CN114729058A - IgG抗体组合物和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了抗体、重组蛋白和其使用方法，所述抗体包含例如免疫球蛋白G(IgG)抗体和重组蛋白，所述IgG抗体包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。此外，本文尤其提供了免疫球蛋白G(IgG)抗体和重组蛋白，所述IgG抗体包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，并且其中与野生型Fc相比，所述Fc区对配体具有更高的亲和力。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月23日提交的美国临时申请第62/891,200号的优先权权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
就联邦资助的研究和开发中的发明权利的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的合同第P01CA163205号的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含创建于2020年8月21日并作为命名为048440-730001WO_SL.ST25.txt的ASCII文件以电子方式提交的序列表，所述序列表为848千字节并且整体并入本文。
背景技术
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)代表了在适应性免疫或治疗性单克隆抗体(mAb)输注后免疫细胞识别和清除病原体或肿瘤细胞的主要机制。自然杀伤(NK)细胞是ADCC的主要效应子，并且表达低亲和力的Fcγ受体FcγRIIIA/CD16α(以下简称CD16α)。然而，人血中的内源性IgG的浓度为30-10μM，比CD16α-IgG相互作用的解离常数(Kd)高大约100倍。事实上，在这里提供的证据证明，人NK细胞天然被内源性IgG涂覆，其过量会竞争性地抑制如瑞图宣(Rituxan)等治疗性mAb结合CD16α并诱导ADCC。
IdeS是一种源自化脓性链球菌的内肽酶，并且其在IgG重链的下部铰链区的Gly249处特异性切割，所述下部铰链区是CD16α结合所必需的区域。IgG的IdeS切割使消除IgG与FcγR结合，并且因此，其从NK细胞表面释放，释放了FcγR的结合位点。在过去的临床试验中，IdeS已安全地输注到患者中，并且已在这些患者中证明了IgG的切割(Jordan等人)。仍然需要改进的癌症治疗性抗体。
本文提供了尤其是对本领域中的这些和其它问题的解决方案。
发明内容
本文描述了一种增强治疗性mAb的功效的策略，所述策略涉及(1)使mAb对IdeS具有抗性，以及(2)使用IdeS去除内源性IgG与FcγR的结合。本文所描述的体外数据证明，CD16α+NK细胞、单核细胞和巨噬细胞(CD16α和CD32α)以及粒细胞(CD64)上的FcγR结合位点的这种另外的可用性使治疗性mAb的结合更加丰富，并且因此通过ADCC提高了治疗性mAb对肿瘤细胞靶标或其它相关靶标的功效。
一方面，本文提供了一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。
一方面，本文提供了免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述抗体包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，并且其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
一方面，本文提供了重组蛋白，其包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。
一方面，本文提供了重组蛋白，其包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
一方面，本文提供了编码本文所描述的重组蛋白的分离的核酸。
一方面，本文提供了表达载体，所述表达载体包含编码本文所描述的重组蛋白的分离的核酸。
一方面，本文提供了细胞，所述细胞包含本文所描述的表达载体。
一方面，本文提供了抗CD20抗体，其包含具有如图14所示的CDR变体的抗体。
一方面，本文提供了将配体与CHO细胞表面重组蛋白结合的方法，所述方法包含使配体与CHO细胞表面重组蛋白接触，其中所述CHO细胞表面重组蛋白包含表皮生长因子受体(EGFR)跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体。所述EGFR跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，所述IgG抗体能够结合配体，并且所述CHO细胞表面蛋白对IgG特异性蛋白酶的切割具有抗性或对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力。
一方面，本文提供了治疗患者的癌症的方法，所述方法包含施用治疗性IgG抗体和IgG特异性蛋白酶，其中所述治疗性IgG抗体对所述IgG特异性蛋白酶具有抗性。
附图说明
图1示意性地展示了人免疫细胞被内源性IgG天然涂覆，这防止了治疗性mAb与人免疫细胞的表面上表达的FcγR之间的相互作用。因此，这限制了治疗性mAb与FcγR的结合，从而限制了治疗性mAb的功效。
图2提供了流式细胞仪数据，证明人NK细胞被IgG分子天然涂覆，其可以通过与IdeS酶一起温育来去除。人外周血单核细胞(PBMC)在37℃下用IdeS消化持续30分钟，并用针对谱系标志物或针对人IgG Fc的抗体染色。注意CD3+T细胞不表达FcγR，并且因此在任何条件下都不与结合人IgG。
图3示意性地展示了用于增强mAb治疗效率的策略。图(a)示出了免疫细胞上的FcγR通常被内源性IgG占据；图(b)和(c)示出了IdeS消化可以去除内源性IgG并释放输注治疗性mAb的FcγR结合位点，所述治疗性mAb被工程化为对IdeS具有抗性并保留FcγR结合功能；(图(c)和(d))；输注的治疗性mAb可以首先结合到未经占据的FcγR上，如图(c)所示，或者可以首先结合在癌细胞上表达的肿瘤相关抗原，如图(d)所示。无论如何，一旦抗原-mAb-FcγR交联，FcγR+细胞就会经历免疫激活，如图(f)所示。流程图展示了未被占据并且因此可用于结合治疗性mAb的FcγR越多，消除的肿瘤细胞就越多(图(e))。
图4A-4E展示了在不存在或存在IgG特异性蛋白酶(IdeS或IdeZ肽酶)的情况下，各种功能性IgG蛋白在GFP+中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上的展示的流式细胞仪密度图。灰点代表用对照处理的CHO细胞，并且黑点代表用IdeS或IdeZ肽酶处理的CHO细胞，切割IgG铰链区的IgG特异性蛋白酶防止IgG分子与Fc-γ受体结合。图4A定量了识别IgG的Fab部分的mAb与不具有Fab部分的IgG1Fc-EGFR(顶部)或利妥昔单抗-EGFR(底部)结合的能力。图4B定量了识别IgG的Fc部分的mAb与IgG1Fc-EGFR(顶部)或利妥昔单抗-EGFR(底部)结合的能力；重要的是，这种特定的多克隆mAb识别未被IdeS或IdeZ切割的区域，因此没有观察到切割。图4C定量了可溶性CD64(FcγRI)与IgG1Fc-EGFR(顶部)或利妥昔单抗-EGFR(底部)结合的能力；图4D定量了可溶性CD32a(FcγRIIa)与IgG1Fc-EGFR(顶部)或利妥昔单抗-EGFR(底部)结合的能力；图4E定量了可溶性CD16a(FcγRIIIa)与IgG1Fc-EGFR(顶部)或利妥昔单抗-EGFR(底部)结合的能力。
图5展示了IgG1Fc的新下部铰链的产生，所述新下部铰链具有增强的对CD16α的结合亲和力和对IdeS和IdeZ切割的抗性。以逐步方式将氨基酸(AA)添加到不结合CD16α的IgG1Δ16(SEQ ID NO:16)的N末端。通过逐步连接更多个氨基酸以增加结合亲和力来选择获得CD16α结合的克隆。
图6A-B展示了通过在IgG1FcΔ16的N末端顺序添加氨基酸(AA)来逐步获得CD16α结合。图6A示出了人IgG1FcΔ16与EGFR跨膜螺旋结构域融合并在CHO细胞表面上展示为1型膜蛋白的各种事务的结合亲和力。图6B示出了添加更多个AA时所有阳性克隆的单独的图。
图7示出了从用利妥昔单抗-EGFR转染的CHO细胞收集的数据。利妥昔单抗的铰链区由野生型(WT)铰链(ELLGGPS；SEQ ID NO:544)或两个从头IdeS/IdeZ抗性铰链之一：EETCWDW构成，其对FcγR CD16α的亲和力高于WT或EDSCWDW，其对FcγR CD16α的亲和力低于WT。
图8示出了各种FcγR对表达利妥昔单抗的CHO细胞的结合亲和力，所述利妥昔单抗的铰链部分是WT(ELLGGPS；SEQ ID NO:544)或已经使用本文所描述的和图7所示的方法用新的从头铰链区变体(EETCWDW，SEQ ID NO:545；或EDSCWDW，SEQ ID NO:546)进行工程化。使用如Y轴所指示的荧光标记的FcγR胞外域和X轴上的荧光标记的抗人Fc抗体对所得的各种FcγR的表面IgG表达和结合亲和力进行定量。每个直方图的左上象限指示了对每个铰链部分的FcγR结合亲和力。
图9提供了展示新型铰链区(EETCWDW)对IdeS/IdeZ的切割的抗性的代表性实例。当用荧光标记的抗人Fc抗体染色时，与IdeZ预温育的WT利妥昔单抗不再能够在CD20(+)Daudi淋巴瘤细胞的表面上检测到(左直方图，虚线)，而EETCWDW利妥昔单抗仍然可以检测到(右直方图，虚线)。
图10示出了用曲妥珠单抗-EGFR转染的CHO细胞。曲妥珠单抗含有其野生型(WT)铰链部分或两个从头新铰链部分EETCWDW或EDSCWDW之一，所述新铰链部分被工程化为使用本文所描述的用于利妥昔单抗的相同方法替换曲妥珠单抗的WT铰链区。使用如Y轴所指示的荧光标记的FcγR胞外域和X轴上的荧光标记的抗人Fc抗体对所得的各种FcγR的表面IgG表达和结合亲和力进行定量。每个直方图的左上象限指示了对每个铰链部分的FcγR结合亲和力。
图11A-C展示了利妥昔单抗变体的活性。图11A-B示出了比较WT利妥昔单抗和“EETCWDW利妥昔单抗”在自然杀伤(NK)细胞激活中的代表性数据，并且图11C示出了在B细胞的NK细胞消耗中比较WT利妥昔单抗和“EETCWDW利妥昔单抗”的代表性数据。这些实验是在10小时的过程内，在没有(“对照”)或有IdeZ(“IdeZ”)的情况下在人全血体外进行的。IdeZ去除了先天免疫细胞(如NK细胞、单核细胞和粒细胞)上与FcγR(如CD16α)结合的内源性IgG。
图12展示了血液中增加的AB血清浓度(并因此增加内源性IgG的浓度)如何与EETCWDW利妥昔单抗竞争结合NK细胞FcγRIIIA(CD16α)，从而减少NK细胞激活。
图13是展示了在CHO细胞的表面上作为利妥昔单抗-EGFR融合蛋白表达的利妥昔单抗的数据。X轴示出了可以与表达IgG1-EGFR或利妥昔单抗-EGFR的CHO细胞结合的荧光标记的抗Fc mAb。Y轴示出了可以与利妥昔单抗-EGFR结合的荧光标记CD20分子。在左侧直方图中，CHO细胞表达IgG1 Fc-EGFR，因此在X轴上结合但在Y轴上不结合。中间直方图表示利妥昔单抗-EGFR，并定量了利妥昔单抗对CD20的亲和力。右侧的直方图示出了荧光标记的CD20分子与利妥昔单抗(线A)或与和实际利妥昔单抗相比对CD20具有更高亲和力的利妥昔单抗的假设变体(线B)或与和实际利妥昔单抗相比对CD20具有更低亲和力的利妥昔单抗的假设变体(线C)的结合。右图示出了CHO细胞的表面上Fc的CH2-CH3片段的表达，因此没有与人荧光标记的CD20分子结合。
图14展示了序列依赖性利妥昔单抗靶选择和对应序列的流式细胞术密度图。代表性的实例示出了来自由CD20结合变体组成的利妥昔单抗文库的多个克隆，以及每个变体与荧光标记的CD20分子的结合亲和力的流式细胞术测量结果，如图13所展示。
图15展示了通过单个氨基酸取代逐渐获得IdeS抗性。
图16展示了野生型、L248E和L248D铰链突变体利妥昔单抗与人FcγR的结合。利妥昔单抗的野生型或单一氨基酸突变体(L248E和L248E)作为I型膜蛋白在CHO细胞上表达，并使用荧光标记的抗人Fc和不同的人FcγR胞外域测试其表达和与人FcγR的结合。
具体实施方式
I.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本说明书和以下权利要求书中，将参考多个术语，所述多个术语应被定义为具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”根据其一般和普通的含义使用并且是指由特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其功能片段编码的多肽。识别的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，这进而分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。术语“抗体”还包含二价或双特异性分子、双体、三体和四体。
如本文所用，当提及蛋白质或肽时，术语“特异性(或选择性地)结合”或“特异性(或选择性地)与蛋白质或肽具有免疫反应性”根据其一般和普通的含义使用并且是指确定蛋白质存在的结合反应，通常在蛋白质和其它生物制品的异质群体中。因此，在指定免疫测定条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合是背景的至少两倍，并且更通常是背景的10-100倍以上。在这种条件下与抗体的特异性结合需要选择对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，可选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原而不与其它蛋白质发生特异性免疫反应的抗体的子集。这一选择可以通过减去与其它分子交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如，Harlow和Lane,《使用抗体，实验室手册(Using Antibodies,A Laboratory Manual)》(1998)，以描述可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定方式和条件)。
免疫球蛋白(抗体)结构单元的实例包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的N末端限定了约100个到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语“可变重链”、“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包含Fv、scFv、dsFv或Fab；而术语“可变轻链”、“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包含Fv、scFv、dsFv或Fab。
抗体功能片段的实例包含但不限于完整抗体分子、抗体片段，如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2'以及这些的任何组合或能够结合至靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其它功能部分(参见例如，《基础免疫学(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY)》(Paul编辑,第4版2001)。如本领域技术人员所理解的，可以通过多种方法获得各种抗体片段，例如用酶(如胃蛋白酶)消化完整抗体；或从头合成。抗体片段通常通过化学方法或使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体包含通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段。
如本文所用，术语“嵌合抗体”根据其一般和普通的含义使用并且是指抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变的类、效应功能和/或物种、或赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等的恒定区；或(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。本发明的并且用于根据本发明使用的优选抗体包含人源化和/或嵌合单克隆抗体。
如本文所用，术语“治疗性抗体”根据其一般和普通的含义使用并且是指可用于治疗疾病的抗体。治疗性抗体可以激活、抑制或改变对特定细胞或分子的内源性免疫应答。在实施例中，治疗性抗体是可用于治疗癌症、炎性和/或自身免疫性疾病的抗体。在实施例中，治疗性抗体是可用于治疗癌症的抗体。在实施例中，治疗性抗体是IgG抗体并且此类实施例可以被称为治疗性IgG或治疗性IgG抗体。治疗性抗体的实例包含阿昔单抗(Abciximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿仑单抗、阿利库单抗(Alirocumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、贝利单抗(Belimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)、本妥昔单抗(Brentuximab)、布罗达单抗(Brodalumab)、康纳单抗(Canakinumab)、卡罗单抗(Capromab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、达土木单抗(Daratumumab)、地诺单抗(Denosumab)、达妥昔单抗(Dinutuximab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)、依库珠单抗(Eculizumab)、依法珠单抗(Efalizumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、法洛索单抗(Fanolesomab)、吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗(Golimumab)、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)、艾达赛珠单抗(Idarucizumab)、英西单抗(Imiciromab)、英利昔单抗(Infliximab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)、那他珠单抗(Natalizumab)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、纳武单抗(Nivolumab)、若莫单抗(Nofetumomab)、奥托昔单抗(Obiltoxaximab)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、奥瑞组单抗(Ocrelizumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉曲单抗(Olaratumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、瑞西巴库单抗(Raxibacumab)、瑞替珠单抗(Reslizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、沙妥莫单抗(Satumomab)、苏金单抗(Secukinumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、硫索单抗(Sulesomab)、托珠单抗(Tocilizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲妥珠单抗美坦新(Trastuzumab emtansine)、优特克单抗(Ustekinumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、沃洛尤单抗(Volocumab)和伏妥莫单抗(Votumumab)。
如本文所用，术语“利妥昔单抗”根据其一般和普通的含义使用并且是指由基因泰克公司(Genentech,Inc.)发明的靶向在B细胞的表面表达的CD20抗原的单克隆抗体治疗剂。其也以品牌名称瑞图宣(基因泰克公司)、瑞图宣Sc(霍夫曼-罗氏公司(Hoffman-LaRoche,Inc.))和生物仿制药Truixma(赛创科技(Celltiron)，瑟法隆公司(Cephalon,Inc.))著称。铰链区由Kabat编号表示为位置246-252，并且可替代地通过例如在US7317091中使用的编号表示为位置233-239。
如本文所用，术语“癌症”根据其一般和普通的含义使用并且是指在哺乳动物(例如，人)中发现的所有类型的癌症、肿瘤或恶性肿瘤，包含白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤。可以用本文所提供的化合物、组合物或方法治疗的癌症的实例包含脑癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、头部癌症、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)和非霍奇金氏淋巴瘤。另外的实例包含甲状腺癌、胆管癌、胰腺癌、皮肤恶性黑色素瘤、结肠腺癌、直肠腺癌、胃腺癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、浸润性乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、恶性胰腺岛瘤、恶性类癌、尿膀胱癌、癌变前皮肤损伤、睾丸癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroidcancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑色素瘤、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌或前列腺癌。
术语“白血病”根据其一般和普通的含义使用并且是指血液形成器官的渐进性、恶性疾病，并且总体上其特征在于白细胞及其前体在血液和骨髓中的失调增殖和发展。白血病通常在临床上基于以下进行分类：(1)急性病或慢性病的持续时间和特性；(2)所涉及的细胞的类型；髓样(骨髓性的)、淋巴样(淋巴性的)或单核细胞的；以及(3)异常细胞在血液中的数量的增加或非增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)。可以用本文所提供的化合物或方法治疗的白血病的实例包含例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血胚细胞白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成骨髓细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利氏白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、李德尔氏细胞白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病或未分化型细胞白血病。
“患者”或“有需要的受试者”根据其一般和普通的含义使用并且是指遭受或易于遭受可以通过施用如本文所提供的组合物、化合物或方法进行治疗的疾病或病状的活生物体。非限制性实例包含人、其它哺乳动物、牛科动物、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿和其它非哺乳动物。在一些实施例中，患者是人。在实施例中，所述受试者患有、患过或疑似患有癌症。
如本文所用，术语“对照”或“对照实验”根据其一般和普通的含义使用，并且是指其中如在平行实验中一样对实验的受试者或试剂进行处理的实验，不同之处在于省略了实验的程序、试剂或变量。在一些情况下，对照在评价实验效果时被用作比较的标准。在一些实施例中，对照是在不存在如本文(包含实施例和实例)所描述的化合物的情况下，蛋白质的活性的度量。
如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”根据其一般和普通的含义使用并且是指成功治疗或改善损伤、疾病、病理或病状的任何指标，包含任何客观或主观参数，如，消除；缓解；减轻症状或使得损伤、病理或病状对患者而言更易忍受；减缓退化或衰退的速度；或使退化的最终点较少衰退；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包含身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其缀合可以包含预防伤害、病理学、病状或疾病。在实施例中，治疗包含预防。在实施例中，治疗不包含预防。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”根据其一般和普通的含义使用并且是通过在比较窗口之上比较两个最佳比对的序列确定的，其中比较窗口中的多核苷酸序列或多肽序列的部分可以包括如相比于用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)的添加或缺失(即，间隙)。百分比通过以下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的总位置数并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
如本文所用，术语“相同”或“同一性”百分比根据其一般和普通的含义使用并且在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中是指如使用利用以下描述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的相同的或具有指定百分比的氨基酸残基的两个或更多个序列或相同的核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域之上针对最大对应性进行比较和比对时，在指定区域之上的约60％同一性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)(参见，例如，NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)。此类序列然后被称为“基本上相同”。此定义还涉及或可以应用于测试序列的互补物。所述定义还包含具有缺失和/或添加的序列，以及具有置换的序列。如下所述，优选的算法可以解释空位等。优选地，在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域之上，或更优选地在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域之上存在同一性。
如本文所用，术语“亲和力选择”或“亲和力成熟”根据其一般和普通的含义使用并且是指抗体通常通过一个或多个氨基酸残基的突变从参考抗体进化，以使对靶抗原的活性比对应形式的参考抗体对相同靶抗原的活性增加的过程。因此，与参考抗体相比，进化的抗体被优化。可以通过各种生物物理和体外方法来选择精制抗体。
如本文所用，术语“融合蛋白”根据其一般和普通的含义使用并且是指衍生自两种或更多种不同蛋白质或基因的共价连接的多肽链。
