KR20150023535A - 공통 경쇄를 사용하여 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법 - Google Patents

공통 경쇄를 사용하여 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법 Download PDF

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죤 맥훠터
린 맥도날드
션 스티븐스
사뮤엘 데이비스
데이비드 알. 버클러
캐롤리나 에이. 호시아와
앤드류 제이. 머피
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Abstract

유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 마우스는 제한된 수의 경쇄 가변 도메인을 특징으로 하는 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 발현하고, 생식세포 계열의 제한된 레퍼토리로부터 단 하나 또는 소수의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스가 제공된다. 본원에서 설명된 마우스를 사용하여, 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는, 보편적인 경쇄를 갖는 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공된다. 다중 특이적 결합 단백질, 예를 들어, 이중 특이적 항체에서 사용에 적합한 인간 가변 영역을 만드는 방법, 및 숙주 세포가 제공된다. 제1 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체가 제공되는데, 제1 및 제2 항원은 단일 단백질의 별개의 에피토프이거나 두 개의 다른 단백질 상의 별개의 에피토프가 제공된다.

Description

공통 경쇄를 사용하여 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법{METHODS FOR MAKING FULLY HUMAN BISPECIFIC ANTIBODIES USING A COMMON LIGHT CHAIN}
본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서 2013년 6월 5일에 출원되었으며, 2012년 6월 5일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제13/488,628호의 우선권을 주장하며, 이것의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
다양한 인간 가변/마우스 불변 중쇄와 결합된 공통 인간 가변/마우스 불변 경쇄를 갖는 항체를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 마우스의 B 세포의 인간 가변 영역 유전자 서열의 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공된다.
항체는 전형적으로 호모다이머 중쇄 구성요소를 포함하며, 각각의 중쇄 모노머는 동일한 경쇄에 결합된다. 헤테로다이머 중쇄 구성요소를 갖는 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체)는 치료적 항체로서 바람직하다. 이중 특이적 항체의 중쇄 각각에 만족스럽게 결합할 수 있는 적합한 경쇄 구성요소를 갖는 이중 특이적 항체를 만드는 것은 문제가 있는 것으로 증명되었다.
한 접근법에서, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 사용량 통계(usage statistics)를 조사하고, 인간 항체에서 가장 자주 이용된 경쇄를 확인하고, 시험관 내에서 상기 경쇄를 다른 특이성의 두 개의 중쇄와 짝을 이룸으로써 선택될 수도 있다.
또 다른 접근법에서, 경쇄는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library) (예를 들어, 인간 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 인간 scFv 라이브러리)에서 경쇄 서열을 관찰하고 라이브러리에서 가장 흔하게 사용된 경쇄 가변 영역을 선택함으로써 선택될 수도 있다. 그 다음에 경쇄는 원하는 두 개의 다른 중쇄에서 테스트될 수 있다.
또 다른 접근법에서, 경쇄는 프로브로서 원하는 두 개의 중쇄의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 검정함으로써 선택될 수도 있다. 두 개의 중쇄 가변 서열과 결합하는 경쇄는 중쇄에 대한 경쇄로서 선택될 수도 있다.
또 다른 접근법에서, 후보 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄에 맞추어 정렬될 수도 있고, 변형은 경쇄에서 두 개의 중쇄의 동족 경쇄에 공통인 서열 특성과 더 밀접하게 일치하도록 이루어진다. 면역원성의 기회가 최소화될 필요가 있으면, 변형은 바람직하게 알려진 인간 경쇄 서열에 존재하는 서열을 발생시키고, 이로 인해 단백질 용해 공정은 면역원성의 가능성을 평가하기 위한 업계에 알려진 파라미터 및 방법 (즉, 인 실리코(in silico), 뿐만 아니라 습성 검정)에 기초하여 T 세포 에피토프를 발생시킬 가능성이 낮다.
상기 접근법 모두는 많은 선험적 규제(a priori restraints), 예를 들어, 서열 동일성, 특이적인 미리-선택된 중쇄와의 결합 능력, 등을 포함하는 시험관 내 방법에 의존한다. 시험관 내 상태의 조작에 의존하지는 않지만, 대신에 공통 경쇄를 포함하는 인간 에피토프-결합 단백질을 만드는 더 생물학적으로 합리적인 접근법을 이용하는 조성물 및 방법이 업계에 필요하다.
인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 제한된 경쇄 가변 레퍼토리(repertoire)를 갖는다. 친화도-성숙 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 레퍼토리와 결합하고 이것을 발현하는 인간 경쇄 가변 도메인을 생성하는 생물학적 시스템이 제공된다. 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 갖는 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, 및 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질에서 마우스의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 이용하는 단계를 포함한다. 방법은 다중-특이적 항원-결합 단백질을 만드는데 있어서 사용에 적합한 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 만드는 방법을 포함한다.
재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 레퍼토리로부터 유래된 적합한 친화도-성숙 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공되며, 친화도-성숙 인간 중쇄 가변 도메인은 하나의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로부터 유래된 단일 인간 경쇄 가변 도메인과 결합하고 이것을 발현한다. 두 개의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 선택을 제공하는 유전적으로 조작된 마우스가 또한 제공된다. 다양한 양태에서, 하나 또는 두 개의 유전자 세그먼트는 인간 Vκ1-39 및 인간 Vκ3-20을 포함한다.
제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 도메인, 또는 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 제한된 레퍼토리의 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일 경쇄를 발현하는 (두 개의 경쇄 중 하나 또는 둘 다를 발현하는) 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 유전자 (또는 두 개의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하기 위해 재배열하는 단일 재배열되지 않은 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 (또는 두 개의 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트)를 포함하도록 유전적으로 조작된다. 재배열된 인간 경쇄 가변 도메인은 마우스에 의해 선택된 복수의 친화도-성숙 인간 중쇄와 짝을 이룰 수 있으며, 중쇄 가변 영역은 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다.
제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 도메인, 또는 인간 경쇄 가변 영역 서열의 제한된 레퍼토리의 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일 경쇄의 가변 영역을 발현하는 (또는 두 개의 가변 영역 중 하나 또는 둘 다를 발현하는) 단일 V/J 인간 경쇄 서열 (또는 두 개의 V/J 서열)을 포함하도록 유전적으로 조작된다. 가변 서열을 포함하는 경쇄는 마우스에 의해 클론에 의해 선택된 복수의 친화도-성숙 인간 중쇄와 짝을 이룰 수 있으며, 중쇄 기변 영역은 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 양태에서, 인간 J 유전자 세그먼트 (하나 또는 복수의 JL 세그먼트로부터 선택된)를 재배열하고 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 암호화할 수 있는 단일 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역 유전자 세그먼트를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또 다른 양태에서, 마우스는 둘 이하의 인간 VL 유전자 세그먼트를 포함하며, 이것들 각각은 인간 J 유전자 세그먼트 (하나 또는 복수의 JL 세그먼트로부터 선택된)를 재배열하고 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 암호화할 수 있다.
한 구체예에서, 단일 인간 VL 유전자 세그먼트는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, 및 Jκ5로부터 선택된 인간 JL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합되며, 단일 인간 VL 유전자 세그먼트는 하나 이상의 인간 JL 유전자 세그먼트 중 어떤 것으로 경쇄 가변 영역 유전자를 암호화하는 서열을 형성하기 위해 재배열할 수 있다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 세그먼트를 포함하지 않는 면역글로불린 경쇄 자리를 포함하며, VL 자리는 경쇄 유전자의 VL 영역을 암호화하기 위해 재배열할 수 있는 단일 인간 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 VL 유전자 세그먼트는 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 세그먼트를 포함하지 않는 VL 자리를 포함하며, VL 자리는 경쇄 유전자의 VL 영역을 암호화하기 위해 재배열할 수 있는 두 개 이하의 인간 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 둘 이하의 인간 VL 유전자 세그먼트는 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 세그먼트 및 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 암호화하는 단일 재배열된 (V/J) 인간 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역 (즉, VL/JL 영역)을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또 다른 양태에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄의 인간 VL 도메인을 암호화할 수 있는 둘 이하의 재배열된 인간 VL 영역을 포함한다.
한 구체예에서, VL 영역은 재배열된 인간 Vκ1-39/J 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20/J 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 VL/JL 서열의 인간 JL 세그먼트는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, 및 Jκ5로부터 선택된다. 특정 구체예에서, VL 영역은 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스는 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 및 인간 Vκ3-20Jκ1 서열 둘 다를 갖는다.
한 구체예에서, 인간 VL 유전자 세그먼트는 인간 또는 마우스 선도 서열에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 선도 서열은 마우스 선도 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 선도 서열은 마우스 Vκ3-7 선도 서열이다. 특정 구체예에서, 선도 서열은 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된다. 특정 구체예에서, 선도 서열은 재배열된 인간 VL/JL 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 면역글로불린 프로모터 서열에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 프로모터 서열은 인간 프로모터 서열이다. 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 프로모터는 인간 Vκ3-15 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된다. 특정 구체예에서, 프로모터는 재배열된 인간 VL/JL 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 경쇄 자리는 인간 면역글로불린 프로모터와 5' (VL 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에서 플랭킹되고(flanked) 인간 J 세그먼트로 재배열하는 인간 VL 유전자 세그먼트와 3'에서 플랭킹된 선도 서열을 포함하고 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 역방향 키메라 경쇄의 VL 도메인을 암호화한다. 특정 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 마우스 Vκ 자리에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 경쇄 자리는 인간 면역글로불린 프로모터와 5' (VL 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에서 플랭킹되고 재배열된 인간 VL 영역 (VL/JL 서열)과 3'에서 플랭킹된 선도 서열을 포함하고 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 역방향 키메라 경쇄의 VL 도메인을 암호화한다. 특정 구체예에서, 재배열된 인간 VL/JL 서열은 마우스 카파 (κ) 자리에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 변형된 마우스의 VL 자리는 κ 경쇄 자리이고, κ 경쇄 자리는 마우스 κ 인트론성 인핸서(enhancer), 마우스 κ 3' 인핸서, 또는 인트론성 인핸서 및 3' 인핸서 둘 다를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 비기능적 면역글로불린 람다 (λ) 경쇄 자리를 포함한다. 특정 구체예에서, λ 경쇄 자리는 자리의 하나 이상의 서열의 결실을 포함하며, 하나 이상의 결실은 λ 경쇄 자리가 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열할 수 없게 한다. 또 다른 구체예에서, λ 경쇄 자리의 모든 또는 실질적으로 모든 VL 유전자 세그먼트가 결실된다.
한 구체예에서, 마우스는 인간 VL 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 만든다. 한 구체예에서, 경쇄는 인간 VL 유전자 세그먼트, 및 마우스 Cκ 영역으로부터 유래된 체세포 돌연변이된 VL 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 λ 경쇄를 발현하지 않는다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 인간 VL 영역 서열에 체세포 초돌연변이를 일으킬 수 있다. 특정 구체예에서, 마우스는 VL 도메인을 재배열하고 암호화할 수 있는 인간 VL 유전자 세그먼트로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하는 세포를 포함하고, 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자는 체세포 돌연변이된 VL 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 Cκ에 결합된 체세포 돌연변이된 인간 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 발현하는 세포를 포함하며, 경쇄는 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 VH 도메인을 포함하는 중쇄와 결합하고 중쇄는 마우스 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 마우스 CH1, 마우스 힌지(hinge), 마우스 CH2, 및 마우스 CH3을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 인간 CH1, 힌지, 마우스 CH2, 및 마우스 CH3을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하며, 인간 VH 유전자 세그먼트는 마우스 CH 영역 유전자에 작동 가능하게 결합되고, 이로 인해 마우스는 인간 VH 유전자 세그먼트를 재배열하고 인간 VH 도메인 및 마우스 CH를 포함하는 역방향 키메라 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 세그먼트의 90-100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트는 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 적어도 19개, 적어도 39개, 또는 적어도 80개 또는 81개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 적어도 12개의 기능적 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 적어도 25개의 기능적 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 또는 적어도 43개의 기능적 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 마우스는 모든 마우스 DH 및 JH 세그먼트의 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 세그먼트 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 세그먼트로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 DH 세그먼트는 1-1, D1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 JH 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포를 포함하며, 결합 단백질은 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열 또는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래된 경쇄를 포함하고, 세포는 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59, 및 5-51 유전자 세그먼트로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트의 재배열로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 인간 중쇄 JH 유전자 세그먼트로 재배열된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 인간 VH 및 JH 유전자 세그먼트는 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 및 7-27로부터 선택된 인간 DH 유전자 세그먼트로 재배열된다. 특정 구체예에서, 경쇄 유전자는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 마우스는 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5, 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 VH/DH/JH 영역을 포함하는 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 재배열된 인간 VL 영역은 인간 Vκ1-39Jκ5 서열이고, 마우스는 (i) 인간 VL/JL 서열로부터 유래된 VL 도메인 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역방향 키메라 경쇄를 발현하며; 경쇄는 (i) 마우스 CH 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인을 포함하는 역방향 키메라 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이되는 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정 구체예에서, 인간 VH 유전자 세그먼트는 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51, 및 1-69 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 및 7-27로부터 선택된 DH 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 JH 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5, 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 재배열된 인간 VH/DH/JH 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 재배열된 인간 VL 영역은 인간 Vκ3-20Jκ1 서열이고, 마우스는 (i) 재배열된 인간 VL/JL 서열로부터 유래된 VL 도메인, 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역방향 키메라 경쇄를 발현하며, 경쇄는 (i) 마우스 CH, 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 인간 VH를 포함하는 역방향 키메라 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정 구체예에서, 인간 VH 유전자 세그먼트는 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 및 5-51 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16, 및 6-13으로부터 선택된 DH 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 JH 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인은 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5, 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 인간 VH/DH/JH 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 및 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열 둘 다를 포함하고, 마우스는 (i) 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래된 VL 도메인, 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역방향 키메라 경쇄를 발현하며, 경쇄는 (i) 마우스 CH, 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 인간 VH를 포함하는 역방향 키메라 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 내인성 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 세그먼트의 90-100%가 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 특정 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 세그먼트는 적어도 하나의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 적어도 18개, 적어도 39개, 적어도 80개, 또는 81개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트가 대체된다. 한 구체예에서, 적어도 12개의 기능적 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 적어도 25개의 기능적 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 또는 적어도 43개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트가 대체된다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 C57BL 계통이고, 특정 구체예에서는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/01a로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통 및 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 또 다른 특정 구체예에서, 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합체, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합체이다. 특정 구체예에서, 혼합체의 129 계통 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래된 마우스 Cκ 및 체세포 돌연변이된 인간 VL 도메인을 포함하는 경쇄, 및 마우스 CH 및 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 및 a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 역방향 키메라 항체를 발현하며, 마우스는 완전한 마우스 항체를 발현하지 않고 완전한 인간 항체를 발현하지 않는다. 한 구체예에서 마우스는 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로의 대체를 포함하고, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트의 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 레퍼토리의 인간 VH 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 κ 경쇄 자리를 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되며, 항체는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열 또는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래된 경쇄 유전자를 포함하고, 항체는 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51, 및 a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 선택된 인간 VH 유전자 세그먼트의 재배열로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 인간 중쇄 JH 유전자 세그먼트로 재배열된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 이상의 체세포 초돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 1, 2, 3, 또는 4개의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄 유전자는 1 또는 2개의 돌연변이를 갖는다. 다양한 구체예에서, 경쇄 유전자는 그것의 서열에 따라 다수의 돌연변이를 초래할 수 있다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 경쇄는 적어도 하나 또는 넷 이하의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 두 개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 세 개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄는 적어도 네 개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 프레임워크(framework) 영역 (FW)에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 FW 및/또는 하나 이상의 CDR에 존재한다. 다양한 구체예에서, 프레임워크 영역은 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3), 및/또는 이것들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, CDR은 CDR1, CDR2, CDR3, 및/또는 이것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 또는 하나 이상의 CDR에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 및 하나 이상의 CDR에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 또는 하나 이상의 CDR에서 적어도 두 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 또는 하나 이상의 CDR에서 적어도 세 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 또는 하나 이상의 CDR에서 적어도 네 개의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄는 하나 이상의 FW 또는 하나 이상의 CDR에서 적어도 다섯 개의 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 두 개의 FW에서 적어도 다섯 개 또는 다섯 개 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 하나의 FW 및 하나의 CDR에서 적어도 다섯 개 또는 다섯 개 이상의 돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 9%는 FW1에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 9%는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 25%는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 19%는 CDR1에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 5%는 CDR1에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 20%는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 셋 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 17%는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 1%는 FW2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 1%는 FW2에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 10%는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 10%는 CDR2에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 1%는 CDR2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 29%는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 넷 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 21%는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 5%는 FW3에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 2%는 FW3에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 2%는 FW3에 존재하는 네 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 37%는 CDR3에 존재하는 적어도 하나 또는 넷 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 27%는 CDR3에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 8%는 CDR3에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 1%는 CDR3에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 1%는 CDR3에 존재하는 네 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되며, 항체는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래된 경쇄를 포함하고 Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 9%는 FW1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 25%는 CDR1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 20%는 FW2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 10%는 CDR2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 29%는 FW3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ1-39/Jκ5-유래된 경쇄의 약 37%는 CDR3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 35%는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 25%는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 9%는 FW1에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 1%는 FW1에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 1%는 FW1에 존재하는 다섯 개 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 92%는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 넷 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 92%는 CDR1에 존재하는 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 적어도 네 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 26%는 CDR1에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 44%는 CDR1에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 19%는 CDR1에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 3%는 CDR1에 존재하는 네 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/J 5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 66%는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 셋 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 66%는 FW2에 존재하는 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 35%는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 23%는 FW2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄는 적어도 8%는 FW2에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 70%는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 넷 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 70%는 CDR2에 존재하는 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 적어도 네 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 적어도 34%는 CDR2에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 20%는 CDR2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 12%는 CDR2에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 5%는 CDR2에 존재하는 네 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 91%는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 최대 다섯 개 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 91%는 FW3에 존재하는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 19%는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 33%는 FW3에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 22%는 FW3에 존재하는 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 11%는 FW3에 존재하는 네 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 1%는 FW3에 존재하는 다섯 개 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 63%는 CDR3에 존재하는적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 63%는 CDR3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 54%는 CDR3에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 9%는 CDR3에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되는데, 항체는 인간 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유래된 경쇄를 포함하고 중쇄의 적어도 35%는 FW1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 중쇄의 약 92%는 CDR1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 중쇄의 약 66%는 FW2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 중쇄의 약 70%는 CDR2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 중쇄의 약 91%는 FW3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 중쇄의 약 63%는 CDR3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 경쇄 유전자는 적어도 하나 또는 둘 이하의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄 유전자는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷 이상의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 프레임워크 영역에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 CDR 영역에 존재한다. 특정 구체예에서, 돌연변이는 경쇄의 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR 영역에 존재한다. 다양한 구체예에서, 프레임워크 영역은 프레임워크 1 (FW1), 프레임워크 2 (FW2), 프레임워크 3 (FW3), 및/또는 이것들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκl-유래된 경쇄의 약 10%는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 10%는 FW1에서 하나의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 53%는 CDR1에서 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 27%는 CDR1에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 약 54%는 CDR1에 존재하는 하나 또는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 6%는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 6%는 FW2에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 3%는 FW2에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 3%는 FW2에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 적어도 약 3%는 CDR2에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 3%는 CDR2에서 하나의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 17% 또는 그 이상은 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다.; 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 20%는 FW3에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 17%는 FW3에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 Vκ3-20/Jκl-유래된 경쇄는 적어도 43% CDR3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 43%는 CDR3에서 하나의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되며, 항체는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래된 경쇄를 포함하고 Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 10%는 FW1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 53%는 CDR1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 6%는 FW2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 3%는 CDR2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 37%는 FW3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, Vκ3-20/Jκ1-유래된 경쇄의 약 43%는 CDR3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 43%는 FW1에 존재하는 적어도 하나 또는 둘 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 41%는 FW1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 약 41%는 FW1에 존재하는 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 약 2%는 FW1에 존재하는 두 개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 92%는 CDR1에 존재하는 적어도 하나 또는 넷 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 43%는 CDR1에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 25%는 CDR1에 존재하는 적어도 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 15%는 CDR1에 존재하는 적어도 3개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 10%는 CDR1에 존재하는 4개 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 46%는 FW2에 존재하는 적어도 하나 또는 셋 이하의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 34%는 FW2에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 10%는 FW2에 존재하는 둘 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 2%는 FW2에 존재하는 셋 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 84%는 CDR2에 존재하는 적어도 하나 또는 최대 다섯 개 또는 다섯 개 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 39%는 CDR2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 18%는 CDR2에 존재하는 둘 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 21%는 CDR2에 존재하는 셋 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 3%는 CDR2에 존재하는 넷 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 2%는 CDR2에 존재하는 다섯 개 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 92%는 FW3에 존재하는 적어도 하나 또는 최대 다섯 개 또는 다섯 개 이상의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 경쇄의 적어도 21%는 FW3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 20%는 FW3에 존재하는 적어도 두 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 13%는 FW3에 존재하는 적어도 세 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 20%는 FW3에서 적어도 네 개의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 적어도 18%는 FW3에서 적어도 5개의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 경쇄는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래되고 중쇄의 약 7%는 CDR3에 존재하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 중쇄의 약 7%는 CDR3에서 하나의 돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 항원-특이적 항체의 집단이 제공되며, 항체는 인간 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유래된 경쇄를 포함하고 중쇄의 약 43%는 FW1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 중쇄의 약 92%는 CDR1에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 중쇄의 약 46%는 FW2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 중쇄의 약 84%는 CDR2에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 중쇄의 약 92%는 FW3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 중쇄의 약 7%는 CDR3에 존재하는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
한 양태에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되며, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 마우스의 생식세포 계열에 존재하고, 면역글로불린 경쇄는 인간 가변 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열은 재배열된 경쇄 서열을 포함하는 마우스의 모든 B 세포에 존재하는 비-대리 경쇄 서열로서 같은 V 세그먼트 및 같은 J 세그먼트로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열은 기능적 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 유전자 세그먼트가 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열은 기능적 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 유전자 세그먼트가 결핍된다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열은 하나 이하, 둘 이하, 또는 셋 이하의 재배열된 (V/J) 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 재배열된 V/J 서열은 κ 경쇄 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 인간 κ 경쇄 서열이다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39/J 서열, 인간 Vκ3-20/J 서열, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39/Jκ5 서열이다. 특정 구체예에서, κ 경쇄 서열은 인간 Vκ3-20/Jκ1 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는, 생식세포 계열에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열에 관하여 5'의 마우스 κ 인트론성 인핸서, 마우스 κ 3' 인핸서, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 서열을 더 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트, 및 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 포함하며, 상기 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 중쇄 불변 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열을 형성하기 위해 재배열할 수 있다. 한 구체예에서, 마우스는 복수의 인간 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 내인성 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트를 대체한다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트로의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 인간 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 마우스 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 자리에 있다. 특정 구체예에서, 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 경쇄 V 및 J 서열을 대체한다.
한 양태에서, 비-대리 경쇄 서열을 포함하고 단일 인간 V 세그먼트 및 단일 인간 J 세그먼트로부터 유래된 재배열된 경쇄 유전자를 포함하는 각 B 세포를 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스의 생식세포 계열에서 유일한 경쇄 가변 서열은 단일 인간 V 세그먼트 및 단일 인간 J 세그먼트로부터 유래된 재배열된 서열이고, 재배열된 경쇄 유전자를 포함하는 각 B 세포는 동족 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 더 포함하며, 재배열된 경쇄 유전자는 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 적어도 네 개의 체세포 초돌연변이를 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 다분화능 세포(pluripotent cell), 유도 만능 세포(induced pluripotent cell), 또는 전분화능 세포(totipotent cell)가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 조직은 본원에서 설명된 마우스의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유래된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 핵이 제공된다. 한 구체예에서, 핵은 B 세포가 아닌 이배체 세포(diploid cell)의 것이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스로부터 분리된 마우스 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 림프구이다. 한 구체예에서, 림프구는 B 세포이다. 한 구체예에서, B 세포는 인간 유전자 세그먼트로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 키메라 중쇄, 및 재배열된 인간 Vκ1-39/J 서열, 재배열된 인간 Vκ3-20/J 서열, 또는 이것들의 조합으로부터 유래된 경쇄를 발현하며, 중쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 또는 인간 불변 영역에 융합된다.
한 양태에서, 히브리도마(hybridoma)가 제공되는데, 히브리도마는 본원에서 설명된 마우스의 B 세포로 만들어진다. 특정 구체예에서, B 세포는 원하는 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역화된 본원에서 설명된 마우스의 것이고, B 세포는 원하는 에피토프를 결합하는 결합 단백질을 발현하고, 결합 단백질은 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인 및 마우스 CH를 갖고 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 유래된 인간 VL 도메인 및 마우스 CL을 갖는다.
