KR20150045443A - FcγRIIb 특이적 Fc영역 개변체 - Google Patents
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Abstract
(과제) 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물, 그 의약 조성물을 함유하는 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제, 및 이들의 제조방법, 추가로 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키며, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
(해결수단) EU 넘버링 238번째의 아미노산 개변과 다른 특정 아미노산 개변이 조합되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 것을 발견하였다.
(해결수단) EU 넘버링 238번째의 아미노산 개변과 다른 특정 아미노산 개변이 조합되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 것을 발견하였다.
Description
본 발명은 항체의 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써, 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.
항체는 혈중에서의 안정성이 높고 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 현재 시판되고 있는 항체 의약의 대부분이 인간 IgG1 서브클래스의 항체이다. IgG 클래스의 항체의 기능 중 하나로서 항체 의존성 세포 장애 활성(이하, ADCC 활성으로 표기한다)이 알려져 있다(비특허문헌 3). 항체가 ADCC 활성을 발휘하기 위해서는 항체의 Fc영역과 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 활성화된 마크로파지 등의 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 항체 결합 수용체인 Fcγ 수용체(이하, FcγR로 표기한다)와의 결합이 필요하다.
인간의 경우는 FcγR의 단백질 패밀리에는 FcγRIa(CD64A), FcγRIIa(CD32A), FcγRIIb(CD32B), FcγRIIIa(CD16A), FcγRIIIb(CD16B)의 아이소폼이 보고되어 있고, 각각의 알로타입도 보고되어 있다(비특허문헌 7). FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa는 면역 활성적인 기능을 갖기 때문에 활성형 FcγR로 불리고, FcγRIIb는 면역 억제적인 기능을 가져 억제형 FcγR로 불린다(비특허문헌 8).
Fc영역과 FcγR의 결합에 대해서는 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인 내의 몇 개의 아미노산 잔기 및 CH2 도메인에 결합되어 있는 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄가 중요한 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 4, 비특허문헌 5, 비특허문헌 6). 이들 개소로 변이를 도입한 항체를 중심으로 지금까지 다양한 FcγR 결합 특성을 갖는 변이체가 연구되어, 활성형 FcγR에 대한 보다 높은 결합 활성을 갖는 Fc영역 변이체가 얻어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4).
활성형 FcγR은 면역 복합체로 가교되면 세포내 도메인 또는 상호작용 상대인 FcR common γ-chain에 포함되는 immunoreceptor tyrosine-based activating motifs(ITAMs)의 인산화를 일으켜 시그널 전달물질인 SYK를 활성화하고, 활성화 시그널 캐스케이드를 개시함으로써 염증성 면역 반응을 일으킨다(비특허문헌 9).
FcγRIIb는 B세포에 발현되고 있는 유일한 FcγR이다(비특허문헌 10). FcγRIIb에 대해 항체의 Fc영역이 상호작용함으로써 B세포의 초회 면역이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11). 또한 B세포 상의 FcγRIIb와 B세포 수용체(B cell receptor:BCR)가 혈중 면역 복합체를 매개로 가교되면 B세포의 활성화가 억제되어 B세포의 항체 생산이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 12). 이 BCR과 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 시그널의 전달에는 FcγRIIb의 세포내 도메인에 포함되는 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)가 필요하다(비특허문헌 13, 비특허문헌 14). 시그널이 들어가고 ITIM이 인산화되면 SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase(SHIP)가 리쿠르트되어, 다른 활성형 FcγR의 시그널 캐스케이드의 전달을 저해하여 염증성 면역 반응을 억제한다(비특허문헌 15). 또한 FcγRIIb만을 회합화함으로써도 BCR 비의존적으로 IgM 생산 B세포를 아포토시스하지 않고 B세포의 증식과 BCR의 가교에 의한 칼슘 유입을 일과적으로 억제하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 16).
또한 FcγRIIb는 수상 세포, 마크로파지, 활성화된 호중구, 마스트 세포, 호염기구에서도 발현되고 있다. 이들 세포에 있어서도 FcγRIIb는 phagocytosis나 염증성 사이토카인의 방출 등의 활성형 FcγR의 기능을 저해하여 염증성 면역 반응을 억제한다(비특허문헌 8).
FcγRIIb의 면역 억제적인 기능의 중요성에 대해서는 지금까지 FcγRIIb 녹아웃 마우스를 사용한 연구에 의해 명확해져 왔다. FcγRIIb 녹아웃 마우스의 경우는 액성 면역이 적절히 제어되지 않고(비특허문헌 17), 콜라겐 유도 관절염(CIA)에 대한 감수성이 증가되는 것이나(비특허문헌 18), 루프스(lupus) 유사 증상을 나타내는 것, 굿파스처(Goodpasture) 증후군 유사 증상을 나타내는(비특허문헌 19) 것이 보고되어 있다.
또한 FcγRIIb의 조절 부전은 인간의 자기면역 질환과의 관련도 보고되어 있다. 예를 들면 FcγRIIb의 프로모터 영역이나 세포막 관통 영역에 있어서의 유전자 다형과 전신성 에리테마토데스(SLE)의 발증 빈도의 관련(비특허문헌 20, 비특허문헌 21, 비특허문헌 22, 비특허문헌 23, 비특허문헌 24)이나, SLE 환자의 B세포 표면에 있어서의 FcγRIIb의 발현 저하가 보고되어 있다(비특허문헌 25, 비특허문헌 26).
이와 같이 마우스 모델 및 임상상의 지견(知見)으로부터 FcγRIIb는 특히 B세포와의 관여를 통해 자기면역 질환, 염증성 질환을 제어하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되어 자기면역 질환, 염증성 질환을 제어하기 위한 유망한 표적 분자이다.
시판의 항체 의약으로서 주로 사용되고 있는 IgG1은 FcγRIIb뿐 아니라 활성형 FcγR에도 강하게 결합하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 27). FcγRIIb에 대한 결합을 증강시켰거나 또는 활성형 FcγR과 비교하여 FcγRIIb로의 결합 선택성을 향상시킨 Fc영역을 이용함으로써 IgG1과 비교하여 면역 억제적인 성질을 가진 항체 의약의 개발이 가능하다. 예를 들면 BCR에 결합하는 가변영역과 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체를 이용함으로써 B세포의 활성화를 저해할 수 있을 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 28). B세포 상의 FcγRIIb와 B-cell receptor에 결합한 IgE가 가교됨으로써 B세포의 플라즈마 세포로의 분화, 그 결과로서 일어나는 IgE 생산이 억제되어 인간 PBMC를 이식한 마우스에 있어서 인간 IgG나 IgM 농도는 유지되고 있으나, 인간 IgE 농도는 감소하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 29). IgE뿐 아니라 B-cell receptor의 복합체의 구성 분자인 CD79b와 FcγRIIB를 항체로 가교한 경우에는, in vitro에 있어서 B세포의 증식이 억제된 것, 콜라겐 관절염 모델에 있어서는 그 증상이 완화된 것이 보고되어 있다(비특허문헌 30).
B세포 이외에도 IgE의 수용체인 FcεRI와 결합하는 IgE의 Fc부분과 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 IgG의 Fc부분을 융합시킨 분자를 사용하여 마스트 세포 상의 FcεRI와 FcγRIIb를 가교함으로써 FcγRIIb의 인산화를 일으켜 FcεRI 의존적인 칼슘의 유입을 억제하는 것이 보고되어 있고, 이는 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킴으로써 FcγRIIb의 자극을 매개로 한 탈과립의 저해가 가능한 것을 시사하고 있다(비특허문헌 31).
이들 사실로부터, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시킨 Fc를 갖는 항체가 자기면역 질환 등의 염증성 질환의 치료제로서 유망한 것이 시사된다.
또한 항체와 항원의 면역 복합체 존재하에서는 LPS 자극에 의한 Toll-like receptor 4를 매개로 한 수상 세포, 마크로파지의 활성화를 억제하는 것이 보고되어 있고, 이 효과도 면역 복합체의 FcγRIIb를 매개로 한 작용인 것이 시사되어 있다(비특허문헌 32,33). 이 사실로부터, FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체를 사용함으로써 TLR을 매개로 한 활성화 시그널을 억제하는 작용을 증강시키는 것이 가능할 것으로 기대되어, 자기면역 질환 등의 염증성 질환의 치료제로서 유망한 것이 시사된다.
또한 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 변이체는 자기면역 질환 등의 염증성 질환의 치료제에 더하여 암 치료제로서도 유망한 것이 시사되어 있다. 지금까지 FcγRIIb는 항TNF 수용체 슈퍼패밀리에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성에 있어서 중요한 역할을 하는 것이 명확해져 있다. 구체적으로는 TNF 수용체 패밀리에 포함되는 CD40, DR4, DR5, CD30, CD137에 대한 항체의 아고니스트 활성에는 FcγRIIb와의 상호작용이 필요한 것이 시사되어 있다(비특허문헌 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40). 비특허문헌 34에 있어서는 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체를 사용함으로써 항CD40 항체의 항종양 효과가 증강되는 것이 나타내어져 있다. 이 사실로부터, FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체는 항TNF 수용체 슈퍼패밀리에 대한 항체를 비롯한 아고니스트 항체의 아고니스트 작용을 증강시키는 효과가 있을 것으로 기대된다.
이에 더하여, Receptor Tyrosine kinase(RTK)의 하나인 Kit를 인식하는 항체를 사용하여 Kit를 발현하는 세포 상에서 Kit와 FcγRIIb를 가교함으로써 세포의 증식이 억제되는 것이 나타내어져 있다. 이 Kit가 항상적으로 활성화되어 암화를 촉진시키는 변이를 가지고 있던 경우라도 동일한 효과가 보고되어 있다(비특허문헌 41). 이 사실로부터, FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체를 사용함으로써 항상적으로 활성화된 변이를 갖는 RTK를 발현한 세포에 대한 억제작용을 증강시키는 것이 가능할 것으로 기대된다.
지금까지 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시킨 Fc를 갖는 항체에 대해서 보고가 되어 있다(비특허문헌 28). 이 문헌 중에서는 항체의 Fc영역에 S267E/L328F, G236D/S267E, S239D/S267E 등의 개변을 가함으로써 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시키고 있었다. 이 중에서 S267E/L328F의 변이를 도입한 항체가 가장 강하게 FcγRIIb에 대해 결합하고, FcγRIa 및 FcγRIIa의 131번째의 잔기가 His인 FcγRIIa H형에 대한 결합은 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지되고 있었다. 그러나 다른 보고에 따르면, 이 개변은 FcγRIIa의 131번째의 잔기가 His인 FcγRIIa R형에 대한 결합이 FcγRIIb에 대한 결합과 같은 정도로 수백 배 증강되어 있어, FcγRIIa R형과 비교한 경우 FcγRIIb에 대한 결합의 선택성이 향상되어 있지 않다(특허문헌 5).
FcγRIIb를 발현하지 않고 FcγRIIa를 발현하고 있는 혈소판과 같은 세포(비특허문헌 8)에 관하여는 FcγRIIb에 대한 결합의 증강이 아니라 FcγRIIa에 대한 결합의 증강 효과만이 영향을 미치는 것으로 생각된다. 예를 들면 VEGF에 대한 항체인 베바시주맙(bevacizumab)이 투여된 환자군에서는 혈전 색전증의 리스크가 상승하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 42). 또한 CD40 ligand에 대한 항체의 임상 개발 시험에 있어서도 마찬가지로 혈전 색전증이 관찰되어 임상 시험이 중지되었다(비특허문헌 43). 이들 중 어느 항체의 경우도 동물 모델 등을 사용한 그 후의 연구에 의해 투여한 항체가 혈소판 상의 FcγRIIa에 대한 결합을 매개로 혈소판을 응집시켜 혈전을 형성하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 44, 비특허문헌 45). 자기면역 질환 중 하나인 전신성 에리테마토데스에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어 혈소판의 활성화가 중증도와 상관한다는 보고가 있다(비특허문헌 46). 이러한 혈전 색전증을 발증시킬 리스크가 원래 높은 환자에 대해 FcγRIIa에 대한 결합을 증강시킨 항체를 투여하는 것은 혈전 색전증의 발증 리스크를 한층 높이게 되어 매우 위험하다.
또한 FcγRIIa에 대한 결합을 증강시킨 항체는 마크로파지를 매개로 한 항체 의존적 탐식 활성(ADCP)이 증강하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 47). 그 항체가 결합하는 항원이 마크로파지에 의해 탐식되는 동시에 그 항체 자신도 탐식되는 것으로 생각된다. 항체를 의약품으로서 투여한 경우, 투여한 항체 유래의 펩티드 단편도 항원 제시되기 쉬워지는 것이 상정되어, 그 항체 의약품에 대한 항체(항의약품 항체)의 생산 리스크를 상승시킬 것으로 생각된다. 즉, FcγRIIa에 대한 결합을 증강시키면 항의약품 항체의 생산 리스크를 높여 의약품으로서의 가치를 현저히 감소시켜 버린다. 또한 수상 세포 상의 FcγRIIb는 항원과 항체로 이루어지는 면역 복합체에 의한 수상 세포의 활성화 억제, 또는 활성형 Fcγ 수용체를 매개로 한 T세포로의 항원 제시를 억제함으로써 말초성 톨러런스에 기여하고 있는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 48). 수상 세포 상에는 FcγRIIa도 발현되고 있기 때문에 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체를 의약품으로서 사용하는 경우, FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합이 증강되어 있기 때문에 수상 세포 등에 항원 제시되기 어렵고 항의약품 항체 생산의 리스크도 상대적으로 감약 가능하여, 그 점에서도 유용할 것으로 생각된다.
즉, FcγRIIa에 대한 결합을 증강시키면 혈소판 응집을 매개로 한 혈전 형성의 리스크를 상승시키게 되는 점, 면역 원성이 높아져 항의약품 항체 생산의 리스크를 높이게 되는 점에서 의약품으로서의 가치를 현저히 감소시키게 된다.
이러한 관점에서 앞선 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc 개변체에 대해서 살펴보면, FcγRIIa R형에 대한 결합은 천연형 IgG1과 비교하여 현저히 증강되어 있기 때문에, FcγRIIa R형을 보유하는 환자에 대한 의약품으로서는 가치를 현저히 감소시키고 있다. FcγRIIa의 H형과 R형은 백인(Caucasian)이나 아프리카계 미국 흑인(African-American)에서 거의 같은 정도의 빈도로 관찰된다(비특허문헌 49, 비특허문헌 50). 이 사실로부터, 이 Fc 개변체를 자기면역 질환의 치료에 사용하는 경우에 의약품으로서의 효과를 향수하면서 안전하게 이용할 수 있는 환자의 수는 한정적이다.
또한 FcγRIIb를 결손한 수상 세포 또는 항FcγRIIb 항체에 의해 FcγRIIb와 항체의 Fc부분의 상호작용이 저해된 수상 세포에 있어서는 수상 세포의 성숙이 일어나는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 51,비특허문헌 52). 이 보고로부터 FcγRIIb는 염증 등이 생기지 않은 활성화되어 있지 않은 정상(定常)상태에 있어서 수상 세포의 성숙을 억제하고 있는 것이 시사된다. 수상 세포 표면에는 FcγRIIb에 더하여 FcγRIIa도 발현되고 있는 것으로부터, 가령 억제형 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시켰다 하더라도 활성형 FcγRIIa 등에 대한 결합도 증강되어 있으면, 결과적으로 수상 세포의 성숙을 촉진시키게 될 것으로 생각된다. 즉, FcγRIIb에 대한 결합 활성뿐 아니라 FcγRIIa에 대한 결합 활성에 대해 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 비율을 개선하는 것이 항체에 면역 억제적인 작용을 초래하는 데 있어서는 중요할 것으로 생각된다.
이 사실로부터, FcγRIIb의 결합을 매개로 한 면역 억제적인 작용을 이용한 의약품의 창출을 고려한 경우, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시킬 뿐 아니라 FcγRIIa H형, R형 중 어느 유전자 다형에 대해서도 결합을 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지하거나, 그 이하로 감약된 Fc 개변체가 요구되고 있다.
이에 대해 지금까지 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 FcγRIIb에 대한 결합의 선택성을 상승시킨 예가 보고되어 있다(비특허문헌 53). 그러나 이 문헌 중에서 보고되어 있는 FcγRIIb에 대한 선택성이 개선된 것으로 알려져 있는 어느 변이체에 있어서도 천연형 IgG1과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 감소되어 있었다. 이 때문에 이들 변이체가 실제로 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 반응을 IgG1 이상으로 일으키는 것은 곤란할 것으로 생각된다.
또한 앞서 기술한 아고니스트 항체에 있어서도 FcγRIIb는 중요한 역할을 하고 있기 때문에, 그 결합 활성을 증강시킴으로써 아고니스트 활성의 증강도 기대된다. 그러나 FcγRIIa에 대한 결합도 동일하게 하여 증강시켜 버리면 목적으로 하지 않는 ADCC 활성이나 ADCP 활성 등을 발휘하게 되어 부작용도 생길 우려가 있다. 이러한 관점에서도 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 활성을 증강시킬 수 있는 것이 바람직하다.
이들 결과로부터 FcγRIIb를 이용한 자기면역 질환 치료나 암의 치료를 목적으로 한 항체 의약을 창제하는 것에 있어서는, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIa 중 어느 유전자 다형에 대해서도 결합 활성이 유지 또는 감소되고, 또한 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되어 있는 것이 중요하다. 그러나 FcγRIIb는 활성형 FcγR 중 하나인 FcγRIIa와 세포외영역의 서열이 93% 일치하여 매우 구조가 유사하고, 또한 FcγRIIa에는 유전자 다형으로서 131번째의 아미노산이 His인 H type(H형)과 Arg인 R type(R형)이 존재하여, 각각 항체와의 상호작용이 상이하다(비특허문헌 54). 이 때문에 FcγRIIa와 FcγRIIb의 매우 유사한 서열을 구별하면서 FcγRIIa의 양쪽 유전자 다형과 비교하여 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합을 증강시키는 Fc영역 개변체를 창제하는 것은 곤란한 과제로 생각되어, 사실 지금까지 FcγRIIb에 대한 충분한 결합 활성과 선택성을 갖는 변이체는 얻어지지 않았다. 특허문헌 5에는 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강된 변이체도 보고되어 있는데, 그 정도는 약하여 상기와 같은 성질을 갖는 변이체의 개발이 요구되고 있었다.
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본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 항체의 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써, 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 증강되고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 대해서 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 개변되어 있는 Fc영역 개변체에 다른 아미노산 개변을 조합시킴으로써 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 것을 발견하였다.
즉 본 발명은 다음에 관한 것이다.
〔1〕EU 넘버링 238번째의 아미노산 및 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 234번째의 아미노산, 235번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 265번째의 아미노산, 266번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 269번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 274번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 326번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 331번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산, 334번째의 아미노산, 355번째의 아미노산, 356번째의 아미노산, 358번째의 아미노산, 396번째의 아미노산, 409번째의 아미노산 및 419번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역 개변체로서, 그 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 15.0 이상이 되는 Fc영역 개변체.
〔2〕EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되고, 또한 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는, 〔1〕에 기재된 Fc영역 개변체.
〔3〕EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp 및 233번째의 아미노산이 Asp, 234번째의 아미노산이 Tyr, 235번째의 아미노산이 Phe, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 265번째의 아미노산이 Glu, 266번째의 아미노산이 Phe, Leu 또는 Met, 267번째의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Gln, 268번째의 아미노산이 Asp, Gln 또는 Glu, 269번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro 또는 Gln, 274번째의 아미노산이 Gln, 296번째의 아미노산이 Asp 또는 Phe, 326번째의 아미노산이 Ala 또는 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Lys, Arg 또는 Ser, 331번째의 아미노산이 Ser, 332번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 333번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 334번째의 아미노산이 Arg, Ser 또는 Thr, 355번째의 아미노산이 Ala, Gln, 356번째의 아미노산이 Glu, 358번째의 아미노산이 Met, 396번째의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 409번째의 아미노산이 Arg 및 419번째의 아미노산이 Glu인 아미노산군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는 Fc영역 개변체로서, 그 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 15.0 이상이 되는 Fc영역 개변체.
〔4〕EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 및 271번째의 아미노산이 Gly이고, 또한 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 또는 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg, 332번째의 아미노산이 Thr 및 396번째의 아미노산이 Leu 또는 Met인 아미노산군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는, 〔3〕에 기재된 Fc영역 개변체.
〔5〕〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 50.0 이상인 〔1〕내지〔4〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔6〕〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 100.0 이상인 〔1〕내지〔4〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔7〕〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(R형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 10.0 이상인 〔1〕내지〔6〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔8〕〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(R형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 20.0 이상인 〔1〕내지〔6〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔9〕상기 Fc영역 개변체가 하기 (a) 내지 (x) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변이 포함되는, 〔1〕내지〔8〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째 및 330번째의 아미노산 개변
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 330번째의 아미노산 개변
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
〔10〕상기 Fc영역 개변체가 하기 (a) 내지 (x) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 〔1〕내지〔8〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Gly 또는 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met인 아미노산 서열
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Gly, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
〔11〕서열번호 43~68, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 75~77로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역 개변체.
〔12〕〔1〕내지〔11〕중 어느 하나에 기재된 2개 이상의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드로서, 당해 2개의 Fc영역 개변체가 회합되어 있는 폴리펩티드.
〔13〕상기 폴리펩티드에 포함되는 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체가 동일한 아미노산 서열인, 〔12〕에 기재된 폴리펩티드.
〔14〕상기 폴리펩티드에 포함되는 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체가 상이한 아미노산 서열인, 〔12〕에 기재된 폴리펩티드.
〔15〕상기 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체의 아미노산 서열이 Fc영역 개변체의 EU 넘버링 235번째의 아미노산, 236번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 238번째의 아미노산 및 239번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산인, 〔14〕에 기재된 폴리펩티드.
〔16〕회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체 중 어느 한쪽의 아미노산 서열이 EU 넘버링 235번째의 아미노산이 Asp, Gln, Glu 또는 Thr, 236번째의 아미노산이 Asn, 237번째의 아미노산이 Phe 또는 Trp, 238번째의 아미노산이 Glu, Gly 또는 Asn 및 239번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는 아미노산 서열인, 〔15〕에 기재된 폴리펩티드.
〔17〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인, 〔12〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔18〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인, 〔12〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔19〕〔12〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물.
또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변을 도입하는 것에 따른 그 Fc영역의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변을 도입하는 것에 따른 그 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 면역 염증성 질환의 치료 또는 예방제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 바이러스의 증식 억제제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 바이러스의 증식 억제방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 바이러스의 증식 억제방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 바이러스의 증식 억제제 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 바이러스의 증식 억제방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명에 의해 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시킨 Fc영역 개변체가 제공되었다. 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 사용함으로써 FcγRIIb의 ITIM의 인산화를 매개로 한 염증성 면역 반응의 억제성 시그널을 증강시키는 것이 가능해진다. 또한 FcγRIIb에 선택적으로 결합하는 성질을 Fc영역에 부여함으로써 항의약품 항체의 생산 억제가 가능해질 가능성이 있다. 또한 pH 산성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드에 본 발명의 Fc영역 개변체를 이용함으로써 혈장 중에 존재하는 당해 폴리펩티드가 결합하는 항원의 소실을 촉진시키는 것이 가능하다.
도 1은 FcγRIIa의 다형(R/H)을 갖는 도너 유래의 혈소판을 사용한 혈소판 응집 어세이에 있어서의 omalizumab-G1d-v3/IgE 면역 복합체에 의한 혈소판 응집능의 평가결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 FcγRIIa의 다형(H/H)을 갖는 도너 유래의 혈소판을 사용한 혈소판 응집 어세이에 있어서의 omalizumab-G1d-v3/IgE 면역 복합체에 의한 혈소판 응집능의 평가결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 세정 혈소판 막 표면의 CD62p 발현을 평가한 결과를 나타낸 도면이다. 검은색으로 칠해진 그래프는 PBS와 반응시킨 후 ADP를 첨가하여 자극한 경우의 결과를 나타내고, 그래프 안이 칠해지지 않은 것은 면역 복합체와 반응시킨 후 ADP로 자극한 경우의 결과를 나타낸다.
도 4는 세정 혈소판 막 표면의 활성형 인테그린 발현을 평가한 결과를 나타낸 도면이다. 검은색으로 칠해진 그래프는 PBS와 반응시킨 후 ADP를 첨가하여 자극한 경우의 결과를 나타내고, 그래프 안이 칠해지지 않은 것은 면역 복합체와 반응시킨 후 ADP로 자극한 경우의 결과를 나타낸다.
도 5는 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 도면이다. Fc부분 CH2 도메인, CH3 도메인의 각각에 대해서 도면의 좌측을 도메인 A, 우측을 도메인 B로 하였다.
도 6은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 구조와 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조(PDB code:3RY6)를, Fc부분 CH2 도메인 A에 있어서 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 비교한 도면이다. 도면 중 굵은선으로 묘획된 것이 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체이고, 가는선으로 묘획된 것이 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조이다. 또한 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조에 있어서는, Fc부분 CH2 도메인 A만을 묘획하였다.
도 7은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, FcγRIIb의 160번째 Tyr과 주쇄 부분에 있어서 수소 결합을 형성하는 Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근의 구조의 상세를 나타낸 도면이다.
도 8은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, FcγRIIb의 160번째의 Tyr과 주쇄 부분에서 수소 결합을 형성하는 Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 측쇄 주위의 아미노산 잔기의 구조를 나타낸 도면이다.
도 9는 참고예 7에 있어서 나타내어진 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 B에 있어서 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 EU 넘버링 266번째 내지 271번째의 루프 주변에서 비교한 도면이다. 본 루프 중 Fc(P208)은 Fc(P238D)와 비교하여 EU 넘버링 268번째의 위치에 H268D의 개변을, EU 넘버링 271번째의 위치에 P271G의 개변을 갖는다.
도 10은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, Fc부분 CH2 도메인 B의 Ser239 주변의 구조를 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 나타낸 도면이다.
도 11은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 입체 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체 구조를 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 비교한 도면이다.
도 12는 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근에 있어서 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 비교한 도면이다.
도 13은 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근에 있어서 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 비교한 도면이다.
도 14는 G1d와 G4d의 정상영역의 서열을 비교한 도면이다. 도면 중 테두리로 둘러싼 아미노산은 G1d와 G4d에서 상이한 아미노산 잔기로 되어 있는 부위를 나타낸다.
도 15는 가로축은 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 결합량, 세로축은 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 결합량의 값을 나타내는 도면이다. 도면 중에 나타낸 개변 G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, P238E, P238D는 GpH7-B3에 도입한 개변을 가리킨다. 또한 A5/B3는 어느 쪽 사슬에도 개변을 도입하지 않은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 나타내고, 한쪽 사슬에만 P238D를 포함하는 개변체란 GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0를 나타낸다.
도 16은 가로축은 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값, 세로축은 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 나타내는 도면이다. 도면 중의 IL6R-B3/IL6R-L 및 IL6R-G1d/IL6R-L은 각 개변체를 평가하는 데 비교대상이 되는 천연형 인간 IgG의 서열을 갖는 항체를 나타낸다. 또한 IL6R-BP264/IL6R-L이란 각 개변체를 제작하는 데 기초가 된 개변체이다. IL6R-BP404/IL6R-L은 IL6R-BP264/IL6R-L에 대해 양쪽 사슬에 L234Y를 도입한 개변체로, 개변 도입 전의 IL6R-BP264/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 향상된 개변체이다.
도 17은 FcγRIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 18은 FcγRIIa H형과 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 19는 FcγRIIa R형과 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 20은 FcγRIIIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 21은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 정상영역을 구성하는 아미노산 잔기와 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX로도 불린다)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 22는 가로축은 각 PD variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 PD variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타내는 도면이다. 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체인 IL6R-F652/IL6R-L(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 도면 중의 F652라는 플롯은 IL6R-F652/IL6R-L의 값을 나타낸다.
도 23은 세로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 가로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖는 IL6R-F652에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타내는 도면이다. 또한 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값을 개변 도입 전의 항체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 여기서 P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우 및 P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우 모두 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘한 개변은 영역 A에 포함되고, P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하나, P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하지 않는 개변은 영역 B에 포함된다.
도 24는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조를 나타내는 도면이다.
도 25는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조를, FcγRIIb 세포외영역 및 Fc CH2 도메인 A에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합한 도면이다.
도 26은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조에 대해서 Fc CH2 도메인 A 및 Fc CH2 도메인 B 단독끼리 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 P238D 부근의 상세 구조를 비교한 도면이다.
도 27은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서, Fc CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째의 Gly의 주쇄와 FcγRIIb의 160번째의 Tyr 사이에 수소 결합이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 28은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서, Fc CH2 도메인 B의 EU 넘버링 270번째의 Asp와 FcγRIIb의 131번째의 Arg 사이에 정전적인 상호작용이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 29는 가로축은 각 2B variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 2B variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 나타내는 도면이다. 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다.
도 30은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링 233번째의 Glu와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 31은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링 330번째의 Ala와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 32는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 및 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조를, Fc Chain B에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합하여, Fc Chain B의 EU 넘버링 271번째의 Pro의 구조를 나타낸 도면이다.
도 33은 Fv4-IgG1, Fv4-P587이 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 항원 결합 분자의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 34는 Fv4-IgG1, Fv4-P587이 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 인간 IL-6R의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 35는 기존의 중화 항체에 비해 중성 pH에 있어서의 FcγR에 대한 결합을 증강시킨 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체의 투여에 의해, 혈장 중으로부터 가용형 항원이 소실되는 비한정의 작용 메커니즘을 나타내는 도면이다.