如本文所用，术语“CD16蛋白”或“CD16”或“FcγRIII”或“Fcγ受体III”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的受体CD16或分化簇16(CD16)或维持CD16活性(例如，与CD16相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的CD16蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，CD16蛋白与由UniProt参考编号P08637鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。在实施例中，CD16蛋白与由UniProt参考编号Q9ULV2鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。CD16是IgG Fc区的受体，并且介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文所用，术语“CD32蛋白”或“CD32”或“FcγRII”或“Fcγ受体II”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的受体CD32或分化簇32(CD32)或维持CD32活性(例如，与CD32相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的CD32蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，CD32蛋白与由UniProt参考编号P12318鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。在实施例中，CD32蛋白与由UniProt参考编号P31994鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。在实施例中，CD32蛋白与由UniProt参考编号P31995鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。CD32是复合或聚集IgG的Fc区的受体，介导B细胞活化、吞噬作用和免疫复合物的内吞作用。
如本文所用，术语“CD64蛋白”或“CD64”或“FcγRI”或“Fcγ受体I”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的受体CD64或分化簇64(CD64)或维持CD64活性(例如，与CD64相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的CD64蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，CD64蛋白与由UniProt参考编号P12314鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。在实施例中，CD64蛋白与由UniProt参考编号Q92637鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。在实施例中，CD64蛋白与由UniProt参考编号P30273鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。CD64是结合非复合免疫球蛋白的高亲和力受体。
如本文所用，术语“EGFR蛋白”或“EGFR”或“HER1”根据其一般和普通的含义使用并且是指在人中也被称为ErbB-1或HER1的重组或天然形式的表皮生长因子受体(EGFR)或维持EGFR活性(例如，与EGFR相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在EGFR蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，EGFR蛋白与由UniProt参考编号P00533鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。EGFR是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“PDGFR蛋白”或“PDGFR”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的血小板衍生生长因子受体(PDGFR)或维持PDGFR活性(例如，与PDGFR相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在EGFR蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，PDGFR蛋白质与由UniProt参考编号P16234鉴别的蛋白质PDGFR-α或与其基本上相同的变异体或同源物基本上相同。在实施例中，PDGFR蛋白与由UniProt参考编号P09619鉴定的蛋白质PDGFR-β或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。PDGFR是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“HER-2蛋白”或“HER2”或“人表皮生长因子受体2”或“受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB-2”或“ERBB2”或“原癌基因Neu”或“CD340”或“分化簇340”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的人表皮生长因子受体2(HER2)或维持HER2活性(例如，与HER2相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的HER2蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，HER2蛋白与由UniProt参考编号P04626鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。HER2是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“HER-3蛋白”或“HER3”或“人表皮生长因子受体3”或“受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB-3”或“ERBB3”或“原癌基因样蛋白c-ErbB-3”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的人表皮生长因子受体3(HER3)或维持HER3活性(例如，与HER3相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的HER3蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，HER3蛋白与由UniProt参考编号P21860鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。HER3是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“HER-4蛋白”或“HER4”或“人表皮生长因子受体4”或“受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB-4”或“ERBB4”或“原癌基因样蛋白c-ErbB-4”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的人表皮生长因子受体4(HER4)或维持HER4活性(例如，与HER4相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的HER4蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，HER4蛋白与由UniProt参考编号Q15303鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。HER4是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“FGFR-1蛋白”或“FGFR1”或“成纤维细胞生长因子受体1”或“碱性成纤维细胞生长因子受体”或“N-sam”或“原癌基因c-Fgr”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)或维持FGFR1活性(例如，与FGFR1相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的FGFR1蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，FGFR1蛋白与由UniProt参考编号P11362鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。FGFR1是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“FGFR-2蛋白”或“FGFR2”或“成纤维细胞生长因子受体2”或“角质形成细胞生长因子受体”或“K-sam”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)或维持FGFR2活性(例如，与FGFR2相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的FGFR2蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，FGFR2蛋白与由UniProt参考编号P21802鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。FGFR2是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“FGFR-3蛋白”或“FGFR3”或“成纤维细胞生长因子受体3”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)或维持FGFR3活性(例如，与FGFR3相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的FGFR3蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，FGFR3蛋白与由UniProt参考编号P22607鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。FGFR3是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“FGFR-4蛋白”或“FGFR4”或“成纤维细胞生长因子受体4”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)或维持FGFR4活性(例如，与FGFR4相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的FGFR4蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，FGFR4蛋白与由UniProt参考编号P22455鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。FGFR4是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“VEGFR-1蛋白”或“VEGFR1”或“血管内皮生长因子受体1”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)或维持VEGFR1活性(例如，与VEGFR1相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的VEGFR1蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，VEGFR1蛋白与由UniProt参考编号P17948鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。VEGFR1是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“VEGFR-2蛋白”或“VEGFR2”或“血管内皮生长因子受体2”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的血管内皮生长因子受体1(VEGFR2)或维持VEGFR2活性(例如，与VEGFR2相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的VEGFR2蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，VEGFR2蛋白与由UniProt参考编号P35968鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。VEGFR2是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“VEGFR-3蛋白”或“VEGFR3”或“血管内皮生长因子受体3”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的血管内皮生长因子受体1(VEGFR3)或维持VEGFR3活性(例如，与VEGFR3相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的VEGFR3蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，VEGFR3蛋白与由UniProt参考编号P35916鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。VEGFR3是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“NTRK1蛋白”或“NTRK1”或“Trk-A”或“高亲和力神经生长因子受体”或“神经营养酪氨酸激酶受体1型”或“原肌球蛋白相关激酶A”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的高亲和力神经生长因子受体(NTRK1)或维持NTRK1活性(例如，与NTRK1相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的NTKR1蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，NTKR1蛋白与由UniProt参考编号P04629鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。NTKR1是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“NTRK2蛋白”或“NTRK2”或“Trk-B”或“BDNF/NT-3生长因子受体”或“脑源性神经营养生长因子受体”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的癌基因BDNF/NT-3生长因子受体(NTRK2)或维持NTRK2活性(例如，与NTRK2相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的NTKR2蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，NTKR2蛋白与由UniProt参考编号Q16620鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。NTKR2是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“NTRK3蛋白”或“NTRK3”或“Trk-C”或“NT-3生长因子受体”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的NT-3生长因子受体(NTRK3)或维持NTRK3活性(例如，与NTRK3相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的NTKR3蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，NTKR3蛋白与由UniProt参考编号Q16628鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。NTKR3是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“IGF1R蛋白”或“IGF1R”或“胰岛素样生长因子受体”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的胰岛素样生长因子受体(IGF1R)或维持IGF1R活性(例如，与IGF1R相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的IGF1R蛋白相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，IGF1R蛋白与由UniProt参考编号P08069鉴定的蛋白质或与其基本上相同的变体或同源物基本上相同。IGF1R是受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“谷氨酰内肽酶V8”或“GluV8”或“SspA”或“内肽酶Glu-C”或“V8蛋白酶”或“葡萄球菌丝氨酸蛋白酶”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的SspA蛋白或维持SspA活性(例如，与SspA相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的SspA多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，SspA是由UniProt参考编号P0C1U8鉴定的蛋白质或是与其基本上相同的变体或同源物。SspA是优先地切割谷氨酸和天冬氨酸的羧基末端的肽键的丝氨酸蛋白酶。
如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”或“Ig-结构域”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在的形式的Ig-结构域或维持Ig-结构域折叠或三维结构的其变体或同源物中的任一种。Ig结构域属于蛋白质折叠家族，所述家族由排列成具有希腊键拓扑结构的两个β片层的7-9条反平行β链的2层夹层组成。折叠模式通常由(片层1中的N末端β-发夹)-(片层2中的β-发夹)-(片层1中的β链)-(片层2中的C末端β-发夹)键组成。免疫球蛋白结构域是抗体的主要组分，并且也是大量细胞外表面受体，包含受体酪氨酸激酶。
如本文所用，术语“免疫球蛋白G”或“IgG”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的IgG抗体蛋白或维持IgG活性(例如，与IgG相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的IgG多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。IgG抗体由四条单独的链(两条相同的轻链和两条相同的重链)构成，它们以典型的Y形四级结构形成异二聚体(一条轻链和一条重链间二硫键)的同源二聚体(通过重链间二硫键)。轻链包含可变免疫球蛋白结构域(VL)和恒定免疫球蛋白结构域(CL)。重链包含一个可变免疫球蛋白结构域(VH)和三个恒定免疫球蛋白结构域(CH1、CH2、CH3)。可变结构域形成IgG抗体的抗原识别表面。IgG有四个功能不同的亚类，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1介导针对多肽和蛋白质抗原的胸腺相关免疫应答。IgG2介导针对多糖或碳水化合物抗原的免疫应答。IgG3介导针对蛋白质和多肽抗原的高亲和力应答。IgG4在与食物过敏相关的应答中起作用，但其功能在很大程度上是未知的。
如本文所用，术语“Fc区”或“片段可结晶区”根据其一般和普通的含义使用并且是指任何重组或天然存在的形式的与被称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的尾端区(C末端)。Fc区包含抗体IgG、IgA和IgD中的两个重链恒定Ig结构域和抗体IgE和IgM中的三个重链恒定Ig结构域。
如本文所用，术语“Fab区”或“抗原结合片段区”根据其一般和普通的含义使用并且是指任何重组或天然存在的形式的含有抗原识别和结合位点的抗体的尾端区(N末端)。Fab区通常包含抗体IgG、IgA、IgD以及IgE和IgM中的轻链和重链两者的一个可变结构域和一个恒定结构域。
如本文所用，术语“铰链区”根据其一般和普通的含义使用并且是指任何重组或天然存在的形式的抗体的与连接抗体中的Fab结构域和Fc结构域的多肽序列，和/或在抗体N末端处连接来自轻链和重链的两个单链可变片段(scFv)的序列相对应的区域。
如本文所用，术语“胃蛋白酶”或“胃蛋白酶原A”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的胃蛋白酶蛋白或维持胃蛋白酶活性(例如，与胃蛋白酶相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的胃蛋白酶多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，胃蛋白酶是由NCBI序列参考GI:387013鉴定的蛋白质、其同源物或功能片段。
如本文所用，术语“组织蛋白酶G”或“组织蛋白酶G蛋白酶”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在形式的组织蛋白酶G蛋白或维持组织蛋白酶G活性(例如，与组织蛋白酶G相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的组织蛋白酶G多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，组织蛋白酶G是由NCBI序列参考GI:4503149鉴定的蛋白质、其同源物或功能片段。
如本文所用，术语“MMP3”或“MMP3蛋白酶”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在的形式的基质金属蛋白酶3(MMP3)或维持MMP3活性(例如，与MMP3相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的MMP3多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，MMP3是由NCBI序列参考GI:77567646鉴定的蛋白质、其同源物或功能片段。
如本文所用，术语“MMP7”或“MMP7蛋白酶”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在的形式的基质金属蛋白酶7(MMP7)或维持MMP7活性(例如，与MMP7相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的MMP7多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，MMP7是由NCBI序列参考GI:116861鉴定的蛋白质、其同源物或功能片段。
如本文所用，术语“MMP12”或“MMP12蛋白酶”根据其一般和普通的含义使用并且是指重组或天然存在的形式的基质金属蛋白酶9(MMP12)或维持MMP12活性(例如，与MMP12相比，使活性维持在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的其变体或同源物中的任一种。在一些方面，与天然存在的MMP12多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在实施例中，MMP12是由NCBI序列参考GI:73858572鉴定的蛋白质、其同源物或功能片段。
如本文所用，术语“I型跨膜蛋白”根据其一般和普通的含义使用并且是指任何重组或天然存在的形式的含有单程跨膜区的膜蛋白，其中所述蛋白的N末端定位于细胞外表面。
如本文所用，术语“CHO细胞”或“中国仓鼠卵巢细胞”根据其一般和普通的含义使用并且是指源自中国仓鼠卵巢的任何上皮细胞系。
如本文所用，术语“Kabat编号”或“Kabat位置”根据其一般和普通的含义使用并且是指用于基于可变区对抗体中的氨基酸残基进行编号的方案。所述方案在比较抗体之间的这些可变区时很有用。在实施例中，根据其它编号系统，抗CD20抗体利妥昔单抗的L248位置与抗体序列的L325相关。
如本文所用，术语“表达载体”或“表达构建体”根据其简单和普通的含义使用并且是指用于将所关注靶基因表达为蛋白质产品的任何重组或天然存在的形式的细菌质粒、杆粒或病毒或其变体或同源物。所关注靶标可以是任何所关注基因，包含编码天然存在的蛋白质、天然存在的蛋白质的任何部分或经修饰的变体、嵌合蛋白质、标记蛋白或从头设计的蛋白质序列的基因。表达载体必须包含基因表达所必需的元件，包含但不限于启动子序列、核糖体结合序列、起始密码子、所关注靶序列和终止密码子。表达载体可以通过任何基因工程化过程或技术进行修饰，包含但不限于聚合酶链式反应(PCR)、限制性内切酶消化和DNA连接、吉布森克隆和CRISPR相关基因编辑。
如本文所用，术语“表面展示”根据其一般和普通的含义使用并且是指其中细胞系统用于在细胞表面上表达蛋白质或肽的过程。细胞系统可以是原核的或真核的，并且可以包含细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。表面展示是通过将所关注蛋白质表达为融合蛋白来实现的，所述融合蛋白通常包含所选细胞系统中的内源表达的蛋白质和所关注蛋白质的部分或全部序列。
如本文所用，术语“细胞毒性”根据其一般和普通的含义使用并且是指对细胞具有毒性的性质。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性”、“ADCC”和“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”根据其简单和普通的含义使用并且是指免疫机制，通过所述免疫机制，带有Fc受体的效应细胞可以识别和杀死在其表面上表达肿瘤或病原体衍生的抗原的抗体涂覆的靶细胞。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”和“ADCP”根据其一般和普通的含义使用并且是指抗体调理的靶细胞激活巨噬细胞的表面上的Fc受体以诱导吞噬作用，从而导致靶细胞摄取和降解的机制。巨噬细胞Fc受体是指所有类别的Fcγ受体。
如本文所用，术语“适应性免疫应答”、“获得性免疫系统”和“特异性免疫系统”根据其一般和普通的含义使用并且是指整个免疫系统的由消除指定靶标的专门的系统性细胞和过程构成的子系统。靶标是通过免疫记忆鉴定来指定的。免疫记忆是在免疫系统先前遇到免疫攻击时创建的，并保留了其记录。
