CN103596424B - 表达具有共同轻链的抗体的非人动物 - Google Patents

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Abstract

提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠表达特征在于有限数目的轻链可变结构域的免疫球蛋白轻链库。提供了仅表达一个或少数来自它们的种系中的有限库的免疫球蛋白轻链可变结构域的小鼠。提供了用于在小鼠中产生轻链可变区包括人轻链可变区的方法。提供了用于产生适合用于多特异性结合蛋白例如双特异性抗体的人可变区的方法。

Description

表达具有共同轻链的抗体的非人动物
发明领域
提供了表达抗体的遗传修饰的小鼠，所述抗体具有与多种人可变/小鼠恒定重链缔和的共有人可变/小鼠恒定轻链。提供了用于从小鼠的B细胞的人可变区基因序列制备人双特异性抗体的方法。
背景
抗体通常包含同二聚体重链组分，其中每个重链单体与相同的轻链缔和。具有异二聚体重链组分的抗体（例如双特异性抗体）作为治疗性抗体是理想的。但是制备具有能够令人满意地与双特异性抗体的每个重链缔和的合适的轻链组分的双特异性抗体被证明是存在问题的。
在一种方法中，可通过测定所有轻链可变结构域的使用统计学、鉴定人类抗体中最常使用的轻链并在体外将这样的轻链与不同特异性的两个重量配对来选择轻链。
在另一种方法中，可通过观察噬菌体展示文库（例如包含人轻链可变区序列的噬菌体展示文库，例如人scFv文库）中的轻链序列并从该文库中选择最常使用的轻链可变区来选择轻链。然后，可以在感兴趣的两个不同重链上测试这样的轻链。
在另一种方法中，可以通过测定轻链可变序列的噬菌体展示文库（使用感兴趣的两个重链的重链可变序列作为探针）来选择轻链。与两个重链可变序列缔和的轻链可被选择为所述重链的轻链。
在另一种方法中，可以将候选轻链与重链的同源轻链比对，并在轻链中进行修饰以更紧密地匹配两个重链的同源轻链的特征性共有的序列。如果需要使免疫原性的机会最小化，则所述修饰优选产生存在于已知的人轻链序列中的序列，从而不太可能发生蛋白水解处理以产生T细胞表位（基于本领域已知的用于测定免疫原性可能性的参数和方法（即计算机测定以及湿法测定）。
所有上述方法都依赖于体外方法，其包含了多种事先限制，例如序列同一性，与特定的预先选择的重链缔和的能力，等等。本领域需要不依赖于体外操作条件的组合物和方法，而是使用更加生物敏感的方法来制备包括共有轻链的人表位结合性蛋白。
概述
提供了表达人免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的遗传修饰的小鼠，其中小鼠具有有限的轻链可变库。提供了用于产生人轻链可变结构域的生物系统，所述轻链可变结构域与亲和力成熟的人重链可变结构域的不同库缔合并一起表达。提供了用于产生包含免疫球蛋白可变结构域的结合蛋白的方法，包括用目的抗原免疫具有有限的免疫球蛋白轻链库的小鼠，和在结合蛋白中使用特异性结合目的抗原的小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列。方法包括用于产生适合用于产生多特异性抗原结合蛋白的人免疫球蛋白重链可变结构域的方法。
提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠选择来源于未重排的人重链可变区基因区段的库的适当的亲和力成熟的人免疫球蛋白重链可变结构域，其中亲和力成熟的人重链可变结构域与来源于一个人轻链可变区基因区段的单个人轻链可变结构域缔合并一起表达。还提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠提供了两个人轻链可变区基因区段的选择。
提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠从人轻链可变区基因区段的有限库表达人轻链可变结构域的有限库或单个人轻链可变结构域。小鼠被遗传工程化以包括单个未重排的人轻链可变区基因区段(或两个人轻链可变区基因区段)，所述可变区基因区段重排以形成表达单个轻链(或表达两个轻链之任一或两者)的重排的人轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区基因)。重排的人轻链可变结构域能够与多个由小鼠选择的亲和力成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。
提供了从人轻链可变区序列的有限库表达人轻链可变结构域的有限库或单个人轻链可变结构域的遗传工程化的小鼠。通过对小鼠进行遗传工程化以包括表达单个轻链的可变区(或表达两个可变区之任一或两者)的单个V/J人轻链序列(或两个V/J序列)。包含可变序列的轻链能够与多个由小鼠克隆地选择的亲和力成熟的人重链配对，其中所述重链可变区特异性结合不同表位。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，所述小鼠包含单个能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排和编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的人免疫球蛋白轻链可变(VL)区基因区段。在另一个方面，小鼠包含不超过两个人VL基因区段，其各自能够与人J基因区段(选自一个或多个JL区段)重排并且编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域。
在一个实施方案中，单个人VL基因区段有效地连接于选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的人JL基因区段，其中单个人VL基因区段能够重排以形成编码具有一个或多个人JL基因区段的任一个的轻链可变区基因的序列。
在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包含免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段，其中VL基因座包含单个能够重排以编码轻链基因的VL区的人VL基因区段。在具体的实施方案中，人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段或人Vκ3-20Jκ1基因区段。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包含VL基因座，所述基因座不包含能够重排以形成免疫球蛋白轻链基因的内源小鼠VL基因区段，其中VL基因座包含不超过2个能够重排以编码轻链基因的VL区的人VL基因区段。在具体的实施方案中，所述不超过2个人VL基因区段是人Vκ1-39Jκ5基因区段和人Vκ3-20Jκ1基因区段。
在一个方面，提供了包含单个编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的重排的(V/J)人免疫球蛋白轻链可变(VL)区(即，VL/JL区)的遗传修饰的小鼠。在另一个方面，小鼠包含不超过2个能够编码免疫球蛋白轻链的人VL结构域的重排的人VL区。
在一个实施方案中，VL区是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一个实施方案中，重排的VL/JL序列的人JL区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在具体的实施方案中，VL区是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在具体的实施方案中，小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列。
在一个实施方案中，人VL基因区段有效地连接于人或小鼠前导序列。在一个实施方案中，前导序列是小鼠前导序列。在具体的实施方案中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。在具体的实施方案中，前导序列有效地连接于未重排的人VL基因区段。在具体的实施方案中，前导序列有效地连接于重排的人VL/JL序列。
在一个实施方案中，VL基因区段有效地连接于免疫球蛋白启动子序列。在一个实施方案中，启动子序列是人启动子序列。在具体的实施方案中，人免疫球蛋白启动子是人Vκ3-15启动子。在具体的实施方案中，启动子有效地连接于未重排的人VL基因区段。在具体的实施方案中，启动子有效地连接于重排的人VL/JL序列。
在一个实施方案中，轻链基因座包含前导序列，其在5’(相对于VL基因区段的转录方向)与人免疫球蛋白启动子侧翼连接，在3’与人VL基因区段侧翼连接，所述人VL基因区段与人J区段重排，并且编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方案中，VL基因区段位于小鼠Vκ基因座中，并且小鼠CL是小鼠Cκ。
在一个实施方案中，轻链基因座包含前导序列，其在5’(相对于VL基因区段的转录方向)与人免疫球蛋白启动子侧翼连接，在3’与重排的人VL区(VL/JL序列)侧翼连接，并且编码包含内源小鼠轻链恒定区(CL)的反向嵌合轻链的VL结构域。在具体的实施方案中，重排的人VL/JL序列为于小鼠κ基因座，并且小鼠CL是小鼠Cκ。
在一个实施方案中，修饰的小鼠的VL基因座是κ轻链基因座，并且所述κ轻链基因座包含小鼠κ内含增强子，小鼠κ3’增强子，或内含增强子和3’增强子二者。
在一个实施方案中，小鼠包含非功能性免疫球蛋白λ轻链基因座。在具体的实施方案中，λ轻链基因座包含基因座的一个或多个序列的缺失，其中一个或多个缺失使得λ轻链基因座不能重排以形成轻链基因。在另一个实施方案中，缺失λ轻链基因座的全部或基本上全部VL基因区段。
在一个实施方案中，小鼠产生包含来源于人VL基因区段的体细胞突变的VL结构域。在一个实施方案中，轻链包含来源于人VL基因区段的体细胞突变的VL结构域和小鼠Cκ区。在一个实施方案中，小鼠不表达λ轻链。
在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠能够体细胞高度突变人VL区序列。在具体的实施方案中，小鼠包含细胞，所述细胞含有重排的免疫球蛋白轻链基因，其来源于人VL基因区段，能够重排和编码VL结构域，并且所述重排的免疫球蛋白轻链基因包含体细胞突变的VL结构域。
在一个实施方案中，小鼠包含表达含有连接于小鼠Cκ的体细胞突变的人VL结构域的轻链的细胞，其中轻链与重链链合，所述重链包含来源于人VH基因区段的体细胞突变的VH结构域并且其中重链包含小鼠重链恒定区(CH)。在具体的实施方案中，重链包含小鼠CH1、小鼠铰链、小鼠CH2和小鼠CH3。在具体的实施方案中，重链包含人CH1、小鼠铰链、小鼠CH2和小鼠CH3。
在一个实施方案中，小鼠包含一个或多个人VH基因区段对内源小鼠VH基因区段的替代，其中人VH基因区段有效地连接于小鼠CH区基因，以便小鼠重排人VH基因区段并且表达包含人VH结构域和小鼠CH的反向嵌合的免疫球蛋白重链。在一个实施方案中，90-100%的未重排的小鼠VH基因区段被至少一个未重排的人VH基因区段替代。在具体的实施方案中，全部或基本上全部内源小鼠VH基因区段被至少一个未重排的人VH基因区段替代。在一个实施方案中，替代是使用至少19个，至少39个或至少80或81个未重排的人VH基因区段。在一个实施方案中，替代是使用至少12个功能性未重排的人VH基因区段，至少25个功能性未重排的人VH基因区段或至少43个功能性未重排的人VH基因区段。在一个实施方案中，小鼠包含至少一个未重排的人DH区段和至少一个未重排的人JH区段对全部小鼠DH和JH区段的替代。在一个实施方案中，至少一个未重排的人DH区段选自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27及其组合。在一个实施方案中，至少一个未重排的人JH区段选自1、2、3、4、5、6及其组合。在具体的实施方案中，一个或多个VH基因区段选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1人VH基因区段及其组合。
在一个实施方案中，小鼠包含表达特异性结合目的抗原的结合蛋白的B细胞，其中结合蛋白包含来源于人Vκ1-39/Jκ5重排或人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链，并且其中细胞包含来源于选自1-69、2-5、3-13、3-23、3-30、3-33、3-53、4-39、4-59和5-51基因区段的人VH基因区段的重排的重排的免疫球蛋白重链基因。在一个实施方案中，一个或多个人VH基因区段与选自1、2、3、4、5和6的人重链JH基因区段重排。在一个实施方案中，一个或多个VH和JH基因区段与选自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13和7-27的人DH基因区段重排。在具体的实施方案中，轻链基因具有1、2、3、4或5个或更多个体细胞高度突变。
在一个实施方案中，小鼠包含含有重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列的B细胞，所述基因序列包含选自2-5/6-6/1、2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、3-23/3-3/4、3-23/3-10/4、3-23/6-6/4、3-23/7-27/4、3-30/1-1/4、3-30/1-7/4、3-30/3-3/3、3-30/3-3/4、3-30/3-22/5、3-30/5-5/2、3-30/5-12/4、3-30/6-6/1、3-30/6-6/3、3-30/6-6/4、3-30/6-6/5、3-30/6-13/4、3-30/7-27/4、3-30/7-27/5、3-30/7-27/6、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4、4-39/1-26/3、4-59/3-16/3、4-59/3-16/4、4-59/3-22/3、5-51/3-16/6、5-51/5-5/3、5-51/6-13/5、3-53/1-1/4、1-69/6-6/5和1-69/6-13/4的VH/DH/JH区。在具体的实施方案中，B细胞表达结合蛋白，所述结合蛋白包含与小鼠重链恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区和与小鼠轻链恒定区融合的人免疫球蛋白轻链可变区。在一个实施方案中，重排的人VL区是人Vκ1-39Jκ5序列，并且小鼠表达反向嵌合轻链，所述轻链包含(i)来源于人VL/JL序列的VL结构域和(ii)小鼠CL；其中轻链与与反向嵌合重链缔合，所述重链包含(i)小鼠CH和(ii)来源于选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1人VH基因区段及其组合的人VH基因区段的体细胞突变的人VH结构域。在一个实施方案中，小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方案中，CL是小鼠Cκ。在具体的实施方案中，人VH基因区段选自2-5、3-13、3-23、3-30、4-59、5-51和1-69基因区段。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域包含来源于选自1-1、1-7、2-8、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13和7-27的DH区段的序列。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域包含来源于选自1、2、3、4、5和6的JH区段的序列。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域由选自2-5/6-6/1、2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、3-23/3-3/4、3-23/3-10/4、3-23/6-6/4、3-23/7-27/4、3-30/1-1/4、3-30/1-7/4、3-30/3-3/4、3-30/3-22/5、3-30/5-5/2、3-30/5-12/4、3-30/6-6/1、3-30/6-6/3、3-30/6-6/4、3-30/6-6/5、3-30/6-13/4、3-30/7-27/4、3-30/7-27/5、3-30/7-27/6、4-59/3-16/3、4-59/3-16/4、4-59/3-22/3、5-51/5-5/3、1-69/6-6/5和1-69/6-13/4的重排的人VH/DH/JH序列编码。