도 36은 Fv4-IgG1, Fv4-P587, Fv4-P587_LS가 인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 항원 결합 분자의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 37은 Fv4-IgG1, Fv4-P587, Fv4-P587_LS가 인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 인간 IL-6R의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 2는 FcγRIIa의 다형(H/H)을 갖는 도너 유래의 혈소판을 사용한 혈소판 응집 어세이에 있어서의 omalizumab-G1d-v3/IgE 면역 복합체에 의한 혈소판 응집능의 평가결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 세정 혈소판 막 표면의 CD62p 발현을 평가한 결과를 나타낸 도면이다. 검은색으로 칠해진 그래프는 PBS와 반응시킨 후 ADP를 첨가하여 자극한 경우의 결과를 나타내고, 그래프 안이 칠해지지 않은 것은 면역 복합체와 반응시킨 후 ADP로 자극한 경우의 결과를 나타낸다.
도 4는 세정 혈소판 막 표면의 활성형 인테그린 발현을 평가한 결과를 나타낸 도면이다. 검은색으로 칠해진 그래프는 PBS와 반응시킨 후 ADP를 첨가하여 자극한 경우의 결과를 나타내고, 그래프 안이 칠해지지 않은 것은 면역 복합체와 반응시킨 후 ADP로 자극한 경우의 결과를 나타낸다.
도 5는 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 도면이다. Fc부분 CH2 도메인, CH3 도메인의 각각에 대해서 도면의 좌측을 도메인 A, 우측을 도메인 B로 하였다.
도 6은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 구조와 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조(PDB code:3RY6)를, Fc부분 CH2 도메인 A에 있어서 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 비교한 도면이다. 도면 중 굵은선으로 묘획된 것이 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체이고, 가는선으로 묘획된 것이 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조이다. 또한 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 구조에 있어서는, Fc부분 CH2 도메인 A만을 묘획하였다.
도 7은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, FcγRIIb의 160번째 Tyr과 주쇄 부분에 있어서 수소 결합을 형성하는 Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근의 구조의 상세를 나타낸 도면이다.
도 8은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, FcγRIIb의 160번째의 Tyr과 주쇄 부분에서 수소 결합을 형성하는 Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 측쇄 주위의 아미노산 잔기의 구조를 나타낸 도면이다.
도 9는 참고예 7에 있어서 나타내어진 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 B에 있어서 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 EU 넘버링 266번째 내지 271번째의 루프 주변에서 비교한 도면이다. 본 루프 중 Fc(P208)은 Fc(P238D)와 비교하여 EU 넘버링 268번째의 위치에 H268D의 개변을, EU 넘버링 271번째의 위치에 P271G의 개변을 갖는다.
도 10은 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조에 있어서, Fc부분 CH2 도메인 B의 Ser239 주변의 구조를 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 나타낸 도면이다.
도 11은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 입체 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체 구조를 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 비교한 도면이다.
도 12는 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근에 있어서 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 비교한 도면이다.
도 13은 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를, Fc부분 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 237번째 Asp 부근에 있어서 X선 결정 구조 해석에 의해 얻어진 2Fo-Fc 계수로 하는 전자 밀도와 함께 비교한 도면이다.
도 14는 G1d와 G4d의 정상영역의 서열을 비교한 도면이다. 도면 중 테두리로 둘러싼 아미노산은 G1d와 G4d에서 상이한 아미노산 잔기로 되어 있는 부위를 나타낸다.
도 15는 가로축은 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 결합량, 세로축은 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 결합량의 값을 나타내는 도면이다. 도면 중에 나타낸 개변 G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, P238E, P238D는 GpH7-B3에 도입한 개변을 가리킨다. 또한 A5/B3는 어느 쪽 사슬에도 개변을 도입하지 않은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 나타내고, 한쪽 사슬에만 P238D를 포함하는 개변체란 GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0를 나타낸다.
도 16은 가로축은 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값, 세로축은 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 나타내는 도면이다. 도면 중의 IL6R-B3/IL6R-L 및 IL6R-G1d/IL6R-L은 각 개변체를 평가하는 데 비교대상이 되는 천연형 인간 IgG의 서열을 갖는 항체를 나타낸다. 또한 IL6R-BP264/IL6R-L이란 각 개변체를 제작하는 데 기초가 된 개변체이다. IL6R-BP404/IL6R-L은 IL6R-BP264/IL6R-L에 대해 양쪽 사슬에 L234Y를 도입한 개변체로, 개변 도입 전의 IL6R-BP264/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 향상된 개변체이다.
도 17은 FcγRIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 18은 FcγRIIa H형과 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 19는 FcγRIIa R형과 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 20은 FcγRIIIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비교를 나타내는 도면으로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 항체 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 항체의 결합을 라벨하였다. 「mutation A」란 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 가리키고, 「mutation B」란 EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변을 가리킨다.
도 21은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 정상영역을 구성하는 아미노산 잔기와 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX로도 불린다)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 22는 가로축은 각 PD variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 PD variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타내는 도면이다. 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체인 IL6R-F652/IL6R-L(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 도면 중의 F652라는 플롯은 IL6R-F652/IL6R-L의 값을 나타낸다.
도 23은 세로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 가로축은 각 개변을 P238D 개변을 갖는 IL6R-F652에 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 나타내는 도면이다. 또한 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값을 개변 도입 전의 항체의 FcγRIIb에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 여기서 P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우 및 P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우 모두 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘한 개변은 영역 A에 포함되고, P238D를 갖지 않는 GpH7-B3에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하나, P238D를 갖는 IL6R-F652에 도입한 경우에는 FcγRIIb에 대한 결합 증강 효과를 발휘하지 않는 개변은 영역 B에 포함된다.
도 24는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조를 나타내는 도면이다.
도 25는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조를, FcγRIIb 세포외영역 및 Fc CH2 도메인 A에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합한 도면이다.
도 26은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조에 대해서 Fc CH2 도메인 A 및 Fc CH2 도메인 B 단독끼리 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 P238D 부근의 상세 구조를 비교한 도면이다.
도 27은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서, Fc CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째의 Gly의 주쇄와 FcγRIIb의 160번째의 Tyr 사이에 수소 결합이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 28은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서, Fc CH2 도메인 B의 EU 넘버링 270번째의 Asp와 FcγRIIb의 131번째의 Arg 사이에 정전적인 상호작용이 확인되는 것을 나타내는 도면이다.
도 29는 가로축은 각 2B variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축은 각 2B variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 나타내는 도면이다. 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 2B variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다.
도 30은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링 233번째의 Glu와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 31은 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조에 있어서 Fc Chain A의 EU 넘버링 330번째의 Ala와 FcγRIIb 세포외영역에 있어서의 그 주변 잔기를 나타내는 도면이다.
도 32는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 및 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조를, Fc Chain B에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합하여, Fc Chain B의 EU 넘버링 271번째의 Pro의 구조를 나타낸 도면이다.
도 33은 Fv4-IgG1, Fv4-P587이 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 항원 결합 분자의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 34는 Fv4-IgG1, Fv4-P587이 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 인간 IL-6R의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 35는 기존의 중화 항체에 비해 중성 pH에 있어서의 FcγR에 대한 결합을 증강시킨 이온 농도 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체의 투여에 의해, 혈장 중으로부터 가용형 항원이 소실되는 비한정의 작용 메커니즘을 나타내는 도면이다.
도 36은 Fv4-IgG1, Fv4-P587, Fv4-P587_LS가 인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 항원 결합 분자의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 37은 Fv4-IgG1, Fv4-P587, Fv4-P587_LS가 인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중에 있어서의 투여된 인간 IL-6R의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
본 발명은 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 및 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 구체적으로는, EU 넘버링 238번째의 아미노산 개변과 다른 특정 아미노산 개변이 조합되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 Fc영역 개변체, 및 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은 Fc영역에 그 아미노산 개변을 도입함으로써 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키거나 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 Fc영역에 그 아미노산 개변을 도입함으로써 생체에 투여된 경우에 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역과 비교하여 Fc영역에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서의 「폴리펩티드」란 통상 10 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 또한 통상 생물 유래의 폴리펩티드이나 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 예로서 항체를 들 수 있다. 더욱 바람직한 예로서, 천연형 IgG, 특히 천연형 인간 IgG를 들 수 있다. 천연형 IgG란 천연으로 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다.
항체의 경쇄 정상영역에는 IgK(Kappa, κ쇄), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, IgL7(Lambda, λ쇄) 타입의 정상영역이 존재하고 있는데, 어느 경쇄 정상영역이어도 된다. 인간 IgK(Kappa) 정상영역과 인간 IgL7(Lambda) 정상영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 어느 것이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 정상영역은 아미노산의 치환, 부가, 결손, 삽입 및/또는 수식 등의 개변이 행해진 경쇄 정상영역이어도 된다. 항체의 Fc영역으로서는, 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc영역은, 예를 들면 인간 IgG 항체의 Fc영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 Fc영역이다. 본 발명의 Fc영역으로서, 예를 들면 천연형 IgG의 정상영역, 구체적으로는 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 정상영역(서열번호:11), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 정상영역(서열번호:12), 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 정상영역(서열번호:13), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 정상영역(서열번호:14) 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 도 21에는 천연형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 정상영역의 서열을 나타낸다. 천연형 IgG의 정상영역에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체의 정상영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링 356-358번째의 아미노산 서열이 DEL이어도 EEM이어도 된다.
Fcγ 수용체(본 명세서에서는 Fcγ 수용체, FcγR 또는 FcgR로 기재하는 경우가 있다)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합 가능한 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는, 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64);아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 인간 FcγRIIb에는 스플라이싱 배리언트로서 FcγRIIb1과 FcγRIIb2가 보고되어 있다. 또한 그 이외에도 FcγRIIb3라는 스플라이싱 배리언트도 보고되어 있다(J. Exp. Med, 1989, 170: 1369). 인간 FcγRIIb에는 이 스플라이싱 배리언트, 이에 더하여 NCBI에 등록되어 있는 NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, NP_003992.3의 스플라이싱 배리언트를 모두 포함한다. 또한 인간 FcγRIIb에는 기존의 보고된 모든 유전자 다형을 포함하고, FcγRIIb(Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum Mol Genet, 2005, 14: 2881-92, Arthritis Rheum. 2002 May;46(5):1242-54.)도 포함되며, 또한 향후 보고되는 모든 유전자 다형도 포함된다.
FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되는데, 이들에 한정되지 않고 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16) 및/또는 FcγRIIIB(CD16)를 들 수 있다.
FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호:1(NM_000566.3) 및 2(NP_000557.1)에,
FcγRIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호:3(BC020823.1) 및 4(AAH20823.1)에,
FcγRIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호:5(BC146678.1) 및 6(AAI46679.1)에,
FcγRIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호:7(BC033678.1) 및 8(AAH33678.1)에, 및
FcγRIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호:9(BC128562.1) 및 10(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다).
또한 FcγRIIa에는 FcγRIIa의 131번째의 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990).
본 명세서에서 「아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역」이란, 본 발명의 아미노산 개변이 도입되기 전의 Fc영역을 의미한다. 본 발명에 있어서의 「아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역」은, 예를 들면 천연형 IgG의 Fc영역이어도 되고 또한 천연형 IgG에 본 발명의 아미노산 개변 이외의 개변이 가해진 IgG의 Fc영역이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 「Fc영역 개변체」는 본 발명의 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역에 본 발명의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 의미한다. 여기서 「하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는」 것에는 당해 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 및 그와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역이 포함된다.
천연형 IgG란 천연으로 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다.
천연형 IgG의 Fc영역이란, 천연으로 발견되는 IgG를 기원으로 하는 Fc영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc영역을 의미한다. 천연형 IgG의 중쇄 정상영역은 도 21(서열번호:11~14)에 나타내고 있는데, 예를 들면 도 21의 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 중쇄 정상영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 중쇄 정상영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 중쇄 정상영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 중쇄 정상영역 중의 Fc영역을 의미한다. 천연형 IgG의 Fc영역에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다.
본 발명에 있어서 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 Fc영역 개변체가 각종 FcγR에 대한 결합 활성이 증강되었거나 또는 결합 활성이 유지 또는 감소되었는지 여부는, 예를 들면 본 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 상호작용 해석기기인 BIACORE를 사용하여 항체를 센서칩 상에 고정화 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩에 대해 각종 FcγR을 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석 결과로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 센서칩 상에 고정화했거나 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩 상의 항체에 대해 각종 FcγR을 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상의 리조넌스 유닛(RU)값의 변화량을 센서칩에 항체를 고정화 또는 캡쳐시킨 전후에서의 리조넌스 유닛(RU)의 변화량으로 나눈 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다. 또한 FcγR을 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩을 사용하여, 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석으로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 FcγR을 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩에 대해 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 값의 변화량이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다.
구체적으로는 Fc영역 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성은 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting) 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 측정할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여, 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드의 감광제(photosensitizer)는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변으로 확산되어 근접해 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 폴리펩티드 회합체가 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 회합체의 비존재하에서는 야생형 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 시그널을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 변이 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체는 야생형 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 활성이 결정될 수 있다. 항체 등의 폴리펩티드 회합체를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터에 보유한 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적용시킴으로써 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 안쪽에서 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질랴이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 시그널의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기의 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램으로부터 센서칩 표면에 포착한 리간드에 대한 애널라이트의 결합량이 구해진다. 또한 센서그램의 커브로부터 키네틱스:결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가 당해 상수의 비로부터 해리상수(KD)가 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.
FcγR에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란, 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드(모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 모체 폴리펩티드라고도 한다)와 당해 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 포함하는 폴리펩티드(Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 개변 폴리펩티드라고도 한다)의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 약한 결합 활성으로 FcγR과 결합하는 Fc영역 개변체 또는 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
또한 FcγR에 대한 결합 활성이 증강된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 양과 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 강한 결합 활성으로 FcγR과 결합하는 Fc영역 개변체 또는 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
FcγR에 대한 결합 활성이 유지된 폴리펩티드란, 모체 Fc영역을 갖는 폴리펩티드와 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에, 모체 폴리펩티드와 본질적으로 변화가 없는 동등한 결합 활성으로 FcγR과 결합하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되었다는 것은, 예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, 〔모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 KD값 비가 바람직하게는 15.0 이상, 20.0 이상, 25.0 이상, 30.0 이상, 35.0 이상, 40.0 이상, 45.0 이상, 더욱이 50.0 이상, 55.0 이상, 60.0 이상, 65.0 이상, 70.0 이상, 75.0 이상, 80.0 이상, 85.0 이상, 90.0 이상, 95.0 이상, 100.0 이상이 되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체가 FcγRIIa보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되었다는 것은,
(i) FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, FcγRIIa에 대한 결합 활성은 유지 또는 감소되는,
(ii) FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, FcγRIIa에 대한 결합 활성도 증강되는데, FcγRIIa에 대한 결합 활성의 증강 정도가 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 증강 정도보다도 낮거나, 또는
(iii) FcγRIIb에 대한 결합 활성은 감소되어 있는데, 당해 결합 활성의 감소 정도가 FcγRIIa에 대한 결합 활성의 감소 정도보다도 낮은
것을 의미한다. 본 발명의 Fc영역 개변체가 FcγRIIa보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되었는지 여부는, 예를 들면 상기 예에 따라 구한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa에 대한 KD값과 FcγRIIb에 대한 KD값의 비(FcγRIIa에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값)와 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa에 대한 KD값과 FcγRIIb에 대한 KD값의 비(FcγRIIa에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값)를 비교함으로써 판단하는 것이 가능하다. 구체적으로는 상기 KD값 비의 값이 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에서 커진 경우, 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 모체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIa보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되었다고 판단할 수 있다. 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성은 FcγRIIa(H형)에 대한 것보다도 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 상관하기 쉽기 때문에, FcγRIIa(R형)보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시킬 수 있는 아미노산 개변을 발견하는 것이 FcγRIIb 이외의 다른 FcγR보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 데 있어서 중요하다.
FcγRIIa(R형)과 FcγRIIb 사이에서의 결합 선택성으로서는, 예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, 〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(R형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 KD값 비가 바람직하게는 10.0 이상, 더욱 바람직하게는 20.0 이상이다.
FcγRIIa(H형)과 FcγRIIb 사이에서의 결합 선택성으로서는, 예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, 〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(H형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 KD값 비가 바람직하게는 100.0 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 더욱 바람직하게는 600 이상, 700 이상, 800 이상, 900 이상이다.
또한 본 발명의 폴리펩티드의 각종 FcγR에 대한 결합 활성이 유지, 증강, 또는 감소되었는지 여부는 상기 예에 따라 구한 각종 FcγR의 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합량의 증감으로 판단하는 것도 가능하다. 여기서 각종 FcγR의 폴리펩티드에 대한 결합량은 각 폴리펩티드에 대해 애널라이트인 각종 FcγR을 상호작용시킨 전후에서 변화된 센서그램에 있어서의 RU값의 차를 센서칩에 폴리펩티드를 포착시킨 전후에서 변화된 센서그램에 있어서의 RU값의 차로 나눈 값을 의미한다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체로서는 FcγRIIb에 대한 KD값(mol/L)에 특별히 제한은 없으나, 예를 들면 9×10-7 이하여도 되고, 바람직하게는 5×10-7 이하, 보다 바람직하게는 3×10-7 이하, 보다 바람직하게는 1×10-7 이하, 보다 바람직하게는 5×10-8 이하이다.
「Fc영역」은 항체 분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 프래그먼트를 말한다. IgG 클래스의 Fc영역은 EU 넘버링(본 명세서에서는 EU INDEX로도 불린다)(도 21 참조)으로, 예를 들면 226번째의 시스테인으로부터 C말단 또는 230번째의 프롤린으로부터 C말단까지를 의미하는데, 이것에 한정되지 않는다.
Fc영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 프로테인 A 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 제한적으로 Fab나 F(ab')2를 발생시키도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면 펩신이나 파파인 등을 예시할 수 있다.
본 발명은 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 Fc영역에 대해 EU 넘버링 238번째의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 234번째의 아미노산, 235번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 265번째의 아미노산, 266번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 269번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 274번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 326번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 331번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산, 334번째의 아미노산, 355번째의 아미노산, 356번째의 아미노산, 358번째의 아미노산, 396번째의 아미노산, 409번째의 아미노산 및 419번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 조합한 개변을 포함하는 Fc영역 개변체를 제공한다. 인간 IgG의 Fc영역에 EU 넘버링 238번째의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 234번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 265번째의 아미노산, 266번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 269번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 274번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 326번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 331번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산, 334번째의 아미노산, 355번째의 아미노산, 356번째의 아미노산, 358번째의 아미노산, 396번째의 아미노산, 409번째의 아미노산 및 419번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 조합함으로써, 당해 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 선택성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다. EU 넘버링 238번째의 아미노산 개변과 조합되는 다른 아미노산 개변으로서는, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산이 바람직하고, 특히 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 330번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산이 바람직하다. 특히 EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 조합한 개변이 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키거나 또는 FcγRIIa와 비교한 경우의 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 관점에서 바람직한 아미노산 개변의 조합으로서 들 수 있다.
개변되는 아미노산은 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 또는 FcγRIIa와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 234번째의 아미노산이 Tyr, 235번째의 아미노산이 Phe, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 265번째의 아미노산이 Glu, 266번째의 아미노산이 Phe, Leu 또는 Met, 267번째의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Gln, 268번째의 아미노산이 Asp, Gln 또는 Glu, 269번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro 또는 Gln, 274번째의 아미노산이 Gln, 296번째의 아미노산이 Asp 또는 Phe, 326번째의 아미노산이 Ala 또는 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Lys, Arg 또는 Ser, 331번째의 아미노산이 Ser, 332번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 333번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 334번째의 아미노산이 Arg, Ser 또는 Thr, 355번째의 아미노산이 Ala, Gln, 356번째의 아미노산이 Glu, 358번째의 아미노산이 Met, 396번째의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 409번째의 아미노산이 Arg, 419번째의 아미노산이 Glu인 것이 바람직하다. 특히 EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 조합시키는 경우는 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 또는 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg, 332번째의 아미노산이 Thr, 396번째의 아미노산이 Leu 또는 Met인 것이 바람직하다.
본 발명은 이들 개변에 더하여 또 다른 하나 이상의 Fc영역에 대한 개변을 추가하는 것이 가능하다. FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강 및/또는 FcγRIIa보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 또한 개변은 Fc영역의 일부를 아이소타입의 상이한 다른 Fc영역의 해당하는 부위로 치환하는 개변과 조합해서 행하는 것도 가능하다. 예를 들면 IgG1 유래의 Fc영역의 EU 넘버링 118번째의 Ala에서 225번째의 Thr까지의 아미노산 서열의 IgG4 유래의 Fc영역의 EU 넘버링 118번째의 Ala에서 222번째의 Pro까지의 아미노산 서열로의 치환과 전술한 아미노산 개변을 조합함으로써 FcγRIIb로의 결합 활성 및/또는 FcγRIIb로의 결합 선택성을 증강시키는 것도 가능하다. 구체적으로는 예를 들면 실시예 7에 기재된 IL6R-BP478/IL6R-L과 같이, IL6R-BP230에서 도입되어 있는 아미노산 개변과 G1d의 EU 넘버링 118번째의 Ala에서 225번째의 Thr까지의 아미노산 서열을 G4d의 EU 넘버링 118번째의 Ala에서 222번째의 Pro까지의 아미노산 서열로 치환하는 개변의 조합을 들 수 있다.
이들 중에서도 보다 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되는 개변 또는 보다 FcγRIIa(R형)보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 개변이 바람직하다. 이러한 바람직한 아미노산 개변의 조합으로서는, 예를 들면 아래의 (a) 내지 (x)의 조합을 들 수 있다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째 및 330번째의 아미노산 개변
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 330번째의 아미노산 개변
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
또한 이들 개변의 조합 중에서도 아래의 (a) 내지 (x)의 아미노산 개변의 조합을 보다 바람직한 조합으로서 들 수 있다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Gly 또는 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met인 아미노산 서열
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Gly, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
또한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에는 다른 목적으로 행해지는 아미노산 개변을 조합시키는 것도 가능하다. 예를 들면 FcRn에 대한 결합 활성을 향상시키는 아미노산 치환(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56, J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24., Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69., Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9., WO/2006/019447, WO/2006/053301, WO/2009/086320), 항체의 헤테로제니티나 안정성을 향상시키기 위한 아미노산 치환(WO/2009/041613)을 가해도 된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 WO2011/122011, PCT/JP2011/072550에 기재된 항원의 소실을 촉진하기 위한 성질을 부여한 폴리펩티드나 WO2009/125825, WO2012/073992, WO2013/047752에 기재된 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하기 위한 성질을 부여한 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 혈 중 체류성을 높일 목적으로 정상영역의 pI를 저하시키는 아미노산 개변(WO/2012/016227)을 조합시켜도 된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 사용하여 다른 항원에 대한 결합능을 부여할 목적으로 CH3에 EP1752471, EP1772465에 기재된 아미노산 개변을 조합시켜도 된다.
본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 항체와 같은 항원 결합 분자인 경우에는, 항원 결합 분자의 혈장 중으로부터의 항원 소실 효과를 높이기 위해 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키기 위한 아미노산 개변을 조합시킬 수 있다. 보다 구체적으로는 예를 들면 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키기 위해 사용되는 개변으로서는, IgG 항체의 EU 넘버링으로 표시되는 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하고, 434번 위치의 Asn을 Ser로 치환하는 방법(Nat Biotechnol, 2010 28:157-159.), 434번 위치의 Asn을 Ala로 치환하는 방법(Drug Metab Dispos. 2010 Apr;38(4):600-5.), 252번 위치의 Met를 Tyr로 치환하고, 254번 위치의 Ser을 Thr로 치환하며, 256번 위치의 Thr을 Glu로 치환하는 방법(J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524), 250번 위치의 Thr을 Gln으로 치환하고, 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하는 방법(J Immunol. 2006, 176(1):346-56), 434번 위치의 Asn을 His로 치환하는 방법(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290.), 및 WO2010106180, WO2010045193, WO2009058492, WO2008022152, WO2006050166, WO2006053301, WO2006031370, WO2005123780, WO2005047327, WO2005037867, WO2004035752, WO2002060919 등에 있어서 기재되는 바와 같은 개변을 사용함으로써도 실시가 가능할 것으로 생각된다.
또한 최근 들어 인간화 항CD4 항체에 대해 pH 산성역 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시키고, 혈장 중 체류성을 향상시키기 위해, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 Asn을 His로 치환한 항체 분자가 류머티즘 인자(Rheumatiod factor, RF)에 대해 결합하는 것이 보고되었다(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90). 이 항체는 인간 IgG1의 Fc영역을 가지고 있는데, FcRn에 대한 결합 부위에 위치하는 434번 위치의 Asn을 His로 치환함으로써 그 치환 개소를 인식하는 류머티즘 인자가 결합하는 것이 나타내어져 있다.
전술한 바와 같이, pH 산성역 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시키기 위한 개변으로서 다양한 것이 보고되어 있는데, 이들 개변을 Fc영역 중의 FcRn 결합 부위에 도입함으로써 당해 부위를 인식하는 류머티즘 인자에 대한 결합성을 증강시켜버릴 가능성이 있다.
그러나 Fc영역의 당해 부위에 FcRn에 대한 결합 활성을 저하시키지 않고 류머티즘 인자에 대한 결합 활성만을 저하시키는 개변을 도입함으로써, 류머티즘 인자에 대한 결합성을 갖지 않고 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킨 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능하다.
그러한 류머티즘 인자에 대한 결합 활성을 저하시키는 개변으로서는, EU 넘버링으로 표시되는 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439, 441-444번 위치로의 개변이 사용된다. 바람직하게는 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438, 440번 위치로의 개변이 바람직하게 사용된다. 특히 바람직하게는 422번 위치의 Val을 Glu 또는 Ser로 치환하는 개변, 424번 위치의 Ser을 Arg로 치환하는 개변, 433번 위치의 His를 Asp로 치환하는 개변, 436번 위치의 Tyr을 Thr로 치환하는 개변, 438번 위치의 Gln을 Arg 또는 Lys로 치환하는 개변, 440번 위치의 Ser을 Glu 또는 Asp로 치환하는 개변이 사용된다. 이들 개변은 단독으로 사용되어도 되고, 복수 개소를 조합해서 사용해도 된다.
또는 류머티즘 인자에 대한 결합 활성을 저하시키기 위해 당해 부위에 N형 당쇄의 부가 서열을 도입해도 된다. 구체적으로는 N형 당쇄 부가 서열로서 Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx는 Pro를 제외한 임의의 아미노산)이 알려져 있는데, 이 서열을 Fc영역의 당해 부위에 도입함으로써 N형 당쇄를 부가시켜 N형 당쇄의 입체장애에 의해 RF와의 결합을 저해하는 것이 가능하다. N형 당쇄를 부가하기 위한 개변으로서 바람직하게는 248번 위치의 Lys를 Asn으로 치환하는 개변, 424번 위치의 Ser을 Asn으로 치환하는 개변, 436번 위치의 Tyr을 Asn으로 치환하고 438번 위치의 Gln을 Thr로 치환하는 개변, 438번 위치의 Gln을 Asn으로 치환하는 개변이 사용된다. 특히 바람직하게는 424번 위치의 Ser을 Asn으로 치환하는 개변이 사용된다.
본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 바람직한 예로서 IgG 항체와 같이 2개 이상의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드로서 당해 2개의 Fc영역 개변체가 회합되어 있는 폴리펩티드를 들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드로서 IgG 항체를 사용하는 경우, 그 정상영역의 종류는 한정되지 않고 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 아이소타입(서브클래스)의 IgG를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 IgG 항체는 바람직하게는 인간 IgG이고, 더욱 바람직하게는 인간 IgG1, 인간 IgG4이며, 인간 IgG1 및 인간 IgG4의 중쇄 정상영역의 아미노산 서열은 공지이다. 인간 IgG1 정상영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.
상기 폴리펩티드에 포함되는 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체는 동일한 아미노산 개변이 도입되어 있는 Fc영역 개변체여도 되고(이하, 호모 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드라 한다), 각각 상이한 아미노산 개변이 도입된 상이한 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역 개변체여도 되며, 또한 어느 한쪽 Fc영역에만 아미노산 개변이 도입된 상이한 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역 개변체여도 된다(이하, 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드라 한다). 어느 한쪽 Fc영역에만 도입되는 아미노산 개변으로서는, FcγRIIb 및 FcγRIIa와의 결합에 관여하고 있는 Fc영역의 CH2 도메인의 EU 넘버링 233번째 내지 239번째의 루프 구조 부위가 바람직하고, 한쪽의 Fc영역에 있어서의 CH2영역의 루프 구조를 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 개변을 도입하고, 다른 한쪽 Fc영역에 있어서의 CH2영역의 루프 구조를 불안정화시키는 아미노산 개변을 도입하는 것이 바람직하다. CH2영역의 루프 구조를 불안정화시키는 아미노산 개변으로서는, 예를 들면 EU 넘버링 235번째의 아미노산, 236번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 238번째의 아미노산 및 239번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 루프 구조를 불안정화하는 것이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면 EU 넘버링 235번째의 아미노산이 Asp, Gln, Glu 또는 Thr로 개변되어 있고, 236번째의 아미노산이 Asn으로 개변되어 있으며, 237번째의 아미노산이 Phe 또는 Trp로 개변되어 있고, 238번째의 아미노산이 Glu, Gly 또는 Asn으로 개변되어 있으며, 239번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu로 개변되어 있음으로써 CH2영역의 루프 구조를 불안정화시키는 것이 가능하다.
본 발명의 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제작하는 데는 서로 상이한 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체끼리를 회합화시키거나 또는 목적의 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 다른 호모 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드로부터 분리할 필요가 있다.