한 양태에서, 마우스 배아가 제공되며, 배아는 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 기능자 ES 세포를 포함한다.
한 양태에서, 벡터의 5' 및 3' 마우스 상동성 팔의 서열에 관하여 전사 방향의 5'에서 3'으로 5' 마우스 상동성 팔, 인간 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 인간 또는 마우스 선도 서열, 및 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 인간 VL 영역, 및 3' 마우스 상동성 팔을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 팔은 5' 및 마우스 Cκ 유전자의 근위에 존재하는 인핸서 서열에 관하여 벡터를 5'의 서열로 표적화한다. 한 구체예에서, 프로모터는 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 세그먼트 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 인간 Vκ3-15 프로모터이다. 한 구체예에서, 선도 서열은 마우스 선도 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 선도 서열은 마우스 Vκ3-7 선도 서열이다.
한 양태에서, 표적화 벡터가 상기 설명된 바와 같이 제공되지만, 5' 마우스 상동성 팔을 대신해서, 인간 또는 마우스 프로모터가 부위-특이적 리컴비나제 인식 부위 (SRRS)와 5'에 플랭킹되고, 3' 마우스 상동성 팔을 대신해서, 인간 VL 영역은 SRRS와 3'에 플랭킹된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스에 의해 만들어진 역방향 키메라 항체로서, 역방향 키메라 항체는 인간 VL 및 마우스 CL을 포함하는 경쇄, 및 인간 VH 및 마우스 CH를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 단일 세포에서 (a) 인간 CH 유전자 서열과 융합된, 본원에서 설명된 면역화된 마우스의 제1 VH 유전자 서열; (b) 인간 CL 유전자 서열과 융합된, 본원에서 설명된 면역화된 마우스의 VL 유전자 서열을 발현하는 단계; 및, (c) 완전한 인간 항체를 발현하는데 충분한조건 하에 세포를 유지하고, 항체를 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 인간 CH 유전자 서열과 융합된 제2 본원에서 설명된 면역화된 마우스의 제2 VH 유전자 서열을 포함하고, 제1 VH 유전자 서열은 제1 에피토프를 인식하는 VH 도메인을 암호화하며, 제2 VH 유전자 서열은 제2 에피토프를 인식하는 VH 도메인을 암호화하는데, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다.
한 양태에서, 에피토프-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 마우스를 원하는 에피토프를 포함하는 면역원에 노출시키는 단계, 마우스가 원하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 생성하는데 충분한 조건 하에 마우스를 유지하는 단계, 및 원하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 분리하는 단계를 포함하며, 에피토프-결합 단백질은 체세포 돌연변이된 인간 VH 및 마우스 CH를 포함하고, 마우스 CL 및 재배열된 인간 Vκ1-3 Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 유래된 인간 VL을 포함하는 경쇄와 결합된 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, 에피토프-결합 단백질을 발현하는 세포가 제공되며, 세포는 (a) 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1으로부터 유래된 인간 VL 도메인을 암호화하는 인간 뉴클레오티드 서열로서, 인간 뉴클레오티드 서열은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 cDNA 서열 (예를 들어, 인간 κ 불변 도메인 DNA 서열)에 융합되는 (직접적으로 또는 결합자를 통해) 인간 뉴클레오티드 서열; 및, (b) 제1 인간 VH 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 인간 VH 도메인을 암호화하는 제1 인간 VH 뉴클레오티드 서열로서, 제1 인간 VH 뉴클레오티드 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 융합되고 (직접적으로 또는 결합자를 통해); 에피토프-결합 단백질은 제1 에피토프를 인식하는 제1 인간 VH 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 10-6 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M 미만, 또는 10-12 M 미만의 해리 상수로 제1 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 세포는 제2 인간 VH 도메인을 암호화하는 제2 인간 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 인간 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 융합되고 (직접적으로 또는 결합자를 통해), 제2 인간 VH 도메인은 제1 에피토프를 특이적으로 인식하지 않으며 (예를 들어, 예를 들어, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 또는 그 이상의 해리 상수를 나타냄), 에피토프-결합 단백질은 제1 에피토프 및 제2 에피토프를 인식하고, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄 각각은 (a)의 동일한 경쇄와 결합한다.
한 구체예에서, 제2 VH 도메인은 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11 M, 또는 10-12 M 미만인 해리 상수로 제2 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 각각 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 재배열된 인간 VL 영역으로부터 유래된 동일한 경쇄와 결합되는데, 제1 면역글로불린 중쇄는 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리 상수로 제1 에피토프에 결합하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리 상수로 제2 에피토프에 결합하며, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않고, 제1 면역글로불린 중쇄는 제2 에피토프에 결합하지 않거나 마이크로몰 범위 (예를 들어, 밀리몰 범위)보다 더 약한 해리 상수로 제2 에피토프에 결합하며, 제2 면역글로불린 중쇄는 제1 에피토프에 결합하지 않거나 마이크로몰 범위 (예를 들어, 밀리몰 범위)보다 더 약한 해리 상수로 제1 에피토프에 결합하고, VL 중 하나 이상, 제1 면역글로불린 중쇄의 VH, 및 제2 면역글로불린 중쇄의 VH는 체세포 돌연변이된다.
한 구체예에서, 제1 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기를 포함하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기가 결핍된다.
한 구체예에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 양태에서, 인간 VH 및 마우스 중쇄 불변 도메인, 인간 VL 및 마우스 경쇄 불변 도메인을 포함하는 역방향 키메라 항체가 제공되는데, 항체는 본원에서 설명된 마우스를 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역화하는 단계를 포함하는 공정에 의해 만들어지고, 항체는 마우스가 면역화되는 면역원의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, VL 도메인은 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서 VH 도메인은 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL 도메인 및 VH 도메인 둘 다는 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL은 내인성 마우스 중쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트를 대체하는 인간 VH 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스 Cκ 도메인에 결합되고, 하나 또는 둘 이하의 재배열된 인간 경쇄 VL/JL 서열은 재배열된 Vκ1-39/J 및 재배열된 Vκ3-20/J 또는 이것들의 조합으로부터 선택되고, 모든 마우스 경쇄 유전자 세그먼트를 대체하며; 인간 중쇄 가변 유전자 세그먼트는 마우스 불변 유전자에 결합되고, 재배열된 인간 경쇄 서열은 인간 또는 마우스 불변 유전자에 결합된다.
한 양태에서, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 중쇄 가변 유전자 세그먼트의 인간 중쇄 가변 유전자 세그먼트로의 대체, 및 하나 또는 둘 이하의 재배열된 인간 경쇄 VL/JL 서열을 포함하는 마우스 ES 세포로서, 인간 중쇄 가변 유전자 세그먼트는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 결합되고, 재배열된 인간 경쇄 VL/JL 서열은 마우스 또는 인간 면역글로불린 경쇄 불변 유전자에 결합된다. 특정 구체예에서, 경쇄 불변 유전자는 마우스 불변 유전자이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스에 의해 만들어진 항원-결합 단백질이 제공된다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 마우스 불변 영역과 융합된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 불변 영역은 마우스 불변 영역이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열로 만들어진 완전한 인간 항원-결합 단백질이 제공되며, 항원-결합 단백질은 본원에서 설명된 마우스의 서열로부터 유래된 인간 가변 영역을 포함하는 완전한 인간 중쇄, 및 Vκ1-39 또는 Vκ3-20을 포함하는 완전한 인간 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 하나 내지 다섯 개의 체세포 돌연변이를 포함한다.한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 마우스의 B 세포에서 중쇄 가변 영역과 짝을 이루는 동족 경쇄 가변 영역이다.
한 구체예에서, 완전한 인간 항원-결합 단백질은 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하며, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 본원에서 설명된 마우스로부터 독립적으로 유래된 동일하지 않은 가변 영역을 포함하고, 제1 및 제2 중쇄 각각은 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 경쇄와 결합된 숙주 세포로부터 발현한다. 한 구체예에서, 제1 중쇄는 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 중쇄는 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 다르다. 특정 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 같고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다. 특정 구체예에서, 결합 단백질의 제1 분자에 의한 제1 에피토프의 결합은 결합 단백질의 제2 분자에 의한 제2 에피토프의 결합을 차단하지 않는다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 마우스의 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 완전한 인간 결합 단백질은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 제1 면역글로불린 중쇄는 제2 면역글로불린 중쇄의 가변 영역과 동일하지 않은 제1 가변 영역을 포함하고, 제1 면역글로불린 중쇄는 야생형 단백질 A 결합 결정요인을 포함하고, 제2 중쇄는 야생형 단백질 A 결정요인이 결핍된다. 한 구체예에서, 제1 면역글로불린 중쇄는 분리 조건 하에서 단백질 A에 결합하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 분리 조건 하에서 단백질 A에 결합하지 않거나 제1 면역글로불린 중쇄가 단백질 A에 결합하는 것보다 적어도 10배, 100배, 또는 1000배 더 약하게 단백질 A에 결합한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 중쇄는 IgG1 이소타입이며, 제2 중쇄는 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), 및 이것들의 조합으로부터 선택된 변형을 포함하고, 제1 중쇄는 이러한 변형이 결핍된다.
한 양태에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 본원에서 설명된 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 본원에서 설명된 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 완전한 인간 단일 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하지 않다.
한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원이 동일하고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다. 한 구체예에서, 제1 중쇄 가변 영역의 제1 에피토프로의 결합은 제2 중쇄 가변 영역의 제2 에피토프로의 결합을 차단하지 않는다.
한 구체예에서, 인간 경쇄는 제1 중쇄와 짝을 이룰 때 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하고 제2 중쇄와 짝을 이룰 때 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 제1 항원은 가용성 항원 및 세포 표면 항원 (예를 들어, 종양 항원)으로부터 선택되고, 제2 항원은 세포 표면 수용체를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 같은 세포 표면 수용체이고, 제1 중쇄의 제1 에피토프로의 결합은 제2 중쇄의 제2 에피토프로의 결합을 차단하지 않는다.
한 구체예에서, 경쇄의 경쇄 가변 도메인은 2 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 제1 또는 제2 중쇄 가변 도메인으로 면역화된 제1 또는 제2 마우스의 B 세포에서 발현된, 체세포 돌연변이된 동족 경쇄이다. 한 구체예에서, 세포의 경쇄는 생식세포 계열 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하고, 제2 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 변형을 포함하지 않는다.
한 양태에서, 제1 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 방법은 (a) 제1 항원에 특이적인 제1 인간 중쇄 가변 (VH) 도메인을 암호화하는 제1 핵산 서열을 확인하는 단계; (b) 제2 항원에 특이적인 제2 인간 중쇄 가변 (VH) 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 확인하는 단계; (c) (a)의 VH 영역과 짝을 이룰 때 제1 항원에 특이적으로 결합하고, (b)의 VH 영역과 짝을 이룰 때 제2 항원에 특이적으로 결합하는 인간 경쇄 가변 (VL) 영역을 암호화하는 제3 핵산 서열을 제공하는 단계; (d) 제1 및 제2 인간 VH 영역 및 인간 VL 영역의 발현이 이중 특이적 항체를 형성하게 하도록 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 이중 특이적 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 제1 및 제2 항원은 서로 다르다. 다양한 양태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 면역화된 마우스로부터 분리되며, 재배열된 면역글로불린 서열은 마우스의 생식세포 계열에 있다.
한 구체예에서, 인간 VL 영역은 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 인간 경쇄 서열로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 서열은 생식세포 계열 서열이다 (즉, V 유전자 세그먼트 서열 내에서 체세포 초돌연변이를 포함하지 않는다).
한 구체예에서, 제3 핵산 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 마우스로부터 분리된다. 한 구체예에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 VL 영역은 변형된 내인성 면역글로불린 경쇄 자리로부터 발현된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 하나의 분자에 존재한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 다른 분자에 존재한다. 다양한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 단백질 A에 대한 암호화된 중쇄의 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, 및 VH6-1로부터 선택된 인간 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄 유전자 세그먼트는 VH2-5, VH3-23 또는 VH3-30이다.
한 양태에서, 제1 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 방법은 (a) 제1 항원에 특이적인 제1 인간 중쇄 가변 (VH) 도메인을 암호화하는 제1 핵산 서열을 확인하는 단계; (b) 제2 항원에 특이적인 제2 인간 중쇄 가변 (VH) 도메인을 암호화하는 제2 핵산 서열을 확인하는 단계; (c) (a)의 VH 영역과 짝을 이룰 때 제1 항원에 특이적으로 결합하고, (b)의 VH 영역과 짝을 이룰 때 제2 항원에 특이적으로 결합하는 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 경쇄 가변 (VL) 영역을 암호화하는 제3 핵산 서열을 제공하는 단계; (d) 이중 특이적 항체를 형성하기 위해 제1 및 제2 인간 VH 영역 및 인간 VL 영역의 발현을 허용하도록 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 상기 이중 특이적 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 제1 및 제2 항원은 서로 다르다. 다양한 양태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 재배열된 면역글로불린 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 면역화된 마우스로부터 분리되며, 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-30 유전자 세그먼트는 마우스의 생식세포 계열 내에 있다.
한 구체예에서, 제3 핵산 서열은 생식세포 계열 서열이다 (즉, V 유전자 세그먼트 서열 내에서 체세포 초돌연변이를 포함하지 않는다). 한 구체예에서, 제3 핵산 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 마우스로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 제3 핵산 서열은 상보성 결정 영역 (CDR) 및/또는 프레임워크 영역 (FWR)에서 2 내지 5개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 VL 영역은 변형된 내인성 면역글로불린 경쇄 자리로부터 발현된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 하나의 분자에 존재한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 다른 분자에 존재한다. 한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 단백질 A에 대한 암호화된 중쇄의 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, 및 VH6-1로부터 선택된 인간 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄 유전자 세그먼트는 VH2-5, VH3-23 또는 VH3-30이다.
한 양태에서, 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 본원에서 설명된 마우스를 원하는 항원에 노출하는 단계, 마우스가 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 원하는 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 인간 Vκ 1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다. 한 구체예에서, 제1 중쇄 가변 영역의 제1 에피토프로의 결합은 제2 중쇄 가변 영역의 제2 에피토프로의 결합을 차단하지 않는다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 중쇄는 제1 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 이중 특이적 항체는 제1 및 제2 에피토프에 동시에 결합한다. 한 구체예에서, 이중 특이적 항체는 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 독립적으로 결합한다.
한 구체예에서, 항원에 대한 이중 특이적 항체의 결합 반응은 항원에 대한 제1 중쇄 가변 영역의 결합 반응보다 약 2배 더 높다. 한 구체예에서, 항원에 대한 이중 특이적 항체의 결합 반응은 항원에 대한 제2 중쇄 가변 영역의 결합 반응보다 약 2배 더 높다. 한 구체예에서, 항원에 대한 이중 특이적 항체의 결합 반응은 항원에 대한 제1 중쇄 가변 영역 및/또는 제2 중쇄 가변 영역의 결합 반응과 거의 같거나, 또는 거의 동일하다.
한 구체예에서, 항원은 가용성 항원, 세포 표면 항원 (예를 들어, 종양 항원) 및 세포 표면 수용체로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다.
한 구체예에서, 경쇄의 경쇄 가변 도메인은 2 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 제1 또는 제2 중쇄 가변 도메인으로 면역화된 마우스의 B 세포에서 발현된 체세포 돌연변이된 동족 경쇄이다.
한 구체예에서, 제1 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하고, 제2 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 변형을 포함하지 않는다.
다양한 구체예에서, 이중 특이적 항체를 만드는 방법은 이중 특이적 항체의 각 중쇄 가변 영역과 짝을 이루기 위해 공통 경쇄를 이용함으로써 향상된다. 다양한 구체예에서, 본원에서 사용된 공통 경쇄를 이용하는 것은 원래의 동족 경쇄를 이용하는 것과 비교하여 이중 특이성이 결핍된 면역글로불린의 부적절한 종의 수를 감소시킨다. 다양한 구체예에서, 이중 특이적 항체의 중쇄 가변 영역은 공통 경쇄를 포함하는 단일 특이적 항체로부터 확인된다. 다양한 구체예에서, 이중 특이적 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 중쇄와 동족인 제한된 인간 경쇄 레퍼토리, 또는 단일 인간 경쇄를 발현하고, 원하는 항원에 노출에 반응하여, 하나 또는 둘 중 하나의 가능한 인간 경쇄 가변 영역과 동족인 복수의 인간 중쇄 가변 영역을 함유하는 키메라 항체 레퍼토리를 생성하도록 조작된 마우스 B 세포 내에서 생체 내에서 재배열된 인간 중쇄 가변 유전자 세그먼트를 포함하며, 키메라 항체는 원하는 항원에 특이적이다.
다양한 양태에서, 이중 특이적 항체를 제조하는 방법에 제공되는데, 이중 특이적 항체는 1) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 제1 및 제2 폴리펩티드가 다이머를 형성하게 하는 멀티머화(multimerization) 도메인 (예를 들어, 면역글로불린 Fc 도메인)을 포함하고, 멀티머화 도메인은 제1 및 제2 폴리펩티드 사이에서 안정한 상호작용을 촉진하며, 멀티머화 도메인 중 하나는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하고 다른 멀티머화 도메인은 변형이 결핍된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드, 2) 제1 및 제2 폴리펩티드 각각의 결합 도메인으로서, 각 결합 도메인은 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하며, 제1 폴리펩티드의 가변 경쇄 및 제2 폴리펩티드의 가변 경쇄는 공통 아미노산 서열을 갖는데, 공통 서열은 폴리펩티드 각각의 원래의 경쇄에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 95% 및 가장 바람직하게 100% 서열 동일성의 아미노산 서열 동일성을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 각각의 결합 도메인을 포함한다. 다양한 구체예에서, 가변 경쇄는 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 다양한 구체예에서, 가변 경쇄는 재배열된 인간 경쇄 서열이다. 다양한 구체예에서, 가변 경쇄는 본원에서 설명된 마우스로부터 분리된다.
다양한 구체예에서, 방법은 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 공통 경쇄를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 핵산이 발현되는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 숙주 세포 배양물에서 이중 특이적 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 제1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유한다. 한 구체예에서, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 공통 경쇄를 암호화하는 핵산은 단일 벡터 또는 별개의 백터에 존재한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 상기 단락에 따르는 이중 특이적 항체를 만드는데 사용된다.
한 양태에서, 이중 특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, (a) 본원에서 설명된 마우스로부터 분리된 제1 인간 중쇄 가변 영역을 암호화하는 제1 핵산을 선택하는 단계; (b) 본원에서 설명된 바와 같은 또는 별개의 마우스로부터 분리된 제2 인간 중쇄 가변 영역을 암호화하는 제2 핵산을 선택하는 단계; (c) 본원에서 설명된 마우스로부터 분리되거나 또는 본원에서 설명된 재배열된 인간 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 인간경쇄 가변 영역을 암호화하는 제3 핵산을 제공하는 단계; (d) 제1, 제2 및 제3 핵산의 발현이 발생하도록 제1, 제2 및 제3 핵산을 숙주 세포로 도입하고 숙주세포를 배양하는 단계; (e) 세포 배양물에서 형성된 이중 특이적 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 인간 중쇄 가변 영역은 체세포 돌연변이된다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 인간 중쇄 가변 영역은 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51, 및 a 6-1 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 선택된 재배열된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 독립적으로 유래된다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 인간 중쇄 가변 영역은 2-5, 3-30 및 3-23으로부터 선택된 재배열된 인간 VH 유전자 세그먼트로부터 독립적으로 유래된다. 한 구체예에서, 제1 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH2-5 유전자 세그먼트로부터 유래되고 제2 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH3-30 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, 제1 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH3-30 유전자 세그먼트로부터 유래되고 제2 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH3-23 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, 제1 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH3-23 유전자 세그먼트로부터 유래되고 제2 인간 중쇄 가변 영역은 인간 VH3-30 유전자 세그먼트로부터 유래된다.
한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산은 단계 (c) 전에 변형되는데, 제1 또는 제2 핵산은 단백질 A에 대한 감소된 친화도를 갖도록 변형된다.
한 구체예에서, 제3 핵산은 본원에서 설명된 마우스로부터 분리된다. 한 구체예에서, 제3 핵산은 2 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 제3 핵산은 인간 Vκ 1-39 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 경쇄 가변 영역을 암호화한다. 한 구체예에서, 제3 핵산은 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 경쇄 가변 영역을 암호화한다.
한 구체예에서, 제3 핵산은 재배열된 인간 경쇄 가변 영역으로부터 유래된다. 한 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 가변 영역은 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 가변 영역은 생식세포 계열 인간 Vκ1-39 서열을 포함한다 (즉, V 유전자 세그먼트 서열 내에 체세포 초돌연변이를 포함하지 않는다). 한 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 가변 영역은 생식세포 계열 인간 Vκ3-20 서열을 포함한다.
다양한 구체예에서, 생식세포 계열에서 재배열된 인간 경쇄 서열이 결핍된 변형된 마우스로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 제1 인간 중쇄를 포함하는 이중 특이적 항체를 제조하는 방법이 제공되는데, 제1 인간 중쇄는 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 재배열된 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 동족 인간 경쇄와 짝을 이룬다. 다양한 구체예에서, 제1 인간 중쇄와 다른 특이성을 가진 제2 인간 중쇄는 본원에서 설명된 면역화된 마우스로부터 확인된다. 두 개의 중쇄 및 공통 경쇄를 암호화하는 핵산은 세 개의 사슬 모두의 발현이 발생하고 이중 특이적 항체가 세포 배양물로부터 회수되도록 상기 단락에서 설명된 숙주 세포로 도입된다.
한 구체예에서, 마우스는 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 발생시키는데 사용된 같은 항원으로 면역화된다. 한 구체예에서, 마우스는 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 발생시키는데 사용된 다른 항원으로 면역화된다.
한 양태에서, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 단일 인간 경쇄와 짝을 이룰 수 있는 인간 중쇄를 선택하는 방법이 제공되는데, 이중 특이적 항체를 암호화하는 핵산 및 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
한 양태에서, 단일 특이적 항체와 같이 바람직하지 않은 생성물보다 세포 배양물에서 바람직한 이중 특이적 항체의 양을 증가시키는 방법이 제공되는데, 이중 특이적 항체의 중쇄 중 하나는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키도록 변형된다.
한 양태에서, 분리된 숙주 세포가 제공되는데, 숙주 세포는 (a) 제1 항원에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 암호화하는 제1 핵산으로서, 제1 핵산 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 제1 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리되는 제1 핵산 서열; (b) 제2 항원에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 제2 핵산 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 제2 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리되는 제2 핵산 서열; (c) 인간 경쇄 가변 영역을 암호화하는 제3 핵산 서열로서, (a)의 중쇄 가변 영역과 짝을 이룰 때 제1 항원에 결합하고, (b)의 중쇄 가변 영역과 짝을 이룰 때 제 항원에 결합하는 인간 경쇄 가변 영역을 암호화하는 제3 핵산 서열을 포함한다.
다양한 양태에서, 제1 및 제2 항원은 서로 다르다. 다양한 양태에서, 제1, 제2 및 제3 핵산 서열의 발현은 제1 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 항체의 형성으로 이어진다.
한 구체예에서, 인간 VL 영역은 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 인간 경쇄 서열로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 재배열된 인간 경쇄 서열은 생식세포 계열 서열이다 (즉, 가변 도메인 내에 체세포 초돌연변이를 포함하지 않는다). 한 구체예에서, 제3 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 마우스로부터 분리되며, 재배열된 인간 경쇄 서열은 마우스의 생식세포 계열에 존재한다. 한 구체예에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트는 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 프레임워크 영역 (FWR)에서 적어도 하나의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1, 제2 및 제3 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 면역글로불린 VL 영역을 발현하는 마우스로부터 분리되며, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 마우스의 생식세포 계열에 존재한다.
다양한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄를 혀성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 함유하지 않는다.
한 구체예에서, 인간 면역글로불린 VL 영역은 변형된 내인성 면역글로불린 경쇄 자리로부터 발현된다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 하나의 분자에 존재한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 항원은 다른 분자에 존재한다. 한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 단백질 A에 대한 암호화된 중쇄의 친화도를 감소시키는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 또는 제2 핵산 서열은 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, 및 VH6-1로부터 선택된 인간 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄 유전자 세그먼트는 VH2-5, VH3-23 또는 VH3-30이다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 만들어진 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 이중 특이적 항체가 제공된다. 또 다른 양태에서, 완전한 인간 항체 또는 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만들기 위한 본원에서 설명된 마우스의 사용이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 유전적으로 변형된 마우스, 배아, 또는 세포는 내인성 조절 또는 제어 요소, 예를 들어, 마우스 κ 인트론성 인핸서, 마우스 κ 3' 인핸서, 또는 인트론성 인핸서 및 3' 인핸서 둘 다를 보유하는 κ 경쇄 자리를 포함하며, 조절 또는 제어 요소는 κ 경쇄 자리의 발현된 서열의 체세포 돌연변이 및 친화도 성숙화를 용이하게 한다.