如本文所用，术语“解离常数”或“Kd”根据其一般和普通的含义使用并且是指测量两个分子彼此缔合倾向的特定类型的平衡常数。在生物化学中，解离常数用于描述蛋白质与配体之间的相对亲和力，例如抗体对抗原的亲和力。通常，解离常数Kd可以用等式来描述
其中[P]是蛋白质的摩尔浓度，[L]是配体的摩尔浓度，并且[PL]是蛋白质-配体复合物的摩尔浓度。
II.抗体
一方面，本文提供了一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。
在实施例中，所述IgG抗体选自IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
在实施例中，所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。在实施例中，对蛋白酶切割的抗性意指蛋白酶不能在铰链区内的氨基酸序列处切割抗体。在实施例中，铰链区的氨基酸序列赋予了对蛋白酶切割的抗性。在实施例中，对蛋白酶切割的抗性与天然或野生型铰链区序列有关。在实施例中，所述天然或野生型铰链序列是包含ELLGGPS(SEQ ID NO:544)的氨基酸测序。在实施例中，对蛋白酶切割的抗性与已知的序列对照有关。在实施例中，已知序列是包含ELLGGPS(SEQ ID NO:544)的氨基酸序列，其对IgG内肽酶的切割敏感。在实施例中，包括氨基酸序列PVAGPS的人IgG2铰链区对IgG内肽酶切割具有抗性，并且可以用作阴性对照。在实施例中，使用特定的已知测定，对蛋白酶切割的抗性高于某个阈值水平。在实施例中，所述测定可以是IgG和SDS-PAGE的酶消化和考马斯染色以确定消化片段的分子量。
在实施例中，铰链区包含蛋白酶抗性序列。在实施例中，根据Kabat编号，所述序列处于氨基酸位置246到252之间。在实施例中，所述序列是与Kabat位置246到252相对应的位置。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为两个或更多个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为三个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为四个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为五个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为六个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为七个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:545的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:546的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:547的氨基酸。
在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10- 8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10- 10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10- 10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10- 8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10- 6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述蛋白酶是IgG内肽酶。在实施例中，所述IgG内肽酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在实施例中，所述IgG抗体包含对对ELLGGPS(SEQ ID NO:544)氨基酸序列具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
一方面，本文提供了免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述抗体包含通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
在实施例中，所述IgG抗体选自IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10- 8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10- 10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10- 10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10- 8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10- 6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，与野生型Fc相比，所述Fc区包含赋予对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。在实施例中，与野生型Fc相比，所述Fc区包含赋予对CD32(FcγRII)的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。在实施例中，与野生型Fc相比，所述Fc区包含赋予对CD16(FcγRIII)的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。在实施例中，与野生型Fc相比，所述Fc区包含赋予对CD64(FcγRI)的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。
在实施例中，与野生型Fc相比，所述Fc区包含赋予对CD16(FcγRIII)的更高结合亲和力并且根据Kabat编号，选自S252D、I351E和A349L的一种或多种氨基酸取代。在实施例中，所述Fc区包含S252D氨基酸取代。在实施例中，所述Fc区包含I351E氨基酸取代。.在实施例中，所述Fc区包含A349L氨基酸取代。在实施例中，所述Fc区包含S252D和I351E氨基酸取代。在实施例中，所述Fc区包含S252D、I351E和A349L氨基酸取代。
在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在实施例中，所述IgG抗体包含对对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在实施例中，铰链区包含蛋白酶抗性序列。在实施例中，根据Kabat编号，所述序列处于氨基酸位置246到252之间。在实施例中，所述序列处于与Kabat位置246到252相对应的位置之间。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为两个或更多个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为三个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为四个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为五个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为六个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为七个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:545的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:546的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:547的氨基酸。
III.重组蛋白
一方面，本文提供了重组蛋白，其包含I型跨膜结构域、免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。
在实施例中，所述I型跨膜结构域能够二聚化。在实施例中，所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-α跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-β跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-A跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-B跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-C跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是胰岛素受体跨膜结构域。
在实施例中，重组蛋白包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，所述IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区、Fab(抗原结合片段)区和铰链区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fab(服装结晶)区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fc(抗原结合片段)区。在实施例中，重组蛋白，其中所述IgG抗体包含铰链区。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，铰链区包含蛋白酶抗性序列。在实施例中，根据Kabat编号，所述序列处于氨基酸位置246到252之间。在实施例中，所述序列处于与Kabat位置246到252相对应的位置之间。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为两个或更多个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为三个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为四个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为五个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为六个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为七个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:546的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:545的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:547的氨基酸。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10- 12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10- 8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10- 9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10- 7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10- 5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10- 7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-13M。
在实施例中，IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，所述IgG抗体包含对对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
一方面，本文提供了重组蛋白，其包含I型跨膜结构域、免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
在实施例中，所述I型跨膜结构域能够二聚化。在实施例中，所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-α跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-β跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-A跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-B跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-C跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是胰岛素受体跨膜结构域。
在实施例中，重组蛋白包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，所述IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区、Fab(抗原结合片段)区和铰链区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fab(服装结晶)区。在实施例中，所述IgG抗体包含Fc(抗原结合片段)区。在实施例中，重组蛋白，其中所述IgG抗体包含铰链区。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10- 12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10- 8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10- 10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10- 13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10- 9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10- 7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10- 5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10- 7M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，本文所描述的IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-13M。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，铰链区包含蛋白酶抗性序列。在实施例中，根据Kabat编号，所述序列处于氨基酸位置246到252之间。在实施例中，所述序列处于与Kabat位置246到252相对应的位置之间。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为两个或更多个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为三个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为四个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为五个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为六个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为七个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:546的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:545的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:547的氨基酸。
在实施例中，IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为两个氨基酸并且包含DW、YD、QW、QE、PW、QD或DD的氨基酸序列。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为三个氨基酸并且包含XDW、XDW、XYD、XQW、XQE、XPW、XQD或XDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为四个氨基酸并且包含XXDW、XXDW、XXYD、XXQW、XXQE、XXPW、XXQD或XXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为五个氨基酸并且包含XXXDW、XXXYD、XXXQW、XXXQE、XXXPW、XXXQD或XXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为六个氨基酸并且包含XXXXDW、XXXXYD、XXXXQW、XXXXQE、XXXXPW、XXXXQD或XXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为七个氨基酸并且包含XXXXXDW、XXXXXYD、XXXXXQW、XXXXXQE、XXXXXPW、XXXXXQD或XXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为八个氨基酸并且包含XXXXXXDW、XXXXXXYD、XXXXXXQW、XXXXXXQE、XXXXXXPW、XXXXXXQD或XXXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区的长度为九个氨基酸并且包含XXXXXXXDW、XXXXXXXYD、XXXXXXXQW、XXXXXXXQE、XXXXXXXPW、XXXXXXXQD或XXXXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，IgG抗体铰链区包含XCWDW、XXCWDW、XXXCWDW、XXXXXCWDW、XXXXXCWDW、XXXXXXCWDW、XXXXXXXCWDW、ETCWDW、DSCWDW、YDCWDW、DDCWDW、DMCWDW、EHCWDW、IICWDW、DVCWDW、EFCWDW、FNCWDW、EETCWDW、EDSCWDW、EETCWDD或EETQWDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。
在实施例中，IgG抗体铰链区包含DW、YD、QW、QE、PW、QD、DD、CWDW、ETCWDW、DSCWDW、YDCWDW、DDCWDW、DMCWDW、EHCWDW、IICWDW、DVCWDW、EFCWDW、FNCWDW、EETCWDW(SEQ ID NO:545)、EDSCWDW(SEQ ID NO:547)、EETCWDD、EETCWSW(SEQ ID NO:547)、EETQWDD。在一些方面，变体或同源物具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸序列同一性。
在实施例中，IgG抗体包含与以下中的任一个的Fab区相同的Fab区：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、阿仑单抗、阿利库单抗、阿西莫单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝利单抗、贝索单抗、贝伐单抗、贝伐单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、布罗达单抗、康纳单抗、卡罗单抗、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达土木单抗、地诺单抗、达妥昔单抗、度匹鲁单抗、度伐鲁单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、埃罗妥珠单抗、法洛索单抗、吉妥单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、艾达赛珠单抗、英西单抗、英利昔单抗、伊匹单抗、美泊利单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、若莫单抗、奥托昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗、奥拉曲单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、兰尼单抗、瑞西巴库单抗、瑞替珠单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、苏金单抗、司妥昔单抗、硫索单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦新、优特克单抗、维多珠单抗、沃洛尤单抗和伏妥莫单抗。在实施例中，IgG抗体包含与阿昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿达木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿仑单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿仑单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿利库单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿西莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿特朱单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与阿维鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与巴利昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与贝利单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与贝索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与贝伐单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与贝洛托舒单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与本妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与布罗达单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与康纳单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与卡罗单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与卡妥索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与赛妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与西妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与达土木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与地诺单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与达妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与度匹鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与度伐鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与依库珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与依法珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与埃罗妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与法洛索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与吉妥单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与戈利木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与替伊莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与艾达赛珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与英西单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与英利昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与伊匹单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与美泊利单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与莫罗单抗-CD3的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与那他珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与耐昔妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与纳武单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与若莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥托昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥比妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥瑞组单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥法木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥拉曲单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与奥马珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与帕利珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与帕尼单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与派姆单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与帕妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与雷莫芦单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与兰尼单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与瑞西巴库单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与瑞替珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与利妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与沙妥莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与苏金单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与司妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与硫索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与托珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与托西莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与曲妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与曲妥珠单抗美坦新的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与优特克单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与维多珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与沃洛尤单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，IgG抗体包含与伏妥莫单抗的Fab区相同的Fab区。
