CN117186227A - 编码锚修饰的抗体的核酸以及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文描述了锚修饰的免疫球蛋白多肽，其中锚将所述免疫球蛋白多肽固定到所关注的受体。所述锚修饰的免疫球蛋白多肽通常在N末端处用锚，例如与受体结合的配体的受体结合部分表征。用编码所述锚修饰的免疫球蛋白多肽的重组免疫球蛋白区段基因修饰的非人动物能够制备所述锚修饰的免疫球蛋白多肽。还提供了此类非人动物，以及用于制备和使用所述非人动物的方法和组合物。还提供了用于由非人动物产生锚修饰的免疫球蛋白的方法，以及由此产生的锚修饰的免疫球蛋白。
Description
本申请是申请号为202180085965.3、申请日为2021年12月20日、发明名称为“编码锚修饰的抗体的核酸以及其用途”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2021/064263的PCT国际申请的中国国家阶段申请，该PCT国际申请分别要求2020年12月23日和2021年07月08日提交的美国申请63/129,893和63/219,402的优先权。
相关申请交叉引用
本申请根据35USC§119(e)要求于2020年12月23日提交的美国临时申请序列号63/129,893和于2021年7月8日提交的美国临时申请序列号63/219,402的权益，所述申请中的每一个特此通过引用并入。
序列表
写入文件10507WO01_ST25.txt中的序列表为47千字节，创建于2021年12月17日，并且特此通过引用整体并入。
背景技术
单克隆抗体产品彻底改变了生物制药行业，并且在治疗若干种疾病方面取得了重大进展。尽管取得了这些进展，并且通过将单克隆抗体用于治疗用途获得了知识，但与单克隆抗体难以结合和/或获得的靶点相关的疾病仍然存在，这突出了开发有效治疗方法的不同方法的必要性。
发明内容
本文公开的是认识到，期望将非人动物工程化为改进的体内系统，用于鉴定和开发新的基于抗体的治疗，以及在一些实施例中，抗体(例如，单克隆抗体和/或其片段)，其可用于治疗多种疾病。本文所公开的核酸、非人动物、方法和多肽涉及锚修饰的免疫球蛋白。如本文所描述的锚通常包括与同源受体结合的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分。附着在免疫球蛋白上的锚有助于增加免疫球蛋白与锚的同源受体的亲和力，从而改善免疫球蛋白的结合特性。本文描述了编码锚修饰的免疫球蛋白的核酸分子和/或可用于修饰非人动物，使得所述非人动物可以从头制备锚修饰的免疫球蛋白。
本文所描述的锚修饰的免疫球蛋白可以至少部分由可变区(V)区段编码，例如免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)区段或Ig轻链可变区(VL)区段，经修饰以编码Ig前导序列与种系V区段的框架(FR)和互补决定区(CDR)序列之间的锚并与其可操作地连接的。
因此，还描述了包含靶向载体和非人动物基因组，包括未重排的或重排的经修饰的Ig V区段的核酸分子。还描述了包括本文所描述的核酸分子的非人动物基因组、非人动物细胞和非人动物。
本文所描述的重组核酸分子可以包括编码锚修饰的Ig多肽的经修饰的免疫球蛋白(Ig)可变(V)区段，其中所述经修饰的Ig V区段包括编码所述锚的核酸序列，所述锚位于编码Ig信号肽的核酸序列与编码种系Ig V区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，其中所述锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，以及(iii)所述种系Ig V区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3，其中所述锚包括与同源受体结合的所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分，并且任选地其中所述重组核酸分子缺乏任何其它V区段。本文所描述的重组核酸分子还可以包括一个或多个(未)重排的Ig多样性(D)区段、一个或多个(未)重排的Ig接合(J)区段和/或一个或多个Ig恒定区(C)基因。
在一些实施例中，所述Ig信号肽是所述种系Ig V区段或其变体的所述Ig信号肽。在一些实施例中，所述Ig信号肽包括序列MDWTWRFLFVVAAATGVQS(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，所述锚包括将所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分与所述种系Ig V区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3连接的接头。在一些接头实施例中，所述接头包括序列GGGGS(SEQ ID NO:5)
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体是种系Ig重链可变(VH)区段或其变体，例如是人(h)种系Ig V区段或其变体，例如种系人(h)VH1-2区段、种系hVH1-3区段、种系hVH1-8区段、种系hVH1 18区段、种系hVH1-24区段、种系hVH1-45区段、种系hVH1-46区段、种系hVH1-58区段、种系hVH1-69区段、种系hVH2-5区段、种系hVH2-26区段、种系hVH2-70区段、种系hVH3-7区段、种系hVH3-9区段、种系hVH3-11区段、种系hVH313区段、种系hVH3-15区段、种系hVH3-16区段、种系hVH3-20区段、种系hVH3-21区段、种系hVH3-23区段、种系hVH3-30区段、种系hVH3-30-3区段、种系hVH3-30-5区段、种系hVH3-33区段、种系hVH3-35区段、种系hVH3-38区段、种系hVH3-43区段、种系hVH3-48区段、种系hVH3-49区段、种系hVH3-53区段、种系hVH3-64区段、种系hVH3-66区段、种系hVH3-72区段、种系hVH3-73区段、种系hVH3-74区段、种系hVH4-4区段、种系hVH4-28区段、种系hVH4-30-1区段、种系hVH4 30-2区段、种系hVH4-30-4区段、种系hVH4-31区段、种系hVH4-34区段、种系hVH4-39区段、种系hVH4-59区段、种系hVH4-61区段、种系hVH5-51区段、种系hVH6-1区段、种系hVH7-4-1区段、种系hVH7-81区段或其变体。在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体是种系hVH1-69区段或其变体。在一些实施例中，所述变体是等位基因变体。
在一些实施例中，重组核酸分子可以包括重链可变区基因座，例如可以包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig VH区段，(II)一个或多个Ig重链多样性(DH)区段，以及(III)一个或多个Ig重链接合(JH)区段。在一些实施例中，(II)的所述一个或多个Ig DH区段包括一个、多个或所有人Ig DH区段，和/或(III)的所述一个或多个IgJH区段包括一个、多个或所有人Ig JH区段。在一些实施例中，(II)的所述一个或多个Ig DH区段和(III)的所述一个或多个Ig JH基因区段被重组并形成重排的Ig DH/JH序列，使得所述重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：所述经修饰的Ig VH基因区段和所述重排的Ig DH/JH序列。
在一些实施例中，所述经修饰的Ig VH基因区段和所述重排的Ig DH/JH序列被重组并形成编码锚修饰Ig重链可变结构域的重排的Ig VH/DH/JH序列，其中所述锚修饰的Ig重链可变结构域包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，以及(iii)由所述重排的Ig VH/DH/JH序列编码的所述FR1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在一些实施例中，所述经修饰的Ig VH区段是未重排的经修饰的Ig VH基因区段。
在一些实施例中，本文所公开的重组核酸进一步包括编码Ig重链恒定区(CH)的核酸序列，其中编码Ig CH的所述核酸序列在(I)所述经修饰的Ig VH区段、(II)所述一个或多个Ig DH区段以及(III)所述一个或多个Ig JH区段的下游且与其可操作地连接。在一些实施例中，编码Ig CH的核酸序列包括编码IgM同种型的Igμ基因、编码IgD同种型的Igδ基因、编码IgG同种型的Igγ基因、编码IgA同种型的Igα基因和/或编码IgE同种型的Igε基因。在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括编码锚修饰的Ig重链的核酸序列，其中所述锚修饰的Ig重链包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，(iii)包括由重排的Ig VH/DH/JH序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig重链可变结构域，以及(iv)Ig CH。在一些实施例中，所述Ig CH是非人Ig CH，例如啮齿动物Ig CH、例如大鼠Ig CH或小鼠Ig CH。
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体是种系Ig轻链可变(VL)区段或其变体。在一些实施例中，重组核酸分子可以包括轻链可变区基因座，例如可以包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的VL区段，以及(II)一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。
在一些实施例中，所述经修饰的Ig VL区段和所述一个或多个Ig JL区段被重组并形成编码锚修饰的Ig轻链可变结构域的重排的Ig VL/JL序列，其中所述锚修饰的Ig轻链可变结构域包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，以及(iii)由所述重排的IgVL/JL序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在一些实施例中，重组核酸分子可以包括轻链可变区基因座和编码Ig轻链恒定区(CL)的核酸序列，其中编码Ig CL的所述核酸序列在以下的下游与其可操作地连接：(I)经修饰的Ig VL区段和(II)所述一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。在一些实施例中，所述锚修饰的Ig轻链包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，(iii)包括由重排的Ig VL/JL序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig轻链可变结构域，以及(iv)IgCL。在一些实施例中，所述Ig CL是非人Ig CL，例如啮齿动物Ig CL、例如大鼠Ig CL或小鼠IgCL。
在一些轻链可变区基因座实施例中，所述种系Ig VL区段或其变体是种系Ig轻链可变κ(Vκ)区段或其变体。因此，在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vκ区段和(II)一个或多个Ig轻链接合κ(Jκ)区段。在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vκ区段、(II)一个或多个Ig轻链接合κ(Jκ)以及(III)编码Ig轻链条恒定κ区(Cκ)的核酸序列。
在一些轻链可变区基因座实施例中，所述种系Ig VL区段或其变体是种系Ig轻链可变λ(Vλ)区段或其变体。因此，在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Vλ区段和(II)一个或多个Ig轻链接合λ(Jλ)区段。在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vλ区段，(II)一个或多个Ig轻链接合λ(Jλ)区段，以及编码Ig轻链恒定λ区(Cλ)的核酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括示出为SEQ ID NO:8或其简并变体，或SEQ ID NO:10或其简并变体的序列。
还描述了靶向载体、非人动物细胞(例如，宿主细胞、胚胎干细胞等)和包括核酸分子的非人动物。
还描述了包括本文所公开的重组核酸分子实施例的靶向载体。在一些靶向载体实施例中，所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的非人VH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的除一个外的所有非人VH区段或所有非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。在一些实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是啮齿动物或啮齿动物细胞(例如，啮齿动物胚胎干细胞)中的内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性IgVH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH基因区段、所有非人JH基因区段和一个或多个非人CH基因。在一些实施例中，所述5'同源臂包括示出为SEQ ID NO:11的序列和/或所述3'同源臂包括示出为SEQ ID NO:12的序列。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人VL区段和所有非人JL区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的所有非人VL区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。在一些实施例中，本文所描述的靶向载体包括本文所描述的核酸分子和靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段、所有非人JL基因区段和所述非人CL基因。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的一个或多个非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的所有非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括在所述Ig轻链κ基因座处与非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段、所有非人Jκ基因区段和所述非人Cκ基因。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的所有非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。在一些实施例中，靶向载体包括如本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段、所有非人Jλ基因区段和所述非人Cλ基因。
本文还描述了非人动物基因组，其包括如本文所描述的重组核酸分子和/或靶向载体。在一些非人动物基因组实施例中，所述非人动物基因组在所述非人动物基因组的内源性Ig基因座处包括如本文所描述的重组核酸分子，例如，所述非人动物基因组包括如本文所描述的靶向载体，其中所述靶向载体包括靶向所述内源性Ig基因座的5'和3'同源臂。在一些实施例中，所述非人动物基因组是啮齿动物基因组。在一些实施例中，所述非人动物基因组是大鼠基因组。在一些实施例中，所述非人动物基因组是小鼠基因组。
本文还描述了包括如本文所描述的重组核酸分子、靶向载体和/或非人动物基因组的非人动物或非人动物细胞。在一些非人动物实施例中，如本文所描述的非人动物在其种系中，例如在生殖细胞中包括如本文所描述的重组核酸分子、靶向载体或非人动物基因组，例如能够将如本文所描述的所述重组核酸分子、靶向载体和/或非人动物基因组传递给其后代。
还描述了在体外使用本文所描述的重组核酸分子，例如靶向载体来制备非人细胞、非人胚胎和/或非人动物的方法。在一些实施例中，修饰分离的细胞的体外方法包括将如本文所描述的重组核酸分子引入分离的细胞中，例如通过使所述细胞与如本文所描述的靶向载体接触。在一些方法实施例中，所述细胞是宿主细胞。在一些方法实施例中，所述细胞是胚胎干(ES)细胞。在一些实施例中，如本文所描述的或根据本文所描述的方法制备的细胞是啮齿动物细胞，例如其中所述啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
还描述了使用如本文所描述的所述核酸分子、所述非人细胞和/或所述非人动物来制备锚修饰的抗原结合蛋白的方法。还描述了非人动物胚胎和非人动物，其可以包括如本文所描述的胚胎干细胞和/或由其发育(例如，产生)。此类胚胎或非人动物可以通过一种方法发育，所述方法包括将如本文所描述的ES细胞植入胚胎中，和/或将包括所述ES细胞的胚胎植入合适的宿主体内，并且在所述ES细胞或所述胚胎发育成可存活子代期间将所述宿主维持在合适的条件下。
在如本文所描述的一些非人动物实施例中(例如，其中非人动物包括如本文所描述的重组核酸分子、靶向载体和/或基因组和/或根据如本文所描述的方法产生的实施例)，与对照非人动物相比，非人动物包括：(a)脾脏中相当数量的成熟B细胞，(b)脾脏中相当数量的κ阳性B细胞，(c)脾脏中相当数量的λ阳性B细胞，(d)相当水平的血清IgG和/或(e)相当水平的血清IgM。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物能够产生与对照非人动物相当的免疫应答。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物包括多个抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白各自包括锚和/或源自如本文所描述的重组核酸分子、靶向载体和/或非人动物。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物进一步包括所关注的非免疫球蛋白多肽的同源受体，其中所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分用作锚。在一些非人动物实施例中，如本文所描述的非人动物包括多个抗原结合蛋白，所述多个抗原结合蛋白各自与所述所关注的非免疫球蛋白多肽的所述同源受体特异性结合，其中所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分用作锚。
如本文所描述的，所关注的非免疫球蛋白多肽(其中所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分用作锚)可以包括心房利钠肽(ANP)。在一些实施例中，ANP的c末端尾部(例如，NSFRY(SEQ ID NO:3))可以用作同源受体的锚。在一些实施例中，所述同源受体包括利钠肽受体(NPR)，例如NPR3或其部分。
在一些非人动物实施例中，其中如本文所描述的非人动物用所述所关注的非免疫球蛋白多肽(例如，ANP)的所述同源受体(任选地其中所述同源受体包括利钠肽受体(NPR)，例如，NPR3)免疫，其受体结合部分(例如，NSFRY(SEQ ID NO:3))用作如本文所描述的锚，如本文所描述的非人动物进一步包括与所述同源受体结合的多种抗原结合蛋白，每种所述抗原结合蛋白包括小于1×109的KD和/或超过30分钟的t1/2。在一些实施例中，至少15％的所述多种抗原结合蛋白能够阻断和/或阻断所述同源受体与所述所关注的非免疫球蛋白多肽的结合。在一些实施例中，超过50％的所述多种抗原结合蛋白与在细胞表面上表达的所述同源受体结合。
在本文所描述的一些非人动物实施例中，所述非人动物是啮齿动物。在本文所描述的一些非人动物实施例中，所述非人动物是大鼠。在一些非人实施例中，所述非人动物是小鼠。
还描述了由本文所描述的核酸分子编码或由本文所描述的非人动物制备的锚修饰的抗原结合蛋白。
本文描述了产生抗原结合蛋白或获得编码所述抗原结合蛋白的核酸的方法，所述方法包括(i)用抗原(例如，所关注的非免疫球蛋白多肽的所述同源受体，其中所述所关注的非免疫球蛋白多肽的所述受体结合部分用作锚)免疫本文所描述的或根据本文所描述的方法制备的非人动物(例如，包括编码锚修饰的Ig多肽的经修饰的免疫球蛋白(Ig)可变(V)区段的非人动物)，以及(ii)允许所述非人动物产生对所述抗原的免疫应答，包含与所述抗原结合的抗体或编码所述抗体的核酸。一些实施例进一步包括从所述非人动物或非人动物细胞，例如B细胞回收所述抗原结合蛋白或编码所述抗原结合蛋白的核酸，并且任选地将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。一些实施例进一步包括将回收的核酸克隆到表达构建体中，并且任选地在宿主细胞中表达所述表达构建体。在一些克隆实施例中，所述方法进一步包括克隆所述回收的核酸，其中所述回收的核酸在具有人Ig恒定区编码序列的框架中编码Ig可变结构域。本文还描述了所述B细胞、与所述B细胞融合的杂交瘤或表达从所述B细胞回收的核酸的所述宿主细胞。在一些实施例中，每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在。在一些实施例中，通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定每种抗原结合蛋白的质量。在一些实施例中，每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且每种抗原结合蛋白的质量通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定。
本文还描述了锚修饰的Ig多肽，其(a)由本文所描述的重组核酸分子、本文所描述的靶向载体或本文所描述的非人动物基因组编码，(b)由本文所描述的非人动物或非人动物细胞表达，(c)由根据本文所描述的方法制备的所述非人动物或非人动物细胞表达，和/或(d)通过本文所描述的任何方法产生。
本文所公开的非人动物、细胞、核酸和组合物的其它特点、目的和优点在下述某些实施例的详细描述中是显而易见的。然而，应理解，尽管指出了某些实施例，但详细描述仅为了说明而非限制而给出。
附图说明
本文包含的附图由下图组成，仅用于说明目的，并且不作为限制。
图1示出了可用作Cas9/GA修饰的供体DNA的ANP修饰的VH基因区段的示例性非限制性实施例的图示，未按比例绘制。还示出了限制识别位点(XhoI、Mrel、EcoRI、AvrII、Mrel)和大观霉素(Spectinomycin)抗性基因(SPEC)。在此非限制性实施例中，用编码心房利钠蛋白(ANP)的C末端尾部(NSFRY；SEQ ID NO:3)的序列修饰人VH1-69基因区段，以形成包括ANP修饰的VH1-69基因区段的供体DNA。通常，未填充的形状表示人序列，填充的形状表示鼠序列，并且虚线形状表示非人和非鼠序列。
图2示出了用于修饰BAC克隆VI504中VH1-69基因的DNA供体(示出为SEQ ID NO:10)的示例性非限制性实施例。示出了以下特征：
-一种有义DNA序列，其包含
(a)由种系人VH1-69区段编码的二分信号肽的最后7个密码子(参见标记为“信号肽”的拆分箭头)；编码整个信号多肽的核苷酸序列示出为SEQ ID NO:6；并且整个信号多肽的氨基酸序列示出为SEQ ID NO:7，
(b)种系Ig VH1-69区段，其包含外显子1、内含子1和外显子2(参见DNA序列正上方标记为“VH”的拆分箭头)
(c)种系Ig VH1-69区段的内含子1(“内含子”)，
(d)核苷酸序列编码心房利钠肽(ANP)(SEQ ID NO:3)的C末端尾部和G4S接头(SEQID NO:5)，
(e)编码FR1、CDR1(图案化框)、FR2、CDR2(图案化框)、FR3和CDR3(图案化框)的种系VH1-69区段的部分以及其氨基酸序列(参见标记为IgHV1-69的拆分箭头)，以及
(e)23-mer重组信号序列(RS-23拆分)，
-ANP修饰的VH1-69区段的概念翻译，其包含前导序列(标记为ANP-G4S-VH1-69)，
-用于在体外用Cas9切割VI504的crRNA结合位点(标记为5'VH1-69Cas9和PAM)，
-用于供体与VI504的Gibson组装的5'和3'重叠(分别标记为“5'VH1-69重叠”和3'VH1-69重叠的箭头的黑线)，以及
-由序列下方的对角条纹框指示的限制性酶位点：用于将大观霉素抗性盒连接到供体中的EcoRI和AvrII位点，用于从pUC载体主链中去除供体的XhoI位点，以及用于在通过接合物寡核苷酸介导的Gibson组装进行无缝修复之前从修饰的BAC中去除Spec盒的MreI位点。
图3示出了根据实例1将ANP修饰的VH1-69区段插入BAC克隆VI504以产生靶向载体VI748的非限制性示例性实施例的图示，未按比例绘制。通常，未填充的形状表示人序列(例如，未填充三角形表示人VH1-69区段、人DH区段和人JH区段)，填充的形状表示鼠序列(例如，填充的三角形表示内源性鼠VH区段(未标记)，填充的箭头表示鼠Adam6a“a”和Adam6b“b”基因，表示Ig增强子的实心椭圆形和表示鼠Igμ基因“IgM”的实心箭头)，并且虚线形状表示非人和非鼠序列(例如，氯霉素(chloramphenicol)抗性基因“CM”、位点特异性重组酶识别位点“Frt位点”、潮霉素(hygromycin)抗性基因“HYG”和大观霉素抗性基因“SPEC”)。
图4示出了通过电穿孔将靶向载体插入小鼠ES细胞的基因组中的免疫球蛋白重链可变区基因座的非限制性示例性实施例的图示，未按比例绘制。电穿孔后，此非限制性示例性实施例保留内源性VH区段，其被描绘为Adam6a(“a”)基因上游的填充的三角形。通常，未填充的形状表示人序列(例如，未填充三角形表示人VH1-69区段、人DH区段和人JH区段)，填充的形状表示鼠序列(例如，填充的三角形表示内源性鼠VH区段(未标记)，填充的箭头表示鼠Adam6a“a”和Adam6b“b”基因，表示Ig增强子的实心椭圆形和表示鼠Igμ基因“IgM”的实心箭头)，并且虚线形状表示非人和非鼠序列(例如，氯霉素抗性基因“CM”、位点特异性重组酶识别位点“Frt位点”、潮霉素抗性基因“HYG”和大观霉素抗性基因“SPEC”)
图5A-5F示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，图比较了来自ANP-VH1-69修饰的小鼠与对照小鼠的群体脾细胞。图5A-B提供了用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(A)每个脾脏的细胞总数(y轴)、CD19+细胞/脾脏的数量(y轴)或(B)每个脾脏(y轴)的淋巴细胞(CD19+细胞)的百分比。图5C-5D提供了用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(C)每个脾脏的成熟B细胞(CD19+IgDhiIgMint)和过渡B细胞(CD19+IgDintIgMhi)的总数(y轴)或(D)每个脾脏的成熟B细胞(CD19+IgDhiIgMint)和过渡B细胞(CD19+IgDintIgMhi)的百分比。图5E-F提供了用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(E)每个脾脏的CD19+κ+细胞和CD19+λ+细胞的总数(y轴)或(F)每个脾脏的CD19+κ+细胞和CD19+λ+细胞的百分比(y轴)。
图6A-6F示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，图比较了从ANP-VH1-69修饰的小鼠的股骨分离的群体骨髓细胞与对照小鼠。图6A-B提供了用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(A)每个股骨的细胞总数(y轴)和每个股骨的CD19+B细胞数量(y轴)或(B)每个股骨的淋巴细胞(CD19+细胞)的百分比。图6C-D提供了用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(C)每个股骨的CD43+ckit+原B细胞的总数(y轴)和每个股骨的CD43-ckit-前B细胞的数量(y轴)或(D)每个股骨的CD43+ckit+原-B细胞或CD43-ckit-前B细胞的百分比。图6E-F提供了(E)用ANP修饰的VH1-69区段(ANP)修饰的小鼠或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)的(E)每个股骨的未成熟B细胞和成熟B细胞的总数(y轴)或(F)每个股骨的未成熟B细胞和成熟B细胞的百分比(y轴)。
图7示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，通过蛋白质印迹分析分析了来自ANP-VH1-69修饰的动物与对照对照动物的血清IgG水平。
图8A-B示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，(A)血清小鼠(m)IgG或(B)从ANP-VH1-69修饰的动物(ANP)或包括人源化Ig基因座的对照动物(对照)分离的血清mIgM的浓度(μg/mL；y轴)。
图9示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，图比较了ANP-VH1-69修饰的小鼠(ANP)或包括蛋白抗原上的人源化Ig基因座的对照动物(对照)的免疫应答(抗体滴度；y轴)。在测试的血清中，3个血清样品来自第3次增强后的出血，1个来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的第5次增强后。对于对照小鼠，2个血清样品来自第6次增强后的出血，1个来自第9次增强后。
图10示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，图比较了ANP-VH1-69修饰的小鼠(ANP)或包括蛋白抗原上的人源化Ig基因座的对照动物(对照)的免疫应答(抗体滴度；y轴)。在测试的血清中，3个血清样品来自第3次增强后的出血，1个来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的第5次增强后。对于对照小鼠，2个血清样品来自第6次增强后的出血，1个来自第9次增强后。
图11示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，使用箱线图的图比较了hNPR3-MMH与NPR3单克隆抗体(mAb)结合的KD值(y轴)，所述单克隆抗体是从ANP-VH1-69修饰的小鼠(ANP)或包括在25℃下在蛋白抗原上的人源化Ig基因座的对照动物(对照)中分离的。
图12：示出了与本发明的非限制性实施例相关的结果，使用箱线图的图比较了hNPR3-MMH与NPR3单克隆抗体(mAb)结合的t1/2值(y轴)，所述单克隆抗体是从ANP-VH1-69修饰的小鼠(ANP)或包括在25℃下在蛋白抗原上的人源化Ig基因座的对照动物(对照)中分离的。
定义
本发明的范围由本文所附权利要求书限定，并且不受本文所描述的特定实施例的限制；本领域的技术人员在阅读本公开内容后将认识到可以等同于这些所描述的实施例或者在权利要求书的范围内的多个修改。一般而言，除非另有明确指示，否则术语应符合其在本领域中的理解含义。本文和下文提供了某些术语的明确定义；这些和其它术语在说明书自始至终在特定情况下的含义根据上下文对于本领域技术人员是明确的。下述术语和其它术语的另外定义在说明书各处阐述。本说明书内引用的参考文献或其相关部分通过全文引用的方式并入本文。
在权利要求书中使用如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修改权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素的任何优先权、优先级、或顺序优于另一个权利要求元素或者方法的动作被执行的时间顺序，而是仅用作用于将具有某个名称的一个权利要求元素与具有相同名称(但使用顺序术语)的另一元素进行区分的标签，从而区分这些权利要求元素。
