KR101995753B1 - 공통 경쇄를 가진 항체를 발현하는 비-사람 동물 - Google Patents
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Abstract
유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 제한된 수의 경쇄 가변 도메인에 의해 특성화된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 발현한다. 마우스가 제공되며, 그것들의 생식세포에서 제한된 레퍼토리로부터 하나 또는 소수의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현한다. 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는, 마우스의 경쇄 가변 영역을 만드는 방법이 제공된다. 다중 특이적 결합 단백질, 예를 들어, 이중 특이적 항체의 사용에 적합한 사람 가변 영역을 만드는 방법이 제공된다.
Description
다양한 사람 가변/마우스 불변 중쇄에 결합된 공통 사람 가변/마우스 불변 경쇄를 가진 항체를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 마우스의 B 세포의 사람 가변 영역 유전자 서열로 사람 이중 특이적 항체를 만드는 방법이 제공된다.
항체는 전형적으로 호모다이머 중쇄 성분을 포함하며, 각각의 중쇄 모노머는 동일한 경쇄에 결합된다. 헤테로다이머 중쇄 성분 (예를 들어, 이중 특이적 항체)을 갖는 항체는 치료적 항체로서 바람직하다. 하지만 이중 특이적 항체의 중쇄의 각각에 만족스럽게 결합될 수 있는 적합한 경쇄 성분을 갖는 이중 특이적 항체를 만드는 것은 문제가 있는 것으로 입증되었다.
한 접근에서, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 사용량 통계를 조사하고, 사람 항체에서 가장 흔하게 이용되는 경쇄를 확인하고 상기 경쇄를 시험관 내에서 특이성이 다른 두 개의 중쇄와 짝을 이룸으로써 선택될 수도 있다.
또 다른 접근에서, 경쇄는 파지 디스플레이 라이브러리 (phage display library) (예를 들어, 사람 경쇄 가변 영역 서열, 예를 들어, 사람 scFv 라이브러리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리)에서 경쇄 서열을 관찰하고 라이브러리로부터 가장 흔히 사용된 경쇄 가변 영역을 선택함으로써 선택될 수도 있다. 경쇄는 원하는 두 개의 다른 중쇄에서 테스트될 수 있다.
또 다른 접근에서, 경쇄는 프로브로서 원하는 두 개의 중쇄의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 검정함으로써 선택될 수도 있다. 두 개의 중쇄 가변 서열에 결합된 경쇄는 중쇄에 대한 경쇄로 선택될 수도 있다.
또 다른 접근에서, 후보 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄에 맞춰 조정될 수도 있고 변형은 일반적인 서열 특성을 두 개의 중쇄의 동족 경쇄에 더 밀접하게 맞추는 경쇄에서 만들어진다. 면역원성의 기회가 최소화될 필요가 있으면, 변형은 바람직하게 알려진 사람 경쇄 서열에 존재하는 서열을 발생시키고, 단백질 가수분해 공정은 면역원성의 가능성을 평가하는 업계에 알려진 파라미터 및 방법에 기초하여 (즉, 인 실리코 (in silico)뿐만 아니라 습식 검정) T 세포 에피토프를 발생시키지 않을 것이다.
상기 접근 중 모두는 많은 연역적 규제 (priori restraint), 예를 들어, 서열 동일성, 미리 선택된 특이적 중쇄와 결합되는 능력, 등을 포함하는 시험관 내 방법에 의존한다. 업계에 시험관 내 조건을 조정하는 것에 의존하지 않지만, 대신에 공통 경쇄를 포함하는 사람 에피토프-결합 단백질을 만드는, 더 생물학적으로 민감한 접근을 이용하는 조성물 및 방법이 필요하다.
사람 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 제한된 경쇄 가변 레퍼토리를 갖는다. 친화도-성숙한 사람 중쇄 가변 도메인의 다양한 레퍼토리와 결합되고 이를 발현하는 사람 경쇄 가변 도메인을 생성하는 생물학적 시스템이 제공된다. 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 원하는 항원과 함께 제한된 면역글로불린 경쇄 레퍼토리를 갖는 마우스를 면역화하는 단계, 및 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질에서 마우스의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 이용하는 단계를 포함한다. 방법은 다중- 특이적 항원-결합 단백질을 만드는데 있어서 사용에 적합한 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 만드는 방법을 포함한다.
재배열되지 않은 사람 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 레퍼토리로부터 유도된 적합한 친화도-성숙한 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 선택하는, 유전적으로 조작된 마우스가 제공되며, 친화도-성숙한 사람 중쇄 가변 도메인은 하나의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트에 결합되고 이를 발현한다. 두 개의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 선택을 제공하는, 유전적으로 조작된 마우스가 또한 제공된다.
사람 경쇄 가변 도메인의 제한된 레퍼토리, 또는 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 제한된 레퍼토리의 단일 사람 경쇄 가변 도메인을 발현하는, 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일 경쇄를 발현하는 (또는 두 개의 경쇄 중 하나 또는 둘 다를 발현하는) 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 유전자 (또는 두 개의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자)를 형성하기 위해 재배열된 단일 재배열되지 않은 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 (또는 두 개의 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트)를 포함하도록 유전적으로 조작된다. 재배열된 사람 경쇄 가변 도메인은 마우스에 의해 선택된 복수의 친화도-성숙한 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있으며, 중쇄 가변 영역은 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다.
사람 경쇄 가변 도메인의 제한된 레퍼토리, 또는 사람 경쇄 가변 영역 서열의 제한된 레퍼토리의 단일 사람 경쇄 가변 도메인을 발현하는, 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 마우스는 단일 경쇄의 가변 영역을 발현하는 (또는 두 개의 가변 영역 중 하나 또는 둘 다를 발현하는) 단일 V/J 사람 경쇄 서열 (또는 두 개의 V/J 서열)을 포함하도록 유전적으로 조작된다. 가변 서열을 포함하는 경쇄는 마우스에 의해 클로닝으로 선택된 복수의 친화도-성숙한 사람 중쇄와 짝을 이룰 수 있으며, 중쇄 가변 영역은 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 양태에서, 사람 J 유전자 세그먼트 (하나 또는 복수의 JL 세그먼트로부터 선택됨)와 함께 재배열하고 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 암호화할 수 있는 단일 사람 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역 유전자 세그먼트를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또 다른 양태에서, 마우스는 둘 이하의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함하며, 이것들 각각은 사람 J 유전자 세그먼트 (하나 또는 복수의 JL 세그먼트로부터 선택됨)와 함께 재배열하고 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 암호화할 수 있다.
한 구체예에서, 단일 사람 VL 유전자 세그먼트는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, 및 Jκ5로부터 선택된 사람 JL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합되며, 단일 사람 VL 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트 중 어떤 것도 갖는 경쇄 가변 영역 유전자를 암호화하는 서열을 형성하도록 재배열할 수 있다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하도록 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 세그먼트를 포함하지 않는 면역글로불린 경쇄 자리를 포함하며, VL 자리는 경쇄 유전자의 VL 영역을 암호화하도록 재배열할 수 있는 단일 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정한 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 세그먼트 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 면역글로불린 경쇄 유전자를 형성하도록 재배열할 수 있는 내인성 마우스 VL 유전자 세그먼트를 포함하지 않는 VL 자리를 포함하며, VL 자리는 경쇄 유전자의 VL 영역을 암호화하도록 재배열할 수 있는 둘 이하의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정한 구체예에서, 둘 이하의 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 세그먼트 및 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 암호화하는 단일 재배열된 (V/J) 사람 면역글로불린 경쇄 가변 (VL) 영역 (즉, VL/JL 영역)을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 또 다른 양태에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄의 사람 VL 도메인을 암호화할 수 있는 둘 이하의 재배열된 사람 VL 영역을 포함한다.
한 구체예에서, VL 영역은 재배열된 사람 Vκ1-39/J 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20/J 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 VL/JL 서열의 사람 JL 세그먼트는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, 및 Jκ5로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 서열이다. 특정한 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 및 사람 Vκ3-20Jκ1 서열 둘 다를 갖는다.
한 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 또는 마우스 선도 서열에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 선도 서열은 마우스 선도 서열이다. 특정한 구체예에서, 마우스 선도 서열은 마우스 Vκ3-7 선도 서열이다. 특정한 구체예에서, 선도 서열은 재배열되지 않은 사람 VL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된다. 특정한 구체예에서, 선도 서열은 재배열된 사람 VL/JL 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 면역글로불린 프로모터 서열에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 프로모터 서열은 사람 프로모터 서열이다. 특정한 구체예에서, 사람 면역글로불린 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 특정한 구체예에서, 프로모터는 재배열되지 않은 사람 VL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된다. 특정한 구체예에서, 프로모터는 재배열된 사람 VL/JL 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 경쇄 자리는 사람 면역글로불린 프로모터로 5' (VL 유전자 세그먼트의 전사 방향에 대하여) 플랭킹 (flank)되고 사람 J 세그먼트와 함께 재배열하고 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 역 키메라 경쇄의 VL 도메인을 암호화하는 사람 VL 유전자로 3' 플랭킹된 선도 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 마우스 Vκ 자리에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 경쇄 자리는 사람 면역글로불린 프로모터로 5' (VL 유전자 세그먼트의 전사 방향에 대하여) 플랭킹되고 재배열된 사람 VL 영역 (VL/JL 서열)로 3' 플랭킹된 선도 서열을 포함하고 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함하는 역 키메라 경쇄의 VL 도메인을 암호화한다. 특정한 구체예에서, 재배열된 사람 VL/JL 서열은 마우스 카파 (κ) 자리에 있고, 마우스 CL은 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, 변형된 마우스의 VL 자리는 κ 경쇄 자리이고, κ 경쇄 자리는 마우스 κ 인트론의 인핸서, 마우스 κ3' 인핸서, 또는 인트론의 인핸서 및 3' 인핸서 둘 다를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 비기능적 면역글로불린 람다 (lambda; λ) 경쇄 자리를 포함한다. 특정한 구체예에서, λ 경쇄 자리는 자리 중 하나 이상의 서열의 삭제를 포함하며, 하나 이상의 삭제는 λ 경쇄 자리가 경쇄 유전자를 형성하도록 재배열할 수 없게 만든다. 또 다른 구체예에서, λ 경쇄 자리의 모든 또는 실질적으로 모든 VL 유전자 세그먼트가 삭제된다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 VL 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 만든다. 한 구체예에서, 경쇄는 사람 VL 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 VL 도메인, 및 마우스 Cκ 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 λ 경쇄를 발현하지 않는다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 사람 VL 영역 서열을 체세포 초돌연변이 (hypermutation)되게 할 수 있다. 특정한 구체예에서, 마우스는 VL 도메인을 재배열하고 암호화할 수 있는 사람 VL 유전자 세그먼트로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하는 세포를 포함하고 재배열된 면역글로불린 경쇄 유전자는 체세포 돌연변이된 VL 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 Cκ에 결합된 체세포 돌연변이된 사람 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 발현하는 세포를 포함하며, 경쇄는 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 VH 도메인을 포함하는 중쇄와 결합되고 중쇄는 마우스 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 특정한 구체예에서, 중쇄는 마우스 CH1, 마우스 힌지 (hinge), 마우스 CH2, 및 마우스 CH3을 포함한다. 특정한 구체예에서, 중쇄는 사람 CH1, 힌지, 마우스 CH2, 및 마우스 CH3을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 사람 VH 유전자 세그먼트로 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트의 대체를 포함하며, 사람 VH 유전자 세그먼트는 마우스 CH 영역 유전자에 작동 가능하게 결합하고, 마우스는 사람 VH 유전자 세그먼트를 재배열하고 사람 VH 도메인 및 마우스 CH를 포함하는 역 키메라 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 마우스 VH 유전자 세그먼트 중 90-100%는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 특정한 구체예에서, 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트의 모두 또는 실질적으로 모두는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 19, 적어도 39, 또는 적어도 80 또는 81개의 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 세그먼트로 된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 재배열되지 않은 기능적 사람 VH 유전자 세그먼트, 적어도 25개의 재배열되지 않은 기능적 사람 VH 유전자 세그먼트, 또는 적어도 43개의 재배열되지 않은 기능적 사람 VH 유전자 세그먼트로 된다. 한 구체예에서, 마우스는 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 세그먼트 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 세그먼트로 모든 마우스 DH 및 JH 세그먼트의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 DH 세그먼트는 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 JH 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 하나 이상의 사람 VH 유전자 세그먼트는 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포를 포함하며, 결합 단백질은 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열 또는 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고, 세포는 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59, 및 5-51 유전자 세그먼트로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트의 재배열로부터 유도된 재배열된 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 사람 VH 유전자 세그먼트는 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 사람 중쇄 JH 유전자 세그먼트로 재배열된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 사람 VH 및 JH 유전자 세그먼트는 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 및 7-27로부터 선택된 사람 DH 유전자 세그먼트로 재배열된다. 특정한 구체예에서, 경쇄 유전자는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 체세포 초돌연변이를 갖는다.
한 구체예에서, 마우스는 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5, 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 VH/DH/JH 영역을 포함하는 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 B 세포를 포함한다. 특정한 구체예에서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 서열이고, 마우스는 (i) 사람 VL/JL 서열로부터 유도된 VL 도메인 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역 키메라 경쇄를 발현하며; 경쇄는 (i) 마우스 CH 및 (ii 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인을 포함하는 역 키메라 중쇄에 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정한 구체예에서, 사람 VH 유전자 세그먼트는 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51, 및 1-69 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 및 7-27로부터 선택된 DH 세그먼트로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 JH 세그먼트로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5, 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스는 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포를 포함하며, 결합 단백질은 사람 Vκ1-39/Jκ5 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고, 세포는 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 VH/DH/JH 영역을 포함하는 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ3-20Jκ1 서열이고, 마우스는 (i) 재배열된 사람 VL/JL 서열로부터 유도된 VL 도메인, 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역 키메라 경쇄를 발현한다; 경쇄는 (i) 마우스 CH, 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 VH을 포함하는 역 키메라 중쇄와 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다. 특정한 구체예에서, 사람 VH 유전자 세그먼트는 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 및 5-51 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16, 및 6-13으로부터 선택된 DH 세그먼트로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 JH 세그먼트로부터 유도된 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인은 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5, 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스는 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포를 포함하며, 결합 단백질은 사람 Vκ3-20/Jκ1 재배열로부터 유도된 경쇄를 포함하고, 세포는 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 VH/DH/JH 영역을 포함하는 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, B 세포는 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 및 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열 둘 다를 포함하고, 마우스는 (i) 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 VL 도메인, 및 (ii) 마우스 CL을 포함하는 역 키메라 경쇄를 발현한다; 경쇄는 (i) 마우스 CH, 및 (ii) 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 사람 VH 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 VH를 포함하는 역키메라 중쇄에 결합된다. 한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이된 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, CL은 마우스 Cκ이다.
다양한 구체예에서, B 세포에 의해 유발된, 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 마우스 경쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 마우스에서 동족이다. 다양한 구체예에서, 마우스에 의해 발현된 키메라 경쇄 및 키메라 중쇄는 마우스에서 동족이다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 C57BL 균주이고, 특정한 구체예에서, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 균주 및 상기 언급된 C57BL/6 균주의 혼합체이다. 특정한 구체예에서, 혼합체의 129 균주는 129S6 (129/SvEvTac) 균주이다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 Cκ 및 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 VL 도메인을 포함하는 경쇄, 및 마우스 CH 및 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 및 6-1 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 역 키메라 항체를 발현하며, 마우스는 완전한 마우스 항체를 발현하지 않고 완전한 사람 항체를 발현하지 않는다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 대체를 포함하고, 사람 VH 유전자 세그먼트의 완전한 또는 실질적으로 완전한 레퍼토리로 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트의 대체를 포함하는 κ 경쇄 자리를 포함한다.
한 양태에서, 마우스의 생식세포에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열의 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되며, 면역글로불린 경쇄는 사람 가변 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포는 재배열되지 않은 기능적 면역글로불린 경쇄 V 유전자 세그먼트가 부족하다. 한 구체예에서, 마우스의 생식세포는 재배열되지 않은 기능적 면역글로불린 경쇄 J 유전자 세그먼트가 부족하다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포는 하나 이하, 둘 이하, 또는 셋 이하의 재배열된 (V/J) 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 재배열된 V/J 서열은 경쇄 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 κ 경쇄 서열이다. 특정한 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ1-39/J 서열, 사람 Vκ3-20/J 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ1-39/Jκ5 서열이다. 특정한 구체예에서, κ 경쇄 서열은 사람 Vκ3-20/Jκ1 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 그것의 생식세포 서열에서, 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열에 대한 마우스 κ 인트론의 인핸서 5', 마우스 κ3' 인핸서, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 더 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열되지 않은 사람 VH 유전자 세그먼트, 재배열되지 않은 사람 DH 유전자 세그먼트, 및 재배열되지 않은 사람 JH 유전자 세그먼트를 포함하며, 상기 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 중쇄 불변 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열을 형성하도록 재배열할 수 있다. 한 구체예에서, 마우스는 복수의 사람 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정한 구체예에서, 사람 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 내인성 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트를 대체한다. 특정한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 사람 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트로 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 사람 불변 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된 마우스 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 서열, 힌지 서열, CH2 서열, CH3 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스의 생식세포에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 자리에 있다. 특정한 구체예에서, 마우스의 생식세포에서 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열은 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 경쇄 V 및 J 서열을 대체한다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 분리된 마우스 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 림프구이다. 한 구체예에서, 림프구는 B 세포이다. 한 구체예에서, B 세포는 사람 유전자 세그먼트로부터 유도된 가변 도메인을 포함하는 키메라 중쇄; 및 재배열된 사람 Vκ1-39/J 서열, 재배열된 사람 3-20/J 서열, 또는 이들의 조합으로부터 유도된 경쇄를 발현하며; 중쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 또는 사람 불변 영역에 융합된다.