한 양태에서, 하나, 또는 둘 이하의 재배열된 또는 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유래된 면역글로불린 경쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 거의 같은 κ:λ 경쇄 비를 나타낸다.
한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 하나 이하, 또는 둘 이하의 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 하나 이하의 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유래된다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의 인간 Vκ/Jκ 서열로부터 유래된 면역글로불린 경쇄를 발현하는 본원에서 설명된 마우스가 제공되며, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 하나 이상의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하고, 마우스는 약 1 내지 약 20의 (a) λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포 대 (b) κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 비율을 나타낸다.
한 구체예에서, 마우스는 인간 Vκ1-39J 5 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 발현하고, λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포 대 κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 비율은 약 1 내지 약 20이다. 한 구체예에서, 비율은 약 1 내지 적어도 약 66이다. 특정 구체예에서, 비율은 약 1 내지 66이다.
한 구체예에서, 마우스는 인간 Vκ3~20Jκ5 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 나타내고, λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포 대 κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 비율은 약 1 내지 약 20이다. 한 구체예에서, 비율은 약 1 내지 약 21이다. 특정 구체예에서, 비율은 1 내지 20, 또는 1 내지 21이다.
한 양태에서, 단일 재배열된 κ 경쇄를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 기능적 λ 경쇄 자리를 포함하고, 마우스는 같은 단일 재배열된 κ 경쇄로부터 유래된 κ 경쇄를 발현하는 Igκ+ 세포를 포함하는 B 세포 집단을 발현한다. 한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 야생형 마우스에서와 거의 같다. 특정 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 2 내지 약 6 퍼센트이다. 특정 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 2 내지 약 3이며, 단일 재배열된 κ 경쇄가 Vκ1-39Jκ5 서열로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 퍼센트는 약 2.6이다. 특정 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 4 내지 약 8이며, 단일 재배열된 κ 경쇄는 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 퍼센트는 약 6이다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 마우스는 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 단일 재배열된 κ 경쇄를 발현하고, 마우스는 단일 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 포함하는 B 세포 집단을 발현하고, 유전적으로 변형된 마우스는 체세포 초돌연변이에 대하여 저항성으로 만들어지지 않았다. 한 구체예에서, 마우스의 B 세포에서 발현된 κ 경쇄의 적어도 90%는 적어도 하나 내지 약 다섯 개의 체세포 초돌연변이를 나타낸다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 발현하도록 변형된 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 야생형 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량, 또는 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 야생형 레퍼토리를 포함하는 같은 계통의 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량보다 약 2배 이상, 적어도 3배 이상, 또는 적어도 4배 이상 더 높은 κ 경쇄 사용량을 나타낸다. 특정 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열 하나 이하의 단일 κ 경쇄를 발현한다. 더 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의 재배열된 경쇄 κ 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 마우스는 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 인간 κ 경쇄 자리를 함유하는 마우스에 의해 나타난 같은 κ 경쇄 사용량보다 약 100배 이상, 적어도 약 200배 이상, 적어도 약 300배 이상, 적어도 약 400배 이상, 적어도 약 500배 이상, 적어도 약 600배 이상, 적어도 약 700배 이상, 적어도 약 800배 이상, 적어도 약 900배 이상, 적어도 약 1000배 이상 더 높은 κ 경쇄 사용량을 나타낸다. 특정 구체예에서, 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 인간 κ 경쇄 자리를 함유하는 마우스는 기능적 재배열되지 않은 마우스 κ 경쇄 서열이 결핍된다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나 이하 재배열된 κ 경쇄 서열의 단일 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열의 하나의 카피 (예를 들어, 이형 접합체)를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 경쇄 서열의 두 개의 카피 (예를 들어, 동형 접합체)를 포함한다. 더 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하, 재배열된 경쇄 서열로부터 유래된 단일 경쇄를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 유전적으로 변형된 마우스의 경쇄는 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 경쇄 자리를 함유하는 마우스에 의해 나타난 같은 재배열된 경쇄의 발현보다 적어도 10배 내지 약 1,000배, 100배 내지 약 1,000배, 200배 내지 약 1,000배, 300배 내지 약 1,000배, 400배 내지 약 1,000배, 500배 내지 약 1,000배, 600배 내지 약 1,000배, 700배 내지 약 1,000배, 800배 내지 약 1,000배, 또는 900배 내지 약 1,000배 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 경쇄는 인간 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 서열은 κ 서열이다. 한 구체예에서, 인간 서열은 λ 서열이다. 한 구체예에서, 경쇄는 완전한 인간 경쇄이다.
한 구체예에서, 발현 수준은 전사된 경쇄 서열의 mRNA를 정량하고, 그것을 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 경쇄 자리를 함유하는 마우스의 전사된 경쇄 서열과 비교하는 것을 특징으로 한다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유래된 단일 κ 경쇄를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 항원으로 면역화시, 마우스는 같은 항원으로 면역화된 야생형 마우스와 비슷한 혈청 역가를 나타낸다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나 이하 재배열된 경쇄 서열의 단일 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 혈청 역가는 총 면역글로불린으로 특징지어 진다. 특정 구체예에서, 혈청 역가는 IgM 특이적 역가로 특징지어 진다. 특정 구체예에서, 혈청 역가는 IgG 특이적 역가로 특징지어 진다. 더 구체적인 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 항원-특이적 항체의 집단을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 항원-특이적 항체의 집단의 면역글로불린 경쇄 모두는 같은 단일 인간 VL 유전자 세그먼트로부터 유래된 인간 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함하고 면역글로불린 중쇄는 복수의 인간 VH 유전자 세그먼트 중 하나로부터 유래된 인간 중쇄 가변 (VH) 영역을 포함한다.
다양한 구체예에서, 인간 VH 유전자 세그먼트는 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, 및 VH6-1로부터 선택된다.
다양한 구체예에서, 같은 단일 인간 VL 유전자 세그먼트는 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 및 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 모두는 Jκ 및 Jλ 유전자 세그먼트로부터 선택된 인간 경쇄 J (JL) 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 인간 JL 유전자 세그먼트는 인간 Jκ1 및 Jκ5 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 마우스 면역글로불린 VL 유전자 세그먼트, 마우스 면역글로불린 JL 유전자 세그먼트, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 서열이 결핍된다. 다양한 구체예에서, 인간 VL 영역은 인간, 마우스, 또는 래트 면역글로불린 경쇄 불변 (CL) 영역에 작동 가능하게 결합된다. 특정 구체예에서, 인간 VL 영역은 마우스 Cκ 영역에 작동 가능하게 결합된다. 특정 구체예에서, 인간 VL 영역은 래트 Cκ 영역에 작동 가능하게 결합된다.
다양한 구체예에서, 인간 VL 영역은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리로부터 발현된다. 다양한 구체예에서, 인간 VH 영역은 인간, 마우스, 또는 래트 면역글로불린 중쇄 불변 (CH) 영역에 작동 가능하게 결합된다. 다양한 구체예에서, (CH) 영역은 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4, 및/또는 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 인간 VH 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 발현된다.
한 양태에서, 단일 경쇄와 결합된 복수의 면역글로불린 중쇄를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 중쇄는 인간 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 인간 서열은 가변 서열, CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일 경쇄는 인간 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 인간 서열은 가변 서열, 불변 서열, 및 이것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 마우스는 고장난 내인성 면역글로불린 자리를 포함하고 전이 유전자 또는 염색체 외 에피솜으로부터 중쇄 및/또는 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 자리에서 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 유전자 세그먼트 (즉, V, D, J), 및/또는 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 불변 서열 (예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3, 또는 이것들의 조합), 및/또는 일부 또는 모든 내인성 마우스 경쇄 서열 (예를 들어, V, J, 불변, 또는 이것들의 조합)의, 하나 이상의 인간 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다.
한 양태에서, 같은 경쇄를 갖는 항체를 만드는데 적합한 마우스가 제공되는데, 마우스에서 만들어진 모든 또는 실질적으로 모든 항체는 같은 경쇄와 함께 발현된다. 한 구체예에서, 경쇄는 내인성 경쇄 자리로부터 발현된다.
한 양태에서, 인간 항체에 대한 경쇄를 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 마우스로부터 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 얻고, 인간 항체를 만드는데 있어서 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 이용하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 인간 항체는 이중 특이적 항체이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같이 원하는 항원을 조작된 경쇄와 결합시킬 수 있는 인간 중쇄 가변 도메인을 확인하는 방법이 제공되는데, 방법은 항원을 결합시킬 수 있는 제1 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인을 제공하는 단계, 중쇄 가변 도메인을 생식세포 계열 경쇄 서열로 수리하는 단계, 및 각각 제2 항체를 형성하기 위해 발현되도록 세포를 트랜스펙션하는 단계, 제2 항체를 항원에 노출하는 단계, 및 제2 항체의 항원으로의 결합을 측정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 항체의 경쇄는 인간 Vκ1-39 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 항체의 경쇄는 인간 Vκ3-20 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 생식세포 계열 경쇄 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 제2 항체의 항원으로의 결합은 제1 항체의 항원으로의 결합과 비교하여 결정된다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역를 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역를 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하며, 단일 완전한 인간 경쇄는 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하며, (a) 제1 항원 및 제2 항원은 동일하지 않거나; 또는 (b) 제1 항원 및 제2 항원은 동일하고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하며; 인간 경쇄는 제1 중쇄와 짝을 이룰 때 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고 제2 중쇄와 짝을 이룰 때 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하며; 제1 완전한 인간 중쇄 유전자는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하고, 제2 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 변형을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 변형은 95R (EUR 435R), 96F (EUR 436F), 및 이것들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 방법은 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 단일 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 인간 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 단일 완전한 인간 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계, 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함하며; 세포의 인간 경쇄는 생식세포 계열 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함하며, 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함하며, 단일 인간 경쇄 가변 도메인에서는 재배열된 인간 Jκ5 또는 인간 Jκ1 유전자 세그먼트를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함하며, 마우스는 하나 이상의 비-인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 함유하는 인간화된 중쇄 자리를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 인간화된 중쇄 자리는 하나 이상의 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 80개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 27개의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트 및 여섯 개의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트를 포함하는데, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 인간 VH1-2, VH1-8, VH1-24, VH1-69, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH3-53, VH4-31, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH6-1, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함하며, 마우스는 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 함유하지 않는다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항체에 사용되는 두 개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는 방법이 제공되는데 원하는 항원으로 마우스를 면역화하는 단계를 포함하며, 마우스는 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하고, 두 개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 원하는 항원에 결합하기 위해 단일 인간 경쇄 가변 도메인과 독립적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공되는데 이중 특이적 항체에서 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 마우스의 두 개의 다른 B 세포의 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 서열을 이용하는 단계를 포함하며, 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 재배열된 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 재배열된 인간 Jκ5 유전자 세그먼트를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 재배열된 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 재배열된 인간 Jκ1 유전자 세그먼트를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 이중 특이적 항체에 사용되는 두 개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는 방법이 제공되는데 마우스는 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하며, 두 개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 원하는 항원에 결합하기 위해 단일 인간 경쇄 가변 도메인과 독립적으로 결합하고, 마우스는 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 함유하지 않는다.
달리 지시되거나 문맥에서 분명하지 않으면, 본원에서 설명된 구체예 및 양태 중 어떤 것도 서로 함께 사용될 수 있다. 다른 구체예는 다음 설명의 리뷰로부터 당업자에게 분명해질 것이다.
도 1은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 인간 Vκ1-39Jκ5 유전자 영역으로 대체하기 위한 표적화 계획을 도시한다.
도 2는 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 인간 Vκ3-20Jκ1 유전자 영역으로 대체하기 위한 표적화 계획을 도시한다.
도 3은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 인간 VpreB/Jλ5 유전자 영역으로 대체하기 위한 표적화 계획을 도시한다.
도 4는 야생형 마우스 (WT), 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO)에 대하여 동형 접합성인 마우스 및 조작된 인간 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 HO)에 대하여 동형 접합성인 마우스에 대한 말초 혈액의 CD19+ B 세포의 퍼센트 (y축)를 나타낸다.
도 5A는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Hκ), 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대하여 이형 접합성인 마우스 (Vκ1-39Jκ5 HET)에서 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역의 접합에 특이적인 프로브 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)를 사용하는 정량적 PCR 검정으로 Vκ1-39-유래된 경쇄의 상대적 mRNA 발현 (y축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다. N.D.: 미검출.
도 5B는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Hκ), 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Vκ1-39Jκ5 HO)에서 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역의 접합에 특이적인 프로브 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 인간 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)를 사용하는 정량적 PCR 검정으로 Vκ1-39-유래된 경쇄의 상대적 mRNA 발현 (y축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 5C는 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Hκ), 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 인간 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대하여 이형 접합성인 마우스 (HET) 및 동형 접합성인 마우스 (HO)에서 조작된 인간 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역의 접합에 특이적인 프로브 (Vκ3-20Jκ1 접합 프로브) 및 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트 (Vκ3-20 프로브)를 사용하는 정량적 PCR 검정으로 Vκ3-20-유래된 경쇄의 상대적 mRNA 발현 (y축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 6A는 β-갈락토시다제로 면역화된 야생형 (WT; N=2) 및 조작된 인간 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Vκ1-39Jκ5 HO; N=2)에서 IgM (왼쪽) 및 IgG (오른쪽) 역가를 나타낸다.
도 6B는 β-갈락토시다제로 면역화된 야생형 (WT; N=5) 및 조작된 인간 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대하여 동형 접합성인 마우스 (Vκ3-20Jκ1 HO; N=5)에서 전체 면역글로불린 (IgM, IgG, IgA) 역가를 나타낸다.
도 7A는 단일 특이적 항체 (모체-1 및 모체-2) 및 각각의 모체 단일 특이적 항체의 중쇄 가변 영역으로부터 구성된 이중 특이적 항체 (이중 특이적)의 개략도를 나타낸다. 공통 경쇄 가변 영역 (어두움)은 이중 특이적 항체에서 표시된다.
도 7B는 원하는 항원에 대한 두 개의 모체 단클론성 항체 (모체-1 및 모체-2)의 결합 특성, 뿐만 아니라 각각의 단일 특이적 모체 항체의 중쇄 가변 영역이 공통 경쇄와 짝을 이룸으로써 구성된 이중 특이적 항체의 결합 특성에 대한 개략도를 나타낸다. 원하는 항원의 두 개의 분명한 에피토프에 별개로 (왼쪽 하단) 또는 동시에 (오른쪽 하단) 결합하는 이중 특이적항체의 능력이 표시된다.
도 8은 300nM 이중 특이적 (어두운 막대) 및 단일 특이적 (줄무늬 막대 및 회색 막대) 항체의 캡쳐된(captured) 모노머 항원 E 표면으로의 결합의 막대 그래프를 BIACORE™ 유닛 (RU)으로 나타낸다. 단클론성 모체-1 항체 (PI Ab), 단클론성 모체-2 (P2 Ab) 및 이중 특이적 항체 (BsAb)가 표시된다.
본 발명은 특정 방법, 및 설명된 실험 조건에 제한되지 않는데, 방법 및 조건이 다를 수도 있기 때문이다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구체예를 설명할 목적만을 위한 것으로 생각되며, 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 한정되기 때문에, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 한정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은, 반대가 분명하게 표시되거나 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 분명하게 명백하지 않으면, 용어 및 구절이 업계에서 이루어졌다는 의미를 포함한다. 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 실행 및 테스트에서 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 지금 설명된다. 언급된 모든 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 네 개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호-연결된 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 (VH) 영역 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 (VL) 영역 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있으며, 프레임워크 영역 (FR)로 불리는 더 보존되는 영역과 함께 배치된다. 각 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR을 포함하며, 다음 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 줄여쓸 수도 있다; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 줄여쓸 수도 있다. 용어 "고 친화도" 항체는 약 10-9 M 이하 (예를 들어, 약 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M)의 표적 에피토프에 대한 KD를 갖는 항체를 나타낸다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance), 예를 들어, BIACORE™에 의해 측정된다; 또 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
구절 "이중 특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중 특이적 항체는 두 개의 다른 단클론성 항체의 단편을 포함하고 (도 7A) 일반적으로 두 개의 다른 단클론성 항체로부터 유래된 두 개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는데, 각 중쇄는 두 개의 다른 분자 (예를 들어, 두 개의 다른 면역원의 다른 에피토프; 도 7B, 왼쪽 하단 참조) 또는 같은 분자 (예를 들어, 같은 면역원 상의 다른 에피토프; 도 7B, 오른쪽 하단 참조) 상에서 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중 특이적 항체는 두 개의 다른 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있고, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 적어도 하나 내지 둘 또는 셋 또는 넷 이상의 자릿수 더가 낮거나, 그 반대일 것이다. 이중 특이적 항체에 특이적으로 결합된 에피토프는 같거나 다른 표적 (예를 들어, 같거나 다른 단백질; 도 7B 참조) 상에 있을 수 있다. 예시적 이중 특이적 항체는 종양 항원에 특이적인 제1 중쇄 및 세포독성 마커, 예를 들어, Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 등) 또는 T 세포 마커 (예를 들어, CD3, CD28, 등)에 특이적인 제2 중쇄를 갖는 것들을 포함한다. 게다가, 제2 중쇄 가변 영역은 다른 원하는 특이성을 가진 중쇄 가변 영역으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원에 특이적인 제1 중쇄 및 독소에 특이적인 제2 중쇄를 갖는 이중 특이적 항체는 종양 세포에 독소 (예를 들어, 사포린, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 등)를 전달하기 위해 짝을 이룰 수 있다. 다른 예시적 이중 특이적 항체는 활성화 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαRI, T 세포 수용체, 등)에 특이적인 제1 중쇄 및 억제 수용체 (예를 들어, FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, 등)에 특이적인 제2 중쇄를 갖는 것들을 포함한다. 이러한 이중 특이적 항체는 세포 활성화와 관련된 치료적 질병 (예를 들어, 알레르기(allergy) 및 천식(asthma))을 위해 구성될 수 있다. 이중 특이적 항체는, 예를 들어, 같은 또는 다른 면역원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합함으로써 만들어질 수 있다 (도 7B). 예를 들어, 같거나 다른 면역원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 같거나 다른 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중 특이적 항체는
각각 세 개의 중쇄 CDR에 이어서, (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 및 에피토프-결합 특이성을 부여하지는 않지만 각 중쇄와 결합하거나, 또는 각 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 에피토프-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 하나 또는 둘 다의 에피토프에 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는 두 개의 중쇄를 갖는다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 어떤 세포도 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 그것들 (단일-세포 또는 다수-세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균(E. coli)의 계통, 바실루스 종(Bacillus spp.), 스트렙토미세스 종(Streptomyces spp.), 등), 미코박테리아(mycobacteria) 세포, 균류 세포, 효모 세포 (예를 들어, 에스 세레비시애(S. cerevisiae), 에스 폼베(S. pombe), 피 파스토리스(P. pastoris), 피 메타놀리카(P. methanolica), 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스(baculovirus)-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 예를 들어, 히브리도마 또는 콰드로마(quadroma)를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵세포이며 다음 세포로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하는데, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6™ 세포)가 있다.
구절 "상보성 결정 영역", 또는 용어 "CDR"은 보통 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 두 개의 프레임워크 영역 사이에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식세포 계열 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 및, 예를 들어, 나이브(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이되거나 (예를 들어, 동물의 생식세포 계열에서 암호화된 서열과 다르거나), 인간화되거나, 및/또는 아미노산 치환, 추가, 또는 결실로 변형될 수 있다. 어떤 경우에 (예를 들어, CDR3에 대하여), CDR은 인접하지 않지만 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 예를 들어, 서열의 스플라이싱(splicing) 및 연결의 결과 (예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)로서, B 세포 핵산 서열에서는 인접한 둘 이상의 서열 (예를 들어, 생식세포 계열 서열)에 의해 암호화될 수 있다
용어 "보존적"은, 보존적 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용될 때, 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 원하는 기능적 성질, 예를 들어, 원하는 친화도로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 가변 영역의 능력을 실질적으로 변화시키지 않는다.
유사한 화학적 성질을 가진 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-히드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 리신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환기는, 예를 들어, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 리신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르트산염, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구체예에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이 유발에서 사용된 바와 같이, 단백질에서 어떤 고유한 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 구체예에서, Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45에서 개시된 PAM250 로그-확률 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양수 값을 갖는 보존적 치환이 이루어지며, 본원에 참고로 포함된다. 일부 구체예에서, 치환은 적당히 보존적인 치환이며, 치환은 PAM250 로그-확률 매트릭스에서 비음수 값을 갖는다.
일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 다르다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 이것들의 기능적 단편 (예를 들어, B 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단편)에서 잔기 위치는 아미노산 서열이 본원에서 나열된 경쇄와 동일하지 않지만, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환이 다르다.
구절 "에피토프-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR을 갖고 에피토프를 선택적으로 인식할 수 있는, 예를 들어, 약 1 마이크로몰 이하의 KD (예를 들어, 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M인 KD)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프-결합 단백질 (예를 들어, 치료적 항체)은 종종 나노몰 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 필요로 한다.
구절 "기능적 단편"은 발현될 수 있고, 분비될 수 있고, 에피토프에 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 갖는 특이적 인식이 포함된다.
용어 "생식세포 계열"은 비-체세포 돌연변이된 세포, 예를 들어, 비-체세포 돌연변이된 B 세포 또는 pre-B 세포 또는 조혈성 세포(hematopoietic cell)에서 면역글로불린 핵산 서열에 대한 참조를 포함한다.
구절 "중쇄", 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은, 달리 명시되지 않으면, 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는, 가변 도메인 (N-말단에서 C-말단으로)에 이어서, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 (예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인식할 수 있는) 단편을 포함하며, 이것은 세포로부터 발현하고 분비할 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열과 관련되어 사용될 때 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 업계에 알려진 다른 많은 알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 동일성을 포함한다. 본원에서 설명된 일부 구체예에서, 동일성은 10.0의 오픈 갭 페널티(open gap penalty), 0.1의 연장 갭 패널티(extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v. 1.83 (느림) 정렬을 사용하여, 및 Gonnet 유사성 매트릭스 (MAC VECTOR™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008)를 사용하여 결정된다. 서열의 동일성에 관하여 비교된 서열의 길이는 특정 서열에 의존적이지만, 경쇄 불변 도메인의 경우에, 길이는 고전적 경쇄 불변 도메인을 형성하도록 자가-결합할 수 있는, 예를 들어, 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트(sheet)를 형성할 수 있고 인간 또는 마우스의 적어도 하나의 CH1 도메인과 상호작용할 수 있는 경괘 불변 도메인으로 폴딩(fold)하는데 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다. CH1 도메인의 경우에, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 마우스 또는 인간의 적어도 하나의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 CH1 도메인으로 폴딩하는데 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다.
구절 "면역글로불린 분자"는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 다를 수도 있고, 경쇄는 동일하거나 다를 수도 있다.
구절 "경쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 경쇄 서열도 포함하며, 달리 명시되지 않으면 인간 κ 및 λ 경쇄 및 VpreB, 뿐만 아니라 대리 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은, 달리 명시되지 않으면, 전형적으로 세 개의 경쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는, 아미노 말단에서 카르복실 말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 및 경쇄 불변 도메인을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 경쇄는, 예를 들어, 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합하고 인식하거나, 중쇄가 이것들에 결합하고 인식하는 것을 돕는 것들을 포함한다. 공통 경쇄는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래된 것들이며, 체세포 돌연변이된 (예를 들어, 친화도 성숙) 버젼을 포함한다.
구절 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하려는 것이고; 구절 "나노몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하려는 것이고; 구절 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하려는 것이다.
구절 "체세포 돌연변이된"은 종류 번환(class-switching)을 경험한 B 세포의 핵산 서열에 대한 참조를 포함하며, 종류 변환된 B 세포의 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함함)은 종류 변환 전 B 세포의 핵산 서열과 동일하지 않는데, 예를 들어, 종류 변환을 경험하지 않은 B 세포와 종류 변환을 경험한 B 세포 사이에서 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이이다. "체세포 돌연변이된"은 친화도-성숙하지 않은 B 세포의 해당 면역글로불린 가변 영역 서열 (즉, 생식세포 계열 세포의 게놈의 서열)과 동일하지 않은 친화도-성숙한 B 세포의 핵산 서열에 대한 참조를 포함한다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 또한 B 세포의 원하는 에피토프에 노출 후 B 세포의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 참조를 포함하는데, 핵산 서열은 B 세포의 원하는 에피토프에 노출 전 해당 핵산 서열과 다르다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 면역원 도전에 반응하여 동물, 예를 들어, 인간 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 가진 마우스에서 생성되고, 이러한 동물에서 선천적으로 작동 가능한 선택 공정으로부터 발생하는 항체의 서열을 나타낸다.
