MXPA03008454A

MXPA03008454A - Animales transgenicos que expresan anticuerpos especificos para genes de interes y usos de los mismos.

Info

Publication number: MXPA03008454A
Application number: MXPA03008454A
Authority: MX
Inventors: Ghayur Tariq
Original assignee: Abbott Gmbh & Co Kg
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2004-06-30
Also published as: WO2002076196A1; EP1379125A1; JP2005508608A; CA2440676A1; US20020138857A1; US20110154521A1; EP2294917A1; US7795494B2; EP1379125A4

Abstract

La invencion proporciona composiciones y metodos para la generacion de animales transgenicos novedosos, que no son seres humanos, los cuales contienen una alteracion en un gen de interes. Estos animales transgenicos son capaces de generar anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, especificos para el producto de un gen de interes que ha sido funcionalmente interrumpido en el animal transgenico. Ademas, los metodos y composiciones de la invencion son adecuados para utilizarse en el tratamiento, diagnostico y formacion de imagenes de la enfermedad.

Description

ANIMALES TRANSGENICOS QUE EXPRESAN ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA GENES DE INTERES Y USOS DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/278,515, presentada el 22 de Marzo del 2001.

INFORMACION RELACIONADA Los contenidos de todas las patentes, solicitudes de patente y referencias citadas a través de esta especificación se incorporan aquí por referencia en sus totalidades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La noción de que los anticuerpos proporcionan un medio específico, seguro y rápido para desarrollar agentes terapéuticos está ganando interés. Con el proyecto " del genoma humano casi completo, está disponible un gran número de objetivos de anticuerpo novedosos. También están disponibles metodologías bien establecidas para hacer anticuerpos monoclonales (mAbs). Estas metodologías incluyen aspectos tanto in vitro (presentación de fago, presentación de levadura, presentación viral, etc.), como in vivo (inmunizaciones de animales con el antígeno objetivo seguido por tecnología de hibridoma clásico). Los anticuerpos terapéuticos pueden ser totalmente humanos, humanizados o injertados con CDR. Se cree que estos anticuerpos, anticuerpos terapéuticos totalmente humanos, muestran más promesa ya que pueden ser menos inmunogénicos y tienen una vida media larga. Los ratones transgénicos (Tg) que llevan genes humanos que codifican anticuerpos ofrecen un método para hacer mAbs completamente humanos, rápidamente. Sin embargo, una de las limitaciones principales de este aspecto es que un gran número de proteínas está altamente conservado, tanto estructural como f uncionalmente, entre seres humanos y roedores. En el caso de proteínas conservadas, la mayoría de los anticuerpos desarrollados podrían ser contra regiones (epítopos) de proteínas que son diferentes entre seres humanos y ratones. Dichas regiones pueden o no producir mAbs de grado terapéutico, neutralizante.

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención proporciona animales transgénicos que no son seres humanos que contienen alteraciones en un gen de interés, de manera que el producto del gen de interés no es expresado. La ausencia del producto del gen de interés en el animal permite la producción de moléculas de inmunoglobulina a través del animal, después de exponer al producto del gen de interés (GOI). La presente invención de esta manera proporciona métodos para producir moléculas de inmunoglobulina, las cuales superan los problemas de generar anticuerpos contra proteínas altamente conservadas (es decir, genes de interés) que pueden ser reconocidas como propias en un animal que no es un ser humano y de esta manera pueden ser no inmunogénicas. En una modalidad preferida (1), la invención proporciona un animal transgénico que no es un ser humano que contiene una mutación en un gen de interés (GUI), de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido, y cuando este animal es expuesto al producto de gen es capaz de expresar una molécula de inmunoglobulina, la cual puede unirse al producto de gen. En la modalidad (2), el animal es capaz de expresar una inmunoglobulina funcional que puede unir el homólogo humano del producto de GOI. En la modalidad (3), el animal transgénico que no es un ser humano también es transgénico para inmunoglobulinas humanas y, por lo tanto, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana funcional que puede unirse al homólogo humano del producto de GOI. En la modalidad (4), la inmunoglobulina puede ser una cadena pesada humana, una cadena ligera humana, o tanto una cadena pesada humana como una cadena ligera humana. En la modalidad (5) por lo menos un sitio de inmunoglobulina endógeno está inactivo en el animal transgénico que no es un ser humano. En otra modalidad preferida (6), la invención proporciona un animal transgénico que no es un ser humano que contiene lo siguiente: (a) por lo menos un sitio de inmunoglobulina endógena inactivo; (b) llevar un ácido nucleico que codifica por lo menos una porción de una mmunoglobulina humana capaz de ser expresada como una molécula de unión funcional; (c) contiene una alteración en un gen de interés, de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido; de manera que este animal, después de la exposición al producto de gen, puede expresar una inmunoglobulina humana funcional capaz de unirse al producto de gen. En la modalidad (7), el sitio de inmunoglobulina endógena consiste de una cadena pesada endógena, una cadena ligera endógena, o ambas. En la modalidad (8), el animal que no es un ser humano contiene ácido nucleico para la cadena pesada humana, una cadena ligera humana, o ambas. En una modalidad preferida (9), la invención proporciona un animal transgénico que no es un ser humano que contiene lo siguiente: (a) sitios de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera endógenas inactivos; (b) ácido nucleico que codifica cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana, que expresa un anticuerpo funcional; (c) una alteración en un gen de interés, de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido; de manera que este animal, después de la exposición al producto de gen, es capaz de expresar una cadena ligera humana y una cadena pesada humana como una inmunoglobulina humana funcional que puede unirse al producto de gen. En la modalidad (10), el animal transgénico que no es un ser humano de acuerdo con las modalidades 6 y 9, cuando se expone al homólogo humano del producto de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana funcional capaz de unirse al producto de gen. En la modalidad (11), los anticuerpos expresados a través de los animales transgénicos que no son seres humanos de todas las modalidades anteriores pueden ser IgG, IgM o IgA. En la modalidad (12), la alteración de GOl en el animal y en todas las modalidades anteriores puede ser una ruptura de existencia natural, una ruptura o escisión del gen genéticamente diseñado por ingeniería. En la modalidad (13), el GOl en todas las modalidades anteriores puede ser cualquier proteína, polipéptido o péptido que pueda o no adquirir además glicosilación, fosforilación, etc., a través de modificación de traducción posterior. En la modalidad (14), estas proteínas, polipéptidos y péptidos son proteínas secretadas o receptores de superficie. De acuerdo con la modalidad (15), las proteínas secretadas pueden ser seleccionadas de familias de citosinas tales como interferón (IFN), factor de necrosis tumoral (TNF), interleucinas (IL), IP-10, PF4, a GRO, 9E3, EMAP-II, factor de estimulación de colonia (CSF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), y factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF). Además, en la modalidad (16), las interleucinas pueden ser IL-1a, l L- 1 ß , IL-12 o IL-18. En una modalidad preferida, el GOl endógeno es el gen de IL-18. En la modalidad (17), un anticuerpo y cualquier fragmento del anticuerpo capaz de unirse al producto de gen del GOl pueden ser derivados del animal transgénico que no es un ser humano de todas las modalidades anteriores. En la modalidad (18), el ácido nucleico que codifica al anticuerpo puede derivarse del animal transgénico que no es un ser humano. En la modalidad (19), las células B que expresan el anticuerpo pueden ser derivadas del animal transgénico que no es un ser humano y subsecuentemente utilizadas para derivar hibridomas que pueden expresar un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al producto de gen. En la modalidad (20), las células del tallo embriónicas pueden ser derivadas del animal transgénico que no es un ser humano de las modalidades anteriores. En la modalidad (21), la progenie también puede ser derivada del animal transgénico que no es un ser humano de las modalidades anteriores. En la modalidad preferida (22), la invención proporciona un método para hacer un animal transgénico que no es un ser humano a partir de células del tallo embriónicas, en donde el gen endógeno de interés es alterado, de manera que el producto de este gen endógeno ya no es más producido; este animal, después de exponerse al producto de gen, puede expresar anticuerpos capaces de unirse al producto de gen. En la modalidad (23), la invención proporciona otro método para hacer un animal transgénico que no es un ser humano a partir de células del tallo embriónicas, en donde los múltiples genes endógenos de interés son alterados, de manera que los productos de estos genes endógenos ya no pueden ser más producidos, de manera que el animal, después de exponerse a estos productos de gen, puede expresar anticuerpos capaces de unirse a los productos de gen. En la modalidad (24), el producto de gen de acuerdo con las modalidades 22 y 23 es un homólogo humano. En la modalidad (25), el animal transgénico que no es un ser humano de las modalidades 22 y 23 anteriores, también es transgénico para genes de inmunoglobulina humana, de manera que después de la exposición al homólogo humano del producto de gen, el animal es capaz de expresar un anticuerpo humano funcional capaz de unirse al producto de gen humano. En la modalidad (26), el sistema inmune del animal transgénico que no es un ser humano, de las modalidades 22 y 23, puede ser extirpado y subsecuentemente injertado con células de médula ósea capas de expresar inmunoglobulinas humanas. En la modalidad preferida (27), la invención proporciona otro método para hacer ia progenie cruzando animales transgénicos que no sean seres humanos para genes de inmunoglobulina humana con animales transgénicos que no son seres humanos en donde uno o más de los genes de interés del animal son alterados, de manera que uno o más de los productos de gen endógeno de los genes de interés ya no son más producidos y su progenie, después de la exposición a un producto de gen o a su homólogo humano, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana, la cual puede unirse al producto de gen. En una modalidad preferida (28), la invención proporciona un método para hacer un animal transgénico que no es un ser humano a partir de una célula de tallo embriónica, la cual ya lleva los genes de inmunoglobulina humana; en donde uno o más genes endógenos de interés han sido alterados, de manera que sus productos de gen ya no son más producidos; de manera que este animal, después de exponerse a uno o más de los productos de gen o su homólogo humano puede expresar inmunoglobulinas humanas capaces de unirse a los productos de gen. En una modalidad preferida, el GOI en todas las modalidades anteriores puede ser cualquier proteína, polipéptido o péptido. Además estas proteínas, polipéptidos y péptidos pueden ser proteínas secretadas o receptores de superficie. En una modalidad muy preferida, las proteínas secretadas pueden ser seleccionadas de familia de citocinas tales como interferón (IFN), factor de necrosis tumoral (TNF), interleucinas (IL), IP-10, PF4, a GRO, 9E3, EMAP-II, factor de estimulación de colonia (CSF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), y factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF). En una modalidad muy preferida, las interleucinas pueden ser IL-1oc, I L- 1 , IL-12 o IL-18. En las modalidades anteriores, en donde los anticuerpos, con múltiples caracteres específicos capaces de reconocer una combinación de antígenos, se pueden obtener, dicha combinación de antígenos puede incluir dos o más de los productos de los genes de interés mencionados anteriormente. En la modalidad (29), el animal transgénico que no es un ser humano en todas las modalidades anteriores puede ser un ratón, rata, conejo, o cabra. El animal muy preferido del grupo anterior es un ratón. En la modalidad (30), la invención proporciona un método para tratar enfermedades en un paciente con la necesidad del mismo, administrando el anticuerpo monocjonai de (a modalidad 20 anterior al paciente. En la modalidad (31), la invención proporciona un método para diagnosticar enfermedades utilizando el anticuerpo monoclonal de la modalidad 20 para detectar el antígeno en una muestra del paciente. En la modalidad (32), la invención proporciona un método para detectar la presencia de enfermedades, administrando el anticuerpo monoclonal de la modalidad 20 a un paciente y formando imágenes de la unión del anticuerpo monoclonal a un antígeno particular asociado con la enfermedad. En la modalidad preferida (33), la invención proporciona un método para producir una molécula de unión capaz de unir el producto de gen de un gen de interés, en donde la molécula de unión es codificada por un ácido nucleico derivado de una colección de organismos, cada organismo representando en su superficie, una inmunoglobulina; y cada organismo conteniendo ácido nucleico con secuencia derivada de un animal transgénico que no es un ser humano de todas las modalidades anteriores, inmunizado con el antígeno de gen de interés y que no tiene moléculas de inmunoglobulina específicas para el antígeno de gen de interés encontrado en los sueros, y que codifica una cadena de polipéptido, que es parte de un componente de la inmunoglobulina presentada en la superficie de ese organismo; y seleccionar, uniendo con el producto de gen, una o más inmunoglobulinas con carácter específico de unión para el producto de gen. En la modalidad (34), la invención proporciona un método para clasificar patrones de unión de la ¡nmunoglobulina, utilizando representación diferencial con sistemas de fago, de levadura o virales. En otra modalidad (35), la invención proporciona un método para hacer una molécula de unión de la ¡nmunoglobulina, utilizando representación diferencial con sistemas de fago, levadura o viral. En la modalidad (36), la invención proporciona un método para sintetizar una colección de ADN capaz de codificar una familia de proteínas de unión realizando los siguientes pasos: (a) aislar el ADN que codifica un grupo diverso de proteínas de unión de antígeno a partir de una muestra de tejido del animal transgénico que no es un ser humano en todas las modalidades anteriores; (b) amplificar las secuencias de gen específicas utilizando iniciadores específicos para las regiones conservadas del ADN; (c) insertar el ADN amplificado al área de región variable de un vector de expresión de anticuerpo de marco que tiene una porción substancial del gen de cadena pesada de ¡nmunoglobulina; (d) expresar el vector del paso (c) con un vector que contiene un gen de cadena ligera de ¡nmunoglobulina y transfectar los vectores a una célula, con el fin de crear una colección de células que producen tanto inmunoglobulinas de cadena ligera como inmunoglobulinas de cadena pesada.