한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 분리된 마우스 B 세포가 제공되며, B 세포는 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH로부터 유도된 키메라 중쇄; 및 재배열된 사람 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도된 키메라 경쇄를 발현하고; 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합된다.
한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 분리된 마우스 B 세포가 제공되며, B 세포는 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열로부터 유도된 키메라 중쇄; 및 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도된 키메라 경쇄를 발현하고; 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합된다.
다양한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 분리된 B 세포에 의해 발현된 키메라 중쇄 및 경쇄는 마우스에서 동족이다.
한 양태에서, 히브리도마 (hybridoma)가 제공되며, 히브리도마는 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 B 세포로 만들어진다. 특정한 구체예에서, B 세포는 여기에 설명된 바와 같이 원하는 에피토프를 포함하는 면역원으로 면역화된 마우스의 것이고, B 세포는 원하는 에피토프에 결합하는 결합 단백질을 발현하고, 결합 단백질은 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인 및 마우스 CH를 갖고, 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 유도된 사람 VL 도메인 및 마우스 CL을 갖는다.
한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 B 세포로 만들어진 히브리도마가 제공되며, 히브리도마는 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/4, 3-30/5-5/2, 3-30/7-27/6, 1-69/6-6/5 및 1-69/6-13/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열로부터 유도된 키메라 중쇄; 및 재배열된 사람 Vκ1-39/Jκ5 서열로부터 유도된 키메라 경쇄를 발현하고; 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합된다.
한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 B 세포로 만들어진 히브리도마가 제공되며, 히브리도마는 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 서열로부터 유도된 키메라 중쇄; 및 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ1 서열로부터 유도된 키메라 경쇄를 발현하고; 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합되고 경쇄 가변 도메인은 마우스 불변 영역에 융합된다.
다양한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 B 세포로 만들어진 히브리도마에 의해 발현된 키메라 중쇄 및 경쇄는 히브리도마에서 동족이다. 다양한 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 B 세포로 만들어진 히브리도마에 의해 발현된 키메라 중쇄 및 경쇄는 마우스의 B 세포에서 동족이다.
한 양태에서, 마우스 배아가 제공되며, 배아는 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 유도된 기증자 ES 세포를 포함한다.
한 양태에서, 벡터의 5' 및 3' 마우스 상동성 팔의 서열에 관한 전사 방향이 5'에서 3'인, 5' 마우스 상동성 팔, 사람 또는 마우스 면역글로불린 프로모터, 사람 또는 마우스 선도 서열, 및 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 사람 VL 영역, 및 3' 마우스 상동성 팔을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다. 한 구체예에서, 5' 및 3' 상동성 팔은 5'에 존재하고 마우스 Cκ 유전자에 인접한 인핸서 서열에 관하여 벡터를 서열 5'에 표적화한다. 한 구체예에서, 프로모터는 사람 면역글로불린 가변 영역 유전자 세그먼트 프로모터이다. 특정한 구체예에서, 프로모터는 사람 Vκ3-15 프로모터이다. 한 구체예에서, 선도 서열은 마우스 선도 서열이다. 특정한 구체예에서, 마우스 선도 서열은 마우스 Vκ3-7 선도 서열이다.
한 양태에서, 표적화 벡터가 상기 설명된 바와 같이 제공되지만, 5' 마우스 상동성 팔 대신에, 사람 또는 마우스 프로모터는 부위- 특이적 재조합효소 인식 부위 (SRRS)와 5' 플랭킹되고, 3' 마우스 상동성 팔 대신에, 사람 VL 영역은 SRRS와 3' 플랭킹된다.
한 양태에서, 역 키메라 항체는 여기에 설명된 바와 같이 마우스에 의해 만들어지며, 역 키메라 항체는 사람 VL 및 마우스 CL을 포함하는 경쇄, 및 사람 VH 및 마우스 CH를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, 항체를 만드는 방법이 제공되며, 단일 세포에서 (a) 여기에 설명된 바와 같이 사람 CH 유전자 서열과 융합된 면역화된 마우스의 제1 VH 유전자 서열; (b) 여기에 설명된 바와 같이 사람 CL 유전자 서열과 융합된 면역화된 마우스의 VL 유전자 서열을 발현하는 단계; 및, (c) 완전한 사람 항체를 발현하기 위해 충분한 조건 하에 세포를 유지하는 단계, 및 항체를 분리하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 여기에 설명된 바와 같이 사람 CH 유전자 서열과 융합된 제2 면역화된 마우스의 제2 VH 유전자 서열을 포함하고, 제1 VH 유전자 서열은 제1 에피토프를 인식하는 VH 도메인을 암호화하고, 및 제2 VH 유전자 서열은 제2 에피토프를 인식하는 VH 도메인을 암호화하며, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다.
한 양태에서, 에피토프-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 여기에 설명된 바와 같이 원하는 에피토프를 포함하는 면역원과 함께 마우스를 노출하는 단계, 마우스가 원하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 생성하기 위해 충분한 조건 하에 마우스를 유지하는 단계, 및 원하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 분리하는 단계를 포함하며, 에피토프-결합 단백질은 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 유도된 마우스 CL 및 사람 VL을 포함하는 경쇄와 결합된, 체세포 돌연변이된 사람 VH 및 마우스 CH를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 양태에서, 에피토프-결합 단백질을 발현하는 세포가 제공되며, 세포는 (a) 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 유도된 사람 VL 도메인을 암호화하는 사람 뉴클레오티드 서열로서, 사람 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 cDNA 서열 (예를 들어, 사람 κ 불변 도메인 DNA 서열)에 융합되는 (직접적으로 또는 결합자를 통해) 서열; 및 (b) 제1 사람 VH 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 사람 VH 도메인을 암호화하는 제1 사람 VH 뉴클레오티드 서열로서, 제1 사람 VH 뉴클레오티드 서열이 사람 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 융합되는 (직접적으로 또는 결합자를 통해) 서열을 포함하며; 에피토프-결합 단백질은 제1 에피토프를 인식한다. 한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 10-6 M보다 적은, 10-8 M보다 적은, 10-9 M보다 적은, 10-10 M보다 적은, 10-11 M보다 적은, 또는 10-12 M보다 적은 해리 상수를 갖는 제1 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 세포는 제2 사람 VH 도메인을 암호화하는 제2 사람 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 제2 사람 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 cDNA 서열에 융합되고 (직접적으로 또는 결합자를 통해), 제2 사람 VH 도메인은 제1 에피토프를 특이적으로 인식하지 않고 (예를 들어, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 이상의 해리 상수를 나타냄), 에피토프-결합 단백질은 제1 에피토프 및 제2 에피토프를 인식하고, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄는 각각 (a)의 동일한 경쇄에 결합된다.
한 구체예에서, 제2 VH 도메인은 10-6 M보다 적은, 10-7 M보다 적은, 10-8 M보다 적은, 10-9 M보다 적은, 10-10 M보다 적은, 10-11 M보다 적은, 또는 10-12 M보다 적은 해리 상수로 제2 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 에피토프-결합 단백질은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 각각은 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된 재배열된 사람 VL 영역으로부터 유도된 동일한 경쇄와 결합되며, 제1 면역글로불린 중쇄는 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리 상수로 제1 에피토프에 결합하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 나노몰 내지 피코몰 범위의 해리 상수로 제2 에피토프에 결합하고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않고, 제1 면역글로불린 중쇄는 제2 에피토프에 결합하지 않거나 미크로몰 범위보다 더 약한 (예를 들어, 밀리몰 범위) 해리 상수로 제2 에피토프에 결합하고, VL, 제1 면역글로불린 중쇄의 VH, 및 제2 면역글로불린 중쇄의 VH 중 하나 이상은 체세포 돌연변이된다.
한 구체예에서, 제1 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기를 포함하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 단백질 A-결합 잔기가 부족하다.
한 구체예에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 양태에서, 역 키메라 항체가 제공되고, 사람 VH 및 마우스 중쇄 불변 도메인, 사람 VL 및 마우스 경쇄 불변 도메인을 포함하며, 항체는 여기에 설명된 바와 같이 에피토프를 포함하는 면역원으로 마우스를 면역화하는 단계를 포함하는 공정에 의해 만들어지고, 항체는 마우스가 면역화된 면역원의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, VL 도메인은 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서, VH 도메인은 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL 도메인 및 VH 도메인 둘 다는 체세포 돌연변이된다. 한 구체예에서, VL은 마우스 Cκ 도메인에 결합된다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 내인성 마우스 중쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트를 대체하는 사람 VH 유전자 세그먼트; 모든 마우스 경쇄 유전자 세그먼트를 대체하는, 재배열된 Vκ1-39/J 및 재배열된 Vκ3-20/J 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 또는 둘 이하의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열을 포함하고; 사람 중쇄 가변 유전자 세그먼트는 마우스 불변 유전자에 결합되고, 재배열된 사람 경쇄 서열은 사람 또는 마우스 불변 유전자에 결합된다.
한 양태에서, 마우스 ES 세포는 사람 중쇄 가변 유전자 세그먼트, 및 하나 또는 둘 이하의 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열로 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 중쇄 가변 유전자 세그먼트의 대체를 포함하며, 사람 중쇄 가변 유전자 세그먼트가 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 결합되고, 재배열된 사람 경쇄 VL/JL 서열은 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 유전자에 결합된다. 특정한 구체예에서, 경쇄 불변 유전자는 마우스 불변 유전자이다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스에 의해 만들어진 항원-결합 단백질이 제공된다. 특정한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 마우스 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역, 및 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유도된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 불변 영역은 마우스 불변 영역이다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열로 만들어진 완전한 사람 항원-결합 단백질이 제공되며, 항원-결합 단백질은 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 서열로부터 유도된 사람 가변 영역을 포함하는 완전한 사람 중쇄, 및 Vκ1-39 또는 Vκ3-20을 포함하는 완전한 사람 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 하나 내지 다섯 개의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 마우스의 B 세포에서 중쇄 가변 영역과 짝을 이루는 동족 경쇄 가변 영역이다.
한 구체예에서, 완전한 사람 항원-결합 단백질은 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하며, 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 독립적으로 유도된 비-동일한 가변 영역을 포함하고, 숙주 세포로부터 제1 및 제 중쇄의 각각은 Vκ1-39 유전자 세그먼트 또는 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유도된 사람 경쇄와 결합된 숙주 세포로부터 발현한다. 한 구체예에서, 제1 중쇄는 제1 항원의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 중쇄 가변 영역을 포함하고, 제2 중쇄는 제2 항원의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 다르다. 특정한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 같고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다; 특정한 구체예에서, 결합 단백질의 제1 분자에 의한 제1 에피토프의 결합은 결합 단백질의 제2 분자에 의한 제2 에피토프의 결합을 차단하지 않는다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 사람 면역글로불린 서열로부터 유도된 완전한 사람 결합 단백질은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 제1 면역글로불린 중쇄는 제2 면역글로불린 중쇄의 가변 영역과 동일하지 않은 제1 가변 영역을 포함하고, 제1 면역글로불린 중쇄는 야생형 단백질 A 결합 결정 요소를 포함하고, 제2 중쇄는 야생형 단백질 A 결합 결정 요소가 부족하다. 한 구체예에서, 제1 면역글로불린 중쇄는 분리 조건 하에 단백질 A와 결합하고, 제2 면역글로불린 중쇄는 분리 조건 하에 단백질 A와 결합하지 않거나 제1 면역글로불린 중쇄가 단백질 A와 결합하는 것보다 적어도 10배, 100배, 또는 1000배 더 약하게 단백질 A와 결합한다. 특정한 구체예에서, 제1 및 제2 중쇄는 IgG1 이소타입이며, 제2 중쇄는 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), 및 이들의 조합으로부터 선택된 변형을 포함하고, 제1 중쇄는 이러한 변형이 부족하다.
한 양태에서, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 여기에 설명된 바와 같이 제1 마우스를 제1 에피토프를 포함하는 원하는 제1 항원에 노출하는 단계, 여기에 설명된 바와 같이 제2 마우스를 제2 에피토프를 포함하는 원하는 제2 항원에 노출하는 단계, 제1 및 제2 마우스 각각이 원하는 항원에 대한 면역 반응을 증가시키 것을 허용하는 단계, 제1 마우스에서 원하는 제1 항원의 제1 에피토프와 결합하는 제1 사람 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 제2 마우스에서 원하는 제2 항원의 제2 에피토프와 결합하는 제2 사람 중쇄 가변 영역을 확인하는 단계, 원하는 제1 항원의 제1 에피토프에 결합하는 제1 중쇄를 암호화하는 제1 완전한 사람 중쇄 유전자를 만드는 단계, 원하는 제2 항원의 제2 에피토프에 결합하는 제2 중쇄를 암호화하는 제2 완전한 사람 중쇄 유전자를 만드는 단계, 이중 특이적 항원-결합 단백질을 형성하기 위해 사람 Vκ1-39 또는 사람 Vκ3-20 유전자 세그먼트로부터 유도된 단일 완전한 사람 경쇄를 발현하는 세포에서 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 발현하는 단계 및 이중 특이적 항원-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하지 않다.
한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하고, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일하지 않다. 한 구체예에서, 제1 에피토프에 제1 중쇄 가변 영역의 결합은 제2 에피토프에 제2 중쇄 가변 영역의 결합을 차단하지 않는다.
한 구체예에서, 제1 항원은 가용성 항원 및 세포 표면 항원 (예를 들어, 종양 항원)으로부터 선택되고, 제2 항원은 세포 표면 수용체를 포함한다. 특정한 구체예에서, 세포 표면 수용체는 면역글로불린 수용체이다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 수용체는 Fc 수용체이다. 한 구체예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 같은 세포 표면 수용체이고, 제1 에피토프에 제1 중쇄의 결합은 제2 에피토프에 제2 중쇄의 결합을 차단하지 않는다.
한 구체예에서, 경쇄의 경쇄 가변 도메인은 2 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 도메인은 제1 또는 제2 중쇄 가변 도메인을 갖는 제1 또는 제2 면역화된 마우스의 B 세포에서 발현된 체세포 돌연변이된 동족 경쇄이다.
한 구체예에서, 제1 완전한 사람 중쇄는 단백질 A에 대한 그것의 친화도를 감소시키는 아미노산 변형을 함유하고, 제2 완전한 사람 중쇄는 단백질 A에 대한 그것의 친화도를 감소시키는 변형을 포함하지 않는다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 만들어진 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 이중 특이적 항체가 제공된다. 또 다른 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 완전한 사람 항체 또는 완전한 사람 이중 특이적 항체를 만들기 위한 마우스의 사용이 제공된다.
한 양태에서, 여기에 설명된 유전적으로 변형된 마우스, 배아, 또는 세포는 내인성 조절기 또는 제어 요소, 예를 들어, 마우스 κ 인트론의 인핸서, 마우스 κ3' 인핸서, 또는 인트론의 인핸서 및 3' 인핸서 둘 다를 유지하는 κ 경쇄 자리를 포함하며, 조절기 또는 제어 요소는 κ 경쇄 자리의 발현된 서열의 체세포 돌연변이 및 친화도 성숙을 가능하게 한다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 또는 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 B 세포 집단을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 거의 같은 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다.
한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유도된다. 특정한 구체예에서, 경쇄는 하나 이하의 재배열된 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유도된다.
한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 비교하여 약 55:1 내지 75:1, 60:1 내지 70:1, 63:1 내지 68: 1, 또는 약 65:1 내지 67:1인 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다. 특정한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 비교하여 66:1인 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다. 한 구체예에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 또는 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유도된 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ1-39, 사람 Vκ3-20, 사람 Jκ1 및 사람 Jκ5로부터 선택된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ1-39 서열을 포함하는 단일 사람 경쇄 서열로부터 유도된다.
