ES2839087T3

ES2839087T3 - Anticuerpo derivado de IGG1 humana con actividad pro-apoptótica

Info

Publication number: ES2839087T3
Application number: ES14823891T
Authority: ES
Inventors: Mylène Dorvillius; Doussal Jean-Marc Le; Mickaël Terme
Original assignee: Ogd2 Pharma
Current assignee: Ogd2 Pharma
Priority date: 2013-11-12
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2021-07-05
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: CN106414494B; WO2015070972A1; CN106414494A; JP2016537975A; EP3068798A1; CA2963178C; EP3068798B1; JP6633520B2; CA2963178A1; US20160280765A1; US10669328B2

Abstract

Un método para aumentar la actividad pro-apoptótica de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado que ha perdido su actividad pro-apoptótica en el proceso de quimerización y que se une específicamente a un antígeno de gangliósido con la condición de que dicho gangliósido no corresponda a GD2-Oacetilado, comprendiendo dicho método la etapa de mutar el dominio CH1γ1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, de acuerdo con el índice EU según lo establecido en Kabat et al., del dominio CH1γ1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, para restablecer el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, o sustituyendo el dominio CH1γ1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1γ2), IgG3 (CH1γ3) o IgG4 (CH1γ4) humanas.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo derivado de IGG1 humana con actividad pro-apoptótica

Campo de la invención

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos y sus usos en terapias.

Antecedentes de la invención

Dado que los anticuerpos son moléculas de proteína que tienen alta actividad de unión y especificidad de unión a una molécula diana (antígeno) y alta estabilidad en sangre, se han intentado aplicaciones de los mismos a agentes de diagnóstico, preventivos y terapéuticos para diversas enfermedades humanas. Aunque los anticuerpos se producen generalmente administrando (inmunizando) un antígeno a un animal no humano, los anticuerpos obtenidos de un animal no humano tienen una secuencia de aminoácidos específica de la especie y los efectos secundarios se deben a que los anticuerpos son reconocidos como sustancias foráneas en el organismo humano. Por consiguiente, se han preparado anticuerpos quiméricos humanos o anticuerpos humanizados a partir de anticuerpos de animales distintos de los seres humanos (animales no humanos) utilizando técnicas de recombinación de genes.

Los anticuerpos quiméricos humanos y los anticuerpos humanizados han resuelto los problemas que poseen los anticuerpos de animales no humanos, tales como los anticuerpos de ratón, tal como la alta inmunogenicidad, la baja función efectora y la semivida breve en sangre, y las aplicaciones de anticuerpos monoclonales a las preparaciones farmacéuticas fueron posibles gracias a su utilización. En los Estados Unidos, por ejemplo, una pluralidad de anticuerpos humanizados ya ha sido sometida a prueba como anticuerpos para el tratamiento del cáncer y está en el mercado.

Estos anticuerpos quiméricos humanos y anticuerpos humanizados muestran en realidad efectos hasta cierto punto a nivel clínico, pero se demandan anticuerpos terapéuticos que tengan efectos superiores. Por ejemplo, en el caso de la administración única de Rituxan (fabricado por IDEC/Roche/Genentech), que es un anticuerpo quimérico humano contra CD20, se ha informado que su índice de respuesta para pacientes con linfoma no Hodgkin de baja malignidad recidivante en la prueba clínica en fase III no supera 48% (remisión completa 6%, remisión parcial 42%) y la duración media de su respuesta es de 12 meses. En el caso de la administración única de Herceptin (fabricado por Genentech), que es un anticuerpo humanizado contra HER2, se ha informado que su índice de respuesta para pacientes con cáncer de mama metastásico en la prueba clínica en fase III es solo de 15%, y la duración promedio de su respuesta es de 9,1 meses.

La molécula de anticuerpo humano también se denomina inmunoglobulina (en lo sucesivo, Ig) y se clasifica en subclases IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM en función de su estructura molecular. Los cuatro isotipos de IgG humana (IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4) son altamente homólogos entre sí en la secuencia de aminoácidos en la región constante de la cadena H excepto por las bisagras que muestran una amplia variedad. Sin embargo, estos isotipos inducen una actividad efectora de diferente intensidad. En general, la actividad ADCC disminuye en el siguiente orden: IgG 1 > IgG3 > IgG4 = IgG2, mientras que la actividad CDC disminuye en el siguiente orden: IgG3 ^ IgG >> IgG2 = IgG4.

Aunque la IgG1 humana y la IgG3 humana son subclases que tienen excelentes actividades ADCC y CDC, se sabe que el anticuerpo IgG3 humano tiene una semivida más corta en la sangre que otras subclases de IgG humana y, por tanto, desaparece rápidamente de la sangre después de la administración. También se sabe que la IgG3 humana no tiene actividad de unión a la proteína A, a diferencia de otras subclases de IgG humana. Al producir un anticuerpo a escala industrial, predomina un proceso de purificación que utiliza proteína A y otros procesos que utilizan, por ejemplo, proteína G tienen algunos problemas, tales como un alto coste de purificación.

Basándose en lo anterior, se puede decir que el anticuerpo IgG 1 humano es la subclase más adecuada como fármaco de anticuerpos, ya que tiene mayores actividades ADCC y CDC que otras subclases, se puede purificar utilizando proteína A, muestra una semivida prolongada en sangre y tiene un valor desde el punto de vista del coste de producción. Aunque se ha empleado un anticuerpo IgG1 humano como fármaco en la práctica como se describió anteriormente, los efectos del fármaco mostrados por los fármacos de anticuerpos existentes son todavía insuficientes.

Por tanto, se ha requerido un fármaco de anticuerpo que tenga efectos mejorados.

Se han introducido muchas modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la IgG1 humana intercambiando parte de ella. Sin embargo, tal anticuerpo preparado mediante el reemplazo de una secuencia de aminoácidos que no está presente en la naturaleza tiene el riesgo de que sea reconocido como una materia foránea en el organismo humano y por lo tanto induzca un efecto secundario similar al anticuerpo animal no humano como se discutió anteriormente. Por otro lado, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo preparado intercambiando secuencias de aminoácidos entre subclases humanas es una combinación de secuencias de aminoácidos de anticuerpos inherentemente portados por seres humanos. Natsume et al. (Cancer Research, 2008, vol. 68, núm. 10, páginas 3863-3872) describen un método para mejorar la citotoxicidad dependiente del complemento de un anticuerpo mediante el uso de una región constante modificada genéticamente de isotipos quiméricos IgG1/IgG3 humanos.

Compendio de la invención

A continuación, los autores de la presente invención han demostrado sorprendentemente que una mutación específica en CH1y1 de un anticuerpo quimérico (c8B6), que restaura el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de otras subclases de IgG, o su sustitución por un CH1y3 humano, da como resultado la restauración de la actividad pro-apoptótica del anticuerpo IgG3 8B6 murino parental, siendo dicha propiedad inherente a la mayoría de los anticuerpos IgG3.

En consecuencia, parece que el emparejamiento atípico entre la bisagra y el dominio CL en la IgG1 humana - debido a la ausencia de cisteína en el dominio CH1 - está asociado con la menor actividad pro-apoptótica observada para los anticuerpos IgG 1.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para aumentar la actividad pro-apoptótica de un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado que ha perdido su actividad pro-apoptótica en el proceso de quimerización y que se une específicamente a un antígeno gangliósido con la condición de que dicho gangliósido no corresponda a GD2-O-acetilado, comprendiendo dicho método la etapa de mutar el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat et al., del dominio CH1 y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, para restablecer el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, o sustituyendo el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1y3) o IgG4 (CH1y4) humanas.