在本文所提供的重组蛋白的实施例中，所述IgG抗体包含对对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
IV.抗CD20抗体
一方面，本文提供了一种抗CD20抗体，其包含由SEQ ID No:551-588中的任一个的核酸序列编码的互补决定区(CDR)。
在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗CD20抗体，其中所述抗体包含互补决定区(CDR)并由图14中所示的核酸序列编码(也在表1、2和3中再现)。在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗CD20抗体，其中所述抗体包含具有在表1、2和3中所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗CD20抗体，其中所述抗体包含具有SEQ ID No:589-629或633-635中的任一个的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗体，其与未突变的利妥昔单抗(CD20结合抗体)相比，对CD20具有更高的结合亲和力。在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗体，其当与未突变的利妥昔单抗(CD20结合抗体)相比时，对CD20具有更高的结合亲和力并且包含蛋白酶抗性铰链区。在实施例中，本文提供了一种结合CD20或其抗原片段的抗体，其与未突变的利妥昔单抗(CD20结合抗体)相比，对CD20具有更高的结合亲和力，并且包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCGGGGAAGCGGTATAAC(SEQ ID NO:551)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P01A09，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCGGGGAAGCGGTATAAC(SEQ ID NO:551)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTGKRYN(SEQ ID NO:592)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P01A09，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTGKRYN(SEQ ID NO:592)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCTGTTTTAGGTATAAC(SEQ ID NO:552)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P01B01，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCTGTTTTAGGTATAAC(SEQ ID NO:552)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTCFRYN(SEQ ID NO:593)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P01B01，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTCFRYN(SEQ ID NO:593)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCTTCACAATTCGTTTG(SEQ ID NO:553)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P02C12，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCTTCACAATTCGTTTG(SEQ ID NO:553)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTFTIRL(SEQ ID NO:594)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P02C12，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTFTIRL(SEQ ID NO:594)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCGGGCGTTTTTATAAC(SEQ ID NO:554)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P02F01，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCGGGCGTTTTTATAAC(SEQ ID NO:554)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTGRFYN(SEQ ID NO:595)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P02F01，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTGRFYN(SEQ ID NO:595)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCAGTTGGATGTATAAC(SEQ ID NO:555)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P03A05，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCAGTTGGATGTATAAC(SEQ ID NO:555)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTSWMYN(SEQ ID NO:596)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P03A05，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTSWMYN(SEQ ID NO:596)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TGGTTGTGGACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:556)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05B09，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TGGTTGTGGACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:556)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含WLWTSYN(SEQ ID NO:597)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05B09，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为WLWTSYN(SEQ ID NO:597)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCTGGGGGATTTATAAC(SEQ ID NO:557)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05H07，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCTGGGGGATTTATAAC(SEQ ID NO:557)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTWGIYN(SEQ ID NO:598)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05H07，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTWGIYN(SEQ ID NO:598)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCTTCACAAGGTATAAT(SEQ ID NO:558)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04A02，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCTTCACAAGGTATAAT(SEQ ID NO:558)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTFTRYN(SEQ ID NO:599)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04A02，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTFTRYN(SEQ ID NO:599)。
在实施例中，结合CD20的抗体或其抗原片段依次包含：由TATACCTTCACATTTCCTTAT(SEQ ID NO:559)的核苷酸序列编码的CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05F06，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCTTCACATTTCCTTAT(SEQ ID NO:559)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTFTFPY(SEQ ID NO:600)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05F06，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTFTFPY(SEQ ID NO:600)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TATACCGGTATTCGGTATAAC(SEQ ID NO:560)的核苷酸序列编码的重链CDR1。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、轻链CDR2由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码，并且轻链CDR3由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07C04，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR1序列由TATACCGGTATTCGGTATAAC(SEQ ID NO:560)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTGIRYN(SEQ ID NO:601)的重链CDR1氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07C04，并且在下表1的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR1氨基酸序列为YTGIRYN(SEQ ID NO:601)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCTTGTATCTT(SEQ ID NO:561)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04D06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCTTGTATCTT(SEQ ID NO:561)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGLYL(SEQ ID NO:602)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04D06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGLYL(SEQ ID NO:602)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCACGCTGCTG(SEQ ID NO:562)的核苷酸序列编码的CDR2的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04F01，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCACGCTGCTG(SEQ ID NO:562)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGTLL(SEQ ID NO:603)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04F01，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGTLL(SEQ ID NO:603)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCCATATGGGG(SEQ ID NO:563)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04F02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCCATATGGGG(SEQ ID NO:563)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGHMG(SEQ ID NO:604)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04F02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGHMG(SEQ ID NO:604)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCATGCTTTGG(SEQ ID NO:564)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04G03，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCATGCTTTGG(SEQ ID NO:564)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGMLW(SEQ ID NO:605)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04G03，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGMLW(SEQ ID NO:605)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCGCTGTTTCG(SEQ ID NO:565)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04H06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCGCTGTTTCG(SEQ ID NO:565)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04H06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGAVS(SEQ ID NO:606)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCACTCATAAG(SEQ ID NO:566)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04H07，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCACTCATAAG(SEQ ID NO:566)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGTHK(SEQ ID NO:607)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04H07，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为f IYPGTHK(SEQ ID NO:607)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCACTCAGTCT(SEQ ID NO:567)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06A06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCACTCAGTCT(SEQ ID NO:567)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGTQS(SEQ ID NO:608)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06A06，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGTQS(SEQ ID NO:608)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCAATGCGGAT(SEQ ID NO:568)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCAATGCGGAT(SEQ ID NO:568)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGNAD(SEQ ID NO:609)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGNAD(SEQ ID NO:609)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCAGTTTTGAG(SEQ ID NO:569)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H01，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCAGTTTTGAG(SEQ ID NO:569)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGSFE(SEQ ID NO:610)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H01，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGSFE(SEQ ID NO:610)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCACGTTTCTT(SEQ ID NO:570)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04D09，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCACGTTTCTT(SEQ ID NO:570)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGTFL(SEQ ID NO:611)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P04D09，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGTFL(SEQ ID NO:611)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGTTACGGGCGAT(SEQ ID NO:571)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05A03，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGTTACGGGCGAT(SEQ ID NO:571)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPVTGD(SEQ ID NO:612)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05A03，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPVTGD(SEQ ID NO:612)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGTATCTGGGCGAT(SEQ ID NO:572)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05A12，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGTATCTGGGCGAT(SEQ ID NO:572)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGLYL(SEQ ID NO:602)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05A12，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPYLGD(SEQ ID NO:613)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由TTTATCCGTGGAATGGCGAT(SEQ ID NO:573)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05B02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGTGGAATGGCGAT(SEQ ID NO:573)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPWNGD(SEQ ID NO:614)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P05B02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPWNGD(SEQ ID NO:614)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCTTGTATCTT(SEQ ID NO:561)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B04，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCTCTGTGGGGCGAT(SEQ ID NO:574)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPLWGD(SEQ ID NO:615)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B04，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPLWGD(SEQ ID NO:615)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCAGTAGTCGT(SEQ ID NO:575)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCAGTAGTCGT(SEQ ID NO:575)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGSSR(SEQ ID NO:616)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06B11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGSSR(SEQ ID NO:616)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCACTTTTCGT(SEQ ID NO:576)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H05，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCACTTTTCGT(SEQ ID NO:576)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGTFR(SEQ ID NO:617)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H05，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGTFR(SEQ ID NO:617)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCGTTGGTCGG(SEQ ID NO:577)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCGTTGGTCGG(SEQ ID NO:577)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGVGR(SEQ ID NO:618)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P06H11，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGVGR(SEQ ID NO:618)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCTCTCAGGCG(SEQ ID NO:578)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07F02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCTCTCAGGCG(SEQ ID NO:578)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGSEA(SEQ ID NO:619)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07F02，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGSEA(SEQ ID NO:619)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCAGTAATATG(SEQ ID NO:579)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07F10，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCAGTAATATG(SEQ ID NO:579)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGSNM(SEQ ID NO:620)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07F10，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGSNM(SEQ ID NO:620)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由ATTTATCCGGGCGCTTTTCTT(SEQ ID NO:580)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:550)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08B05，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR2序列由ATTTATCCGGGCGCTTTTCTT(SEQ ID NO:580)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含IYPGAFL(SEQ ID NO:621)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和RSTYYGGDWYFN(SEQ ID NO:591)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08B05，并且在下表2的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR2氨基酸序列为IYPGAFL(SEQ ID NO:621)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CAGTCTATTTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:581)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07C02，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CAGTCTATTTATTATGGCGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:581)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含QSIYYGGDWYFN(SEQ ID NO:622)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07C02，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为QSIYYGGDWYFN(SEQ IDNO:622)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGCTGATTGCT(SEQ ID NO:582)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07H08，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGCTGATTGCT(SEQ ID NO:582)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTYYGGDWLIA(SEQ ID NO:623)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07H08，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTYYGGDWLIA(SEQ IDNO:623)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCGTGGCGGGGGGCGATTGGTATTTTAA(SEQ ID NO:583)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07H10，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCGTGGCGGGGGGCGATTGGTATTTTAA(SEQ ID NO:583)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTVAGGDWYFN(SEQ ID NO:624)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07H10，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTVAGGDWYFN(SEQ IDNO:624)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGCGGTGGCGG(SEQ ID NO:584)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08A01，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGCGGTGGCGG(SEQ ID NO:584)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTYYGGDWRWR(SEQ ID NO:625)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08A01，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTYYGGDWRWR(SEQ IDNO:625)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCTATTATGGCGGGTTTTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:585)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08B11，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCTATTATGGCGGGTTTTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:585)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTYYGGFWYFN(SEQ ID NO:626)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08B11，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTYYGGFWYFN(SEQ IDNO:626)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTCTTGGGCT(SEQ ID NO:586)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08G02，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCTATTATGGCGGCGATTGGTCTTGGGCT(SEQ ID NO:586)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含QSIYYGGDWYFN(SEQ ID NO:622)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08G02，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTYYGGDWSWA(SEQ IDNO:627)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCATGTGTAAGGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:587)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07A06，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCATGTGTAAGGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:587)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTMCKGDWYFN(SEQ ID NO:628)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P07A06，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTMCKGDWYFN(SEQ IDNO:628)。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含由CGCAGCACCATGTTGGGTGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:588)的核苷酸序列编码的重链CDR3。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由TATACCTTCACAAGCTATAAC(SEQ ID NO:548)的核苷酸序列编码的重链CDR1和由ATTTATCCGGGCAACGGCGAT(SEQ ID NO:549)的核苷酸序列编码的重链CDR2。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含由GCGAGCAGCAGCGTGAGC(SEQ ID NO:630)的核苷酸序列编码的轻链CDR1、由GGAAGCGGCACCAGC(SEQ ID NO:631)的核苷酸序列编码的轻链CDR2，以及由TGGACCAGCAACCCGCCG(SEQ ID NO:632)的核苷酸序列编码的轻链CDR3。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08E05，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，抗CD20抗体由编码利妥昔单抗的氨基酸序列的核酸序列编码，除了重链CDR3序列由CGCAGCACCATGTTGGGTGGCGATTGGTATTTTAAC(SEQ ID NO:588)的核苷酸序列编码。
在实施例中，所述抗CD20抗体包含RSTMLGGDWYFN(SEQ ID NO:629)的重链CDR3氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含YTFTSYN(SEQ ID NO:589)的重链CDR1氨基酸序列和IYPGNGD(SEQ ID NO:590)的重链CDR2氨基酸序列。在实施例中，所述抗CD20抗体进一步包含ASSSVS(SEQ ID NO:633)的轻链CDR1氨基酸序列、GSGTS(SEQ ID NO:634)的轻链CDR2氨基酸序列和WTSNPP(SEQ ID NO:635)的轻链CDR3氨基酸序列。在实施例中，这种抗CD20抗体被称为P08E05，并且在下表3的描述中进一步描述。在实施例中，所述抗CD20抗体具有利妥昔单抗的氨基酸序列，除了重链CDR3氨基酸序列为RSTMLGGDWYFN(SEQ IDNO:629)。
IV.表达系统
一方面，本文提供了一种编码如本文所描述的重组蛋白的分离的核酸。
在实施例中，本文提供了一种分离的核酸，其编码包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体的重组蛋白，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。在实施例中，本文提供了一种分离的核酸，其编码包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体的重组蛋白，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
在实施例中，本文提供了一种表达载体，其包含编码重组蛋白的分离的核酸，所述重组蛋白包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。在实施例中，本文提供了一种表达载体，其包含编码重组蛋白的分离的核酸，所述重组蛋白包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
在实施例中，本文提供了一种细胞，所述细胞含有所描述的表达载体。具体地，本文提供了一种表达载体，所述细胞含有表达载体，所述表达载体包含编码重组蛋白的分离的核酸，所述重组蛋白包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。具体地，本文提供了一种细胞，所述细胞含有表达载体，所述表达载体包含编码重组蛋白的分离的核酸，所述重组蛋白包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。在实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在实施例中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在实施例中，由所描述的表达载体编码的IgG抗体在细胞表面上表达。在实施例中，由所描述的表达载体编码的IgG抗体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面上表达。
V.使用方法
一方面，本文提供了将配体与细胞表面重组蛋白结合的方法，所述方法包含使配体与细胞表面重组蛋白接触，其中所述细胞表面重组蛋白包含I型跨膜结构域、免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述I型跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合，并且其中所述IgG抗体能够结合配体，并且进一步地，其中所述细胞表面蛋白对蛋白酶的切割具有抗性或对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力。
在将配体与细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述细胞是CHO细胞。在将配体与CHO细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述蛋白质是如本文所描述的重组蛋白。在将配体与CHO细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述表面蛋白是重组蛋白，所述重组蛋白包含I型跨膜结构域和免疫球蛋白G(IgG)抗体，并且其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的C末端融合。在将配体与CHO细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。在将配体与CHO细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述重组蛋白对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力。
在将配体与细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述I型跨膜结构域能够二聚化。在实施例中，所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-α跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是PDGFR-β跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是HER4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是FGFR4跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR1跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR2跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是VEGFR3跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-A跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-B跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是Trk-C跨膜结构域。在实施例中，所述I型跨膜结构域是胰岛素受体跨膜结构域。
在将配体与细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述重组蛋白包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
在将配体与细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在将配体与细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述IgG抗体包含对对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
在将配体与CHO细胞表面蛋白结合的方法的实施例中，所述重组蛋白对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力，并且如上文所描述的，所述重组蛋白包含对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
一方面，本文提供了一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包含施用治疗性IgG抗体和IgG特异性蛋白酶，其中所述治疗性IgG抗体对IgG特异性蛋白酶具有抗性。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中用于治疗癌症的所述治疗性IgG抗体是具有本文所描述的抗体特性中的任何抗体特性的抗体。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG抗体。在实施例中，所述治疗性IgG抗体是IgG1抗体。在实施例中，所述治疗性IgG抗体是IgG2抗体。在实施例中，所述治疗性IgG抗体是IgG3抗体。在实施例中，所述IgG抗体是IgG4抗体。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区、Fab(抗原结合片段)区和铰链区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含Fc(可结晶片段)区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含Fab(服装结晶)区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含Fc(抗原结合片段)区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含铰链区。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含与以下中的任一个的Fab区相同的Fab区：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、阿仑单抗、阿利库单抗、阿西莫单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝利单抗、贝索单抗、贝伐单抗、贝伐单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、布罗达单抗、康纳单抗、卡罗单抗、卡妥索单抗、赛妥珠单抗、西妥昔单抗、达土木单抗、地诺单抗、达妥昔单抗、度匹鲁单抗、度伐鲁单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、埃罗妥珠单抗、法洛索单抗、吉妥单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、艾达赛珠单抗、英西单抗、英利昔单抗、伊匹单抗、美泊利单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、若莫单抗、奥托昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞组单抗、奥法木单抗、奥拉曲单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、兰尼单抗、瑞西巴库单抗、瑞替珠单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、苏金单抗、司妥昔单抗、硫索单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦新、优特克单抗、维多珠单抗、沃洛尤单抗和伏妥莫单抗。