한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 비교하여 약 18:1 내지 23:1 또는 약 19:1 내지 22:1인 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다. 한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 비교하여 21:1인 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다. 한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트의 야생형 보체를 포함하는 마우스와 비교하여 거의 같거나 20:1인 κ:λ 경쇄 비율을 나타낸다. 한 구체예에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 또는 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트로부터 유도된 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ1-39, 사람 Vκ3-20, 사람 Jκ1 및 사람 Jκ5로부터 선택된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 사람 Vκ3-20 서열을 포함하는 단일 사람 경쇄 서열로부터 유도된다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 하나 이하, 또는 둘 이하의, 사람 Vκ/Jκ 서열로부터 유도된 면역글로불린 경쇄를 발현하는 마우스가 제공되며, 마우스는 하나 이상의 사람 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 대체를 포함하고, 마우스는 약 1 내지 약 20의, (b) κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한, (a) λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 비율을 나타낸다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ1-39Jκ5 서열로부터 유도된 단일 κ 경쇄를 발현하고 κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한 λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포의 비율은 약 1 내지 약 20이다; 한 구체예에서, 비율은 약 1 내지 적어도 약 66이다; 특정한 구체예에서, 비율은 약 1 내지 66이다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ3-20Jκ5 서열로부터 유도된 단일 경쇄를 발현하고, κ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포에 대한 λ 경쇄를 갖는 면역글로불린을 발현하는 CD19+ B 세포 의 비율은 약 1 내지 약 20이다; 한 구체예에서, 비율은 약 1 내지 약 21이다. 특정한 구체예에서, 비율은 1 내지 20, 또는 1 내지 21이다.
한 양태에서, 단일 재배열된 κ 경쇄를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 기능적 λ 경쇄 자리를 포함하고, 같은 단일 재배열된 κ 경쇄로부터 유도된 κ 경쇄를 발현하는 Igκ+ 세포를 포함하는 B 세포 집단을 발현한다. 한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 야생형 마우스에서와 거의 같다. 특정한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 2 내지 약 6 퍼센트이다. 특정한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 2 내지 약 3 퍼센트이며, 여기에서 단일 재배열된 κ 경쇄가 Vκ1-39Jκ5 서열로부터 유도되고; 특정한 구체예에서, 약 2.6 퍼센트이다. 특정한 구체예에서, 마우스에서 Igκ+Igλ+ B 세포의 퍼센트는 약 4 내지 약 8 퍼센트이며, 단일 재배열된 κ 경쇄는 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도되고; 특정한 구체예에서, 약 6 퍼센트이다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유도된 단일 재배열된 κ 경쇄를 발현하고, 마우스는 단일 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일 κ 경쇄를 포함하는 B 세포 집단을 발현하고, 유전적으로 변형된 마우스는 체세포 초돌연변이에 대하여 저항성으로 만들어졌다. 한 구체예에서, 마우스의 B 세포 상에서 발현된 κ 경쇄 중의 적어도 90%는 적어도 하나 내지 적어도 다섯 개의 체세포 초돌연변이를 나타낸다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일 κ 경쇄를 발현하도록 변형된 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 야생형 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량보다, 또는 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 야생형 레퍼토리를 포함하는 같은 균주의 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량보다 야생형 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량보다, 또는 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 야생형 레퍼토리를 포함하는 같은 균주의 마우스에 의해 나타난 κ 경쇄 사용량보다 약 2배 이상, 적어도 약 3배 이상, 또는 적어도 약 4배 이상 더 큰 κ 경쇄 사용량을 나타낸다. 특정한 구체예에서, 마우스는 하나 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열의 단일 κ 경쇄를 발현한다. 더 특정한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일 κ 경쇄를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 사람 κ 경쇄 자리를 함유하는 마우스에 의해 나타난 같은 κ 경쇄 사용량보다 약 100배 이상, 적어도 약 200배 이상, 적어도 약 300배 이상, 적어도 약 400배 이상, 적어도 약 500배 이상, 적어도 약 600배 이상, 적어도 약 700배 이상, 적어도 약 800배 이상, 적어도 약 900배 이상, 적어도 약 1000배 이상 더 큰 κ 경쇄 사용량을 나타낸다. 특정한 구체예에서, 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 사람 κ 경쇄 자리를 함유하는 마우스는 재배열되지 않은 기능적 마우스 κ 경쇄 서열이 부족하다. 특정한 구체예에서, 마우스는 하나 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 단일 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열의 하나의 카피 (예를 들어, 이형 접합체)를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 재배열된 κ 경쇄 서열의 두 개의 카피 (예를 들어, 동형 접합체)를 포함한다. 더 특정한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 경쇄 서열로부터 유도된 단일 경쇄를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 유전적으로 변형된 마우스의 경쇄는 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 경쇄 자리를 함유하는 마우스에 의해 나타난 같은 재배열된 경쇄의 발현보다 적어도 10배 내지 약 1,000배, 100배 내지 약 1,000배, 200배 내지 약 1,000배, 300배 내지 약 1,000배, 400배 내지 약 1,000배, 500배 내지 약 1,000배, 600배 내지 약 1,000배, 700배 내지 약 1,000배, 800배 내지 약 1,000배, 또는 900배 내지 약 1,000배 더 높은 발현의 수준을 나타낸다. 한 구체예에서, 경쇄는 사람 서열을 포함한다. 특정한 구체예에서, 사람 서열은 κ 서열이다. 한 구체예에서, 사람 서열은 λ 서열이다. 한 구체예에서, 경쇄는 완전한 사람 경쇄이다.
한 구체예에서, 발현의 수준은 전사된 경쇄 서열의 mRNA를 정량하고, 그것을 완벽한 또는 실질적으로 완벽한 경쇄 자리를 함유하는 마우스의 전사된 경쇄 서열과 비교함으로써 특성화된다.
한 양태에서, 하나 이하, 또는 둘 이하의, 재배열된 κ 경쇄 서열로부터 유도된 단일 κ 경쇄를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 항원으로 면역화할 때, 마우스는 같은 항원으로 면역화된 야생형 마우스와 비슷한 혈청 역가를 나타낸다. 특정한 구체예에서, 마우스는 하나 이하의 재배열된 κ 경쇄 서열의 단일 κ 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 혈청 역가는 총 면역글로불린으로서 특성화된다. 특정한 구체예에서, 혈청 역가는 IgM 특이적 역가로서 특성화된다. 특정한 구체예에서, 혈청 역가는 IgG 특이적 역가로서 특성화된다. 더 특정한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 선택된다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ5 서열이다. 한 구체예에서, 재배열된 κ 경쇄 서열은 Vκ3-20Jκ1 서열이다.
한 양태에서, 단일 경쇄와 결합된 복수의 면역글로불린 중쇄를 발현하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 중쇄는 사람 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 서열은 가변 서열, CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 단일 경쇄는 사람 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 서열은 가변 서열, 불변 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 마우스는 무능력한 내인성 면역글로불린 자리를 포함하고 이식 유전자 또는 염색체 외 에피솜의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현한다. 한 구체예에서, 마우스는 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 유전자 세그먼트 (즉, V, D, J), 및/또는 일부 또는 모든 내인성 마우스 중쇄 불변 서열 (예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3, 또는 이들의 조합), 및/또는 일부 또는 모든 내인성 마우스 경쇄 서열 (예를 들어, V, J, 불변, 또는 이들의 조합)의 내인성 마우스 자리에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다.
한 양태에서, 같은 경쇄를 갖는 항체를 만드는데 적합한 마우스가 제공되며, 마우스에서 만들어진 모든 또는 실질적으로 모든 항체는 같은 경쇄와 함께 발현된다. 한 구체예에서, 경쇄는 내인성 경쇄 자리로부터 발현된다.
한 양태에서, 사람 항체에 대한 경쇄를 만드는 방법이 제공되며, 여기에 설명된 바와 같이 마우스로부터 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 얻는 단계, 및 사람 항체를 만드는데 있어서 경쇄 서열 및 중쇄 서열을 이용하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 항체는 이중 특이적 항체이다.
여기에 설명된 구체예 및 양태 중 어떤 것도 달리 지시되거나 문맥에서 분명하지 않으면, 서로 함께 사용될 수 있다. 다른 구체예는 하기 설명의 리뷰로부터 당업자에게 분명해질 것이다.
도 1은 사람 Vκ1-39Jκ5 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하는 표적화 계획을 설명한다.
도 2는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하는 표적화 계획을 설명한다.
도 3은 사람 VpreB/Jλ5 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하는 표적화 계획을 설명한다.
도 4는 야생형 마우스 (WT), 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스 및 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스에 대한 말초 혈액의 CD19+ B 세포의 퍼센트 (y-축)를 나타낸다
도 5a는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HET)에 대하여 이형 접합체인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 사람 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ를 발현하도록 표준화된다. N.D.: 미검출.
도 5b는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 사람 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 5c는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대하여 이형 접합체 (HET) 및 동형 접합체 (HO)인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 접합 프로브) 및 사람 Vκ3-20 유전자 세그먼트 (Vκ3-20 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ3-20-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 6a는 야생형 (WT; N=2) 및 β-갈락토시다제로 면역화된 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO; N=2)에 대하여 동형 접합체인 마우스의 IgM (왼쪽) 및 IgG (오른쪽) 역가를 나타낸다.
도 6b는 야생형 (WT; N=5) 및 β-갈락토시다제로 면역화된 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 HO; N=5)에 대하여 동형 접합체인 마우스의 전체 면역글로불린 (IgM, IgG, IgA) 역가를 나타낸다.
도 2는 사람 Vκ3-20Jκ1 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하는 표적화 계획을 설명한다.
도 3은 사람 VpreB/Jλ5 유전자 영역으로 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하는 표적화 계획을 설명한다.
도 4는 야생형 마우스 (WT), 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스 및 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스에 대한 말초 혈액의 CD19+ B 세포의 퍼센트 (y-축)를 나타낸다
도 5a는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HET)에 대하여 이형 접합체인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 사람 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ를 발현하도록 표준화된다. N.D.: 미검출.
도 5b는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO)에 대하여 동형 접합체인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 접합 프로브) 및 사람 Vκ1-39 유전자 세그먼트 (Vκ1-39 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ1-39-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 5c는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 (Ηκ)로 내인성 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 야생형 마우스 (WT), 및 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 대하여 이형 접합체 (HET) 및 동형 접합체 (HO)인 마우스에서 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 접합 프로브) 및 사람 Vκ3-20 유전자 세그먼트 (Vκ3-20 프로브)의 접합에 특이적인 프로브를 사용하는 정량 PCR 검정에서 Vκ3-20-유도된 경쇄의 상대적인 mRNA 발현 (y-축)을 나타낸다. 신호는 마우스 Cκ의 발현으로 표준화된다.
도 6a는 야생형 (WT; N=2) 및 β-갈락토시다제로 면역화된 조작된 사람 재배열된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 HO; N=2)에 대하여 동형 접합체인 마우스의 IgM (왼쪽) 및 IgG (오른쪽) 역가를 나타낸다.
도 6b는 야생형 (WT; N=5) 및 β-갈락토시다제로 면역화된 조작된 사람 재배열된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 (Vκ3-20Jκ1 HO; N=5)에 대하여 동형 접합체인 마우스의 전체 면역글로불린 (IgM, IgG, IgA) 역가를 나타낸다.
본 발명은 특정 방법, 및 설명된 실험 조건에 제한되지 않는데, 이러한 방법 및 조건이 다를 수도 있기 때문이다. 여기에 사용된 용어가 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이라는 것으로 또한 이해되어야 하고, 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 한정되기 때문에, 제한되어서는 안 된다.
달리 정의되지 않으면, 여기에 사용된 모든 용어 및 구절은 반대가 용어 또는 구절이 사용된 맥락으로부터 명백하게 지시되거나 분명하지 않으면 용어 및 구절이 업계에서 획득한 의미를 포함한다. 여기에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 지금 설명된다. 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 결합된 네 개의 폴리펩티드 사슬, 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 (VL) 영역 및 경쇄 불변 영역 (CL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는, 초가변성의 영역으로 더 세분되고, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 더 보존된 영역과 함께 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR을 포함하며, 다음 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 축약될 수도 있다; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 축약될 수도 있다). 용어 "고 친화도" 항체는 약 10-9 M 이하 (예를 들어, 약 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M)의 그것의 표적 에피토프에 대한 KD를 갖는 항체를 나타낸다. 한 구체예에서, KD는 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance), 예를 들어, BIACORE™에 의해 측정된다; 또 다른 구체예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
구절 "이중 특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중 특이적 항체는 일반적으로 두 개의 다른 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 두 개의 다른 분자 상의 다른 에피토프 (예를 들어, 두 개의 다른 면역원 상의 다른 에피토프) 또는 같은 분자 상의 다른 에피토프 (예를 들어, 같은 면역원 상의 다른 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 이중 특이적 항체가 두 개의 다른 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있으면, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도보다 더 낮은 적어도 한 자리 내지 두 자리 또는 세 자리 내지 네 자리 수, 및 그 반대일 것이다. 이중 특이적 항체에 특이적으로 결합된 에피토프는 같은 또는 다른 표적 상에 있을 수 있다 (예를 들어, 같은 또는 다른 단백질 상에). 이중 특이적 항체는, 예를 들어, 같은 면역원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄를 결합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 같은 면역원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 같은 또는 다른 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중 특이적 항체는 각각 세 개의 중쇄 CDR에 이어서 (N-말단에서 C-말단으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 두 개의 중쇄, 및 에피토프-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄에 결합될 수 있거나, 각각의 중쇄에 결합될 수 있고 중쇄 에피토프-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄에 결합할 수 있고 하나 또는 두 개의 에피토프에 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 결합할 수 있게 하는 면역글로불린 경쇄를 갖는다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 어떤 세포도 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 그것 (단일 세포 또는 다수의 세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜리 (E. coli), 바실루스 종 (Bacillus spp.), 스트렙토미세스 종 (Streptomyces spp.), 등), 미코박테리아 세포, 균류 세포, 효모 세포 (예를 들어, 에스. 세레비시애 (S. cerevisiae), 에스. 폼베 (S. pombe), 피. 파스토리스 (P. pastoris), 피. 메타놀리카 (P. methanolica), 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스 (baculovirus)-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니 (Trichoplusia ni), 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합, 예를 들어, 히브리도마 또는 콰드로마 (quadroma)를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵세포이고 다음 세포로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유도된 세포주를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PER.C6™ 세포)를 포함한다.
구절 "상보성 결정 영역," 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 두 개의 프레임워크 영역 사이에서 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
CDR은, 예를 들어, 생식세포 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 및, 예를 들어, 나이브 (naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. CDR은 체세포 돌연변이되고 (예를 들어, 동물의 생식세포에서 암호화된 서열과 다름), 사람화되고, 아미노산 치환, 추가, 또는 삭제로 변형될 수 있다. 일부 상황에서 (예를 들어, CDR3에 대한), CDR은 인접하지 않지만 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 예를 들어, 서열의 스플라이싱 (splicing) 또는 결합 (예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하는 V-D-J 재조합)의 결과로서 B 세포 핵산 서열에 인접한 둘 이상의 서열 (예를 들어, 생식세포 서열)에 의해 암호화될 수 있다.
용어 "보존적"은 보존적 아미노산 치환을 설명하기 위해 사용될 때, 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 원하는 기능적 성질, 예를 들어, 원하는 친화도로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 가변 영역의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 성질을 가진 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-히드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-함유 측쇄; 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 리신, 아르기닌, 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및, 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-함유 측쇄를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 기는 예를 들어, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 리신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구체예에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 생성에 사용된 바와 같이 알라닌으로 단백질의 어떤 원래의 잔기의 치환도 될 수 있다. 일부 구체예에서, Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스 (log-likelihood matrix)에서 양수 값을 갖는 보존적 치환이 만들어지며, 본원에 참고로 포함된다. 일부 구체예에서, PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 비음수 값을 갖는 치환이 적당한 보존적 치환이다.
일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 이들의 기능적 단편 (예를 들어, B 세포로부터 발현 및 분비를 허용하는 단편)에서 잔기 위치는 아미노산 서열이 여기에 나열된 경쇄와 동일하지 않지만, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 다르다.
구절 "에피토프-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR을 갖고 에피토프를 선택적으로 인식할 수 있는, 예를 들어, 약 1 미크로몰 이하 (예를 들어, 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 Μ, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M인 KD)의 KD로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료적 에피토프-결합 단백질 (예를 들어, 치료적 항체)은 종종 나노몰 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 필요로 한다.
구절 "기능적 단편"은 발현되고, 분비되고, 미크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인식은 적어도 미크로몰 범위, 나노몰 범위, 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 갖는 것을 포함한다.
용어 "생식세포"는 비-체세포 돌연변이된 세포, 예를 들어, 비-체세포 돌연변이된 B 세포 또는 전-B 세포 또는 조혈 세포의 면역글로불린 핵산 서열에 대한 기재를 포함한다.