除非明确指出相反，否则说明书和权利要求中的冠词“一个”和“一种”应该理解为包含复数指代物。在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述应当被视为是满足以下情况，即组成员中的一个、多于一个或全部存在于、被应用于给定的产品或方法中，或以其它方式与给定的产品或方法相关，除非指出相反或根据上下文明显不同。本发明包含这样的实施例，其中所述组的刚好一个成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。本发明还包含实施例，在所述实施例中，所述组中多于一个或全部成员存在于、使用于或以其它方式关联给定的产品或过程。此外，应当理解，本发明涵盖所有的变化、组合和置换，其中来自一条或多条所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性用语等被引入从属于同一基础权利要求的另一个权利要求(或者相关的任何其它权利要求)中，除非另外指明或除非对于本领域的普通技术人员来说明显会引起矛盾或不一致。当要素以列表的形式(例如，以马库什组或类似形式)呈现时，应当理解这些要素的每个亚组也被公开，并且任何要素可从该组中去除。应当理解，一般而言，在本发明或本发明的方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，本发明或本发明各方面的某些实施例由此类要素、特征等组成，或基本上由此类要素、特征等组成。为了简洁起见，这些实施例并不是在每种情况下都用本文的那么多词语来具体描述。还应当理解，本发明的任何实施例或方面可明确地从权利要求排除，不管在说明书中是否描述了此类具体排除。
如本专利申请中所用，术语“约”和“大约”可等同使用。本申请中使用的有或无约/大约的任何数值意指涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动，例如+/-5％。
施用：是指将组合物向受试者或系统施用(例如，向细胞、器官、组织、生物体或其相关组分或一组组分)。所属领域的技术人员将了解，施用途径可以根据例如组合物正施用于的受试者或系统、组合物的性质、投药目的等而变化。
例如，在一些实施例中，向动物受试者(例如，向人或啮齿动物)施用可以是支气管(包含通过支气管滴注)、经颊、肠内、皮内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、脑室内、粘膜、鼻内、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管内(包含通过气管内滴注)、透皮、阴道内和/或玻璃体内。在一些实施例中，施用可以涉及间歇给药。在一些实施例中，施用可以涉及连续给药(例如，灌注)达至少一段选定的时间。在一些实施例中，由本文所公开的非人动物产生的抗体可以向受试者(例如，人受试者或啮齿动物)施用。在一些实施例中，药物组合物包含由本文所公开的非人动物产生的抗体。在一些实施例中，药物组合物可以包含缓冲液、稀释剂、赋形剂或其任何组合。在一些实施例中，包含由本文所公开的非人动物产生的抗体的药物组合物可以包含在用于储存或施用的容器中，例如小瓶、注射器(例如，IV注射器)或袋(例如，IV袋)。
亲和力：是指抗原结合蛋白与其结合配偶体之间的相互作用的强度，例如抗体与特定表位之间。与表位特异性结合的抗体相对于其靶表位的KD通常为约10-9M或更低(例如，约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或约1×10-12M)。KD可以通过表面等离子体共振(例如BIACORETM)；酶联免疫测定(ELISA)或其它众所周知的方法来测量。
抗体：是指免疫球蛋白抗原结合蛋白。四聚体抗体包括四个多肽免疫球蛋白(Ig)链，例如通过二硫键相互连接的两个Ig重(H)链和两个Ig轻(L)链。每个重链包括Ig重链可变结构域和Ig重链恒定区或结构域(CH)。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个Ig轻链包括Ig轻链可变结构域和Ig轻链恒定区(CL)。
Ig重链可变结构域和Ig轻链可变结构域可以各自进一步细分为穿插有被称为框架区(FR)的更保守区的被称为互补决定区(CDR)的高变区。Ig重链可变结构域和轻链可变结构域中的每一个包括三个CDR和四个FR，其按以下顺序从氨基末端排列到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以简称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以简称为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
抗原结合蛋白是指免疫球蛋白、抗体、抗体、结合蛋白等，例如单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、微抗体、双抗体和抗独特型(anti-Id)抗体以及上述任一种的表位结合片段。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”也指共价双功能抗体，例如美国专利申请公开20070004909，其全部内容通过引用并入本文，以及Ig DARTS，如在美国专利申请公开20090060910中公开的那些，所述美国专利公开的全部内容通过引用并入本文。
生物活性：是指任何药剂在生物系统、体外或体内(例如，生物体内)具有活性的特征。例如，当存在于生物体中时，在该生物体内具有生物学效应的药剂被认为具有生物学活性。
在其中蛋白质或多肽具有生物活性的特定实施例中，赋予蛋白质或多肽至少一种生物活性的蛋白质或多肽的一部分通常被称为“生物活性”部分。
同源：是指通常相互作用的两种生物分子(例如，受体以及其配体)。
相当的：是指彼此可能不相同但足够相似以允许在其间进行比较使得可以基于所观察到的差异或相似性而合理地得出结论的两种或更多种药剂、实体、情况、条件组等。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，对于两个或两个以上此类药剂、实体、情形、条件组等，在任何给定情况下被视为相当所需的同一性程度如何。
保守性：是指保守性氨基酸取代，即一个氨基酸残基被另一个具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基取代。通常，保守性氨基酸取代不会显著改变蛋白质的功能特性，例如，所关注的非免疫球蛋白多肽与其同源受体结合的能力。侧链具有相似化学特性的氨基酸组实例包含：脂族侧链，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族羟基侧链，例如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，例如天冬酰胺和谷氨酰氨；芳香族侧链，例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，例如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，例如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸取代群组包含例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。
在一些实施例中，保守性氨基酸取代可以是蛋白质中的任何原生残基被丙氨酸取代，如例如丙氨酸扫描突变诱发中所使用。在一些实施例中，进行保守性取代，其在Gonnet,G.H.等人,1992,《科学(Science)》256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值，所述文献特此通过全文引用的方式并入本文。在一些实施例中，如果取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值，则该取代是适度保守取代。
对照：是指本领域理解的“对照”的含义，即比较结果的标准。通常，对照通过分离变量以得出有关此类变量的结论而用于增进实验完整性。在一些实施例中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较的反应或测定。“对照”可以指“对照动物”。“对照动物”可具有如本文所述的修饰，与本文所述的修饰不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。在一个实验中，施加“测试”(即，所测试的变量)。在第二个实验中，即“对照”，不施加所测试的变量。对照可以是阳性对照或阴性对照。
在一些实施例中，对照是历史对照(即，此前进行的测试或测定，或此前已知的量或结果)。在一些实施例中，对照为或包括印刷或以其它方式保存的记录。
参考核酸分子的简并变体编码多肽，所述多肽具有与参考核酸编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，并且具有与参考核酸分子基本相同的核酸序列，但是由于遗传密码的简并而存在差异。
断裂：是指与DNA分子(例如，与如基因或基因座等内源性同源序列)的同源重组事件的结果。
在一些实施例中，断裂可实现或代表插入、缺失、取代、置换、错义突变或DNA序列移码或其任何组合。插入可包含插入整个基因、基因片段例如外显子(其可具有除内源性序列外的起源(例如，异源序列))、或者从特定目的基因衍生或分离的编码序列。在一些实施例中，断裂可以增强基因或基因产物(例如由基因编码的蛋白质)的表达和/或活性。在一些实施例中，断裂可以减少基因或基因产物的表达和/或活性。在一些实施例中，断裂可以改变基因或编码的基因产物(例如，编码的蛋白质)的序列。在一些实施例中，断裂可以改变染色体的序列或基因组中的染色体位置。在一些实施例中，断裂可以截断或分裂基因或已编码的基因产物(例如已编码的蛋白质)。在一些实施例中，断裂可以延伸基因或所编码的基因产物。在一些此类实施例中，断裂可以实现融合蛋白的组装。在一些实施例中，断裂可影响基因或基因产物的水平但不影响其活性。在一些实施例中，断裂可影响基因或基因产物的活性但不影响其水平。在一些实施例中，断裂可对基因或基因产物的水平无显著影响。在一些实施例中，断裂可对基因或基因产物的活性无显著影响。在一些实施例中，断裂可对基因或基因产物的水平或活性都无显著影响。在一些实施例中，显著效果可以通过例如但不限于斯图登氏T测试(Student'sT-test)来测量。
内源性基因座或内源性基因：是指在引入本文所描述的改变、断裂、缺失、插入、修饰、取代或置换之前，在亲本或参考生物体(或细胞)中发现的遗传基因座。
在一些实施例中，内源性基因座包括在自然界中发现的全部或部分序列。在一些实施例中，内源性基因座为野生型基因座。在一些实施例中，参考生物体为野生型生物体。在一些实施例中，参考生物体为工程化的生物体。在一些实施例中，参考生物体为实验室繁育的生物体(无论是野生型还是工程化的)。
内源性启动子：指与内源性基因或遗传基因座自然相关的启动子，例如在野生型生物体中。
工程化的：通常是指被人工操纵的方面。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解的，即使实际的操作是对先前的实体进行的工程化的多核苷酸或细胞的子代通常仍然被称为“工程化的”。此外，本领域的技术人员将认识到，可以通过多种可用的方法来实现本文所述的“工程化”。当两个或更多个在自然界中没有按顺序连接在一起的序列被人工操纵以在工程化的多核苷酸中彼此直接连接时，多核苷酸可以被认为是“工程化的”。在一些实施例中，工程化的多核苷酸可以包括调控序列，所述调控序列在自然界中与第一编码序列存在操作性连接，但与第二编码序列不存在操作性链接，所述调控序列通过人工连接，从而与第二编码序列操作性地连接。可替代地或另外地，在一些实施例中，各自编码在自然界中彼此不连接的多肽元件或结构域的第一核酸序列和第二核酸序列可在单个经改造的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施例中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，此前不存在的新遗传物质已经被引入，或者此前存在的遗传物质已被改变或移除)，则该细胞或生物体可被视为“工程化的”。
在一些实施例中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统的选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体)，所述计算机系统被编程以执行分析或比较，或以其它方式分析、推荐和/或选择序列、改变等。可替代地或另外地，在一些实施例中，“工程化”可涉及使用体外化学合成方法和/或重组核酸技术，例如核酸扩增(例如，经由聚合酶链反应)、杂交、突变、转化、转染等、和/或各种受控交配方法中的任一种。如本领域技术人员将理解的，各种已建立的此类技术(例如，用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染等)在本领域中是众所周知的，并且在本说明书中引用和/或讨论的各种一般和更具体的参考文献中进行了描述。参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第2版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),1989；通过全文引用的方式并入本文。
基因：指染色体中编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。为了清楚起见，术语“基因”通常是指编码多肽的核酸的一部分；所述术语可以任选地涵盖调控序列，这在上下文中对于本领域普通技术人员将是清楚的。该定义无意排除将术语“基因”应用于非蛋白质编码表达单元，而是为了阐明，在大多数情况下，本文档所用的术语是指编码多肽的核酸。
在一些实施例中，基因包含编码序列(即，编码特定产物的序列)。在一些实施例中，基因包含非编码序列。在一些实施例中，基因可以包含编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列两者。在一些实施例中，基因可以包含例如可以控制或影响基因表达(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)的一个或多个方面的一个或多个调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。
免疫球蛋白抗原受体的可变结构域，例如抗体编码在一组基因区段中，在本文中也称为“区段”，所述区段沿着染色体顺序定位，并且进行体细胞重组以形成完整的可变结构域外显子。可以在以下中找到遗传的人基因区段的构型，例如，人基因区段的种系构型，例如人基因区段在人种系基因组(例如，传递到下一代的基因组)中的顺序：Lefranc,M.-P.,《实验和临床免疫遗传学(Exp.Clin.Immunogenet.)》,18,100-116(2001)，通过全文引用的方式并入本文，其还显示了在种系构型的人免疫球蛋白重链基因座内发现的功能性基因区段和假基因。基因区段被分类为可变(V)基因区段(其中每个也可以被单独称为V区段)、多样性(D)基因区段(其中每个也可以被单独称为D区段)或接合(J)基因区段(其中每个也可以被单独称为J区段)。种系DNA中每种类型的基因区段都有多个拷贝，但携带受体的淋巴细胞中每种类型的受体链只有一个拷贝表达
涉及若干种遗传组分的一系列重组事件作用于从基因区段(例如V、D和J)的有序排列装配免疫球蛋白。已知基因区段的这种装配是不精确的，并且因此，通过组合不同基因区段和经由不精确接合形成独特连结两者实现免疫球蛋白多样性。通过称为体细胞超突变的过程生成进一步的多样性，其中改变所述免疫球蛋白的可变区序列，以增加对于抗原的亲和力和特异性。本文中提及的Ig基因区段，例如Ig V区段包含种系Ig V区段的变体。种系Ig区段的变体，例如种系Ig V区段包含其多态性(例如，等位基因)变体、其体细胞高突变变体、其重组变体和其简并变体。
Ig区段的编码区的序列多态性，例如种系Ig区段的等位基因变体的序列，在以下中进行了描述：Pallarès,N.等人,(1998)《实验和临床免疫遗传学》,15,8-18；Barbié,V.和Lefranc,M.-P.(1998)《实验和临床免疫遗传学》,15,171-183；Martinez,C.和Lefranc,M.-P.(1998)《实验和临床免疫遗传学》,15,184-193；Pallarès,N.等人,(1999)《实验和临床免疫遗传学》,16,36-60(1999)，以及Ruiz,M.等人,(1999)《实验和临床免疫遗传学》,16,173-184，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。等位基因种系Ig区段的表达也可以在万维网(www)上以两种格式找到，即imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/#B，其通过与等位基因*01比较显示了分配给不同等位基因的所有已知序列的比对，以及imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/#C，其通过与等位基因*01比较提供了不同等位基因的核苷酸突变和对应的氨基酸变化的描述。还参见EP专利第3 128009号，所述文献的通过全文引用的方式并入本文。
如果Ig V区段包括以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，与种系区段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的核酸序列同源性，或编码与由种系Ig V区段编码的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同源性的氨基酸。
在一些实施例中，如果Ig V区段包括以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，与种系区段的核酸序列同源性介于80％至99％之间。在一些实施例中，如果Ig V区段包括以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，与种系区段的核酸序列同源性介于85％至99％之间。在一些实施例中，如果Ig V区段包括以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，与种系区段的核酸序列同源性介于90％至99％之间。在一些实施例中，如果Ig V区段包括以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，与种系区段的核酸序列同源性介于95％至99％之间。
如果Ig V区段编码以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，一种与种系Ig V区段编码的氨基酸序列具有介于80％至99％之间的氨基酸序列同源性的氨基酸。如果Ig V区段编码以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，一种与种系Ig V区段编码的氨基酸序列具有介于85％至99％之间的氨基酸序列同源性的氨基酸。如果Ig V区段编码以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，一种与种系Ig V区段编码的氨基酸序列具有介于90％至99％之间的氨基酸序列同源性的氨基酸。如果Ig V区段编码以下一个或多个区，则其可以被认为是种系Ig V区段的重组的或体细胞高突变的变体：FR1、FR2和/或FR3，一种与种系Ig V区段编码的氨基酸序列具有介于95％至99％之间的氨基酸序列同源性的氨基酸。
免疫球蛋白分子是一种Y形多肽，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，每条链都有两个结构组分：一个可变结构域和一个恒定结构域。它是由基因区段装配形成的重链和轻链的可变结构域，而恒定结构域通过RNA剪接与可变结构域融合。尽管装配(或连接)基因区段的机制对于重链和轻链是相似的，但轻链只需要一个连接事件(即V与J)，而重链需要两个连接事件(即D与J和V与DJ)。
通常地，免疫球蛋白重链可变结构域由可变结构域外显子编码，所述可变结构域外显子是由免疫球蛋白重链可变(VH)基因区段(也称为VH区段)与免疫球蛋白重链多样性(DH)基因区段(也称为DH区段)和免疫球蛋白重链接合JH基因区段(也称为JH区段)重组而成。免疫球蛋白轻链可变结构域通常由可变结构域外显子编码，所述可变结构域外显子是由免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段(也称为VL区段)与免疫球蛋白轻链接合(JL)基因区段(也称为JL区段)的体细胞重组形成的。
重链和轻链可变区的基因区段的组装(分别称为VDJ重组和VJ重组)由侧接每个基因区段的保守非编码DNA序列(称为重组信号序列(RSS))引导，其确保DNA在相对于V、D和J编码序列的精确位置重排(参见例如，Ramsden,D.A.等人,1994,《核酸研究(Nuc.AcidsRes.)》22(10):1785-96；通过全文引用的方式并入本文)。每个RSS由七个核苷酸的保守嵌段(七聚体)组成，所述七聚体与编码序列(例如，V、D或J区段)连续，然后是间隔子(12bp或23bp)和九个核苷酸的第二个保守嵌段(九聚体)。尽管12bp或23Bp间隔子在个体之间存在相当大的序列差异是可以容忍的，但这些序列的长度通常不会变化。免疫球蛋白基因区段之间的重组遵循通常称为12/23规则的规则，其中侧接具有12bp间隔子(或12聚体)的RSS的基因区段通常与侧接23bp间隔子的基因区段(或23聚体；参见例如Hiom,K.和M.Gellert,1998,《分子细胞(Mol.Cell.)》1(7):1011-9；通过全文引用的方式并入本文)。
除非另有说明，或除非本领域普通技术人员明显会出现矛盾或不一致，否则未提及RSS的未重排的基因区段被认为包括所述基因区段与之自然相关的两个RSS，例如，侧接、可操作地连接等。在一些实施例中，本文中未重排的基因区段可以包括呈其种系(例如，野生型)构型的基因区段，例如，种系VH基因区段和种系JH基因区段的两侧各侧接23聚体RSS。相反，种系DH基因区段，例如未重排的DH基因区段在每侧侧接12聚体RSS。
因此，未重排的基因区段也可以指呈其种系构型的基因区段，包含与此类种系构型相关的任何RSS。此外，呈其种系构型的多个基因区段通常不仅是指每个单独的基因区段呈其种系(例如，未重排的)构型，还指功能基因区段的顺序和/或位置。参见例如，Lefranc,M.-P.,《实验和临床免疫遗传学》,18,100-116(2001)；通过全文引用的方式并入本文，用于人V、D和J基因区段的种系构型。
每个V区段包括编码Ig信号或前导(L)肽的核酸序列，所述肽与编码免疫球蛋白可变结构域的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的一部分的核酸序列可操作地连接。每个D基因区段都有助于免疫球蛋白重链可变结构域的CDR3。每个J基因区段也有助于免疫球蛋白可变结构域的CDR3和FR4。FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的氨基酸位置基于以下中描述的独特的编号：Lefranc等人,(2003)《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27:55-77，并且也可以在www.imgt.org上查看。
异源：是指来自不同来源的药剂或实体。例如，当用于提及存在于特定细胞或生物体中的多肽、基因或基因产物时，所述术语阐明相关多肽或其片段、基因或其片段或基因产物或其片段：(1)是人工工程化的；(2)通过人工(例如，通过基因工程化)引入细胞或生物体(或其前体)；和/或(3)不是由相关细胞或生物体(例如，相关细胞类型或生物体类型)自然产生或存在于相关细胞或生物体中。另一个实例包含多肽或其片段、基因或其片段或其基因产物或片段，其通常存在于特定的天然细胞或生物体中，但已被修饰，例如，通过突变或置于非天然相关的和在一些实施例中非内源性调节元件(例如，启动子)的控制下。
宿主细胞：是指已被引入异源(例如，外源性)核酸或蛋白质的细胞。本领域技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅指特定的主题细胞，而且还用于指该细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代可能会与亲本细胞不相同，但仍包含在术语“宿主细胞”的范围内。
在一些实施例中，宿主细胞为或包括原核细胞或真核细胞。在实施例中，宿主细胞为或包括哺乳动物细胞。一般来讲，宿主细胞是适于接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而与该细胞被指定所属的生命界无关。示例性细胞包含原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四重杂交瘤。
在一些实施例中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，细胞是真核细胞且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏细胞(Sertoli cell)、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞，和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施例中，细胞包括一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如细胞)。在一些实施例中，宿主细胞为或包括分离的细胞。在一些实施例中，宿主细胞为组织的一部分。在一些实施例中，宿主细胞为生物体的一部分。
人源化：指非人起源的分子(例如，核酸、蛋白质等)，其一部分已被对应的人分子的对应部分置换，从而使经修饰的(例如，人源化)分子保留其生物功能和/或维持执行保留的生物功能的结构。相比之下，“人”等涵盖只来源于人的分子，例如分别只包括人核苷酸和氨基酸序列的人核苷酸或蛋白质。术语“人(源化)”用于反映人(源化)分子可为(a)人分子或(b)人源化分子。
同一性：就序列的比较而言，是指由本领域已知的许多不同算法确定的同一性，所述算法可以用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，使用ClustalW v.1.83(慢)比对(采用开放缺口罚分10.0、延伸缺口罚分0.1)和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)来确定本文所述的同一性。
免疫球蛋白是指存在于血清中或在免疫系统的B细胞上表达的一类多肽和编码所述多肽的核酸，其作为抗体发挥作用，例如抗原结合蛋白。
非免疫球蛋白多肽是指与同源受体结合的配体，例如多肽。示例性和众所周知的非免疫球蛋白多肽:同源受体对包含但不限于，例如与同源G蛋白偶联受体(GPCR)结合的那些非免疫球蛋白多肽。示例性GPCR包含但不限于趋化因子受体、胰高血糖素受体(例如，GLP1:GLP1R)、降钙素受体、黑皮质素受体。这些和其它同源GPCR，包含与其结合的非免疫球蛋白多肽在本领域中是众所周知的。参见例如，Wu等人,(2017)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》429:2726-45，所述问下通过全文引用的方式并入本文。另外的非限制性和示例性非免疫球蛋白多肽(配体):同源受体对包含
a.与同源受体酪氨酸激酶结合的配体，例如，如但不限于以下的配体：表皮生长因子(EGF)、胰岛素、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。
b.DLL:Notch受体对，
c.B7:CD28/CLTA4/PD1受体对，
d.臂板蛋白:丛蛋白受体对，
e.PCSK9/LDLR对，
f.HLA:LILR对，
g.HLA:KIR对，
h.RGD配体:整合素对，
i.胰淀素:CALCR/RAMP，例如RAMP1/2/3对
j.利钠肽(例如，ANP、BNP、CNP等):利钠肽受体(NPR、NPR3等)对等。
配体:受体对可能包含蛋白酶和抑制剂。
体外：是指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：是指在多细胞生物体，如人和/或非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的语境中，该术语可以用于指在活细胞内(与例如体外系统相对)发生的事件。
分离的：是指已经(1)从最初生产时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其缔合的组分中的至少一些组分中分离出的物质和/或实体，和/或(2)通过人工设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与其最初缔合的约10种或更多种其它组分分离。在一些实施例中，分离的药剂是至少约80％或更纯的。如果物质基本上不含其它组分，则其是“纯的”。在一些实施例中，如将由本领域的技术人员所理解，在与某些其它组分(例如，一种或多种载体或赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等))组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施例中，计算不包含此类载体或赋形剂的物质的分离百分比或纯度。
仅举一个实例，在一些实施例中，在以下情况下，出现在自然界中的生物聚合物，如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：(a)由于其起源或衍生来源，不与在其天然状态下伴随其的部分或全部组分缔合；(b)其基本上不含来自在自然界中产生其的物种的相同物种的其它多肽或核酸；或(c)由来自细胞或其它表达系统的组分表达或以其它方式与所述细胞或其它表达系统的组分缔合，所述细胞或其它表达系统不属于在自然界中产生所述生物聚合物的物种。因此，举例来说，在一些实施例中，化学合成或在细胞系统中合成的多肽被视为“已分离”的多肽，所述细胞系统不同于在自然界中产生其的细胞系统。可替代地或另外地，在一些实施例中，已历经一种或多种纯化技术的多肽在其已与a)在自然界中与其关联的；和/或b)当最初产生时与其关联的其它组分分离的程度上可被认为是“分离的”多肽。
前导序列或信号肽：是指引导免疫球蛋白重链或轻链通过内质网的免疫球蛋白信号或前导(L)肽，并且随后在组装最终抗体之前从重链或轻链上切割。其也可以指编码信号或前导肽的核酸序列。每个V基因区段包括由所述区段的外显子1和外显子2编码的前导序列(参见例如，图2)，所述前导序列紧邻编码种系Ig V区段的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的外显体2序列的上游。Ig信号或前导序列在本领域中是众所周知的。参见例如，Lefranc等人,(2003)《发展与比较免疫学》27:55-77，通过全文引用的方式并入本文，并且也可以在地址为imgt.org的万维网(www)上查看。还参见Lefranc和Lefranc(2020)《生物医学(Biomedicines)》8(9):1-117。
非人动物：是指任何不是人的脊椎动物。非人动物可能是圆口动物、硬骨鱼、软骨鱼(例如，鲨鱼或鳐鱼)、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。在一些实施例中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛或啮齿动物。在一些实施例中，非人动物可以是大鼠或小鼠。
核酸在其最广义上是指任何化合物和/或物质，其被或可以被结合到寡核苷酸链中，并且通常可以与核酸分子、核酸序列、核苷酸分子、核苷酸分子互换，所述术语也可彼此互换。
在一些实施例中，“核酸”是通过磷酸二酯键被掺入或可被掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以看出，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包括单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”为或包括RNA；在一些实施例中，“核酸”为或包括DNA。在一些实施例中，“核酸”为一个或多个天然核酸残基、包括一个或多个天然核酸残基或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中，“核酸”为一个或多个核酸类似物、包括一个或多个核酸类似物或由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中，核酸类似物与“核酸”的差别在于核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，“核酸”为一个或多个“肽核酸”、包括一个或多个肽核酸或由一个或多个肽核酸组成，所述肽核酸在本领域中是已知的并且在主链中具有肽键而非磷酸二酯键，其被认为在本发明的范围之内。可替代地或另外地，在一些实施例中，“核酸”具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，“核酸”为一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包括一个或多个天然核苷、或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施例中，“核酸”为一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基以及其组合)、包括一个或多个核苷类似物或由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施例中，与天然核酸中的糖相比，“核酸”包括一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，“核酸”具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施例中，“核酸”具有编码多肽片段(例如肽)的核苷酸序列。在一些实施例中，“核酸”包含一个或多个内含子。在一些实施例中，“核酸”包含一个或多个外显子。在一些实施例中，“核酸”包含一个或多个编码序列。在一些实施例中，“核酸”通过下述方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶学合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施例中，“核酸”至少为3个或更多个残基长。在一些实施例中，“核酸”为单链的；在一些实施例中，“核酸”为双链的。在一些实施例中，“核酸”具有包括至少一个元件的核苷酸序列，所述至少一个元件编码多肽或其片段，或者是编码多肽或其片段的序列的互补体。在一些实施例中，“核酸”具有酶学活性。