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿达木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿仑单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿仑单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿利库单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿西莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿特朱单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与阿维鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与巴利昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与贝利单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与贝索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与贝伐单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与贝洛托舒单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与本妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与布罗达单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与康纳单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述I治疗性gG抗体包含与卡罗单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与卡妥索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与赛妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与西妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与达土木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与地诺单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与达妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与度匹鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与度伐鲁单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与依库珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与依法珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与埃罗妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与法洛索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与吉妥单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与戈利木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与替伊莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与艾达赛珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与英西单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与英利昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与伊匹单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与美泊利单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与莫罗单抗-CD3的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与那他珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与耐昔妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与纳武单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与若莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥托昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥比妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥瑞组单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥法木单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥拉曲单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与奥马珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与帕利珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与帕尼单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与派姆单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与帕妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与雷莫芦单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与兰尼单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与瑞西巴库单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与瑞替珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与利妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与沙妥莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与苏金单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与司妥昔单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与硫索单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与托珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与托西莫单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与曲妥珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与曲妥珠单抗美坦新的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与优特克单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与维多珠单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与沃洛尤单抗的Fab区相同的Fab区。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含与伏妥莫单抗的Fab区相同的Fab区。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含铰链区，所述铰链区包含蛋白酶抗性序列。在实施例中，根据Kabat编号，所述序列处于氨基酸位置246到252之间。在实施例中，所述序列处于与Kabat位置246到252相对应的位置之间。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为两个或更多个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为三个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为四个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为五个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为六个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列的长度为七个氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:546的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:545的氨基酸。在实施例中，所述蛋白酶抗性序列包含SEQ ID NO:547的氨基酸。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为两个氨基酸并且包含DW、YD、QW、QE、PW、QD或DD的氨基酸序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为三个氨基酸并且包含XDW、XDW、XYD、XQW、XQE、XPW、XQD或XDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为四个氨基酸并且包含XXDW、XXDW、XXYD、XXQW、XXQE、XXPW、XXQD或XXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为五个氨基酸并且包含XXXDW、XXXYD、XXXQW、XXXQE、XXXPW、XXXQD或XXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为六个氨基酸并且包含XXXXDW、XXXXYD、XXXXQW、XXXXQE、XXXXPW、XXXXQD或XXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为七个氨基酸并且包含XXXXXDW、XXXXXYD、XXXXXQW、XXXXXQE、XXXXXPW、XXXXXQD或XXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为八个氨基酸并且包含XXXXXXDW、XXXXXXYD、XXXXXXQW、XXXXXXQE、XXXXXXPW、XXXXXXQD或XXXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区的长度为九个氨基酸并且包含XXXXXXXDW、XXXXXXXYD、XXXXXXXQW、XXXXXXXQE、XXXXXXXPW、XXXXXXXQD或XXXXXXXDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。在实施例中，所述治疗性IgG抗体铰链区包含XCWDW、XXCWDW、XXXCWDW、XXXXXCWDW、XXXXXCWDW、XXXXXXCWDW、XXXXXXXCWDW、ETCWDW、DSCWDW、YDCWDW、DDCWDW、DMCWDW、EHCWDW、IICWDW、DVCWDW、EFCWDW、FNCWDW、EETCWDW、EDSCWDW、EETCWDD或EETQWDD的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含铰链区，所述铰链区包含DW、YD、QW、QE、PW、QD、DD、CWDW、ETCWDW、DSCWDW、YDCWDW、DDCWDW、DMCWDW、EHCWDW、IICWDW、DVCWDW、EFCWDW、FNCWDW、EETCWDW(SEQ ID NO:545)、EDSCWDW(SEQID NO:547)、EETCWDD、EETCWSW(SEQ ID NO:547)、EETQWDD。在一些方面，变体或同源物具有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸序列同一性。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含对蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对IdeS蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对IdeZ蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体包含对对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性的蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶包含但不限于胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对胃蛋白酶的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对基质金属蛋白酶7(MMP7)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对基质金属蛋白酶3(MMP3)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对基质金属蛋白酶(MMP12)的切割具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对组织蛋白酶G的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。在实施例中，所述治疗性IgG抗体包含对谷氨酰内肽酶V8(GluV8)的裂解具有抗性的蛋白酶抗性序列。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD20、CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。RI)。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10- 13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10- 11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的所述Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD32(FcγRII)的解离常数为约1×10-13M。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的所述Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10- 8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10- 6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD16(FcγRIII)的解离常数为约1×10-13M。
治疗癌症的方法的实施例包含治疗性IgG抗体，其中所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的所述Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M到约1×10-12M、约1×10-5M到约1×10-11M、约1×10-5M到约1×10-10M、约1×10-5M到约1×10-9M、约1×10-5M到约1×10-8M、约1×10-5M到约1×10-7M、约1×10-5M到约1×10-6M、约1×10-6M到约1×10-13M、约1×10-6M到约1×10-12M、约1×10-6M到约1×10-11M、约1×10-6M到约1×10-10M、约1×10-6M到约1×10-9M、约1×10-6M到约1×10-8M、约1×10-6M到约1×10-7M、约1×10-7M到约1×10-13M、约1×10-7M到约1×10-12M、约1×10-7M到约1×10-11M、约1×10-7M到约1×10-10M、约1×10-7M到约1×10-9M、约1×10-7M到约1×10-8M、约1×10-8M到约1×10-13M、约1×10-8M到约1×10-12M、约1×10-8M到约1×10-11M、约1×10-8M到约1×10-10M、约1×10-8M到约1×10-9M、约1×10-9M到约1×10-13M、约1×10-9M到约1×10-12M、约1×10-9M到约1×10-11M、约1×10-9M到约1×10-10M、约1×10-10M到约1×10-13M、约1×10-10M到约1×10-12M、约1×10-10M到约1×10-11M、约1×10-11M到约1×10-13M、约1×10-11M到约1×10-12M或约1×10-12M到约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M、约1×10-6M、约1×10-7M、约1×10-8M、约1×10-9M、约1×10-10M、约1×10-11M、约1×10-12M或约1×10-13M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-5M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-6M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-7M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-8M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-9M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-10M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-11M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-12M。在实施例中，所述治疗性IgG抗体的Fc区对CD64(FcγRI)的解离常数为约1×10-13M。
一方面，本文提供了增强治疗性IgG抗体在受试者中的功效的方法，所述方法包含使治疗性IgG抗体的铰链区突变以产生对根据本文所描述的各个实施例中的任个实施例的蛋白酶具有抗性的治疗性IgG抗体的变体。
在增强治疗性IgG抗体在受试者中的功效的方法的实施例中，治疗性IgG抗体对蛋白酶具有抗性，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶是IdeS蛋白酶。在实施例中，所述IgG特异性蛋白酶是IdeZ蛋白酶。在实施例中，所述蛋白酶对ELLGGPS氨基酸序列(SEQ ID NO:544)具有特异性。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是胃蛋白酶。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是基质金属蛋白酶7(MMP7)。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是基质金属蛋白酶3(MMP3)。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP12)。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是组织蛋白酶G。在实施例中，ELLGGPS氨基酸序列特异性蛋白酶是谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
在增强治疗性IgG抗体在受试者中的功效的方法的实施例中，所述治疗性IgG抗体是如上文和本文所描述的任何抗体。进一步，所述治疗性IgG抗体是选自赫赛汀和任何其它IgG治疗性mAb的抗体，所述抗体依赖于IgG抗体的Fc区与任何先天免疫细胞(例如，NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞)的FcγR结合来发挥其功效。
本文进一步公开了使用本文所描述的蛋白质、抗体、融合蛋白、抗体片段、抗原和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的方法。在一些实施例中，所述方法涉及使用蛋白质、抗体、融合蛋白、抗体片段、抗原和CHO细胞以通过亲和力选择快速优化抗体-抗原相互作用。在一些实施例中，所述方法涉及使用如本文所描述的蛋白质、抗体、融合蛋白、抗体片段、抗原和CHO细胞来提高治疗性抗体的功效，其中部分或全部治疗效果是通过ADCC或ADCP介导的。
一方面，本文提供了产生具有对IgG特异性蛋白酶具有抗性的铰链区的IgG抗体的方法。
一方面，本文提供了产生具有铰链区的IgG抗体的方法，所述铰链区能够以更高的亲和力结合CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)。
一方面，本文提供了产生具有铰链区的IgG抗体的方法，所述铰链区能够以更低的亲和力结合CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)。
一方面，本文提供了产生具有铰链区的IgG抗体的方法，所述铰链区对IgG特异性蛋白酶具有抗性并且能够以更高的亲和力结合CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)。
一方面，本文提供了产生具有铰链区的IgG抗体的方法，所述铰链区对IgG特异性蛋白酶具有抗性并且能够以更低的亲和力结合CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)。
一方面，本文提供了产生对其特异性抗原具有不同亲和力的IgG抗体的方法。
应当理解，本文所描述的实例和实施例仅出于说明的目的，并且将对本领域技术人员建议鉴于此的各种修改或变化且包含在本申请案的精神和范围内及所附权利要求的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
P-实施例
实施例P-1.一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其包括通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。
实施例P-2.根据实施例1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
实施例P-3.根据实施例1到2中任一项所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
实施例P-4.根据实施例1到2中任一项所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG2抗体。
实施例P-5.根据实施例1到2中任一项所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG3抗体。
实施例P-6.根据实施例1到2中任一项所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG4抗体。
实施例P-7.根据实施例6所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括根据Kabat的EU编号在氨基酸位置246到252之间的蛋白酶抗性序列。
实施例P-8.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为2个或更多个氨基酸。
实施例P-9.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
实施例P-10.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
实施例P-11.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
实施例P-12.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
实施例P-13.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
实施例P-14.根据实施例7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列包括SEQ IDNO:545的氨基酸。
实施例P-15.根据实施例1到14中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-16.根据实施例1到15中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-17.根据实施例1到16中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-18.根据实施例1到17中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-19.根据实施例1到18中任一项所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
实施例P-20.根据实施例19所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。
实施例P-21.根据实施例20所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IdeS。
实施例P-22.根据实施例20所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IdeZ。
实施例P-23.根据实施例1到18中任一项所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
实施例P-24.一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述抗体包括通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-25.根据实施例24所述的IgG抗体，其中与野生型Fc相比，所述Fc区包括赋予对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。
实施例P-26.根据实施例25所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括根据Kabat的EU编号选自S252D、I351E和A349L的氨基酸取代，并且其中与野生型相比，所述取代赋予对CD16(FcγRIII)的更高结合亲和力。
实施例P-27.根据实施例26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D。
实施例P-28.根据实施例26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代I351E。
实施例P-29.根据实施例26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D和I351E。
实施例P-30.根据实施例26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D、I351E和A349。