구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열도 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시되지 않으면, 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인을 따라 (N-말단에서 C-말단으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 에피토프를 특이적으로 인식 (예를 들어, 미크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프를 인식)할 수 있고, 세포로부터 발현하고 분비할 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열에 관하여 사용될 때 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는, 업계에 알려진 많은 다른 알고리즘에 의해 결정된 동일성을 포함한다. 여기에 설명된 일부 구체예에서, 동일성은 10.0의 오픈 갭 패널티 (open gap penalty), 0.1의 연장 갭 패널티 (extend gap penalty)를 이용하는 ClustalW v.1.83 (느림) 정렬을 사용하여, 및 Gonnet 유사성 매트릭스 (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)을 사용하여 결정되었다. 서열의 동일성에 관하여 비교된 서열의 길이는 특정 서열에 의존할 것이지만, 경쇄 불변 도메인의 경우에, 길이는 표준 경쇄 불변 도메인을 형성하기 위해 자가 결합 (self-association)할 수 있는, 예를 들어, 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트 (sheet)를 형성할 수 있고 사람 또는 마우스의 적어도 하나의 CH1 도메인과 상호작용할 수 있는 경쇄 불변 도메인으로 폴딩 (fold)하기 위해 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다. CH1 도메인의 경우에, 서열의 길이는 베타 가닥을 포함하는 두 개의 베타 시트를 형성할 수 있고 마우스 또는 사람의 적어도 하나의 경쇄 불변 도메인과 상호작용할 수 있는 CH1 도메인으로 폴딩하기 위해 충분한 길이의 서열을 함유해야 한다.
구절 "면역글로불린 분자"는 두 개의 면역글로불린 중쇄 및 두 개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 중쇄는 동일하거나 다를 수도 있고, 경쇄는 동일하거나 다를 수도 있다.
구절 "경쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않으면 사람 κ 및 λ 경쇄 및 VpreB, 뿐만 아니라 대리 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은 달리 명시되지 않으면, 전형적으로 세 개의 경쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전체 길이 경쇄는, 아미노 말단에서 카르복실 말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 경쇄는 예를 들어, 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타난 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 에피토프에 결합하거나 이를 인식하는 중쇄에 결합하고 이를 인식하거나 지원하는 것들을 포함한다. 보통의 경쇄는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유도된 것들이고 체세포 돌연변이된 (예를 들어, 친화도 성숙한) 버젼을 포함한다.
구절 "미크로몰 범위"는 1-999 미크로몰을 의미하는 것이다; 구절 "나노몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하는 것이다; 구절 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하는 것이다.
구절 "체세포 돌연변이된"은 클래스 스위칭 (class-switching)을 경험한 B 세포의 핵산 서열에 대한 기재를 포함하며, 클래스 스위칭된 B 세포에서 면역글로불린 가변 영역의 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는) 핵산 서열은 클래스 스위칭 전에 B 세포의 핵산 서열과 동일하지 않다, 예를 들어, 클래스 스위칭을 경험하지 않은 B 세포 및 클래스 스위칭을 경험한 B 세포 사이에서 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열의 차이이다. "체세포 돌연변이된"은 친화도-성숙한 B 세포의 해당 면역글로불린 가변 영역 서열과 동일하지 않은 친화도-성숙한 B 세포의 핵산 서열 (즉, 생식세포의 게놈의 서열)에 대한 기재를 포함한다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 또한 원하는 에피토프에 B 세포의 노출 후 B 세포의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 기재를 포함하며, 핵산 서열은 원하는 에피토프에 B 세포의 노출 전에 해당 핵산 서열과 다르다. 구절 "체세포 돌연변이된"은 면역원 도전에 반응하여, 동물, 예를 들어, 사람 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 갖는 마우스에서 생성되고 이러한 동물에서 선천적으로 조작 가능한 선택 공정으로부터 발생하는 항체의 서열을 나타낸다.
핵산 서열에 관하여 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포의 생식세포에 존재하는 핵산 서열을 포함한다.
구절 "가변 도메인"은 N-말단에서 C-말단으로의 서열에서 (달리 지시되지 않으면), 다음 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (원하는 바와 같이 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
공통
경쇄
유용한 다중 특이적 에피토프-결합 단백질, 예를 들어, 이중 특이적 항체를 만들기 위한 노력 전에, 흔히 공통 패러다임을 공유하는 다양한 문제에 의해 방해된다: 합리적으로 조작하거나, 시행착오를 통해 조작하기 위한 서열의 시험관 내 선택 또는 조작, 헤테로다이머 이중 특이적 사람 면역글로불린의 짝을 이루는데 적합한 포맷. 불행하게도, 시험관 내 조작 접근 중 모두가 아닌 대부분이, 전혀 아닌 경우, 개개의 분자에 적합한 주로 즉석의 고정을 제공한다. 반면에, 사람 치료로 이어질 수 있는 적절한 페어링 (pairing)을 선택하기 위해 복잡한 유기체를 이용하는 생체 내 방법은 실현되지 않았다.
일반적으로, 원래의 마우스 서열은 종종 사람 치료적 서열에 대한 좋은 공급원은 아니다. 적어도 그 이유를 위해, 공통 사람 경쇄와 짝을 이루는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 생성하는 것은 제한된 실용 가치이다. 불확실한 결과로, 공통 사람 경쇄와 커플링하는 능력을 유지하면서 에피토프 특이성 및 친화도를 유지하는 것을 희망하는 한편 더 많은 시험관 내 조작 노력이 마우스 중쇄 가변 서열을 사람화하기 위해 시도하는 시행착오 공정에서 소비될 것이다. 이러한 공정의 끝에서, 최종 생성물은 특이성 및 친화도 중 일부를 유지할 수도 있고, 공통 경쇄와 결합되지만, 궁극적으로 사람의 면역원성은 심각한 위험으로 남아있을 가능성이 있다.
그러므로, 사람 치료제를 만드는데 적합한 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 대신에 사람 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 적합하게 큰 레퍼토리를 포함한다. 사람 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 중쇄 불변 도메인을 재배열하고 이와 재조합하여 역 키메라 중쇄 (즉, 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 영역을 포함하는 중쇄)를 형성할 수 있어야 한다. 중쇄는 중쇄 가변 도메인의 적합하게 큰 레퍼토리가 사람 경쇄 가변 영역의 제한된 레퍼토리와 결합될 수 있는 것을 선택하는 마우스에 대하여 이용 가능하도록 클래스 스위칭 및 체세포 초돌연변이가 가능해야 한다.
복수의 중쇄에 대한 공통 경쇄를 선택하는 마우스는 실용 가치를 갖는다. 다양한 구체예에서, 공통 경쇄만을 발현할 수 있는 마우스에서 발현하는 항체는 동일한 또는 실질적으로 동일한 경쇄와 결합되고 이와 함게 발현할 수 있는 중쇄를 가질 것이다. 이것은 이중 특이적 항체를 만드는데 있어서 특히 유용하다. 예를 들어, 이러한 마우스는 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해서 제1 면역원으로 면역화될 수 있다. 마우스 (또는 유전적으로 같은 마우스)는 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 생성하기 위해서 제2 면역원으로 면역화될 수 있다. 가변 중쇄 영역은 B 세포로부터 클로닝될 수 있고 같은 중쇄 불변 영역, 같은 경쇄를 발현하고, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 세포에서 발현되며, 이중 특이적 항체의 경쇄 성분이 경쇄 성분에 결합되거나 이를 발현하기 위해 마우스에 의해 선택된다.
발명자는 중쇄의 상당히 다양한 패밀리와 적합하게 짝을 이룰 면역글로불린 경쇄를 생성하기 위해 마우스를 조작하였으며, 가변 영역이 생식세포 서열에서 출발하는 중쇄, 예를 들어, 친화도 성숙한 또는 체세포 돌연변이된 가변 영역을 포함한다. 다양한 구체예에서, 마우스는 체세포 돌연변이를 포함하는 사람 중쇄 가변 도메인과 사람 경쇄 가변 도메인이 짝을 이루도록 고안되며, 따라서 사람 치료제로서 사용에 적합한 고 친화도 결합 단백질에 대한 루트를 가능하게 한다. 유기체 내에서 항체 선택의 길고 복잡한 공정을 통해, 유전적으로 조작된 마우스는 제한된 수의 사람 경쇄 옵션과 사람 중쇄 가변 도메인의 다양한 수거를 짝을 이루는데 있어서 생물학적으로 적절하게 선택하였다. 이를 달성하기 위해, 마우스는 매우 다양한 사람 중쇄 가변 도메인 옵션과 함께 제한된 수의 사람 경쇄 가변 도메인 옵션을 제공하도록 조작된다. 면역원으로 도전에서, 마우스는 항체를 그것의 레퍼토리에서 면역원으로 개발하기 위한 용액의 수를 최대화하며, 그것의 레퍼토리의 수 또는 경쇄 옵션에 의해 크게 또는 전적으로 제한된다. 다양한 구체예에서, 이것은 그럼에도 불구하고 마우스가 특히 체세포 돌연변이된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하는, 상대적으로 크게 다양한 사람 중쇄 가변 도메인과 호환될 경쇄 가변 도메인의 적합하고 호환 가능한 체세포 돌연변이를 달성하는 것을 허용한다.
경쇄 옵션의 제한된 레퍼토리를 달성하기 위해, 마우스는 원래의 마우스 경쇄 가변 도메인을 만들거나, 재배열하는 그것의 능력을 비기능적 또는 실질적으로 비기능적으로 만들기 위해 조작된다. 이것은, 예를 들어, 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 삭제함으로써 달성될 수 있다. 내인성 마우스 자리는 선택되는 외인성 적합한 사람 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트에 의해 변형되고, 외인성 사람 가변 영역 유전자 세그먼트가 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 결합하고 재배열된 역 키메라 경쇄 유전자 (사람 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 조작 가능하게 결합될 수 있다. 다양한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포 돌연변이될 수 있다. 다양한 구체예에서, 체세포 돌연변이를 획득하는 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위해, 적절한 인핸서(들)이 마우스에서 유지된다. 예를 들어, 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트로 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트를 대체하도록 마우스 κ 경쇄 자리를 변형시키는데 있어서, 마우스 κ 인트론의 인핸서 및 마우스 3' 인핸서는 기능적으로 유지되거나, 붕괴되지 않는다.
다양한 역 키메라 (사람 가변, 마우스 불변) 중쇄와 결합된 역 키메라 (사람 가변, 마우스 불변) 경쇄의 제한된 레퍼토리를 발현하는, 유전적으로 조작된 마우스가 제공된다. 다양한 구체예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 세그먼트는 삭제되고 단일 (또는 두 개의) 재배열된 사람 경쇄 영역과 대체되며, 내인성 마우스 Cκ 유전자에 조작 가능하게 결합된다. 재배열된 사람 경쇄 영역의 체세포 초돌연변이를 최대화하는 구체예에서, 마우스 κ 인트론의 인핸서 및 마우스 κ3' 인핸서는 유지된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 또한 비기능적 λ 경쇄 자리, 또는 이들의 삭제 또는 자리가 λ 경쇄를 만들 수 없게 하는 삭제를 포함한다.
다양한 구체예에서, 내인성 마우스 경쇄 VL 및 JL 유전자 세그먼트가 부족하고 마우스 불변 영역에 조작 가능하게 결합된, 재배열된 사람 경쇄 가변 영역, 한 구체예에서, 재배열된 사람 VL/JL 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 자리를 포함하는, 유전적으로 조작된 마우스가 제공되며, 자리는 체세포 초돌연변이를 경험할 수 있고, 자리는 마우스 불변 영역에 결합된 사람 VL/JL 서열을 포함하는 경쇄를 발현한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 자리는 마우스 κ3' 인핸서를 포함하며, 이것은 정상, 또는 야생형 수준의 체세포 초돌연변이와 연관성이 있다.
다양한 구체예에서, 유전적으로 조작된 마우스는 원하는 항원으로 면역화될 때 하나 또는 두 개의 재배열된 경쇄와 함께 발현하고 기능하는 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 다양한 재배열을 나타내는 B 세포를 생성하며, 하나 또는 두 개의 경쇄가 예를 들어, 1 내지 5개의 체세포 돌연변이를 포함하는 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 구체예를 포함한다. 다양한 구체예에서, 그렇게 발현된 사람 경쇄는 마우스에서 발현된 어떤 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역에도 결합되고 이와 함께 발현할 수 있다.
하나 이상의
에피토프에
결합하는
에피토프
-결합 단백질
여기에 설명된 것의 조성물 및 방법은 고 친화도로 하나 이상의 에피토프에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어, 이중 특이적 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이점은 적합하게 높은 결합 (예를 들어, 친화도 성숙한) 중쇄 면역글로불린 사슬을 선택하는 능력을 포함하며, 이것들 각각은 단일 경쇄에 결합될 것이다.
이증 특이적 결합 단백질의 합성 및 발현은 부분적으로 두 개의 다른 중쇄에 결합되고 이와 함께 발현할 수 있는 적합한 경쇄를 확인하는 것과 연관된 문제로 인해 및 부분적으로 분리 문제로 인해, 문제가 있었다. 여기에 설명된 방법 및 조성물은 유전적으로 변형된 마우스가, 달리 자연스러운 공정을 통해, 하나 이상의 중쇄에 결합되고 이와 함께 발현할 수 있는 적합한 경쇄를 선택하는 것을 허용하며, 체세포 돌연변이된 (예를 들어, 친화도 성숙한) 중쇄를 포함한다. 여기에 설명된 바와 같이 역 키메라 중쇄 (즉, 사람 가변 및 마우스 불변)를 갖는 친화도 성숙한 항체를 발현하는, 면역화된 마우스 적합한 B 세포의 사람 VL 및 VH 서열은 적합한 사람 불변 영역 유전자 서열 (예를 들어, 사람 IgG1)을 갖는 발현 벡터에서 확인되고 인 프레임 (in frame) 클로닝될 수 있다. 이러한 두 개의 구조가 제조될 수 있으며, 각 구조는 다른 에피토프에 결합하는 사람 중쇄 가변 도메인을 암호화한다. 생식세포 서열에서 또는 서열이 체세포 돌연변이된 B 세포의 사람 VL (예를 들어, 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1) 중 하나는 적합한 사람 불변 영역 유전자 (예를 들어, 사람 κ 불변 유전자)에 인 프레임 융합될 수 있다. 이들 세 개의 완전한 사람 중쇄 및 경쇄 구조는 발현에 적합한 세포에 배치될 수 있다. 세포는 두 개의 주요 종을 발현할 것이다: 동일한 경쇄와 함께 호모다이머 중쇄, 및 동일한 경쇄와 함께 헤테로다이머 중쇄. 이들 주요 종의 손쉬운 분리를 허용하기 위해, 중쇄 중 하나는 단백질 A-결합 결정 요소를 생략하도록 변형되며, 헤테로다이머 결합 단백질과 다른 호모 다이머 결합 단백질의 친화도를 발생시킨다. 이 문제를 해결하는 조성물 및 방법은 US 2010/0331527A1로 공개된, "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format"이라는 제목의, 2010년 6월 25일 출원된 USSN 12/832,838에 설명되며, 본원에 참고로 포함된다.
한 양태에서, 여기에 설명된 바와 같이 에피토프-결합 단백질이 제공되며, 사람 VL 및 VH 서열은 여기에 설명된, 원하는 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된 마우스로부터 유도된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 에피토프-결합 단백질이 제공되며, 제1 폴리펩티드는, N-말단에서 C-밀단으로, 제1 에피토프에 이어진, IgG1, IgG2, IgG4, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 불변 영역에 선택적으로 결합하는 제1 에피토프-결합 영역을 포함하고; 제2 폴리펩티드는, N-말단에서 C-밀단으로, 제2 에피토프에 이어진, IgG1, IgG2, IgG4, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하는 불변 영역에 선택적으로 결합하는 제2 에피토프-결합 영역을 포함하며, 제2 CH3 영역은 단백질 A에 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 H95R 변형 (IMGT 엑손 번호 매기기에 의해; EU 번호 매기기에 의해 H435R)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제2 CH3 영역은 Y96F 변형 (IMGT; EU에 의해 Y436F)을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 사람 IgG1의 것이고, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I)로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 사람 IgG2의 것이고, N44S, K52N, and V82I (IMGT; EU에 의해 N384S, K392N, 및 V422I)로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 사람 IgG4의 것이고 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, and V82I (IMGT; EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I)로 구성된 그룹으로부터 선택된 변형을 더 포함한다.