El anticuerpo derivado de IgG1 obtenido mediante el método de la presente invención presenta una combinación de las propiedades inherentes de IgG1 y de una actividad pro-apoptótica aumentada que da como resultado una eficacia terapéutica potencializada.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que se puede obtener mediante tal método, en donde dicho anticuerpo comprende:

a) una cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

i) la Región Variable de Cadena Ligera (LCVR) específica de un antígeno; y

ii) un dominio Constante (CL) kappa (k) humano; y

b) una cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

i) la Región Variable de la Cadena Pesada (HCVR) específica de dicho antígeno;

ii) los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana; y

iii) el dominio CH1 de una IgG1 humana, que está mutado para restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de otras subclases de IgG, o está sustituido por un dominio CH1 de una IgG2, IgG3 o IgG4 humanas.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de tales anticuerpos y un portador farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención se refiere a un método para tratar un cáncer que comprende proporcionar a un paciente que lo necesite una composición farmacéutica que comprenda al menos uno de dichos anticuerpos, o al menos un fragmento funcional de los mismos.

Finalmente, la presente invención se refiere al uso de al menos uno de tales anticuerpos, o de al menos un fragmento funcional de los mismos, para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir el cáncer.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra las secuencias de cadena ligera y pesada del anticuerpo c8B6.

La Figura 2 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.14a.

La Figura 3 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra de los anticuerpos 301.14b y 311.14b.

La Figura 4 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra de los anticuerpos 301.15 y 311.15.

La Figura 5 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.16.

La Figura 6 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.17.

La Figura 7 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.18.

La Figura 8 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.19.

La Figura 9 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.15b.

La Figura 10 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.20.

La Figura 11 muestra la secuencia de dominios CH1 y bisagra del anticuerpo 301.21.

La Figura 12 muestra la citotoxicidad directa de anticuerpos anti-OacGD2 por yoduro de propidio.

La Figura 13 muestra la citotoxicidad directa de anticuerpos anti-GD2 por yoduro de propidio.

Descripción detallada

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para incrementar la actividad pro-apoptótica de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado que ha perdido su actividad proapoptótica tras el proceso de quimerización y que se une específicamente a un antígeno gangliósido con la condición de que dicho gangliósido no corresponde a GD2-O-acetilado, comprendiendo dicho método la etapa de mutar el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido de la posición 133 o 134, según el índice EU expuesto en Kabat et al., del dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, con el fin de restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 y IgG4 humanas, o sustituyendo el dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1^y2), IgG3 (CH1^y3) o IgG4 (CH1^y4) humanas.

Dicho método de incremento de la eficacia terapéutica comprende incrementar la actividad pro-apoptótica de dicho anticuerpo.

Un anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina que corresponde a un tetrámero que comprende cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) idénticas (aproximadamente 50-70 kDa cuando están completas) y dos cadenas ligeras (L) idénticas (aproximadamente 25 kDa cuando están completas) interconectadas por medio de enlaces disulfuro. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa y lambda.

La cadena pesada se clasifica como gamma para la IgG. Cada cadena pesada está formada por una región variable de cadena pesada N-terminal (abreviada como HCVR) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está formada por tres dominios (CH1, CH2, y CH3) para IgG y un dominio bisagra entre los dominios CH1 y CH2.

Cada cadena ligera está formada por una región variable de cadena ligera N-terminal (abreviada en la presente memoria como LCVR) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está formada por un dominio, CL. Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada HCVR y LCVR está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con convenciones bien conocidas (IMGT, The International Immunogenetics Information System®, LEFRANC et al., Nucleic Acids Research, vol. 27, pág.: 209-212, 1999). La capacidad funcional del anticuerpo para unirse a un antígeno particular depende de las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada, y está determinada en gran medida por las CDR. Como se emplea en la presente memoria, la expresión "derivado de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) humana" se refiere a un anticuerpo quimérico o humanizado. Comprendiendo tal anticuerpo derivado:

i) el dominio constante de la cadena ligera (CL) y los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) de una IgG1 humana; y

ii) la Región Variable de la Cadena Ligera (LCVR) y la Región Variable de la Cadena Pesada (HCVR), o las correspondientes CDR, no de una IgG1 humana.

El término "fragmentos funcionales" como se emplea en la presente memoria se refiere a fragmentos de anticuerpos, que se unen específicamente al gangliósido GD2 O-acetilado y que comprenden un dominio CH1. Tales fragmentos pueden ser identificados simplemente por el experto en la técnica y comprenden, como ejemplo, están incluidos en la invención el fragmento F^ab(p. ej., mediante digestión con papaína), el fragmento F^ab' (p. ej., mediante digestión con pepsina y reducción parcial), el fragmento F(ab')2 (p. ej., mediante digestión con pepsina), F^acb(p. ej., mediante digestión con plasmina), y también el fragmento F^d(p. ej., mediante digestión con pepsina, reducción parcial y re agregación).

Tales fragmentos pueden ser producidos mediante escisión enzimática, mecanismos sintéticos o recombinantes, como los conocidas en la técnica y/o como se describe en la presente memoria. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas utilizando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de parada aguas arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen combinado que codifique una porción de cadena pesada de F(ab')2 para que incluya secuencias de ADN que codifiquen el dominio CH1 y/o la región bisagra de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos se pueden reunir químicamente mediante mecanismos convencionales, o se pueden preparar como una proteína contigua utilizando mecanismos de ingeniería genética.

En una primera realización preferida, el método de la invención comprende la etapa de mutar el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido de la posición 133 o 134, según el índice EU como se expone en Kabat et al, del dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, con el fin de restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 y IgG4 humanas.

El dominio CH1 de una IgGI humana es bien conocido por el experto en la técnica. Como ejemplo, el dominio CH1 de una IgGI humana corresponde a SEQ ID NO: 21.

Como se emplea en la presente memoria, la etapa de "mutación del dominio CH1^y1 humano para restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las otras subclases de IgG", se refiere a un dominio CH1y1 humano en donde un aminoácido ha sido sustituido por un resto de cisteína, preferiblemente en donde la posición del aminoácido 133 o 134 es una cisteína, y más preferiblemente en donde el aminoácido de la posición 133 es una cisteína. La numeración de la región constante es la del índice EU como se expone en Kabat et al. (1991, Publicación NIH Núm. 91-3242, National technical Information Service Springfield, VA). Como primer ejemplo, tal dominio CH1 y1 humano se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, en donde el resto de serina de la posición 133 ha sido sustituido por una cisteína. Como segundo ejemplo, tal dominio CH1^y1 humano se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22, en donde el resto de serina de la posición 134 ha sido sustituido por una cisteína. El resto de cisteína de la posición 133 o 134 de la secuencia de CH1 restaura un enlace disulfuro entre la cadena ligera y la cadena pesada de los anticuerpos de la invención.

Ventajosamente, la etapa de mutar el dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, según el índice EU expuesto en Kabat et al., del dominio Ch 1 yl humano de dicho anticuerpo por un resto de aminoácido de cisteína, para restaurar el emparejamiento los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se lleva a cabo mediante:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio CH1 de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgGI) quimérico o humanizado, codificando preferiblemente dicha secuencia de ácido nucleico la cadena pesada del anticuerpo;

b) mutación del codón que codifica la posición 133 o 134 de dicho dominio CH1 para codificar el aminoácido cisteína (C) para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

c) aportación a la secuencia de ácido nucleico mutada de elementos de expresión operables;

d) expresión conjunta del ácido nucleico mutado con una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo en un anfitrión adecuado proporcionando de ese modo un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado mutado; y

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

En una segunda realización preferida, el método de la invención comprende la etapa de sustituir dicho dominio CH1y1 humano por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1y3) o IgG4 (CH1y4) humanas.

Los dominios CH1 de una IgG2, IgG3, y IgG4 humanas son bien conocidos para el experto en la técnica. Como ejemplo, el dominio CH1 de una IgG2 humana corresponde a SEQ ID NO: 23, el dominio CH1 de una IgG3 humana corresponde a SEQ ID NO: 2, y el dominio CH1 de una IgG4 humana corresponde a SEQ ID NO: 24.

Ventajosamente, la etapa de sustitución del dominio del dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1 y3) o IgG4 (CH1y4) humanas se llevado a cabo por medio de:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio CH1 de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado, codificando dicha secuencia de ácido nucleico preferiblemente la cadena pesada del anticuerpo;

b) sustitución de dicha secuencia de ácido nucleico de CH1y1 por una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1y3) o IgG4 (CH1 y4) humanas para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

En una realización más preferida, el método de la invención comprende adicionalmente la etapa de mutar el dominio bisagra de IgG1 humana de dicho anticuerpo, con el fin de restaurar el emparejamiento entre la bisagra y el dominio CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 y IgG4 humanas, o de sustituir dicho dominio bisagra de IgG1 humana por el dominio de una IgG2, IgG3, IgG4 humanas, o un dominio bisagra truncado de una IgG3 humana que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9.

El dominio bisagra de una IgG1 humana es bien conocido para el experto en la técnica y corresponde como ejemplo a SEQ ID NO: 3.

Como se emplea en la presente memoria, la etapa de "mutar el dominio bisagra humano de dicho anticuerpo, con el fin de restaurar el emparejamiento entre la bisagra y el dominio CH2 que es típico de otras subclases de IgG", se refiere a un dominio bisagra de IgG1 humana, en donde el resto de cisteína en la quinta posición de la secuencia de la bisagra ha sido sustituido por otro resto, preferiblemente por una serina. De hecho, dicha mutación da como resultado la restauración de la estructura de IgG típica. Como ejemplo de tal derivado, se puede citar SEQ ID NO: 4.

En una realización preferida, la mutación del dominio bisagra humano de dicho anticuerpo, con el fin de restaurar el emparejamiento entre la bisagra y el dominio CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se lleva a cabo sustituyendo el resto de cisteína en la quinta posición de su secuencia por otro resto, preferiblemente por una serina.

Ventajosamente, la etapa de mutar el dominio bisagra humano de dicho anticuerpo, para restaurar el emparejamiento entre el dominio bisagra y CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se realiza por medio de:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio bisagra de un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado, codificando preferiblemente dicha secuencia de ácido nucleico la cadena pesada del anticuerpo;

b) mutación del codón que codifica el resto de aminoácido cisteína (C) en la posición 5 de dicho dominio bisagra para codificar otro resto de aminoácido, preferiblemente un resto de serina, para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

d) expresión conjunta del ácido nucleico mutado con una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo en un anfitrión adecuado, proporcionando así un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado mutado; y

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

El dominio bisagra de una IgG2, IgG3 o IgG4 humanas es bien conocido por el experto en la técnica y corresponde como ejemplo a SEQ ID NO: 5 para IgG3. Los derivados de la IgG3 humana también son bien conocidos por el experto en la técnica y corresponden como ejemplo a SEQ ID NO: 6 a 9, preferiblemente a SEQ ID NO: 9.

De manera más ventajosa, la etapa de sustitución del dominio bisagra de IgG1 humana de dicho anticuerpo, por el dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humanas, o un dominio de bisagra truncado forma una IgG3 humana que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9, se realiza por medio de:

b) sustitución de dicha secuencia de ácido nucleico del dominio bisagra de IgG1 por una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humanas o un dominio bisagra truncado de una IgG3 humana que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9 para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

También se describe un anticuerpo, o fragmento funcional del mismo, que se puede obtener mediante el método de la invención, en donde dicho anticuerpo comprende:

a) una cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

i) la Región Variable de Cadena Ligera (LCVR) específica de un antígeno; y

ii) un dominio Constante (CL) kappa (k) humano; y

b) una cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos:

ii) los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana; y

iii) el dominio CH1 de una IgG1 humana, que está mutado para restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de otras subclases de IgG, o sustituido por un dominio CH1 de una IgG2, IgG3 o IgG4 humanas.

El término "anticuerpo", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo monoclonal per se. Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. El dominio CL kappa (k) humano es bien conocido por el experto en la técnica y corresponde, como ejemplo, a SEQ ID NO: 10.

Los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana son bien conocidos por el experto en le técnica y corresponden como ejemplo a SEQ ID NO: 11.

Los anticuerpos útiles en la invención se producen de forma recombinante, ya que se requiere la manipulación de los anticuerpos típicamente murinos u otros anticuerpos no humanos con la especificidad apropiada para convertirlos a la forma humanizada. Los anticuerpos pueden o no estar glicosilados, aunque se prefieren los anticuerpos glicosilados. Los anticuerpos se entrecruzan adecuadamente mediante enlaces disulfuro, como es bien sabido.

El anticuerpo obtenido por el método de la invención es un anticuerpo quimérico. Por la expresión "anticuerpo quimérico" se entiende un anticuerpo que está compuesto de regiones variables de una inmunoglobulina murina y de regiones constantes de una inmunoglobulina humana. Esta alteración consiste simplemente en sustituir la región constante de un anticuerpo humano por la región constante murina, dando así como resultado una quimera humana/murina que puede tener una inmunogenicidad suficientemente baja como para ser aceptable para su uso farmacéutico. Para la presente invención, dicho anticuerpo quimérico comprende las regiones constantes de cadenas ligeras y pesadas humanas. Se ha informado todavía de varios métodos para producir tales anticuerpos quiméricos, formando así parte del conocimiento general del experto en la técnica (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.225.539).

El anticuerpo obtenido por el método de la invención es un anticuerpo humanizado.

Por "anticuerpo humanizado" se entiende un anticuerpo que está compuesto parcial o totalmente por secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de un anticuerpo humano alterando la secuencia de un anticuerpo que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas. Esta humanización de la región variable del anticuerpo y eventualmente la CDR se realiza mediante mecanismos que ahora son bien conocidos en la técnica.

Como ejemplo, la Solicitud de Patente Británica GB 2188638A y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.585.089 describen procesos en donde se producen anticuerpos recombinantes en los que la única parte del anticuerpo que está sustituida es la región determinante de complementariedad, o "CDR". La técnica de injerto de CDR se ha utilizado para generar anticuerpos que consisten en CDR murinas y regiones marco y constantes de la región variable humana (véase, p. ej., RIECHMANN et al., Nature, vol. 332, pág: 323-327, 1988). Estos anticuerpos retienen las regiones constantes humanas que son necesarias para la función efectora dependiente de Fc, pero es mucho menos probable que provoquen una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo.

Como ejemplo, las regiones marco de las regiones variables se sustituyen por las regiones marco humanas correspondientes dejando la CDR no humana sustancialmente intacta, o incluso reemplazando la CDR por secuencias derivadas de un genoma humano. Los anticuerpos completamente humanos se producen en ratones modificados genéticamente cuyos sistemas inmunitarios se han alterado para que correspondan a los sistemas inmunitarios humanos. Como se mencionó anteriormente, es suficiente para su uso en los métodos de la invención, el empleo de un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo los fragmentos que representan formas monocatenarias.

Un anticuerpo humanizado nuevamente se refiere a un anticuerpo que comprende un marco humano, al menos una CDR de un anticuerpo no humano, y en el que cualquier región constante presente es sustancialmente idéntica a una región constante de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85 o 90%, preferiblemente al menos 95% idéntica. Por tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencias de inmunoglobulina humana nativa. Por ejemplo, una inmunoglobulina humanizada normalmente no abarcaría un anticuerpo quimérico de región variable de ratón/región constante humana.

