えばイントロンまたはプロモーターなどの一つ以上の転写制御配列と、任意の他の核酸とを含む場合があり、それらは選択された核酸配列の発現に必要になり得る。導入遺伝子は、導入遺伝子を取り込んだ子孫（例えば、細胞）のその後の選択を可能にする一つ以上の選択マーカーを含み得る。
トランスジェニック動物、トランスジェニック非ヒト動物、またはＴｇ＋は、本明細書において相互交換可能に使用され、任意の非天然非ヒト動物を意味し、非ヒト動物の細胞の一つ以上が、対象のポリペプチドの全部または一部をコードする、異種核酸および／または遺伝子を含有している。
一部の実施形態では、異種核酸配列および／または遺伝子は、例えばマイクロインジェクションを用いるか、または組み換えウイルスによる感染を用いるなどの計画的な遺伝子操作を介した前駆細胞への導入によって、直接的または間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は、伝統的な交配技術を含めずに、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入を対象にするものである。この分子は、染色体内に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。「Ｔｇ＋」という用語には、異種核酸および／もしくは遺伝子に対してヘテロ接合性もしくはホモ接合性である動物、ならびに／または異種核酸および／または遺伝子の単一コピーもしくは多コピーを有する動物が含まれる。
標的化ベクターとは、特に、別の核酸分子、例えば、ドナープラスミド、非ヒト動物ゲノムなどに、対象核酸の標的化挿入を行うことを目的として、関連付けられた対象核酸を輸送することができる核酸分子を指す。
一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製を行うことができ、ならびに／または、真核細胞および／もしくは原核細胞などの宿主細胞中で連結された核酸を発現することができる。動作可能に連結された遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書において、「発現ベクター」または「構築物」と呼称される。
野生型は、（変異、罹患、操作または変更などとは対照をなす）「正常」な性質で存在する構造および／または活性を有する実体を指す、当分野で公知の意味を有する。当業者であれば、野生型の遺伝子およびポリペプチドは複数の異なる形態（例えば、アレル）で存在することが多いことを理解するであろう。
本発明の他の特徴、目的および利益は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明で明らかである。しかし、詳細な説明は、本発明のいくつかの実施形態を示しているが、それらは例示の目的で提示されているものであり、限定を目的として提示されていないことを理解されたい。本発明の範囲内のさまざまな変更および修正は、発明を実施するための形態から当業者には明らかとなるであろう。
［発明を実施するための形態］
抗体ベースの治療剤は、いくつかの疾患の治療において大きな希望を与えたが、厄介な標的に結合する特に有効な抗体剤の開発は依然として課題である。本明細書において、アンカー改変型免疫グロブリン（Ｉｇ）、およびそれをコードする改変Ｉｇ ＶＩｇ Ｖセグメントが記述され、ここで当該アンカーは、同族受容体に結合するリガンド（例えば、非免疫グロブリンポリペプチド）の少なくとも受容体結合部分を含む。改変Ｉｇ Ｖセグメントを備える動物は、当該アンカーに対して同族の受容体を用いた免疫化に反応して、多様なアンカー改変型免疫グロブリンのレパートリーを産生し得る。
理論に拘束されるものではないが、アンカーは、例えば、同族受容体に特異的に結合する抗体と同時に同族受容体に結合し、および／または当該同族受容体を用いた抗原チャレンジに反応して、当該アンカーがなければ通常では拡張されないであろう抗体のアフィニティ成熟を発生させることにより、同族受容体を用いた抗原チャレンジに反応した動物において新たに生成される抗体のアフィニティを増大するように作用する。したがって、本明細書に開示される非ヒト動物により産生される免疫グロブリンの多様なレパートリーは、高アフィニティで同族受容体に結合するアンカー改変型免疫グロブリンが含まれ、それによって、過去では厄介であった標的に対するリード候補物が発見される可能性がある免疫グロブリン集団が増加する。
標的化ベクターおよび動物ゲノムなどを含む核酸分子
本明細書に記載されるアンカー改変型免疫グロブリンは、少なくとも部分的に、Ｉｇリーダー配列、ならびに生殖系列のＩｇ Ｖセグメントのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）の間に、およびそれらと動作可能な連結でアンカーをコードするように改変された、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖可変領域（ＶＨ）セグメントまたは軽鎖可変領域（ＶＬ）セグメントなどの可変領域（Ｖ）セグメントによってコードされてもよい。免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドをコードする核酸配列、および生殖系列Ｖセグメント、例えばヒト生殖系列Ｖセグメントの核酸配列は、当分野で公知であり、またコードされるアミノ酸配列も同様である。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．－Ｐ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１８，１００－１１６（２００１）を参照のこと。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。またはウェブ（ｗｗｗ）のｉｍｇｔ．ｏｒｇのアドレスで閲覧されるウェブサイトも参照のこと。
標的化ベクターを含む核酸分子、および本明細書に記載される動物ゲノムは、生殖系列Ｖセグメントの任意のＩｇシグナルペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。一部の実施形態では、改変Ｉｇ Ｖセグメントは、第一の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントのシグナルペプチドをコードする核酸配列、アンカーをコードする核酸配列、ならびに第二の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３をコードする核酸を含み、この場合において当該第一の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントおよび第二の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントは、異なる生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントである。一部の実施形態では、改変Ｉｇ Ｖセグメントは、第一の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントのシグナルペプチドをコードする核酸配列、アンカーをコードする核酸配列、ならびに第二の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３をコードする核酸を含み、この場合において当該第一の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントおよび第二の生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントは、同じ生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントである。一部の実施形態では、Ｉｇシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号７）を含む。
ヒト（ｈ）生殖系列Ｖセグメント（例えば、ヒト生殖系列可変重鎖（ｈＶＨまたはｈＩＧＶＨ）セグメント、ヒト生殖系列可変カッパ（ｈＶκまたはｈＩＧＫＶ）セグメント、およびヒト生殖系列可変ラムダ（ｈＶλまたはｈＩＧＬＶ）セグメント）のアミノ酸配列、およびマウス（ｍ）生殖系列Ｖセグメント（例えば、マウス生殖系列可変重鎖（ｍＶＨまたはｍＩＧＶＨ）セグメント、マウス生殖系列可変カッパ（ｍＶκまたはｍＩＧＫＶ）セグメントおよびマウス生殖系列可変ラムダ（ｍＶλまたはｍＩＧＬＶ）セグメント）のアミノ酸配列は、ウェブ（ｗｗｗ）アドレスのｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｏｇｏｓ／ｈｕｍａｎ／ およびｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｏｇｏｓ／ｍｏｕｓｅ／で閲覧可能であり、それら各々は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアント（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶセグメントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードするバリアント）は、ヒト（ｈ）生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントであり、例えば、生殖系列ヒト（ｈ）ＶＨ１－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１ １８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－２４セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４５セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４６セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－５８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－６９セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－２６セグメント、生殖系列ｈＶＨ２ ７０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３ １１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３ １３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－５３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６４セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７２セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－２８セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４ ３０－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－５９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－６１セグメント、生殖系列ｈＶＨ５－５１セグメント、生殖系列ｈＶＨ６－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－４－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－８１セグメント、またはそのバリアントである。一部の実施形態では、生殖系列のＩｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列のｈＶＨ１－６９セグメントまたはそのバリアントである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、改変Ｉｇ ｈＶＨセグメントのみを含み、例えば、いかなる追加のｈＶＨセグメントまたはそのバリアントも含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、改変Ｉｇ ｈＶＨセグメントに加えて、追加のｈＶＨセグメント、例えば、ＶＨ１－２、ｈＶＨ１－３、ｈＶＨ１－８、ｈＶＨ１ １８、ｈＶＨ１－２４、ｈＶＨ１－４５、ｈＶＨ１－４６、ｈＶＨ１－５８、ｈＶＨ１－６９、ｈＶＨ２－５、ｈＶＨ２－２６、ｈＶＨ２ ７０、ｈＶＨ３－７、ｈＶＨ３－９、ｈＶＨ３ １１、ｈＶＨ３ １３、ｈＶＨ３－１５、ｈＶＨ３－１６、ｈＶＨ３－２０、ｈＶＨ３－２１、ｈＶＨ３－２３、ｈＶＨ３－３０、ｈＶＨ３－３０－３、ｈＶＨ３－３０－５、ｈＶＨ３－３３、ｈＶＨ３－３５、ｈＶＨ３－３８、ｈＶＨ３－４３、ｈＶＨ３－４８、ｈＶＨ３－４９、ｈＶＨ３－５３、ｈＶＨ３－６４、ｈＶＨ３－６６、ｈＶＨ３－７２、ｈＶＨ３－７３、ｈＶＨ３－７４、ｈＶＨ４－４、ｈＶＨ４－２８、ｈＶＨ４－３０－１、ｈＶＨ４ ３０－２、ｈＶＨ４－３０－４、ｈＶＨ４－３１、ｈＶＨ４－３４、ｈＶＨ４－３９、ｈＶＨ４－５９、ｈＶＨ４－６１、ｈＶＨ５－５１、ｈＶＨ６－１、ｈＶＨ７－４－１、ｈＶＨ７－８１、およびそのバリアントのうちの一つ、複数、または各々をさらに含む。ＶＨ１－２、ｈＶＨ１－３、ｈＶＨ１－８、ｈＶＨ１ １８、ｈＶＨ１－２４、ｈＶＨ１－４５、ｈＶＨ１－４６、ｈＶＨ１－５８、ｈＶＨ１－６９、ｈＶＨ２－５、ｈＶＨ２－２６、ｈＶＨ２ ７０、ｈＶＨ３－７、ｈＶＨ３－９、ｈＶＨ３ １１、ｈＶＨ３ １３、ｈＶＨ３－１５、ｈＶＨ３－１６、ｈＶＨ３－２０、ｈＶＨ３－２１、ｈＶＨ３－２３、ｈＶＨ３－３０、ｈＶＨ３－３０－３、ｈＶＨ３－３０－５、ｈＶＨ３－３３、ｈＶＨ３－３５、ｈＶＨ３－３８、ｈＶＨ３－４３、ｈＶＨ３－４８、ｈＶＨ３－４９、ｈＶＨ３－５３、ｈＶＨ３－６４、ｈＶＨ３－６６、ｈＶＨ３－７２、ｈＶＨ３－７３、ｈＶＨ３－７４、ｈＶＨ４－４、ｈＶＨ４－２８、ｈＶＨ４－３０－１、ｈＶＨ４ ３０－２、ｈＶＨ４－３０－４、ｈＶＨ４－３１、ｈＶＨ４－３４、ｈＶＨ４－３９、ｈＶＨ４－５９、ｈＶＨ４－６１、ｈＶＨ５－５１、ｈＶＨ６－１、ｈＶＨ７－４－１、およびｈＶＨ７－８１セグメントのうちの複数、または各々を含む一部の実施形態では、ｈＶＨセグメントは、生殖系列の配置である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、Ｉｇ重鎖可変領域を含んでもよく、例えば、アンカー改変型Ｖセグメントに加えて追加の（非）再構成されたＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントを含んでもよく、一部の実施形態では、追加の（非）再構成されたｈＶＨ、ｈＤＨおよび／またはｈＪＨ遺伝子セグメントを含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、（非）再構成されたｈＶＨセグメントを一つのみ、（非）再構成されたｈＤＨセグメントを一つ以上、および（非）再構成されたｈＪＨセグメントを一つ以上を含み、この場合において当該一つのみの（非）再構成されたｈＶＨセグメントは、本明細書に記載されるアンカーをコードする核酸配列を含む改変ｈＶＨセグメントである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組み換え核酸（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、一つ以上のヒトＤＨセグメントを含み、例えば、ｈＤＨ１－１、ｈＤＨ１－７、ｈＤＨ１－１４、ｈＤＨ１－２０、ｈＤＨ１－２６、ｈＤＨ２－２、ｈＤＨ２－８、ｈＤＨ２－１５、ｈＤＨ２－２１、ｈＤＨ３－３、ｈＤＨ３－９、ｈＤＨ３－１０、ｈＤＨ３－１６、ｈＤＨ３－２２、ｈＤＨ４－４、ｈＤＨ４－１１、ｈＤＨ４－１７、ｈＤＨ４－２３、ｈＤＨ５－５、ｈＤＨ５－１２、ｈＤＨ５－１８、ｈＤＨ５－２４、ｈＤＨ６－６、ｈＤＨ６－１３、ｈＤＨ６－１９、ｈＤＨ６－２５、ｈＤＨ７－２７、およびそれらのバリアントの内の一つ、複数、またはそれぞれを含む。一部の実施形態では、ｈＤＨ１－１、ｈＤＨ１－７、ｈＤＨ１－１４、ｈＤＨ１－２０、ｈＤＨ１－２６、ｈＤＨ２－２、ｈＤＨ２－８、ｈＤＨ２－１５、ｈＤＨ２－２１、ｈＤＨ３－３、ｈＤＨ３－９、ｈＤＨ３－１０、ｈＤＨ３－１６、ｈＤＨ３－２２、ｈＤＨ４－４、ｈＤＨ４－１１、ｈＤＨ４－１７、ｈＤＨ４－２３、ｈＤＨ５－５、ｈＤＨ５－１２、ｈＤＨ５－１８、ｈＤＨ５－２４、ｈＤＨ６－６、ｈＤＨ６－１３、ｈＤＨ６－１９、ｈＤＨ６－２５、およびｈＤＨ７－２７のうちの複数、またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＤＨセグメントは、生殖系列の配置にある。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組み換え核酸（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、一つ以上のヒトＪＨセグメントを含み、例えば、ｈＪＨ１、ｈＪＨ２、ｈＪＨ３、ｈＪＨ４、ｈＪＨ５、ｈＪＨ６、およびそれらのバリアントのうちの一つ、複数、またはそれぞれを含む。ｈＪＨ１、ｈＪＨ２、ｈＪＨ３、ｈＪＨ４、ｈＪＨ５、およびｈＪＨ６セグメントのうちの複数またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＪＨセグメントは、生殖系列の配置にある。
一部の実施形態では、組換え核酸分子（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、重鎖可変領域の座位を含んでもよく、例えば、動作可能な連結で、５’から３’に向かって以下を含んでもよい：（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＨセグメント、（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖多様性（ＤＨ）セグメント、および（ＩＩＩ）一つまたは複数のすべてのＩｇ重鎖結合（ＪＨ）セグメント。一部の実施形態では、（ＩＩ）のＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数は、ヒトＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つ、複数の、またはすべてを含み、および／または（ＩＩＩ）のＩｇ ＪＨセグメントのうちの一つまたは複数は、ヒトＩｇ ＪＨセグメントのうちの一つ、複数、またはすべてを含む。一部の実施形態では、（ＩＩ）のＩｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数、および（ＩＩＩ）のＩｇ ＪＨ遺伝子セグメントのうちの一つまたは複数が、組み替えられ、再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列を形成する。それにより、組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって以下を含む：改変されたＩｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列。
一部の実施形態では、Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および再構成されたＩｇ ＤＨ／ＪＨ配列が組み替えられ、再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、当該配列がアンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインをコードする。この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインは、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、および（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされるＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ１）、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む。
一部の実施形態では、改変されたＩｇ ＶＨセグメントは、再構成されていない改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される組み換え核酸（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、Ｉｇ重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列をさらに含み、この場合においてＩｇ ＣＨをコードする核酸配列は、（Ｉ）改変されたＩｇ ＶＨセグメント、（ＩＩ）Ｉｇ ＤＨセグメントのうちの一つまたは複数、および（ＩＩＩ）Ｉｇ ＪＨセグメントのうちの一つまたは複数、の下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される。一部の実施形態では、核酸配列はＩｇ ＣＨをコードし、ＩｇＭアイソタイプをコードするＩｇμ遺伝子、ＩｇＤアイソタイプをコードするＩｇδ遺伝子、ＩｇＧアイソタイプをコードするＩｇγ遺伝子、ＩｇＡアイソタイプをコードするＩｇα遺伝子、および／またはＩｇＥアイソタイプをコードするＩｇε遺伝子を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、アンカー改変型Ｉｇ重鎖をコードする核酸配列を含み、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ重鎖は、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によりコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ重鎖可変ドメイン、ならびに（ｉｖ）Ｉｇ ＣＨ、を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ ＣＨは、非ヒトＩｇ ＣＨ、例えば齧歯類のＩｇ ＣＨ、例えばラットのＩｇ ＣＨまたはマウスのＩｇ ＣＨである。
一部の実施形態では、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアント（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶセグメントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３をコードするバリアント）は、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変（ＶＬ）セグメントまたはそのバリアントである。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、軽鎖可変領域の座位を含んでもよく、例えば、動作可能な連結で、５’から３’に向かって以下を含んでもよい：（Ｉ）改変されたＩｇ ＶＬセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、改変されたＩｇ ＶＬセグメント、およびＩｇ ＪＬセグメントのうちの一つまたは複数が組み替えられ、再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列を形成する。当該配列は、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインをコードし、この場合において当該アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインは、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、および（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、軽鎖可変領域座位、およびＩｇ軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列を含んでもよく、この場合において当該Ｉｇ ＣＬをコードする核酸配列は、以下の下流にあり、それらに動作可能に連結されている：（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖は、動作可能な連結で、（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、（ｉｉ）アンカー、（ｉｉｉ）再構成されたＩｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ軽鎖可変ドメイン、および（ｉｖ）Ｉｇ ＣＬ、を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ ＣＬは、非ヒトＩｇ ＣＬ、例えば齧歯類のＩｇ ＣＬ、例えばラットのＩｇ ＣＬまたはマウスのＩｇ ＣＬである。
一部の実施形態では、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアント（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶセグメントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードするバリアント）は、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変カッパ（Ｖκ）セグメントまたはそのバリアントであり、例えば、ヒトＶκセグメントであり、例えば、ｈＶκ１－５セグメント、ｈＶκ １－６セグメント、ｈＶκ１－８セグメント、ｈＶκ１Ｄ－８セグメント、ｈＶκ１－９セグメント、ｈＶκ１－１２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１２セグメント、ｈＶκ１－１３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１３セグメント、ｈＶκ１－１６セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１６セグメント、ｈＶκ１－１７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１７セグメント、ｈＶκ１－２７セグメント、ｈＶκ１－３３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３３セグメント、ｈＶκ１－３７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３７セグメント、ｈＶκ１－３９セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３９，ａ ｈＶκ１－ＮＬ１セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４３セグメント、ｈＶκ２－４セグメント、ｈＶκ２－１８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－１８セグメント、ｈＶκ２－２４セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２４セグメント、ｈＶκ２－２８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２８セグメント、ｈＶκ２－２９セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２９セグメント、ｈＶκ２－３０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－３０セグメント、ｈＶκ２－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２６セグメント、ｈＶκ３－７セグメント、ｈＶκ３Ｄ－７セグメント、ｈＶκ３－１１セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１１セグメント、ｈＶκ３－１５セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１５セグメント、ｈＶκ３－２０セグメント、ｈＶκ３Ｄ－２０セグメント、ｈＶκ４－１セグメント、ｈＶκ５－２セグメント、ｈＶκ６－２１セグメント、ｈＶκ６Ｄ－２１セグメント、ｈＶκ６Ｄ－４１セグメント、ｈＶκ７－３セグメントおよびそれらのバリアントである。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、改変Ｉｇ ｈＶκセグメントに加えて追加のｈＶκセグメントをさらに含み、例えば、ｈＶκ１Ｄ－８セグメント、ｈＶκ１－９セグメント、ｈＶκ１－１２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１２セグメント、ｈＶκ１－１３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１３セグメント、ｈＶκ１－１６セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１６セグメント、ｈＶκ１－１７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１７セグメント、ｈＶκ１－２７セグメント、ｈＶκ１－３３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３３セグメント、ｈＶκ１－３７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３７セグメント、ｈＶκ１－３９セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３９，ａ ｈＶκ１－ＮＬ１セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４３セグメント、ｈＶκ２－４セグメント、ｈＶκ２－１８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－１８セグメント、ｈＶκ２－２４セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２４セグメント、ｈＶκ２－２８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２８セグメント、ｈＶκ２－２９セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２９セグメント、ｈＶκ２－３０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－３０セグメント、ｈＶκ２－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２６セグメント、ｈＶκ３－７セグメント、ｈＶκ３Ｄ－７セグメント、ｈＶκ３－１１セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１１セグメント、ｈＶκ３－１５セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１５セグメント、ｈＶκ３－２０セグメント、ｈＶκ３Ｄ－２０セグメント、ｈＶκ４－１セグメント、ｈＶκ５－２セグメント、ｈＶκ６－２１セグメント、およびｈＶκ６Ｄ－２１セグメントのうちの一つ、複数、またはそれぞれをさらに含む。ｈＶκ１Ｄ－８セグメント、ｈＶκ１－９セグメント、ｈＶκ１－１２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１２セグメント、ｈＶκ１－１３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１３セグメント、ｈＶκ１－１６セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１６セグメント、ｈＶκ１－１７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－１７セグメント、ｈＶκ１－２７セグメント、ｈＶκ１－３３セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３３セグメント、ｈＶκ１－３７セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３７セグメント、ｈＶκ１－３９セグメント、ｈＶκ１Ｄ－３９，ａ ｈＶκ１－ＮＬ１セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４２セグメント、ｈＶκ１Ｄ－４３セグメント、ｈＶκ２－４セグメント、ｈＶκ２－１８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－１８セグメント、ｈＶκ２－２４セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２４セグメント、ｈＶκ２－２８セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２８セグメント、ｈＶκ２－２９セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２９セグメント、ｈＶκ２－３０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－３０セグメント、ｈＶκ２－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－４０セグメント、ｈＶκ２Ｄ－２６セグメント、ｈＶκ３－７セグメント、ｈＶκ３Ｄ－７セグメント、ｈＶκ３－１１セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１１セグメント、ｈＶκ３－１５セグメント、ｈＶκ３Ｄ－１５セグメント、ｈＶκ３－２０セグメント、ｈＶκ３Ｄ－２０セグメント、ｈＶκ４－１セグメント、ｈＶκ５－２セグメント、ｈＶκ６－２１セグメント、およびｈＶκ６Ｄ－２１セグメントのうちの複数またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＶκセグメントは、生殖系列の配置にある。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、Ｉｇ軽鎖κ可変領域を含んでもよく、例えば、アンカー改変型ｈＶκセグメントに加えて追加の（非）再構成されたＪκセグメントを含んでもよく、一部の実施形態では、追加の（非）再構成されたｈＪκ遺伝子セグメントを含んでもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖκセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合カッパＪκセグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、本明細書に記載の組み換え核酸（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、一つ以上のヒトＪκセグメントを含み、例えば、ｈＪκ１、ｈＪκ２、ｈＪκ３、ｈＪκ４、ｈＪκ５、およびそれらのバリアントのうちの一つ、複数、またはそれぞれを含む。ｈＪκ１、ｈＪκ２、ｈＪκ３、ｈＪκ４、ｈＪκ５セグメントのうちの複数またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＪκセグメントは、生殖系列の配置にある。
さらに一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖκセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ 軽鎖結合カッパ（Ｊκ）のうちの一つまたは複数、およびＩｇ軽鎖定常カッパ領域（Ｃκ）をコードする核酸配列。