용어 "재배열되지 않은"은, 핵산 서열에 관하여, 동물 세포의 생식세포 계열에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "가변 도메인"은, N-말단에서 C-말단의 순서로 (달리 지시되지 않으면), 다음 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (원하는 바와 같이 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
보편적인 경쇄
다중 특이적 에피토프-결합 단백질, 예를 들어, 이중 특이적 항체를 만들기 위한 노력 이전에, 헤테로다이머 이중 특이적 인간 면역글로불린과 짝을 이루는데 적합한 포맷을 합리적으로 조작하거나, 시행착오를 거쳐 조작하기 위한 서열의 시험관 내 선택 또는 처리는 공통 패러다임을 빈번하게 공유하는 다양한 문제에 의해 방해되었다. 불행하게도, 전부가 아닌 대부분의 시험관 내 조작 접근법은, 적어도, 개개의 분자에 적합한 대체로 임시(ad hoc) 고정을 제공한다. 반면에, 인간 치료제로 이어질 수 있는 적절한 짝짓기를 선택하기 위해 복잡한 유기체를 이용하는 생체 내 방법이 실현되지는 않았다.
일반적으로, 고유한 마우스 서열은 종종 인간 치료 서열에 대한 좋은 공급원이 아니다. 적어도 상기 이유를 위해, 공통 인간 경쇄와 짝을 이루는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 실용적 유용성이 제한된다. 더 많은 시험관 내 조작 노력이 마우스 중쇄 가변 서열을 인간화하기 위해 노력하는 시행착오 과정에서 확장되는 한편, 불확실한 결과로, 공통 인간 경쇄와 커플링하는 능력을 유지하는 동안 에피토프 특이성 및 친화도를 유지하도록 희망한다. 이러한 공정의 끝에, 최종 생성물은 특이성 및 친화도의 일부를 유지하고, 공통 경쇄에 결합할 수도 있지만, 궁극적으로 인간의 면역원성에는 엄청난 위험이 남아있을 가능성이 크다.
그러므로, 인간 치료제를 만드는데 적합한 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대신해서 인간 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 적합하게 큰 레퍼토리를 포함할 것이다. 인간 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트는 역방향 키메라 중쇄 (즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 영역을 포함하는 중쇄)를 형성하기 위해 재배열하고 내인성 마우스 중쇄 불변 도메인과 재조합할 수 있어야 한다. 중쇄는 중쇄 가변 도메인의 적합하게 큰 큰 레퍼토리가 인간 경쇄 가변 영역의 제한된 레퍼토리와 결합할 수 있는 것을 선택하기 위해 마우스에 이용 가능하도록 종류 전환 및 체세포 초 돌연변이 가능해야 한다.
복수의 중쇄에 대한 공통 경쇄를 선택하는 마우스는 실제적 유용성을 갖는다. 다양한 구체예에서, 공통 경쇄을 발현할 수 있는 마우스에서 발현되는 항체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 경쇄와 결합하고 이것을 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 이중 특이적 항체를 만드는데 특히 유용하다. 예를 들어, 이러한 마우스는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해 제1 면역원으로 면역화될 수 있다. 마우스 (또는 유전적으로 같은 마우스)는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해 제1 면역원으로 면역화될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클로닝되고 같은 중쇄 불변 영역, 및 같은 경쇄를 발현되고, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 세포에서 발현될 수 있으며, 이중 특이적 항체의 경쇄 구성요소는 경쇄 구성요소와 결합하여 이것을 발현하기 위해 마우스에 의해 선택되었다.
발명자는 가변 영역, 예를 들어, 친화도 성숙 또는 체세포 돌연변이된 가변 영역이 생식세포 계열 서열에서 떨어져 있는 중쇄를 포함하는, 중쇄의 매우 다양한 과와 적합하게 짝을 이루는 면역글로불린 경쇄를 생성하기 위해 조작된 마우스를 갖는다. 다양한 구체예에서, 마우스는 인간 경쇄 가변 도메인을 체세포 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 가변 도메인과 짝을 이루어서, 인간 치료제로서 사용에 적합한 고 친화도 결합 단백질에 대한 경로를 가능하게 하도록 고안된다.
유전적으로 조작된 마우스는, 유기체 내 항체 선택의 길고 복잡한 공정을 통해, 인간 경쇄 옵션의 수가 제한된 인간 중쇄 가변 도메인의 다양한 컬렉션과 짝을 이루는데 있어서 생물학적으로 적절한 선택을 한다. 이것을 달성하기 위해, 마우스는 다양한 인간 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 인간 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 조작된다. 면역원으로 도전 시, 마우스는 면역원에 대한 항체를 개발하기 위한 그것의 레퍼토리에서 용액의 개수를 최대화하며, 그것의 레퍼토리에서 개수 또는 경쇄 옵션에 의해 대부분 또는 단독으로 제한된다. 다양한 구체예에서, 이것은 마우스가 상대적으로 매우 다양한 인간 중쇄 가변 도메인과 호환성인 경쇄 가변 도메인의 적합한 및 호환성 체세포 돌연변이를 달성하게 하는 단계를 포함하며, 특정 체세포 돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인에서 포함한다.
경쇄 옵션의 제한된 레퍼토리를 달성하기 위해, 마우스는 고유한 마우스 경쇄 가변 도메인을 만들거나 재배열하는 능력을 비기능적 또는 실질적으로 비기능적으로 만들기 위해 조작된다. 이것은, 예를 들어, 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 결실함으로써 달성될 수 있다. 그 다음에 내인성 마우스 자리는, 외인성 인간 가변 영역 유전자 세그먼트가 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 결합하여 재배열된 역방향 키메라 경쇄 유전자 (인간 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 작동 가능하게 결합된, 선택되는 외인성 적합한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트에 의해 변형될 수 있다. 다양한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포 돌연변이될 수 있다. 다양한 구체예에서, 체세포 돌연변이를 획득하는 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위해, 적절한 인핸서(들)은 마우스에서 유지된다. 예를 들어, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트를 인간 κ 경쇄 유전자 세그먼트로 대체하기 위해 마우스 κ 경쇄 자리를 변형시키는데 있어서, 마우스 κ 인트론성 인핸서 및 마우스 3' 인핸서는 기능적으로 유지되거나, 붕괴되지 않는다.
다양한 역방향 키메라 (인간 가변, 마우스 불변) 중쇄와 결합된 역방향 키메라 (인간 가변, 마우스 불변) 경쇄의 제한된 레퍼토리를 발현하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트는 결실되고 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동 가능하게 결합된 단일 (또는 두 개의) 재배열된 인간 경쇄 영역으로 대체된다. 재배열된 인간 경쇄 영역의 체세포 초돌연변이를 최대화하기 위한 구체예에서, 마우스 κ 인트론성 인핸서 및 마우스 κ 3' 인핸서가 유지된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 또한 비기능적 λ 경쇄 자리, 또는 이것의 결실 또는 자리가 λ 경쇄를 만들 수 없게 하는 결실을 포함한다.
다양한 구체예에서, 내인성 마우스 경쇄 VL 및 JL 유전자 세그먼트가 결핍된 경쇄 가변 영역 자리를 포함하고, 마우스 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 재배열된 인간 경쇄 가변 영역, 한 구체예에서는, 재배열된 인간 VL/JL 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 마우스가 제공되는데, 자리는 체세포 초돌연변이를 경험할 수 있고, 자리는 마우스 불변 영역에 결합된 인간 VL/JL 서열을 포함하는 경쇄를 발현한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 자리는 마우스 κ 3' 인핸서를 포함하는데, 이것은 정상, 또는 야생형 수준의 체세포 초돌연변이와 연관성이 있다.
유전적으로 조작된 마우스는 다양한 구체예에서 원하는 항원으로 면역화될 때 하나 또는 두 개의 재배열된 경쇄를 발현하고 이것들과 함께 기능하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 다양한 재배열을 나타내는 B 세포를 생성하는데, 하나 또는 두 개의 경쇄가, 예를 들어, 1 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 구체예를 포함한다. 다양한 구체예에서, 그렇게 발현된 인간 경쇄는 마우스에서 발현된 어떤 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 결합하고 이것을 발현할 수 있다.
하나 이상의 에피토프에 결합하는 에피토프-결합 단백질
본원에서 설명된 조성물 및 방법은 높은 친화도로 하나 이상의 에피토프에 결합하는 결합 단백질, 예를들어, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이점은 각각 단일 경쇄와 결합하는, 적합하게 높은 결합 (예를 들어, 친화도 성숙) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함한다.
재조합 세포 배양물로부터 이중 특이적 항체 단편을 만들기 위한 여러 기술이 보고되었다. 하지만, 이중 특이적 결합 단백질의 합성 및 발현은 문제가 많았는데, 부분적으로 두 개의 다른 중쇄와 결합하고 이것들을 발현할 수 있는 적합한 경쇄의 확인과 연관된 문제로 인해, 및 부분적으로 분리 문제로 인한 것이다. 다양한 구체예에서, 본원에서 설명된 조성물 및 방법은 구성요소의 안정성/상호작용을 증가시킴으로써 전통적인 면역글로불린 구조를 유지하기 위해 특별한 변형(들)을 필요로 하지 않는 전장 이중 특이적 항체의 이점을 제공한다 (도 7A). 다양한 구체예에서, 이러한 변형(들)은 힘든 문제로 입증되었고 이중 특이적 항체 기술의 개발 및 인간 질환을 치료하는데 있어서 그것들의 잠재적 사용에 대한 장애물로서 역할을 하였다. 따라서, 다양한 구체예에서, 다중 특이성의 추가된 성질을 갖는 천연 면역글로불린 구조 (즉, 전장)를 제공함으로써, 전장 이중 특이적 항체는 이전에 이중 특이적 단편이 결핍된 그것들의 중요한 작용기 기능을 유지하고, 더 긴 반감기의 중요한 약물동역학적 파라미터를 입증하는 치료제를 더 제공한다.
본원에서 설명된 방법 및 조성물은 유전적으로 변형된 마우스가, 그 외에 천연 가공을 통해, 체세포 돌연변이된 (예를 들어, 친화도 성숙) 중쇄를 포함하는, 하나 이상의 중쇄와 결합하고 이것들을 발현할 수 있는 적합한 항체를 선택하게 한다. 역방향 키메라 중쇄 (즉, 인간 가변 및 마우스 불변)를 가진 친화도 성숙 항체를 발현하는 본원에서 설명된 면역화된 마우스의 적합한 B 세포의 인간 VL 및 VH 서열이 확인되고 적합한 인간 불변 영역 유전자 서열 (예를 들어, 인간 IgG1)와 함께 발현 벡터에서 인 프레임(in frame) 클로닝될 수 있다. 이러한 두 개의 구조가 제조될 수 있으며, 각 구조는 다른 에피토프에 결합하는 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화한다. 생식세포 계열 서열에서 또는 서열이 체세포 돌연변이된 B 세포의 인간 VL (예를 들어, 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1) 중 하나는 적합한 인간 불변 영역 유전자 (예를 들어, 인간 κ 불변 유전자)에 인 프레임 융합될 수 있다. 이 세 개의 완전한 인간 중쇄 및 경쇄 구조는 발현되는 적합한 세포에서 대체될 수 있다. 세포는 두 개의 주요한 종을 발현할 것이다: 동일한 경쇄를 가진 호모다이머 중쇄, 및 동일한 경쇄를 가진 헤테로다이머 중쇄. 이 주요한 종들의 용이한 분리를 허용하기 위해, 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정요인을 생략하도록 변형되는데, 헤테로다이머 결합 단백질과 다른 친화도의 호모다이머 결합 단백질을 발생시킨다. 이 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 2010년 6월 25일에 출원된 제USSN 12/832,838호에서 설명되었으며, "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format"이라는 제목으로, 제US 2010/0331527A1호로 공개되었으며, 본원에서 참고로 포함된다. 한 양태에서, 본원에서 설명된 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 인간 VL 및 VH 서열은 원하는 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 에피토프-결합 단백질이 제공되는데, 제1 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 에피토프-결합 영역에 이어서, IgG1, IgG2, IgG4, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고, 제2 폴리펩티드는, N-말단에서 C-말단으로, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 에피토프-결합 영역에 이어서, IgG1, IgG2, IgG4, 및 이것들의 조합으로부터 선택된 인간 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하며, 제2 CH3 영역은 제2 CH3 도메인의 단백질 A로의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링(numbering)에 의해; EU 넘버링에 의해 H435R)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제2 CH3 영역은 Y96F 변형 (IMGT; EU에 의해 Y436F)을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 인간 IgG1의 것이고, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I)로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 인간 IgG2의 것이고, N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 N384S, K392N, 및 V422I)로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 인간 IgG4의 것이고, Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I)로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
하나 이상의 에피토프에 결합하는 에피토프-결합 단백질을 만드는 하나의 방법은 원하는 제1 에피토프를 포함하는 항원으로 본 발명에 따르는 제1 마우스를 면역화하는 것인데, 마우스는 경쇄를 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 마우스 VL을 함유하지 않는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 자리를 포함하고, 마우스 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 단일 재배열된 인간 VL 영역은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 자리에 있고, 재배열된 인간 VL 영역은 인간 Vκ1-39Jκ5 및 인간 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되며, 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트는, 마우스에 의해 만들어진 면역글로불린 중쇄가 단독으로 또는 실질적으로 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 포함하는 중쇄가 되도록, 전체 또는 부분적으로 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체되었다. 면역화될 때, 이러한 마우스는 역방향 키메라 항체를 만들 것이며, 두 개의 인간 경쇄 가변 도메인 중 하나 (예를 들어, 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 중 하나)만을 포함한다. B 세포가 원하는 에피토프에 결합하는 VH를 암호화하는 것으로 확인되면, VH (및, 선택적으로 VL)의 뉴클레오티드 서열이 회수될 수 있고 (예를 들어, PCR에 의해), 적합한 인간 면역글로불린 불변 도메인과 함께 발현 구조로 인 프레임 클로닝될 수 있다. 이 공정은 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 도메인을 확인하기 위해 반복될 수 있고, 제2 VH 유전자 서열이 회수되고 적합한 제2 면역글로불린 불변 도메인에 대하여 발현 벡터로 인 프레임 클로닝될 수 있다. 제1 및 제2 면역글로불린 불변 도메인은 같거나 다른 이소타입일 수 있고, 면역글로불린 불변 도메인 중 하나 (하지만 다른 것은 아니다)는 본원에서 또는 제US 2010/0331527A1호에서 설명된 바와 같이 변형될 수 있고, 에피토프-결합 단백질은 적합한 세포에서 발현되고, 예를 들어, 제US 2010/0331527 A1호에서 설명된 바와 같이 호모다이머 에피토프-결합 단백질과 비교하여 단백질 A에 대한 차등적 친화도에 기초하여 분리될 수 있다.
한 구체예에서, 이중 특이적 에피토프-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되는데, 본원에서 설명된 마우스의 제1 친화도-성숙 (예를 들어, 하나 이상의 체세포 초돌연변이를 포함) 인간 VH 뉴클레오티드 서열 (VH1)을 확인하는 단계, 본원에서 설명된 마우스의 제2 친화도-성숙 (예를 들어, 하나 이상의 체세포 초돌연변이를 포함) 인간 VH 뉴클레오티드 서열 (VH2)을 확인하는 단계, 중쇄 1 (HC1) 형태에 대하여 제US 2010/0331527A1호에서 설명된 바와 같이 단백질 A-결정요인 변형이 결핍된 인간 중쇄와 함께 VH1을 인프레임 틀로닝하는 단계, 중쇄 2 (HC2) 형태에 대하여 제US 2010/0331527A1호에서 설명된 바와 같이 단백질 A-결정요인을 포함하는 인간 중쇄와 함께 VH1을 인프레임 틀로닝하는 단계, HC1을 포함하는 발현 벡터 및 HC2를 포함하는 같거나 다른 발현 벡터를 세포로 도입하는 단계로서, 세포는 또한 인간 경쇄 불변 도메인에 융합된 인간 νκ1-39/인간 Jκ5 또는 인간 Vκ3-20/인간 Jκ1을 포함하는 인간 면역글로불린 경쇄를 발현하는 단계, 및 단일 특이적 호모다이머 에피토프-결합 단백질과 비교하여 단백질 A에 결합하는 차등적 능려겡 기초하여 이중 특이적 에피토프-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, HC1은 IgG1이고, HC2는 변형 H95R (IMGT; EU에 의해 H435R)을 포함하고 변형 Y96F (IMGT; EU에 의해 Y436F)를 더 포함하는 IgG1이다. 한 구체예에서, VH1에 의해 암호화된 VH 도메인, VH2에 의해 암호화된 VH 도메인, 또는 둘 다는 체세포 돌연변이된다.
공통 인간 V L 과 함께 발현하는 인간 V H 유전자
네 개의 다른 항원에 대하여 발생한 친화도-성숙 항체의 다양한 인간 가변 영역은 그것들의 동족 경쇄, 또는 인간 Vκ1-39/Jκ5, 인간 Vκ3-20/Jκ1, 또는 인간 VpreB/Jλ5로부터 선택된 인간 경쇄 중 적어도 하나와 함께 발현되었다 (실시예 1 참조). 각각의 항원에 대한 항체에 대하여, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 성공적으로 짝을 이루는 다른 유전자 과의 체세포 돌연변이된 고 친화도 중쇄는 중쇄 및 경쇄를 발현하는 세포로부터 분비되었다. Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1에 대하여, 다음 인간 VH 유전자 과로부터 유래된 VH 도메인이 바람직하게 발현된다: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 및 6-1. 따라서, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 중 하나 또는 둘 다의 인간 VL 도메인의 제한된 레퍼토리를 발현하도록 조작된 마우스는 마우스 VH 유전자 세그먼트를 인간 VH 유전자 세그먼트로 대체하기 위해 변형된 VH 자리의 체세포 돌연변이된 인간 VH 도메인의 다양한 집단을 발생시킨다.
단일 재배열된 경쇄 (예를 들어, Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J)와 결합된 역방향 키메라 (인간 가변, 마우스 불변) 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 유전적으로 조작된 마우스는, 원하는 항원으로 면역화될 때, 다양한 인간 VH 재배열을 포함하는 B 세포를 발생시켰고 항원의 그것의 리간드로의 결합을 차단하는 능력에 관하여, 및 항원의 변이체에 결합하는 능력에 관하여 다양한 성질을 가진 다양한 고-친화도 항원-특이적 항체를 발현하였다 (실시예 5 내지 10 참조).
따라서, 본원에서 설명된 마우스 및 방법은 다양한 재배열로부터 발생하고, 다양한 친화도 (약 나노몰 이하의 KD를 나타냄), 다양한 특이성 (같은 항원의 다른 에피토프에 결합)을 나타내고, 같은 또는 실질적으로 같은 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 결합하고 이것들과 함께 발현하는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 만들고 선택하는데 유용하며, 체세포 돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
공통 경쇄를 갖는 완전한 인간 이중 특이적 항체
다양한 구체예의 제1 단계로서, 인간 중쇄 가변 도메인 (및 이중 특이적 항체를 형성하는 어떤 추가적 핵산 서열)을 각각 암호화하는 제1 및 제2 핵산 서열은, 예를 들어, 다른 에피토프에 결합할 수 있거나 (도 7A 및 7B 참조), 다른 친화도를 갖는, 등의 원하는 특성을 갖는 모체 단클론성 항체로부터 선택된다. 보통, 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산 서열은, 본원에서 설명된 바와 같이, 인간 투여에 적합하도록 인간 중쇄 불변 영역과의 융합을 허용하기 위해 면역화된 마우스로부터 분리된다. 서열(들)에 대한 추가의 변형은 추가의 기능성을 이중 특이적 항체에 추가하는 것이 달성될 수 있는 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있는데, 이것은, 예를 들어, 혈청 반감기의 증가 (예를 들어, 제U.S. 7,217,797호 참조) 및/또는 항체-의존적 세포-매개된 세포 독성의 증가 (예를 들어, 제U.S. 6,737,056호 참조)를 포함한다. 돌연변이를 항체의 불변 영역으로의 도입은 업계에 알려져 있다. 추가적으로, 이중 특이적 항체의 일부는 세포 배양물에서 재조합에 의해 만들어질 수 있고 분자의 다른 부분(들)은 상기 언급된 기술에 의해 만들어질 수 있다.
항체를 생산하기 위한 여러 기술이 설명되었다. 예를 들어, 다양한 구체예에서 키메라 항체는 본원에서 설명된 마우스에서 생산된다. 항체는 면역화된 마우스의 B 세포로부터 직접적으로 분리될 수 있고 (예를 들어, 제U.S. 2007/0280945A1호 참조) 및/또는 면역화된 마우스의 B 세포는 히브리도마를 만드는데 사용될 수 있다 (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497). 본원에서 설명된 마우스의 항체 (인간 중쇄 및/또는 경쇄)를 암호화하는 DNA는 통상적인 기술을 사용하여 쉽게 분리되고 시퀀싱된다(sequenced). 본원에서 설명된 마우스로부터 유래된 히브리도마 및/또는 B 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 분리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수도 있는데, 이것은 그 다음에 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻기 위해서, 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포로 트랜스펙션된다. DNA는 또한 쥐 서열을 대신해서 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 암호화하는 서열을 치환함으로써 변형될 수도 있다.
다양한 구체예에서, DNA의 분리 및 원하는 특이성/친화도를 갖는 제1 및 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 제1 및 제2 핵산 서열, 및 인간 경쇄 도메인을 암호화하는 제3 핵산 서열 (생식세포 계열 재배열된 서열 또는 본원에서 설명된 마우스로부터 분리된 경쇄 서열)의 선택 후, 분자를 암호화하는 세 개의 핵산 서열은 업계에서 널리 이용 가능한 재조합 기술을 사용하여 발현되어 이중 특이적 항체를 형성한다. 흔히, 선택되는 발현 시스템은 이중 특이적 항체가 적절하게 글리코실화되도록 (예를 들어, 글리코실화되는 항체 도메인을 포함하는 이중 특이적 항체의 경우에) 포유동물 세포 발현 벡터 및 숙주를 수반할 것이다. 하지만, 분자는 또한 원핵생물 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 보통, 숙주 세포는 단일 벡터 또는 독립적 벡터의 인간 경쇄 도메인인 제1 인간 중쇄 가변 도메인, 제2 인간 중쇄 가변 도메인 둘 다를 암호화하는 DNA로 형질전환될 것이다. 하지만, 독립적인 발현 시스템에서 제1 인간 중쇄 가변 도메인, 제2 인간 중쇄 가변 도메인, 및 인간 경쇄 도메인 (이중 특이적 항체 구성요소)를 발현하고 시험관 내에서 발현된 폴리펩티드를 커플링하는 것이 가능하다. 다양한 구체예에서, 인간 경쇄 도메인은 생식세포 계열 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 인간 경쇄 도메인은 경쇄 도메인의 경쇄 가변 서열과 함께 하나 이하, 둘 이하, 셋 이하, 넷 이하, 또는 다섯 이하의 체세포 초돌연변이를 포함한다.
다양한 구체예에서, 두 개의 중쇄 및 단일 인간 경쇄를 암호화하는 핵산(들) (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 및/또는 발현을 위해 복제 가능 벡터로 삽입된다. 많은 벡터들이 이용 가능하며, 일반적으로는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제의 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 각 구성요소는 개별적으로 또는 숙주 세포 선택 또는 실험적으로 결정된 다른 기준에 기초하여 선택될 수 있다. 각 구성요소의 여러 샘플이 업계에 알려져 있다.
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 이중 특이적 항체의 각각 또는 모든 구성요소를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합되는 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식된 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이 프로모터들은 제한 효소 분해에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 분리된 프로모터 서열을 벡터로 삽입함으로써 이중 특이적 항체-암호화 DNA에 작동 가능하게 결합된다.
진핵생물 숙주 세포 (효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다세포 유기체의 유핵 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 때로는 3' 비번역 영역으로부터 공통으로 이용 가능하다. 이 영역들은 이중 특이적 항체 구성요소를 암호화하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 다양한 구체예에 적합한 발현 벡터는 이중 특이적 항체를 암호화하는 DNA의 포유동물 세포에서 일과성 발현을 제공하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 일과성 발현은 숙주 세포에서 효과적으로 복제 가능한 발현 벡터의 사용을 수반하며, 이로 인해 숙주 세포는 많은 카피의 발현 벡터를 축적하고, 차례로, 발현 벡터에 의해 암호화된 원하는 폴리펩티드의 높은 수준을 합성한다. 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 일과성 발현 시스템은 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 편리한 확실한 확인, 뿐만 아니라 제1 또는 제2 인간 중쇄 가변 도메인의 호모다이머를 가진 모체 항체와 비교하여 원하는 결합 특이성/친화도 또는 원하는 겔 이동 특성을 갖는 이중 특이적 항체의 신속한 스크리닝을 허용한다.