在一个实施方案中，小鼠包含表达特异性结合目的抗原的结合蛋白的B细胞，其中结合蛋白包含来源于人Vκ1-39/Jκ5重排的轻链，并且其中细胞包含含有VH/DH/JH区(选自2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、3-23/6-6/4、3-23/7-27/4、3-30/1-1/4、3-30/3-3/4、3-30/5-5/2、3-30/7-27/6、1-69/6-6/5和1-69/6-13/4)的重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列。在具体的实施方案中，B细胞表达含有与小鼠重链恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区和与小鼠轻链恒定区融合的人免疫球蛋白轻链可变区的结合蛋白。
在一个实施方案中，重排的人VL区是人Vκ3-20Jκ1序列，并且小鼠表达反向嵌合轻链缔合，所述轻链包含(i)来源于重排的人VL/JL序列的VL结构域，和(ii)小鼠CL；其中轻链与反向嵌合重链缔合，所述重链包含(i)小鼠CH，和(ii)来源于选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1人VH基因区段及其组合的人VH基因区段的体细胞突变的人VH。在一个实施方案中，小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方案中，CL是小鼠Cκ。在具体的实施方案中，人VH基因区段选自3-30、3-33、3-53、4-39和5-51基因区段。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域包含来源于选自1-1、1-7、1-26、2-15、3-3、3-16和6-13的DH区段的序列。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域包含来源于选自3、4、5和6的JH区段的序列。在具体的实施方案中，体细胞突变的人VH结构域由选自3-30/1-1/4、3-30/3-3/3、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4、4-39/1-26/3、5-51/3-16/6、5-51/6-13/5和3-53/1-1/4的重排的人VH/DH/JH序列编码。
在一个实施方案中，小鼠包含表达特异性结合目的抗原的结合蛋白的B细胞，其中结合蛋白包含来源于人Vκ3-20/Jκ1重排的轻链，并且其中细胞包含含有选自3-30/3-3/3、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4和3-53/1-1/4的VH/DH/JH区的重排的免疫球蛋白重链可变区基因序列。在具体的实施方案中，B细胞表达包含与小鼠重链恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区和与小鼠轻链恒定区融合的人免疫球蛋白轻链可变区的结合蛋白。
在一个实施方案中，小鼠包含重排的人Vκ1-39Jκ5序列和重排的人Vκ3-20Jκ1序列，并且小鼠表达反向嵌合轻链，所述轻链包含(i)来源于人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列的VL结构域，和(ii)小鼠CL；其中轻链与反向嵌合重链缔合，所述重链包含(i)小鼠CH和(ii)来源于选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1人VH基因区段及其组合的人VH基因区段的体细胞突变的人VH。在一个实施方案中，小鼠表达体细胞突变的轻链。在一个实施方案中，CL是小鼠Cκ。
在不同的实施方案中，由B细胞表达的与小鼠重链恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区和与小鼠轻链恒定区融合的人免疫球蛋白轻链可变区在小鼠中是同源的。在不同的实施方案中，小鼠表达的嵌合轻链和嵌合重链在小鼠中是同源的。
在一个实施方案中，90-100%的内源未重排小鼠VH基因区段被至少一个未重排的人VH基因区段替代。在具体的实施方案中，全部或基本上全部内源未重排小鼠VH基因区段被至少一个未重排的人VH基因区段替代。在一个实施方案中，替代是利用至少18、至少39、至少80或81个未重排的人VH基因区段。在一个实施方案中，替代是利用至少12个功能性未重排的人VH基因区段、至少25个功能性未重排的人VH基因区段或至少43个未重排的人VH基因区段。
在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠为C57BL品系，在具体实施方案中选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C57BL/Ola。在具体的实施方案中，遗传修饰的小鼠是上述129个品系和上述C57BL/6品系的混合物。在另一个具体实施方案中，小鼠是上述129个品系的混合物，或上述BL/6品系的混合物。在具体的实施方案中，混合物的129个品系为129S6(129/SvEvTac)品系。
在一个实施方案中，小鼠表达包含轻链和重链的反向嵌合抗体，所述轻链包含小鼠Cκ和来源于重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的体细胞突变的人VL结构域，所述重链包含小鼠CH和来源于选自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51和6-1人VH基因区段的人VH基因区段的体细胞突变的人VH结构域，其中小鼠不表达完全小鼠抗体和不表达完全人抗体。在一个实施方案中，小鼠包含κ轻链基因座，所述基因座包含利用重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列对内源小鼠κ轻链基因区段的替代，并包含利用人VH基因区段的完全或基本上完全的库对全部或基本上全部内源小鼠VH基因区段的替代。
在一个方面，提供了从小鼠的种系的重排的免疫球蛋白轻链序列表达免疫球蛋白轻链的小鼠，其中免疫球蛋白轻链包含人可变序列。
在一个实施方案中，小鼠的种系不存在功能性未重排的免疫球蛋白轻链V基因区段。在一个实施方案中，小鼠的种系不存在功能性未重排的免疫球蛋白轻链J基因区段。
在一个实施方案中，小鼠的种系包含不超过一个、不超过两个或不超过三个重排的(V/J)轻链序列。
在一个实施方案中，重排的V/J序列包含κ轻链序列。在具体的实施方案中，κ轻链序列是人κ轻链序列。在具体的实施方案中，κ轻链序列选自人Vκ1-39/J序列、人Vκ3-20/J序列及其组合。在具体的实施方案中，κ轻链序列是人Vκ1-39/Jκ5序列。在具体的实施方案中，κ轻链序列是人Vκ3-20/Jκ1序列。
在一个实施方案中，小鼠还在其种系中包含选自小鼠κ内含增强子5’(相对于重排的免疫球蛋白轻链序列)、小鼠κ3’增强子及其组合的序列。
在一个实施方案中，小鼠包含未重排的人VH基因区段、未重排的人DH基因区段和未重排的人JH基因区段，其中所述VH、DH和JH基因区段能够重排以形成有效地连接于重链恒定基因序列的免疫球蛋白重链可变基因序列。在一个实施方案中，小鼠包含多个人VH、DH和JH基因区段。在具体的实施方案中，人VH、DH和JH基因区段替代内源小鼠免疫球蛋白重链基因座中的内源小鼠VH、DH和JH基因区段。在具体的实施方案中，小鼠包括利用全部或基本上全部功能性人VH、DH和JH基因区段对全部或基本上全部功能性小鼠VH、DH和JH基因区段的替代。
在一个实施方案中，小鼠表达包含小鼠恒定序列的免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，小鼠表达包含人恒定序列的免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，小鼠表达包含选自CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合的小鼠序列的免疫球蛋白重链。
在一个实施方案中，小鼠表达包含选自CH1序列、铰链序列、CH2序列、CH3序列及其组合的人序列的免疫球蛋白重链。
在一个实施方案中，小鼠的种系中的重排的免疫球蛋白轻链序列位于内源小鼠免疫球蛋白轻链基因座中。在具体的实施方案中，小鼠的种系的重排的免疫球蛋白轻链序列替代内源小鼠免疫球蛋白轻链基因座中的全部或基本上全部小鼠轻链V和J序列。
在一个方面，提供了从本文中描述的小鼠分离的小鼠细胞。在一个实施方案中，细胞是ES细胞。在一个实施方案中，细胞是淋巴细胞。在一个实施方案中，淋巴细胞是B细胞。在一个实施方案中，B细胞表达包含来源于人基因区段的可变结构域的嵌合重链；和来源于重排的人Vκ1-39/J序列、重排的人Vκ3-20/J序列或其组合的轻链；其中将重链可变结构域融合至小鼠恒定区以及将轻链可变结构域融合至小鼠或人恒定区。
在一个实施方案中，提供了从本文中描述的小鼠分离的小鼠B细胞，其中B细胞表达来源于重排的人VH/DH/JH序列的嵌合重链，所述重排的人VH/DH/JH序列选自2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5和1-69/6-13/4；和来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的嵌合轻链；其中将可变结构域融合至小鼠恒定区以及将轻链可变结构域融合至小鼠恒定区。
在一个实施方案中，提供了从本文中描述的小鼠分离的小鼠B细胞，其中B细胞表达来源于重排的人VH/DH/JH序列的嵌合重链，所述重排的人VH/DH/JH序列选自3-30/3-3/3,3-33/1-7/4,3-33/2-15/4和3-53/1-1/4；和来源于重排的人Vκ3-20/Jκ1序列的嵌合轻链；其中将可变结构域融合至小鼠恒定区以及将轻链可变结构域融合至小鼠恒定区。
在不同的实施方案中，从本文中描述的小鼠分离的B细胞表达的嵌合重链和轻链在小鼠中是同源的。
在一个方面，提供了杂交瘤，其中利用本文中描述的小鼠的B细胞产生杂交瘤。在具体的实施方案中，B细胞来自本文中描述的小鼠，所述小鼠已用包含目的表位的免疫原免疫，并且B细胞表达结合目的表位的结合蛋白，结合蛋白具有体细胞突变的人VH结构域和小鼠CH，并且具有来源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL结构域和小鼠CL。
在一个实施方案中，提供了利用本文中描述的小鼠的B细胞制备的杂交瘤，其中杂交瘤表达来源于重排的人VH/DH/JH序列的嵌合重链，所述VH/DH/JH序列选自2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5和1-69/6-13/4；和来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的嵌合轻链；其中将可变结构域融合至小鼠恒定区和将轻链可变结构域融合至小鼠恒定区。
在一个实施方案中，提供了利用本文中描述的小鼠的B细胞制备的杂交瘤，其中杂交瘤表达来源于重排的人VH/DH/JH序列的嵌合重链，所述VH/DH/JH序列选自3-30/3-3/3、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4和3-53/1-1/4；和来源于重排的人Vκ3-20/Jκ1序列的嵌合轻链；其中将可变结构域融合至小鼠恒定区和将轻链可变结构域融合至小鼠恒定区。
在不同的实施方案中，由利用本文中描述的小鼠的B细胞制备的杂交瘤表达的嵌合重链和轻链在杂交瘤中是同源的。在不同的实施方案中，由利用本文中描述的小鼠的B细胞制备的杂交瘤表达的嵌合重链和轻链在小鼠的B细胞中是同源的。
在一个方面，提供了小鼠胚胎，其中所述胚胎包含来源于本文中所述的小鼠的供体ES细胞。
在一个方面，提供了靶向载体，其在转录方向上参照载体的5’和3’小鼠同源臂的序列从5’至3’包含：5’小鼠同源臂、人或小鼠免疫球蛋白启动子、人或小鼠前导序列以及选自重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL区和3’小鼠同源臂。在一个实施方案中，5’和3’同源臂将载体靶向位于小鼠Cκ基因的5’并且靠近小鼠Cκ基因的相对于增强子序列在5’的序列。在一个实施方案中，启动子是人免疫球蛋白可变区基因区段启动子。在具体的实施方案中，启动子是人Vκ3-15启动子。在一个实施方案中，前导序列是小鼠前导序列。在具体的实施方案中，小鼠前导序列是小鼠Vκ3-7前导序列。
在一个方面，提供了上述靶向载体，但取代5’小鼠同源臂，在人或小鼠启动子的5’侧翼连接位点特异性重组酶识别位点(SRRS)，并且取代3’小鼠同源臂在人VL区的3’侧翼连接SRRS。
在一个方面，反向嵌合抗体可利用本文中描述的小鼠来制备，其中反向嵌合抗体包含：含有人VL和小鼠CL的轻链以及含有人VH和小鼠CH的重链。
在一个方面，提供了用于产生抗体的方法，包括在单细胞中表达(a)与人CH基因序列融合的本文中描述的经免疫的小鼠的第一VH基因序列；(b)与人CL基因序列融合的本文中描述的经免疫的小鼠的VL基因序列；和(c)在足以表达完全人抗体的条件下维持细胞，和分离抗体。在一个实施方案中，细胞包含与人CH基因序列的融合的本文中描述的第二经免疫的小鼠的第二VH基因序列，第一VH基因序列编码识别第一表位的VH结构域，并且第二VH基因序列编码识别第二表位的VH结构域，其中第一表位和第二表位不相同。
在一个方面，提供了用于产生表位结合蛋白的方法，包括将本文中描述的小鼠暴露于包含目的表位的免疫原，在对于小鼠足以产生特异性结合目的表位的免疫球蛋白分子的条件下维持小鼠，和分离特异性结合目的表位的免疫球蛋白分子；其中表位结合蛋白包含：与轻链缔合的的重链，所述重链包含体细胞突变的人VH和小鼠CH，所述轻链包含小鼠CL和来源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL。
在一个方面，提供了表达表位结合蛋白的细胞，其中细胞包含：(a)编码来源于重排的人Vκ1-39Jκ5或重排的人Vκ3-20Jκ1的人VL结构域的人核苷酸序列，其中将所述人核苷酸序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白轻链恒定结构域cDNA序列(例如，人κ恒定结构域DNA序列)；和，(b)编码来源于第一人VH核苷酸序列的人VH结构域的第一人VH核苷酸序列，其中将第一人VH核苷酸序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白重链恒定结构域cDNA序列；其中表位结合蛋白识别第一表位。在一个实施方案中，表位结合蛋白以低于10-6M、低于10-8M、低于10-9M、低于10-10M、低于10-11M或低于10-12M的解离常数结合第一表位。
在一个实施方案中，细胞包含编码第二人VH结构域的第二人核苷酸序列，其中将第二人序列融合(直接或通过接头)于人免疫球蛋白重链恒定结构域cDNA序列，并且其中第二人VH结构域不特异性识别第一表位(例如，展示例如10-6M、10-5M、10-4M或更高的解离常数)，并且其中表位结合蛋白识别第一表位和第二表位，其中第一和第二免疫球蛋白重链各自与(a)的相同的轻链缔合。
在一个实施方案中，第二VH结构域以低于10-6M、低于10-7M、低于10-8M、低于10-9M、低于10-10M、低于10-11M或低于10-12M的解离常数结合第二表位。
在一个实施方案中，表位结合蛋白包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，所述重链各自与来源于选自人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1的重排的人VL区的相同轻链缔合，其中第一免疫球蛋白重链以在纳摩尔或皮摩尔范围内的解离常数结合第一表位，第二免疫球蛋白重链以在纳摩尔或皮摩尔范围内的解离常数结合第二表位，第一表位和第二表位不同，第一免疫球蛋白重链不结合第二表位或以比微摩尔范围更弱(例如，毫摩尔范围)的解离常数结合第二表位，第二免疫球蛋白重链不结合第一表位或以比微摩尔范围更弱(例如，毫摩尔范围)的解离常数结合第一表位，并且VL、第一免疫球蛋白重链的VH和第二免疫球蛋白重链的VH中的一个或多个发生了体细胞突变。