상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 항체 H쇄의 제2 정상영역(CH2) 또는 H쇄의 제3 정상영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, H쇄의 다른 정상영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는 예를 들면 2종의 H쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제1의 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1) 내지 (3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(組)로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다;
(1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기,
(2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기,
(3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한 상기 제1의 H쇄 CH3영역과는 다른 제2의 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1) 내지 (3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1의 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1) 내지 (3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가, 상기 제1의 H쇄 CH3영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합하였을 때에 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 H쇄 CH3영역 또는 H쇄 정상영역에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 상기 (1) 내지 (3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적절히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다;
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서 「동종의 전하를 갖는」이란, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는」이란, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1의 H쇄 CH3영역과 제2의 H쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변영역 또는 항체의 정상영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 헤테로 Fc영역 개변체의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob;돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole;공극)로 치환하여, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 함으로써 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
이에 더하여 헤테로 Fc영역 개변체의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3를 사용함으로써, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 일으킬 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지기술을 사용해도 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다.
WO2011/028952에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 헤테로 이량화 항체 제작기술도 사용할 수 있다.
WO2008/119353, WO2011/131746에 기재된 방법과 같이, 2종류의 호모 이량화 항체를 사전에 제작하여 그들을 환원 조건하에서 인큐베이션함으로써 비회합화시키고, 재차 회합화시킴으로써 헤테로 이량화 항체를 제작하는 기술을 사용하는 것도 가능하다.
또한 J. Mol. (2012) 420, 204-219에 기재된 방법과 같이, IgG1, IgG2의 CH3에 전하적으로 반발하도록 Lys, Arg, Glu, Asp와 같이 전하를 갖는 잔기를 도입하여 헤테로 이량화 항체를 제작하는 기술을 사용하는 것도 가능하다.
또한 WO2012/058768에 기재된 방법과 같이, CH2, CH3영역에 개변을 가함으로써 헤테로 이량화 항체를 제작하는 기술을 사용하는 것도 가능하다.
또한 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 효율적으로 형성할 수 없는 경우라도, 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 호모 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드와 분리, 정제함으로써도 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 얻는 것이 가능하다. 서로 서열이 다른 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제작할 때에는, 2개의 제1 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드, 2개의 제2 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드가 불순물로서 혼입된다. 이들 2종류의 호모 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 효율적으로 제거하는 방법으로서 공지기술을 사용할 수 있다. 2종류의 H쇄의 가변영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적의 헤테로 이량화 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 헤테로 이량화 항체를 정제하는 방법으로서, 지금까지 프로테인 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로테인 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로 이량화 항체를 프로테인 A를 사용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844).
또한 IgG와 Protein A의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째의 아미노산 잔기를 Tyr, His 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 사용함으로써, 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜 Protein A 칼럼을 사용함으로써 헤테로 이량화 항체만을 효율적으로 정제하는 것도 가능하다.
이들의 치환, 기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합해서 사용할 수 있다. 또한 이들 개변은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드에 적절히 따로 따로 가할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기 개변이 가해지 것을 기초로 하여 제작한 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산의 개변이란, 치환, 결손, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 의미한다. 본 발명에 있어서는 아미노산의 개변은 아미노산의 변이로 바꿔말하는 것이 가능하며, 동일한 의미로 사용된다.
아미노산 잔기를 치환하는 경우에는, 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 예를 들면 다음의 (a) 내지 (c)와 같은 점에 대해서 개변하는 것을 목적으로 한다.
(a) 시트 구조 또는 나선 구조의 영역에 있어서의 폴리펩티드의 백본 구조;
(b) 표적 부위에 있어서의 전하 또는 소수성, 또는
(c) 측쇄의 크기.
아미노산 잔기는 일반 측쇄의 특성을 토대로 아래의 그룹으로 분류된다:
(1) 소수성:노르로이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성:cys, ser, thr, asn, gln;
(3) 산성:asp, glu;
(4) 염기성:his, lys, arg;
(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기:gly, pro;및
(6) 방향족성:trp, tyr, phe.
이들 각 그룹 내에서의 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환으로 불리는 한편, 타 그룹 간끼리에서의 아미노산 잔기의 치환은 비보존적 치환으로 불린다. 본 발명에 있어서의 치환은 보존적 치환이어도 되고 비보존적 치환이어도 되며, 또한 보존적 치환과 비보존적 치환의 조합이어도 된다.
아미노산 서열의 개변은 당분야에 있어서 공지의 각종 방법으로 조제된다. 이들 방법은 다음의 것으로 한정되는 것은 아니나, 부위 특이적 변이 유도법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492), PCR 변이법, 카세트 변이법 등의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 아미노산의 수식에는 번역 후 수식이 포함된다. 구체적인 번역 후 수식으로서 당쇄의 부가 또는 결손을 나타낼 수 있다. 예를 들면 서열번호:11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 IgG1 정상영역에 있어서 EU 넘버링의 297번째의 아미노산 잔기는 당쇄로 수식된 것일 수 있다. 수식되는 당쇄 구조는 한정되지 않는다. 일반적으로 진핵 세포에서 발현되는 항체는 정상영역에 당쇄 수식을 포함한다. 따라서 아래와 같은 세포에서 발현되는 항체는 통상 어떠한 수식으로 수식된다.
·포유동물의 항체 생산 세포
·항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 진핵 세포
여기에 나타낸 진핵 세포에는 효모나 동물세포가 포함된다. 예를 들면 CHO 세포나 HEK293H 세포는 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환하기 위한 대표적인 동물세포이다. 한편, 당해 위치에 당쇄 수식이 없는 것도 본 발명의 정상영역에 포함된다. 정상영역이 당쇄로 수식되어 있지 않은 항체는 항체를 코드하는 유전자를 대장균 등의 원핵 세포로 발현시켜서 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는 예를 들면 Fc영역의 당쇄에 시알산을 부가한 것이어도 된다(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.).
또한 본 발명은 전술한 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서의 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함한다), 다중클론 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 다특이성 항체(다중 특이성 항체)(예를 들면 이특이성 항체(이중 특이성 항체)), 키메라 항체, 인간화 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 항원의 종류, 항체의 유래 등은 한정되지 않고, 어떠한 항체여도 된다. 항체의 유래로서는 특별히 한정되지 않으나, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 등을 들 수 있다.
항체를 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 단일클론 항체의 경우 하이브리도마법(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)), 재조합 방법(미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조해도 된다. 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리해도 된다(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)).
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불린다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다.
3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 항체 가변영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간화 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 그 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에 그 재조합 세포를 배양하고, 그 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다.
인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
본 발명의 항체를 구성하는 가변영역은 임의의 항원을 인식하는 가변영역일 수 있다.
본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면 리간드(사이토카인, 케모카인 등), 수용체, 암 항원, MHC 항원, 분화 항원, 면역 글로불린 및 면역 글로불린을 일부에 포함하는 면역 복합체를 적합하게 들 수 있다.
사이토카인의 예로서는 인터류킨 1~18, 콜로니 자극 인자(G-CSF, M-CSF, GM-CSF 등), 인터페론(IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등), 성장인자(EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF 등), 종양 괴사 인자(TNF-α, TNF-β), 림포톡신, 에리트리포이에틴, 렙틴, SCF, TPO, MCAF, BMP를 들 수 있다.
케모카인의 예로서는 CCL1~CCL28 등의 CC 케모카인, CXCL1~CXCL17 등의 CXC 케모카인, XCL1~XCL2 등의 C 케모카인, CX3CL1 등의 CX3C 케모카인을 들 수 있다.
수용체의 예로서는, 예를 들면 조혈 인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌 키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G단백질 콘쥬게이트형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신 포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착 인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체 및 그 특징에 관해서는 다수의 문헌, 예를 들면 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich 등(Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massague(e에는 양음 악센트 기호가 붙는다)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima 등(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga 등(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl 등(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith 등(Cell (1994) 76 (6) 959-962), Flower DR.(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234) 등에 기재되어 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들면 인간 또는 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 수용체(Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277-285), 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, mG-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), 인간 또는 마우스 인슐린 수용체(Nature (1985) 313 (6005), 756-761), 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α, β 수용체(Cell (1990) 60 (2), 225-234. 및 Cell (1994) 77 (3), 391-400), 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터류킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 유사 증식 인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제 인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경 영양 인자(CNTF) 수용체 등이 적합하게 예시된다.
암 항원은 세포의 악성화에 동반하여 발현하는 항원으로, 종양 특이성 항원으로도 불린다. 또한 세포가 암화되었을 때에 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 암 항원으로, 암 당쇄 항원으로도 불린다. 암 항원의 예로서는, 예를 들면 상기 수용체로서 GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하는 간암을 비롯한 몇 가지 암에 있어서 발현되고 있는 GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65), 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현하는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31), CA19-9, CA15-3, 시리얼 SSEA-1(SLX) 등을 적합하게 들 수 있다.
MHC 항원은 주로 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 분류되며, MHC class I 항원에는 HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되고, MHC class II 항원에는 HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다.
분화 항원에는 CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130이 포함될 수 있다.
면역 글로불린에는 IgA, IgM, IgD, IgG, IgE가 포함된다. 또한 면역 복합체는 적어도 면역 글로불린 중 어느 하나의 성분을 포함한다.
그 밖의 항원으로서는 하기와 같은 분자;17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨 인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극 인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양 인자(Bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 웰치균 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어 인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파 1, GFR-알파 2, GFR-알파 3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출 인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮬러리안 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신(prorelaxin), 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV)F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직 인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P, 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.
가변영역을 구성하는 아미노산 서열은 그 항원 결합 활성이 유지되는 한, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 개변이 허용된다. 가변영역의 아미노산 서열을 개변하는 경우, 개변되는 부위나 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 CDR 및/또는 FR에 존재하는 아미노산을 적절히 개변할 수 있다. 가변영역의 아미노산을 개변하는 경우, 특별히 한정되지 않으나 결합 활성이 유지되어 있는 것이 바람직하고, 예를 들면 개변 전과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상의 결합 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한 아미노산 개변에 의해 결합 활성이 상승되어 있어도 되고, 예를 들면 결합 활성이 개변 전과 비교하여 2배, 5배, 10배 등이 되어 있어도 된다. 본 발명의 항체에 있어서 아미노산 서열의 개변이란 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결손 및 수식 중 하나 이상일 수 있다.
예를 들면 가변영역의 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다. 따라서 본 발명의 항체는 그 중쇄의 N말단이 글루타민인 경우에는 그것이 피로글루타민산에 수식된 가변영역을 포함한다.
본 발명의 항체의 가변영역은 임의의 서열이어도 되고, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체, 및 이들 비인간 항체를 인간화한 인간화 항체 및 인간 항체 등, 어떠한 유래의 항체의 가변영역이어도 된다. 「인간화 항체」란, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불리는 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 또한 이들 항체의 가변영역에 대해 항원으로의 결합, 약물동태, 안정성, 면역원성을 개선하기 위해 다양한 아미노산 치환을 도입한 것이어도 된다. 본 발명의 항체의 가변영역은 항원에 대한 결합에 pH 의존성을 가짐으로써 항원에 대해 반복 결합할 수 있어도 된다(WO2009/125825).
항체의 경쇄 정상영역에는 κ쇄와 λ쇄 타입의 정상영역이 존재하고 있는데, 어느 경쇄 정상영역이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 정상영역은 아미노산의 치환, 결손, 부가 및/또는 삽입 등의 개변이 행해진 경쇄 정상영역이어도 된다.
본 발명의 항체의 중쇄 정상영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG 항체의 중쇄 정상영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체, 인간 IgG4 항체의 중쇄 정상영역이다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체는 다른 단백질, 생리 활성 펩티드 등과 결합시켜 Fc 융합 단백질 분자로 하는 것이 가능하다. 여기서 융합 단백질이란 천연으로는 그것이 자연히 연결되지 않는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 다른 단백질, 생리 활성 펩티드로서는, 예를 들면 수용체, 접착 분자, 리간드, 효소를 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 Fc 융합 단백질 분자의 바람직한 예로서, 표적에 결합하는 수용체 단백질에 Fc영역을 융합한 단백질을 들 수 있고, 예를 들면 TNFR-Fc 융합 단백, IL1R-Fc 융합 단백, VEGFR-Fc 융합 단백, CTLA4-Fc 융합 단백 등(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52, BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)을 들 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드에 융합시키는 단백질은 표적 분자에 결합하는 한 어떠한 분자여도 되고, 예를 들면 scFv 분자(WO2005/037989), 단일 도메인 항체 분자(WO2004/058821, WO2003/002609), 항체 유사 분자(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469, Protein Science 2006, 15:14-27), 예를 들면 DARPins(WO2002/020565), Affibody(WO1995/001937), Avimer(WO2004/044011, WO2005/040229), Adnectin(WO2002/032925) 등을 들 수 있다. 또한 항체 및 Fc 융합 단백질 분자는 복수 종류의 표적 분자 또는 에피토프에 결합하는 다중 특이성 항체여도 된다.
또한 본 발명의 항체에는 항체의 수식물도 포함된다. 항체의 수식물의 예로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 세포 장애성 물질 등의 각종 분자와 결합시킨 항체를 들 수 있다. 이러한 항체 수식물은 본 발명의 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
또한 본 발명의 항체는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)여도 된다. 이중 특이성 항체란, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일한 항체 분자 내에 갖는 항체를 말하는데, 당해 에피토프는 상이한 분자 중에 존재하고 있어도 되고 동일한 분자 중에 존재하고 있어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 항체는 아래의 방법으로 제작할 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
항체의 중쇄를 코드하는 DNA로서, Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA, 및 항체의 경쇄를 코드하는 DNA를 발현시킨다. Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는, 예를 들면 천연형의 중쇄를 코드하는 DNA의 Fc영역 부분을 취득하고, 그 Fc영역 중의 특정 아미노산을 코드하는 코돈이 목적의 다른 아미노산을 코드하도록 적절히 치환을 도입함으로써 얻을 수 있다.
또한 사전에 천연형 중쇄의 Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코드하는 DNA를 설계하고, 그 DNA를 화학적으로 합성함으로써 Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 아미노산의 치환 부위, 치환의 종류로서는 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 치환에 한정되지 않고, 결손, 부가, 삽입 중 어느 하나 또는 그들의 조합이어도 된다.
또한 Fc영역 중에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다. 부분 DNA의 조합으로서는, 예를 들면 가변영역을 코드하는 DNA와 정상영역을 코드하는 DNA, 또는 Fab영역을 코드하는 DNA와 Fc영역을 코드하는 DNA 등을 들 수 있는데, 이들 조합에 한정되는 것은 아니다. 경쇄를 코드하는 DNA도 또한 동일하게 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다.
상기 DNA를 발현시키는 방법으로서는 아래의 방법을 들 수 있다. 예를 들면 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 중쇄 정상영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 중쇄 발현 벡터를 구축한다. 동일하게, 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 경쇄 정상영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 경쇄 발현 벡터를 구축한다. 이들 중쇄, 경쇄의 유전자를 단일 벡터에 삽입하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 항체를 코드하는 DNA를 발현 벡터로 삽입할 때, 발현 제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다. 그때는 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한 cDNA의 서브 클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사 제조), 「QIAexpress system」(QIAGEN사 제조), pEGFP 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397, 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 리포펙틴법, 인산칼슘법, DEAE-Dextran법을 사용해서 행할 수 있다.
대장균 발현 벡터 외에, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사 제조)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17), p5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CAG 프로모터(Gene. (1991) 108, 193, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하여, 형질전환 세포를 선택하기 위한 유전자(예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한 유전자를 안정적으로 발현시키고 또한 세포 내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하여 메토트랙세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 또한 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한 숙주세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
항체의 회수는, 예를 들면 형질전환된 세포를 배양한 후, 분자 형질전환한 세포의 세포 내 또는 배양액으로부터 분리함으로써 행할 수 있다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리, 황산암모늄 분획, 염석, 한외여과, 1q, FcRn, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 적절히 조합해서 행할 수 있다.
또한 본 발명은 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역 개변체에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다;
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 측정하는 공정, 및
(c) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 공정.
바람직한 태양으로서는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역 개변체에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다;
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 폴리펩티드의 FcγRIIa에 대한 결합 활성 및 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 측정하는 공정, 및
(c) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 공정.
바람직한 태양으로서는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역 개변체에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다;
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 폴리펩티드의 FcγRIIa에 대한 결합 활성 및 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 측정하는 공정, 및
(c) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 공정.
바람직한 태양으로서는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는 생체에 투여된 경우에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산이 억제된 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다;
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정, 및
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드가 생체에 투여된 경우에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 항체의 생산이 억제되는 것을 확인하는 공정.
그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산이 억제되었는지 여부는 동물에 실제로 그 폴리펩티드를 투여하는 등의 방법으로 확인할 수 있다. 또는 FcγRIIa에 대한 결합 활성 및 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 측정하고, FcγRIIa에 대한 KD값을 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값이 증가하는 것으로써 항체의 생산이 억제되었다고 판단하는 것도 가능하다. 그러한 폴리펩티드는 활성형 FcγR을 활성화하지 않고 항체의 생산을 억제할 수 있기 때문에 의약품으로서 유용할 것으로 생각된다.
상기 제조방법에 있어서는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키고 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키도록 하는 것이 바람직ㅎ다.
상기 제조방법에 있어서의 바람직한 태양으로서는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc영역에 있어서 EU 넘버링 238번째의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 234번째의 아미노산, 235번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 265번째의 아미노산, 266번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 269번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 274번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 326번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 331번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산, 334번째의 아미노산, 355번째의 아미노산, 356번째의 아미노산, 358번째의 아미노산, 396번째의 아미노산, 409번째의 아미노산 및 419번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변이 도입되도록 당해 Fc영역을 개변한다. EU 넘버링 238번째의 아미노산 개변과 조합되는 다른 아미노산 개변으로서는, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산이 바람직하고, 특히 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 330번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산이 바람직하다. 특히 EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 조합한 개변을, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키거나 또는 FcγRIIa와 비교한 경우의 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 관점에서 바람직한 아미노산 개변의 조합으로서 들 수 있다.
개변되는 아미노산은 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되거나 또는 FcγRIIa와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 234번째의 아미노산이 Tyr, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 265번째의 아미노산이 Glu, 266번째의 아미노산이 Phe, Leu 또는 Met, 267번째의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Gln, 268번째의 아미노산이 Asp, Gln 또는 Glu, 269번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro 또는 Gln, 274번째의 아미노산이 Gln, 296번째의 아미노산이 Asp 또는 Phe, 326번째의 아미노산이 Ala 또는 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Lys, Arg 또는 Ser, 331번째의 아미노산이 Ser, 332번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 333번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 334번째의 아미노산이 Arg, Ser 또는 Thr, 355번째의 아미노산이 Ala, Gln, 356번째의 아미노산이 Glu, 358번째의 아미노산이 Met, 396번째의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 409번째의 아미노산이 Arg, 419번째의 아미노산이 Glu인 것이 바람직하다. 개변되는 아미노산으로서는, 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고 또한 FcγRIIa와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 것이 보다 바람직하다. 특히 EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산과, EU 넘버링 233번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 조합하는 경우는, EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 또는 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg, 332번째의 아미노산이 Thr, 396번째의 아미노산이 Leu 또는 Met인 것이 바람직하다.
이들 조합 중에서도 보다 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되는 개변, 또는 보다 FcγRIIa(R형)보다도 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강되는 개변을 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 개변으로서 바람직한 아미노산 치환의 조합으로서는, 예를 들면 아래의 (a) 내지 (x)의 조합을 들 수 있다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째 및 330번째의 아미노산 개변
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 330번째의 아미노산 개변
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
또한 이들 개변의 조합 중에서도 아래의 (a) 내지 (x)의 아미노산 개변의 조합을 보다 바람직한 조합으로서 들 수 있다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Gly 또는 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met인 아미노산 서열
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Gly, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
또한 본 발명은 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 생체에 투여된 경우에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 항체의 생산이 억제된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양으로서는, 예를 들면 전술한 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 기재된 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다. 또한 바람직한 태양으로서는, 예를 들면 전술한 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 기재된 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 개변되고, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 또는 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 개변되고, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되며, 또한 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 상기 핵산은 DNA, RNA 등 어떠한 형태여도 된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 종류는 벡터가 도입되는 숙주세포에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 당업자가 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 숙주세포를 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 아래와 같은 숙주세포를 들 수 있다.
진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포:CHO(Chinese hamster ovary cell line), COS(Monkey kidney cell line), 골수종(Sp2/0, NS0 등), BHK(baby hamster kidney cell line), Hela, Vero 등, HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA), Freestyle 293, PER.C6 cell(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes) 등(Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2) 양서류세포:아프리카 발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포:sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모:사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
-사상균:아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성을 증강시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 생체에 투여된 경우에 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양으로서는, 예를 들면 전술한 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강 및/또는 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 기재된 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다.
또한 상기 중 어느 한 방법에 의해 제조된 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 상기 항체 또는 Fc 융합 단백질 분자에 가하여 의약적으로 허용 가능한 담체를 도입하고, 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수 규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기 염류 등을 담체로서 들 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
투여는 바람직하게는 비경구투여이고, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여제형 등을 들 수 있다. 주사제형은, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한 본 발명의 의약 조성물은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎ 내지 1,000 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001 내지 100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있는데, 이들 값으로 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되는데 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 B 세포, 마스트 세포, 수상(樹狀) 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제하는 약제의 유효 성분으로서 유용하다. 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 활성형 FcγR을 활성화하지 않고 FcγRIIb에 선택적으로 작용하여 B 세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제하는 것이 가능하다. B 세포의 활성화란 증식, IgE 생산, IgM 생산, IgA 생산 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 FcγRIIb와 IgE를 가교함으로써 B 세포의 IgE 생산을 억제하고, IgM과 가교함으로써 B 세포의 IgM 생산을 억제하며, IgA와 가교함으로써 IgA 생산을 억제한다. 그 이외에도 BCR, CD19, CD79b 등의 B 세포 상에 발현하고 있는 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 상기와 동일한 억제작용을 발휘한다. 또한 마스트 세포의 활성화란 증식, IgE 등에 의한 활성화, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 마스트 세포에 있어서는 IgE 수용체인 FcεRI, DAP12, CD200R3 등의 마스트 세포 상에 발현하고 있는 ITAM 도메인을 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적, 간접적으로 가교함으로써 증식, IgE 등에 의한 활성화, 탈과립을 억제하는 것이 가능하다. 또한 호염기구의 활성화란 증식, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 호염기구에 있어서도 FcγRIIb와 세포막 상의 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 활성화, 탈과립, 증식을 억제하는 것이 가능하다. 또한 수상 세포의 활성화란 증식, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 수상 세포에 있어서도 세포막 상의 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 활성화, 탈과립, 증식을 억제하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서는 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 유효 성분으로서 유용하다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 B 세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제할 수 있기 때문에, 그 결과로서 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 면역 염증성 질환을 치료 또는 예방하는 것이 가능하다. 「면역 염증성 질환」은 다음의 것을 포함하는데, 단 그것들에만 한정되지 않는다:류마티스성 관절염, 자기면역성 간염, 자기면역성 갑상선염, 자기면역성 수포증, 자기면역성 부신피질염, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반증, 거적혈구성 빈혈, 자기면역성 위축성 위염, 자기면역성 호중구 감소증, 자기면역성 정소염, 자기면역성 뇌척수염, 자기면역성 수용체병(receptor disease), 자기면역 불임, 만성 활동형 간염, 사구체신염, 간질성 폐섬유증, 다발성 경화증, 파제트병(Paget's disease), 골다공증(osteoporosis), 다발성 골수종, 포도막염, 급성 및 만성 척추염, 통풍성 관절염, 염증성 장질환, 성인 호흡 촉진 증후군(ARDS), 건선, 크론병, 바세도우병(Basedow disease), 약년성 당뇨병, 애디슨병, 중증 근무력증, 수정체성 포도막염, 전신성 에리테마토데스, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 궤양성 대장염, 과민증, 근육 변성, 악액질, 전신성 경피증, 국한성 경피증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 베체트병(Behcet disease), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), I형 및 II형 당뇨병, 골흡수 질환, 이식편대 숙주 반응, 허혈성 재관류 외상, 아테롬 경화증, 뇌 트라우마, 대뇌 말라리아, 패혈증, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 발열, 염색에 의한 말기아스(malgias), 재생 불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 돌발성 혈소판 감소증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토병, 천포창(pemphigus), IgA 신증, 화분증, 항인지질 항체 증후군, 다발성 근염, 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 동맥염, 혼합성 결합 조직병, 섬유근통증, 천식, 아토피성 피부염, 만성 위축성 위염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 췌장염, 대동맥염 증후군, 급속 진행성 사구체신염, 거적혈구성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 원발성 갑상선 기능 저하증, 특발성 애디슨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 만성 원판상 에리테마토데스, 유천포창(pemphigoid), 임신성 포진, 선상 IgA 수포성 피부염, 후천성 표피 수포증, 원형 탈모증, 심상성 백반, 수톤 후천성 원심성 백반, 하라다병, 자기면역성 시신경증, 특발성 무정자증, 습관성 유산, 저혈당증, 만성 두드러기, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 원발성 관절염, 척추 관절증, 건부착부염(enthesitis), 과민성 장증후군, 만성피로 증후군, 피부근염, 봉입체 근염, 쉬미트 증후군(Schmidt's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 악성 빈혈, 루포이드간염(lupoid hepatitis), 초로기 치매, 알츠하이머병, 탈수성 질환(demyelinating disease), 근위축성 측색 경화증, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군(Dressler syndrome), 이튼-람버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 포진상 피부염, 탈모증, 진행성 전신성 경화증, CREST 증후군(석회 침착증, 레이노 현상, 식도 운동 장애, 강지증 및 모세혈관 확장증), 사르코이드증(sarcoidosis), 류마티스열, 다형성 홍반, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 수혈 반응, 한센병, 다카야스 동맥염, 류마티스성 다발 근통증, 측두 동맥염, 거세포 동맥염, 습진, 림프종 유사 육아종증, 가와사키병, 심내막염, 심내막 심근 섬유증, 안내염, 태아 적아구증, 호산구성 근막염, 펠티 증후군(Felty's Syndrome), 헤노호-쉔라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 이식 거부반응, 유행성 이하선염, 심근증, 화농성 관절염, 가족성 지중해열, 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells Syndrome), 고IgD 증후군.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 자기항원에 대한 항체(자기항체)의 생산이 질환의 원인으로 생각되는 자기면역 질환에 있어서, 그 자기항체의 생산을 억제하여 당해 자기면역 질환을 치료 또는 예방하는 약제의 유효 성분으로서 유용하다. 중증 근무력증의 자기항원인 AchR과 항체의 Fc부분을 융합한 분자를 사용함으로써, AchR을 인식하는 BCR을 발현하는 B 세포의 증식을 억제하여 아포토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다(J Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010). 자기항체가 인식하는 항원과 본 발명에 기재된 항체 Fc영역의 융합 단백질을 사용함으로써 그 자기항원에 대한 BCR을 발현하는 B 세포의 BCR과 FcγRIIb를 가교하고 자기항원에 대한 BCR을 발현하는 B 세포의 증식을 억제하여 아포토시스를 유도하는 것이 가능하다. 이러한 자기면역 질환에는 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 만성 위축성 위염, 자기면역성 간염, 원발성 담증성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 췌장염, 대동맥염 증후군, 굿파스처 증후군, 급속 진행성 사구체신염, 거적아구성 빈혈, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 호중구 감소중, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 바세도우병, 하시모토병, 원발성 갑상선 기능 저하증, 특발성 애디슨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 만성 원판상 에리테마토데스, 국한성 경피증, 천포창, 유천포창, 임신성 포진, 선상 IgA 수포성 피부증, 후천성 표피 수포증, 원형 탈모증, 심상성 백반, 수톤 후천성 원심성 백반, 하라다병, 자기면역성 시신경증, 특발성 무정자증, 습관성 유산, 2형 당뇨병, 저혈당증, 만성 두드러기가 포함되는데, 이것들에만 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제의 유효 성분으로서 유용하다. 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환에 대해 그 단백질을 약제로서 투여하여 보충하는 치료법이 사용되는데, 환자는 원래 그 단백질을 결손하고 있기 때문에 외부로부터 보충된 그 단백질은 이물질로서 인식되어 그 단백질에 대한 항체가 생산되어 버린다. 그 결과로서, 그 단백질이 제거되기 쉬워지게 되어 약제로서의 효과가 감약되어 버린다. 그러한 단백질과 본 발명에 기재된 항체 Fc영역의 융합 단백질을 사용함으로써 당해 단백질을 인식하는 B 세포 상에 있어서 BCR과 FcγRIIb를 가교하여 당해 단백질에 대한 항체 생산을 억제하는 것이 가능하다. 보충하는 단백질로서는 Factor VIII, Factor IX, TPO, EPO, α-iduronidase, iduronate sulfatase, A형 heparan N-sulfatase,B형 α-N-acetylglucosaminidase, C형 acetyl CoA:α-glucosaminidase acetyltransferase,D형 N-acetylglucosamine 6-sulfatase, galactose 6-sulfatase, N-acetylgalactosamine 4-sulfatase, β-glucuronidase, α-galactosidase, acidic α-galactosidase, glucocerebrosidase가 포함된다. 또한 이들 단백질을 보충하는 질환으로서는, 혈우병, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 신성 빈혈(renal anemia), 리소좀병(뮤코다당증, 파브리병, 폼페병, 고쉐병) 등이 포함된다. 단 이들에 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 항바이러스제의 유효 성분으로서 유용하다. 바이러스에 대한 항체로서 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체는 바이러스에 대한 항체에 보이는 항체 의존성 감염 증강(antibody-dependent enhancement)을 억제하는 것이 가능하다. 항체 의존성 감염 증강이란, 바이러스가 그 바이러스에 대한 중화 항체를 이용하여 활성형 FcγR을 매개로 탐식되어 FcγR 발현세포에 감염시킴으로써 감염을 확대하는 현상이다. 뎅기 바이러스(dengue virus)에 대한 중화 항체의 FcγRIIb에 대한 결합이 항체 의존성 감염 증강을 억제하는 데 중요한 역할을 하고 있는 것이 보고되어 있다(Proc Natl Acad Sci USA, 108, 12479-12484, 2011). 뎅기 바이러스에 대한 중화 항체가 형성하는 뎅기 바이러스와의 면역 복합체가 FcγRIIb를 가교함으로써 FcγR을 매개로 한 탐식을 저해하여, 그 결과로서 항체 의존성 감염 증강을 억제한다. 바이러스에는 뎅기 바이러스(DENV1, DENV2, DENV4)나 HIV가 포함된다. 단 이들에만 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 동맥경화 예방제 또는 치료제의 유효 성분으로서 유용하다. 동맥경화의 원인인 산화 LDL에 대한 항체로서, 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체는 FcγRIIa 의존적인 염증성 세포의 접착을 방지하는 것이 가능하다. 항산화 LDL 항체는 산화 LDL과 CD36의 상호작용을 저해하는데, 항산화 LDL 항체가 내피세포에 대해 결합하여 그 Fc부분을 모노사이트가 FcγRIIa나 FcγRI 의존적으로 인식하여 접착하는 것이 보고되어 있다(Immunol Lett, 108, 52-61, 2007). 이러한 항체에 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체를 이용함으로써 FcγRIIa 의존적인 결합은 저해되고, 또한 FcγRIIb를 매개로 한 억제 시그널에 의해 모노사이트의 접착을 억제하는 것이 생각된다.