一部の実施形態では、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアント（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶセグメントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードするバリアント）は、生殖系列のＩｇ軽鎖可変ラムダ（Ｖλ）セグメントまたはそのバリアントであり、例えばヒトＶλセグメントであり、例えば、ｈＶλ１－３６セグメント、ｈＶλ１－４０セグメント、ｈＶλ１－４１セグメント、ｈＶλ１－４４セグメント、ｈＶλ１－４７セグメント、ｈＶλ１－５０セグメント、ｈＶλ１－５１セグメント、ｈＶλ１－６２セグメント、ｈＶλ２－５セグメント、ｈＶλ２－８セグメント、ｈＶλ２－１１セグメント、ｈＶλ２－１４セグメント、ｈＶλ２－１８セグメント、ｈＶλ２－２３セグメント、ｈＶλ２－３３セグメント、ｈＶλ２－３４セグメント、ｈＶλ３－１セグメント、ｈＶλ３－９セグメント、ｈＶλ３－１０セグメント、ｈＶλ３－１２セグメント、ｈＶλ３－１３セグメント、ｈＶλ３－１６セグメント、ｈＶλ３－１９セグメント、ｈＶλ３－２１セグメント、ｈＶλ３－２２セグメント、ｈＶλ３－２５セグメント、ｈＶλ３－２７セグメント、ｈＶλ３－３１セグメント、ｈＶλ３－３２セグメント、ｈＶλ４－３セグメント、ｈＶλ４－６０セグメント、ｈＶλ４－６９セグメント、ｈＶλ５－３７セグメント、ｈＶλ５－３９セグメント、ｈＶλ５－４５セグメント、ｈＶλ５－４８セグメント、ｈＶλ５－５２セグメント、ｈＶλ６－５７セグメント、ｈＶλ７－４３セグメント、ｈＶλ７－４６セグメント、ｈＶλ８－６１セグメント、ｈＶλ９－４９セグメント、ｈＶλ１０－５４セグメント、ｈＶλ１１－５５セグメント、およびそれらのバリアントである。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸分子は、改変Ｉｇ ｈＶλセグメントに加えて、追加のｈＶλセグメントをさらに含み、例えば、ｈＶλ１－３６セグメント、ｈＶλ１－４０セグメント、ｈＶλ１－４１セグメント、ｈＶλ１－４４セグメント、ｈＶλ１－４７セグメント、ｈＶλ１－５０セグメント、ｈＶλ１－５１セグメント、ｈＶλ１－６２セグメント、ｈＶλ２－５セグメント、ｈＶλ２－８セグメント、ｈＶλ２－１１セグメント、ｈＶλ２－１４セグメント、ｈＶλ２－１８セグメント、ｈＶλ２－２３セグメント、ｈＶλ２－３３セグメント、ｈＶλ２－３４セグメント、ｈＶλ３－１セグメント、ｈＶλ３－９セグメント、ｈＶλ３－１０セグメント、ｈＶλ３－１２セグメント、ｈＶλ３－１３セグメント、ｈＶλ３－１６セグメント、ｈＶλ３－１９セグメント、ｈＶλ３－２１セグメント、ｈＶλ３－２２セグメント、ｈＶλ３－２５セグメント、ｈＶλ３－２７セグメント、ｈＶλ３－３１セグメント、ｈＶλ３－３２セグメント、ｈＶλ４－３セグメント、ｈＶλ４－６０セグメント、ｈＶλ４－６９セグメント、ｈＶλ５－３７セグメント、ｈＶλ５－３９セグメント、ｈＶλ５－４５セグメント、ｈＶλ５－４８セグメント、ｈＶλ５－５２セグメント、ｈＶλ６－５７セグメント、ｈＶλ７－４３セグメント、ｈＶλ７－４６セグメント、ｈＶλ８－６１セグメント、ｈＶλ９－４９セグメント、ｈＶλ１０－５４セグメント、およびｈＶλ１１－５５セグメントのうちの一つ、複数またはそれぞれをさらに含む。ｈＶλ１－３６セグメント、ｈＶλ１－４０セグメント、ｈＶλ１－４１セグメント、ｈＶλ１－４４セグメント、ｈＶλ１－４７セグメント、ｈＶλ１－５０セグメント、ｈＶλ１－５１セグメント、ｈＶλ１－６２セグメント、ｈＶλ２－５セグメント、ｈＶλ２－８セグメント、ｈＶλ２－１１セグメント、ｈＶλ２－１４セグメント、ｈＶλ２－１８セグメント、ｈＶλ２－２３セグメント、ｈＶλ２－３３セグメント、ｈＶλ２－３４セグメント、ｈＶλ３－１セグメント、ｈＶλ３－９セグメント、ｈＶλ３－１０セグメント、ｈＶλ３－１２セグメント、ｈＶλ３－１３セグメント、ｈＶλ３－１６セグメント、ｈＶλ３－１９セグメント、ｈＶλ３－２１セグメント、ｈＶλ３－２２セグメント、ｈＶλ３－２５セグメント、ｈＶλ３－２７セグメント、ｈＶλ３－３１セグメント、ｈＶλ３－３２セグメント、ｈＶλ４－３セグメント、ｈＶλ４－６０セグメント、ｈＶλ４－６９セグメント、ｈＶλ５－３７セグメント、ｈＶλ５－３９セグメント、ｈＶλ５－４５セグメント、ｈＶλ５－４８セグメント、ｈＶλ５－５２セグメント、ｈＶλ６－５７セグメント、ｈＶλ７－４３セグメント、ｈＶλ７－４６セグメント、ｈＶλ８－６１セグメント、ｈＶλ９－４９セグメント、ｈＶλ１０－５４セグメント、およびｈＶλ１１－５５セグメントのうちの複数またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＶλセグメントは、生殖系列の配置にある。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、Ｉｇ軽鎖λ可変領域を含んでもよく、例えば、アンカー改変型ｈＶλセグメントに加えて追加の（非）再構成されたＪλセグメントを含んでもよく、一部の実施形態では、追加の（非）再構成されたｈＪκλ伝子セグメントを含んでもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、および５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖλセグメント、および（ＩＩ）Ｉｇ軽鎖結合カッパＪλセグメントのうちの一つまたは複数。一部の実施形態では、本明細書に記載の組み換え核酸（例えば、標的化ベクター、非ヒト動物ゲノムなど）は、一つ以上のヒトＪλセグメントを含み、例えば、ｈＪλ１、ｈＪλ２、ｈＪλ３、ｈＪλ４、ｈＪλ５、ｈＪλ６、ｈＪλ７セグメント、およびそれらのバリアントのうちの一つ、複数、またはそれぞれを含む。ｈＪλ１、ｈＪλ２、ｈＪλ３、ｈＪλ４、ｈＪλ５、ｈＪλ６、ｈＪλ７セグメントのうちの複数またはそれぞれを含む一部の実施形態では、ｈＪλセグメントは、生殖系列の配置にある。一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、以下を含む：（Ｉ）改変されたＩｇ Ｖλセグメント、（ＩＩ）Ｉｇ 軽鎖結合ラムダ（Ｊλ）セグメントのうちの一つまたは複数、およびＩｇ軽鎖定常ラムダ領域（Ｃλ）をコードする核酸配列。
アンカー
本明細書に記載されるように、アンカーは、同族受容体に結合するリガンド（またはその一部）を含む。一部の実施形態では、リガンドは、非免疫グロブリンポリペプチドであってもよい。したがって、本明細書に記載されるように、アンカーは、非免疫グロブリンポリペプチドを含んでもよく、例えば、非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を含んでもよい。本明細書に記載のアンカー改変は、例えば抗体などの抗原結合タンパク質と、厄介な受容体とのアフィニティを増加させるのに有用であり得る。
例示的および公知の非免疫グロブリンポリペプチド：同族受容体のペアとしては限定されないが、例えば、同族Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合する非免疫グロブリンポリペプチドが挙げられる。ＧＰＣＲの例としては限定されないが、ケモカイン受容体、グルカゴン受容体（例えば、ＧＬＰ１：ＧＬＰ１Ｒ）、カルシトニン受容体、メラノコルチン受容体が挙げられる。同受容体に結合する非免疫グロブリンポリペプチドを含む、これら、および他の同族ＧＰＣＲは当分野で公知である。例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９：２７２６－４５を参照のこと。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。追加的な非限定的、および例示的な非免疫グロブリンポリペプチド（リガンド）：同族受容体のペアとしては、以下が挙げられる：
ａ．同族受容体のチロシンキナーゼに結合するリガンド、例えば限定されないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などのリガンド、
ｂ．ＤＬＬ：Ｎｏｔｃｈ受容体ペア、
ｃ．Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＬＴＡ４／ＰＤ１受容体ペア、
ｄ．セマフォリン：プレキシン（ｐｌｅｘｉｎ）受容体ペア、
ｅ．ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲペア、
ｆ．ＨＬＡ：ＬＩＬＲペア、
ｇ．ＨＬＡ：ＫＩＲペア、
ｈ．ＲＧＤ－リガンド：インテグリンペア、
ｉ．ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰなど）：ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ、ＮＰＲ３など）のペア。
リガンド：受容体ペアには、プロテアーゼと阻害剤も含まれ得る。
一部の実施形態では、アンカーにはナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）が含まれ、例えば、ＮＰの受容体結合部分が含まれる。ＮＰは、少なくとも八つの構造的に関連性のあるアミノ酸ペプチドを含み、以下の三種の異なるプロホルモンとして保存されている：心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）プロホルモン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）プロホルモン、およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）プロホルモン。近年、デンドロアスピス（ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドであるＤ型ナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）が発見され、ヒトにおけるその役割は未だ不明である。
ＡＮＰプロホルモン（ｐｒｏＡＮＰ）は、１２６アミノ酸のポリペプチドであり、主に心筋細胞によって発現され、血圧低下、ナトリウム利尿、利尿、および／またはカリウム利尿の性能を有するいくつかのペプチドを産生する。ＡＮＰプロホルモンに由来するこれらのペプチドは、ＡＮＰプロホルモンのＮ末端で始まるアミノ酸配列によって識別される。例えば特に、ｐｒｏＡＮＰ １－３０は、長時間作用型ＮＰを含み、ｐｒｏＡＮＰ ３１‐６７は、血管拡張性を備え、ｐｒｏＡＮＰ ７９－９８は、カリウム利尿ペプチドを含み、そしてアミノ酸９９－１２６がある（ＡＮＰとも呼ばれる）。腎臓内でｐｒｏＡＮＰは異なる処理を受けて、例えば、ｐｒｏＡＮＰ ９５－１２６（ウロジラチンとも呼ばれる）など、Ｎ末端に追加の４アミノ酸が付加される。
ＢＮＰプロホルモン（ｐｒｏＢＮＰ）は、１０８アミノ酸のポリペプチドであり、主に心筋細胞によって発現される。ＢＮＰプロホルモンは、ヒトの心臓内で処理を受けて、ＢＮＰ（例えば、その１０８アミノ酸のプロホルモンのアミノ酸７７～１０８）、およびＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ（例えば、アミノ酸１－７６、そのどちらもヒトで循環する）を形成する。ＢＮＰは、心室拡張の信頼性のあるバイオマーカーである。Ｐａｎｄｉｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｉｎｄ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１５（４）Ｓ３４５－５３。当該文献は参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
ＡＮＰやＢＮＰとは異なり、ＣＮＰは主に内皮細胞および腎上皮細胞によって発現される。二種のＣＮＰ分子が循環中に同定されている。また、ＣＮＰはナトリウム利尿機能を欠いているようであるが、ＣＮＰは、血管の緊張と、パラクライン様式またはオートクライン様式での増殖の調節因子として機能している可能性が高く、ＣＮＰが骨成長において役割を果たしている可能性があるといういくつかの兆候がある。
ＮＰは、細胞表面受容体に特異的に結合することによって生物学的機能を発揮する。哺乳動物組織において以下の三種の特異的受容体が同定されている：二種のグアニリルシクラーゼ結合受容体（ＧＣ－ＡおよびＧＣ－Ｂ、それぞれＮＰ受容体（ＮＰＲ）－ＡおよびＮＰＲ－Ｂとも呼称される）。ＮＰＲ－ＡおよびＮＰＲ－Ｂは、ｃＧＭＰ依存性シグナル伝達カスケードの活性化を介して作用する。対照的に第三のＣ型受容体（ＮＰＲ－Ｃとも呼称される）はグアニリルシクラーゼに結合されず、主にＮＰのクリアランスに関与すると考えられている。三種の受容体すべてが異なるアフィニティでＡＮＰ、ＢＮＰ、およびＣＮＰに結合する。ＧＣ－Ａに対するリガンド選択性のランク順位は、ＡＮＰ≧ＢＮＰ≫ＣＮＰであり、ＧＣ－ＢについてはＣＮＰ≫ＡＮＰ≧ＢＮＰであり、ＮＰＲ－ＣについてはＡＮＰ＞ＣＮＰ＞ＢＮＰである。Ｊａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＰＮＡＳ ９６（１８）１０２７８－２８３。当該文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
ＮＰ受容体は高血圧および心血管系疾患の治療に有用な標的であり得る。しかしながらＡＮＰおよびＢＮＰは、重要な利尿性能、ナトリウム利尿性能、および低血圧性能を有し、一方でＣＮＰは骨成長において役割を果たす可能性がある。そのため、ＮＰ受容体の抗体ベースの標的化はいずれもＮＰに対する受容体の差異的な結合アフィニティに留意しなければならない。
一部の実施形態では、アンカーは、ＡＮＰ配列またはその一部を含む。ヒトＡＮＰをコードする核酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００６１７２．４および本明細書において配列番号１として記載される。ヒトＡＮＰのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６１６３および本明細書において配列番号２として記載される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるアンカーは、ＡＮＰの受容体結合部分、例えば、ＡＮＰのＣ末端尾部を含む。一部の実施形態では、ＡＮＰの受容体結合部分は、アミノ酸配列のＮＳＦＲＹ（配列番号３）を含む。
リンカー
一部の実施形態では、アンカーはリンカーを含み、当該リンカーは、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を、生殖系列のＩｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３に連結する。一部の実施形態では、リンカーの長さは、１アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、２アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、３アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、４アミノ酸であってもよく、例えば、リンカーは、配列ＧＬＳＧ（配列番号１３）を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、５アミノ酸であってもよく、例えば、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、６アミノ酸であってもよく、例えば、配列ＧＬＳＧＳＧ（配列番号１４）を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、７アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＬＳＧＬＳＧＳ（配列番号１５）を含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、９アミノ酸であってもよい。一部の実施形態では、リンカーの長さは、１０アミノ酸であってもよく、例えば、配列ＧＬＳＧＬＳＧＬＳＧ（配列番号１６）または配列ＧＬＳＧＧＳＧＬＳＧ（配列番号１７）を含んでもよい。一部の実施形態では、第一および第二のリンカーは、長さにおいて同一であり、各々の長さは、１０アミノ酸よりも長い。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組換え核酸分子は、配列番号８として記載される配列もしくはその縮重バリアント、または配列番号１０もしくはその縮重バリアントを含む。
標的化ベクター
さらに本明細書に提供される遺伝子改変された非ヒト動物、細胞、組織または胚を作製するための方法に採用される標的化ベクターが提供される。
一つの実施形態では、例えば、５’および３’相同アームに隣接された本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む組換え核酸分子などの挿入核酸を含む標的化ベクターが提供され、当該アームは、例えばＩｇ重鎖または軽鎖可変領域座位などの対象の座位との相同組換えを行うことができる。標的化ベクター、および標的化ベクターの構成要素の例（すなわち、挿入核酸、対象ポリヌクレオチド、発現カセットなど）を、本明細書において以下に詳細に記述する。
相同アームと標的部位（すなわち、同族ゲノム領域）は、その二つの領域が充分なレベルの配列同一性を互いに共有し、相同組換え反応の基質として作用する場合に、互いに「相補体」または「相補的で」である。「相同性」とは、対応する配列または「相補的な」配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と、標的化ベクター上に存在する対応する相同アームとの間の配列同一性は、相同組換えが発生し得る任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば標的化ベクターの相同アーム（またはその断片）と標的部位（またはその断片）により共有される配列同一性の量は、当該配列が相同組換えを行うよう、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってもよい。さらに、相同アームと相補的な標的部位との間の相同性のある相補的領域は、切断された認識部位での相同組換えを促進するのに充分な任意の長さであってもよい。例えば所与の相同アームおよび／または相補的な標的部位は、細胞ゲノム内の対応する標的部位との相同組換えを行うのに充分な相同性を相同アームが有するように、長さが少なくとも５～１０ｋｂ、５～１５ｋｂ、１０～２０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～４０ｋｂ、４０～５０ｋｂ、５０～６０ｋｂ、６０～７０ｋｂ、７０～８０ｋｂ、８０～９０ｋｂ、９０～１００ｋｂ、１００～１１０ｋｂ、１１０～１２０ｋｂ、１２０～１３０ｋｂ、１３０～１４０ｋｂ、１４０～１５０ｋｂ、１５０～１６０ｋｂ、１６０～１７０ｋｂ、１７０～１８０ｋｂ、１８０～１９０ｋｂ、１９０～２００ｋｂ、２００ｋｂ～３００ｋｂ以上である相同性のある相補的領域を含んでもよい（例えば、本明細書で別段に記載されるベクターにおいて記載される）。参照を容易にするために、本明細書において相同アームは５’および３’相同アームと呼称される。当該専門用語は、標的化ベクター内の挿入核酸に対する相同アームの相対的な位置に関連する。
したがって、標的化ベクターの相同アームは、標的座位を有する標的部位に対して相補的であるように設計される。ゆえに相同アームは、細胞にとって天然の座位に対して相補的であってもよく、あるいは限定されないが導入遺伝子、発現カセット、またはゲノムＤＮＡの異種領域もしくは外来性領域をはじめとする、細胞ゲノム内に統合された異種または外来性のＤＮＡセグメントの領域に対して相補的であってもよい。あるいは標的化ベクターの相同アームは、ヒト人工染色体の領域に対して相補的であってもよく、または適切な宿主細胞中に含有される任意の他の操作されたゲノム領域に対して相補的であってもよい。さらに、標的化ベクターの相同アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、またはＰ１ファージライブラリーの領域に対して相補的であってもよく、またはそれらに由来してもよい。したがって特定の実施形態では、標的化ベクターの相同アームは、所与の細胞に対し天然である、異種である、または外来性である、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯類、マウスまたはラットのゲノム座位に対して相補的である。一つの実施形態において、相同アームは合成ＤＮＡに由来する。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターはさらに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメントおよび／またはＩｇ ＪＨセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべてまたはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。
一部の実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される組換え核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメント、Ｉｇ ＪＨセグメントおよび／またはＩｇ ＣＨ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、齧歯類または齧歯類細胞（例えば、齧歯類胚性幹細胞）中の内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、すべての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、すべての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する。
一部の実施形態では、５’相同アームは、配列番号１２として記載される配列を含み、および／または３’相同アームは、配列番号１３として記載される配列を含む。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、当該Ｉｇ軽鎖座位で非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメント、および／またはＩｇ ＣＬ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位が、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、当該Ｉｇ軽鎖κ座位で非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位が、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメント、および／またはＩｇ Ｃκ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該Ｉｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメント、すべてのＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する。
一部の標的化ベクターの実施形態では、標的化ベクターは本明細書に記載される組換え核酸分子ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖λ座位が、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む。
一部の実施形態では、標的化ベクターは、本明細書に記載される核酸分子、ならびに５’および３’相同アームを含み、当該アームは、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメント、および／またはＩｇ Ｃλ遺伝子を含む組換え核酸分子）を含む。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化ベクターは、部位特異的組み換えの標的配列に隣接したヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。標的化ベクター内の任意の領域、または個別の対象ポリヌクレオチドも、かかる部位に隣接し得ることが認識される。部位特異的リコンビナーゼは、細胞内にリコンビナーゼポリペプチドを導入することによる方法、または宿主細胞内に部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する方法をはじめとする任意の方法によって、細胞内に導入され得る。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、標的化ベクター内、または別個のポリヌクレオチド内に配置されてもよい。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導性プロモーター、細胞にとって内因性であるプロモーター、細胞にとって異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発生段階特異的プロモーターを含む、細胞内で活性なプロモーターに動作可能に連結されてもよい。標的化ベクター中でヌクレオチド配列、または対象の任意のポリヌクレオチドに隣接し得る部位特異的組み換え標的配列としては限定されないが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
一部の実施形態では、部位特異的組み換え部位は、標的化ベクター内の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに隣接する。標的化座位で標的化ベクターを統合した後の例では、部位特異的組み換え部位間のヌクレオチド配列を除去してもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化ベクターは、選択マーカーを含み、当該選択マーカーは、選択カセットに含まれ得る。このような選択マーカーとしては限定されないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一つの実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。一つの実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、部位特異的組み換え標的配列と隣接される。
非ヒト動物ゲノム
本明細書において、本明細書に記載される組換え核酸分子および／または標的化ベクターを含む非ヒト動物ゲノムも記述される。一部の非ヒト動物ゲノムの実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、当該非ヒト動物ゲノムの内因性Ｉｇ座位で本明細書に記載される組換え核酸分子を含み、例えば、当該非ヒト動物ゲノムは、本明細書に記載される標的化ベクターを含み、この場合において当該標的化ベクターは、内因性Ｉｇ座位を標的とする５’および３’相同アームを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、齧歯類のゲノムである。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、ラットのゲノムである。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、マウスのゲノムである。
非ヒト動物ゲノムの実施形態では、ゲノムは、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメントおよび／またはＩｇ ＪＨセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ重鎖座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべてまたはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で、非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、非ヒトＩｇ重鎖座位は、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメント、Ｉｇ ＪＨセグメントおよび／またはＩｇ ＣＨ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、齧歯類または齧歯類細胞（例えば、齧歯類胚性幹細胞）中の内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、すべての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、すべての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する。
非ヒト動物ゲノムの実施形態では、ゲノムは、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖座位で、非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結される。
非ヒト動物ゲノムの実施形態では、Ｉｇ軽鎖座位は、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメント、および／またはＩｇ ＣＬ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する。
非ヒト動物ゲノムの実施形態では、ゲノムは、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメント、および／またはＩｇ Ｃκ遺伝子を含む組換え核酸分子）は、Ｉｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結され、任意選択的に当該組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＶκセグメント、すべての非ヒトＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する。
非ヒト動物ゲノムの実施形態では、ゲノムは、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖λ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結される。
一部の非ヒト動物ゲノムの実施形態では、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位の非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメント、および／またはＩｇ Ｃλ遺伝子を含む組換え核酸分子）を含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で、非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する。
非ヒト動物細胞、非ヒト動物、およびそれらの作製方法
非ヒト動物および非ヒト動物細胞
例えば、Ｉｇリーダー配列、ならびに生殖系列Ｖセグメントのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の間に、およびそれらに動作可能に連結されたアンカーをコードするように改変された、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域（ＶＨ）セグメントまたはＩｇ軽鎖可変領域（ＶＬ）セグメントなどの改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む、本明細書に記載の組換え核酸分子を含むように改変されたＩｇ座位からアンカー改変型免疫グロブリンを発現する非ヒト動物および非ヒト動物細胞が提供される。したがって、本明細書に記載される組換え核酸分子、標的化構築物および／または動物ゲノムを含む、非ヒト動物、胚、細胞が提供される。
一部の非ヒト動物または非ヒト動物細胞の実施形態では、非ヒト動物または細胞は、本明細書に記載の組換え核酸分子（当該動物のゲノム内に無作為に配置された、Ｉｇリーダー配列、ならびに生殖系列Ｖセグメントのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の間に、およびそれらに動作可能に連結されたアンカーをコードするように改変された、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域（ＶＨ）セグメントまたはＩｇ軽鎖可変領域（ＶＬ）セグメントなどの改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む）を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物または細胞は、当該非ヒト動物の内因性Ｉｇ座位で本明細書に記載の組換え核酸分子（Ｉｇリーダー配列、ならびに生殖系列Ｖセグメントのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）配列の間に、およびそれらに動作可能に連結されたアンカーをコードするように改変された、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域（ＶＨ）セグメントまたはＩｇ軽鎖可変領域（ＶＬ）セグメントなどの改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む）を含む。例えば、当該非ヒト動物は、本明細書に記載される標的化ベクターを含み、この場合において当該標的化ベクターは、内因性Ｉｇ座位を標的とする５’および３’相同アームを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物細胞は、齧歯類の細胞である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一部の実施形態では、非ヒト動物細胞は、ラットの細胞である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。一部の実施形態では、非ヒト動物細胞は、マウスの細胞である。
複数の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメントおよび／またはＩｇ ＪＨセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ重鎖座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべてまたはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で、非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、非ヒトＩｇ重鎖座位は、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ ＶＨセグメント、ならびに任意でＩｇ ＤＨセグメント、Ｉｇ ＪＨセグメントおよび／またはＩｇ ＣＨ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、齧歯類または齧歯類細胞（例えば、齧歯類胚性幹細胞）中の内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ重鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、すべての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、すべての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する。
一部の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖座位で、非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、Ｉｇ軽鎖座位は、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および任意選択的にＩｇ ＪＬセグメント、および／またはＩｇ ＣＬ遺伝子を含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含み、および任意選択的にこの場合において当該組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する。
一部の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊκセグメント、および／またはＩｇ Ｃκ遺伝子を含む組換え核酸分子）は、Ｉｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結され、任意選択的に当該組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で、非ヒトＶκセグメント、すべての非ヒトＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する。
一部の実施形態では、非ヒト動物または非ヒト動物細胞は、組換え核酸分子（例えば、改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメントを含む組換え核酸分子）を、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含む非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を含み、任意選択的にこの場合において、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／またはこの場合において当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、当該非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、Ｉｇ軽鎖λ座位で、非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、当該Ｉｇ軽鎖λ座位の非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子（例えば、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および任意選択的にＩｇ Ｊλセグメント、および／またはＩｇ Ｃλ遺伝子を含む組換え核酸分子）を含む。一部の実施形態では、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で、非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する。