Los anticuerpos humanizados tienen al menos tres ventajas potenciales sobre los anticuerpos quiméricos y no humanos para su uso en terapia en seres humanos:

1) Debido a que la porción efectora es humana, puede interactuar mejor con las otras partes del sistema inmunológico humano (p. ej., destruir las células diana de manera más eficiente mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)).

2) El sistema inmunológico humano no debería reconocer el marco o la región C del anticuerpo humanizado como foráneo y, por lo tanto, la respuesta del anticuerpo contra dicho anticuerpo inyectado debería ser menor que contra un anticuerpo no humano totalmente foráneo o un anticuerpo quimérico parcialmente foráneo. 3) Se ha informado de que los anticuerpos no humanos inyectados tienen una semivida en la circulación humana mucho más corta que la semivida de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados inyectados tendrán una semivida esencialmente idéntica a la de los anticuerpos humanos naturales, lo que permitirá administrar dosis más pequeñas y menos frecuentes.

Como ejemplo, el diseño de inmunoglobulinas humanizadas se puede llevar a cabo de la siguiente manera: cuando un aminoácido cae en la siguiente categoría, el aminoácido del marco de una inmunoglobulina humana que se va a utilizar (inmunoglobulina aceptora) se reemplaza por un aminoácido del marco de una Inmunoglobulina no humana que proporciona la CDR (inmunoglobulina donadora): (a) el aminoácido en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es típico de la inmunoglobulina humana en esa posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o (c) cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido del marco está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de la CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional (QUEEN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., vol.88, pág: 2869, 1991). Cuando cada uno de los aminoácidos en la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora y un aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es inusual para la inmunoglobulina humana en esa posición, tal aminoácido es reemplazado por un aminoácido típico de la inmunoglobulina humana en esa posición.

El anticuerpo o fragmento del mismo están dirigidos contra un inmunorregulador, un antígeno infeccioso o tumoral. La Región Variable de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específica de tal antígeno puede ser identificada simplemente por el experto en la técnica en vista de su conocimiento general.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno inmunorregulador" se refiere a un antígeno expresado por células inmunitarias inductoras activadas, tales como células T y/o NK o por células supresoras activadas.

Como ejemplo de un antígeno expresado por células supresoras activadas, se puede citar CTL-A4 (Antígeno Asociado a Linfocitos Citotóxicos, también denominado CD 152) que se descubrió en 1987 (BRUNET et al., Nature, vol. 328, pág: 267-270, 1987).

Como ejemplo de antígeno expresado por células inmunitarias inductoras activadas, se puede citar BTLA (atenuador de linfocitos B y T), también conocido como CD272, que se induce durante la activación de las células T y permanece expresado sobre las células Th1 pero no sobre las células Th2.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno infeccioso" se refiere a una sustancia antigénica producida en células infectadas por un microbio tal como una bacteria o un virus.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno tumoral" se refiere a una sustancia antigénica producida en células tumorales. Muchos antígenos tumorales son bien conocidos por el experto en la técnica y se pueden citar, como ejemplos no limitantes, CD20, CEA, EGFR, HER2, EPCAM, MUC1, P^sM^a, CD-19, GM1, CAIX, antígenos de fosfolípidos tales como fosfatidilserina o gangliósidos tales como GD2, GD2-O-acetilado o GD3.

Preferiblemente, dicho antígeno no corresponde a GD2-O-acetilado.

CD-20 es una fosfoproteína no glicosilada que se expresa durante el desarrollo temprano de las células pre-B y permanece hasta la diferenciación de las células plasmáticas. Específicamente, la molécula de CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que se requiere para el inicio y la diferenciación del ciclo celular y normalmente se expresa a niveles muy altos en células B neoplásicas ("tumorales"). CD20, por definición, está presente tanto en las células B "normales" como en las células B "malignas". Por tanto, el antígeno de superficie CD20 tiene el potencial de servir como candidato para "dirigirse" a los linfomas de células B.

En cuanto a los anticuerpos dirigidos contra CD20, con el fin de obtener sus correspondientes Regiones Variables de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específicas de CD20, se puede citar rituximab ("RITUXAN®") (Patente de Estados Unidos Núm. 5.736.137); el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio-[90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (Patente de Estados Unidos Núm. 5.736.137); la IgG2a murina "BI", también llamada "Tositumomab", opcionalmente marcada con 131I para generar el "131I-BI "(yoduro 131 tositumomab, BEXXAR®) (Patente de Estados Unidos Núm. 5.595.721); y 2H7 humanizado; Ofatumumab, una IgG1 completamente humanizada contra un epítopo nuevo sobre CD20 huMax-CD20 (Solicitud de patente internacional PCT WO 2004/035607). Entre ellos, rituximab, ibritumomab, tiuxetan y tositumomab recibieron la aprobación comercial para el tratamiento de linfomas específicos, y Ofatumumab recibió aprobación comercial para el tratamiento de leucemias específicas. Preferiblemente, dicho anticuerpo dirigido contra CD20 es rituximab y corresponde a las secuencias presentadas en las siguientes tablas para Regiones Variables de Cadena Pesada (HCVR; SEQ ID NO: 25 a 31), y para Regiones Variables de Cadena Ligera (LCVR; SEQ ID NO: 32 a 37).

Anti-CD20 (rituximab) Cadena Pesada Variable:

Anti-CD20 (rituximab) Cadena Ligera Variable (cadena k):

Más preferiblemente, la secuencia de CH1 y de la bisagra de rituximab corresponde a SEQ ID NO: 38.

La glicoproteína CEA (antígeno carcinoembrionario) es un marcador tumoral involucrado en la adherencia celular. En cuanto a los anticuerpos dirigidos contra CEA, para obtener sus correspondientes Regiones Variables de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específicas de CEA, se puede citar arcitumomab (IMMUNOMEDICS).

Los receptores de ErbB se expresan en diversos tejidos de origen epitelial, mesenquimatoso y neuronal. En condiciones normales, la activación de los receptores de ErbB está controlada por la expresión espacial y temporal de sus ligandos, que son miembros de la familia de factores de crecimiento EGF. La unión del ligando a los receptores de ErbB induce la formación de homo y heterodímeros del receptor y la activación del dominio quinasa intrínseco, lo que da como resultado la fosforilación de restos de tirosina quinasa específicos dentro de la cola citoplasmática. Estos restos fosforilados sirven como sitios de acoplamiento para diversas proteínas, cuyo reclutamiento conduce a la activación de vías de señalización intracelular. Entre los receptores de ErbB, se sabe que EGFR y HER2 juegan un papel esencial en la regulación de la proliferación y diferenciación celulares. Tienen una fuerte tendencia a ensamblarse con otros receptores de HER en homo y/o heterodímeros tras la unión del factor de crecimiento extracelular, lo que da como resultado diversas formas de activación de las vías de transducción de señales, lo que conduce a la apoptosis, supervivencia o proliferación celulares.

En cuanto a los anticuerpos dirigidos contra EGFR, para obtener sus correspondientes Regiones Variables de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específicas de EGFR, se pueden citar el anticuerpo monoclonal humanizado 425, también denominado matuzumab (hMAb 425, Patente de Estados Unidos Núm. 5.558.864; documento EP 0531 472), el anticuerpo monoclonal quimérico 225 (cMAb 225), también denominado cetuximab (ERBITUX®; Patente de Estados Unidos Núm. 7.060.808), y el anticuerpo anti-EGFR completamente humano panitumumab (VECTIBIX®; Patente de Estados Unidos Núm. 6.235.883). Entre ellos, se demostró que cetuximab y panitumumab inhiben los tumores colorrectales humanos in vivo y ambos recibieron una marcada aprobación.