在一个实施方案中，第一免疫球蛋白重链包含蛋白A结合残基，并且第二免疫球蛋白重链不存在蛋白A结合残基。
在一个实施方案中，细胞选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如，PERC.6TM细胞)。
在一个方面，提供了反向嵌合抗体，其包含人VH和小鼠重链恒定结构域、人VL和小鼠轻链恒定结构域，其中抗体通过这样的方法制备，所述方法包括：用包含表位的免疫原免疫本文中描述的小鼠，并且抗体特异性结合用于免疫小鼠的免疫原的表位。在一个实施方案中，VL结构域已发生了体细胞突变。在一个实施方案中，VH结构域发生了体细胞突变。在一个实施方案中，VL结构域和VH结构域发生了体细胞突变。在一个实施方案中，VL连接于小鼠Cκ结构域。
在一个方面，提供了小鼠，所述小鼠包含替代内源小鼠重链基因座上的全部或基本上全部小鼠VH基因区段的人VH基因区段；不超过一个或两个替代全部小鼠轻链基因区段的重排的人轻链VL/JL序列(选自重排的Vκ1-39/J和重排的Vκ3-20/J或其组合)；其中人重链可变基因区段连接于小鼠恒定基因，并且重排的人轻链序列连接于人或小鼠恒定基因。
在一个方面，小鼠ES细胞包含人重链可变基因区段对全部或基本上全部小鼠重链可变基因区段的替代，和不超过一个或两个重排的人轻链VL/JL序列，其中人重链可变基因区段连接于小鼠免疫球蛋白重链恒定基因，并且重排的人轻链VL/JL序列连接于小鼠或人免疫球蛋白轻链恒定基因。在具体的实施方案中，轻链恒定基因是小鼠恒定基因。
在一个方面，提供了由本文中描述的小鼠产生的抗原结合蛋白。在具体的实施方案中，抗原结合蛋白包含与小鼠恒定区融合的人免疫球蛋白重链可变区以及来源于Vκ1-39基因区段或Vκ3-20基因区段的人免疫球蛋白轻链可变区，其中轻链恒定区是小鼠恒定区。
在一个方面，提供了从本文中描述的小鼠的免疫球蛋白可变区基因序列制备的完全人抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白包含：含有来源于本文中描述的小鼠的序列的人可变区的完全人重链和含有Vκ1-39或Vκ3-20的完全人轻链。在一个实施方案中，轻链可变区包含1至5个体细胞突变。在一个实施方案中，轻链可变区是在小鼠的B细胞中与重链可变区配对的同源轻链可变区。
在一个实施方案中，完全人抗原结合蛋白包含第一重链和第二重链，其中第一重链和第二重链包含独立地来源于本文中描述的小鼠的不相同的可变区，并且其中从宿主细胞表达的第一和第二重链的每一个与来源于Vκ1-39基因区段或Vκ3-20基因区段的人轻链缔合。在一个实施方案中，第一重链包含特异性结合第一抗原的第一表位的第一重链可变区，第二重链包含特异性结合第二抗原的第二表位的第二重链可变区。在具体的实施方案中，第一抗原与第二抗原不同。在具体的实施方案中，第一抗原与第二抗原相同，第一表位与第二表位不同；在具体的实施方案中，结合蛋白的第一分子对第一表位的结合不阻断结合蛋白的第二分子对第二表位的结合。
在一个方面，来源于本文中描述的小鼠的人免疫球蛋白序列的完全人结合蛋白包含第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，其中第一免疫球蛋白重链包含与第二免疫球蛋白重链的可变区不相同的第一可变区，并且其中第一免疫球蛋白重链包含野生型蛋白A结合决定簇，第二重链不存在野生型蛋白A结合决定簇。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白重链在分离条件下结合蛋白A，并且第二免疫球蛋白重链在分离条件下不结合蛋白A或对蛋白A的结合强度为第一免疫球蛋白重链对蛋白A的结合强度的至多1/10、1/100或1/1000。在具体的实施方案中，第一和第二重链是IgG1同种型，其中第二重链包含选自95R(EU435R)、96F(EU436F)及其组合的修饰，并且其中第一重链不存在这样的修饰。
在一个方面，提供了用于产生双特异性抗原结合蛋白的方法，包括将本文中描述的第一小鼠暴露于包含第一表位的第一目的抗原，将本文中描述的第二小鼠暴露于包含第二表位的第二目的抗原，从而允许第一和第二小鼠各自引发对目的抗原的免疫应答，在第一小鼠中鉴定结合第一目的抗原的第一表位的第一人重链可变区，在第二小鼠中鉴定结合第二目的抗原的第二表位的第二人重链可变区，产生编码结合第一目的抗原的第一表位的第一重链的第一完全人重链基因，产生编码结合第二目的抗原的第二表位的第二重链的第二完全人重链基因，在表达来源于人Vκ1-39或人Vκ3-20基因区段的单个完全人轻链的细胞中表达第一重链和第二重链，以形成双特异性抗原结合蛋白，和分离所述双特异性抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原不相同。
在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的，第一表位和第二表位是不同的。在一个实施方案中，第一重链可变区对第一表位的结合不阻断第二重链可变区对第二表位的结合。
在一个实施方案中，第一抗原选自可溶性抗原和细胞表面抗原(例如，肿瘤抗原)，并且第二抗原包含细胞表面受体。在具体的实施方案中，细胞表面受体是免疫球蛋白受体。在具体的实施方案中，免疫球蛋白受体是Fc受体。在一个实施方案中，第一抗原和第二抗原是相同的细胞表面受体，第一重链对第一表位的结合不阻断第二重链对第二表位的结合。
在一个实施方案中，轻链的轻链可变区包含2至5个体细胞突变。在一个实施方案中，轻链可变区是在第一或第二经免疫的小鼠的B细胞(具有第一或第二重链可变结构域)中表达的体细胞突变的同源轻链。
在一个实施方案中，第一完全人重链具有减小其对蛋白A的亲和力的氨基酸修饰，第二完全人重链不包含减少其对蛋白A的亲和力的修饰。
在一个方面，提供了根据本发明制备的包含人重链可变结构域的抗体或双特异性抗体。在另一个方面，提供了本文中描述的小鼠用于产生完全人抗体或完全人双特异性抗体的用途。
在一个方面，本文中描述的遗传修饰的小鼠、胚胎或细胞包含保留内源调节或控制元件例如小鼠κ内含增强子、小鼠κ3’增强子或内含增强子和3’增强子二者的κ轻链基因座，其中调节或控制元件促进κ轻链基因座的表达的序列的体细胞突变和亲和力成熟。
在一个方面，提供了包含B细胞群体的小鼠，所述B细胞群体的特征在于具有来源于不超过一个或不超过两个重排的或未重排的免疫球蛋白轻链V和J基因区段的免疫球蛋白轻链，其中小鼠显示与包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠大致相同的κ:λ轻链比率。
在一个实施方案中，免疫球蛋白轻链来源于不超过一个或不超过两个重排的免疫球蛋白轻链V和J基因区段。在具体的实施方案中，轻链来源于不超过一个重排的免疫球蛋白轻链V和J基因区段。
在一个实施方案中，相较于包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠，小鼠显示约55:1至75:1、60:1至70:1、63:1至68:1或约65:1至67:1的κ:λ轻链比率。在具体的实施方案中，相较于包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠，小鼠显示66:1的κ:λ轻链比率。在一个实施方案中，来源于不超过一个，或不超过两个的重排的或未重排的免疫球蛋白轻链V和J基因区段的免疫球蛋白轻链包括选自人Vκ1-39,人Vκ3-20,人Jκ1和人Jκ5的人Vκ和Jκ基因区段。在具体的实施方案中，免疫球蛋白轻链来源于包含人Vκ1-39序列的单个人轻链序列。
在一个实施方案中，相较于包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠，小鼠显示约18:1至23:1或约19:1至22:1的κ:λ轻链比率。在一个实施方案中，相较于包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠，小鼠显示21:1的κ:λ轻链比率。在一个实施方案中，相较于包含免疫球蛋白轻链V和J基因区段的野生型互补序列的小鼠，小鼠显示大致相同或20:1的κ:λ轻链比率。在一个实施方案中，来源于不超过一个或不超过两个重排的或未重排的免疫球蛋白轻链V和J基因区段的免疫球蛋白轻链包括选自人Vκ1-39,人Vκ3-20,人Jκ1和人Jκ5的人Vκ和Jκ基因区段。在具体的实施方案中，免疫球蛋白轻链来源于包含人Vκ3-20序列的单个人轻链序列。
在一个方面，提供了本文中描述的小鼠，所述小鼠表达来源于不超过一个或不超过两个人Vκ/Jκ序列的免疫球蛋白轻链，其中小鼠包含利用一个或多个人重链可变区基因区段对全部或基本上全部内源小鼠重链可变区基因区段的替代，并且小鼠显示约1至约20的(a)表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞对(b)表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比率。
在一个实施方案中，小鼠表达单个来源于人Vκ1-39Jκ5序列的κ轻链，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞对表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比率为约1至约20；在一个实施方案中，比率为约1至至少约66；在具体的实施方案中，比率为约1至66。
在一个实施方案中，小鼠表达单个来源于人Vκ3-20Jκ5序列的κ轻链，并且表达具有λ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞对表达具有κ轻链的免疫球蛋白的CD19+B细胞的比率为约1至约20；在一个实施方案中，比率为约1至约21；在具体的实施方案中，比率为1至20或1至21。
在一个方面，提供了表达单个重排的κ轻链的遗传修饰的小鼠，其中小鼠包含功能性λ轻链基因座，并且其中小鼠表达B细胞群体，所述B细胞群体包含表达来源于相同单个重排的κ轻链的κ轻链的Igκ+细胞。在一个实施方案中，小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分比与野生型小鼠中的大致相同。在具体的实施方案中，小鼠中Igκ+Igλ+B细胞的百分比为约2%至约6%。在具体的实施方案中，其中单个重排的κ轻链来源于Vκ1-39Jκ5序列的小鼠中的Igκ+Igλ+B细胞的百分比为约2%至约3%；在具体的实施方案中，为约2.6%。在具体的实施方案中，其中单个重排的κ轻链来源于Vκ3-20Jκ1序列的小鼠中的Igκ+Igλ+B细胞的百分比为约4%至约8%；在具体的实施方案中，为约6%。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠表达单个来源于人Vκ和Jκ基因区段的重排的κ轻链，其中小鼠表达包含来源于单个重排的κ轻链序列的单个κ轻链的B细胞群体，其中未曾使遗传修饰的小鼠对体细胞高度突变有抗性。在一个实施方案中，至少90%的在小鼠的B细胞上表达的κ轻链显示至少1至约5个体细胞高度突变。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，所述小鼠经修饰表达单个来源于不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的κ轻链，其中小鼠显示为野生型小鼠显示的κ轻链使用的约至少2倍或更多倍，至少约3倍或更多倍，或至少约4倍或更多倍的κ轻链使用，或大于包含κ轻链基因区段的野生型库的相同品系的小鼠显示的κ轻链使用的κ轻链使用。在具体的实施方案中，小鼠表达单个来自不超过一个重排的κ轻链序列的κ轻链。在更具体的实施方案中，重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其表达单个来源于不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的κ轻链，其中小鼠显示为具有完全或基本上完全人κ轻链基因座的小鼠显示的κ轻链使用的约100倍或更多倍、至少约200倍或更多倍、至少约300倍或更多倍、至少约400倍或更多倍、至少约500倍或更多倍、至少约600倍或更多倍、至少约700倍或更多倍、至少约800倍或更多倍、至少约900倍或更多倍、至少约1000倍或更多倍的κ轻链使用。在具体的实施方案中，具有完全或基本上完全人κ轻链基因座的小鼠不存在功能性未重排的小鼠κ轻链序列。在具体的实施方案中，小鼠表达单个来自不超过一个重排的κ轻链序列的κ轻链。在一个实施方案中，小鼠包含一个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，杂合子)。在一个实施方案中，小鼠包含两个拷贝的重排的κ轻链序列(例如，纯合子)。在更具体的实施方案中,重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
在一个方面，提供了表达单个来源于不超过一个或不超过两个重排的轻链序列的轻链的遗传修饰的小鼠，其中遗传修饰的小鼠的轻链显示为具有完全或基本上完全轻链基因座的小鼠显示的重排轻链的表达的至少10倍至约1,000倍、100倍至约1,000倍、200倍至约1,000倍、300倍至约1,000倍、400倍至约1,000倍、500倍至约1,000倍、600倍至约1,000倍、700倍至约1,000倍、800倍至约1,000倍或900倍至约1,000倍的表达水平。在一个实施方案中，轻链包含人序列。在具体的实施方案中，人序列是κ序列。在一个实施方案中，人序列是λ序列。在一个实施方案中，轻链是完全人轻链。
在一个实施方案中，表达水平通过定量转录的轻链序列的mRNA，和将其与具有完全或基本上完全的轻链基因座的小鼠的转录的轻链序列相比较来进行表征。
在一个方面，提供了表达单个来源于不超过一个或不超过两个重排的κ轻链序列的κ轻链的遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠，在用抗原免疫后，显示出与利用相同抗原免疫的野生型小鼠旗鼓相当的血清滴度。在具体的实施方案中，小鼠表达单个来自不超过一个重排的κ轻链序列的κ轻链。在一个实施方案中，血清滴度被表征为总的免疫球蛋白。在具体的实施方案中，血清滴度被表征为IgM特异性滴度。在具体的实施方案中，血清滴度被表征为IgG特异性滴度。在更具体的实施方案中,重排的κ轻链序列选自Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ1-39Jκ5序列。在一个实施方案中，重排的κ轻链序列是Vκ3-20Jκ1序列。
在一个方面，提供了表达多个与单个轻链缔合的免疫球蛋白重链的遗传修饰的小鼠。在一个实施方案中，重链包含人序列。在不同的实施方案中，人序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方案中，单个轻链包含人序列。在不同的实施方案中，人序列选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方案中，小鼠包含失能的内源免疫球蛋白基因座并且表达来自转基因或染色体外附加体的重链和/或轻链。在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠基因座上包含利用一个或多个人免疫球蛋白序列对一些或全部内源小鼠重链基因区段(即，V、D、J)和/或一些或全部内源小鼠重链恒定序列(例如，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合)和/或一些或全部内源小鼠轻链序列(例如，V、J、恒定或其组合)的替代。
在一个方面，提供了适合用于制备具有相同轻链的抗体的小鼠，其中小鼠中制备的全部或基本上全部抗体经表达具有相同的轻链。在一个实施方案中，轻链从内源轻链基因座表达。
在一个方面，提供了用于制备人抗体的轻链的方法，包括从本文中描述的小鼠获得轻链序列和重链序列，和将轻链序列和重链序列用于制备人抗体。在一个实施方案中，人抗体为双特异性抗体。