Las ventajas de los animales transgénicos anteriores y métodos incluyen la habilidad para generar moléculas de inmunoglobulina totalmente humanas específicas para un gen particular de interés. La presente invención además proporciona métodos para producir las moléculas de inmunoglobulina en los animales transgénicos que no son seres humanos y métodos para utilizar las moléculas. Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detalla y las reivindicaciones.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los seres humanos y los animales son naturalmente tolerantes a todas las proteínas propias o puras. Esta tolerancia ocurre ya que las células inmunes que reconocer proteínas propias o puras son eliminas durante el desarrollo. Además, los mecanismos de tolerancia periféricos se mantienen en células inmunes auto-reactivas en verificación. Esta tolerancia inmune a proteínas propias sirve para limitar el repertorio de anticuerpos de células B y T a proteínas altamente homologas en animales, de manera que los anticuerpos pueden ser desarrollados solamente contra regiones que no tienen identidad. Sin embargo, si los animales son deficientes en la proteína(s) de interés, no podrían desarrollar la tolerancia a la proteína y podrían ser capaces de montar una respuesta inmune a toda la proteína. Dichos animales, por lo tanto, pueden ofrecer un medio ideal para generar una respuesta inmune a la proteína de interés conduciendo a los anticuerpos monoclonales de alta afinidad efectivos para toda la proteína. Se pueden generar animales que carecen de proteína(s) específ ica(s) a través de tecnología de ruptura/eliminación de gen activado. El ratón es el animal preferido para el propósito anterior. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en la generación de animales transgénicos novedosos, que no son seres humanos, que contienen una alteración en un gen de interés, de manera que su producto no es producido. En una modalidad preferida, dichos animales carecerán de genes Ig endógenos y expresan transgenes Ig humanos. Estos animales transgénicos novedosos que no son seres humanos son capaces de, por ejemplo, generar anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanos, específicos para el producto de un gen de interés que ha sido funcionalmente interrumpido en el animal. El término "gen de interés" (GOI), como se utiliza aquí, se refiere a un gen endógeno en un animal que no es un ser humano. El GOI puede ser funcionalmente interrumpido, de manera que se evita la función normal del GOI. Los términos "funcionalmente interrumpido", alteración en un gen de interés", e "¡nactivado", como se utiliza aquí, se refieren a un gen que tiene una mutación que evita la función normal del gen, por ejemplo, evita la expresión de un gen de Ig normal y/o un gen de producto de interés, o evita la expresión de cantidades normales del gen de Ig y/o un gen de producto de interés. La mutación que causa la interrupción funcional puede ser una inserción, eliminación o mutación(es) de punto, que alteran la secuencia de aminoácido del GOl endógeno y/o el producto de gen de Ig endógeno codificado ahí. El término "substancialmente reducido o ausente" significa que se producen cantidades esencialmente no detectables del producto de GOl endógeno normal y/o el producto de gen de Ig endógeno en células del animal. Este tipo de mutación también se denomina en la técnica como una 'mutación nula" y un animal que lleva dicha mutación nula también es denominado como un "animal fuera de combate". El término "animal transgénico", como se utiliza aquí, se refiere a un animal que tiene células que contienen un transgen, en donde el transgen fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, una etapa embriónica. Un "transgen" es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo así la expresión de un producto de gen codificado en uno o más tipos o tejidos de célula del animal transgénico. En una modalidad preferida, los transgenes son genes de IgG humanos. El sistema inmune mamífero incluye linfocitos B que, en totalidad, expresan un repertorio de anticuerpos compuestos de cientos de miles de millones de diferentes específicos de anticuerpos. La "respuesta inmune" normal para un antígeno particular involucra la selección, a partir de este repertorio, de uno o más anticuerpos que específicamente unen el antígeno, y el éxito de una respuesta inmune se basa en, por lo menos en parte, la habilidad de estos anticuerpos para reconocer específicamente el antígeno estimulante e "ignorar" otras moléculas en el ambiente de los anticuerpos. Los términos "inmunoglobulina" y "anticuerpo", como se utiliza aquí, están destinados a referirse a moléculas de inmunoglobulina compuestas de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas a través de enlace de disulfuro. Como se utiliza aquí, el término "cadena pesada" es la región de un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena pesada (abreviado aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Como se utiliza aquí, el término "cadena ligera" es la región de un anticuerpo compuesto de una región variable de cadena ligera (abreviado aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL además pueden ser subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones de determinación de complementaridad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas como regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos a partir del término amino hacia el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4.

Un "anticuerpo monoclonal", como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo derivado de hibridoma (por ejemplo, un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado a través de tecnología de hibridoma, tal como la metodología de hibridoma estándar de Kohier y Milstein). El anticuerpo monoclonal puede ser específico para un solo antígeno o puede ser capaz de unir más de un antígeno. Un anticuerpo de carácter específico doble derivado de hibridoma de la invención aún se denomina como un anticuerpo monoclonal, aunque tiene carácter específico antigénico para más de un antígeno individual. El término "anticuerpo humano", como se utiliza aquí, se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponde a, se derivan de, secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal humanas como se describe por, por ejemplo, Kabat y otros, (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención, sin embargo, pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas a través de mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o a través de mutación somática in vivo), por ejemplo, en los CDRs, y en particular CDR3. Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención tienen regiones variables, y también pueden incluir regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humanas (ver, Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of ¡mmunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). En ciertas modalidades, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis ¡n vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de línea germinal humanas, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos recombinantes son el resultado de mutagénesis selectiva o mutación de regreso, o ambas. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie, y secuencias de región constante de otra especie, tal como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena ligera y pesada en murino enlazadas a regiones constantes humanas. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo que está substancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes caracteres específicos antigénicos (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente une un péptido o proteína expresado a través de un GOI, que está substancialmente Ubre de anticuerpos que específicamente unen antígenos distintos al producto de GOl). Un anticuerpo aislado que específicamente une un producto de GOl, sin embargo, puede tener reactividad cruzada para otros antígenos, tales como moléculas codificadas por GOl de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar substancialmente libre de otros materiales celulares y/o químicos. El término "inmunoglobulina funcional", como se utiliza aquí, se refiere a anticuerpos capaces de neutralizar el antígeno (por ejemplo, producto de GOl), actuando como un agonista o antagonista para el antígeno y cualquier otro cambio en el antígeno que modifique la función del antígeno. El término "célula", como se utiliza aquí, se refiere a la estructura más pequeña capaz de realizar en forma independiente, procedimientos de sostenimiento de vida, incluyendo procedimientos metabólicos, por ejemplo, desarrollo y reproducción. El término "célula", como se utiliza aquí, incluye una célula bacteriana, de levadura, fúngica, vegetal, o de animal. El término "célula recombinante", como se utiliza aquí, incluye una célula genéticamente modificada. La célula puede ser un microorganismo o una célula eucariótica superior. El término está destinado a incluir la progenie de la célula originalmente modificada. En modalidades preferidas, la célula es un cigoto o una célula del tallo embriónica. El término "célula germinal", como se utiliza aquí, incluye células de esperma haploides, células de huevo, y sus precursores. El término "células somática", como se utiliza aquí, incluye cualquier célula diploide en un organismo que no es una célula germinal. Un animal que no es un ser humano, preferido, se caracteriza por: 1) ser incapaz de expresar un gen endógeno de interés; 2) ser capaz de producir cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina xenogeneica para producir una inmunoglobulina xenogeneica o análogo de inmunoglobulina; 3) ser incapaz de producir cadena pesada de inmunoglobulina endógena; y 4) ser substancialmente incapaz de producir cadenas ligeras de inmunoglobulina endógena. De esta manera, el animal puede tener un sitio entero de inmunoglobulina endógena substituido por una porción de, o una totalidad de, sitio de inmunoglobulina xenogeneica, o puede tener un sitio de inmunoglobulina xenogeneica insertado en un cromosoma de la célula huésped y una región de inmunoglobulina endógeno inactiva. Estas varias alternativas serán logradas, por lo menos en parte, empleando recombinación homologa para la inactivación o reemplazo en los sitios de inmunoglobulina para las cadenas pesadas y ligeras.