非ヒト動物または非ヒト動物細胞を作製する方法
また、本明細書に記載される例えば標的化ベクターなどの組換え核酸分子を使用して、インビトロで例えば非ヒト胚などの非ヒト細胞および／または非ヒト動物を作製する方法も記述される。一部の実施形態では、単離細胞を改変するインビトロでの方法は、当該単離細胞に、例えば、本明細書に記載される標的化ベクターと細胞を接触させることによって、本明細書に記載の組換え核酸分子を導入することを含む。一部の方法の実施形態では、細胞は、宿主細胞である。一部の実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞、または本明細書に記載の方法に従って作製された細胞は、齧歯類細胞であり、例えば、この場合において当該齧歯類細胞は、ラット細胞またはマウス細胞である。
また、本明細書に記載の核酸分子、非ヒト細胞、および／または非ヒト動物を使用して、アンカー改変型抗原結合タンパク質を作製する方法も記述されている。また、本明細書に記載される胚性幹細胞を含み得る、および／または本明細書に記載される胚性幹細胞から開発（例えば、生成）され得る非ヒト動物胚および非ヒト動物も記述されている。そのような胚または非ヒト動物は、本明細書に記載されるＥＳ細胞を胚に移植すること、および／またはＥＳ細胞を含む胚を適切な宿主に移植すること、ならびに当該ＥＳ細胞または当該胚の発生中に適切な条件下で宿主を生存可能な子孫へと維持することを含む方法によって開発され得る。
本明細書に記載されるように、標的化ベクターを使用して、ヒトまたはヒト化免疫グロブリン可変領域を有するＩｇ座位を標的化してもよい。ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン座位は、当分野で公知であり、例えば、米国特許第 ５，６３３，４２５号、第５，７７０，４２９号、第５，８１４，３１８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号、第６，９９８，５１４号、第７，７９５，４９４号、第７，９１０，７９８号、第８，２３２，４４９号、第８，５０２，０１８号、第８，６９７，９４０号、第８，７０３，４８５号、第８，７５４，２８７号、第８，７９１，３２３号、第８，８０９，０５１号、第８，９０７，１５７号、第９，０３５，１２８号、第９，１４５，５８８号、第９，２０６，２６３号、第９，４４７，１７７号、第９，５５１，１２４号、第９，５８０，４９１号、および第９，４７５，５５９号、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、ならびに米国特許出願公開 第 ２０１００１４６６４７号、第２０１１０１９５４５４号、第２０１３０１６７２５６号、第２０１３０２１９５３５号、第２０１３０３２６６４７号、第２０１３００９６２８７号、および第２０１５／０１１３６６８号、その各々が、その全体が参照により本明細書に取り込まれ、およびＰＣＴ出願公開第 ２００７１１７４１０号、第２００８１５１０８１号、第２００９１５７７７１号、第２０１００３９９００号、第２０１１００４１９２号、第２０１１１２３７０８号、および第２０１４０９３９０８号に見出され、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む外来性の完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含み、当該セグメントはマウスの前駆Ｂ細胞において再構成する能力を有する（Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １：２３１－２３６。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。これらの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、（無作為に）挿入されてもよく、および内因性免疫グロブリン遺伝子は、ノックアウトされてもよい（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＹＡＣｓ，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ７：１３－２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｆｒｏｍ ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１１３４－１１４３。これら各公表文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。例えばこの場合において内因性免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖の座位は、例えば各内因性座位の小さいが必須の部分を標的化欠失させ、その後に、無作為の統合される巨大導入遺伝子またはミニ染色体としてヒト免疫グロブリン遺伝子座位を導入することにより不活化される（Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ ｍｉｃｅ： ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｋａｐｐａ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７：７２２－７２７。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含むヒトまたはヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位は、それぞれ内因性免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の座位にある。ただ一つの内因性ＶＨ遺伝子セグメントとヒトＶＨ遺伝子セグメントの置換であっても、ヒト化免疫グロブリン可変ドメインを含む免疫反応が生じ得ることが示された。例えば、Ｔｉｅｎら、（２０１６年）Ｃｅｌｌ １６６：１４７１～８４を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
マウスが子孫を残す能力を維持しつつ、マウス生殖系列免疫グロブリン可変遺伝子座位と、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変遺伝子座位との大規模な原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）遺伝子置換を行う方法は、既に報告されている。例えば、米国特許第６，５９６，５４１号および第８，６９７，９４０号を参照、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、マウスの定常領域をそのまま残しながら、マウス重鎖とκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座の両方の６個のメガ塩基の、それらのヒトカウンターパートとの正確な置換が記載されている。結果として、マウス定常領域を維持しながら、その生殖系列の免疫グロブリン可変レパートリー全体の、同等なヒト生殖系列の免疫グロブリン可変配列での正確な置換を有するマウスが生成された。ヒト可変領域を、マウス定常領域に結合して、再構成し、生理学的に適切なレベルで発現するキメラのヒトとマウスの免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現された抗体は、「逆キメラ」であり、すなわち、それらは、ヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。
一部の実施形態では、ヒトまたはヒト化可変領域とマウス定常領域を有する抗体を発現する、ヒト化免疫グロブリン可変領域を有するマウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと呼ばれる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスと本質的には識別不可能な、完全な機能的液性免疫系を呈する。それらは、Ｂ細胞発生のすべての段階で正常な細胞集団を呈する。それらは、正常なリンパ器官形態を呈する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの抗体配列は、正常なＶ（Ｄ）Ｊ再構成および正常な体細胞超変異頻度を呈する。これらのマウスにおける抗体集団は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプシス－スイッチ）から生じるアイソタイプ分布を反映する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫することで、治療候補物質としての使用に適したヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する大規模で多様な抗体レパートリーを生成する、安定的な液性免疫反応が生じる。このプラットフォームは、医薬的に許容可能な抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための天然アフィニティ成熟したヒト免疫グロブリン可変領域配列の豊富な供給源を提供する。マウス免疫グロブリン可変配列と、ヒト免疫グロブリン可変配列を正確に置換することによって、当該ヒト免疫グロブリン可変配列は、逆キメラの様式で内因性非ヒト定常領域遺伝子配列と動作可能に結合され、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが作製される。
逆キメラ様式で修飾されたマウスとしては限定されないが、内因性免疫グロブリン座位で、内因性定常領域に動作可能に結合されたヒト（ヒト化）可変領域（例えば、（Ｄ）、Ｊ、および一つ以上のヒトＶ遺伝子セグメントを含む）を含むよう改変されたマウスが挙げられ、当該座位としては例えば、
（ａ）内因性重鎖座位が挙げられ、
（ｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的なヒト非再構成ヒトＶＨ遺伝子セグメント）、一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを含み、
任意選択的にこの場合において当該一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的なヒトＤＨ遺伝子セグメント）および／または一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的なヒトＪＨ遺伝子セグメント）である、
（ｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された限定的な非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該限定的な非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントに動作可能に連結された単一の非再構成ヒト重鎖可変領域ＶＨ遺伝子セグメントから本質的になり、任意選択的にこの場合において当該一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントは、それぞれ、一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメントおよび／または一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントである、
（ｉｉｉ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン修飾非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該ヒスチジン修飾された非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む、
（ｉｖ）内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含む重鎖のみの免疫グロブリンコード配列を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該内因性重鎖定常領域は、（１）軽鎖と会合するＩｇＭアイソタイプをコードするインタクトな内因性ＩｇＭ遺伝子、および（２）機能的ＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く例えばＩｇＧ遺伝子などの非ＩｇＭ遺伝子、を含み、この場合において当該非ＩｇＭ遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるＣＨ１ドメインを欠く非ＩｇＭアイソタイプをコードする、
および／または
（ｂ）内因性軽鎖座位が挙げられ、
（ｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的なヒト非再構成ヒトＶＬ遺伝子セグメント）、および一つ以上の非再構成免疫グロブリン重鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含み、
任意選択的にこの場合において当該一つ以上の非再構成免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントは、一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、全ての機能的なヒトＪＨＬ遺伝子セグメント）である、
任意選択的にこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖カッパ（κ）座位であり、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ（Ｖκ）および結合κ（Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、およびこの場合において当該内因性軽鎖定常領域は、内因性κ鎖定常領域配列であり、および／またはこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖ラムダ（λ）であり、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ（Ｖλ）遺伝子セグメントおよび結合λ（Ｊλ）遺伝子セグメントを含み、当該内因性軽鎖定常領域は、内因性λ鎖定常領域配列であり、任意選択的にこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖λ座位は、（ａ）一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つ以上のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および齧歯類免疫グロブリン軽鎖定常（Ｃλ）遺伝子セグメントに動作可能に結合され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位は、一つ以上の齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ），および一つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、任意選択的に三つのヒトＥλを含む、
（ｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に結合された再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントと再構成されたヒト軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子セグメントを含む、
（ｉｉｉ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された限定的な非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該限定的な非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合（ＪＬ）遺伝子セグメントに動作可能に連結された二つ以下の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含む、
（ｉｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン修飾非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該ヒスチジン修飾された非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、
（ｖ）内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン修飾再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域を含むように改変されたマウスであって、この場合において当該ヒスチジン修飾された再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、
任意選択的にマウスはさらに、
（ｉ）機能的なＡＤＡＭ６遺伝子を含むヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖座位を含み、それによって当該マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈し；および／または
（ｉｉ）抗原受容体の多様性を増すための外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、任意でそれによって再構成可変領域遺伝子の少なくとも１０％は、鋳型には無い付加を含み、
当該マウスは、過去に報告されている。例えば、米国特許第８，６９７，９４０号、第８，７５４，２８７号、第９，２０４，６２４号、第９，３３４，３３４号、第９，８０１，３６２号、第９，３３２，７４２号、および第９，５１６，８６８号、米国特許出願公開第２０１１０１９５４５４号、第２０１２００２１４０９号、第２０１２０１９２３００号、第２０１３００４５４９２号、第２０１５０２８９４８９号、第２０１８０１２５０４３号、第２０１８０２４４８０４号、ＰＣＴ特許出願公開第２０１９／１１３０６５号、第２０１７２１０５８６号および第２０１１１６３３１４号、Ｌｅｅら、（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：３５６を参照のこと。それら各公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる
当業者であれば、任意のマウスまたはマウス細胞（例えば、逆キメラ様式で改変されたマウスＥＳ細胞）は、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含むように改変されてもよい。一部の実施形態では、本明細書において、遺伝子改変非ヒト動物が記述され、例えば生殖系列ゲノムなどの当該動物のゲノムは、
本発明の改変ＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメント、およびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン座位を含み、この場合において当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結され、および／または
本発明の改変ＶＬセグメント、およびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性鎖座位を含み、この場合において当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される。
一部の実施形態では、非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスは、そのゲノム中に、一つ以上のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントと、内因性免疫グロブリン重鎖座位の一つ以上の内因性ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントの置換を含み、この場合において当該一つ以上のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントは、本明細書に記載の改変ヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、および内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子に動作可能に連結され、および任意選択的に、非再構成または再構成ヒトＶＬセグメントおよびヒトＪＬセグメントは、例えば内因性非ヒト軽鎖座位で、例えばマウスやラットなどの齧歯類などの非ヒトまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域遺伝子に動作可能に連結される。
特定の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば生殖系列ゲノムなど、そのゲノム中に、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖ遺伝子セグメントを含む一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域、および免疫グロブリン定常領域遺伝子を含む免疫グロブリン定常領域、を含有する免疫グロブリン座位（外因性または内因性）を含み。この場合において当該一つ以上の非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、免疫グロブリン定常領域遺伝子に動作可能に連結される。
概して、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、免疫グロブリン定常領域に動作可能に連結された免疫グロブリン可変領域（免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む）を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、重鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントを含む、一つ以上のヒト非再構成免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、κ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖκ遺伝子セグメントを含む、ヒト非再構成免疫グロブリン可変領域κ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、κ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖλ遺伝子セグメントを含む、ヒト非再構成免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変免疫グロブリン座位は、λ鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖλ遺伝子セグメントを含む、ヒト非再構成免疫グロブリン可変領域λ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内因性重鎖座位で、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された本明細書に記載の改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントを含む非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、この場合において免疫グロブリン可変領域は、一つ以上の非再構成ヒトＩｇ重鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、一つ以上の非再構成ヒトＩｇ可変領域遺伝子セグメントは、本明細書に記載の改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメント、一つ以上の免疫グロブリン重鎖多様性（ＤＨ）セグメント、および一つ以上の免疫グロブリン重鎖結合（ＪＨ）セグメント（任意選択的に一つ以上の非再構成ヒトＪＨセグメント）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントは、重鎖可変領域に存在する唯一のＩｇ ＶＨセグメントである。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能的なヒトＤＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、機能的なヒトＪＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。Ｉｇ重鎖遺伝子セグメントを含む可変領域の例は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１１ ：５１４７～５２および補足情報において概説されている。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に提供される非ヒト動物は、内因性重鎖座位で、少なくとも非ヒトＩｇＭ遺伝子を含む内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された限定的な非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域を含み、この場合において当該限定的な非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント（例えば、本明細書に記載される単一の改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメント）、複数のＤＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＤＨ遺伝子セグメント）および複数のＪＨ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＪＨ遺伝子セグメント）を特徴とし、この場合において当該限定的な免疫グロブリン重鎖座位は、再構成を行い、複数の個別の再構成を形成させることができ、この場合において当該再構成は、単一のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨセグメントのうちの一つ、およびＤＨセグメントのうちの一つから誘導されたものであり、この場合において当該再構成は、異なる重鎖可変ドメインをコードする（米国特許公開２０１３００９６２８７に記載され、当該文献はその全体で参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、単一の改変ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２またはＶＨ１－６９である。
特定の実施形態では、非ヒト動物は、内因性軽鎖座位で、内因性軽鎖座位定常領域に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ ＶＬセグメントを含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、非再構成ヒトＩｇκ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン可変領域は、一つ、または複数の非再構成ヒトＶκセグメントを含み、当該セグメントは、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖκセグメントおよび一つ以上の非再構成ヒトＪκセグメントを含んでもよい。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪκセグメントの全てを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、４個の機能的なＶκセグメント、およびすべてのヒトＪκセグメントを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、１６個の機能的なＶκセグメントおよび全てのヒトＪκセグメント（例えば、全ての機能的なヒトＶκセグメントおよびＪκセグメント）を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＶκセグメントの全て、および全てのヒトＪκセグメントを含む。Ｉｇ κ遺伝子セグメントを含む可変領域の例は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １ １１ ：５１４７～５２および補足情報において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された限定的な非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域が、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントおよび複数のＪＬ遺伝子セグメントを含むという点で特徴付けられ（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７９６，７８８号に記載される、デュアル軽鎖マウス、またはＤＬＣ）、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントのうちのひとつは、本明細書に記載の改変Ｉｇ ＶＬセグメントであってもよい。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、Ｖλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、Ｖκ遺伝子セグメントは、ＩＧＫＶ３－２０およびＩＧＫＶ１－３９である。一部の実施形態では、非ヒト動物は厳密に、マウスの内因性κ軽鎖座位で、マウス軽鎖定常領域に動作可能に連結された２個の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントと、５個の非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントを含み、任意でこの場合において当該厳密な２個の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１－３９遺伝子セグメントとヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントであり、当該５個の非再構成ヒトＪκ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１遺伝子セグメント、ヒトＪκ２遺伝子セグメント、ヒトＪκ３遺伝子セグメント、ヒトＪκ４遺伝子セグメント、およびヒトＪκ５遺伝子セグメントであり、当該非再構成ヒトカッパ軽鎖遺伝子セグメントは、抗体のヒト可変ドメインを再構成およびコードする能力があり、および任意でさらに、当該非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域が形成されるよう再構成する能力を有する内因性Ｖκ遺伝子セグメントを含まない。
特定の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、本明細書に記載の改変Ｉｇ λセグメントを含む、非再構成ヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数のヒトＶλセグメントおよび一つ以上のヒトＪλセグメントを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、一つ以上のヒトＶλセグメント、一つ以上のヒトＪλセグメント、および一つ以上のヒトＣλ定常領域配列を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＶλセグメントの全てを含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、ヒトＪλセグメントのすべてを含む。Ｉｇλ遺伝子セグメントを含む可変領域の例は、例えば、米国特許第 ９，０３５，１２８号および第６，９９８，５１４号において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、（ａ）一つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメント、（ｂ）一つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメント、および（ｃ）一つまたは複数のヒトＣλ遺伝子セグメントを含み、この場合において、（ａ）および（ｂ）は、（ｃ）および内因性（例えば齧歯類）Ｃλ遺伝子セグメントに動作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つまたは複数の齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）、および一つまたは複数のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー（Ｅλ）を含み、任意で３個のヒトＥλを含む。
特定の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、内因性（例えば、齧歯類またはラットもしくはマウス）Ｃκ遺伝子に動作可能に連結された、本明細書に記載の改変Ｉｇ λセグメントなどの非再構成ヒトＩｇλ可変領域遺伝子セグメントを含み、それによって、当該非ヒト動物は、内因性κ定常ドメインと融合されたＶλおよびＪλ遺伝子セグメントに由来するヒトλ可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。例えば、米国特許第９，２２６，４８４号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位、例えば、ヒト化免疫グロブリン内因性κ座位は、一つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメント（例えば、本明細書に記載される改変ヒトＶλセグメント）、およびＣλ遺伝子の上流の（例えば、動作可能に連結された）一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、それらは、例えば、内因性Ｃκ遺伝子を置換してもよい。一部の実施形態では、Ｃλ遺伝子は、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子である。一部の実施形態では、Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子である。一部の実施形態では、Ｃλ遺伝子は、一つ以上のヒトＣλ遺伝子を含む。一部の実施形態では、このようなヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位の一つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントおよび一つ以上のＣλ遺伝子は、Ｊλ－Ｃλクラスタに存在する。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してホモ接合性である。一部の実施形態では、遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、かかるヒト化免疫グロブリンκ軽鎖座位を含む遺伝子改変齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）は、特に、例えば抗原刺激に応答して、λ軽鎖を含む抗体を産生し、この場合、各λ軽鎖は、ヒトλ軽鎖定常ドメインに動作可能に連結されたヒトλ軽鎖可変ドメインを含む。
一部の実施形態では、非再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子間配列も含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、非ヒト（例えば、齧歯類、ラット、マウス）Ｉｇ可変領域遺伝子間配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子間配列は、内因性の種起源の遺伝子間配列である。