除非另有所指或根据上下文而很明显的，本文中描述的实施方案和方面的任一项可彼此结合使用。根据下文进行的描述，其它实施方案将变得对于本领域技术人员来说是显而易见的。
附图概述
图1显示了用于利用人Vκ1-39Jκ5基因区域替代内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。
图2显示了用于利用人Vκ3-20Jκ1基因区域替代内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。
图3显示了用于利用人VpreB/Jλ5基因区域替代内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因区段的靶向策略。
图4显示来自野生型小鼠(WT)、对于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区是纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO)以及对于工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区是纯合的小鼠(Vκ3-20Jκ1HO)的外周血的CD19+B细胞的百分比(y轴)。
图5A显示在使用特异于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区的接合处的探针(Vκ1-39Jκ5接合探针(JunctionProbe))和特异于人Vκ1-39基因区段的探针(Vκ1-39探针)的定量PCR测定中，对于利用人Vκ和Jκ基因区段(Hκ)对内源Vκ和Jκ基因区段的替代是纯合的小鼠、野生型小鼠(WT)和对于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区是杂合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HET)的Vκ1-39衍生的轻链的相对mRNA表达(y轴)。将信号针对小鼠Cκ的表达进行标准化。N.D.:未检测到。
图5B显示在使用特异于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区的接合处(Vκ1-39Jκ5接合探针)的探针和特异于人Vκ1-39基因区段的探针(Vκ1-39探针)的定量PCR测定中，对于利用人Vκ和Jκ基因区段(Hκ)对内源Vκ和Jκ基因区段的替代是纯合的小鼠、野生型小鼠(WT)和对于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区是纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO)的Vκ1-39衍生的轻链的相对mRNA表达(y轴)。将信号针对小鼠Cκ的表达进行标准化。
图5C显示在使用特异于工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区的接合处的探针(Vκ3-20Jκ1接合探针)和特异于人Vκ3-20基因区段的探针(Vκ3-20探针)的定量PCR测定中，对于利用人Vκ和Jκ基因区段(Hκ)对内源Vκ和Jκ基因区段的替代是纯合的小鼠、野生型小鼠(WT)和对于工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区是杂合的(HET)和纯合的(HO)的小鼠的Vκ3-20衍生的轻链的相对mRNA表达(y轴)。将信号针对小鼠Cκ的表达进行标准化。
图6A显示利用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N=2)和对于工程化的人重排的Vκ1-39Jκ5轻链区是纯合的小鼠(Vκ1-39Jκ5HO；N=2)的IgM(左)和IgG(右)滴度。
图6B显示利用β-半乳糖苷酶免疫的野生型(WT；N=5)和对于工程化的人重排的Vκ3-20Jκ1轻链区是纯合的小鼠(Vκ3-20Jκ1HO；N=5)的总的免疫球蛋白(IgM,IgG,IgA)滴度。
详述
本发明不限于描述的具体的方法和实验条件，此类方法和条件可变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，并且无意是限定性的，因为本发明的范围由权利要求界定。
除非另外定义，否则本文中使用的全部术语和短语包括所述术语和短语已在本领域获得的含义，除非明确地指出相反情况或根据其中使用该术语或短语的上下文明确地得出相反情况。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但现描述特定的方法和材料。将全部提及的出版物通过引用并入本文。
如本文中所用，术语"抗体"包括含有4条多肽链(通过二硫键链连接的2条重(H)链和2条轻(L)链)的免疫球蛋白分子。每一条重链包含重链可变(VH)区和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每一条轻链包含轻链可变(VL)区和轻链恒定区(CL)。还可将VH和VL区细分成称为互补决定区(CDR)的具有高突变率的区域，它们之间散布有称为构架区(FR)的更保守的区域。每一个VH和VL从氨基端至羧基端包含按下列顺序排列的3个CDR和4个FR：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和力”抗体是指相对于其靶表位具有约10-9M或更低(例如，约1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M)的KD的抗体。在一个实施方案中，KD通过表面等离子体共振技术例如BIACORETM来测量；在另一个实施方案中，通过ELISA测量KD。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两种或更多种表位的抗体。双特异性抗体通常包含两个不相同的重链，每一个重链特异性结合不同的表位—在两个不同的分子上(例如，两个不同免疫原上的不同表位)或在相同分子上(例如，相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对于第一表位的亲和力通常比第一重链对于第二表位的亲和力低至少1至2或3或4或更多个数量级，反之亦然。由双特异性抗体特异性结合的表位可在相同或不同的靶上(例如，在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别相同免疫原的不同表位的重链来制备。例如，可将编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列融合至编码相同或不同重链恒定区的核酸序列，可将这样的序列在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型的双特异性抗体具有两条重链(每一条重链具有3个重链CDR，后跟(N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域)，和免疫球蛋白轻链，所述轻链不赋予表位结合特异性但可与每一条重链缔合，或可与每一条重链缔合并且可结合一个或多个被重链表位结合区结合的表位，或可与每一条重链缔合并且使得一条或两条重链能够结合至一个或两个表位。
术语“细胞”包括适合用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属的菌株等)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、嗜甲醇毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物例如杂交瘤或细胞杂交瘤(quadromas)。在一些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞并且选自下列细胞；CHO(例如，CHOK1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(epidermal)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6TM细胞)。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可由例如种系序列或重排的或未重排的序列编码，例如由原态B细胞或成熟B细胞或T细胞编码。CDR可发生体细胞突变(例如，从动物的种系中编码的序列变化)、人源化和/或利用氨基酸置换、添加或缺失进行修饰。在一些情况(例如，对于CDR3)下，CDR可由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述序列不是连续的(例如，在未重排的核酸序列中)但在B细胞核酸序列中是连续的，例如作为剪接或连接序列的结果(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。
术语"保守的”，当用于描述保守氨基酸置换时，包括利用另一个具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基的置换。一般而言，保守氨基酸置换大体上不改变蛋白质的目的功能性质，例如可变区以期望的亲和力特异性结合靶表位的能力。具有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括脂肪族侧链例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链例如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链例如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链例如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链例如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸，以及天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸置换可以是利用丙氨酸对蛋白质的任意天然残基的置换，如例如丙氨酸扫描诱变使用的。在一些实施方案中，产生保守置换，所述置换在Gonnet等人(1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science256:1443-45(通过引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值。在一些实施方案中，置换是适度保守的置换，其中置换在PAM250对数似然矩阵中具有非负值。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链中的残基位置相异在于一个或多个保守氨基酸置换。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或其功能片段(例如允许从例如B细胞表达和分泌的片段)中的残基位置与其氨基酸序列列于本文中的轻链不完全相同，但相异在于一个或多个保守氨基酸置换。
短语“表位结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性识别表位，例如能够以至少约1微摩尔或更低的KD(例如，约1x10-6M、1x10-7M、1x10-9M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M或约1x10-12M的KD)结合表位的蛋白质。治疗性表位结合蛋白(例如，治疗性抗体)通常需要在纳摩尔或皮摩尔范围内的KD。
短语“功能性片段”包括可被表达、分泌以及以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD特异性结合表位的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括具有至少在微摩尔范围、纳摩尔范围或皮摩尔范围内的KD。
术语“种系”包括提及非体细胞突变的细胞例如非体细胞突变的B细胞或pre-B细胞或造血细胞中的免疫球蛋白核酸序列。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另外指定，否则重链可变结构域包括3个重链CDR和4个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链在可变结构域(从N末端至C末端)后具有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如，以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别表位)，能够从细胞表达和分泌以及包含至少一个CDR的片段。
当与序列结合使用时，术语“同一性”包括如通过本领域已知的许多不同算法测定的同一性，所述算法可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性。在本文中描述的一些实施方案中，使用ClustalWv.1.83(慢)比对(使用10.0的开口罚分、0.1的延伸缺口罚分和使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM10.0.2,MacVectorInc.,2008))测定同一性。就序列的同一性进行比较的序列的长度将取决于具体序列，但在轻链恒定结构域的情况下，长度应当包含具有足以折叠成轻链恒定结构域的长度的序列，所述轻链恒定结构域能够自我缔合以形成经典轻链恒定结构域，例如能够形成包含β链的两个β折叠片和能够与人或小鼠的至少一个CH1结构域相互作用。在CH1结构域的情况下，序列的长度应当包含具有足以折叠成CH1结构域的长度的序列，所述CH1结构域能够形成包含β链的两个β折叠片和能够与小鼠或人的至少一个轻链恒定结构域相互作用。
短语“免疫球蛋白分子”包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链。重链可以是相同的或不同的，并且轻链可以是相同的或不同的。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另外指定，否则包括人κ和λ轻链和VpreB以及替代性轻链。除非另外指定，否则轻链可变(VL)结构域通常包括3个轻链CDR和4个构架(FR)区。一般而言，全长轻链从氨基端至羧基端包括VL结构域(其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和轻链恒定结构域。轻链包括例如不选择性结合被表位结合蛋白(所述轻链出现于其中)选择性结合的第一或第二表位的那些轻链。轻链还包括结合并识别重链或帮助重链结合和识别一个或多个被表位结合蛋白(所述轻链出现于其中)选择性结合的表位的那些轻链。共同轻链是来源于重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的那些轻链，并且包括体细胞突变的(例如，亲和力成熟的)形式。
短语“微摩尔范围”意指1-999微摩尔；短语“纳摩尔范围”意指1-999纳摩尔；短语“皮摩尔范围”意指1-999皮摩尔。
短语“体细胞突变的”包括提及来自已经历类别转换的B细胞的核酸序列，其中类别转换的B细胞的免疫球蛋白可变区的核酸序列(例如，重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列)与类别转换前的B细胞中的核酸序列不完全相同，例如，未经因类别转换的B细胞与已经历类别转换的B细胞之间的CDR或构架核酸序列中的差异。“体细胞突变的”包括提及来自亲和力成熟的B细胞的核酸序列，所述核酸序列与非亲和力成熟的B细胞中的对应免疫球蛋白可变区序列(即，种系细胞的基因组中的序列)不完全相同。短语“体细胞成熟的”还包括提及在将B细胞暴露于目的表位后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中核酸序列与B细胞暴露于目的表位之前的对应核酸序列不同。短语“体细胞突变的”是指来自抗体的序列，所述抗体已在动物例如具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠中响应于免疫原攻击而产生，并且由在这样的动物中固有地运行的选择过程产生。
关于核酸序列的术语“未重排的”包括存在于动物细胞的种系中的核酸序列。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链的氨基酸序列(按需要修饰的)，所述氨基酸序列从N末端至C末端按顺序(除非另有所指)包含下列氨基酸区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
共同轻链
先前制备有用的多特异性表位结合蛋白例如双特异性抗体的努力一直以来受到各种各样的问题阻碍，所述问题通常具有有共同的范例：体外选择或操作序列以合理地工程化，或通过试错法工程化适当形式以配对异二聚体双特异性人免疫球蛋白。不幸地，大多数(如果不是全部的话)体外工程法特别提供了对于个别分子是适当的(即使有的话)的特设的固定物。在另一方面，用于使用复杂生物体选择能够产生人治疗剂的适当的配对的体内方法未曾实现。
一般而言，天然小鼠序列通常不是人治疗剂序列的良好来源。因为至少该原因，产生与共同人轻链配对的小鼠重链免疫球蛋白可变区具有有限的实际效用。在试错法中将花费更多的体外工程化努力来试图人源化小鼠重链可变序列，同时希望保留表位特异性和亲和力，同时维持偶联共同人轻链的能力，具有不确定的结果。在这样的过程结束时，终产物可维持一定的特异性和亲和力，并且与共同轻链缔合，但最终在人中的免疫原性可能仍然是重大的风险。
因此，用于制备人治疗剂的适当小鼠可包括替代内源小鼠重链可变区基因区段的人重链可变区基因区段的适当地大的库。人重链可变区基因区段应当能够重排和与内源小鼠重链恒定结构域重组以形成反向嵌合重链(即，包含人可变结构域和小鼠恒定区的重链)。重链应当能够进行类别转换和体细胞高度突变，以便对于小鼠可获得重链可变结构域的适当地大的库来选择可与人轻链可变区的有限的库缔合的重链可变结构域。
选择多个重链的共同轻链的小鼠具有实际效用。在不同的实施方案中，在仅可表达共同轻链的小鼠中表达的抗体将具有可与相同或基本上相同的轻链缔合并且与其一起表达的重链。这在制备双特异性抗体中是特别有用的。例如，这样的小鼠可用第一免疫原免疫来产生表达特异性结合第一表位的抗体的B细胞。小鼠(或遗传上相同的小鼠)可用第二免疫原免疫来产生表达特异性结合第二表位的抗体的B细胞。重链可变区可从B细胞克隆并且与相同重链恒定区和相同轻链一起表达，在细胞中表达以产生双特异性抗体，其中双特异性抗体的轻链组分已被小鼠选择来与轻链组分缔合并一起表达。
本发明人已工程化小鼠以产生将适当地与极具多样性的重链家族配对的免疫球蛋白轻链，所述重链包括其可变区(例如亲和力成熟和或体细胞突变的可变区)背离种系序列的重链。在不同的实施方案中，小鼠被设计来将人轻链可变结构域与包含体细胞突变的重链可变结构域配对，从而使得高亲和力结合蛋白能够适合用作人治疗剂。
遗传工程化的小鼠，通过生物体内长期复杂的抗体选择过程，在将人重链可变结构域的多样性集合与有限数量的人轻链配对中作出生物学上适当的选择。为了实现该目的，将小鼠工程化以提供与广泛多样的人重链可变结构域结合的有限数量的人轻链可变结构域。在利用免疫原攻击后，小鼠使其库中方案的数目最大化以产生针对免疫原的抗体，这有限地主要或仅受其库中轻链数目限制。在不同的实施方案中，这包括允许小鼠获得轻链可变结构域的适当的相容性体细胞突变，所述体细胞突变将与相对丰富多样的人重链可变结构域(特别包括体细胞突变的人重链可变结构域)相容。
为了实现轻链的有限库，将小鼠工程化以使其产生或重排天然小鼠轻链可变结构域的能力无功能或基本上无功能。这可以例如通过缺失小鼠的轻链可变区基因区段来实现。随后可这样修饰内源小鼠基因座：以使外源人可变区基因区段能与内源小鼠轻链恒定区基因组合并且形成重排的反向嵌合轻链基因(人可变、小鼠恒定)的方式，将选择的适当的外源人轻链可变区基因区段有效地连接于内源小鼠轻链恒定结构域。在不同的实施方案中，轻链可变区能够发生体细胞突变。在不同的实施方案中，为了使轻链可变区获得体细胞突变的能力最大化，将适当的增强子保留在小鼠中。例如，在修饰小鼠κ轻链基因座以用人κ轻链基因区段替代内源小鼠κ轻链基因区段时，可功能性保留或不破坏小鼠κ内含增强子和小鼠κ3’增强子。
提供了表达与多种多样的反向嵌合(人可变，小鼠恒定)重链缔合的反向嵌合(人可变，小鼠恒定)轻链的有限库的遗传工程化的小鼠。在不同的实施方案中，缺失内源小鼠κ轻链基因区段，用有效地连接于内源小鼠Cκ基因的单个(或两个)重排的人轻链区替代内源小鼠κ轻链基因区段。在用于最大化重排的人轻链区的体细胞高度突变的实施方案中，保留小鼠κ内含增强子和小鼠κ3’增强子。在不同的实施方案中，小鼠还包含无功能λ轻链基因座，或其缺失或使得基因座不能产生λ轻链的缺失。
提供了遗传工程化的小鼠，所述小鼠在不同的实施方案中包含不存在内源小鼠轻链VL和JL基因区段但包含重排的人轻链可变区的轻链可变区基因座，在一个实施方案中，重排的人VL/JL序列有效地连接于小鼠恒定区，其中基因座能够经历体细胞高度突变，并且其中基因座表达包含连接于小鼠恒定区的人VL/JL序列的轻链。因此，在不同的实施方案中，基因座包含小鼠κ3’增强子，其与体细胞高度突变的正常或野生型水平相关。
不同实施方案中的遗传工程化的小鼠，当用目的抗原免疫时，产生B细胞，所述B细胞显示人免疫球蛋白重链可变区的多种重排，所述人免疫球蛋白重链可变区与一个或两个重排的轻链(包括其中一个或两个轻链包含含有例如1至5个体细胞突变的人轻链可变区的实施方案)一起表达和起作用。在不同的实施方案中，这样所表达的人轻链能够与小鼠中表达的任何人免疫球蛋白重链可变区缔合并一起表达。
结合超过一个表位的表位结合蛋白
本文中描述的组合物和方法可用于制备以高亲和力结合超过一个表位的结合蛋白，例如双特异性抗体。本发明的有利方面包括选择适当地高度结合性(例如，亲和力成熟的)重链免疫球蛋白链(其各自与单个轻链缔合)的能力。
双特异性结合蛋白的合成和表达一直有问题，这部分归因于与鉴定可与两个不同重链缔合并一起表达的适当的轻链相关的问题，以及部分归因于分离问题。本文中描述的方法和组合物允许遗传修饰的小鼠通过自然过程选择适当的轻链，所述轻链可与超过一种重链，包括体细胞突变的(例如亲和力成熟的)重链缔合并与其一起表达。可鉴定来自本文中描述的经免疫的小鼠的适当的B细胞(所述B细胞表达具有反向嵌合重链(即，人可变区和小鼠恒定区)的亲和力成熟的抗体)的人VL和VH序列，并且将其按读框与适当的人恒定区基因序列(例如，人IgG1)一起克隆进入表达载体。可制备两个这样的构建体，其中每一个构建体编码结合不同表位的人重链可变结构域。可将种系序列中或来自其中序列已发生体细胞突变的B细胞的人的VL之一(例如，人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1)按读框融合至适当的人恒定区基因(例如，人κ恒定基因)。可将这3个完全人重链和轻链构建体置于适当的细胞中以进行表达。细胞将表达两个主要种类：具有相同轻链的同二聚体重链和具有相同轻链的异二聚体重链。为了使得容易分离这些主要种类，将重链之一进行修饰以省略蛋白A结合决定簇，从而导致同二聚体结合蛋白与异二聚体结合蛋白的差别亲和力。解决该问题的组合物和方法描述于2010年6月25日提交的标题为“ReadilyIsolatedBispecificAntibodieswithNativeImmunoglobulinFormat”的USSN12/832,838(公布为US2010/0331527A1，通过引用并入本文)中。
在一个方面，提供了本文中描述的表位结合蛋白，其中人VL和VH序列来源于本文中描述的小鼠，所述小鼠已用包含目的表位的抗原免疫。
在一个实施方案中，提供了包含第一和第二多肽的表位结合蛋白，第一多肽从N末端至C末端包含选择性结合第一表位的第一表位结合区，后跟包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第一CH3区的恒定区；以及，第二多肽从N末端至C末端包含选择性结合第二表位的第二表位结合区，后跟包含选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人IgG的第二CH3区的恒定区，其中第二CH3区包含减小或消除第二CH3结构域对蛋白A的结合的修饰。
在一个实施方案中，第二CH3区包含H95R修饰(按照IMGT外显子编号；H435R，按照EU编号)。在另一个实施方案中，第二CH3区还包含Y96F修饰(IMGT；Y436F，按照EU)。
在一个实施方案中，第二CH3区来自修饰的人IgG1，并且还包含选自D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I，按照EU)的修饰。
在一个实施方案中，第二CH3区来自修饰的人IgG2，并且还包含选自N44S、K52N和V82I(IMGT；N384S、K392N和V422I，按照EU)的修饰。
在一个实施方案中，第二CH3区来自修饰的人IgG4，并且还包含选自Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I，按照EU)的修饰。
一个用于产生结合超过一个表位的表位结合蛋白的方法是用包含第一目的表位的抗原免疫根据本发明的第一小鼠，其中小鼠包含内源免疫球蛋白轻链可变区基因座，所述基因座不包含能够重排和形成轻链的内源小鼠VL，其中在内源小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因座中是有效地连接于小鼠内源轻链恒定区基因的单个重排的人VL区，重排的人VL区选自人Vκ1-39Jκ5和人Vκ3-20Jκ1，并且内源小鼠VH基因区段已被人VH基因区段完全或部分替代，从而小鼠产生的免疫球蛋白重链完全是或基本上是包含人可变结构域和小鼠恒定结构域的重链。当免疫时，这样的小鼠将产生反向嵌合抗体，其仅包含两个人轻链可变结构域之一(例如，人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1之一)。一旦鉴定了编码结合目的表位的VH的B细胞，就可回收(例如，通过PCR)VH(和，任选地VL)的核苷酸序列，将其按读框与适当的人免疫球蛋白恒定结构域一起克隆进入表达构建体。可重复该过程以鉴定结合第二表位的第二VH结构域，可回收第二VH基因序列，将其按读框与第二适当的免疫球蛋白恒定结构域克隆于表达载体中。第一和第二免疫球蛋白恒定结构域可以是相同的或不同的同种型，可如本文中或US2010/0331527A1中所述修饰免疫球蛋白恒定结构域之一(但非另一个)，表位结合蛋白可在适当的细胞中表达和基于其对于蛋白A的差别亲和力(与同二聚体表位结合蛋白相比较)分离，例如，如US2010/0331527A1中描述的。
在一个实施方案中，提供了用于制备双特异性表位结合蛋白的方法，包括鉴定来自本文中描述的小鼠的第一亲和力成熟的(例如，包含一个或多个体细胞高度突变)人VH核苷酸序列(VH1)，鉴定来自本文中描述的小鼠的第二亲和力成熟的(例如，包含一个或多个体细胞高度突变)人VH核苷酸序列(VH2)，将VH1与不存在US2010/0331527A1中描述的蛋白A决定簇修饰的人重链按读框克隆以形成重链1(HC1)，将VH2与包含US2010/0331527A1中描述的蛋白A决定簇的人重链按读框克隆以形成重链2(HC2)，将包含HC1的表达载体和相同的或不同的包含HC2的表达载体克隆进入细胞，其中细胞还表达包含融合至人轻链恒定结构域的人Vκ1-39/人Jκ5或人Vκ3-20/人Jκ1的人免疫球蛋白轻链，从而允许细胞表达双特异性表位结合蛋白，所述蛋白包含由VH1编码的VH结构域和由VH2编码的VH结构域，基于其结合蛋白A的差异能力(与单特异性同二聚体表位结合蛋白相比较)分离双特异性表位结合蛋白。在具体的实施方案中，HC1是IgG1，HC2是包含修饰H95R(IMGT；H435R，按照EU)并还包含修饰Y96F(IMGT；Y436F，按照EU)的IgG1。在一个实施方案中，由VH1编码的VH结构域、由VH2编码的VH结构域或两者发生体细胞突变。
与共同人VL一起表达的人VH基因
将来自针对4种不同抗原产生的亲和力成熟的抗体的多种人可变区与它们的同源轻链或选自人Vκ1-39Jκ5、人Vκ3-20Jκ1或人VpreBJλ5的人轻链的至少一个一起表达(参见实施例1)。对于针对每一种抗原的抗体，来自不同基因家族的体细胞突变的高亲和力重链与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区成功地配对，并且从表达重链和轻链的细胞分泌。对于Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1，来源于下列人VH基因家族的VH结构域有利地表达：1-2、1-8、1-24、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、4-31、4-39、4-59、5-51和6-1。因此，经工程化从Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1之一或两者表达人VL结构域的有限库的小鼠将从经修饰用人VH基因区段替代小鼠VH基因区段的VH基因座产生体细胞突变的人VH结构域的多样性群体。
经遗传工程化以表达与单个重排的轻链(例如，Vκ1-39/J或Vκ3-20/J)缔合的反向嵌合(人可变，小鼠恒定)免疫球蛋白重链的小鼠，当用目的抗原免疫时，产生B细胞，所述B细胞包含多种人VH重排，并且表达多种高亲和力抗原特异性抗体，所述抗体在它们阻断抗原对其配体的结合的能力方面以及在它们结合抗原的变体的能力方面具有多样性性质(参见实施例5至10)。
因此，本文中描述的小鼠和方法用于制备和选择人免疫球蛋白重链可变结构域，包括体细胞突变的人重链可变结构域，所述重链可变结构域由多种重排产生，显示广泛多样的亲和力(包括显示为约纳摩尔或更少的KD)、广泛多样的特异性(包括对相同抗原的不同表位的结合)，与相同或基本上相同的人免疫球蛋白轻链可变区缔合并一起表达。
下列实施例被提供来给本领域技术人员描述如何产生和使用本发明的方法和组合物，所述实施例无意限定本发明人所认为的本发明的范围。已努力确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应当解释一些实验误差和偏差。除非另有所指，否则部分是按重量计的部分，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示，压力是在大气压或近大气压下。
实施例
下列实施例被提供来描述如何产生和使用本发明的方法和组合物，并且无意限定本发明人所认为的本发明的范围。除非另有所指，否则部分是按重量计的部分，分子量是平均分子量，温度以摄氏度表示，压力是在大气压或近大气压。
实施例1
与选择的人VL区缔合的人VH区的鉴定
构建了体外表达系统以确定单个重排的人种系轻链是否能与人重链一起从抗原特异性人抗体共表达。
用于在遗传修饰的小鼠中产生人抗体的方法是已知的(参见例如，US6,596,541，RegeneronPharmaceuticals,)。技术包括产生遗传修饰的小鼠，所述小鼠具有包含有效地连接于内源小鼠恒定区基因座的人重链和轻链可变区的基因组，从而该小鼠响应抗原性刺激产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。编码从小鼠产生的抗体的重链和轻链的可变区的DNA是完全人的。最初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如下文中所述，就期望的特征(包括亲和力、选择性、表位等)表征和选择抗体。用期望的人恒定区替代小鼠恒定区以产生包含非-IgM同种型，例如野生型或修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的完全人抗体。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。
利用促进血管生成的生长因子(抗原C)免疫小鼠，分离抗原特异性人抗体，使用本领域中承认的标准技术就V基因使用进行测序。将选择的抗体克隆至人重链和轻链恒定区，69个重链被选择用来与3个人轻链之一配对：(1)连接于人κ恒定区的同源κ轻链，(2)连接于人κ恒定区的人重排的人种系Vκ1-39Jκ5或(3)连接于人κ恒定区的重排的人种系Vκ3-20Jκ1。使用标准技术将每一个重链和轻链对共转染进CHO-K1细胞。通过在ELISA测定中通过抗人IgG来检测抗体在上清液中的存在。测定每一个重链/轻链对的抗体滴度(ng/ml)，将利用不同的重排的种系轻链获得的滴度与利用亲代抗体分子(即，与同源轻链配对的重链)获得的滴度相比较，计算天然滴度的百分比(表1)。VH：重链可变基因。ND：在当前实验条件下未检测到表达。
表1
在相似的实验中，用几种不同的抗原免疫小鼠，就与不同的重排的人种系轻链(如上文中描述的)配对的能力测试抗原特异性人抗体的选择的重链。本实验中使用的抗原包括参与胆固醇动态平衡的酶(抗原A)、参与调节葡萄糖动态平衡的血清激素(抗原B)、促进血管生成的生长因子(抗原C)和细胞表面受体(抗原D)。从每一个免疫组的小鼠分离抗原特异性抗体，克隆重链和轻链可变区并测序。根据重链和轻链的序列，确定V基因的使用，将选择的重链与它们的同源轻链或重排的人种系Vκ1-39Jκ5区配对。将每一个重链/轻链对共转染进CHO-K1细胞，在ELISA测定中通过抗人IgG检测抗体在上清液中的存在。测定每一个重链/轻链配对的抗体滴度(μg/ml)，将不同的重排的人种系轻链的滴度与对于亲代抗体分子(即，与同源轻链配对的重链)获得的滴度相比较，计算天然滴度的百分比(表2)。VH：重链可变基因。Vκ：κ轻链可变基因。ND：在当前实验条件下未检测到表达。
从这些实验获得的结果显示：来自不同基因家族的体细胞突变的高亲和力重链能够与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1区配对，并且作为正常抗体分子从细胞分泌。如表1中显示的，当与亲代抗体的同源轻链相比较时，当与重排的人Vκ1-39Jκ5轻链配对时，对于约61%(69个中的42个)的重链，抗体滴度增加；当与重排的人Vκ3-20Jκ1轻链配对时，对于约29%(69个中的20个)的重链，抗体滴度增加。当与亲代抗体的同源轻链相比较时，对于约20%(69个中的14个)的重链，两种重排的人种系轻链赋予表达的增加。如表2中显示的，重排的人种系Vκ1-39Jκ5区域赋予相较于亲代抗体的同源轻链，几种特异于一些不同种类抗原的重链的表达的增加。相较于亲代抗体的同源轻链，对于约35%(15/43)的重链，抗体滴度增加2倍多。对于两个重链(315和316)，相较于亲代抗体，增加超过10倍。在所有显示相较于亲代抗体的同源轻链增加的表达的重链内，家族3(VH3)重链相较于其它重链可变区基因家族过表达。这证明人VH3重链与重排的人种系Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1轻链配对的有利关系。
实施例2
重排的人种系轻链基因座的产生
使用技术(参见，例如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等人(2003)High-throughputengineeringofmousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,NatureBiotech.21(6):652-659)产生各种重排的人种系轻链靶向载体，以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)克隆302g12和254m04(Invitrogen)。通过使用这两个BAC克隆，工程化基因组构建体以包含单个重排的人种系轻链区，将其插入先前被修饰来缺失内源κ可变基因区段和连接基因区段的内源κ轻链基因座。
重排的人种系轻链靶向载体的构建
使用本领域公认的标准分子生物学技术产生3个不同的重排的人种系轻链。用于构建这3个区域的人可变基因区段包括重排的人Vκ1-39Jκ5序列、重排的人Vκ3-20Jκ1序列和重排的人VpreBJλ5序列。
通过从头DNA合成(IntegratedDNATechnologies)产生包含小鼠Vκ3-7基因的外显子1(编码前导肽)和内含子1的DNA区段。包括直至天然存在的BlpI限制性内切酶位点的5’非翻译区的部分。从人基因组BAC文库PCR扩增人Vκ1-39和Vκ3-20基因的外显子。正向引物具有包含小鼠Vκ3-7基因的内含子1的剪接受体位点的5’延伸。用于人Vκ1-39序列的PCR的反向引物包括编码人Jκ5的延伸，用于人Vκ3-20序列的PCR的反向引物包含编码人Jκ1的延伸。通过从头DNA合成(IntegratedDNATechnologies)制备人VpreBJλ5序列。从质粒pBS-296-HA18-PISceIPCR扩增包含剪接供体位点的人Jκ-Cκ内含子的部分。正向PCR引物包括编码人Jκ5、Jκ1或Jλ5序列的部分的延伸。反向引物包括先前工程化进入内含子的PI-SceI位点。
通过重叠延伸PCR将小鼠Vκ3-7外显子1/内含子1、人可变轻链外显子和人Jκ-Cκ内含子片段缝合在一起，以BlpI和PI-SceI消化，连接进入质粒pBS-296-HA18-PISceI，所述质粒包含来自人Vκ3-15可变基因区段的启动子。用侧翼连接了NotI和AscI位点的FRT化的潮霉素盒替代质粒pBS-296-HA18-PISceI内的lox化的潮霉素盒。将该质粒的NotI/PI-SceI片段连接进入修饰的小鼠BAC254m04，所述修饰的小鼠BAC254m04包含小鼠Jκ-Cκ内含子的部分、小鼠Cκ外显子和小鼠κ基因座下游的约75kb的基因组序列，其为小鼠ES细胞中的同源重组提供了3’同源臂。随后将该BAC的NotI/AscI片段连接进入修饰的小鼠BAC302g12，所述修饰的小鼠BAC302g12包含FRT化的潮霉素盒和内源κ基因座上游的约23kb的基因组序列(用于小鼠ES细胞的同源重组)。
重排的人种系Vκ1-39Jκ5靶向载体(图1)
在工程化的轻链插入物的5’和3’末端引入引入限制性内切酶位点以克隆进入靶向载体：在5’末端引入AscI位点，在3’末端引入PI-SceI位点。在5’AscI位点和3’PI-SceI位点内，靶向构建体从5’至3’包含5’同源臂(含有从小鼠BAC克隆302g12获得的内源小鼠κ轻链基因座的5’的序列)、FRT化的潮霉素抗性基因、基因组序列(包含人Vκ3-15启动子、小鼠Vκ3-7可变基因区段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因区段的内含子序列、重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框架)、包含人Jκ-Cκ内含子的部分的基因组序列和3’同源臂(包含从小鼠BAC克隆254m04获得的内源小鼠Jκ5基因区段的3’的序列)(图1，中间))。内源小鼠κ轻链基因座上游和大多数3’Jκ基因区段下游(例如，内源3’增强子)的基因和/或序列未被靶向构建体修饰(参见图1)。工程化的人Vκ1-39Jκ5基因座的序列示于SEQIDNO:1中。
使用位于重排的人种系轻链区内的序列的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)来确认重排的人种系Vκ1-39Jκ5区至BACDNA的靶向插入。简而言之，利用引物ULC-m1F(AGGTGAGGGTACAGATAAGTGTTATGAG；SEQIDNO:2)和ULC-m1R(TGACAAATGCCCTAATTATAGTGATCA；SEQIDNO:3)确认小鼠Vκ3-7前导序列的3’的内含子序列。利用引物1633-h2F(GGGCAAGTCAGAGCATTAGCA；SEQIDNO:4)和1633-h2R(TGCAAACTGGATGCAGCATAG；SEQIDNO:5)来确认重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的开放阅读框架。利用引物neoF(GGTGGAGAGGCTATTCGGC；SEQIDNO:6)和neoR(GAACACGGCGGCATCAG；SEQIDNO:7)来确认新霉素盒。随后将靶向的BACDNA用于电穿孔小鼠ES细胞，以产生用于产生表达重排的人种系Vκ1-39Jκ5区的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
通过TAQMANTM筛选确认阳性ES细胞克隆，并使用特异于插入内源基因座的工程化的Vκ1-39Jκ5轻链区的探针进行核型分析。简而言之，探针neoP(TGGGCACAACAGACAATCGGCTG；SEQIDNO:8)在新霉素标记基因内结合，探针ULC-m1P(CCATTATGATGCTCCATGCCTCTCTGTTC；SEQIDNO:9)在小鼠Vκ3-7前导序列的3’的内含子序列内结合，探针1633h2P(ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCT；SEQIDNO:10)在重排的人种系Vκ1-39Jκ5开放阅读框架内结合。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝表达种系Vκ1-39Jκ5轻链区的幼崽。
或者，用表达FLP的构建体转染具有重排的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区的ES细胞以除去通过靶向构建体引入的FRT化的新霉素盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠交配来除去新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留在小鼠内。
重排的人种系Vκ3-20Jκ1靶向载体(图2)
以类似的方式，使用靶向构建体制备表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的工程化的轻链基因座，所述构建体从5’至3’包含5’同源臂(含有获自小鼠BAC克隆302g12的内源小鼠κ轻链基因座的5’的序列)、FRT化的新霉素抗性基因、基因组序列(包含人Vκ3-15启动子、小鼠Vκ3-7可变基因区段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因区段的内含子序列、重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框架)、包含人Jκ-Cκ内含子的部分的基因组序列和3’同源臂(包含获自小鼠BAC克隆254m04的内源小鼠Jκ5基因区段的3’的序列)(图2，中间))。重排的人Vκ3-20Jκ1基因座的序列示于SEQIDNO:11中。
使用位于重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链区内的序列中的引物通过聚合酶链式反应(PCR)来确认重排的人种系Vκ3-20Jκ1区至BACDNA内的靶向插入。简而言之，利用引物ULC-m1F(SEQIDNO:2)和ULC-m1R(SEQIDNO:3)确认小鼠Vκ3-7前导序列的3’的内含子序列。利用引物1635-h2F(TCCAGGCACCCTGTCTTTG；SEQIDNO:12)和1635-h2R(AAGTAGCTGCTGCTAACACTCTGACT；SEQIDNO:13)来确认重排的人种系Vκ3-20Jκ1区的开放阅读框架。利用引物neoF(SEQIDNO:6)和neoR(SEQIDNO:7)来确认新霉素盒。随后将靶向的BACDNA用于电穿孔小鼠ES细胞以产生用于产生表达重排的人种系Vκ3-20Jκ1轻链的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
通过TAQMANTM筛选来确认阳性ES细胞克隆，使用特异于插入内源κ轻链基因座的工程化的Vκ3-20Jκ1轻链区的探针进行核型分析。简而言之，探针neoP(SEQIDNO:8)在新霉素标记基因内结合，探针ULC-m1P(SEQIDNO:9)在小鼠Vκ3-7前导序列的3’的内含子序列内结合，探针1635h2P(AAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG；SEQIDNO:14)在人Vκ3-20Jκ1开放阅读框架内结合。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠。一窝表达人种系Vκ3-20Jκ1轻链区的幼崽。
或者，用表达FLP的构建体转染具有人种系Vκ3-20Jκ1轻链的ES细胞以除去通过靶向构建体引入的FRT化的新霉素盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠交配来除去新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留在小鼠内。
重排的人种系VpreBJλ5靶向载体(图3)
以类似的方式，使用靶向构建体制备表达重排的人种系VpreBJλ5区的工程化的轻链基因座，所述构建体从5’至3’包含5’同源臂(含有获自小鼠BAC克隆302g12的内源小鼠κ轻链基因座的5’的序列)、FRT化的新霉素抗性基因、基因组序列(包含人Vκ3-15启动子、小鼠Vκ3-7可变基因区段的前导序列、小鼠Vκ3-7可变基因区段的内含子序列、重排的人种系VpreBJλ5区的开放阅读框架)、包含人Jκ-Cκ内含子的部分的基因组序列和3’同源臂(包含获自小鼠BAC克隆254m04的内源小鼠Jκ5基因区段的3’的序列)(图3，中间))。工程化的人重排的人VpreBJλ5基因座的序列示于SEQIDNO:15中。
使用位于重排的人种系VpreBJλ5轻链区内的序列中的引物通过聚合酶链式反应(PCR)来确认重排的人种系VpreBJλ5区至BACDNA内的靶向插入。简而言之，利用引物ULC-m1F(SEQIDNO:2)和ULC-m1R(SEQIDNO:3)确认小鼠Vκ3-7前导序列的3’的内含子序列。利用引物1616-h1F(TGTCCTCGGCCCTTGGA；SEQIDNO:16)和1616-h1R(CCGATGTCATGGTCGTTCCT；SEQIDNO:17)来确认重排的人种系VpreBJλ5区的开放阅读框架。利用引物neoF(SEQIDNO:6)和neoR(SEQIDNO:7)来确认新霉素盒。随后将靶向的BACDNA用于电穿孔小鼠ES细胞以产生用于产生表达重排的人种系VpreBJλ5轻链的嵌合小鼠的修饰的ES细胞。
通过TAQMANTM筛选来确认阳性ES细胞克隆，使用特异于插入内源κ轻链基因座的工程化的VpreBJλ5轻链的探针进行核型分析。简而言之，探针neoP(SEQIDNO:8)在新霉素标记基因内结合，探针ULC-m1P(SEQIDNO:9)在小鼠IgVκ3-7前导序列的3’的内含子序列内结合，探针1616h1P(ACAATCCGCCTCACCTGCACCCT；SEQIDNO:18)在人VpreBJλ5开放阅读框架内结合。随后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝表达种系轻链区的幼崽。
或者，用表达FLP的构建体转染具有重排的人种系VpreBJλ5轻链的ES细胞以除去通过靶向构建体引入的FRT化的新霉素盒。任选地，通过与表达FLP重组酶的小鼠交配来除去新霉素盒(例如，US6,774,279)。任选地，将新霉素盒保留在小鼠内。
实施例3
表达单个重排的人轻链的小鼠的产生
将上述靶向的ES细胞用作供体ES细胞，并且通过法(参见，例如，美国专利号7,294,754和Poueymirou等人(2007)F0generationmicethatareessentiallyfullyderivedfromthedonorgene-targetedEScellsallowingimmediatephenotypicanalysesNatureBiotech.25(1):91-99)将其引入8细胞期小鼠胚胎。使用检测独特的重排的人种系轻链区的存在的等位基因测定法的改进型(Valenzuela等人,同上)通过基因分型鉴定独立地具有工程化的人种系Vκ1-39Jκ5轻链区、Vκ3-20Jκ1轻链区或VpreBJλ5轻链区的。
对幼崽进行基因分型，选择对于独特的重排的人种系轻链区是杂合的或纯合的幼崽来表征重排的人种系轻链区的表达。
流式细胞术
通过分析免疫球蛋白κ和λ在共同轻链小鼠的脾细胞和外周血中的表达来验证重排的人轻链区域在共同轻链小鼠的正常抗体库中的表达。使用标准方法从野生型(n=5)、Vκ1-39Jκ5共同轻链杂合子(n=3)、Vκ1-39Jκ5共同轻链纯合子(n=3)、Vκ3-20Jκ1共同轻链杂合子(n=2)、Vκ3-20Jκ1共同轻链纯合子(n=2)小鼠的肾和外周血制备细胞悬浮物，使用荧光标记的抗体(BDPharmigen)，用CD19+、Igλ+和Igκ+进行染色。