다양한 구체예에서, 이중 특이적 항체의 구성요소를 암호화하는 DNA가 상기 설명된 바와 같이 원하는 벡터(들)로 조립되면, 그것들은 발현 및 회복에 적합한 숙주 세포로 도입된다. 숙주 세포의 트랜스펙션은 선택된 숙주 세포에 적절한, 업계에 알려져 있는 표준 기술 (예를 들어, 전기천공, 핵 미세 주입법, 온전한 세포로의 박테리아 원형질체 융합, 또는 다가 양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리 오르니틴, 등)을 사용하여 성취될 수 있다.
다양한 구체예에서, 구성요소를 함유하는 발현 벡터에 가장 적합하고 이중 특이적 항체 종의 가장 효과적이고 바람직한 생산을 허용하는 숙주 세포가 선택된다. 발현을 위한 예시적 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균의 계통, 바실루스 종, 스트렙토미세스 종, 등), 미코박테리아 세포, 균류세포, 효모 세포 (예를 들어, 에스 세레비시애, 에스 폼베, 피 파스토리스, 피 메타놀리카, 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니, 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는, 예를 들어, 히브리도마 또는 콰드로마와 같은 세포 융합체의 것들을 포함한다. 다양한 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주로부터 선택된 진핵 세포이다. 다양한 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하는데, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6™ 세포)가 있다.
이중 특이적 항체를 생산하는데 사용된 포유동물 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수도 있다. Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((Minimal Essential Medium; MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((Dulbeccols Modified Eagle's Medium; DMEM), Sigma)와 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 버퍼 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™), 미량의 요소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 한정됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수도 있다. 어떤 다른 보충물은 당업자에게 알려져 있는 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH, 등과 같은 배양 조건은, 다양한 구체예에서, 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 당업자에게 분명해질 것이다.
이중 특이적 항체는 다양한 구체예에서 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되지만, 그것은 또한 분비 신호 없이 직접적으로 생산될 때 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있다. 이중 특이적 항체가 막-결합되면, 그것은 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하여 막으로부터 방출될 수 있다. 바람직하게, 본원에서 설명된 이중 특이적 항체는 제1 면역글로불린 CH3 도메인 및 제2 면역글로불린 CH3 도메인의 사용을 수반하는데, 제1 및 제2 면역글로불린 CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 다르고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중-특이적 항체와 비교하여 단백질 A에 대한 이중 특이적 항체의 결합을 감소시킨다 (제U.S. 2010/0331527A1호 참조; 본원에서 참고로 포함된다). 한 구체예에서, 제1 면역글로불린 CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 면역글로불린 CH3 도메인은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의해; EU 넘버링에 의해 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의해 Y436F)을 더 포함할 수도 있다. 제2 CH3 내에서 발견될 수도 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I). 상기 설명된 이중-특이적 항체 포맷에 대한 변화는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
이중 특이적 항체의 이중적인 성질 때문에 (즉, 하나의 폴리펩티드의 다른 에피토프에 특이적일 수도 있거나 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수도 있다, 도 7B 참조; 또한, 예를 들어, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et a., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244 참조), 그것들은 치료적 적용에 대한 많은 유용한 이점들을 제공한다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 백신 보조제로서, 재방향성 세포 독성 (예를 들어, 종양 세포를 사멸시키기 위해), 혈전에 혈전 용해제의 전달, 표적 부위(예를 들어, 종양)에서 효소 활성화된 프로드러그(prodrug)의 전환, 감염성 질환의 치료, 면역 복합체의 세포 표면 수용체로의 표적화, 또는 종양 세포에 항체 독소의 전달에 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 이중 특이적 항체는 또한 효소 면역 검정, 이방향 면역 검정, 다양한 질환 (예를 들어, 암)의 시험관 내 또는 생체 내 면역 진단, 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역 침강 검정과 같이, 여러 치료적 및 비-치료적 및/또는 진단적 검정 방법에서 사용될 수 있다. 이중 특이적 항체의 다른 사용은 당업자에게 분명해질 것이다.
다음 예는 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위해서 제공되고, 발명자들이 발명으로 간주하는 것들의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였고 일부 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 일부는 중량에 의한 일부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압 정도이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위해서 제공되고, 발명자들이 발명으로 간주하는 것들의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였고 일부 실험적 오차 및 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압 정도이며, 일부는 중량에 의한 일부이고, 분자량은 평균 분자량이다.
실시예 1
선택된 인간 V L 영역과 결합된 인간 V H 영역의 확인
단일 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄가 항원 특이적 인간 항체의 인간 중쇄와 동시-발현될 수 있는지 결정하기 위해 시험관 내 발현 시스템을 구성하였다.
유전적으로 변형된 마우스에서 인간 항체를 생성하는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, 제US 6,596,541호, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). VELOCIMMUNE® 기술은 마우스가 항원성 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하도록 내인성 마우스 불변 영역 자리에 작동 가능하게 결합된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 가진 유전적으로 변형된 마우스의 생성을 수반한다. VELOCIMMUNE® 마우스로부터 생산된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 완전한 인간이다. 처음에는, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가진 고 친화도 키메라 항체를 분리한다. 하기 설명된 바와 같이, 항체를 특성화하고 친화도, 선택성, 에피토프, 등을 포함하는 바람직한 특성에 대하여 선택한다. 마우스 불변 영역을 비-IgM 이소타입, 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 함유하는 완전한 인간 항체를 생성하기 위해 원하는 인간 불변 영역으로 대체한다. 선택된 불변 영역이 특이적 사용에 따라 달라질 수도 있는 한편, 고 친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 있다.
VELOCIMMUNE® 마우스를 혈관 형성을 촉진하는 성장 인자 (항원 C)로 면역화하였고 항원-특이적 인간 항체를 분리하였으며 업계에서 인식된 표준 기술을 사용하여 V 유전자 사용량에 대하여 시퀀싱하였다. 선택된 항체를 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 클로닝하였고 69개의 중쇄를 세 개의 인간 경쇄 중 하나와 짝을 이루기 위해 선택하였다: (1) 인간 κ 불변 영역에 결합된 동족 κ 경쇄, (2) 인간 κ 불변 영역에 결합된 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5, 또는 (3) 인간 κ 불변 영역에 결합된 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1. 각각의 중쇄 및 경쇄 쌍을 표준 기술을 사용하여 CHO-K1 세포에서 동시-트랜스펙션하였다. 상층액 중 항체의 존재를 ELISA 검정에서 항-인간 IgG로 검출하였다. 각 중쇄/경쇄 쌍에 대하여 항체 역가 (ng/ml)를 결정하였고 다른 재배열된 생식세포 계열 경쇄의 역가를 모체 항체 분자 (즉, 동족 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻어진 역가와 비교하였으며 고유 역가의 퍼센트를 계산하였다 (표 1). VH: 중쇄 가변 유전자. ND: 현재 실험 조건 하에서 검출된 발현 없음.
표 1
VH 항체 역가 (ng/mL) 고유 역가의 퍼센트
동족 LC Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1 Vκ1-39Jκ5 Vκ3-20Jκ1
3-15 63 23 11 36.2 17.5
1-2 103 53 ND 51.1 -
3-23 83 60 23 72.0 27.5
3-33 15 77 ND 499.4 -
4-31 22 69 17 309.4 76.7
3-7 53 35 28 65.2 53.1
- 22 32 19 148.8 89.3
1-24 3 13 ND 455.2 -
3-33 1 47 ND 5266.7 -
3-33 58 37 ND 63.1 -
- 110 67 18 60.6 16.5
3-23 127 123 21 96.5 16.3
3-33 28 16 2 57.7 7.1
3-23 32 50 38 157.1 119.4
- 18 45 18 254.3 101.7
3-9 1 30 23 2508.3 1900.0
3-11 12 26 6 225.9 48.3
1-8 16 ND 13 - 81.8
3-33 54 81 10 150.7 19.1
- 34 9 ND 25.9 -
3-20 7 14 54 203.0 809.0
3-33 19 38 ND 200.5 -
3-11 48 ND 203 - 423.6
- 11 23 8 212.7 74.5
3-33 168 138 182 82.0 108.2
3-20 117 67 100 57.5 86.1
3-23 86 61 132 70.7 154.1
3-33 20 12 33 60.9 165.3
4-31 69 92 52 133.8 75.0
3-23 87 78 62 89.5 71.2
1-2 31 82 51 263.0 164.6
3-23 53 93 151 175.4 285.4
- 11 8 17 75.7 151.4
3-33 114 36 27 31.6 23.4
3-15 73 39 44 53.7 59.6
3-33 1 34 16 5600.0 2683.3
3-9 58 112 57 192.9 97.6
3-33 67 20 105 30.1 157.0
3-33 34 21 24 62.7 70.4
3-20 10 49 91 478.4 888.2
3-33 66 32 25 48.6 38.2
3-23 17 59 56 342.7 329.8
- 58 108 19 184.4 32.9
- 68 54 20 79.4 29.9
3-33 42 35 32 83.3 75.4
- 29 19 13 67.1 43.9
3-9 24 34 29 137.3 118.4
3-30/33 17 33 7 195.2 43.1
3-7 25 70 74 284.6 301.6
3-33 87 127 ND 145.1 -
6-1 28 56 ND 201.8 -
3-33 56 39 20 69.9 36.1
3-33 10 53 1 520.6 6.9
3-33 20 67 10 337.2 52.3
3-33 11 36 18 316.8 158.4
3-23 12 42 32 356.8 272.9
3-33 66 95 15 143.6 22.5
3-15 55 68 ND 123.1 -
- 32 68 3 210.9 10.6
1-8 28 48 ND 170.9 -
3-33 124 192 21 154.3 17.0
3-33 0 113 ND 56550.0 -
3-33 10 157 1 1505.8 12.5
3-33 6 86 15 1385.5 243.5
3-23 70 115 22 163.5 31.0
3-7 71 117 21 164.6 29.6
3-33 82 100 47 122.7 57.1
3-7 124 161 41 130.0 33.5
유사한 실험에서, VELOCIMMUNE® 마우스를 여러 다른 항원으로 면역화하였고 항원 특이적 인간 항체의 선택된 중쇄를 다른 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄와 짝을 이루는 능력에 대하여 테스트하였다 (상기 설명된 바와 같음). 이 실험에서 사용된 항원은 콜레스테롤 항상성에 수반된 효소 (항원 A), 글루코스 항상성을 조절하는데 수반된 혈청 호르몬 (항원 B), 혈관 형성을 촉진하는 성장 인자 (항원 C) 및 세포-표면 수용체 (항원 D)를 포함하였다. 항원 특이적 항체를 각각의 면역화 군의 마우스로부터 분리하였고 중쇄 및 경쇄가변 영역을 클로닝하고 시퀀싱하였다. 중쇄 및 경쇄의 서열에서, V 유전자 사용량을 결정하였고 선택된 중쇄를 그것들의 동족 경쇄 또는 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 영역과 짝을 지었다. 각 중쇄/경쇄 쌍을 CHO-K1 세포에 동시-트랜스펙션하였고 상층액 중 항체의 존재를 ELISA 검정에서 항-인간 IgG에 의해 검출하였다. 항체 역가 (μg/ml)를 각 중쇄/경쇄 쌍에 대하여 결정하였고 다른 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄의 역가를 모체 항체 분자 (즉, 동족 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻어진 역가와 비교하였으며 고유 역가의 퍼센트를 계산하였다 (표 2). VH: 중쇄 가변 유전자. Vκ: κ 경쇄 가변 유전자. ND: 현재 실험 조건 하에서 검출된 발현 없음.
표 2
항원 항체 VH Vκ 역가 (μg/ml) 고유
역가의
퍼센트
VH 단독 VH + Vκ VH +
Vκ1-39Jκ5
A 320 1-18 2-30 0.3 3.1 2.0 66
321 2-5 2-28 0.4 0.4 1.9 448
334 2-5 2-28 0.4 2.7 2.0 73
313 3-13 3-15 0.5 0.7 4.5 670
316 3-23 4-1 0.3 0.2 4.1 2174
315 3-30 4-1 0.3 0.2 3.2 1327
318 4-59 1-17 0.3 4.6 4.0 86
B 257 3-13 1-5 0.4 3.1 3.2 104
283 3-13 1-5 0.4 5.4 3.7 69
637 3-13 1-5 0.4 4.3 3.0 70
638 3-13 1-5 0.4 4.1 3.3 82
624 3-23 1-17 0.3 5.0 3.9 79
284 3-30 1-17 0.3 4.6 3.4 75
653 3-33 1-17 0.3 4.3 0.3 7
268 4-34 1-27 0.3 5.5 3.8 69
633 4-34 1-27 0.6 6.9 3.0 44
C 730 3-7 1-5 0.3 1.1 2.8 249
728 3-7 1-5 0.3 2.0 3.2 157
691 3-9 3-20 0.3 2.8 3.1 109
749 3-33 3-15 0.3 3.8 2.3 62
750 3-33 1-16 0.3 3.0 2.8 92
724 3-33 1-17 0.3 2.3 3.4 151
706 3-33 1-16 0.3 3.6 3.0 84
744 1-18 1-12 0.4 5.1 3.0 59
696 3-11 1-16 0.4 3.0 2.9 97
685 3-13 3-20 0.3 0.5 3.4 734
732 3-15 1-17 0.3 4.5 3.2 72
694 3-15 1-5 0.4 5.2 2.9 55
743 3-23 1-12 0.3 3.2 0.3 10
742 3-23 2-28 0.4 4.2 3.1 74
693 3-23 1-12 0.5 4.2 4.0 94
D 136 3-23 2-28 0.4 5.0 2.7 55
155 3-30 1-16 0.4 1.0 2.2 221
163 3-30 1-16 0.3 0.6 3.0 506
171 3-30 1-16 0.3 1.0 2.8 295
145 3-43 1-5 0.4 4.4 2.9 65
49 3-48 3-11 0.3 1.7 2.6 155
51 3-48 1-39 0.1 1.9 0.1 4
159 3-7 6-21 0.4 3.9 3.6 92
169 3-7 6-21 0.3 1.3 3.1 235
134 3-9 1-5 0.4 5.0 2.9 58
141 4-31 1-33 2.4 4.2 2.6 63
142 4-31 1-33 0.4 4.2 2.8 67
이 실험들로부터 얻어진 결과는 다른 유전자 과의 체세포 돌연변이된, 고 친화도 중쇄가 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 짝을 이룰 수 있고 정상 항체 분자로서 세포로부터 분비될 수 있다는 것을 입증한다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 항체 역가는 모체 항체의 동족 경쇄에 비해 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 경쇄와 짝을 이룰 때 약 61% (69 중 42) 중쇄 및 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이룰 때 약 29% (69 중 20) 중쇄에 대하여 증가하였다. 중쇄 중 약 20% (69 중 14)에 대하여, 두 개의 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄는 모체 항체의 동족 경쇄에 비해 발현의 증가를 부여했다. 표 2에서 나타난 바와 같이, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 영역은 모체 항체에 대한 동족 경쇄에 비해 다른 등급의 항원의 범위에 특이적인 여러 중쇄의 발현의 증가를 부여했다. 항체 역가는 모체 항체의 동족 경쇄에 비해 중쇄의 약 35% (15/43)에 대하여 2배 이상만큼 증가하였다. 두 개의 중쇄 (315 및 316)에 대하여, 증가는 모체 항체에 비해 10배 더 컸다. 모체 항체의 동족 경쇄에 비해 발현의 증가를 나타내는 모든 중쇄 내에서, 과 세 개의 (VH3) 중쇄는 다른 중쇄 가변 영역 유전자 과와 비교하여 과하게 표현되었다. 이것은 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이루기 위한 인간 VH3 중쇄의 바람직한 관계를 입증한다.
실시예 2
재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 자리의 생성
다양한 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 표적화 벡터를 마우스 게놈 박테리아 인공 염색체 (Bacterial Artificial Chromosome; BAC) 클론 302g12 및 254m04 (Invitrogen)를 변형시키기 위해 VELOCIGENE® 기술 (예를 들어, 미국 특허 번호 제6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659를 참고하면 된다)을 사용하여 만들었다. 이 두 개의 BAC 클론들을 사용하여, 게놈 구조를 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역을 함유하도록 조작하였고 내인성 κ 가변 및 결합 유전자 세그먼트가 결실되도록 이전에 변형된 내인성 경쇄 자리로 삽입하였다.
재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄의 구성
표적화 벡터. 세 개의 다른 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역을 업계에서 인식된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 만들었다. 이 세 개의 영역을 구성하는데 사용된 인간 가변 유전자 세그먼트는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열, 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열 및 재배열된 인간 VpreBJλ5 서열을 포함하였다.
마우스 Vκ3-7 유전자의 엑손 1 (선도 펩티드를 암호화함) 및 인트론 1을 함유하는 DNA 세그먼트를 데 노보(de novo) DNA 합성 (Integrated DNA Technologies)으로 만들었다. 자연 발생 BlpI 제한 효소 부위까지에 대한 5' 비번역 영역의 일부가 포함되었다. 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자의 엑손을 인간 게놈 BAC 라이브러리로부터 PCR 증폭하였다. 정방향 프라이머는 마우스 Vκ3-7 유전자의 인트론 1의 스플라이스(splice) 수용기 부위를 함유하는 5' 연장을 갖고 있었다. 인간 Vκ1-39 서열의 PCR에 사용된 역방향 프라이머는 인간 Jκ5를 암호화하는 연장을 포함하는 반면에, 인간 Vκ3-20 서열의 PCR에 사용된 역방향 프라이머는 인간 Jκ1을 암호화하는 연장을 포함하였다. 인간 VpreBJλ5 서열을 데 노보 DNA 합성 (Integrated DNA Technologies)으로 만들었다. 스플라이스 기증 부위를 포함하는 인간 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI로부터 PCR 증폭하였다. 정방향 PCR 프라이머는 인간 Jκ5, Jκ1, 또는 Jλ5 서열의 일부를 암호화하는 연장을 포함하였다. 역방향 프라이머는 PI-SceI 부위를 포함하였는데, 이것을 이전에 인트론으로 조작하였다.
마우스 Vκ3-7 엑손 1/인트론 1, 인간 가변 경쇄 엑손, 및 인간 Jκ-Cκ 인트론 단편을 중첩 연장 PCR에 의해 함께 만들었고, BlpI 및 PI-SceI로 분해하였고, 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI로 결찰하였는데, 이것은 인간 Vκ3-15 가변 유전자 세그먼트의 프로모터를 함유하였다. 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI 내 록스된(loxed) 히그로마이신 카세트를 NotI 및 AscI 부위에 의해 플랭킹된 FRTed 히그로마이신 카세트로 대체하였다. 이 플라스미드의 NotI/PI-SceI 단편을 변형된 마우스 BAC 254m04에 결찰하였는데, 이것은 마우스 κ 자리의 다운스트림(downstream)에 마우스 Jκ-Cκ 인트론, 마우스 Cκ 엑손, 및 약 75 kb의 게놈 서열의 일부를 함유하였고, 이것은 마우스 ES 세포에서 상동 재조합을 위해 3' 상동성 팔을 제공하였다. 그 다음에 이 BAC의 NotI/AscI 단편을 변형된 마우스 BAC 302g12에 결찰하였는데, 이것은 마우스 ES 세포에서 상동 재조합을 위해 내인성 κ 자리의 업스트림(upstream)에 FRTed 네오마이신 카세트 및 약 23 kb의 게놈 서열을 함유하였다.
재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 표적화 벡터 (도 1). 제한 효소 부위를 표적화 벡터로 클로닝하기 위해 조작된 경쇄 삽입물의 5' 및 3' 끝에서 도입하였다: 5' 끝에 AscI 부위 및 3' 끝에 PI-SceI 부위. 5' AscI 부위 및 3' PI-SceI 부위 내에서 5'에서 3'으로의 표적화 구조는 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻어진 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 5'에서 서열을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 인간 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 인간 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻어진 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 3'에서 서열을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하였다 (도 1, 중앙). 내인성 마우스 K 경쇄 자리의 업스트림 및 가장 3' Jκ 유전자 세그먼트 (예를 들어, 내인성 3' 인핸서)의 다운스트림에서 유전자 및/또는 서열은 표적화 구조에 의해 변형되지 않았다 (도 1 참조). 조작된 인간 Vκ1-39Jκ5 자리의 서열은 SEQ ID NO: 1에서 나타난다.
재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39J 5 영역의 BAC DNA로의 표적화된 삽입을 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역 내 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)로 확인하였다. 간단히 말하면, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 3'에서 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO: 2) 및 ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO: 3)로 확인하였다. 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO: 4) 및 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO: 5)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO: 6) 및 neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO: 7)로 확인하였다. 그 다음에 마우스 ES 세포를 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 영역을 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위해 표적화된 BAC DNA를 사용하여 생성된 변형된 ES 세포로 전기천공하였다.
양성 ES 세포 클론을 TAQMAN™ 스크리닝 및 내인성 자리로 삽입된 조작된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석(karyotyping)으로 확인하였다. 간단히 말하면, 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하는 프로브 neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO: 8), 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 3'의 인트론 서열 내에 결합하는 프로브 ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO: 9), 및 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 오픈 리딩 프레임 내에 결합하는 프로브 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO: 10). 그 다음에 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 발현하는 한 배 새끼를 낳기 위해서 양성 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하였다.
대안으로, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포를 표적화 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션한다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 리컴비나제를 발현하는 마우스와 교배시킴으로써 제거한다 (예를 들어, 제US 6,774,279호). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 유지된다.
재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 표적화 벡터 (도 2). 유사한 방식으로, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 영역을 발현하는 조작된 경쇄 자리를, 5'에서 3'으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻어진 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 5'에서 서열을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 인간 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임, 인간 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻어진 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 3'에서 서열을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하는 표적화 구조를 사용하여 만들었다 (도 2, 중앙). 조작된 인간 Vκ3-20Jκ1 자리의 서열은 SEQ ID NO: 11에서 나타난다.
재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 영역의 BAC DNA로의 표적화된 삽입을 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 내 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로 확인하였다. 간단히 말하면, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 3'에서 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F (SEQ ID NO: 2) 및 ULC-m1R (SEQ ID NO: 3)로 확인하였다. 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO: 12) 및 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO: 13)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (SEQ ID NO: 6) 및 neoR (SEQ ID NO: 7)로 확인하였다. 그 다음에 재배열된 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 경쇄를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위해 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 생성된 변형된 ES 세포로 전기천공하였다.
양성 ES 세포 클론을 TAQMAN™ 스크리닝 및 내인성 κ 경쇄 자리로 삽입된 조작된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석으로 확인하였다. 간단히 말하면, 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하는 프로브 neoP (SEQ ID NO: 8), 마우스 Vκ3-7 선도 서열 내에 결합하는 프로브 ULC-m1P (SEQ ID NO: 9), 및 인간 Vκ3-20Jκ1 오픈 리딩 프레임 내에 결합하는 프로브 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO: 14). 그 다음에 양성 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하였다. 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 발현하는 한 배 새끼.
대안으로, 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포를 표적화 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션할 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 리컴비나제를 발현하는 마우스와 교배시킴으로써 제거한다 (예를 들어, 제US 6,774,279호). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 유지된다.
재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 표적화 벡터 (도 3). 유사한 방식으로, 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 영역을 발현하는 조작된 경쇄 자리를, 5'에서 3'으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻어진 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 5'에서 서열을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 인간 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 영역의 오픈 리딩 프레임, 인간 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻어진 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 3'에서 서열을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하는 표적화 구조를 사용하여 만들었다 (도 3, 중앙). 조작된 인간 VpreBJλ5 자리의 서열은 SEQ ID NO: 15에서 나타난다.
재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 영역의 BAC DNA로의 표적화된 삽입을 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 영역 경쇄 영역 내 서열에 위치한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로 확인하였다. 간단히 말하면, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 3'에서 인트론 서열을 프라이머 ULC-m1F (SEQ ID NO: 2) 및 ULC-m1R (SEQ ID NO: 3)로 확인하였다. 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머s 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO: 16) 및 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO: 17)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (SEQ ID NO: 6) 및 neoR (SEQ ID NO: 7)로 확인하였다. 그 다음에 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 경쇄를 발현하는 키메라 마우스를 생성하기 위해 표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 ES 세포를 생성된 변형된 ES 세포로 전기천공하였다.