可操作地连接的：是指并置，其中所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。
在其它实施例中，可操作连接不需要邻接。例如，彼此“可操作地连接的”未重排的可变区基因区段能够重排以形成重排的可变区基因，这些未重排的可变区域基因区段可能不一定彼此连续。可操作地彼此连接的并与连续恒定区基因连接的未重排的可变区基因区段能够重排以形成重排的可变区基因，所述重排的可变区基因与恒定区基因一起表达为抗原结合蛋白的多肽链。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包含与所关注的基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制所关注的基因的表达控制序列。
术语“表达控制序列”是指影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。“表达控制序列”包含合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳质定性的序列；以及当需要时，增强蛋白分质泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列一般包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常地，这种控制序列包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包含其存在对表达和加工至关重要的组分，并且还可以包含其存在有利的另外的组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
生理条件：具有其在细胞或生物体生活和/或繁殖的条件下本领域理解的含义参考条件。在一些实施例中，所述术语是指生物体或细胞系统在自然界中可能出现的外部或内部环境的条件。在一些实施例中，生理条件是存在于人或非人动物体内的那些条件，尤其是存在于所关注靶部分处和/或外科手术部位内的那些条件。生理条件通常包含例如20-40℃的温度范围、大气压力1、pH 6-8、1-20mM的葡萄糖浓度、以大气水平的氧浓度和如它在地球上遇到的重力。在一些实施例中，实验室中的条件在生理条件下操纵和/或维持。在一些实施例中，生理条件在生物(例如，非人动物)中遇到。
多肽：是指氨基酸的任何聚合链。
在一些实施中，多肽具有在天然中存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有不在天然中存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有这样的氨基酸序列：其含有在自然中彼此单独存在的部分(即，来自两种或更多种不同的生物体，例如人和非人部分)。在一些实施例中，多肽具有由于通过人工行为来设计和/或产生而工程化的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽可包括多个片段或由多个片段组成，所述片段各自相对于彼此以与目的多肽中发现的那种不同的空间排列在相同亲本多肽中发现(例如在亲本中直接连接的片段可在目的多肽中在空间上分开，或反之亦然，和/或片段可在目的多肽中以与在亲本中不同的次序存在)，使得目的多肽是其亲本多肽的衍生物。
重组：指通过重组手段设计、工程化、制备、表达、产生或分离的核酸和/或多肽，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽，从重组组合人多肽文库中分离的多肽(Hoogenboom H.R.,1997《生物技术趋势(TIB Tech.)》15:62-70；Hoogenboom H.和ChamesP.,2000,《今日免疫学(Immunology Today)》21:371-378；Azzazy H.和Highsmith W.E.,2002,《临床生物化学(Clin.Biochem.)》35:425-445；Gavilondo J.V.和Larrick J.W.,2002,《生物技术(BioTechniques)》29:128-145)，从为转基因人免疫球蛋白基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.等人,1992,《核酸研究》20:6287-6295；Little M.等人,2000,《今日免疫学》21:364-370；Kellermann S.A.和Green L.L.,2002,《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology)》13:593-597；Murphy,A.J.等人,2014,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》111(14):5153-5158；所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文)或通过涉及将所选序列元件彼此剪接的任何其它方式制备、表达、产生或分离的多肽。
在一些实施例中，此类所选序列元件中的一个或多个元件是在自然界中发现的。在一些实施例中，此类选定的序列元件中的一个或多个是通过计算机模拟(in silico)来设计的。在一些实施例中，一个或多个此类选定的序列元件由已知序列元件(例如，来自天然或合成来源)的诱变(例如，体内或体外)产生。例如，在一些实施例中，重组多肽包括在目的源生物(例如人、小鼠等)的基因组(或多肽)中发现的序列。在一些实施例中，重组多肽包括在两种不同生物(例如人和非人生物)中，在自然界中彼此分开存在的序列(即，来自两种或更多种不同生物，例如人和非人部分)。在一些实施例中，重组多肽具有来源于诱变(例如在体外或体内，例如在非人动物中)的氨基酸序列，使得重组多肽的氨基酸序列是这样的序列，其虽然源于多肽序列且与多肽序列相关，但可能并非天然存在于非人动物体内的基因组内。
参考：是指与所关注的药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值进行比较的标准或对照药剂、动物，队列、个体，群体、样品，序列或值。“参考”或“对照”可以指“参考动物”或“对照动物”。“参考动物”可以具有如本文所述的修饰，与本文所述不同的修饰或不具有修饰(即，野生型动物)。典型地，如所属领域的技术人员所理解，参考药剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或值是在与用于测定或表征所关注的药剂、动物(例如哺乳动物)、群组、个体、群体、样品、序列或值的条件相当的条件下测定或表征。
在一些实施例中，参考药剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或值的测试和/或测定基本上与所述药剂、动物、群组、个体、群体、样品、序列或值的测试或测定同时进行。在一些实施例中，参考药剂、动物、队列、个体、群体、样品、序列或值为历史参考，其任选地以有形介质体现。在一些实施例中，参考可以指对照。“对照”等，例如作为参考动物的“对照”或“对照”是指包括人源化重和κ可变区基因座的小鼠，其中小鼠能够繁殖。这些对照小鼠通常在以下中描述：Macdonald等人,(2014)《美国国家科学院院刊》111:5147-52和补充信息，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
体细胞重组：是指VH、DH和JH基因区段在免疫球蛋白重链基因座处的重组，或VL和JL基因区段在免疫球蛋白轻链基因座处的重组。在骨髓中B细胞发育期间，体细胞重组发生在抗原接触ad之前。在重链基因座处，一个DH和一个JH随机重组，在被称为D-J接合的过程中去除所有中间DNA。接下来，将随机VH区段重组为重排的DHJH区段。免疫球蛋白轻链基因座处的重组以类似的方式发生。VL基因区段和JL基因区段组合，并且在被称为V-J接合的过程中重组，去除其之间的所有DNA。
基本上：指表现出所关注的特征或特性的全部或接近全部的程度或度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在的完全性缺失。
实质同源性：是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则这两个序列通常被认为是“实质上同源的”。同源残基可以是相同的残基。可替代地，同源残基可以是具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水”或“亲水”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的取代可以通常被认为是“同源”取代。典型的氨基酸分类汇总如下：
如本领域所熟知的，可以使用多种算法中的任何一种来比较氨基酸或核酸序列，所述算法包含商业计算机程序中可用的那些，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、有空位的BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序在以下中进行了描述：Altschul，S.F.等人,1990,《分子生物学杂志》,215(3):403-410；Altschul,S.F.等人,1996,《酶学方法(Methods in Enzymol.)》266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,《核酸研究》,25:3389-402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编辑)《生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南(Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins)》,Wiley,1998；以及Misener等人,(编辑)《生物信息学方法和方案(Bioinformatics Methods and Protocols》(《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》,第132卷),胡马纳出版社(Humana Press),1998。除了鉴定同源序列以外，上文提及的程序通常还提供同源性程度的指示。
在一些实施例中，如果两个序列的至少95％或更多的对应的残基在残基的相关序列段上是同源的，则认为这两个序列是基本同源的。在一些实施例中，相关序列段为完全序列。在一些实施例中，相关序列段为至少9个或更多个残基。在一些实施例中，相关序列段包含沿着完全序列的邻接的残基。在一些实施例中，相关序列段包含沿着完全序列的非邻接的残基，例如通过多肽或其一部分的折叠构象集中在一起的非邻接的残基。在一些实施例中，相关序列段为至少10个或更多个残基。
实质同一性：是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如将由本领域的普通技术人员所理解，如果两个序列在对应的位置上含有相同残基，则这两个序列通常被认为是“实质上相同的”。如本领域所熟知的，可以使用多种算法中的任何一种来比较氨基酸或核酸序列，所述算法包含商业计算机程序中可用的那些，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、有空位的BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序在以下中进行了描述：Altschul，S.F.等人,1990,《分子生物学杂志》,215(3):403-410；Altschul,S.F.等人,1996,《酶学方法》266:460-80；Altschul,S.F.等人,1997,《核酸研究》,25:3389-3402；Baxevanis,A.D.和B.F.F.Ouellette(编辑)《生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南》,Wiley,1998；以及Misener等人,(编辑)《生物信息学方法和方案》(《分子生物学方法》,第132卷),胡马纳出版社,1998。除了鉴定相同序列之外，上述程序通常提供对同一性程度的指示。
在一些实施例中，如果两个序列的至少95％或更多的对应的残基在残基的相关序列段上是相同的，则认为这两个序列是基本相同的。在一些实施例中，相关序列段为完全序列。在一些实施例中，相关序列段为至少10个或更多个残基。
靶向载体或靶向构建体：是指包括靶向区的多核苷酸分子。靶向区包括这样的序列：该序列与靶细胞、组织或动物中的序列相同或实质上相同，并且提供了靶向构建体经由同源重组至所述细胞、组织或动物的基因组内的位置的整合。还包含使用位点特异性重组酶识别位点(例如loxP或Frt位点)靶向的靶向区。
在一些实施例中，如本文所述的靶向构建体进一步包括特定目的核酸序列或基因、可选择标记物、对照和/或调控序列、以及允许通过外源添加蛋白质介导的重组的其它核酸序列，所述蛋白质帮助或促进涉及此类序列的重组。在一些实施例中，如本文所述的靶向构建体进一步包括全部或部分的所关注的基因，其中所关注的基因是编码全部或部分的多肽的异源基因，所述多肽具有与内源性序列编码的蛋白质相似的功能。在一些实施例中，如本文所述的靶向构建体进一步包括全部或部分的所关注的人源化基因，其中所关注的人源化基因编码全部或部分的多肽，所述多肽具有与内源性序列编码的多肽相似的功能。在一些实施例中，靶向构建体(或靶向载体)可以包括由人工操纵的核酸序列。例如，在一些实施例中，靶向构建体(或靶向载体)可构建为含有含两个或更多个序列的经工程化的或重组多核苷酸，所述两个或更多个序列不以自然界中的顺序连接在一起，而是由人工操纵为在经工程化的或重组多核苷酸中彼此直接连接。
转基因或转基因构建体：指通过人工，如本文所描述的方法引入细胞的核酸序列(编码例如，所关注的多肽，全部或部分)。转基因对于它所被引入其中的转基因动物或细胞可为部分或完全异源的，即外源的。转基因可以包含一个或多个转录调控序列和任何其它核酸，诸如内含子或启动子，它们对于选定的核酸序列的表达可为必需的。转基因可以包含一个或多个可选择标志物，所述可选择标志物允许随后选择已经接受转基因的子代(例如，细胞)。
转基因动物、转基因非人动物或Tg+：在本文中可互换使用，并且是指任何非天然存在的非人动物，其中所述非人动物的一个或多个细胞全部或部分含有异源核酸和/或编码所关注的多肽的基因。
在一些实施例中，异源核酸序列和/或基因通过引入前体细胞直接或间接引入细胞，通过有意的基因操纵，如通过显微注射或通过感染重组病毒。术语基因操纵不包含经典育种技术，而是涉及重组DNA分子的引入。该分子可以整合进染色体内，或者它可以是染色体外复制的DNA。术语“Tg+”包含异源核酸和/或基因杂合或纯合的动物，和/或具有异源核酸和/或基因的单拷贝或多拷贝的动物。
靶向载体：指能够运输与其缔合的所关注的核酸的核酸分子，特别是将所关注的核酸靶向插入另一个核酸分子，例如供体质粒、非人动物基因组等。
在一些实施例中，载体能够在宿主细胞(诸如真核和/或原核细胞)中进行染色体外复制和/或表达它们所连接的核酸。能够引导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”或“构建体”。
野生型：其本领域理解的含义是指在“正常”(与突变体、患病、工程化的、改变的等相反)状态或背景下，具有自然界中发现的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
本发明的其它特征、目的和优点在下面一些实施例的详细描述中是显而易见的。然而，应理解，在指示本发明的一些实施例的同时，给出的详细描述仅仅是说明，而不是限制。所属领域的技术人员从详细描述将显而易见属于本发明范围内的各种变化和修改。
具体实施方式
尽管基于抗体的治疗在治疗若干种疾病方面有显著的前景，但开发与顽固靶点结合的特别有效的抗体药剂仍然是一个挑战。本文描述了锚修饰的免疫球蛋白(Ig)和编码其的经修饰的Ig V区段，其中所述锚至少包括与同源受体结合的配体(例如，非免疫球蛋白多肽)的受体结合部分。包括经修饰的Ig V区段的动物可以产生多种锚修饰的免疫球蛋白，以响应于与锚同源的受体的免疫。
不受理论的束缚，认为锚的作用是增加动物中响应于同源受体的抗原攻击而从头产生的抗体的亲和力，例如，通过与特异性结合同源受体的抗体同时结合同源受体和/或允许那些在没有锚的情况下通常不会扩增的抗体的亲和力成熟，以响应于同源受体的抗原攻击。因此，本文所公开的非人动物产生的多种免疫球蛋白可以包括锚修饰的免疫球蛋白，所述锚修饰的免疫球蛋白以高亲和力与同源受体结合，由此增加免疫球蛋白的群体，从中可以发现针对先前难治性靶标的主要候选物。
核酸分子，包含靶向载体和动物基因组等。
本文所描述的锚修饰的免疫球蛋白可以至少部分由可变区(V)区段编码，例如免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)区段或Ig轻链可变区(VL)区段，经修饰以编码Ig前导序列与种系Ig V区段的框架(FR)和互补决定区(CDR)序列之间的锚并与其可操作地连接的。编码免疫球蛋白(Ig)信号肽的核酸序列和种系V区段(例如，人种系V区段)的核酸序列在本领域是众所周知的，如此编码的氨基酸序列也是众所周知的。参见例如，Lefranc,M.-P.,《实验和临床免疫遗传学》,18,100-116(2001)，通过全文引用的方式并入本文，以及在万维网(www)中找到的网站，地址为imgt.org。
如本文所述的核酸分子，包含靶向载体和动物基因组可以包括编码种系V区段的任何Ig信号肽的核酸序列。在一些实施例中，经修饰的Ig V区段包括编码第一种系Ig V区段的信号肽的核酸序列、编码锚的核酸序列和编码第二种系Ig V区段的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸，其中所述第一种系Ig V区段和所述第二种系Ig V区段是不同的种系Ig V区段。在一些实施例中，经修饰的Ig V区段包括编码第一种系Ig V区段的信号肽的核酸序列、编码锚的核酸序列和编码第二种系Ig V区段的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸，其中所述第一种系Ig V区段和所述第二种系Ig V区段是相同的种系Ig V区段。在一些实施例中，所述Ig信号肽包括序列MDWTWRFLFVVAAATGVQS(SEQ ID NO:7)。
人(h)种系V区段(例如，人种系可变重链(hVH或hIGVH)区段、人种系可变κ(hVκ或hIGKV)区段和人种系可变λ(hVλ或hIGLV)区段以及鼠(m)种系V区段(例如，小鼠种系可变重链(mVH或mIGVH)区段、小鼠种系可变κ(mVκ或mIGKV)区段和小鼠种系可变λ(mVλ或mIGLV)区段的氨基酸序列可以在万维网(www)地址imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/SequenceLogos/human/和imgt.org/IMGTrepertoire/Proteins/SequenceLogos/mouse/找到，所述地址中的每一个通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体(例如，编码如本文所描述的经修饰的Ig V区段的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的区段或其变体)是人(h)种系Ig V区段或其变体，例如，种系人(h)VH1-2区段、种系hVH1-3区段、种系hVH1-8区段、种系hVH1 18区段、种系hVH1-24区段、种系hVH1-45区段、种系hVH1-46区段、种系hVH1-58区段、种系hVH1-69区段、种系hVH2-5区段、种系hVH2-26区段、种系hVH2 70区段、种系hVH3-7区段、种系hVH3-9区段、种系hVH3 11区段、种系hVH3 13区段、种系hVH3-15区段、种系hVH3-16区段、种系hVH3-20区段、种系hVH3-21区段、种系hVH3-23区段、种系hVH3-30区段、种系hVH3-30-3区段、种系hVH3-30-5区段、种系hVH3-33区段、种系hVH3-35区段、种系hVH3-38区段、种系hVH3-43区段、种系hVH3-48区段、种系hVH3-49区段、种系hVH3-53区段、种系hVH3-64区段、种系hVH3-66区段、种系hVH3-72区段、种系hVH3-73区段、种系hVH3-74区段、种系hVH4-4区段、种系hVH4-28区段、种系hVH4-30-1区段、种系hVH4 30-2区段、种系hVH4-30-4区段、种系hVH4-31区段、种系hVH4-34区段、种系hVH4-39区段、种系hVH4-59区段、种系hVH4-61区段、种系hVH5-51区段、种系hVH6-1区段、种系hVH7-4-1区段、种系hVH7-81区段或其变体。在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体是种系hVH1-69区段或其变体。
在一些实施例中，本文所描述的核酸分子仅包括经修饰的Ig hVH区段，例如不包括任何另外的hVH区段或其变体。
在一些实施例中，除经修饰的Ig hVH区段外，如本文所描述的核酸分子进一步包括另外的hVH区段，例如，以下中的一个、多于一个或每一个：VH1-2、hVH1-3、hVH1-8、hVH1 18、hVH1-24、hVH1-45、hVH1-46、hVH1-58、hVH1-69、hVH2-5、hVH2-26、hVH2 70、hVH3-7、hVH3-9、hVH311、hVH3 13、hVH3-15、hVH3-16、hVH3-20、hVH3-21、hVH3-23、hVH3-30、hVH3-30-3、hVH3-30-5、hVH3-33、hVH3-35、hVH3-38、hVH3-43、hVH3-48、hVH3-49、hVH3-53、hVH3-64、hVH3-66、hVH3-72、hVH3-73、hVH3-74、hVH4-4、hVH4-28、hVH4-30-1、hVH4 30-2、hVH4-30-4、hVH4-31、hVH4-34、hVH4-39、hVH4-59、hVH4-61、hVH5-51、hVH6-1、hVH7-4-1、hVH7-81以及其变体。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：VH1-2、hVH1-3、hVH1-8、hVH1 18、hVH1-24、hVH1-45、hVH1-46、hVH1-58、hVH1-69、hVH2-5、hVH2-26、hVH2 70、hVH3-7、hVH3-9、hVH3 11、hVH3 13、hVH3-15、hVH3-16、hVH3-20、hVH3-21、hVH3-23、hVH3-30、hVH3-30-3、hVH3-30-5、hVH3-33、hVH3-35、hVH3-38、hVH3-43、hVH3-48、hVH3-49、hVH3-53、hVH3-64、hVH3-66、hVH3-72、hVH3-73、hVH3-74、hVH4-4、hVH4-28、hVH4-30-1、hVH4 30-2、hVH4-30-4、hVH4-31、hVH4-34、hVH4-39、hVH4-59、hVH4-61、hVH5-51、hVH6-1、hVH7-4-1和hVH7-81区段，所述hVH区段呈种系构型。
在一些实施例中，如本文所描述的核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)可以包括Ig重链可变区，例如，除了所述锚修饰的V区段外，可以包括另外的(未)重排的VH、DH和/或JH基因区段，并且在一些实施例中，另外的(未)重排的hVH、hDH和/或hJH基因区段。在一些实施例中，如本文所描述的核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)仅包括一个(未)重排的hVH区段、一个或多个(未)重排的hDH区段和一个或多个(未)重排的hJH区段，其中所述仅一个(未)重排的hVH区段是包括编码如本文所描述的锚的核酸序列的经修饰的hVH区段。
在一些实施例中，如本文所描述的重组核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)包括一个或多个人DH区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hDH1-1、hDH1-7、hDH1-14、hDH1-20、hDH1-26、hDH2-2、hDH2-8、hDH2-15、hDH2-21、hDH3-3、hDH3-9、hDH3-10、hDH3-16、hDH3-22、hDH4-4、hDH4-11、hDH4-17、hDH4-23、hDH5-5、hDH5-12、hDH5-18、hDH5-24、hDH6-6、hDH6-13、hDH6-19、hDH6-25、hDH7-27以及其变体。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hDH1-1、hDH1-7、hDH1-14、hDH1-20、hDH1-26、hDH2-2、hDH2-8、hDH2-15、hDH2-21、hDH3-3、hDH3-9、hDH3-10、hDH3-16、hDH3-22、hDH4-4、hDH4-11、hDH4-17、hDH4-23、hDH5-5、hDH5-12、hDH5-18、hDH5-24、hDH6-6、hDH6-13、hDH6-19、hDH6-25和hDH7-27，所述hDH区段呈种系构型。
在一些实施例中，如本文所描述的重组核酸(例如，靶向载体、非人动物基因组等)包括一个或多个人JH区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hJH1、hJH2、hJH3、hJH4、hJH5、hJH6以及其变体。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hJH1、hJH2、hJH3、hJH4、hJH5和hJH6区段，所述hJH区段呈种系构型。
在一些实施例中，如本文所描述的重组核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)可以包括重链可变区基因座，例如可以包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig VH区段，(II)一个或多个Ig重链多样性(DH)区段，以及(III)一个或多个所有Ig重链接合(JH)区段。在一些实施例中，(II)的所述一个或多个Ig DH区段包括一个、多个或所有人Ig DH区段，和/或(III)的所述一个或多个Ig JH区段包括一个、多个或所有人Ig JH区段。在一些实施例中，(II)的所述一个或多个Ig DH区段和(III)的所述一个或多个Ig JH基因区段被重组并形成重排的Ig DH/JH序列，使得所述重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：所述经修饰的Ig VH基因区段和所述重排的Ig DH/JH序列。
在一些实施例中，所述Ig VH基因区段和所述重排的Ig DH/JH序列被重组并形成编码锚修饰Ig重链可变结构域的重排的Ig VH/DH/JH序列，其中所述锚修饰的Ig重链可变结构域包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，以及(iii)由所述重排的Ig VH/DH/JH序列编码的所述FR1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在一些实施例中，所述经修饰的Ig VH区段是未重排的经修饰的Ig VH基因区段。
在一些实施例中，如本文所公开的重组核酸(例如，靶向载体、非人动物基因组等)进一步包括编码Ig重链恒定区(CH)的核酸序列，其中编码Ig CH的所述核酸序列在(I)所述经修饰的Ig VH区段、(II)所述一个或多个Ig DH区段以及(III)所述一个或多个Ig JH区段的下游且与其可操作地连接。在一些实施例中，编码Ig CH的核酸序列包括编码IgM同种型的Igμ基因、编码IgD同种型的Igδ基因、编码IgG同种型的Igγ基因、编码IgA同种型的Igα基因和/或编码IgE同种型的Igε基因。在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括编码锚修饰的Ig重链的核酸序列，其中所述锚修饰的Ig重链包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，(iii)包括由重排的Ig VH/DH/JH序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig重链可变结构域，以及(iv)Ig CH。在一些实施例中，所述Ig CH是非人IgCH，例如啮齿动物Ig CH、例如大鼠Ig CH或小鼠Ig CH。
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体(例如，编码如本文所描述的经修饰的Ig V区段的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的所述区段或其变体)是种系Ig轻链可变(VL)区段或其变体。在一些实施例中，重组核酸分子可以包括轻链可变区基因座，例如可以包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的VL区段，以及(II)一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。在一些实施例中，所述经修饰的Ig VL区段和所述一个或多个Ig JL区段被重组并形成编码锚修饰的Ig轻链可变结构域的重排的Ig VL/JL序列，其中所述锚修饰的Ig轻链可变结构域包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，以及(iii)由所述重排的Ig VL/JL序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在一些实施例中，重组核酸分子可以包括轻链可变区基因座和编码Ig轻链恒定区(CL)的核酸序列，其中编码Ig CL的所述核酸序列在以下的下游与其可操作地连接：(I)经修饰的Ig VL区段和(II)所述一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。在一些实施例中，所述锚修饰的Ig轻链包括可操作地连接的：(i)所述Ig信号肽，(ii)所述锚，(iii)包括由重排的Ig VL/JL序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig轻链可变结构域，以及(iv)Ig CL。在一些实施例中，所述Ig CL是非人Ig CL，例如啮齿动物Ig CL、例如大鼠Ig CL或小鼠Ig CL。