하나 이상의 에피토프에 결합하는 에피토프-결합 단백질을 만드는 방법은 본 발명에 따라 제1 마우스를 원하는 제1 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화하는 것이며, 마우스는 경쇄를 재배열하고 형성할 수 있는 내인성 마우스 VL을 함유하지 않는 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 영역 자리를 포함하며, 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 영역 자리에서 단일 재배열된 사람 VL 영역은 마우스 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합되고, 재배열된 사람 VL 영역은 사람 Vκ1-39Jκ5 및 사람 Vκ3-20Jκ1로부터 선택되고, 내인성 마우스 VH 유전자 세그먼트는 사람 VH 유전자 세그먼트로 전부 또는 부분적으로 대체되고, 마우스에 의해 만들어진 면역글로불린 중쇄는 전적으로 또는 실질적으로 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 포함하는 중쇄이다. 면역화될 때, 이러한 마우스는 역 키메라 항체를 만들 것이며, 두 개의 사람 경쇄 가변 도메인 중 하나 (예를 들어, 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1 중 하나)만을 포함한다. 원하는 에피토프에 결합하는 VH를 암호화하는 B 세포가 확인될 때, VH (및, 선택적으로, VL)의 뉴클레오티드 서열은 검색될 수 있고 (예를 들어, PCR에 의해) 적합한 사람 면역글로불린 불변 도메인을 갖는 인 프레임 발현 구조에 클로닝될 수 있다. 이 공정은 제2 에피토프에 결합하는 제2 VH 도메인을 확인하기 위해 반복될 수 있고, 제2 VH 유전자 서열은 검색될 수 있고 제2 적합한 면역글로불린 불변 도메인에 대한 인 프레임 발현 벡터에 클로닝될 수 있고, 제1 및 제2 면역글로불린 불변 도메인은 같은 또는 다른 이소타입일 수 있고, 면역글로불린 불변 도메인 중 하나는 (하지만 다른 것은 아님) 여기에 또는 US 2010/0331527A1에 설명된 바와 같이 변형될 수 있고, 예를 들어, US 2010/0331527A1에 설명된 바와 같이, 에피토프-결합 단백질은 적합한 세포에서 발현될 수 있고 호모다이머 에피토프-결합 단백질에 비교하여 단백질 A에 대한 그것의 다른 친화도에 기초하여 분리될 수 있다.
한 구체예에서, 이중 특이적 에피토프-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 제1 친화도-성숙한 (예를 들어, 하나 이상의 체세포 초돌연변이를 포함하는) 사람 VH 뉴클레오티드 서열 (VH1)을 확인하는 단계, 여기에 설명된 바와 같이 마우스의 제2 친화도-성숙한 (예를 들어, 하나 이상의 체세포 초돌연변이를 포함하는) 사람 VH 뉴클레오티드 서열 (VH2)을 확인하는 단계, 중쇄 1 (HC1)의 형성에 대하여 US 2010/0331527A1에 설명된 바와 같이 단백질 A-결정 요소 변형이 부족한 사람 중쇄와 함께 인 프레임 VH1을 클로닝하는 단계, 중쇄 2 (HC2)의 형성에 대하여 US 2010/0331527A1에 설명된 바와 같이 단백질 A-결정 요소 변형이 부족한 사람 중쇄와 함께 인 프레임 VH2를 클로닝하는 단계, HC1을 포함하는 발현 벡터 및 HC2를 포함하는 같은 또는 다른 발현 벡터를 세포에 도입하며, 세포는 또한 사람 경쇄 불변 도메인에 융합된 사람 Vκ1-39/사람 Jκ5 또는 사람 Vκ3-20/사람 Jκ1을 포함하는 사람 면역글로불린 경쇄를 발현하는 단계, 세포가 VH1에 의해 암호화된 VH 도메인 및 VH2에 의해 암호화된 VH 도메인을 포함하는 이중 특이적 에피토프-결합 단백질을 발현하는 것을 허용하는 단계, 및 단일 특이적 호모다이머 에피토프-결합 단백질과 비교하여 단백질 A에 결합하는 그것의 다른 능력에 기초하여 이중 특이적 에피토프-결합 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 특정한 구체예에서, HC1은 IgG1이고, HC2는 변형 H95R (IMGT; EU에 의해 H435R)을 포함하고 변형 Y96F (IMGT; EU에 의해 Y436F)를 더 포함하는 IgG1이다. 한 구체예에서, VH1에 의해 암호화된 VH 도메인, VH2에 의해 암호화된 VH 도메인, 또는 둘 다는 체세포 돌연변이된다.
공통 사람
V
L
과 함께 발현하는 사람
V
H
유전자
네 개의 다른 항원에 대하여 증가한 친화도-성숙한 항체의 다양한 사람 가변 영역은 그것들의 동족 경쇄, 또는 사람 Vκ1-39Jκ5, 사람 Vκ3-20Jκ1, 또는 사람 VpreBJλ5로부터 선택된 사람 경쇄 중 적어도 하나와 함께 발현된다 (실시예 1을 참고하면 된다). 각각의 항원에 대한 항체에 대하여, 체세포 돌연변이된, 다른 유전자 패밀리의 고 친화도 중쇄는 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 성공적으로 짝을 이루었고 중쇄 및 경쇄를 발현하는 세포로부터 분비된다. Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1에 대하여, 다음 사람 VH 유전자 패밀리로부터 유도된 VH 도메인이 바람직하게 발현되었다: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 및 6-1. 따라서, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 중 하나 또는 둘 다로부터 사람 VL 도메인의 제한된 레퍼토리를 발현하도록 조작된 마우스는 마우스 VH 유전자 세그먼트를 사람 VH 유전자 세그먼트로 대체하도록 변형된 VH 자리의 체세포 돌연변이된 사람 VH 도메인의 다양한 집단을 발생시킬 것이다.
단일 재배열된 경쇄 (예를 들어, Vκ1-39/J 또는 Vκ3-20/J)과 결합된 역 키메라 (사람 가변, 마우스 불변) 면역글로불린 중쇄를 발현하도록 조작된 유전적으로 조작된 마우스는, 원하는 항원으로 면역화될 때, 다양한 사람 VH 재배열을 포함하는 B 세포를 발생시켰고 그것의 리간드에 항원의 결합을 차단하는 그것들의 능력에 관하여 및 항원의 변이체에 결합하는 그것들의 능력에 관하여 다양한 성질을 가진 다양한 고-친화도 항원-특이적 항체를 발현시켰다 (실시예 5 내지 10을 참고하면 된다).
따라서, 여기에 설명된 마우스 및 방법은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 만들고 선택하는데 있어서 유용하며, 다양한 재배열로부터 발생하고, 광범위한 친화도 (약 나노몰 이하의 KD를 나타내는 것을 포함), 광범위한 특이성 (같은 항원의 다른 에피토프에 결합하는 것을 포함)을 나타내고, 같은 또는 실질적으로 같은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 결합되고 이와 함께 발현되는, 체세포 돌연변이된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
다음 예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 설명하기 위해 제공되고, 발명자가 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관한 정확도를 보장하기 위해 노력하였지만 일부 실험 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 일부는 중량의 일부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨로 표시되고, 압력은 대기압 정도이다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 설명하기 위해 제공되고, 발명자가 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 달리 지시되지 않으면, 온도는 섭씨로 표시되고 압력은 대기압 정도이다.
실시예
1
선택된 사람
V
L
영역과
결합된
사람
V
H
영역의 확인
단일 재배열된 사람 생식세포 경쇄가 항원 특이적 사람 항체의 사람 중쇄와 동시 발현할 수 있는지 결정하기 위해 시험관 내 발현 시스템을 구성하였다.
유전적으로 변형된 마우스에서 사람 항체를 발현시키는 방법이 알려져 있다 (예를 들어, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®을 참고하면 된다). VELOCIMMUNE® 기술은 항원 자극에 반응하여 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하는, 내인성 마우스 불변 영역 자리에 작동 가능하게 결합된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전적으로 변형된 마우스의 발생을 수반한다. VELOCIMMUNE® 마우스로부터 생산된 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 완전히 사람의 것이다. 처음에, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고 친화도 키메라 항체가를 분리한다. 하기 설명된 바와 같이, 항체를 특성화하고 친화도, 선택성, 에피토프, 등을 포함하는 바람직한 특성에 대하여 선택한다. 마우스 불변 영역은 비-IgM 이소타입, 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 함유하는 완전한 사람 항체를 생성하기 위해 원하는 사람 불변 영역으로 대체된다. 선택된 불변 영역이 특이적인 사용에 따라 다를 수도 있는 한편, 고 친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 있다.
VELOCIMMUNE® 마우스를 혈관 형성 (angiogenesis)을 촉진하는 성장 인자 (항원 C)로 면역화하였고 항원-특이적 사람 항체를 업계에 인식된 표준 기술을 사용하여 V 유전자 사용량에 대하여 분리하고 시퀀싱하였다. 선택된 항체를 사람 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 클로닝하였고 69개의 중쇄를 세 개의 사람 경쇄 중 하나와 짝을 이루기 위해 선택하였다: (1) 사람 κ 불변 영역에 결합된 동족 κ 경쇄, (2) 사람 κ 불변 영역에 결합된 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5, 또는 (3) 사람 κ 불변 영역에 결합된 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1. 각 중쇄 및 경쇄 짝을 표준 기술을 사용하여 CHO-K1 세포에 동시-트랜스펙션하였다. ELISA 검정에서 항-사람 IgG에 의해 상층액에서 항체의 존재를 검출하였다. 항체 역가 (ng/ml)를 각 중쇄/경쇄 짝에 대하여 결정하였고 다른 재배열된 생식세포 경쇄의 역가는 모체 항체 분자 (즉, 동족 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻은 역가와 비교하였고 원래의 역가의 퍼센트를 계산하였다 (표 1). VH: 중쇄 가변 유전자. ND: 현재 실험 조건 하에서 발현이 검출되지 않음.
표 1
유사한 실험에서, VELOCIMMUNE® 마우스를 여러 다른 항원으로 면역화하였고 항원 특이적 사람 항체의 선택된 중쇄를 다른 재배열된 사람 생식세포 경쇄와 짝을 이루는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다 (상기 설명된 바와 같음). 이 실험에 사용된 항원은 콜레스테롤 항상성에 수반된 효소 (항원 A), 글루코스 항상성을 조절하는데 수반된 혈청 호르몬 (항원 B), 혈관 형성을 촉진하는 성장 인자 (항원 C) 및 세포-표면 수용체 (항원 D)를 포함하였다. 항원 특이적 항체를 각 면역화 그룹의 마우스로부터 분리하였고 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하였고 시퀀싱하였다. 중쇄 및 경쇄의 서열로부터, V 유전자 사용량을 결정하였고 선택된 중쇄는 그것들의 동족 경쇄 또는 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역과 짝을 이루었다. 각 중쇄/경쇄 짝을 CHO-K1 세포에서 동시 트랜스펙션하였고 상층액에서 항체의 존재를 ELISA 검정에서 항-사람 IgG에 의해 검출하였다. 각 중쇄/경쇄 페어링에 대한 항체 역가 (pg/ml)를 결정하였고 다른 재배열된 사람 생식세포 경쇄의 역가를 모체 항체 분자 (동족 경쇄와 짝을 이룬 중쇄)로 얻은 역가와 비교하였고 원래의 역가의 퍼센트를 계산하였다 (표 2). VH: 중쇄 가변 유전자. Vκ: 경쇄 가변 유전자. ND: 현재 실험 조건 하에서 발현이 검출되지 않음.
표 2
이들 실험으로부터 얻은 결과는 체세포 돌연변이된, 다른 유전자 패밀리의 고 친화도 중쇄가 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 영역과 짝을 이룰 수 있고 정상 항체 분자로서 세포로부터 분비될 수 있다. 표 1에 나타난 바와 같이, 항체 역가는 모체 항체의 동족 경쇄와 비교하여 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄와 짝을 이룰 때 약 61 % (69개 중 42개) 중쇄 및 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이룰 때 약 29% (69개 중 20개) 중쇄에 대하여 증가하였다. 약 20% (69개 중 14개)의 중쇄에 대하여, 두 개의 재배열된 사람 생식세포 경쇄는 모체 항체의 동족 경쇄와 비교하여 발현의 증가를 부여하였다. 표 2에 나타난 바와 같이, 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역은 모체 항체에 대한 동족 경쇄와 비교하여 다른 등급의 항원의 범위에 특이적인 여러 중쇄의 발현의 증가를 부여하였다. 항체 역가는 모체 항체의 동족 경쇄와 비교하여 중쇄의 약 35% (15/43)에 대하여 두 배 이상 증가하였다. 두 개의 중쇄 (315 및 316)에 대하여, 증가량은 모체 항체와 비교하여 열 배 이상 더 컸다. 모체 항체의 동족 경쇄에 비해 증가 발현을 나타낸 모든 중쇄 내에서, 패밀리 3 (VH3) 중쇄는 다른 중쇄 가변 영역 유전자 패밀리와 비교할 때 지나치게 많이 나타난다. 이것은 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 경쇄와 짝을 이루는 사람 VH3 중쇄의 바람직한 관계를 입증한다.
실시예
2
재배열된 사람 생식세포
경쇄
자리의 생성
다양한 재배열된 사람 생식세포 경쇄 표적화 벡터를 마우스 게놈 Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 클론 302g12 및 254m04 (Invitrogen)를 변형시키기 위해 VELOCIGENE® 기술을 사용하여 만들었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6):652-659를 참고하면 된다). 이들 두 개의 BAC 클론을 사용하여, 게놈 구조를 단일 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역을 함유하도록 조작하였고 이전에 내인성 κ 가변 및 결합 유전자 세그먼트를 삭제하도록 변형된 내인성 κ 경쇄 자리에 삽입하였다.
재배열된 사람 생식세포 경쇄 표적화 벡터의 구조. 세 개의 다른 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역을 업계에 인식된 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 만들었다. 이들 세 개의 영역을 구성하는데 사용된 사람 가변 유전자 세그먼트는 재배열된 사람 Vκ1-39Jκ5 서열, 재배열된 사람 Vκ3-20Jκ1 서열 및 재배열된 사람 VpreBJλ5 서열을 포함하였다.
마우스 Vκ3-7 유전자의 엑손 1 (선도 펩티드를 암호화) 및 인트론 1을 함유하는 DNA 세그먼트를 데 노보 (de novo) DNA 합성 (Integrated DNA Technologies)에 의해 만들었다. 자연 발생한 BlpI 제한 효소 부위까지의 5' 비번역된 영역의 일부를 포함하였다. 사람 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자의 엑손을 사람 게놈 BAC 라이브러리로부터 PCR 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 마우스 Vκ3-7 유전자의 인트론 1의 스플라이스 수용 부위를 함유하는 5' 연장을 갖는다. 사람 Vκ1-39 서열의 PCR에 사용된 역방향 프라이머는 사람 Jκ5를 암호화하는 연장을 포함하는 반면, 사람 Vκ3-20 서열에 사용된 역방향 프라이머는 사람 Jκ1을 암호화하는 연장을 포함하였다. 사람 VpreBJλ5 서열을 데노보 DNA 합성 (Integrated DNA Technologies)에 의해 만들었다. 스플라이스 기증 부위를 포함하는 사람 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI로부터 PCR 증폭하였다. 정방향 PCR 프라이머는 사람 Jκ5, Jκ1, 또는 Jλ5 서열의 일부를 암호화하는 연장을 포함하였다. 역방향 프라이머는 PI-SceI 부위를 포함하였으며, 이것은 이전에 인트론으로 조작되었다.
마우스 Vκ3-7 엑손 1/인트론 1, 사람 가변 경쇄 엑손, 및 사람 Jκ-Cκ 인트론 단편을 중첩 연장 PCR에 의해 봉합되었고, BlPI 및 PI-SceI으로 분해하였고, 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI에 결찰하였으며, 이것은 사람 Vκ3-15 가변 유전자 세그먼트의 프로모터를 함유하였다. 플라스미드 pBS-296-HA18-PISceI 내의 록스된 (loxed) 히그로마이신 카세트를 NotI 및 AscI 부위에 의해 플랭크된 (flanked) FRTed 히그로마이신 카세트로 대체하였다. 이 플라스미드의 NotI/PI-SceI 단편을 변형된 마우스 BAC 254m04에 결찰하였으며, 이것은 마우스 Jκ-Cκ 인트론의 일부, 마우스 Cκ 엑손, 및 마우스 κ 자리의 약 75 kb의 게놈 서열 다운스트림을 포함하고, 이것은 마우스 ES 세포에서 상동 재조합을 위해 3' 상동성 팔을 제공하였다. 이 BAC의 NotI/AscI 단편을 변형된 마우스 BAC 302g12에 결찰하였으며, 이것은 마우스 ES 세포에서 상동 재조합을 위해 FRTed 네오마이신 카세트 및 내인성 κ 자리의 약 23 kb의 게놈 서열 업스트림을 함유하였다.
재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 표적화 벡터 (도 1). 제한 효소 부위를 표적화 벡터에 클로닝되는 조작 경쇄 인서트 (insert)의 5' 및 3' 끝에 도입하였다: 5' 끝의 AscI 부위 및 3' 끝의 PI-SceI 부위. 5' AscI 부위 및 3' PI-SceI 부위 내에 5'에서 3'으로의 표적 구조는 서열 5'을 함유하는 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 서열 5'을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 유전자, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 서열 3'을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하였다 (도 1, 가운데). 내인성 마우스 κ 경쇄 자리의 유전자 및/또는 서열 업스트림 및 대부분의 3' Jκ 유전자 세그먼트 (예를 들어, 내인성 3' 인핸서)의 다운 스트림은 표적 구조에 의해 변형되지 않았다 (도 1을 참고하면 된다). 조작된 사람 Vκ1-39Jκ5 자리의 서열은 SEQ ID NO:1에 나타난다.