양성 ES 세포 클론을 TAQMAN™ 스크리닝 및 내인성 κ 경쇄 자리로 삽입된 조작된 VpreBJλ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하는 염색체 분석으로 확인하였다. 간단히 말하면, 네오마이신 마커 유전자 내에서 결합하는 프로브 neoP (SEQ ID NO: 8), 마우스 IgVκ3-7 선도 서열 내에 결합하는 프로브 ULC-m1P (SEQ ID NO: 9), 및 인간 VpreBJλ5 오픈 리딩 프레임 내에 결합하는 프로브 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO: 18). 그 다음에 인간 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 발현하는 한 배 새끼를 낳기 위해 양성 ES 세포 클론을 사용하여 암컷 마우스에 이식하였다.
대안으로, 재배열된 인간 생식세포 계열 VpreBJλ5 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포를 표적화 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션한다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 리컴비나제를 발현하는 마우스와 교배시킴으로써 제거한다 (예를 들어, 제US 6,774,279호). 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 유지된다.
실시예 3
단일 재배열된 인간 경쇄를 발현하는 마우스의 발생
상기 설명된 표적화된 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용하였고 VELOCIMOUSE® 방법으로 8-세포 단계 마우스 배아로 도입하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,294,754호 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1): 91-99를 참고하면 된다). 조작된 인간 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역, Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 또는 VpreBJλ5 경쇄 영역을 함유하는 VELOCIMOUSE®을 독특한 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역의 존재를 검출하는 대립유전자 검정 (Valenzuela et al, 상기)의 변형을 사용하여 유전자형 분석으로 확인한다.
새끼들을 유전자형 분석하고 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역의 발현의 특성화를 위해 독특한 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역에 이형 접합성 또는 동형 접합성인 새끼들을 선택한다.
유동 세포 분석법. 공통 경쇄 마우스의 정상 항체 레퍼토리에서 재배열된 인간 경쇄 영역의 발현을 공통 경쇄 마우스의 비장 세포 및 말초 혈액에서 면역글로불린 κ 및 λ 발현의 분석으로 인증하였다. 야생형 (n=5), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 이형 접합체 (n=3), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형 접합체 (n=3), Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 이형 접합체 (n=2), 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형 접합체 (n=2) 마우스의 수확된 비장 및 말초 혈액의 세포 현탁액을 표준 방법을 사용하여 만들었고 형광 표지된 항체 (BD Pharmigen)을 사용하여 CD19+, Igλ+ 및 Igκ+로 염색하였다.
간단히 말하면, 1x1O6개의 세포를 항-마우스 CD16/CD32 (클론 2.4G2, BD Pharmigen)와 함께 얼음 위에서 10분 동안 배양한 후, 이어서 다음 항체 칵테일로 얼음 위에서 30분 동안 표지하였다: APC 컨쥬게이션된(conjugated) 항-마우스 CD19 (클론 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 컨쥬게이션된 항-마우스 CD3 (클론 17A2, BioLegend), FITC 컨쥬게이션된 항-마우스 Igλκ (클론 187.1, BD Pharmigen), PE 컨쥬게이션된 항-마우스 Igλ (클론 RML-42, BioLegend). 염색 후, 세포를 세척하였고 2% 포름알데히드로 고정하였다. 데이터 취득을 LSRII 유동 세포 분석기에서 수행하였고 FlowJo로 분석하였다. 게이팅(Gating): 전체 B 세포 (CD19+CD3-), Igκ+ B 세포 (Igκ+Igλ-CD19+CD3-), Igλ+ B 세포 (Igκ-Igλ+CD19+CD3-). 혈액 및 비장 세포 샘플에서 모아진 데이터는 유사한 결과를 입증하였다. 표 3은 Igλ+, Igκ+, 또는 Igλ+Igκ+인 각 군에서 한 마리의 대표 마우스의 말초 혈액의 퍼센트 양성 CD19+ B 세포를 제시한다. 야생형 (WT) 및 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄에 대하여 동형 접합성인 마우스의 말초 혈액에서 CD19+ B 세포의 퍼센트는 도 4에서 나타난다.
표 3
마우스 CD19+ B 세포
Igλ+ Igκ+ Igλ+Igκ+
야생형 4.8 93 0.53
Vκ1-39Jκ5 1.4 93 2.6
Vκ3-20Jκ1 4.2 88 6
공통 경쇄 발현.
각 공통 경쇄 (Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1)의 발현을 정량적 PCR 검정 (예를 들어 TAQMAN™)을 사용하여 이형 접합성 및 동형 접합성 마우스에서 분석하였다.
간단히 말하면, CD19+ B 세포를 제조사의 설명서에 따라 마우스 CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec)를 사용하여 야생형, 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 자리의 해당 인간 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 자리 (Hκ)로의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스, 뿐만 아니라 각 재배열된 인간 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1)에 대하여 동형 접합성 및 이형 접합성인 마우스의 비장으로부터 정제하였다. 전체 RNA를 제조사의 설명에 따라 RNeasy Mini 키트 (Qiagen)를 사용하여 CD19+ B 세포로부터 정제하였고 게놈 RNA를 RNase-free DNase 온-컬럼(on-column) 처리 (Qiagen)를 사용하여 제거하였다. 200 ng mRNA를 First Stand cDNA Synthesis kit (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사하였고 결과의 cDNA를 Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 증폭하였다. 모든 반응을 (1) 두 개의 공통 경쇄에 대한 Vκ-Jκ 접합, (2) Vκ 유전자 단독 (즉 Vκ1-39 및 Vκ3-20), 및 (3) 마우스 Cκ 영역을 스패닝(spanning)하는 프라이머 및 Taqman MGB 프로브를 사용하는 ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 표 4는 이 검정에 이용된 프라이머 및 프로브의 서열을 제시한다. 상대적 발현을 마우스 Cκ 영역의 발현에 대하여 표준화하였다. 결과는 도 5A, 5B 및 5C에서 나타난다.
표 4
영역 프라이머/프로브 설명 (5'-3') SEQ ID NOs:
Vκ1-39Jκ5 접합 (센스) AGCAGTCTGC AACCTGAAGA TTT
(안티-센스) GTTTAATCTC CAGTCGTGTC CCTT
(프로브) CCTCCGATCA CCTTC		 19
20
21
Vκ1-39 (센스) AAACCAGGGA AAGCCCCTAA
(안티-센스) ATGGGACCCC ACTTTGCA
(프로브) CTCCTGATCT ATGCTGCAT		 22
23
24
Vκ3-20Jκ1 접합 (센스) CAGCAGACTG GAGCCTGAAG A
(안티-센스) TGATTTCCAC CTTGGTCCCT T
(프로브) TAGCTCACCT TGGACGTT		 25
26
27
Vκ3-20 (센스) CTCCTCATCT ATGGTGCATC CA
(안티-센스) GACCCACTGC CACTGAACCT
(프로브) CCACTGGCAT CCC		 28
29
30
마우스 Ck (센스) TGAGCAGCAC CCTCACGTT
(안티-센스) GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTT
(프로브) ACCAAGGACG AGTATGAA		 31
32
33
항원 특이적 공통 경쇄 항체. 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에서 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄를 함유하는 공통 경쇄 마우스를 β-갈락토시다제로 면역화하였고 항체 역가를 측정하였다.
간단히 말하면, 제조사의 지시에 따라, β-갈락토시다제 (Sigma)를 titermax 보조제 (Sigma)에서 에멀젼화하였다. 야생형 (n=7), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형 접합체 (n=2) 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형 접합체 (n=5)를 100 μg β-갈락토시다제/Titermax로의 피하 주사로 면역화하였다. 마우스를, 3주 간격으로, 두 번의 50 μg β-갈락토시다제/Titermax의 피하 주사로 촉진하였다.제2 촉진 후, 혈액을 제조사의 지시에 따라 레트로-오비탈(retro-orbital) 채혈법을 사용하여 마취된 마우스로부터 혈청 분리기 튜브 (BD Biosciences)로 수거하였다. 항-β-갈락토시다제 IgM 또는 IgG 항체를 측정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc)를 1 μg/mL β-갈락토시다제로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 과도한 항원을 상온에서 한 시간 동안 1% BSA가 들어있는 PBS로 차단하기 전에 씻어냈다. 혈청의 단계 희석액을 플레이트에 추가하였고 세척 전에 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 다음에 플레이트를 HRP 컨쥬게이션된 항-IgM (Southern Biotech) 또는 항-IgG (Southern Biotech)와 함께 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 또 다른 세척 후, 플레이트를 TMB 기질 (BD Biosciences)로 발달시켰다. 반응을 1N 황산으로 중단하였고 OD450을 Victor X5 Plate Reader (Perkin Elmer)를 사용하여 판독하였다. 데이터를 GraphPad Prism을 사용하여 분석하였고 신호를 배경보다 2배 더 높은 혈청의 희석액으로서 계산하였다. 결과는 도 6A 및 6B에서 나타난다.
이 실시예에서 나타난 바와 같이, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 마우스의 비장 및 말초 구획 둘 다에서 κ/λ B 세포의 비율은 거의 야생형 패턴을 입증하였다 (표 3 및 4). 하지만, VpreBJλ5 공통 경쇄 마우스는 소수의 말초 B 세포 중 약 1-2%가 조작된 인간 경쇄 영역을 발현한다는 것을 입증하였다 (데이터 미도시). 내인성 κ 경쇄 자리으로부터 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 재배열된 인간 경쇄 영역의 발현 수준은 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로의 완벽한 대체를 함유하는 내인성 κ 경쇄 자리와 비교하여 증가하였다 (도 5A, 5B 및 5C). VpreBJλ5 재배열된 인간 경쇄 영역의 발현 수준은 이형 접합성 및 동형 접합성 마우스 둘 다에서 내인성 κ 경쇄 자리의 유사한 높은 발현을 입증하였다 (데이터 미도시). 이것은, 마우스 λ, κ, 또는 두 개의 내인성 경쇄 자리와의 직접적인 경쟁에서, 단일 재배열된 인간 VL/JL 서열이 내인성 κ 경쇄 자리로부터 야생형 수준 발현보다 더 많이 수득할 수 있고 정상적인 비장 및 혈액 B 세포 빈도를 발생시킨다. 게다가, 인간 Vκ1-39Jκ5 또는 인간 Vκ3-20Jκ1 서열을 갖는 조작된 κ 경쇄 자리의 존재는 마우스에 의해 허용되었고 면역 반응의 체액 구성요소에서 경쇄 레퍼토리의 실질적인 부분을 나타냄으로써 야생형 방식에서 기능하는 것으로 나타난다 (도 6A 및 6B).
실시예 4
단일 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄를 발현하는 마우스의 교배
이 실시예는 다수의 유전적으로 변형된 면역글로불린 자리가 있는 다수의 유전적으로 변형된 마우스 마우스 계통을 생성하기 위해 본원에서 설명된 공통 경쇄 마우스 중 어느 하나와 교배될 수 있는 여러 다른 유전적으로 변형된 마우스 계통을 설명한다.
내인성 Igκ 넉아웃(knockout) (KO). 조작된 경쇄 자리의 사용량을 최적화하기 위해, 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역 중 하나를 함유하는 마우스를 내인성 λ 경쇄 자리의 결실을 함유하는 또 다른 마우스와 교배한다. 이 방식으로, 얻어진 자손은, 그것들의 유일한 경쇄로서, 실시예 2에서 설명된 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역을 발현할 것이다. 교배를 업계에서 인식된 표준 기술로 및, 대안으로, 상업적 사육사 (예를 들어, The Jackson Laboratory)에 의해 수행한다. 조작된 경쇄 자리 및 내인성 λ 경쇄 자리의 결실을 함유하는 마우스 계통을 새로운 경쇄 영역의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대하여 스크리닝한다.
인간화된 내인성 중쇄 자리. 조작된 인간 생식세포 계열 경쇄 자리를 함유하는 마우스를 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 자리의 인간 중쇄 가변 유전자 자리로의 대체를 함유하는 마우스와 교배한다 (US 6,596,541; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.를 참고하면 된다). VELOCIMMUNE® 마우스는 마우스가 항원 자극에 반응하여 인간 중쇄 가변 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하도록 내인성 마우스 불변 영역 자리에 작동 가능하게 결합된 인간 중쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 포함한다. 항체의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 인간 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 결합시킨다. 그 다음에 DNA를 항체의 완전한 인간 중쇄를 발현할 수 있는 세포에서 발현시킨다.
내인성 마우스 VH 자리의 인간 VH 자리로의 대체 및 내인성 κ 경쇄 자리에서 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 VL 영역을 함유하는 마우스를 얻는다. 단일 인간 경쇄 (인간 VL 및 마우스 CL)와 함께 체세포 돌연변이된 중쇄 (인간 VH 및 마우스 CH)를 함유하는 역방향 키메라 항체를 원하는 항원으로 면역화에서 얻는다. 항체를 발현하는 B 세포의 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열을 확인하고 완전한 인간 항체를 적합한 발현 시스템에서 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열의 인간 CH 및 CL 뉴클레오티드 서열로의 융합으로 만든다.
실시예 5
인간 중쇄 및 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역을 발현하는 마우스의 항체의 생성
조작된 인간 경쇄 영역을 함유하는 마우스를 다른 내인성 Igλ 자리의 변형 및 결실을 함유하는 다양한 원하는 계통과 교배한 후 (실시예 4에서 설명된 바와 같음), 선택된 마우스를 원하는 항원으로 면역화할 수 있다.
일반적으로, 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역 중 하나를 함유하는 VELOCIMMUNE® 마우스는 항원으로 시도되고, 림프 세포 (예를 들어, B-세포)를 동물의 혈청으로부터 회수한다. 림프 세포를 골수종 세포주와 융합하여 불멸 히브리도마 세포주를 제조하고, 인간 중쇄 가변 및 면역화에 사용된 항원에 특이적인 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄를 함유하는 항체를 생산하는 히브리도마 세포주를 확인하기 위해 이러한 히브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 중쇄 및 경쇄의 바람직한 이소타입 불변 영역에 결합시킨다. 내인성 마우스 서열 및 내인성 자리에 존재하는 어떤 추가적인 씨스(cis)-작용 요소의 존재로 인해, 각 항체의 단일 경쇄는 체세포 돌연변이될 수도 있다. 이것은 단일 경쇄 및 다양한 중쇄 서열을 포함하는 항원-특이적 레퍼토리에 추가적인 다양성을 추가한다. 그 후에 결과의 클로닝된 항체 서열을 CHO 세포와 같은 세포에서 발현시킨다. 대안으로, 항원-특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원-특이적 림프구로부터 직접 확인한다.
처음에는, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고 친화도 키메라 항체를 분리한다. 상기 설명된 바와 같이, 항체를 친화도, 선택성, 에피토프, 등을 포함하는 원하는 특성에 대하여 특성화하고 선택한다. 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 재배열된 인간 생식세포 계열 경쇄 영역으로부터 유래된 체세포 돌연변이된 인간 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 완전한 인간 항체를 생성한다. 적합한 인간 불변 영역은, 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 포함한다.
내인성 마우스 중쇄 자리의 인간 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트로의 대체 및 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 조작된 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 인간 경쇄 영역 또는 조작된 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 인간 경쇄 영역으로의 대체를 함유하는 VELOCIMMUNE® 마우스의 별개의 코호트(cohort) (상기 설명됨)를 인간 세포-표면 수용체 단백질 (항원 E)로 면역화한다. 항원 E를 3-4일 마다 여섯 번의 연이은 주사로 마우스의 뒷 발바닥에 직접 투여한다. 주사 전에 2 내지 3 마이크로그램의 항원 E를 10 μg의 CpG 올리고뉴클레오티드 (제품 번호 tlrl-modn-ODN1826 올리고뉴클레오티드; InVivogen, San Diego, CA) 및 25 μg의 Adju-Phos (인산 알루미늄 겔 보조제, 제품 번호 H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)와 혼합한다. 총 여섯 번의 주사가 최종 항원 회수 전에 제공되는데, 이것은 희생 전 3-5일에 제공된다. 제4 및 제6 주사 후 혈액을 수거하고 항체 면역 반응을 표준 항원-특이적 면역 검정으로 관찰한다.
원하는 항원 반응을 달성할 때 비장 세포를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합하여 그것들의 생존력을 보존하고 히브리도마 세포주를 형성한다. 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해 히브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택한다. 이 기술을 사용하여 여러 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 (즉, 인간 중쇄 가변 도메인, 같은 인간 경쇄 가변 도메인, 및 마우스 불변 도메인을 소유하는 항체)를 얻는다.
대안으로, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 골수종 세포에 융합하지 않고 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 분리하였으며, U.S. 2007/0280945 A1에서 설명된 바와 같고, 그 전문이 본원에서 특이적으로 포함된다. 이 방법을 사용하여, 여러 완전한 인간 항-항원 E 공통 경쇄 항체 (즉, 인간 중쇄 가변 도메인, 조작된 인간 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 조작된 인간 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역, 및 인간 불변 도메인을 소유하는 항체)를 얻었다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 생물학적 성질은 하기 제시된 섹션에서 상세히 설명된다.
실시예 6
항원-특이적 공통 경쇄 항체에서 중쇄 유전자 세그먼트 사용량
생산된 인간 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 구조를 분석하기 위해서, 중쇄 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산을 클로닝하고 시퀀싱하였다. 항체의 핵산 서열 및 예측된 아미노산 서열로부터, 유전자 사용량을 조작된 인간 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 조작된 인간 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 함유하는 면역화된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 얻어진 선택된 공통 경쇄 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR)에 대하여 확인하였다. 결과는 표 5 및 6에서 나타나는데, 이것은 본 발명에 따르는 마우스가 단지 인간 Vκ1-39-또는 인간 Vκ3-20-유래된 경쇄로부터 경쇄를 발현하는 마우스를 이용할 때, 다양한 재배열로 인해, 다양한 인간 중쇄 유전자 세그먼트로부터 항원-특이적 공통 경쇄 항체를 생성한다는 것을 입증한다. 2, 3, 4, 및 5개의 과의 인간 VH 유전자 세그먼트는 항원-특이적 항체를 수득하기 위해 다양한 인간 DH 세그먼트 및 인간 JH 세그먼트로 재배열하였다.
표 5
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 HCVR 항체 HCVR
VH DH JH VH DH JH
2952 2-5 6-6 1 6030 3-30 6-6 5
5978 2-5 6-6 1 6032 3-30 6-6 5
5981 2-5 3-22 1 2985 3-30 6-13 4
6027 3-13 6-6 5 2997 3-30 6-13 4
3022 3-23 3-10 4 3011 3-30 6-13 4
3028 3-23 3-3 4 3047 3-30 6-13 4
5999 3-23 6-6 4 5982 3-30 6-13 4
6009 3-23 2-8 4 6002 3-30 6-13 4
6011 3-23 7-27 4 6003 3-30 6-13 4
5980 3-30 1-1 4 6012 3-30 6-13 4
3014 3-30 1-7 4 6013 3-30 6-13 4
3015 3-30 1-7 4 6014 3-30 6-13 4
3023 3-30 1-7 4 6015 3-30 6-13 4
3024 3-30 1-7 4 6016 3-30 6-13 4
3032 3-30 1-7 4 6017 3-30 6-13 4
6024 3-30 1-7 4 6020 3-30 6-13 4
6025 3-30 1-7 4 6034 3-30 6-13 4
6031 3-30 1-7 4 2948 3-30 7-27 4
6007 3-30 3-3 4 2987 3-30 7-27 4
2982 3-30 3-22 5 2996 3-30 7-27 4
6001 3-30 3-22 5 3005 3-30 7-27 4
6005 3-30 3-22 5 3012 3-30 7-27 4
6035 3-30 5-5 2 3020 3-30 7-27 4
3013 3-30 5-12 4 3021 3-30 7-27 4
3042 3-30 5-12 4 3025 3-30 7-27 4
2955 3-30 6-6 1 3030 3-30 7-27 4
3043 3-30 6-6 3 3036 3-30 7-27 4
3018 3-30 6-6 4 5997 3-30 7-27 4
2949 3-30 6-6 5 6033 3-30 7-27 4
2950 3-30 6-6 5 3004 3-30 7-27 5
2954 3-30 6-6 5 6028 3-30 7-27 6
2978 3-30 6-6 5 3010 4-59 3-16 3
3016 3-30 6-6 5 3019 4-59 3-16 3
3017 3-30 6-6 5 6018 4-59 3-16 3
3033 3-30 6-6 5 6026 4-59 3-16 3
3041 3-30 6-6 5 6029 4-59 3-16 3
5979 3-30 6-6 5 6036 4-59 3-16 3
5998 3-30 6-6 5 6037 4-59 3-16 3
6004 3-30 6-6 5 2964 4-59 3-22 3
6010 3-30 6-6 5 3027 4-59 3-16 4
6019 3-30 6-6 5 3046 5-51 5-5 3
6021 3-30 6-6 5 6000 1-69 6-13 4
6022 3-30 6-6 5 6006 1-69 6-6 5
6023 3-30 6-6 5 6008 1-69 6-13 4
표 6
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 HCVR 항체 HCVR
VH DH JH VH DH JH
5989 3-30 3-3 3 5992 4-39 1-26 3
5994 3-33 1-7 4 2975 5-51 6-13 5
5985 3-33 2-15 4 2972 5-51 3-16 6
5987 3-33 2-15 4 5986 5-51 3-16 6
5995 3-33 2-15 4 5993 5-51 3-16 6
2968 4-39 1-26 3 5996 5-51 3-16 6
5988 4-39 1-26 3 5984 3-53 1-1 4
5990 4-39 1-26 3
실시예 7
LUMINEX™ 검정에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 차단 능력의 결정
항원 E에 대하여 발생한 98개의 인간 공통 경쇄 항체를 비드-기반 검정으로 항원 E의 천연 리간드 (리간드 Y)의 항원 E로의 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다.
항원 E의 세포 외 도메인 (ECD)은 두 개의 myc 에피토프 태그 및 6X 히스티딘 태그 (항원 E-mmH)에 컨쥬게이션되었고 MES 버퍼에서 20 μg/mL의 농도로 카르복실화된 미소구체에 아민-커플링되었다. 혼합물을 상온에서 두 시간 동안 배양한 후 이어서 1M Tris pH 8.0로 비드 비활성화한 후 이어서 0.05 부피% Tween-20이 들어있는 PBS로 세척하였다. 그 다음에 비드를 2 중량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서, 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:15로 희석하였다.
항체 상층액에 대하여 같은 배지 구성요소와 함께 목(mock) 상층액을 함유하는 음성 대조군을 제조하였다. 항원 E-표지된 비드를 상층액에 추가하였고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 비오티닐화된-리간드 Y 단백질을 최종 농도 0.06 nM으로 추가하였고 상온에서 두 시간 동안 배양하였다. 항원 E-myc-myc-6His 표지된 비드에 결합된 비오티닐화된-리간드 Y 단백질의 검출을 스트렙타비딘 (Moss Inc, Pasadena, MD)에 컨쥬게이션된 R-피코에리트린으로 결정한 후 이어서 LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기에서 측정하였다. 리간드 Y가 없는 샘플의 배경 평균 형광 강도 (MFI)를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱한 후 100에서 결과의 값을 뺌으로써 계산하였다.
유사한 실험에서, 항원 E에 대하여 발생한 같은 98개의 인간 공통 경쇄 항체를 항원 E의 리간드 Y-표지된 비드로의 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다.
간단히 말하면, 리간드 Y를 MES 버퍼에서 희석된 20 μg/ml의 농도로 카르복실화된 미소구체에 아민-커플링시켰다. 혼합물을 상온에서 두 시간 배양한 후 이어서 1M Tris pH 8로 비드를 비활성화시킨 다음에 0.05 부피% Tween-20이 들어있는 PBS로 세척하였다. 그 다음에 비드를 2 중량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서, 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:15로 희석하였다. 항체 상층액에 대하여 같은 배지 구성요소와 함께 목 상층액을 함유하는 음성 대조군을 제조하였다. 비오티닐화된-항원 E-mmH를 0.42 nM의 최종 농도로 추가하였고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음에 리간드 Y-표지된 비드를 항체/항원 E 혼합물에 추가하였고 상온에서 두 시간 동안 배양하였다. 리간드 Y-비드에 결합된 비오티닐화된-항원 E-mmH를 스트렙타비딘 (Moss Inc, Pasadena, MD)에 컨쥬게이션된 R-피코에리트린으로 결정한 후 이어서 LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기에서 측정하였다. 항원 E가 없는 샘플의 배경 평균 형광 강도 (MFI)를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱한 후 100에서 결과의 값을 뺌으로써 계산하였다.
표 7 및 8은 두 번의 LUMINEX™ 검정에서 테스트된 98개의 항-항원 E 공통 경쇄 항체 모두에 대한 퍼센트 차단을 나타낸다. ND: 현재 실험 조건 하에서 미결정됨.