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体(例如，编码如本文所描述的修饰的Ig V区段的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的所述区段或其变体)是种系Ig轻链可变κ(Vκ)区段或其变体，例如人Vκ区段，例如是hVκ1-5区段、hVκ1-6区段、hVκ1-8区段、hVκ1D-8区段、hVκ1-9区段、hVκ1-12区段、hVκ1D-12区段、hVκ1-13区段、hVκ1D-13区段、hVκ1-16区段、hVκ1D-16区段、hVκ1-17区段、hVκ1D-17区段、hVκ1-27区段、hVκ1-33区段、hVκ1D-33区段、hVκ1-37区段、hVκ1D-37区段、hVκ1-39区段、hVκ1D-39、hVκ1-NL1区段、hVκ1D-42区段、hVκ1D-43区段、hVκ2-4区段、hVκ2-18区段、hVκ2D-18区段、hVκ2-24区段、hVκ2D-24区段、hVκ2-28区段、hVκ2D-28区段、hVκ2-29区段、hVκ2D-29区段、hVκ2-30区段、hVκ2D-30区段、hVκ2-40区段、hVκ2D-40区段、hVκ2D-26区段、hVκ3-7区段、hVκ3D-7区段、hVκ3-11区段、hVκ3D-11区段、hVκ3-15区段、hVκ3D-15区段、hVκ3-20区段、hVκ3D-20区段、hVκ4-1区段、hVκ5-2区段、hVκ6-21区段、hVκ6D-21区段、hVκ6D-41区段、hVκ7-3区段以及其变体。在一些实施例中，除所述经修饰的Ig hVκ区段外，如本文所描述的核酸分子进一步包括另外的hVκ区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hVκ1D-8区段、hVκ1-9区段、hVκ1-12区段、hVκ1D-12区段、hVκ1-13区段、hVκ1D-13区段、hVκ1-16区段、hVκ1D-16区段、hVκ1-17区段、hVκ1D-17区段、hVκ1-27区段、hVκ1-33区段、hVκ1D-33区段、hVκ1-37区段、hVκ1D-37区段、hVκ1-39区段、hVκ1D-39、ahVκ1-NL1区段、hVκ1D-42区段、hVκ1D-43区段、hVκ2-4区段、hVκ2-18区段、hVκ2D-18区段、hVκ2-24区段、hVκ2D-24区段、hVκ2-28区段、hVκ2D-28区段、hVκ2-29区段、hVκ2D-29区段、hVκ2-30区段、hVκ2D-30区段、hVκ2-40区段、hVκ2D-40区段、hVκ2D-26区段、hVκ3-7区段、hVκ3D-7区段、hVκ3-11区段、hVκ3D-11区段、hVκ3-15区段、hVκ3D-15区段、hVκ3-20区段、hVκ3D-20区段、hVκ4-1区段、hVκ5-2区段、hVκ6-21区段和hVκ6D-21区段。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hVκ1D-8区段、hVκ1-9区段、hVκ1-12区段、hVκ1D-12区段、hVκ1-13区段、hVκ1D-13区段、hVκ1-16区段、hVκ1D-16区段、hVκ1-17区段、hVκ1D-17区段、hVκ1-27区段、hVκ1-33区段、hVκ1D-33区段、hVκ1-37区段、hVκ1D-37区段、hVκ1-39区段、hVκ1D-39、hVκ1-NL1区段、hVκ1D-42区段、hVκ1D-43区段、hVκ2-4区段、hVκ2-18区段、hVκ2D-18区段、hVκ2-24区段、hVκ2D-24区段、hVκ2-28区段、hVκ2D-28区段、hVκ2-29区段、hVκ2D-29区段、hVκ2-30区段、hVκ2D-30区段、hVκ2-40区段、hVκ2D-40区段、hVκ2D-26区段、hVκ3-7区段、hVκ3D-7区段、hVκ3-11区段、hVκ3D-11区段、hVκ3-15区段、hVκ3D-15区段、hVκ3-20区段、hVκ3D-20区段、hVκ4-1区段、hVκ5-2区段、hVκ6-21区段和hVκ6D-21区段，所述hVκ区段呈种系构型。
在一些实施例中，如本文所描述的核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)可以包括Ig轻链κ可变区，例如，除了所述锚修饰的hVκ区段外，可以包括另外的(未)重排的Jκ区段，并且在一些实施例中，另外的(未)重排的hJκ基因区段。因此，在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vκ区段和(II)一个或多个Ig轻链接合κJκ区段。在一些实施例中，如本文所描述的重组核酸(例如，靶向载体、非人动物基因组等)包括一个或多个人Jκ区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hJκ1、hJκ2、hJκ3、hJκ4、hJκ5以及其变体。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hJκ1、hJκ2、hJκ3、hJκ4、hJκ5区段，所述hJκ区段呈种系构型。
另外，在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vκ区段和(II)一个或多个Ig轻链接合κ(Jκ)以及编码Ig轻链条恒定κ区(Cκ)的核酸序列。
在一些实施例中，所述种系Ig V区段或其变体(例如，编码如本文所描述的经修饰的Ig V区段的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的所述区段或其变体)是种系Ig轻链可变λ(Vλ)区段或其变体，例如人Vλ区段，例如hVλ1-36区段、hVλ1-40区段、hVλ1-41区段、hVλ1-44区段、hVλ1-47区段、hVλ1-50区段、hVλ1-51区段、hVλ1-62区段、hVλ2-5区段、hVλ2-8区段、hVλ2-11区段、hVλ2-14区段、hVλ2-18区段、hVλ2-23区段、hVλ2-33区段、hVλ2-34区段、hVλ3-1区段、hVλ3-9区段、hVλ3-10区段、hVλ3-12区段、hVλ3-13区段、hVλ3-16区段、hVλ3-19区段、hVλ3-21区段、hVλ3-22区段、hVλ3-25区段、hVλ3-27区段、hVλ3-31区段、hVλ3-32区段、hVλ4-3区段、hVλ4-60区段、hVλ4-69区段、hVλ5-37区段、hVλ5-39区段、hVλ5-45区段、hVλ5-48区段、hVλ5-52区段、hVλ6-57区段、hVλ7-43区段、hVλ7-46区段、hVλ8-61区段、hVλ9-49区段、hVλ10-54区段、hVλ11-55区段以及其变体。在一些实施例中，除所述经修饰的Ig hVλ区段外，如本文所描述的核酸分子进一步包括另外的hVλ区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hVλ1-36区段、hVλ1-40区段、hVλ1-41区段、hVλ1-44区段、hVλ1-47区段、hVλ1-50区段、hVλ1-51区段、hVλ1-62区段、hVλ2-5区段、hVλ2-8区段、hVλ2-11区段、hVλ2-14区段、hVλ2-18区段、hVλ2-23区段、hVλ2-33区段、hVλ2-34区段、hVλ3-1区段、hVλ3-9区段、hVλ3-10区段、hVλ3-12区段、hVλ3-13区段、hVλ3-16区段、hVλ3-19区段、hVλ3-21区段、hVλ3-22区段、hVλ3-25区段、hVλ3-27区段、hVλ3-31区段、hVλ3-32区段、hVλ4-3区段、hVλ4-60区段、hVλ4-69区段、hVλ5-37区段、hVλ5-39区段、hVλ5-45区段、hVλ5-48区段、hVλ5-52区段、hVλ6-57区段、hVλ7-43区段、hVλ7-46区段、hVλ8-61区段、hVλ9-49区段、hVλ10-54区段和hVλ11-55区段。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hVλ1-36区段、hVλ1-40区段、hVλ1-41区段、hVλ1-44区段、hVλ1-47区段、hVλ1-50区段、hVλ1-51区段、hVλ1-62区段、hVλ2-5区段、hVλ2-8区段、hVλ2-11区段、hVλ2-14区段、hVλ2-18区段、hVλ2-23区段、hVλ2-33区段、hVλ2-34区段、hVλ3-1区段、hVλ3-9区段、hVλ3-10区段、hVλ3-12区段、hVλ3-13区段、hVλ3-16区段、hVλ3-19区段、hVλ3-21区段、hVλ3-22区段、hVλ3-25区段、hVλ3-27区段、hVλ3-31区段、hVλ3-32区段、hVλ4-3区段、hVλ4-60区段、hVλ4-69区段、hVλ5-37区段、hVλ5-39区段、hVλ5-45区段、hVλ5-48区段、hVλ5-52区段、hVλ6-57区段、hVλ7-43区段、hVλ7-46区段、hVλ8-61区段、hVλ9-49区段、hVλ10-54区段、hVλ11-55区段，所述hVλ区段呈种系构型。
在一些实施例中，如本文所描述的核酸分子(例如，靶向载体、非人动物基因组等)可以包括Ig轻链λ可变区，例如，除了所述锚修饰的hVλ区段外，可以包括另外的(未)重排的Jλ区段，并且在一些实施例中，另外的(未)重排的hJλ基因区段。因此，在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vλ区段和(II)一个或多个Ig轻链接合κJλ区段。在一些实施例中，如本文所描述的重组核酸(例如，靶向载体、非人动物基因组等)包括一个或多个人Jλ区段，例如以下中的一个、多于一个或每一个：hJλ1、hJλ2、hJλ3、hJλ4、hJλ5、hJλ6、hJλ7区段以及其变体。在包括以下中的多于一个或每一个的一些实施例中：hJλ1、hJλ2、hJλ3、hJλ4、hJλ5、hJλ6、hJλ7区段，所述hJλ区段呈种系构型。在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：(I)所述经修饰的Ig Vλ区段，(II)一个或多个Ig轻链接合λ(Jλ)区段，以及编码Ig轻链恒定λ区(Cλ)的核酸序列。
锚
如本文所描述的，锚包括与同源受体结合的配体(或其部分)。在一些实施例中，配体可以是非免疫球蛋白多肽。因此，如本文所描述的，锚可以包括非免疫球蛋白多肽，例如非免疫球蛋白多肽的受体结合部分。本文所描述的锚修饰可以用于增加抗原结合蛋白(例如，抗体)对难治性受体的亲和力。
示例性和众所周知的非免疫球蛋白多肽:同源受体对包含但不限于，例如与同源G蛋白偶联受体(GPCR)结合的那些非免疫球蛋白多肽。示例性GPCR包含但不限于趋化因子受体、胰高血糖素受体(例如，GLP1:GLP1R)、降钙素受体、黑皮质素受体。这些和其它同源GPCR，包含与其结合的非免疫球蛋白多肽在本领域中是众所周知的。参见例如，Wu等人,(2017)《分子生物学杂志》429:2726-45，所述问下通过全文引用的方式并入本文。另外的非限制性和示例性非免疫球蛋白多肽(配体):同源受体对包含
a.与同源受体酪氨酸激酶结合的配体，例如，如但不限于以下的配体：表皮生长因子(EGF)、胰岛素、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等。
b.DLL:Notch受体对，
c.B7:CD28/CLTA4/PD1受体对，
d.臂板蛋白:丛蛋白受体对，
e.PCSK9/LDLR对，
f.HLA:LILR对，
g.HLA:KIR对，
h.RGD配体:整合素对，
i.利钠肽(例如，ANP、BNP、CNP等):利钠肽受体(NPR、NPR3等)对等。
配体:受体对可能包含蛋白酶和抑制剂。
在一些实施例中，锚包括利钠肽(NP)，例如NP的受体结合部分。NP包括至少八种结构相关的氨基酸肽，作为三种不同的激素原储存：心房利钠肽(ANP)激素原、B型利钠肽(BNP)激素原和C型利钠肽(CNP)激素原。树眼镜蛇属利钠肽是一种最近被发现的D型利钠肽(DNP)，其在人中的作用仍不清楚。
ANP激素原(proANP)是一种126个氨基酸的多肽，主要由心肌细胞表达，并且产生具有降血压特性、利钠特性、利尿特性和/或利钾特性的若干种肽。这些源自ANP激素原的肽通过其起始于ANP激素原的N末端的氨基酸序列进行鉴定：尤其例如，proANP 1–30包括长效NP，proANP 31-67包括血管扩张因子，proANP 79–98包括利钾肽和氨基酸99–126(也称为ANP)等。在肾脏内，proANP被不同地处理，导致另外的四个氨基酸被添加到N末端，例如proANP 95-126(也称为尿扩张素)。
BNP激素原(proBNP)是一种108个氨基酸的多肽，也主要由心肌细胞表达。BNP原激素在人心脏内被加工以形成BNP(例如，其108个氨基酸的原激素中的氨基酸77–108)和NT-proBNP(例如，氨基酸1–76)，两者都在人体内循环。BNP是心室扩张的可靠生物标志物。Pandit等人,(2011)《印度内分泌与代谢杂志(Ind.J.Endocrinol.Metab.)》15(4)S345-53，通过全文引用的方式并入本文。
与ANP和BNP不同，CNP主要由内皮细胞和肾上皮细胞表达。在循环中已经鉴定出两种CNP分子。此外，尽管CNP似乎缺乏利钠功能，但CNP可能以旁分泌或自分泌的方式作为血管张力和生长的调节因子，并且有一些迹象表明CNP可能在骨生长中发挥作用。
NP通过与细胞表面受体的特异性结合发挥其生物学功能。在哺乳动物组织中已鉴定出三种特异性受体：两种鸟苷酰基环化酶偶联受体(GC-A和GC-B，分别也称为NP受体(NPR)-A和NPR-B)。NPR-A和NPR-B通过激活cGMP依赖性信号级联起作用。相反，第三种C型受体(也称为NPR-C)不与鸟苷酰基环化酶偶联，并且似乎主要参与NP的清除。所有三种受体都以不同的亲和力与ANP、BNP和CNP结合。GC-A的配体选择性的等级顺序为ANP≥BNP＞＞CNP，GC-B的配体选择性等级顺序为CNP＞＞ANP≥BNP，并且NPR-C的配体选择性等级顺序为ANP>CNP>BNP。Jaubert等人,(1999)《美国国家科学院院刊(PNAS)》96(18)10278-283，通过全文引用的方式并入本文。
NP受体可能是用于治疗高血压和心血管疾病的有用靶标。然而，尽管ANP和BNP具有重要的利尿、利钠和降压特性，CNP可能在骨生长中发挥作用。因此，任何基于抗体的NP受体靶向都必须注意受体对NP的不同结合亲和力。
在一些实施例中，锚包括序列ANP或其一部分。编码人ANP的核酸序列在本文中示出为NCBI登录号NM_006172.4和SEQ ID NO:1。人ANP的氨基酸序列在本文中示出为NCBI登录号NP_006163和SEQ ID NO:2。在一些实施例中，本文所描述的锚包括ANP的受体结合部分，例如ANP的C末端尾部。在一些实施例中，ANP的受体结合部分包括氨基酸序列NSFRY(SEQID NO:3)。
接头
在一些实施例中，锚包括将所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分与所述种系Ig V区段或其变体的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3连接的接头。在一些实施例中，接头的长度可以是一个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度可以是两个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度可以是三个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度可以是四个氨基酸，例如接头可以包括序列GLSG(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，接头的长度可以是五个氨基酸，例如可以包括序列GGGGS(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，接头的长度可以是六个氨基酸，例如可以包括序列GLSGSG(SEQ ID NO:14)。在一些实施例中，接头的长度可以是七个氨基酸。在一些实施例中，接头可以包括序列GLSGLSGS(SEQ ID NO:15)。在一些实施例中，接头的长度可以是九个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度可以是十个氨基酸，例如可以包括序列GLSGLSGLSG(SEQ ID NO:16)或GLSGGSGLSG(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，第一和第二接头的长度相同，且长度各自为超过十个氨基酸。
在一些实施例中，本文所描述的重组核酸分子包括示出为SEQ ID NO:8或其简并变体，或SEQ ID NO:10或其简并变体的序列。
靶向载体
进一步提供了用于制备本文所提供的基因修饰的非人动物、细胞、组织或胚胎的方法中采用的靶向载体。
在一个实施例中，提供了靶向载体，所述靶向载体包括插入核酸，例如包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段的重组核酸分子，其侧接5'和3'同源臂，所述同源臂可以与所关注的基因座(例如，Ig重链或轻链可变区基因座)进行同源重组。靶向载体和靶向载体的组分的实例(即插入核酸、所关注的多核苷酸、表达盒等)在本文以下部分中详细描述。
当同源臂和靶位点(即同源基因组区)彼此共享足够水平的序列同一性以作为同源重组反应的底物时，这两个区互为“补体”或“互补”。“同源性”意指与对应或“互补”序列相同或共享序列同一性的DNA序列。给定靶位点与靶向载体上发现的对应同源臂之间的序列同一性可以是允许发生同源重组的任何程度的序列同一性。例如，靶向载体(或其片段)的同源臂与靶位点(或其片段)共享的序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，使得序列经历同源重组。此外，同源臂与互补靶位点之间的同源性互补区可以是足以促进切割的识别位点处的同源重组的任何长度。例如，给定的同源臂和/或互补靶位点可以包括长度为至少5kb至10kb、5kb至15kb、10kb至20kb、20kb至30kb、30kb至40kb、40kb至50kb、50kb至60kb、60kb至70kb、70kb至80kb、80kb至90kb、90kb至100kb、100kb至110kb、110kb至120kb、120kb至130kb、130kb至140kb、140kb至150kb、150kb至160kb、160kb至170kb、170kb至180kb、180kb至190kb、190kb至200kb、200kb至300kb或更长(如本文其它地方所描述的载体中所描述的)的同源性互补区，使得同源臂具有足够的同源性以与细胞的基因组内的对应靶位点经历同源重组。为了便于参考，同源臂在本文中被称为5'和3'同源臂。此术语涉及靶向载体内同源臂与插入核酸的相对位置。
因此，靶向载体的同源臂被设计为与具有靶向的基因座的靶位点互补。因此，同源臂可以与细胞固有的基因座互补，或可替代地，其可以与整合到细胞的基因组中的DNA的异源或外源性区段的区域互补，包含但不限于转基因、表达盒或基因组DNA的异源或外源性区。可替代地，靶向载体的同源臂可以与适当宿主细胞中包含的人工染色体的区或任何其它工程化基因组区互补。仍进一步地，靶向载体的同源臂可以与BAC文库、粘粒文库或P1噬菌体文库的区互补或由其衍生。因此，在特定实施例中，靶向载体的同源臂与给定细胞的天然、异源或外源性的真核生物、非人、哺乳动物、非人哺乳动物、人、啮齿动物、小鼠或大鼠基因组基因座互补。在一个实施例中，所述同源臂源自合成DNA。
在一些靶向载体实施例中，所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地Ig DH和/或Ig JH区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的非人VH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的除一个外的所有非人VH区段或所有非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
在一些实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地Ig DH区段、Ig JH区段和/或Ig CH基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是啮齿动物或啮齿动物细胞(例如，啮齿动物胚胎干细胞)中的内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH基因区段、所有非人JH基因区段和一个或多个非人CH基因。
在一些实施例中，所述5'同源臂包括示出为SEQ ID NO:12的序列和/或所述3'同源臂包括示出为SEQ ID NO:13的序列。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地Ig JL区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人VL区段和所有非人JL区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的所有非人VL区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
在一些实施例中，本文所描述的靶向载体包括本文所描述的核酸分子和靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地IgJL区段和/或Ig CL基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段、所有非人JL基因区段和所述非人CL基因。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的一个或多个非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的所有非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括在所述Ig轻链κ基因座处与非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段和/或Ig Cκ基因的重组核酸分子)，任选地其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段、所有非人Jκ基因区段和所述非人Cκ基因。
在一些靶向载体实施例中，靶向载体包括本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig Vλ区段和任选地Ig Jλ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的所有非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
在一些实施例中，靶向载体包括如本文所描述的重组核酸分子和靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vλ区段和任选地Ig Jλ区段和/或Ig Cλ基因的重组核酸分子)。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段、所有非人Jλ基因区段和所述非人Cλ基因。
在一些实施例中，如本文所描述的靶向载体可以进一步包括侧接有位点特异性重组靶序列的核苷酸序列。已经认识到，靶向载体内所关注的任何区或单个多核苷酸也可以被此类位点侧接。位点特异性重组酶可以通过任何方式引入细胞，包含通过将重组酶多肽引入细胞或通过将编码位点特异性重组酶的多核苷酸引入宿主细胞。编码位点特异性重组酶的多核苷酸可以位于靶向载体内或单独的多核苷酸内。位点特异性重组酶可以与细胞中活性的启动子可操作地连接，所述启动子包含例如诱导型启动子、细胞内源性的启动子、细胞异源的启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。可以侧接靶向载体中的所关注的核苷酸序列或任何多核苷酸的位点特异性重组靶序列可以包含但不限于loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2、lox5171、FRT、FRT11、FRT71、attp、att、FRT、rox或其组合。
在一些实施例中，位点特异性重组位点侧接靶向载体内编码选择标志物的多核苷酸。在此类情况下，靶向的基因座处的靶向载体整合后，位点特异性重组位点之间的核苷酸序列可以被去除。
在一些实施例中，如本文所描述的靶向载体包括选择标志物，所述选择标志物可以包含在选择盒中。此类选择标志物包含但不限于新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟菌素-S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)或其组合。在一个实施例中，编码选择标志物的多核苷酸与细胞中活性的启动子可操作地连接。在一个实施例中，编码选择标志物的多核苷酸侧接有位点特异性重组靶序列。
非人动物基因组
本文还描述了非人动物基因组，其包括如本文所描述的重组核酸分子和/或靶向载体。在一些非人动物基因组实施例中，所述非人动物基因组在所述非人动物基因组的内源性Ig基因座处包括如本文所描述的重组核酸分子，例如，所述非人动物基因组包括如本文所描述的靶向载体，其中所述靶向载体包括靶向所述内源性Ig基因座的5'和3'同源臂。在一些实施例中，所述非人动物基因组是啮齿动物基因组。在一些实施例中，所述非人动物基因组是大鼠基因组。在一些实施例中，所述非人动物基因组是小鼠基因组。
在非人动物基因组实施例中，所述基因组包括非人Ig重链基因座，所述非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地Ig DH和/或Ig JH区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的非人VH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的除一个外的所有非人VH区段或所有非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地IgDH区段、Ig JH区段和/或Ig CH基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是啮齿动物或啮齿动物细胞(例如，啮齿动物胚胎干细胞)中的内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性IgVH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH基因区段、所有非人JH基因区段和一个或多个非人CH基因。
在非人动物基因组实施例中，所述基因组包括非人Ig轻链基因座，所述非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地Ig JL区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人VL区段和所有非人JL区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的所有非人VL区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的。
在非人动物基因组实施例中，所述Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地Ig JL区段和/或Ig CL基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段、所有非人JL基因区段和所述非人CL基因。
在非人动物基因组实施例中，所述基因组包括非人Ig轻链κ基因座，所述非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的一个或多个非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的所有非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，重组核酸分子与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段和/或Ig Cκ基因的重组核酸分子)与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的，任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段、所有非人Jκ基因区段和所述非人Cκ基因。
在非人动物基因组实施例中，所述基因组包括非人Ig轻链λ基因座，所述非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig Vλ区段和任选地Ig Jλ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的所有非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的。
在一些非人动物基因组实施例中，所述非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的所述重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vλ区段和任选地Ig Jλ区段和/或Ig Cλ基因的重组核酸分子)。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段、所有非人Jλ基因区段和所述非人Cλ基因。
非人动物细胞、非人动物以及其制备方法
非人动物和非人动物细胞
提供了表达锚修饰的免疫球蛋白的非人动物和非人动物细胞，例如来自经修饰以包括如本文所描述的重组核酸分子的Ig基因座，所述重组核酸分子包括经修饰的Ig V区段，例如Ig重链可变区(VH)区段或Ig轻链可变区(VL)区段，经修饰以编码Ig前导序列与种系V区段的框架(FR)和互补决定区(CDR)序列之间的锚并与其可操作地连接的。因此提供了本文所描述的非人动物、胚胎、包括重组核酸分子的细胞、靶向构建体和/或动物基因组。
在一些非人动物或非人动物细胞实施例中，所述非人动物或细胞包括如本文所描述的重组核酸分子(包括经修饰的Ig V区段，例如Ig重链可变区(VH)区段或Ig轻链可变区(VL)区段，经修饰以编码Ig前导序列与随机位于所述动物的所述基因组内的种系V区段的框架(FR)和互补决定区(CDR)序列之间的锚并与其可操作地连接的。在一些实施例中，所述非人动物或细胞包括如本文所描述的重组核酸分子(包括经修饰的Ig V区段，例如Ig重链可变区(VH)区段或Ig轻链可变区(VL)区段，经修饰以编码Ig前导序列与位于所述非人动物的内源性Ig基因座处的种系V区段的框架(FR)和互补决定区(CDR)序列之间的锚并与其可操作地连接的，例如，所述非人动物包括如本文所描述的靶向载体，其中所述靶向载体包括靶向所述内源性Ig基因座的5'和3'同源臂。在一些实施例中，所述非人动物是啮齿动物。在一些实施例中，所述非人动物细胞是啮齿动物细胞。在一些实施例中，所述非人动物是大鼠。在一些实施例中，所述非人动物细胞是大鼠细胞。在一些实施例中，所述非人动物是小鼠。在一些实施例中，所述非人动物细胞是小鼠细胞。
在实施例中，所述非人动物或非人动物细胞包括非人Ig重链基因座，所述非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地Ig DH和/或Ig JH区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的非人VH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的除一个外的所有非人VH区段或所有非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig VH区段和任选地IgDH区段、Ig JH区段和/或Ig CH基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig重链基因座是啮齿动物或啮齿动物细胞(例如，啮齿动物胚胎干细胞)中的内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性IgVH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH基因区段、所有非人JH基因区段和一个或多个非人CH基因。
在一些实施例中，所述非人动物或非人动物细胞包括非人Ig轻链基因座，所述非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地Ig JL区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人VL区段和所有非人JL区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的所有非人VL区段和所有非人JH区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig VL区段和任选地Ig JL区段和/或Ig CL基因的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合，并且任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段、所有非人JL基因区段和所述非人CL基因。
在一些实施例中，所述非人动物或非人动物细胞包括非人Ig轻链κ基因座，所述非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的一个或多个非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的所有非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。在一些实施例中，重组核酸分子与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和任选地Ig Jκ区段和/或Ig Cκ基因的重组核酸分子)与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的，任选地其中所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段、所有非人Jκ基因区段和所述非人Cκ基因。
在一些实施例中，所述非人动物或非人动物细胞包括非人Ig轻链λ基因座，所述非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子(例如，包括经修饰的Ig Vλ区段和任选地Ig Jλ区段的重组核酸分子)，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的所有非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。在一些实施例中，所述重组核酸分子与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的。
在一些实施例中，所述非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的所述重组核酸分子(例如，包括如本文所描述的经修饰的IgVλ区段和任选地Ig Jλ区段和/或Ig Cλ基因的重组核酸分子)。在一些实施例中，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段、所有非人Jλ基因区段和所述非人Cλ基因。
非人动物或非人动物细胞的制备方法
还描述了在体外使用本文所描述的重组核酸分子，例如靶向载体来制备非人细胞、非人胚胎和/或非人动物的方法。在一些实施例中，修饰分离的细胞的体外方法包括将如本文所描述的重组核酸分子引入分离的细胞中，例如通过使所述细胞与如本文所描述的靶向载体接触。在一些方法实施例中，所述细胞是宿主细胞。在一些方法实施例中，所述细胞是胚胎干(ES)细胞。在一些实施例中，如本文所描述的或根据本文所描述的方法制备的细胞是啮齿动物细胞，例如其中所述啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
还描述了使用如本文所描述的所述核酸分子、所述非人细胞和/或所述非人动物来制备锚修饰的抗原结合蛋白的方法。还描述了非人动物胚胎和非人动物，其可以包括如本文所描述的胚胎干细胞和/或由其发育(例如，产生)。此类胚胎或非人动物可以通过一种方法发育，所述方法包括将如本文所描述的ES细胞植入胚胎中，和/或将包括所述ES细胞的胚胎植入合适的宿主体内，并且在所述ES细胞或所述胚胎发育成可存活子代期间将所述宿主维持在合适的条件下。
如本文所描述的，靶向载体可以用于靶向具有人或人源化免疫球蛋白可变区的Ig基因座。包括人可变区基因区段的免疫球蛋白基因座是本领域已知的，并且可见于例如美国专利第5,633,425号；第5,770,429号；第5,814,318号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；第6,998,514号；第7,795,494号；第7,910,798号；第8,232,449号；第8,502,018号；第8,697,940号；第8,703,485号；第8,754,287号；第8,791,323号；第8,809,051号；第8,907,157号；第9,035,128号；第9,145,588；9,206,263号；第9,447,177号；第9,551,124号；第9,580,491号和第9,475,559号；其中每个专利以全文引用的方式并入本文中；以及美国专利公开第20100146647号、第20110195454号、第20130167256号、第20130219535号、第20130326647号、第20130096287号和第2015/0113668号，其中每个公开以全文引用的方式并入本文中；以及PCT公开第WO 2007117410号、第WO 2008151081号、第WO 2009157771号、第WO 2010039900号、第WO 2011004192号、第WO 2011123708号和第WO 2014093908号，其中每个公开以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，如本文所公开的非人动物包括外源性全人免疫球蛋白转基因，所述外源性全人免疫球蛋白转基因包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段，所述区段能够在小鼠的前体B细胞中重排(Alt等人,1985,转基因小鼠中的免疫球蛋白基因(Immunoglobulin genes in transgenic mice),《遗传学趋势(Trends Genet)》1:231-236；通过全文引用的方式并入本文)。在这些实施例中，可以(随机)插入包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段的全人免疫球蛋白转基因，并且还可以敲除内源性免疫球蛋白基因(Green等人,1994,来自用人Ig重链和轻链YAC工程化的小鼠的抗原特异性人单克隆抗体(Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with humanIg heavy and light chain YACs),《自然遗传学(Nat Genet)》7:13-21；Lonberg等人,1994,来自包括四种不同基因修饰的小鼠的抗原特异性人抗体(Antigen-specific humanantibodies from mice comprising four distinct genetic modifications),《自然(Nature)》368:856-859；Jakobovits等人,2007,从XenoMouse技术到帕尼单抗，第一种来自转基因小鼠的全人抗体产品(From XenoMouse technology to panitumumab,the firstfully human antibody product from transgenic mice),《自然生物技术(NatBiotechnol)》25:1134-1143；所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入)，例如，其中内源性免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活，例如通过靶向缺失每个内源性基因座的小但关键的部分，然后引入人免疫球蛋白基因座作为随机整合的大转基因，或微型染色体(Tomizuka等人,2000,双反式染色体小鼠：维持含有Ig重和κ基因座的两个单独的人染色体片段和全人抗体的表达(Double trans-chromosomic mice:maintenance of twoindividual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci andexpression of fully human antibodies)，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》97:722-727；通过全文引用的方式并入)。
在一些实施例中，包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段的人或人源化免疫球蛋白重链和轻链基因座分别位于内源性免疫球蛋白轻链和重链基因座处。已经表明，甚至用人VH基因区段置换单个内源性VH基因区段也可以导致包括人源化免疫球蛋白可变结构域的免疫应答。参见例如，Tien等人,(2016)《细胞(Cell)》166:1471-84；通过全文引用的方式并入本文。
先前已经描述了一种用人种系免疫球蛋白可变基因座大规模原位基因置换小鼠种系免疫球蛋白可变基因座，同时维持小鼠产生后代的能力的方法。参见例如美国专利第6,596,541号和第8,697,940号，每个专利以全文引用的方式并入。具体地讲，描述了小鼠重链和κ轻链免疫球蛋白可变基因基因座的六兆碱基用其人对应部分精确替换，同时保持小鼠恒定区完整。因此，已经建立了整个种系免疫球蛋白可变谱经同等人种系免疫球蛋白可变序列精确替换，同时维持小鼠恒定区的小鼠。人可变区连接于小鼠恒定区，形成嵌合人-小鼠免疫球蛋白基因座，所述基因座重排并以生理学上适当的水平表达。所表达的抗体是“反向嵌合体”，即，它们包括人可变区序列和小鼠恒定区序列。
在一些实施例中，具有表达具有人或人源化可变区和小鼠恒定区的抗体的人源化免疫球蛋白可变区的小鼠被称为小鼠。人源化小鼠表现出与野生型小鼠基本上不可区分的完全功能性体液免疫系统。它们在B细胞发育的所有阶段均显示正常细胞群体。它们表现出正常的淋巴器官形态。小鼠的抗体序列表现出正常V(D)J重排和正常体细胞超突变频率。这些小鼠中的抗体群体反映由正常类别转换(例如，正常同种型顺式转换)产生的同种型分布。对小鼠进行免疫接种产生稳固的体液免疫应答，其产生具有适合用作治疗候选物的人免疫球蛋白可变结构域的大型多样化抗体谱。此平台提供了用于制造药学上可接受的抗体和其它抗原结合蛋白的天然亲和力成熟的人免疫球蛋白可变区序列的丰富来源。正是用人免疫球蛋白可变序列精确替换小鼠免疫球蛋白可变序列使得人免疫球蛋白可变序列以反向嵌合方式与内源性非人恒定区基因序列可操作地连接，从而允许制造小鼠。
以反向嵌合方式修饰的小鼠包含但不限于经修饰以在内源性免疫球蛋白基因座处包括与内源性恒定区可操作地连接的人(源化)可变区(例如，包括(D)、J和一个或多个人V基因区段)的小鼠，例如
(a)在内源性重链基因座处：
(i)与内源性重链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区，其中所述未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区包括多个未重排的人重链可变区VH基因区段(例如，所有功能性人未重排的人VH基因区段)、一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段，
任选地其中所述一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或更多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段是一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链DH基因区段(例如，所有功能性人DH基因区段)和/或一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链JH基因区段(例如，所有功能性人JH基因区段)；
(ii)与内源性重链恒定区可操作地连接的限制性未重排的人(源化)重链可变区，其中所述限制性未重排的人(源化)重链可变区基本上由与一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段可操作地连接的单个未重排的人重链可变区VH基因区段组成，任选地其中所述一个或多个未重排的免疫球蛋白重链DH基因区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白重链JH基因区段分别是一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链DH基因区段和/或一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链JH基因区段；
(iii)与内源性重链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区包括未重排的免疫球蛋白重链可变基因序列，所述未重排的免疫球蛋白重链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子；或
(iv)仅重链免疫球蛋白编码序列，其包括与内源性重链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)重链可变区，其中所述内源性重链恒定区包括(1)编码与轻链缔合的IgM同种型的完整内源性IgM基因和(2)非IgM基因，例如IgG基因，缺乏编码功能性CH1结构域的序列，其中所述非IgM基因编码缺乏能够与轻链恒定结构域共价结合的CH1结构域的非IgM同种型；
和/或
(b)在内源性轻链基因座处：
(i)与内源性轻链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区，其中所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包括多个未重排的人轻链可变区VL基因区段(例如所有功能性人未重排的人VL基因区段)和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链JL基因区段，
任选地其中所述一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链JL基因区段为一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链JL基因区段(例如所有功能性人JHL基因区段)，
任选地其中所述内源性免疫球蛋白轻链基因座是内源性免疫球蛋白质轻链κ(κ)基因座，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包括人可变κ(Vκ)和接合κ(Jκ)基因区段，并且其中所述内源性轻链恒定区是内源性κ链恒定区序列和/或其中所述内源性免疫球蛋白轻链基因座是内源性免疫球蛋白轻链λ(λ)，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包括人可变λ(Vλ)和接合λ(Jλ)基因区段，并且所述内源性轻链恒定区是内源性λ链恒定区序列，任选地其中所述内源性免疫球蛋白轻链λ基因座包括(a)一个或多个人Vλ基因区段，(b)一个或多个人Jλ基因区段，和(c)一个或多个人Cλ基因区段，其中(a)和(b)与(c)和啮齿动物免疫球蛋白轻链恒定Cλ)基因区段可操作地连接，并且其中所述内源性免疫球蛋白λ轻链基因座进一步包括：一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，)和一个或多个人免疫球蛋白λ轻链增强子(Eλ)，任选地包括三个人Eλ；
(ii)共同轻链编码序列，其包括与内源性轻链恒定区可操作地连接的重排的人(源化)轻链可变区序列，其中所述重排的人(源化)轻链可变区序列包括与免疫球蛋白轻链JL基因区段一起重排的人轻链可变区VL基因区段；
(iii)与内源性轻链恒定区可操作地连接的受限的未重排的人(源化)轻链可变区，其中所述受限的未重排的人(源化)轻链可变区包括可操作地连接于一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链接合JL)基因区段的不超过两个未重排的人免疫球蛋白轻链可变(VL)基因区段；
(iv)与内源性轻链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包括未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列，所述未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子；或
(v)与内源性轻链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区，其中所述经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区包括重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列，所述重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列中包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子，
任选地，其中所述小鼠进一步包括
(i)人(源化)免疫球蛋白重链基因座，其包括功能性ADAM6基因，使得小鼠展现非人动物的野生型繁殖力；和/或
(ii)用于增加抗原受体多样性的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)基因，任选地使得重排的可变区基因的至少10％包括非模板添加，
先前已经描述了所述小鼠。参见例如，美国专利第8,697,940号；第8,754,287号；第9,204,624号；第9,334,334号；第9,801,362号；第9,332,742号；和第9,516,868号；美国专利公开20110195454、20120021409、20120192300、20130045492；20150289489；20180125043；20180244804；PCT公开第WO2019/113065号、第WO 2017210586号和第WO2011163314号；Lee等人,(2014)《自然生物技术》32:356，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文。
本领域技术人员将容易地认识到，任何小鼠或小鼠细胞(例如，以反向嵌合方式修饰的小鼠ES细胞)可以被修饰以包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段。在一些实施例中，本文所描述是基因修饰的非人动物，其基因组，例如种系基因组包括：
内源性免疫球蛋白基因座，其包括免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包括本发明的经修饰的hVH基因区段、人DH基因区段和人JH基因区段，其中所述免疫球蛋白重链变区与恒定区可操作地连接，和/或
内源性链基因座，其包括免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包括本发明的经修饰的VL区段和人JL基因区段，其中所述免疫球蛋白轻链可变区与恒定区可操作地连接。
在一些实施例中，非人动物，例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠在其基因组中包括用一个或多个人VH、DH和JH区段置换内源性免疫球蛋白重链基因座处的一个或多个内源性VH、DH和JH区段，并且其中所述一个或多个人VH、DH和JH区段包括如本文所描述的经修饰的人VH基因区段，并且与内源性免疫球蛋白重链基因可操作地连接；以及任选地未重排的或重排的人VL和人JL区段，所述区段与非人，例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠或人免疫球蛋白轻链恒定(CL)区基因(例如，在内源性非人轻链基因座处)可操作地连接。
在某些实施例中，基因修饰的非人动物在其基因组，例如种系基因组中包括免疫球蛋白基因座(外源性或内源性)，所述免疫球蛋白基因座含有免疫球蛋白可变区，所述免疫球蛋白可变区包括一个或多个未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段，所述基因区段包含如本文所描述的经修饰的Ig V基因区段和包括免疫球蛋白恒定区基因的免疫球蛋白恒定区，并且其中所述一个或多个未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段与所述免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接。
一般来讲，基因修饰的免疫球蛋白基因座包括可操作地连接于免疫球蛋白恒定区的免疫球蛋白可变区(包括免疫球蛋白可变区基因区段)。在一些实施例中，基因修饰的免疫球蛋白基因座包括一个或多个人未重排的免疫球蛋白重链可变区基因区段，所述基因区段包含如本文所描述的经修饰的Ig VH基因区段，与重链恒定区基因可操作地连接。在一些实施例中，基因修饰的免疫球蛋白基因座包括人未重排的免疫球蛋白可变区κ基因区段，所述基因区段包含如本文所描述的经修饰的Ig Vκ基因区段，与κ链恒定区基因可操作地连接。在一些实施例中，基因修饰的免疫球蛋白基因座包括人未重排的免疫球蛋白可变区λ基因区段，所述基因区段包含如本文所描述的经修饰的Ig Vλ基因区段，与κ链恒定区基因可操作地连接。在一些实施例中，基因修饰的免疫球蛋白基因座包括人未重排的免疫球蛋白可变区λ基因区段，所述基因区段包含如本文所描述的经修饰的Ig Vλ基因区段，与λ链恒定区基因可操作地连接。
在某些实施例中，非人动物在内源性重链基因座处包括未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变区，其包括如本文所描述的与内源性重链恒定区可操作地连接的经修饰的IgVH基因区段，其中免疫球蛋白可变区含有一个或多个未重排的人Ig重链可变区基因区段。在一些实施例中，所述一个或多个未重排的人Ig可变区基因区段包括如本文所描述的经修饰的Ig VH基因区段、一个或多个免疫球蛋白重链多样性(DH)区段和一个或多个免疫球蛋白质重链接合接(JH)区段(任选地一个或多个未重排的人JH区段)。在一些实施例中，如本文所描述的经修饰的Ig VH基因区段是重链可变区中存在的唯一Ig VH区段。在一些实施例中，未重排的人Ig基因区段包含所有功能性人DH基因区段。在一些实施例中，未重排的人Ig基因区段包含所有功能性人JH基因区段。包括Ig重链基因区段的示例性可变区在例如以下中提供：Macdonald等人,《美国国家科学院院刊》111:5147-52和补充信息，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，本文所提供的非人动物在内源性重链基因座处包括与至少包括非人IgM基因的内源性重链恒定区可操作地连接的限制性未重排的人(源化)重链可变区，其中所述限制性未重排的人(源化)重链可变区的特征在于单个人VH基因区段(例如，如本文所描述的单个经修饰的Ig VH基因区段)、多个DH基因区段(例如，人DH基因区段)和多个JH基因区段(例如人JH基因区段)，其中所述限制性免疫球蛋白重链基因座能够重排并形成多个不同的重排，其中每个重排源自所述单个人VH基因区段、一个所述DH区段和一个所述JH区段，并且其中每个重排编码不同的重链可变结构域(例如，如美国专利公开第20130096287号中描述的，所述美国专利公开通过全文引用的方式并入本文)。在一些实施例中，所述单个经修饰的人VH基因区段是VH1-2或VH1-69。
在某些实施例中，非人动物在内源性轻链基因座处包括未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区，其包含如本文所描述的经修饰的Ig VL区段，与内源性轻链恒定区可操作地连接的。在一些实施例中，未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区含有未重排的人Igκ可变区基因区段。在一些实施例中，未重排的人(源化)免疫球蛋白可变区包括一个或多个未重排的人Vκ区段，所述区段可以包含如本文所描述的经修饰的Ig Vκ区段和一个或多个未重排的人JK区段。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括所有人Jκ区段。在一些实施例中，免疫球蛋白可变区基因区段包括四个功能性Vκ区段和所有人Jκ区段。在一些实施例中，免疫球蛋白可变区基因区段包括16个功能性Vκ区段和所有人Jκ区段(例如，所有功能性人Vκ区段和Jκ区段)。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括所有人Vκ区段和所有人Jκ区段。包括Igκ基因区段的示例性可变区在例如以下中提供：Macdonald等人,《美国国家科学院院刊》111:5147-52和补充信息，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，与内源性轻链恒定区可操作地连接的限制性未重排的人(源化)轻链可变区的特征在于，所述未重排的人(源化)轻链可变区包括不超过两个人VL基因区段和多个JL基因区段(例如，双轻链小鼠或DLC，如美国专利第9,796,788号中所描述的，所述美国专利通过全文引用的方式并入本文)，其中一个不超过两个的人VL基因区段可以是如本文所描述的经修饰的Ig VL区段。在一些实施例中，VL基因区段是Vκ基因区段。在一些实施例中，VL基因区段是Vλ基因区段。在一些实施例中，Vκ基因区段是IGKV3-20和IGKV1-39。在一些实施例中，非人动物在小鼠的内源性κ轻链基因座包括可操作地连接于小鼠轻链恒定区的正好两个未重排的人Vκ基因区段和五个未重排的人Jκ基因区段，任选地其中正好两个未重排的人Vκ基因区段为人Vκ1-39基因区段和人Vκ3-20基因区段，其中五个未重排的人Jκ基因区段为人Jκ1基因区段、人Jκ2基因区段、人Jκ3基因区段、人Jκ4基因区段和人Jκ5基因区段，其中未重排的人κ轻链基因区段能够重排和编码抗体的人可变结构域，并且任选地，进一步其中非人动物不包括能够重排形成免疫球蛋白轻链可变区的内源性Vκ基因区段。
在某些实施例中，与内源性轻链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区含有未重排的人Igλ可变区基因区段，其包含如本文所描述的经修饰的Igλ区段。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括多个人Vλ区段和一个或多个人Jλ区段。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括一个或多个人Vλ区段、一个或多个人Jλ区段和一个或多个人Cλ恒定区序列。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括所有人Vλ区段。在一些实施例中，未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段包括所有人Jλ区段。例如以下中提供了包括Igλ基因区段的示例性可变区：美国专利第9,035,128号和第6,998,514号，每个专利以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，与内源性轻链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包括(a)一个或多个人Vλ基因区段、(b)一个或多个人Jλ基因区段和(c)一个或多个人Cλ基因区段，其中(a)和(b)可操作地连接于(c)和内源性(例如啮齿动物)Cλ基因区段，并且其中内源性免疫球蛋白λ轻链基因座进一步包括∶一个或多个啮齿动物免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ)和一个或多个人免疫球蛋白λ轻链强化子(Eλ)，任选地包括三个人Eλ。
在某些实施例中，与内源性轻链恒定区可操作地连接的未重排的人(源化)免疫球蛋白轻链可变区包括未重排的人Igλ可变区基因区段，例如，如本文所描述的经修饰的Igλ区段，与内源性(例如，啮齿动物，例如，大鼠或小鼠)Cκ基因可操作地连接，使得非人动物表达免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包括λ源自与内源性κ恒定结构域融合的Vλ和Jλ基因区段的人可变结构域序列，参见例如，美国专利第9,226,484号，所述美国专利通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，人源化免疫球蛋白κ轻链基因座，例如人源化免疫球蛋白内源性κ基因座包括Cλ基因上游(例如，与其可操作地连接的)的一个或多个人Vλ基因区段(例如，如本文所描述的经修饰的人Vλ区段)和一个或多个人Jλ基因区段，例如，其可以置换内源性Cκ基因。在一些实施例中，Cλ基因是啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)Cλ基因。在一些实施例中，Cλ基因是小鼠Cλ1基因。在一些实施例中，Cλ基因包括一个或多个人Cλ基因。在一些实施例中，此类人源化免疫球蛋白κ轻链基因座的一个或多个人Jλ基因区段和一个或多个Cλ基因存在于Jλ-Cλ簇中。在一些实施例中，基因修饰的啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)就此类人源化免疫球蛋白κ轻链基因座而言是纯合的。在一些实施例中，基因修饰的啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)就此类人源化免疫球蛋白κ轻链基因座而言是杂合的。在一些实施例中，包括此类人源化免疫球蛋白κ轻链基因座的基因修饰的啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)产生抗体，例如，响应于抗原刺激，所述抗体尤其包括λ轻链，其中每个λ轻链包括可操作地连接至人λ轻链恒定结构域的人λ轻链可变结构域。
在一些实施例中，包括未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段的免疫球蛋白可变区还包含人免疫球蛋白可变区基因间序列。在一些实施例中，免疫球蛋白可变区包含非人(例如啮齿动物、大鼠、小鼠)Ig可变区基因间序列。在一些实施例中，基因间序列是内源性物种来源。
在一些实施例中，免疫球蛋白可变区是重排的轻链可变区(通用轻链可变区)。在一些实施例中，重排的Ig轻链可变区基因是人重排的Ig轻链可变区基因。示例性重排的Ig轻链可变区在以下中提供：例如美国专利第9,969,814号、第10,130,181号和第10,143,186号和美国专利公开第20120021409号、第20120192300号、第20130045492号、第20130185821号、第20130302836号和第20150313193号，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，包括通用轻链可变区的非人生物体(“通用轻链”生物体)用于产生双特异性抗体。在一些实施例中，常见的轻链编码序列包括与内源性轻链恒定区可操作地连接的单个重排的人免疫球蛋白轻链Vκ/Jκ序列。在一些实施例中，修饰单个重排的人免疫球蛋白轻链Vκ/Jκ序列，使得所述单个重排的人免疫球蛋白轻链序列编码如本文所描述的与通用轻链可操作地连接的锚。在一些实施例中，单个重排的人免疫球蛋白轻链Vκ/Jκ序列是(i)包括与人Jκ5基因区段融合的人Vκ1-39基因区段的人Vκ1-39/Jκ5序列，或(ii)包括与人Jκ1基因区段融合的人Vκ3-20基因区段的人Vκ3-20/Jκ1序列。
在一些实施例中，免疫球蛋白可变区为包含插入和/或替换组氨酸密码子的轻链和/或重链免疫球蛋白可变区，所述组氨酸密码子的插入和/或替换被设计成引入pH依赖性结合特性至在此类非人生物体中产生的抗体中。在一些此类实施例中，组氨酸密码子在编码CDR3的核酸序列中插入和/或替换。各种此类轻链和/或重链免疫球蛋白基因座在美国专利第9,301,510号、第9,334,334号和第9,801,362号和美国专利申请公布第20140013456号中提供，各以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，与内源性轻链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的重排的人(源化)轻链可变区包括包含人Vκ和Jκ区段序列的单个重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因序列，任选地其中Vκ区段序列来源于人Vκ1-39或Vκ3-20基因区段，并且其中单个重排的人免疫球蛋白轻链可变区基因序列包括Vκ区段序列的至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代，所述组氨酸密码子在选自由以下组成的群组的位置表达：105、106、107、108、109、111和其组合(根据IMGT编号)。在一些实施例中，与内源性重链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)重链可变区包括未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变基因序列，所述基因序列在互补决定区3(CDR3)编码序列(例如，在如本文所描述的经修饰的(人)VH基因区段中)中包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施例中，未重排的人(源化)免疫球蛋白重链可变基因序列包括未重排的人VH(例如，如本文所描述的经修饰的(人)VH区段)、未重排的人DH或合成DH、以及未重排的人JH基因区段，任选地其中所述未重排的人VH区段(例如，如本文所描述的经修饰的(人)VH区段)包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施例中，与内源性重链恒定区可操作地连接的经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包括未重排的VL和未重排的JL基因区段。在一些实施例中，经过组氨酸修饰的未重排的人(源化)轻链可变区包括不超过两个未重排的人VL(例如不超过两个Vκ基因区段)和一个或多个未重排的人JL(例如Jκ)基因区段，其中不超过两个人VL基因区段中的每一个在CDR3编码序列包括至少一个非组氨酸密码子经组氨酸密码子取代或插入至少一个组氨酸密码子。在一些实施例中，所述不超过两个未重排的人Vκ基因区段为各自包括非组氨酸密码子经组氨酸密码子一次或多次取代的人Vκ1-39和Vκ3-20基因区段，并且其中人Vκ和Jκ基因区段能够重排并且人Vκ和Jκ基因区段编码在选自由以下组成的群组的位置包括一个或多个组氨酸的人轻链可变结构域：105、106、107、108、109、111(根据IGMT编号)和其组合，其中一个或多个组氨酸来源于一次或多次取代。