实施例P-31.根据实施例24或25中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-32.根据实施例24到30中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-33.根据实施例24或25中任一项所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-34.根据实施例24到33中任一项所述的IgG抗体，其中所述抗体对蛋白酶切割具有抗性。
实施例P-35.根据实施例34所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
实施例P-36.根据实施例35所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeS。
实施例P-37.根据实施例35所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeZ。
实施例P-38.根据实施例34所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
实施例P-39.根据实施例34到38中任一项所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括根据Kabat的EU编号在氨基酸位置246到252处的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
实施例P-40.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
实施例P-41.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
实施例P-42.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
实施例P-43.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
实施例P-44.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
实施例P-45.根据实施例39所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
实施例P-46.一种重组蛋白，其包括：
I型跨膜结构域；以及
b.免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的所述C末端融合；并且
其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。
实施例P-47.根据实施例46所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域能够二聚化。
实施例P-48.根据权利要求46或47中任一项所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。
实施例P-49.根据实施例46到48中任一项所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。
实施例P-50.根据实施例46到49中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
实施例P-51.根据实施例46到49中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG1抗体。
实施例P-52.根据实施例46到49中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG2抗体。
实施例P-53.根据实施例46到49中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG3抗体。
实施例P-54.根据实施例46到49中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG4抗体。
实施例P-55.根据实施例46到54中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括Fc(可结晶片段)区、Fab(抗原结合片段)区和铰链区。
实施例P-56.根据实施例55所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括Fc区。
实施例P-57.根据实施例55所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括铰链区。
实施例P-58.根据实施例55到57中任一项所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括根据Kabat的EU编号在氨基酸位置246到252之间的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
实施例P-59.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
实施例P-60.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
实施例P-61.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
实施例P-62.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
实施例P-63.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
实施例P-64.根据实施例58所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
实施例P-65.根据实施例46到64中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
实施例P-66.根据实施例46到65中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
实施例P-67.根据实施例46到66中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
实施例P-68.根据实施例46到67中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
实施例P-69.根据实施例46到68中任一项所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
实施例P-70.根据实施例69所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。
实施例P-71.根据实施例70所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeS。
实施例P-72.根据实施例70所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeZ。
实施例P-73.根据实施例69所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
实施例P-74.一种重组蛋白，其包括：
a.I型跨膜结构域；以及
b.免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述跨膜结构域与所述IgG抗体的所述C末端融合；并且
其中所述重组蛋白包括对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
实施例P-75.根据实施例74所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域能够二聚化。
实施例P-76.根据实施例74或75中任一项所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。
实施例P-77.根据实施例74到76中任一项所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。
实施例P-78.根据实施例74到77中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
实施例P-79.根据实施例74到78中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG1抗体。
实施例P-80.根据实施例74到78中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG2抗体。
实施例P-81.根据实施例74到78中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG3抗体。
实施例P-82.根据实施例74到78中任一项所述的重组蛋白，其中所述IgG结构域是IgG4抗体。
实施例P-83.根据实施例74到82中任一项所述的重组蛋白，其中与野生型Fc相比，所述Fc区包括赋予对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的高结合亲和力的一个或多个氨基酸。
实施例P-84.根据实施例74到83中任一项所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-85.根据实施例74到83中任一项所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-86.根据实施例74到83中任一项所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-87.根据实施例74到85中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白对蛋白酶切割具有抗性。
实施例P-88.根据实施例87所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
实施例P-89.根据实施例88所述的重组蛋白，其中所述IgG蛋白酶是IdeS。
实施例P-90.根据实施例88所述的重组蛋白，其中所述IgG蛋白酶是IdeZ。
实施例P-91.根据实施例87所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
实施例P-92.根据实施例74到91中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括铰链区，并且其中所述铰链区包括根据Kabat的EU编号在氨基酸位置246到252处的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
实施例P-93.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
实施例P-94.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
实施例P-95.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
实施例P-96.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
实施例P-97.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
实施例P-98.根据实施例92所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
实施例P-99.一种分离的核酸，其编码根据实施例46到98中任一项所述的重组蛋白。
实施例P-100.一种表达载体，其包括根据实施例99所述的核酸。
实施例P-101.一种细胞，其包括根据实施例100所述的表达载体。
实施例P-102.根据实施例101所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
实施例P-103.根据实施例101或102所述的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
实施例P-104.根据实施例101到103中任一项所述的细胞，其中在所述细胞的表面处表达IgG抗体。
实施例P-105.抗CD20抗体，其包括如图3所示的CDR。
实施例P-106.一种将配体与CHO细胞表面重组蛋白结合的方法，所述方法包括使配体与CHO细胞表面重组蛋白接触，其中所述CHO细胞表面重组蛋白包括：
i.EGFR跨膜结构域；以及
ii.免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述EGFR跨膜结构域与所述IgG结构域的所述C末端融合；并且
其中所述IgG抗体能够结合配体；并且
其中所述CHO细胞表面蛋白对IgG特异性蛋白酶的切割具有抗性或对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力。
实施例P-107.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗性IgG抗体和IgG特异性蛋白酶，其中所述治疗性IgG抗体对IgG特异性蛋白酶具有抗性。
实施例P-108.根据实施例107所述的方法，其中所述治疗性IgG抗体对CD20、CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
实施例P-109.一种增强治疗性IgG抗体在受试者中的功效的方法，所述方法包括向所述受试者施用IgG特异性蛋白酶和对所述IgG特异性蛋白酶具有抗性的治疗性IgG。
实施例P-110.根据实施例109所述的方法，其中所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。
实例
实例1：IgG抗体和内肽酶
图1示意性地展示了人免疫细胞被内源性IgG天然涂覆，这防止了治疗性mAb与人免疫细胞的表面上表达的FcγR之间的相互作用。因此，这限制了治疗性mAb与FcγR的结合，从而限制了治疗性mAb的功效。
图2的流式细胞仪数据证明了人NK细胞被IgG分子天然涂覆，其可以通过与IdeS酶一起温育来去除。人PBMC在37℃下用IdeS消化持续30分钟，并用针对谱系标志物或针对人IgG Fc的抗体染色。注意CD3+T细胞不表达FcγR，并且因此在任何条件下都不与结合人IgG。
图3示意性地展示了用于增强mAb治疗效率的策略。图(a)描绘了免疫细胞上的FcγR通常被内源性IgG占据；图(b)示出了IdeS消化可以去除内源性IgG并释放输注治疗性mAb的FcγR结合位点，所述治疗性mAb被工程化为对IdeS具有抗性并保留FcγR结合功能；(c)示出了输注的治疗性mAb可以首先结合到未经占据的FcγR上，或者如图(d)所描绘的，可以首先结合在癌细胞上表达的肿瘤相关抗原。无论如何，一旦抗原-mAb-FcγR交联，FcγR+细胞就会经历免疫激活(f)。流程图展示了未被占据并且因此可用于结合治疗性mAb的FcγR越多，消除的肿瘤细胞就越多。
实例2：新型治疗性抗体筛选与工程化平台
迄今为止开发的许多FDA批准的抗体治疗剂都是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产的，因为CHO细胞产生的重组蛋白具有在人中相容且具有生物活性的翻译后修饰。因此，CHO细胞代表了治疗性抗体筛选与工程化的理想系统。
本文进行的实验旨在开发一种在CHO细胞的表面上展示含Ig和/或Fc的融合蛋白的全长、片段或组合的方法。
开发了一种通过流式细胞术选择CHO细胞表面表达的EGFR-TMH/mAb和EGFR-TMF/FcγR融合蛋白的一个子集的方法。在CHO细胞的表面上表达的每个IgG或含有Fc的分子都具有完全功能，包含单独的IgG结构域、Fc结构域、部分抗体、部分受体、全长抗体、全长抗体或单独的IgG/Fc结构域的组合行为类似于类似的可溶性构建体(去除EGFR-TMH部分)。流式细胞术被用作研究这些分子的不同部分的方法，鉴定其物理和化学特性以用于所关注应用。
测试了EGFR TMH(SEQ ID NO:6)以优化CHO细胞中的IgG的表面表达。如图4的第一行所示，呈现了用GFP报告基因的IgG-Fc表面表达结果。在图4的底行中，呈现了带有GFP标志物的全长利妥昔单抗的表面表达结果。X轴上GFP的荧光与CHO细胞的表面上的Fc和利妥昔单抗的表面密度表达成比例。在CHO细胞的表面上表达的这两种IgG分子中的每一种都具有与可溶性IgG一样的功能，允许使用流式细胞术来研究IgG的不同部分。这消除了进行蛋白质纯化以优化mAb与其同源抗原和先天免疫效应细胞的表面上表达的三类Fc-γ受体(FcγR)的结合特性的需要。
先前的研究几乎没有触及IgG的铰链区，因为它非常灵活，并且两个铰链与FcγR紧密且不对称地结合。通过缺失WT铰链区序列ELLGGPS制备IgG1 FcΔ16。将氨基酸添加到IgG1FcΔ16的N末端，并选择获得CD16α结合的变体进行下一轮修饰。使用CHO细胞展示平台产生了几个从头铰链区，与原始(或野生型)铰链区相比，所述平台对FcγR的亲和力更高。重要的是要注意，此技术也是一种平台技术，因为它可以用于修饰已知序列的任何抗体，以获得对FcγR的结合亲和力增加或减少的变体。
图5展示了IgG1Fc的新下部铰链的产生，所述新下部铰链具有增强的对CD16α的结合亲和力和对IdeS和IdeZ切割的抗性。以逐步方式将氨基酸添加到不结合CD16α的IgG1Δ16(SEQ ID NO:16)的N末端。通过逐步连接更多个氨基酸以增加结合亲和力来选择获得CD16α结合的克隆。经测试发现对IdeS/Z具有抗性并且对CD16α示出了与野生型序列类似或更高的结合亲和力的7AA从头铰链区被移植到mAb。
人IgG1的野生型下部铰链区以相对较低的亲和力与FcγRIII CD16α结合(图6)。图(A)示出了缺乏野生型铰链(ELLGGPS；SEQ ID NO:544)的人IgG1 FcΔ16(SEQ ID NO:16)失去与FcγRIII CD16的结合。将2个氨基酸的四百(400)种组合添加到人IgG1 FcΔ16的N末端，并且单独地测量其与CD16α和其它FcγR的结合。在所有获得CD16a结合的序列中，选择DW进行下一轮优化，从而鉴定CWDW，并且随后鉴定其它6和7个AA序列。
图6展示了通过在IgG1FcΔ16的N末端顺序添加AA来逐步获得CD16α结合。图6A示出了人IgG1FcΔ16与EGFR跨膜螺旋结构域融合并在CHO细胞表面上展示为1型膜蛋白的各种构建体的结合亲和力。由于缺乏铰链区，IgG1FcΔ16不结合人CD16α。在IgG1FcΔ16的N末端添加四百种2AA组合，并通过快速流式细胞术分析单独地测定其与CD16a的结合。选择前两个AA，DW进行进一步优化，并使鉴定4AA、6AA和7AA从头铰链，其中CD16a结合增加，如图所示。这些实验是在存在IdeS的情况下进行的，证明了新型IgG1铰链区对切割的抗性。图6B示出了添加更多个AA时所有阳性克隆的单独的图。
图7示出了从用利妥昔单抗-EGFR转染的CHO细胞收集的数据。利妥昔单抗的铰链区由野生型(WT)铰链(ELLGGPS；SEQ ID NO:544)或两个从头IdeS/IdeZ抗性铰链之一：EETCWDW构成，其对FcγR CD16α的亲和力高于WT或EDSCWDW，其对FcγR CD16α的亲和力低于WT。使用可溶性荧光标记的CD16αVal176结合和荧光标记的抗人Fc抗体(结合不受切割影响的Fc区)完成对CHO细胞上的表面IgG1表达的评估。CD16αVal176和Phe176是对IgG1具有不同亲和力的多态性。经转染的CHO细胞单独与培养基一起温育(对照，上行)或在染色之前用IdeZ在37℃下消化持续30分钟(下行)。IgG1对CD16α的结合亲和力指示在每个直方图的左上象限中。如下行所示，与IdeZ温育导致WT铰链断裂(其中CD16α结合和亲和力丧失)，而从头铰链对IdeZ的切割具有抗性，并且因此与上行相比时，保留了结合力和几乎相同的亲和力。
从头铰链可以移植到不同的抗体中，并且仍然保留相同的IdeS/IdeZ抗性和改进的FcγR结合(图8、图10)。可以产生类似的构建体来修饰mAb与三类IgG FcγR的结合。众所周知，存在三类FcγR：FcγRI(CD64)具有最高的亲和力，并且存在于粒细胞上；FcγRII(CD32)具有中等亲和力，并且存在于单核细胞和树突状细胞上；FcγRIII(CD16)具有较低亲和力，并且存在于单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上。IgG含有两个Fab臂、Fc结构域和连接在Fab臂与Fc结构域之间的柔性铰链区。IgG的Fc结构域和铰链区两者都有助于结合在先天免疫效应细胞上表达的FcγR(包含CD64、CD32、CD16)，并通过包含抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的细胞方式介导靶细胞破坏。已经为改进IgG-FcγR结合做出了显著努力。
图8示出了各种FcγR对表达利妥昔单抗的CHO细胞的结合亲和力，所述利妥昔单抗的铰链部分是WT(ELLGGPS；SEQ ID NO:544)或已经使用本文所描述的和图7所示的方法用新的从头铰链区变体(EETCWDW，SEQ ID NO:545或EDSCWDW，SEQ ID NO:546)进行工程化。使用如Y轴所指示的荧光标记的FcγR胞外域和X轴上的荧光标记的抗人Fc抗体对所得的各种FcγR的表面IgG表达和结合亲和力进行定量。每个直方图的左上象限指示了对每个铰链部分的FcγR结合亲和力。应注意，与WT(ELLGGPS，SEQ ID NO:544)相比，两个新的AA铰链区(EETCWDW，SEQ ID NO:545和EDSCWDW，SEQ ID NO:546)对CD16b和CD32a的亲和力明显降低，但示出了对CD16α和CD64的更高亲和力。
图9提供了展示新型铰链区(EETCWDW)对IdeS/IdeZ的切割的抗性的代表性实例。在此实例中，抗CD20 mAb利妥昔单抗要么含有其野生型(WT)铰链区，要么已被工程化为表达新的(EETCWDW)铰链区。WT利妥昔单抗或EETCWDW利妥昔单抗首先在存在或不存在IdeZ蛋白酶的情况下在37℃下温育30分钟。接下来，将CD20(+)Daudi淋巴瘤细胞与经处理的WT或新型(EETCWDW)利妥昔单抗一起温育，洗涤，并且然后用荧光标记的抗人Fc抗体染色。当用荧光标记的抗人Fc抗体染色时，与IdeZ预温育的WT利妥昔单抗不再能够在CD20(+)Daudi淋巴瘤细胞的表面上检测到(左直方图，虚线)，而EETCWDW利妥昔单抗仍然可以检测到(右直方图，虚线)。
实例3：内肽酶抗性铰链和FcγR结合
对EETCWDW铰链区和其变体的FcγR结合性质和对IdeS/IdeZ抗性的选择代表了一种平台技术，因为使用第二种不相关的治疗性mAb，即被称为曲妥珠单抗或
的抗Her2/neu mAb，使用抗CD20 mAb利妥昔单抗观察到的结果具有高度可重复性。图10示出了用曲妥珠单抗-EGFR转染的CHO细胞。曲妥珠单抗含有其野生型(WT)铰链部分或两个从头新铰链部分EETCWDW(SEQ ID NO:545)或EDSCWDW(SEQ ID NO:546)之一，所述新铰链部分被工程化为使用本文所描述的用于利妥昔单抗的相同方法替换曲妥珠单抗的WT铰链区。当使用相同的两个新铰链区进行工程化时，EETCWDW和EDSCWDW曲妥珠单抗展示了与利妥昔单抗展示的相同的结合性质，如图8所示。具体地，与WT(ELLGGPS)相比，具有AA铰链区的两种新型曲妥珠单抗mAb(EETCWDW或EDSCWDW)示出了对CD16β和CD32α的亲和力明显降低，但对CD16α和CD64的亲和力高于WT，但IdeZ或IdeS均未示出切割(未示出)。使用如Y轴所指示的荧光标记的FcγR胞外域和X轴上的荧光标记的抗人Fc抗体对所得的各种FcγR的表面IgG表达和结合亲和力进行定量。每个直方图的左上象限指示了对每个铰链部分的FcγR结合亲和力。
图11分别示出了通过对CD16/CD62L和CD107α/CD69染色来激活自然杀伤(NK)细胞。EETCWDW利妥昔单抗对CD16α的更高亲和力(与WT利妥昔单抗相比)导致对NK细胞的激活更大或更强烈。当NK细胞的CD16识别并结合与B细胞靶标结合的EETCWDW利妥昔单抗时，与识别与B细胞靶标结合的WT利妥昔单抗的NK细胞CD16相比，CD16α的下调幅度更大(比较图11A上部“对照”行左下象限“WT”(45.2)对“EETCWDW”(80.5))。CD62L也是如此，其在NK细胞激活后下调。当NK细胞识别与B细胞靶标结合的EETCWDW利妥昔单抗时，与识别与B细胞靶标结合的WT利妥昔单抗的NK相比，CD107α的上调幅度更大(比较图11B上部“对照”行右上象限“WT”(35.3)对“EETCWDW”(62.8))。CD69也是如此。进一步，通过IdeZ进行的治疗实际上消除了WT利妥昔单抗对NK细胞的激活(比较图11A“对照”行，左下象限“WT”(45.2)对下“IdeZ”行，左下象限“WT”(8.8)；并且比较(图11B)上“对照”行右上象限“WT”(35.8)对下“IdeZ”行，右上象限“WT”(1.9))。相比之下，通过IdeZ进行的治疗导致EETCWDW利妥昔单抗对NK细胞的激活没有或很少降低(比较图11A“对照”行，左下象限“EETCWDW”(80.5)对下“IdeZ”行，左下象限“EETCWDW”(80.5)；并且比较图11B上“对照”行右上象限“EETCWDW”62.8)对下“IdeZ”行，右上象限“EETCWDW”(47.5))。
图11C示出了代表性数据证明了当与WT利妥昔单抗相比时，EETCWDW利妥昔单抗对CD16α的更高亲和力导致通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)使血液中的B细胞的NK细胞耗竭更大，并且在存在IdeZ(“IdeZ”)的情况下甚至更大的耗竭。当NK细胞识别在没有IdeZ(“对照”)的情况下与血液中的CD19(+)B细胞靶标结合的EETCWDW利妥昔单抗时，与识别与对照血液中的CD19(+)B细胞靶标结合的WT利妥昔单抗的NK相比，CD19(+)B细胞的耗竭增加17％(比较图11C上部“对照”行右下象限“WT”(6.0)对“EETCWDW”(5.0))。然而，当识别WT利妥昔单抗与对照血液中的CD19(+)B细胞靶标结合的NK细胞与和IdeZ温育后识别WT利妥昔单抗与CD19(+)B细胞靶标结合的NK细胞进行比较时，CD19(+)B细胞耗竭恶化63％(比较图11C上部“对照”行右下象限“WT”(6.0)对下“IdeZ”行右下象限“WT”(9.8))。相比之下，与IdeZ温育后，当NK细胞识别EETCWDW利妥昔单抗与CD19(+)B细胞靶标结合时，在与对照血液温育后，当与识别WT利妥昔单抗与CD19(+)B细胞靶标结合的NK细胞相比时，CD19(+)B细胞耗竭改善了50％(比较图11C上“对照”行右下象限“WT”(6.0)对下“IdeZ”行右下象限“EETCWDW”(3.0))。
在图11A中，证明了，EETCWDW利妥昔单抗对CD16α的更高亲和力(与WT利妥昔单抗相比)导致全血中的NK细胞的激活更大或更强，如通过CD16α的下调所测量的。图12展示了血液中的AB血清浓度的增加(并因此增加内源性IgG的浓度)如何与EETCWDW利妥昔单抗竞争结合NK细FcγRIIIA(CD16α)，从而降低NK细胞激活(比较NK细胞的CD16识别和结合与含有6.7％血清的血液中的B细胞结合的EETCWDW利妥昔单抗(14.2％的NK细胞下调CD16的表面表达)的能力与NK细胞的CD16识别和结合与含有40％血清的血液中的B细胞结合的EETCWDW利妥昔单抗的能力(仅5.5％的NK细胞下调CD16的表面表达))。然而，将IdeZ添加到40％血清中显著去除了内源性IgG与NK细胞FcγRIIIA(CD16α)的结合，并允许NK细胞的CD16识别并结合与血液中的B细胞结合的EETCWDW利妥昔单抗，从而使NK细胞激活增加，如通过CD16α的显着下调测量的(在没有IdeZ的40％AB血清中为5.5％，而在含有IdeZ的40％AB血清中为22.7％)。