표 7
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 항원 E-표지된
비드의 % 차단		 용액 중 항원 E의
% 차단
2948 81.1 47.8
2948G 38.6 ND
2949 97.6 78.8
2949G 97.1 73.7
2950 96.2 81.9
2950G 89.8 31.4
2952 96.1 74.3
2952G 93.5 39.9
2954 93.7 70.1
2954G 91.7 30.1
2955 75.8 30.0
2955G 71.8 ND
2964 92.1 31.4
2964G 94.6 43.0
2978 98.0 95.1
2978G 13.9 94.1
2982 92.8 78.5
2982G 41.9 52.4
2985 39.5 31.2
2985G 2.0 5.0
2987 81.7 67.8
2987G 26.6 29.3
2996 87.3 55.3
2996G 95.9 38.4
2997 93.4 70.6
2997G 9.7 7.5
3004 79.0 48.4
3004G 60.3 40.7
3005 97.4 93.5
3005G 77.5 75.6
3010 98.0 82.6
3010G 97.9 81.0
3011 87.4 42.8
3011G 83.5 41.7
3012 91.0 60.8
3012G 52.4 16.8
3013 80.3 65.8
3013G 17.5 15.4
3014 63.4 20.7
3014G 74.4 28.5
3015 89.1 55.7
3015G 58.8 17.3
3016 97.1 81.6
3016G 93.1 66.4
3017 94.8 70.2
3017G 87.9 40.8
3018 85.4 54.0
3018G 26.1 12.7
3019 99.3 92.4
3019G 99.3 88.1
3020 96.7 90.3
3020G 85.2 41.5
3021 74.5 26.1
3021G 81.1 27.4
3022 65.2 17.6
3022G 67.2 9.1
3023 71.4 28.5
3023G 73.8 29.7
3024 73.9 32.6
3024G 89.0 10.0
3025 70.7 15.6
3025G 76.7 24.3
3027 96.2 61.6
3027G 98.6 75.3
3028 92.4 29.0
3028G 87.3 28.8
3030 6.0 10.6
3030G 41.3 14.2
3032 76.5 31.4
3032G 17.7 11.0
3033 98.2 86.1
3033G 93.6 64.0
3036 74.7 32.7
3036G 90.1 51.2
3041 95.3 75.9
3041G 92.4 51.6
3042 88.1 73.3
3042G 60.9 25.2
3043 90.8 65.8
3043G 92.8 60.3
표 8
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 항원 E-표지된
비드의 % 차단		 용액 중 항원 E의
% 차단
2968 97.1 73.3
2968G 67.1 14.6
2969 51.7 20.3
2969G 37.2 16.5
2970 92.2 34.2
2970G 92.7 27.2
2971 23.4 11.6
2971G 18.8 18.9
2972 67.1 38.8
2972G 64.5 39.2
2973 77.7 27.0
2973G 51.1 20.7
2974 57.8 12.4
2974G 69.9 17.6
2975 49.4 18.2
2975G 32.0 19.5
2976 1.0 1.0
2976G 50.4 20.4
상기 설명된 제1 LUMINEX™ 실험에서, Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는 80개의 공통 경쇄 항체를 항원-E 표지된 비드에 대한 리간드 Y 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다. 이 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 68개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 12개는 <50% 차단 (25-50% 차단에서 6개 및 <25% 차단에서 6개)을 입증하였다. Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 12개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 6개는 항원 E-표지된 비드에 대한 리간드 Y 결합의 <50% 차단 (25-50% 차단에서 3개 및 <25% 차단에서 3개)을 입증하였다.
상기 설명된 제2 LUMINEX™ 실험에서, Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는 같은 80개의 공통 경쇄 항체를 리간드 Y-표지된 비드에 대한 항원 E의 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다. 이 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 36개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 44개는 <50% 차단 (25-50% 차단에서 27개 및 <25% 차단에서 17개)을 입증하였다. Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 1개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 17개는 리간드 Y-표지된 비드에 대한 항원 E 결합의 <50% 차단 (25-50% 차단에서 5개 및 <25% 차단에서 12개)를 입증하였다.
표 7 및 8의 데이터는 표 5 및 6에서 설명된 재배열이 다양한 정도의 효능으로 리간드 Y의 그것의 동족 수용체 항원 E로의 결합을 차단하는 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 생성하였으며, 이것은 항원 E에 관하여 중복 및 비-중복 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함하는 표 5 및 6의 항-항원 E 공통 경쇄 항체와 일치한다는 것을 확립한다.
실시예 8
ELISA에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 차단 능력의 결정
항원 E에 대하여 발생한 인간 공통 경쇄 항체를 ELISA 검정에서 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다.
리간드 Y를 PBS에서 희석된 2 μg/mL의 농도로 96-웰 플레이트에서 코팅하였고 하룻밤 동안 배양한 후 이어서 0.05% Tween-20이 들어있는 PBS로 네 번 세척하였다. 그 다음에 플레이트를 0.5 중량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 상온에서 한 시간 동안 차단하였다. 별도의 플레이트에서, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:10으로 희석하였다. 항체의 같은 구성요소를 갖는 목 상층액을 음성 대조군으로서 사용하였다. 항원 E-mmH (상기 설명됨)를 0.150 nM의 최종 농도로 추가하였고 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 그 다음에 항체/항원 E-mmH 혼합물을 리간드 Y를 함유하는 플레이트에 추가하였고 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 리간드 Y에 결합된 항원 E-mmH의 검출을 항-펜타-His 항체 (Qiagen, Valencia, CA)에 컨쥬게이션된 Horse-Radish Peroxidase (HRP)로 결정하였고 황산에 의해 중화된 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하는 표준 비색 반응에 의해 발달시켰다. 흡광도를 OD450에서 0.1초 동안 판독하였다. 항원 E가 없는 샘플의 배경 흡광도를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱한 후 100에서 결과의 값을 뺌으로써 계산하였다.
표 9 및 10은 ELISA 검정에서 테스트된 98개의 항-항원 E 공통 경쇄 항체 모두에 대한 퍼센트 차단을 나타낸다. ND: 현재 실험 조건 하에서 미결정됨.
표 9
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 용액 중 항원 E의
% 차단		 항체 용액 중 항원 E의
% 차단
2948 21.8 3015 23.7
2948G 22.9 3015G 10.2
2949 79.5 3016 78.1
2949G 71.5 3016G 37.4
2950 80.4 3017 61.6
2950G 30.9 3017G 25.2
2952 66.9 3018 40.6
2952G 47.3 3018G 14.5
2954 55.9 3019 94.6
2954G 44.7 3019G 92.3
2955 12.1 3020 80.8
2955G 25.6 3020G ND
2964 34.8 3021 7.6
2964G 47.7 3021G 20.7
2978 90.0 3022 2.4
2978G 90.2 3022G 15.0
2982 59.0 3023 9.1
2982G 20.4 3023G 19.2
2985 10.5 3024 7.5
2985G ND 3024G 15.2
2987 31.4 3025 ND
2987G ND 3025G 13.9
2996 29.3 3027 61.4
2996G ND 3027G 82.7
2997 48.7 3028 40.3
2997G ND 3028G 12.3
3004 16.7 3030 ND
3004G 3.5 3030G 9.5
3005 87.2 3032 ND
3005G 54.3 3032G 13.1
3010 74.5 3033 77.1
3010G 84.6 3033G 32.9
3011 19.4 3036 17.6
3011G ND 3036G 24.6
3012 45.0 3041 59.3
3012G 12.6 3041G 30.7
3013 39.0 3042 39.9
3013G 9.6 3042G 16.1
3014 5.2 3043 57.4
3014G 17.1 3043G 46.1
표 10
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 용액 중 항원 E의
% 차단		 항체 용액 중 항원 E의
% 차단
2968 68.9 2972G 35.7
2968G 15.2 2973 20.7
2969 10.1 2973G 23.1
2969G 23.6 2974 ND
2970 34.3 2974G 22.0
2970G 41.3 2975 8.7
2971 6.3 2975G 19.2
2971G 27.1 2976 4.6
2972 9.6 2976G 26.7
이 실시예에서 설명된 바와 같이, 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트된 Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는 80개의 공통 경쇄 항체 중에서, 22개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 58개는 <50% 차단 (25-50% 차단에서 20개 및 <25% 차단에서 38개)을 입증하였다. Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 하나는 >50% 차단을 입증하는 한편, 17개는 리간드 Y-코팅된 표면에 대한 항원 E 결합의 <50% 차단 (25-50% 차단에서 5개 및 <25% 차단에서 12개)을 입증하였다. 이 결과들은 또한 항원 E에 관하여 중복 및 비-중복 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함하는 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 풀과 일치한다.
실시예 9
항원-특이적 공통 경쇄 항체에 대한 BIACORE™ 친화도 결정
선택된 항체 상층액에 대한 평형 해리 상수 (KD)를 BIACORE™ TWO 기구 (GE Healthcare)를 사용하여 SPR (표면 플라스몬 공명)에 의해 결정하였다. 모든 데이터를 25℃에서 러닝(running) 버퍼 및 샘플 버퍼 둘 다로 HBS-EP (1OmM Hepes, 150mM NaCl, 0.3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)를 사용하여 얻었다. 항체를 표준 아민 커플링 화학법을 사용하여 고 밀도의 항-인간 Fc 항체로 이전에 유래된 CM5 센서 CH1p 표면 상의 미가공 상층액 샘플로부터 캡쳐하였다. 캡쳐 단계 중에, 상층액을 총 3분 동안 3 μL/분의 유속으로 항-인간 Fc 표면에 걸쳐 주사하였다. 캡쳐 단계는 35 μL/분의 유속으로 2분 동안 100 nM의 농도로 러닝 버퍼 또는 분석물의 주사로 이어졌다. 캡쳐된 항체로부터 항원의 해리를 6분 동안 관찰하였다. 캡쳐된 항체를 10 mM 글리신, pH 1.5의 간략한 주사로 제거하였다. 모든 센서그램(sensorgram)을 분석물 센서그램에서 버퍼 주사의 센서그램을 뺌으로써 이중 참고하였고, 이로 인해 캡쳐 표면으로부터 항체의 해리에 의해 유발된 인공물을 제거한다. 각 항체에 대한 결합 데이터는 BIAcore T100 Evaluation 소프트웨어 v2.1을 사용하는 대량 수송으로 1:1 결합 모델에 맞춰진다. 결과는 표 11 및 12에서 나타난다.
표 11
Vκ1-39Jκ5
공통 경쇄 항체
항체 100 nM 항원 E 항체 100 nM 항원 E
KD (nM) T1/2 (분) KD (nM) T1/2 (분)
2948 8.83 28 3015 29.1 11
2948G 95.0 1 3015G 65.9 0
2949 3.57 18 3016 4.99 17
2949G 6.37 9 3016G 18.9 4
2950 4.91 17 3017 9.83 8
2950G 13.6 5 3017G 55.4 2
2952 6.25 7 3018 11.3 36
2952G 7.16 4 3018G 32.5 3
2954 2.37 24 3019 1.54 59
2954G 5.30 9 3019G 2.29 42
2955 14.4 6 3020 5.41 39
2955G 12.0 4 3020G 41.9 6
2964 14.8 6 3021 50.1 6
2964G 13.0 9 3021G 26.8 4
2978 1.91 49 3022 25.7 17
2978G 1.80 58 3022G 20.8 12
2982 6.41 19 3023 263 9
2982G 16.3 9 3023G 103 5
2985 64.4 9 3024 58.8 7
2985G 2.44 8 3024G 7.09 10
2987 21.0 11 3025 35.2 6
2987G 37.6 4 3025G 42.5 8
2996 10.8 9 3027 7.15 6
2996G 24.0 2 3027G 4.24 18
2997 7.75 19 3028 6.89 37
2997G 151 1 3028G 7.23 22
3004 46.5 14 3030 46.2 7
3004G 1.93 91 3030G 128 3
3005 2.35 108 3032 53.2 9
3005G 6.96 27 3032G 13.0 1
3010 4.13 26 3033 4.61 17
3010G 2.10 49 3033G 12.0 5
3011 59.1 5 3036 284 12
3011G 41.7 5 3036G 18.2 10
3012 9.71 20 3041 6.90 12
3012G 89.9 2 3041G 22.9 2
3013 20.2 20 3042 9.46 34
3013G 13.2 4 3042G 85.5 3
3014 213 4 3043 9.26 29
3014G 36.8 3 3043G 13.1 22
표 12
Vκ3-20Jκ1
공통 경쇄 항체
항체 100 nM 항원 E 항체 100 nM 항원 E
KD (nM) T1/2 (분) KD (nM) T1/2 (분)
2968 5.50 8 2973 5.35 39
2968G 305 0 2973G 11.0 44
2969 34.9 2 2974 256 0
2969G 181 1 2974G 138 0
2970G 12.3 3 2975 38.0 2
2971G 32.8 22 2975G 134 1
2972 6.02 13 2976 6.73 10
2972G 74.6 26 2976G 656 8
표 5 및 6에서 나타난 재배열을 포함하는 공통 경쇄 항체의 표 11 및 12에서 나타난 결합 친화도는 다양하며, 거의 모두 나노몰 범위의 KD를 나타낸다. 친화도 데이터는 고-친화도인 것으로 표 5 및 6에서 설명되고, 클로닝에 의해 선택되고, 체세포 돌연변이된 재배열된 가변 도메인의 조합의 결합으로부터 발생한 공통 경쇄 항체와 일치한다. 이전에 나타난 데이터와 결합하여, 표 5 및 6에서 설명된 공통 경쇄 항체는 항원 E에서 하나 이상의 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 다양한, 고-친화도 항체의 컬렉션을 포함한다.
실시예 10
LUMINEX™ 검정에 의한 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 결합 특이성의 결정
선택된 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 항원 E의 ECD 및, 게먹이 원숭이(cynomolgous monkey) 오쏠로그(ortholog) (Mf 항원 E)를 포함하는, 항원 E ECD 변종에 결합하는 능력에 대하여 테스트하였는데, 이것은 아미노산 잔기의 대략 10%가 인간 단백질과 다르다; ECD의 C-말단 끝의 최종 10개의 아미노산이 결핍된 항원 E의 결실 돌연변이 (항원 E-ΔCT); 및 리간드 Y와의 상호작용의 예상 위치에서 알라닌 치환을 함유하는 두 개의 돌연변이 (항원 E-Ala1 및 항원E-Ala2). 항원 E 단백질을 CHO 세포에서 생산하였고 각각은 myc-myc-His C-말단 태그를 함유하였다.
결합 연구를 위해, 1 mL의 배양 배지로부터 항원 E ECD 단백질 또는 변종 단백질 (상기 설명됨)을 항-myc 단클론성 항체 (MAb 9E10, 히브리도마 세포주 CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA)로 공유 결합에 의해 코팅된 1 x 106개의 미소구체 (LUMINEX™) 비드와 함께 상온에서 2시간 동안 배양으로 캡쳐하였다. 그 다음에 비드를 사용 전에 PBS로 세척하였다. 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:4로 희석하였고 96-웰 필터 플레이트에 추가하였다. 항체가 없는 목 상층액을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 다음에 캡쳐된 항원 E 단백질을 함유하는 비드를 항체 샘플에 추가하였고 (웰당 3000개의 비드) 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 샘플 비드를 세척하였고 결합된 공통 경쇄 항체를 R-피코에리트린-컨쥬게이션된 항-인간 IgG 항체로 검출하였다. 비드 (각 항원 E 단백질에 결합하는 각 항체 샘플에 대하여 계수된 대략 100개의 비드)의 형광 강도를 LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기로 측정하였고, 비드/항체 상호작용 당 적어도 100개의 계수된 비드에 대한 중간 형광 강도 (MFI)를 기록하였다. 결과는 표 13 및 14에서 나타난다.
표 13
Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 항체
항체 평균 형광 강도 (MFI)
항원 E-ECD 항원 E-ΔCT 항원 E-Ala1 항원 E-Ala2 Mf 항원 E
2948 1503 2746 4953 3579 1648
2948G 537 662 2581 2150 863
2949 3706 4345 8169 5678 5142
2949G 3403 3318 7918 5826 5514
2950 3296 4292 7756 5171 4749
2950G 2521 2408 7532 5079 3455
2952 3384 1619 1269 168 911
2952G 3358 1001 108 55 244
2954 2808 3815 7114 5039 3396
2954G 2643 2711 7620 5406 3499
2955 1310 2472 4738 3765 1637
2955G 1324 1802 4910 3755 1623
2964 5108 1125 4185 346 44
2964G 4999 729 4646 534 91
2978 6986 2800 14542 10674 8049
2978G 5464 3295 11652 8026 6452
2982 4955 2388 13200 9490 6772
2982G 3222 2013 8672 6509 4949
2985 1358 832 4986 3892 1669
2985G 43 43 128 244 116
2987 3117 1674 7646 5944 2546
2987G 3068 1537 9202 6004 4744
2996 4666 1917 12875 9046 6459
2996G 2752 1736 8742 6150 4873
2997 5164 2159 12167 8361 5922
2997G 658 356 3392 2325 1020
3004 2794 1397 8542 6268 3083
3004G 2753 1508 8267 5808 4345
3005 5683 2221 12900 9864 5868
3005G 4344 2732 10669 7125 5880
3010 4829 1617 2642 3887 44
3010G 3685 1097 2540 3022 51
3011 2859 2015 7855 5513 3863
3011G 2005 1072 6194 4041 3181
3012 3233 2221 8543 5637 3307
3012G 968 378 3115 2261 1198
3013 2343 1791 6715 4810 2528
3013G 327 144 1333 1225 370
3014 1225 1089 5436 3621 1718
3014G 1585 851 5178 3705 2411
3015 3202 2068 8262 5554 3796
3015G 1243 531 4246 2643 1611
3016 4220 2543 8920 5999 5666
3016G 2519 1277 6344 4288 4091
3017 3545 2553 8700 5547 5098
3017G 1972 1081 5763 3825 3038
3018 2339 1971 6140 4515 2293
3018G 254 118 978 1020 345
3019 5235 1882 7108 4249 54
3019G 4090 1270 4769 3474 214
3020 3883 3107 8591 6602 4420
3020G 2165 1209 6489 4295 2912
3021 1961 1472 6872 4641 2742
3021G 2091 1005 6430 3988 2935
3022 2418 793 7523 2679 36
3022G 2189 831 6182 3051 132
3023 1692 1411 5788 3898 2054
3023G 1770 825 5702 3677 2648
3024 1819 1467 6179 4557 2450
3024G 100 87 268 433 131
3025 1853 1233 6413 4337 2581
3025G 1782 791 5773 3871 2717
3027 4131 1018 582 2510 22
3027G 3492 814 1933 2596 42
3028 4361 2545 9884 5639 975
3028G 2835 1398 7124 3885 597
3030 463 277 1266 1130 391
3030G 943 302 3420 2570 1186
3032 2083 1496 6594 4402 2405
3032G 295 106 814 902 292
3033 4409 2774 8971 6331 5825
3033G 2499 1234 6745 4174 4210
3036 1755 1362 6137 4041 1987
3036G 2313 1073 6387 4243 3173
3041 3674 2655 8629 5837 4082
3041G 2519 1265 6468 4274 3320
3042 2653 2137 7277 5124 3325
3042G 1117 463 4205 2762 1519
3043 3036 2128 7607 5532 3366
3043G 2293 1319 6573 4403 3228
표 14
Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 항체
항체 평균 형광 강도 (MFI)
항원 E-ECD 항원 E-ΔCT 항원 E-Ala1 항원 E-Ala2 Mf 항원 E
2968 6559 3454 14662 3388 29
2968G 2149 375 9109 129 22
2969 2014 1857 7509 5671 3021
2969G 1347 610 6133 4942 2513
2970 5518 1324 14214 607 32
2970G 4683 599 12321 506 31
2971 501 490 2506 2017 754
2971G 578 265 2457 2062 724
2972 2164 2158 8408 6409 3166
2972G 1730 992 6364 4602 2146
2973 3527 1148 3967 44 84
2973G 1294 276 1603 28 44
2974 1766 722 8821 241 19
2974G 2036 228 8172 135 26
2975 1990 1476 8669 6134 2468
2975G 890 315 4194 3987 1376
2976 147 140 996 1079 181
2976G 1365 460 6024 3929 1625
항-항원 E 공통 경쇄 항체 상층액은 항원 E-ECD에 결합된 비드에 대한 고 특이적 결합을 나타냈다. 이 비드들에 대하여, 음성 대조군 목 상층액은 항원 E-ECD 비드 샘플과 결합될 때 극미량의 신호 (<10 MFI)를 발생시킨 반면에, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 사층액은 강한 결합 신호를 나타냈다 (98 항체 상층액에 대하여 2627의 평균 MFI; 91/98 항체 샘플에 대하여 MFI > 500).
항원 E의 ECD에서 다른 에피토프를 확인하는 선택된 항-항원 E 공통 경홰 항체의 능력의 측정값으로서, 변종에 대한 항체의 상대적 결합을 결정하였다. 고유한 항원 E-ECD 결합 연구를 위해 모두 네 개의 항원 E 변종을 상기 설명된 항-myc LUMINEX™ 비드에 캡쳐하였고, 상대적인 결합 비율 (MFI변종/MFI항원 E-ECD)을 결정하였다. 표 12 및 13에서 나타난 98개의 테스트된 공통 경쇄 항체 상층액에 대하여, 평균 비율 (MFI변종/MFI항원 E-ECD)은 각 변종에 대하여 달랐고, 비드에서 단백질의 다른 캡쳐량 (각각 항원 E-ΔCT, 항원 E-Ala1, 항원 E-Ala2, 및 Mf 항원 E에 대하여 0.61, 2.9, 2.0, 및 1.0의 평균 비율)을 반영할 가능성이 크다. 각 단백질 변종에 대하여, 98개의 테스트된 공통 경쇄 항체의 서브세트에 대한 결합은 크게 감소된 결합을 나타냈다. 특정 변종을 특성화하는 돌연변이에 대한 민감도를 나타낸다. 예를 들어, 공통 경쇄 항체 샘플 중 19개는 <8%의 MFI변종/MFI항원 E-ECD로 Mf 항원 E에 결합하였다. 이 군에서 다수가 높은 또는 적당히 높은 친화도 항체를 포함하기 때문에 (5개는 KD < 5nM, 15개는 KD < 50 nM), 이 군에 대하여 더 낮은 신호는 더 낮은 친화도 대신에 고유한 항원 E-ECD와 특정 변종 사이의 서열 (에피토프) 차이에 대한 민감도로부터 발생할 가능성이 크다.
이 데이터들은 표 5 및 6에서 설명된 공통 경쇄 항체가 항원 E에서 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-E-특이적 공통 경쇄 항체의 다양한 군을 나타낸다는 것을 확립한다.
실시예 11
공통 경쇄 항체에서 경쇄 셔플링(shuffling)
선택된 항원-특이적 공통 경쇄 항체의 중쇄를 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 또는 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄로 중쇄를 회복시킨 후 항원 E에 대한 결합에 대하여 테스트하였다 (실시예 1에서 설명됨).
간단히 말하면, 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 (Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1)의 247개의 중쇄를 생식세포 계열 Vκ1-39 또는 생식세포 계열 Vκ3-20 조작된 경쇄로 트랜스펙션하였고 LUMINEX™ 검정에 의해 항원 E에 대한 결합에 대하여 재스크리닝하였다 (실시예 7 및 실시예 10에서 설명됨). 항원 E에 대한 결합을 BIACORE™으로 확인하였다 (실시예 9에서 설명됨). 결과는 표 15에서 나타난다.
이 실시예에서 나타난 바와 같이, 항원 E에 특이적인 28개의 공통 경쇄 항체는 경쇄의 생식세포 계열 형태로 회복될 때 항원 E에 결합할 수 있었다.
표 15
원래의 경쇄 회복된 경쇄 테스트된 숫자 확인된 바인더의 숫자
1-39 1-39 198 23
3-20 3-20 49 5
실시예 12
중쇄 유전자 사용량 및 공통 경쇄 항체에서 체세포 초 돌연변이 빈도
VELCOIMMUNE® 마우스에서 발생한 항체의 중쇄 및 경쇄 서열 (>6000) (예를 들어, 제US 6,596,541호 및 제US 7,105,348호)을 항체 사슬의 중쇄 유전자 세그먼트 사용량및 체세포 초돌연변이 빈도를 비교하기 위해 다중-항원 면역화 계획에 의해 얻어진 공통 경쇄 항체의 중쇄 및 경쇄 서열 (>600)로 종합하였다.