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、再構成軽鎖可変領域（一般的な軽鎖可変領域）である。一部の実施形態では、再構成Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子は、ヒト再構成Ｉｇ軽鎖可変領域遺伝子である。典型的な再構成Ｉｇ軽鎖可変領域は、例えば、米国特許第９，９６９，８１４号、第１０，１３０，１８１号、および第１０，１４３，１８６号、ならびに米国特許出願公開 第２０１２００２１４０９号、第２０１２０１９２３００号、第２０１３００４５４９２号、第２０１３０１８５８２１号、第２０１３０３０２８３６号、および第２０１５０３１３１９３号において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、一般的な軽鎖可変領域を含む非ヒト生物（「一般的な軽鎖」生物）を使用して、二重特異性抗体が産生される。一部の実施形態では、共通軽鎖コード配列は、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列を含む。一部の実施形態では、単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖配列が、ユニバーサル軽鎖に動作可能に連結された本明細書に記載されるアンカーをコードするように、単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖のＶκ／Ｊκ配列が改変される。一部の実施形態では、単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖκ／Ｊκ配列は、（ｉ）ヒトＪκ５遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ１－３９遺伝子セグメントを含むヒトＶκ１－３９／Ｊκ５配列、または（ｉｉ）ヒトＪκ１遺伝子セグメントに融合されたヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントを含むヒトＶκ３－２０／Ｊκ１配列、のいずれかである。
一部の実施形態では、免疫グロブリン可変領域は、ヒスチジンコドンの挿入および／または置換を含む、軽鎖および／または重鎖の免疫グロブリン可変領域であり、当該コドンは、かかる非ヒト生物において産生される抗体にｐＨ依存性の結合特性を導入するよう設計される。かかる実施形態の一部では、ヒスチジンコドンは、ＣＤＲ３をコードする核酸配列に挿入され、および／または置換される。様々なかかる軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子座は、米国特許第９，３０１，５１０号、第９，３３４，３３４号、および第９，８０１，３６２号、ならびに米国特許出願公開２０１４００１３４５６において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン修飾再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、ヒトＶκおよびＪκセグメント配列を含む単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含み、任意選択的にこの場合において当該Ｖκセグメント配列は、ヒトＶκ１－３９またはＶκ３－２０遺伝子セグメントに由来し、およびこの場合において当該単一の再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１およびそれらの組み合わせ（ＩＭＧＴナンバリングに準拠）からなる群から選択された位置で発現される、Ｖκセグメント配列の少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換を含む。一部の実施形態では、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）重鎖可変領域は、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）コード配列（例えば、本明細書に記載される改変（ヒト）ＶＨ遺伝子セグメント）において、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、非再構成ヒト（ヒト化）免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列は、非再構成ヒトＶＨ（例えば、本明細書に記載される改変（ヒト）ＶＨセグメント）、非再構成ヒトＤＨＨ、または合成ＤＨ、および非再構成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、任意選択的にこの場合において当該非再構成ヒトＶＨセグメント（例えば、本明細書に記載される改変（ヒト）ＶＨセグメント）は、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、非再構成ＶＬおよび非再構成ＪＬ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、ヒスチジン改変非再構成ヒト（ヒト化）軽鎖可変領域は、２個以下の非再構成ヒトＶＬ（例えば、２個以下のＶκ遺伝子セグメント）および一つ以上の非再構成ヒトＪＬ（例えば、Ｊκ）遺伝子セグメントを含み、２個以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントの各々は、ＣＤＲ３コード配列中に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンと置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む。一部の実施形態では、２個以下の非再構成ヒトＶκ遺伝子セグメントは、各々、非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンとの置換を一つ以上含む、ヒトＶκ１－３９およびヒトＶκ３－２０遺伝子セグメントであり、およびこの場合において当該ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、再構成を行う能力を有し、ヒトＶκおよびヒトＪκ遺伝子セグメントは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１（ＩＧＭＴナンバリングに準拠）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される位置で、一つ以上のヒスチジンを含むヒト軽鎖可変ドメインをコードし、この場合において当該一つ以上のヒスチジンは、一つ以上の置換からもたらされる。
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、内因性の種起源の重鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒトの配列の混合である。例えば、一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、ヒトＣＨ１領域ならびに非ヒト（例えば、内因性の種起源、マウス、ラット）のＣＨ２および／またはＣＨ３領域をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子は、Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ（Ｃγｌ、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４）、ＣαまたはＣεの定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、内因性定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、定常領域遺伝子は、非ヒト動物が、重鎖のみの抗体を発現するように、変異ＣＨ１領域をコードする（例えば、米国特許第８，７５４，２８７号、米国特許出願公開第２０１５／０２８９４８９号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、（一般的またはデュアル軽鎖生物において）二重特異性抗体を作製するために重鎖を生成することが目的である、一部の実施形態では、重鎖のＦｃドメインは、重鎖ヘテロ二量体形成を促進し、および／または重鎖ホモ二量体形成を阻害するための修飾を含む。かかる修飾は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、第７，６４２，２２８号および第８，６７９，７８５号、ならびに米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、軽鎖定常領域遺伝子を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、κ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、λ定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、内因性の種起源の軽鎖定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子またはラット定常領域遺伝子である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子は、ヒトと非ヒト配列の混合である。
一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域、および可変領域遺伝子セグメントが動作可能に結合された免疫グロブリン定常領域遺伝子は、内因性免疫グロブリン遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性重鎖遺伝子座である。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性κ遺伝子座である。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン座位は、内因性λ遺伝子座である。一部の実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントが動作可能に連結された定常領域遺伝子は、内因性定常領域遺伝子である。
一部の実施形態では、本明細書において提供される非ヒト動物のゲノム中の内因性免疫グロブリン座位の一つ以上、または一つ以上の内因性座位の一部（例えば、可変領域および／または定常領域）は、不活化される。内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子剤およびその一部は、限定されないが、生物のゲノムからの座位またはその一部の欠失、座位またはその一部と異なる核酸配列との置換、座位の一部の逆位、および／または座位の一部を非ヒト生物のゲノム中の別の位置へ移動させること、を含む、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して不活化され得る。一部の実施形態では、座位の不活化は、部分的な不活化のみである。一部の実施形態では、座位の可変領域は不活化されるが、定常領域は機能性を維持する（例えば、非内因性可変領域遺伝子セグメントに動作可能に結合されているためである）。
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活化された内因性免疫グロブリン重鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖座位またはその一部は、内因性重鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位される内因性重鎖座位の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖座位またはその一部は、内因性重鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内因性重鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＯμ遺伝子を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活化された内因性免疫グロブリンκ鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンκ鎖座位またはその一部は、内因性κ鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内因性κ鎖座位の可変領域の少なくとも一部は、可変領域のＪセグメントを含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンκ鎖座位またはその一部は、内因性κ鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内因性κ鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＣκ遺伝子を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、不活性化された内因性免疫グロブリンλ鎖座位を含む。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンλ鎖座位またはその一部は、内因性λ鎖座位の内因性可変領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、内因性λ鎖座位中の少なくとも一つのＶ－Ｊ－Ｃ遺伝子クラスタの少なくとも一部が、欠失、置換、移動および／または逆位にされる。一部の実施形態では、内因性免疫グロブリンλ鎖座位またはその一部は、内因性λ鎖座位の内因性定常領域の少なくとも一部の欠失、置換、移動および／または逆位により、不活化される。一部の実施形態では、欠失、置換、移動および／または逆位にされる内因性λ鎖座位の定常領域の少なくとも一部は、内因性定常領域のＣ遺伝子を含む。
様々な実施形態では、免疫グロブリン座位の改変は、非ヒト動物の生殖能力に影響を与えない。一部の実施形態では、重鎖座位は、機能的な、例えば、内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含み、遺伝子改変は、内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方の発現および／または機能に影響を与えない。一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物のゲノムはさらに、異所性に位置する機能的、例えば、内因性ＡＤＡＭ６ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６ｂ遺伝子、またはその両方を含む。外来性のＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂを発現する典型的な非ヒト動物は、米国特許第 ８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載され、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物はさらに、増加した抗原受容体多様性のため、外来性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）遺伝子を含み、発現する。外来性ＴｄＴを発現する典型的な非ヒト動物は、ＰＣＴ特許出願公開第２０１７２１０５８６に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、転写調節因子は、ＲＡＧ１転写調節因子、ＲＡＧ２転写調節因子、免疫グロブリン重鎖転写調節因子、免疫グロブリンκ軽鎖転写調節因子、免疫グロブリンλ軽鎖転写調節因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物のゲノムはさらに、一つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖遺伝子を含む（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、米国特許第８，６４２，８３５号、米国特許第８，６９７，９４０号、米国特許第８，７９１，３２３号、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８７Ａ１号および第２０１８／０１２５０４３Ａ１号、およびＰＣＴ出願公開第２０１９／１１３０６５号を参照、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む組換え核酸分子は、例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）系統（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号または米国特許第８，６４２，８３５号を参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）など、異なる改変系統の胚性幹細胞内に導入されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の標的化ベクターを、改変系統由来の細胞に導入することにより作製され得る。一例を挙げると、本明細書に記載の標的化ベクターは、米国特許第８，６４２，８３５号および第８，６９７，９４０号に記載される非ヒト動物に導入されてもよく、その全体が参照により本明細書に取り込まれ、非ヒト動物は、完全なヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現する。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子（可変領域遺伝子および／または定常領域遺伝子）をさらに含むように作製される。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む本明細書に記載の非ヒト動物は、本明細書に記載の操作されたＤＨ領域、および異種（例えば、ヒト）由来の遺伝物質を含み、遺伝物質は、一つ以上のヒト重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を、全体または部分でコードする。
本明細書に記載の非ヒト動物は、多くの場合、非ヒト動物の意図される使用に応じて、追加のヒト遺伝子またはヒト化遺伝子を含むように、上述の通り、または当該技術分野において公知の方法を使用して調製され得る。かかる追加のヒトまたはヒト化遺伝子の遺伝物質は、上述の通り、または所望される他の遺伝子改変された系統を用いて、当該技術分野において公知の繁殖技術を通じて、遺伝子改変を有する細胞（例えば、胚性幹細胞）のゲノムのさらなる改変を通じて導入され得る。
例えば、本明細書に記載される通り、本明細書に記載される改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む非ヒト動物は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開第２０１１－０１９５４５４ Ａ１号、第２０１２－００２１４０９ Ａ１号、第２０１２－０１９２３００ Ａ１号、第２０１３－００４５４９２ Ａ１号、第２０１３－０１８５８２１ Ａ１号、第２０１３－０１９８８８０ Ａ１号、第２０１３－０３０２８３６ Ａ１号、第２０１５－００５９００９ Ａ１号；国際特許出願公開第２０１１／０９７６０３号、第２０１２／１４８８７３号、第２０１３／１３４２６３号、第２０１３／１８４７６１号、第 ２０１４／１６０１７９号、第２０１４／１６０２０２号として記載される一つ以上の修飾（例えば、交雑または複数の遺伝子標的化戦略を介して）さらに含む。
トランスジェニック創始非ヒト動物は、そのゲノム中に改変Ｉｇ Ｖセグメントが存在することに基づいて特定することができ、および／または同族受容体に結合する非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分に対応するアミノ酸を含むアンカー改変型抗体の発現に基づいて特定することができる。次いでトランスジェニック創始非ヒト動物を使用して、改変Ｉｇ Ｖセグメントを担持する別の非ヒト動物と交配させ、それによって各々が一つ以上の改変Ｉｇ Ｖセグメントのコピーを担持する一連の非ヒト動物を生成することができる。さらに、改変Ｉｇ Ｖセグメントを担持するトランスジェニック非ヒト動物を、所望される他の導入遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）を担持する他のトランスジェニック非ヒト動物とさらに交配させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物はまた、導入遺伝子の発現の制御または指示を可能にする選択システムを含有するように生成されてもよい。典型的なシステムは、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２～６２３６を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）および出芽酵母のＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１～１３５５、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を含む。そのような動物は、例えば一種は選択された改変（例えば改変Ｉｇ Ｖセグメント）を含む導入遺伝子を含有し、他方はリコンビナーゼ（例えばＣｒｅリコンビナーゼ）をコードする導入遺伝子を含有する、二種のトランスジェニック動物を交配することによって、「二重の」トランスジェニック動物を構築することにより提供され得る。
マウス（すなわち、改変ヒトＶＨセグメント、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントを含むマウスであり、それらはすべて、一つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に動作可能に連結されている）において、改変Ｉｇ Ｖセグメントを利用する実施形態が本明細書で広範に論じられているが、改変Ｉｇ Ｖセグメントを含む他の非ヒト動物も提供される。そのような非ヒト動物としては、本明細書に記載されるアンカー改変型免疫グロブリンを発現するよう遺伝子改変され得る非ヒト動物のいずれか、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの哺乳類が挙げられる。例えば、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物について、他の方法を利用して、遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製する。かかる方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を修飾する工程、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を利用して、適当な細胞、例えば、除核卵母細胞に遺伝子修飾したゲノムを導入する工程、および修飾された細胞（例えば、修飾された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させる工程を含む。
非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、雌牛、齧歯類、ニワトリなど）の修飾方法は、、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を利用して、本明細書に記載の改変Ｉｇ Ｖセグメントを含むようゲノムを改変する工程を含む。非ヒト動物の生殖系列ゲノムを改変する方法の指針は、例えば、米国特許出願公開第２０１５－０３７６６２８ Ａ１号、第２０１６－０１４５６４６ Ａ１号、および第２０１６－０１７７３３９ Ａ１号において見ることができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、小さな哺乳類、例えば、トビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾された動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、ネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、ならびにメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、および高原モグラネズミ）から選択される科由来である。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾マウスは、ネズミ科のメンバー由来である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載の齧歯類は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、マウスである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯類である。一部の実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら、１９９９年、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ら、２０００年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４～１０２８，１０３０，１０３２を参照；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾マウスは、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。一部の実施形態では、本明細書に記載の混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統の混合である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ラットである。一部の実施形態では、本明細書に記載のラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載のラット系統は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される二種以上の系統の混合である。
アンカー改変型免疫グロブリンの作製方法、およびアンカー改変型免疫グロブリン
いくつかのインビトロ技術およびインビボ技術が、抗体ベースの治療薬を生み出すために開発されてきた。詳細には、インビボ技術は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を備えたトランスジェニック動物（すなわち、齧歯類）であって、遺伝子が、動物のゲノムにランダムに組み込まれている（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）か、または動物の内因性免疫グロブリン定常領域と動作可能に連結された内因性免疫グロブリン座位に寸分たがわずに配置されている、動物の生成を特徴としてきた（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、および第８，７９１，３２３号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。両方のアプローチは、ヒトへの使用に有望な抗体治療候補の生成に、よい結果をもたらしてきた。さらに、これら両方のアプローチは、インビボで生成された抗体レパートリーから抗体候補が選択されるという点で、インビトロアプローチよりも優れており、この選択には、宿主免疫システムの内部環境内での抗原に対するアフィニティおよび特異性の選択が含まれる。このように、抗体は、インビトロ技術に付随し得る人工環境またはインシリコ予測ではなく、自然提示された抗原に（関連する生物学的エピトープおよび表面内で）結合するものである。インビボ技術から得られる頑強な抗体レパートリーにも関わらず、複合体（例えば、ウイルス、チャンネルポリペプチド）または細胞質抗原に対する抗体は、依然として困難なままである。さらに、免疫寛容に起因して、種（例えば、ヒトおよびマウス）間で高度な配列同一性を共有するポリペプチドに対する抗体の発生も課題のままである。
したがって本発明は特に、アンカーを有して、免疫グロブリンが対象抗原（例えば、アンカーの同族受容体）に係留するのを補助し、および同族受容体に対するアフィニティによって分子のアビディティに寄与することによって、および／または同族受容体を認識する能力を有する免疫グロブリンの大規模レパートリーの体細胞超変異を行うことによって、抗原に対するアフィニティを増大させる抗体の作製を特徴とするインビボシステムを構築するという認識に基づいている。
提供される非ヒト動物は、ヒト抗体を作製するのに利用され得、ヒト抗体は、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞の遺伝物質によってコードされる一つ以上の可変領域核酸配列由来の可変ドメインを含む。例えば、提供される非ヒト動物は、当該非ヒト動物が対象抗原（例えば、アンカーに対して同族である受容体）に対し免疫反応を生じさせる条件下、および充分な時間、当該対象抗原で免疫化される。抗体は、非ヒト動物（または一つ以上の細胞、例えば、一つ以上のＢ細胞）から単離され、例えば、親和性、特異性、エピトープマッピング、リガンドと受容体の相互作用を阻害する能力、阻害受容体活性などを測定する、種々のアッセイを用いて特徴付けられる。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物によって産生される抗体は、非ヒト動物から単離された一つ以上のヒト可変領域ヌクレオチド配列からもたらされる一つ以上のヒト可変ドメインを含む。
本明細書に記載の非ヒト動物は、様々なアッセイに有用なヒト抗体を産生するための、改良されたインビボシステムおよび生物学的物質（例えば、細胞）の供給源を提供する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、本明細書に記載されるリガンド受容体ペアの一つ以上の受容体を標的とする治療剤が開発される。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ポリペプチドに結合する候補治療薬（例えば、抗体など）を同定し、スクリーニングし、および／または開発する。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上の受容体チロシンキナーゼ、一つ以上のヒトＧＰＣＲポリペプチド、一つ以上のＮｏｔｃｈ受容体、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの一つ以上、プレキシン受容体、ＬＤＬＲ、ＬＩＬＲ、ＫＩＲ、およびインテグリン、または例えばＮＰＲ３などのＮＰＲの活性を妨害する候補治療剤（例えば、抗体など）がスクリーニングされ、開発される。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のヒトＧＰＣＲポリペプチド、一つ以上のＮｏｔｃｈ受容体、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの一つ以上、プレキシン受容体、ＬＤＬＲ、ＬＩＬＲ、ＫＩＲ、およびインテグリン、または例えばＮＰＲ３などのＮＰＲのアンタゴニストおよび／またはアゴニストの結合プロファイルが決定される。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、一つ以上のヒトＧＰＣＲポリペプチド、一つ以上のＮｏｔｃｈ受容体、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの一つ以上、プレキシン受容体、ＬＤＬＲ、ＬＩＬＲ、ＫＩＲ、およびインテグリン、または例えばＮＰＲ３などのＮＰＲに結合する一つ以上の候補治療用抗体のエピトープが決定される。
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を使用して、抗体の薬物動態プロファイルを決定する。一部の実施形態では、一つ以上の提供される非ヒト動物および一つ以上の対照または参照の非ヒト動物が、各々、一つ以上の候補治療抗体に様々な用量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治療薬抗体は、非経口および経口投与経路を含む、任意の望ましい投与経路を介して投与され得る。非経口経路は、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または他の経路の注入を含む。経口経路は、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射、例えば、静脈内液体バックを使用によってもよい。血液は、非ヒト動物（ヒト化および対照）から、様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大３０日またはそれ以上の日数）で単離される。様々なアッセイは、総ＩｇＧ、抗治療抗体応答、凝集などを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載の非ヒト動物から取得された飼料を使用して、投与される候補治療抗体の薬物動態特性を決定してもよい。
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、抗体を発現し、従って、細胞、細胞株、および細胞培養物は、例えば、アンタゴニストまたはアゴニストの結合または機能についてアッセイするため、結合および機能アッセイにおける使用のための抗体の供給源として働くよう生成され得、アンタゴニストまたはアゴニストは、ヒトポリペプチド配列またはエピトープに特異的であるか、あるいは、リガンドと受容体の相互作用（結合）において機能するヒトポリペプチド配列またはエピトープに特異的である。一部の実施形態では、候補治療抗体またはｓｉＲＮＡにより結合されるエピトープは、提供される非ヒト動物から単離された細胞を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物由来の細胞は、場当たり的に単離され、使用され得るか、または多世代にわたって培養物中で維持され得る。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物由来の細胞は、（例えば、ウイルスの使用を介して）不死化され、培養物中（例えば、連続培養物中）で無期限に維持される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒト対象抗原に結合する抗体バリアントの生成のためのインビボシステムを提供する。かかるバリアントは、二つ以上のヒト標的抗原により共有される共通のエピトープに対して所望される機能性、特異性、低い交差反応性を有する抗体を含む。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物を利用して、所望または改善された機能性についてスクリーニングされる一連の抗体バリアントを生成するための抗体のパネルを生成する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、抗体ライブラリーを生成するためのインビボシステムを提供する。かかるライブラリーは、所望のエフェクター機能に基づき異なるＦｃ領域に移植され、および／または当技術分野で公知の技術（例えば、部位特異的変異誘導、エラープローンＰＣＲなど）を使用して可変領域配列の親和性成熟の供給源として使用され得る、重鎖および軽鎖可変領域配列の供給源を提供する。
キット
本発明はさらに、本明細書に記載の、少なくとも一つの非ヒト動物、非ヒト細胞、ＤＮＡフラグメント、および／または標的化ベクターを充填した一つ以上の容器を含むパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば調査方法）において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、（ａ）ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用に関する説明書、またはその両方、または二つ以上の実体の間の物質および／または生物製品（例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）の移送を支配する契約書、を反映している。
非限定的な実施形態を以下に記載する。
実施形態１．
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドをコードする改変免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）セグメントを含む組換え核酸分子であって、
改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含み、
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含み、
アンカーが、同族受容体に結合する、対象非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を含み、ならびに
任意選択的に核酸分子は、他のＶセグメントをすべて欠く、組換え核酸分子。
実施形態２．
Ｉｇシグナルペプチドは、生殖系列のＩｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＩｇシグナルペプチドである、実施形態１に記載の組換え核酸分子。
実施形態３．