I. Métodos para Generar Animales Transqénicos que no son Seres Humanos, que Contienen Genes de Interés Alterados La interrupción de un GOl endógeno y/o un alelo del gen Ig endógeno en una célula puede lograrse a través de recombinación homologa entre el alelo y un gen de GOl y/o gen de Ig endógeno, o porción del mismo, introducido en la célula. La célula puede ser de un tipo de célula diferenciada que normalmente expresa Ig, tal como una célula B, o una línea de célula de tipo célula B (es decir, líneas de célula con las propiedades de estos tipos de célula, incluyendo la expresión de Ig), o una célula que normalmente expresa el GOl. Alternativamente, la célula puede ser una célula progenitora pluripotente que puede desarrollarse en un animal, tal como una célula del tallo embriónica. Cuando la célula es una célula de tallo embriónica, la célula puede ser introducida en un blastocito, y el blastocito se deja desarrollar en un animal adoptivo para producir así un animal que tenga células somáticas y germinales, en donde un alelo del gen de GOl endógeno y/o un alelo del gen Ig endógeno es funcionalmente interrumpido. Dicho animal es denominado aquí como un animal "recombinante homólogo". Un animal recombinante homólogo preferido de la invención es un ratón. Para crear una célula o animal recombinante homólogo, se prepara un vector de activación, el cual contiene ADN que codifica un gen de GOl y/o un gen de Ig, o una porción del mismo, teniendo una mutación introducida en el mismo. Un vector de activación preferido para crear una mutación nula en un GOl endógeno y/o un gen Ig endógeno incluye el ADN que codifica COI y/o el ADN que codifica Ig en donde ha sido insertado ADN que codifica a un gen que no es GOl y/o el ADN que codifica a un gen que no es Ig. Por ejemplo, en una modalidad, el vector de activación de la invención para interrumpir funcionalmente un gen GOl endógeno y/o un gen de lg endógeno en una célula, comprende: a) una porción de reemplazo no homologa; b) una primera región de homología localizada corriente arriba de la porción de reemplazo no homologa, la primera región de homología teniendo una secuencia de nucleótido con una identidad substancial a una primera secuencia de GOl y/o del gen Ig; y c) una segunda región de homología localizada corriente debajo de la porción de reemplazo no homologa, la segunda región de homología teniendo una secuencia de nucleótido con una identidad substancial a una segunda secuencia de GOl y/o gen lg, la segunda secuencia de GOl y/o del gen de Ig, teniendo una ubicación corriente debajo de la primera secuencia de GOl y/o gen de Ig en un GOl endógeno y/o gen de lg endógeno de existencia natural. De esta manera, la porción de reemplazo no homologa está flanqueada en 5' y 3' a través de secuencias de nucleótido con identidad substancial a las secuencias de GOl y/o del gen lg. Una secuencia de nucleótido con una "identidad substancial" para una secuencia de GOl y/o un gen de lg está destinada a describir una secuencia de nucleótido que tiene homología suficiente para una secuencia de GOl y/o un gen de lg para permitir la recombinación homologa entre la secuencia de nucleótido y una secuencia de GOl endógeno y/o un gen de lg endógeno en una célula huésped. Típicamente, las secuencias de nucleótido de las regiones de homología de flanqueo son por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 90%, preferiblemente por lo menos 95%, y muy preferiblemente 100% idénticas a las secuencias de nucleótido del GOI endógeno y/o gen de Ig endógeno que será activado para la recombinación homologa. Muy preferiblemente, las regiones de homología de flanqueo son isogénicas con el alelo endógeno activo (por ejemplo, el ADN de las regiones de flanqueo es aislado de células del mismo antecedente genético como la célula en donde se va a introducir la construcción de activación). Además, las regiones de homología de flanqueo del vector de activación son de una longitud suficiente para la recombinación homologa entre el vector de activación y un GOI endógeno y/o un gen Ig endógeno en una célula huésped, cuando el vector es introducido en la célula huésped. Típicamente, las regiones de homología de flanqueo son por lo menos de una kilobase de longitud, y muy preferiblemente por lo menos de varias kilobases en longitud. Un vector de activación tiene un cásete de expresión de selección positiva como la porción de reemplazo no homologa. El término "cásete de expresión de selección positiva" se refiere a secuencias de nucleótido que codifican un marcador de selección positivo operativamente enlazado a elementos reguladores que controlan la expresión del marcador de selección positivo (por ejemplo, secuencias de promotor y de poliadenilación). Un "marcador de selección positivo" permite la selección de células que contienen el marcador, mientras que las células que no contienen y expresan el marcador, son seleccionadas en contra (por ejemplo, son asesinadas por el agente de selección). Por ejemplo, un cásete de expresión de selección positiva preferido incluye un gen de fosfotransferasa de neomicina ("neo") operativamente enlazado a un promotor y a una señal de poliadenilación. Las células que llevan y expresan el gen neo exhiben resistencia al agente de selección G418. Además del cásete de expresión de selección positiva, un vector de activación de la invención típicamente también incluye un cásete de expresión de selección negativa ubicado lejos de las regiones de homología ya sea corriente arriba o corriente abajo (es decir, las regiones substancialmente idénticas a las secuencias que codifican Ig). Un "cásete de expresión de selección negativa" se refiere a secuencias de nucleótido que codifican un marcador de selección negativo operativamente enlazado a elementos reguiadores que controlan la expresión del marcador de selección negativo. Un "marcador de selección negativo" permite la selección contra células que llevan el marcador, por ejemplo, células que contienen y expresan el marcador son asesinadas por un agente de selección, mientras que las células que no contienen y expresan el marcador de selección negativo sobreviven. Por ejemplo, un cásete de expresión de selección negativo preferido incluye un gen de cinasa de timidina del virus de herpes simples ("tk") operativamente enlazado a un promotor y a una señal de poliadenilación. Las células que contienen y expresan el gen tk pueden ser asesinadas, por ejemplo, a través del agente de selección, ganciclovir. Esta configuración del vector de activación permite el uso de la técnica de selección "positiva/negativa" para seleccionar recombinantes homólogos: células en donde el vector de activación ha sido introducido, se seleccionan, que contienen y expresan el marcador de selección positiva pero, las cuales han perdido el marcador de selección negativa. Por consiguiente, estas células llevan el ADN de porción de reemplazo no homólogo (por ejemplo, el gen neo insertado). Pero han periodo el ADN que codifica al marcador de selección negativo ubicado lejos de éste en el vector de activación, probablemente como resultado de la recombinación homologa entre el vector de activación y el gen de Ig endógeno. En una modalidad preferida, el vector de activación incluye regiones de homología de flanqueo que tienen una identidad substancial a un GOl de ratón y/o secuencias de gen de Ig de ratón (mlg) para activar así un GOl de ratón endógeno y/o un gen de Ig de ratón endógeno en una célula huésped de ratón (por ejemplo, una célula del tallo embriónica de murino) para recombinación homologa. El ADN genómico de GOl de murino y/o Ig de murino, utilizado como las regiones de homología de flanqueo del vector de activación, puede ser aislado de una colección de ADN genómico de murino seleccionando la colección con una sonda de ADNc abarcando todo o parte del ADNc del GOl de murino y/o el ADNc de Ig de murino, utilizando técnicas estándares. De preferencia, se prepara una colección de ADN genómico clasificada a partir de células isogénicas con la célula que va a ser transfectada con el vector de activación. Por ejemplo, una colección genómica de la cepa de ratón 129/Sv (disponible comercialmente de Stratagene) puede ser clasificada para aislar el ADN genómico de Ig de ratón para utilizarse en un vector de activación para transfección a la línea de célula del tallo embriónica D3 derivada de la cepa 129/Sv. La secuencia de nucleótido del ADNc de Ig de ratón y la secuencia de aminoácido pronosticada de la proteína de Ig de ratón se describen por Nett y otros (1992) J. Immunol. 149:3254-3259. La estructura completa secuencia de nucleótido del gen de Ig de murino se describen en Cassano, F. J. y otros (1994) Genomics 20:474-481. Para interrumpir funcionalmente un alelo de GOl endógeno y/o de un gen de Ig endógeno de una célula huésped, un vector de activación de la invención es introducido en la célula huésped, por ejemplo, una célula diferenciada que normalmente expresa el GOl y/o la Ig, o una célula del tallo embriónica, y se seleccionan recombinantes homólogos. Un vector de activación puede ser introducido en una célula huésped a través de cualquiera de las varias técnicas conocidas en el campo adecuadas para la introducción de ADN exógeno (por ejemplo, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrana, microinyección, lipofección, y similares), pero muy probablemente es introducido a la célula huésped a través de electroporación. Después de la introducción del vector en la célula huésped, la célula es cultivada durante un periodo de tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la recombinación homologa entre el vector de activación introducido y un GOI endógeno y/o un gen de Ig endógeno. Las células huésped son seleccionadas (por ejemplo, a través de las técnicas de selección positiva/negativa descritas anteriormente) y clasificadas para recombinación homologa en el sitio de GOI endógeno y/o el gen de Ig endógeno a través de técnicas estándares (por ejemplo, hibridaciones Southern utilizando una sonda que distingue el alelo endógeno normal del alelo recombinante homólogo). Para crear un homocigoto de célula (por ejemplo, macrófago o un monocito) para la interrupción de GOI y/o el gen de Ig, se puede utilizar el método de escalación G418 de ortensen, R. N. y otros, ((1992) Mol. Cell. Biol. 12:2391-2395) en las células heterocigotas. Alternativamente, el primer alelo de una célula huésped de tipo silvestre puede ser interrumpido a través de un primer evento de recombinación homologa que se selecciona con un marcador (por ejemplo, resistencia G418) y después el segundo alelo de las células heterocigotas puede ser interrumpido por un segundo evento de recombinación homologa que se selecciona con un marcador diferente (por ejemplo, resistencia a higromicina) (ver, por ejemplo, TeRiele, H. (1990) Nature 348:649-651). Para crear un animal recombinante homólogo de la invención, se introduce una célula del tallo embriónica que tiene una funcionalidad de alelo de GOI y/o gen de Ig funcionalmente Interrumpido, a un blastocito, el blastocito se implanta en una madre adoptiva pseudoembarazada, y el embrión se deja desarrollar a término. El animal resultante es una quimera que tiene células descendientes de la célula del tallo embriónica. Los animales quiméricos en donde la célula del tallo embriónica ha contribuido a células germinales del animal, pueden ser apareados con animales de tipo silvestre para producir así animales heterocigotos para la interrupción de GOI y/o el gen de Ig en células somáticas y germinales. Los animales heterocigotos pueden ser después apareados para crear animales homocigotos para la interrupción del gen Ig (es decir, que tienen alelos de gen tanto de GOI como de y/o de gen Ig f uncionalmente interrumpidos). Estos animales recombinantes homólogos mencionados anteriormente pueden ser utilizados como animales de control o de prueba para ensayos de clasificación in vivo (descritos con detalle más adelante). Además, las células del animal homocigoto para la interrupción de GOI y/o en el gen de Ig pueden ser aisladas de los animales y cultivadas para utilizarse en ensayos de clasificación in vitro. Por ejemplo, los macrófagos de exudado peritoneal (por ejemplo, producidos por tioglicolato) los cuales normalmente expresan Ig, pueden ser aislados de los animales a través de técnicas estándares. Además, se pueden preparar líneas de células inmortalizada a partir de células del animal, utilizando técnicas estándares para inmortalización de célula, por ejemplo, a través de transfección de las células con un vector de expresión que codifica un antígeno T myc, ras o SV40.