본 발명에 있어서는 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 암에 대한 치료제 또는 예방제의 유효 성분으로서 유용하다. 전술한 바와 같이, FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킴으로써 아고니스트 항체의 아고니스트 활성이 증강되어, 당해 항체가 갖는 항종양 효과도 증강되는 것이 알려져 있다. 이 때문에 본 발명에 기재된 Fc영역 개변체를 사용한 아고니스트 항체는 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 구체적으로는 본 발명에 기재된 Fc영역 개변체는 예를 들면 Aliases, CD120a, CD120b, Lymphotoxin β receptor, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, Osteoprotegerin, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, Nerve growth factor receptor, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25, Ectodysplasin A2 receptor 등의 TNF 수용체 패밀리에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성을 증강시켜, 암의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다. 또한 상기 이외에도 그 아고니스트 활성에 FcγRIIb와의 상호작용이 필요시되는 분자에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성도 증강된다. 이에 더하여 Receptor Tyrosine kinase(RTK)의 하나인 Kit와 같이 FcγRIIb와 가교됨으로써 세포의 증식이 억제되는 분자에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함시킴으로써 당해 분자를 발현한 세포에 대한 억제 작용을 증강시키는 것이 가능해진다. 암은 다음의 것을 포함하는데, 단 그것들에만 한정되지 않는다:폐암(소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암 및 폐편평상피암을 포함한다), 대장암, 직장암, 결장암, 유방암, 간암, 위암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 갑상선암, 담관암, 복막암, 중피종, 편평상피암, 자궁경부암, 자궁체암, 방광암, 식도암, 두경부암, 비인두암, 타액선종양, 흉선종, 피부암, 기저세포종, 악성 흑색종, 항문암, 음경암, 정소암, 윌름스종양, 급성 골수성 백혈병(급성 골수구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병 및 급성 단구성 백혈병을 포함한다), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 호지킨림프종, 비호지킨림프종(버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 맨틀세포 림프종, 여포성 림프종, 비만성 대세포형 림프종, 변연대 림프종(marginal zone lymphoma), 모양세포 백혈병 형질 세포종, 말초성 T세포 림프종 및 성인 T세포 백혈병/림프종), 랑게르한스세포 조직구증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 뇌종양(신경교종, 별세포종, 신경교아세포종(glioblastoma), 수막종 및 상의종을 포함한다), 신경아세포종, 망막아세포종, 골육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 혈관 육종, 혈관 외피 세포종.
또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 대상(환자)에 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 적어도 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드, 또는 본 발명의 의약 조성물을 포함하는 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는 그 밖에 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해 두는 것도 가능하다. 또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 명세서에서 사용되고 있는 아미노산의 3문자 표기와 1문자 표기의 대응은 아래와 같다.
알라닌:Ala:A
아르기닌:Arg:R
아스파라긴:Asn:N
아스파라긴산:Asp:D
시스테인:Cys:C
글루타민:Gln:Q
글루타민산:Glu:E
글리신:Gly:G
히스티딘:His:H
이소류신:Ile:I
류신:Leu:L
리신:Lys:K
메티오닌:Met:M
페닐알라닌:Phe:F
프롤린:Pro:P
세린:Ser:S
트레오닌:Thr:T
트립토판:Trp:W
티로신:Tyr:Y
발린:Val:V
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에에 포함된다.
실시예
본 발명은 아래의 실시예에 의해 추가적으로 예시하나, 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕기존의 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체의 혈소판 응집능의 평가
참고예 4의 표 16에 나타내어지는 바와 같이, 인간 천연형 IgG1의 EU 넘버링 267번째의 Ser을 Glu로, 328번째의 Leu를 Phe로 치환하는 개변을 도입하는 기존의 FcgRIIb 증강기술(비특허문헌 28)은 IgG1과 비교하여 FcgRIIb로의 결합을 408배 증강시키고, FcgRIIaH에 대한 결합을 0.51배로 감약시키는 한편으로, FcgRIIaR로의 결합이 522배 증강된다. 「배경기술」에 있어서 기술한 바와 같이 FcgRIIb에 대한 결합이 증강되어 있었다 하더라도, FcgRIIa만을 발현하는 혈소판과 같은 세포에 관하여는 FcgRIIa에 대한 증강효과만이 영향을 미치는 것으로 생각된다. 즉, FcgRIIaR에 대한 결합이 증강된 기존의 기술은 혈소판 응집 활성이 증강되어 혈전증의 발증 리스크를 높일 위험이 있다. 이를 확인하기 위해 실제로 항체의 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시킨 경우에 혈소판 응집 활성이 증강되는지 여부를 검증하였다.
IgE에 결합하는 인간 IgG1 항체의 중쇄로서 omalizumab-VH-G1d(서열번호:25), 경쇄로서 omalizumab-VL-CK(서열번호:26)를 참고예 1의 방법을 사용하여 제작하였다. 또한 omalizumab-VH-G1d에 대해 인간 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시키기 위해 EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 Ser을 Glu로, 328번 위치의 Leu를 Phe로 치환한 omalizumab-VH-G1d-v3를 제작하였다. 참고예 1의 방법을 사용하여 omalizumab-VH-G1d-v3를 중쇄로서 포함하고 omalizumab-VL-CK를 경쇄로서 포함하는 omalizumab-G1d-v3를 제작하였다. 이 항체를 사용하여 혈소판 응집능의 평가를 실시하였다.
혈소판 응집은 혈소판 응집능 측정장치 헤마 트래이서 712(주식회사 엘·엠·에스)를 사용해서 측정하였다. 먼저 약 50 mL의 전혈을 0.5 mL의 3.8% 구연산나트륨을 포함하는 4.5 mL 진공 채혈관에 일정 분량씩 채취하였다. 혈액을 200 g으로 15분간 원심분리하고 상청을 회수하여 Platelet Rich Plasma(PRP)로 하였다. 얻어진 PRP는 완충액 1(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.42 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 5.55 mM dextrose, 1.5 U/mL apyrase, 0.35% BSA)을 사용하여 세정한 후, 추가로 완충액 2(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.42 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 5.55 mM dextrose, 2 mM CaCl2, 0.35% BSA)로 치환하여 1 μL당 약 300,000개의 세정 혈소판을 조정하였다. 혈소판 응집능 측정장치에 교반봉을 포함하는 측정용 큐벳을 세팅하고, 거기에 세정 혈소판을 156 μL 분주하였다. 기기 내에서는 큐벳은 37.0℃로 유지되고, 교반봉은 1,000 rpm으로 혈소판을 교반하였다. 거기에 mol비 1:1의 omalizumab-G1d-v3와 IgE의 면역 복합체(최종 농도가 각각 600 ㎍/mL 및 686 ㎍/mL가 되도록 조제)를 44 μL 첨가하여 5분간 반응시켰다. 추가로 2차 응집을 일으키지 않는 농도의 아데노신 2인산(ADP, SIGMA)을 첨가하여 응집이 증강되는지를 확인하였다.
이 어세이로 얻어진 FcγRIIa의 유전자 다형(H/H 또는 R/H)의 도너별 결과를 도 1, 도 2에 나타낸다. 도 1의 결과로부터, FcγRIIa의 다형(R/H)에서는 면역 복합체를 첨가한 경우에 혈소판 응집을 증강시키는 것이 나타내어졌다. 한편 도 2에 나타낸 바와 같이 FcγRIIa 다형(H/H)에서는 혈소판 응집을 증강시키지 않았다.
다음으로 혈소판의 활성화를 활성화 마커를 사용하여 평가하였다. 혈소판의 활성화는 CD62p(p-selectin) 또는 활성형 인테그린 등의 활성화 마커의 혈소판 막 표면에 있어서의 발현 증가에 의해 측정할 수 있다. 전술한 방법에 의해 조정한 세정 혈소판 7.7 μL에 면역 복합체를 2.3 μL 첨가하고 실온에서 5분간 반응시킨 후, 추가로 최종 농도가 30 μM가 되도록 ADP를 첨가하고 활성화를 야기하여 면역 복합체에 의해 ADP에 의한 활성화가 증강되는지를 확인하였다. 음성 대조에는 면역 복합체 대신에 인산 완충액(pH 7.4, Gibco)을 첨가한 샘플을 사용하였다. 반응 후의 각 샘플은 PE 표지 항CD62 항체(BECTON DICKINSON), PerCP 표지 항CD61 항체, FITC 표지 PAC-1 항체(BD bioscience)를 사용하여 염색하고, 플로우 사이토미터(FACS CantoII, BD bioscience)로 각 형광강도를 측정하였다.
이 어세이법으로 얻어진 CD62p 발현 결과를 도 3에, 활성화 인테그린 발현 결과를 도 4에 나타낸다. 세정 혈소판은 FcγRIIa의 다형이 R/H인 1명의 건강한 정상인으로부터 얻은 것을 사용하였다. ADP 자극에 의해 혈소판 막 표면에 발현 유도되는 CD62p 및 활성형 인테그린은 면역 복합체 존재하에 있어서 모두 증강되었다.
이들 결과로부터, IgG1의 Fc에 EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 Ser을 Glu로, 328번 위치의 Leu를 Phe로 치환한 Fc를 갖는 기존의 인간 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체에서는, FcγRIIa의 유전자 다형 중 131번째의 아미노산이 R인 경우에는 131번째의 아미노산이 H인 경우와 비교하여 혈소판 응집 활성이 증강되는 것이 명확해졌다. 즉, 기존의 인간 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체는 FcγRIIa R형을 갖는 인간에 있어서는 혈소판 응집에 의한 혈전증의 발증 리스크를 높일 위험성이 시사되어, 이 문제점을 극복한 보다 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합을 증강시킨 Fc의 유용성이 명확해졌다.
〔실시예 2〕FcgRIIb로의 결합을 증강시킨 개변체의 제작
실시예 1에서 나타낸 바와 같이, FcgRIIb로의 결합을 증강시킬 때에는 다른 활성형 FcgR에 대한 결합을 가능한 한 억제하여 FcgRIIb로의 결합을 증강시킬 필요가 있다. 이에 FcgRIIb로의 결합 증강, 또는 선택성을 증대시키는 효과가 있는 개변끼리를 조합하고, 추가로 FcgRIIb로의 결합 또는 선택성을 증강시킨 개변체의 제작을 검토하였다. 구체적으로는 FcgRIIb로의 결합 증강, 선택성 향상의 양쪽에 있어서 우수한 효과를 나타내는 P238D 개변을 베이스로 하여, 참고예 6, 참고예 8, 참고예 9에 있어서 P238D와 조합시킴으로써 효과가 보인 개변끼리를 추가로 조합하였다.
항체 H쇄 가변영역으로서 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 가변영역인 IL6R-H의 가변영역(서열번호:18)을, 항체 H쇄 정상영역으로서는 인간 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d를 갖는 IL6R-G1d(서열번호:19)를 제작하였다. 또한 IL6R-G1d에 대해 K439E를 도입한 IL6R-B3(서열번호:23)를 제작하였다. 이에 대해 참고예 6, 참고예 8, 참고예 9에 있어서 P238D와 조합하여 효과가 확인된 개변인 E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R, A330K를 조합한 개변체를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하고, 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다.
각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD를 표 1에 나타낸다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 각 개변체를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 표 중의 「KD(IIaR)/KD(IIb)」란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 「모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)」는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 「모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)」는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 표 1 중 회색으로 칠해진 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
인간 천연형 IgG1의 서열을 갖는 IL6R-G1d/IL6R-L은 이에 대해 K439E를 도입한 IL6R-B3/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 결합을 1로 한 경우에, FcgRIa로의 결합이 1.3배, FcgRIIaR로의 결합이 1.1배, FcgRIIaH로의 결합이 1.1배, FcgRIIb로의 결합이 1.2배, FcgRIIIaV로의 결합이 0.9배로, 이들 모든 FcgR에 대한 결합이 IL6R-G1d/IL6R-L과 동등하였다. 따라서 각 개변체의 결합을 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하는 것은 각 개변체를 인간 천연형 IgG1의 서열을 갖는 IL6R-G1d/IL6R-L과 비교하는 것과 동등한 것으로 생각된다. 이에 이 이후의 실시예에 있어서는 각 개변체의 결합 활성을 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하는 것으로 하였다.
표 1로부터 어느 개변체도 개변 도입 전의 IL6R-B3와 비교하여 FcgRIIb로의 친화성이 향상되어 있고, 가장 낮았던 IL6R-BF648/IL6R-L에서 2.6배, 가장 높았던 IL6R-BP230/IL6R-L에서 147.6배였다. 또한 선택성을 나타내는 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값은 가장 낮았던 IL6R-BP234/IL6R-L에서 10.0, 가장 높았던 IL6R-BP231/IL6R-L에서 32.2가 되어, 어느 개변체도 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L의 0.3과 비교하여 선택성이 향상되어 있었다. 또한 어느 개변체도 FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIIaV로의 결합은 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L보다도 낮았다.
〔실시예 3〕FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체 및 FcγRIIaR형 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석
실시예 2에 있어서 가장 FcgRIIb로의 결합을 증강시킨 개변체 IL6R-BP230/IL6R-L은 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 약 150배로 증강되고, FcgRIIaR형으로의 결합도 1.9배 정도로 억제되어 있다. 따라서 IL6R-BP230/IL6R-L은 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 우수한 개변체이나, 더욱 우수한 개변체를 제작하기 위해서는 가능한 한 FcgRIIaR로의 결합을 억제하여 FcgRIIb로의 결합을 추가적으로 증강시킬 수 있는 것이 바람직하다.
참고예 7의 도 28에 나타낸 바와 같이, P238D 개변을 포함하는 Fc에서는 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 270번째의 Asp와 FcγRIIb의 131번째 Arg 사이에서 강고한 정전 상호작용을 형성하는데, 이 131번째의 잔기가 FcγRIIIa나 FcγRIIaH형에서는 His인 것에 대해 FcγRIIaR형에 있어서는 FcγRIIb와 동일한 Arg로, 결과적으로 이 부분에서의 상호작용에 차가 생겨 이것이 FcγRIIaR형과의 선택성이 나오기 어려운 요인이 되고 있다.
한편으로, FcγRIIa와 FcγRIIb는 세포외영역의 아미노산 서열의 93%가 일치하여 매우 높은 상동성을 가지고 있다. 천연형 IgG1의 Fc(이하 Fc(WT))와 FcγRIIaR형의 세포외영역 복합체의 결정 구조(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)를 분석하면, 양자의 상호작용 계면 부근에 있어서는 FcγRIIaR형과 FcγRIIb 사이에서 겨우 3 아미노산(Gln127, Leu132, Phe160)의 차이밖에 발견되고 있지 않아, FcγRIIaR형과의 선택성 개선에는 상당한 곤란함이 예상되었다.
이 때문에 추가적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성 증강과 선택성 향상을 도모하기 위해서는, FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 입체구조뿐 아니라 선택성 개선이 가장 곤란할 것으로 예상되는 FcγRIIaR형 세포외영역과의 복합체의 입체구조를 동시에 취득하여, 수용체의 차이에 의한 상호작용의 미묘한 차이를 입체구조적으로 명확하게 한 뒤에, 도입하는 아미노산 변이를 상세하게 검토하는 것이 필요하다고 생각하였다. 이에 IL6R-BP230/IL6R-L의 제작에 있어서 베이스가 된 개변체인 IL6R-BP208/IL6R-L(참고예 9에 있어서 제작)의 Fc로부터 K439E의 개변을 제거한 Fc(P208)을 대상으로 FcγRIIb 세포외영역 및 FcγRIIaR형 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석을 행하였다.
3-1. Fc(P208)과 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석
구조 해석 결과, Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체 구조를 분해능 2.81Å에서 결정, 그 해석 결과 취득된 구조를 도 5에 나타낸다. 2개의 Fc CH2 도메인 사이에 FcγRIIb 세포외영역이 끼이도록 결합되어 있어, 지금까지 해석된 천연형 IgG의 Fc인 Fc(WT)와 FcγRIIIa(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 12669-126674), FcγRIIIb(Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276, 16469-16477), FcγRIIa 의 각 세포외영역과의 복합체의 입체 구조가 유사하였다.
그러나 세부를 살펴보면 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 경우는 G237D 및 P238D의 변이 도입의 영향으로 Fc(WT)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체와 비교하여 Fc CH2 도메인 A의 힌지영역으로부터 계속되는 EU 넘버링 233번째부터 239번째의 루프 구조가 변화되어 있었다(도 6). 그 결과, Fc(P208)의 EU 넘버링 237번째 Asp의 주쇄와 FcγRIIb의 160번째 Tyr 측쇄 사이에 강고한 수소 결합의 형성이 확인되었다(도 7). 이 Tyr160은 FcγRIIa에 있어서는 H형, R형 모두 Phe로, 수소 결합의 형성은 불가능한 것으로부터 본 수소 결합은 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상 및 FcγRIIa에 대한 결합 활성의 저감이라는 선택성 획득에 중요한 기여를 하고 있는 것으로 생각되었다.
한편으로 Fc(P208)의 EU 넘버링 237번째의 Asp의 측쇄 자체는 FcγRIIb와의 사이에서 특별히 눈에 띄는 상호작용은 형성하고 있지 않고, Fc 내부 잔기와의 상호작용도 보이지 않았다. 이 EU 넘버링 237번째의 Asp의 주위에는 Fc 내의 EU 넘버링 332번째의 Ile, EU 넘버링 333번째의 Glu, EU 넘버링 334번째의 Lys가 근방에 위치하고 있었다(도 8). 이들 부위를 친수성 잔기로 치환함으로써 EU 넘버링 237번째의 Asp 측쇄와 상호작용을 형성시켜 본 루프 구조를 안정화할 수 있으면 FcγRIIb의 160번째의 Tyr과의 수소 결합 형성에 수반되는 엔트로피적인 에너지 손실을 경감하는 것으로 이어져 결합 자유 에너지의 증가, 즉 결합 활성의 향상으로 이어질 가능성이 생각되었다.
참고예 7에 있어서 나타내어진 P238D 개변을 갖는 Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)과 FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를 비교하면, Fc(P208)은 Fc(P238D)와 비교하여 새롭게 5개의 변이를 포함하고 있는데, 그 대부분은 측쇄 레벨의 변화에 그치고 있었다. 단 Fc의 CH2 도메인 B에 있어서는 EU 넘버링 271번째 Pro를 Gly로 개변한 것으로 인해 주쇄 레벨에서의 위치 변화가 보이는 동시에, 이와 함께 앞쪽의 EU 넘버링 266-270번 루프의 구조 변화가 일어나 있었다(도 9). 참고예 8에 나타낸 바와 같이, Fc(P238D)에 있어서는 EU 넘버링 270번째의 Asp가 FcγRIIb의 131번째 Arg와 강고한 정전 상호작용을 형성할 때, 이 EU 넘버링 271번째 Pro 부분에 입체화학적인 스트레스가 걸려 있을 가능성이 시사되고 있었다. 금번 EU 넘버링 271번째로의 Gly 도입에 의해 보인 구조 변화는 개변 전의 Pro 부분에 쌓여 있던 구조적인 변형이 해소된 결과로 생각되고, 그 해소분이 FcγRIIb와의 결합 자유 에너지의 개선, 즉 결합 활성의 향상으로 이어진 것으로 추찰하고 있다.
또한 이 EU 넘버링 266-271번째의 루프의 구조 변화에 기인하여 EU 넘버링 292번째의 Arg가 두 상태를 취하면서 구조 변화를 일으키고 있는 것이 확인되었다. 그때, 이 EU 넘버링 292번째의 Arg는 Fc(P208)에 있어서의 다른 개변 잔기의 하나인 EU 넘버링 268번째의 Asp와 정전 상호작용을 형성(도 9), 본 루프 구조의 안정화에 기여하고 있을 가능성이 생각되었다. 본 루프 중의 EU 넘버링 270번째의 Asp와 FcγRIIb의 131번째의 Arg 사이에서 형성되는 정전 상호작용은 FcγRIIb와의 결합 활성에 크게 기여하고 있는 것으로부터, H268D 개변의 도입은 본 루프 구조를 FcγRIIb 결합시 형태로 안정화시킴으로써 결합에 수반되는 엔트로피적인 에너지 손실을 경감하여 결합 자유 에너지의 증가, 즉 결합 활성의 향상으로 이어졌을 가능성이 있다.
또한 본 구조 해석 결과를 토대로 추가적인 활성 향상을 목표로 한 개변의 가능성을 정밀 조사한 바, 개변 도입 부위의 후보 중 하나로서 EU 넘버링 239번째의 Ser이 발견되었다. 도 10에 나타내는 바와 같이, FcγRIIb의 117번째의 Lys가 구조적으로 보아 가장 자연스러운 모양으로 신장되는 방향으로 이 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 239번째의 Ser은 위치하고 있다. 다만 금번 해석에서는 FcγRIIb의 117번째의 Lys의 전자밀도는 확인되고 있지 않아 본 Lys 잔기는 일정 구조를 취하고 있지 않은 것으로부터, 현재 상황에서는 Fc(P208)과의 상호작용으로의 이 Lys 잔기의 관여는 한정적일 것으로 생각되는데, 이 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 239번째의 Ser을 음전하를 갖는 Asp 또는 Glu로 개변한 경우, 양전하를 갖는 FcγRIIb의 117번째의 Lys와의 사이에 정전 상호작용을 기대할 수 있고, 그 결과로서 FcγRIIb로의 결합 활성의 향상이 기대되었다.
한편 CH2 도메인 A에 있어서의 EU 넘버링 239번째 Ser의 구조를 살펴보면, 본 아미노산 측쇄는 EU 넘버링 236번째의 Gly의 주쇄와 수소 결합을 형성하고, 힌지영역으로부터 계속되어 FcγRIIb Tyr160 측쇄와 수소 결합을 형성하는 EU 넘버링 237번째 Asp를 포함하는 233번째부터 239번에 걸친 루프 구조를 안정화시키고 있는 것으로 생각되었다(도 7). 본 루프 구조를 결합시의 형태로 안정화시키는 것은 결합에 수반되는 엔트로피적 에너지 손실을 경감시켜 결과적으로 결합 자유 에너지의 증가, 즉 결합 활성의 향상으로 이어진다. 한편 이 CH2 도메인 A의 EU 넘버링 239번째를 Asp 또는 Glu로 개변한 경우, EU 넘버링 239번째 Gly 주쇄와의 수소 결합이 상실되고 또한 바로 가까이에 존재하는 EU 넘버링 265번째 Asp와 정전 반발도 초래할 가능성이 있어, 커다란 루프 구조의 불안정화가 일어날 가능성이 생각되었다. 이 불안정화된 만큼의 에너지는 FcγRIIb와의 결합 자유 에너지의 감소로 작용하기 때문에, 결과적으로 결합 활성의 저하를 초래할 가능성이 있다.
[Fc(P208)의 발현 정제]
Fc(P208)의 조제는 아래와 같이 행하였다. 먼저 IL6R-BP208(서열번호:24)의 EU 넘버링 439번째의 Glu를 천연형 인간 IgG1의 서열인 Lys로 한 IL6R-P208을 제작하였다. 다음으로 EU 넘버링 220번째의 Cys를 Ser로 치환하고, EU 넘버링 216번째의 Glu로부터 그 C말단을 PCR에 의해 클로닝한 유전자 서열 Fc(P208)을 참고예 1에 기재된 방법에 따라 발현 벡터의 제작, 발현, 정제를 행하였다. 또한 EU 넘버링 220번째의 Cys는 통상의 IgG1에 있어서는 L쇄의 Cys와 disulfide bond를 형성하고 있는데, Fc만을 조제하는 경우 L쇄를 공발현시키지 않기 때문에 불필요한 disulfide bond 형성을 회피하기 위해 Ser로 치환하였다.
[FcγRIIb 세포외영역의 발현 정제]
참고예 2의 방법에 따라 조제하였다.
[Fc(P208) FcγRIIb 세포외영역 복합체의 정제]
결정화용으로 얻어진 FcγRIIb 세포외영역 샘플 1.5 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15 ㎎을 첨가하고, 0.1M Bis-Tris pH 6.5의 Buffer 조건으로 실온에서 3일간 정치함으로써 N형 당쇄를 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine을 남기고 절단하였다. 다음으로 이 당쇄 절단 처리를 행한 FcγRIIb 세포외영역 샘플을 5000MWCO의 한외여과막에 의해 농축하고, 20 mM HEPES pH 7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하였다. 또한 얻어진 당쇄 절단 FcγRIIb 세포외영역 분획에 Fc(P208)을 몰비로 FcγRIIb 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 첨가하여 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 25 mM HEPES pH 7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하여 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 얻었다.
[Fc(P208)/FcγRIIb 복합체 세포외영역 복합체의 결정화]
Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 약 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 행잉 드롭 증기 확산법에서 Seeding법을 병용하면서 결정화를 행하였다. 결정화에는 VDXm 플레이트(Hampton Research)를 사용하고, 0.1M Bis-Tris pH 6.5, 19%(w/v) PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic의 리저버 용액에 대해, 리저버 용액:결정화 샘플=0.85 ㎕:0.85 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작하고, 거기에 동일한 조건으로 얻어진 동 복합체의 결정을 Seed Bead(Hampton Research)를 사용하여 파쇄한 종결정 용액으로부터 제작한 희석 용액 0.15 ㎕를 첨가하고, 리저버가 든 웰에 밀폐, 20℃에 정치한 바 판형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
[Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정]
얻어진 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 단결정 하나를 0.1M Bis-Tris pH 6.5, 24%(w/v) PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic, 20%(v/v) Ethylene glycol의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀으로 용액째 떠내 액체질소 중에서 동결시키고, Spring-8의 BL32XU로 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 놓음으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인이 비치된 CCD 디텍터 MX-225HE(RAYONIX)에 의해 결정을 0.6°씩 회전시키면서 토탈 300매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)를 사용하고, 최종적으로 분해능 2.81Å까지의 회절 강도 데이터를 얻었다. 본 결정은 공간군 C2221에 속하고, 격자상수 a=156.69Å, b=260.17Å, c=56.85Å, α=90°, β=90°, γ=90°였다.
[Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조 해석]
구조 결정은 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)를 사용한 분자 치환법에 의해 행하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 1개로 예상되었다. Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조인 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터 A쇄 239-340번 및 B쇄 239-340번의 아미노산 잔기 부분을 별도 좌표로서 취출하여 각각을 Fc의 CH2 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마찬가지로 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터 A쇄 341-444번과 B쇄 341-443번의 아미노산 잔기 부분을 하나의 좌표로서 취출하여 Fc CH3 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마지막으로 FcγRIIb 세포외영역의 결정 구조인 PDB code:2FCB의 구조 좌표로부터 A쇄 6-178번의 아미노산 잔기 부분을 취출하여 Fc(P208)의 탐색용 모델로 하였다. Fc CH3 도메인, FcγRIIb 세포외영역, Fc CH2 도메인의 각 탐색용 모델의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정하고자 한 바, CH2 도메인의 하나에 대해서는 그 위치 결정이 제대로 이루어지지 않았다. 이에 나머지 3개의 부분으로부터 계산된 위상을 토대로 계산한 전자밀도 맵에 대해 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조를 참고로 하면서 마지막 CH2 도메인의 위치를 결정, Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정 구조의 초기 모델을 얻었다. 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc의 CH2 도메인, 2개의 Fc의 CH3 도메인 및 FcγRIIb 세포외영역을 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 42.6%, Free R값은 43.7%가 되었다. 또한 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출한 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 맵을 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)로 행하고, 이를 반복함으로써 모델의 정밀화를 행하였다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 맵을 토대로 수분자를 모델에 삽입하고 정밀화를 행함으로써, 최종적으로 분해능 25-2.81Å의 27259개의 회절 강도 데이터를 사용하여 4786개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 24.5%, Free R값은 28.2%가 되었다.
3-2. Fc(P208)과 FcγRIIaR형 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석
구조 해석 결과, Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체와의 결정 구조를 분해능 2.87Å에서 결정하였다. Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 결정 구조를 실시예 3-1에 나타낸 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체와의 결정 구조와 비교한 바, 양쪽 수용체의 매우 높은 아미노산 상동성을 반영하여 전체 구조에 대해서는 거의 차이는 보이지 않았다(도 11). 그러나 전자밀도 레벨에서 구조를 상세하게 살펴보면 선택성 개선에 사용할 수 있을 가능성이 있는 차이가 발견되었다. FcγRIIaR형에 있어서는 160번째의 잔기는 Tyr이 아니라 Phe로, 도 12에 나타낸 바와 같이 P238D 개변을 포함하는 Fc와 FcgRIIb의 결합시에 존재한 Fc CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째의 아미노산 잔기의 주쇄 사이의 수소 결합은 형성할 수 없다. 이것이 P238D 개변의 도입에 의한 FcγRIIaR형과의 선택성 개선의 주요인으로 생각되는데, 추가로 전자밀도 레벨에서 비교해본 바, FcγRIIb와의 복합체에서는 Fc CH2 도메인 A에 있어서 EU 넘버링 235번째의 Leu나 EU 넘버링 234번째의 Leu의 측쇄의 전자밀도가 확인 가능한 것에 대해 FcγRIIaR형과의 복합체에서는 이들 측쇄의 전자밀도가 명확하지 않아, EU 넘버링 237번째 부근의 루프가 이 부근에서의 FcgRIIaR형과의 상호작용의 저하에 수반하여 흔들리고 있는 것으로 생각된다. 한편 CH2 도메인 B에 대해서 같은 영역의 구조를 비교해본 바(도 13), FcγRIIb와의 복합체 구조에서는 EU 넘버링의 237번째의 Asp까지의 전자밀도를 확인할 수 있는 것에 대해, FcγRIIaR형과의 복합체에서는 EU 넘버링의 237번째의 Asp부터 앞쪽 3 잔기 정도까지 전자밀도를 확인하는 것이 가능하여, FcgRIIb 결합시와 비교하여 보다 넓은 영역을 사용하여 상호작용을 형성하고 있는 것으로 생각된다. 이상으로부터, Fc(P208)의 EU 넘버링 234번째부터 238번째의 영역에 있어서는 FcγRIIb와의 결합시에는 CH2 도메인 A측의 기여가, FcγRIIaR과의 결합시에는 CH2 도메인 B측의 기여가 커져 있을 가능성이 시사되었다.
[FcγRIIaR형 세포외영역의 발현 정제]
참고예 2의 방법에 따라 조제하였다.
[Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 정제]
정제된 FcγRIIa R형 세포외영역 샘플 1.5 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15 ㎎과 20 ㎕의 5 U/㎖ Endo F2(QA-bio) 및 20 ㎕의 5 U/㎖ Endo F3(QA-bio)를 첨가하여, 0.1M Na Acetate pH 4.5의 Buffer 조건으로 실온에서 9일간 정치한 후, 추가로 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.07 ㎎과 7.5 ㎕의 5 U/㎖ Endo F2(QA-bio) 및 7.5 ㎕의 5 U/㎖ Endo F3(QA-bio)를 추가하고, 추가적으로 3일간 정치함으로써 N형 당쇄를 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine을 남기고 절단하였다. 다음으로 이 당쇄 절단 처리를 행한 FcγRIIaR형 세포외영역 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축하고, 25 mM HEPES pH 7, 0.1M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하였다. 추가로 얻어진 당쇄 절단 FcγRIIaR형 세포외영역 분획에 Fc(P208)을 몰비로 FcγRIIaR형 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 첨가하고, 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 25 mM HEPES pH 7, 0.1M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하여 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 샘플을 얻었다.
[Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 결정화]
Fc(P208)/FcγRIIa R형 세포외영역 복합체의 샘플을 10000MWCO의 한외여과막으로 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 시팅 드롭 증기확산법으로 결정화를 행하였다. 0.1M Bis-Tris pH 7.5, 26%(w/v) PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfate의 리저버 용액에 대해 리저버 용액:결정화 샘플=0.8 ㎕:1.0 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작 후, 실링으로 밀폐, 20℃에 정치한 바, 판형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
[Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정]
얻어진 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 단결정 하나를 0.1M Bis-Tris pH 7.5, 27.5%(w/v) PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfate, 20%(v/v) Glycerol의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀으로 용액째 떠내 액체질소 중에서 동결시키고, 고에너지 가속기 연구기구의 방사광시설 포톤팩토리 BL-17A로 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 놓음으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인이 비치된 CCD 디텍터 Quantum 315r(ADSC)에 의해 결정을 0.6°씩 회전시키면서 토탈 225매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)를 사용하고, 최종적으로 분해능 2.87Å까지의 회절 강도 데이터를 얻었다. 본 결정은 공간군 C2221에 속하고, 격자상수 a=154.31Å, b=257.61Å, c=56.19Å, α=90°, β=90°, γ=90°였다.
[Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조 해석]
구조 결정은 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)를 사용한 분자 치환법으로 행하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 Fc(P208)/FcγRIIaR형 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 1개로 예상되었다. 실시예 3-1에서 얻어진 Fc(P208)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조를 탐색용 모델로 하고, 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정, 추가로 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc의 CH2 도메인, 2개의 Fc의 CH3 도메인 및 FcγRIIaR형 세포외영역을 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 38.4%, Free R값은 38.0%가 되었다. 추가로 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출한 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 맵을 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)로 행하고, 이를 반복함으로써 모델의 정밀화를 행하였다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 맵을 토대로 수분자를 모델에 삽입하고 정밀화를 행함으로써, 최종적으로 분해능 25-2.87Å의 24838개의 회절 강도 데이터를 사용하여 4758개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 26.3%, Free R값은 29.8%가 되었다.
〔실시예 4〕결정 구조를 토대로 개변 개소를 결정한 Fc 개변체
실시예 3에 있어서 나타낸 바와 같이, FcgRIIb 결합 증강 개변체 Fc(P208)의 CH2 도메인 B에서는 P271G 개변의 도입에 수반되는 주위의 구조 변화의 결과로서 EU 넘버링 268번째 Asp가 EU 넘버링 292번째 Arg와 정전 상호작용을 형성하고 있는 것이 시사되었다(도 9). 이 상호작용 형성이 EU 넘버링 266-271번째의 루프 구조의 안정화로 작용하여, 결과적으로 FcγRIIb로의 결합 증강에 기여했을 가능성이 생각된다. 이에 이 EU 넘버링 268번째의 Asp를 Glu로 개변함으로써 FcγRIIb 292번째의 Arg와의 정전 상호작용을 강화시켜 본 루프 구조를 더욱 안정화시킴으로써 FcgRIIb와의 상호작용 증강으로 이어지는지 검토를 행하였다. 또한 도 8에 나타낸 바와 같이, FcgRIIb의 EU 넘버링 160번째 Tyr은 Fc(P208) CH2 도메인 A의 EU 넘버링 237번째 Asp의 주쇄와 수소 결합을 형성하여 FcgRIIb와의 결합에 중요한 역할을 하고 있다. 한편 EU 넘버링 237번째 Asp의 측쇄 부분은 특정 상호작용은 형성하고 있지 않지만 분자 내에서 EU 넘버링 332번째 Ile, EU 넘버링 333번째 Glu, EU 넘버링 334번째 Lys가 근방에 위치하고 있다. 이들 부위를 친수성 잔기로 치환함으로써 EU 넘버링 237번째 Asp와 상호작용을 강화하여 본 잔기 근방의 루프 구조를 안정화함으로써 FcγRIIb의 160번째의 Tyr과의 상호작용이 증강되는지 함께 검증하였다.
실시예 2에 있어서 제작한 IL6R-BP230/IL6R-L(서열번호:27/서열번호:21)에 대해 H268E, I332T, I332S, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, E333T, K334S, K334T, K334E를 각각 도입한 개변체를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하고 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다.
각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD를 표 2에 나타낸다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-BP230을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 표 중의 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. KD(IIaR)/KD(IIb)란, 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 2 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
IL6R-BP230/IL6R-L에 대해 H268E를 도입한 IL6R-BP264/IL6R-L, E333K를 도입한 IL6R-BP465/IL6R-L, E333R을 도입한 IL6R-BP466/IL6R-L, E333T를 도입한 IL6R-BP470은 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 향상되어 있었다. 또한 I332T를 도입한 IL6R-BP391/IL6R-L은 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 선택성은 저하되지만, FcgRIIb로의 결합이 향상되어 있었다.
〔실시예 5〕EU 넘버링 271번째 주변으로의 망라적 개변의 도입
P238D 개변을 갖는 Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(P208)과 FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조를 비교하면, 가장 구조적으로 커다란 변화가 보이는 것은 EU 넘버링 271번째 근방의 구조로 되어 있다(도 9). 참고예 8에 나타낸 바와 같이 Fc(P238D)에서는 EU 넘버링 270번째 Asp가 FcγRIIb의 131번째 Arg와 강고한 정전 상호작용을 형성할 때, EU 넘버링 271번째 Pro 부분에 입체 화학적인 스트레스가 걸려 있을 가능성이 시사되었다. Fc(P208)/FcγRIIb의 구조에 있어서는 P271G의 개변 도입에 의해 이 구조적인 변형을 해소하도록 주쇄 레벨에서의 위치 변화가 일어나고 있어, 그 결과 EU 넘버링 271번째 근방의 구조가 크게 변화된 것으로 생각된다. 이 변화된 구조를 더욱 안정화할 수 있도록 제대로 개변을 도입할 수 있다면 FcγRIIb 131번째 Arg와의 정전 상호작용 형성에 수반되는 엔트로피적인 에너지 손실을 더욱 경감할 수 있어 결합 활성 향상으로 이어질 가능성이 있다. 이에 EU 넘버링 271번째의 주변에 대해 망라적인 개변을 도입하여 FcgRIIb에 대한 결합 증강 또는 선택성의 향상 효과를 나타내는 개변을 탐색하였다.
망라적인 개변을 도입하는 주형으로서는 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 E233D, G237D, P238D, H268E, P271G를 도입한 IL6R-BP267(서열번호:29)을 제작해서 사용하였다. IL6R-BP267에 대해 EU 넘버링 264번째, 265번째, 266번째, 267번째, 269번째, 272번째의 아미노산을 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변으로부터 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다. 얻어진 개변체 중에서 개변을 도입하기 전의 IL6R-BP267/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합을 증강시키는 것, 또는 FcgRIIb로의 선택성을 향상시키는 것에 대해서 표 3에 정리하였다.
각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD를 표 3에 나타낸다. 또한 표 중의 「IL6R-BP267에 가한 개변」이란 주형으로 한 IL6R-BP267(서열번호:29)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 기초가 되는 IL6R-B3/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 표 중의 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 3 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 3에 나타낸 개변체는 모두 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하여 FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIIaV로의 결합이 유지 또는 감소되어 있었다. 또한 IL6R-BP267/IL6R-L에 대해 각각 S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G, V266M을 가한 개변체는 개변을 가하기 전의 IL6R-BP267/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 증강되어 있었다. 또한 IL6R-BP267/IL6R-L에 대해 각각 S267A, S267G, E272M, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I, E272F를 가한 개변체는 개변을 가하기 전의 IL6R-BP267/IL6R-L과 비교하여 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값이 증가되어 있어, FcgRIIb로의 선택성을 향상시키는 효과를 나타내었다.
〔실시예 6〕CH3영역으로의 개변 도입에 의한 FcgRIIb로의 결합 증강
EU 넘버링 396번째의 Pro를 Leu로 치환하는 개변은 FcgRIIb로의 결합을 증강시키는 것이 보고되어 있다(Cancer Res., 2007, 67, 8882-8890). EU 넘버링 396번째는 FcgR과의 상호작용에는 직접 관여하지 않는 부위이나, 항체의 구조를 변화시킴으로써 FcgR과의 상호작용에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 이에 EU 넘버링 396번째에 망라적으로 개변을 도입함으로써 FcgRIIb로의 결합 또는 선택성이 향상되는지 여부에 대해서 검증을 행하였다.
IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 E233D, G237D, P238D, S267A, H268E, P271G, A330R을 도입한 IL6R-BP423(서열번호:33)을 제작하여 주형으로 하였다. IL6R-BP423에 대해 EU 넘버링 396번째를 원래의 아미노산과 시스테인을 제외한 18종류의 아미노산으로 치환한 개변체를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다. 얻어진 개변체의 각 FcgR로의 결합을 표 4에 정리하였다.
또한 표 중의 「IL6R-BP423에 가한 개변」이란 IL6R-BP423에 대해 도입한 개변을 나타내는데, IL6R-BP423을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 표 중의 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)은 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 4 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 4의 결과로부터, IL6R-BP423/IL6R-L에 대해 P396M을 도입한 IL6R-BP456/IL6R-L, P396L을 도입한 IL6R-BP455/IL6R-L, P396Y를 도입한 IL6R-BP464/IL6R-L, P396F를 도입한 IL6R-BP450/IL6R-L, P396D를 도입한 IL6R-BP448/IL6R-L, P396Q를 도입한 IL6R-BP458/IL6R-L, P396I를 도입한 IL6R-BP453/IL6R-L, P396E를 도입한 IL6R-BP449/IL6R-L, P396K를 도입한 IL6R-BP454/IL6R-L, P396R을 도입한 IL6R-BP459/IL6R-L은 모두 개변을 도입하기 전의 IL6R-BP423/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 향상되어 있었다. 또한 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값으로부터 IL6R-BP423/IL6R-L에 대해 P396M을 도입한 IL6R-BP456/IL6R-L은 개변을 도입하기 전의 IL6R-BP423/IL6R-L과 비교하여 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값이 크고 FcgRIIb로의 선택성이 향상되어 있었다. 표 4 중에서 제작한 개변체는 모두 FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIIaV로의 친화성은 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L보다도 낮았다.
〔실시예 7〕서브클래스 서열의 이용에 의한 FcgRIIb 증강 개변체의 제작
인간 IgG에는 서브클래스가 존재하여 FcgR로의 결합 프로파일이 상이하다. 여기서는 IgG1과 IgG4의 각 FcgR로의 친화성의 차이를 FcgRIIb로의 결합, 선택성의 향상에 이용할 수 없는지 검증하였다.
먼저 처음으로 IgG1과 IgG4의 각 FcgR로의 친화성을 해석하였다. 항체 H쇄로서는 인간 IgG4의 EU 넘버링 228번째의 Ser을 Pro로 치환하고, C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G4d를 갖는 IL6R-G4d(서열번호:30)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 IL6R-G1d/IL6R-L 및 IL6R-G4d/IL6R-L을 발현, 정제하여, 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다. 얻어진 개변체의 각 FcgR로의 결합을 표 5에 정리하였다.
IL6R-G4d/IL6R-L은 IL6R-G1d/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 1.5배 강하고, FcgRIIaR로의 결합이 2.2배 약한 것을 알 수 있었다. 또한 FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIIaV로의 친화성에 관하여도 IL6R-G4d/IL6R-L은 IL6R-G1d/IL6R-L과 비교하여 약하였다. 이상의 결과로부터, IL6R-G4d는 IL6R-G1d와 비교하여 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 우수한 것이 명확해졌다.
도 14는 G1d와 G4d의 CH1부터 C말단까지의 서열(EU 넘버링 118번째 내지 445번째)을 비교한 것이다. 도 14 중의 테두리로 둘러싸인 아미노산은 G1d와 G4d에서 상이한 잔기인 것을 나타내고 있다. 이들 상이한 아미노산 중에서 FcgR과의 상호작용에 관여할 것으로 예상되는 부위를 몇 개 선택하여 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 우수한 G4d의 서열을 FcgRIIb 증강 개변체에 이식함으로써 추가적인 결합, 선택성의 향상이 가능한지 여부를 검증하였다.
구체적으로는 IL6R-BP230에 대해 A327G를 도입한 IL6R-BP473, A330S를 도입한 IL6R-BP472, P331S를 도입한 IL6R-BP471, A330S와 P331S를 도입한 IL6R-BP474, A327G와 A330S를 도입한 IL6R-BP475, A327G, A330S, P331S를 도입한 IL6R-BP476, A327G와 P331S를 도입한 IL6R-BP477을 제작하였다. 또한 IL6R-BP230의 EU 넘버링 118번째의 Ala부터 225번째의 Thr까지를 G4d의 서열(EU 넘버링 118번째의 Ala부터 222번째의 Pro까지)로 치환한 IL6R-BP478(서열번호 31)을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다.
각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD를 표 6에 나타낸다. 또한 표 중의 「모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)」는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 「IL6R-BP230에 가한 개변」이란 IL6R-BP230에 대해 도입한 개변을 나타내는데, IL6R-BP230을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L에 대해서는 *1로서, 또한 IL6R-BP230의 EU 넘버링 118번째의 Ala부터 225번째의 Thr까지를 G4d의 서열(EU 넘버링 118번째의 Ala부터 222번째의 Pro까지)로 치환한 IL6R-BP478(서열번호 31)에 대해서는 *2로서 나타내었다. 「모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)」은 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 6 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 6에 기재한 개변체 중, A327G를 도입한 IL6R-BP473/IL6R-L은 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 1.2배 증강되어 있었다. 또한 IL6R-BP230의 EU 넘버링 118번째의 Ala부터 225번째의 Thr까지를 G4d의 서열(EU 넘버링 118번째의 Ala부터 222번째의 Pro까지)로 치환한 IL6R-BP478/IL6R-L은 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합, FcgRIIaR로의 결합 모두 1.1배 증강되어 있었다. 어느 개변체도 FcgRIa, FcgRIIaH, FcgRIIIaV로의 친화성은 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L보다도 낮았다.
또한 도 14에 나타내는 바와 같이, G1d와 G4d에서 이 밖에 상이한 아미노산으로 되어 있는 부위로서 EU 넘버링 268번째, 274번째, 296번째, 355번째, 356번째, 358번째, 409번째, 419번째, 445번째를 들 수 있다. 따라서 이들 부위를 IgG4 유래의 아미노산으로 치환함으로써 FcgRIIb로의 결합 및 선택성이 향상될 가능성이 생각된다.
지금까지의 검토에 있어서, 개변체 IL6R-BP230/IL6R-L에 대해 인간 IgG4의 서열인 A327G를 이식함으로써 FcγRIIb로의 결합 활성이 증강되는 것이 나타내어졌다. 이에 IgG4와 IgG1의 서열에서 상이한 부위에 대해서 추가로 검토를 행하였다.
구체적으로는 항체 H쇄로서 IL6R-BP230에 대해 K274Q를 도입한 IL6R-BP541, Y296F를 도입한 IL6R-BP542, H268Q를 도입한 IL6R-BP543, R355Q를 도입한 IL6R-BP544, D356E를 도입한 IL6R-BP545, L358M을 도입한 IL6R-BP546, K409R을 도입한 IL6R-BP547, Q419E를 도입한 IL6R-BP548을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 상기 중쇄의 개변체와 IL6R-L의 경쇄를 포함하는 항체가 정제되었다. 정제된 항체의 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb, FcγRIIIaV)에 대한 결합이 참고예 2의 방법으로 평가되었다.
각 개변체의 각 FcγR에 대한 KD를 표 7에 나타내었다. 또한 표 중의 「모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)」는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 표 중의 「IL6R-BP230에 가한 개변」이란 IL6R-BP230에 대해 도입된 개변을 나타내었다. 단, IL6R-BP230을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L은 *1로서 나타내었다. 「모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)」은 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 당해 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD를 당해 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcγRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 7에 있어서 회색으로 칠해진 셀 속의 수치는 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출된 수치이다.
표 7에 나타내는 바와 같이, IL6R-BP230/IL6R-L에 대해 K274Q를 도입한 IL6R-BP541/IL6R-L, R355Q를 도입한 IL6R-BP544/IL6R-L, D356E를 도입한 IL6R-BP545/IL6R-L, L358M을 도입한 IL6R-BP546/IL6R-L은 개변 도입 전의 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 FcγRIIb로의 결합이 증강되어 있었다. 또한 이 중에서 IL6R-BP230/IL6R-L에 대해 R355Q를 도입한 IL6R-BP544/IL6R-L, D356E를 도입한 IL6R-BP545/IL6R-L, L358M을 도입한 IL6R-BP546/IL6R-L은 개변 도입 전의 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값이 증가되어 있어 FcγRIIb로의 선택성에 대해서도 향상되는 개변인 것이 나타내어졌다.
〔실시예 8〕FcgRIIb로의 결합 증강, 선택성의 향상을 초래하는 개변의 조합 검토
지금까지의 검토에 있어서 발견된 FcγRIIb로의 결합 활성 또는 선택성을 향상시키는 개변의 조합에 대해 검토하여 추가적인 최적화를 시도하였다.
IL6R-B3에 대해 지금까지의 검토 중에서 FcγRIIb로의 결합의 증강 및/또는 선택성 향상을 초래한 개변의 조합이 도입되었다. 또한 비교 대조로서 기존의 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 개변(Seung 등(Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933))인 S267E 및 L328F의 개변이 IL6R-B3에 도입된 IL6R-BP253이 제작되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L이 사용되었다. 참고예 1의 방법에 따라 발현한 상기 중쇄의 개변체와 IL6R-L의 경쇄를 포함하는 항체가 정제되었다. 정제된 항체의 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb, FcγRIIIaV)에 대한 결합이 참고예 2의 방법으로 평가되었다.
각 개변체의 각 FcγR에 대한 KD를 표 8에 나타내었다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3에 대해 도입된 개변을 나타내었다. 단 각 개변체를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-B3/IL6R-L은 *로서 나타내었다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 또한 모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)은 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 당해 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD로 나눈 값을 가리킨다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD를 당해 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcγRIIaR과 비교하여 FcγRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 KD(IIaH)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD를 당해 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcγRIIaH와 비교하여 FcγRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 8에 있어서 회색으로 칠해진 셀 속의 수치는 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 수치이다.
표 8에 기재된 개변체 중, FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 기존의 개변이 가해진 IL6R-BP253/IL6R-L의 FcγRIIb 및 FcγRIIaR에 대한 결합 활성은 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L의 그것과 비교하여 각각 277배 및 529배 증강되었다. 또한 IL6R-BP253/IL6R-L의 FcγRIa로의 결합 활성도 IL6R-B3/IL6R-L의 그것보다도 증강되어 있었다. 한편 IL6R-BP253/IL6R-L의 FcγRIIaH 및 FcγRIIIaV로의 결합은 IL6R-B3/IL6R-L의 그것과 비교하여 감약되어 있었다. 그 밖의 개변체 중 IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP438/IL6R-L, IL6R-BP567/IL6R-L, IL6R-BP568/IL6R-L의 FcγRIa로의 결합이 개변 도입 전의 IL6R-B3/IL6R-L의 그것과 비교하여 다소 증강되었으나, 그 이외의 개변체의 FcγRIa로의 결합은 모두 감약되어 있었다. 또한 어느 개변체도 FcγRIIaH 및 FcγRIIIaV로의 결합은 IL6R-B3/IL6R-L의 그것과 비교하여 감약되어 있었다.
본 검토에서 제작된 개변체와 기존의 FcγRIIb로의 결합 증강 개변체인 IL6R-BP253/IL6R-L을 비교하면, KD(IIaH)/KD(IIb)의 값은 가장 낮았던 IL6R-BP480/IL6R-L에서 107.7, 가장 높았던 IL6R-BP426/IL6R-L에서 8362로, 어느 개변체도 IL6R-BP253/IL6R-L의 107.1과 비교하여 높았다. 또한 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값은 가장 낮았던 IL6R-BP479/IL6R-L에서 16.1, 가장 높았던 IL6R-BP567/IL6R-L에서 64.4로, 어느 개변체도 IL6R-BP253/IL6R-L의 0.2와 비교하여 높았다. 이들 결과로부터, 표 8에 기재된 개변체는 모두 기존의 FcγRIIb에 대한 결합 증강 개변이 가해진 개변체와 비교하여 FcγRIIb로의 선택성이 향상된 개변체인 것이 나타내어졌다. 특히 IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R-BP493/IL6R-L, IL6R-BP557/IL6R-L, IL6R-BP492/IL6R-L, IL6R-BP500/IL6R-L, IL6R-BP567/IL6R-L은 모두 FcγRIIaR로의 결합을 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하여 1.5배 이하로 유지하면서 FcγRIIb로의 결합 활성이 100배 이상으로 증강되어 있는 것으로부터, FcγRIIaR로의 결합을 증강시켜 버리는 것에 의한 부작용을 회피하면서 FcγRIIb로의 결합 증강에 의한 효과를 나타내는 것이 기대된다.
또한 IL6R-BP489/IL6R-L, IL6R-BP487/IL6R-L, IL6R-BP499/IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, IL6R-BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, IL6R-BP552/IL6R-L, IL6R-BP507/IL6R-L, IL6R-BP536/IL6R-L, IL6R-BP534/IL6R-L, IL6R-BP491/IL6R-L, IL6R-BP553/IL6R-L, IL6R-BP532/IL6R-L, IL6R-BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, IL6R-BP531/IL6R-L, IL6R-BP510/IL6R-L, IL6R-BP535/IL6R-L, IL6R-BP497/IL6R-L, IL6R-BP533/IL6R-L, IL6R-BP555/IL6R-L, IL6R-BP554/IL6R-L, IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP440/IL6R-L, IL6R-BP538/IL6R-L, IL6R-BP429/IL6R-L, IL6R-BP438/IL6R-L, IL6R-BP565/IL6R-L, IL6R-BP540/IL6R-L, IL6R-BP426/IL6R-L, IL6R-BP437/IL6R-L, IL6R-BP439/IL6R-L, IL6R-BP551/IL6R-L, IL6R-BP494/IL6R-L, IL6R-BP537/IL6R-L, IL6R-BP550/IL6R-L, IL6R-BP556/IL6R-L, IL6R-BP539/IL6R-L, IL6R-BP558/IL6R-L, IL6R-BP425/IL6R-L, IL6R-BP495/IL6R-L의 FcγRIIb로의 결합은 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 기존의 개변이 가해진 IL6R-BP253/IL6R-L의 그것과 비교하여 윗돌고 있고, 가장 낮았던 IL6R-BP495/IL6R-L부터 가장 높았던 IL6R-BP489/IL6R-L까지의 증강 폭은 IL6R-B3/IL6R-L의 결합을 1로 한 경우에 321배부터 3100배까지였다. 따라서 이들 개변체는 FcγRIIb로의 결합, 선택성 양면에서 기존 기술보다도 우수한 개변체라 할 수 있다.
여기서 FcγRIIb로의 선택성 관점에서 가장 우수하다고 생각되는 IL6R-BP567/IL6R-L과 관련된 개변체에 대해서 면역 원성의 관점에서 고찰하였다. 가장 선택성이 높았던 IL6R-BP567/IL6R-L 및 FcγRIIaR로의 결합이 천연형과 비교하여 완전히 동등하고 FcγRIIb로의 결합을 147배 증강시킨 IL6R-BP493/IL6R-L은 Y296D 개변이 도입되어 있다. Y296은 Tregitope 서열에 포함되는 것이 보고되어 있어(De Groot 등(Blood (2008) 112, 3303-3311)), 이 부위로의 개변 도입은 본래 천연형 IgG1이 갖는 면역 억제적인 기능이 손상될 가능성이 있다. 따라서 면역 원성의 관점에서는 Y296D 개변을 포함하지 않는 개변체가 보다 바람직하다. IL6R-BP568/IL6R-L 및 IL6R-BP492/IL6R-L은 각각 IL6R-BP567/IL6R-L 및 IL6R-BP493/IL6R-L로부터 Y296D 개변을 뺀 것이다. FcγRIIb에 대한 결합 활성 및 선택성에 대해서 살펴보면 IL6R-BP492/IL6R-L 및 IL6R-BP568/IL6R-L은 Y296D 개변을 뺌으로써 선택성, 결합 활성 모두 Y296D를 포함하는 경우보다도 저하되어 있었다. 그러나 IL6R-BP568/IL6R-L은 천연형과 비교하여 FcγRIIaR로의 결합이 1.6배, FcγRIIb로의 결합이 211배이고, 또한 IL6R-BP492/IL6R-L은 FcγRIIaR로의 결합이 1.2배, FcγRIIb로의 결합이 131배로 여전히 높은 선택성과 결합 활성을 유지하고 있었다. 이들 결과로부터, IL6R-BP568/IL6R-L 및 IL6R-BP492/IL6R-L은 FcγRIIb로의 결합 활성, 선택성에 더하여 면역 원성의 면에서도 우수한 개변체라 할 수 있다.
〔실시예 9〕헤테로 이량체 항체에 의한 FcgRIIb로의 결합 증강
9-1. P238D를 한쪽 사슬에만 도입한 검토
참고예 7의 도 26에 나타내는 바와 같이 Fc(P238D)가 FcgRIIb로의 높은 FcgRIIb로의 결합을 획득한 요인은, P238D 개변을 도입함으로써 Pro에서는 주변 잔기와 소수성 코어를 형성하고 있었던 것이 Asp로 변화함으로써 소수성 코어에 존재할 수 없게 되어 용매측을 향한 결과, 도메인 A의 루프 구조가 크게 변화된 것에 기인한다. 그러나 양쪽 사슬에 대해 P238D 개변을 도입할 필요가 있는 것인가, 또한 한쪽 사슬에 대해 P238D를 도입하고 다른 한쪽 사슬에 대해서는 다른 개변이어도 되는 것인가라는 점에 대해서는 검토의 여지가 있다. 이에 항체의 각 H쇄에 상이한 개변을 도입한 헤테로 이량화 항체를 이용하여 이들 점에 대해서 검증을 행하였다.
항체 H쇄에는 WO2009/041062에 개시되어 있는 혈장 중 동태가 개선된 항글리피칸 3 항체인 GpH7의 CDR을 포함하는 글리피칸 3 항체의 가변영역(서열번호:15)을 사용하였다. GpH7을 가변영역에 갖는 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 GpH7-G1d(서열번호:34)에 대해 D356K 및 H435R의 개변을 도입한 GpH7-A5(서열번호:35), GpH7-G1d에 K439E의 개변을 도입한 GpH7-B3(서열번호:17)를 이용하였다. 각각의 H쇄에 도입한 D356K 및 K439E의 개변은 2개의 H쇄로 이루어지는 헤테로 이량화 항체를 생산할 때, 각 H쇄의 헤테로체를 효율적으로 형성시키기 위해 도입하였다(WO2006/106905). H435R은 Protein A로의 결합을 방해하는 개변으로, 상이한 개변이 도입된 2개의 H쇄로 이루어지는 이량체인 헤테로체와 동일한 개변이 도입된 2개의 H쇄로 이루어지는 이량체인 호모체를 효율적으로 분리하기 위해 도입하였다. 한쪽 H쇄로서 참고예 1에서 제작한 GpH7-B3(서열번호:17)에 대해 EU 넘버링 236번째, 237번째, 238번째의 아미노산을 원래의 아미노산과 Cys로 치환한 개변체를 사용하였다. 또 다른 한쪽의 사슬로서는 GpH7-A5(서열번호:35)에 대해 P238D를 도입한 GpH7-AP001을 제작하였다. 항체 L쇄에는 WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 글리피칸 3 항체의 GpL16-k0(서열번호:16)를 공통으로 사용하였다. 이들 개변체를 참고예 1의 방법으로 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgRIIaR형, FcgRIIb에 대한 결합을 평가하였다. 각 개변체의 FcgR에 대한 결합량을 도 15에 나타낸다.
도 15에 나타낸 개변 G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, P238E, P238D는 GpH7-B3에 도입한 개변을 가리킨다. 또한 A5/B3는 어느 쪽 사슬에도 개변을 도입하지 않은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 나타내고, 한쪽 사슬에만 P238D를 포함하는 개변체란 GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0를 나타낸다. 또한 이들 결과를 표 9에 나타낸다.
표 9 중의 「FcgRIIb로의 결합량/FcgRIIaR로의 결합량」이란 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 결합량을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 결합량으로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb에 대한 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 「GpH7-A5에 도입한 개변」 및 「GpH7-B3에 도입한 개변」은 각각 GpH7-A5 및 GpH7-B3에 도입한 개변을 나타내는데, GpH7-A5 및 GpH7-B3를 제작할 때의 주형으로 한 GpH7-G1d에 대해서는 *로서 나타내었다. 표 9의 결과로부터 양쪽 사슬에 P238D 개변을 갖는 GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0가 가장 FcgRIIb로의 선택성이 높았다. 또 다른 한쪽 사슬에 P238E, P238N, P238G를 갖는 GpH7-AP001/GpH7-BP061/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP069/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP063/GpL16-k0는 FcgRIIb로의 결합량/FcgRIIaR로의 결합량이 각각 2.9, 2.2, 1.7로, 양쪽 사슬에 P238D 개변을 갖는 GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0와 비교해도 FcgRIIb로의 높은 선택성을 유지하고 있었다. 또한 FcgRIIb로의 친화성에 대해서도 양쪽 사슬에 P238D 개변을 갖는 GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0의 69% 이상을 유지하고 있었던 것으로부터, 한쪽 사슬에 P238D 개변이 존재한다면 다른 한쪽 사슬에 대해서는 P238E, P238N, P238G로 대체 가능하다 할 수 있다. 또한 FcgRIIb로의 결합에 착안할 때, 양쪽 사슬에 P238D를 포함하는 GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0와 비교하여 한쪽 사슬에만 P238D를 포함하고 또 다른 한쪽 사슬에는 개변을 포함하지 않는 GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0 쪽이 FcgRIIb에 대해 강하게 결합하고, 한쪽 사슬에 P238D를 포함하고 또 다른 한쪽 사슬에 각각 G236N, G237F, G237W를 포함하는 GpH7-AP001/GpH7-BP032/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP044/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP057/GpL16-k0 쪽이 보다 강하게 FcgRIIb에 결합하는 것이 명확해졌다.
9-2. Fc(P208)/FcgRIIb의 구조 정보를 토대로 한 개변의 검증
도 10에 나타낸 바와 같이, Fc(P208)/FcgRIIb의 결정 구조에 있어서는 FcgRIIb의 117번째 Lys의 전자밀도가 관찰되고 있지 않아, 본 잔기는 Fc(P208)과의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 생각되어, 근방에 위치하는 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 239번째 Ser을 Asp 또는 Glu로 치환함으로써 이 FcgRIIb의 117번째 Lys와의 사이에 정전 상호작용을 형성할 수 있을 가능성이 있다. 한편 도 7에 나타낸 바와 같이 CH2 도메인 A에 있어서는 EU 넘버링 239번째 Ser은 EU 넘버링 236번째 Gly과 수소 결합을 형성하고, EU 넘버링 233번째 내지 239번째의 루프 구조를 안정화함으로써 FcgRIIb의 EU 넘버링 160번째 Tyr과의 결합 강화에 기여하고 있는 것으로 생각되어, 이 부위의 치환은 CH2 도메인 A에 있어서 루프 구조의 불안정화와 그에 수반되는 결합 활성의 저하를 초래할 것이 예상되고, 호모 개변에서는 이들이 서로 상쇄될 것이 예상되었다. 이에 본 검토에서는 헤테로 이량화에 의해 한쪽 사슬에만 S239D 또는 S239E의 개변을 도입하여 FcgRIIb로의 결합 증강 효과를 검증하였다.
한쪽의 항체 H쇄로서 IL6R-BP208(서열번호:24)에 대해 S239D를 도입한 IL6R-BP256 및 S239E를 도입한 IL6R-BP257을 제작하였다. 마찬가지로 IL6R-BP230(서열번호:27)에 대해 S239D를 도입한 IL6R-BP259 및 S239E를 도입한 IL6R-BP260을 제작하였다. 다른 한쪽의 항체 H쇄로서 IL6R-A5(서열번호:69)에 대해 IL6R-BP208의 CH2에 포함되는 것과 동일한 개변인 E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R을 도입한 IL6R-AP002 및 IL6R-BP230의 CH2에 포함되는 것과 동일한 개변인 E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, Y296D, A330R을 도입한 IL6R-AP009를 제작해서 사용하였다. 또한 비교대상으로서 기존의 FcgRIIb 증강 기술(비특허문헌 28)인 S267E, L328F를 IL6R-B3에 도입한 IL6R-BP253(서열번호:32)을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다.
각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD를 표 10에 나타낸다. 표 중의 「모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)」는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 「모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)」은 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 「KD(IIaR)/KD(IIb)」란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 10 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 10의 결과로부터, IL6R-BP208/IL6R-L에 대해 한쪽 사슬에 S239D를 도입한 IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L, S239E를 도입한 IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L은 모두 IL6R-BP208/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 증강되어 있었다. 또한 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값도 IL6R-BP256/IL6R-L을 윗돌고 있고 FcgRIIb로의 선택성에 있어서도 향상되어 있었다. 한편 IL6R-BP208/IL6R-L의 양쪽 사슬에 대해 S239D를 도입한 IL6R-BP256/IL6R-L 및 양쪽 사슬에 S239E를 도입한 IL6R-BP257/IL6R-L은 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 IL6R-BP208/IL6R-L과 비교하여 대폭 저하되었다. 이와 같이 한쪽 사슬에만 S239D 또는 S239E를 도입한 경우에는 FcgRIIb로의 결합 증강효과가 보인 것에 대해, 양쪽 사슬에 도입한 경우에 FcgRIIb에 대한 결합이 대폭 저하된 이유로서는, 전술한 바와 같이 CH2 도메인 A에 있어서의 루프 구조의 불안정화가 요인으로 생각된다. IL6R-BP230/IL6R-L을 주형으로 하여 S239D, S239E를 도입한 경우에 있어서도 동일한 결과가 보였다. IL6R-BP230/IL6R-L의 한쪽 사슬에 각각 S239D, S239E를 도입한 IL6R-AP009/IL6R-BP259/IL6R-L, IL6R-AP009/IL6R-BP260/IL6R-L은 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 IL6R-BP230/IL6R-L을 윗돌았으나, 양쪽 사슬에 각각 S239D, S239E를 도입한 IL6R-BP259/IL6R-L, IL6R-BP260/IL6R-L은 모두 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 IL6R-BP230/IL6R-L과 비교하여 대폭 저하되었다. 또한 IL6R-BP208/IL6R-L 및 IL6R-BP230/IL6R-L의 한쪽 사슬에 S239D 또는 S239E를 도입한 개변체는 모두 기존의 FcgRIIb 증강 기술을 이용한 IL6R-BP253/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합, 선택성 모두 윗돌았다.
9-3. Fc(P208)/FcgRIIaR의 구조 정보를 토대로 한 개변의 검증
실시예 3에 있어서 Fc(P208)의 FcgRIIb와의 결정 구조와 FcgRIIaR과의 결정 구조를 비교한 바, FcgRIIb 160번째 Tyr과 수소 결합을 형성하는 EU 넘버링 237번째 부근에 있어서 전자 밀도 상에 차가 보이고, FcgRIIb와의 결합에는 CH2 도메인 A측의, FcgRIIaR과의 결합에는 CH2 도메인 B측의 기여가 큰 것이 시사되었다(도 12, 도 13). 예를 들면 전위 밀도의 보여지는 방식으로 볼 때, FcgRIIaR형과의 결합에 있어서는 CH2 도메인 B의 EU 넘버링 234번째 Leu, 235번째 Leu가 수용체와의 결합에 관여하고 있는 것으로 생각되는 한편으로, FcgRIIb와의 결합에 있어서는 이들 잔기의 관여는 적을 것으로 생각된다. 이에 이들 2개의 잔기를 소수성 이외의 잔기로 치환함으로써 FcgRIIaR형과의 상호작용 쪽을 보다 크게 저감시킬 수 있을 가능성이 생각된다. 단 CH2 도메인 A측에 있어서는 EU 넘버링 234번째 Leu, 235번째 Leu의 잔기는 EU 넘버링 237번째 부근의 루프 구조의 안정성에 기여하고 있는 것으로 생각되고, 특히 FcgRIIb와의 결합에 보다 크게 관여하고 있을 가능성이 높다. 이 때문에 이들 잔기를 소수성 이외의 잔기로 치환하는 것은 CH2 도메인 A에 있어서의 FcgRIIb와의 상호작용을 보다 저하시킬 가능성이 있다. 특히 EU 넘버링 235번째 Leu는 FcgRIIb와의 복합체 구조의 CH2 도메인 A에 있어서 양호한 소수성 상호작용을 형성하고 있어, EU 넘버링 237번째 부근의 루프 구조의 안정화로의 기여가 클 것으로 생각되기 때문에, 본 잔기에 대해서는 한쪽 사슬만 소수성 이외의 잔기로 치환하는 검토를 행하였다. 또한 양쪽 사슬의 EU 넘버링 235번째의 Leu를 그 이외의 소수성 아미노산으로 치환함으로써, 특히 CH2 도메인 A에서의 소수성 상호작용을 보다 강화하여 EU 넘버링 237번째 부근의 루프 구조를 보다 안정화할 수 있으면 FcgRIIb 160번째 Tyr과의 수소 결합 형성에 수반되는 엔트로피적인 에너지 손실의 경감으로 이어져, FcgRIIb로의 결합 및 선택성이 향상될 가능성이 있기 때문에 그것에 대해서도 함께 검토를 행하였다.
항체 H쇄로서는 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 E233D, G237D, P238D, H268E, P271G, Y296D, A330R을 도입한 IL6R-BP264(서열번호:28)를 제작하여 주형으로서 사용하였다. IL6R-BP264의 EU 넘버링 234번째의 Leu를 Asn, Ser, Asp, Gln, Glu, Thr, Arg, His, Gly, Lys, Tyr로 각각 치환한 개변체를 제작하였다. 또한 IL6R-BP264의 EU 넘버링 235번째의 아미노산을 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 치환한 개변체를 제작하였다. 다른 한쪽의 항체 H쇄로서 IL6R-A5(서열번호:69)에 대해 E233D, G237D, P238D, H268E, P271G, Y296D, A330R을 도입한 IL6R-AP029(서열번호:42)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하고, IL6R-BP264에 대해 L234N, L234S, L234D, L234Q, L234E, L234T, L234R, L234H, L234G, L234K, L234Y를 도입한 개변체와, L235W, L235M, L235P, L235F, L235A, L235V, L235I를 도입한 개변체에 대해서는 양쪽 사슬에 동일한 개변을 포함하는 호모체로서 L235N, L235S, L235D, L235Q, L235E, L235T, L235R, L235H, L235G, L235K, L235Y를 도입한 개변체에 대해서는 IL6R-AP029와 조합한 헤테로 이량화 항체로서 검토를 행하였다.
참고예 1의 방법에 따라 이들 개변체로부터 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcgR(FcgRIa, FcgRIIaH형, FcgRIIaR형, FcgRIIb, FcgRIIIaV형)에 대한 결합을 평가하였다. 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD를 가로축에, FcgRIIaR에 대한 KD를 세로축에 나타내는 그래프를 도 16에 나타낸다.
도 16에 나타내는 바와 같이, IL6R-BP264/IL6R-L에 대해 양쪽 사슬에 L234Y를 도입한 IL6R-BP404/IL6R-L은 개변 도입 전의 IL6R-BP264/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 다소 증강되었다.
이들 개변체 중에서 FcgRIIb로의 결합이 증강된 IL6R-BP404/IL6R-L 및 FcgRIIb로의 선택성이 향상되어 있었던 개변체에 대해서 표 11에 정리하였다. 표 중의 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 또한 모체 폴리펩티드의 KD(IIaR)/개변 폴리펩티드의 KD(IIaR)는 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. KD(IIaR)/KD(IIb)란 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 각 개변체의 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb로의 선택성이 높은 것을 나타낸다. 또한 표 11 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 11에 나타낸 바와 같이, IL6R-BP264/IL6R-L에 대해 양쪽 사슬에 L234Y를 도입한 IL6R-BP404/IL6R-L은 개변 도입 전의 IL6R-BP264/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb로의 결합이 1.1배 상승하였다. IL6R-BP264/IL6R-L의 양쪽 사슬에 L235Q를 도입한 IL6R-BP408/IL6R-L, 양쪽 사슬에 L235F를 도입한 IL6R-BP419/IL6R-L, 한쪽 사슬에 L235D를 도입한 IL6R-AP029/IL6R-BP407/IL6R-L, 한쪽 사슬에 L235Q를 도입한 IL6R-AP029/IL6R-BP408/IL6R-L, 한쪽 사슬에 L235E를 도입한 IL6R-AP029/IL6R-BP409/IL6R-L, 한쪽 사슬에 L235T를 도입한 IL6R-AP029/IL6R-BP410/IL6R-L은 모두 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값이 개변 도입 전의 IL6R-BP264/IL6R-L과 비교하여 커서 FcgRIIb로의 선택성이 향상된 개변체였다.
〔실시예 10〕FcgRIIb 결합 증강 Fc 개변체의 in silico 면역 원성 예측 툴에 의한 면역 원성의 평가
본 실시예에 기재된 Fc 개변체를 항체 의약품으로서 사용하는 경우에는, 그 약리작용을 감약하는 항의약품 항체의 생산을 유도하지 않는 것이 바람직하다. 면역 원성이 높은 항체는 항의약품 항체의 생산을 유도하기 쉬운 것으로부터, 항체 의약품의 면역 원성은 될 수 있는 한 낮은 것이 바람직하다. 개변체의 면역 원성을 될 수 있는 한 증대시키지 않도록 하기 위해 Epibase, EpiMatrix 등의 T-cell epitope를 예측하는 in silico 면역 원성 예측 툴을 이용할 수 있다. Epibase Light(Lonza)는 FASTER algorism(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)을 사용하여 9-mer 펩티드와 major DRB1 대립유전자(allele)를 포함하는 MHC classII와의 결합능을 계산하는 in silico 면역 원성 예측 툴이다. 본 툴은 MHC classII에 대한 강한 결합을 갖는 T-cell epitope(Strong epitopes) 및 중간 정도의 결합을 갖는 T-cell epitope(Medium epitopes)를 동정할 수 있다.
계산에는 DRB1 알로타입의 존재비가 반영되고, 이것에는 아래의 표 12에 나타내는 Caucasian에 있어서의 존재비를 사용할 수 있다.
이 툴을 사용함으로써 지금까지 보고가 있는 각종 Fc 개변체와 본 실시예에 기재된 FcgRIIb 선택적으로 결합을 증강시킨 Fc 개변체의 서열 중(EU 넘버링 118번 위치부터 C말단까지의 서열)에 포함되는 강한 결합과 중간 정도의 결합을 갖는 모든 T-cell epitope 수를 비교하였다. 구체적으로는 과거에 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 것으로 보고되어 있는(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006,103:4005-10.) S239D, A330L, I332E의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(DLE)(서열번호:78), 과거에 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 것으로 보고되어 있는(J Biol Chem. 2006, 281:23514-24.) M252Y, S254T, T256E의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(YTE)(서열번호:79), FcgRIIb에 대한 결합을 증강시키는 것으로 보고되어 있는(Mol Immunol. 2008, 45:3926-33.) S267E, L328F의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(EF)(서열번호:80), WO2012/115241에 기재되어 있는 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시키는 것으로 보고되어 있는 E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(P208)(서열번호:81)을 기존 기술을 평가하기 위한 비교대상으로서 제작하고, 본 실시예에 기재되어 있는 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시키는 개변체 BP568과 동일하게 E233D, P238D, S264I, S267A, H268E, P271G의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(P587)(서열번호:70) 및 BP492와 동일하게 P238D, S264I, S267A, H268E, P271G의 개변을 도입한 항체의 Fc영역인 Fc(P588)(서열번호:71)을 제작하여, Epibase를 사용하여 이들 Fc 개변체의 강한 결합과 중간 정도의 결합의 모든 에피토프 수를 비교하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
이 결과로부터, 본 실시예에 기재된 개변체의 Fc영역인 Fc(P587) 및 Fc(P588)은 기존의 Fc 개변체 중에서도 T-cell epitope 수가 적어 면역 원성 리스크가 낮은 것이 나타내어졌다. 이 성질은 의약품으로서 사용하는 데 있어 항의약품 항체를 유도할 가능성이 저감되어 있어 우수한 것을 나타내고 있다.
〔실시예 11〕인간 FcgRIIb 형질전환 마우스를 사용한 인간 FcgRIIb 결합 증강 Fc 개변체의 혈중 동태의 평가
(11-1) 시험의 개요
WO2013/047752에서 나타내어져 있는 바와 같이, pH 산성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 가지며, 또한 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 FcgR에 대한 결합 도메인보다도 FcgR에 대한 결합 활성이 높은 FcgR 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 투여함으로써, 천연형 인간 IgG와 비교하여 생체 중에 있어서의 그 표적이 되는 가용성 항원의 혈장 중 농도를 대폭으로 저하시키는 것이 가능하다. FcgR 중에서도 특히 FcgRIIb에 대한 결합 활성을 증강시킨 항원 결합 분자가 생체 내에 투여된 경우, 혈장 중의 가용성 항원의 소실을 촉진시켜 혈장 중의 가용성 항원의 농도를 효과적으로 저하시키는 것이 가능한 것도 보고되어 있다. 본 실시예에서는 인간 FcgRIIb를 유전자 개변에 의해 도입한 형질전환 마우스에 인간 FcgRIIb에 대해 결합을 증강시킨 Fc 개변체를 투여함으로써 본 명세서에 기재한 실제로 인간 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc 개변체로, 그 표적이 되는 가용성 항원의 소실 속도를 빠르게 할 수 있는 지를 검증하였다.
(11-2) FcgRIIb에 대해 결합을 증강시킨 항체의 조제
인간 FcgRIIb에 대해 결합을 증강시킨 Fc 개변체로서는 아래의 항체를 사용하였다. WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체(인간 IL-6R)에 대한 항체의 가변영역과, 인간 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d의 정상영역으로 이루어지는 IL6R-G1d(서열번호:19)에, BP568과 동일하게 E233D, P238D, S264I, S267A, H268E, P271G의 개변을 도입한 IL6R-P587을 제작하였다. 항체 H쇄로서 IL-6R-P587을, 항체 L쇄로서는 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 IL-6R에 대한 항체의 L쇄인 IL6R-L2(서열번호:74)를 갖는 Fv4-P587을 참고예 1의 방법에 따라 조제하였다. 또한 비교대상으로서 IL6R-G1d(서열번호:19)와 IL6R-L2(서열번호:74)를 각각 항체 H쇄, L쇄로서 갖는 Fv4-IgG1을 동일하게 참고예 1의 방법에 따라 조제하였다. 여기서 조제한 Fv4-G1d 및 Fv4-P587은 WO2009/125825에 기재된 바와 같이, 산성 pH 조건하에서는 중성 pH 조건하와 비교하여 항원인 인간 IL-6R에 대해 약하게 결합한다고 하는, 프로톤 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 가지고 있다.
(11-3) 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스의 제작
인간 FcgRIIb 형질전환 마우스를 아래의 방법으로 제작하였다.
C57BL/6(B6)마우스에 인간 FcgRIIb 유전자를 도입한 형질전환 마우스를 제작하였다. 형질전환 마우스의 제작은 「Nagy 등(Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)」 및 「우에다 등(진 타겟팅의 최신기술, 요도샤. (2000) 190-207)」에 기재된 순서에 따라 실시되었다. 즉, B6 마우스의 수정란 전핵에 인간 FcgRIIb 유전자(GeneBank # NW_004077999:18, 307, 411-18, 381, 603)의 게놈영역이 클로닝되어 있는 대장균 인공 염색체(Bacterial artificial chromosome)를 마이크로인젝션함으로써 제작하였다. 얻어진 마우스 중 인간 FcgRIIb 유전자가 도입된 마우스를 인간 FcgRIIb 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 사용한 서던 블로법 및 PCR에 의해 선발하였다. 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스로부터 혈액 및 간장을 채취하고, 인간 FcgRIIb 유전자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 인간 FcgRIIb 유전자의 발현을 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)로 확인하였다. 그 결과, 인간 FcgRIIb 유전자의 발현이 검출되었다. 또한 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스의 혈액으로부터 마우스 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 단리하고, PBMC 중의 인간 FcgRIIb의 발현을 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 해석에 의해 확인하였다. 그 결과, 인간 FcgRIIb의 발현이 검출되었다. 이상의 사실로부터, 인간 FcgRIIb를 발현하는 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스가 수립된 것을 확인하였다.
(11-4) 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스를 사용한 항원과 항체를 동시 투여한 in vivo 시험
(11-3)에서 제작한 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스를 사용하여 항원인 가용형 인간 IL-6R과 (11-2)에서 조제된 항인간 IL-6R 항체를 동시에 투여하고, 그 투여 후의 혈장 중 가용형 인간 IL-6R 농도 및 항인간 IL-6R 항체 농도가 평가되었다.
가용형 인간 IL-6R 및 항인간 IL-6R 항체의 혼합 용액(각각 5 ㎍/mL, 0.1 ㎎/mL)을 꼬리 정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 이때 가용형 인간 IL-6R에 대해 항인간 IL-6R 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, 가용형 인간 IL-6R은 거의 모두 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 5분 후, 1시간 후, 4시간 후, 7시간 후, 1일 후, 3일 후, 7일 후, 14일 후, 21일 후, 28일 후에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 항인간 IL-6R 항체로서는 전술한 Fv4-P587, Fv4-IgG1을 사용하였다.
(11-5) 혈장 중 항인간 IL-6R 항체 농도의 ELISA법에 의한 측정
마우스 혈장 중 항인간 IL-6R 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 항인간 IgG(γ쇄 특이적)F(ab')2 항체 단편(Sigma)을 Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp(Nalge Nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 항인간 IgG 고상화 플레이트를 조제하였다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하고, 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 가용형 인간 IL-6R을 200 μL 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후 항인간 IgG 고상화 플레이트에 분주하고 추가로 실온에서 1시간 교반하였다. 그 후 비오틴화 항인간 IL-6R 항체(R&D)를 실온에서 1시간 반응시키고, 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시켜, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색 반응을 행하고, 1N 황산(Showa Chemical)으로 반응 정지 후, 마이크로 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥 내 투여 후의 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 33에 나타내었다.
(11-5) 전기화학발광법에 의한 혈장 중 인간 IL-6R 농도 측정
마우스의 혈장 중 인간 IL-6R 농도는 전기화학발광법으로 측정하였다. 혈장 중 농도로서 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.781, 0.391, 0.195 ng/mL로 조정한 인간 IL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하고, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 토실리주맙 용액을 혼합하여 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 0.5% BSA(w/v)를 함유한 PBS-Tween 용액을 사용하여 5℃에서 하룻밤 Blocking한 Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가로 실온에서 2시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×2)(Meso Scale Discovery)를 분주하고 바로 SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)으로 측정을 행하였다. hSIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥 내 투여 후의 인간 FcgRIIb 형질전환 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 IL-6R 농도 추이를 도 34에 나타내었다.
(11-6) 인간 FcgRIIb 결합 증강의 효과
Fv4-IgG1과 인간 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fv4-P587의 in vivo 시험의 결과를 비교하였다. 도 33에 나타낸 바와 같이 양자의 항체 혈장 중 체류성은 거의 동등하였으나, 도 34에 나타내는 바와 같이 인간 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fv4-P587과 동시에 투여한 인간 IL-6R 쪽이 Fv4-IgG1과 동시에 투여한 인간 IL-6R과 비교하여 인간 IL-6R의 소실이 빨라져 있는 것이 확인되었다. 즉, pH 의존적으로 인간 IL-6R에 결합하는 항체가 인간 FcgRIIb 결합능을 증강시킴으로써 가용형 인간 IL-6R 농도를 저감시킬 수 있는 것이 발견되었다.
특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 이 결과로부터 도 35에 나타낸 메커니즘에 따라 인간 FcγRIIb를 매개로 FcγRIIb를 발현하는 세포에 흡수됨으로써 당해 항체에 결합하는 혈장 중 가용형 항원이 소실되어 있는 것으로 고찰하는 것도 가능하다.
가용형 인간 IL-6R에 결합하는 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6R은 항체와 함께 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되는 것에 대해 pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 항체인 Fv4-IgG1은 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6R을 해리한다. 해리된 가용형 인간 IL-6R은 리소좀에 의해 분해되기 때문에 가용형 인간 IL-6R의 소실을 대폭 가속시키는 것이 가능해져, 추가로 pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 항체인 Fv4-IgG1은 엔도솜 내에서 FcRn에 결합한 후에 혈장 중으로 리사이클된다. 리사이클된 당해 항체는 재차 가용형 인간 IL-6R에 결합할 수 있기 때문에 항원(가용형 인간 IL-6R)에 대한 결합과 FcRn에 의한 혈장 중에서의 리사이클이 반복된다. 그 결과, 하나의 항체 분자가 복수 회 반복하여 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 것이 가능해질 것으로 생각된다. 또한 pH 의존적으로 항원에 결합하는 Fv4-IgG1의 FcgRIIb 결합 활성을 증강시키는 것에 의해 가용형 인간 IL-6R에 결합하는 항체와 가용형 인간 IL-6R의 복합체가 FcgRIIb를 매개로 빠르게 세포 내에 흡수됨으로써, 가용형 인간 IL-6R 농도를 보다 효율적으로 저감시키는 것이 가능할 것으로 생각된다(도 35)
〔실시예 12〕인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스를 사용한 인간 FcgRIIb 결합 증강 Fc 개변체의 혈중 동태의 평가
(12-1) 시험의 개요
WO2013/047752에서 나타내어져 있는 바와 같이, FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높고, pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강된 항원 결합 분자를 사용함으로써, pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강되어 있지 않은 항원 결합 분자와 비교하여 혈장 중 체류성의 향상이 확인되었다. 한편으로 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높고, pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강된 항원 결합 분자 쪽이 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높고, pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강되어 있지 않은 항원 결합 분자와 비교하여 혈장 중 표적 항원 농도가 저하되어 있있던 것도 보고되어 있다. 이에 본 실시예에 기재된 인간 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc영역 개변체를 갖는 항원 결합 분자가 동일한 성질을 갖는지를 검증하였다.
(12-2) FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높고, pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강된 항원 결합 분자의 제작
실시예 11-2에 기재되어 있는 Fv4-IgG1, Fv4-P587에 더하여 항체 H쇄로서 Fv4-P587의 H쇄인 IL6R-P587에 대해 과거에 항체의 혈중 동태를 개선하는 것으로 보고되어 있는(Nat. Biotechnol. 2010. 28; 157-159) EU 넘버링으로 표시되는 428번 위치의 Met의 Leu로의 치환과, 434번 위치의 Asn의 Ser로의 치환으로 이루어지는 개변을 도입한 IL6R-P587-LS(서열번호:73)와 항체 L쇄로서 IL6R-L2를 갖는 Fv4-P587-LS를 참고예 1의 방법에 따라 조제하였다.
(12-3) 인간 FcRn에 대한 상호작용 해석
조제한 항체의 인간 FcRn에 대한 상호작용 해석을 Biacore T200을 사용하여 아래에 기재된 센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 프로테인 L(BioVision)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로 FcRn 희석액과 러닝 버퍼(참조 대조용액으로서)를 인젝트하여 센서칩 상에 포착시킨 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mmol/L 인산나트륨, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 6.0을 사용하고, FcRn의 희석에도 러닝 버퍼를 사용하였다. 칩의 재생에는 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하였다. 측정은 모두 25℃에서 실시하였다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하여, 그 값을 토대로 각 항체의 인간 FcRn에 대한 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다. 이 방법으로 측정했을 때의 금번 조제한 항체의 인간 FcRn에 대한 KD값을 표 14에 나타내었다. 표 14에 나타내어져 있는 바와 같이, Fv4-P587-LS는 Fv4-P587과 비교하여 FcRn에 대한 결합이 산성 조건하에서 증강되어 있는 것이 확인되었다.
(12-4) 인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스의 제작
인간 FcgRIIb, 인간 FcRn 형질전환 마우스 및 마우스 FcRn 녹아웃 마우스를 아래의 방법으로 제작하였다.
먼저, 마우스 FcRn 녹아웃 마우스를 제작하였다. 녹아웃 마우스의 제작은 「Nagy 등(Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)」에 기재된 순서에 따라 실시되었다. 즉, 마우스 FcRn 유전자를 파괴하기 위한 타겟팅 벡터를 제작하여 그 벡터를 ES세포(C57BL/6마우스 유래)에 도입하고, 상동 재조합에 의해 마우스 FcRn의 유전자를 파괴하였다. 수립한 마우스 FcRn 녹아웃 마우스의 간장으로부터 RNA를 추출하고, RNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 마우스 FcRn을 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, 마우스 FcRn 녹아웃 마우스의 경우는 마우스 FcRn 유전자가 검출되지 않았다. 이어서 마우스 FcRn 녹아웃 마우스에 인간 FcgRIIb와 인간 FcRn 유전자를 도입한 형질전환 마우스를 제작하였다. 형질전환 마우스의 제작은 「Nagy 등(Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)」 및 「우에다 등(진 타겟팅의 최신기술, 요도샤. (2000) 190-207)」에 기재된 순서에 따라 실시되었다. 즉, 마우스 FcRn 녹아웃 마우스의 수정란 전핵에 인간 FcRn 유전자(GeneBank #NC_000019.9:50,000,108-50,039,865) 및 인간 FcgRIIb 유전자(GeneBank # NW_004077999:18,307,411-18,381,603)의 게놈영역이 클로닝되어 있는 대장균 인공 염색체(Bacterial artificial chromosome)를 마이크로인젝션함으로써 제작하였다. 얻어진 마우스 중 인간 FcRn 유전자 및 인간 FcgRIIb 유전자가 도입되고, 또한 마우스 FcRn 녹아웃 대립유전자가 호모 접합체화된 마우스를 각 유전자에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 사용한 서던 블롯법 및 PCR에 의해 선발하였다. 인간 FcgRIIb, 인간 FcRn 형질전환 마우스 및 마우스 FcRn 녹아웃 마우스로부터 혈액을 채취하고, 인간 FcRn 유전자 및 인간 FcgRIIb 유전자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여, 인간 FcRn 유전자 및 인간 FcgRIIb 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 인간 FcRn 유전자 및 인간 FcgRIIb 유전자의 발현이 검출되었다. 이상의 사실로부터, 인간 FcRn 및 인간 FcgRIIb를 발현하고, 마우스 FcRn의 발현이 없는 인간 FcgRIIb, 인간 FcRn 형질전환 마우스 및 마우스 FcRn 녹아웃 마우스가 수립된 것을 확인하였다.
(12-5) pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키는 것에 의한 약물 동태의 개선
인간 FcgRIIb 및 인간 FcRn 형질전환 마우스에 각각 Fv4-IgG1, Fv4-P587 및 Fv4-P587-LS를 투여한 in vivo 시험이 실시예 11의 방법과 동일하게 실시되고, 당해 마우스군의 혈장 중 가용형 IL-6R 및 혈장 중 항인간 IL-6R 항체 농도가 측정되었다. 혈장 중 항인간 IL-6R 항체 농도 및 혈장 중 가용형 IL-6R의 측정 결과를 각각 도 36, 도 37에 나타내었다.
Fv4-P587의 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성을 증강시킨 Fv4-P587-LS가 투여된 마우스군에 있어서, Fv4-P587이 투여된 마우스군에 비해 항체의 혈장 중 체류성 향상이 확인되었다. 이에 더하여, Fv4-P587-LS는 Fv4-IgG1보다도 혈장 중 체류성이 향상되어 있었다. 한편으로 Fv4-P587-LS가 투여된 마우스군의 혈장 중 가용형 IL-6R 농도는 Fv4-P587이 투여된 마우스군의 그것과 동등하였다. Fv4-P587-LS 또는 Fv4-P587이 투여된 마우스군은 Fv4-IgG1이 투여된 마우스군에 비해 혈장 중 가용형 IL-6R 농도가 저하되어 있었다.
이상의 사실로부터, 인간 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자의 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 증강되어 있는 항체의 투여에 의해, 당해 투여를 받은 생체에 있어서의 투여한 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성 향상이 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 항원 결합 분자가 투여된 생체의 혈장 중 체류성이 향상되어도 당해 생체에 있어서의 항원 소실 효과는 감약되지 않고, 오히려 항원 소실 효과를 지속시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.
pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키기 위한 개변으로서는 특별히 한정되지 않고, IgG 항체의 EU 넘버링으로 표시되는 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하고, 434번 위치의 Asn을 Ser로 치환하는 방법(Nat. Biotechnol. (2010) 28, 157-159), 434번 위치의 Asn을 Ala로 치환하는 방법(Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4) 600-605), 252번 위치의 Met를 Tyr로 치환하고, 254번 위치의 Ser을 Thr로 치환하며, 256번 위치의 Thr을 Glu로 치환하는 방법(J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23524), 250번 위치의 Thr을 Gln으로 치환하고, 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하는 방법(J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356), 434번 위치의 Asn을 His로 치환하는 방법(Clin. Pharmcol. Ther. (2011) 89 (2) 283-290), 및 WO2010/106180, WO2010/045193, WO2009/058492, WO2008/022152, WO2006/050166, WO2006/053301, WO2006/031370, WO2005/123780, WO2005/047327, WO2005/037867, WO2004/035752, WO2002/060919 등에 있어서 기재되는 개변도 사용된다.
〔참고예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
항체의 가변영역의 H쇄 및 L쇄의 염기서열을 코드하는 전장 유전자의 합성은 Assemble PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 제작하였다. 아미노산 치환의 도입은 PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하고, H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen사) 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하고, 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore) 또는 0.45 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하여다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔참고예 2〕FcγR의 조제방법 및 개변 항체와 FcγR의 상호작용 해석방법
FcγR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcγR의 세포외 도메인의 유전자 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 그때 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는 FcγRI에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_000566.3의 서열, FcγRIIa에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_001136219.1의 서열, FcγRIIb에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_004001.3의 서열, FcγRIIIa에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_001127593.1의 서열, FcγRIIIb에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_000570.3의 서열을 토대로 제작하고, C말단에 His 태그를 부가하였다. 또한 FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb에 대해서는 다형이 알려져 있는데, 다형 부위에 대해서는 FcγRIIa에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25, FcγRIIIa에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIb에 대해서는 J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691을 참고로 하여 제작하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질을 발현시켰다. 또한 결정 구조 해석용으로 사용한 FcγRIIb에 대해서는 최종농도 10 ㎍/mL의 Kifunesine 존재하에서 목적 단백질을 발현시켜 FcγRIIb에 부가되는 당쇄가 고만노오스형이 되도록 하였다. 배양하고, 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙으로서 다음 4단계로 정제하였다. 제1 단계는 양이온 교환 칼럼크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제2 단계는 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 단계는 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 단계는 무균 여과를 실시하였다. 단 FcγRI에 대해서는 제1 단계에 Q sepharose FF를 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제한 Fcγ 수용체의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고 측정온도는 25℃로 하였다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법으로 항원 펩티드, Protein A(Thermo Scientific), Protein A/G(Thermo Scientific), Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩을 사용하였다.
이들 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하고 항체 간에 비교하였다. 단 Fcγ 수용체의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 Fcγ 수용체의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 센서칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
또한 각 개변 항체의 FcγR에 대한 KD값을 산출하기 위해 속도론적인 해석은 아래의 방법에 따라 실시하였다. 먼저, 상기 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
또한 각 개변 항체와 FcγR의 상호작용이 미약하여 상기 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단된 경우, 그 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재된 아래의 1:1 결합 모델식을 이용하여 KD를 산출하였다.
1:1 binding model에서 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 1로 나타낼 수 있다.
〔식 1〕
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
이 식을 변형하면 KD는 아래의 식 2와 같이 나타낼 수 있다.
〔식 2〕
이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD를 산출하는 것이 가능하다. RI, C에 대해서는 측정결과의 센서그램, 측정조건으로부터 값을 구할 수 있다. Rmax의 산출에 대해서는 아래의 방법에 따랐다. 그 측정시에 동시에 평가한 비교대상이 되는 상호작용이 충분히 강한 항체에 대해서, 상기 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때 얻어진 Rmax의 값을 비교대상이 되는 항체의 센서칩에 대한 캡쳐량으로 나누고, 평가하고자 하는 개변 항체의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값을 Rmax로 하였다.
〔참고예 3〕Fc 개변체의 FcγR에 대한 결합의 망라적 해석
IgG1과 비교하여 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa의 H형 및 R형 중 어느 유전자 다형에 대해서도 Fc를 매개로 한 결합이 감소되며, 또한 FcγRIIb에 대한 결합이 증강된 항체를 제작하기 위해 IgG1 항체에 변이를 도입하여 각 FcγR에 대한 결합의 망라적 해석을 실시하였다.
항체 H쇄에는 WO2009/041062에 개시되어 있는 혈장 중 동태가 개선된 항글리피칸 3 항체인 GpH7의 CDR을 포함하는 글리피칸 3 항체의 가변영역(서열번호:15)을 사용하였다. 마찬가지로 항체 L쇄에는 WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 글리피칸 3 항체의 GpL16-k0(서열번호:16)를 공통으로 사용하였다. 또한 항체 H쇄 정상영역으로서 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d에 K439E의 변이를 도입한 B3를 이용하였다. 이 H쇄를 GpH7-B3(서열번호:17), L쇄를 GpL16-k0(서열번호:16)라 부른다.
GpH7-B3에 대해 FcγR의 결합에 관여하는 것으로 생각되는 아미노산과 그 주변의 아미노산(EU 넘버링으로 234번째 내지 239번째, 265번째 내지 271번째, 295번째, 296번째, 298번째, 300번째, 324번째 내지 337번째)을 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환하였다 이들 Fc 변이체를 B3 variant라 부른다. B3 variant를 참고예 1의 방법으로 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa)에 대한 결합을 망라적으로 평가하였다.
각각의 FcγR과의 상호작용 해석결과에 대해서 아래의 방법에 따라 도면을 작성하였다. 각 B3 variant에 유래하는 항체의 FcγR에 대한 결합량의 값을 B3에 변이를 도입하지 않은 비교대상이 되는 항체(EU 넘버링으로 234번째 내지 239번째, 265번째 내지 271번째, 295번째, 296번째, 298번째, 300번째, 324번째 내지 337번째가 인간 천연형 IgG1의 서열을 갖는 항체)의 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누었다. 그 값을 추가로 100배한 값을 각 변이체의 FcγR에 대한 상보적인 결합 활성의 지표로 하였다. 가로축에 각 변이체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 변이체의 활성형 FcγR인 FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIIa에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(도 1, 2, 3, 4).
그 결과, 도 1~4에 라벨로 표시한 바와 같이 전체 개변 중 mutation A(EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변)라는 변이 및 mutation B(EU 넘버링으로 328번째의 Leu를 Glu로 치환하는 개변)라는 변이만이 도입되면, 도입 전에 비해 FcγRIIb에 대한 결합을 현저히 증강시켜, FcγRIIa의 양쪽 타입에 대한 결합을 현저히 억제하는 효가가 있는 것을 발견하였다.
〔참고예 4〕FcγRIIb 선택적 결합 개변체의 SPR 해석
실시예 1에서 발견한 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변에 대해서 각 FcγR에 대한 결합을 보다 상세하게 해석하였다.
항체 H쇄 가변영역으로서 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 가변영역인 IL6R-H의 가변영역(서열번호:18)을, 항체 H쇄 정상영역으로서 인간 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d를 갖는 IL6R-G1d(서열번호:19)를 IgG1의 H쇄로서 사용하였다. IL6R-G1d의 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 IL6R-G1d-v1(서열번호:20)을 제작하였다. 다음으로 IL6R-G1d의 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 IL6R-G1d-v2를 제작하였다. 또한 비교를 위해 비특허문헌 28에 기재되어 있는 IL6R-G1d의 EU 넘버링 267번째의 Ser을 Glu로 치환하고, EU 넘버링 328번째의 Leu를 Phe로 치환한 IL6R-G1d-v3를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 tocilizumab의 L쇄인 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하고, 각각의 H쇄와 함께 참고예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제시켰다. 여기서 얻어진 항체 H쇄로서 IL6R-G1d, IL6R-G1d-v1, IL6R-G1d-v2, IL6R-G1d-v3에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 각각 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3라 부른다.
다음으로, 이들 항체와 FcγR의 상호작용의 속도론적인 해석을 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용해서 실시하였다. 러닝 버퍼로는 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하고, 측정온도는 25℃로 하였다. Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)에 대해 아민 커플링법으로 Protein A를 고정화한 칩을 사용하였다. 이 칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 각 FcγR을 상호작용시켜 항체에 대한 결합을 측정하였다. 측정 후에는 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다. Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과로서 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 해석함으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
금번, IgG1-v1과 IgG1-v2의 FcγRIIa H형과 FcγRIIIa에 대한 결합은 미약하기 때문에, 상기 해석법으로는 KD 등의 속도론적 파라미터를 산출할 수 없었다. 이들 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재된 아래의 1:1 결합 모델식을 이용하여 KD를 산출하였다.
1:1 결합 모델에서 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 1로 나타낼 수 있다.
〔식 1〕
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
이 식을 변형하면 KD는 아래의 식 2와 같이 나타낼 수 있다.
〔식 2〕
이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD를 산출하는 것이 가능하다. 금번 측정조건에서는 RI=0, C=2 ㎛ol/L로 할 수 있다. 또한 Rmax에는 각 FcγR에 대한 IgG1의 상호작용 해석 결과로서 얻어진 센서그램에 대해 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때 얻어진 Rmax의 값을 IgG1의 캡쳐량으로 나누고, IgG1-v1, IgG1-v2의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값으로 하였다. 이는 IgG1에 변이를 도입한 어느 개변체에 있어서도 IgG1과 비교하여 각 FcγR이 결합할 수 있는 한계량에는 변화가 없고, 측정시 Rmax는 그 측정시에 칩 상에 결합되어 있는 항체의 양에 비레한다는 가정을 토대로 한 계산이다. Req는 측정시에 관찰된 각 FcγR의 센서칩 상의 각 개변체에 대한 결합량으로 하였다.
금번 측정조건에서는 FcγRIIa H형에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 결합량(Req)은 각각 약 2.5, 10 RU, FcγRIIIa에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 결합량(Req)은 각각 약 2.5, 5 RU였다. FcγRIIa H형에 대한 상호작용 해석시의 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2의 캡쳐량은 452, 469.2, 444.2 RU이고, FcγRIIIa에 대한 상호작용 해석시의 IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2의 캡쳐량은 454.5, 470.8, 447.1 RU였다. 또한 FcγRIIa H형, FcγRIIIa에 대한 IgG1의 상호작용 해석 결과로서 얻어진 센서그램에 대해 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때에 얻어진 Rmax는 각각 69.8, 63.8 RU였다. 이들 값을 사용하면 FcγRIIa H형에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 Rmax는 각각 72.5, 68.6 RU, FcγRIIIa에 대한 IgG1-v1, IgG1-v2의 Rmax는 각각 66.0, 62.7 RU로 산출되었다. 이들 값을
〔식 2〕
의 식에 대입하여 IgG1-v1, IgG1-v2의 FcγRIIa H형 및 FcγRIIIa에 대한 KD를 산출하였다.
IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 각 FcγR에 대한 KD값을 표 1(각 항체의 각 FcγR에 대한 KD값)에, 또한 IgG1의 각 FcγR에 대한 KD값을 IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 각 FcγR에 대한 KD값으로 나눈 IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v3의 상대적인 KD값을 표 2(각 항체의 각 FcγR에 대한 상대적인 KD값)에 나타내었다.
상기 표 15 중 *는 FcγR의 IgG에 대한 결합이 충분히 관찰되지 않았기 때문에,
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 KD를 의미한다.
표 16으로부터, IgG1과 비교하여 IgG1-v1은 FcγRIa에 대해 결합 활성이 0.047배로 저하되고, FcγRIIa의 R형에 대해서는 0.10배로 저하되며, FcγRIIa H형에 대해 결합 활성이 0.014배로 저하되고, FcγRIIIa에 대해서는 결합 활성이 0.061배로 저하되어 있었다. 한편으로 FcγRIIb에 대해서는 결합 활성이 4.8배 향상되어 있었다.
또한 표 16으로부터 IgG1과 비교하여 IgG1-v2는 FcγRIa에 대해 결합 활성이 0.74배로 저하되고, FcγRIIa의 R형에 대해서는 0.41배로 저하되며, FcγRIIa H형에 대해 결합 활성이 0.064배로 저하되고, FcγRIIIa에 대한 결합 활성은 0.14배로 저하되어 있었다. 한편으로 FcγRIIb에 대해서는 결합 활성이 2.3배 향상되어 있었다.
즉, 이 결과로부터 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변을 갖는 IgG1-v1 및 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 개변을 포함하는 IgG1-v2는 FcγRIIa의 양쪽 유전자 다형을 포함하는 활성형의 전체 FcγR에 대한 결합을 감약시키는 한편으로, 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합을 상승시키는 성질이 있는 것이 명확해졌다.
다음으로, FcγRIIb에 대한 결합 활성과 FcγRIIa R형 또는 H형에 대한 결합 활성의 비율을 지표로 하여, 얻어진 개변체의 FcγRIIb에 대한 선택성을 평가하였다. 구체적으로는 FcγRIIa R형 또는 H형에 대한 KD값을 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값인 I/A(R) 또는 I/A(H)를 각 FcγRIIa에 대한 FcγRIIb의 선택성 지표로서 사용하였다. 이 지표는 FcγRIIb에 대한 KD값이 작아질수록, 또는 FcγRIIa에 대한 KD값이 커질수록 큰 값을 나타낸다. 즉, 보다 큰 값을 나타내는 개변체 쪽이 FcγRIIa와 비교한 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성이 향상되어 있는 것을 나타낸다. 각 개변체에 대해서 이 지표를 표 17에 정리하였다.
표 17의 결과로부터, IgG1과 비교하여 기존 기술을 적용한 IgG1-v3는 I/A(H)에 대해서는 IgG1보다도 큰 값을 나타내 FcγRIIb에 대해서 보다 선택적인데, I/A(R)에 대해서는 IgG1보다도 작은 값을 나타내 FcγRIIb에 대한 선택성은 개선되어 있었다. 한편으로 본 실시예에서 발견한 IgG1-v1과 IgG1-v2는 I/A(R) 및 I/A(H) 모두 IgG1보다 큰 값을 나타내고 있어, FcγRIIb에 대한 선택성이 FcγRIIa 중 어느 유전자 다형에 대해서도 개선되어 있었다.
이러한 성질을 갖는 개변은 지금까지 보고가 없고, 실제로 도 18, 19, 20, 21에 나타내는 바와 같이 매우 드물다. EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변이나 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 개변은 면역 염증성 질환 등의 치료제의 개발에 매우 유용하다.
또한 표 2로부터 비특허문헌 28에 기재되어 있는 IgG1-v3는 확실하게 FcγRIIb에 대한 결합을 408배 증강시키고, FcγRIIa H형에 대한 결합은 0.51배로 감소되어 있는데, 한편으로 FcγRIIa R형에 대한 결합을 522배 증강시키고 있다. 이 결과로부터, IgG1-v1 및 IgG1-v2는 FcγRIIa R형 및 H형 양쪽에 대한 결합을 억제하고, 또한 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시키는 것으로부터, IgG1-v3와 비교하여 FcγRIIb에 대해 보다 선택적으로 결합하는 개변체인 것으로 생각된다. 즉, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변이나 EU 넘버링 328번째의 Leu를 Glu로 치환한 개변은 면역 염증성 질환 등의 치료제의 개발에 매우 유용하다.
〔참고예 5〕FcγRIIb 선택적 결합 개변과 다른 Fc영역의 아미노산 치환의 조합에 의한 효과
참고예 3 및 참고예 4에서 발견한 FcγRIIb에 대한 선택성이 향상된 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변체를 토대로 하여 FcγRIIb에 대한 선택성을 추가로 증강시키는 것을 시도하였다.
먼저, IL6R-G1d에 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변을 도입한 IL6R-G1d_v1(서열번호:20)에 대해 참고예 4에 기재한 FcγRIIb에 대한 선택성을 증강시키는 EU 넘버링 328번째의 Leu의 Glu로의 치환을 도입한 개변체 IL6R-G1d-v4를 제작하고, IL6R-L(서열번호:21)과 합하여 참고예 1의 방법에 따라 조제하였다. 여기서 얻어진 항체 H쇄로서 IL6R-G1d-v4에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 IgG1-v4로 한다. IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2, IgG1-v4의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 참고예 2의 방법에 따라 평가하고, 그 결과를 표 18에 나타내었다.
표 18의 결과로부터, L328E는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 2.3배 향상시키는 것으로부터, 마찬가지로 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 4.8배 향상시키는 P238D와 조합시키면, FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상 정도가 더욱 증대될 것이 기대되었는데, 실제로는 그들 개변을 조합한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성은 IgG1과 비교하여 0.47배로 저하되어 버리는 것이 명확해졌다. 이 결과는 각각의 개변 효과로부터는 예측할 수 없는 효과이다.
동일하게 하여 IL6R-G1d에 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변을 도입한 IL6R-G1d-v1(서열번호:20)에 대해 참고예 4에 기재한 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시키는 EU 넘버링 267번째의 Ser의 Glu로의 치환 및 EU 넘버링 328번째의 Leu의 Phe로의 치환을 도입한 개변체 IL6R-G1d-v5를 참고예 1의 방법에 따라 조제하였다. 여기서 얻어진 항체 H쇄로서 IL6R-G1d-v5에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 IgG1-v5로 한다. IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3, IgG1-v5의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 참고예 2의 방법에 따라 평가하고, 그 결과를 표 19에 나타내었다.
P238D 개변체에 대해 참고예 4에서 FcγRIIb에 대한 증강 효과가 있었던 S267E/L328F를 도입하여, 개변 도입 전후에서의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 평가하고, 그 결과를 표 19에 나타내었다.
표 19의 결과로부터, S267E/L328F는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 408배 향상시키는 것으로부터, 동일하게 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 IgG1과 비교하여 4.8배 향상시키는 P238D와 조합하면, FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상 정도가 더욱 증대될 것이 기대되었으나, 실제로는 앞선 예와 마찬가지로 그들의 개변을 조합한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성은 IgG1과 비교하여 12배 정도밖에 향상되지 않은 것이 명확해졌다. 이 결과도 각각의 개변의 효과로부터는 예측할 수 없는 효과이다.
이들 결과로부터, EU 넘버링 238번째의 Pro의 Asp로의 치환은 그 단독으로는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 향상시키지만, 그 밖의 FcγRIIb에 대한 결합 활성 향상 개변과 조합한 경우에는 그 효과를 발휘하지 않는 것이 명확해졌다. 그 하나의 요인으로서 Fc와 FcγR의 상호작용 계면의 구조가 EU 넘버링 238번째의 Pro의 Asp로의 치환을 도입함으로써 변화되어 버려, 천연형 항체에 있어서 관찰된 개변의 효과를 반영하지 않게 되어 버린 것으로 생각된다. 이 사실로부터, EU 넘버링 238번째의 Pro의 Asp로의 치환을 포함하는 Fc를 주형으로 하여, 추가로 FcγRIIb에 대한 선택성이 우수한 Fc를 창출하는 것은 천연형 항체에서 얻어진 개변 효과의 정보를 활용할 수 없어 매우 곤란하다고 생각되었다.
〔참고예 6〕P238D 개변에 더하여 hinge 부분의 개변을 도입한 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합의 망라적 해석
참고예 5에서 나타낸 바와 같이, 인간 천연형 IgG1에 대해 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 Fc에 대해 추가로 FcγRIIb로의 결합을 올릴 것으로 예측되는 다른 걔변을 조합하더라도, 기대되는 조합 효과는 얻어지지 않았다. 이에 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 Fc 개변체를 토대로 하여, 그 Fc에 대해 개변을 망라적으로 도입함으로써 추가로 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 개변체를 발견하는 검토를 실시하였다. 항체 H쇄로서는, IL6R-G1d(서열번호:19)에 대해 EU 넘버링 252번째의 Met를 Tyr로 치환하는 개변, EU 넘버링 434번째의 Asn을 Tyr로 치환하는 개변을 도입한 IL6R-F11(서열번호:22)을 제작하고, 이에 대해 추가로 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변을 도입한 IL6R-F652를 제작하였다. IL6R-F652에 대해 EU 넘버링 238번째 잔기 근방의 영역(EU 넘버링 234번째 내지 237번째, 239번째)을 원래의 아미노산과 시스테인을 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환한 항체 H쇄 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 각각 준비하였다. 항체 L쇄에는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 이들 개변체를 참고예 1의 방법으로 발현, 정제하여 발현시켰다. 이들 Fc 변이체를 PD variant라 부른다. 참고예 2의 방법으로 각 PD variant의 FcγRIIa R형 및 FcγRIIb에 대한 상호작용을 망라적으로 평가하였다.
각각의 FcγR과의 상호작용 해석 결과에 대해서 아래의 방법에 따라 도면을 작성하였다. 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변인 IL6R-F652/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 PD variant의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 가로축에 각 PD variant의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 PD variant의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(도 22).
그 결과, 11종류의 개변이 개변 도입 전의 항체와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시키고, FcγRIIa R형에 대한 결합을 유지 또는 증강시키는 효과가 있는 것을 발견하였다. 이들 11 종류의 개변체의 FcγRIIb 및 FcγRIIa R에 대한 결합 활성을 정리한 결과를 표 20에 나타낸다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-F11(서열번호:22)에 대해 도입한 개변을 나타낸다.
이 11종류의 개변을 P238D가 도입된 개변체에 대해 추가로 도입한 경우의 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 값, 참고예 3에 있어서 이들 개변을 P238D를 포함하지 않는 Fc에 도입했을 때의 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 값을 도 23에 나타내었다. 이들 11종류의 개변은 P238D 개변에 추가로 도입하면 도입 전에 비해 FcγRIIb에 대한 결합량을 증강시키고 있었으나, G237F, G237W, S239D를 제외한 8종류의 개변에서는 그와는 반대로 참고예 3에서 사용한 P238D를 포함하지 않는 개변체(GpH7-B3/GpL16-k0)에 도입한 경우에는 FcγRIIb로의 결합을 낮추는 효과를 나타내고 있었다.
참고예 5와 이 결과로부터, 천연형 IgG1에 대해 도입한 개변의 효과로부터 P238D 개변을 Fc에 포함하는 개변체에 대해 동 개변을 도입했을 때의 효과를 예측하는 것은 곤란한 것이 명확해졌다. 또한 바꿔말하면 금번 발견한 8종류의 개변은 본 검토를 행하지 않으면 발견하는 것이 불가능한 개변이다.
표 20에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIaV에 대한 KD값을 참고예 2의 방법으로 측정한 결과를 표 21에 정리하였다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-F11(서열번호:22)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-F11을 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 21에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-F11(서열번호:22)을 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 21 중 회색으로 칠한 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 21로부터 어느 개변체도 IL6R-F11과 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상 폭은 1.9배 내지 5.0배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉, 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-F11/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 모두 0.7이기 때문에, 표 21 중 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이라는 것은, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나, 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 0.7 내지 5.0이었기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것과 비교하여 거의 동등하거나, 그것보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터, 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감하면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성을 향상시키고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 IL6R-F11과 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.
〔참고예 7〕P238D를 포함하는 Fc와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석
앞선 참고예 5에 나타낸 바와 같이, P238D를 포함하는 Fc에 대해 FcγRIIb와의 결합 활성을 향상시키거나 또는 FcγRIIb로의 선택성을 향상시키는 개변을 도입하더라도 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 감약되어 버리는 것이 명확해지고, 이 원인으로서 Fc와 FcγRIIb의 상호작용 계면의 구조가 P238D를 도입함으로써 변화되어 버린 것이 생각되었다. 이에 이 현상의 원인을 추궁하기 위해 P238D의 변이를 갖는 IgG1의 Fc(이하, Fc(P238D))와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 입체 구조를 X선 결정 구조 해석에 의해 명확하게 하고, 천연형 IgG1의 Fc(이하, Fc(WT))와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체와 입체 구조 및 결합 양식을 비교하기로 하였다. 또한 Fc와 FcγR 세포외영역의 복합체의 입체 구조에 대해서는 이미 복수의 보고가 있어, Fc(WT)/FcγRIIIb 세포외영역 복합체(Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276, 16469-16477), Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 12669-126674), Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)의 입체 구조가 해석되어 있다. 지금까지 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체 구조는 해석되어 있지 않은데, Fc(WT)와의 복합체의 입체 구조가 기지인 FcγRIIa와 FcγRIIb에서는 세포외영역에 있어서 아미노산 서열의 93%가 일치하여 매우 높은 상동성을 가지고 있는 것으로부터, Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 입체 구조는 Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조로부터 모델링에 의해 추정하였다.
Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체에 대해서는 X선 결정 구조 해석에 의해 분해능 2.6Å에서 입체 구조를 결정하였다. 그 해석 결과의 구조를 도 24에 나타낸다. 2개의 Fc CH2 도메인 사이에 FcγRIIb 세포외영역이 끼이도록 결합되어 있어, 지금까지 해석된 Fc(WT)와 FcγRIIIa, FcγRIIIb, FcγRIIa의 각 세포외영역의 복합체의 입체 구조와 유사하다.