En cuanto a los anticuerpos dirigidos contra Her2, para obtener sus correspondientes Regiones Variables de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específicas de Her2, se pueden citar la versión humanizada recombinante del anticuerpo de ratón 4D5 ((Patente de Estados Unidos Núm. 5.677.171), designado huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab o HERCEPTIN® (Patente de Estados Unidos Núm. 5.821.337). Este anticuerpo recibió la aprobación de comercialización en 1998 para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores expresan en exceso la proteína ErbB2. Preferiblemente, dicho anticuerpo dirigido contra Her2 es trastuzumab y corresponde respectivamente a las secuencias presentadas en las siguientes tablas para las Regiones Variables de Cadena Pesada (HCVR; SEQ ID NO: 39 a 45), y para Regiones Variables de Cadena Ligera (LCVR; SEQ ID NO: 46 a 51).

Anti-Her2 (trastuzumab) Cadena Pesada Variable:

Anti-Her2 (trastuzumab) Cadena Ligera Variable (cadena k):

Más preferiblemente, la secuencia de CH1 y de la bisagra de trastuzumab corresponde a SEQ ID NO: 38.

GD2 es un disialogangliósido expresado en tumores de origen en el neuroectodermo, incluidos el neuroblastoma y el melanoma. En cuanto a los anticuerpos dirigidos contra GD2, para obtener sus correspondientes Regiones Variables de Cadena Ligera y Pesada (LCVR y HCVR) específicas de GD2, se pueden citar los anticuerpos monoclonales IgG3 murinos 3F8 y 14.18, o el anticuerpo monoclonal quimérico anti-GD2 ch14.18 (formado por la región variable del anticuerpo anti-GD2 murino 14.18 y la región constante de la IgG1 humana), que se han utilizado en el tratamiento del neuroblastoma, o el anticuerpo monoclonal IgG3 murino 8B6, que es específico de la forma O-acetilada de GD2 (Solicitud de patente internacional PCT WO 2008/043777). Preferiblemente, dicho anticuerpo dirigido contra GD2 es ch14.18 y corresponde respectivamente a las secuencias presentadas en las siguientes tablas para las Regiones Variables de Cadena Pesada (HCVR; SEQ ID NO: 52 a 57) y para las Regiones Variables de Cadena Ligera (LCVR; SEQ ID NO: 58 a 63).

Anti-GD2 (ch14.18) Cadena Pesada Variable:

Anti-GD2 (ch14.18) Cadena Ligera Variable (cadena k):

Más preferiblemente, la secuencia de CH1 y de la de ch14.18 corresponde a SEQ ID NO: 38.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno tumoral" también se puede referir a una neovascularización tumoral o a un antígeno de matriz extracelular tumoral.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno relacionado con la neovascularización del tumor" se refiere a un antígeno que es expresado por los vasos sanguíneos neo-sintetizados presentes en el tumor.

Como ejemplo de tal antígeno, se pueden citar los dominios EDA y EDB de fibronectina, endosalina/TEM1, Endoglina/105, PSMA o B7-H4.

Como se emplea en la presente memoria, un "antígeno relacionado con la matriz extracelular del tumor" se refiere a un antígeno que se expresa en la matriz extracelular presente en el tumor.

Como ejemplo de tal antígeno, se puede citar el fragmento G45 de laminina-332 (ROUSSELLE et al., Cancer Research, vol.68 (8), pág: 2885-94, 2008).

El anticuerpo obtenido mediante el método de la invención comprende un dominio CH1y1 humano en donde un aminoácido ha sido sustituido por un resto de cisteína, preferiblemente en donde el aminoácido en la posición 133 o 134 es una cisteína, y más preferiblemente en donde el aminoácido en la posición 133 es una cisteína. La numeración de la región constante es la del índice UE como se establece en Kabat et al. (1991, NIH Publication Núm. 91-3242, Servicio Nacional de Información Técnica Springfield, VA). Como ejemplo, tal dominio CH1y1 humano mutado se refiere a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, en donde el resto de serina en la posición 133 ha sido sustituido por una cisteína. El resto de cisteína en la posición 133 o 134 de la secuencia de CH1 restaura un disulfuro unido entre la cadena ligera y la cadena pesada de los anticuerpos de la invención.

El anticuerpo obtenido por el método de la invención comprende un dominio CH1 de una IgG2, IgG3 o IgG4 humanas, preferiblemente dicho dominio es un dominio CH1 de una IgG3, tal como la secuencia SEQ ID NO: 2. Si bien el anticuerpo de la invención puede comprender un dominio bisagra de una IgG1 humana, también puede comprender un dominio bisagra humano, que es una bisagra de IgG1 humana mutada para restaurar el apareamiento típico de IgG, o que es un dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humanas o un derivado de las mismas.

Una "bisagra de IgG1 humana mutada para restaurar el emparejamiento de IgG típico" se refiere a un dominio bisagra de IgG 1, en donde el resto de cisteína en la quinta posición de su secuencia ha sido sustituido por otro resto, preferiblemente por una serina. De hecho, dicha mutación da como resultado la restauración de la estructura típica de IgG. Como ejemplo de tal derivado, se puede citar SEQ ID NO: 4.

Preferiblemente, la introducción de un resto de cisteína dentro de los anticuerpos de la invención por un dominio CH1 mutado de una IgG 1 humana que presenta un resto de cisteína en las posiciones 133 o 134 de su secuencia, o por un dominio CH1 de una IgG2, IgG3 o IgG4, no libera ningún grupo tiol libre previamente ligado a otro resto de cisteína.

Los anticuerpos obtenidos mediante el método de la invención abarcan productos inmunoconjugados.

Como se emplea en la presente memoria, el término "producto inmunoconjugado" se refiere a una molécula conjugada que comprende al menos un anticuerpo quimérico o un fragmento funcional del mismo, unido a una segunda molécula, preferiblemente un agente citotóxico o un radioisótopo. Preferiblemente, dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo se unen a dicha segunda molécula mediante enlace covalente.

En una realización, el anticuerpo obtenido mediante el método de la invención es un producto inmunoconjugado. En una realización particular, el anticuerpo obtenido mediante el método de la invención es un producto inmunoconjugado en donde dicho producto inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención o un fragmento funcional del mismo y un agente citotóxico.

En otra realización particular, el anticuerpo obtenido mediante el método de la invención es un producto inmunoconjugado en donde dicho producto inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención o un fragmento funcional del mismo y un radioisótopo.

Según un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que comprende al menos un anticuerpo obtenido mediante el método de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en terapia.

Dicha composición es particularmente útil para el tratamiento de cáncer, enfermedad autoinmune o infección.

Dicha composición puede estar en cualquier forma farmacéutica adecuada para su administración a un paciente, incluidas, entre otras, soluciones, suspensiones, polvos liofilizados, cápsulas y comprimidos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender adicionalmente cualquier diluyente, excipiente o auxiliar farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica de la invención se puede formular para inyección, p. ej. inyección local, administración transmucosa, inhalación, administración oral y más generalmente cualquier formulación que el experto en la técnica considere apropiada para lograr la terapia deseada.

El anticuerpo obtenido mediante el método de la invención está contenido en dicha composición farmacéutica en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido y a dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

Más específicamente, una dosis terapéuticamente eficaz representa una cantidad de un compuesto eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas del sujeto que padece cáncer o una infección.

Dependiendo de la aplicación pretendida, el anticuerpo quimérico de la invención puede comprender adicionalmente constituyentes adicionales. Como ejemplo, el anticuerpo quimérico de la invención puede corresponder a un producto inmunoconjugado.

También se describe un método para el tratamiento del cáncer o una infección que comprende la etapa de administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de la composición como se describe en la presente memoria, que comprende al menos un anticuerpo, o al menos un fragmento funcional del mismo como se describe en la presente memoria.

En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con una composición para su uso en un método para el tratamiento del cáncer.

Como se emplea en la presente memoria, el término "paciente" se refiere a un mamífero, preferiblemente a un ser humano.