实例4：利妥昔单抗变体
人血浆中的内源性IgG结合所有先天免疫细胞上的Fcγ受体(R)，限制了外源性施用的治疗性抗体对自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞上的FcγR的访问。利妥昔单抗是具有人IgG1恒定区的CD20抗体。利妥昔单抗的Fab区与B细胞上的CD20结合，并且其Fc区结合FcγRIIIa(CD16)，并且通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)激活NK细胞，从而耗竭良性或恶性B细胞群体。为了发生ADCC，治疗性抗体必须将FcγR先天免疫效应细胞与其Fc区结合，并且它必须将靶细胞上的抗原与其Fab区结合。所述发现的重点是增强(1)结合亲和力和(2)增强治疗性抗体的Fc区与先天免疫效应细胞表面上表达的FcγR数量的占有率百分比。本文中的数据使用(1)与CD20结合并且可以耗竭正常和恶性B细胞两者的众所周知的治疗性抗体利妥昔单抗；(2)人NK细胞作为带有FcγR的先天免疫细胞证明了这些原理。本文所描述的发现/发明意在描述一种平台，所述平台可以适用于任何治疗性抗体，所述抗体通过结合FcγR来参与任何免疫细胞的其部分或全部功能。
抗体疗法的挑战之一是它必须与存在于人体内的大量内源性IgG竞争FcγR结合，并且治疗性mAb的铰链区中的修饰以改善其与FcγR的结合不会完全取代内源性IgG与所有先天免疫效应细胞上的FcγR结合。这进而又会限制通过ADCC和/或ADCP发挥作用的mAb的治疗效果。然而，已经在人体中证明，静脉内施用IgG肽酶IdeZ和IdeS会在铰链区处切割内源性IgG，并完全破坏内源性IgG-FcγR结合，使FcγR空缺以供治疗性mAb结合。由于很少有序列修饰集中在IgG铰链区，大多数人源化抗体都具有野生型铰链序列，并且因此对IdeZ和IdeS切割敏感，因此，用IdeZ或IdeS处理也会切割治疗性mAb的铰链区。重要的是，使用任何治疗性mAb策略中产生的CHO细胞展示对铰链区的修饰可以抵抗IgG肽酶IdeZ和IdeS的切割(图7和图9)。因此，从实际的角度来看，IgG肽酶IdeZ和IdeS可以施用于患者(Jordan等人)，切割所有内源性IgG，并且因此打开所有IgG-FcγR以与经修饰的mAb独家结合，大大增加了配备有治疗性mAb并能够执行ADCC和ADCP的先天免疫效应细胞的数量。因此，这一发现可以显著提高治疗性mAb的功效，其作用机制部分或完全通过ADCC和ADCP发生，如用于治疗淋巴瘤和多发性硬化症的利妥昔单抗。
IdeZ(和IdeS)酶在内源性IgG以及野生型利妥昔单抗的天然ELLGGPS氨基酸(AA)铰链序列的第一个甘氨酸之后立即切割人IgG1，从而从结合Fcγ受体中去除内源性IgG和野生型利妥昔单抗两者，消除NK细胞激活(图11A，顶行)并将利妥昔单抗介导的B细胞耗竭降低>50％(即，6％到9.8％；图11B，顶行)。IdeZ没有用新的EETCWDW AA铰链序列切割合成的利妥昔单抗(在图8和9中被称为“EETCWDW利妥昔单抗”)。因此，IdeZ的存在并未取消NK细胞激活(图11A，底行)，并改善了B细胞的ADCC耗竭(图11A，底行)。IdeZ介导的内源性IgG从与Fcγ受体结合中的去除可能为“EETCWDW利妥昔单抗”创造了更多的Fcγ受体结合，并且因此与不存在IdeZ的野生型利妥昔单抗相比，NK细胞ADCC和B细胞耗竭增加了50％(图11B，分别为3.0％对6.0％的残留B细胞)。
当NK细胞通过将其Fc区与NK细胞的FcγRIII(CD16)结合并将Fab区与靶细胞结合来参与治疗性单克隆抗体时，NK细胞被激活，ADCC发生，并且CD16在NK细胞的表面上被下调。随着血浆或血清的增加，内源性IgG的量增加并竞争性抑制外源性治疗性抗体Fc区与NK细胞CD16的结合，从而限制了NK细胞结合治疗性抗体并通过ADCC激活以杀死预期靶标的能力(图12；比较6.7％血清中的14.2％的CD16下调与40％血清中的5.5％的CD16下调)。在添加IdeZ的情况下，内源性IgG被切割，并且不能与CD16结合，从而释放NK细胞上的CD16结合位点，以供抗IdeZ的“EETCWDW利妥昔单抗”在40％血清的情况下结合并激活NK细胞(比较5.5％在不存在IdeZ的情况下的CD16下调与在存在IdeZ的情况下的22.7％的CD16下调。这导致肿瘤靶标的耗竭被改善，在这种情况下是血液中的B细胞(图11B)。这些原理适用于NK细胞(CD16)上的FcγR，但也适用于单核细胞、巨噬细胞(CD16和CD32a)以及粒细胞(CD64)上的Fcγ，它们的每个FcγR通常都被内源性IgG占据。
通过在利妥昔单抗与CD20结合的区域中引入随机突变来产生利妥昔单抗文库，从而启动亲和力选择过程，并且许多变体的特征在于对CD20的亲和力增加或减少。使用EGFR-TMH融合蛋白在CHO细胞的表面表达变体，并评估每个变体对荧光标记的CD20的结合亲和力(图13)。图13中的数据证明，利妥昔单抗在CHO细胞的表面上以利妥昔单抗-EGFR融合蛋白的形式表达。X轴示出了可以与表达IgG1-EGFR或利妥昔单抗-EGFR的CHO细胞结合的荧光标记的抗Fc mAb。Y轴示出了可以与利妥昔单抗-EGFR结合的荧光标记CD20分子。在左侧直方图中，CHO细胞表达IgG1 Fc-EGFR，因此在X轴上结合但在Y轴上不结合。中间直方图表示利妥昔单抗-EGFR，并定量了利妥昔单抗对CD20的亲和力。右侧的直方图示出了荧光标记的CD20分子与利妥昔单抗(线A)或与和实际利妥昔单抗相比对CD20具有更高亲和力的利妥昔单抗的假设变体(线B)或与和实际利妥昔单抗相比对CD20具有更低亲和力的利妥昔单抗的假设变体(线C)的结合。右图示出了CHO细胞的表面上Fc的CH2-CH3片段的表达，因此没有与人荧光标记的CD20分子结合。
图14展示了序列依赖性利妥昔单抗靶选择和对应序列的流式细胞术密度图。代表性的实例示出了来自由CD20结合变体组成的利妥昔单抗文库的多个克隆，以及每个变体与荧光标记的CD20分子的结合亲和力的流式细胞术测量结果，如图13所展示。
利妥昔单抗重链CDR1、CDR2、CDR3和轻链CDR3是涉及结合CD20的主要区域。为了测试和验证本文所描述的实施例，分别在重链CDR1、CDR2和CDR3中制作突变文库，并鉴定了来自每个文库的代表性突变体。这些突变体仅在指定的CDR区域有所不同。例如，克隆A-P01A09在重链CDR1处与野生型利妥昔单抗不同，其中突变下划线。因此，轻链CDR1、CDR2和CDR3是野生型、非突变的利妥昔单抗序列。具体地，本文所描述的所有变体包含野生型利妥昔单抗轻链CDR1(核酸序列：GCGAGCAGCAGCGTGAGC；氨基酸序列：ASSSVS)，轻链CDR2(核酸序列：GGAAGCGGCACCAGC；氨基酸序列：GSGTS)和轻链CDR3(核酸序列：TGGACCAGCAACCCGCCG；氨基酸序列：WTSNPP)。
下表1-3和图14中提供了所测试的CDR区变体。所述表指示在本文所描述的实验中创建和测试的克隆。每个克隆在单个CDR区中具有变体，其中其它CDR区是野生型或非突变的利妥昔单抗。在此情况下，野生型是抗CD20抗体利妥昔单抗的CDR。与非变异或“野生型”CDR相比，CDR的变化在表中用下划线表示。例如，表1示出了在利妥昔单抗的CDR1中具有突变(下划线)并且具有与非突变(也称为野生型(WT))利妥昔单抗相同的CDR2和CDR3的克隆。表1中的每个克隆都具有编码利妥昔单抗的核酸序列，除了提到的相对于利妥昔单抗的CDR变化。例如，第一行中的克隆P01A09相对于利妥昔单抗具有变体重链CDR1(下划线序列示出了特定差异)，但重链CDR2和重链CDR3相对于利妥昔单抗是非突变序列。另外，P01A09包含非突变的轻链CDR1、非突变的轻链CDR2、非突变的轻链CDR3。实际上，除了变体重链CDR1之外，P01A09的序列与利妥昔单抗的序列相匹配。
表1.
表2.CDR2变体
表3.CDR3变体
图15展示了通过单个氨基酸取代逐渐获得IdeS抗性。IdeS/Z切割位点上游的第一亮氨酸(L248)单独地突变为其它19个氨基酸。利妥昔单抗的野生型或单氨基酸突变体作为I型膜蛋白在CHO细胞上表达，并且使用荧光标记的抗人IgG Fc和CD16α胞外域测试其表达和与人CD16α的结合。L248E和L248D突变获得了显著的IdeS抗性，其中CD16α结合仅轻微丧失。
图16展示了野生型、L248E和L248D铰链突变体利妥昔单抗与人FcγR的结合。利妥昔单抗的野生型或单一氨基酸突变体(L248E和L248E)作为I型膜蛋白在CHO细胞上表达，并使用荧光标记的抗人Fc和不同的人FcγR胞外域测试其表达和与人FcγR的结合。与野生型蛋白质相比，L248E和L248D突变对CD16α、CD16β和CD32α的亲和力略有下降，并且对CD64的亲和力增加。
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Claims (108)
1.一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其包括通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述铰链区对蛋白酶的切割具有抗性。
2.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
3.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
4.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG2抗体。
5.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG3抗体。
6.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述IgG抗体是IgG4抗体。
7.根据权利要求6所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括根据Kabat编号在氨基酸位置246到252之间的蛋白酶抗性序列。
8.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为2个或更多个氨基酸。
9.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
10.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
11.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
12.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
13.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
14.根据权利要求7所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
15.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
16.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
17.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
18.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
19.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
20.根据权利要求19所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。
21.根据权利要求20所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IdeS。
22.根据权利要求20所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IdeZ。
23.根据权利要求1所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
24.一种免疫球蛋白G(IgG)抗体，其中所述抗体包括通过铰链区连接的Fab区和Fc区，其中所述Fc区对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
25.根据权利要求24所述的IgG抗体，其中与野生型Fc区相比，所述Fc区包括赋予对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的更高结合亲和力的一种或多种氨基酸取代。
26.根据权利要求25所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括根据Kabat的EU编号选自S252D、I351E和A349L的氨基酸取代，并且其中与野生型IgG抗体相比，所述取代赋予对CD16(FcγRIII)的更高结合亲和力。
27.根据权利要求26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D。
28.根据权利要求26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代I351E。
29.根据权利要求26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D和I351E。
30.根据权利要求26所述的IgG抗体，其中所述Fc区包括氨基酸取代S252D、I351E和A349。
31.根据权利要求24所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
32.根据权利要求24所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
33.根据权利要求24所述的IgG抗体，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
34.根据权利要求24所述的IgG抗体，其中所述抗体对蛋白酶切割具有抗性。
35.根据权利要求34所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
36.根据权利要求35所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeS。
37.根据权利要求35所述的IgG抗体，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeZ。
38.根据权利要求34所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
39.根据权利要求34所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括根据Kabat编号在氨基酸位置246到252处的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
40.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
41.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
42.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
43.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
44.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
45.根据权利要求39所述的IgG抗体，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
46.一种重组蛋白，其包括：
(i)I型跨膜结构域；以及
(ii)包括C末端的免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述I型跨膜结构域与所述IgG抗体的所述C末端融合；并且
其中所述重组蛋白对蛋白酶的切割具有抗性。
47.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域能够二聚化。
48.根据权利要求到46中任一项所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。
49.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。
50.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
51.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
52.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG2抗体。
53.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG3抗体。
54.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG4抗体。
55.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括Fc(可结晶片段)区、Fab(抗原结合片段)区和铰链区。
56.根据权利要求55所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括Fc区。
57.根据权利要求55所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体包括铰链区。
58.根据权利要求55所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括根据Kabat的EU编号在氨基酸位置246到252之间的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
59.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
60.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
61.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
62.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
63.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
64.根据权利要求58所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
65.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
66.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
67.根据权利要求46到66中任一项所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
68.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
69.根据权利要求46到68中任一项所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
70.根据权利要求69所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶选自IdeS和IdeZ。
71.根据权利要求70所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeS。
72.根据权利要求70所述的重组蛋白，其中所述IgG特异性蛋白酶是IdeZ。
73.根据权利要求46所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
74.一种重组蛋白，其包括：
(i)I型跨膜结构域；以及
(ii)包括C末端的免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述I型跨膜结构域与所述IgG抗体的所述C末端融合；并且
其中所述重组蛋白包括对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M的Fc区。
75.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域能够二聚化。
76.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域选自EGFR、PDGFR-α、PDGFR-β、HER2、HER3、HER4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Trk-A、Trk-B、Trk-C和胰岛素受体跨膜结构域。
77.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述I型跨膜结构域是EGFR跨膜结构域。
78.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
79.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG1抗体。
80.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG2抗体。
81.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG3抗体。
82.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述IgG抗体是IgG4抗体。
83.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中与野生型Fc区相比，所述Fc区包括赋予对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的高结合亲和力的一个或多个氨基酸。
84.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD32的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
85.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD16的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
86.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述Fc区对CD64的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
87.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白对蛋白酶切割具有抗性。
88.根据权利要求87所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶是IgG特异性蛋白酶。
89.根据权利要求88所述的重组蛋白，其中所述IgG蛋白酶是IdeS。
90.根据权利要求88所述的重组蛋白，其中所述IgG蛋白酶是IdeZ。
91.根据权利要求87所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶选自胃蛋白酶、基质金属蛋白酶7(MMP7)、基质金属蛋白酶3(MMP3)、基质金属蛋白酶(MMP12)、组织蛋白酶G和谷氨酰内肽酶V8(GluV8)。
92.根据权利要求74所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白包括铰链区，并且其中所述铰链区包括根据Kabat编号在氨基酸位置246到252处的并且长度为2个或更多个氨基酸的蛋白酶抗性序列。
93.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为3个氨基酸。
94.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为4个氨基酸。
95.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为5个氨基酸。
96.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为6个氨基酸。
97.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述蛋白酶抗性序列的长度为7个氨基酸。
98.根据权利要求92所述的重组蛋白，其中所述铰链区包括SEQ ID NO:545的氨基酸。
99.一种分离的核酸，其编码根据权利要求46到98中任一项所述的重组蛋白。
100.一种表达载体，其包括根据权利要求99所述的核酸。
101.一种细胞，其包括根据权利要求100所述的表达载体。
102.根据权利要求101所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
103.根据权利要求101所述的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
104.根据权利要求101所述的细胞，其中在所述细胞的表面处表达IgG抗体。
105.一种抗CD20抗体，其包括由SEQ ID No:551-588中的任一个的核酸序列编码的互补决定区(CDR)。
106.一种将配体与CHO细胞表面重组蛋白结合的方法，所述方法包括使配体与CHO细胞表面重组蛋白接触，其中所述CHO细胞表面重组蛋白包括：
i.EGFR跨膜结构域；以及
ii.包括C末端的免疫球蛋白G(IgG)抗体；
其中所述EGFR跨膜结构域与所述IgG抗体的所述C末端融合；并且
其中所述IgG抗体能够结合配体；并且
其中所述CHO细胞表面蛋白对IgG特异性蛋白酶的切割具有抗性或对CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个具有更高的结合亲和力。
107.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗性IgG抗体和IgG特异性蛋白酶，其中所述治疗性IgG抗体对IgG特异性蛋白酶具有抗性。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述治疗性IgG抗体对CD20、CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)和CD64(FcγRI)中的一个或多个的解离常数为约1×10-5M到约1×10-13M。
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