Para descripciones adicionales de vectores de activación y metodologías de recombinación homologa, ver también, por ejemplo, Thomas, K. R., y otros (1986) Cell 44:419-428; Thomas, K. R., y otros (1987) Cell 51:503-512; Thomas, K. R., y otros (1992) Mol. Cell. 12:2919-2923; Deng, C. y Capecchi, M. R. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3365-3371; Hasty, P., y otros (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2474; Li, E., y otros (1992) Cell 69:915; Zhang, H. , y otros (1994) Mol. Cell. Biol. 14:2404-2410; Bradley, A. In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987 pág. 113-152; publicación Internacional de PCT No. WO 90/11354; publicación Internacional de PCT No. WO 91/01140; publicación Internacional de PCT No. WO 91/19796; publicación Internacional de PCT No. WO 92/20808; y publicación Internacional de PCT No. WO 93/04169. Alternativamente, los núcleos de células somáticas que son heterocigotas u homocigotas para la interrupción de GOl y/o el gen de lg, pueden ser introducidos en huevos no fertilizados sin núcleo y subsecuentemente implantados en madres adoptivas pseudoembarazadas para generar animales recombinantes homólogos, ver también, por ejemplo, Wilmut, I., y otros (1997) Nature 385 (6619):810-813; Kato, Y., y otros (1998) Science 282 (5396):2095-2098; Wakayama, T., y otros (1998) Nature 394 (6691):369-374; McCreath, K. J., y otros (2000) Nature 405 (6790):1066-1069; Wakayama, T., y otros (2001 ) Mol. Reprod. Dev. 58 (4):376-383. Ambas copias de un gen lg pueden ser funcionalmente interrumpidas de acuerdo con los métodos descritos en la publicación Internacional de PCT No. WO 93/16177. Además, se puede utilizar una recombinasa para interrumpir funcionalmente un GOI y/o un gen de Ig a través de recombinación homologa, como se describe en la publicación internacional de PCT, WO 93/22443. Además de permitir la introducción de una mutación nula en un alelo de gen (por ejemplo, un alelo de lg y/o de GOI), se pueden utilizar técnicas similares para introducir inserciones, mutaciones de punto o eliminaciones en un alelo de gen (por ejemplo, un alelo de lg y/o de GOI). Las mutaciones de punto o eliminación pueden ser introducidas en un alelo de gen, por ejemplo, a través del procedimiento de recombinación homologa de "golpear y correr" (como se describe por Valancius, V., y Smithies, O. (1991) Mol. Cell. Biol. 11:1402-1408; y Hasty, P., y otros (1991) Nature 350-243-246) o a través del procedimiento de recombinación homologa de doble reemplazo como se describe en Wu, H., y otros (1994) Proc. Nati. Acad. Se/. USA 91:2819-2823). Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona células recombinantes homologas y animales (por ejemplo, células humanas o animales que no son seres humanos) que expresan un producto alterado del gen lg y/o del GOI. Para crear un animal transgénico, un ácido nucleico de la invención que codifica una proteína de fusión transactivadora, como se describió anteriormente, puede ser incorporado en un vector de expresión recombinante en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped. El término "en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula huésped" representa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras operativamente enlazadas al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en una forma que permite la transcripción del ácido nucleico al ARNm y la traducción del ARNm a la proteína de fusión. El término "secuencia reguladora" se reconoce en la técnica y está destinada a incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras conocidas por aquellos expertos en la técnica se describen por Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods ¡n Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se debe entender que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que será transfectada y/o la cantidad de proteína de fusión que será expresada. Cuando se utiliza en células de mamífero, por lo regular se proporcionan funciones de control del vector de expresión recombinante por el material genético viral. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovírus y virus 40 de simio. El uso de elementos reguladores virales para dirigir la expresión de la proteína de fusión puede permitir la expresión constitutiva de alto nivel de la proteína de fusión en una variedad de células huésped. En un vector de expresión recombinante preferido, las secuencias que codifican la proteína de fusión son flanqueadas corriente arriba (es decir, 5') a través del promotor de IE de citomegalovírus humano y corriente abajo (es decir, 3'} a través de una señal poli(A) de SV40. Por ejemplo, se puede utilizar un vector de expresión similar a aquel descrito en el Ejemplo 1. El promotor IE de citomegalovirus humano se describe por Boshart y otros (1985) Cell 41:521-530. Otros promotores de expresión ubicua que pueden ser utilizados incluyen el promotor HSV-Tk (descrito por McKnight y otros (1984) Cell 37:253-262) y promotores ß-actina (por ejemplo, el promotor de ß-actina humana como se describe por Ng y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:2720-2732). Alternativamente, las secuencias reguladoras dei vector de expresión recombinante pueden dirigir la expresión de la proteína de fusión preferencialmente en un tipo de célula particular, es decir, se pueden utilizar elementos reguladores específicos en tejidos. Ejemplos no limitantes de promotores específicos en tejido que se pueden utilizar incluyen el promotor de albúmina (específica en hígado; Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos linfoides (Caíame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de célula T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y otros (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neurona (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byne and Ruddle (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund y otros (1985) Science 230:921-916), y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente de E. U. A. No. 4,873,316 y publicación de solicitud Europea No. 264,166). También se abarcan promotores desarrollalmente regulados, por ejemplo, los promotores hox de murino (Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor a-cetoproteína (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546). Alternativamente, se puede crear una construcción de autorregulación que codifica una proteína de fusión transactivadora. Para lograr esto el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión está operativamente enlazado a una secuencia de promotor mínima y por lo menos una secuencia de operador de tet. Cuando este ácido nucleico es introducido en una célula (por ejemplo, en un vector de expresión recombinante), probablemente puede ocurrir una cantidad pequeña de transcripción basal del gen transactivador debido a la "falta de ajuste". En presencia de tetraciclina, Te (o análogo de la misma), esta pequeña cantidad de proteína de fusión transactivadora se unirá a la secuencia(s) del operador tet corriente arriba de la secuencia de nucleotido que codifica al transactivador y estimula la transcripción adicional de la secuencia de nucleotido que codifica al transactivador, conduciendo así a una producción adicional de la proteína de fusión transactivadora en la célula. Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que dicho promotor de auto-regulación también puede ser utilizado junto con otros transactivadores regulados con tetraciclina, tal como la proteína de fusión represora Tet de tipo silvestre (tTA) descrita por Gossen, M.

And Bujard, H. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, que se une a los operadores tet en ausencia de Te (como se ilustra en la Figura 9A). Cuando se utiliza junto con este transactivador, la transcripción autorregulada de la secuencia de nucleótido que codifica este transactivador es estimulada en ausencia de Te. El plásmido pUHD15-3, el cual comprende secuencias de nucleótido que codifican la tTA descrita por Gossen and Bujard (1992), citada anteriormente, operativamente enlazada a un promotor de auto-regulación, ha sido depositado el 8 de julio de 1994 bajo las provisiones del tratado de Budapest en Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zell Kulturen GMBH (DSM) en Braunschweig, Alemania y se le asignó el número de depósito DSM 9280. En una modalidad, el vector de expresión recombinante de la invención es un plásmido. Alternativamente, un vector de expresión recombinante de la invención puede ser un virus, o porción del mismo, que permite la expresión de un ácido nucleico introducido en el ácido nucleico viral. Por ejemplo, se pueden utilizar retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus asociados con adeno. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con dichos virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., y otros (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14, y otros manuales de laboratorio estándares. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM, los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ejemplos de líneas de virus de empaque adecuadas incluyen ??p?, ?2 y ???t?. El genoma de adenovirus puede ser manipulado de manera que codifica y expresa un proteína de fusión transactivadora pero se inactiva en términos de su habilidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Ver, por ejemplo, Berkner y otros (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld y otros (1991) Science 252:431-434; y Rosenfield y otros (1992) Cell 68:143-155. Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d!324 u otras cepas de adenovirus, por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Alternativamente, el vector del virus asociado con adeno, tal como aquel descrito en Tratschin y otros (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, puede ser utilizado para expresar una proteína de fusión transactivadora. El ácido nucleico que codifica proteínas de fusión puede ser introducido a una célula huésped a través de técnicas estándares para transfectar células eucarióticas. El término "transfectar", o "transfección" abarca todas las técnicas convencionales para introducir ácidos nucleicos en células huésped, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrana, lipofección, electroporación y microinyección. Los métodos adecuados para transfectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2o. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio. El número de células huésped transformadas con un ácido nucleico de la invención dependerá, por lo menos en parte, del tipo de vector de expresión recombinante utilizado y el tipo de técnica de transfección utilizada. El ácido nucleico puede ser introducido a una célula huésped en forma pasajera, o más típicamente, durante una regulación de expresión de gen a largo plazo, el ácido nucleico está establemente integrado al genoma de la célula huésped o permanece como un episoma estable en la célula huésped. Los vectores de plásmido introducidos a células de mamífero típicamente están integrados en el ADN de la célula huésped solamente a una baja frecuencia. Con el fin de identificar estos integrantes, un gen que contiene un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a fármacos) generalmente es introducido en las células huésped junto con el ácido nucleico de interés. Los marcadores seleccionabas preferidos incluyen aquellos que confieran resistencia a ciertos fármacos, tales como G418 e higromicina. Se pueden introducir marcadores seleccionables en un plásmido separado del ácido nucleico de interés o, se introducen en el mismo plásmido. Las células huésped transfectadas con un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, un vector de expresión recombinante) y un gen para un marcador seleccionable pueden ser identificadas seleccionando células utilizando el marcador seleccionable. Por ejemplo, si el marcador seleccionable codifica un gen confiere resistencia a neomicina, las células huésped que han absorbido el ácido nucleico pueden ser seleccionadas con G418. Las células que tienen incorporado al gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán. Una célula huésped transfectada con un ácido nucleico que codifica una proteína, de fusión de la invención además puede ser transfectada con uno o más ácidos nucleicos que sirven como el objetivo para la proteína de fusión. El ácido nucleico objetivo comprende una secuencia de nucleótido que será transcrita operativamente enlazada a por lo menos una secuencia del operador tet. El ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la invención puede ser introducido en células eucarióticas que crecen el cultivo in vitro a través de técnicas de transfección convencionales (por ejemplo, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrana, electroporación, etc.). El ácido nucleico también puede ser transfectado a células in vivo, por ejemplo, a través de la aplicación de un mecanismo de suministro adecuado para la introducción del ácido nucleico a células in vivo, tales como vectores retrovirales (ver, por ejemplo, Ferry, N y otros (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8377.8381; y Kay, M. A. Y otros (1992) Human Gene Therapy 3:641-647), vectores adenovirales (ver, por ejemplo, Rosenfeld, M. A. (1992) Cell 68:143-155; y Herz, J. y Gerard, R. D. (1993) Proc. Nati. Acad. USA 90:2812-2816), absorción ADN mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu, G. y Wu, C. H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson y otros (1992) J. Biol. Chem. 267:967; y patente de E. U. A. No. 5,166,320), inyección directa de ADN (ver, por ejemplo, Acsadi y otros (1991) Nature 332:815-818; y Woif y otros (1990) Science 247:1465-1468) o bombardeo de partículas (ver, por ejemplo, Cheng, L., y otros (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:4455-4459; y Zelenin, A. V., y otros (1993) FEBS Letters 315:29-32). De esta manera, para propósitos de terapia de gen, las células pueden ser modificadas ¡n vitro y administradas a un sujeto o, alternativamente, las células pueden ser directamente modificadas in vivo. La proteína de fusión transactivadora de ácido nucleico puede ser transfectada a un oocito fertilizado de un animal que no es un ser humano para crear un animal transgénico, el cual expresa la proteína de fusión de la invención en uno o más tipos de células. En una modalidad, el animal no ser humano es un ratón, aunque la invención no está limitada al mismo. En otras modalidades, el animal transgénico es una cabra, oveja, cerdo, vaca, u otro animal de granja doméstico. Dichos animales transgénicos son útiles para la producción a gran escala de proteínas (la así llamada "farmacia de gen"). En otra modalidad más, el animal transgénico es un primate que no es un ser humano. Un animal transgénico puede ser creado, por ejemplo, introduciendo un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión (típicamente enlazada a elementos reguladores apropiados, tales como un mejorador constitutivo o de tejido específico) en los pronúcleos macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, a través de microinyección, y permitir que el oocito se desarrolle en un animal adoptivo hembra pseudo-embarazada. También se pueden incluir secuencias intrónicas y señales de poliadenilación en el transgen para incrementar la eficiencia de la expresión del transgen. Los métodos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen en, por ejemplo, patentes de E. U. A. Nos. 4,736,866 y 4,870,009, y en Hogan, B., y otros, (1986) A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory. Se puede utilizar un animal fundador transgénico para criar animales adicionales que llevan el transgen. Los animales transgénicos que llevan un transgen que codifica la proteína de infusión de la invención además pueden ser criados para otros animales transgénicos que llevan otros transgenes, por ejemplo, a un animal transgénico que contiene un gen operativamente enlazado a una secuencia de operador de tet. Se apreciará que, además de los animales transgénicos, el sistema regulador aquí descrito puede ser aplicado a otros organismos transgénicos, tales como plantas transgénicas. Se pueden hacer plantas transgénicas a través de técnicas convencionales conocidas en el campo. Por consiguiente, la invención abarca organismo transgénicos que no son seres humanos, incluyendo animales y plantas, que contienen células que expresan la proteína de fusión transactivadora de la invención (es decir, un ácido nucleico que codifica al transactivador se incorpora en uno o más cromosomas en las células del organismo transgénico). Los aspectos y características de los animales de la invención, y células derivadas de los mismos, los hacen útiles para una amplia variedad de aplicaciones, como se describe con detalle en las sub-secciones que siguen.