Otras realizaciones y ventajas de la presente invención se ilustran en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

1 - Actividad pro-apoptótica del anticuerpo anti-OAcGD2 in vitro

En una primera etapa, el anticuerpo quimérico anti-OAcGD2, c8B6, se ha diseñado a partir de 8B6 sustituyendo sus regiones constantes por la de una IgG1,k humana. Sus secuencias están representadas en la figura 1 (SEq ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13).

La estructura de este anticuerpo comprende 2 enlaces disulfuro intramoleculares en cadena ligera (Cys23-Cys93 y Cys139-Cys199) y 4 enlaces disulfuro intramoleculares en cadena pesada (Cys22-Cys98, Cys146-Cys202, Cys263-Cys323 y Cys369-Cys427). Los restos de cisteína implicados en enlaces disulfuro intracadena se indican con una estrella (*). Toda la estructura está estabilizada por 3 enlaces disulfuro intermoleculares: la cadena ligera está conectada a la cadena pesada por un enlace disulfuro entre el último resto de cisteína de la cadena ligera y el resto de cisteína de la región de bisagra superior (Cys219-Cys 222), y las cadenas pesadas están conectadas por 2 enlaces disulfuro que conectan la cisteína en la bisagra central (Cys228-Cys228 y Cys231-Cys231). Los restos de cisteína implicados en los enlaces disulfuro entre cadenas se indican con una flecha (T).

La LCVR de 8B6 se clona NotI-KasI en un vector pEvi para fusionarse con el dominio CL de una IgG1 humana. El dominio de HCVR de 8B6 se clona NotI-NheI en un vector pEvi' para fusionarse con el dominio constante de la cadena pesada de una IgG1 humana.

En ese caso, las células CHO K1 son cotransfectadas por ambos vectores.

Después de la transfección, las células CHO K1 se mantienen en un medio sin suero durante varios días.

Cada día, el medio de cultivo se recolecta y se congela a -80°C. Se añade un nuevo medio a las células transfectadas hasta que la viabilidad celular es inferior a 70-80%.

Los medios de cultivo recolectados se combinan y el anticuerpo se purifica utilizando proteína A inmovilizada sobre una matriz de sefarosa.

La producción de c8B6 en CHO se analizó mediante electroforesis tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Los resultados han demostrado que en condiciones no reductoras, el anticuerpo c8B6 mostró una banda a 150 kD correspondiente al anticuerpo completo. Mientras que, en condiciones reductoras, se observó una banda a 50 kD para HC y una banda a 25 kD para LC. La filtración en gel en una columna SUPERDEX mostró un perfil de cromatograma con un pico principal (99,0% para el grado de pureza) a 12,3 ml correspondiente a 150 kD. Finalmente, el rendimiento de producción del c8B6 quimérico después de la purificación en una columna de proteína A fue de aproximadamente 315 mg/L de sobrenadante.

La unión del anticuerpo a su diana se confirmó mediante citometría de flujo en células IRM5 que expresan gangliósido GD2-O-acetilado. La unión fue revelada por un anti-IgG humana de cabra conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Estos experimentos han confirmado la funcionalidad de este anticuerpo, que se une a GD2-O-acetilado.

A continuación, se evaluó la citotoxicidad directa del anticuerpo c8B6 mediante ensayos MTT.

En estos ensayos, se incubaron 1 x 104 células IMR5 24 h a 37°C en una microplaca de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos de 80-0,15 pg/ml y se incubaron durante 24 h a 37°C. A continuación, se añadieron cincuenta pg de MTT a cada pocilio y se incubaron al menos 4 h a 37°C, antes de que las células se solubilizaran con SDS al 10% y se incubasen O.N. a 37°C. A continuación, se leyó la absorbancia a 570 y 650 nm. La absorbancia del producto a 650 nm se restó de la absorbancia a 570 nm (Abs570-Abs650) para calcular la conversión total de colorante. Cuatro pocillos de control con células tratadas con 20 pg de etopósido proporcionan el blanco para absorbancia proporcionando 0% de viabilidad. La inhibición de la viabilidad (%) se expresó como un porcentaje con respecto a las células no tratadas y cada valor se representa como media ± ETM por cuadruplicado.

Los resultados han demostrado que el anticuerpo c8B6 ha perdido la citotoxicidad directa de 8B6 después de la etapa de quimerización al pasar de dominios constantes de IgG3 murinos a dominios constantes de IgG1 humanos. Por otra parte, el anticuerpo perdió aún más las propiedades de cooperación de la IgG38B6 parental.

Finalmente, muchos experimentos que prueban diferentes formas de quimerización solo restauran poca actividad pro-apoptótica, y no se observó cooperación en la unión.

Sorprendentemente, las modificaciones específicas del dominio constante CH1 para la quimerización dan como resultado grandes cambios para la actividad pro-apoptótica.

Estos resultados se obtuvieron con los anticuerpos 301.14a, 301.14b, 301.15, 301.15b, 301.16, 301.17, 301.18, 301.19, 301.20 y 301.21 que se diseñaron sobre la base de las construcciones anteriores.

El anticuerpo 301.14a corresponde a un CH1^y1 humano mutado (mutación S133C subrayada) con el dominio Bisagra y1 humano como se representa en la figura 2 (SEQ ID NO: 14). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.14b corresponde a un CH1y1 humano mutado (mutación S133C subrayada) con un dominio Bisagra ^y1 humano mutado (mutación C222S subrayada) como se representa en la figura 3 (SEQ ID NO: 15). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.15 corresponde a un CH1y3 humano (que reemplaza a su primo CH1y1) con el dominio Bisagra Y1 humano como se representa en la figura 4 (SEQ ID NO: 16). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.15b corresponde a un CH1^y3 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con un dominio Bisagra Y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un residuo de serina, C222S) como se representa en la figura 9 (SEQ ID NO: 66). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y C^h3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 8).

El anticuerpo 301.16 corresponde a un CH1y1 humano mutado (mutación subrayada S133C) con el dominio Bisagra Y3 humano (en sustitución de su primo Bisagra y1) como se representa en la figura 5 (SEQ ID NO: 17). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.17 corresponde a un CH1^y3 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con el dominio Bisagra Y3 humano (que reemplaza a su primo Bisagra y1) como se representa en la figura 6 (SEQ ID NO: 18). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.18 corresponde a un CH1y1 humano mutado (mutación subrayada S133C) con un dominio Bisagra ^y3 humano acortado (17 aminoácidos) como se representa en la figura 7 (SEQ ID NO: 19). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.19 corresponde a un CH1^y3 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con un dominio Bisagra Y3 humano acortado (17 aminoácidos) como se representa en la figura 8 (SEQ ID NO: 20). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 11) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 10).

El anticuerpo 301.20 corresponde a un CH1^y2 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con el dominio Bisagra Y1 humano como se representa en la figura 10 (SEQ ID NO: 23). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 8).

El anticuerpo 301.21 corresponde a un CH1^y4 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con el dominio Bisagra Y1 humano como se representa en la figura 11 (SEQ ID NO: 24). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 8).

El control muIgG3 corresponde a una IgG38B6 murina, en donde CH1 de IgG3 corresponde a SEQ ID NO: 64, en donde el resto de cisteína en la posición 134 está sustituido por un resto de serina y el resto de serina en la posición 224 está sustituido por un resto de cisteína.

La unión de dichos anticuerpos al gangliósido GD2-O-acetilado se confirmó como anteriormente.

A continuación, se determinaron las actividades pro-apoptóticas potenciales de dichos anticuerpos como se mencionó anteriormente.

Los resultados se resumen en las siguientes tablas, donde el porcentaje de lisis es el obtenido para una concentración de anticuerpo de 80 pg/ml.