중쇄 유전자 사용량. 인간 세포-표면 수용체 (항원 E), 두 개의 인간 세포-표면 당단백질의 헤테로다이머 (항원 F), 인간 시토킨 수용체 (항원 G) 및 인간 종양 분화 항원 (항원 H)으로 면역화된, 내인성 마우스 중쇄 자리의 인간 VH, DH 및 JH 유전자 세그먼트로의 대체 및 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 조작된 생식세포 계열 Vκ1-39Jκ5 인간 경쇄 영역 또는 조작된 생식세포 계열 Vκ3-20Jκ1 인간 경쇄 영역으로의 대체를 함유하는 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 얻은 중쇄 및 경쇄 서열 (실시예 2에서 설명됨)을 중쇄 유전자 세그먼트 사용량에 대하여 분석하였고 VH 및 JH 유전자 세그먼트를 기록하였다. 결과는 표 16-18에서 나타난다.
표 16-18의 퍼센트는 반올림된 값을 나타내고 일부 경우에서 함께 추가될 때 100% 동일하지 않을 수도 있다.
표 16은 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI), 동족 Vκ 1-39 경쇄를 갖는 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI-Vκ1-39), Vκ1-39 조작된 경쇄 마우스의 항체 (Vκ1-39), 동족 Vκ3-20 경쇄를 갖는 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI-Vκ3-20), 및 Vκ3-20 조작된 경쇄 마우스의 항체 (Vκ3-20)에 대한 퍼센트 중쇄 과 사용량을 제시한다. 표 17은 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI), 동족 Vκ1-39 경쇄를 갖는 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI-Vκ1-39), Vκ1-39 조작된 경쇄 마우스의 항체 (Vκ1-39), 동족 Vκ3-20 경쇄를 갖는 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체 (VI-Vκ3-20), Vκ3-20 조작된 경쇄 마우스의 항체 (Vκ3-20)에 대한 퍼센트 VH 및 JH 유전자 사용량을 제시한다. 표 18은 각 면역화 군 (항원 E, F, G 및 H)의 Vκ1-39 조작된 경쇄 마우스의 항체에 대한 퍼센트 VH 유전자 사용량 (Vκ1-39 마우스) 및 선택된 면역화 군 (항원 E 및 G)의 Vκ3-20 조작된 경쇄 마우스의 항체에 대한 퍼센트 VH 유전자 사용량 (Vκ3-20 마우스)을 제시한다.
이 실시예에서 나타난 바와 같이, Vκ1-39Jκ5-조작된 경쇄 마우스에서 테스트된 항원에 대한 중쇄 유전자 사용량은 VH 과 III 부분군 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33 및 VH3-48)의 우세를 특징으로 하였다. 다른 VH 과 부분군의 주목할 만한 사용량은 VH1-18, VH1-69, VH2-5, VH4-59 및 VH6-1의 사용량을 특징으로 하였다. Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄 마우스에서 테스트된 항원에 대하여, 중쇄 유전자 사용량은 VH 과 III, VH 과 IV 및 VH 과 V 부분군 (VH3-11, VH3-30, VH3-33, VH4-39, VH4-59 및 VH5-51)의 우세를 특징으로 하였다. 다른 VH 과 부분군의 주목할 만한 사용량은 VH1-18, VH1-69, VH2-70 및 VH6-1을 특징으로 하였다.
체세포 초돌연변이 빈도. VELCOIMMUNE® 마우스 및 조작된 경쇄 마우스에서 발생한 항체의 중쇄 및 경쇄 (상기 설명됨)를 각 중쇄 및/또는 경쇄에 대하여 입증된 중쇄 및 경쇄 유전자 사용량에 따라 생식세포 계열 서열로 정렬하였다. 각 서열의 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대하여 각 프레임워크 영역 (FW) 및 상보성 결정 영역 (CDR)에 대한 아미노산 변형을 계산하였다. 결과는 표 19-22에서 나타난다. 표 21-24의 퍼센트는 반올림된 값을 나타내고 일부 경우에서 함께 추가될 때 100% 동일하지 않을 수도 있다.
표 19는 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체의 중쇄, Vκ1-39 조작된 경쇄 마우스 (Vκ1-39 마우스)의 항체의 중쇄 및 Vκ3-20 조작된 경쇄 마우스 (Vκ3-20 마우스)의 항체의 중쇄의 각각 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산 (AA) 변화의 수를 제시한다. 표 20은 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체의 경쇄, Vκ1-39 조작된 마우스 (Vκ1-39 마우스)의 항체의 경쇄 및 Vκ3-20 조작된 마우스 (Vκ3-20 마우스)의 항체의 경쇄의 각각 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산 (AA) 변화의 수를 제시한다. 표 21은 선택된 면역화 군 (항원 E, F 및 H)에 대하여 Vκ1-39 조작된 경쇄 마우스 (Vκ1-39 마우스)의 항체의 중쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산 (AA) 변화의 수를 제시한다. 표 22는 선택된 면역화 군 (항원 E 및 G)에 대하여 Vκ3-20 조작된 경쇄 마우스 (Vκ3-20 마우스)의 항체의 중쇄의 각각의 FW 및 CDR 영역에서 관찰된 아미노산 (AA) 변화의 수를 제시한다.
표 16
VH 과 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1 9.0 14.8 3.3 7.1 4.9
2 2.2 1.8 4.6 0 1.6
3 77.8 69.8 77.3 61.4 29.5
4 8.4 8.3 11.2 27.1 39.3
5 0.9 0 0.7 4.3 23.0
6 1.7 5.3 3.0 0 1.6
표 17
VH 유전자 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1-2 3.9 8.3 0 2.9 0
1-3 0 0 0 0 0
1-8 1.3 0.6 0 1.4 0
1-18 3.0 0.6 1.3 2.1 1.6
1-24 0.4 3.6 0 0.7 0
1-46 0.1 0 0 0 0
1-58 0 0 0 0 0
1-69 0.3 1.8 2.0 0 3.3
2-5 1.9 0 4.6 0 0
2-26 0.2 1.8 0.0 0 0
2-70 0.1 0 0 0 1.6
3-7 3.0 14.8 0 1.4 0
3-9 8.5 3.6 29.6 16.4 0
3-11 5.4 10.7 0 7.1 1.6
3-13 3.2 1.8 0.7 2.1 0
3-15 4.0 4.7 0.3 0.7 0
3-20 1.0 0.6 0.3 5.0 0
3-21 0.8 0.6 0 2.1 0
3-23 20.4 8.9 3.3 8.6 0
3-30 17.6 4.1 35.2 12.9 1.6
3-33 12.6 14.8 0 5.0 26.2
3-43 0.2 0.6 0 0 0
3-48 0.8 1.2 7.2 0 0
3-53 0.3 3.6 0.3 0 0
3-64 0 0 0.3 0 0
3-72 0 0 0 0 0
3-73 0 0 0 0 0
4-31 2.7 0 0.7 8.6 0
4-34 1.8 0.6 0.3 14.3 0
4-39 1.6 0.6 3.0 2.1 14.8
4-59 2.3 7.1 7.2 2.1 24.6
5-51 0.9 0 0.7 4.3 23.0
6-1 1.7 5.3 3.0 0 1.6
JH 유전자 VI VI-Vκ1-39 Vκ1-39 VI-Vκ3-20 Vκ3-20
1 1.5 1.2 7.1 0 0
2 4.5 2.4 0.7 5.0 26.9
3 10.5 16.6 13.1 13.6 26.9
4 44.0 34.3 32.3 50.7 9.6
5 9.6 10.1 16.8 7.9 1.9
6 29.7 35.5 30.0 22.9 34.6
표 18
VH 유전자 Vκ1-39 마우스 Vκ3-20 마우스
항원 E 항원 F 항원 G 항원 H 항원 E 항원 G
1-2 0 0 0 0 0 0
1-3 0 0 0 0 0 0
1-8 0 0 0 0 0 0
1-18 0 0 0 8.3 0 3.1
1-24 0 0 0 0 0 0
1-46 0 0 0 0 0 0
1-58 0 0 0 0 0 0
1-69 2.9 0 25.0 0 0 6.3
2-5 8.2 0 0 0 0 0
2-26 0 0 0 0 0 0
2-70 0 0 0 0 0 3.1
3-7 0 0 0 0 0 0
3-9 1.2 98.8 0 14.6 0 0
3-11 0 0 0 0 0 3.1
3-13 0.6 0 25.0 0 0 0
3-15 0 1.2 0 0 0 0
3-20 0 0 25.0 0 0 0
3-21 0 0 0 0 0 0
3-23 4.1 0 25.0 4.2 0 0
3-30 62.9 0 0 0 3.4 0
3-33 0 0 0 0 13.8 37.5
3-43 0 0 0 0 0 0
3-48 0.6 0 0 43.8 0 0
3-53 1.6 0 0 0 0 0
3-64 1.6 0 0 0 0 0
3-72 0 0 0 0 0 0
3-73 0 0 0 0 0 0
4-31 0 0 0 4.2 0 0
4-34 0 0 0 2.1 0 0
4-39 5.3 0 0 0 31.0 0
4-59 11.8 0 0 4.2 3.4 43.8
5-51 1.2 0 0 0 48.3 0
6-1 0 0 0 18.8 0 3.1
표 19
# AA 변화 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 63 32 36 26 12 82
1 23 32 41 31 22 17
2 9 25 17 23 27 1
3 4 10 5 16 13 0
4 0 1 1 3 12 0
>5 1 0 0 1 14 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 65 8 34 30 9 37
1 25 26 35 34 19 54
2 9 44 23 20 33 9
3 1 19 8 12 22 0
4 0 3 0 5 11 0
>5 1 0 0 0 7 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스의 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 57 8 54 16 8 93
1 41 43 34 39 21 7
2 2 25 10 18 20 0
3 0 15 2 21 13 0
4 0 10 0 3 20 0
>5 0 0 0 2 18 0
표 20
# AA 변화 VELCOIMMUNE® 마우스의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 65 24 49 60 33 23
1 24 20 34 31 27 38
2 9 27 16 9 18 28
3 1 20 1 0 14 7
4 0 7 0 0 4 3
>5 1 1 0 0 3 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 91 75 80 90 71 63
1 9 19 17 10 21 27
2 0 5 1 1 5 8
3 0 0 1 0 2 1
4 0 0 0 0 2 1
>5 0 0 0 0 0 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스의 항체의 경쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 90 47 93 97 63 57
1 10 27 3 3 20 43
2 0 27 3 0 17 0
3 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
>5 0 0 0 0 0 0
표 21
# AA 변화 Vκ1-39 마우스의 항-항원 E 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 75 8 49 41 14 36
1 21 25 33 35 25 52
2 4 43 14 18 28 12
3 0 20 4 5 16 0
4 0 5 0 1 12 0
>5 1 0 0 0 5 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스의 항-항원 F 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 52 0 6 6 2 15
1 35 24 32 35 15 78
2 11 59 46 22 49 7
3 0 17 16 24 29 0
4 0 0 0 12 4 0
>5 1 0 0 0 1 0
# AA 변화 Vκ1-39 마우스의 항-항원 H 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 54 21 29 33 4 77
1 17 35 50 27 6 23
2 23 21 15 21 25 0
3 6 21 4 15 27 0
4 0 2 2 2 15 0
>5 0 0 0 2 23 0
표 22
# AA 변화 Vκ3-20 마우스의 항-항원 E 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 79 17 62 24 17 90
1 21 28 34 55 31 10
2 0 28 3 21 24 0
3 0 14 0 0 10 0
4 0 14 0 0 3 0
>5 0 0 0 0 14 0
# AA 변화 Vκ3-20 마우스의 항-항원 G 항체의 중쇄
FW1 CDR1 FW2 CDR2 FW3 CDR3
0 38 0 47 9 0 97
1 59 56 34 25 13 3
2 3 22 16 16 16 0
3 0 16 3 41 16 0
4 0 6 0 6 34 0
>5 0 0 0 3 22 0
실시예 13
보편적인 경쇄를 갖는 이중 특이적 항체의 결합 친화도
완전한 인간 이중 특이적 항체를 업계에 알려져 있는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 선택된 단일 특이적 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 클로닝된 인간 중쇄 가변 영역으로부터 구성하였다 (실시예 5에서 설명됨). 표 23은 선택된 모체 단일 특이적 항체의 인간 중쇄 (HC-1 및 HC-2)의 짝짓기를 제시하는데, 각각의 쌍을 각 이중 특이적 항체의 구성을 위해 생식세포 계열 재배열된 인간 Vκ1-39/Jκ5 경쇄와 함께 이용하였다.
이중 특이적 또는 모체 단일 특이적 항-항원 E 항체의 항원 E의 세포 외 도메인 (ECD)으로의 결합을 BIACORE™ 2000 기구 (GE Healthcare)에서 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 결정하였다. EDC-NHS 화학법을 사용하여 항-c-myc-특이적 단클론성 항체 (Clone# 9E10)로부터 유래된 CM5 BIACORE™ 센서 표면을 항원 E의 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그된 ECD (항원E-mmh)를 캡쳐하는데 사용하였다. 항원E-mmh의 대략 190 RU를 BIACORE™ 센서 표면에서 캡쳐한 후 이어서, 50 μl/분의 유속으로 300nM 및 50nM 농도의 다른 이중 특이적 또는 모체 단일 특이적 항-항원 E 항체를 주사하였다. 실험을 25℃에서 HBST 러닝 버퍼 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05 부피% 계면활성제 P20)에서 수행하였다. 300nM 농도에서 항원 E-mmh 표면에 결합하는 항체의 양을 항체 주사가 끝나기 전 3초에 기록하였고 플롯팅하였다(plotted).
표 24 및 도 8은 각각의 이중 특이적 항체 (BsAb) 및 단일 특이적 모체 항체 (PAb-1, PAb-2)에 대하여 관찰된 결합 반응 (BIACORE™ 유닛; RU)을 제시한다. 각 항체를 동일한 항원 E-mmh 표면에서 포화 조건 하에서 주사하기 때문에, 결합 반응은 항원 캡쳐 표면에 결합하는 각 항체에 대한 결합 화학량론을 반영한다.
이 실시예에서 나타난 바와 같이, 각 이중 특이적 항체에 대하여 관찰된 결합 반응은 각 모데 단일 특이적 항체에 대한 결합 반응보다 대략 2배 더 컸으며 (표 24 및 도 8), 이중 특이적 항체 분자에서 각 Fab 팔이 세포 표면 수용체의 세포 외 도메인에서 뚜렷한 에피토프에 동시에 결합하는 경우에 항원-특이적 단클론성 항체의 중쇄 및 공통 경쇄를 사용하는 이중 특이적 항체의 기능적 구성을 입증한다 (항원 E; 도 7B, 왼쪽 하단을 참고하면 된다).
표 23
이중 특이적 항체 모체 HC-1 모체 HC-2
3108 2952 2978
3109 2978 3022
3111 2952 3005
3112 3022 3005
표 24
이중 특이적 항체 결합 반응 (RU)
PAb-1 PAb-2 BsAb
3108 236 229 485
3109 236 197 408
3111 202 229 435
3112 202 197 345
SEQUENCE LISTING <110> BABB, Robert MCWHIRTER, John MACDONALD, Lynn STEVENS, Sean DAVIS, Samuel BUCKLER, David R. HOSIAWA, Karolina A. MURPHY, Andrew J. <120> Common Light Chain Mouse <130> 802D <140> To be assigned <141> <150> 13/412,936 <151> 2012-03-06 <150> 13/093,156 <151> 2011-04-25 <150> 13/022,759 <151> 2011-02-08 <150> 61/302,282 <151> 2010-02-08 <160> 33 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460 aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640 acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700 actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760 gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820 aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880 acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940 taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000 tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060 tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120 atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 aggtgagggt acagataagt gttatgag 28 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 tgacaaatgc cctaattata gtgatca 27 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gggcaagtca gagcattagc a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 tgcaaactgg atgcagcata g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gaacacggcg gcatcag 17 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 atcagcagaa accagggaaa gcccct 26 <210> 11 <211> 3166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400 ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460 gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520 atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580 cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640 agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700 agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760 ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820 tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880 aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940 aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000 attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060 ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120 gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 tccaggcacc ctgtctttg 19 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 aagtagctgc tgctaacact ctgact 26 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 aaagagccac cctctcctgc aggg 24 <210> 15 <211> 3187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60 tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120 atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180 cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240 atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300 ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360 gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420 acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480 tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540 aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600 gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660 atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720 attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780 aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840 ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900 gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960 gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020 gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080 tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140 accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200 aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260 agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320 ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380 aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440 accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500 catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560 caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620 caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680 tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740 acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800 gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860 cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920 gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980 agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040 ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100 gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160 ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220 ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280 aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340 atcattccag gtgccagatg tgttgtggtc ctcagccggt gctgcatcag ccgccggcca 2400 tgtcctcggc ccttggaacc acaatccgcc tcacctgcac cctgaggaac gaccatgaca 2460 tcggtgtgta cagcgtctac tggtaccagc agaggccggg ccaccctccc aggttcctgc 2520 tgagatattt ctcacaatca gacaagagcc agggccccca ggtcccccct cgcttctctg 2580 gatccaaaga tgtggccagg aacagggggt atttgagcat ctctgagctg cagcctgagg 2640 acgaggctat gtattactgt gctatgcata actcagtgac gcatgtgttt ggcagcggga 2700 cccagctcac cgttttaagt aagtaatttt tcactattgt cttctgaaat ttgggtctga 2760 tggccagtat tgacttttag aggcttaaat aggagtttgg taaagattgg taaatgaggg 2820 catttaagat ttgccatggg ttgcaaaagt taaactcagc ttcaaaaatg gatttggaga 2880 aaaaaagatt aaattgctct aaactgaatg acacaaagta aaaaaaaaaa gtgtaactaa 2940 aaaggaaccc ttgtatttct aaggagcaaa agtaaattta tttttgttca ctcttgccaa 3000 atattgtatt ggttgttgct gattatgcat gatacagaaa agtggaaaaa tacatttttt 3060 agtctttctc ccttttgttt gataaattat tttgtcagac aacaataaaa atcaatagca 3120 cgccctaaga tctagatgca tgctcgagtg ccatttcatt acctctttct ccgcacccga 3180 catagat 3187 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 tgtcctcggc ccttgga 17 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 ccgatgtcat ggtcgttcct 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 acaatccgcc tcacctgcac cct 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 agcagtctgc aacctgaaga ttt 23 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 gtttaatctc cagtcgtgtc cctt 24 <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 cctccgatca ccttc 15 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 aaaccaggga aagcccctaa 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 atgggacccc actttgca 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 ctcctgatct atgctgcat 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 cagcagactg gagcctgaag a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 tgatttccac cttggtccct t 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 tagctcacct tggacgtt 18 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 ctcctcatct atggtgcatc ca 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 gacccactgc cactgaacct 20 <210> 30 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 ccactggcat ccc 13 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 tgagcagcac cctcacgtt 19 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 gtggcctcac aggtatagct gtt 23 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 accaaggacg agtatgaa 18

Claims (29)

  1. 단일 인간 경쇄 가변 도메인 및 복수의 인간 중쇄 가변 도메인을 발현하는 같은 또는 별개의 마우스로부터 분리된 두 개의 다른 B 세포로부터 유래된 두 개의 다른 인간 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 얻는 단계, 및
    상기 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 두 개의 인간 중쇄 및 상기 인간 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간 경쇄를 갖는 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 단계
    를 포함하는 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 같은 또는 별개의 마우스에서 발현된 단일 인간 경쇄 가변 도메인은 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 V 세그먼트 및 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 J 세그먼트로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 V 세그먼트는 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 재배열된 인간 Vκ3-20 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 생식세포 계열 J 세그먼트는 재배열된 인간 Jκ5 또는 재배열된 인간 Jκ1 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 같은 또는 별개의 마우스는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 함유하는 중쇄 자리를 포함하며, 하나 이상의 비-인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5 항에 있어서, 중쇄 자리는 하나 이상의 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 80개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 27개의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트 및 여섯 개의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5 항에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 인간 VH1-2, VH1-8, VH1-24, VH1-69, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH3-53, VH4-31, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH6-1, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1 항에 있어서, 같은 또는 별개의 마우스는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, 두 개의 인간 중쇄 가변 영역 유전자 서열 중 각각은 같거나 다른 VH 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하고, VH 세그먼트는 VH1-2, VH1-8, VH1-24, VH1-69, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH3-53, VH4-31, VH4-39, VH4-59, VH5-51 및 VH6-1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항에 있어서, 두 개의 인간 중쇄는
    두 개의 다른 항원, 또는
    같은 항원의 두 개의 다른 에피토프
    에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 핵산 서열에 의해 암호화된 단일 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 복수의 인간 중쇄 가변 도메인을 발현하는 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계,
    단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 핵산 서열에 의해 암호화된 단일 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 복수의 인간 중쇄 가변 도메인을 발현하는 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계,
    제1 및 제2 마우스가 각각 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키게 하는 단계,
    원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 마우스의 제1 인간 중쇄 가변 도메인을 확인하는 단계,
    원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 마우스의 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 확인하는 단계,
    제1 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 인간 중쇄 유전자 및 제2 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 인간 중쇄 유전자를 만드는 단계,
    제1 및 제2 중쇄 유전자를 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 단일 완전한 인간 경쇄 유전자를 포함하는 세포로 도입하는 단계,
    이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 세포에서 완전한 인간 중쇄 유전자에 의해 암호화된 제1 및 제2 완전한 인간 중쇄 및 단일 완전한 인간 경쇄 유전자에 의해 암호화된 완전한 인간 경쇄를 발현하는 단계, 및
    상기 세포로부터 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계
    를 포함하는 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법.
  12. 제11 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Jκ1 또는 Jκ5 유전자 세그먼트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11 항에 있어서,
    제1 항원 및 제2 항원은 동일하지 않거나; 또는
    제1 항원 및 제2 항원은 동일하고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11 항에 있어서, 완전한 인간 경쇄는 제1 완전한 인간 중쇄와 짝을 이룰 때 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고 완전한 인간 경쇄는 제2 완전한 인간 중쇄와 짝을 이룰 때 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11 항에 있어서, 둘 다는 아니지만, 제1 또는 제2 완전한 인간 중쇄는 단백질 A에 대한 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, 변형은 95R (EUR 435R), 96F (EUR 436F), 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제11 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열은 생식세포 계열 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제11 항에 있어서, 제1 및 제2 마우스에서 복수의 인간 중쇄 가변 도메인은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 포함하는 중쇄 자리에 의해 암호화되며, 하나 이상의 비-인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19 항에서, 제1 또는 제2 마우스에서 중쇄 자리는 하나 이상의 마우스 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 80개의 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 세그먼트, 27개의 재배열되지 않은 인간 DH 유전자 세그먼트 및 여섯 개의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19 항에 있어서, 하나 이상의 인간 VH 유전자 세그먼트는 인간 VH1-2, VH1-8, VH1-24, VH1-69, VH2-5, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-48, VH3-53, VH4-31, VH4-39, VH4-59, VH5-51, VH6-1, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1 항원에 결합하는 제1 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 얻기 위해 제1 마우스를 원하는 제1 항원으로 면역화하는 단계로서, 제1 마우스는 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 단일 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 발현하는 단계, 및
    제2 항원에 결합하는 제2 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 얻기 위해 제2 마우스를 원하는 제2 항원으로 면역화하는 단계로서, 제2 마우스는 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열로부터 유래된 단일 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 복수의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 발현하는 단계
    를 포함하는, 이중 특이적 항원-결합 단백질에서 사용되는 두 개의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는 방법.
  23. 제22 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Jκ1 또는 Jκ5 유전자 세그먼트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22 항에 있어서, 제1 및 제2 마우스는 면역글로불린 경쇄를 형성하기 위해 재배열할 수 있는 내인성 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제22 항에 있어서, 제1 및 제2 항원은
    다르거나; 또는
    동일하고, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인은 별개의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) 제1 항원에 결합하는 제1 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 제1 핵산 서열로서, 제1 인간 중쇄는 제1 인간 중쇄 가변 도메인의 서열을 포함하고 제1 인간 중쇄 가변 도메인의 서열은 제1 항원으로 면역화된 제1 마우스로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 제1 핵산 서열;
    (b) 제2 항원에 결합하는 제2 인간 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 제2 핵산 서열로서, 제2 인간 중쇄는 제2 인간 중쇄 가변 도메인의 서열을 포함하고 제2 인간 중쇄 가변 도메인의 서열은 제2 항원으로 면역화된 제2 마우스로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 제2 핵산 서열; 및
    (c) 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 제3 핵산 서열로서, 제3 핵산은 인간 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 제3 핵산 서열
    을 포함하며, 제1, 제2 및 제3 핵산 서열은 제1 및 제2 항원에 결합하는 항원-결합 단백질을 생성하기 위해 발현되는 숙주 세포.
  28. 제27 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  29. 제28 항에 있어서, 단일 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 재배열된 인간 Jκ1 또는 Jκ5 유전자 세그먼트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
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