在一些实施例中，免疫球蛋白恒定区包括重链恒定区基因。在一些实施例中，重链恒定区基因是人重链恒定区基因。在一些实施例中，重链恒定区基因是内源性物种来源。在一些实施例中，重链恒定区基因是小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施例中，恒定区基因是人和非人序列的混合物。例如，在一些实施例中，恒定区基因编码人CH1区和非人(例如内源性物种来源、小鼠、大鼠)CH2和/或CH3区。在一些实施例中，重链恒定区基因是Cμ、Cδ、Cγ(Cγl、Cγ2、Cγ3、Cγ4)、Cα或Cε恒定区基因。在一些实施例中，恒定区基因是内源性恒定区基因。在一些实施例中，恒定区基因编码突变的CH1区域，使得非人动物表达只有重链的抗体(参见例如美国专利第8,754,287号、美国专利申请公开第2015/0289489号，各以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，例如，在目标是产生重链以制备双特异性抗体的情况下(例如，在通用或双轻链生物体中)，重链的Fc结构域包括促进重链异二聚体形成和/或抑制重链同二聚体形成的修饰。此类修饰例如在以下中提供：美国专利第5,731,168号、第5,807,706号、第5,821,333号、第7,642,228号和第8,679,785号以及美国专利公开第2013/0195849号，各以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，免疫球蛋白恒定区包括轻链恒定区基因。在一些实施例中，轻链恒定区基因是κ恒定区基因。在一些实施例中，轻链恒定区基因是λ恒定区基因。在一些实施例中，轻链恒定区基因是内源性物种来源。在一些实施例中，轻链恒定区基因是小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施例中，轻链恒定区基因是人和非人序列的混合物。
在一些实施例中，包括人可变区基因区段的免疫球蛋白可变区和可变区基因区段可操作地连接于的免疫球蛋白恒定区基因位于内源性免疫球蛋白基因座处。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白基因座是内源性重链基因座。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白基因座是内源性κ基因座。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白基因座是内源性λ基因座。在一些实施例中，人可变区基因区段可操作地连接于的恒定区基因是内源性恒定区基因。
在一些实施例中，本文提供的非人动物的基因组中的一个或多个内源性免疫球蛋白基因座或一个或多个内源性基因座(例如可变区和/或恒定区)的一部分失活。可使用本领域已知的任何方法使内源性免疫球蛋白可变区基因基因座和其部分失活，包含但不限于基因座或其一部分从生物体的基因组缺失、用不同核酸序列替换基因座或其一部分、基因座的一部分倒置和/或基因座的一部分移到非人生物体基因组中的另一位置。在一些实施例中，基因座的失活仅是部分失活。在一些实施例中，基因座的可变区是失活的，但恒定区保持功能(例如，因为其可操作地连接于非内源性可变区基因区段)。
在一些实施例中，经过基因修饰的非人动物包含失活的内源性免疫球蛋白重链基因座。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白重链基因座或其一部分通过内源性重链基因座的内源性可变区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，缺失、置换、移位和/或倒置的内源性重链基因座的可变区的至少一部分包括可变区的J区段。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白重链基因座或其部分通过内源性重链基因座的内源性恒定区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，缺失、置换、移位和/或倒置的恒定区的内源性重链基因座的至少一部分包括内源性恒定区的Ομ基因。
在一些实施例中，经过基因修饰的非人动物包含失活的内源性免疫球蛋白κ链基因座。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白κ链基因座或其一部分通过内源性κ链基因座的内源性可变区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，缺失、置换、移位和/或倒置的内源性κ链基因座的可变区的至少一部分包括可变区的J区段。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白κ链基因座或其一部分通过内源性κ链基因座的内源性恒定区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，缺失、置换、移位和/或倒置的内源性κ链基因座的恒定区的至少一部分包括内源性恒定区的Cκ基因。
在一些实施例中，经过基因修饰的非人动物包含失活的内源性免疫球蛋白λ链基因座。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白λ链基因座或其一部分通过内源性λ链基因座的内源性可变区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，内源性λ链基因座中的至少一个V-J-C基因簇的至少一部分缺失、置换、移位和/或倒置。在一些实施例中，内源性免疫球蛋白λ基因座或其一部分通过内源性λ链基因座的内源性恒定区的至少一部分的缺失、置换、移位和/或倒置而失活。在一些实施例中，缺失、置换、移位和/或倒置的内源性λ链基因座的恒定区的至少一部分包括内源性恒定区的C基因。
在各种实施例中，免疫球蛋白基因座修饰不影响非人动物的繁殖力。在一些实施例中，重链基因座包括功能性，例如内源性ADAM6a基因、ADAM6b基因或两者，并且基因修饰不影响内源性ADAM6a基因、ADAM6b基因或两者的表达和/或功能。在一些实施例中，基因修饰的非人动物的基因组进一步包括位于异位的功能性，例如内源性ADAM6a基因、ADAM6b基因，或两者。表达外源ADAM6a和/或ADAM6b的示例性非人动物在以下中描述：美国专利第8,642,835号和第8,697,940号，各以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，经过基因修饰的非人动物进一步包括外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以增加抗原受体多样性。在PCT公开WO 2017210586中描述了表达外源TdT的示例性非人动物，所述公开特此以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，转录控制元件包含RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件，免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白k轻链转录控制元件、免疫球蛋白l轻链转录调控元件或其任何组合。
在一些实施例中，所提供的非人动物的基因组进一步包括一种或多种人免疫球蛋白重链和/或轻链基因(参见例如，美国专利第8,502,018号；美国专利第8,642,835号；美国专利第8,697,940号；美国专利第8,791,323号；以及美国专利申请公开第2013/0096287A1号和第2018/0125043A1号；以及PCT公开第WO2019/113065号，所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入本文)。可替代地，可以将包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段的重组核酸分子引入不同的经修饰的菌株，例如菌株的胚胎干细胞中(参见例如，美国专利第8,502,018号或美国专利第8,642,835号；通过全文引用的方式并入本文)。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物可以通过将如本文所描述靶向载体引入来自经修饰的菌株的细胞中来制备。仅举一个实例，如美国专利第8,642,835号和第8,697,940号(通过全文引用的方式并入本文)中所描述的，可以将如本文所描述的靶向载体引入非人动物，所述非人动物表达具有完全人可变区和小鼠恒定区的抗体。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物被制备为进一步包括人免疫球蛋白基因(可变和/或恒定区基因)。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段和来自异源物种(例如，人)的遗传物质，其中所述遗传物质全部或部分编码一个或多个人重链和/或轻链可变区。
本文所述的非人动物可以如上文所述那样或使用本领域已知的方法制备为包括另外的人或人源化基因，这通常取决于非人动物的预期用途。此类另外的人或人源化基因的遗传物质可通过进一步改变具有上述基因修饰的细胞(例如，胚胎干细胞)的基因组，或通过本领域已知的培育技术利用所需的其它基因修饰品系引入。
例如，如本文所描述的，包括如本文所描述的经修饰的Ig V区段的非人动物可以进一步包括(例如，通过杂交育种或多种基因靶向策略)一个或多个修饰，如以下中所描述的：美国专利申请公开第2011-0195454A1号、第2012-0021409A1号、第2012-0192300A1号、第2013-0045492A1号、第2013-0185821A1号、第2013-0198880A1号、第2013-0302836A1号、第2015-0059009A1号；国际专利申请公开第WO 2011/097603号、第WO 2012/148873号、第WO2013/134263号、第WO 2013/184761号、第WO 2014/160179号、第WO 2014/160202号；所有所述文献特此通过全文引用的方式并入。
转基因创始者非人动物可以基于其基因组中经修饰的Ig V区段的存在和/或锚修饰的抗体的表达来鉴定，所述锚修饰的抗体包括与和同源受体结合的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分相对应的氨基酸。转基因创始者非人动物可以然后用于培育携带经修饰的IgV区段的另外的非人动物，由此产生一系列非人动物，所述非人动物携带经修饰的Ig V区段的一个或多个拷贝。此外，携带经修饰的Ig V区段的转基因非人动物可以进一步如期望的与携带其它转基因(例如，人免疫球蛋白基因)的其它转基因非人动物培育。
还可以产生含有所选系统的转基因非人动物，所选系统能够调控或引导转基因的表达。示例性系统包含噬菌体P1的Cre/loxP重组酶系统(参见例如，Lakso,M.等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:6232-6236，所述文献通过全文引用的方式并入)和酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP/Frt重组酶系统(O'Gorman,S.等人,1991,《科学(Science)》251:1351-1355；所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入)。此类动物可以通过构建“双”转基因动物来提供，例如，通过使两个转基因动物交配，一个含有包括选定修饰(例如，经修饰的Ig V区段)的转基因，并且另一个含有编码重组酶(例如，Cre重组酶)的转基因。
尽管本文广泛讨论了在小鼠(即，具有经修饰的人VH区段、DH和JH基因区段的小鼠，其全部与一个或多个鼠重链恒定区基因可操作地连接)中使用经修饰的Ig v区段的实施例，但也提供了包括经修饰的Ig v区段的其它非人动物。此类非人动物包含可以被基因修饰以表达入本文所描述的锚修饰的免疫球蛋白的任何动物，包含例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)等。例如，对于合适的可基因修饰的ES细胞不容易获得的那些非人动物，采用其它方法来制备包括基因修饰的非人动物。此类方法包含例如修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)并利用体细胞核转移(SCNT)来将基因修饰的基因组转移至合适的细胞，例如去核卵母细胞，以及在适于形成胚胎的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)。
用于修饰非人动物基因组(例如，猪、牛、啮齿动物、鸡等)的方法包含，例如使用锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或Cas蛋白(即，CRISPR/Cas系统)来修饰基因组以包含如本文所描述的经修饰的Ig V区段。用于修饰非人动物的种系基因组的方法的指导可以在例如以下中找到：美国专利申请公开第2015-0376628A1号、第US2016-0145646A1号和第US2016-0177339 A1号；通过全文引用的方式并入本文。
在一些实施例中，本文所描述的非人动物是哺乳动物。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一些实施例中，如本文所描述的基因修饰的动物是啮齿动物。在一些实施例中，如本文所描述的啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施例中，如本文所描述的啮齿动物选自鼠总科。在一些实施例中，如本文所描述基因修饰的动物来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如，丽仓鼠(mouse-like hamster))、仓鼠科(Cricetidae)(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺棒睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施例中，如本文所描述的基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一些实施例中，如本文所描述的基因修饰的小鼠是来自鼠科的成员。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物是啮齿动物。在一些实施例中，如本文所描述的啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一些实施例中，如本文所描述的非人动物是小鼠。
在一些实施例中，如本文所描述的非人动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自以下的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在一些实施例中，本发明的小鼠是选自由以下品系组成的组的129品系，即129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人,1999,《哺乳动物基因组(Mammalian Genome)》10:836；Auerbach,W.等人,2000,《生物技术(Biotechniques)》29(5):1024-1028,1030,1032；通过全文引用的方式并入本文)。在一些实施例中，如本文所描述的基因修饰的小鼠是上述129品系和上述C57BL/6品系的混合品系。在一些实施例中，如本文所描述的小鼠是上述129品系的混合，或上述BL/6品系的混合品系。在一些实施例中，如本文所描述的混合品系的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在一些实施例中，如本文所描述的小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在一些实施例中，如本文所描述的小鼠是BALB品系和另一种前述品系的混合品系。
在一些实施例中，如本文所描述的非人动物是大鼠。在一些实施例中，如本文所描述的大鼠选自威斯塔大鼠(Wistar rat)、LEA品系、斯泼累格多雷品系(Sprague Dawleystrain)、费舍尔品系(Fischer strain)、F344、F6和黑刺鼠(Dark Agouti)。在一些实施例中，如本文所描述的大鼠品系是选自由以下组成的组的两个或更多个品系的混合体：威斯塔、LEA、斯泼累格多雷、费舍尔、F344、F6和黑刺鼠。
产生锚修饰的免疫球蛋白的方法和锚修饰的免疫球蛋白
已经开发了若干种体外和体内技术来产生基于抗体的治疗剂。特别地，体内技术的特征是产生含有人免疫球蛋白基因的转基因动物(即啮齿动物)，所述人免疫球蛋白基因要么随机结合到动物基因组中(例如，参见美国专利第5,569,825号，通过全文引用的方式并入)，要么精确地放置在内源性免疫球蛋白基因座处，与动物的内源性免疫球蛋白恒定区可操作地连接的(例如，参见美国专利第8,502,018号；第8,642,835号；第8,697,940；号和第8,791,323号；所述文献中的每一个通过全文引用的方式并入)。这两种方法在生产用于人中使用的有希望的抗体治疗候选物方面均具有成效。进一步地，这两种方法均具有超过体外方法的优点，因为抗体候选物选自体内生成的抗体储库，其包含在宿主的免疫系统的内部环境内对于抗原的亲和力和特异性选择。以这种方式，抗体结合天然存在的抗原(在相关生物表位和表面内)，而不是可伴随体外技术的人工环境或计算机芯片预测。尽管由体内技术产生了稳健的抗体库，但复合物(例如，病毒、通道多肽)或细胞质抗原的抗体仍然很困难。进一步地，由于免疫耐受性，生成针对在物种(例如，人和小鼠)之间共享高度序列同一性的多肽的抗体仍是挑战。
因此，本发明尤其基于这样的认识，即构建体内系统的特征在于产生具有锚的抗体，以帮助将免疫球蛋白固定到所关注的抗原(例如，锚的同源受体)并增加其对抗原的亲和力，通过其自身对其同源受体的亲和力促进分子的亲合力和/或通过允许能够识别同源受体的更大的免疫球蛋白库的体细胞超突变。
所提供的非人动物可以用于制备人抗体，其中所述人抗体包括源自由如本文所描述的非人动物的细胞的遗传物质编码的一个或多个可变区核酸序列的可变结构域。例如，所提供的非人动物用所关注的抗原(例如，与锚同源的受体)在足以使所述非人动物产生对所述所关注的抗原的免疫应答的条件和时间下免疫。从非人动物(或一个或多个细胞，例如一个或多个B细胞)中分离抗体，并且使用各种测定进行表征，所述测定测量例如亲和力、特异性、表位作图、阻断配体-受体相互作用的能力、抑制性受体活化等。在一些实施例中，由所提供的非人动物产生的抗体包括一个或多个人可变结构域，所述人可变结构域源自从非人动物分离的一个或多个人可变区核苷酸序列。
如本文所描述的非人动物提供了用于产生可用于多种测定的人抗体的改进的体内系统和生物材料(例如，细胞)的来源。在一些实施例中，所提供的非人动物用于开发靶向配体受体对的一个或多个受体的治疗剂，如本文所描述的。在一些实施例中，所提供的非人动物用于鉴定、筛选和/或开发与一个或多个G蛋白偶联受体(GPCR)多肽结合的候选治疗剂(例如，抗体等)。在一些实施例中，所提供的非人动物用于筛选和开发阻断一种或多种受体酪氨酸激酶、一种或多种人GPCR多肽、一种或多种Notch受体、CD28、CTLA4和PD1中的一种或多种、丛蛋白受体、LDLR、LILR、KIR和整合素或NPR(例如，NPR3)的活性的候选治疗剂(例如，抗体等)。在一些实施例中，所提供的非人动物用于确定一种或多种人GPCR多肽、一种或更多种Notch受体、CD28、CTLA4和PD1中的一种或多种、丛蛋白受体、LDLR、LILR、KIR和整合素或NPR(例如，NPR3)的拮抗剂和/或激动剂的结合曲线。在一些实施例中，所提供的非人动物用于确定一种或多种候选治疗性抗体的一个或多个表位，所述候选治疗性抗体与一种或多种人GPCR多肽、一种或多种Notch受体、CD28、CTLA4和PD1中的一种或多种、丛蛋白受体、LDLR、LILR、KIR和整合素或NPR(例如，NPR3)。
在一些实施例中，所提供的非人动物用于确定抗体的药代动力学曲线。在一些实施例中，一种或多种所提供的非人动物和一种或多种对照或参考非人动物各自暴露于不同剂量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg或更高)的一种或多种候选治疗性抗体。候选治疗性抗体可以经由各种所需的施用途径(包含肠胃外和非肠胃外施用途径)来给药。肠胃外途径包含例如静脉内、动脉内、门静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊柱内、鞘内、脑室内、颅内、胸膜内或其它注射途径。非肠胃外途径包含例如经口、经鼻、经皮、经肺、经直肠、经颊、经阴道、经眼。施用也可以通过连续输注、局部施用、从植入物(凝胶、膜等)持续释放和/或静脉内注射，例如使用静脉内流体袋。在多个时间点(例如，0小时、6小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或最多30天或更多天)从非人动物(人源化和对照)分离血液。可以使用从如本文所描述的非人动物获得的样品来进行多种测定，以确定所施用的候选治疗性抗体的药代动力学性质，包含但不限于总IgG、抗治疗性抗体应答、凝集等。
在一些实施例中，所提供的非人动物表达抗体，因此可以产生细胞、细胞系和细胞培养物以用作结合和功能测定中使用的抗体的来源，例如，测定拮抗剂或激动剂的结合或功能，特别是当拮抗剂或促动剂对人多肽序列或表位具有特异性时，或可替代地对配体-受体相互作用(结合)中起作用的人多肽序列或表位具有特异性。在一些实施例中，由候选治疗性抗体或siRNA结合的表位可以使用从所提供的非人动物中分离的细胞来确定。
在一些实施例中，来自所提供的非人动物的细胞可以在特定的基础上分离和使用，或可以在培养中维持许多代。在一些实施例中，来自所提供的非人动物的细胞永生化(例如，通过使用病毒)并且无限期地维持在培养物中(例如，在连续培养物中)。
在一些实施例中，如本文所描述的非人动物提供了用于产生与人靶抗原结合的抗体变体的体内系统。此类变体包含对两种或更多种人靶抗原共享的共同表位具有期望的功能性、特异性、低交叉反应性的抗体。在一些实施例中，所提供的非人动物用于产生抗体组套以产生一系列抗体变体，所述抗体变体被筛选以获得期望的或改进的功能。
在一些实施例中，如本文所描述的非人动物提供了用于产生抗体文库的体内系统。此类文库提供了重链和轻链可变区序列源，其可基于所需效应子功能移植到不同的Fc区上和/或使用本领域已知的技术(例如定点诱变、易错PCR等)用作可变区序列的亲和力成熟的来源。
试剂盒
本发明进一步提供了包装或试剂盒，其包括装有至少一种本文所描述的非人动物、非人细胞、DNA片段和/或靶向载体的一个或多个容器。试剂盒可以用于任何适用的方法(例如，研究方法)。任选地与一个或多个此类容器相关的可以是由政府机构规定形式的注意事项，该注意事项规定药物或生物产品的制造、使用或销售，该注意事项反映了(a)机构关于用于人施用的制造、使用或销售的批准，(b)使用说明或它们二者，或管理两个或更多个实体之间的材料和/或生物产品(例如，本文所述的非人动物或非人细胞)的转移的合约。
非限制性实施例描述如下：
实施例1.一种重组核酸分子，其包括编码锚修饰的Ig多肽的经修饰的免疫球蛋白(Ig)可变(V)区段，
其中所述经修饰的Ig V区段包括编码锚的核酸序列，所述锚位于编码Ig信号肽的核酸序列与编码种系Ig V区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，
其中锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig V区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3，
其中所述锚包括与同源受体结合的所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分，并且
任选地其中所述核酸分子缺乏任何其它V区段。
实施例2.根据实施例1所述的重组核酸分子，其中所述Ig信号肽是所述种系Ig V区段或其变体的Ig信号肽。
实施例3.根据实施例1或实施例2所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig V区段或其变体是种系Ig重链可变(VH)区段或其变体，使得
所述经修饰的Ig V区段是包括编码锚的所述核酸序列的经修饰的Ig VH区段，所述锚位于所述编码Ig信号肽的核酸序列与编码所述种系Ig VH区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，并且
所述锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig VH区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig V区段或其变体是种系人(h)VH1-2区段、种系hVH1-3区段、种系hVH1-8区段、种系hVH1-18区段、种系hVH1-24区段、种系hVH1-45区段、种系hVH1-46区段、种系hVH1-58区段、种系hVH1-69区段、种系hVH2-5区段、种系hVH2-26区段、种系hVH2-70区段、种系hVH3-7区段、种系hVH3-9区段、种系hVH3-11区段、种系hVH3-13区段、种系hVH3-15区段、种系hVH3-16区段、种系hVH3-20区段、种系hVH3-21区段、种系hVH3-23区段、种系hVH3-30区段、种系hVH3-30-3区段、种系hVH3-30-5区段、种系hVH3-33区段、种系hVH3-35区段、种系hVH3-38区段、种系hVH3-43区段、种系hVH3-48区段、种系hVH3-49区段、种系hVH3-53区段、种系hVH3-64区段、种系hVH3-66区段、种系hVH3-72区段、种系hVH3-73区段、种系hVH3-74区段、种系hVH4-4区段、种系hVH4-28区段、种系hVH4-30-1区段、种系hVH4-30-2区段、种系hVH4-30-4区段、种系hVH4-31区段、种系hVH4-34区段、种系hVH4-39区段、种系hVH4-59区段、种系hVH4-61区段、种系hVH5-51区段、种系hVH6-1区段、种系hVH7-4-1区段、种系hVH7-81区段或其变体。
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig V区段或其变体是种系hVH1-69区段或其变体，任选地其中所述Ig信号肽包括序列MDWTWRFLFVVAAATGVQS(SEQ ID NO:7)。
实施例6.根据实施例3至5中任一项所述的重组核酸分子，其包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：
(I)所述经修饰的Ig VH区段；
(II)一个或多个Ig重链多样性(DH)区段；以及
(III)一个或多个Ig重链接合(JH)区段。
实施例7.根据实施例6所述的重组核酸分子，其中
(II)的所述一个或多个Ig DH区段包括一个、多个或所有人Ig DH区段，和/或
(III)的所述一个或多个Ig JH区段包括一个、多个或所有人Ig JH区段。
实施例8.根据实施例6或实施例7所述的重组核酸分子，其中(II)的所述一个或多个Ig DH区段和(III)的一个或多个Ig JH基因区段被重组并形成重排的Ig DH/JH序列，使得所述重组核酸分子包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：
经修饰的Ig VH基因区段；以及
所述重排的Ig DH/JH序列。
实施例9.根据实施例8所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的Ig VH基因区段和所述重排的Ig DH/JH序列被重组并形成编码锚修饰的Ig重链可变结构域的重排的Ig VH/DH/JH序列，
其中所述锚修饰的Ig重链可变结构域包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)由所述重排的Ig VH/DH/JH序列编码的FR1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
实施例10.根据实施例3至8中任一项所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的IgVH区段是未重排的经修饰的Ig VH基因区段。
实施例11.根据实施例6至10中任一项所述的重组核酸分子，其进一步包括编码Ig重链恒定区(CH)的核酸序列，
其中所述编码Ig CH的核酸序列位于以下各项的下游并与其可操作地连接：
(I)所述经修饰的Ig VH区段；
(II)所述一个或多个Ig DH区段；以及
(III)所述一个或多个Ig JH区段。
实施例12.根据实施例11所述的重组核酸分子，其中所述编码Ig CH的核酸序列包括编码IgM同种型的Igμ基因、编码IgD同种型的Igδ基因、编码IgG同种型的Igγ基因、编码IgA同种型的Igα基因和/或编码IgE同种型的Igε基因。
实施例13.根据实施例3至12中任一项所述的重组核酸分子，其包括编码锚修饰的Ig重链的核酸序列，其中所述锚修饰的Ig重链包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；
(iii)包括由重排的Ig VH/DH/JH序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig重链可变结构域；以及
(iv)Ig CH。
实施例14.根据实施例11至13中任一项所述的重组核酸分子，其中所述Ig CH是非人Ig CH。
实施例15.根据实施例14所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CH是啮齿动物IgCH。
实施例16.根据实施例15所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CH是大鼠Ig CH。
实施例17.根据实施例15所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CH是小鼠Ig CH。
实施例18.根据实施例1或实施例2所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig V基因区段或其变体是种系Ig轻链可变(VL)区段或其变体，使得
所述经修饰的Ig V区段是包括编码锚的所述核酸序列的经修饰的Ig VL区段，所述锚位于所述编码Ig信号肽的核酸序列与编码所述种系Ig VL区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，并且
所述锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig VL区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。
实施例19.根据实施例18所述的重组核酸分子，其包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：
(I)所述经修饰的Ig VL区段；以及
(II)一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。
实施例20.根据实施例19所述的重组核酸分子，其中所述经修饰的Ig VL区段和所述一个或多个Ig JL区段被重组并形成编码锚修饰的Ig轻链可变结构域的重排的Ig VL/JL序列，
其中所述锚修饰的Ig轻链可变结构域包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)由所述重排的Ig VL/JL序列编码的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
实施例21.根据实施例19或实施例20所述的重组核酸分子，其进一步包括编码Ig轻链恒定区(CL)的核酸序列，
其中所述编码Ig CL的核酸序列位于以下各项的下游并与其可操作地连接：
(I)所述经修饰的Ig VL区段；以及
(II)所述一个或多个Ig轻链接合(JL)区段。
实施例22.根据实施例18至21中任一项所述的重组核酸分子，其包括编码锚修饰的Ig轻链的核酸序列，其中所述锚修饰的Ig轻链包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；
(iii)包括由重排的Ig VL/JL序列编码的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4的Ig轻链可变结构域；以及
(iv)Ig CL。
实施例23.根据实施例21或实施例22所述的重组核酸分子，其中所述Ig CL是非人Ig CL。
实施例24.根据实施例23所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CL是啮齿动物IgCL。
实施例25.根据实施例23所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CL是大鼠Ig CL。
实施例26.根据实施例23所述的重组核酸分子，其中所述非人Ig CL是小鼠Ig CL。
实施例27.根据实施例18至26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig VL区段或其变体是种系Ig轻链可变κ(Vκ)区段或其变体，使得
所述经修饰的Ig V区段是包括编码锚的所述核酸序列的经修饰的Ig Vκ区段，所述锚位于编码Ig信号肽的所述核酸序列与编码所述种系Ig Vκ区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，并且
所述锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig Vκ区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。
实施例28.根据实施例27所述的重组核酸分子，其包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：
(I)所述经修饰的Ig Vκ区段；以及
(II)一个或多个Ig轻链接合κ(Jκ)区段。
实施例29.根据实施例28所述的重组核酸分子，其进一步包括编码Ig轻链恒定κ区(Cκ)的核酸序列，
其中所述编码Ig Cκ的核酸序列位于以下各项的下游并与其可操作地连接：
(I)所述经修饰的Ig Vκ区段；以及
(II)所述一个或多个Ig Jκ区段。
实施例30.根据实施例18至26中任一项所述的重组核酸分子，其中所述种系Ig VL区段或其变体是种系Ig轻链可变λ(Vλ)区段或其变体，使得
所述经修饰的Ig V区段是包括编码锚的所述核酸序列的经修饰的Ig Vλ区段，所述锚位于编码Ig信号肽的所述核酸序列与编码所述种系Ig Vλ区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，并且
所述锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig Vλ区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3。
实施例31.根据实施例30所述的重组核酸分子，其包括可操作地连接并且从5'至3'的以下各项：
(I)所述经修饰的Ig Vλ区段；以及
(II)一个或多个Ig轻链接合λ(Jλ)区段。
实施例32.根据实施例31所述的重组核酸分子，其进一步包括编码Ig轻链恒定λ区(Cλ)的核酸序列，
其中所述编码Ig Cλ的核酸序列位于以下各项的下游并与其可操作地连接：
(I)所述经修饰的Ig Vλ区段；以及
(II)所述一个或多个Ig Jλ区段。
实施例33.根据实施例1至32中任一项所述的重组核酸分子，其中所述锚包括将所关注的非免疫球蛋白多肽的所述受体结合部分与所述种系Ig V区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3连接的接头。
实施例34.根据实施例33所述的重组酸分子，其中所述接头包括序列GGGGS(SEQID NO:5)。
实施例35.根据实施例1至34中任一项所述的重组核酸分子，其中所述锚包括利钠肽(NP)的利钠肽受体(NPR)结合部分。
实施例36.根据实施例35所述的重组核酸分子，其中所述NP的所述NPR结合部分包括所述NP的C末端尾部。
实施例37.根据实施例35或实施例36所述的重组核酸分子，其中所述NP是心房利钠肽(ANP)。
实施例38.根据实施例1至37中任一项所述的重组核酸分子，其中所述锚包括序列NSFRY(SEQ ID NO:3)。
实施例39.根据实施例1至38中任一项所述的重组核酸分子，其包括选自由以下组成的组的序列：示出为SEQ ID NO:8或其简并变体的序列、示出为SEQ ID NO:10或其简并变体、其简并变体的SEQ ID NO:11以及SEQ ID NO:12或其简并变体的序列。
实施例40.一种包括根据实施例1至10和33至39中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。
实施例41.根据实施例40所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的非人VH区段。
实施例42.根据实施例40或实施例41所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。
实施例43.根据实施例40至42中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的除一个外的所有非人VH区段或所有非人VH区段、所有非人DH区段和所有非人JH区段。
实施例44.根据实施例40至43中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例45.根据实施例40至44中任一项所述的靶向载体，其中所述5'同源臂包括示出为SEQ ID NO:11的序列，和/或所述3'同源臂包括示出为SEQ ID NO:12的序列。
实施例46.一种包括根据实施例1至17和33至39中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。
实施例47.根据实施例46所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig重链基因座处的一个或多个非人VH区段、所有非人DH基因区段、所有非人JH基因区段和一个或多个非人CH基因。
实施例48.一种包括根据实施例1至2、18至20、27至28、30至31和33至38中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。
实施例49.根据实施例48所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段。
实施例50.根据实施例48或实施例49所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人VL区段和所有非人JL区段。
实施例51.根据实施例48至50中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的所有非人VL区段和所有非人JH区段。
实施例52.根据实施例48至51中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例53.一种包括根据实施例1至2、18至38中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。
实施例54.根据实施例53所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的非人VL区段、所有非人JL基因区段和非人CL基因。
实施例55.一种包括根据实施例1至2、18至20、27至28和33至38中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座，和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。
实施例56.根据实施例55所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段。
实施例57.根据实施例55或实施例56所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的一个或多个非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。
实施例58.根据实施例55至57中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的所有非人Vκ区段和所有非人Jκ区段。
实施例59.根据实施例55至58中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例60.一种包括根据实施例1至2和18至29中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例61.根据实施例60所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Vκ区段、所有非人Jκ基因区段和非人Cκ基因。
实施例62.一种包括根据实施例1至2、18至20、30至31和33至38中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座，和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。
实施例63.根据实施例62所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段。
实施例64.根据实施例62或实施例63所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链基因座处的一个或多个非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。
实施例65.根据实施例62至64中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的所有非人Vλ区段和所有非人Jλ区段。
实施例66.根据实施例62至65中任一项所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例67.一种包括根据实施例1至2、18至26和30至38中任一项所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
实施例68.根据实施例67所述的靶向载体，其中在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所述重组核酸分子置换所述非人Ig轻链λ基因座处的非人Vλ区段、所有非人Jλ基因区段和非人Cλ基因。
实施例69.一种包括根据实施例1至39中任一项所述的重组核酸分子或根据实施例40至68中任一项所述的靶向载体的非人动物基因组，任选地其中非人动物是啮齿动物，任选地其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
实施例70.根据实施例69所述的非人动物基因组，其中重组核酸位于所述非人动物基因组的内源性Ig基因座处。
实施例71.一种包括根据实施例1至39中任一项所述的重组核酸分子、根据实施例40至68中任一项所述的靶向载体或根据实施例69或实施例70所述的非人动物基因组的非人动物或非人动物细胞。
实施例72.根据实施例71所述的非人动物或非人动物细胞，其中所述重组核酸分子、所述靶向载体或所述非人动物基因组在所述非人动物或非人动物细胞的种系中。
实施例73.一种修饰分离的细胞的体外方法，所述方法包括将根据实施例1至39中任一项所述的重组核酸分子引入到所述分离的细胞中。
实施例74.根据实施例73所述的体外方法，其中引入包括使所述细胞与根据实施例40至68中任一项所述的靶向载体接触。
实施例75.根据实施例73或实施例74所述的体外方法，其中所述细胞是宿主细胞。
实施例76.根据实施例73或实施例74所述的体外方法，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞。
实施例77.根据实施例73至76中任一项所述的体外方法，其中所述细胞是啮齿动物细胞，任选地其中所述啮齿动物细胞是大鼠细胞或小鼠细胞。
实施例78.一种由根据实施例76所述的胚胎干细胞产生的非人动物胚胎。
实施例79.一种由根据实施例76所述的胚胎干细胞产生的非人动物。
实施例80.一种制备非人动物的方法，所述方法包括将实施例76的所述ES细胞或包括所述ES细胞的胚胎植入到合适的宿主体内，并且在所述ES细胞或所述胚胎发育成可存活子代期间将所述宿主维持在合适的条件下。
实施例81.根据实施例71至72和79中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其中与对照非人动物相比，所述非人动物包括：
(a)脾脏中相当数量的成熟B细胞；
(b)脾脏中相当数量的κ阳性B细胞；
(c)脾脏中相当数量的λ阳性B细胞；
(d)相当水平的血清IgG；和/或
(e)相当水平的血清IgM。
实施例82.根据实施例71至72、79和81中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其中所述非人动物能够产生与对照非人动物相当的免疫应答。
实施例83.根据实施例71至72、79和81至82中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其包括多种抗原结合蛋白，所述多种抗原结合蛋白各自包括所述锚修饰的Ig多肽，任选地：
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
实施例84.根据实施例71至72、79和81至83中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其中所述非人动物进一步包括所述所关注的非免疫球蛋白多肽的所述同源受体。
实施例85.根据实施例71至72、79和81至84中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其包括多种抗原结合蛋白，所述多种抗原结合蛋白各自包括所述锚修饰的Ig多肽并与所述所关注的非免疫球蛋白多肽的所述同源受体特异性结合，任选地：
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
实施例86.根据实施例84至85中任一项所述的非人动物，其中所述同源受体是利钠肽受体(NPR)。
实施例87.根据实施例84至86中任一项所述的非人动物，其中所述多种抗原结合蛋白中的每一种包括小于1×109的KD和/或超过30分钟的t1/2。
实施例88.根据实施例84至87中任一项所述的非人动物，其中至少15％的所述多种抗原结合蛋白阻断所述同源受体与所述所关注的非免疫球蛋白多肽的结合。
实施例89.根据实施例84至88中任一项所述的非人动物，其中超过50％的所述多种抗原结合蛋白与在细胞表面上表达的所述同源受体结合。
实施例90.根据实施例71至72、79和81至89中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物，其中所述非人动物是啮齿动物，任选地其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
实施例91.一种产生抗原结合蛋白或获得编码所述抗原结合蛋白的核酸的方法，所述方法包括：
用抗原免疫根据实施例71至72、79和81至90中任一项所述的非人动物或根据实施例80所述的方法制备的非人动物；
使所述非人动物产生包括所述锚修饰的Ig多肽的抗原结合蛋白或编码所述抗原结合蛋白的核酸，所述抗原结合蛋白与所述抗原结合，任选地：
其中所述抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中所述抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中所述抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且所述抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
实施例92.根据实施例91所述的方法，其进一步包括从所述非人动物或非人动物细胞回收所述抗原结合蛋白或编码所述抗原结合蛋白的核酸。
实施例93.根据实施例92所述的方法，其中所述非人动物细胞是B细胞或杂交瘤。
实施例94.一种根据实施例91所述的方法回收的非人动物细胞。
实施例95.根据实施例94所述的非人动物，其中所述非人动物细胞是B细胞。
实施例96.根据实施例94或95所述的非人动物细胞，其中所述B细胞是小鼠B细胞。
实施例97.一种杂交瘤细胞，其包括与骨髓瘤细胞融合的根据实施例94至95中任一项所述的非人动物细胞。
实施例98.一种锚修饰的Ig多肽，其由根据实施例1至39中任一项所述的重组核酸分子、根据实施例40至68中任一项所述的靶向载体、根据实施例69至70中任一项所述的非人动物基因组编码，由根据实施例71至72和81至90中任一项所述的非人动物或非人动物细胞表达，由根据实施例73至76和80中任一项所述的方法制备的非人动物或非人动物细胞表达，或根据实施例91至93中任一项所述的方法制备，任选地：
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
实施例99.根据实施例98所述的锚修饰的Ig多肽，其包括位于其N末端的示出为SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
所述实施例的其它特点将在示例性实施例的下述描述的过程中将变得显而易见，所述示例性实施例为了说明而给出，并且不预期是其限制。
实例
提供下述实例以便向本领域普通技术人员描述如何制备和使用本文公开的方法和组合物，并且不预期限制发明人视为其发明的范围。除非另外指明，否则温度用摄氏度说明，且压力是或接近大气压。
实例1.构建包括ANP修饰的免疫球蛋白可变区基因区段的免疫球蛋白可变区
此非限制性实例说明了靶向载体的构建，所述靶向载体用于将锚修饰的免疫球蛋白(Ig)可变区(V)基因区段整合到免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白可变区中。如下所描述的，ANP C末端尾部的编码序列与Ig V基因区段可操作地连接的，所述经修饰的Ig V区段可以与Ig接合(J)基因区段以及适当的Ig多样性(D)基因区段可操作地连接的，使得在V(D)J重组时，表达在免疫球蛋白多肽链的N末端处包括ANP C末端尾部的抗体。
使用以下技术创建了含有用于插入免疫球蛋白重链可变区的ANP修饰的VH基因区段的靶向载体：技术(参见例如，美国专利第6,586,251号和Valenzuela等人,2003,《自然生物技术》21(6):652-659；通过引用并入本文)和本领域已知的分子生物学技术。使用编码ANP的C末端尾部的序列构建靶向载体的非限制性示例性策略在图1至2中描述。
通过从头DNA合成制备了包括通过编码肽接头的序列插入种系VH1-69基因区段的ANP的C末端尾部的供体DNA片段(华盛顿州博赛尔的蓝鹭生物科技公司(Blue HeronBiotech,Bothell,WA))。图1示出了“p466090”ANP-VH1-69 Cas9供体片段。将大观霉素抗性盒“SPEC”连接到供体质粒p46609的EcoRI和AvrII位点，以制备质粒p46685(图1)。图2中示出的是得到的供体质粒p46609的更详细的说明。
供体片段用于修饰BAC克隆VI504(MAID6211)。参见图2。BAC克隆VI504从5'至3'包括约20kb的5'小鼠同源臂、含有小鼠Adam6a基因“a”的约15kb的I-CeuI-AscI片段、Frt-Ub-Hyg-Frt盒和小鼠Adam6b基因“b”、含有种系人VH1-69基因的约9kb的AscI-AsiSI片段、含有人DH和人JH基因的约60kb片段，和含有小鼠IgH内含子增强子(填充椭圆形)的约8kb的3'小鼠同源臂、IgM开关区和部分小鼠IgM基因(图3)。
在步骤1中，用与切割人种系VH1-69基因的5'和3'的两种gRNA的混合物复合的Cas9在体外消化VI504。所得的3'和5'端与p46685的端有60bp的重叠。然后通过Gibson组装将p46685的XhoI片段与VI504(MAID6211)组装以制备VI738。在步骤2中，用MreI消化VI738以去除大观霉素抗性盒。然后通过接合物寡核苷酸介导的Gibson组装修复BAC，留下无缝连结(ΔMreI)以制备最终LTVEC VI748(MAID6833)。除了在VI748中插入ANP-G4S密码子之外，LTVEC与VI504相同。
在使用表1所述的引物构建靶向载体的整个过程中，通过测序和聚合酶链式反应证实了所描述的供体片段的正确组装以及用如本文所描述的NP修饰的VH1-69基因区段靶向置换BAC克隆VI504的种系(GL)VH1-69基因区段。
表1
实例2.包括NP修饰的VH基因区段的啮齿动物的产生
此实例证明了非人动物(例如，啮齿动物)的产生，其基因组包括免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含NP修饰的VH基因区段，例如，包括ANP的C末端尾部的VH基因区段。
将VI748靶向载体线性化并电穿孔到具有内源性Ig重链可变区基因座纯合基因组的小鼠胚胎干细胞中，所述基因座包括除大多数5'VH1-86区段(1115KO)外的所有内源性VH、DH和JH区段的缺失，以及内源性Ig轻链可变区κ基因座，其包括用人Vκ和Jκ区段的完整库置换所有内源性Vκ和Jκ区段。用于电穿孔每个靶向载体的ES细胞的Ig重链基因座(具有50％的Balb、25％的C57BL/6、25％的129背景)如图4所描绘的。电穿孔后，将电穿孔的细胞在选择培养基中培养。在电穿孔后10天挑选耐药菌落，并且通过TAQMANTM和核型分析进行筛选，以获得如前所述的正确靶向(Valenzuela等人,同上；Frendewey,D.等人,2010,《酶学方法》476:295-307，所述文献通过全文引用的方式并入本文)，使用检测锚修饰的VH1-69基因区段的适当整合的引物/探针组。
正向引物：TGTGTCCTGTCCACAGGTG(SEQ ID NO:34)
探针：CCAGTCCAACAGTTCCGGTACG(SEQ ID NO:35)
反向引物：CAGCTGGACCTGGCTACC(SEQ ID NO:36)
使用方法(DeChiara,T.M.等人,2010,《酶学方法》476:285-294；DeChiara,T.M.,2009,《分子生物学方法》530:311-324；Poueymirou等人,2007,《自然生物技术》25:91-99；所述文献通过全文引用的方式并入本文)，其中将靶向的ES细胞注射到未压实的8细胞期Swiss Webster胚胎中，以产生健康的完全ES细胞源性F0代小鼠，所述小鼠对锚(ANP)修饰的VH区段杂合并且表达锚(ANP)修饰的抗体。此类经修饰的小鼠在本文中被称为ANP-VH1-69修饰的小鼠。
药物选择盒可以任选地通过随后添加重组酶(例如，通过Cre处理)或通过繁殖到Cre deleter小鼠品系(参见例如，国际专利申请公开第WO 2009/114400号，通过全文引用的方式并入本文)来去除，以去除由未去除的靶向构建体引入的任何loxed选择盒，例如在ES细胞期或在胚胎中。任选地，选择盒保留在小鼠中。
实例3.通过流式细胞术分析啮齿动物的免疫表型分析
为了确定ANP-VH1-69修饰的小鼠的免疫表型，通过流式细胞术分析骨髓和脾脏B细胞。为了此研究，处死两只对照小鼠(参见例如，美国专利第8,502,018号；第8,642,835号；第8,697,940号，所述美国专利中的每一个通过全文引用的方式并入本文)和实例2中所描述的三只ANP-VH1-69修饰的小鼠，并且采集其脾脏和骨髓。通过在8,000rpm下离心2分钟从股骨收集骨髓。将脾脏解离以获得单细胞悬浮液。用ACK裂解缓冲液裂解来自脾脏和骨髓制剂的红细胞，然后用含有2％ FBS的DPBS洗涤。将分离的细胞(总计1×106个)与抗小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2，BD)在冰上温育10分钟，然后用表2中所描述的抗体组套在冰上标记30分钟。
表2：用于流式细胞术的Ab的组套
在染色后，将细胞洗涤并在2％甲醛中固定。数据采集在BD LSRFortessa流式细胞仪上进行，并且用FlowJo进行分析。使用以下策略鉴定细胞亚群。骨髓成熟：未成熟B细胞(B220int IgM+)、成熟B细胞(B220high IgM+)、原B细胞(IgM-B220int、c-KitintCD43high)、前B细胞(IgM-B220int、c-Kit-CD43int)。脾脏和骨髓κ/λ：B细胞(CD19+CD3-)、T细胞(CD3+CD19-)、IgK+B细胞(CD19+IgK+IgL-)、IgL+B细胞(CD19+IgK-IgL+)。脾脏成熟：成熟B细胞(CD19+、B220+CD93-)，卵泡B细胞(CD19+、B220+CD93-、CD21/35intIgMint/+)，边缘区B细胞(CD19+、B220+CD93-、CD21/35+IgM+)，过渡B细胞(CD19+、B220+CD93+)、T1 B细胞(CD19+、B220+CD93+、IgM+CD23-)、T2 B细胞(CD19+、B220+CD93+、IgM+CD23+)和T3 B细胞(CD19+、B220+CD93+、IgMint CD23+)。
如图5A-5F所示，在脾脏中，与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的B细胞水平相似。ANP-VH1-69修饰的小鼠的成熟B细胞的频率似乎与在对照小鼠中观察到的频率相似，然而与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的未成熟细胞的频率略有下降。在脾脏中，与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的λ和κ阳性B细胞的频率相似。
如图6A-6F所示，在骨髓中，与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的B细胞水平相似。在骨髓中，与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的原B细胞较多，并且前B细胞较少。与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠的骨髓中存在较少成熟和较多未成熟B细胞。
为了对ANP-VH1-69修饰的小鼠进行进一步免疫表型分析，通过蛋白质印迹分析小鼠IgG的水平。对于测定，从ANP-VH1-69修饰的小鼠和对照小鼠的亚群中抽取血液。将血清收集在血清分离管(BD公司)中，温育30分钟，并且通过在4℃下以9000rcf离心五分钟从血液中分离。将小鼠血清在PBS中以1:25稀释，并且然后在非还原条件下在4％至20％ Novex Tris-Glycine凝胶上运行。根据制造商的规范(BioRad Trans-Blot转移系统)将凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后用具有0.05％吐温20(TBST，西格玛公司(Sigma))的Tris缓冲盐水中的10％脱脂牛奶阻断印迹过夜。将PVDF膜与在TBST中的4％脱脂牛奶中以1:20,000稀释的抗小鼠IgG-HRP(赛默公司(Thermo)/Pierce公司(Pierce)，目录号31432)在室温下温育一小时。然后将印迹洗涤五次，每次洗涤五分钟，并且随后根据制造商的规范用Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂(通用电气医疗集团(GEHealthcare Life Sciences))显影一分钟。然后使用GE Healthcare ImageQuant LAS-4000冷却CCD相机凝胶记录系统对印迹进行成像。以15秒间隔捕获图像直到捕获到20幅图像或图像完全暴露，以先到者为准。
如图7所示，如通过蛋白质印迹测量的，ANP-VH1-69修饰的小鼠和对照小鼠的血清IgG水平相当。此结果表明，与对照小鼠相比，ANP小鼠Designer V小鼠具有正常Ab水平。
为了对ANP-VH1-69修饰的小鼠进行进一步免疫表型分析，通过ELISA测量总血清IgM和IgG的水平。对于ELISA，用1μg/mL的抗小鼠IgM+IgG+IgA(克隆Ab102445，艾博抗公司(Abcam))在4℃下涂覆板过夜。然后在具有0.1％吐温20的DPBS中洗涤板，并且在室温下在DPBS中的1％ BSA中阻断1小时。ANP-VH1-69修饰的小鼠或对照小鼠的血清和小鼠IgM标准品(百进生物公司，目录号401604)或小鼠IgG标准品(西格玛公司，目录号I8765)在DPBS中的1％ BSA中连续稀释，并且在室温下温育1小时。温育后，在具有0.1％吐温20的DPBS中洗涤板，并且使用抗小鼠IgM-HRP(南方生物技术公司(SouthernBiotech)，目录号1021-05)或抗小鼠IgG-HRP(南方生物技术公司，目录号1030-05)检测IgM或IgG。进行进一步的洗涤，并且然后添加TMB底物(BD公司)。在允许显色后，用1N硫酸停止反应，并且在SpectraMax读板仪上读取450nm处的吸光度。使用IgM或IgG标准品的非线性回归(曲线拟合，四参数)在GraphPad Prism中生成标准图，并且定量血清IgM和IgG水平。
如图8A-8B所示，通过ELISA测量的血清IgG水平在ANP-VH1-69修饰的小鼠与对照小鼠之间是相当的。通过ELISA测量的血清IgM水平在ANP-VH1-69修饰的小鼠与对照小鼠之间也是相当的。两个结果都表明，与对照小鼠相比，ANP小鼠具有正常的Ab水平。
通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)验证了抗体对锚的保留。使用蛋白A磁珠(赛默科技公司(Thermo Scientific))从小鼠血清中分离的免疫球蛋白通过SDS-PAGE凝胶在还原条件下运行，以分离免疫球蛋白重链和轻链。切除免疫球蛋白重链并用Lys-C酶(普洛麦格公司(Promega))消化过夜。根据制造商的方案，用C18 Ziptip(密理博公司(Millipore))从消化物中去除盐。在2.5ul的含有10mg/ml的a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)的70％ ACN/0.1％ TFA中从每个ziptip洗脱肽，并且将其直接应用于与a-氰基4-羟基肉桂酸混合的Bruker Anchorchip靶标(Bruker Daltonics)上，所述靶标溶于70％乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)中。干燥后，通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)在Bruker Ultraflextreme MALDI MS(Bruker Daltonics)上以反射管正模式分析每个靶标。
MALDI-TOF MS表明，ANP修饰的免疫球蛋白在ANP-VH-1-69修饰的小鼠的血清中保持完整(数据未示出)。
实例4.啮齿动物体内含有工程化免疫球蛋白可变区基因区段的抗体的产生
此实例展示了在啮齿动物体内产生抗体，所述啮齿动物的基因组包括免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含如本文所描述的工程化免疫球蛋白可变区基因区段。此实例中所描述的方法和/或本领域众所周知的免疫方法可以用于按照期望用多肽或其片段(例如，源自期望的表位的肽)或多肽或其片段的组合免疫含有如本文所描述的工程化免疫球蛋白可变区基因区段的啮齿动物。
简而言之，使用本领域已知的免疫方法，用所关注的抗原，例如与同源受体结合的所关注的非免疫球蛋白多肽的受体攻击包含如本文所描述的工程化免疫球蛋白可变区基因区段的小鼠队列。通过ELISA免疫测定(即，血清滴度)监测抗体免疫应答。
免疫
对照(n＝3)和ANP-VH1-69修饰的(n＝4)小鼠使用标准免疫方案用蛋白质免疫原免疫，所述蛋白质免疫原包括融合到C末端mFc标签(称为人NPR3胞外-mFc)的NPR3的胞外结构域。在开始免疫之前和免疫原增强之后对小鼠进行取血。对用于抗体分离的小鼠实施安乐死之前的最后一次取血进行人NPR3蛋白(包括融合到myc-myc-六聚组氨酸标签的C末端的NPR3的胞外结构域；称为人NPR3胞外-MMH)和工程化人NPR3表达细胞(工程化为过表达全长人NPR3的HEK293细胞；称为293/hNPR3细胞)的滴度分析。
抗血清滴度确定
使用ELISA确定血清中抗NPR3的抗体滴度。将九十六孔微量滴定板(Pierce公司)以2μg/mL的人NPR3胞外-MMH抗原在磷酸盐缓冲盐水(PBS，Irvine Scientific)中于4℃下涂覆过夜。用含有0.05％吐温20的PBS(PBS-T，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))洗涤板，并且在室温下用PBS中的250μL的0.5％牛血清白蛋白(BSA，西格玛-奥德里奇公司)阻断1小时。用PBS-T洗涤板。将免疫前和免疫抗血清在0.5％ BSA-PBS中连续稀释三倍，并且在室温下添加到板中1小时。洗涤板，并且将山羊抗小鼠IgG-Fc辣根过氧化物酶(HRP)缀合的次级抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson ImmunoResearch))以1:5000稀释度添加到板中，并且在室温下温育1小时。使用TMB/H2O2作为底物，通过温育15分钟至20分钟对板进行洗涤和显影。用酸停止反应，并且在450nm下的分光光度计(Victor，珀金埃尔默公司(Perkin-Elmer))上读取板。使用Graphpad PRISM软件计算抗体滴度。滴度被定义为内插血清稀释因子，其结合信号是背景的2倍。
细胞的抗体滴度
使用中尺度发现公司(Meso Scale Discovery，MSD)的技术确定工程化细胞上的抗NPR3抗体滴度。九十六孔碳电极板(来自MSD)在37℃下用PBS中的293/hNPR3细胞或HEK293细胞的40,000个细胞/孔涂覆1小时。倾析细胞包衣溶液，并且通过在室温(RT)下用150μL的于PBS中的2％牛血清白蛋白(BSA，西格玛-奥德里奇公司)温育1小时阻断板，然后用PBS洗涤。将免疫前和免疫抗血清在1％ BSA-PBS中连续稀释三倍，并且在室温下添加到板中1小时，然后洗涤。然后将山羊抗小鼠IgG-Fc钌缀合的次级抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司和内部钌标记)以1μg/mL添加到板中，并且在室温下温育1小时。将MSD的4X Read Buffer T无表面活性剂稀释到1X，并且向每个孔中添加150μL，并且在MSD成像仪上读取。使用Graphpad PRISM软件计算抗体滴度。滴度被定义为内插血清稀释因子，其结合信号是背景的2倍。
结果
对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠的体液免疫应答是在用NPR3胞外蛋白免疫原免疫后，使用重组hNPR3蛋白和工程化的人NPR3表达细胞(HEK293/hNPR3)确定的。ANP-VH1-69修饰的小鼠(n＝4)的抗体对hNPR3.mmh蛋白显示出一定范围的高抗体滴度，平均滴度为465,625，与对照品系(n＝3)的平均滴度394,032相当(图9)。ANP-VH1-69修饰的小鼠对表达HEK293/hNPR3的细胞和亲代HEK293细胞的平均抗体滴度分别为268,763和3,948，表明抗血清对NPR3具有特异性。对照小鼠获得了类似的结果，对表达HEK293/hNPR3的细胞和亲代HEK293细胞的平均抗体滴度分别为72,826和5,219(图10)。这些结果表明，ANP-VH1-69修饰的小鼠能够产生与对照小鼠品系相当的免疫应答。
实例4.表达和/或编码啮齿动物产生的含有工程化免疫球蛋白可变区基因区段的抗体的核酸的细胞的分离
当实现所需的免疫应答时，收集脾细胞(和/或其它淋巴组织)并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保持其活力并形成永生化杂交瘤细胞系。对杂交瘤细胞系进行筛选(例如，通过ELISA测定)和选择，以鉴定产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞系。还可以根据需要表征杂交瘤的相对结合亲和力和同种型。使用这种技术，获得几种抗原特异性嵌合抗体(即，具有人可变结构域和啮齿动物恒定结构域的抗体)。
编码重链和轻链可变区的DNA可被分离并连接至重链和轻链的期望同种型(恒定区)，用于制备全人抗体。此类抗体蛋白可以在如CHO细胞等细胞中产生。然后表征完全人抗体对所关注的抗原的相对结合亲和力和/或中和活性。
编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离。最初，分离具有人可变区和啮齿动物恒定区的高亲和力嵌合抗体，并且针对期望特征(包含亲和力、选择性、表位等)进行表征且选择。用所需人恒定区替换啮齿动物恒定区，以生成全人抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。还从抗原阳性B细胞(来自免疫小鼠)中直接分离抗原特异性抗体，而不融合至骨髓瘤细胞，如例如美国专利号7,582,298中所述，所述专利特别以引用的方式全文并入本文。使用这种方法，制备了若干种完全人抗原特异性抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。
具体而言，来自NPR3免疫的小鼠或ANP-VH1-69修饰的小鼠的脾细胞用使用C末端人Fc标签(hNPR3胞外-hFc)和FITC抗mFc表达的人NPR3胞外结构域染色，如美国专利第7,582,298号中所描述的，所述美国专利通过全文引用的方式并入本文。通过荧光激活的细胞分选(FACS)将单个IgG阳性和抗原阳性B细胞分离到384孔板的分离的孔中。根据Wang和Stollar描述的方法进行来自这些B细胞的抗体基因的RT-PCR(《免疫学方法杂志(Journal of Immunology Methods)》2000；244:217-225，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。简而言之，通过逆转录酶(RT)反应(SUPERSCIPTTMIII，英杰公司(Invitrogen))合成每个B细胞的cDNA。然后将每个得到的RT产物分离并转移到分离的384孔板上的两个对应的孔中，用于扩增重链和轻链序列。首先使用对人IgG重链可变区前导序列具有特异性的5'简并引物和对小鼠重链恒定区具有特异性的3'引物通过PCR扩增一组得到的RT产物，以形成扩增子。使用对人IgG重链可变区序列的框架1具有特异性的5'简并引物组或ANP肽(仅ANP小鼠)的特异性引物以及对人IgG重链可变区序列的框架4具有特异性的3'简并引物组对扩增子进行第二轮PCR。首先使用对人κ轻链可变区前导序列具有特异性的5'简并引物和对小鼠κ轻链恒定区具有特异性的3'引物通过PCR扩增另一组得到的RT产物以形成扩增子。使用对人κ轻链可变区序列的框架1具有特异性的5'简并引物组和对人κ轻链可变区序列的框架4的3'简并引物组对此扩增子进行第二轮PCR。将重链和轻链PCR产物分别克隆到含有人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的抗体载体中。通过CHO K1细胞的瞬时转染产生重组hIgG1抗体用于进一步筛选。
实例5：从CHO K1细胞分离的上清液的初步筛选
表征了含有从CHO K1转染的细胞(146个来自ANP-VH1-69修饰的小鼠并且65个来自对照)收集的上清液的抗NPR3单克隆抗体的组套与hNPR3-mmH的结合特性，并且使用SPR技术确定了动力学结合参数和平衡结合常数。
使用Biacore 4000仪器，使用实时表面等离子体共振生物传感器确定NPR3与不同NPR3单克隆抗体(mAb)结合的平衡解离常数(KD)和pH6.0下的解离速率。所有结合研究均在10mM磷酸钠、137mM NaCl、2.7mM KCl和0.05％v/v表面活性剂吐温20(PBS-T)中进行，在25℃下pH 7.4(PBS-T_pH7.4)缓冲液中制备。Biacore CM5传感器芯片表面首先通过与抗人Fc特异性小鼠mAb(REGN2567)的胺偶联进行衍生，以捕获不同的NPR3mAb。将在PBS-T_pH7.4运行缓冲液中制备的用C末端myc-myc-6xHis标签(hNPR3-MMH)表达的单个100nM浓度的人NPR3胞外结构域以30微升/分钟的流速在NPR3 mAb捕获的表面上注射90秒，并且监测其在PBS-T_pH7.4运行缓冲液中的解离90秒。在解离阶段之后，将在pH 6.0(PBS-T_pH6.0)下制备的PBS-T缓冲液注射2分钟。在每个循环结束时，使用20mM磷酸的12秒注射使NPR3 mAb捕获的表面再生。
缔合速率(ka)和解离速率(kd)通过使用Biacore 4000评估软件将实时结合传感器图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来确定，而来自PBS-T_pH6.0中的NPR3 mAb的hNPR3-MMH的解离通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件拟合解离曲线来确定。根据动力学速率计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)为：
和
表3中还计算并提供了从对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的NPR3 mAb的KD和t1/2值的中值和平均值。
从对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的NPR3mAb的KD和t1/2值分别使用盒和箱线图进行比较，如图11-12所示。
表3分别列出了来自ANP-VH1-69修饰的和对照的mAb的KD和t1/2的平均值和中值，并且KD值和t1/2值的比较分别在图11和图12中示出。ANP-VH1-69修饰的和对照小鼠两者都能够产生宽亲和力范围的抗体，其中来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的Ab的平均/中值KD值比对照小鼠小，并且t1/2较长。这些结果表明，ANP-VH1-69修饰的小鼠可能在比对照小鼠更高的群体中产生高亲和力抗体。
表3：hNPR3-MMH与NPR3单克隆抗体(mAb)的中值和平均KD和t1/2值，所述单克隆抗体在25℃下从对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠分离
Luminex
进行Luminex结合测定以确定从用NPR3免疫的小鼠中分离的抗体与NPR3抗原的组套的结合。对于此测定，抗原是与Luminex微球偶联的胺。用于胺偶联蛋白的微球如下制备：约1000万个MicroPlex微球(MicroPLex Microspheres，Luminex，目录号LC10000-00)，通过在500μL的0.1M NaPO4(pH 6.2)(激活缓冲液)中涡旋重新悬浮，并且然后离心以去除上清液。将微球重新悬浮于160μL的活化缓冲液中，并且将羧酸酯基团(-COOH)通过添加15μL的50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，赛默科技公司，目录号24525)、然后添加15μL的50mg/mL1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC，赛默科技公司，目录号22980)(25℃下)。10分钟后，通过添加pH 5.0的500μL的50mM MES将反应的pH降低到5.0，并且将微球涡旋随后离心以去除上清液。将激活的微球立即与500μL的25μg/mL的蛋白质抗原[用C末端人Fc标签表达的人NPR3胞外结构域(hNPR3胞外-hFc)和用与人ANP复合的C末端小鼠Fc标签(hNPR3-胞外-mFc-hANP)表达的人NPR3胞外结构域]在50mM MES pH 5.0中混合。每个偶联的蛋白质/抗体使用独特的珠区。将微球-蛋白质混合物在25℃下温育两小时。将偶联反应通过添加pH 8.0的50μL的1M Tris-HCl淬灭，并且将微球涡旋、离心并用800uL的含有0.05％吐温20的PBS洗涤三次，以去除未偶联的蛋白质和其它反应组分。将微球以1000万个微球/mL重新悬浮具有2％ BSA和0.05％叠氮化钠的PBS中。
将具有胺偶联蛋白的微球以2700珠/mL混合，然后将75μL的微球每孔铺板在96孔过滤板平底板上(密理博公司，目录号：MSBVN1250)，并且与25μL的含有单个抗NPR3抗体的上清液混合。将样品和微球在25℃下温育两小时，并且然后用200μL的含有0.05％吐温20的PBS洗涤两次。为了检测单个微球的结合抗体水平，添加100μL的2.5μg/mL R-藻红蛋白缀合的山羊F(ab')2抗人κ(南方生物技术公司，目录号2063-09)(在含有2％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS中)，然后在25℃下温育30分钟。样品用200μL的含有0.05％吐温20的PBS洗涤两次，并且重新悬浮在150μL的含有0.05％吐温20的PBS中。在具有Luminex xPonent软件版本4.2的Luminex FlexMap3D仪器上读取板。
表4中示出了结合信号大于1000但小于5000以及大于5000的与hNPR3-胞外-hFc和hNPR3-胞外-mFc-hANP结合的抗体。检测了总计439个样品：来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的236个样品和来自对照小鼠的203个样品。结合信号被测量为中值荧光强度(MFI)。如表4所示，与从对照小鼠中分离的抗体相比，来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的抗体在Luminex测定中与hNPR3胞外-hFc和hNPR3胞外-mFc-hANP>5000的复合物结合的百分比更高。
表4：在Luminex结合测定中与胺偶联的hNPR3-胞外-hFc和hNPR3-胞外-mFc-hANP结合的抗NRP3抗体的总数(百分比)。
阻断能力
开发了一种基于ELISA的阻断测定来确定抗NPR3抗体阻断人NPR3结合人ANP(hANP)的能力。在此测定中，重组人NPR3蛋白，包括在NPR3C末端与小鼠IgG2a的Fc部分融合的一部分人NPR3胞外结构域(氨基酸Gly27-Ser482)(hNPR3-mFc、Seq ID或登录号)，在4℃下的96孔微量滴定板上以2μg/mL的PBS浓度被动吸收过夜。随后使用在PBS中的BSA的0.5％(w/v)溶液在室温下阻断非特异性结合位点1小时。用PBS+吐温洗涤板后，添加1:10稀释的抗NPR3抗体上清液或1μg/mL的非结合人IgG1同种型对照抗体。将板在室温下温育1小时，然后添加重组生物素化的hANP(生物素-hANP；加利福尼亚州伯林盖姆的凤凰制药公司(Phoenix Pharmaceuticals INC,Burlingame,CA))到200pM的最终浓度并温育1小时。生物素-hANP的浓度在EC50值附近的生物素-hANP与板涂覆的hNPR3的剂量依赖性结合的动态范围内。洗涤板，并且用100ng/mL与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素检测板结合的生物素-hANP，并且根据制造商的推荐程序使用TMB底物溶液(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA))进行可视化。在VictorTM多标签读板仪(PerkinElmerTM)上测量450nm处的吸光度。
使用下式计算测试的抗NPR3抗体的阻断百分比：
阻断生物素-hANP与hNPR3的结合大于或等于50％的抗体被归类为阻断剂。
使用基于ELISA的阻断测定评估了来自对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠的抗NPR3抗体上清液阻断人ANP与人NPR3结合的能力。如表5所见的，338份抗NPR3抗体上清液用于测试阻断人ANP与人NPR3的结合，其中125份来自对照小鼠，并且213份来自ANP-VH1-69修饰的小鼠。一百三十四份抗NPR3抗体上清液以大于或等于50％的阻断百分比阻断hNPR3-mFc与生物素-hANP的结合。在134种阻断剂中，17种是从对照小鼠中分离的，并且117种来自ANP-VH1-69修饰的小鼠，所述阻断剂分别占对照小鼠和ANP-VH1-69修饰的小鼠测试的抗体数量的14％和55％。在前50种阻断剂中，7种来自对照小鼠，并且43种来自ANP-VH1-69修饰的小鼠，其分别占两个品系的小鼠测试的总mAb的6％和20％。
在此实验中，人IgG1同种型对照抗体显示出32％的阻断百分比，并且被归类为非阻断剂。
总体而言，与对照小鼠相比，ANP-VH1-69修饰的小鼠产生了更多的抗体，所述抗体以高特异性与NPR3结合，并且阻断了重组NPR3蛋白与人ANP的结合。
表5.阻断人ANP与人NPR3-mFc结合的抗NPR3抗体上清液的汇总。
使用基于电化学发光(ECL)的测定确定从用NPR3重组蛋白免疫的ANP-VH1-69修饰的和对照小鼠中分离的抗人NPR3单克隆抗体与表达人NPR3(hNPR3)的细胞结合的能力。
简而言之，HEK293通过用编码人NPR3的新霉素抗性pLVXN.NPR3表达质粒(氨基酸M1-A541，UniProtKB-P17342)转染细胞而被工程化以表达人NPR3。将非转染的HEK293细胞作为背景结合对照包含在实验中，其通过用商用心房利钠肽(ANP)的荧光激活细胞分选(FACS)未显示出可检测的NPR3表达。包含抗过敏原人IgG1抗体和抗独特型小鼠IgG2抗体作为用于结合的无关抗体对照。
根据以下程序进行实验。将表达NPR3的细胞和在烧瓶中培养的亲本细胞在不含Ca2+/Mg2+的1xPBS缓冲液中冲洗一次，并且在37℃下与无酶细胞解离溶液温育10分钟以分离细胞。用含有Ca2+/Mg2+的1xPBS洗涤细胞沉淀物一次，并且用CellometerTM Auto T4细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的耐细隆生物技术公司(Nexcelom Bioscience,Lawrence,MA))计数。将每个孔约2.0×104个HEK293/hNPR3或HEK293细胞分别接种到96孔碳电极板(马里兰州罗克维尔的中尺度发现公司(Meso Scale Discovery,Rockville,MD))上，并且在37℃下温育1小时以使细胞粘附。非特异性结合位点通过与2％ BSA(w/v)在含有Ca2+/Mg2+的1xPBS中在室温下温育1小时来阻断。将稀释为1:10或0.2μg/mL对照抗体的抗NPR3抗体上清液添加到板结合的细胞中，然后在室温下温育1小时。然后使用具有细胞洗涤头的AquaMax2000洗板器(加利福尼亚州桑尼维尔的MDS分析技术公司(MDS AnalyticalTechnologies,Sunnyvale,CA))洗涤板以去除未结合的抗体。板结合的人IgG用对重链和轻链具有特异性的SULFO-TAGTM缀合的山羊多克隆抗人IgG抗体(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson Immunoresearch Labs,West Grove,PA))检测，并且板结合的小鼠IgG(商用NPR3抗体和mIgG同种型对照抗体)用对Fcγ片段具有特异性的SULFO-TAGTM缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG抗体检测(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室有限公司)，在室温下进行1小时。洗涤后，根据制造商的推荐程序，用读取缓冲液(马里兰州罗克维尔的中尺度发现公司)对板进行显影，并且用SECTOR Imager 600(马里兰州罗克维尔的中尺度发现公司)记录发光信号。计算HEK293/hNPR3上的结合信号与亲代HEK293细胞的比率，并且将其报告为抗NPR3抗体的结合特异性的指示。在HEK293/hNPR3细胞上具有大于或等于200RLU的结合信号并且结合比率大于或等于3的抗体被归类为特异性结合物，并且具有小于200RLU的结合信号或结合比率小于3的抗体被归类为非特异性结合物或非结合物。
结果：
在基于电化学发光的结合测定中评估了从对照和ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的抗NPR3抗体与表达NPR3的HEK293细胞特异性结合的能力。
实验结果在表6中汇总。测试了粗上清液中总共338种抗NPR3抗体与HEK293/hNPR3细胞的结合，其中125种抗体从对照小鼠中分离，并且213种抗体从ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离。总共有250种抗NPR3抗体，其中62种来自对照，并且188种来自ANP-VH1-69修饰的小鼠，在HEK293/hNPR3细胞上显示出大于或等于200RLU的结合信号，并且在HEK293/hNPR3上与亲代HEK293的结合比率大于或等于3，表明这些抗体能够与NPR3特异性结合。来自对照小鼠的百分之五十的以及相比之下，来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的88％的抗NPR3抗体是特异性NPR3结合物。在前50种特异性结合物中，6种抗体来自对照，并且44种来自ANP-VH1-69修饰的小鼠，这表明5％的来自对照小鼠的抗NPR3抗体上清液和21％的来自ANP-VH1-69修饰的小鼠的抗NPR3抗体上清液是顶级结合物。
在实验中，商用抗hNPR3-mIgG2抗体(包含作为与HEK293/hNPR3细胞特异性结合的阳性对照)以及人IgG1和小鼠IgG2同种型对照两者都没有如预期的与HEK293/hNPR3细胞结合。
总体而言，使用HEK293/hNPR3细胞的结合结果表明，ANP-VH1-69修饰的小鼠能够产生与hNPR3表达细胞特异性结合的抗体，并且从ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的抗体的高效结合物的丰度可能高于从常规对照小鼠中分离的抗体。
表6：与工程化以表达人NPR3的细胞结合的抗NPR3抗体上清液的汇总。
纯化的抗体
为了评估源自ANP-VH1-69修饰的小鼠的抗NPR3抗体与NPR3结合的能力，在HEK293细胞(人胚胎肾293，ATCC)中建立了工程化细胞系，所述细胞被转染以稳定表达全长人NPR3，并且随后进行高表达分选。所得细胞系被命名为HEK293/hNPR3高分选(ACL#9752，再生元制药公司(Regeneron))。
对于流式细胞术结合评估，用无酶细胞解离缓冲液(密理博公司，目录号S-004-C)提升HEK293/hNPR3高分选细胞，洗涤一次并用2％过滤的胎牛血清(Seradigm公司(Seradigm)，目录号1500-500)重新悬浮于染色缓冲液(1X PBS，不含钙或镁(欧文科技公司(Irvine Scientific)，目录号9240))中，并且用可固定的绿色活力染料(生命技术公司(Life Technologies)，目录号L23101)染色，然后再次洗涤并在V底染色板(爱思进科技公司(Axygen Scientific)，目录号P-96-450-V-C-S)中铺板。
将从ANP-VH1-69修饰的小鼠和对照小鼠分离的纯化的抗体、商用抗体(GeneTex公司(GeneTex)，GTX84015)或同种型对照抗体在染色缓冲液1:3中从100nM连续稀释到24.4pM(具有用于单独染色缓冲液的另外的孔，不含测试分子)，并且添加到染色板中的细胞中。
在另外的洗涤步骤后，在用CytoFix(BD生物科学公司，目录号554655)固定缓冲液固定之前，用647标记的次级检测抗体[抗人(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号109-607-003)和抗小鼠(杰克逊免疫研究实验室有限公司，目录号115-607-003)]对样品进行染色。所有样品在通过iQue PLUS细胞仪之前通过96孔滤板(颇尔公司(Pall)，目录号8027)过滤到U底读取板(康宁公司(Corning)，目录号3799)中，并且测量每个样品的平均荧光强度(MFI)。在iQue软件中对数据进行门控，以计算RL1-A通道中每个样品的几何平均值，并且使用8软件中的非线性回归(4参数逻辑)模型对结果进行进一步分析，以获得EC50值。使用以下方程计算最大结合倍数：
在此方程中，“MFI几何平均RL1-A”是指用纯化的抗体染色的细胞的RL1-A通道中的最大平均荧光强度(MFI)值。“MFI几何平均RL1-A，仅次级抗体对照”是指来自仅用Alexa647标记的次级检测抗体染色的细胞的RL1-A通道中的MFI值。
如表7所示，从用ANP标签(“+ANP”)表达的ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的12种纯化的抗NPR3抗体，从不用ANP标记(“-ANP”)表达的ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的12个纯化的抗NPR3抗体，以及从对照小鼠中分离的8种纯化的抗NPR3抗体通过流式细胞术测试了与HEK293/hNPR3高分选细胞的特异性结合。从用ANP标签表达的ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的12种纯化的抗NPR3抗体中，有十一种显示出与HEK293/hNPR3细胞的特异性结合，与仅次级检测抗体对照相比，其结合倍数值范围为21至1012，并且EC50值范围为7.7nM至>10nM。从没有用ANP标签表达的ANP-VH1-69修饰的小鼠中分离的12种纯化的抗NPR3抗体中，有10种显示出与HEK293/hNPR3细胞的特异性结合，与仅次级检测抗体对照相比，其结合倍数值范围为132至819，并且EC50值范围为6.3nM至>10nM。从对照小鼠中分离的所有8种纯化的抗NPR3抗体都显示出与HEK293/hNPR3细胞的特异性结合，与仅次级检测抗体对照相比，其结合倍数值范围为215至789，并且EC50值范围为2.4nM至>10nM。同种型对照抗体显示不与HEK293/hNPR3细胞结合，并且商用抗NPR3抗体与HEK293/hNPR3结合，其结合是仅次级检测抗体对照的22倍，并且EC50为7.6nM。
表7
等效形式
在如此描述本发明的至少一个实施例的若干方面后，所属领域的技术人员应了解，所属领域的技术人员将容易想到各种更改、修改和改进。此类改变、修改和改进旨在作为本公开的部分，并且旨在处于本发明的精神和范围内。因此，前述描述和附图只是为了举例且本发明通过以下权利要求书详细描述。
所属领域的技术人员将了解可归因于本文所述分析或其它过程中所得值的偏差或误差的典型标准。
本文引用的用以描述本发明背景以及用以提供与其实施有关的其它细节的出版物、网站和其它参考材料均据此以引用方式并入。
Claims (19)
1.一种重组核酸分子，其包括编码锚修饰的Ig多肽的经修饰的免疫球蛋白(Ig)可变(V)区段，
其中所述经修饰的Ig V区段包括编码锚的核酸序列，所述锚位于编码Ig信号肽的核酸序列与编码种系Ig V区段或其变体的框架区(FR)1、互补决定区(CDR)1、FR2、CDR2、FR3和CDR3的核酸序列之间，
其中锚修饰的Ig多肽包括可操作地连接的以下各项：
(i)所述Ig信号肽；
(ii)所述锚；以及
(iii)所述种系Ig V区段或其变体的所述FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3，
其中所述锚包括与同源受体结合的所关注的非免疫球蛋白多肽的受体结合部分，并且
任选地其中所述核酸分子缺乏任何其它V区段。
2.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括位于所述非人Ig重链基因座处的非人Ig CH上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。
3.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig重链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig重链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig重链基因座包括与所述非人Ig重链基因座处的非人Ig重链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig重链基因座是内源性啮齿动物Ig重链基因座，和/或其中所述非人Ig重链基因座包括人或人源化免疫球蛋白重链可变区、内源性Ig VH、DH和/或JH基因区段的缺失或其组合。
4.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig CL上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。
5.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链基因座包括与所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig轻链调控序列可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链基因座是内源性啮齿动物Ig轻链基因座，和/或其中所述非人Ig轻链基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig VL和/或JL基因区段的缺失或其组合。
6.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括位于所述非人Ig轻链κ基因座处的非人Ig Cκ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链κ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链κ基因座，和/或其中所述非人Ig轻链κ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vκ和/或Jκ基因区段的缺失或其组合。
7.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链κ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链κ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链κ基因座包括与所述Ig轻链κ基因座处的非人Ig轻链κ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
8.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括位于所述非人Ig轻链基因座处的非人Ig Cλ上游并与其可操作地连接的重组核酸分子，任选地其中所述非人Ig轻链λ基因座是内源性啮齿动物Ig轻链λ基因座，和/或其中所述非人Ig轻链λ基因座包括人或人源化免疫球蛋白轻链可变区、内源性Ig Vλ和/或Jλ基因区段的缺失或其组合。
9.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子的靶向载体，其中所述靶向载体进一步包括靶向非人Ig轻链λ基因座的5'和3'同源臂，使得在所述靶向载体与所述非人Ig轻链λ基因座之间同源重组时，所靶向的非人Ig轻链λ基因座包括与所述Ig轻链λ基因座处的非人Ig轻链λ调控序列可操作地连接的重组核酸分子。
10.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子或根据权利要求2至9中任一项所述的靶向载体的非人动物基因组，任选地其中非人动物是啮齿动物，任选地其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
11.一种包括根据权利要求1所述的重组核酸分子、根据权利要求2至9中任一项所述的靶向载体或根据权利要求10所述的非人动物基因组的非人动物或非人动物细胞。
12.一种修饰分离的细胞的体外方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的重组核酸分子引入到所述分离的细胞中，其中引入包括使所述细胞与根据权利要求2至9中任一项所述的靶向载体接触，其中所述细胞是胚胎干(ES)细胞。
13.一种由根据权利要求12所述的胚胎干细胞产生的非人动物胚胎。
14.一种由根据权利要求12所述的胚胎干细胞产生的非人动物。
15.一种制备非人动物的方法，所述方法包括将权利要求12的所述ES细胞或包括所述ES细胞的胚胎植入到合适的宿主体内，并且在所述ES细胞或所述胚胎发育成可存活子代期间将所述宿主维持在合适的条件下。
16.一种产生抗原结合蛋白或获得编码所述抗原结合蛋白的核酸的方法，所述方法包括：
用抗原免疫根据权利要求11所述的非人动物或根据权利要求15所述的方法制备的非人动物；
使所述非人动物产生包括所述锚修饰的Ig多肽的抗原结合蛋白或编码所述抗原结合蛋白的核酸，所述抗原结合蛋白与所述抗原结合，任选地：
其中所述抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中所述抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中所述抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且所述抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
17.一种根据权利要求16所述的方法回收的非人动物细胞。
18.一种杂交瘤细胞，其包括与骨髓瘤细胞融合的根据权利要求17所述的非人动物细胞。
19.一种锚修饰的Ig多肽，其由根据权利要求1所述的重组核酸分子、根据权利要求2至9中任一项所述的靶向载体、根据权利要求10所述的非人动物基因组编码，由根据权利要求11所述的非人动物或非人动物细胞表达，由根据权利要求12或15所述的方法制备的非人动物或非人动物细胞表达，或根据权利要求16所述的方法制备，任选地：
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，
其中每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的，或者
其中每种抗原结合蛋白的质量证实所述锚修饰的Ig多肽的存在，并且每种抗原结合蛋白的质量是通过基质辅助激光解吸电离–飞行时间质谱法确定的。
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