다음으로 상세한 비교를 위해, Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조를 FcγRIIb 세포외영역 및 Fc CH2 도메인 A에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합하였다(도 25). 그때 Fc CH2 도메인 B끼리의 겹침 정도는 양호하지 않아, 이 부분에 입체 구조적인 차이가 있는 것이 명확해졌다. 또한 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조 및 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조를 사용하여, FcγRIIb 세포외영역과 Fc CH2 도메인 B 사이에서 그 거리가 3.7Å 이하의 원자쌍을 추출하여 비교함으로써, FcγRIIb와 Fc CH2 도메인 B 사이의 원자간 상호작용의 차이를 Fc(WT)와 Fc(P238D)에서 비교하였다. 표 22에 나타내는 바와 같이, Fc(P238D)와 Fc(WT)에서는 Fc CH2 도메인 B와 FcγRIIb 사이의 원자간 상호작용은 일치하지 않는다.
또한 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조와 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조에 대해서 Fc CH2 도메인 A 및 Fc CH2 도메인 B 단독끼리 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합을 행하여 P238D 부근의 상세구조를 비교하였다. Fc(P238D)와 Fc(WT)에서는 변이 도입 위치인 EU 넘버링 238번째의 아미노산 잔기의 위치가 변화되고, 그에 수반되어 힌지영역에서 계속되는 이 근방의 루프 구조가 Fc(P238D)와 Fc(WT)에서는 변화되어 있는 것을 알 수 있다(도 26). 애초부터 Fc(WT)에 있어서는 EU 넘버링 238번째의 Pro는 단백의 내측에 있어 주위의 잔기와 소수성 코어를 형성하고 있는데, 이것이 전하를 가져 매우 친수적인 Asp로 변화된 경우, 그대로 소수성 코어에 있는 것은 탈용매화 측면에서 에너지적으로 불리해지게 된다. 이에 Fc(P238D)에서는 이 에너지적인 불리를 해소하기 위해 EU 넘버링 238번째의 아미노산 잔기가 용매측을 향하는 형태로 변화되어 있어, 그것이 이 부근의 루프 구조의 변화를 초래한 것으로 생각된다. 또한 이 루프는 S-S 결합으로 가교된 힌지영역에서 계속되고 있는 것으로부터, 그 구조 변화가 국소적인 변화에 그치지 않고 Fc CH2 도메인 A와 도메인 B의 상대적인 배치에도 영향을 미쳐, 그 결과 FcγRIIb와 Fc CH2 도메인 B 사이의 원자간 상호작용에 차이를 초래한 것으로 추찰된다. 이 때문에 P238D 개변을 이미 갖는 Fc에 천연형 IgG에 있어서 FcγRIIb에 대한 선택성, 결합 활성을 향상시키는 개변을 조합하더라도 예측되는 효과가 얻어지지 않은 것으로 생각된다.
또한 P238D의 도입에 의한 구조 변화의 결과, Fc CH2 도메인 A에 있어서는 이웃하는 EU 넘버링 237번째의 Gly의 주쇄와 FcγRIIb의 160번째의 Tyr 사이에 수소 결합이 확인된다(도 27). 이 Tyr160에 상당하는 잔기는 FcγRIIa에서는 Phe이고, FcγRIIa와의 결합인 경우에는 이 수소 결합은 형성되지 않는다. 160번째의 아미노산은 Fc와의 상호작용 계면에 있어서의 FcγRIIa와 FcγRIIb 사이의 적은 차이 중 하나인 것을 합치면, FcγRIIb 특유의 이 수소 결합의 유무가 Fc(P238D)의 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 향상과 FcγRIIa에 대한 결합 활성의 저감을 초래하여, 선택성 향상의 원인이 된 것으로 추측된다. 또한 Fc CH2 도메인 B에 대해서는 EU 넘버링 270번째의 Asp와 FcγRIIb의 131번째의 Arg 사이에 정전적인 상호작용이 확인된다(도 28). FcγRIIa의 알로타입의 하나 FcγRIIa H형의 경우는 대응하는 잔기가 His로 되어 있어 이 정전 상호작용을 형성할 수 없다. 이 사실로부터 FcγRIIa R형과 비교하여 FcγRIIa H형의 경우는 Fc(P238D)에 대한 결합 활성이 저감되어 있는 이유를 설명할 수 있다. 이러한 X선 결정 구조 해석의 결과에 기초하는 고찰로부터, P238D의 도입에 의한 그 부근의 루프 구조의 변화와 그에 수반되는 도메인 배치의 상대적인 변화가 천연형 IgG에는 없는 새로운 상호작용을 형성하여, P238D 개변체의 FcγRIIb에 대한 선택적인 결합 프로파일로 이어져 있는 것이 명확해졌다.
[Fc(P238D)의 발현 정제]
P238D 개변을 포함하는 Fc의 조제는 아래와 같이 행하였다. 먼저, hIL6R-IgG1-v1(서열번호:20)의 EU 넘버링 220번째의 Cys를 Ser로 치환하고, EU 넘버링 216번째의 Glu로부터 그 C말단을 PCR에 의해 클로닝한 유전자 서열 Fc(P238D)를 참고예 1에 기재된 방법에 따라 발현 벡터의 제작, 발현, 정제를 행하였다. 또한 EU 넘버링 220번째의 Cys는 통상의 IgG1에 있어서는 L쇄의 Cys와 disulfide bond를 형성하고 있는데, Fc만을 조제하는 경우, L쇄를 공발현시키지 않기 때문에 불필요한 disulfide bond 형성을 회피하기 위해 Ser로 치환하였다.
[FcγRIIb 세포외영역의 발현 정제]
참고예 2의 방법에 따라 조제하였다.
[Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 정제]
결정화용으로 얻어진 FcγRIIb 세포외영역 샘플 2 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.29 ㎎을 첨가하고, 0.1M Bis-Tris pH 6.5의 Buffer 조건으로 실온에서 3일간 정치함으로써 N형 당쇄를 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine을 남기고 절단하였다. 다음으로 이 당쇄 절단 처리를 행한 FcγRIIb 세포외영역 샘플을 5000MWCO의 한외여과막으로 농축하고, 20 mM HEPS pH 7.5, 0.05M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하였다. 추가로 얻어진 당쇄 절단 FcγRIIb 세포외영역 분획에 Fc(P238D)를 몰비로 FcγRIIb 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 첨가하고 10000MWCO의 한외여과막으로 농축 후, 20 mM HEPS pH 7.5, 0.05M NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)로 정제하여 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 얻었다.
[Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정화]
Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 약 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 시팅 드롭 증기 확산법으로 결정화를 행하였다. 결정화에는 Hydra II Plus One(MATRIX)을 사용하고, 100mM Bis-Tris pH 6.5, 17% PEG3350, 0.2M Ammonium acetate, 2.7%(w/v) D-Galactose의 리저버 용액에 대해 리저버 용액:결정화 샘플=0.2 ㎕:0.2 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작하고, 실링 후, 20℃에 정치한 바, 얇은 판형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
[Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정]
얻어진 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 단결정 하나를 100 mM Bis-Tris pH 6.5, 20% PEG3350, Ammonium acetate, 2.7%(w/v) D-Galactose, Ethylene glycol 22.5%(v/v)의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀으로 용액째 떠내 액체질소 중에서 동결시키고, 고에너지 가속기 연구기구의 방사광시설 포톤팩토리 BL-1A로 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소 기류 중에 둠으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인이 비치된 CCD 디텍터 Quantum 270(ADSC)에 의해 결정을 0.8°씩 회전시키면서 토탈 225매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)를 사용하여, 최종적으로 분해능 2.46Å까지의 회절 강도 데이터를 얻었다. 본 결정은 공간군 P21에 속하고 격자상수 a=48.85Å, b=76.01Å, c=115.09Å, α=90°, β=100.70°, γ=90°였다.
[Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조 해석]
Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조 결정은 프로그램 Phaser(CCP4 Software Suite)를 사용한 분자 치환법에 의해 행하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 1개로 예상되었다. Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조인 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터 A쇄 239-340번 및 B쇄 239-340번의 아미노산 잔기 부분을 별도 좌표로서 취출하여 각각 Fc CH2 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마찬가지로 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터 A쇄 341-444번과 B쇄 341-443번의 아미노산 잔기 부분을 하나의 좌표로서 취출하여 Fc CH3 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마지막으로 FcγRIIb 세포외영역의 결정 구조인 PDB code:2FCB의 구조 좌표로부터 A쇄 6-178번의 아미노산 잔기 부분을 취출하여 FcγRIIb 세포외영역의 탐색용 모델로 하였다. Fc CH3 도메인, FcγRIIb 세포외영역, Fc CH2 도메인의 순서로 각 탐색용 모델의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정하고, Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정 구조의 초기 모델을 얻었다. 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc CH2 도메인, 2개의 Fc CH3 도메인 및 FcγRIIb 세포외영역을 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 40.4%, Free R값은 41.9%가 되었다. 추가로 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출한 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 맵을 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Paul Emsley)로 행하여, 이들을 반복함으로써 모델의 정밀화를 행하였다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 맵을 토대로 수분자를 모델에 삽입하고 정밀화를 행함으로써, 최종적으로 분해능 25-2.6Å의 24291개의 회절 강도 데이터를 사용하여 4846개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 23.7%, Free R값은 27.6%가 되었다.
[Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조 제작]
Fc(WT)/FcγRIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조인 PDB code:3RY6의 구조 좌표를 베이스로 프로그램 Disovery Studio 3.1(Accelrys)의 Build Mutants 기능을 사용하여 FcγRIIb의 아미노산 서열과 일치하도록 구조 좌표 중의 FcγRIIa에 변이를 도입하였다. 이때 Optimization Level을 High, Cut Radius를 4.5로 하고, 5개의 모델을 발생시켜 그 중에서 가장 에너지 스코어가 좋은 것을 채용하여 Fc(WT)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 모델 구조로 하였다.
〔참고예 8〕 결정 구조에 기초하여 개변 개소를 결정한 Fc 개변체의 FcγR에 대한 결합의 해석
참고예 7에서 얻어진 Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석 결과에 기초하여, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 Fc 개변체 상에서 FcγRIIb와의 상호작용에 영향을 미칠 것이 예측되는 부위(EU 넘버링 233번째, 240번째, 241번째, 263번째, 265번째, 266번째, 267번째, 268번째, 271번째, 273번째, 295번째, 296번째, 298번째, 300번째, 323번째, 325번째, 326번째, 327번째, 328번째, 330번째, 332번째, 334번째의 잔기)에 대해 망라적인 개변을 도입하여 추가로 FcγRIIb와의 결합을 증강시키는 조합 개변체를 검토하였다.
참고예 4에서 제작한 IL6R-G1d(서열번호:19)에 대해 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환한 개변을 도입한 IL6R-B3(서열번호:23)를 제작하였다. 다음으로 IL6R-B3에 대해 EU 넘버링으로 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변을 도입한 IL6R-BF648을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호:21)을 공통으로 사용하였다. 이들 개변체를 참고예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하여 참고예 2의 방법으로 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 결합을 망라적으로 평가하였다.
각각의 FcγR과의 상호작용 해석 결과에 대해서 아래의 방법에 따라 도면을 제작하였다. 각 개변체의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 IL6R-BF648/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 개변체의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 가로축에 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 개변체의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(도 29).
그 결과, 도 29에 나타내는 바와 같이 전체 개변 중 24종류의 개변에 있어서 개변 도입 전의 항체와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합을 유지 또는 증강시키는 효과가 있는 것을 발견하였다. 이들 개변체의 각각의 FcγR에 대한 결합을 표 23에 나타낸다. 또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23, 표 23 중의 IL6R-2B999)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다.
표 23에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIa V형에 대한 KD값을 참고예 2의 방법으로 측정한 결과를 표 24에 정리하였다. 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 24에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-B3(서열번호:23)를 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 24 중 회색으로 칠한 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 24로부터 어느 개변체도 IL6R-B3(표 24 중의 IL6R-2B999)와 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상 폭은 2.1배 내지 9.7배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉, 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 각각 0.3, 0.2이기 때문에, 표 24 중 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이라는 것은, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 4.6 내지 34.0이었기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터, 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감시키면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성을 향상시키고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 もIL6R-B3와 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.
얻어진 조합 개변체 중 유망한 것에 대해서 결정 구조로부터 그 효과의 요인을 고찰하였다. 도 30에는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 결정 구조를 나타내었다. 이 중에서 좌측에 위치하는 H쇄를 Fc Chain A, 우측에 위치하는 H쇄를 Fc Chain B로 한다. 여기서 Fc Chain A에 있어서의 EU 넘버링 233번째의 부위는 FcγRIIb의 EU 넘버링 113번째의 Lys의 근방에 위치하는 것을 알 수 있다. 단, 본 결정 구조에 있어서는 E233의 측쇄는 그 전자 밀도가 잘 관찰되고 있지 않아 상당히 운동성이 높은 상태에 있다. 따라서 EU 넘버링 233번째의 Glu를 Asp로 치환하는 개변은 측쇄가 1탄소분 짧아짐으로써 측쇄의 자유도가 작아지고, 그 결과 FcγRIIb의 EU 넘버링 113번째의 Lys와의 상호작용 형성시의 엔트로피 손실이 저감되어, 결과적으로 결합 자유 에너지 향상에 기여하고 있는 것으로 추측된다.
도 31에는 동일하게 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체의 구조 중 EU 넘버링 330번째 부위 근방의 환경을 나타내었다. 이 도면으로부터 Fc(P238D)의 Fc Chain A의 EU 넘버링 330번째의 부위 주변은 FcγRIIb의 EU 넘버링 85번째의 Ser, 86번째의 Glu, 163번째의 Lys 등으로부터 구성되는 친수적인 환경인 것을 알 수 있다. 따라서 EU 넘버링 330번째의 Ala를 Lys 또는 Arg로 치환하는 개변은 FcγRIIb의 EU 넘버링 85번째의 Ser 내지 EU 넘버링 86번째의 Glu와의 상호작용 강화에 기여하고 있는 것으로 추측된다.
도 32에는 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 및 Fc(WT)/FcγRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조를 Fc Chain B에 대해 Cα 원자간 거리를 토대로 한 최소 제곱법에 의해 중합하여 EU 넘버링 271번째의 Pro의 구조를 나타내었다. 이들 2개의 구조는 잘 일치하나 EU 넘버링 271번째의 Pro의 부위에 있어서는 상이한 입체 구조로 되어 있다. 또한 Fc(P238D)/FcγRIIb 세포외영역 복합체 결정 구조에 있어서는 이 주변의 전자 밀도가 약한 것을 함께 생각할 때, Fc(P238D)/FcγRIIb에 있어서는 EU 넘버링 271번째가 Pro인 것으로 인해 구조상 커다란 부하가 걸려 있어, 이로 인해 이 루프 구조가 최적의 구조를 취하지 못하고 있을 가능성이 시사되었다. 따라서 EU 넘버링 271번째의 Pro를 Gly로 치환하는 개변은 이 루프 구조에 유연성을 부여하여 FcγRIIb와 상호작용하는 데 있어서 최적의 구조를 취하게 할 때의 에너지적인 장애를 경감시킴으로써 결합 증강에 기여하고 있는 것으로 추측된다.
〔참고예 9〕P238D와 조합함으로써 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 개변의 조합 효과의 검증
참고예 6, 참고예 8에 있어서 얻어진 개변 중에서 FcγRIIb로의 결합을 증강시키는 효과 또는 FcγRIIb로의 결합을 유지하고, 다른 FcγR로의 결합을 억제하는 효과가 보인 개변끼리를 조합하여 그 효과를 검증하였다.
참고예 8의 방법과 마찬가지로, 표 19,22로부터 특히 우수한 개변을 선택하여 항체 H쇄 IL6R-BF648에 대해 조합해서 도입하였다. 항체 L쇄에는 공통으로 IL6R-L을 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제시키고, 참고예 2의 방법으로 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 결합을 망라적으로 평가하였다.
각각의 FcγR과의 상호작용 해석 결과에 대해서 아래의 방법에 따라 상대적 결합 활성을 산출하였다. 각 개변체의 각 FcγR에 대한 결합량의 값을 대조로 한 개변 도입 전의 항체(EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 IL6R-BF648/IL6R-L)의 각 FcγR에 대한 결합량의 값으로 나누고, 추가로 100배한 값을 각 개변체의 각 FcγR에 대한 상대적인 결합 활성의 값으로 하였다. 가로축에 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 상대적인 결합 활성의 값, 세로축에 각 개변체의 FcγRIIa R형에 대한 상대적인 결합 활성의 값을 각각 표시하였다(표 25).
또한 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다.
표 25에 나타낸 개변체의 FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb, FcγRIIIa V형에 대한 KD값을 참고예 2의 방법으로 측정한 결과를 표 26에 정리하였다. 표 중의 개변이란 IL6R-B3(서열번호:23)에 대해 도입한 개변을 나타낸다. 단 IL6R-B3를 제작할 때의 주형으로 한 IL6R-G1d/IL6R-L에 대해서는 *로서 나타내었다. 또한 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb) 및 KD(IIaH)/KD(IIb)는 각각 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값, 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 나타낸다. 모체 폴리펩티드의 KD(IIb)/개변 폴리펩티드의 KD(IIb)는 모체 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값을 가리킨다. 이들에 더하여 각 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값을 표 26에 나타내었다. 여기서 모체 폴리펩티드란 IL6R-B3(서열번호:23)를 H쇄에 갖는 개변체를 가리킨다. 또한 표 26 중 회색으로 칠한 셀은 FcγR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고예 2에 기재된
〔식 2〕
의 식을 이용하여 산출한 값이다.
표 26으로부터 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 FcγRIIb에 대한 친화성이 향상되고, 그 향상 폭은 3.0배 내지 99.0배였다. 각 개변체의 FcγRIIaR에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 각 개변체의 FcγRIIaH에 대한 KD값/각 개변체의 FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성에 대한 상대적인 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 나타낸다. 즉, 이 값은 각 개변체의 FcγRIIb로의 결합 선택성의 높이를 나타낸 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcγRIIb에 대해 결합 선택성이 높다. 모체 폴리펩티드인 IL6R-B3/IL6R-L의 FcγRIIaR에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비 및 FcγRIIaH에 대한 KD값/FcγRIIb에 대한 KD값의 비는 각각 0.3, 0.2이기 때문에, 표 26의 어느 개변체도 모체 폴리펩티드보다도 FcγRIIb로의 결합 선택성이 향상되어 있었다. 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값/모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 KD값이 1 이상이라는 것은, 그 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합이 모체 폴리펩티드의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합과 동등하거나 보다 저감되어 있는 것을 의미한다. 금번 얻어진 개변체에서는 이 값이 0.7 내지 29.9였기 때문에, 금번 얻어진 개변체의 FcγRIIaR 및 FcγRIIaH에 대한 결합 활성 중 강한 쪽의 결합은 모체 폴리펩티드의 그것과 비교하여 거의 동등하거나 그것보다도 저감되어 있었다고 할 수 있다. 이들 결과로부터, 금번 얻어진 개변체에서는 모체 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIa R형 및 H형으로의 결합 활성을 유지 또는 저감시키면서 FcγRIIb로의 결합 활성을 증강시키고 있어, FcγRIIb로의 선택성을 향상시키고 있는 것이 명확해졌다. 또한 FcγRIa 및 FcγRIIIaV에 대해서는 어느 개변체도 IL6R-B3와 비교하여 친화성이 저하되어 있었다.
또한 각 서열번호의 서열에 있어서의 가변영역 및 정상영역을 아래의 표에 정리하였다. 표 중 「B3」는 「2B999(B3)」, 「omlizH」는 「omalizumab-VH」, 「omlizL」은 「omalizumab-VL」을 나타낸다.
본 발명에 의해 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 증강되고, 또한 FcγRIIa(R형)과 비교한 FcγRIIb에 대한 결합 선택성이 증강된 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 제공되었다. 그 폴리펩티드를 사용함으로써 FcγRIIb의 ITIM의 인산화를 매개로 한 염증성 면역반응의 억제성 시그널을 전달하는 것이 가능해진다. 또한 FcγRIIb에 선택적으로 결합하는 성질을 항체의 Fc에 부여함으로써, FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 작용을 통해 항의약품 항체의 생산을 억제할 수 있을 가능성이 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> Fc region-modified antibodies specific to Fc-gamma-RIIb
<130> C1-A1212P
<150> JP 2012-185868
<151> 2012-08-24
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1125
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga 900
ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag 960
aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc 1020
cttcaagaag acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag 1080
ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag 1125
<210> 2
<211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290 295 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325 330 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355 360 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210> 3
<211> 951
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa 60
ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgctcc cccaaaggct 120
gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac gtgctccagg aggactctgt gactctgaca 180
tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc 240
attcccaccc acacgcagcc cagctacagg ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag 300
tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc 360
gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg gagttccagg agggagaaac catcatgctg 420
aggtgccaca gctggaagga caagcctctg gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa 480
tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac 540
agtggtgatt accactgcac aggaaacata ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg 600
accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc agctcttcac caatgggggt cattgtggct 660
gtggtcattg cgactgctgt agcagccatt gttgctgctg tagtggcctt gatctactgc 720
aggaaaaagc ggatttcagc caattccact gatcctgtga aggctgccca atttgagcca 780
cctggacgtc aaatgattgc catcagaaag agacaacttg aagaaaccaa caatgactat 840
gaaacagctg acggcggcta catgactctg aaccccaggg cacctactga cgatgataaa 900
aacatctacc tgactcttcc tcccaacgac catgtcaaca gtaataacta a 951
<210> 4
<211> 316
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20 25 30
Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
35 40 45
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
50 55 60
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
65 70 75 80
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
100 105 110
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
115 120 125
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
130 135 140
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
145 150 155 160
Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
165 170 175
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
180 185 190
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
195 200 205
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala
210 215 220
Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
225 230 235 240
Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala
245 250 255
Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln
260 265 270
Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met
275 280 285
Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu
290 295 300
Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305 310 315
<210> 5
<211> 876
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atgggaatcc tgtcattctt acctgtcctt gccactgaga gtgactgggc tgactgcaag 60
tccccccagc cttggggtca tatgcttctg tggacagctg tgctattcct ggctcctgtt 120
gctgggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 180
gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac 240
tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 300
ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 360
agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg 420
gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 480
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac 540
ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 600
ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca 660
ccgatgggga tcattgtggc tgtggtcact gggattgctg tagcggccat tgttgctgct 720
gtagtggcct tgatctactg caggaaaaag cggatttcag ccaatcccac taatcctgat 780
gaggctgaca aagttggggc tgagaacaca atcacctatt cacttctcat gcacccggat 840
gctctggaag agcctgatga ccagaaccgt atttag 876
<210> 6
<211> 291
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1 5 10 15
Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20 25 30
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35 40 45
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu
50 55 60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp
65 70 75 80
Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
85 90 95
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr
100 105 110
Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
115 120 125
Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu
130 135 140
Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
145 150 155 160
Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg
165 170 175
Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180 185 190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys
195 200 205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile
210 215 220
Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala
225 230 235 240
Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro
245 250 255
Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr
260 265 270
Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln
275 280 285
Asn Arg Ile
290
<210> 7
<211> 765
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gttgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tgtcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 8
<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcaacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacattcca 480
aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctctc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattt ga 702
<210> 10
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225 230
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 326
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 13
<211> 377
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 14
<211> 327
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 17
<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
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260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 20
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 21
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65 70 75 80
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210
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp
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Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 25
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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420 425 430
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Pro
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<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 26
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<212> PRT
<213> Artificial
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<223> An artificially generated sequence
<400> 27
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<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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65 70 75 80
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100 105 110
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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<223> An artificially generated sequence
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<213> Artificial
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<223> An artificially generated sequence
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<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 45
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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<213> Artificial
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<400> 70
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<213> Artificial
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<223> An artificially generated sequence
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> An artificially generated sequence
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<213> Artificial
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 81
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> An artificially generated sequence
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
Claims (19)
- EU 넘버링 238번째의 아미노산 및 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 234번째의 아미노산, 235번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 265번째의 아미노산, 266번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 268번째의 아미노산, 269번째의 아미노산, 271번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 274번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 326번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 331번째의 아미노산, 332번째의 아미노산, 333번째의 아미노산, 334번째의 아미노산, 355번째의 아미노산, 356번째의 아미노산, 358번째의 아미노산, 396번째의 아미노산, 409번째의 아미노산 및 419번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역 개변체로서, 그 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 15.0 이상이 되는 Fc영역 개변체.
- 제1항에 있어서,
EU 넘버링 238번째의 아미노산, 268번째의 아미노산 및 271번째의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되고, 또한 EU 넘버링 233번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 264번째의 아미노산, 267번째의 아미노산, 272번째의 아미노산, 296번째의 아미노산, 327번째의 아미노산, 330번째의 아미노산, 332번째의 아미노산 및 396번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역 개변체. - EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp 및 233번째의 아미노산이 Asp, 234번째의 아미노산이 Tyr, 235번째의 아미노산이 Phe, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 265번째의 아미노산이 Glu, 266번째의 아미노산이 Phe, Leu 또는 Met, 267번째의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Gln, 268번째의 아미노산이 Asp, Gln 또는 Glu, 269번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro 또는 Gln, 274번째의 아미노산이 Gln, 296번째의 아미노산이 Asp 또는 Phe, 326번째의 아미노산이 Ala 또는 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Lys, Arg 또는 Ser, 331번째의 아미노산이 Ser, 332번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 333번째의 아미노산이 Lys, Arg, Ser 또는 Thr, 334번째의 아미노산이 Arg, Ser 또는 Thr, 355번째의 아미노산이 Ala, Gln, 356번째의 아미노산이 Glu, 358번째의 아미노산이 Met, 396번째의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr, 409번째의 아미노산이 Arg 및 419번째의 아미노산이 Glu인 아미노산군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는 Fc영역 개변체로서, 그 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 15.0 이상이 되는 Fc영역 개변체.
- 제3항에 있어서,
EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 및 271번째의 아미노산이 Gly이고, 또한 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 또는 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg, 332번째의 아미노산이 Thr 및 396번째의 아미노산이 Leu 또는 Met인 아미노산군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는 Fc영역 개변체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 50.0 이상인 Fc영역 개변체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
〔아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 100.0 이상인 Fc영역 개변체. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(R형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 10.0 이상인 Fc영역 개변체. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa(R형)에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 값이 20.0 이상인 Fc영역 개변체. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Fc영역 개변체가 하기 (a) 내지 (x) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변이 포함되는 Fc영역 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 332번째의 아미노산 개변
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째 및 330번째의 아미노산 개변
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 330번째의 아미노산 개변
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째, 327번째, 330번째 및 396번째의 아미노산 개변
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 330번째의 아미노산 개변
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째 및 271번째의 아미노산 개변
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 237번째, 267번째, 268번째, 271번째, 296번째 및 330번째의 아미노산 개변
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째, 272번째 및 296번째의 아미노산 개변
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째, 233번째, 264번째, 267번째, 268번째, 271번째 및 296번째의 아미노산 개변 - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Fc영역 개변체가 하기 (a) 내지 (x) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 Fc영역 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(b) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(c) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(d) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Gly 또는 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(e) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(f) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 332번째의 아미노산이 Thr인 아미노산 서열
(g) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(h) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(i) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(j) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(k) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(l) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(m) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(n) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(o) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Ala 또는 Gly, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(p) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met 또는 Leu인 아미노산 서열
(q) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp, 327번째의 아미노산이 Gly, 330번째의 아미노산이 Arg 및 396번째의 아미노산이 Met인 아미노산 서열
(r) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(s) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(t) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Pro, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(u) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu 및 271번째의 아미노산이 Gly인 아미노산 서열
(v) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 237번째의 아미노산이 Asp, 267번째의 아미노산이 Gly, 268번째의 아미노산이 Asp, 271번째의 아미노산이 Gly, 296번째의 아미노산이 Asp 및 330번째의 아미노산이 Arg인 아미노산 서열
(w) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly, 272번째의 아미노산이 Asp 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열
(x) Fc영역의 EU 넘버링 238번째의 아미노산이 Asp, 233번째의 아미노산이 Asp, 264번째의 아미노산이 Ile, 267번째의 아미노산이 Ala, 268번째의 아미노산이 Glu, 271번째의 아미노산이 Gly 및 296번째의 아미노산이 Asp인 아미노산 서열 - 서열번호 43~68, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 75~77로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역 개변체.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 2개 이상의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드로서, 당해 2개의 Fc영역 개변체가 회합되어 있는 폴리펩티드.
- 제12항에 있어서,
상기 폴리펩티드에 포함되는 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체가 동일한 아미노산 서열인 폴리펩티드. - 제12항에 있어서,
상기 폴리펩티드에 포함되는 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체가 상이한 아미노산 서열인 폴리펩티드. - 제14항에 있어서,
상기 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체의 아미노산 서열이 Fc영역 개변체의 EU 넘버링 235번째의 아미노산, 236번째의 아미노산, 237번째의 아미노산, 238번째의 아미노산 및 239번째의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산인 폴리펩티드. - 제15항에 있어서,
회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체 중 어느 한쪽의 아미노산 서열이 EU 넘버링 235번째의 아미노산이 Asp, Gln, Glu 또는 Thr, 236번째의 아미노산이 Asn, 237번째의 아미노산이 Phe 또는 Trp, 238번째의 아미노산이 Glu, Gly 또는 Asn 및 239번째의 아미노산이 Asp 또는 Glu로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 가지고 있는 아미노산 서열인 폴리펩티드. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인 폴리펩티드. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인 폴리펩티드. - 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물.
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