II. Uso de Animales Transgénicos que no son Seres Humanos para Hacer Anticuerpos La invención proporciona anticuerpos, así como sus porciones de anticuerpo, que unen el producto de un análogo humano de un GOI, por ejemplo, un péptido o proteína de hGOI. Preferiblemente, los anticuerpos, o porciones de los mismos, son anticuerpos aislados. Preferiblemente, los anticuerpos o sus porciones, son anticuerpos neutralizantes. En una modalidad, los anticuerpos o sus porciones, son mAbs. En una modalidad preferida, los mAbs, o sus porciones, contienen cadenas pesadas y ligeras humanas. En una modalidad aún muy preferida, los mAbs o sus porciones, contienen cadenas pesadas y ligeras humanas. En una modalidad preferida, el animal transgénico que no es un ser humano de la invención es inmunizado con el antígeno después de tratamiento con irradiación de cuerpo total letal, seguido por radio protección con células de médula ósea de un ratón con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), seguido por injerto con linfocitos humanos funcionales. Este tipo de quimera, denominado como el sistema de Trímera, ha sido utilizado para producir anticuerpos monoclonales humanos a través de la inmunización de los ratones con un antígeno de interés seguido por la preparación de anticuerpos monoclonales utilizando tecnología de hibridoma estándar. Para descripción adicional de estos ratones y su uso en generación de anticuerpos, ver, por ejemplo, Eren, R., y otros (1998) Immunology 93:154-161; Reisner, Y y Dagan, S. (1998) Treds Biotechnol. 16:242-246; lian, E. y otros (1999) Hepatology 29:553-562; y Bocher, W. O., y otros (1999) Immunology 96:634-641. Las células B de un huésped transgénico que produce moléculas de inmunoglobulina o análogos de molécula de inmunoglobulina pueden ser utilizadas para preparar anticuerpos monoclonales a través de técnicas estándares, tales como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (ver también, Brown y otros (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown y otros (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh y otros (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh y otros (1982) Int. J. Cáncer 29:269-75). La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal es bien conocida (ver en general, R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biológica! Analices, Plenum Publishing Corp., New York, New (1980); E. A. Lerner (1981) Ya/e J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter y otros (1977) Somatic Cell Genetic, 3:231-36). En resumen, una línea de célula inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona a linfocitos (típicamente en esplenocitos o células de nodo linfático o linfocitos de sangre periférica) de un mamífero inmunizado con un inmunogeno específico como se describe más adelante, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes son clasificados para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal con carácter específico para el producto del gen de interés. Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas pueden ser aplicados con el propósito de generar anticuerpos monoclonales de carácter específico doble (ver, por ejemplo, G. Galfre y otros, (1977) Nature 266:550-52; Gefter y otros, Somatic Ce// Genet., citada anteriormente; Lerner, Yale J. Biol. Med., citada anteriormente; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citada anteriormente). Además, los expertos en la técnica ordinarios apreciarán que existen muchas variaciones de dichos métodos, las cuales también podrían ser útiles. Típicamente, la línea de célula inmortal (por ejemplo, una línea de célula de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero como los linfocitos. Por ejemplo, se pueden hacer hibridomas de murino fusionando linfocitos de un mamífero inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de célula de ratón inmortalizado. Las líneas de células inmortales preferidas son líneas de célula de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio de HAT"). Cualquiera de un número de líneas de célula de mieloma se puede utilizar como un patrón de fusión de acuerdo con las técnicas estándares, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1 -Ag4-1 , P3-x63-Ag8.653 o Sp2/0-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la colección de American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, d. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT son fusionadas a esplenocitos de ratón utilizando glicol polietiiénico ("PEG"). Después, se seleccionan células de hibridoma que resultan de la fusión, utilizando el medio HAT, el cual asesina células de mieloma no fusionadas y fusionadas y no productivamente (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días ya que no son transformados). Las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales que específicamente reconocen el producto del gen de interés son identificadas clasificando los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para dichos anticuerpos, por ejemplo, utilizando un ensayo estándar de ELISA, para seleccionar aquellos anticuerpos que específicamente pueden unirse al producto de gen. Estas células inmortalizadas después pueden ser desarrolladas en un cultivo continuo o ser introducidas en el peritoneo de un huésped compatible para la producción de ascitos. La presente invención proporciona la producción de antisueros humanos policlonales o anticuerpos monoclonales humanos o análogos de anticuerpo. Un aspecto in vivo estándar para preparar anticuerpos es inmunizar un animal apropiado sometido con un antígeno para exponer así el repertorio de anticuerpo in vivo para ei antígeno, seguido por la recuperación de un anticuerpo o anticuerpos de interés del animal. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, un antígeno químicamente sintetizado o recombinantemente expresado. La preparación además puede incluir un auxiliar, tal como un auxiliar completo o incompleto de Freund, o compuesto inmunoestímulante similar. Además, cuando se utiliza para desarrollar anticuerpos, en particular a través de inmunización in vivo, el antígeno se utiliza solo, o muy preferiblemente se utiliza como un conjugado como una proteína portadora. Dicho aspecto para mejorar las respuestas del anticuerpo es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de proteínas portadoras adecuadas a las cuales se pueden conjugar un antígeno de carácter específico doble, incluyen hemocianina de lapa de ojo de cerradura ( LH) y albúmina. Cuando el huésped mamífero ha sido inmunizado con un inmunógeno, los anticuerpos humanos resultantes pueden ser aislados de las otras proteínas utilizando una columna de afinidad, teniendo una porción de unión Fe, tal como proteína A, o similares. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos de carácter específico doble. El término "anticuerpo de carácter específico doble", como se utiliza aquí, está destinado a incluir anticuerpos que específicamente reconocen aún más de dos diferentes antígenos, pero relacionados, tales como anticuerpos que reconocen tres, cuatro, cinco o más antígenos estructuralmente relacionados, pero distintos. Además, el término "antígenos diferentes, pero estructuralmente relacionados" pretende incluir antígenos (por ejemplo, proteínas) cuyas estructuras totales están relacionadas también como antígenos (por ejemplo, proteínas), que comparten una o más regiones estructuralmente relacionadas pero que de otra manera no están relacionadas. De esta manera, antígenos "diferentes pero estructuralmente relacionados" pueden ser, por ejemplo, dos proteínas que son miembros de la misma familia de proteína que tiene una estructura total común o pueden ser, por ejemplo, dos proteínas cuya estructura total es diferente (no relacionada), pero cada una contiene un dominio estructuralmente relacionado. Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocítos y líneas de células inmortalizadas puede ser aplicado con el propósito de generar anticuerpos monoclonales de carácter específico doble (ver, por ejemplo, patente de E. U. A. No. 5,939,598, solicitud de PCT No. WO 96/33735, publicación de PCT No. WO 96/34096, publicación de PCT No. WO 98/24893 y publicación de PCT No. WO 99/53049 de Abgenix Inc., y patentes de E. U. A. Nos. 5,897,861; 6,071,517; y 6,096,311 de edarex, Inc. Ver también Galfre y otros (1977) Nature 266:550-52; Gefter y otros, Somatic Ce// Genet, citadas anteriormente; Lerner, Ya/e J. Biol. Med., citadas anteriormente; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citadas anteriormente). El término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se utiliza aquí, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un análogo humano de un producto de GOI (por ejemplo, un péptido o proteína de hGOl)). Se ha mostrado que la función de unión de antígeno de un anticuerpo puede realizarse a través de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento divalente que comprende dos fragmentos de Fab enlazados a través de un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (¡v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementaridad aislada (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, éstos pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazados sintético que permiten que se hagan como una cadena individual en donde el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como la cadena individual Fv (scFv); ver, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242:423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena individual también están destinados a quedar abarcados dentro del término de "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpo de cadena individual, tales como los diacuerpos también se abarcan. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, diespecíficos en donde los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptido individual, pero utilizan un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a formarse en pares con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., y otros (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y otros (1994) Structure 2:1121-1123). Aún más, un anticuerpo o su porción de unión de antígeno puede ser parte de una molécula de ¡nmunoadhesión más grande, formada a través de asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con uno o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de dichas moléculas de ¡nmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para hacer una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S. M., y otros (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de sisteína, un péptido marcador y una etiqueta de pollhistidina C-terminal para hacer moléculas de scFv bivalentes y biotilinadas (Kipriyanov, S. . , y otros (1994) Mol. Immunol. 31:1047- 058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden ser preparadas a partir de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, tales como digestión de papaina o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Además, se pueden obtener anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de ¡nmunoadhesión utilizando técnicas de ADN recombinante estándares, como se describe aquí. Un "anticuerpo neutralizanre", como se utiliza aquí, (o un "anticuerpo que neutraliza una actividad del producto hGOl"), se refiere a un anticuerpo cuya unión a un producto de hGOl da como resultado la inhibición de la actividad biológica de un producto hGOl. Esta inhibición de la actividad biológica de un producto hGOl puede ser analizada midiendo uno o más indicadores de una actividad biológica del producto hGOl. Estos indicadores de una actividad biológica de un producto hGOl puede ser analizada a través de uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo estándares conocidos en la técnica. Un "anticuerpo de carácter específico doble aislado" como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo de carácter específico doble que está substancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes caracteres específicos antigénicos (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente une dos antígenos diferentes, pero estructuralmente relacionados, o regiones estructuralmente relacionadas de otra manera antígenos no relacionados, pero que está substancialmente libre de anticuerpos que específicamente se unen a otros antígenos no relacionados). Además, un anticuerpo de carácter específico doble aislado puede estar substancialmente libre de otro material celular y/o químicos. La frase "anticuerpo recombinante" se refiere a anticuerpos que se preparan, expresa, crea o aislan a través de medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula huésped, anticuerpos aislados de una colección de anticuerpo de combinación, recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón), que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados a través de cualquier otro medio que involucra dividir las secuencias de gen de inmunoglobulina particulares (tales como secuencias de gen de inmunoglobulina humana) a otras secuencias de ADN. Ejemplos de anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos, injertados con CDR, y humanizados. En otra modalidad, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, que une un epítopo de un producto de hGOI. De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y/o humano. El término "resonancia de plasmón de superficie", como se utiliza aquí, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real a través de la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, utilizando un sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, ver Jónsson, U., y otros (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Johnsson, U., y otros (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., y otros (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. El término como se utiliza aquí, se refiere a la constante de velocidad apagada para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno. El término "Kd", como se utiliza aquí, se refiere a la constante de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. En otras modalidades, el anticuerpo aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, se une a un epítopo de un producto de hGOl, en donde el anticuerpo, o su porción de unión de antígeno, se disocia de un producto de hGOl con una constante de velocidad de apagado de 0.1s"1 o menos, según determinado a través de resonancia de plasmón de superficie, o que inhibe la actividad de un producto de hGOl con una 1C50 de 1 x 10"6M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o su porción de unión de antígeno, se puede disociar de un producto de hGOl con una constante de velocidad Kapaggd0 de 1 x 10"2s"1 o menos, según determinado a través de resonacia de plasmón de superficie, o puede inhibir una actividad de hGOl con una IC50 de 1 x 10"7M o menos. Alternativamente, el anticuerpo o su porción de unión de antígeno, puede disociarse de un hGOl con una constante de velocidad Kapagad0 de 1 x 10"3s"1 o menos, según determinado a través de resonancia de plasmón de superficie, o puede inhibir la actividad de producto de un hGOl con una IC50 de 1 x 10"8M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o su porción de unión de antígeno, puede disociarse de un producto hGOl con una constante de velocidad Kapagad0 de 1 x 10"4s" 1 o menos, según determinado a través de resonancia de plasmón de superficie, o puede inhibir la actividad de un hGOl con una IC50 de 1 x 10"9M o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o su porción de unión de antígeno, puede disociarse de un producto hGOl con una constante de velocidad Kapagad9 de 1 x 10"5s"1 o menos, según determinado a través de resonancia de plasmón de superficie, o puede inhibir una actividad de producto de hGOl con una IC50 de 1 x 10"10 o menos. Alternativamente, el anticuerpo, o su porción de unión de antígeno, puede disociarse de un producto hGOl con una constante de velocidad Kapagado de 1 x 10~6s"1 o menos, según determinado a través de resonancia de plasmón de superficie, o puede inhibir un análogo humano de un análogo humano de la actividad de un producto hGOl con una IC50 de 1 x 10"11M o menos.

Usos Terapéuticos Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención preferiblemente son capaces de neutralizar la actividad de un producto de hGOl tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, dichos anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para inhibir la actividad de un producto hGOl, por ejemplo, en un cultivo de célula que contiene un producto hGOl, en seres humanos o en otros mamíferos que tienen un producto de hGOl con el cual un anticuerpo de la invención reacciona en forma cruzada. En una modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de un producto de hGOl, que comprende poner en contacto un producto de hGOl con un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención, de manera que se inhibe la actividad de un producto hGOl. Por ejemplo, en un cultivo de célula que contiene, o que tiene sospecha de contener un producto de hGOl, se puede agregar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención al medio de cultivo para inhibir la actividad de un producto hGOl en el cultivo. En otra modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la actividad de un producto hGOl en un sujeto que padece de un trastorno en donde la actividad de un producto hGOl es dañina. La invención proporciona métodos para inhibir la actividad de un producto de hGOl en un sujeto que padece de dicha enfermedad, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención, de manera que se inhibe la actividad de un producto hGOl en el sujeto. De preferencia, el sujeto es un sujeto ser humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un producto de hGOl con el cual un anticuerpo de la invención reacciona en forma cruzada. Aún más, el sujeto puede ser un mamífero en donde se ha introducido un producto de hGOl (por ejemplo, a través de la administración de un producto hGOl o a través de la expresión de un transgen del producto de hGOl). Un anticuerpo de la invención puede ser administrado a un ser humano para propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención se puede administrar a un mamífero que no es un ser humano que expresa un producto de hGOl con el cual el anticuerpo reacciona en forma cruzada para propósitos veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto a esto último, dichos modelos de animal pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de dosis y tiempos de administración). Como se utiliza aquí, el término "un trastorno en donde la actividad de un producto de hGOl es dañina" incluye enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de un producto de hGOl en un sujeto que padece del trastorno ha mostrado ser o tiene sospecha de ser ya sea responsable de la patofisiología del trastorno o un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en donde la actividad es peligrosa es un trastorno en donde la inhibición de la actividad de un producto de hGOl se espera que alivie los síntomas y/o progresión del trastorno. Dichos trastornos pueden ser evidenciados, por ejemplo, a través de un incremento en la concentración de un producto de hGOl en una muestra biológica de un sujeto que padece el trastorno (por ejemplo, un incremento en la concentración del producto hGOl en un tejido, suero, plasma, fluido sinobial, etc., del sujeto), que puede ser detectado, por ejemplo, utilizando un anticuerpo de producto anti-hGOl como se describió anteriormente. Los ejemplos no limitantes de trastornos que pueden ser tratados con los anticuerpos de la invención incluyen aquellos trastornos discutidos en la siguiente sección con respecto a composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.

Composiciones Farmacéuticas La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo, de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica además comprende por lo menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en donde la actividad de un producto de hGOl es peligrosa. Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para administrarse a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable"incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso ¡sotónicos y de absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, salina, salina regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones. En muchos casos, se prefiere incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio, en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables además pueden comprender cantidades menores de substancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o reguladores de pH, que mejoran la vida de almacenamiento o efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo. Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden ser incorporados en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral. De preferencia, el anticuerpo o porciones de anticuerpo será preparado como una solución inyectable que contiene 0.1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta ya sea de una forma de dosis líquida o liofilizada en un frasco de piedra o ámbar, ampolla o jeringa prellenada. El regulador de pH puede ser L-histidina (1-50 mM), opcionalmente 5-10 mM, a un pH de 5.0 a 7.0 (óptimamente un pH de 6.0). Otros reguladores de pH adecuados incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Se puede utilizar cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosis líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosis liofilizada, principalmente 0-10% de sacarosa (óptimamente 0.5-1.0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trihalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes proporcionadores de volumen para una forma de dosis liofilisada, principalmente 1-10% de manitol (óptimamente 2-4%). Se pueden utilizar estabilizadores tanto en formas de dosis líquidas como liofilisadas, prm' cipa] ente 1-50 mM de L-metionina (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes proporcionadores de volumen adecuados incluyen glicerina, arginina, que pueden ser incluidos como 0-005% de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01%). Los agentes tensoactivos adicionales incluye, pero no se limitan a polisorbato 20 y agentes tensoactivos de BRIJ. Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosis líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en la forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como composiciones similares a aquellas utilizadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el anticuerpo es administrado a través de infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra a través de inyección intramuscular o subcutánea. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. Lá composición puede ser formulada como una solución, microemulsion, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea requerido, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos mencionados anteriormente. En el caso de polvos liofilizados, estériles para las preparaciones de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío, y secado por aspersión que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada, previamente estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de un revestimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de agentes tensoactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede ser producida incluyendo en la composición un agente que retraza la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la presente invención pueden ser administrados a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta preferida/modo de administración es inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como se apreciará por algún experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede ser preparado con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinílo, poüanhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o generalmente son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ser oralmente administrado, por ejemplo, con un diluyente o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desean) también pueden ser encerrados en una cápsula de gelatina de coraza dura o suave, comprimirse a tabletas, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica, los compuestos pueden ser incorporados con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención a través de otra administración parenteral, es necesario cubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con un material para evitar su inactivación. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es co-formulado con y/o co-administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en donde la actividad de un producto de hGOl es dañina. Por ejemplo, un anticuerpo de producto anti-hGOl o porción de anticuerpo de la invención puede ser co-formulado y/o co-administrado con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citosinas o que se unen a moléculas de superficie de célula). Además, se pueden utilizar uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación ventajosamente pueden utilizar dosis inferiores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las varias monoterapias . En una modalidad, los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención se utilizan para tratar patologías asociadas con una variedad de enfermedades asociadas con infecciones virales bacterianas y fúngicas. Dichas patologías incluyen, pero no se limitan a, infecciones respiratorias (por ejemplo, resfriado común, rinitis, faringitis), crup, bronquiolitis, neumonitis, salpullido (por ejemplo, maculopapular, vesicular, hemorrágico), meningitis, parálisis, encefalitis, conjuntivitis, queratitis, blefaritis, pérdida del oído sensoneural, parotitis, miocarditis, pericarditis, niocitis, mialgia, lesiones genitales, orquitis, epididimitis, cistitis hemorrágica, enteritis, hepatitis, efectos teratogénicos, aborto, parto de un feto muerto, fiebre, sepsis, necrosis, tétano, fiebre, escalofríos, sudores nocturnos, anorexia, pérdida de peso, indisposición, y lesiones de la piel. En otra modalidad más, los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención se utilizan para tratar patología asociada con una variedad de enfermedades que involucran elementos inmunes e inflamatorios. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espontiloartropatía, lupus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad inflamatoria del intestino, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, escleroderma de dermatitis, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada con trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveitis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades de parásitos, síndrome de inmunodefiencia adquirida, mielitis transversal aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, falla cardiaca, infarto al miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, tipo I de deficiencia poliglandular y tipo II de deficiencia poliglandular, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria en adultos (aguda), alopecia, alopecia areata, artopatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica asociada, sinobitis enteropática, clamidia, artropatía asociada con yardias y salmonela, espontiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad bolosa autoinmune, pemf igobulgaris, pemfigofoliaceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia emolítica autoinmune, anemia emolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candiadisis monocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, Síndrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogamaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad fibrótica del pulmón, albeolitis fibrosa criptogénica, enfermedad del pulmón interticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad de tejido conectivo asociada con enfermedad de pulmón intersticial, enfermedad de tejido conectivo mixta asociada con enfermedad de pulmón, esclerosis sistémica asociada con enfermedad de pulmón intersticial, artritis reumatoide asociada con enfermedad de pulmón intersticial, lupus sistémlco eritematoso asociado con enfermedad de pulmón, dertatomiocltis/polimiocitis asociada con enfermedad de pulmón, enfermedad de Sjógren asociada con enfermedad de pulmón, espondilitis anquilosante asociada con enfermedad de pulmón, enfermedad de pulmón difusa vasculítica, emociderosis asociada con enfermedad de pulmón, enfermedad de pulmón intersticial inducida por fármacos, fibrosis por radiación, bronqullitis, neumonía eocinofílica crónica, enfermedad de pulmón infiltrante linfocítica, enfermedad de pulmón intersticial post-infecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune de tipo I (autoinmune clásica o hepatitis lupoide), hepatitis autoinmune de tipo II (hepatitis de anticuerpo anti-LKM), hipoglicemia mediada autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricants, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada con trasplante de órganos, enfermedad inmune crónica asociada con trasplante de órganos, osteoartritis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia ¡diopática, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus discoide eritematoso, infertilidad masculina ideopática o NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmía simpatética, hipertensión pu Imonar secundaria a enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjórgren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad de tiroide autoinmune, hipertiroidismo, hipertiroidismo autoinmune gotoso (enfermedad de (Hashímoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixoedema primario, uveitis fajogénica, vasculitis primaria y vitíligo. Los anticuerpos humanos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar seres humanos que padecen de enfermedades autoinmunes, en particular aquellas asociadas con inflamación, incluyendo espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune y uveitis autoinmune. Los anticuerpos de la invención o sus porciones de unión de antígeno, se pueden utilizar solos o en combinación para el tratamiento de dichas enfermedades. Se debe entender que los anticuerpos de la invención o su porción de unión de antígeno se pueden utilizar solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, dicho agente adicional se selecciona por algún experto en la técnica para su uso pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o condición que va a ser tratada por el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un tributo benéfico a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que ocasione la viscosidad de la composición. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la habilidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en donde cualquier efecto tóxico o dañino del anticuerpo o porción de anticuerpo son mitigados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, ya que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Los regímenes de dosis pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta desea óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, se pueden administrar varias dosis divididas durante un tiempo o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza aquí, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos que serán tratados; cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de un compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéuticamente requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención son dictadas por y directamente dependen de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que será logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formular dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad de individuos. Una escala ilustrativa, no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es de 0.1-20 mg/kg, muy preferiblemente 1-10 mg/kg. Se debe observar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y severidad de la condición que va a ser aliviada. Además se debe entender que para cualquier individuo particular, los regímenes de dosis específicos deben ser ajustados con el tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosis establecidas aquí son solo ilustrativas y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada.

III. Métodos para Generar Anticuerpos de Producto Anti-hGOl Los anticuerpos del producto anti-hGOl de la invención se hacen utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en el campo para preparar anticuerpos y utilizar antígenos que comprenden un epítopo del péptido hGOI. En general, los métodos de la invención para hacer un anticuerpo que une un producto de hGOI involucran: Exponer un repertorio de anticuerpo a un antígeno que comprende un epítopo de un producto de hGOI; y Seleccionar del repertorio de anticuerpo, un anticuerpo que une el epítopo de un producto hGOI. En una modalidad, el repertorio de anticuerpo es un repertorio in vivo en un animal que f uncionalmente no expresa el producto del GOI endógeno, y el método comprende inmunizar al animal con el antígeno que comprende el epítopo de un producto de hGOI. En otra modalidad, el repertorio de anticuerpo es una colección de anticuerpo recombinante, y el método que comprende clasificar la colección con el antígeno comprendiendo el epítopo de un péptido de hGOI. De preferencia, la colección es una colección de anticuerpo humano. En la técnica son bien conocidos los métodos para inmunizar un animal con un antígeno para desarrollar así anticuerpos específicos para el antígeno. Un antígeno de hGOI que comprende un epítopo de un producto de hGOl puede ser administrado a un animal para producir anticuerpos policlonales y anticuerpos específicos que unen el epítopo, pueden ser aislados seleccionando de los anticuerpos policlonales a aquellos anticuerpos que se unen al epítopo (por ejemplo, haciendo pasar los antisueros policlonales sobre una columna que comprende un péptido de un producto de hGOl). El antígeno utilizado para producir los anticuerpos policlonales puede ser un producto de hGOl intacto (es decir del longitud completa) o puede ser una porción de un producto de hGOl que incluye un epítopo de interés. Además, los anticuerpos monoclonales para el epítopo pueden hacerse a partir de los animales antes mencionados, utilizando la tecnología de híbridoma estándar y la selección de aquellos hibridomas que secretan un anticuerpo que específicamente une el epítopo de interés, por ejemplo, clasificando los hibridomas con un péptido que comprende aminoácidos de un producto de hGOl y seleccionando anticuerpos que se unen específicamente al péptido. También se pueden utilizar colecciones de anticuerpo recombinantes para hacer los anticuerpos de la invención, en donde una colección de anticuerpo es clasificada para identificar un anticuerpo que tiene el carácter específico de unión deseada. Los métodos para dicha clasificación de colecciones de anticuerpo recombinante son bien conocidas en el campo e incluyen métodos descritos en, por ejemplo, Ladner y otros, patente de E. U. A. No. 5,223,409; Kang y otros, publicación de PCT No. WO 92/18619; Dower y otros, publicación de PCT No. WO 91/17271; Winter y otros, publicación de PCT No. WO 92/20891; Markland y otros, publicación de PCT No. WO 92/15679; Breitling y otros, publicación de PCT No. 93/01288; McCafferty y otros, publicación de PCT No. WO 92/01047; Garrard y otros, publicación de PCT No. WO 92/09690; Fuchs y otros (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y otros (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse y otros (1989) Science 246:1275-1281; Me Cafferty y otros, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths y otros (1992) EMBO J 12:725-734; Hawkins y otros (1992) J Mol Biol. 226:889-896; Clackon y otros (1991) Nature 352:624-628; Gram y otros (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad y otros (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y otros (1991) Nuc. Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y otros (1991) PNAS 88:7978-7982, y publicación de PCT No. WO 97/29131, el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia. La colección de anticuerpo recombinante puede ser de un sujeto inmunizado con un producto de hGOl, o una porción de un producto de hGOl. Alternativamente, la colección de anticuerpo recombinante puede ser de un sujeto natural, es decir, uno que no haya sido inmunizado con un producto de hGOl, tal como una colección de anticuerpo humano de un sujeto ser humano quien no ha sido inmunizado con un producto de hGOl. Los anticuerpos de la invención se seleccionan clasificando la colección de anticuerpo recombinante con un epítopo de un producto de hGOl para seleccionar así aquellos anticuerpos que reconocen este epítopo. En la técnica son bien conocidos los métodos para conducir dicha clasificación y selección, como se describe en las referencias en el párrafo precedente. Para seleccionar anticuerpos de la invención que tienen afinidades de afinidad particulares para un producto de hGOl, tales como aquellas que se disocian de un producto de hGOl con una constante de velocidad Kapagado particular, se puede utilizar el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón de superficie para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de velocidad deseada apagad0. Para seleccionar los anticuerpos de la invención que tengan una actividad neutralizante particular para un producto de hGOl, tales como aquellos con una ICS0 particular, se pueden utilizar métodos estándares conocidos en la técnica para determinar la inhibición de un producto de hGOl.

IV. Usos de los Anticuerpos Anti-hGOl Dada su habilidad para unirse a un producto de hGOl, los anticuerpos anti-hGOl, o sus porciones, de la invención, se pueden utilizar para detectar un producto de hGOl (por ejemplo, en una muestra biológica tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo con inmunoabsorbente enlazado encima (ELISA), un radio inmunoensayo (RAI) o inmunohistoquímica de tejido. La invención proporciona un método para detectar un producto de hGOl en una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo, o una porción de anticuerpo, de la invención, y detectar ya sea el anticuerpo (o porción de anticuerpo) unido a un producto de hGOl o un anticuerpo no unido (porción de anticuerpo), para detectar así un producto de hGOl en la muestra biológica. El anticuerpo está directa o indirectamente marcado con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo oficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen 125l, 131l, 35S o 3H. Alternativo a la marcación del anticuerpo, un producto hGOl puede ser analizado en muestras biológicas en un inmunoensayo de competición utilizando estándares del producto hGOl marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-hGOl no marcado. En este ensayo, la muestra biológica, los estándares del producto de hGOl marcado, y el anticuerpo anti-hGOl se combinan y la cantidad del producto hGOl marcada como estándar unida al anticuerpo, no marcado, se determinó. La cantidad del producto hGOl en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad del estándar del producto hGOl marcado unido al anticuerpo anti-hGOI. Además, el tejido detectado puede ser tejido ubicado in vivo en un sujeto, por ejemplo, tejido visualizado a través de formación de imágenes in vivo del tejido (por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado). En otra modalidad, los anticuerpos del producto hGOl de la invención pueden ser utilizados para propósitos de diagnóstico (por ejemplo, para diagnosticar enfermedades o trastornos mediados por GOI). En una modalidad, un anticuerpo de la invención se utiliza en un ensayo de diagnóstico in vitro, tal como en una prueba de laboratorio para detectar el antígeno(s) de interés o en un punto de prueba de cuidado para detectar el antígeno(s) de interés. Ejemplos de ensayos ¡n vitro bien establecidos que utilizan anticuerpos incluyen ELISAs, RIAs, tinciones Western, y similares. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención se utiliza en un ensayo de diagnóstico in vivo, tal como una prueba de formaciones de imágenes in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado con una sustancia detectable capaz de ser detectada in vivo, el anticuerpo marcado puede ser administrado a un sujeto, y el anticuerpo marcado puede ser detectado in vivo, permitiendo así la formación de imágenes in vivo. Las técnicas de formación de imágenes adecuadas para detectar enfermedades o trastornos mediados por GOI incluyen ensayos biofísicos tales como: dicroismo circular, microscopía electrónica, y fluorescencia. Así como ensayos inmunológicos y bioquímicos tales como hibridación in situ, inmunohistología, inmunotinción, inmunoprecipitación, tinción Western, ensayos de ELISA, y similares. Dichas técnicas comúnmente se utilizan y son conocidas por aquellos expertos en el campo Harlow, E., y Lañe, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A. Laboratory Manual 2°. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1995)). Los anticuerpos del producto de hGOl de la invención se pueden utilizar para producir moléculas de unión específicas para el producto hGOl. Se pueden utilizar métodos de presentación diferencial utilizando sistemas de fago, levadura o virales que son conocidos en la técnica y se utilizan para clasificar moléculas de unión y/o patrones de unión de las inmunoglobulinas de la invención (Liang y otros, (1994) Nucleic Acids Res. 22:5763-5764; Ikeda y otros (1997) Science 276:1564-1566; Taylor y otros (1996) J. Biol. Chem. 271:20399-20405). Por ejemplo, una colección organismo que presenta inmunoglobulinas en sus superficies de célula puede ser utilizada para producir dichas moléculas de unión. Los organismos, cada uno contiene un ácido nucleico con una secuencia derivada de cualquiera de los animales transgénicos, no inmunizados con el antígeno hGOl, como se describe aquí. Ya que el animal está no inmunizado, no expresa moléculas de inmunoglobulina específicas para el antígeno hGOl encontrado en los sueros. Los organismos que hacen la colección, codifican una cadena de polipéptido que es una parte de componente de la inmunoglobulina presentada en la superficie de ese organismo. Después, las inmunoglobulinas son seleccionadas por su habilidad para unir el antígeno hGOl. En otra modalidad, los anticuerpos del producto hGOl de la invención pueden ser utilizados para sintetizar colecciones de ADN capaces de codificar una o más familias de proteínas de combinación de antígeno. En la técnica son conocidos varios métodos para generar colecciones de ADN (Gubler y otros (1983) Gene 25:263-269; Hagen y otros (1988) BioTechniques (6:340-345). Por ejemplo, el ADN que codifica un grupo diverso de proteínas de combinación de antígeno puede aislado de una o más muestras de tejido de uno o más de los animales transgénicos que no son seres humanos descritos aquí. El ADN después puede ser combinado con iniciadores de secuencia específica, los cuales son oligonucleótidos que tienen similitud de secuencia con regiones conservadas del ADN. Después se puede realizar la amplificación de gen específico de secuencia insertando el ADN amplificado en la región variable de dicho gen de cadena pesada codificado dentro de un vector de expresión de anticuerpo de marco. El vector de expresión después se mezcla con un vector comprendiendo un gen de cadena ligera de inmunoglobulina y ambos vectores son transfectados a una célula, creando así una colección de células que producen tanto inmunoglobulinas de cadena ligera como inmunoglobulinas de cadena pesada. Los contenidos de todas las referencias citadas, incluyendo referencias de literatura, patentes emitidas y solicitudes de patente publicadas, como se cita a través de esta solicitud, se incorporan aquí expresamente por referencia. Esta invención además se puede ilustrar a través de los siguientes ejemplos que no deben ser construidos como limitantes.

EJEMPLOS Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de crianza de animales, química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, tecnología de PCR, inmunología, microbiología, o cultivo de célula, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica y se explican en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, Vols. 1 y 2, (D. N. Glover, Ed. 1985); PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y otros, C. S. H. L. Press, Pub (1999); Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Kreig y otros, Williams and Wilkins (1984), y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y otros, Wiley Interscience (1998).

Para técnicas adicionales para generar la eliminación y ratones transgénicos ver, por ejemplo, von Melchner y otros (1992) Genes Dev. 1992 6(6):919-27; Gossler y otros (1989) Science 244 (4903):463-5; Deng y otros (1995) Transgenic Res. 4(4):264-9; Friedrich y otros (1991) Genes Dev. 5(9);1513-23; Soriano y otros (1991) J. Virol. 65(5):2314-9; Skanes y otros, (1992) Genes Dev. 6(6):903-18; Joyner y otros (1989) Nature 338(6211 ): 153-6; Capecchi (1989) Science 244(4910): 288-92; Sauer (1998) Meth. Enz. 14(4):381-92; y Rossi y otros (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9(5):451-6. A menos que se indique otra cosa, se utilizaron los siguientes materiales y métodos en los ejemplos que siguen.

EJEMPLO 1 Métodos para Generar Ratones Fuera de Combate, Ig, Endógenos que Expresan Moléculas de Ig Humanas Se pueden tomar diferentes aspectos para generar ratones fuera de combate (KO) con transgenes de Ig humanos. Algunos ejemplos y sus usos se listan a continuación.

A. Inter-reproducción de ratones fuera de combate con los ratones transgénicos. Este método se utilizó cuando el gen de interés y los transgenes de Ig humanos están sobre cromosomas separados. Los ratones con un gen fuera de combate de IgG son cruzados con ratones que expresan los transgenes para las cadenas H y L de IgG humana. La primera progenie de generación (F1) que son heterocigotos para el gen IgG humana se cruzaron después, generando una segunda progenie de generación (F2), que incluye ratones homocigotos para la cadena H o la cadena L, cada uno a una frecuencia de 1/16.

PASO 1: (-/- ratones KO de IgG de murino) X (+/+ cadenas de capa H y L humanas de IgG) F2 = (-/+, mu/hu IgG) X (-/+, mu/hu IgG) F2 s -/-, cadena hu H/lg de cadena hu H a una frecuencia de 1/16 (F2H: KO/huHIgG) F2 = -/-, lg de cadena L hu/cadena L hu a una frecuencia de 1/16 (F2L: Ko/huLlgG) Los ratones F2H tienen cadenas L de murino y general mAbs quiméricos con cadenas pesadas de humanas y cadenas ligeras de murino. Las cadenas pesadas de humano de dichos mAbs se utilizan in vitro para seleccionar las cadenas ligeras humanas complementarias utilizando la tecnología de presentación de fago.

Similarmente, se utilizaron mAbs quiméricos de los ratones F2L in vitro para seleccionar cadenas pesadas humanas complementarias utilizando tecnología de presentación de fago. El segundo paso de la crianza genera ratones con un fuera de combate de IgG de murino que expresa transgenes de IgG de cadena H humanos y de cadena L humanos. Los ratones F2 homocigotos para una cadena H o una cadena L son cruzados con ratones F2 homocigotos para una cadena L o una cadena H, respectivamente. La tercera progenie de generación (F3), la cual es homocigota para los genes de IgG humanos de cadena H y de cadena L son generadas a una frecuencia de 1/16. En el paso 3, los ratones transgénicos de IgG de cadena ligera humana y de cadena ligera humana, homocigotos, se cruzaron con otro para generar una cuarta generación de progenie (F4), la cual expresa transgenes de IgG de cadena H humanos y cadena L humanos. Dichos ratones generan mAbs totalmente humanos.

PASO 2: F2H X F2L F3 = -/-, Ig de cadena L hu/cadena L hu a una frecuencia de 1/16 PASO 3: F3 X F3 F4 = -/-, cadena L hu/cadena L hu a una frecuencia de 100% B. Eliminación Directa de un Gen de Interés en un Ratón Transgénico El objetivo también es ¡nactivar o sacar de combate a través de medios tales como recombinación homologa, inserción aleatoria, mutagénesis química, o expresión de ARN de antisentido. Además, el gen objetivo es inactivado o sacado de combate condicionalmente combinando el aspecto anterior con el sistema Cre/Lox o con sistemas de expresión de gen de inducción. Estos métodos pueden ser más aplicables cuando el gen de interés y los transgenes de Ig humana están sobre el mismo cromosoma. Dichos ratones KO-Tg pueden no ser tolerantes a la proteína de interés y después de la inmunización, generan anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad contra todas las regiones de la proteína de interés.

EJEMPLO 2 Métodos para Generar mAbs de IL-18 de Ratón-Anti-Ratón Utilizando Ratones Fuera de Combate de IL-18 La inmunización de ratones fuera de combate de IL-18 con ratones de IL-18 se condujo como sigue. Se preparó una emulsión de IL-18 de murino (125 ug/ml) en un auxiliar completo de Freund (CFA) y auxiliar incompleto de Freund (ICFA). En el día 0, los ratones fueron inmunizados con 150 µ?/ratón de la emulsión de CFA entre sitios (50 µ? en cada pata trasera y 50 ul en la base de la cola ID = aproximadamente 18 ug/ratón). En los días 21 y 35, los ratones fueron reforzados con 100 ul de ID en la base de la cola con una emulsión de ICFA conteniendo IL-18 de murino (aproximadamente 12 ug/ratón). En el día 37, se tomaron muestras de suero de ratones de control C57BL/6J (no inmunizados/reforzados) y los 5 ratones fuera de combate de IL-18 inmunizados/reforzados para determinar titulaciones de anticuerpos de IL-18 de anti-murino. En el día 85, los animales fueron reforzados con 10 ug de IL-18 por ratón intravenosamente, en salina regulada en su pH con fosfato en un volumen de 100 ul. En el día 89, los animales fueron terminalmente sangrados para suero y se cosecharon bazos y nodos linfáticos para fusiones con células de mieloma de SP2/0. Las fusiones se realizaron a través de métodos de rutina conocidos por aquellos expertos en la técnica. Dos semanas después de las fusiones, se seleccionaron hibridomas que hacen anticuerpos monoclonales para el IL-18 de ratón, utilizando un ensayo a base de ELISA. Los hibridomas después se probaron para su habilidad para neutralizar funciones de IL-18 de ratón en un ensayo a base de esplenocito de ratón. Los hibridomas positivos fueron seleccionados, subclonados y expandidos.

Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la invención aquí descritas. Dichos equivalentes están destinados a ser

Claims

REIVINDICACIONES 1. - Un ratón transgénico que comprende: (a) por lo menos un sitio de inmunoglobulina endógena inactivo; (b) un ácido nucleico que codifica por lo menos una porción de una inmunoglobulina humana capaz de ser expresada como una molécula de unión funcional; y (c) una alteración en un gen de interés, de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido; en donde el ratón transgénico, después de la exposición al producto de gen, puede expresar una inmunoglobulina humana funcional, o porción de la misma, capaz de unir el producto de gen. 2. - El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ratón, después de la exposición a un homólogo humano del producto de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana funcional, o porción de la misma, capaz de unir el producto de gen. 3. - El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el sitio de inmunoglobulina endógena comprende una cadena pesada endógena, una cadena ligera endógena, y tanto una cadena pesada endógena como una cadena ligera endógena. 4. - El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la inmunoglobulina humana se selecciona del grupo que consiste de una cadena pesada humana, una cadena ligera humana, y tanto una cadena pesada humana como una cadena ligera humana. 5. - El ratón transgénico que comprende: (a) sitios de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera endógena inactivados; (b) ácido nucleico que codifica cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana capaz de ser expresada como una molécula de unión funcional; y (c) una alteración en un gen de interés, de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido; en donde el ratón transgénico, después de la exposición al producto de gen, puede expresar una cadena ligera humana y una cadena pesada humana como una inmunoglobulina humana funcional, capaz de unir el producto de gen. 6. - Un ratón transgénico que comprende: (a) sitios de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera endógena inactivados; (b) ácido nucleico que codifica cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana capaz de ser expresada como una molécula de unión funcional; y (c) una alteración en un gen de interés, de manera que el producto de gen correspondiente ya no es más producido; en donde el ratón transgénico, después de la exposición a un homólogo humano del producto de gen, puede expresar una cadena ligera humana y una cadena pesada humana como una inmunoglobulina humana funcional, capaz de unir el producto de gen. 7. - El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6, en donde la inmunoglobulina es IgG, IgM o IgA. 8. - El ratón transgénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6, en donde la alteración en el gen de interés es una interrupción o escisión de existencia natural o genéticamente diseñada por ingeniería. 9. - El ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el producto de gen del gen de interés es una proteína secretada, la cual se selecciona del grupo que consiste de un IFN, un T F, una interieucina, IP-10, PF4, a GRO, 9E3, EMAP-II, un CSF, un FGF, y un PDGF. 10. - el ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la interieucina es IL-1a, I L- 1 ß , IL-12 o 1L-18. 11.- Una inmunoglobulina, o porción de la misma, derivada del animal transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6. 12.- La inmunoglobulina, o porción de la misma, de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal. 13.- Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina, o porción de la misma, derivada del ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6. 14.- Una célula inmune derivada del ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6, en donde la célula es adecuada para usarse en la fabricación de un hibridoma. 15. - Un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina derivada de la célula inmune de la reivindicación 14. 16. - Una célula del tallo embriónica derivada del ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6. 17.- Progenie derivada del ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 6. 18. - Un método para hacer un ratón transgénico que, después de exponerse a un producto de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina, o porción de la misma, capaz de unir el producto de gen, que comprende: (a) obtener una célula del tallo embriónica del ratón transgénico, en donde el gen de interés endógeno del ratón se ve alterado, de manera que el producto de gen endógeno del gen de interés ya no es más producido; y (b) producir, a partir de la célula del tallo embriónica, el ratón transgénico. 19. - Un método para hacer un ratón transgénico que, después de exponerse a dos o más productos de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina, o porción de la misma, capaz de unir los productos de gen, el cual comprende: (a) obtener una célula del tallo embriónica del ratón transgénico, en donde dos o más de los genes de interés del ratón se ve alterado, de manera que uno o más de los productos de gen endógeno de los genes de interés ya no es más producido; y (b) producir, a partir de la célula del tallo embriónica del ratón transgénico, el ratón transgénico. 20. - El método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en donde el producto de gen es un homólogo humano y la inmunoglobulina es una inmunoglobulina funcional capaz de unir el homólogo humano. 21. - El método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en donde el ratón transgénico también es transgénico para genes de inmunoglobulina humana, de manera que después de exponerse al homólogo humano del producto de gen, el ratón es capaz de expresar una inmunoglobulina humana funcional, o porción de la misma, capaz de unir el homólogo humano del producto de gen. 22. - El método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, que comprende los pasos de extirpar el sistema inmune del ratón transgénico e injertar células de médula ósea capaces de expresar inmunoglobulinas humanas. 23. - El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde las células de médula ósea se obtienen de un ratón transgénico para genes de inmunoglobulina humana. 24. - Un método para hacer una progenie que, después de exponerse a un producto de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana, o porción de la misma, capaz de unir el producto de gen, que comprende los pasos de: (a) obtener un primer ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana; (b) obtener un segundo ratón transgénico, en donde uno o más de los genes de Interés del animal se ven alterados, de manera que uno o más de los productos de gen endógeno de los genes de interés ya no son más producidos; y (c) aparear al ratón del paso (a) con el ratón del paso (b) y obtener la progenie. 25.- El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el producto de gen es un homólogo humano y la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana funcional capaz de unir el homólogo humano. 26.- Un método para hacer un ratón transgénico que, después de exponerse a un producto de gen, es capaz de expresar una inmunoglobulina humana, o porción de la misma, capaz de unir el producto de gen, que comprende los pasos de: (a) obtener una célula del tallo embriónlca del ratón, la cual es transgénica para los genes de inmunoglobulina humana; (b) alterar uno o más genes de interés en la células del tallo embriónica, de manera que uno o más de los productos de gen endógeno de los genes de interés ya no son más producidos; y (c) producir, a partir de la célula del tallo embriónica, el ratón transgénico. 27.- El método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el producto de gen es un homólogo humano y la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana funcional capaz de unir el homólogo humano. La invención proporciona composiciones y métodos para la generación de animales transgénicos novedosos, que no son seres humanos, los cuales contienen una alteración en un gen de interés. Estos animales transgénicos son capaces de generar anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, específicos para el producto de un gen de interés que ha sido funcionalmente interrumpido en el anima! transgénico. Además, los métodos y composiciones de la invención son adecuados para utilizarse en el tratamiento, diagnóstico y formación de imágenes de la enfermedad.