简而言之，将1x106个细胞与抗小鼠CD16/CD32(克隆2.4G2,BDPharmigen)一起在冰上温育10分钟，随后用下列抗体混合物在冰上标记30分钟：缀合有APC的抗小鼠CD19(克隆1D3,BDPharmigen)、缀合有PerCP-Cy5.5的抗小鼠CD3(克隆17A2,BioLegend)、缀合有FITC的抗小鼠Igκ(克隆187.1,BDPharmigen)、缀合有PE的抗小鼠Igλ(克隆RML-42,BioLegend)。在染色后，洗涤细胞，于2%甲醛中进行固定。在LSRII流式细胞仪上进行数据获取，利用FlowJo进行分析。门控：总的B细胞(CD19+CD3-)、Igκ+B细胞(Igκ+Igλ-CD19+CD3-)、Igλ+B细胞(Igκ-Igλ+CD19+CD3-)。从血液和脾细胞样品采集的数据显示出相似的结果。表3显示了来自一个代表性小鼠(来自为Igλ+、Igκ+或Igλ+Igκ+的每一个组)的外周血的百分比阳性CD19+B细胞。来自野生型(WT)和对于Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同轻链是纯合的小鼠的外周血中的CD19+B细胞的百分比示于图4中。
表3
共同轻链表达
使用定量PCR测定(例如TAQMANTM)分析杂合和纯合小鼠的每一个共同轻链(Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1)的表达。
简而言之，按照制造商的说明书，使用小鼠CD19微珠(MiltenyiBiotec)从对于利用对应的人重链和κ轻链可变区基因座(Hκ)对小鼠重链和κ轻链可变区基因座的替代是纯合的野生型小鼠以及对于每一个重排的人轻链区(Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1)是纯合的和杂合的小鼠的脾纯化CD19+B细胞。按照制造商的说明书，使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)从CD19+B细胞纯化总RNA，使用不含DNA酶的RNA酶柱上处理(Qiagen)除去基因组RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将200ngmRNA反转录成cDNA，利用Taqman通用PCR预混合物(AppliedBiosystems)扩增所得的cDNA。使用ABI7900序列检测系统(AppliedBiosystems)，利用跨越(1)两个共同轻链的Vκ-Jκ接合点、(2)单独的Vκ基因(即Vκ1-39和Vκ3-20)和(3)小鼠Cκ区的引物和TaqmanMGB探针进行所有反应。表4显示了用于该测定的引物和探针的序列。将相对表达针对小鼠Cκ区的表达进行标准化。结果示于图5A、5B和5C。
表4
抗原特异性共同轻链抗体
用β-半乳糖苷酶免疫在内源小鼠κ轻链基因座上具有Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同轻链的共同轻链小鼠，测量抗体滴度。
简而言之，按照制造商的指导，在titermax佐剂(Sigma)中乳化β-半乳糖苷酶(Sigma)。通过用100μgβ-半乳糖苷酶/Titermax皮下注射来免疫野生型(n=7)、Vκ1-39Jκ5共同轻链纯合子(n=2)和Vκ3-20Jκ1共同轻链纯合子(n=5)。通过用50μgβ-半乳糖苷酶/Titermax皮下注射2次(间隔3周)来加强小鼠。在第二次加强后，根据生产商的指导，使用眶内出血从麻醉小鼠将血液收集进入血清分离管(BDBiosciences)。为了测量抗-β-半乳糖苷酶IgM或IgG抗体，在4℃用1μg/mLβ-半乳糖苷酶涂覆ELISA板(Nunc)过夜。洗去过量抗原，随后用含有1%BSA的PBS在室温封闭1小时。将血清的连续稀释物添加至板，在室温温育1小时，随后进行洗涤。随后用缀合有HRP的抗IgM(SouthernBiotech)或抗IgG(SouthernBiotech)在室温温育板1小时。在另一次洗涤后，用TMB底物(BDBiosciences)对板进行显色。用1N硫酸终止反应，使用VictorX5板读数器(PerkinElmer)读取OD450。利用GraphPadPrism分析数据，将信号计算为高于本底2倍的血清的稀释度。结果示于图6A和6B中。
如本实施例中所示，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1共同轻链小鼠的脾和外周区室中κ/λB细胞的比率显示为接近野生型模式(表3和图4)。然而，VpreBJλ5共同轻链小鼠显示较少的外周B细胞，其中约1-2%表达工程化的人轻链区(数据未显示)。Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1重排的人轻链区从内源κ轻链基因座的表达水平相较于包含人Vκ和Jκ基因区段对小鼠Vκ和Jκ基因区段的完全替代的内源κ轻链基因座升高(图5A、5B和5C)。VpreBJλ5重排的人轻链区的表达水平在杂合和纯合小鼠中显示相似高的从内源κ轻链基因座的表达(数据未显示)。这证明在与小鼠λ、κ或二者的内源轻链基因座的直接竞争中，单个重排的人VL/JL序列可产生比野生型水平更好的从内源κ轻链基因座的表达，并且产生正常的脾和血液B细胞频率。此外，具有人Vκ1-39Jκ5或人Vκ3-20Jκ1序列的工程化κ轻链基因座的存在被小鼠良好地耐受，并且似乎通过代表免疫应答的体液组分中的轻链库的绝大部分而以野生型方式起作用(图6A和6B)。
实施例4
表达单个重排的人种系轻链的小鼠的培育
本实施例描述了几种其它的遗传修饰的小鼠品系，可将所述小鼠品系与本文中描述的共同轻链小鼠的任一种交配以产生具有多个遗传修饰的免疫球蛋白基因座的多重遗传修饰的小鼠品系。
内源Igλ敲除(KO)
为了最优化工程化的轻链基因座的使用，将具有重排的人种系轻链区之一的小鼠与另一个在内源λ轻链基因座中包含缺失的小鼠交配。以该方式，获得的后代将把实施例2中描述的重排的人种系轻链区作为它们唯一的轻链来表达。通过本领域公认的标准技术，或可选择地通过商业培育者(例如，TheJacksonLaboratory)进行培育。就独特轻链区的存在和内源小鼠λ轻链的不存在筛选具有工程化的轻链基因座和内源λ轻链基因座的缺失的小鼠品系。
人源化内源重链基因座
将具有工程化的人种系轻链基因座的小鼠与包含人重链可变基因基因座对内源小鼠重链可变基因基因座的替代的小鼠交配(参见US6,596,541；小鼠,RegeneronPharmaceuticals,Inc.)。小鼠包含含有有效地连接于内源小鼠恒定区基因座的人重链可变区的基因组，从而小鼠响应抗原性刺激产生包含人重链可变区和小鼠重链恒定区的抗体。分离编码抗体的重链的可变区的DNA，将其有效地连接于编码人重链恒定区的DNA。随后在能够表达抗体的完全人重链的细胞中表达DNA。
获得具有人VH基因座对内源小鼠VH基因座的替代和在内源κ轻链基因座中具有单个重排的人种系VL区的小鼠。在用目的抗原免疫后，获得包含体细胞突变的重链(人VH和小鼠CH)和单个人轻链(人VL和小鼠CL)的反向嵌合抗体。鉴定表达抗体的B细胞的VH和VL核苷酸序列，通过将VH和VL核苷酸序列在适当的表达系统中融合至人CH和CL核苷酸序列来制备完全人抗体。
实施例5
从表达人重链和重排的人种系轻链区的小鼠产生抗体
在将包含工程化的人轻链区的小鼠与各种包含其它内源Ig基因座的修饰和缺失的期望品系(如实施例4中描述的)交配后，选择的小鼠可用目的抗原免疫。
一般而言，用抗原攻击包含单个重排的人种系轻链区之一的小鼠，从动物的血清回收淋巴细胞(例如B细胞)。将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系，筛选和选择这样的杂交瘤细胞系以鉴定产生抗体的杂交瘤细胞系，所述抗体包含对于用于免疫的抗原是特异性的人重链可变区和重排的人种系轻链。分离编码重链和轻链的可变区的DNA，将其连接至重链和轻链的期望的同型恒定区。由于内源小鼠序列和存在于内源基因座中的任何另外的顺式作用元件的存在，每一个抗体的单个轻链可发生体细胞突变。这给包含单个轻链和多种重链序列的抗原特异性库添加了额外的多样性。随后在细胞例如CHO细胞中表达所得的克隆的抗体序列。或者，直接从抗原特异性淋巴细胞鉴定编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA。
最初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如上所述，就期望的特征(包括亲和力、选择性、表位等)表征和选择抗体。用期望的人恒定区替代小鼠恒定区以产生包含体细胞突变的人重链和来源于本发明的重排的人种系轻链区的单个轻链的完全人抗体。适当的人恒定区包括例如野生型或修饰的IgG1或IgG4。
利用人细胞表面受体蛋白(抗原E)免疫小鼠的单独组群，所述小鼠包含人VH、DH和JH基因区段对内源小鼠重链基因座的替代和工程化的种系Vκ1-39Jκ5人轻链区或工程化的种系Vκ3-20Jκ1人轻链区(上文中描述的)对内源小鼠κ轻链基因座的替代。通过6次连续注射(每3-4天一次)将抗原E直接施用至小鼠的后足垫。将2至3微克的抗原E与10μg的CpG寡核苷酸(Cat#tlrl-modn-ODN1826寡核苷酸；InVivogen,SanDiego,CA)和25μg的Adju-Phos(磷酸铝凝胶佐剂,Cat#H-71639-250；BrenntagBiosector,Frederikssund,Denmark)混合，随后注射。在最终的抗原回忆(antigenrecall)之前提供总共6次注射，在处死之前3-5天提供。收集第4和第6次注射后的出血，通过标准抗原特异性免疫检测监测抗体免疫应答。
当达到期望的免疫应答时，收集脾细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持它们的活力和形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生抗原E特异性共同轻链抗体的细胞系。通过使用该技术，获得几种抗-抗原E特异性共同轻链抗体(即，具有人重链可变结构域、相同的人轻链可变区和小鼠恒定结构域的抗体)。
或者，直接从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞分离抗-抗原E共同轻链抗体，如U.S.2007/0280945A1(通过引用将其明确地整体并入本文)中描述的。通过使用该方法，获得几种完全人抗-抗原E共同轻链抗体(即，具有人重链可变结构域、工程化的人Vκ1-39Jκ5轻链或工程化的人Vκ3-20Jκ1轻链区和人恒定结构域的抗体)。
在下面所示的部分中详细地描述按照本实施例的方法产生的示例性抗-抗原E共同轻链抗体的生物学性质。
实施例6
抗原特异性共同轻链抗体的重链基因区段的使用
为了分析产生的人抗-抗原E共同轻链抗体的结构，克隆编码重链抗体可变区的核酸并测序。根据抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列，鉴定获自包含工程化的人Vκ1-39Jκ5轻链或工程化的人Vκ3-20Jκ1轻链区的经免疫的小鼠的选择的共同轻链抗体的重链可变区(HCVR)的基因使用。结果示于表5和6中，所述结果显示根据本发明的小鼠，当使用仅从人Vκ1-39或人Vκ3-20衍生轻链表达轻链的小鼠时，因多种重排而从多种人重链基因区段产生抗原特异性共同轻链抗体。2、3、4和5家族的人VH基因区段与多种人DH区段和人JH区段重排以产生抗原特异性抗体。
表6
实施例7
通过LUMINEXTM测定法测定抗原特异性共同轻链抗体的阻断能力
在基于珠粒的测定中测试98个针对抗原E产生的人共同轻链抗体的阻断抗原E的天然配体(配体Y)对抗原E的结合的能力。
将抗原E的细胞外结构域(ECD)缀合于两个myc表位标签和6X组氨酸标签(抗原E-mmH)并胺偶联至MES缓冲液中的浓度为20μg/mL的羧化微球体。将混合物在室温温育2小时，随后用1MTrispH8.0进行珠粒灭活，随后用PBS中的0.05%(v/v)的Tween-20洗涤。随后用含有2%(w/v)BSA(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)的PBS(IrvineScientific,SantaAna,CA)封闭珠粒。在96孔滤板中，将含抗原E特异性共同轻链抗体的上清液以1:15稀释于缓冲液中。制备包含模拟物上清液(具有与用于抗体上清液的介质组分相同的介质组分)的阴性对照。将抗原E标记的珠粒添加至上清液，在4℃温育过夜。将生物素化的配体Y蛋白添加至终浓度0.06nM，在室温温育2小时。利用缀合于链霉抗生物素蛋白(MossInc,Pasadena,MD)的R-藻红蛋白检测结合至抗原E-myc-myc-6His标记珠粒的生物素化配体Y，随后在基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪中进行测量。从全部样品扣除无配体Y的样品的本底平均荧光强度(MFI)。通过将每一个样品的扣除本底的MFI除以调整的阴性对照值，随后乘以100，从100减去所得的值来计算百分比阻断。
在类似的实验中，测试相同的98个针对抗原E产生的人共同轻链抗体的阻断抗原E对配体Y标记的珠粒的结合的能力。
简而言之，将配体Y胺偶联至于MES缓冲液中稀释的浓度为20μg/mL的羧化微粒体。将混合物在室温温育2小时，随后利用1MTrispH8使珠粒失活，用PBS中的0.05%(v/v)的Tween-20进行洗涤。随后用含有2%(w/v)BSA(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)的PBS(IrvineScientific,SantaAna,CA)阻断珠粒。在96孔滤板中，将含有抗原E特异性共同轻链抗体的上清液以1:15稀释于缓冲液中。制备包含模拟物上清液(具有与用于抗体上清液的介质组分相同的介质组分)的阴性对照。将生物素化的抗原E-mmH添加至0.42nM的终浓度，在4℃温育过夜。随后将配体Y标记的珠粒添加至抗体/抗原E混合物，在室温温育2小时。利用缀合于链霉抗生物素蛋白(MossInc,Pasadena,MD)的R-藻红蛋白检测结合至配体Y-珠粒的生物素化的抗原E-mmH，随后在基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪中进行测量。从全部样品扣除无抗原E的样品的本底平均荧光强度(MFI)。通过将每一个样品的扣除本底的MFI除以调整的阴性对照值，随后乘以100，从100减去所得的值来计算百分比阻断。
表7和8显示了在两个LUMINEXTM测定中测试的全部98个抗-抗原E共同轻链抗体的百分比阻断。ND:在当前实验条件下未测定。
表7
表8
在上述第一个LUMINEXTM实验中，测试了80个含Vκ1-39Jκ5工程化轻链的共同轻链抗体的阻断配体Y对抗原E标记的珠粒的阻断的能力。在这80个共同轻链抗体当中，68个显示大于50%的阻断，然而12个显示小于50%的阻断(6个25-50%的阻断，6个小于25%的阻断)。对于18个含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的共同轻链抗体，12个显示大于50%的配体Y对抗原E标记的珠粒的结合的阻断，然而6个显示小于50%的配体Y对抗原E标记的珠粒的结合的阻断(3个25-50%的阻断，3个小于25%的阻断)。
在上述第二个LUMINEXTM实验中，测试了相同的80个包含Vκ1-39Jκ5工程化轻链的共同轻链抗体的阻断抗原E对配体Y-标记的珠粒的结合的能力。在这80个共同轻链抗体中，36个显示大于50%的阻断，而44个显示小于50%的阻断(27个显示25-50%的阻断，17个显示小于25%的阻断)。对于18个包含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的共同轻链抗体，1个显示大于50%的抗原E对配体Y-标记的珠粒的结合的阻断，而17个显示小于50%的所述阻断(5个显示25-50%的阻断，12个显示小于25%的阻断)。
表7和8的数据确定了表5和6中描述的重排产生抗-抗原E特异性共同轻链抗体，所述抗体以不同程度的效力阻断配体Y对其同源受体抗原E的结合，这与表5和6的抗-抗原E共同轻链抗体(包括具有重叠的和非重叠的针对抗原E的表位特异性的抗体)一致。
实施例8
通过ELISA测定抗原特异性共同轻链抗体的阻断能力
在ELISA测定中测试针对抗原E产生的人共同轻链抗体的阻断抗原E对配体Y涂覆的表面的结合的能力。
将配体Y以2μg/mL的浓度(于PBS中稀释的)涂覆在96孔板上，温育过夜，随后在具有0.05%Tween-20的PBS中洗涤4次。随后用含有0.5%(w/v)BSA(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO)的PBS(IrvineScientific,SantaAna,CA)在室温封闭板1小时。在单独的板中，将含有抗-抗原E共同轻链抗体的上清液以1:10稀释于缓冲液中。将具有抗体的相同组分的模拟物上清液用作阴性对照。将抗原E-mmH(上文中描述的)添加至0.150nM的终浓度，在室温温育1小时。随后将抗体/抗原E-mmH混合物添加至含有配体Y的板中，在室温温育1小时。利用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗-Penta-His抗体(Qiagen,Valencia,CA)确定结合至配体Y的抗原E-mmH的检测，使用利用硫酸中和的四甲基联苯胺(TMB)底物(BDBiosciences,SanJose,CA)，通过标准比色反应进行显色。在OD450读取吸光度，进行0.1秒。从所有样品扣除不具有抗原E的样品的本底吸光度。通过将每一个样品的扣除本底的MFI除以调整的阴性对照值，随后乘以100，然后从100减去所得的值来计算百分比阻断。
表9和10显示了ELISA测定中测试的全部98个抗-抗原E共同轻链抗体的百分比阻断。ND:在当前实验条件下未测定。
表9
表10
如本实施例中所描述的，在测试其阻断抗原E对配体Y-涂覆的表面的结合的能力的80个包含Vκ1-39Jκ5工程化轻链的共同轻链抗体中，22个显示大于50%的阻断，58个显示小于50%的阻断(20个显示25-50%的阻断，38个显示小于25%的阻断)。对于18个包含Vκ3-20Jκ1工程化轻链的共同轻链抗体，一个显示大于50%的抗原E对配体Y-涂覆的表面的结合的阻断，17个显示小于50%的所述阻断(5个显示25-50%的阻断，12个显示小于25%的阻断)。
这些结果与包含具有重叠的和非重叠的针对抗原E的表位特异性的抗体的抗原E特异性共同轻链抗体库也是一致的。
实施例9
抗原特异性共同轻链抗体的BIACORETM亲和力测定
使用BIACORETMT100仪(GEHealthcare)，通过SPR(表面等离子体共振技术)测定选择的抗体上清液的平衡解离常数(KD)。在25℃使用HBS-EP(10mMHepes,150mMNaCl,0.3mMEDTA,0.05%表面活性剂P20,pH7.4)作为运行缓冲液和样品缓冲液来获得所有数据。将抗体从粗制上清液样品捕获至先前使用标准胺偶联化学，利用高密度的抗人Fc抗体衍生的CM5传感器芯片表面上。在捕获步骤中，以3μL/min的流速将上清液注射于抗人Fc表面，进行总共3分钟。在捕获步骤后，以35μL/min的流速以100nM的浓度注射电泳缓冲液或分析物，进行2分钟。监控抗原从捕获的抗体解离，进行6分钟。通过短暂地注射10mM甘氨酸，pH1.5来除去捕获的抗体。通过从分析物传感图扣除来自缓冲液注射的传感图来双参考所有传感图，从而除去通过抗体从捕获表面解离引起的人为假像。使用BIAcoreT100评价软件v2.1将每一种抗体的结合数据与1:1传质结合模型拟合。结果示于表11和12中。
表11
表12
表5和6中显示的包含重排的共同轻链抗体的结合亲和力是变化的，几乎全部显示在纳摩尔范围内的KD。亲和力数据与由表5和6中描述的重排的可变结构域的组合缔合产生的共同轻链抗体(其为高亲和力的、克隆地选择的和体细胞突变的)一致。与先前显示的数据相结合，表5和6中描述的共同轻链抗体包括显示对于抗原E上的一个或多个表位的特异性的不同的高亲和力抗体的集合。
实施例10
通过LUMINEXTM测定来测定抗原特异性共同轻链抗体的结合特异性
测试选择的抗-抗原E共同轻链抗体的结合抗原E的ECD和抗原EECD变体的能力，所述变体包括食蟹猴直系同源物(Mf抗原E)，其与人蛋白质相异在于约10%的其氨基酸残基；缺少ECD的C末端的最后10个氨基酸的抗原E的缺失突变体(抗原E-ΔCT)；和两个在与配体Y相互作用的疑似位置上包含丙氨酸置换的突变体(抗原E-Ala1和抗原E-Ala2)。在CHO细胞中产生抗原E蛋白，每一种蛋白包含myc-myc-HisC-末端标签。
关于结合研究，通过在室温与1x106个用抗myc单克隆抗体(MAb9E10,杂交瘤细胞系CRL-1729TM；ATCC,Manassas,VA)共价涂覆的微球体(LUMINEXTM)珠粒一起温育2小时来捕获来自1mL培养基的抗原EECD蛋白或变体蛋白(上文中描述的)。随后在使用前用PBS洗涤珠粒。将包含抗-抗原E共同轻链抗体的上清液以1:4稀释于缓冲液，将其添加至96孔滤板。将不具有抗体的模拟物上清液用作阴性对照。随后将包含捕获的抗原E蛋白的珠粒添加至抗体样品(3000个珠粒/孔)，在4℃温育过夜。第二天，洗涤样品珠粒，利用缀合有R-藻红蛋白的抗-人IgG抗体检测结合的共同轻链抗体。利用基于LUMINEXTM流式细胞术的分析仪测量珠粒的荧光强度(对于每一个抗体样品对每一种抗原E蛋白的结合，计数约100个珠粒)，记录每珠粒/抗体相互作用至少100个计数的珠粒的平均荧光强度(MFI)。结果示于表13和14中。
表13
表14
抗-抗原E共同轻链抗体上清液显示对连接于抗原E-ECD的珠粒的高特异性结合。对于这些珠粒，当与抗原E-ECD珠粒样品组合时，阴性对照模拟物上清液导致可忽略的信号(<10MFI)，而包含抗-抗原E共同轻链抗体的上清液显示强结合信号(对于98个抗体上清液，平均MFI为2627；对于91/98抗体样品，MFI>500)。
作为选择的抗-抗原E共同轻链抗体鉴定抗原E的ECD上的不同表位的能力的量度，测定了抗体对变体的相对结合。将全部4种抗原E变体捕获至上文中针对天然抗原E-ECD结合研究所描述的抗-mycLUMINEXTM珠粒，测定了相对结合比率(MFI变体/MFI抗原E-ECD)。对于表12和13中显示的98个测试的共同轻链抗体上清液，对于每一种变体，平均比率(MFI变体/MFI抗原E-ECD)都不同，这可能反映了蛋白质在珠粒上的不同捕获量(对于抗原E-ΔCT、抗原E-Ala1、抗原E-Ala2和Mf抗原E分别为0.61、2.9、2.0和1.0的平均比率)。对于每一种蛋白质变体，对于一个亚组98个测试的共同轻链抗体的结合显示大大减少的结合，显示对表征给定的变体的突变的敏感性。例如，共同轻链抗体样品中有19个以小于8%的MFI变体/MFI抗原E-ECD结合Mf抗原E。因为该组中的许多抗体样品包括高亲和力或适中的高亲和力抗体(5个具有小于5nM的KD，15个具有小于50nM的KD)，所以该组的更低的信号可能由对天然抗原E-ECD与给定的变体之间的序列(表位)差异性的敏感性而非更低的亲和力造成。
这些数据确定了表5和6中描述的共同轻链抗体代表特异性识别抗原E上超过一个表位的抗原-E-特异性共同轻链抗体的多样性组。

Claims (37)

1.遗传修饰的小鼠用于制备抗体的用途，其中所述小鼠的特征在于其B细胞产生抗体群体，每个抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域和来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的人轻链可变结构域，其中所述人VH/DH/JH区选自2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、3-23/6-6/4、3-23/7-27/4、3-30/1-1/4、3-30/3-3/4、3-30/5-5/2、3-30/7-27/6、1-69/6-6/5和1-69/6-13/4。
2.权利要求1的用途，其中所述小鼠的种系不存在对于表达抗体轻链有功能的未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段。
3.权利要求1的用途，其中所述抗体是人抗体，所述人抗体的重链可变结构域是选自所述抗体群体的人重链可变结构域的人重链可变结构域，并且所述用途包括在细胞中表达抗体。
4.权利要求3的用途，其中所述人抗体还包括人轻链，所述人轻链的可变结构域由人Vκ1-39/Jκ5表达而来。
5.权利要求1的用途，其中所述小鼠的特征还在于其种系不存在未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段。
6.权利要求1的用途，其中所述抗体包含来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的轻链。
7.权利要求1的用途，其中所述小鼠的特征还在于：
(a)其种系不存在未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段；和
(b)所述抗体包含来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的轻链。
8.权利要求1的用途，其中所述小鼠的特征在于其每个B细胞包含重排的人Vκ1-39/Jκ5序列。
9.权利要求1的用途，其中：
(a)人Vκ1-39/Jκ5序列有效地连接于小鼠Cκ区；
(b)人重链可变结构域有效地连接于选自CH1、铰链、CH2、CH3或其组合的小鼠重链恒定(CH)区序列；和
(c)人重链可变结构域从内源免疫球蛋白重链基因座表达。
10.权利要求1的用途，其中小鼠Vκ和Jκ基因区段被重排的人Vκ1-39/Jκ5序列替换。
11.权利要求1的用途，其中重排的人Vκ1-39/Jκ5序列有效地连接于选自小鼠、大鼠或人序列的免疫球蛋白轻链恒定区序列。
12.遗传修饰的小鼠用于制备抗体的用途，其中所述小鼠的特征在于其B细胞产生抗体群体，每个抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域和来源于重排的人Vκ3-20/Jκ1序列的人轻链可变结构域，其中所述人VH/DH/JH区选自3-30/3-3/3、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4和3-53/1-1/4。
13.权利要求12的用途，其中所述小鼠的种系不存在对于表达抗体轻链有功能的未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段。
14.权利要求12的用途，其中所述抗体是人抗体，所述人抗体的重链可变结构域是选自所述抗体群体的人重链可变结构域的人重链可变结构域，并且所述用途包括在细胞中表达抗体。
15.权利要求14的用途，其中所述人抗体还包括人轻链，所述人轻链的可变结构域由人Vκ3-20/Jκ1表达而来。
16.权利要求12的用途，其中所述小鼠的特征还在于其种系不存在未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段。
17.权利要求12的用途，其中所述抗体包含来源于重排的人Vκ3-20/Jκ1序列的轻链。
18.权利要求12的用途，其中所述小鼠的特征还在于：
(a)其种系不存在未重排的内源免疫球蛋白Vκ基因区段和未重排的内源免疫球蛋白Jκ基因区段；和
(b)所述抗体包含来源于重排的人Vκ3-20/Jκ1序列的轻链。
19.权利要求12的用途，其中所述小鼠的特征在于其每个B细胞包含重排的人Vκ3-20/Jκ1序列。
20.权利要求12的用途，其中：
(a)所述人Vκ3-20/Jκ1序列有效地连接于小鼠Cκ区；
(b)所述人重链可变结构域有效地连接于选自CH1、铰链、CH2、CH3或其组合的小鼠CH区序列；和
(c)所述人重链可变结构域从内源免疫球蛋白重链基因座表达。
21.权利要求12的用途，其中小鼠Vκ和Jκ基因区段被重排的人Vκ3-20/Jκ1序列替换。
22.权利要求12的用途，其中重排的人Vκ3-20/Jκ1序列有效地连接于选自小鼠、大鼠或人序列的免疫球蛋白轻链恒定区序列。
23.前述权利要求任一项的用途，其中所述小鼠包含无功能的免疫球蛋白λ轻链基因座。
24.权利要求1-11任一项的用途，其中所述抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域，所述人VH/DH/JH区选自2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5或1-69/6-13/4。
25.权利要求24的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。
26.权利要求12-22任一项的用途，其中所述抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变(VH)结构域，所述人VH/DH/JH区选自3-30/3-3/3,3-33/1-7/4,3-33/2-15/4或3-53/1-1/4。
27.权利要求26的用途，其中所述抗体是双特异性抗体。
28.权利要求25的用途，其中通过包括下列步骤的方法来产生抗体：在单个细胞中表达人重链可变结构域。
29.权利要求27的用途，其中通过包括下列步骤的方法来产生抗体：在单个细胞中表达人重链可变结构域。
30.权利要求1-22任一项的用途，其中所述抗体的重链是完全人的。
31.权利要求24的用途，其中包含人重链可变结构域的重链与包含来源于重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人轻链可变结构域的轻链配对。
32.权利要求26的用途，其中包含人重链可变结构域的重链与包含来源于重排的人Vκ3-20/Jκ序列的人轻链可变结构域的轻链配对。
33.权利要求24的用途，其中人重链可变结构域通过下列步骤选择：使用目标抗原免疫所述小鼠，确定由所述小鼠表达的人重链可变结构域的序列，和在细胞中表达至少一个所述序列。
34.权利要求26的用途，其中人重链可变结构域通过下列步骤选择：使用目标抗原免疫所述小鼠，确定由所述小鼠表达的人重链可变结构域的序列，和在细胞中表达至少一个所述序列。
35.制备针对目标抗原的抗体的方法，所述抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域，所述人VH/DH/JH区选自2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5或1-69/6-13/4，所述方法包括：
(a)在权利要求1-11任一项所述的小鼠中获得来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域，所述人VH/DH/JH区选自2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5或1-69/6-13/4；和
(b)将(a)中获得的免疫球蛋白可变区序列应用于特异性结合目标抗原的抗体。
36.制备针对目标抗原的抗体的方法，所述抗体包含来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域，所述人VH/DH/JH区选自3-30/3-3/3,3-33/1-7/4,3-33/2-15/4或3-53/1-1/4，所述方法包括：
(a)在权利要求12-22任一项所述的小鼠中获得来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变结构域，所述人VH/DH/JH区选自3-30/3-3/3,3-33/1-7/4,3-33/2-15/4或3-53/1-1/4；和
(b)将(a)中获得的免疫球蛋白可变区序列应用于特异性结合目标抗原的抗体。
37.遗传修饰的小鼠用于制备抗体的用途，其中所述小鼠的特征在于表达针对特定抗原的抗体的B细胞的群体，其中所述群体中每个B细胞表达来源于重排的人Vκ1-39/Jκ5序列的人VL结构域，其中所述群体表达来源于重排的人VH/DH/JH区的人重链可变(VH)结构域，所述人VH/DH/JH区包括2-5/3-22/1,3-13/6-6/5,3-23/2-8/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/3-3/4,3-30/5-5/2,3-30/7-27/6,1-69/6-6/5或1-69/6-13/4中的每一个。
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