生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ重鎖可変（ＶＨ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ ＶＨセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ ＶＨセグメントであり、および
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶＨセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、実施形態１または実施形態２に記載の組換え核酸分子。
実施形態４．
生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントが、生殖系列ヒト（ｈ）ＶＨ１－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－１８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－２４セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４５セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４６セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－５８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－６９セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－２６セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－７０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－５３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６４セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７２セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－２８セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－５９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－６１セグメント、生殖系列ｈＶＨ５－５１セグメント、生殖系列ｈＶＨ６－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－４－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－８１セグメント、またはそのバリアントである、実施形態１～３のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態５．
生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列ｈＶＨ１－６９セグメントまたはそのバリアントであり、任意選択的にＩｇシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号７）を含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態６．
動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＨセグメント、
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖多様性（ＤＨ）セグメント、および
（ＩＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖結合（ＪＨ）セグメントを含む、実施形態３～５のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態７．
（ＩＩ）の一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメントが、一つ、複数、またはすべてのヒトＩｇ ＤＨセグメントを含み、および／または
（ＩＩＩ）の一つまたは複数のＩｇ ＪＨセグメントが、一つ、複数、またはすべてのヒトＩｇ ＪＨセグメントを含む、実施形態６に記載の組換え核酸分子。
実施形態８．
（ＩＩ）の一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメント、および（ＩＩＩ）の一つまたは複数のＩｇ ＪＨ遺伝子セグメントが再結合され、再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、それによって、組換え核酸分子が、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および
再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列を含む、実施形態６または実施形態７に記載の組換え核酸分子。
実施形態９．
改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントと再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列が再結合され、アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインをコードする再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、
アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインが、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされるＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む、実施形態８に記載の組換え核酸分子。
実施形態１０．
改変Ｉｇ ＶＨセグメントが、非再構成改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントである、実施形態３～８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態１１．
Ｉｇ重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列をさらに含み、
Ｉｇ ＣＨをコードする核酸配列が、
（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＨセグメント、
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメント、および
（ＩＩＩ）一つまたは複数のＩｇ ＪＨセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、実施形態６～１０のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態１２．
Ｉｇ ＣＨをコードする核酸配列は、ＩｇＭアイソタイプをコードするＩｇμ遺伝子、ＩｇＤアイソタイプをコードするＩｇδ遺伝子、ＩｇＧアイソタイプをコードするＩｇγ遺伝子、ＩｇＡアイソタイプをコードするＩｇα遺伝子、および／またはＩｇＥアイソタイプをコードするＩｇε遺伝子を含む、実施形態１１に記載の組換え核酸分子。
実施形態１３．
アンカー改変型Ｉｇ重鎖をコードする核酸配列を含み、アンカー改変型Ｉｇ重鎖は、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、
（ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ重鎖可変ドメイン、および
（ｉｖ）Ｉｇ ＣＨ、を含む、実施形態３～１２のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態１４．
Ｉｇ ＣＨは、非ヒトＩｇ ＣＨである、実施形態１１～１３のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態１５．
非ヒトＩｇ ＣＨは、齧歯類Ｉｇ ＣＨである、実施形態１４に記載の組換え核酸分子。
実施形態１６．
非ヒトＩｇ ＣＨは、ラットＩｇ ＣＨである、実施形態１５に記載の組換え核酸分子。
実施形態１７．
非ヒトＩｇ ＣＨは、マウスＩｇ ＣＨである、実施形態１５に記載の組換え核酸分子。
実施形態１８．
生殖系列Ｉｇ Ｖ遺伝子セグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変（ＶＬ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ ＶＬセグメントであり、および
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、実施形態１または実施形態２に記載の組換え核酸分子。
実施形態１９．
動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントを含む、実施形態１８に記載の組換え核酸分子。
実施形態２０．
改変Ｉｇ ＶＬ遺伝子セグメントと一つまたは複数のＩｇ ＪＬセグメントが再結合され、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインをコードする再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列を形成し、
アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインが、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む、実施形態１９に記載の組換え核酸分子。
実施形態２１．
Ｉｇ軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列をさらに含み、
Ｉｇ ＣＬをコードする核酸配列が、
（Ｉ）改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントの下流であり、およびそれらに動作可能に連結される、実施形態１９または実施形態２０に記載の組換え核酸分子。
実施形態２２．
アンカー改変型Ｉｇ軽鎖をコードする核酸配列を含み、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖は、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、
（ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ軽鎖可変ドメイン、および
（ｉｖ）Ｉｇ ＣＬ、を含む、実施形態１８～２１のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態２３．
Ｉｇ ＣＬは、非ヒトＩｇ ＣＬである、実施形態２１または実施形態２２に記載の組換え核酸分子。
実施形態２４．
非ヒトＩｇ ＣＬは、齧歯類Ｉｇ ＣＬである、実施形態２３に記載の組換え核酸分子。
実施形態２５．
非ヒトＩｇ ＣＬは、ラットＩｇ ＣＬである、実施形態２３に記載の組換え核酸分子。
実施形態２６．
非ヒトＩｇ ＣＬは、マウスＩｇ ＣＬである、実施形態２３に記載の組換え核酸分子。
実施形態２７．
生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変カッパ（Ｖκ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ Ｖκセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ Ｖκセグメントであり、および
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶκセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、実施形態１８～２６のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態２８．
動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
（Ｉ）改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合カッパ（Ｊκ）セグメントを含む、実施形態２７に記載の組換え核酸分子。
実施形態２９．
Ｉｇ軽鎖定常カッパ領域（Ｃκ）をコードする核酸配列をさらに含み、
Ｉｇ Ｃκをコードする核酸配列が、
（Ｉ）改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ Ｊκセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、実施形態２８に記載の組換え核酸分子。
実施形態３０．
生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変ラムダ（Ｖλ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ Ｖλセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ Ｖλセグメントであり、および
アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
（ｉ）Ｉｇシグナルペプチド、
（ｉｉ）アンカー、および
（ｉｉｉ）生殖系列Ｉｇ ＶλセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、実施形態１８～２６のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態３１．
動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
（Ｉ）改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合ラムダ（Ｊλ）セグメントを含む、実施形態３０に記載の組換え核酸分子。
実施形態３２．
Ｉｇ軽鎖定常ラムダ領域（Ｃλ）をコードする核酸配列をさらに含み、
Ｉｇ Ｃλをコードする核酸配列が、
（Ｉ）改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および
（ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ Ｊλセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、実施形態３１に記載の組換え核酸分子。
実施形態３３．
アンカーはリンカーを含み、当該リンカーは、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を、生殖系列のＩｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３に連結する、実施形態１～３２のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態３４．
リンカーは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む、実施形態３３に記載の組換え核酸分子。
実施形態３５．
アンカーは、ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）のナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）結合部分を含む、実施形態１～３４のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態３６．
ＮＰのＮＰＲ結合部分は、ＮＰのＣ末端尾部を含む、実施形態３５に記載の組換え核酸分子。
実施形態３７．
ＮＰは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、実施形態３５または実施形態３６に記載の組換え核酸分子。
実施形態３８．
アンカーは、配列ＮＳＦＲＹ（配列番号３）を含む、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態３９．
配列番号８として記載される配列またはその縮重バリアント、配列番号１０として記載される配列またはその縮重バリアント、配列番号１１またはその縮重バリアント、および配列番号１２またはその縮重バリアントからなる群から選択される配列を含む、実施形態１～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子。
実施形態４０．
標的化ベクターがさらに、５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的に非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／または非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１０および３３～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態４１．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する、実施形態４０に記載の標的化ベクター。
実施形態４２．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する、実施形態４０または実施形態４１に記載の標的化ベクター。
実施形態４３．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべてまたはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する、実施形態４０～４２のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態４４．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む、実施形態４０～４３のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態４５．
５’相同アームは、配列番号１１として記載される配列を含み、および／または３’相同アームは、配列番号１２として記載される配列を含む、実施形態４０～４４のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態４６．
標的化ベクターがさらに、５’および３’相同アームを含み、当該アームは非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的に非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／または非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１７および３３～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態４７．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、および全ての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する、実施形態４６に記載の標的化ベクター。
実施形態４８．
標的化ベクターは５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２、１８～２０、２７～２８、３０～３１、および３３～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態４９．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する、実施形態４８に記載の標的化ベクター。
実施形態５０．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する、実施形態４８または実施形態４９に記載の標的化ベクター。
実施形態５１．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する、実施形態４８～５０のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態５２．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、Ｉｇ軽鎖座位で非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む、実施形態４８～５１のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態５３．
標的化ベクターは５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位は、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／またはこの場合において非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２、１８～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態５４．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＶＬセグメント、すべての非ヒトＪＬセグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する、実施形態５３に記載の標的化ベクター。
実施形態５５．
標的化ベクターは５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／またはこの場合において非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２、１８～２０、２７～２８、および３３～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態５６．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する、実施形態５５に記載の標的化ベクター。
実施形態５７．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する、実施形態５５または実施形態５６に記載の標的化ベクター。
実施形態５８．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態５９．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、Ｉｇ軽鎖κ座位で非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む、実施形態５５～５８のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態６０．
標的化ベクターは５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、組換え核酸分子を、Ｉｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能な連結で含む、実施形態１～２および１８～２９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態６１．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＶκセグメント、すべての非ヒトＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する、実施形態６０に記載の標的化ベクター。
実施形態６２．
標的化ベクターは５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖λ座位が、組換え核酸分子を、非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的にこの場合において、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／またはこの場合において非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２、１８～２０、３０～３１、および３３～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態６３．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する、実施形態６２に記載の標的化ベクター。
実施形態６４．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する実施形態６２または実施形態６３に記載の標的化ベクター。
実施形態６５．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する実施形態６２～６４のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態６６．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む、実施形態６２～６５のいずれか一つに記載の標的化ベクター。
実施形態６７．
標的化ベクターは、５’および３’相同アームをさらに含み、当該アームは、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とし、それによって、標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された組換え核酸分子を含む、実施形態１～２、１８～２６、および３０～３８のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクター。
実施形態６８．
標的化ベクターと非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、組換え核酸分子は、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する、実施形態６７に記載の標的化ベクター。
実施形態６９．
任意選択的に非ヒト動物が齧歯類であり、任意選択的に齧歯類がラットまたはマウスである、実施形態１～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子、または実施形態４０～６８のいずれか一つに記載の標的化ベクターを含む非ヒト動物ゲノム。
実施形態７０．
組換え核酸が、非ヒト動物ゲノムの内因性Ｉｇ遺伝子座にある、実施形態６９に記載の非ヒト動物ゲノム。
実施形態７１．
実施形態１～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子、実施形態４０～６８のいずれか一つに記載の標的化ベクター、または実施形態６９もしくは実施形態７０に記載の非ヒト動物ゲノムを含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
実施形態７２．
組換え核酸分子、標的化ベクター、または非ヒト動物ゲノムが、非ヒト動物または非ヒト動物細胞の生殖系にある、実施形態７１に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
実施形態７３．
単離細胞に、実施形態１～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子を導入することを含む、単離細胞をインビトロで改変する方法。
実施形態７４．
導入することが、細胞を、実施形態４０～６８のいずれか一つに記載の標的化ベクターと接触させることを含む、実施形態７３に記載のインビトロの方法。
実施形態７５．
細胞が、宿主細胞である、実施形態７３または実施形態７４に記載のインビトロの方法。
実施形態７６．
細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態７３または実施形態７４に記載のインビトロの方法。
実施形態７７．
細胞が、齧歯類細胞であり、任意選択的に齧歯類細胞が、ラット細胞またはマウス細胞である、実施形態７３～７６のいずれか一つに記載のインビトロの方法。
実施形態７８．
実施形態７６に記載の胚性幹細胞から作製される非ヒト動物胚。
実施形態７９．
実施形態７６に記載の胚性幹細胞から作製される非ヒト動物。
実施形態８０．
実施形態７６に記載のＥＳ細胞またはＥＳ細胞を含む胚を適切な宿主に移植すること、およびＥＳ細胞または胚の発生中に適切な条件下で宿主を生存可能な子孫へと維持すること、を含む、非ヒト動物を作製する方法。
実施形態８１．
非ヒト動物は、対照非ヒト動物と比較して、
（ａ）脾臓において同等の数の成熟Ｂ細胞、
（ｂ）脾臓において同等の数のカッパ陽性Ｂ細胞、
（ｃ）脾臓において同等の数のラムダ陽性Ｂ細胞、
（ｄ）同等のレベルの血清ＩｇＧ、および／または
（ｅ）同等のレベルの血清ＩｇＭ、を含む、実施形態７１～７２および７９のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
実施形態８２．
非ヒト動物は、対照非ヒト動物と同等の免疫反応を惹起させることができる、実施形態７１～７２、７９および８１のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
実施形態８３．
複数の抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質がそれぞれアンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含み、任意選択的に、
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、実施形態７１～７２、７９および８１～８２のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
実施形態８４．
非ヒト動物は、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体をさらに含む、実施形態７１～７２、７９および８１～８３のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
実施形態８５．
複数の抗原結合タンパク質を含み、当該抗原結合タンパク質がそれぞれアンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含み、および対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体に特異的に結合し、任意選択的に、
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、実施形態７１～７２、７９および８１～８４のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
実施形態８６．
同族受容体は、ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）である、実施形態８４～８５のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
実施形態８７．
複数の抗原結合タンパク質のそれぞれが、１Ｘ１０９未満のＫＤ、および／または３０分を超えるｔ１／２を備える、実施形態８４～８６のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
実施形態８８．
複数の抗原結合タンパク質のうちの少なくとも１５％は、対象の非免疫グロブリンポリペプチドへの同族受容体の結合を遮断する、実施形態８４～８７のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
実施形態８９．
複数の抗原結合タンパク質のうちの５０％超が、細胞表面上に発現される同族受容体に結合する、実施形態８４～８８のいずれか一つに記載の非ヒト動物。
実施形態９０．
非ヒト動物が、齧歯類であり、任意選択的に齧歯類が、ラットまたはマウスである、実施形態７１～７２、７９、および８１～８９のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従って作製された非ヒト動物。
実施形態９１．
抗原結合タンパク質を作製する方法、または当該抗原結合タンパク質をコードする核酸を得る方法であって、
実施形態７１～７２、７９、および８１～９０のいずれか一つに記載の非ヒト動物、または実施形態８０に記載の方法に従って作製された非ヒト動物を、抗原を用いて免疫化すること、
非ヒト動物に、抗原に結合する、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含む抗原結合タンパク質を産生させること、または当該タンパク質をコードする核酸を産生させること、を含み、任意選択的に、
抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、方法。
実施形態９２．
抗原結合タンパク質、または抗原結合タンパク質をコードする核酸を、非ヒト動物または非ヒト動物細胞から回収することをさらに含む、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３．
非ヒト動物細胞は、Ｂ細胞またはハイブリドーマである、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４．
実施形態９１に記載の方法に従い回収された非ヒト動物細胞。
実施形態９５．
非ヒト動物細胞は、Ｂ細胞である、実施形態９４に記載の非ヒト動物。
実施形態９６．
Ｂ細胞は、マウスＢ細胞である、実施形態９４または９５に記載の非ヒト動物細胞。
実施形態９７．
ミエローマ細胞と融合された実施形態９４～９５のいずれか一つに記載の非ヒト動物細胞を含む、ハイブリドーマ細胞。
実施形態９８．
実施形態１～３９のいずれか一つに記載の組換え核酸分子、実施形態４０～６８のいずれか一つに記載の標的化ベクター、実施形態６９～７０のいずれか一つに記載の非ヒト動物ゲノムにより、コードされる、実施形態７１～７２および８１～９０のいずれか一つに記載の非ヒト動物もしくは非ヒト動物細胞により発現される、実施形態７３～７６および８０のいずれか一つに記載の方法に従い作製されるまたは実施形態９１～９３のいずれか一つに記載の方法に従い作製される非ヒト動物もしくは非ヒト動物細胞により発現される、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドであって、任意選択的に、
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
各抗原結合タンパク質の質量は、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、アンカー改変型Ｉｇポリペプチド。
実施形態９９．
そのＮ末端に配列番号３として記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態９８に記載のアンカー改変型Ｉｇポリペプチド。
記載される実施形態の他の特徴は以下の例示的な実施形態の記述の過程で明らかになるはずであり、該例示的な実施形態は、例示のために与えられ、その限定を意図するものではない。
以下の実施例は、本明細書に開示される方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者に説明するために提供されており、発明者がその発明としてみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。
実施例１．ＡＮＰ改変型免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン可変領域の構築
この非限定的な実施例は、アンカー改変型免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域（Ｖ）遺伝子セグメントを免疫グロブリン座位の免疫グロブリン可変領域に統合するための標的化ベクターの構築を解説するものである。以下に記載されるように、ＡＮＰのＣ末端尾部のコード配列は、Ｉｇ Ｖ遺伝子セグメントと動作可能に連結されて配置される。改変されたＩｇ Ｖセグメントは、Ｉｇ結合（Ｊ）遺伝子セグメント、および必要な場合にはＩｇ多様性（Ｄ）遺伝子セグメントと動作可能に連結されて配置されてもよく、それによって、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えの際に、免疫グロブリンポリペプチド鎖のＮ末端でＡＮＰのＣ末端尾部を含む抗体が発現される。
免疫グロブリン重鎖可変領域への挿入を目的としたＡＮＰ改変ＶＨ遺伝子セグメントを含有する標的化ベクターは、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照のこと。当該文献は参照により本明細書に援用される）、および当分野で公知の分子生物技術を用いて作製された。ＡＮＰのＣ末端尾部をコードする配列を使用して標的化ベクターを構築するための非限定的な戦略例を図１～２に記載する。
ペプチドリンカーをコードする配列を介して生殖系列ＶＨ１－６９遺伝子セグメント内に挿入されたＡＮＰのＣ末端尾部を含むドナーＤＮＡ断片を、デノボＤＮＡ合成（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ワシントン州ボセル）により作製した。図１は、「ｐ４６６０９０” ＡＮＰ－ＶＨ１－６９ Ｃａｓ９」ドナー断片を示す。スペクチノマイシン耐性カセット「ＳＰＥＣ」を、ドナープラスミドｐ４６６０９のＥｃｏＲＩ部位およびＡｖｒＩＩ部位にライゲーションして、プラスミドｐ４６６８５を作製した（図１）。図２に、得られたドナープラスミドｐ４６６０９の詳細な図を示す。
ドナー断片を使用して、ＢＡＣクローンＶＩ５０４を改変した（ＭＡＩＤ６２１１）。図２を参照のこと。ＢＡＣクローンＶＩ５０４は、５’から３’に向かって、約２０ｋｂの５’相同アーム、マウスＡｄａｍ６ａ遺伝子「ａ」、Ｆｒｔ－Ｕｂ－Ｈｙｇ－Ｆｒｔカセット、およびマウスＡｄａｍ６ａ遺伝子「ｂ」を含有する約１５ｋｂのＩ－ＣｅｕＩ－ＡｓｃＩ断片、生殖系列ヒトＶＨ１－６９遺伝子を含有する約９ｋｂのＡｓｃＩ－ＡｓｉＳＩ断片、ヒトＤＨとヒトＪＨ遺伝子を含有する約６０ｋｂの断片、およびマウスＩｇＨイントロンエンハンサー（黒色の楕円）を含有する約８ｋｂの３’マウス相同アーム、ＩｇＭスイッチ領域、およびマウスＩｇＭ遺伝子の一部、を含有する（図３）。
工程１において、ＶＩ５０４を、インビトロで、二つのｇＲＮＡの混合物と複合体化されたＣａｓ９を用いて消化し、ヒト生殖系列ＶＨ１－６９遺伝子の５’および３’を切断した。得られた３’末端および５’末端は、ｐ４６６８５の末端と６０ｂｐの重複がある。次いで、ｐ４６６８５のＸｈｏＩ断片を、Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙによってＶＩ５０４（ＭＡＩＤ６２１１）と組み立て、ＶＩ７３８を作製した。工程２において、ＶＩ７３８をＭｒｅＩで消化して、スペクチノマイシン耐性カセットを除去した。次いでＢＡＣを、ジョイナーオリゴ介在Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって修復し、シームレスな接合部（ΔＭｒｅＩ）を残して、最終的なＬＴＶＥＣ ＶＩ７４８（ＭＡＩＤ６８３３）を作製した。ＬＴＶＥＣは、ＶＩ７４８にＡＮＰ－Ｇ４Ｓコドンの挿入があることを除き、ＶＩ５０４と同一であった。
記載されるドナー断片の正しい組み立て、および本明細書に記載されるＢＡＣクローンＶＩ５０４の生殖系列（ＧＬ）ＶＨ１－６９遺伝子セグメントとＮＰ改変型ＶＨ１－６９遺伝子セグメントの標的置換が、標的化ベクターの構築全体を通じて、表１に記載されるプライマーを使用した配列解析およびポリメラーゼ連鎖反応によって確認された。
Figure 2024501286000004
Figure 2024501286000005
実施例２．ＮＰ改変型ＶＨ遺伝子セグメントを含む齧歯類の生成
本実施例は、そのゲノムが、ＮＰ改変型ＶＨ遺伝子セグメント、例えば、ＡＮＰのＣ末端尾部を含むＶＨ遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、非ヒト動物（例えば、齧歯類）の作製を示す。
ＶＩ７４８標的化ベクターを線形化し、大部分の５’ＶＨ１－８６セグメントを除き、すべての内因性ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨセグメントが欠失した内因性Ｉｇ重鎖可変領域座位（１１１５ＫＯ）に関してホモ接合性であり、ならびにヒトＶκセグメントおよびＪκセグメントの完全なレパートリーと、すべての内因性ＶκおよびＪκセグメントが置換した内因性Ｉｇ軽鎖可変領域κ座位に関してホモ接合性であるゲノムを有する、マウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションした。各標的化ベクターのエレクトロポレーションに使用されたＥＳ細胞（Ｂａｌｂが５０％、Ｃ５７ＢＬ／６が２５％、１２９が２５％のバックグラウンドを有する）のＩｇ重鎖座位を、図４に示す。エレクトロポレーション後、エレクトロポレーションされた細胞を選択培地中で培養した。エレクトロポレーションから１０日後に薬物耐性コロニーをピックアップし、ＴＡＱＭＡＮ（商標）によりスクリーニングして、アンカー改変型ＶＨ１－６９遺伝子セグメントの適切な統合を検出するプライマー／プローブを使用して、過去に報告される（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上述；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７、当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる）ように標的化の正確性について染色体分析した。
フォワードプライマー：ＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧ（配列番号３４）
プローブ：ＣＣＡＧＴＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＧＧＴＡＣＧ（配列番号３５）
リバースプライマー：ＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣ（配列番号３６）
ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．ら、２０１０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２８５～２９４；ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．、２００９年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５３０：３１１～３２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２５：９１～９９、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を使用した。当該方法において、標的ＥＳ細胞は、非コンパクション状態の８細胞ステージのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に注入され、健康で完全にＥＳ細胞由来のＦ０世代マウスが作製された。当該マウスは、アンカー（ＡＮＰ）改変型ＶＨセグメントについてヘテロ接合性であり、アンカー（ＡＮＰ）改変型抗体を発現する。当該改変マウスは、本明細書において、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスと呼称される。
例えば、ＥＳ細胞段階でまたは胚中で、除去されていないターゲティング構築物によって導入された任意のｌｏｘ付加選択カセットを除去するために、薬物選択カセットを、Ｃｒｅ欠失マウス系統（例えば、国際特許出願公開第２００９／１１４４００号を参照、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を交配することにより、リコンビナーゼの続く添加（例えば、Ｃｒｅ処理により）により場合により除去してもよい。場合により、選択カセットをマウス内に保持する。
実施例３．フローサイトメトリー分析による齧歯類の免疫表現型の解析
ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの免疫表現型を判定するために、骨髄および脾臓Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。本試験では、二匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス（例えば、米国特許第８，５０２，０１８号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号を参照のこと。当該特許は各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および実施例２に記述された三匹のＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスが安楽死され、それらの脾臓と骨髄が採取された。骨髄は、８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって大腿骨から採取された。脾臓を解離させ、単一細胞懸濁液とした。脾臓および骨髄調製物由来の赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解させ、続いて２％ＦＢＳを含むＤＰＢＳで洗浄した。単離細胞（合計１×１０６個）を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ社）とともに氷上で１０分間インキュベートし、続いて、表２に記載される抗体パネルで氷上で３０分間標識した。
Figure 2024501286000006
染色後、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒドで固定した。データ取得はＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。細胞サブセットは、以下の戦略を使用して特定した。骨髄成熟：未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔ ＩｇＭ＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉｇｈ ＩｇＭ＋）、プロＢ細胞（ＩｇＭ－ Ｂ２２０ｉｎｔ，ｃ－ＫｉｔｉｎｔＣＤ４３ｈｉｇｈ）、プレＢ細胞（ＩｇＭ－ Ｂ２２０ｉｎｔ、ｃ－Ｋｉｔ－ＣＤ４３ｉｎｔ）。脾臓および骨髄のカッパ／ラムダ：Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ ＣＤ３－）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ ＣＤ１９－）、ＩｇＫ＋ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ ＩｇＫ＋ ＩｇＬ－）、ＩｇＬ＋ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ ＩｇＫ－ ＩｇＬ＋）。脾臓成熟：成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３－）、濾胞性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３－、ＣＤ２１／３５ｉｎｔ ＩｇＭｉｎｔ／＋）、辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３－、ＣＤ２１／３５＋ ＩｇＭ＋）、移行性Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３＋）、Ｔ１ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３＋、ＩｇＭ＋ ＣＤ２３－）、Ｔ２ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３＋、ＩｇＭ＋ ＣＤ２３＋）、およびＴ３ Ｂ細胞（ＣＤ１９＋、Ｂ２２０＋ ＣＤ９３＋、ＩｇＭｉｎｔ ＣＤ２３＋）。
図５Ａ～５Ｆに示されるように、脾臓では、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスにおいて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、同様のレベルのＢ細胞が存在した。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの成熟Ｂ細胞の頻度は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスで観察された成熟Ｂ細胞と類似しているようであるが、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの未成熟細胞は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較してわずかな減少があった。脾臓では、ラムダおよびカッパ陽性Ｂ細胞の頻度は、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスで類似している。
図６Ａ～６Ｆに示されるように、骨髄では、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスにおいて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、同様のレベルのＢ細胞が存在した。骨髄では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスではより多くのプロＢ細胞が存在し、プレＢ細胞は少なかった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの骨髄では、成熟Ｂ細胞が少なく、未成熟Ｂ細胞が多かった。
ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの免疫表現型をさらに解析するために、マウスＩｇＧレベルをウェスタンブロットにより分析した。このアッセイについて、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスのサブセットから血液を採取した。血清分離管（ＢＤ社）に血清を採取し、３０分間インキュベートし、４℃で５分間、９０００ｒｃｆで遠心分離することによって血液から分離した。マウス血清をＰＢＳ中で１：２５に希釈し、次いで非還元条件下で４～２０％のＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲル上で泳動した。メーカー（ＢｉｏＲａｄ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ社）の説明書に従い、ゲルをポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜へと移した。次いでブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ社）中、１０％無脂肪乳で一晩ブロッキングした。４％脱脂粉乳のＴＢＳＴ溶液中、１：２０，０００希釈された抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｃａｔ ＃３１４３２）とともにＰＶＤＦ膜を室温で１時間インキュベートした。次いでブロットを、一洗浄当たり５分間で５回洗浄し、続いてメーカーの説明書に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて一分間発色させた。次いで、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ－４０００ Ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤ Ｃａｍｅｒａ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してブロットを画像撮影した。２０枚の画像が取得されるまで、または画像が完全に感光されるまでのいずれか早い方まで１５秒間隔で画像を取得した。
図７に示されるように、ウェスタンブロットによって測定された場合、血清ＩｇＧレベルはＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスの間で同等であった。この結果から、ＡＮＰマウスのデザイナーＶマウスが、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、正常なＡｂレベルを有することが示唆される。
ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの免疫表現型をさらに解析するために、血清ＩｇＭおよびＩｇＧの合計レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡについては、プレートを１μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ（クローンＡｂ１０２４４５、Ａｂｃａｍ社）を用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＰＢＳ中で洗浄し、１％ＢＳＡのＤＰＢＳ溶液中、室温で１時間、ブロッキングした。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス、またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスのいずれかの血清、およびマウスＩｇＭ標準（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４０１６０４）、またはマウスＩｇＧ標準（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｉ８７６５）を、１％ＢＳＡのＤＰＢＳ溶液中で連続希釈し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＤＰＢＳ中で洗浄し、抗マウスＩｇＭ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号１０２１－０５）または抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号１０３０－０５）のいずれかを使用して、ＩｇＭまたはＩｇＧを検出した。さらに洗浄を行い、次いでＴＭＢ基質（ＢＤ）を添加した。発色させた後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで、４５０ｎｍで吸光度を測定した。標準プロットは、ＩｇＭまたはＩｇＧ標準の非線形回帰（曲線適合、４パラメータ）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで作成され、血清ＩｇＭおよびＩｇＧのレベルが定量された。
図８Ａ～８Ｂに示されるように、ＥＬＩＳＡにより測定された血清ＩｇＧレベルは、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスの間で同等であった。ＥＬＩＳＡにより測定された血清ＩｇＭレベルも、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスの間で同等であった。両方の結果から、ＡＮＰマウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスと比較して、正常なＡｂレベルを有することが示唆される。
抗体によるアンカーの保持は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）によって検証された。プロテインＡ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用してマウス血清から単離された免疫グロブリンを、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに泳動し、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を分離させた。免疫グロブリン重鎖を取り出し、Ｌｙｓ－Ｃ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で一晩消化した。メーカーのプロトコルに従って、Ｃ１８ Ｚｉｐｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、消化物から塩を除去した。ペプチドは、１０ｍｇ／ｍＬ ａ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を含有する７０％ ＡＣＮ／０．１％ ＴＦＡの２．５ｕｌにおいて、各ｚｉｐｔｉｐから溶出して、７０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解されたａ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（Ｐｒｏｔｅａ社）と混合したＢｒｕｋｅｒ Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ Ｔａｒｇｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）に直接適用した。乾燥させて、各標的を、レフレクストロン（ｒｅｆｌｅｘｔｒｏｎ）陽性モードでのＢｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）で、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）により分析した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって、ＡＮＰ改変免疫グロブリンは、ＡＮＰ－ＶＨ‐１－６９改変マウスの血清中でインタクトの状態を維持していることが示唆された（データは示さず）。
実施例４．操作された免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含有する齧歯類における抗体の産生
本実施例は、ゲノムが、本明細書に記載の操作された免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む齧歯類における抗体の生成を示す。本実施例に記載される方法、および／または分野で公知の免疫化の方法を使用して、本明細書に記載の操作された免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含有する齧歯類を、本明細書に記載されるポリペプチドまたはその断片（例えば、所望のエピトープ由来のペプチド）で、または望ましい場合にはポリペプチドまたはその断片の組み合わせで、免疫化することができる。
簡潔に述べると、本明細書に記載される操作された免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含むマウスのコホートに、当分野で公知の免疫化方法を使用して、例えば同族受容体に結合する対象非免疫グロブリンポリペプチドの受容体などの対象抗原でチャレンジを行う。抗体免疫反応を、ＥＬＩＳＡ免疫アッセイ（すなわち血清力価）でモニターする。
免疫化
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照（ｎ＝３）マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変（ｎ＝４）マウスを、標準的な免疫プロトコルを使用して、Ｃ末端ｍＦｃタグに融合されたＮＰＲ３の細胞外ドメインから構成されるタンパク質免疫原（ヒトＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ｍＦｃと称される）で免疫化した。免疫化の開始前、および免疫原ブーストの後にマウスから採血した。最後の採血を行った後にマウスを安楽死させて抗体を単離した。ヒトＮＰＲ３タンパク質（ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグに融合されたＮＰＲ３の細胞外ドメインから構成される；ヒトＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ＭＭＨと呼称される）、および操作されたヒトＮＰＲ３発現細胞（完全長ヒトＮＰＲ３を過剰発現するよう操作されたＨＥＫ２９３細胞；２９３／ｈＮＰＲ３と呼称される）に対する力価分析を行った。
抗血清力価の決定
ＮＰＲ３に対する血清中の抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｐｉｅｒｃｅ社）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中、２μｇ／ｍＬのヒトＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ＭＭＨ抗原で一晩、４℃でコーティングした。プレートは、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で洗浄され、２５０μｌの０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）のＰＢＳ溶液で、１時間、室温でブロッキングされた。ＰＢＳ－Ｔでプレートを洗浄し、免疫前抗血清、および免疫抗血清を、０．５％ ＢＳＡ－ＰＢＳ中で連続三倍希釈し、プレートに１時間、室温で添加した。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）を１：５０００希釈でプレートに加えて、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を基質として使用して、１５～２０分間のインキュベートにより発色させた。酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍの分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）上でプレート読み取りを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、抗体力価を計算した。力価は、補間血清希釈倍率として定義され、結合シグナルはバックグラウンドの２倍である。
細胞に対する抗体力価
操作された細胞に対する抗ＮＰＲ３抗体力価を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）法を使用して決定した。９６ウェルカーボン電極プレート（ＭＳＤ製）を、３７℃で１時間、ＰＢＳ中、２９３／ｈＮＰＲ３細胞またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかをウェル当たり４０，０００個の細胞でコーティングした。細胞コーティング溶液を廃棄し、プレートを、１５０μＬの２％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションすることによりブロッキングし、続いてＰＢＳで洗浄した。免疫前抗血清、および免疫後抗血清を、１％ ＢＳＡ－ＰＢＳ中で連続三倍希釈し、プレートに１時間、室温で添加し、続いて洗浄した。次いでヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃルテニウムコンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社および自社内でルテリウム標識した）を１μｇ／ｍＬでプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。ＭＳＤ社の４Ｘ Ｒｅａｄ緩衝液・界面活性剤非含有を１Ｘに希釈し、１５０μＬを各ウェルに加えて、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）撮像装置で読み取りを行った。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、抗体力価を計算した。力価は、補間血清希釈倍率として定義され、結合シグナルはバックグラウンドの２倍である。
結果
ＮＰＲ３ ｅｃｔｏタンパク質免疫原を用いた免疫化の後、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスにおける液性免疫応答を、組み換えｈＮＰＲ３タンパク質および操作されたヒトＮＰＲ３発現細胞（ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３）を使用して決定した。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス（ｎ＝４）の抗血清は、ｈＮＰＲ３．ｍｍｈタンパク質に対し、ある範囲の高い抗体力価を示し、平均力価は４６５，６２５で、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対象系統（ｎ＝３）の平均力価の３９４，０３２と同等であった（図９）。ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３発現細胞および親ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの平均抗体力価は、それぞれ２６８，７６３および３，９４８であり、このことから当該抗血清はＮＰＲ３に特異的であることが示唆される。同様の結果がＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスでの得られており、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３発現細胞および親ＨＥＫ２９３細胞それぞれについて、平均抗体力価は７２，８２６および５，２１９であった（図１０）。これらの結果から、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス系統と同等の免疫応答を惹起することができることが示唆される。
実施例４．操作された免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを含有する齧歯類で産生された抗体を発現する細胞、および／または当該抗体をコードする核酸の単離
望ましい免疫反応が得られた場合、脾臓細胞（および／または他のリンパ組織）を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させて、それらの生存能を保持し、不死化ハイブリドーマ細胞株を形成させる。ハイブリドーマ細胞株を（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより）スクリーニングし、選択して、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。ハイブリドーマを、所望の相対結合親和性とアイソタイプについてさらに特徴付けてもよい。この技術を使用して、数種の抗原特異的キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインと齧歯類定常ドメインとを保有する抗体）を得る。
重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、完全ヒト抗体の調製のため、望ましいアイソタイプ（定常領域）の重鎖および軽鎖に結合してもよい。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞のような細胞において産生されてもよい。次に、完全ヒト抗体を、相対結合親和性および／または対象の抗原の中和活性に関して特徴付ける。
抗原特異的キメラ抗体、または軽鎖と重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。最初に、ヒト可変領域と齧歯類定常領域とを有する高親和性のキメラ抗体を単離し、親和性、選択性、エピトープなどの望ましい特性に関して特徴付けし、選択する。齧歯類定常領域を所望のヒト定常領域で置換し、完全ヒト抗体を作製する。選択される定常領域が、特定の用途に応じて変わり得る一方で、高親和性の抗原結合性及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。また、例えば、米国特許第７，５８２，２９８号（該文献はその全体が参照により本明細書に具体的に援用される）に記載されるように、骨髄腫細胞に融合されることなく、抗原特異的抗体を抗原陽性Ｂ細胞（免疫化マウス由来）から直接単離することもできる。この方法を使用して、数種の完全ヒト抗原特異的抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインとを有する抗体）を作製する。
具体的には、ＮＰＲ３で免疫化したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスまたはＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの脾臓細胞を、Ｃ末端ヒトＦｃタグ（ｈＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ｈＦｃ）、および米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるＦＩＴＣ－抗ｍＦｃとともに発現されたヒトＮＰＲ３細胞外ドメインで染色した。当該特許は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。単一ＩｇＧ陽性Ｂ細胞および抗原陽性Ｂ細胞を、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により、３８４ウェルプレートの別々のウェルに単離した。これらのＢ細胞由来の抗体遺伝子のＲＴ－ＰＣＲを、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００；２４４ ： ２１７－２２５。その全体で参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法に従い実施した。簡潔に述べると、各Ｂ細胞のｃＤＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応（ＳＵＰＥＲＳＣＩＰＴ（商標）ＩＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって合成した。次いで、得られた各ＲＴ産物を分割し、別々の３８４ウェルプレートの二つの対応するウェルに移して、重鎖配列および軽鎖配列の増幅を行った。得られたＲＴ産物の１セットを、まず、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウス重鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用したＰＣＲにより増幅し、アンプリコンを形成させた。ヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、またはＡＮＰペプチドに特異的なプライマー（ＡＮＰマウスのみ）、およびヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３’縮重プライマーセットを使用した第二ラウンドのＰＣＲを行った。得られたＲＴ産物の別のセットを、まず、ヒトカッパ軽鎖可変領域リーダー配列に特異的な５’縮重プライマー、およびマウスκ軽鎖定常領域に特異的な３’プライマーを使用したＰＣＲにより増幅し、アンプリコンを形成させた。ヒトカッパ軽鎖可変領域配列のフレームワーク１に特異的な５’縮重プライマーセット、およびヒトカッパ軽鎖可変領域配列のフレームワーク４に特異的な３’縮重プライマーセットを使用して、アンプリコンに第二ラウンドのＰＣＲを実施した。重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物をそれぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含有する抗体ベクター、およびカッパ軽鎖定常領域を含有する抗体ベクターにクローニングした。組換えｈＩｇＧ１抗体は、ＣＨＯ Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションによって作製され、さらにスクリーニングが行われた。
実施例５．ＣＨＯ Ｋ１細胞から単離された上清の一次スクリーニング
ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスからは１４６個、およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照からは６５個であった、ＣＨＯ Ｋ１トランスフェクト細胞から回収された上清を含有する、ｈＮＰＲ３－ｍｍＨに対する抗ＮＰＲ３モノクローナル抗体のパネルの結合特性が特徴解析され、結合動態パラメータおよび結合平衡定数は、ＳＰＲ法を使用して決定された。
様々なＮＰＲ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合するＮＰＲ３の平衡解離定数（ＫＤ）、およびｐＨ６．０での解離速度を、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００装置を使用したリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて決定した。すべての結合試験は、ｐＨ７．４（ＰＢＳ－Ｔ＿ｐＨ７．４）ランニング緩衝液中、２５℃で調製された、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、および０．０５％ｖ／ｖ 界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）中で実施された。 Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ表面は最初に抗ヒトＦｃ特異的マウスｍＡｂ（ＲＥＧＮ２５６７）とのアミンカップリングにより誘導体化されて、様々なＮＰＲ３ｍＡｂを捕捉した。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－６ｘＨｉｓタグ（ｈＮＰＲ３－ＭＭＨ）を含んで発現されたヒトＮＰＲ３の外部ドメインの単一１００ｎＭ濃度はＰＢＳ－Ｔ＿ｐＨ７．４ ランニング緩衝液中で調製され、３０μＬ／分の流量で９０秒間、ＮＰＲ３ ｍＡｂ捕捉表面上に注入されて、ＰＢＳ－Ｔ＿ｐＨ７．４ ランニング緩衝液中のそれらの解離を９０秒間モニタリングした。解離相の後、ｐＨ６．０で調製されたＰＢＴ－Ｔ緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ＿ｐＨ６．０）を２分間注射した。各サイクルの終了時に、ＮＰＲ３ ｍＡｂ捕捉表面を２０ｍＭ リン酸を１２秒間注入することによって再生させた。
結合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００評価ソフトウェアを使用した物質移行限界を含む１：１結合モデルにリアルタイム結合センサグラムを適合することにより決定し、一方でＰＢＳ－Ｔ＿ｐＨ６．０中でのＮＰＲ３ ｍＡｂからのｈＮＰＲ３－ＭＭＨの解離は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して解離曲線に適合することで決定された。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、以下のように運動速度から計算した：
Figure 2024501286000007
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離されたＮＰＲ３ ｍＡｂのＫＤ値およびｔ１／２値の中央値および平均値も計算され、表３に提示する。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離されたＮＰＲ３ ｍＡｂのＫＤ値およびｔ１／２値を、図１１～１２にそれぞれ示される箱ひげ図を使用して比較した。
改変ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスのｍＡｂ群のＫＤおよびｔ１／２の平均値と中央値をそれぞれ表３に示す。ＫＤ値およびｔ１／２の比較をそれぞれ図１１および図１２に示す。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスの両方とも、広範なアフィニティ範囲で抗体を生成する能力を有しており、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスよりもＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスのＡｂのほうが、平均値／中央値について、ＫＤ値は小さく、ｔ１／２は長い。これらの結果から、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスが、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスよりも高密度の集団で、高いアフィニティの抗体を産生し得ることが示唆される。
Figure 2024501286000008
Ｌｕｍｉｎｅｘ
ＮＰＲ３で免疫化されたマウスから単離された抗体のＮＰＲ３抗原パネルへの結合を決定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ結合アッセイが実施された。このアッセイでは、抗原は、Ｌｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアに結合されたアミンとした。アミン結合タンパク質用のマイクロスフェアは、以下のように作製された：約１，０００万個のＭｉｃｒｏＰｌｅｘマイクロスフェア（ＭｉｃｒｏＰＬｅｘ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｌｕｍｉｎｅｘ社、カタログ番号ＬＣ１００００－００）を、０．１Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ６．２（活性化緩衝液）の５００μＬ中でボルテックスすることによって再懸濁し、次いで遠心分離して上清を除去した。マイクロスフェアを１６０μＬの活性化緩衝液に再懸濁し、２５℃で、５０ｍｇ／ｍＬのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２４５２５）を１５μＬ、続いて５０ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号２２９８０）を１５μＬ加えることにより、カルボン酸基（－ＣＯＯＨ）を活性化した。１０分後、反応液のｐＨを、５００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ ５．０を加えることにより５．０に低下させた。マイクロスフェアをボルテックスして、続いて遠心分離し、上清を取り除いた。活性化されたマイクロスフェアを、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．０で、２５μｇ／ｍＬのタンパク質抗原［Ｃ末端ヒトＦｃタグを含んで発現されたヒトＮＰＲ３細胞外ドメイン（ｈＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ｈＦｃ）、およびヒトＡＮＰと複合体化されたＣ末端マウスＦｃタグを含んで発現されたヒトＮＰＲ３細胞外ドメイン（ｈＮＰＲ３－ｅｃｔｏ－ｍＦｃ－ｈＡＮＰ）］の５００μＬと直ちに混合した。結合タンパク質／抗体ごとに、固有ビーズ領域を使用した。マイクロスフェア－タンパク質混合物を、２５℃で２時間インキュベートした。１Ｍ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０を５０μＬ加えることによりカップリング反応をクエンチし、マイクロスフェアをボルテックスし、遠心分離した。そして０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する８００ｕＬのＰＢＳで３回洗浄して、非結合タンパク質と他の反応成分を取り除いた。マイクロスフェアを、２％ ＢＳＡおよび０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に、１，０００万個のマイクロスフェア／ｍＬで再懸濁した。
アミン結合タンパク質を含むマイクロスフェアを２７００ビーズ／ｍＬで混合し、次いで、９６ウェルフィルタープレート平底プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号ＭＳＢＶＮ１２５０）上でウェル当たり７５μＬのマイクロスフェアを播種し、個々の抗ＮＰＲ３抗体を含有する上清の２５μＬと混合した。サンプルおよびミクロスフェアを、２５℃で２時間インキュベートし、次いで、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２００ μＬのＰＢＳで２回洗浄した。個々のマイクロスフェアに結合した抗体レベルを検出するために、１００μＬの２．５μｇ／ｍＬ Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号２０６３－０９）の２％ ＢＳＡおよび０．０５％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液を添加し、次いで２５℃で３０分間インキュベートした。サンプルを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む２００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。プレートを、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰｏｎｅｎｔソフトウェアバージョン４．２を用いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭａｐ ３Ｄ機器で読み取った。
１０００を超えるが、５０００未満である、および５０００を超える結合シグナルでｈＮＰＲ３－ｅｃｔｏ－ｈＦｃおよびｈＮＰＲ３－ｅｃｔｏ－ｍＦｃ－ｈＡＮＰに結合した抗体を表４に示す。合計で４３９個のサンプルが試験された。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスからは２３６個のサンプルであり、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスからは２０３個のサンプルであった。結合シグナルを、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）として測定した。表４に示されるように、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離された抗体と比較して、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスからは、＞５０００でｈＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ｈＦｃおよびｈＮＰＲ３ ｅｃｔｏ－ｍＦｃ－ｈＡＮＰ複合体に結合した抗体が高割合で存在した。
Figure 2024501286000009
ブロッキング能力
ヒトＡＮＰ（ｈＡＮＰ）に結合するヒトＮＰＲ３をブロッキングする抗ＮＰＲ３抗体の能力を判定するために、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイが開発された。このアッセイでは、ＮＰＲ３ Ｃ末端でマウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に融合されたヒトＮＰＲ３細胞外ドメイン（アミノ酸Ｇｌｙ２７－Ｓｅｒ４８２）を含む組み換えヒトＮＰＲ３（ｈＮＰＲ３－ｍＦｃ、配列番号またはアクセッション番号）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート上で、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの濃度で４℃で一晩、受動吸収させた。０．５％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）のＰＢＳ溶液を使用して、室温で１時間、非特異的結合部位をブロッキングした。プレートをＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、１：１０希釈された抗ＮＰＲ３抗体上清、または非結合ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の１μｇ／ｍＬを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、その後、組換えビオチン化ｈＡＮＰ（ビオチン－ｈＡＮＰ；Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＩＮＣ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）を最終濃度２００ｐＭまで添加し、１時間インキュベートした。ビオチン－ｈＡＮＰの濃度は、プレートコーティングされたｈＮＰＲ３に対するビオチン－ｈＡＮＰの濃度依存性の結合に関する、ＥＣ５０付近のダイナミックレンジとした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされた１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンを用いてプレート結合したビオチンｈＡＮＰを検出し、メーカーの推奨手順に従ってＴＭＢ基質溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して可視化した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（商標））で測定した。
試験された抗ＮＰＲ３抗体のブロッキング割合を、以下の式を使用して計算した：
Figure 2024501286000010
ｈＮＰＲ３へのビオチン－ｈＡＮＰの結合を、５０％以上ブロッキングした抗体を、ブロッカーとして分類した。
ヒトＡＮＰがヒトＮＰＲ３に結合することをブロッキングする、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス、またはＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスの抗ＮＰＲ３抗体上清の能力を、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイを使用して評価した。表５に示されるように、３３８個の抗ＮＰＲ３抗体上清が、ヒトＮＰＲ３へのヒトＡＮＰの結合をブロッキングすることに関して試験された。１２５個はＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス由来であり、２１３個はＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来であった。１３４個の抗ＮＰＲ３抗体上清が、５０％以上のブロッキング割合で、ビオチン－ｈＡＮＰへのｈＮＰＲ３－ｍＦｃの結合をブロッキングした。１３４個のブロッカーのうち、１７個がＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスに由来し、１１７個がＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスに由来した。これはそれぞれ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスに由来する被験抗体数の１４％および５５％であった。上位５０個のブロッカーのうち、７個はＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス由来であり、４３個はＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来であった。これはそれぞれ、マウスの二つの系統由来で試験されたｍＡｂの合計数のうち、６％と２０％を占める。
この実験では、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、３２％のブロッキング率を示し、非ブロッカーとして分類された。
全体として、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスは、高い特異性でＮＰＲ３に結合し、ヒトＡＮＰに対する組み換えＮＰＲ３タンパク質の結合をブロッキングした抗体をＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスよりも多く産生した。
ＮＰＲ３組み換えタンパク質で免疫化されたＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離された抗ヒトＮＰＲ３モノクローナル抗体の、ヒトＮＰＲ３（ｈＮＰＲ３）発現細胞に結合する能力を、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのアッセイを使用して決定した。
簡潔に述べると、ヒトＮＰＲ３（アミノ酸 Ｍ１－Ａ５４１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ１７３４２）をコードするネオマイシン耐性ｐＬＶＸＮ．ＮＰＲ３発現プラスミドで細胞をトランスフェクトすることによって、ヒトＮＰＲ３を発現するようにＨＥＫ２９３を操作した。市販の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）を用いた蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）で、ＮＰＲ３の発現が検出されなかった非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を、バックグラウンド結合対照として実験に含めた。抗アレルゲンヒトＩｇＧ１抗体および抗イディオタイプマウスＩｇＧ２抗体は、結合に関する非関連抗体対照として含めた。
実験は、以下の手順に従って行われた：フラスコ中で培養されたＮＰＲ３発現細胞および親細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない１ｘＰＢＳ緩衝液で一回リンスし、酵素を含まない細胞解離溶液で、３７℃で１０分間インキュベートし、細胞を剥がした。細胞ペレットをＣａ２＋／Ｍｇ２＋含有１ｘＰＢＳで一回洗浄し、 Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）Ａｕｔｏ Ｔ４ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、マサチューセッツ州ロレンス）を用いて計数した。１ウェル当たり約２．０ｘ１０４個のＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３またはＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルカーボン電極プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、メリーランド州ロックビル）上に別々に播種し、３７℃で１時間インキュベートして、細胞を接着させた。非特異結合部位を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋含有１ｘＰＢＳ中、２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を用いて、室温（ＲＴ）で１時間インキュベーションすることによりブロッキングした。プレート結合細胞に、１：１０希釈の抗ＮＰＲ３抗体上清、または０．２μｇ／ｍＬの対照抗体を添加し、続いて室温で１時間インキュベーションした。次いでプレートを、細胞洗浄ヘッド（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州サニーベール）を備えたＡｑｕａＭａｘ２０００プレートウォッシャーを使用して、非結合の抗体を除去するために洗浄した。室温で１時間、プレート結合したヒトＩｇＧは、重鎖および軽鎖に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧＴＭコンジュゲート化ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）を用いて検出し、プレート結合したマウスＩｇＧ（市販のＮＰＲ３抗体およびｍＩｇＧアイソタイプ対照抗体）は、Ｆｃγ断片に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧＴＭコンジュゲート化ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）で検出した。洗浄後、メーカーの推奨手順に従って、リード緩衝液（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、メリーランド州ロックビル）を用いて発光させ、発光シグナルを、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、メリーランド州ロックビル）を用いて記録した。ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞と親ＨＥＫ２９３細胞の結合シグナルの比率を計算し、抗ＮＰＲ３抗体の結合特異性の指標として報告した。２００ＲＬＵ以上のＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞に対する結合シグナル、および３以上の結合比を有する抗体を、特異的バインダーと分類し、２００ＲＬＵ未満の結合シグナルまたは３未満の結合比の抗体は、非特異的バインダーと分類した。
結果：
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスおよびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離された抗ＮＰＲ３抗体のＮＰＲ３発現ＨＥＫ２９３細胞に特異的に結合する能力は、電気化学発光ベースの結合アッセイにおいて評価された。
実験結果を表６に要約する。粗上清中の合計３３８個の抗ＮＰＲ３抗体を、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞への結合について試験した。そのうち１２５個の抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離されたもので、２１３個の抗体がＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離されたものであった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照から６２個、およびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから１８８個の合計で２５０個の抗ＮＰＲ３抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞に対して２００ＲＬＵ以上の結合シグナルを示し、およびＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３と親ＨＥＫ２９３の結合比は３以上を示したことから、これらの抗体はＮＰＲ３に特異的に結合する能力を有することが示唆される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス由来の抗ＮＰＲ３抗体の５０％、それに比較してＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来では８８％が特異的ＮＰＲ３バインダーであった。上位５０個の特異的バインダーのうち、６個の抗体はＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス由来であり、４４個はＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来であった。このことから、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス由来の抗ＮＰＲ３抗体上清の５％、およびＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来の抗ＮＰＲ３抗体上清の２１％が上位バインダーであったことが示唆される。
実験では、陽性対照として含まれた市販の抗ｈＮＰＲ３－ｍＩｇＧ２抗体はＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞に特異的に結合し、ヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２アイソタイプ対照は両方とも予想通りＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞に結合しなかった。
全体として、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞を用いた結合実験の結果から、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスは、ｈＮＰＲ３発現細胞に特異的に結合する抗体を産生する能力があり、有効性が高いバインダーの存在量は、通常のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスよりもＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離された抗体のほうが高い可能性がある。
精製抗体
ＮＰＲ３への結合に関する、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウス由来の抗ＮＰＲ３抗体の能力を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎２９３、ＡＴＣＣ）において、完全長ヒトＮＰＲ３を安定的に発現するようトランスフェクトされ、続いて高発現でソーティングされた操作細胞株を確立した。得られた細胞株を、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３ Ｈｉｇｈ Ｓｏｒｔ（ＡＣＬ＃９７５２、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社）と命名した。
フローサイトメトリー結合評価については、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３ Ｈｉｇｈ Ｓｏｒｔ細胞を、酵素を含まない細胞解離緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号Ｓ－００４－Ｃ）を用いてリフトし、１回洗浄して、染色緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ、 カルシウムまたはマグネシウムを含まない（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号９２４０）、２％濾過ウシ胎児血清（Ｓｅｒａｄｉｇｍ社、カタログ番号１５００－５００）を含む）中に再懸濁させ、ｆｉｘａｂｌｅ ｇｒｅｅｎ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号Ｌ２３１０１）で染色して、Ｖ底染色プレート（Ａｘｙｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号Ｐ－９６－４５０－Ｖ－Ｃ－Ｓ）に播種した。
ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスおよびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離された精製抗体、市販抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社、ＧＴＸ８４０１５）、またはアイソタイプ対照抗体を、染色緩衝液１：３で、１００ｎＭから２４．４ｐＭに連続希釈し（染色緩衝液のみで被験分子を含まない追加ウェルを含む）、染色プレート中の細胞に添加した。
追加の洗浄工程の後、サンプルを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７－タグ付き二次検出抗体〔抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９－６０７－００３）および抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１１５－６０７－００３）］で染色し、その後、ＣｙｔｏＦｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号５５４６５５）固定緩衝液で固定した。すべてのサンプルは、９６ウェルフィルタープレート（Ｐａｌｌ社、カタログ番号８０２７）を通してＵ底リードプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、カタログ番号３７９９）に濾過し、その後、ｉＱｕｅ ＰＬＵＳサイトメーターを通して泳動させ、各サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。データはｉＱｕｅ Ｆｏｒｅｃｙｔ（登録商標）ソフトウェアでゲーティングされ、ＲＬ１－Ａチャネルの各サンプルの幾何平均を計算し、結果をＰｒｉｓｍ（登録商標）８ソフトウェアの非線形回帰（４パラメータロジスティック）モデルを使用してさらに分析して、ＥＣ５０値を得た。結合の最大倍率を、以下の式を用いて計算した：
Figure 2024501286000013
この式において、「ＭＦＩ幾何平均ＲＬ１－Ａ」とは、精製抗体で染色された細胞からのＲＬ１－Ａチャネルにおける最大平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を指す。「ＭＦＩ幾何平均ＲＬ１－Ａ、二次抗体単独対照」とは、Ａｌｅｘａ６４７タグ付け二次検出抗体のみで染色された細胞からのＲＬ１－ＡチャネルのＭＦＩ値を指す。
表７に示されるように、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離され、ＡＮＰタグ付きで発現された１２個の精製抗ＮＰＲ３抗体（＋ＡＮＰ）、ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離され、ＡＮＰタグなしで発現された１２個の精製抗ＮＰＲ３抗体（－ＡＮＰ）、およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離された８個の精製抗ＮＰＲ３抗体が、フローサイトメトリーによって、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３ Ｈｉｇｈ Ｓｏｒｔ細胞への特異的結合について試験された。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離され、ＡＮＰタグ付きで発現された１２個の精製抗ＮＰＲ３抗体のうち、１１個が、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞への特異的結合を示し、結合値の倍率は、二次検出抗体単独対照を超えて２１～１０１２の範囲であり、ＥＣ５０値は、７．７ｎＭ～＞１０ｎＭの範囲であった。ＡＮＰ－ＶＨ１－６９改変マウスから単離され、ＡＮＰタグなしで発現された１２個の精製抗ＮＰＲ３抗体のうち、１０個が、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞への特異的結合を示し、結合値の倍率は、二次検出抗体単独対照を超えて１３２～８１９の範囲であり、ＥＣ５０値は、６．３ｎＭ～＞１０ｎＭの範囲であった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウスから単離された精製抗ＮＰＲ３抗体のうち、８個すべてが、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞への特異的結合を示し、結合値の倍率は、二次検出抗体単独対照を超えて２１５～７８９の範囲であり、ＥＣ５０値は、２．４ｎＭ～＞１０ｎＭの範囲であった。アイソタイプ対照抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３細胞への結合を示さず、市販の抗ＮＰＲ３抗体は、二次検出抗体単独対照を超えて２２倍の結合でＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ３に結合し、７．６ｎＭのＥＣ５０であった。
Figure 2024501286000014
均等
本発明の少なくとも一つの実施形態のこのような記述されたいくつかの側面を持つ、様々な修正、変更、および改善を当業者であれば容易に思いつくことが当業者には理解されるはずである。このような修正、変更、および改善は本開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。従って、前述の説明および図面は例示のみとしてのものであり、本発明は以下の請求項によって詳細に記述される。
当業者であれば、アッセイまたは本明細書に記述されたその他のプロセスで得られた値に起因する一般的な標準偏差または誤差を認識するであろう。
本発明の背景を説明し、その実践に関して追加的詳細を提供するための本明細書の出版物、ウェブサイトおよびその他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (99)

  1. アンカー改変型Ｉｇポリペプチドをコードする改変免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）セグメントを含む組換え核酸分子であって、
    前記改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする核酸配列と、生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含み、
    前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記生殖系列Ｉｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含み、
    前記アンカーが、同族受容体に結合する、対象非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を含み、ならびに
    任意選択的に前記核酸分子は、他のＶセグメントをすべて欠く、組換え核酸分子。
  2. 前記Ｉｇシグナルペプチドは、前記生殖系列Ｉｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＩｇシグナルペプチドである、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  3. 前記生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ重鎖可変（ＶＨ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
    前記改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする前記核酸配列と、前記生殖系列Ｉｇ ＶＨセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ ＶＨセグメントであり、および
    前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記生殖系列Ｉｇ ＶＨセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、請求項１または請求項２に記載の組換え核酸分子。
  4. 前記生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントが、生殖系列ヒト（ｈ）ＶＨ１－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－１８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－２４セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４５セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－４６セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－５８セグメント、生殖系列ｈＶＨ１－６９セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－２６セグメント、生殖系列ｈＶＨ２－７０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－１６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２１セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－２３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３０－５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３５セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－３８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４８セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－４９セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－５３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６４セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－６６セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７２セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７３セグメント、生殖系列ｈＶＨ３－７４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－２８セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－２セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３０－４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３１セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３４セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－３９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－５９セグメント、生殖系列ｈＶＨ４－６１セグメント、生殖系列ｈＶＨ５－５１セグメント、生殖系列ｈＶＨ６－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－４－１セグメント、生殖系列ｈＶＨ７－８１セグメント、またはそのバリアントである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  5. 前記生殖系列Ｉｇ Ｖセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列ｈＶＨ１－６９セグメントまたはそのバリアントであり、任意選択的に前記Ｉｇシグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号７）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  6. 動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ ＶＨセグメント、
    （ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖多様性（ＤＨ）セグメント、および
    （ＩＩＩ）一つまたは複数のＩｇ重鎖結合（ＪＨ）セグメントを含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  7. （ＩＩ）の前記一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメントが、一つ、複数、またはすべてのヒトＩｇ ＤＨセグメントを含み、および／または
    （ＩＩＩ）の前記一つまたは複数のＩｇ ＪＨセグメントが、一つ、複数、またはすべてのヒトＩｇ ＪＨセグメントを含む、請求項６に記載の組換え核酸分子。
  8. （ＩＩ）の前記一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメント、および（ＩＩＩ）の前記一つまたは複数のＩｇ ＪＨ遺伝子セグメントが再結合され、再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、それによって、前記組換え核酸分子が、動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
    前記改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメント、および
    前記再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列を含む、請求項６または請求項７に記載の組換え核酸分子。
  9. 前記改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントと前記再構成Ｉｇ ＤＨ／ＪＨ配列が再結合され、アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインをコードする再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列を形成し、
    前記アンカー改変型Ｉｇ重鎖可変ドメインが、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされるＦＲ１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、を含む、請求項８に記載の組換え核酸分子。
  10. 前記改変Ｉｇ ＶＨセグメントが、非再構成改変Ｉｇ ＶＨ遺伝子セグメントである、請求項３～８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  11. Ｉｇ重鎖定常領域（ＣＨ）をコードする核酸配列をさらに含み、
    Ｉｇ ＣＨをコードする前記核酸配列が、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ ＶＨセグメント、
    （ＩＩ）前記一つまたは複数のＩｇ ＤＨセグメント、および
    （ＩＩＩ）前記一つまたは複数のＩｇ ＪＨセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、請求項６～１０のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  12. Ｉｇ ＣＨをコードする前記核酸配列は、ＩｇＭアイソタイプをコードするＩｇμ遺伝子、ＩｇＤアイソタイプをコードするＩｇδ遺伝子、ＩｇＧアイソタイプをコードするＩｇγ遺伝子、ＩｇＡアイソタイプをコードするＩｇα遺伝子、および／またはＩｇＥアイソタイプをコードするＩｇε遺伝子を含む、請求項１１に記載の組換え核酸分子。
  13. アンカー改変型Ｉｇ重鎖をコードする核酸配列を含み、前記アンカー改変型Ｉｇ重鎖は、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、
    （ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ重鎖可変ドメイン、および
    （ｉｖ）Ｉｇ ＣＨ、を含む、請求項３～１２のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  14. 前記Ｉｇ ＣＨは、非ヒトＩｇ ＣＨである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  15. 前記非ヒトＩｇ ＣＨは、齧歯類Ｉｇ ＣＨである、請求項１４に記載の組換え核酸分子。
  16. 前記非ヒトＩｇ ＣＨは、ラットＩｇ ＣＨである、請求項１５に記載の組換え核酸分子。
  17. 前記非ヒトＩｇ ＣＨは、マウスＩｇ ＣＨである、請求項１５に記載の組換え核酸分子。
  18. 前記生殖系列Ｉｇ Ｖ遺伝子セグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変（ＶＬ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
    前記改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする前記核酸配列と、前記生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ ＶＬセグメントであり、および
    前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、請求項１または請求項２に記載の組換え核酸分子。
  19. 動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および
    （ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントを含む、請求項１８に記載の組換え核酸分子。
  20. 前記改変Ｉｇ ＶＬセグメントと前記一つまたは複数のＩｇ ＪＬセグメントが再結合され、アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインをコードする再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列を形成し、
    前記アンカー改変型Ｉｇ軽鎖可変ドメインが、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む、請求項１９に記載の組換え核酸分子。
  21. Ｉｇ軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸配列をさらに含み、
    Ｉｇ ＣＬをコードする前記核酸配列が、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ ＶＬセグメント、および
    （ＩＩ）前記一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合（ＪＬ）セグメントの下流であり、およびそれらに動作可能に連結される、請求項１９または請求項２０に記載の組換え核酸分子。
  22. アンカー改変型Ｉｇ軽鎖をコードする核酸配列を含み、前記アンカー改変型Ｉｇ軽鎖は、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、
    （ｉｉｉ）再構成Ｉｇ ＶＬ／ＪＬ配列によってコードされるＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含むＩｇ軽鎖可変ドメイン、および
    （ｉｖ）Ｉｇ ＣＬ、を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  23. 前記Ｉｇ ＣＬは、非ヒトＩｇ ＣＬである、請求項２１または請求項２２に記載の組換え核酸分子。
  24. 前記非ヒトＩｇ ＣＬは、齧歯類Ｉｇ ＣＬである、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
  25. 前記非ヒトＩｇ ＣＬは、ラットＩｇ ＣＬである、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
  26. 前記非ヒトＩｇ ＣＬは、マウスＩｇ ＣＬである、請求項２３に記載の組換え核酸分子。
  27. 前記生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変カッパ（Ｖκ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
    前記改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする前記核酸配列と、前記生殖系列Ｉｇ Ｖκセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ Ｖκセグメントであり、および
    前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記生殖系列Ｉｇ ＶκセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  28. 動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および
    （ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合カッパ（Ｊκ）セグメントを含む、請求項２７に記載の組換え核酸分子。
  29. Ｉｇ軽鎖定常カッパ領域（Ｃκ）をコードする核酸配列をさらに含み、
    Ｉｇ Ｃκをコードする前記核酸配列が、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ Ｖκセグメント、および
    （ＩＩ）前記一つまたは複数のＩｇ Ｊκセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、請求項２８に記載の組換え核酸分子。
  30. 前記生殖系列Ｉｇ ＶＬセグメントまたはそのバリアントは、生殖系列Ｉｇ軽鎖可変ラムダ（Ｖλ）セグメントまたはそのバリアントであり、それによって、
    前記改変Ｉｇ Ｖセグメントが、Ｉｇシグナルペプチドをコードする前記核酸配列と、前記生殖系列Ｉｇ Ｖλセグメントまたはそのバリアントのフレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３をコードする核酸配列との間にアンカーをコードする核酸配列を含む改変Ｉｇ Ｖλセグメントであり、および
    前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドは、動作可能な連結で、
    （ｉ）前記Ｉｇシグナルペプチド、
    （ｉｉ）前記アンカー、および
    （ｉｉｉ）前記生殖系列Ｉｇ ＶλセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３、を含む、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  31. 動作可能な連結で、５’から３’に向かって、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および
    （ＩＩ）一つまたは複数のＩｇ軽鎖結合ラムダ（Ｊλ）セグメントを含む、請求項３０に記載の組換え核酸分子。
  32. Ｉｇ軽鎖定常ラムダ領域（Ｃλ）をコードする核酸配列をさらに含み、
    Ｉｇ Ｃλをコードする前記核酸配列が、
    （Ｉ）前記改変Ｉｇ Ｖλセグメント、および
    （ＩＩ）前記一つまたは複数のＩｇ Ｊλセグメントの下流にあり、およびそれらに動作可能に連結される、請求項３１に記載の組換え核酸分子。
  33. 前記アンカーはリンカーを含み、前記リンカーは、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの受容体結合部分を、前記生殖系列Ｉｇ ＶセグメントまたはそのバリアントのＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３に連結する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  34. 前記リンカーは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む、請求項３３に記載の組換え核酸分子。
  35. 前記アンカーは、ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）のナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）結合部分を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  36. 前記ＮＰの前記ＮＰＲ結合部分は、前記ＮＰのＣ末端尾部を含む、請求項３５に記載の組換え核酸分子。
  37. 前記ＮＰは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）である、請求項３５または請求項３６に記載の組換え核酸分子。
  38. 前記アンカーは、配列ＮＳＦＲＹ（配列番号３）を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  39. 配列番号８として記載される配列またはその縮重バリアント、配列番号１０として記載される配列またはその縮重バリアント、配列番号１１またはその縮重バリアント、および配列番号１２またはその縮重バリアントからなる群から選択される配列を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子。
  40. 請求項１～１０および３３～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターがさらに、非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とする５’および３’相同アームを含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＨの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的に前記非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  41. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＶＨセグメントを置換する、請求項４０に記載の標的化ベクター。
  42. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する、請求項４０または請求項４１に記載の標的化ベクター。
  43. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つの非ヒトＶＨセグメント以外のすべて、またはすべての非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨセグメント、および全ての非ヒトＪＨセグメントを置換する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  44. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との相同組換えの際に、前記標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、前記非ヒトＩｇ重鎖座位で非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能に連結された前記組換え核酸分子を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  45. 前記５’相同アームは、配列番号１１として記載される配列を含み、および／または前記３’相同アームは、配列番号１２として記載される配列を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  46. 請求項１～１７および３３～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターがさらに、非ヒトＩｇ重鎖座位を標的とする５’および３’相同アームを含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ重鎖座位が、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ重鎖座位の非ヒトＩｇ重鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的に前記非ヒトＩｇ重鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ重鎖座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ重鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＨ、ＤＨおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  47. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ重鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ重鎖座位で、一つ以上の非ヒトＶＨセグメント、全ての非ヒトＤＨ遺伝子セグメント、および全ての非ヒトＪＨ遺伝子セグメント、および一つ以上の非ヒトＣＨ遺伝子を置換する、請求項４６に記載の標的化ベクター。
  48. 請求項１～２、１８～２０、２７～２８、３０～３１、および３３～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位が、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ ＣＬの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的に、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  49. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位で非ヒトＶＬセグメントを置換する、請求項４８に記載の標的化ベクター。
  50. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＬセグメントを置換する、請求項４８または請求項４９に記載の標的化ベクター。
  51. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位ですべての非ヒトＶＬセグメントおよびすべての非ヒトＪＨセグメントを置換する、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  52. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との相同組換えの際に、前記標的とされる非ヒトＩｇ重鎖座位は、前記Ｉｇ軽鎖座位で非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能に連結された前記組換え核酸分子を含む、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  53. 請求項１～２、１８～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖座位は、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ軽鎖制御配列に動作可能な連結で含み、任意選択的に、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ軽鎖座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ ＶＬおよび／もしくはＪＬ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  54. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＶＬセグメント、すべての非ヒトＪＬ遺伝子セグメント、および非ヒトＣＬ遺伝子を置換する、請求項５３に記載の標的化ベクター。
  55. 請求項１～２、１８～２０、２７～２８、および３３～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ Ｃκの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的に、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖κ座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖκおよび／もしくはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  56. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で非ヒトＶκセグメントを置換する、請求項５５に記載の標的化ベクター。
  57. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位で一つ以上の非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する、請求項５５または請求項５６に記載の標的化ベクター。
  58. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位ですべての非ヒトＶκセグメントおよびすべての非ヒトＪκセグメントを置換する、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  59. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との相同組換えの際に、前記標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、前記Ｉｇ軽鎖κ座位で非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能に連結された前記組換え核酸分子を含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  60. 請求項１～２および１８～２９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖κ座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖κ座位は、前記組換え核酸分子を、前記Ｉｇ軽鎖κ座位の非ヒトＩｇ軽鎖κ制御配列に動作可能な連結で含む、標的化ベクター。
  61. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖κ座位の非ヒトＶκセグメント、すべての非ヒトＪκ遺伝子セグメント、および非ヒトＣκ遺伝子を置換する、請求項６０に記載の標的化ベクター。
  62. 請求項１～２、１８～２０、３０～３１、および３３～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、前記標的とされた非ヒトＩｇ軽鎖λ座位が、前記組換え核酸分子を、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位の非ヒトＩｇ Ｃλの上流に、およびそれに動作可能な連結で含み、任意選択的に、前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、内因性齧歯類Ｉｇ軽鎖λ座位であり、および／または前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、内因性Ｉｇ Ｖλおよび／もしくはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含み、またはそれらの組み合わせを含む、標的化ベクター。
  63. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメントを置換する、請求項６２に記載の標的化ベクター。
  64. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖座位で一つ以上の非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する、請求項６２または請求項６３に記載の標的化ベクター。
  65. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位ですべての非ヒトＶλセグメントおよびすべての非ヒトＪλセグメントを置換する、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  66. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、前記標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、前記Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された前記組換え核酸分子を含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の標的化ベクター。
  67. 請求項１～２、１８～２６、および３０～３８のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、非ヒトＩｇ軽鎖λ座位を標的とする５’および３’相同アームをさらに含み、それによって、前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との相同組換えの際に、前記標的とされる非ヒトＩｇ軽鎖λ座位は、前記Ｉｇ軽鎖λ座位で非ヒトＩｇ軽鎖λ制御配列に動作可能に連結された前記組換え核酸分子を含む、標的化ベクター。
  68. 前記標的化ベクターと前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位との間の相同組換えの際に、前記組換え核酸分子は、前記非ヒトＩｇ軽鎖λ座位で非ヒトＶλセグメント、すべての非ヒトＪλ遺伝子セグメント、および非ヒトＣλ遺伝子を置換する、請求項６７に記載の標的化ベクター。
  69. 請求項１～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子、または請求項４０～６８のいずれか一項に記載の標的化ベクターを含む、非ヒト動物ゲノムであって、任意選択的に前記非ヒト動物が齧歯類であり、任意選択的に前記齧歯類がラットまたはマウスである、非ヒト動物ゲノム。
  70. 前記組換え核酸が、前記非ヒト動物ゲノムの内因性Ｉｇ遺伝子座にある、請求項６９に記載の非ヒト動物ゲノム。
  71. 請求項１～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子、請求項４０～６８のいずれか一項に記載の標的化ベクター、または請求項６９もしくは請求項７０に記載の非ヒト動物ゲノムを含む、非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  72. 前記組換え核酸分子、前記標的化ベクター、または前記非ヒト動物ゲノムが、前記非ヒト動物または非ヒト動物細胞の生殖系にある、請求項７１に記載の非ヒト動物または非ヒト動物細胞。
  73. 単離細胞に、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を導入することを含む、単離細胞をインビトロで改変する方法。
  74. 導入することが、前記細胞を、請求項４０～６８のいずれか一項に記載の標的化ベクターと接触させることを含む、請求項７３に記載のインビトロの方法。
  75. 前記細胞が、宿主細胞である、請求項７３または請求項７４に記載のインビトロの方法。
  76. 前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項７３または請求項７４に記載のインビトロの方法。
  77. 前記細胞が、齧歯類細胞であり、任意選択的に前記齧歯類細胞が、ラット細胞またはマウス細胞である、請求項７３～７６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
  78. 請求項７６に記載の胚性幹細胞から作製される非ヒト動物胚。
  79. 請求項７６に記載の胚性幹細胞から作製される非ヒト動物。
  80. 請求項７６に記載のＥＳ細胞または前記ＥＳ細胞を含む胚を適切な宿主に移植すること、および前記ＥＳ細胞または前記胚の発生中に適切な条件下で前記宿主を生存可能な子孫へと維持すること、を含む、非ヒト動物を作製する方法。
  81. 前記非ヒト動物は、対照非ヒト動物と比較して、
    （ａ）脾臓において同等の数の成熟Ｂ細胞、
    （ｂ）脾臓において同等の数のカッパ陽性Ｂ細胞、
    （ｃ）脾臓において同等の数のラムダ陽性Ｂ細胞、
    （ｄ）同等のレベルの血清ＩｇＧ、および／または
    （ｅ）同等のレベルの血清ＩｇＭ、を含む、請求項７１～７２および７９のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
  82. 前記非ヒト動物は、対照非ヒト動物と同等の免疫反応を惹起させることができる、請求項７１～７２、７９および８１のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
  83. 複数の抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質がそれぞれ前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含み、任意選択的に、
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
    各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、請求項７１～７２、７９および８１～８２のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
  84. 前記非ヒト動物は、対象の非免疫グロブリンポリペプチドの同族受容体をさらに含む、請求項７１～７２、７９および８１～８３のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
  85. 複数の抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質がそれぞれ前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含み、および対象の前記非免疫グロブリンポリペプチドの前記同族受容体に特異的に結合し、任意選択的に、
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
    各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、請求項７１～７２、７９および８１～８４のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従い作製された非ヒト動物。
  86. 前記同族受容体は、ナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ）である、請求項８４～８５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  87. 前記複数の抗原結合タンパク質のそれぞれが、１Ｘ１０９未満のＫＤ、および／または３０分を超えるｔ１／２を含む、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  88. 前記複数の抗原結合タンパク質のうちの少なくとも１５％は、対象の前記非免疫グロブリンポリペプチドへの前記同族受容体の結合を遮断する、請求項８４～８７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  89. 前記複数の抗原結合タンパク質のうちの５０％超が、細胞表面上に発現される前記同族受容体に結合する、請求項８４～８８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
  90. 前記非ヒト動物が、齧歯類であり、任意選択的に前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、請求項７１～７２、７９、および８１～８９のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従って作製された非ヒト動物。
  91. 抗原結合タンパク質を作製する方法、または前記抗原結合タンパク質をコードする核酸を得る方法であって、
    請求項７１～７２、７９、および８１～９０のいずれか一項に記載の非ヒト動物、または請求項８０に記載の方法に従って作製された非ヒト動物を、抗原を用いて免疫化すること、
    前記非ヒト動物に、前記抗原に結合する、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドを含む前記抗原結合タンパク質を産生させること、または前記タンパク質をコードする核酸を産生させること、を含み、任意選択的に、
    前記抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
    前記抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
    前記抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および前記抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、方法。
  92. 前記抗原結合タンパク質、または前記抗原結合タンパク質をコードする核酸を、前記非ヒト動物または前記非ヒト動物細胞から回収することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記非ヒト動物細胞は、Ｂ細胞またはハイブリドーマである、請求項９２に記載の方法。
  94. 請求項９１に記載の方法に従い回収された非ヒト動物細胞。
  95. 前記非ヒト動物細胞は、Ｂ細胞である、請求項９４に記載の非ヒト動物。
  96. 前記Ｂ細胞は、マウスＢ細胞である、請求項９４または９５に記載の非ヒト動物細胞。
  97. ミエローマ細胞と融合された請求項９４～９５のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞を含む、ハイブリドーマ細胞。
  98. 請求項１～３９のいずれか一項に記載の組換え核酸分子、請求項４０～６８のいずれか一項に記載の標的化ベクター、請求項６９～７０のいずれか一項に記載の非ヒト動物ゲノムにより、コードされる、請求項７１～７２および８１～９０のいずれか一項に記載の非ヒト動物もしくは非ヒト動物細胞により発現される、請求項７３～７６および８０のいずれか一項に記載の方法に従い作製されるまたは請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法に従い作製される非ヒト動物もしくは非ヒト動物細胞により発現される、アンカー改変型Ｉｇポリペプチドであって、任意選択的に、
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、
    各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定され、または
    各抗原結合タンパク質の質量は、前記アンカー改変型Ｉｇポリペプチドの存在を裏付けるものであり、および各抗原結合タンパク質の質量は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法によって決定される、アンカー改変型Ｉｇポリペプチド。
  99. そのＮ末端に配列番号３として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のアンカー改変型Ｉｇポリペプチド。
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