Citotoxicidad directa de anticuerpos anti-OacGD2301.14a, 301.14b, 301.15, 301.16, 301.17, 301.18 y 301.19 sobre células IMR5:

Los resultados muestran que, inesperadamente, los anticuerpos quiméricos que comprenden un CH1y15 humano mutado o un CH1y3 humano tienen una actividad pro-apoptótica, lo que significa que la pérdida de citotoxicidad directa podría deberse a la estructura de la IgG1 humana. Por otra parte, todos estos anticuerpos muestran una CE⁵⁰mayor que la del anticuerpo inicial 8B6.

Los resultados también han demostrado que la construcción que produjo el efecto citotóxico más alto en términos de % de lisis máximo corresponde (i) a la fusión de CH1 ^y3 humano y Bisagra ^y1 humana (construcción 301.15) o (ii) a la fusión de CH1 y1 humano (mutada en S133C) o CH1 y3 humano y bisagra humana y3 acortada (construcciones 301.18 y 301.19). Para estos 2 últimos, se observó un aumento de afinidad en comparación con el c8B6 original. Finalmente, y todavía sorprendentemente, el anticuerpo 301.15 fue el único que presentó un perfil agregante en las curvas de competición correspondientes a una cooperatividad de unión restaurada.

Citotoxicidad directa de anticuerpos anti-OacGD2301.15b, 301.20 y 301.21 sobre células IMR5, SUM159PT y H187:

Los resultados muestran que, inesperadamente, los anticuerpos quiméricos que comprenden un CH1^y2 o CH1^y4 humano tienen una actividad pro-apoptótica sobre las células IMR5, lo que significa que la pérdida de citotoxicidad directa podría deberse a la estructura de la IgGI humana. Por otra parte, los anticuerpos quiméricos que comprenden un CH1 ^y3 humano y un dominio Bisagra ^y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un resto de serina, C222S) tienen una actividad pro-apoptótica sobre células IMR5. Los resultados también han demostrado que las construcciones correspondientes a la fusión de CH1 ^y1 humano (mutado en S133C) y un dominio Bisagra y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un resto de serina, C222S) (construcción 301.14b) o la fusión de CH1 y3 humano y Bisagra y1 humana (construcción 301.15) tiene actividad pro-apoptótica sobre células SUM159PT y H187.

La citotoxicidad directa de los anticuerpos 301.14b y 301.15 también se evaluó mediante ensayo con yoduro de propidio.

En este ensayo, se sembraron 150.000 células IMR5 en placas de 24 pocillos durante 24 h a 37°C y a continuación se trataron durante 24 h a 37°C con 40 pg/ml de cada anticuerpo. Después, las células muertas se marcaron con yoduro de propidio (12,5 pg/ml). Todas las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en un LSRII FACS (BECTON DICKINSON).

Los resultados se resumen en la siguiente tabla y se ilustran en la figura 12.

Los resultados confirmaron que las construcciones correspondientes a la fusión de CH1 ^y1 humano (mutado en S133C) y un dominio Bisagra y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un resto de serina, C222S) (construcción 301.14b) o la fusión de El CH1 y3 humano y la Bisagra y1 humana (construcción 301.15) tienen actividad pro-apoptótica sobre las células IMR5. Simultáneamente, los resultados confirman que una mutación en la IgG38B6 murina para imitar la estructura de IgG1 da como resultado una pérdida de actividad pro-apoptótica.

La reconstitución del emparejamiento entre CH1 y la cadena ligera, típico de los anticuerpos distintos de IgG1, podría restaurar la actividad pro-apoptótica. Tal reconstitución se podría obtener restaurando la cisteína CH1 típica de subclases que no son IgG1 o sustituyendo un dominio CH1 que no es de IgG1.

En conclusión, los autores de la presente invención logran la quimerización del anticuerpo 8B6 con una actividad pro-apoptótica mantenida, cuya actividad pro-apoptótica incluso aumenta para dos anticuerpos, uno de los cuales muestra también una unión cooperativa como anticuerpo original.

2 - Actividad pro-apoptótica del anticuerpo anti-GD2 in vitro

La citotoxicidad directa del anticuerpo ch14.18 se evaluó mediante ensayos MTT

En estos ensayos, se incubaron 1 x 104 células IMR5 (100 pl) en una microplaca de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Se añadieron anticuerpos de 80 a 0,15 pg/ml en 50 pl de medio y se incubaron 24 horas a 37°C. Se añadieron 50 pg de MTT y se incubaron 4 h a 37°C, las células se solubilizaron y después se realizó la lectura nocturna de la absorbancia a 570 y 650 nm. La absorbancia del producto a 650 nm se restó de la absorbancia a 570 nm (Abs570-Abs650) para calcular la conversión total de colorante. Cuatro pocillos de control con células tratadas con 20 pg de etopósido proporcionan el blanco para la absorbancia proporcionando 0% de viabilidad. La inhibición de la viabilidad (%) se expresó como porcentaje con respecto a las células no tratadas. Los resultados, obtenidos con los anticuerpos 311.14b y 311.15, se resumen en las siguientes tablas, en donde el porcentaje de lisis es el obtenido para la concentración de anticuerpos de 80 pg/ml.

El anticuerpo 311.14b corresponde a un CH1y1 humano mutado (mutación subrayada S133C) con un dominio Bisagra ^y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un resto de serina, C222S) como se representa en la figura 3 (SEQ ID NO: 15). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 8).

El anticuerpo 311.15 corresponde a un CH1^y3 humano (que reemplaza a su primo CH1^y1) con el dominio Bisagra Y1 humano como se representa en la figura 4 (SEQ ID NO: 16). Los otros dominios constantes corresponden a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 (SEQ ID NO: 9) y el dominio CL kappa (SEQ ID NO: 8).

Citotoxicidad directa de los anticuerpos anti-GD2311.14b y 311.15 sobre células IMR5:

Los resultados muestran que, inesperadamente, los anticuerpos quiméricos que comprenden un CH1y15 humano mutado o un CH1^y3 humano, tienen una actividad pro-apoptótica, lo que significa que la pérdida de citotoxicidad directa podría deberse a la estructura de IgG1 humana. Por otra parte, todos estos anticuerpos muestran una CE⁵⁰similar a la del anticuerpo inicial 14.18.

También se evaluó la citotoxicidad directa de los anticuerpos 311.14b y 311.15 mediante ensayo con yoduro de propidio.

En este ensayo, se sembraron 150.000 células IMR5 en placas de 24 pocillos durante 24 h a 37°C y después se trataron durante 24 h a 37°C con 40 pg/ml de cada anticuerpo. Posteriormente, las células muertas se marcaron con yoduro de propidio (12,5 pg/ml). Todas las muestras se analizaron mediante citometría de flujo en un LSRII FACS (Becton Dickinson, San José, CA, EE.UU.).

Los resultados se resumen en la siguiente tabla y se ilustran en la figura 13.

Los resultados confirmaron que las construcciones correspondientes a la fusión de CH1 y1 humano (mutado en S133C) y un dominio Bisagra ^y1 humano mutado (mutación subrayada correspondiente a la sustitución de la cisteína 222 por un resto de serina, C222S) (construcción 311.14b) o la fusión de El CH1 ^y3 humano y la Bisagra ^y1 humana (construcción 311.15) tienen actividad pro-apoptótica sobre las células IMR5.

En conclusión, los autores de la presente invención logran la quimerización del anticuerpo 14.18 con una actividad pro-apoptótica mantenida, cuya actividad pro-apoptótica incluso aumenta para dos anticuerpos, uno de los cuales muestra también una unión cooperativa como el anticuerpo original.

3 - Eficacia del anticuerpo anti-OAcGD2 in vivo

Modelo de neuroblastoma murino

Se adquirieron ratones NOD/SCID, 5 semanas de edad, de Charles River (L'Arbresle, Francia).