재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역의, BAC DNA에 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역 내에 서열에 위치한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 인트론 서열 3'을 프라이머 ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:3)로 확인하였다. 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머 1633-h2F, 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO:4) 및 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO:5)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEQ ID NO:6) 및 neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEQ ID NO:7)로 확인하였다. 표적화된 BAC DNA를 마우스 ES 세포를 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 영역을 발현하는 키메라 마우스를 생성하는 인공적 변형된 ES 세포로 전기천공하기 위해 사용하였다.
양성 ES 세포 클론을 내인성 자리에 삽입된, 조작된 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 TAQMAN™ 스크리닝 및 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 프로브 neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에 결합하고, 프로브 ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO:9)는 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 인트론 서열 3' 내에 결합하고, 프로브 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO: 10)는 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 오픈 리딩 프레임 내에 결합한다. 양성 ES 세포 클론을 생식세포 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 발현하는 한배 새끼를 발생하도록 암컷 마우스를 이식하기 위해 사용하였다.
대안으로, 재배열된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포를 표적 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션하였다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 재조합효소 (예를 들어, US 6,774,279)를 발현하는 마우스를 사육함으로써 제거한다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 유지된다.
재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 표적화 벡터 (도 2). 유사한 방식으로, 조작된 경쇄 자리
재배열된 사람 생식 세포 Vκ3-20Jκ1 영역을 발현하는 조작된 경쇄 자리를, 5'에서 3'으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 서열 5'을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 서열 3'을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하는 표적 구조를 사용하여 만들었다 (도 2, 가운데). 조작된 사람 Vκ3-20Jκ1 자리의 서열은 SEQ ID NO:11에 나타난다.
BAC DNA에 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 영역의 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 내 서열에 위치한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 인트론 서열 3'을 프라이머 ULC-m1F (SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R (SEQ ID NO:3)로 확인하였다. 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO: 12) 및 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO: 13)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (SEQ ID NO:6) 및 neoR (SEQ ID NO:7)로 확인하였다. 표적화된 BAC DNA를 마우스 ES 세포를 재배열된 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 경쇄를 발현하는 키메라 마우스를 생성하는 인공적 변형된 ES 세포로 전기천공하기 위해 사용하였다.
양성 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 자리에 삽입된, 조작된 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 TAQMAN™ 스크리닝 및 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 프로브 neoP (SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에 결합하고, 프로브 ULC-m1P (SEQ ID NO:9)는 마우스 Vκ3-7 선도 서열 내에 결합하고, 프로브 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO: 14)는 사람 Vκ3-20Jκ1 오픈 리딩 프레임 내에 결합한다. 양성 ES 세포 클론을 암컷 마우스를 이식하기 위해 사용하였다. 한배 새끼는 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 발현한다.
대안으로, 사람 생식세포 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포는 표적 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션될 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 재조합효소 (예를 들어, US 6,774,279)를 발현하는 마우스를 사육함으로써 제거할 수도 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 유지된다.
재배열된 사람 생식세포 VpreBJX5 표적화 벡터 ( 도3 ). 유사한 방식으로, 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 영역을 발현하는 조작된 경쇄 자리를, 5'에서 3'으로, 마우스 BAC 클론 302g12로부터 얻은 내인성 마우스 κ 경쇄 자리에 대한 서열 5'을 함유하는 5' 상동성 팔, FRTed 네오마이신 저항 유전자, 사람 Vκ3-15 프로모터를 포함하는 게놈 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 선도 서열, 마우스 Vκ3-7 가변 유전자 세그먼트의 인트론 서열, 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 영역의 오픈 리딩 프레임, 사람 Jκ-Cκ 인트론의 일부를 함유하는 게놈 서열, 및 마우스 BAC 클론 254m04로부터 얻은 내인성 마우스 Jκ5 유전자 세그먼트의 서열 3'을 함유하는 3' 상동성 팔을 포함하는 표적 구조를 사용하여 만들었다 (도 3, 가운데). 조작된 사람 VpreBJλ5 자리는 SEQ ID NO:15에 나타난다.
BAC DNA에 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 영역의 표적화된 삽입을 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 영역 경쇄 영역 내 서열에 위치한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 마우스 Vκ3-7 선도 서열에 대한 인트론 서열 3'을 프라이머 ULC-m1F (SEQ ID NO:2) 및 ULC-m1R (SEQ ID NO:3)으로 확인하였다. 재배열된 사람 생식세포 VpreB 5 영역의 오픈 리딩 프레임을 프라이머 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO: 16) 및 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO: 17)로 확인하였다. 네오마이신 카세트를 프라이머 neoF (SEQ ID NO:6) 및 neoR (SEQ ID NO:7)로 확인하였다. 표적화된 BAC DNA를 마우스 ES 세포를 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 경쇄를 발현하는 키메라 마우스를 생성하는 인공적 변형된 ES 세포로 전기천공하기 위해 사용하였다.
양성 ES 세포 클론을 내인성 κ 경쇄 자리에 삽입된, 조작된 VpreBJλ5 경쇄 영역에 특이적인 프로브를 사용하여 TAQMAN™ 스크리닝 및 염색체 분석에 의해 확인하였다. 간략히 말해, 프로브 neoP (SEQ ID NO:8)는 네오마이신 마커 유전자 내에 결합하고, 프로브 ULC-m1P (SEQ ID NO:9)는 마우스 Vκ3-7 선도 서열 내에 결합하고, 프로브 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:18)는 사람 VpreBJλ5 오픈 리딩 프레임 내에 결합한다. 양성 ES 세포 클론을 생식세포 경쇄 영역을 발현하는 한배 새끼를 발생시키기 위해 암컷 마우스를 이식하기 위해 사용하였다.
대안으로, 재배열된 사람 생식세포 VpreBJλ5 경쇄 영역을 함유하는 ES 세포는 표적 구조에 의해 도입된 FRTed 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 FLP를 발현하는 구조로 트랜스펙션될 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트를 FLP 재조합효소 (예를 들어, US 6,774,279)를 발현하는 마우스를 사육함으로써 제거할 수도 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에 유지된다.
실시예
3
단일 재배열된 사람
경쇄를
발현하는 마우스의 생성
상기 설명된 표적화된 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용되고 VELOCIMOUSE® 방법에 의해 8-세포 단계 마우스 배아에 도입된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,294,754 및 Poueymirou et al. (2007) Generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99를 참고하면 된다). 조작된 사람 생식세포 Vκ1-39Jκ5 경쇄 영역, Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역 또는 VpreBJλ5 경쇄 영역을 독립적으로 함유하는 VELOCIMICE®는 독특한 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역의 존재를 검출하는 대립유전자 검정 (Valenzuela et ai, 상기)의 변형을 사용하는 지노타이핑 (genotyping)에 의해 확인된다.
한배 새끼를 지노타이핑하였고 독특한 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역에 이형 접합성 또는 동형 접합성인 새끼를 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역의 특징적인 발현에 대하여 선택한다.
유동 세포 분석법 ( Flow Cytometry ). 공통 경쇄 마우스의 정상 항체 레퍼토리에서 재배열된 사람 경쇄 영역의 발현을 공통 경쇄 마우스의 비장세포 및 말초 혈액에서 면역글로불린 κ 및 λ 발현의 분석에 의해 입증하였다. 야생형 (n=5), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 이형 접합체 (n=3), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형 접합체 (n=3), Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 이형 접합체 (n=2), 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형 접합체 (n=2) 마우스의 비장 및 말초 혈액의 세포 현탁액을 표준 방법을 사용하여 만들었고 형광으로 표지된 항체를 사용하여 CD19+, Igλ+ 및 Igκ+로 염색하였다 (BD Pharmigen).
간략히 말해, 1 x 106개의 세포를 항-마우스 CD16/CD32 (클론 2.4G2, BD Pharmigen)와 함께 얼음 상에서 10분 동안 배양한 후 이어서, 다음 항체 칵테일로 얼음 상에서 30분 동안 표지하였다: APC 콘쥬게이션된 (conjugated) 항-마우스 CD19 (클론 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 콘쥬게이션된 항-마우스 CD3 (클론 17A2, BioLegend), FITC 콘쥬게이션된 항-마우스 Igλ (클론 187.1, BD Pharmigen), PE 콘쥬게이션된 항-마우스 (클론 RML-42, BioLegend). 염색 후, 세포를 세척하였고 2% 포름알데히드에서 고정하였다. 데이터 수집을 LSRII 유동 세포 분석기에서 수행하였고 FlowJo로 분석하였다. 게이팅 (gating): 전체 B 세포 (CD19+CD3-), Igκ+ B 세포 (Igκ+Igλ-CD19+CD3-), Igλ+ B 세포 (Igκ-Igλ+CD19+CD3-). 혈액 및 비장세포 샘플로부터 모은 데이터는 유사한 결과를 입증하였다. 표 3은 Igλ+, Igκ+, 또는 Igλ+Igκ+인 각 그룹의 한 대표 마우스의 말초 혈액의 퍼센트 양성 CD19+ B 세포를 설명한다. 야생형 (WT) 및 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄에 대하여 동형 접합체인 마우스의 말초 혈액에서 CD19+ B 세포의 퍼센트는 도 4에 나타난다.
표 3
공통 경쇄 발현. 각 공통 경쇄 (Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1)의 발현을 이형 접합체 및 동형 접합체인 마우스에서 정량 PCR 검정 (예를 들어 TAQMAN™)을 사용하여 분석하였다.
간략히 말해, CD19+ B 세포를 제조사의 설명에 따라 마우스 CD19 Microbeads (Miltenyi Biotec)를 사용하여 야생형, 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 자리의, 해당 사람 중쇄 및 κ 경쇄 가변 영역 자리 (Ηκ)로 대체에 대하여 동형 접합체인 마우스, 뿐만 아니라 각 재배열된 사람 경쇄 영역 (Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1)에 대하여 동형 접합체 및 이형 접합체인 마우스의 비장으로부터 정제하였다. 전체 RNA를 제조사의 설명에 따라 RNeasy Mini 키트 (Qiagen)을 사용하여 CD19+ B 세포로부터 정제하였고 게놈 RNA를 RN아제가 없는 DN아제 컬럼 상 (on-column) 처리 (Qiagen)를 사용하여 제거하였다. 200 ng mRNA를 First Stand cDNA Synthesis 키트 (Invitrogen)을 사용하여 cDNA로 역전사하였고 결과의 cDNA를 Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 증폭시켰다. 모든 반응을 (1) 공통 경쇄 둘 다에 대한 Vκ-Jκ 접합, (2) Vκ 유전자 단독 (즉 Vκ1-39 및 Vκ3-20), 및 (3) 마우스 Cκ 영역을 스패닝 (spanning)하는 프라이머 및 Taqman MGB 프로브를 사용하는 ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 표 4는 이 검정에 이용된 프라이머 및 프로브의 서열을 설명한다. 상대적인 발현을 마우스 Cκ 영역의 발현으로 표준화하였다. 결과는 도 5a, 5b 및 5c에 나타난다.
표 4
항원 특이적 공통 경쇄 항체. 내인성 마우스 경쇄 자리에서 Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄를 함유하는 공통 경쇄 마우스는 β-갈락토시다제로 면역화되고 항체 역가를 측정하였다.
간략히 말해, β-갈락토시다제 (Sigma)를, 제조사의 지시에 따라, titermax 보조제 (Sigma)에서 에멀젼화하였다. 야생형 (n=7), Vκ1-39Jκ5 공통 경쇄 동형 접합체 (n=2) 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 동형 접합체 (n=5)를 100 pg β-갈락토시다제 Titermax로 피하 주사에 의해 면역화하였다. 마우스를 두 번, 3주 간격으로, 50 pg β-갈락토시다제/Titermax로 피하 주사에 의해 촉진하였다. 제2 촉진 후, 혈액을 제조사의 지시에 따라 레트로 오비탈 (retro-orbital) 출혈을 사용하여 마취된 마우스로부터 혈청 분리기 튜브 (BD Biosciences)로 수거하였다. 항-β-갈락토시다제 IgM 또는 IgG 항체를 측정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc)를 4 ℃에서 하룻밤 동안 1 pg/mL β-갈락토시다제로 코팅하였다. 과량의 항원을 1% BSA가 들어있는 PBS로 차단하기 전에 상온에서 1시간 동안 씻어냈다. 혈청의 단계 희석액을 플레이트에 추가하였고 세척 전에 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 HRP 콘쥬게이션된 항-IgM (Southern Biotech) 또는 항-IgG (Southern Biotech)와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 또 다른 세척 후, 플레이트를 TMB 기질 (BD Biosciences)로 발달하였다. 반응을 1 N 황산으로 중단하였고 OD450을 Victor X5 Plate Reader (Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. 데이터를 GraphPad Prism으로 분석하였고 신호를 배경의 두 배 이상인 혈청의 희석액으로 계산하였다. 결과는 도 6a 및 6b에 나타난다.
이 실시예에 나타난 바와 같이, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 공통 경쇄 마우스의 비장 및 말초 구획 둘 다에서 κ/λ B 세포의 비율은 거의 야생형 패턴을 입증하였다 (표 3 및 도 4). 하지만, VpreBJλ5 공통 경쇄 마우스는 더 적은 말초 B 세포를 입증하였으며, 이것들 중 약 1-2%는 조작된 사람 경쇄 영역을 발현한다 (데이터 미도시). 내인성 κ 경쇄 자리의 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1 재배열된 사람 경쇄 영역의 발현 수준은 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트로 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 완벽한 대체를 함유하는 내인성 κ 경쇄 자리와 비교하여 증가하였다 (도 5a, 5b 및 5c). VpreBJλ5 재배열된 사람 경쇄 영역 의 발현 수준은 이형 접합체 및 동형 접합체인 마우스 둘 다의 내인성 κ 경쇄 자리의 유사한 높은 발현을 입증하였다 (데이터 미도시). 이것은 마우스 λ, κ, 또는 내인성 경쇄 자리 둘 다와의 직접적인 경쟁에 있어서, 단일 재배열된 사람 VL/JL 서열은 내인성 κ 경쇄 자리의 야생형 수준 발현보다 더 많이 수득할 수 있고 정상 비장 및 혈액 B 세포 빈도를 일으킬 수 있다. 게다가, 사람 Vκ1-39Jκ5 또는 사람 Vκ3-20Jκ1을 갖는 조작된 κ 경쇄 자리의 존재는 마우스가 잘 허용되었고 면역 반응의 체액 성분에서 경쇄 레퍼토리의 실질적인 부분을 나타냄으로써 야생형 방식으로 기능하는 것으로 나타난다 (도 6a 및 6b).
실시예
4
단일 재배열된 사람 생식세포
경쇄를
발현하는 마우스의 교배
이 실시예는 다수의 유전적으로 변형된 면역글로불린 자리를 가진 다수의 유전적으로 변형된 마우스 균주를 생성하기 위해 여기에 설명된 공통 경쇄 마우스 중 어떤 하나와 교배할 수 있는 여러 다른 유전적으로 변형된 마우스 균주를 설명한다.
내인성 Ig λ 넉아웃 ( KO ). 조작된 경쇄 자리의 사용량을 최적화하기 위해, 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역 중 하나를 함유하는 마우스를 내인성 λ 경쇄 자리에서 삭제를 함유하는 또 다른 마우스와 교배시킨다. 이 방식으로, 획득한 자손은 실시예 2에 설명된 바와 같이, 그것들의 경쇄로서만, 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역을 발현할 것이다. 업계에 인식된 표준 기술에 의해 및, 대안으로, 상업적 사육자 (예를 들어, The Jackson Laboratory)에 의해 수행된다. 조작된 경쇄 자리 및 내인성 λ 경쇄 자리의 삭제를 함유하는 마우스를 독특한 경쇄 영역의 존재 및 내인성 마우스 λ 경쇄의 부재에 대하여 스크리닝한다.
사람화된 내인성 중쇄 자리. 조작된 사람 생식세포 경쇄 자리를 함유하는 마우스를 사람 중쇄 가변 유전자 자리로 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 자리의 대체를 함유하는 마우스와 교배시킨다 (US 6,596,541; VELOCIMMUNE® 마우스, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.를 참고하면 된다). VELOCIMMUNE® 마우스는 내인성 마우스 불변 영역 자리에 작동 가능하게 결합된 사람 중쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 포함하며, 항원성 자극에 반응하여 사람 중쇄 가변 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체를 생산한다. 항체의 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 사람 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 결합한다. DNA는 항체의 완전한 사람 중쇄를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.
내인성 κ 경쇄 자리에서 사람 VH 자리 및 단일 재배열된 사람 생식세포 VL 영역으로 내인성 마우스 VH 자리의 대체를 함유하는 마우스가 얻어진다. 단일 사람 경쇄 (사람 VL 및 마우스 CL)와 함께 체세포 돌연변이된 중쇄 (사람 VH 및 마우스 CH)를 함유하는 역 키메라 항체는 원하는 항원으로 면역화할 때 얻어진다. 항체를 발현하는 B 세포의 VH 및 VL 뉴클레오트디 서열이 확인되고 완전한 사람 항체가 만들어진다. VH 및 VL 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 시스템에서 사람 CH 및 CL 뉴클레오티드 서열에 융합시킴으로써 만들어진다.
실시예
5
사람
중쇄
및 재배열된 사람 생식세포
경쇄
영역을 발현하는 마우스의 항체의 생성
조작된 사람 경쇄 영역을 함유하는 마우스를 다른 내인성 Ig 자리의 변형 및 삭제를 함유하는 다양한 원하는 균주에 교배시킨 후 (실시예 4에 설명된 바와 같이), 선택된 마우스는 원하는 항원으로 면역화될 수 있다.
일반적으로, 단일 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역 중 하나를 함유하는 VELOCIMMUNE® 마우스는 항원으로 시도되고, 림프 세포 (예를 들어, B-세포)를 동물의 혈청으로부터 회수한다. 림프 세포를 골수종 세포주와 융합하여 불멸의 히브리도마 세포주를 제조하고, 이러한 히브리도마 세포주를 스크리닝하고 면역화에 사용된 항원에 특이적인 사람 중쇄 가변 및 재배열된 사람 생식세포 경쇄를 함유하는 항체를 생산하는 히브리도마 세포주를 확인하기 위해 선택한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 원하는 중쇄 및 경쇄의 이소타입 불변 영역에 결합한다.내인성 마우스 서열 및 내인성 자리에 존재하는 어떤 추가적인 씨스 (cis)-활성 인자의 존재로 인해, 각 항체의 단일 경쇄는 체세포 돌연변이될 수도 있다. 이것은 단일 경쇄 및 다양한 중쇄 서열을 포함하는 항원-특이적 레퍼토리에 추가적인 다양성을 추가한다. 결과의 클로닝된 항체 서열은 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 이후에 발현된다. 대안으로, 항원-특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원-특이적 림프구로부터 직접 확인한다.
처음에는, 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 고 친화도 카메라 항체를 분리한다. 상기 설명된 바와 같이, 항체는 특성화되고 친화도, 선택성, 에피토프, 등을 포함하는, 원하는 특성에 대하여 선택된다. 마우스 불변 영역을 원하는 사람 불변 영역으로 대체하여 본 발명의 재배열된 사람 생식세포 경쇄 영역으로부터 유도된 체세포 돌연변이된 사람 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 완전한 사람 항체를 발생시킨다. 적합한 사람 불변 영역은 예를 들어, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 포함한다.
VELOCIMMUNE® 마우스의 별도의 코호트 (cohort)
사람 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트로 내인성 마우스 중쇄 자리의 대체 및 조작된 생식세포 Vκ1-39Jκ5 사람 경쇄 영역 또는 조작된 생식세포 Vκ3-20Jκ1 사람 경쇄 영역으로 내인성 마우스 경쇄 자리의 대체를 함유하는 VELOCIMMUNE® 마우스의 별도의 코호트 (cohort)를 사람 세포-표면 수용체 단백질 (항원 E)로 면역화하였다. 항원 E를 3-4일 마다 6번의 연속적으로 주사된 마우스의 발바닥에 직접 투여한다. 항원 E의 두 개 내지 세 개의 유기체를 주사 전에 CpG 올리고뉴클레오티드 (Cat# tlrl-modn - ODN1826 올리고뉴클레오티드; InVivogen, San Diego, CA)의 10 pg 및 Adju-Phos (알루미늄 포스페이트 겔 보조제, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)의 25 pg와 혼합한다. 최종 항원 리콜 (recall) 전에 총 여섯 번의 주사가 제공되며, 희생하기 전 3-5일에 제공된다. 제4 및 제6 주사 후 출혈을 수거하였고 항체 면역 반응을 표준 항원-특이적 면역검정에 의해 관찰한다.
원하는 면역 반응이 도달될 때, 비장세포를 수확하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 그것들의 생존 능력을 보존하고 히브리도마 세포주를 형성한다. 히브리도마 세포주를 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해 스크리닝하고 선택한다. 이 기술을 사용하여, 여러 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 (즉, 사람 중쇄 가변 도메인, 같은 사람 경쇄 가변 도메인, 및 마우스 불변 도메인을 소유하는 항체)를 얻는다.
대안으로, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 U.S. 2007/0280945A1에 설명된 바와 같이 골수종에 융합시키지 않고 항원-양성 B 세포로부터 직접 분리하며, 특히 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이 방법을 사용하여, 여러 완전한 사람 항-항원 E 공통 경쇄 항체 (즉, 사람 중쇄 가변 도메인, 조작된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 조작된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역, 및 사람 불변 도메인을 소유하는 항체)를 얻었다.
이 실시예의 방법에 따라 생성된 전형적인 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 생물학적 성질은 하기 설명된 섹션에서 더 상세히 설명된다.
실시예
6
항원-특이적 공통
경쇄
항체에서
중쇄
유전자
세그먼트
사용량
생산된 사람 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 구조를 분석하기 위해, 중쇄 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산을 클로닝하였고 시퀀싱하였다. 항체의 핵산 서열 및 예측된 아미노산 서열로부터, 조작된 사람 Vκ1-39Jκ5 경쇄 또는 조작된 사람 Vκ3-20Jκ1 경쇄 영역을 함유하는 면역화된 VELOCIMMUNE® 마우스로부터 얻은 선택된 공통 경쇄 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR)에 대하여 유전자 사용량을 확인하였다. 결과는 표 5 및 6에 나타나며, 이것은 본 발명에 따르는 마우스가 사람 Vκ1-39-만의 경쇄 또는 사람 Vκ3-20-유도된 경쇄를 발현하는 마우스를 이용할 때, 다양한 재배열로 인해, 다양한 사람 중쇄 유전자 세그먼트의 항원-특이적 공통 경쇄 항체를 발생시킨다는 것을 입증한다. 2, 3, 4, 및 5 패밀리의 사람 VH 유전자 세그먼트는 다양한 사람 DH 세그먼트 및 사람 JH 세그먼트와 함께 재배열되어 항원-특이적 항체를 수득한다.
표 5
표 6
실시예
7
LUMINEX
™ 검정에 의한 항원-특이적 공통
경쇄
항체의 차단 능력의 결정
항원 E에 대하여 증가한 98개의 사람 공통 경쇄 항체를 비드-기반 검정에서 항원 E에 항원 E의 천연 리간드 (리간드 Y)의 결합을 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.
항원 E의 세포 외 도메인 (ECD)은 두 개의 myc 에피토프 태그 및 6X 히스티딘 태그 (항원 E-mmH)에 콘쥬게이션되었고 MES 버퍼에서 20 pg/mL의 농도로 카르복실화된 미소구체에 아민-커플링되었다. 혼합물을 상온에서 두 시간 동안 배양한 후 이어서, 비드를 1 M Tris pH 8.0으로 탈활성화한 후 이어서 0.05 부피% Tween-20이 들어있는 PBS에서 세척하였다. 비드를 2 질량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific/Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서, 항원 E- 특이적 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:15로 희석하였다. 항체 상층액에 대하여 같은 배지 성분을 갖는 목 (mock) 상층액을 함유하는 음성 대조군을 제조하였다. 항원 E-표지된 비드를 상층액에 추가하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 비오티닐화된 리간드 Y 단백질을 0.06 nM의 최종 농도로 추가하였고 상온에서 두 시간 동안 배양하였다. 항원 E-myc-myc-6His 표지된 비드에 결합된 비오티닐화된 리간드 Y의 검출을 R-피코에리트린이 스트렙타비딘 (Moss Inc, Pasadena, MD)에 콘쥬게이션된 후 이어서, LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기에서 측정으로 결정하였다. 리간드 Y가 없는 샘플의 배경 평균 형광 강도 (MFI)를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱하고 100에서 결과 값을 뺌으로써 계산하였다.
유사한 실험에서, 항원 E에 대하여 증가한 같은 98개의 사람 공통 경쇄 항체를 리간드 Y-표지된 비드에 항원 E의 결합을 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.
간략히 말해, 리간드 Y를 MES 버퍼에서 희석된 20 μg/mL의 농도로 카르복실화된 미소구체에 아민-커플링하였다. 혼합물을 상온에서 두 시간 배양한 후 이어서, 1 M Tris pH 8로 비드를 탈활성화한 후 이어서, 0.05 부피% Tween-20이 들어있는 PBS에서 세척하였다. 비드를 2 질량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 차단하였다. 96-웰 필터 플레이트에서, 항원 E- 특이적 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:15로 희석하였다. 항체 상층액에 대하여 같은 배지 성분을 갖는 목 상층액을 함유하는 음성 대조군을 제조하였다. 비오티닐화된-항원 E-mmH를 0.42 nM의 최종 농도로 추가하였고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 리간드 Y-표지된 비드를 항체/항원 E 혼합물에 추가하였고 상온에서 두 시간 동안 배양하였다. 리간드 Y-비드에 결합된 비오티닐화된-항원 E-mmH의 검출을 R-피코에리트린이 스트렙타비딘 (Moss Inc, Pasadena, MD)에 콘쥬게이션된 후 이어서, LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기에서 측정으로 결정하였다. 항원 E가 없는 샘플의 배경 평균 형광 강도 (MFI)를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱하고 100에서 결과 값을 뺌으로써 계산하였다.
표 7 및 8은 두 번의 LUMINEX™ 검정에서 테스트된 모든 98개의 항-항원 E 공통 경쇄 항체에 대한 퍼센트 차단을 나타낸다. ND: 현재 실험 조건 하에 결정되지 않음.
표 7
표 8
상기 설명된 제1 LUMINEX™ 실험에서, Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는 80개의 공통 경쇄 항체를 항원 E-표지된 비드에 결합하는 리간드 Y를 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다. 이들 80개의 공통 경쇄 항체 중에, 68개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 12개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 6개 및 <25% 차단에서 6개). Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 12개는 항원 E-표지된 비드에 결합하는 리간드 Y의 >50% 차단을 입증하는 한편, 6개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 3개 및 <25% 차단에서 3개).
상기 설명된 제2 LUMINEX™ 실험에서, Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는 80개의 공통 경쇄 항체를 항원 E-표지된 비드에 결합하는 리간드 Y를 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다. 이들 80개의 공통 경쇄 항체 중에, 36개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 44개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 27개 및 <25% 차단에서 17개). Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 1개는 항원 E-표지된 비드에 결합하는 항원 E의 >50% 차단 을 입증하는 한편, 17개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 5개 및 <25% 차단에서 12개).
표 7 및 8의 데이터는 표 5 및 6에 설명된 재배열이 다양한 정도의 효능으로 리간드 Y의, 그것의 동족 수용체 항원 E에 결합을 차단하는 항-항원 E-특이적 공통 경쇄 항체를 생성시켰다는 것을 확립하며, 이것은 항원 E에 대한 중첩 및 비-중첩 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함하는 표 5 및 6의 항-항원 E 공통 경쇄 항체와 일치한다.
실시예
8
ELISA
에 의한 항원-특이적 공통
경쇄
항체의 차단 능력의 결정
항원 E에 대하여 증가한 사람 공통 경쇄 항체를 ELISA 검정에서 리간드 Y-코팅된 표면에 결합하는 항원 E를 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다.
리간드 Y를 96-웰 플레이트에 PBS에 희석된 2 g/mL의 농도로 코팅하였고 하룻밤 동안 배양한 후 이어서 0.05% Tween-20이 들어있는 PBS로 네 번 세척하였다. 플레이트를 0.5 질량% BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)를 함유하는 PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)로 상온에서 한 시간 동안 차단하였다. 별도의 플레이트에서, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:10으로 희석하였다. 항체의 같은 성분을 가진 목 상층액을 음성 대조군으로 사용하였다. 항원 E-mmH (상기 설명됨)를 0.150 nM의 최종 농도로 추가하였고 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 항체/항원 E-mmH 혼합물을 리간드 Y를 함유하는 플레이트에 추가하였고 상온에서 한 시간 동안 배양하였다. 리간드 Y에
결합된 항원 E-mmH의 검출을 항-펜타-His 항체 (Qiagen, Valencia, CA)에 콘쥬게이션된 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (Horse-Radish Peroxidase; HRP)로 결정하였고 황산에 의해 중화된 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 사용하는 표준 비색 반응에 의해 발달하였다. 흡광도를 OD450에서 0.1초 동안 측정하였다. 항원 E가 없는 샘플의 배경 흡광도를 모든 샘플에서 뺐다. 퍼센트 차단을 각 샘플의 배경을 뺀 MFI를 조정된 음성 대조군 값으로 나누고, 100을 곱하고 100에서 결과 값을 뺌으로써 계산하였다.
표 9 및 10은 ELISA 검정에서 테스트된 모든 98개의 항-항원 E 공통 경쇄 항체에 대한 퍼센트 차단을 나타낸다. ND: 현재 실험 조건 하에 결정되지 않음.
표 9
표 10
이 실시예에 설명된 바와 같이, 리간드 Y-코팅된 표면에 결합하는 항원 E를 차단하는 그것들의 능력에 대하여 테스트된 Vκ1-39Jκ5 조작된 경쇄를 함유하는, 80개의 공통 경쇄 항체 중에, 22개는 >50% 차단을 입증하는 한편, 58개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 20개 및 <25% 차단에서 38개). Vκ3-20Jκ1 조작된 경쇄를 함유하는 18개의 공통 경쇄 항체에 대하여, 하나는 리간드 Y-코팅된 표면에 결합하는 항원 E의 >50% 차단을 입증하는 한편, 17개는 <50% 차단을 입증한다 (25-50% 차단에서 5개 및 <25% 차단에서 12개).
이들 결과는 또한 항원 E에 대하여 중첩 및 비-중첩 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함하는 항원 E-특이적 공통 경쇄 항체 풀과 일치한다.
실시예 9
항원-특이적 공통
경쇄
항체의
BIACORE
™ 친화도 결정
선택된 항체 상층액에 대한 평형 해리 상수 (KD)를 BIACORE™ T100 기구 (GE Healthcare)를 사용하여 SPR (표면 플라스몬 공명)에 의해 결정하였다. 모든 데이터를 25 ℃에서 러닝 버퍼 및 샘플 버퍼 둘 다로서 HBS-EP (10mM Hepes, 150mM NaCl, 0.3mM EDTA, 0.05% Surfactant P20, pH 7.4)를 사용하여 얻었다. 항체를 표준 아민 커플링 화학법을 사용하여 고 밀도의 항-사람 Fc 항체로 이전에 유도된 C 5 센서 칩 표면상의 크루드 (crude) 상층액 샘플로부터 캡쳐하였다. 캡쳐 단계 동안에, 상층액을 총 3분 동안, 3 μL/분의 유속으로 항-사람 Fc 표면에 걸쳐 주사하였다. 캡쳐 단계는 35 μL/분의 유속으로 2분 동안 100 nM의 농도로 러닝 버퍼 및 분해물질의 주사로 이어졌다. 캡쳐된 항원으로부터 항원의 해리를 6분 동안 관찰하였다. 캡쳐된 항체를 10 mM 글리신, pH 1.5의 간략한 주사에 의해 제거하였다. 모든 센서그램을 버퍼 주사의 센서그램을 분해물질 센서그램에서 뺌으로써 이중 참조하였고, 그로 인해 캡쳐 표면의 항체의 해리에 의해 유발된 인공물을 제거한다. 각 항체에 대한 결합 데이터는 BIAcore T100 Evaluation 소프트웨어 v2.1을 사용하여 질량 이동하는 1:1 결합 모델에 맞춰졌다. 결과는 표 11 및 12에 나타난다.
표 11
표 12
표 5 및 6에 나타난 재배열을 포함하는 공통 경쇄 항체의 결합 친화도는 다양하며, 거의 모든 것들이 나노몰 범위의 KD를 나타낸다. 친화도 데이터는 표 5 및 6에 설명된 재배열된 가변 도메인의 결합 관계로부터 발생하는 공통 경쇄 항체와 일치하며 고 친화도이고, 클로닝으로 선택되고, 체세포 돌연변이된다. 이전에 나타난 데이터와 함께, 표 5 및 6에 설명된 공통 경쇄 항체는 항원 E상의 하나 이상의 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 다양한 고 친화도 항체의 수집을 포함한다.
실시예
10
LUMINEX
™ 검정에 의한 항원-특이적 공통
경쇄
항체의 결합 특이성의 결정
선택된 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 항원 E의 ECD 및 항원 E ECD 변이체에 결합하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였고, 게먹이 원숭이 (cynomolgous monkey) 오쏠로그 (ortholog) (Mf 항원 E)를 포함하며, 이것은 그것의 아미노산 잔기의 약 10%가 사람 단백질과 다르다; ECD (항원 E-ACT)의 C-말단 끝에서 최종 10개의 아미노산이 결핍된 항원 E의 삭제 돌연변이; 및 리간드 Y (항원 E-Ala1 및 항원 E-Ala2)와 상호작용하는 것으로 의심된 장소에서 알라닌 치환을 함유하는 두 개의 돌연변이. 항원 E 단백질을 CHO 세포에서 생산하였고 각각은 myc-myc-His C-밀단 태그를 함유하였다.
결합 연구를 위해, 1 mL의 배양 배지의 항원 E ECD 단백질 또는 변이체 단백질 (상기 설명된 바와 같음)을 항-myc 단클론성 항체 (MAb 9E10, 히브리도마 세포주 CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA)로 공유결합에 의해 코팅된 1 x 106 미소구체 (LUMINEX™) 비드와 함께 상온에서 2시간 동안 배양에 의해 캡쳐하였다. 비드를 사용 전에 PBS로 세척하였다. 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액을 버퍼에서 1:4로 희석하였고 96-웰 필터 플레이트에 추가하였다. 항체가 없는 목 상층액을 음성 대조군으로 사용하였다. 캡쳐된 항원 E 단백질을 함유하는 비드를 항체 샘플에 추가하였고 (웰 당 3000개의 비드) 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 샘플 비드를 세척하였고 결합된 공통 경쇄 항체를 R-피코에리트린-콘쥬게이션된 항-사람 IgG 항체로 검출하였다. 비드의 형광 강도 (각 항원 E 단백질에 결합하는 각 항체 샘플에 대하여 계산된 약 100개의 비드)를 LUMINEX™ 유동 세포 분석법-기반 분석기로 측정하였고, 비드 당 적어도 100개의 계산된 비드에 대한 중간 형광 강도 (MFI)/항체 상호작용을 기록하였다. 결과는 표 13 및 14에 나타난다.
표 13
표 14
항-항원 E 공통 경쇄 항체 상층액은 항원 E-ECD에 결합한 비드에 매우 특이적 결합을 나타냈다. 이들 비드에 대하여, 음성 대조군 목 상층액은 항원 E-ECD 비드 샘플과 결합할 때 미량의 신호 (<10 MFI)를 발생시키는 반면에, 항-항원 E 공통 경쇄 항체를 함유하는 상층액은 강한 결합 신호 (98개의 항체 상층액에 대하여 2627의 평균 MFI; 91개/98개 항체 샘플에 대하여 MFI > 500)를 나타냈다.
항원 E의 ECD 상의 다른 에피토프를 확인하는, 선택된 항-항원 E 공통 경쇄 항체의 능력의 측정값으로서, 변이체에 항체의 상대적 결합을 결정하였다. 원래의 항원 E-ECD 결합 연구에 대하여 상기 설명된 바와 같이 모든 네 개의 항원 E 변이체를 항-myc LUMINEX™에 캡쳐하였고, 상대적 결합률 (MFI변이체/MFI항원 E-ECD)을 결정하였다. 표 12 및 13에 나타난 98개의 테스트된 공통 경쇄 항체 상층액에 대하여, 평균 비율 (MFI변이체/MFI항원 E-ECD)은 각 변이체에 대해 달랐고, 비드 상의 단백질의 다른 캡쳐량을 반영할 가능성이 크다 (각각 항원 E-ACT, 항원 E-Ala1, 항원 E-Ala2, 및 Mf 항원 E에 대하여 0.61, 2.9, 2.0, 및 1.0의 평균 비율). 각 단백질 변이체에 대하여, 98개의 테스트된 공통 경쇄 항체의 서브세트에 대한 결합은 크게 감소한 결합을 나타냈으며, 특정 변이체를 특성화하는 돌연변이에 대한 민감도를 나타낸다. 예를 들어, 공통 경쇄 항체 샘플 중 19개는 <8%의 MFI변이체/MFI항원 E-ECD로 Mf 항원에 결합하였다. 이 그룹 중 다수가 높은 또는 적당히 높은 친화도 항체를 포함하기 때문에 (5개는 KD < 5 nM, 15개는 KD < 50 nM), 이 그룹에 대한 더 낮은 신호는 더 낮은 친화도 대신에 원래의 항원 E-ECD 및 특정 변이체 사이의 서열 (에피토프) 차이에 대한 민감도로부터 발생할 가능성이 크다.
이들 데이터는 표 5 및 6에 설명된 공통 경쇄 항체가 항원 E 상의 하나 이상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항원-E- 특이적 공통 경쇄 항체의 다양한 그룹을 나타낸다는 것을 확립한다.
SEQUENCE LISTING
<110> MCWHIRTER, John
MACDONALD, Lynn
STEVENS, Sean
DAVIS, Samuel
BUCKLER, David R.
HOSIAWA, Karolina Anna
MURPHY, Andrew J.
<120> Non-Human Animals Expressing
Antibodies Having A Common Light Chain
<130> 802B-WO
<140> To be assigned
<141>
<150> 13/093,156
<151> 2012-04-25
<160> 33
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440
accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tgacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 2400
tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc agagcattag cagctattta 2460
aattggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctatgc tgcatccagt 2520
ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 2580
accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gagttacagt 2640
acccctccga tcaccttcgg ccaagggaca cgactggaga ttaaacgtaa gtaatttttc 2700
actattgtct tctgaaattt gggtctgatg gccagtattg acttttagag gcttaaatag 2760
gagtttggta aagattggta aatgagggca tttaagattt gccatgggtt gcaaaagtta 2820
aactcagctt caaaaatgga tttggagaaa aaaagattaa attgctctaa actgaatgac 2880
acaaagtaaa aaaaaaaagt gtaactaaaa aggaaccctt gtatttctaa ggagcaaaag 2940
taaatttatt tttgttcact cttgccaaat attgtattgg ttgttgctga ttatgcatga 3000
tacagaaaag tggaaaaata cattttttag tctttctccc ttttgtttga taaattattt 3060
tgtcagacaa caataaaaat caatagcacg ccctaagatc tagatgcatg ctcgagtgcc 3120
atttcattac ctctttctcc gcacccgaca tagat 3155
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
aggtgagggt acagataagt gttatgag 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
tgacaaatgc cctaattata gtgatca 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
gggcaagtca gagcattagc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
tgcaaactgg atgcagcata g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 6
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 7
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 9
ccattatgat gctccatgcc tctctgttc 29
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 10
atcagcagaa accagggaaa gcccct 26
<210> 11
<211> 3166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 11
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440
accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tataccaccg gagaaattgt gttgacgcag tctccaggca 2400
ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta 2460
gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct 2520
atggtgcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt gggtctggga 2580
cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg tattactgtc 2640
agcagtatgg tagctcacct tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgta 2700
agtaattttt cactattgtc ttctgaaatt tgggtctgat ggccagtatt gacttttaga 2760
ggcttaaata ggagtttggt aaagattggt aaatgagggc atttaagatt tgccatgggt 2820
tgcaaaagtt aaactcagct tcaaaaatgg atttggagaa aaaaagatta aattgctcta 2880
aactgaatga cacaaagtaa aaaaaaaaag tgtaactaaa aaggaaccct tgtatttcta 2940
aggagcaaaa gtaaatttat ttttgttcac tcttgccaaa tattgtattg gttgttgctg 3000
attatgcatg atacagaaaa gtggaaaaat acatttttta gtctttctcc cttttgtttg 3060
ataaattatt ttgtcagaca acaataaaaa tcaatagcac gccctaagat ctagatgcat 3120
gctcgagtgc catttcatta cctctttctc cgcacccgac atagat 3166
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 12
tccaggcacc ctgtctttg 19
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 13
aagtagctgc tgctaacact ctgact 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 14
aaagagccac cctctcctgc aggg 24
<210> 15
<211> 3187
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 15
ggcgcgccgt agctttgaat tttaaacatc tatttgacaa gaaatgcata gttccttctc 60
tttaaaataa tgtaatgttt ctttcaagaa taagcttggt ttgatgcctc tctccccaac 120
atgatagaag tgtagcataa atctatgaaa aattccattt ccctgtgcct acaacaacta 180
cctgggattg aaaacttctt cccttgctct agtcctttct tctacaccta cttccacatc 240
atctgtgact caaaacaata cttgtcagga aagatcccgg aaagagcaaa aaagacttcc 300
ttagaggtgt cagagattcc tatgccacta tctgtcatct ctagaagggg ttgtgagtat 360
gaggaagagc agagcttgta aattttctac ttgctttgac ttccactgta tttcctaaca 420
acaacaacca cagcaacacc cataacatca caggacaaac ttctagtact tccaaggctt 480
tagtctcagt aaatcttctc tacctccatc acagcagcta gaaggtttga tactcataca 540
aatagtactg tagctttctg ttcataattg gaaaaataga caagacccaa tgtaatacag 600
gctttccttc agccagttag cgttcagttt ttggatcacc attgcacaca tatacccagc 660
atatgtctaa tatatatgta gaaatccgtg aagcaagagt tataatagct tgtgttttct 720
attgtattgt attttcctct tatatcatct tcttcttcgt tcattaaaaa aaaaccgttc 780
aagtaggtct aaattaatta ttggatcata agtagataaa atattttatt tcataacaca 840
ttgacccgat gaatatgttt ctttgccaga catagtcctc atttccaagg taacaagcct 900
gaaaaaatta tactggagca agtcaacagg taatgatggt agcttttcct tattgtcctg 960
gggcaagaat aagacaaaag ataacagggt agaataaaga ttgtgtaaga aagaaggaca 1020
gcaacaggac atgggaacct tttatagagt aacattttga taatggatga tgagaattaa 1080
tgagttagac agggatgggt gggaatgatt gaaggtgtga gtactttagc acagattaag 1140
accaaatcat taggatttaa agagttgtgt agagttagtg aaggaaaagc cttagaatta 1200
aatttggctg cggataaaac attcttggat tagactgaag actcttttct gtgctaagta 1260
agtatattta tgataatgat gatgactgta gtgctgaata tttaataaat aaaaacaaaa 1320
ttaattgccg catacataat gtcctgaata ctattgtaaa tgttttatct tatttccttt 1380
aaactgtcta cagcactata aggtaggtac cagtattgtc acagttacac agatatggaa 1440
accgagacac agggaagtta agttacttga tcaatttcaa gcaatcggca agccatggag 1500
catctatgtc agggctgcca ggacatgtga ctgtaaacag aagtttttca ctttttaact 1560
caaagagggt atgtggctgg gttaatggaa agcttcagga ccctcagaaa acattactaa 1620
caagcaaatg aaaggtgtat ctggaagatt aagttttaac agactcttca tttccatcga 1680
tccaataatg cacttaggga gatgactggg catattgagg ataggaagag agaagtgaaa 1740
acacagcttt ttatattgtt cttaacaggc ttgtgccaaa catcttctgg gtggatttag 1800
gtgattgagg agaagaaaga cacaggagcg aaattctctg agcacaaggg aggagttcta 1860
cactcagact gagccaacag acttttctgg cctgacaacc agggcggcgc aggatgctca 1920
gtgcagagag gaagaagcag gtggtctttg cagctgaaag ctcagctgat ttgcatatgg 1980
agtcattata caacatccca gaattcttta agggcagctg ccaggaagct aagaagcatc 2040
ctctcttcta gctctcagag atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct 2100
gggttccagg tgagggtaca gataagtgtt atgagcaacc tctgtggcca ttatgatgct 2160
ccatgcctct ctgttcttga tcactataat tagggcattt gtcactggtt ttaagtttcc 2220
ccagtcccct gaattttcca ttttctcaga gtgatgtcca aaattattct taaaaattta 2280
aatgaaaagg tcctctgctg tgaaggcttt taaagatata taaaaataat ctttgtgttt 2340
atcattccag gtgccagatg tgttgtggtc ctcagccggt gctgcatcag ccgccggcca 2400
tgtcctcggc ccttggaacc acaatccgcc tcacctgcac cctgaggaac gaccatgaca 2460
tcggtgtgta cagcgtctac tggtaccagc agaggccggg ccaccctccc aggttcctgc 2520
tgagatattt ctcacaatca gacaagagcc agggccccca ggtcccccct cgcttctctg 2580
gatccaaaga tgtggccagg aacagggggt atttgagcat ctctgagctg cagcctgagg 2640
acgaggctat gtattactgt gctatgcata actcagtgac gcatgtgttt ggcagcggga 2700
cccagctcac cgttttaagt aagtaatttt tcactattgt cttctgaaat ttgggtctga 2760
tggccagtat tgacttttag aggcttaaat aggagtttgg taaagattgg taaatgaggg 2820
catttaagat ttgccatggg ttgcaaaagt taaactcagc ttcaaaaatg gatttggaga 2880
aaaaaagatt aaattgctct aaactgaatg acacaaagta aaaaaaaaaa gtgtaactaa 2940
aaaggaaccc ttgtatttct aaggagcaaa agtaaattta tttttgttca ctcttgccaa 3000
atattgtatt ggttgttgct gattatgcat gatacagaaa agtggaaaaa tacatttttt 3060
agtctttctc ccttttgttt gataaattat tttgtcagac aacaataaaa atcaatagca 3120
cgccctaaga tctagatgca tgctcgagtg ccatttcatt acctctttct ccgcacccga 3180
catagat 3187
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 16
tgtcctcggc ccttgga 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 17
ccgatgtcat ggtcgttcct 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 18
acaatccgcc tcacctgcac cct 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
agcagtctgc aacctgaaga ttt 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
gtttaatctc cagtcgtgtc cctt 24
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
cctccgatca ccttc 15
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
aaaccaggga aagcccctaa 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
atgggacccc actttgca 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
ctcctgatct atgctgcat 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
cagcagactg gagcctgaag a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
tgatttccac cttggtccct t 21
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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Claims (24)
- B 세포의 집단을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스로서, 각각의 B 세포는 마우스의 생식세포에 존재하는 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ 서열로부터 유도된 사람 경쇄 가변 (VL) 도메인을 발현하고, 마우스는 재배열되지 않은 기능적 내인성 면역글로불린 Vκ 유전자 세그먼트 및 재배열되지 않은 기능적 내인성 면역글로불린 Jκ 유전자 세그먼트가 결핍되고; 집단의 B 세포는 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 또는 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 영역으로부터 유도된 사람 중쇄 가변 (VH) 도메인을 발현하는 적어도 하나의 B 세포를 포함하는 마우스.
- 제1 항에 있어서,
(a) 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ 서열은 마우스 Cκ 영역 서열에 작동 가능하게 결합되거나;
(b) 사람 VH 도메인을 암호화하는 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 또는 이것들의 조합으로부터 선택된 마우스 CH 영역 서열을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 결합되거나;
(c) 사람 VH 도메인은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스. - 제1 항에 있어서, 모든 내인성 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트는 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ 서열로 대체되는 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제1 항에 있어서, 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ 서열은 마우스, 래트 또는 사람 서열로부터 선택된 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제1 항에 있어서, 마우스는 비기능적 면역글로불린 람다 (λ) 경쇄 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스는 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 및 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 영역으로부터 유도된 적어도 하나의 사람 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함하는 항체를 생산하기 위한 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제6 항에 있어서, 항체는 이중 특이적 항체인 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제7 항에 있어서, 적어도 하나의 사람 중쇄 가변 도메인이 두 개의 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하고 생산은 단일 세포에서 두 개의 사람 중쇄 가변 도메인을 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의한 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제7 항에 있어서, 이중 특이적 항체의 중쇄는 완전한 사람인 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제7 항에 있어서, 적어도 하나의 사람 중쇄 가변 도메인 중 하나를 포함하는 중쇄는 재배열된 사람 Vκ3-20/Jκ 서열로부터 유도된 사람 VL 도메인을 포함하는 경쇄와 짝을 이루는 것을 특징으로 하는 마우스.
- 제7 항에 있어서, 적어도 하나의 사람 중쇄 가변 도메인은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, 마우스에 의해 발현된 사람 중쇄 가변 도메인의 서열을 결정하는 단계, 및 세포에서 서열을 발현시키는 단계에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스.
- 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 또는 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 영역으로부터 유도된 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하는 원하는 항원에 대한 항체를 생산하는 방법으로서,
(a) 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항의 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계;
(b) 마우스로부터 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4 또는 3-53/1-1/4로부터 선택된 재배열된 사람 VH/DH/JH 영역으로부터 유도된 사람 중쇄 가변 도메인을 얻는 단계; 및
(c) 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체에서 (b)에서 얻은 면역글로불린 가변 영역 서열을 이용하는 단계
를 포함하는 방법. - 삭제
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