Los tumores IMR5 de neuroblastoma humano se cultivaron en ratones NOD-SCID inmunodeficientes. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea células tumorales (1 x 106 células IMR5) en el flanco derecho. Se midió el crecimiento tumoral subcutáneo después de la implantación del tumor utilizando la fórmula [Volumen mm3 = (largo) x (ancho2) x 0,5]. En los ratones NOD/SCID portadores de neuroblastoma humano lMR5, el anticuerpo (500 microg/ratón) se administró i.v. cuando el volumen tumoral era igual a 0,1 cm3.

Los ratones recibieron mAb 8B6 (muIgG3), o mAb c.8B6 (huIgG1), o mAb huIgG1 doblemente mutado, o CH1 huIgG1 sustituido por CH1 huIgG3.

4 - Eficacia del anticuerpo anti-GD2 in vivo

Modelo de neuroblastoma murino

Se adquirieron ratones NOD/SCID, de 5 semanas de edad, de CHARLES RIVER (L'Arbresle, Francia).

Los tumores IMR5 de neuroblastoma humano se cultivaron en ratones NOD-SCID inmunodeficientes. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea células tumorales (1 x 106 células IMR5) en el flanco derecho. Se midió el crecimiento del tumor subcutáneo después de la implantación del tumor utilizando la fórmula [Volumen mm3 = (largo) x (ancho2) x 0,5]. En los ratones NOD/SCID portadores de neuroblastoma humano IMR5, el anticuerpo (500 microg/ratón) se administró i.v. cuando el volumen tumoral era igual a 0,1 cm3.

Los ratones recibieron mAb 14.18 (muIgG3), o mAb ch 14.18 (huIgG1), o mAb huIgG1 doblemente mutado, o CH1 huIgG1 sustituido por CH1 huIgG3.

5 - Eficacia del anticuerpo anti-CD20 in vivo

Modelo de linfoma murino

Los tumores Raji del linfoma de Burkitt humano se cultivaron en ratones NOD-SCID inmunodeficientes. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea células tumorales (1 x 107 células Raji) en el flanco derecho. Se midió el crecimiento tumoral subcutáneo después de la implantación del tumor utilizando la fórmula [Volumen mm3 = (largo) x (ancho2) x 0,5]. En los ratones NOD/SCID portadores de linfoma humano Raji, el anticuerpo (500 microg/ratón) se administró i.v. cuando el volumen tumoral era igual a 0,1 cm3.

Los ratones recibieron mAb chIgG1 rituximab, o mAb chIgG1 doblemente mutado, o mAb chIgG1 con CH1 huIgG1 sustituido por CH1 huIgG3.

6 - Eficacia del anticuerpo anti-HER2 (Trastuzumab) in vivo

Modelo de mama murino

Los tumores de mama humana SKBR-3 se cultivaron en ratones NOD-SCID inmunodeficientes. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea células tumorales (2 x 106 células SKBR-3) en el flanco derecho. Se midió el crecimiento del tumor subcutáneo después de la implantación del tumor utilizando la fórmula [Volumen mm3 = (largo) x (ancho2) x 0,5]. En los ratones NOD/SCID que portaban tumor de mama humano SKBR-3, se administró el anticuerpo (500 microg/ratón) i.v. cuando el volumen tumoral era igual a 0,1 cm3.

Los ratones recibieron mAb IgG1 humanizado con trastuzumab, o mAb IgG1 humanizado doblemente mutado, o mAb IgG1 humanizado con CH1 huIgG1 sustituido por CH1 huIgG3.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar la actividad pro-apoptótica de un anticuerpo de inmunoglobulina G de clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado que ha perdido su actividad pro-apoptótica en el proceso de quimerización y que se une específicamente a un antígeno de gangliósido con la condición de que dicho gangliósido no corresponda a GD2-O-acetilado, comprendiendo dicho método la etapa de mutar el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, de acuerdo con el índice EU según lo establecido en Kabat et al., del dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, para restablecer el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, o sustituyendo el dominio CH1y1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1y3) o IgG4 (CH1y4) humanas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende la etapa de mutar el dominio CH1 y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat et al., del dominio CH1 y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, para restaurar el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dicha etapa de mutación se refiere a un dominio CH1^y1 humano en donde el aminoácido en la posición 133, de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat et al., ha sido sustituido por un resto de cisteína.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de mutación del dominio CH1^y1 humano de dicho anticuerpo sustituyendo el aminoácido en la posición 133 o 134, de acuerdo con el índice EU como se establece en Kabat et al., del dominio CH1 ^y1 humano de dicho anticuerpo por un resto de cisteína, para restablecer el emparejamiento entre los dominios CH1 y CL que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se realiza por medio de:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio CH1 de un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG 1) quimérico o humanizado, codificando preferentemente dicha secuencia de ácido nucleico la cadena pesada del anticuerpo;

b) mutación del codón que codifica la posición 133 o 134 de dicho dominio CH1 para codificar el resto de aminoácido cisteína (C) para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende la etapa de sustituir dicho dominio CH1^y1 humano por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1y2), IgG3 (CH1y3) o IgG4 (CH1y4) humanas.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la etapa de sustituir el dominio CH1 y1 humano de dicho anticuerpo por el dominio CH1 de una IgG2 (CH1 ^y2), IgG3 (CH1 ^y3) o IgG4 (CH1 ^y4) humanas se realiza por medio de:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio CH1 de un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado, codificando preferentemente dicha secuencia de ácido nucleico la cadena pesada del anticuerpo;

b) sustitución de dicha secuencia de ácido nucleico CH1 ^y1 por una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio CH1 de una IgG2 (CH1^y2), IgG3 (CH1^y3) o IgG4 (CH1^y4) humanas para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

d) expresión conjunta del ácido nucleico mutado con una secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo en un anfitrión adecuado, proporcionando de ese modo un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado mutado; y

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método comprende adicionalmente la etapa de mutar el dominio IgG1 de bisagra humana de dicho anticuerpo, para restaurar el emparejamiento entre la bisagra y el dominio CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, o de sustituir dicho dominio bisagra de IgG1 humana por el dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humana o un dominio bisagra truncado de una IgG3 humana que tiene una secuencia SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9.

8. El método de la reivindicación 7, en donde dicha etapa de mutación del dominio bisagra humano de dicho anticuerpo, para restaurar el emparejamiento entre la bisagra y el dominio CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se realiza sustituyendo el resto de cisteína en la quinta posición de su secuencia por otro resto, preferiblemente por una serina.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la etapa de mutación del dominio bisagra humano de dicho anticuerpo, para restaurar el emparejamiento entre el dominio bisagra y CH2 que es típico de las subclases IgG2, IgG3 e IgG4 humanas, se realiza por medio de:

a) aislamiento de una secuencia de ácido nucleico que comprende el dominio bisagra de un anticuerpo de inmunoglobulina G clase 1 (IgG1) quimérico o humanizado, codificando preferible dicha secuencia de ácido nucleico la cadena pesada del anticuerpo;

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

10. El método de la reivindicación 8, en donde la etapa de sustitución del dominio bisagra de IgG1 humana de dicho anticuerpo, por el dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humana o un dominio bisagra truncado de una IgG3 humana que tiene una secuencia SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9, se realiza por medio de:

b) sustitución de dicha secuencia de ácido nucleico del dominio bisagra de IgG1 por una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio bisagra de una IgG2, IgG3, IgG4 humana o un dominio bisagra truncado de una IgG3 humana que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6, 7, 8 o 9 para proporcionar una secuencia de ácido nucleico mutada;

e) opcionalmente, aislamiento del anticuerpo mutado.

11. Una composición que comprende al menos un anticuerpo obtenido mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la reivindicación 11, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer.