RU2820161C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ FcyRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ FcyRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820161C1 RU2820161C1 RU2020124366A RU2020124366A RU2820161C1 RU 2820161 C1 RU2820161 C1 RU 2820161C1 RU 2020124366 A RU2020124366 A RU 2020124366A RU 2020124366 A RU2020124366 A RU 2020124366A RU 2820161 C1 RU2820161 C1 RU 2820161C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- region
- asp
- igg antibody
- european numbering
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 243
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 claims abstract description 228
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 claims abstract description 228
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 859
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 215
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 215
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 215
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 210
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 103
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 claims description 96
- -1 Asp amino acids Chemical group 0.000 claims description 90
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 61
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 789
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 778
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 238
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 224
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 224
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 90
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 78
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 58
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 28
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 26
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 15
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 14
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 13
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 11
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 11
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 11
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 11
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 10
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 9
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 9
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 9
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 8
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 8
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 8
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 8
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 7
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 7
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 7
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 7
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 7
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 7
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 7
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 6
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 6
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 6
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 6
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 6
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 6
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 6
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 6
- 102100024568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Human genes 0.000 description 6
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 6
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 6
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 5
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 5
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 5
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 5
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 5
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 5
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 4
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 4
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102100020997 Fractalkine Human genes 0.000 description 4
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 4
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 4
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 description 4
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 4
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 4
- 101000597785 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Proteins 0.000 description 4
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 4
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 4
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 4
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 4
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 4
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 4
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 4
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 4
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 4
- 102100024584 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Human genes 0.000 description 4
- 102100024587 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Human genes 0.000 description 4
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 4
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 4
- 102100035284 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Human genes 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 101150026046 iga gene Proteins 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 4
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 3
- 102100022718 Atypical chemokine receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 3
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 3
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 3
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 3
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 3
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 3
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100037354 Ectodysplasin-A Human genes 0.000 description 3
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100035379 Growth/differentiation factor 5 Human genes 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 101000678892 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 101000880080 Homo sapiens Ectodysplasin-A Proteins 0.000 description 3
- 101000854520 Homo sapiens Fractalkine Proteins 0.000 description 3
- 101000764294 Homo sapiens Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 3
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000830596 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Proteins 0.000 description 3
- 101000764263 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 3
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 3
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 3
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 3
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 3
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 3
- 102100032817 Integrin alpha-5 Human genes 0.000 description 3
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 101000844802 Lacticaseibacillus rhamnosus Teichoic acid D-alanyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 3
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 3
- 101710097155 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Proteins 0.000 description 3
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 3
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 3
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 3
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 3
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 3
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 3
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 description 3
- 102100033760 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19 Human genes 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N (e)-n-[(4r,4as,7ar,12br)-3-(cyclopropylmethyl)-9-hydroxy-7-oxo-2,4,5,6,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a-yl]-3-(4-methylphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1\C=C\C(=O)N[C@]1(CCC(=O)[C@@H]2O3)[C@H]4CC5=CC=C(O)C3=C5[C@]12CCN4CC1CC1 PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N 0.000 description 2
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 2
- 108050009514 Antigen peptide transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N Artemin Chemical compound C1CC2(C)C(O)CCC(=C)C2(O)C2C1C(C)C(=O)O2 CJLHTKGWEUGORV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100023701 C-C motif chemokine 18 Human genes 0.000 description 2
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100021936 C-C motif chemokine 27 Human genes 0.000 description 2
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 description 2
- 102100025277 C-X-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 2
- 102100036153 C-X-C motif chemokine 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 description 2
- 108010040471 CC Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000001902 CC Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100024940 Cathepsin K Human genes 0.000 description 2
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 2
- 102100035294 Chemokine XC receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 2
- 102100025680 Complement decay-accelerating factor Human genes 0.000 description 2
- 102100032768 Complement receptor type 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 2
- 108010009900 Endothelial Protein C Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000009839 Endothelial Protein C Receptor Human genes 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100028461 Frizzled-9 Human genes 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010090254 Growth Differentiation Factor 5 Proteins 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 2
- 102100040896 Growth/differentiation factor 15 Human genes 0.000 description 2
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000777558 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000978371 Homo sapiens C-C motif chemokine 18 Proteins 0.000 description 2
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000797758 Homo sapiens C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 2
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000858064 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000804783 Homo sapiens Chemokine XC receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000856022 Homo sapiens Complement decay-accelerating factor Proteins 0.000 description 2
- 101000941929 Homo sapiens Complement receptor type 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000777461 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Proteins 0.000 description 2
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 2
- 101001061405 Homo sapiens Frizzled-9 Proteins 0.000 description 2
- 101000876511 Homo sapiens General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPD Proteins 0.000 description 2
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000582950 Homo sapiens Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000650117 Homo sapiens Protein Wnt-9a Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 2
- 101000716124 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1c Proteins 0.000 description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- 101000851434 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 101000597779 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 description 2
- 101000638255 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000795167 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 101000648507 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 description 2
- 101000801254 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Proteins 0.000 description 2
- 101000801227 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19 Proteins 0.000 description 2
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 2
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 101000679921 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Proteins 0.000 description 2
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 2
- 108010041014 Integrin alpha5 Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100032999 Integrin beta-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 2
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 2
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 2
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 102100032543 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase and dual-specificity protein phosphatase PTEN Human genes 0.000 description 2
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 2
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100022661 Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform Human genes 0.000 description 2
- 102100027503 Protein Wnt-9a Human genes 0.000 description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 108010038036 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000010498 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 2
- 102100025131 T-cell differentiation antigen CD6 Human genes 0.000 description 2
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 2
- 102100024219 T-cell surface glycoprotein CD1a Human genes 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100030859 Tissue factor Human genes 0.000 description 2
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 101710097161 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 description 2
- 102100024585 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13 Human genes 0.000 description 2
- 101710181056 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 102100024586 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 14 Human genes 0.000 description 2
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 description 2
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100029675 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Human genes 0.000 description 2
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 2
- 102100022205 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Human genes 0.000 description 2
- 102100022156 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N chlorotrianisene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)=C(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=C(OC)C=C1 BFPSDSIWYFKGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- ARLKVQYMFRECLV-JSGCOSHPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanamide Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)=CNC2=C1 ARLKVQYMFRECLV-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N (E,Z)-(1R,2R,3R,5S)-7-(3,5-Dihydroxy-2-((3S)-(3-hydroxy-1-octenyl))cyclopentyl)-5-heptenoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N 0.000 description 1
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100021834 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- AVPYQKSLYISFPO-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzaldehyde Chemical compound ClC1=CC=C(C=O)C=C1 AVPYQKSLYISFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- KFGOFTHODYBSGM-IJCBKZNRSA-N 6-Keto-prostaglandin F1a Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1CC(=O)CCCCC(O)=O KFGOFTHODYBSGM-IJCBKZNRSA-N 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- ZKRFOXLVOKTUTA-KQYNXXCUSA-N 9-(5-phosphoribofuranosyl)-6-mercaptopurine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=S)=C2N=C1 ZKRFOXLVOKTUTA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100027400 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4 Human genes 0.000 description 1
- 108091022885 ADAM Proteins 0.000 description 1
- 102000029791 ADAM Human genes 0.000 description 1
- 108091007504 ADAM10 Proteins 0.000 description 1
- 108091007507 ADAM12 Proteins 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 108091022879 ADAMTS Proteins 0.000 description 1
- 102000029750 ADAMTS Human genes 0.000 description 1
- 108091005664 ADAMTS4 Proteins 0.000 description 1
- 102000051389 ADAMTS5 Human genes 0.000 description 1
- 108091005663 ADAMTS5 Proteins 0.000 description 1
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 1
- 101100192359 Acinetobacter johnsonii ptk gene Proteins 0.000 description 1
- 108010075348 Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 102100034111 Activin receptor type-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 1
- 101710173011 Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 102100034135 Activin receptor type-1C Human genes 0.000 description 1
- 101710173005 Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033346 Adenosine receptor A1 Human genes 0.000 description 1
- 101710128948 Adenosine receptor A1 Proteins 0.000 description 1
- 108010054404 Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100024439 Adhesion G protein-coupled receptor A2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026423 Adhesion G protein-coupled receptor E5 Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100025677 Alkaline phosphatase, germ cell type Human genes 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100036523 Anoctamin-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100031323 Anthrax toxin receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 108010062544 Apoptotic Protease-Activating Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034524 Apoptotic protease-activating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026376 Artemin Human genes 0.000 description 1
- 101710205806 Artemin Proteins 0.000 description 1
- 101000605172 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) Probable endopolygalacturonase E Proteins 0.000 description 1
- 101000605171 Aspergillus niger Endopolygalacturonase E Proteins 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710187595 B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101150033765 BAG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100021676 Baculoviral IAP repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028239 Basal cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010064528 Basigin Proteins 0.000 description 1
- 102000015279 Basigin Human genes 0.000 description 1
- 102100032412 Basigin Human genes 0.000 description 1
- 102100031109 Beta-catenin-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710164563 Beta-catenin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012492 Biacore method Methods 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100025423 Bone morphogenetic protein receptor type-1A Human genes 0.000 description 1
- 101710120270 Bone morphogenetic protein receptor type-1A Proteins 0.000 description 1
- 101710120271 Bone morphogenetic protein receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 102100025422 Bone morphogenetic protein receptor type-2 Human genes 0.000 description 1
- 108050008407 Bone morphogenetic protein receptor type-2 Proteins 0.000 description 1
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 description 1
- 101000941281 Bos taurus Gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 108050005711 C Chemokine Proteins 0.000 description 1
- 102000017483 C chemokine Human genes 0.000 description 1
- 102100031172 C-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710149814 C-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031151 C-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710149815 C-C chemokine receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100025074 C-C chemokine receptor-like 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 1
- 102100023705 C-C motif chemokine 14 Human genes 0.000 description 1
- 102100023703 C-C motif chemokine 15 Human genes 0.000 description 1
- 102100023700 C-C motif chemokine 16 Human genes 0.000 description 1
- 102100023698 C-C motif chemokine 17 Human genes 0.000 description 1
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 1
- 102100036848 C-C motif chemokine 20 Human genes 0.000 description 1
- 102100036846 C-C motif chemokine 21 Human genes 0.000 description 1
- 102100036850 C-C motif chemokine 23 Human genes 0.000 description 1
- 102100036849 C-C motif chemokine 24 Human genes 0.000 description 1
- 102100021933 C-C motif chemokine 25 Human genes 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 1
- 102100021942 C-C motif chemokine 28 Human genes 0.000 description 1
- 102100031092 C-C motif chemokine 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710155856 C-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100036166 C-X-C chemokine receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028989 C-X-C chemokine receptor type 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028990 C-X-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100031658 C-X-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100025618 C-X-C chemokine receptor type 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710098275 C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 1
- 101710098272 C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 1
- 102100025250 C-X-C motif chemokine 14 Human genes 0.000 description 1
- 102100039396 C-X-C motif chemokine 16 Human genes 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036189 C-X-C motif chemokine 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036150 C-X-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710085504 C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 1
- 101710085500 C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108091005932 CCKBR Proteins 0.000 description 1
- 101150049756 CCL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150011672 CCL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 102100036008 CD48 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108090000835 CX3C Chemokine Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010081635 CX3C Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004325 CX3C Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 102100039196 CX3C chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102100036364 Cadherin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036360 Cadherin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031077 Calcineurin B homologous protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102400000113 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100033040 Carbonic anhydrase 12 Human genes 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100028892 Cardiotrophin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 102000003902 Cathepsin C Human genes 0.000 description 1
- 108090000267 Cathepsin C Proteins 0.000 description 1
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 description 1
- 102000004178 Cathepsin E Human genes 0.000 description 1
- 108090000611 Cathepsin E Proteins 0.000 description 1
- 108090000619 Cathepsin H Proteins 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- 102400001321 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 102100026540 Cathepsin L2 Human genes 0.000 description 1
- 101710177066 Cathepsin O Proteins 0.000 description 1
- 108090000613 Cathepsin S Proteins 0.000 description 1
- 102100035654 Cathepsin S Human genes 0.000 description 1
- 102100026657 Cathepsin Z Human genes 0.000 description 1
- 108010061117 Cathepsin Z Proteins 0.000 description 1
- 101150075117 Ccl12 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010082548 Chemokine CCL11 Proteins 0.000 description 1
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 101100148273 Chlorobaculum tepidum (strain ATCC 49652 / DSM 12025 / NBRC 103806 / TLS) rub3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010038447 Chromogranin A Proteins 0.000 description 1
- 102000010792 Chromogranin A Human genes 0.000 description 1
- 108010038439 Chromogranin B Proteins 0.000 description 1
- 102000010791 Chromogranin B Human genes 0.000 description 1
- 101000862089 Clarkia lewisii Glucose-6-phosphate isomerase, cytosolic 1A Proteins 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027995 Collagenase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005238 Collagenase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010003384 Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004626 Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 1
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100030886 Complement receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102100035298 Cytokine SCM-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108010037897 DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin Proteins 0.000 description 1
- 101150082208 DIABLO gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100035619 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase Human genes 0.000 description 1
- 102100027700 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA2 Human genes 0.000 description 1
- 101100203200 Danio rerio shha gene Proteins 0.000 description 1
- 101100317380 Danio rerio wnt4a gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102100033189 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Human genes 0.000 description 1
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 102100029921 Dipeptidyl peptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710087078 Dipeptidyl peptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039673 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100031107 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710121366 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 102100031112 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 12 Human genes 0.000 description 1
- 102100031113 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 Human genes 0.000 description 1
- 102100024364 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100024361 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9 Human genes 0.000 description 1
- 101100347633 Drosophila melanogaster Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 101000968267 Drosophila melanogaster Protein dachsous Proteins 0.000 description 1
- 101000708615 Drosophila melanogaster Protein smoothened Proteins 0.000 description 1
- 101100386912 Drosophila melanogaster bel gene Proteins 0.000 description 1
- 101100261976 Drosophila melanogaster trk gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100037024 E3 ubiquitin-protein ligase XIAP Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010059397 ENA-VASP proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040897 Embryonic growth/differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 description 1
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 102100031983 Ephrin type-B receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100023721 Ephrin-B2 Human genes 0.000 description 1
- 108010044090 Ephrin-B2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100036725 Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710131668 Epithelial discoidin domain-containing receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 1
- 108010000196 Factor XIIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031734 Fibroblast growth factor 19 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100021259 Frizzled-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021261 Frizzled-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100021265 Frizzled-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039820 Frizzled-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039818 Frizzled-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100039799 Frizzled-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100039676 Frizzled-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100028466 Frizzled-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150022345 GAS6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000934641 Gallus gallus Bone morphogenetic protein receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 101100181195 Gallus gallus RPS6KA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710115997 Gamma-tubulin complex component 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100035184 General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPD Human genes 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090296 Growth Differentiation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010041834 Growth Differentiation Factor 15 Proteins 0.000 description 1
- 108010090293 Growth Differentiation Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004858 Growth differentiation factor-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090001086 Growth differentiation factor-9 Proteins 0.000 description 1
- 101710194460 Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 description 1
- 102100035364 Growth/differentiation factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710204282 Growth/differentiation factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100035368 Growth/differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710204281 Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100035363 Growth/differentiation factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710204283 Growth/differentiation factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 1
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000691214 Haloarcula marismortui (strain ATCC 43049 / DSM 3752 / JCM 8966 / VKM B-1809) 50S ribosomal protein L44e Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 description 1
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031465 Hepatocyte growth factor activator Human genes 0.000 description 1
- 101710085796 Hepatocyte growth factor activator Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 108010000487 High-Molecular-Weight Kininogen Proteins 0.000 description 1
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000799140 Homo sapiens Activin receptor type-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000833358 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor A2 Proteins 0.000 description 1
- 101000718243 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor E5 Proteins 0.000 description 1
- 101000574440 Homo sapiens Alkaline phosphatase, germ cell type Proteins 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000928362 Homo sapiens Anoctamin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000796095 Homo sapiens Anthrax toxin receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000615334 Homo sapiens Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000935638 Homo sapiens Basal cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 101000798441 Homo sapiens Basigin Proteins 0.000 description 1
- 101000740785 Homo sapiens Bone marrow stromal antigen 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766294 Homo sapiens Branched-chain-amino-acid aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000716068 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000716070 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000978379 Homo sapiens C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000978381 Homo sapiens C-C motif chemokine 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000978376 Homo sapiens C-C motif chemokine 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000978375 Homo sapiens C-C motif chemokine 16 Proteins 0.000 description 1
- 101000978362 Homo sapiens C-C motif chemokine 17 Proteins 0.000 description 1
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 1
- 101000713099 Homo sapiens C-C motif chemokine 20 Proteins 0.000 description 1
- 101000713085 Homo sapiens C-C motif chemokine 21 Proteins 0.000 description 1
- 101000713081 Homo sapiens C-C motif chemokine 23 Proteins 0.000 description 1
- 101000713078 Homo sapiens C-C motif chemokine 24 Proteins 0.000 description 1
- 101000897486 Homo sapiens C-C motif chemokine 25 Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101000897494 Homo sapiens C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 1
- 101000897477 Homo sapiens C-C motif chemokine 28 Proteins 0.000 description 1
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000946794 Homo sapiens C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000947174 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000916050 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000922405 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000856683 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000858060 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000858068 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000889133 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 16 Proteins 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000947193 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000947186 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000947177 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 1
- 101100165850 Homo sapiens CA9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000914211 Homo sapiens CASP8 and FADD-like apoptosis regulator Proteins 0.000 description 1
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000716130 Homo sapiens CD48 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000714537 Homo sapiens Cadherin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000714553 Homo sapiens Cadherin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000777270 Homo sapiens Calcineurin B homologous protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000867855 Homo sapiens Carbonic anhydrase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000761509 Homo sapiens Cathepsin K Proteins 0.000 description 1
- 101000983577 Homo sapiens Cathepsin L2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910979 Homo sapiens Cathepsin Z Proteins 0.000 description 1
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000856395 Homo sapiens Cullin-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000804771 Homo sapiens Cytokine SCM-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001137256 Homo sapiens DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase Proteins 0.000 description 1
- 101000650600 Homo sapiens DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA2 Proteins 0.000 description 1
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000777455 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 15 Proteins 0.000 description 1
- 101000832767 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000832769 Homo sapiens Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000622123 Homo sapiens E-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101001010541 Homo sapiens Electron transfer flavoprotein subunit alpha, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000884275 Homo sapiens Endosialin Proteins 0.000 description 1
- 101000978392 Homo sapiens Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 101100334515 Homo sapiens FCGR3A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334524 Homo sapiens FCGR3B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000846394 Homo sapiens Fibroblast growth factor 19 Proteins 0.000 description 1
- 101001060280 Homo sapiens Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000819438 Homo sapiens Frizzled-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000819451 Homo sapiens Frizzled-10 Proteins 0.000 description 1
- 101000819477 Homo sapiens Frizzled-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000819458 Homo sapiens Frizzled-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000885581 Homo sapiens Frizzled-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000885585 Homo sapiens Frizzled-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000885673 Homo sapiens Frizzled-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000885797 Homo sapiens Frizzled-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001061408 Homo sapiens Frizzled-8 Proteins 0.000 description 1
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 description 1
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001078133 Homo sapiens Integrin alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000994378 Homo sapiens Integrin alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000994369 Homo sapiens Integrin alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000994365 Homo sapiens Integrin alpha-6 Proteins 0.000 description 1
- 101001046677 Homo sapiens Integrin alpha-V Proteins 0.000 description 1
- 101000599858 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001055145 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000998120 Homo sapiens Interleukin-3 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000599056 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101001034314 Homo sapiens Lactadherin Proteins 0.000 description 1
- 101000605020 Homo sapiens Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000945751 Homo sapiens Leukocyte cell-derived chemotaxin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 1
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000804764 Homo sapiens Lymphotactin Proteins 0.000 description 1
- 101000764535 Homo sapiens Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001106413 Homo sapiens Macrophage-stimulating protein receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000694615 Homo sapiens Membrane primary amine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000616778 Homo sapiens Myelin-associated glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101100405240 Homo sapiens NRG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000613820 Homo sapiens Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000947178 Homo sapiens Platelet basic protein Proteins 0.000 description 1
- 101001071312 Homo sapiens Platelet glycoprotein IX Proteins 0.000 description 1
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001096065 Homo sapiens Plexin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001056707 Homo sapiens Proepiregulin Proteins 0.000 description 1
- 101000684208 Homo sapiens Prolyl endopeptidase FAP Proteins 0.000 description 1
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 description 1
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000831616 Homo sapiens Protachykinin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000814371 Homo sapiens Protein Wnt-10a Proteins 0.000 description 1
- 101000770799 Homo sapiens Protein Wnt-10b Proteins 0.000 description 1
- 101000781981 Homo sapiens Protein Wnt-11 Proteins 0.000 description 1
- 101000781950 Homo sapiens Protein Wnt-16 Proteins 0.000 description 1
- 101000804728 Homo sapiens Protein Wnt-2b Proteins 0.000 description 1
- 101000804792 Homo sapiens Protein Wnt-5a Proteins 0.000 description 1
- 101000804804 Homo sapiens Protein Wnt-5b Proteins 0.000 description 1
- 101000855002 Homo sapiens Protein Wnt-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000855004 Homo sapiens Protein Wnt-7a Proteins 0.000 description 1
- 101000814380 Homo sapiens Protein Wnt-7b Proteins 0.000 description 1
- 101000814350 Homo sapiens Protein Wnt-8a Proteins 0.000 description 1
- 101000650149 Homo sapiens Protein Wnt-8b Proteins 0.000 description 1
- 101000650119 Homo sapiens Protein Wnt-9b Proteins 0.000 description 1
- 101000781955 Homo sapiens Proto-oncogene Wnt-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000954762 Homo sapiens Proto-oncogene Wnt-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001099199 Homo sapiens RalA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000606506 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta Proteins 0.000 description 1
- 101001092206 Homo sapiens Replication protein A 32 kDa subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001133085 Homo sapiens Sialomucin core protein 24 Proteins 0.000 description 1
- 101000652846 Homo sapiens Single Ig IL-1-related receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000708614 Homo sapiens Smoothened homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000654356 Homo sapiens Sodium channel protein type 10 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000640020 Homo sapiens Sodium channel protein type 11 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000684826 Homo sapiens Sodium channel protein type 2 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000684820 Homo sapiens Sodium channel protein type 3 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000693993 Homo sapiens Sodium channel protein type 4 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000694017 Homo sapiens Sodium channel protein type 5 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000654381 Homo sapiens Sodium channel protein type 8 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000654386 Homo sapiens Sodium channel protein type 9 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 1
- 101000934376 Homo sapiens T-cell differentiation antigen CD6 Proteins 0.000 description 1
- 101000980827 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1a Proteins 0.000 description 1
- 101000716149 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1b Proteins 0.000 description 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101000712674 Homo sapiens TGF-beta receptor type-1 Proteins 0.000 description 1
- 101100369999 Homo sapiens TNFSF13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100207070 Homo sapiens TNFSF8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000834948 Homo sapiens Tomoregulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000830603 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000830598 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000830600 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000638161 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000798130 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Proteins 0.000 description 1
- 101000648505 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A Proteins 0.000 description 1
- 101000795169 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 1
- 101000801255 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Proteins 0.000 description 1
- 101000762805 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19L Proteins 0.000 description 1
- 101000679907 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 27 Proteins 0.000 description 1
- 101000679857 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000611185 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000920026 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member EDAR Proteins 0.000 description 1
- 101000984551 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Blk Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032819 Integrin alpha-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100032816 Integrin alpha-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 1
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000507 Integrin alpha2 Human genes 0.000 description 1
- 102000000510 Integrin alpha3 Human genes 0.000 description 1
- 108010041357 Integrin alpha3 Proteins 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000426 Integrin alpha6 Human genes 0.000 description 1
- 108010041100 Integrin alpha6 Proteins 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 1
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 1
- 102100033493 Interleukin-3 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100021596 Interleukin-31 Human genes 0.000 description 1
- 101710181613 Interleukin-31 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100037795 Interleukin-6 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108010018951 Interleukin-8B Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 101710115807 Kallikrein-11 Proteins 0.000 description 1
- 102100038318 Kallikrein-12 Human genes 0.000 description 1
- 101710115809 Kallikrein-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100038298 Kallikrein-14 Human genes 0.000 description 1
- 101710115806 Kallikrein-14 Proteins 0.000 description 1
- 102100038301 Kallikrein-15 Human genes 0.000 description 1
- 101710115873 Kallikrein-15 Proteins 0.000 description 1
- 102100038356 Kallikrein-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710176220 Kallikrein-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034868 Kallikrein-5 Human genes 0.000 description 1
- 101710176223 Kallikrein-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- 101710176224 Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100039648 Lactadherin Human genes 0.000 description 1
- 102100027000 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710178954 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023487 Lens fiber major intrinsic protein Human genes 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 102100034762 Leukocyte cell-derived chemotaxin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 1
- 101710089435 Lipopolysaccharide-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 1
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101710157723 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 1
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000034655 MIF Human genes 0.000 description 1
- 108060004872 MIF Proteins 0.000 description 1
- 102100027998 Macrophage metalloelastase Human genes 0.000 description 1
- 101710187853 Macrophage metalloelastase Proteins 0.000 description 1
- 102100021435 Macrophage-stimulating protein receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010076557 Matrix Metalloproteinase 14 Proteins 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 102100030216 Matrix metalloproteinase-14 Human genes 0.000 description 1
- 102100030201 Matrix metalloproteinase-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000560 Matrix metalloproteinase-15 Proteins 0.000 description 1
- 102100024129 Matrix metalloproteinase-24 Human genes 0.000 description 1
- 108050005214 Matrix metalloproteinase-24 Proteins 0.000 description 1
- 102100030412 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010060408 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027159 Membrane primary amine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101100366137 Mesembryanthemum crystallinum SODCC.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100025825 Methylated-DNA-protein-cysteine methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010047660 Mitochondrial intermediate peptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 101100165563 Mus musculus Bmp8a gene Proteins 0.000 description 1
- 101100437777 Mus musculus Bmpr1a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000713102 Mus musculus C-C motif chemokine 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100222387 Mus musculus Cxcl15 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175313 Mus musculus Gdf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100288960 Mus musculus Lefty1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153533 Mus musculus Ltbr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100239613 Mus musculus Myadm gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153523 Mus musculus Tnfrsf22 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153524 Mus musculus Tnfrsf23 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153526 Mus musculus Tnfrsf26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100207071 Mus musculus Tnfsf8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000866339 Mus musculus Transcription factor E2F6 Proteins 0.000 description 1
- 101100264116 Mus musculus Xcl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710190051 Muscle, skeletal receptor tyrosine protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100038168 Muscle, skeletal receptor tyrosine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100021831 Myelin-associated glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102400000054 Neuregulin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101800000673 Neuregulin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010006696 Neuronal Apoptosis-Inhibitory Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100030411 Neutrophil collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710118230 Neutrophil collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102100022397 Nitric oxide synthase, brain Human genes 0.000 description 1
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 1
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 1
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 102100031942 Oncostatin-M Human genes 0.000 description 1
- 102100040557 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 101150044441 PECAM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071808 PTHLH gene Proteins 0.000 description 1
- 101100096142 Panax ginseng SODCC gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004179 Plasminogen Activator Inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000614 Plasminogen Activator Inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100036851 Platelet glycoprotein IX Human genes 0.000 description 1
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100037891 Plexin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023715 Poly(A)-specific ribonuclease PARN Human genes 0.000 description 1
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 102100025974 Pro-cathepsin H Human genes 0.000 description 1
- 102100025498 Proepiregulin Human genes 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 1
- 108010005642 Properdin Proteins 0.000 description 1
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102100039461 Protein Wnt-10a Human genes 0.000 description 1
- 102100029062 Protein Wnt-10b Human genes 0.000 description 1
- 102100036567 Protein Wnt-11 Human genes 0.000 description 1
- 102100036587 Protein Wnt-16 Human genes 0.000 description 1
- 102100035289 Protein Wnt-2b Human genes 0.000 description 1
- 102100035331 Protein Wnt-5b Human genes 0.000 description 1
- 102100020732 Protein Wnt-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100020729 Protein Wnt-7a Human genes 0.000 description 1
- 102100039470 Protein Wnt-7b Human genes 0.000 description 1
- 102100039453 Protein Wnt-8a Human genes 0.000 description 1
- 102100027542 Protein Wnt-8b Human genes 0.000 description 1
- 102100027502 Protein Wnt-9b Human genes 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100036385 Protocadherin-12 Human genes 0.000 description 1
- 101710158929 Protocadherin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102100031269 Putative peripheral benzodiazepine receptor-related protein Human genes 0.000 description 1
- 108010052562 RELT Proteins 0.000 description 1
- 102000018795 RELT Human genes 0.000 description 1
- 102100038914 RalA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100517381 Rattus norvegicus Ntrk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039808 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta Human genes 0.000 description 1
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 description 1
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 description 1
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 description 1
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 101150110386 SLC2A4 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101001117144 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) [Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring)] kinase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 101100537955 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) trk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034201 Sclerostin Human genes 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 102100030053 Secreted frizzled-related protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108050007990 Secreted frizzled-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034136 Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Human genes 0.000 description 1
- 101710082813 Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100034258 Sialomucin core protein 24 Human genes 0.000 description 1
- 102000008115 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010074687 Signaling Lymphocytic Activation Molecule Family Member 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030929 Single Ig IL-1-related receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102100032799 Smoothened homolog Human genes 0.000 description 1
- 102100031374 Sodium channel protein type 10 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100033974 Sodium channel protein type 11 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100023150 Sodium channel protein type 2 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100023720 Sodium channel protein type 3 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100027195 Sodium channel protein type 4 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100027198 Sodium channel protein type 5 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100031371 Sodium channel protein type 8 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100031367 Sodium channel protein type 9 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102100039024 Sphingosine kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000879712 Streptomyces lividans Protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028848 Stromelysin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710108792 Stromelysin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100028847 Stromelysin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108050005271 Stromelysin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038836 Superoxide dismutase [Cu-Zn] Human genes 0.000 description 1
- 108090000058 Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100026087 Syndecan-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000068 Syndecan-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100026084 Syndecan-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010055215 Syndecan-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100037220 Syndecan-4 Human genes 0.000 description 1
- 101100342402 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) prk gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100033456 TGF-beta receptor type-1 Human genes 0.000 description 1
- 101150081494 TMPO gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034195 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102100026260 Titin Human genes 0.000 description 1
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100026160 Tomoregulin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108050003222 Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710166801 Translocator protein Proteins 0.000 description 1
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010065158 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Proteins 0.000 description 1
- 108090000138 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 15 Proteins 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100028786 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A Human genes 0.000 description 1
- 101710178300 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 1
- 101710187887 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19 Proteins 0.000 description 1
- 102100026716 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19L Human genes 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100022202 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 27 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100030810 Tumor necrosis factor receptor superfamily member EDAR Human genes 0.000 description 1
- 208000035896 Twin-reversed arterial perfusion sequence Diseases 0.000 description 1
- 208000006391 Type 1 Hyper-IgM Immunodeficiency Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100027053 Tyrosine-protein kinase Blk Human genes 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 101150010310 WNT-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150019524 WNT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038258 Wnt inhibitory factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710194167 Wnt inhibitory factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000052547 Wnt-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000052556 Wnt-2 Human genes 0.000 description 1
- 108700020986 Wnt-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000052549 Wnt-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000052548 Wnt-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700020984 Wnt-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000043366 Wnt-5a Human genes 0.000 description 1
- 102000044880 Wnt3A Human genes 0.000 description 1
- 108700013515 Wnt3A Proteins 0.000 description 1
- 108700031544 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Proteins 0.000 description 1
- 201000001696 X-linked hyper IgM syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100485099 Xenopus laevis wnt2b-b gene Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026497 Zinc finger protein 654 Human genes 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 1
- 108010023079 activin B Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc-(1->3)-D-Galp Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]3O)O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MXKCYTKUIDTFLY-ZNNSSXPHSA-N 0.000 description 1
- INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N aluminum;silicic acid;hydrate Chemical class O.[Al].[Al].O[Si](O)(O)O INJRKJPEYSAMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- DQEPMTIXHXSFOR-UHFFFAOYSA-N benzo[a]pyrene diol epoxide I Chemical compound C1=C2C(C3OC3C(C3O)O)=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 DQEPMTIXHXSFOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 1
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 108010041776 cardiotrophin 1 Proteins 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 108010027904 cartilage-derived-morphogenetic protein-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 108040004564 crotonyl-CoA reductase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101150007302 dntt gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026095 hyper-IgM syndrome type 1 Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000030582 inositol polyphosphate 5-phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108060004006 inositol polyphosphate 5-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040001304 interleukin-17 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000053460 interleukin-17 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040002014 interleukin-18 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008625 interleukin-18 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006849 interleukin-2 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108040001834 interleukin-20 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108040006859 interleukin-5 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 108010012808 leiomyoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 102000005861 leptin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010019813 leptin receptors Proteins 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N leukotriene B4 Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC(O)=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-N 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108040008770 methylated-DNA-[protein]-cysteine S-methyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 101150069922 mug gene Proteins 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- SVHOVVJFOWGYJO-UHFFFAOYSA-N pentabromophenol Chemical compound OC1=C(Br)C(Br)=C(Br)C(Br)=C1Br SVHOVVJFOWGYJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutanesulfonyl fluoride Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)S(F)(=O)=O LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N prostaglandin I2 Chemical compound O1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-OZUDYXHBSA-N 0.000 description 1
- UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N protopine Chemical compound C1=C2C(=O)CC3=CC=C4OCOC4=C3CN(C)CCC2=CC2=C1OCO2 GPTFURBXHJWNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 101150086350 rub gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 101150088976 shh gene Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 101150017120 sod gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- XNRNNGPBEPRNAR-JQBLCGNGSA-N thromboxane B2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1OC(O)C[C@H](O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XNRNNGPBEPRNAR-JQBLCGNGSA-N 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 102000009816 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040001269 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150068520 wnt3a gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения варианта Fc-области антитела IgG, имеющей улучшенную связывающую активность с FcγRIIb. Изобретение позволяет эффективно получать варианты Fc-области антитела IgG с улучшенной связывающей активностью с FcγRIIb. 4 з.п. ф-лы, 12 пр., 27 табл., 37 ил.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области антитела, в которые была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и), и которые, по сравнению с Fc-областью, не имеющей такой(их) аминокислотной(ых) модификации(й), обладают более высокой FcγRIIb-связывающей активностью и/или более высокой селективностью связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIa (типа R); и к полипептидам, содержащим указанные варианты Fc-области, а также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды.
Предшествующий уровень техники
Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в крови и имеют мало побочных эффектов (непатентные документы 1 и 2). В настоящее время почти все терапевтические антитела, имеющиеся в продаже, представляют собой человеческие антитела подкласса IgG1. Одной из известных функций антител класса IgG является антитело-зависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (далее называемая ADCC-активностью) (непатентный документ 3). В антителе, обладающим ADCC-активностью, Fc-область должна связываться с Fcγ-рецептором (далее обозначаемым FcγR), который представляет собой антитело-связывающий рецептор, присутствующий на поверхности эффекторных клеток, таких как клетки-киллеры, природные клетки-киллеры и активированные макрофаги.
Сообщалось, что человеческие изоформы FcγRIa (CD64A), FcγRIIa (CD32A), FcγRIIb (CD32B), FcγRIIIa (CD16A), FcγRIIIb (CD16B) представляют собой белки семейства FcγR, и были также описаны их соответствующие аллотипы (непатентный документ 7). FcγRIa, FcγRIIa и FcγRIIIa называются активирующими FcγR, поскольку они обладают иммонологически активными функциями, а FcγRIIb называется ингибирующим FcγR, поскольку он обладает иммуносупрессорными функциями (непатентный документ 8).
Было показано, что при связывании Fc-области с FcγR важную роль играют некоторые аминокислотные остатки, присутствующие в шарнирной области и в СН2-домене антитела, а также сахарная цепь, присоединенная к аминокислоте Asn в положении 297 (в соответствии с Европейской нумерацией), которая связана с СН2-доменом (непатентные документы 4, 5 и 6). Были проведены исследования различных вариантов, обладающих FcγR-связывающими свойствами, главным образом, антител с мутациями, введенными в их сайты, и были получены варианты Fc-области, обладающие более высокой активностью связывания с активирующим FcγR (патентные документы 1, 2, 3 и 4).
Если активирующий FcγR перекрестно связан с иммунным комплексом, то он фосфорилирует тирозиновые активирующие мотивы иммунорецептора (ITAM), содержащиеся во внутриклеточном домене, или общую γ-цепь FcR (партнера по связыванию); активирует SYK, осуществляющий передачу сигнала, и запускает воспалительный иммунный ответ посредством инициации каскада сигналов активации (непатентный документ 9).
FcγRIIb представляет собой FcγR, экспрессирующийся только на В-клетках (непатентный документ 10). Сообщалось, что взаимодействие Fc-области антитела с FcγRIIb приводит к подавлению первичного иммунного ответа В-клеток (непатентный документ 11). Кроме того, сообщалось, что если FcγRIIb, присутствующий на В-клетках, и В-клеточный рецептор (BCR) перекрестно связываются посредством иммунного комплекса в кровотоке, то наблюдается подавление активации В-клеток и подавление продуцирования антитела В-клетками (непатентный документ 12). Для такой передачи иммуносупрессорного сигнала, опосредуемого BCR и FcγRIIb, необходимо присутствие тирозинового ингибирующего мотива иммунорецептора (ITIM), содержащегося во внутриклеточном домене FcγRIIb (непатентные документы 13 и 14). При фосфорилировании ITIM после передачи сигнала происходит рекрутинг SH2-содержащей инозитполифосфат-5-фосфатазы (SHIP), ингибирование передачи других каскадов сигналов активирующего FcγR и подавление воспалительного иммунного ответа (непатентный документ 15). Кроме того, сообщалось, что агрегация лишь одного FcγRIIb приводит к временному подавлению притока кальция, обусловленного перекрестным связыванием BCR, и к пролиферации В-клеток по BCR-независимому механизму без индуцирования апоптоза IgM-продуцирующих В-клеток (непатентный документ 16).
Кроме того, FcγRIIb также экспрессируется на дендритных клетках, макрофагах, активированных нейтрофилах, тучных клетках и базофилах. FcγRIIb ингибирует функции активирующего FcγR, такие как фагоцитоз и высвобождение воспалительных цитокинов в этих клетках, и подавляет воспалительные иммунные ответы (непатентный документ 8).
Важная роль иммуносупрессорных функций FcγRIIb была выявлена в исследованиях, проводимых на FcγRIIb-дефицитных мышах (нокаут-мышах). Сообщалось, что у FcγRIIb-дефицитных мышей не наблюдается соответствующей регуляции гуморального иммунного ответа (непатентный документ 17), а также наблюдается повышенная чувствительность к индуцированному коллагеном артриту (CIA) (непатентный документ 18), наличие симптомов, напоминающих волчанку, и симптомов, напоминающих синдром Гудпасчера (непатентный документ 19).
Кроме того, сообщалось, что такая неадекватная регуляция FcγRIIb ассоциируется с развитием аутоиммунных заболеваний у человека. Так, например, сообщалось о наличии взаимосвязи между генетическим полиморфизмом в трансмембранной области и в промоторной области FcγRIIb и частотой развития системной красной волчанки (СКВ) (непатентные документы 20, 21, 22, 23 и 24), а также о снижении уровня экспрессии FcγRIIb на поверхности В-клеток у пациентов с СКВ (непатентные документы 25 и 26).
Исследования, проводимые на мышиных моделях, и клинические исследования показали, что FcγRIIb играет определенную роль в подавлении аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний посредством связывания с конкретными В-клетками, а поэтому такая молекула представляет особый интерес как мишень для подавления аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний.
Известно, что IgG1, используемый, главным образом, в качестве коммерчески доступного терапевтического антитела, связывается не только с FcγRIIb, но также обладает высокой активностью связывания с активирующим FcγR (непатентный документ 27). Поэтому, с использованием Fc-области, обладающей более высокой активностью связывания с FcγRIIb или более высокой селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активирующим FcγR, могут быть разработаны терапевтические антитела, обладающие более эффективными иммуносупрессорными свойствами по сравнению с IgG1. Так, например, было высказано предположение, что использование антитела, имеющего вариабельную область, которая связывается с BCR, и Fc-область, которая обладает повышенной способностью связываться с FcγRIIb, дает возможность ингибировать активацию В-клеток (непатентный документ 28). Сообщалось, что перекрестное связывание FcγRIIb на В-клетках и IgE, связанного с В-клеточным рецептором, приводило к подавлению дифференцировки В-клеток в клетки плазмы, что, в свою очередь, приводило к подавлению продуцирования IgE, а у мышей, которым были трансплантированы человеческие МКПК, концентрации человеческого IgG и IgM сохранялись, тогда как концентрация человеческого IgE снижалась (непатентный документ 29). Сообщалось, что если FcγRIIb и CD79b, которые представляют собой молекулы-компоненты комплекса В-клеточного рецептора, перекрестно связываются не только с IgE, но с другим антителом, то пролиферация В-клеток подавляется in vitro, и при этом может наблюдаться ослабление симптомов артрита у модели с артритом, индуцированным коллагеном (непатентный документ 30).
Сообщалось, что перекрестное связывание FcεRI и FcγRIIb не только на В-клетках, но и на тучных клетках, посредством молекул, в которых Fc-часть IgG, обладающего повышенной активностью связывания с FcγRIIb, присоединена к Fc-части IgE, связывающейся с рецептором FcεRI IgE, приводит к фосфорилированию FcγRIIb и тем самым к подавлению FcεRI-зависимого притока кальция. Это дает основание предположить, что ингибирование дегрануляции посредством стимуляции FcγRIIb может быть обусловлено повышением активности связывания с FcγRIIb (непатентный документ 31).
В соответствии с этим было высказано предположение, что антитело, имеющие Fc с повышенной активностью связывания с FcγRIIb, может представлять особый интерес как терапевтическое средство для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания.
Кроме того, сообщалось, что активация макрофагов и дендритных клеток посредством Toll-подобного рецептора 4, обусловленная стимуляцией ЛПС, подавляется в присутствии иммунного комплекса «антитело-антиген», и, предполагается, что такой эффект также обусловлен действием иммунного комплекса, опосредуемым FcγRIIb (непатентные документы 32 и 33). Поэтому ожидается, что использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb позволит усиливать подавление активации сигнала, опосредуемого TLR, и, таким образом, можно предположить, что такие антитела представляют особый интерес как терапевтические средства для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания.
Кроме того, было высказано предположение, что мутанты с повышенной активностью связывания с FcγRIIb представляют особый интерес как терапевтические средства для лечения рака, а также как терапевтические средства для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания. Было обнаружено, что FcγRIIb играет важную роль в агонистической активности антител-агонистов против суперсемейства рецепторов TNF. В частности, было высказано предположение, что взаимодействие с FcγRIIb необходимо для агонистической активности антител против CD40, DR4, DR5, CD30 и CD137, которые принадлежат к семейству рецепторов TNF (непатентные документы 34, 35, 36, 37, 38, 39 и 40). В непатентном документе 34 описано использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb в целях усиления противоопухолевого эффекта анти-CD40 антител. В соответствии с этим, можно предположить, что антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIb обладают действием, направленным на повышение агонистической активности антител-агонистов, включая антитела против суперсемейства рецепторов TNF.
Кроме того, было показано, что пролиферация клеток может быть ингибирована с использованием антитела, которое распознает Kit, то есть тирозинкиназный рецептор (RTK), и перекрестие связывается с FcγRIIb на Kit-экспрессирующих клетках. Аналогичные эффекты наблюдались даже в тех случаях, когда этот рецептор Kit является конститутивно активированным и имеет мутации, приводящие к онкогенезу (непатентный документ 41). Поэтому предполагается, что использование антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb будет приводить к усилению ингибирующего действия на клетки, экспрессирующие RTK, имеющий конститутивно активированные мутации.
Имеются также данные об антителах, содержащих Fc с повышенной активностью связывания с FcγRIIb (непатентный документ 28). В этом документе FcγRIIb-связывающая активность была усилена путем введения модификаций, таких как S267E/L328F, G236D/S267E и S239D/S267E, в Fc-область антитела. Из этих антител, антитело, в которое была введена мутация S267E/L328F, исключительно сильно связывалось с FcγRIIb и сохраняло на том же уровне свою способность связываться с FcγRIa и FcγRIIa типа Н, где остаток в положении 131 FcγRIIa представляет собой His, соответствующий остатку природного IgG1. Однако в другой работе показано, что при введении такой модификации уровень связывания антитела с FcγRIIa типа R, где остатком в положении 131 FcγRIIa является His, в несколько сотен раз выше, чем уровень связывания этого антитела с FcγRIIb, что означает, что его селективность связывания с FcγRIIb не отличается от селективности связывания с FcγRIIa типа R (патентный документ 5).
Считается, что на клетки, такие как тромбоциты, которые экспрессируют FcγRIIa, но не экспрессируют FcγRIIb, влияет только эффект усиления связывания с FcγRIIa, но не эффект усиления связывания с FcγRIIb (непатентный документ 8). Так, например, известно, что у группы пациентов, которым вводили бевацизумаб, то есть антитело против VEGF, наблюдался повышенный риск развития тромбоэмболии (непатентный документ 42). Кроме того, аналогичным образом, тромбоэмболия наблюдалась в клинических испытаниях на образование антител против лиганда CD40, а поэтому такое клиническое испытание было прервано (непатентный документ 43). В результате последних исследований, проводимых на животных-моделях с использованием этих антител, было высказано предположение, что вводимые антитела способствуют агрегации тромбоцитов посредством связывания с FcγRIIa на тромбоцитах и образуют кровяные сгустки (непатентные документы 44 и 45). В случае системной красной волчанки, которая является аутоиммунным заболеванием, тромбоциты активируются по FcγRIIa-зависимому механизму, и сообщалось, что такая активация тромбоцитов коррелирует с тяжестью симптомов (непатентный документ 46). Введение антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIa таким пациентам с высоким риском развития тромбоэмболии приводит к повышению риска развития тромбоэмболии и, таким образом, представляет исключительную опасность для пациента.
Кроме того, сообщалось, что антитела с повышенной активностью связывания с FcγRIIa усиливают опосредуемый макрофагами антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) (непатентный документ 47). Если антигены, связанные с антителами, подвергаются фагоцитозу под действием макрофагов, то считается, что сами эти антитела также одновременно подвергаются фагоцитозу. Если антитела вводят в качестве фармацевтических средств, то предполагается, что пептидные фрагменты, происходящие от вводимых антител, также присутствуют в качестве антигена, что тем самым повышает риск продуцирования антител против терапевтических антител (антитерапевтические антитела). Более конкретно, при повышении активности связывания с FcγRIIa повышается риск продуцирования антител против терапевтических антител, что значительно снижает ценность этих антител как фармацевтических средств. Кроме того, было высказано предположение, что FcγRIIb на дендритных клетках вносит свой вклад в периферическую толерантность посредством ингибирования активации дендритных клеток, вызываемой иммунными комплексами, образованными между антигенами и антителами, или посредством супрессии презентации антигена Т-клеткам посредством активирующих Fcγ-рецепторов (непатентный документ 48). Поскольку FcγRIIa также экспрессируется на дендритных клетках, то в случае использования антител, имеющих Fc с повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, в качестве фармацевтических средств презентация антигенов этими дендритными клетками становится маловероятной, и вследствие повышения селективности связывания с FcγRIIb риск продуцирования антитела против лекарственного средства может быть относительно снижен. А поэтому, такие антитела также могут представлять определенную ценность.
Более конкретно, при повышении активности связывания с FcγRIIa, ценность антител как фармацевтических средств значительно снижается, что приводит к повышению риска образования тромбов в результате агрегации тромбоцитов и к повышению риска продуцирования антител против терапевтических средств из-за повышенной иммуногенности.
С этой точки зрения, вышеупомянутый Fc-вариант с повышенной активностью связывания с FcγRIIb обладает значительно более высокой активностью связывания с FcγRIIa типа R по сравнению с природным IgG1. Поэтому его ценность как фармацевтического средства для пациентов, имеющих FcγRIIa типа R, значительно снижается. FcγRIIa типа Н и R встречается у людей индоевропейской расы и у афроамериканцев приблизительно с одинаковой частотой (непатентные документы 49 и 50). Поэтому, если такой Fc-вариант используется для лечения аутоиммунных заболеваний, то число пациентов, у которых может наблюдаться безопасный и благоприятный эффект от введения этого фармацевтического средства, ограничено.
Кроме того, сообщалось, что дендритные клетки, дефицитные по FcγRIIb, или дендритные клетки, в которых взаимодействие между FcγRIIb и Fc-частью антитела ингибируются анти-FcγRIIb антителом, способны к созреванию (непатентные документы 51 и 52). Эти данные позволяют предположить, в дендритных клетках в стабильном состоянии не наблюдаются воспаление и активация, а поэтому предполагается, что FcγRIIb активно подавляет созревание дендритных клеток. FcγRIIa, помимо FcγRIIb, экспрессируются на поверхности дендритных клеток, поэтому, даже при повышении активности связывания с ингибирующим FcγRIIb, а также при повышении активности связывания с активирующим FcγR, таким как FcγRIIa, может происходить стимуляция созревания дендритных клеток. Более конкретно, повышение активности связывания не только FcγRIIb, но также и отношение активности связывания с FcγRIIb к активности связывания с FcγRIIa, рассматривается как важный фактор при получении антител, обладающих иммуносупрессорным действием.
Поэтому, при получении фармацевтических средств, обладающих иммуносупрессорным действием, опосредуемым связыванием с FcγRIIb, необходимо создать Fc-вариант, который будет обладать не только повышенной активностью связывания с FcγRIIb, но также и способностью связываться с FcγRIIa аллотипов типа Н и R, где такое связывание будет сохраняться на уровне, аналогичном уровню связывания природного IgG1, или на более низком уровне.
С другой стороны, сообщалось, что в некоторых случаях аминокислотные модификации могут быть введены в Fc-область для повышения селективности связывания с FcγRIIb (непатентный документ 53). Однако все варианты, которые якобы имеют повышенную селективность к FcγRIIb, как упоминается в этом документе, обладают более низкой способностью связываться с FcγRIIb по сравнению с природным IgG1. Поэтому считается, что фактически индуцирование этими вариантами иммуносупрессорной FcγRIIb-опосредуемой реакции, которая была бы более сильной, чем реакция под действием IgG1, представляет определенные трудности.
Кроме того, поскольку FcγRIIb играет важную роль в продуцировании вышеупомянутых антител-агонистов, то предполагается, что усиление их активности связывания будет приводить к усилению агонистической активности. Однако, при аналогичном усилении активности связывания с FcγRIIa, может наблюдаться непредусмотренная активность, такая как ADCC-активность и ADCP-активность, а поэтому могут возникать побочные эффекты. С этой точки зрения также предпочтительно, чтобы такая повышенная активность связывания с FcγRIIb была селективной.
Исходя из этих результатов, важно отметить, что при продуцировании терапевтических антител, используемых для лечения аутоиммунных заболеваний и рака с применением FcγRIIb, активность связывания с FcγRIIa обоих аллотипов сохранялась на том же уровне, как и для природного IgG, либо такая активность была более низкой, а активность связывания с FcγRIIb была более высокой. Однако, последовательность рецептора FcγRIIb во внеклеточной области на 93% идентична последовательности рецептора FcγRIIa, который является одним из активирующих FcγR, и такие последовательности по своей структуре являются почти аналогичными. Существуют аллотипы FcγRIIa типа Н и R, в которых аминокислотой в положении 131 является His (типа Н) или Arg (типа R), и реакции каждого из них с антителами отличаются друг от друга (непатентный документ 54). Поэтому проблема продуцирования варианта Fc-области, обладающего более высокой селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с селективностью связывания с FcγRIIa каждого аллотипа, заключается в трудности идентификации в высокой степени гомологичных последовательностей FcγRIIa и FcγRIIb. До сих пор, фактически, еще не получены варианты, обладающие достаточной активностью и селективностью связывания с FcγRIIb. В патентном документе 5 описаны варианты, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb, однако, степень такого повышения является низкой, а поэтому необходимо разработать варианты, которые обладали бы свойствами, аналогичными свойствам, описанным выше.
Документы предшествующего уровня техники
[Патентные документы]
[Патентный документ 1] WO 2000/42072
[Патентный документ 2] WO 2006/019447
[Патентный документ 3] WO 2004/99249
[Патентный документ 4] WO 2004/29207
[Патентный документ 5] US2009/0136485
[Непатентные документы]
[Непатентный документ 1] Nat Biotechnol, 23, 1073-1078, 2005
[Непатентный документ 2] Eur J Pharm Biopharm, 59 (3), 389-96, 2005
[Непатентный документ 3] Chem Immunol, 65, 88-110, 1997
[Непатентный документ 4] J Biol Chem, 276, 16478-16483, 2001
[Непатентный документ 5] Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993
[Непатентный документ 6] Immunology, 86, 319-324, 1995
[Непатентный документ 7] Immunol Lett, 82, 57-65, 2002
[Непатентный документ 8] Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010
[Непатентный документ 9] Nat Rev Immunol, 8, 34-47, 2008
[Непатентный документ 10] Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989
[Непатентный документ 11] J Exp Med 129, 1183-1201, 1969
[Непатентный документ 12] Immunol Lett 88, 157-161, 2003
[Непатентный документ 13] Science, 256, 1808-1812, 1992
[Непатентный документ 14] Nature, 368, 70-73, 1994
[Непатентный документ 15] Science, 290, 84-89, 2000
[Непатентный документ 16] J Imunol, 181, 5350-5359, 2008
[Непатентный документ 17] J Immunol, 163, 618-622, 1999
[Непатентный документ 18] J Exp Med, 189, 187-194, 1999
[Непатентный документ 19] J Exp Med, 191, 899-906, 2000
[Непатентный документ 20] Hum, Genet, 117, 220-227, 2005
[Непатентный документ 21] J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007
[Непатентный документ 22] Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006
[Непатентный документ 23] Nat Med, 11, 1056-1058, 2005
[Непатентный документ 24] J Immunol, 176, 5321-5328, 2006
[Непатентный документ 25] J. Exp Med, 203, 2157-2164, 2006
[Непатентный документ 26] J Immunol 178, 3272-3280, 2007
[Непатентный документ 27] Blood, 113, 3716-3725, 2009
[Непатентный документ 28] Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008
[Непатентный документ 29] J Allergy Clin Immunol, 2012, 129: 1102-1115
[Непатентный документ 30] Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010
[Непатентный документ 31] Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008)
[Непатентный документ 32] J. Immunol, 2009, 183: 4509-4520
[Непатентный документ 33] J. Immunol, 2009, 182: 554-562
[Непатентный документ 34] Science, 333, 1030-1034, 2011
[Непатентный документ 35] Cancer Cell 19, 101-113, 2011
[Непатентный документ 36] J Clin Invest, 122 (3), 1066-1075, 2012
[Непатентный документ 37] J Immunol 171, 562-, 2003
[Непатентный документ 38] Blood, 108, 705-, 2006
[Непатентный документ 39] J Immunol 166, 4891, 2001
[Непатентный документ 40] doi: 10.1073/pnas.1208698109
[Непатентный документ 41] Immunol let, 2002, 143: 28-33
[Непатентный документ 42] J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007
[Непатентный документ 43] Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003
[Непатентный документ 44] J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008
[Непатентный документ 45] J Immunol, 185, 1577-1583, 2010
[Непатентный документ 46] Sci Transl Med, vol 2, issue 47, 47-63, 2010
[Непатентный документ 47] Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008
[Непатентный документ 48] J. Immunol, 2007, 178: 6217-6226
[Непатентный документ 49] J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996
[Непатентный документ 50] Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998
[Непатентный документ 51] J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005
[Непатентный документ 52] Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005
[Непатентный документ 53] Mol Immunol, 40, 585-593, 2003
[Непатентный документ 54] J Exp Med, 172, 19-25, 1990
Описание сущности изобретения
[Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения]
Настоящее изобретение было разработано с учетом вышеупомянутых факторов. Целью настоящего изобретения является получение варианта Fc-области путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область антитела, где указанный вариант обладает повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью с FcγRIIa (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была введена аминокислотная модификация; получение полипептида, содержащего вариант Fc-области; и получение фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид.
[Способ решения указанных проблем]
Авторами настоящего изобретения были проведены исследования, посвященные получению варианта Fc-области, обладающей повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (типа R), в отличие от немодифицированной Fc-области, путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область, и получению полипептида, содержащего указанный вариант Fc-области. В результате, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что активность связывания с FcγRIIb и/или селективность связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью связывания с FcγRIIa (R-типа) может быть повышена путем объединения варианта Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области была заменена другой(ими) аминокислотой(ами).
Более конкретно, настоящее изобретение относится:
[1] к варианту Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией и по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 233, 234, 235, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 в соответствии с Европейской нумерацией, заменены другими аминокислотами, где активность связывания варианта с Fcγ-рецепторами [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 15,0 или более;
[2] к варианту Fc-области [1], где аминокислоты в положениях 238, 268 и 271 в соответствии с Европейской нумерацией заменены другими аминокислотами, и где, кроме того, по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 в соответствии с Европейской нумерацией, заменена другими аминокислотами;
[3] к варианту Fc-области, в котором аминокислота в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией представляет собой Asp, и который содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, состоящей из аминокислоты Asp в положении 233, аминокислоты Tyr в положении 234, аминокислоты Phe в положении 235, аминокислоты Asp в положении 237, аминокислоты Ile в положении 264, аминокислоты Glu в положении 265, аминокислот Phe, Leu или Met в положении 266, аминокислот Ala, Glu, Gly или Gln в положении 267, аминокислот Asp, Gln или Glu в положении 268, аминокислоты Asp в положении 269, аминокислоты Gly в положении 271, аминокислот Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro или Gln в положении 272, аминокислоты Gln в положении 274, аминокислот Asp или Phe в положении 296, аминокислот Ala или Asp в положении 326, аминокислоты Gly в положении 327, аминокислот Lys, Arg или Ser в положении 330, аминокислоты Ser в положении 331, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 332, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 333, аминокислот Arg, Ser или Thr в положении 334, аминокислот Ala или Gln в положении 355, аминокислоты Glu в положении 356, аминокислоты Met в положении 358, аминокислот Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении 396, аминокислоты Arg в положении 409 и аминокислоты Glu в положении 419, где активность связывания варианта с Fcγ-рецепторами [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 15,0 или более;
[4] к варианту Fc-области [3], где аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией, и где указанный вариант Fc-области также содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аминокислоты Asp в положении 233, аминокислоты Asp в положении 237, аминокислоты Ile в положении 264, аминокислоты Ala или Gly в положении 267, аминокислоты Asp или Pro в положении 272, аминокислоты Asp в положении 296, аминокислоты Gly в положении 327, аминокислоты Arg в положении 330, аминокислоты Thr в положении 332 и аминокислоты Leu или Met в положении 396;
[5] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[4], где величина [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 50,0 или более;
[6] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[4], где величина [величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была (были) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 100,0 или более;
[7] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[6], где величина [величина KD для FcγRIIa (R-типа) полипептида, содержащего вариант Fc-области]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 10,0 или более;
[8] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[6], где величина [величина KD для FcγRIIa (R-типа) полипептида, содержащего вариант Fc-области]/[величина KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области] имеет значение, равное 20,0 или более;
[9] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[8], где указанный вариант Fc-области содержит любую из нижеследующих групп аминокислотных модификаций (а)-(х), таких как:
(a) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(b) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(c) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(d) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(e) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 267. 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(f) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268. 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(g) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 327 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(h) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(i) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(j) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(k) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(l) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(m) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(n) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(о) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(р) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(q) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 327, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(r) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(s) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(t) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(u) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267. 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(v) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268. 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(w) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области; и
(х) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
[10] к варианту Fc-области по любому из п.п. [1]-[8], где указанный вариант Fc-области содержит любую из нижеследующих аминокислотных последовательностей (а)-(х), таких как:
(a) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Gly или Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, a аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(k) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(l) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(m) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(n) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(о) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(р) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(q) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met в соответствии с Европейской нумерацией;
(r) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, a аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(s) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(t) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, a аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(u) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(v) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Gly, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(w) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией; и
(х) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
[11] к варианту Fc-области, состоящему из любой аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 43-68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75-77;
[12] к полипептиду, содержащему по меньшей мере два варианта Fc-области по любому из п.п. [1]-[11], где указанные два варианта Fc-области являются связанными;
[13] к полипептиду по п. [12], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области в полипептиде являются одинаковыми;
[14] к полипептиду по п. [12], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области в полипептиде являются различными;
[15] к полипептиду по п. [14], где аминокислотные последовательности двух связанных вариантов Fc-области имеют отличающуюся(иеся) аминокислоту(ы) по меньшей мере в одном положении, выбранном из положений 235, 236, 237, 238 и 239 в соответствии с Европейской нумерацией в указанном варианте Fc-области;
[16] к полипептиду по п. [15], где одной из аминокислотных последовательностей двух связанных вариантов Fc-области является аминокислотная последовательность, содержащая по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аминокислот Asp, Gln, Glu или Thr в положении 235, аминокислоты Asn в положении 236, аминокислот Phe или Trp в положении 237, аминокислот Glu, Gly или Asn в положении 238 и аминокислот Asp или Glu в положении 239 в соответствии с Европейской нумерацией;
[17] к полипептиду по любому из п.п. [12]-[16], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является антитело IqG;
[18] к полипептиду по любому из п.п. [12]-[16], где полипептидом, содержащим вариант Fc-области, является молекула слитого Fc-белка; и
[19] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из п.п. [12]-[18].
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения активности связывания Fc-области с FcγRIIb и к повышению селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа) путем введения в Fc-область согласно изобретению аминокислотной(ых) модификации(й). Настоящее изобретение также относится к способу подавления продуцирования антител против полипептида, содержащего Fc-область, путем введения в Fc-область согласно изобретению аминокислотной(ых) модификации(й).
Настоящее изобретение также относится к терапевтическому или профилактическому средству для лечения иммунных воспалительных заболеваний, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный способ включает стадию введения индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического или профилактического средства для лечения иммунных воспалительных заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к ингибитору активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный ингибитор содержит полипептид согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к набору для его применения в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению для продуцирования ингибиторов активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе ингибирования активации В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов согласно изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения терапевтического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом белка, необходимого для организма.
Кроме того, настоящее изобретение относится к средству для подавления пролиферации вируса, где указанное средство содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу подавления пролиферации вируса, где указанный способ включает введение индивидууму полипептида согласно изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, применяемому в способе подавления пролиферации вируса, где указанный набор содержит полипептид согласно изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептида согласно изобретению в целях получения средства для подавления пролиферации вируса. Настоящее изобретение также относится к полипептиду согласно изобретению, применяемому в способе согласно изобретению для подавления пролиферации вируса.
[Эффекты настоящего изобретения]
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, которые, в отличие от немодифицированной Fc-области, обладают повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа). С использованием полипептидов, содержащих варианты Fc-области, могут быть усилены сигналы, ингибирующие воспалительные иммунные ответы, опосредуемые фосфорилированием ITIM FcγRIIb. Кроме того, благодаря сообщению Fc-области такого свойства, как селективное связывание с FcγRIIb, может быть ингибировано продуцирование антитела против лекарственного средства. Кроме того, с использованием вариантов Fc-области согласно изобретению в виде полипептида, обладающего активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН и содержащего антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьируется в зависимости от концентрации ионов, может быть стимулировано удаление полипептид-связывающих антигенов, которые присутствуют в плазме.
Краткое описание графического материала
На фиг.1 представлен график, на котором показаны результаты оценки агрегации тромбоцитов, вызываемой иммунным комплексом «омализумаб-G1d-3/IgE» в анализе на агрегацию тромбоцитов, проводимом с использованием тромбоцитов, выделенных у донора, имеющего полиморфизм FcγRIIa (R/H).
На фиг.2 представлен график, на котором показаны результаты оценки агрегации тромбоцитов, вызываемой иммунным комплексом «омализумаб-G1d-3/IgE» в анализе на агрегацию тромбоцитов, проводимом с использованием тромбоцитов, выделенных у донора, имеющего полиморфизм FcγRIIa (Н/Н).
На фиг.3 представлен график, на котором показаны результаты оценки экспрессии CD62p на промытой мембранной поверхности тромбоцитов. На залитой черным кривой показан результат, полученный при проведении реакции с PBS с последующей стимуляцией путем добавления ADP, а на незаштрихованной кривой показан результат, полученный при проведении реакции с иммунным комплексом с последующей ADP-стимуляцией.
На фиг.4 представлен график, на котором показаны результаты оценки экспрессии активного интегрина на промытой мембранной поверхности тромбоцитов. На залитой черным кривой показан результат, полученный при проведении реакции с PBS с последующей стимуляцией путем добавления ADP, а на незаштрихованной кривой показан результат, полученный при проведении реакции с иммунным комплексом с последующей ADP-стимуляцией.
На фиг.5 показан комплекс Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенный с помощью рентгеноструктурного анализа. Для СН2-домена и СН3-домена Fc-области, часть, показанная слева, определена как домен А, а часть, показанная справа, определена как домен В.
На фиг.6 проиллюстрировано сравнение, сделанное путем суперпозиции кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb и кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, (код PDB: 3RY6) для СН2-домена А Fc-области, где такое сравнение проводили методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Сα. На этой фигуре, структура комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb показана жирными линиями, а структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa показана тонкими линиями. Следует отметить, что структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa показана только для СН2-домена А Fc-части.
На фиг.7 детально представлена структура вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена А Fc-части, главная цепь которой образует водородную связь с Tyr в положении 160 FcγRIIb, как показал рентгеноструктурный кристаллографический анализ комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.8 представлена структура аминокислотных остатков вокруг боковой цепи Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена А Fc-части, главная цепь которой образует водородную связь с Tyr в положении 160 FcγRIIb, как показал рентгеноструктурный анализ комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.9 графически проиллюстрирована суперпозиция определенных с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, описанного в сравнительном примере 7, и комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb для СН2-домена В Fc-части, где такую суперпозицию осуществляли для сравнения области вокруг петли в положениях 266-271, соответствующих Европейской нумерации, с применением метода наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Сα. В этой петле вариант Fc(P208) имеет модификацию H268D в положении 268 (в соответствии с Европейской нумерацией) и модификацию P271G в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) по сравнению с вариантом Fc(P238D).
На фиг.10 представлена структура вокруг Ser239 СН2-домена В Fc-части вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.
На фиг.11 проиллюстрировано сравнение, сделанное путем суперпозиции трехмерной структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа и трехмерной структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, где такое сравнение было осуществлено методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Сα.
На фиг.12 проиллюстрировано сравнение кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, и кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене А Fc-части, вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.
На фиг.13 проиллюстрировано сравнение кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, и кристаллической структуры комплекса Fc(P208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, вокруг Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене В Fc-части, вместе с картой электронной плотности, полученной с помощью рентгеноструктурного анализа, в котором в качестве коэффициента был использован 2Fo-Fc.
На фиг.14 проиллюстрировано сравнение последовательностей константных областей G1d и G4d. На этой фигуре обведенные рамкой аминокислоты означают части, в которых аминокислотные остатки G1d и G4d отличаются друг от друга.
На фиг.15 представлены величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIb на горизонтальной оси и величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIaR на вертикальной оси. Модификации, показанные на этой фигуре, а именно, G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, Р238Е и P238D, означают модификации, введенные в GpH7-B3. A5/B3 означает GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, цепи которых не содержат каких-либо модификаций, а вариант, содержащий P238D только в одной цепи, обозначен GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0.
На фиг.16 представлены величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb на горизонтальной оси и величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на вертикальной оси. На этой фигуре IL6R-B3/IL6R-L и IL6R-G1d/IL6R-L означают антитела, имеющие нативные человеческие последовательности IgG, которые служат в качестве сравнительного контроля при оценке каждого из этих вариантов. IL6R-BP264/IL6R-L представляет собой исходный вариант, используемый для продуцирования каждого из вариантов. IL6R-BP404/IL6R-L представляет собой вариант, полученный путем введения модификации L234Y в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L и обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с вариантом IL6R-BP264/IL6R-L до введения в него указанной модификации.
На фиг.17 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIa и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.
На фиг.18 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIa Н-типа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.
На фиг.19 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIa R-типа и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.
На фиг.20 проиллюстрировано сравнение активности связывания с FcγRIIIa и с FcγRIIb. На этой фигуре отмечено связывание антитела, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Asp, и связывание антитела, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) был заменен остатком Glu. Термин «мутация А» означает мутацию, полученную путем замены остатка Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Asp, а термин «мутация В» означает мутацию, полученную путем замены остатка Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) остатком Glu.
На фиг.21 показано сходство между аминокислотными остатками, составляющими константные области IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 и пронумерованными в соответствии с Европейской нумерацией (соответствующей здесь индексу EU).
На фиг.22 представлен график, где на горизонтальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого PD-варианта с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого PD-варианта с FcγRIIa R-типа. Величину активности связывания каждого PD-варианта с каждым из FcγR делят на величину активности связывания IL6R-F652/IL6R-L, которое представляет собой контрольное антитело до введения модификации (модификации Fc с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) с каждым FcγR, и полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания каждого PD-варианта с каждым FcγR. На графике F652 представлена величина для IL6R-F652/IL6R-L.
На фиг.23 представлен график, где на вертикальной оси отложены относительные величины FcγRIIb-связывающей активности вариантов, полученных путем введения модификации в вариант GpH7-В3, который не имеет модификации P238D, а на горизонтальной оси отложены относительные величины FcγRIIb-связывающей активности вариантов, полученных путем введения модификации в вариант IL6R-F652, который имеет модификацию P238D. Величину активности связывания каждого варианта с FcγRIIb делят на величину активности связывания FcγRIIb с антителом до его модификации, а затем полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания. В данном случае область А содержит модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb в обоих случаях, где модификацию вводят в вариант GpH7-B3, который не имеет модификации P238D, и в IL6R-F652/IL6R-L, который имеет модификацию P238D. Область В содержит модификации, повышающие активность связывания с FcγRIIb, если данная модификации была введена в вариант GpH7-B3, который не имеет модификации P238D, но не повышающие активности связывания с FcγRIIb, если данная модификации была введена в вариант IL6R-F652, который имеет модификацию P238D.
На фиг.24 представлена кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.25 графически проиллюстрирована суперпозиция кристаллической структуры комплекса внеклеточной области Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуры-модели комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb на внеклеточную область FcγRIIb и СН2-домен А Fc, где указанную суперпозицию осуществляют методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Сα.
На фиг.26 проиллюстрировано детальное сравнение структуры вокруг замены P238D после суперпозиции кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуры-модели комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb только на СН2-домен А Fc или только на СН2-домен В Fc, где указанное сравнение проводят методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Сα.
На фиг.27 показано, что водородная связь присутствует между главной цепью Gly в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене А Fc и Tyr в положении 160 FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.28 показано, что электростатическое взаимодействие наблюдается между Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене В Fc и Arg в положении 131 FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточной области FcγRIIb.
На фиг.29 представлен график, где на горизонтальной оси отложены величины относительной активности связывания каждого варианта 2В с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта 2В с FcγRIIa R-типа. Величину активности связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR делят на величину активности связывания с контрольным антителом до модификации (модификации Fc с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) в каждом FcγR, и полученную величину умножают на 100, в результате чего получают величину относительной активности связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR.
На фиг.30 показаны Glu в положении 233 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи А Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.31 показаны Ala в положении 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи А Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг.32 проиллюстрировано сравнение структуры с Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи В Fc после суперпозиции кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb со структурой цепи В Fc, где указанное сравнение проводили методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Сα.
На фиг.33 проиллюстрировано изменение концентраций антигенсвязывающих молекул человеческого FcγRIIb в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1 или Fv4-Р587.
На фиг.34 проиллюстрировано изменение концентраций человеческого IL-6R или человеческого FcγRIIb в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1 или Fv4-Р587.
На фиг.35 проиллюстрирован неограничивающий механизм выведения растворимых антигенов из плазмы при введении антител, которые связываются с антигенами в зависимости от концентрации ионов, где указанные антитела обладают повышенной активностью связывания с FcγR при нейтральном рН по сравнению с активностью связывания известных нейтрализующих антител.
На фиг.36 проиллюстрировано изменение концентраций антигенсвязывающих молекул человеческого FcγRIIb и человеческого FcRn в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1, Fv4-P587 или Fv4-P587_LS.
На фиг.37 проиллюстрировано изменение концентраций человеческого IL-6R, человеческого FcγRIIb и человеческого FcRn в плазме трансгенных мышей после введения этим мышам Fv4-IgG1, Fv4-P587 или Fv4-P587_LS.
Способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, обладающему повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и/или селективностью связывания с FcγRIIa (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и); и к полипептиду, содержащему вариант Fc-области.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к варианту Fc-области, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет комбинацию аминокислотной замены в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) и другой(их) специфической(их) аминокислотной(ых) модификации(й); и к полипептиду, содержащему такой вариант Fc-области. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения активности связывания с FcγRIIb и/или селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от Fc-области, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и), где указанный способ включает введение аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область. Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования продуцирования антител против Fc-области путем введения аминокислотной(ых) модификации(й) в Fc-область и последующего введения такого варианта Fc-области в организм, причем такого ингибирования не происходит, если в Fc-область не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и).
Термин «полипептиды» согласно изобретению в общих чертах означает пептиды или белки, длина которых составляет приблизительно десять или более аминокислот. Кроме того, такие полипептиды могут быть получены от любых организмов без каких-либо ограничений, и такие полипептиды могут представлять собой, например, полипептиды, содержащие искусственно сконструированную последовательность. Кроме того, такими полипептидами могут быть природные полипептиды, синтетические полипептиды, рекомбинантные полипептиды или т.п.
Предпочтительными примерами полипептидов согласно изобретению являются антитела. Более предпочтительными примерами являются природные IgG, а в частности, природные человеческие IgG. Термин «природные (нативные) IgG» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает природный человеческий IgG1, природный человеческий IgG2, природный человеческий IgG3, природный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG.
Если константная область типа IgK (каппа-цепь, k-цепь), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6 и IgL7 (лямбда-цепь, λ-цепь) присутствует в константной области легкой цепи антитела, то она может представлять собой любую константную область легкой цепи. Для константной области человеческого IgK (каппа) и константной области человеческого IgL7 (лямбда), множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. Кроме того, в настоящем изобретении константной областью легкой цепи может быть константная область легкой цепи, в которую были введены аминокислотные замены, добавления, делеции, инсерции и/или модификации или т.п. В антителах, например, в антителах IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM имеются Fc-области. Так, например, Fc-областью антитела согласно изобретению может служить Fc-область человеческого антитела IgG, а предпочтительными являются Fc-области человеческого антитела IgG1. Fc-областями, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, например, Fc-области, происходящие от константных областей природного IgG, или, в частности, константных областей природного человеческого IgG1 (SEQ ID NO:11), константных областей природного человеческого IgG2 (SEQ ID NO:12), константных областей природного человеческого IgG3 (SEQ ID NO:13) и константных областей природного человеческого IgG4 (SEQ ID NO:14). На фиг.21 представлены последовательности константной области природных IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константными областями природных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG. Для константных областей человеческих антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, множество последовательностей аллотипов, образующихся в результате генетического полиморфизма, описаны в публикации NIH No.91-3242 «Sequences of proteins of immunological interest», и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении. В частности, аминокислотная последовательность человеческого IgG1 в положениях 356-358 (в соответствии с Европейской нумерацией) может представлять собой DEL или ЕЕМ.
Термин «Fcγ-рецепторы» (называемые здесь Fcγ-рецепторами, FcγR или FcgR) означает рецепторы, которые могут связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и, практически, означает любой член семейства белков, кодируемых генами Fcγ-рецептора. У человека это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы Н131 (Н-типа) и R131 (R-типа)), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIb-c; a также FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) и любые неограничивающие примеры человеческих изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Сообщалось, что FcγRIIb1 и FcγRIIb2 представляют собой варианты сплайсинга человеческого FcγRIIb. Кроме того, в литературе также описан вариант сплайсинга, обозначаемый FcγRIIb3 (J. Exp Med, 1989, 170: 1369). Человеческий FcγRIIb, помимо этих вариантов сплайсинга, включает все варианты сплайсинга, зарегистрированные в NCBI под номерами NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1 и NP_003992.3. Кроме того, человеческий FcγRIIb включает любой ранее описанный генетический полиморфизм, а также FcγRIIb (Arthritis Rheum., 2003, 48: 3242-52, Hum. Mol. Genet, 2005, 14: 2881-92, и Arthritis Rheum, 2002 May; 46(5): 1242-54) и каждый генетический полиморфизм, который будет описан в будущем.
Неограничивающими примерами FcγR являются человеческие, мышиные, крысиные, кроличьи и обезьяньи FcγR, а также FcγR, которые могут происходить от любого организма. Мышиными FcγR являются FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), и любые неограничивающие примеры мышиных изоформ или аллотипов FcγR, которые пока еще не были обнаружены. Предпочтительными примерами таких Fcγ-рецепторов являются человеческие FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIHA (CD16) и/или FcγRIIIB (CD16).
Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO:1 (NM_000566.3) и 2 (NP_000557.1), соответственно;
полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIA представлены в SEQ ID NO:3 (ВС020823.3) и 4 (ААН20823.4), соответственно;
полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIB представлены в SEQ ID NO:5 (ВС146678.1) и 6 (AAI46679.1), соответственно;
полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIA представлены в SEQ ID NO:7 (ВС033678.1) и 8 (ААН33678.1), соответственно; и
полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIB представлены в SEQ ID NO:9 (ВС128562.1) и 10 (AAI28563.1), соответственно (регистрационный номер RefSeq указан в скобках).
FcγRIIa имеет два аллотипа, в одном из которых аминокислотой в положении 131 является гистидин (Н-типа), а в другом эта аминокислота заменена аргинином (R-типа)(J. Ехр. Med, 172, 19-25, 1990).
В настоящем изобретении термин «Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и)» или аналогичный термин означает Fc-область до введения в нее аминокислотной(ых) модификации(й) согласно изобретению. В настоящем изобретении этот термин может означать, например, Fc-область нативного IgG или Fc-область IgG, полученную путем введения в нативный IgG модификации, не являющейся аминокислотной(ыми) модификацией(ями) согласно изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении термин «вариант Fc-области» означает Fc-область, в которой по меньшей мере одна аминокислота была заменена другой аминокислотой согласно изобретению без введения аминокислотной(ых) модификации(й) согласно изобретению. В настоящем изобретении Fc-область, в которой «по меньшей мере одна аминокислота была заменена другой аминокислотой», включает Fc-область, в которую была введена указанная аминокислотная модификация, и Fc-область, состоящую из той же самой аминокислотной последовательности.
Термин «природные IgG» означает полипептиды, принадлежащие к классу антител, обычно кодируемых генами гамма-иммуноглобулина и содержащих аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природных IgG. Так, например, термин «природный человеческий IgG» означает нативный человеческий IgG1, нативный человеческий IgG2, нативный человеческий IgG3, нативный человеческий IgG4 или т.п. Природными IgG также являются мутанты, спонтанно продуцируемые из этих IgG.
Термин «Fc-область нативного IgG» означает Fc-область, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, происходящей от природного IgG. Константная область тяжелой цепи нативного IgG представлена на фиг.21 (SEQ ID NO:11-14), и на этой фиг.21, например, показаны Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG1, Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG2, Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG3, и Fc-области в константной области тяжелой цепи, происходящей от нативного человеческого IgG4. Fc-областями нативных IgG также являются мутанты, спонтанно продуцированные из этих IgG.
В соответствии с настоящим изобретением, активность связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области или вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγR каждого типа, независимо от того является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена, например, путем мониторинга снижения или увеличения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсограммы, где различные FcγR, используемые в качестве аналита, подвергают взаимодействию с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка A/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п. с применением оборудования BIACORE, которое представляет собой анализатор взаимодействия, работающий на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР), как описано в примерах. Альтернативно, такая активность может быть определена путем мониторинга увеличения или уменьшения величины, полученной путем деления величины изменения резонансной единицы (RU) на сенсограмме до и после взаимодействия FcγR различных типов, используемых в качестве аналита, с антителами, иммобилизованными на сенсорных чипах или захваченными на сенсорных чипах посредством белка А, белка L, белка A/G, G-белка, антител против цепи лямбда, антител против цепи каппа, антигенных пептидов, антигенных белков или т.п., на величину изменения резонансных единиц (RU) до и после иммобилизации или захвата антител на сенсорном чипе. Кроме того, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величины константы диссоциации (KD), вычисленной по результатам анализа сенсограммы, где оцениваемый образец, такой как антитело, используемое в качестве аналита, подвергают взаимодействию на сенсорном чипе, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки. Альтернативно, активность может быть определена, например, путем мониторинга увеличения или уменьшения величин на сенсограмме до и после взаимодействия оцениваемого образца, такого как антитело, используемое в качестве аналита, с сенсорным чипом, на котором FcγR иммобилизован непосредственно или посредством антитела против метки.
В частности, активность связывания варианта Fc-области с Fcγ-рецептором может быть определена путем скрининга, проводимого посредством проксимального гомогенного анализа на активацию люминесценции (ALPHA), с применением метода BIACORE на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) или т.п., а также с помощью ELISA или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA-скрининг осуществляют с применением ALPHA-технологии, в которой используются две сферы, «донор» и «акцептор», и которая основана на нижеследующих принципах. Люминесцентные сигналы детектируются только в том случае, когда молекулы, связанные с донорными сферами, физически взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными сферами, и эти две сферы расположены в непосредственной близости друг к другу. Фотосенсибилизатор с лазерным излучением, присутствующий в донорных сферах, превращает кислород окружающей среды в синглетный кислород в возбужденном состоянии. Синглетный кислород диспергируется вокруг донорных сфер, и когда он достигает соседних акцепторных сфер, в этих сферах индуцируется хемилюминесцентная реакция, приводящая, в конечном счете, к излучению света. Если молекулы, связанные с донорными сферами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными сферами, то хемилюминесцентной реакции не происходит, поскольку синглетный кислород, продуцируемый донорными сферами, не достигает акцепторных сфер.
Так, например, биотинилированный полипептидный комплекс связывается с донорными сферами, а Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST), связывается с акцепторными сферами. В отсутствии конкурирующего полипептидного комплекса, содержащего вариант Fc-области, полипептидный комплекс, содержащий Fc-область дикого типа, взаимодействует с Fcγ-рецептором и продуцирует сигналы на длине волны 520-620 нм. Полипептидный комплекс, содержащий немеченую мутантную Fc-область, конкурирует с полипептидным комплексом, содержащим Fc-область дикого типа, за связывание с Fcγ-рецептором. Относительная активность связывания может быть определена путем количественной оценки снижения интенсивности флуоресценции, наблюдаемого после такого конкурентного связывания. Биотинилирование полипептидных комплексов, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п. хорошо известно специалистам. Экспрессию Fcγ-рецептора и GST в клетке, несущей слитый ген, продуцируемый путем присоединения полинуклеотида, кодирующего Fcγ-рецептор, с сохранением рамки считывания, к полинуклеотиду, кодирующему GST в экспрессионном векторе, и проведение очистки на колонке с глутатионом осуществляют методом мечения Fcγ-рецептора ферментом GST. Полученные сигналы, предпочтительно, анализируют, например, путем приведения их в соответствие с односайтовой моделью конкуренции посредством нелинейного регрессионного анализа с помощью компьютерной программы, такой как GRAPHPAD PRISM (GraphPad Inc., San Diego).
При наблюдении взаимодействия, одно из веществ (лиганд) иммобилизуют на тонкой золотой пленке на сенсорном чипе, после чего, при облучении светом с обратной стороны сенсорного чипа так, чтобы на границе между тонкой золотой пленкой и стеклом наблюдалось полное отражение, в части отраженного света образуется участок с пониженной интенсивностью отражения (ППР-сигнал). При наблюдении взаимодействия, в случае, если другое вещество (аналит) наносят на поверхность сенсорного чипа, и если лиганд связывается с аналитом, то масса иммобилизованной лигандной молекулы повышается, что приводит к изменению показателя преломления растворителя на поверхности сенсорного чипа. В результате такого изменения показателя преломления происходит сдвиг положения ППР-сигнала (с другой стороны, при диссоциации такого связывания, сигнал возвращается в свое первоначальное положение). Система Biacore регистрирует величину вышеупомянутого изменения или, более конкретно, изменение массы в зависимости от времени путем построения кривой изменения массы на поверхности сенсорного чипа, отложенной на ординате по данным измерения (сенсограммы). По этой сенсограмме определяют количество аналита, связанного с лигандом, захваченным на поверхности сенсорного чипа. Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации (ка) и константы скорости диссоциации (kd), определяют на кривых сенсограммы, а константы диссоциации (KD) определяют как отношение этих констант. В анализе BIACORE, предпочтительно, применяется метод оценки ингибирования. Пример такого метода оценки ингибирования описан в Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010.
Fc-область с пониженной активностью связывания с FcγR или полипептид, содержащий такую Fc-область, означают вариант Fc-области или полипептид, содержащий такой вариант Fc-области, который связывается с FcγR со значительно более низкой активностью связывания, чем полипептид, содержащий родительскую Fc-область; при этом анализы на такое снижение активности связывания осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и) (где указанный полипептид также называется полипептидом, содержащим родительские Fc-области, или родительским полипептидом), и полипептида, содержащего по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в Fc-области (где указанный полипептид также называется полипептидом, содержащим вариант Fc-области, или модифицированным полипептидом).
Кроме того, Fc-область с повышенной активностью связывания с FcγR или полипептид, содержащий такую Fc-область, означают вариант Fc-области или полипептид, содержащий такой вариант Fc-области, который связывается с FcγR со значительно более высокой активностью связывания, чем полипептид, содержащий родительскую Fc-область; при этом анализы на такое повышение активности связывания осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего родительскую Fc-область, и полипептида, содержащего вариант Fc-области.
Полипептид с постоянной активностью связывания с FcγR означает полипептид, который связывается с FcγR с активностью связывания, эквивалентной активности связывания родительского полипептида или по существу не отличающейся от активности связывания родительского полипептида; при этом анализы на такую постоянную активность осуществляют с использованием, в основном, одинаковых количеств полипептида, содержащего родительскую Fc-область, и полипептида, содержащего вариант Fc-области.
В настоящем изобретении повышенная активность связывания с FcγRIIb, предпочтительно, означает, например, активность, при которой отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего родительскую Fc-область, с FcγRIIb]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], измеренное с применением вышеупомянутого метода оценки, предпочтительно имеет значение, равное 15,0 или выше; 2 0,0 или выше; 2 5,0 или выше; 3 0,0 или выше; 35,0 или выше; 4 0,0 или выше; 4 5,0 или выше; 50,0 или выше; 55,0 или выше; 60,0 или выше; 65,0 или выше; 7 0,0 или выше; 7 5,0 или выше; 8 0,0 или выше; 8 5,0 или выше; 90,0 или выше; 95,0 или выше; или 10 0,0 или выше.
Кроме того, выражение «вариант Fc-области согласно изобретению обладает повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa» означает, что:
(i) активность связывания с FcγRIIb является повышенной, и активность связывания с FcγRIIa является постоянной или пониженной;
(ii) активность связывания с FcγRIIb является повышенной, и активность связывания с FcγRIIa также является повышенной, однако, степень повышения активности связывания с FcγRIIa ниже степени повышения активности связывания с FcγRIIb; или
(iii) активность связывания с FcγRIIb является пониженной, но степень снижения такой активности связывания ниже, чем степень снижения активности связывания с FcγRIIa. Независимо от того, имеет или не имеет вариант Fc-области согласно изобретению повышенную селективность связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIa, такая селективность связывания может быть определена, например, путем сравнения отношения величины KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIa к величине KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIb (величина KD для FcγRII а/величина KD для FcγRIIb), где такое отношение величины KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIa к величине KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, с FcγRIIb (величина KD для FcγRIIa/величина KD для FcγRIIb), определяют как описано в вышеупомянутых примерах. В частности, если величина отношения KD для полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, превышает величину отношения KD для полипептида, содержащего родительскую Fc-область, то полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, может быть определен как полипептид, обладающий повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область. В частности, поскольку активность связывания с FcγRIIa (R-типа), вероятно, коррелирует с активностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с FcγRIIa (Н-типа), то выбор аминокислотной(ых) модификации(й), которая(ые) может (могут) способствовать повышению селективности связывания с FcγRIIb, но не с FcγRIIa (R-типа), будет играть важную роль в повышении селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с селективностью связывания с другими FcγR, не являющимися FcγRIIb.
Селективность связывания FcγRIIa (R-типа) и FcγRIIb выражают, например, как отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIa (R-типа)]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], составляющее предпочтительно 10,0 или более, а более предпочтительно 2 0,0 или более, где указанную величину KD измеряют методом, описанном выше.
Селективность связывания FcγRIIa (Н-типа) и FcγRIIb выражают, например, как отношение величин KD [величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIa (Н-типа)]/[величина KD для связывания полипептида, содержащего вариант Fc-области, с FcγRIIb], составляющее предпочтительно 100 или более, 2 00 или более, 300 или более, 4 00 или более, 500 или более, а более предпочтительно 600 или более, 700 или более, 800 или более или 90 0 или более, где указанную величину KD измеряют методом, описанным выше.
Кроме того, активность связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, независимо от того, является ли она повышенной, постоянной или пониженной, может быть определена по увеличению или снижению активности связывания полипептидов согласно изобретению с различными FcγR, как описано выше в примерах. В настоящем изобретении активность связывания полипептидов с различными FcγR означает величину, полученную путем определения разности относительных величин (RU) на сенсограммах до и после взаимодействия различных FcγR, используемых в качестве аналита, с каждым полипептидом, и деления этой разности на разность величин RU на сенсограммах до и после захвата полипептидов на сенсорных чипах.
Неограничивающие варианты Fc-области согласно изобретению имеют величину KD (моль/л) для FcγRIIb, составляющую, например, 9×10-7 или менее, предпочтительно 5×10-7 или менее, более предпочтительно 3×10-7 или менее, еще более предпочтительно 1×10-7 или менее, а наиболее предпочтительно 5×10-8 или менее.
Термин «Fc-область» означает фрагмент, состоящий из шарнирной области или ее части, СН2-домена и СН3-домена, присутствующих в молекуле антитела. В соответствии с Европейской нумерацией (также называемой здесь EU-индексом) (см. фиг. 21), например, Fc-область класса IgG, означает, например, область, которая простирается от цистеина в положении 226 до С-конца или от пролина в положении 230 до С-конца, но не ограничивается этими областями.
Fc-область может быть получена, предпочтительно, путем повторного элюирования фракции, адсорбированной на колонке с белком А, после частичного гидролиза моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п.с использованием протеазы, такой как пепсин. Такой протеазой может быть любая протеаза, при условии, что она может гидролизовать полноразмерное антитело так, чтобы фрагменты Fab и F(ab')2 продуцировались посредством рестрикционного гидролиза в ферментативной реакции, осуществляемой при соответствующем рН, и посредством соответствующих ферментов, и примерами таких ферментов являются пепсин и папаин.
Настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, имеющим комбинацию модификаций, которые включают замену аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) другой аминокислотой и замену по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 2 33, 2 34, 235, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 (в соответствии с Европейской нумерацией), другой аминокислотой в Fc-области человеческого IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Путем объединения замены аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) с заменой по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 2 33, 2 34, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 (в соответствии с Европейской нумерацией), другой аминокислотой в Fc-области человеческого IgG, можно получить полипептид, содержащий вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa, а в частности, с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и). Другими аминокислотными модификациями, которые могут быть объединены с аминокислотной модификацией в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительно являются модификации в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296, 327, 330, 332, 333 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией), а в частности, модификации в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией). В частности, для повышения активности связывания с FcγRIIb или повышения селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa, предпочтительной комбинацией аминокислотных модификаций является комбинация модификаций в положениях аминокислот 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) с модификацией по меньшей мере одной аминокислоты в положениях, выбранных из положений 233, 237, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией).
Модифицированные аминокислоты не имеют конкретных ограничений, при условии, что эти аминокислоты будут способствовать повышению активности связывания с FcγRIIb или повышению селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa, по сравнению с активностью до их модификации, при этом предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 234 является Tyr, аминокислотой в положении 235 является Phe, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 265 является Glu, аминокислотой в положении 266 является Phe, Leu или Met, аминокислотой в положении 267 является Ala, Glu, Gly или Gln, аминокислотой в положении 268 является Asp, Gln или Glu, аминокислотой в положении 269 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro или Gln, аминокислотой в положении 274 является Gln, аминокислотой в положении 296 является Asp или Phe, аминокислотой в положении 326 является Ala или Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Lys, Arg или Ser, аминокислотой в положении 331 является Ser, аминокислотой в положении 332 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 333 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 334 является Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 355 является Ala или Gln, аминокислотой в положении 356 является Glu, аминокислотой в положении 358 является Met, аминокислотой в положении 396 является Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, аминокислотой в положении 4 09 является Arg, а аминокислотой в положении 419 является Glu в соответствии с Европейской нумерацией. В частности, при объединении модификаций аминокислот в положениях 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) с модификациями по меньшей мере одной аминокислоты в положениях, выбранных из положений 233, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp или Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, аминокислотой в положении 332 является Thr, а аминокислотой в положении 396 является Leu или Met в соответствии с Европейской нумерацией.
В соответствии с настоящим изобретением, помимо этих модификаций, в Fc-область может быть добавлена по меньшей мере одна другая модификация. Такая добавленная модификация не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет приводить к повышению активности связывания с FcγRIIb и/или селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa. Кроме того, модификации могут быть осуществлены путем введения совокупности модификаций, где часть Fc-области заменена соответствующей частью Fc-области другого изотипа. Так, например, активность связывания с FcγRIIb и/или селективность связывания с FcγRIIb может быть повышена путем объединения вышеупомянутых аминокислотных модификаций с заменой аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области, происходящей от IgG1, аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc-области, происходящей от IgG4. Конкретный пример включает комбинацию аминокислотных модификаций, вводимых в IL6R-BP230, и модификации, такой как замена аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Gld, аминокислотной последовательности, простирающейся от аминокислоты Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией) в G4d, как описано в примере 7 для IL6R-BP478/IL6R-L.
Из этих модификаций предпочтительными являются модификации, которые приводят к значительному повышению активности связывания с FcγRIIb или к значительному повышению селективности связывания
с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа). Примерами таких предпочтительных комбинаций аминокислотных модификаций являются нижеследующие модификации (а)-(х):
(a) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(b) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(c) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(d) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(e) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(f) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(g) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 327 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(h) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(i) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(j) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(k) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(l) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(m) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(n) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(о) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(р) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(q) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 327, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(r) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(s) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(t) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(u) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(v) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(w) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области; и
(х) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области.
Кроме того, из этих комбинаций более предпочтительными комбинациями аминокислотных модификаций являются нижеследующие комбинации модификаций аминокислотных последовательностей (а)-(х), таких как:
(a) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Gly или Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является аминокислотой Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(k) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(l) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(m) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(n) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(о) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(р) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(q) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met в соответствии с Европейской нумерацией;
(r) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, и аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(s) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(t) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(u) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(v) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Gly, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(w) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, и аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией; и
(х) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией.
Кроме того, аминокислотные модификации, введенные для другой(их) цели(ей), могут быть объединены в полипептидах, содержащих вариант Fc-области согласно изобретению. Так, например, могут быть добавлены аминокислотные замены, повышающие активность связывания с FcRn (J. Immunol. 2 00 6 Jan 1; 176(1): 346-56; J. Biol. Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24; Int. Immunol. 2006 Dec, 18(12): 1759-69; Nat. Biotechnol. 2010 Feb. 28(2): 157-9; WO/2006/019447; WO 2006/053301 и WO/2009/086320), и аминокислотные замены, повышающие гетерогенность или стабильность антитела (WO/2009/041613). Альтернативно, полипептиды, продуцируемые путем сообщения полипептидам, содержащим вариант Fc-области согласно изобретению, свойств, стимулирующих элиминацию антигенов, как описано в WO 2011/122011 или РСТ/JP 2011/072550, и полипептиды, сообщающие способность повторно связываться с множеством антигенных молекул, как описано в WO 2009/125825, WO 2012/073992 или WO 2013/047752, также входят в объем настоящего изобретения. Альтернативно, для повышения способности полипептидов сохраняться в плазме, аминокислотные модификации, способствующие снижению pi константной области (WO/2012/016227), могут быть объединены в полипептиде, содержащем вариант Fc-области согласно изобретению. Альтернативно, для сообщения способности связываться с другими антигенами, аминокислотные модификации, описанные в ЕР 1752471 и ЕР 1772465, могут быть объединены в СН3 полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению.
Если полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, представляет собой антигенсвязывающую молекулу, такую как антитело, то аминокислотные модификации, способствующие повышению активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, могут быть объединены в целях усиления действия антигенсвязывающей молекулы, направленного на элиминацию антигенов из плазмы. Более конкретно, модификации, используемые для повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, могут быть введены в антитело IgG, например, путем замены Met на Leu в положении 42 8 и замены Asn на Ser в положении 434 в соответствии с Европейской нумерацией (Nat. Biotechnol., 2010 28: 157-159); путем замены Asn на Ala в положении 434 (Drug Metab Dispos 2010 Apr.; 38(4): 600-5); путем замены Met на Tyr в положении 252, замены Ser на Thr в положении 2 54 и замены Thr на Glu в положении 256 (J. Biol. Chem., 2006, 281: 23514-23524); путем замены Thr на Gln в положении 250 и замены Met на Leu в положении 428 (J. Immunol. 2006, 176(1): 346-56); путем замены Asn на His в положении 434 (Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2): 283-290) или замен, описанных в WO 2010106180, WO 2010045193, WO 2009058492, WO 2008022152, WO 2006050166, WO 2006053301, WO 2006031370, WO 2005123780, WO 2005047327, WO 2005037867, WO 2004035752, WO 2002060919 или т.п.
Кроме того, недавно сообщалось, что молекула антитела, полученная путем замены Asn на His в положении 4 34 (в соответствии с Европейской нумерацией) в гуманизированном анти-CD4 антителе в целях повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН и улучшения свойств, таких как пролонгированное время присутствия в плазме, связывается с ревматоидными факторами (РФ) (Clin. Pharmacol. Ther. 2011 Feb.; 89(2): 283-90). Было показано, что это антитело имеет Fc-область человеческого IgG1, которая, после замены Asn на His в положении 434 в сайте связывания с FcRn, связывается с ревматоидными факторами, распознающими сайт с указанными заменами.
Как описано выше, имеются сообщения о различных модификациях, способствующих повышению активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, но при этом введение этих модификаций в сайт связывания с FcRn в Fc-области приводит к повышению аффинности с ревматоидными факторами, которые распознают этот сайт.
Однако, при введении модификаций, которые не снижают активности связывания с FcRn, а снижают только активность связывания с ревматоидными факторами в этом сайте Fc-области, могут быть получены антигенсвязывающие молекулы, обладающие повышенной активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, но не обладающие аффинностью по отношению к ревматоидным факторам.
Для введения модификаций, снижающих активность связывания с ревматоидными факторами, были сделаны замены в положениях 24 8-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 и 441-444 в соответствии с Европейской нумерацией. Предпочтительными являются модификации в положениях 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 и 440. Особенно предпочтительными являются замена Val на Glu или Ser в положении 422, замена Ser на Arg положении 424, замена His на Asp в положении 433, замена Tyr на Thr в положении 43 6, замена Gln на Arg или Lys в положении 438 и замена Ser на Glu или Asp в положении 440. Эти модификации могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом во множестве положений.
Альтернативно, для снижения активности связывания с ревматоидными факторами, в этот сайт может быть введена последовательность гликозилирования N-типа. В частности, последовательность Asn-Xxx-Ser/Thr (Ххх представляет собой любую аминокислоту кроме Pro) известна как последовательность гликозилирования N-типа. Присоединение сахарной цепи N-типа путем введения этой последовательности в данный сайт Fc-области приводит к ингибированию связывания с РФ благодаря стерическому затруднению, вызываемому сахарной цепью N-типа. Модификациями, используемыми для присоединения сахарной цепи N-типа, предпочтительно являются замена Lys на Asn в положении 24 8, замена Ser на Asn в положении 424, замена Tyr на Asn в положении 43 6, замена Gln на Thr в положении 438 и замена Gln на Asn в положении 438. Особенно предпочтительной модификацией является замена Ser на Asn в положении 424.
Предпочтительным примером полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, является полипептид, содержащий по меньшей мере два варианта Fc-области, где указанные два варианта Fc-области, по всей вероятности, связаны друг с другом в антителе IgG. При использовании антитела IgG в качестве полипептида согласно изобретению, тип константной области не имеет конкретных ограничений, и могут быть использованы IgG различных изотипов (подклассов), таких как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антителами IgG согласно изобретению предпочтительно являются человеческий IgG, а более предпочтительно человеческий IgG1 и человеческий IgG4. Аминокислотные последовательности константных областей тяжелой цепи человеческого IgG1 и человеческого IgG4 являются известными. Множество последовательностей аллотипов со свойственным им генетическим полиморфизмом описаны в публикации «Sequences of proteins of immunological interest» NIH Publication No.91-3242 для константной области человеческого IgG1, и любая из этих последовательностей может быть использована в настоящем изобретении.
Два ассоциированных варианта Fc-области, включенных в вышеупомянутый полипептид, могут представлять собой варианты Fc-области, в которые была (и) введена (ы) одна и та же или одни и те же аминокислотные модификации (далее, этот полипептид будет называться полипептидом, содержащим гомологичные варианты Fc области), или варианты Fc-области, содержащие различные аминокислотные последовательности, в каждую из которых была(и) введена(ы) другая(ие) аминокислотная(ые) модификация(и), или, альтернативно, варианты Fc-области, содержащие различные аминокислотные последовательности, где только в одну из Fc-областей была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и) (далее, этот полипептид будет называться полипептидом, содержащим гетерологичные варианты Fc-области). Из аминокислотных модификаций, вводимых только в одну из Fc-областей, предпочтительной модификацией в части петлевой структуры является модификация в положениях 233-239 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене Fc-области, где указанная модификация способствует связыванию с FcγRIIb и FcγRIIa; а более предпочтительной модификацией является модификация, способствующая повышению активности связывания с FcγRIIb и/или селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа) в СН2-области структуры петли одной из Fc-областей, и аминокислотная модификация, способствующая дестабилизации петлевой структуры СН2-области в другой Fc-области. Примерами аминокислотных модификаций, которые могут дестабилизировать петлевую структуру СН2-области, может быть замена по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 235, 236, 237, 238 и 239, другой аминокислотой. В частности, структура петли СН2-области может быть дестабилизирована, например, путем замены аминокислоты в положении 235 на Asp, Gln, Glu или Thr, замены аминокислоты в положении 236 на Asn, замены аминокислоты в положении 237 на Phe или Тгр, замены аминокислоты в положении 238 на Glu, Gly или Asn, и замены аминокислоты в положении 239 на Asp или Glu в соответствии с Европейской нумерацией.
Для получения полипептида, содержащего гетерологичные варианты Fc-области согласно изобретению, необходимо, чтобы варианты Fc-области, имеющие аминокислоты, отличающиеся друг от друга, были связанными, либо чтобы полипептид, содержащий представляющие интерес гетерологичные варианты Fc-области, был отделен от других полипептидов, содержащих гомологичные варианты Fc-области.
Для связывания полипептидов, имеющих различные аминокислоты, может быть применен метод ингибирования непредусмотренного связывания Н-цепей, заключающийся в сообщении электростатического отталкивания на границе второй константной области Н-цепи антитела (СН2) или третьей константной области Н-цепи антитела (СН3) (WO 2006/106905).
В методе ингибирования непредусмотренного связывания Н-цепей, заключающемся в сообщении электростатического отталкивания на границе СН2 или СН3, примерами аминокислотных остатков, контактирующих на границе других константных областей Н-цепи, являются остаток в положении 356 (в соответствии с Европейской нумерацией), остаток в положении 439 (в соответствии с Европейской нумерацией), область, расположенная перед остатком в положении 357 (в соответствии с Европейской нумерацией), остаток в положении 370 (в соответствии с Европейской нумерацией), остаток в положении 399 (в соответствии с Европейской нумерацией) и остаток в положении 409 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН3-домена.
Более конкретно, например, может быть получено антитело, содержащее СН3-домены Н-цепи двух типов, то есть антитело, в котором 1-3 пары аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных остатков, представленных ниже в пунктах (1)-(3), в первом СН3-домене Н-типа, имеют одинаковый заряд, то есть:
(1) аминокислотные остатки в положениях 356 и 439 (в соответствии с Европейской нумерацией), которые представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в СН3-домене Н-цепи;
(2) аминокислотные остатки в положениях 357 и 370 (в соответствии с Европейской нумерацией), которые представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в СН3-домене Н-цепи; и
(3) аминокислотные остатки в положениях 399 и 409 (в соответствии с Европейской нумерацией), которые представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в СН3-домене Н цепи.
Кроме того, может быть продуцировано антитело, в котором 1-3 пары аминокислотных остатков, соответствующих парам аминокислотных остатков, указанных выше в (1)-(3) и имеющих одинаковый заряд в СН3-домене первой Н-цепи, имеют заряды, противоположные зарядам соответствующих аминокислотных остатков в вышеупомянутом СН3-домене первой Н-цепи, где пары аминокислотных остатков выбраны из пар аминокислотных остатков, указанных выше в (1)-(3), в СН3-домене второй Н-цепи, который отличается от СН3-домена первой Н-цепи.
Соответствующие аминокислотные остатки (1)-(3), упомянутые выше, расположены близко друг от друга, если они являются связанными. Специалист в данной области может самостоятельно найти сайты, соответствующие вышеупомянутым аминокислотным остаткам (1)-(3), путем моделирования гомологии и т.п. с использованием коммерчески доступной компьютерной программы для нужного СН3-домена Н-цепи или константной области Н-цепи, и, при необходимости, аминокислотные остатки этих сайтов могут быть модифицированы.
В вышеупомянутых антителах, например, «заряженные аминокислотные остатки» предпочтительно выбраны из аминокислотных остатков, входящих в любую из представленных ниже групп (X) или (Y):
(X) глутаминовая кислота (Е) и аспарагиновая кислота (D), и (Y) лизин (К), аргинин (R) и гистидин (Н).
В вышеупомянутых антителах выражение «имеющий один и тот же заряд» означает, что, например, все два или более аминокислотных остатков представляют собой аминокислотные остатки, входящие в любую из вышеупомянутых групп (X) и (Y). Выражение «имеющий противоположный заряд» означает, что, например, если по меньшей мере один из двух или более аминокислотных остатков представляет собой аминокислотный остаток, входящий в любую из вышеупомянутых групп (X) и (Y), то остальные аминокислотные остатки представляют собой аминокислотные остатки, входящие в другую группу.
В предпочтительном варианте вышеупомянутого антитела, СН3 домен первой Н-цепи и СН3-домен второй Н-цепи могут быть перекрестно связаны дисульфидными связями.
В настоящем изобретении модифицируемые аминокислотные остатки не ограничиваются аминокислотными остатками константной области антитела или вариабельной области антитела, описанных выше. Специалист в данной области может самостоятельно найти аминокислотные остатки, которые образуют границу в полипептидных мутантах или гетеромультимерах, путем моделирования гомологии и т.п. с использованием коммерчески доступной компьютерной программы, и аминокислотные остатки в этих сайтах могут быть модифицированы для регуляции связывания.
Кроме того, для связывания гетерологичных вариантов Fc-области могут быть применены и другие известные методы. В частности, такой метод осуществляют путем замены аминокислотной боковой цепи, присутствующей в вариабельной области одной из Н-цепей антитела, более крупной боковой цепью (узел, который означает «утолщение»), и путем замены аминокислотной боковой цепи, присутствующей в вариабельной области другой Н-цепи, более короткой боковой цепью (дырка, которая означает «пустоту»), в результате чего такой узел может быть помещен в дырку. Это может стимулировать эффективное связывание полипептидов, содержащих Fc-область и имеющих различные аминокислоты (WO 1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
Кроме того, для гетерологичного связывания вариантов Fc-области могут быть также применены и другие известные методы. Связывание полипептидов, имеющих различные последовательности, может быть эффективно индуцировано посредством комплементарного связывания СН3 с использованием СН3-домена, сконструированного путем замены цепи, то есть путем замены части СН3 одной из Н-цепей антитела на происходящую от IgA последовательность, соответствующую этой части, и введения в комплементарную часть СН3 другой Н-цепи последовательности, происходящей от IgA и соответствующей этой части (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). Этот известный метод может быть также применен для эффективного индуцирования связывания полипептидов, содержащих Fc-область и имеющих различные аминокислоты.
Кроме того, могут быть также применены методы продуцирования гетеродимеризованных антител путем связывания СН1 и CL антитела и связывания VH и VL антитела, как описано в WO 2011/028952.
Как описано в WO 2008/119353 и WO 2011/131746, может быть также применен метод продуцирования гетеродимеризованных антител, где сначала получают гомодимеризованные антитела двух типов с последующим их инкубированием в восстанавливающих условиях для диссоциации, а затем их снова подвергают ассоциации.
Как описано в публикации J. Mol. (2012) 420, 204-219, может быть также применен метод продуцирования гетеродимеризованных антител путем введения заряженных остатков Lys, Arg, Glu и Asp так, чтобы в СН3 IgG1 и IgG2 наблюдалось электростатическое отталкивание.
Кроме того, как описано в WO 2012/058768, может быть также применен метод продуцирования гетеродимеризованных антител путем введения модификаций в СН2- и СН3-области.
Кроме того, даже в тех случаях, если полипептиды, содержащие гетерологичные варианты Fc-области, не могут быть эффективно продуцированы, то полипептиды, содержащие гетерологичные варианты Fc-области, могут быть получены путем их отделения и очистки от полипептидов, содержащих гетерологичные варианты Fc-области. При продуцировании полипептида, содержащего гетерологичные варианты Fc-области, состоящие из первого полипептида и второго полипептида, имеющих различные последовательности, полипептиды, содержащие гомологичную Fc-область, состоящую только из первого из двух полипептидов, смешивают с полипептидом, содержащим гомологичную Fc-область, состоящую только из второго из двух полипептидов, в виде примеси. Эти известные технологии могут быть использованы как метод эффективного удаления указанных полипептидов двух типов, содержащих гомологичную Fc-область. Сообщалось, что этот метод позволяет проводить очистку гомодимеров двух типов и представляющего интерес гетеродимеризованного антитела с помощью ионообменной хроматографии благодаря созданию различий изоэлектрических точек путем введения аминокислотных замен в вариабельные области Н-цепей двух типов (WO 2007114325). В настоящее время, для очистки гетеродимеризованных антител применяется метод с использованием белка А, позволяющий проводить очистку гетеродимеризованного антитела, содержащего Н-цепь мышиного IgG2a, которая связывается с белком А, и Н-цепь крысиного IgG2b, которая не связывается с белком A (WO 98050431, WO 95033844).
Кроме того, одно гетеродимеризованное антитело может быть эффективно очищено с использованием Н-цепей, в которых аминокислотные остатки в сайте связывания IgG-белок А в положениях 435 и 436 (в соответствии с Европейской нумерацией) были заменены аминокислотами Tyr или His с получением антитела, обладающего другой аффинностью к белку А, то есть другой аффинностью связывания каждой из Н-цепей с белком А, и такое антитело может быть очищено на колонке с белком А.
Множество таких замен и методов, например, два или более из них, могут быть применены в комбинации друг с другом. Кроме того, при необходимости, эти модификации могут быть введены по отдельности в первый полипептид и во второй полипептид. Полипептиды согласно изобретению могут быть также получены из продуктов с вышеупомянутыми модификациями.
В настоящем изобретении термин «аминокислотная модификация» означает любую замену, любую делецию, любое добавление, любую инсерцию и любую другую модификацию или их комбинации. Другими словами, в настоящем изобретении аминокислотная модификация может называться аминокислотной мутацией, и эти термины могут быть использованы как синонимы.
При замене аминокислотных остатков, замена одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком может быть осуществлена в зависимости от различных факторов, таких как факторы, описанные ниже (а)-(с):
(а) структура полипептидного остова в области, имеющей складчатую или спиральную структуру;
(b) электрический заряд или гидрофобность в сайте-мишени; или
(c) размер боковой цепи.
Аминокислотные остатки могут быть подразделены на нижеследующие группы по их общим свойствам боковых цепей:
(1) гидрофобные остатки: норлейцин, met, ala, val, leu и ile;
(2) нейтральные гидрофильные остатки: cys, ser, thr, asn и gln;
(3) кислотные остатки: asp и glu;
(4) основные остатки: his, lys и arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly и pro; и
(6) ароматические остатки: trp, tyr и phe.
Замена аминокислотных остатков, входящих в каждую из этих групп аминокислот, называется консервативной заменой, а замена аминокислотных остатков, входящих в другие группы, называется неконсервативной заменой. В настоящем изобретении такими заменами могут быть консервативные замены или неконсервативные замены или комбинации консервативных замен и неконсервативных замен.
Модификации аминокислотной последовательности получают различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, метод сайт-направленного мутагенеза (Hashimoto-Gotoh, Т, Mizuno, Т, Ogasahara, Y, and Nakagawa, М. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; и Kunkel, ТА (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492), ПЦР мутагенез и кластерный мутагенез.
Модификация аминокислот согласно изобретению включает посттрансляционную модификацию. Специфическая посттрансляционная модификация может представлять собой присоединение или делецию сахарной цепи. Так, например, в константной области IgG1, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:11, аминокислотный остаток в положении 297 (в соответствии с Европейской нумерацией) может быть модифицирован сахарной цепью. Структура сахарной цепи, используемая для модификации, не имеет конкретных ограничений. Вообще говоря, антитела, экспрессирующиеся в эукариотических клетках, содержат в своей константной области сайт гликозилирования. Поэтому антитела, экспрессирующиеся в клетках, таких как клетки, указанные ниже, обычно модифицируют сахарной цепью нескольких типов, где указанными клетками являются:
- антитело-продуцирующие клетки млекопитающих
- эукариотические клетки, трансформированные экспрессионным вектором, содержащим ДНК, кодирующую антитело.
Описанными здесь эукариотическими клетками являются дрожжевые клетки и клетки животных. Так, например, репрезентативными клетками животных, используемыми для трансформации экспрессионным вектором, содержащим ДНК, кодирующую антитело, являются клетки СНО и клетки НЕК293Н. С другой стороны, в константную область согласно изобретению также включены последовательности, не гликозилированные в этом положении. Антитела, константная область которых не является гликозилированной, могут быть получены посредством экспрессии антитело-кодирующего гена в прокариотических клетках, таких как Escherichia coli.
В частности, например, к сахарной цепи Fc-области может быть присоединена сиаловая кислота (MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27).
Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, содержащим любой описанный выше вариант Fc-области.
В настоящем изобретении термин «антитело/антитела» употребляется в самом широком смысле, при условии, что такое антитело обладает нужной биологической активностью, и этот термин включает любое антитело, такое как моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, варианты антител, фрагменты антител, полиспецифические антитела (мультиспецифические антитела)(например, биспецифические антитела (диантитела)), химерные антитела и гуманизированные антитела.
Что касается антител согласно изобретению, то тип и происхождение антител не имеет конкретных ограничений, и такими антителами могут быть антитела любого типа. Происхождение антител также не имеет конкретных ограничений, например, такими антителами являются человеческие антитела, мышиные антитела, крысиные антитела и кроличьи антитела.
Методы продуцирования антител хорошо известны специалистам, например, моноклональные антитела могут быть получены гибридомным методом (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975) или рекомбинантным методом (патент США №4816567). Альтернативно, эти антитела могут быть выделены из фаговой библиотеки антител (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:5 81-597 (1991)).
Гуманизированное антитело также называется реконструированным человеческим антителом. В частности, гуманизированные антитела получают путем присоединения CDR антитела животного, не являющегося человеком, такого как мышиное антитело, к человеческому антителу, и такие методы также известны специалистам. Также известны стандартные методы генной инженерии, применяемые для получения гуманизированных антител. В частности, например, метод ПЦР с перекрывающимся удлинением известен как метод присоединения CDR мышиного антитела к человеческим FR.
Вектор для экспрессии гуманизированного антитела может быть получен путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область антитела, в которой три CDR и четыре FR лигированы друг с другом, и ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела, в экспрессионный вектор так, чтобы эти ДНК были присоединены друг к другу с сохранением рамки считывания. После переноса этого интегрирующего вектора хозяину для получения рекомбинантных клеток, эти клетки культивируют, и ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, подвергают экспрессии для продуцирования гуманизированного антитела в клеточной культуре (см. публикацию Европейской патентной заявки ЕР 239400 и публикацию Международной патентной заявки WO 1996/002576).
При необходимости, аминокислотный остаток в FR может быть заменен так, чтобы CDR реконструированного человеческого антитела образовывали соответствующий антигенсвязывающий сайт. Так, например, мутация может быть введена в аминокислотную последовательность FR ПЦР-методом, применяемым для присоединения мышиных CDR к человеческим FR.
Нужное человеческое антитело может быть получено путем ДНК-иммунизации трансгенного животного, имеющего полный репертуар генов человеческого антитела (см. публикации Международных заявок WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 и WO 1996/033735), и это антитело может быть использовано для иммунизации.
Кроме того, методы получения человеческого антитела посредством пэннинга с использованием библиотеки человеческих антител известны специалистам. Так, например, V-область человеческого антитела экспрессируют на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv) методом фагового представления. При этом может быть отобран scFv-экспрессирующий фаг, который связывается с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующая V-область связанного с антигеном человеческого антитела, может быть определена путем анализа генов выбранного фага. После определения последовательности ДНК scFv, которое связывается с антигеном, экспрессионный вектор может быть получен путем присоединения, в той же рамке считывания, последовательности V-области к последовательности нужной С-области человеческого антитела и последующего встраивания полученной последовательности в подходящий экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор вводят в клетки, подходящие для экспрессии, как описано выше, и человеческое антитело может быть получено посредством экспрессии гена, кодирующего человеческое антитело. Эти методы уже известны специалистам (см. публикации Международных заявок WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 и WO 1995/015388).
Вариабельными областями, входящими в состав антител согласно изобретению, могут быть вариабельные области, распознающие любой антиген.
В настоящем изобретении антигенами могут быть любые антигены без каких-либо конкретных ограничений. Примерами таких антигенов предпочтительно являются лиганды (цитокины, хемокины и т.п.), рецепторы, раковые антигены, антигены МНС, антигены дифференцировки, иммуноглобулины и иммунные комплексы, частично содержащие иммуноглобулины.
Примерами цитокинов являются интерлейкины 1-18, колониестимулирующие факторы (G-CSF, M-CSF, GM-CSF и т.п.), интерфероны (IFN-α, IFN-β, IFN-γ и т.п.), факторы роста (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF и т.п.), факторы некроза опухоли (TNF-α и TNF-β), лимфотоксин, эритропоэтин, лептин, SCF, ТРО, MCAF и BMP.
Примерами хемокинов являются хемокины СС, такие как CCL1-CCL28, хемокины СС, такие как CXCL1-CXCL17, хемокины С, такие как XCL1-XCL2, и хемокины СХ3С, такие как CX3CL1.
Примерами рецепторов являются рецепторы, принадлежащие к таким семействам, как семейство рецепторов гемопоэтического фактора роста, семейство рецепторов цитокинов, семейство рецепторов тирозинкиназного типа, семейство рецепторов серин/треонин-киназного типа, семейство рецепторов TNF, семейство рецепторов, сопряженных с G-белком, семейство рецепторов GPI якорного типа, семейство рецепторов тирозин-фосфатазного типа, семейство рецепторов факторов адгезии и семейство рецепторов гормонов. Рецепторы, принадлежащие к этим семействам, и их свойства описаны во многих документах, таких как Cooke ВА., King RJB., Van der Molen HJ. Ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp. 1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy (1990) 61(1), 13-14); Ullrich et al. (Cell (1990) 61(2), 203-212), Massague (Cell (1992) 69(6): 1067-1070); Miyajima, et al (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga et al. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al. (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481), Smith et al. (Cell (1994) 76(6): 959-962) и Flower DR. Flower (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3): 207-234).
Примерами специфических рецепторов, принадлежащих к вышеупомянутым семействам рецепторов, предпочтительно являются рецепторы человеческого или мышиного эритропоэтина (ЕРО) (Blood (1990) 76(1), 31-35 и Cell (1989) 57(2): 277-285); рецепторы человеческого или мышиного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990), 87(22), 8702-8706; mG-CSFR (Cell (1990) 61(2): 341-350); рецепторы человеческого или мышиного тромбопоэтина (ТРО) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1992) 89(12): 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7): 2645-53); рецепторы человеческого или мышиного инсулина (Nature (1985) 313 (6005): 756-761); рецепторы человеческого или мышиного лиганда Flt-3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91(2): 459-463); рецепторы человеческого или мышиного тромбоцитарного фактора роста (PDGF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85(10): 3435-3439); рецепторы человеческого или мышиного интерферона (IFN-α и (3) (Cell (1990) 60(2): 225-234) и Cell (1994) 77(3): 391-400); рецепторы человеческого или мышиного лептина, рецепторы человеческого или мышиного гормона роста (GH), рецепторы человеческого или мышиного интерлейкина (IL)-10, рецепторы человеческого или мышиного инсулиноподобного фактора роста (IGF)-I, рецепторы ингибирующего фактора человеческого или мышиного лейкоза (LIF) и рецепторы человеческого или мышиного цилиарного нейтротропного фактора (CNTF).
Раковые антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются в процессе озлокачествования клеток, и такие антигены также называются опухолеспецифическими антигенами. Аномальные сахарные цепи, образующиеся на клеточных поверхностях или белковых молекулах раковых клеток, также называются раковыми антигенами, и такие антигены также являются раковыми антигенами с сахарной цепью. Примерами раковых антигенов предпочтительно является антиген GPC3, который представляет собой рецептор, принадлежащий к вышеупомянутому семейству рецепторов GPI якорного типа, и который также экспрессируется в некоторых раковых опухолях, включая рак печени (Int. J. Cancer (2003) 103(4): 455-65); ЕрСАМ, который экспрессируется в некоторых раковых опухолях, включая рак легких (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1989) 86(1): 27-31); CA19-9, CA15-3 и сиалил-SSEA-1 (SLX).
Антигены МНС, грубо говоря, подразделяются на антигены МНС класса I и антигены МНС класса II. Антигенами МНС класса I являются HLA-A, -В, -С, -Е, -F, -G и -Н, а антигенами МНС класса II являются HLA-DR, -DQ и -DP.
Антигенами дифференцировки могут быть CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 и CDw130.
Иммуноглобулины включают IgA, IgM, IgD, IgG и IgE. Иммунные комплексы включают компонент по меньшей мере любого из этих иммуноглобулинов.
Другими антигенами являются, например, нижеследующие молекулы: 17-IA, 4-1 ВВ, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, А33, АСЕ, АСЕ-2, активин, активин А, активин АВ, активин В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RUB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/ТАСЕ, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id антитело, аспарагиновая кислота, атриальный натриуретический пептид, интегрин av/ЬЗ, Axl, Ь2М, В7-1, В7-2, В7-Н, В-лимфоцитарный стимулирующий фактор (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, ВАК, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bel, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенин BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, остеогенный нейротропный фактор, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактор комплемента 3 (СЗ), СЗа, С4, С5, С5а, СЮ, СА125, CAD-8, кальцитонин, сАМР, канцероэмбриональный антиген (СЕА), антиген, ассоциированный с раковой опухолью, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CC1, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок рб7), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM 5, CFTR, cGMP, CINC, ботулинический токсин, токсины Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, антиген, ассоциированный с опухолевым цитокератином, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, фактор регуляции комплемента (фактор, ускоряющий разрушение опухоли), des(l-3)-IGF-I (IGF-I головного мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, E-селектин, ET-1, фактор На, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, белок активации фибробластов (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-б (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gpl30, gp72, GRO, рилизинг-фактор гормона роста, гаптен (NP-кэп или NIP-кэп), HB-EGF, НСС, гликопротеин оболочки gB HCMV, гликопротеин оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтический фактор роста (HGF), gp120 Hep В, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный антиген, ассоциированный с меланомой (HMW-MAA), gp120 ВИЧ, V3-петля gp120 ВИЧ IIIB, HLA, HLA-DR, НМ1.24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, человеческий кардиомиозин, человеческий цитомегаловирус (HCMV), человеческий гормон роста (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-β, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин-альфа 2, интегрин-альфа 3, интегрин-альфа 4, интегрин-а4/(31, интегрин-альфа 4/бета 7, интегрин-альфа 5 (альфа V), интегрин-а5/(31, интегрин-альфа 5/бета 3, интегрин-альфа 6, интегрин-бета 1, интегрин-бета 2, интерферон-гамма, IP-10, I-ТАС, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин L1, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, КС, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антиген Lewis-Y, Lewis-Y-ассоциированный антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, поверхностный антиген легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Мег, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцин (Mucl), MUC18, мюллеровский ингибирующий фактор, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, адгерин N-C, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротропин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нервных клеток (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочная фосфатаза плаценты (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, мембранный антиген, специфичный для предстательной железы (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, А-цепь релаксина, В-цепь релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, серии, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TAC1, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, ТЕСК, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза яичек, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, антиген, специфичный к TGF-бета всех типов, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RHb, TGF-бета RIII, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбин, Ск-1 тимуса, тиреотропный стимулирующий гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевый фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа,бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF1OB (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF1IB (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST2 3 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд TRANCE/RANK ODF, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR AITR, лиганд TL6), TNFSF1A (коннектин TNF-α, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40, CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Fas, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27, CD70), TNFSF8 (лиганд CD30, CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB, лиганд CD137), TP-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированный антиген CA12 5, опухолеассоциированный антиген, экспрессирующий Lewis Y-ассоциированные углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерин, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный антиген, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, A(3, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный ЛНП, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.l, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, С6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевый фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор ХНа, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA и S1P, а также рецепторы гормонов и факторов роста.
В аминокислотные последовательности, составляющие вариабельные области, могут быть введены одна или более модификаций аминокислотных остатков, при условии, что они будут сохранять антигенсвязывающую активность. При модификации аминокислотной последовательности вариабельной области, сайты модификации и число модифицируемых аминокислот не имеют конкретных ограничений. Так, например, аминокислоты, присутствующие в CDR и/или FR, могут быть соответствующим образом модифицированы. При модификации аминокислот в вариабельной области, активность связывания предпочтительно должна быть сохранена, но без каких-либо конкретных ограничений; например, она должна составлять 50% или более, предпочтительно 80% или более, а более предпочтительно 100% или более от активности до модификации. Кроме того, активность связывания может быть повышена путем модификации аминокислот. Так, например, активность связывания может в 2, 5, 10 или более раз превышать активность до модификации. В антителах согласно изобретению, модификацией аминокислотной последовательности могут быть по меньшей мере одна замена, по меньшей мере одно добавление, по меньшей мере одна делеция и по меньшей мере одна модификация аминокислоты.
Так, например, замена N-концевого глутамина вариабельной области на пироглутаминовую кислоту, осуществляемая посредством пироглутамилирования, представляет собой модификацию, хорошо известную специалистам. Таким образом, если у N-конца тяжелой цепи присутствует глутамин, то антитела согласно изобретению содержат вариабельные области, в которых глутамин заменен пироглутаминовой кислотой.
Вариабельные области антител согласно изобретению могут иметь любые последовательности, и такие вариабельные области антител могут происходить от любого источника, например, такими антителами могут быть мышиные антитела, крысиные антитела, кроличьи антитела, козьи антитела, верблюжьи антитела, гуманизированные антитела, полученные путем гуманизации нечеловеческих антител, и человеческие антитела.
«Гуманизированные антитела», также называемые «реконструированными человеческими антителами», представляют собой антитела, в которых гипервариабельные области (CDR) антитела, происходящего от млекопитающего, не являющегося человеком, например, от мышиного антитела, были заменены на CDR человеческого антитела. Методы идентификации CDR известны специалистам (Rabat et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). Стандартные методы рекомбинации генов также известны специалистам (см. публикацию Европейской патентной заявки № ЕР 125023 и WO 96/02576). Кроме того, эти антитела могут иметь различные аминокислотные замены, введенные в их вариабельные области для повышения уровня связывания с антигеном, для улучшения фармакокинетических свойств, для повышения стабильности и для снижения иммуногенности. Вариабельные области антител согласно изобретению могут обладать способностью связываться с антигенами повторно, что обусловлено зависимостью связывания антигена от рН (WO 2009/125825).
Константные области легкой цепи антитела представляют собой константные области цепи каппа-типа и лямбда-типа, однако, приемлемой может быть любая из константных областей легкой цепи. Кроме того, константные области легкой цепи согласно изобретению могут представлять собой константные области легкой цепи с аминокислотными модификациями, такими как замены, делеции, добавления и/или инсерции.
Так, например, для конструирования константных областей тяжелой цепи антитела согласно изобретению могут быть использованы константные области тяжелой цепи человеческих антител IgG, при этом предпочтительными являются константные области тяжелой цепи человеческих антител IgG1 и человеческих антител IgG4.
Кроме того, варианты Fc-области согласно изобретению могут быть получены в виде молекул слитых белков Fc путем присоединения к другим белкам, физиологически активным пептидам и т.п. В настоящем изобретении термин «слитый белок» означает химерный полипептид, содержащий по меньшей мере два различных полипептида, которые в природе спонтанно не связываются друг с другом. Примерами таких других белков и биологически активных пептидов являются, но не ограничиваются ими, рецепторы, адгезивные молекулы, лиганды и ферменты.
Предпочтительными примерами молекул слитых белков Fc согласно изобретению являются белки, содержащие Fc-область, присоединенную к рецепторному белку, который связывается с мишенью, и примерами таких белков являются слитый белок TNFR-Fc, слитый белок IL1R-Fc, слитый белок VEGFR-Fc и слитый белок CTLA4-Fc (Nat. Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52, BioDrugs 2006; 20(3):151-60). Кроме того, белком, присоединенным к полипептиду согласно изобретению, может быть любая молекула, при условии, что она будет связываться с молекулой-мишенью, и примерами таких молекул являются молекулы scFv (WO2005/037989), молекулы однодоменных антител (WO2004/058821; WO2003/002609), антитело-подобные молекулы (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469 и Protein Science 2006, 15: 14-27), такие как DARP-ины (WO2002/020565), аффинное антитело (WO1995/001937), авимер (WO2004/044011, WO2005/040229) и аднектин (WO2002/032925). Кроме того, молекулы антител и Fc-слитых белков могут представлять собой мультиспецифические антитела, которые связываются с молекулами-мишенями или эпитопами многих типов.
Кроме того, антителами согласно изобретению являются модификации антител. Такими модификациями антител являются, например, антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и цитотоксические вещества. Такие модифицированные антитела могут быть получены путем химической модификации антител согласно изобретению. Методы модификации антител хорошо известны специалистам в данной области.
Антителами согласно изобретению могут быть также биспецифические антитела. Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, которое, в одной своей молекуле, имеет вариабельные области, распознающие различные эпитопы. Эпитопы могут присутствовать в одной молекуле или в различных молекулах.
Полипептиды согласно изобретению могут быть получены методами, известными специалистам. Так, например, антитела могут быть получены методами, описанными ниже, но не ограничивающимися ими.
Была экспрессирована ДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, а также была экспрессирована ДНК, кодирующая легкую цепь антитела. ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть получена, например, путем конструирования ДНК, кодирующей природную тяжелую цепь Fc-области, и введения соответствующей замены так, чтобы кодон, кодирующий конкретную аминокислоту в Fc-области, кодировал другую представляющую интерес аминокислоту.
Альтернативно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть также получена путем конструирования и химического синтеза ДНК, кодирующей белок, в котором один или более аминокислотных остатков в природной тяжелой цепи Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами. Положение и тип аминокислотной замены не имеют конкретных ограничений. Кроме того, модификация не ограничивается только заменой, то есть такой модификацией может быть любая делеция, любое добавление или любая инсерция или их комбинации.
Альтернативно, ДНК, кодирующая тяжелую цепь, в которой один или более аминокислотных остатков в Fc-области были заменены другими представляющими интерес аминокислотами, может быть получена в виде комбинации неполных ДНК. Такими комбинациями неполных ДНК являются, например, но не ограничиваются ими, комбинация ДНК, кодирующей вариабельную область, и ДНК, кодирующей константную область, и комбинация ДНК, кодирующей Fab-область, и ДНК, кодирующей Fc-область. Кроме того, ДНК, кодирующая легкую цепь, может быть аналогичным образом получена в виде комбинации неполных ДНК.
Методы экспрессии вышеописанных ДНК включают методы, описанные ниже. Так, например, экспрессионный вектор для тяжелой цепи конструируют путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, в экспрессионный вектор вместе с ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аналогичным образом, экспрессионный вектор для легкой цепи конструируют путем встраивания ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи, в экспрессионный вектор вместе с ДНК, кодирующей константную область легкой цепи. Альтернативно, эти гены тяжелой и легкой цепей могут быть встроены в один вектор.
ДНК, кодирующую представляющее интерес антитело, встраивают в экспрессионный вектор так, чтобы антитело экспрессировалось под контролем области регуляции экспрессии, такой как энхансер или промотор. Затем клетки-хозяева трансформируют этим экспрессионным вектором для экспрессии антитела. В таких случаях может быть использована соответствующая комбинация хозяина и экспрессионного вектора.
Примерами векторов являются векторы М13, векторы pUC, pBR322, pBluescript и pCR-Script. Альтернативно, для субклонирования и вырезания кДНК, помимо вышеописанных векторов, могут быть использованы pGEM-T, pDIRECT, pT7 и т.п.
Экспрессионные векторы являются особенно подходящими для продуцирования полипептидов согласно изобретению. Так, например, если клеткой-хозяином является Е. coil, такая как JM109, DH5α, НВ101 и XL1-Blue, то экспрессионные векторы должны содержать промотор, обеспечивающий эффективную экспрессию в Е. coil, например, промотор lacZ (см. публикации Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки), промотор araB (см. публикацию Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), промотор Т7 или т.п. Такими векторами, помимо вышеописанных векторов, являются pGEX-5Х-1 (Pharmacia), «QIAexpress system» (QIAGEN), pEGFP или рЕТ (в этом случае хозяином предпочтительно является BL21, который экспрессирует РНК-полимеразу Т7).
Векторы могут содержать сигнальные последовательности для секреции полипептида. В случае секреции полипептида в периплазму Е. coil, в качестве сигнальной последовательности для такой секреции может служить сигнальная последовательность pelB (см. публикацию Lei, SP et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4397, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Вектор может быть встроен в клетки-хозяева методом с использованием липофектина, фосфата кальция и DEAE-дектрана.
Помимо экспрессионных векторов Е. coil, векторами для продуцирования полипептидов согласно изобретению являются, например, экспрессионные векторы млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (см. публикацию Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p.5322, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), pEF и pCDM8); экспрессионные векторы, происходящие от клеток насекомых (например, «бакуловирусная экспрессионная система Bac-to-BAC» (GIBCO BRL) и рВасРАК8); экспрессионные векторы, происходящие от растений (например, рМН1 и рМН2); экспрессионные векторы, происходящие от вируса животного (например, pHSV, pMV и pAdexLcw); ретровирусные экспрессионные векторы (например, pZIPneo); дрожжевые экспрессионные векторы (например, «Набор для экспрессии в дрожжах Pichia» («Pichia Expression Kit» Invitrogen), pNV11 и SP-Q01); и экспрессионные векторы Bacillus subtllls (например, pPL608 и рКТН50).
Векторы для экспрессии в клетках животных, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, должны иметь промоторы, необходимые для экспрессии в таких клетках, например, промотор SV40 (см. публикацию Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки); промотор MMTV-LTR, промотор EF1α (см. публикацию Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки); промотор CAG (см. публикацию Gene. (1991) 108, 193, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки) и промотор CMV, а более предпочтительно, такие векторы должны содержать ген для отбора трансформированных клеток (например, ген резистентности к лекарственному средству, который позволяет проводить такой отбор с использованием агента (неомицина, G418 или т.п.)). Векторами, обладающими такими свойствами, являются, например, рМАМ, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и рОР13.
Кроме того, для стабильной экспрессии гена и амплификации различных копий генов в клетках может быть применен описанный ниже метод, в котором клетки СНО, дефицитные по механизму синтеза нуклеиновой кислоты, вводят вместе с вектором, который несет ген DHFR, компенсирующий такой дефицит (например, pCHOI), а вектор амплифицируют с использованием метотрексата (МТХ). Альтернативно, для временной экспрессии гена может быть применен описанный ниже метод, в котором клетки COS, имеющие ген, экспрессирующий Т-антиген SV40 на хромосоме этих клеток, трансформируют вектором, имеющим ориджин репликации SV40 (pcD и т.п.). Могут быть также использованы ориджины репликации, происходящие от полиомавируса, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Для амплификации ряда копий генов в клетках-хозяевах могут быть также использованы экспрессионные векторы, содержащие селективные маркеры, такие как ген аминогликозид-трансферазы (АРН), ген тимидин-киназы (ТК), ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. coil (Ecogpt) и ген дигидрофолат-редуктазы (dhfr).
Антитела могут быть собраны, например, путем культивирования трансформированных клеток с последующим выделением антител из трансформированных клеток или из культуральной среды. Антитела могут быть выделены и очищены с применением соответствующих комбинированных методов, таких как центрифугирование, фракционирование сульфатом аммония, высаливание, ультрафильтрация, метод с использованием 1q, FcRn и колонки с белком А и G-белком, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и гель-фильтрация.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела, обладающего повышенной активностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область, где указанный способ включает введение в вариант Fc-области по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Примерами способов продуцирования являются способы, включающие следующие стадии:
(a) добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептидов, содержащих Fc-область;
(b) определение активности связывания полипептидов, модифицированных в стадии (а) с FcγRIIb; и
(c) отбор полипептидов, содержащих вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, где указанный включает стадии:
(a) модификации полипептид-кодирующей нуклеиновой кислоты для повышения активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью полипептида, содержащего родительскую Fc-область;
(b) введения нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева и их культивирования для индуцирования экспрессии; и
(c) сбора полипептида из культуры клеток-хозяев.
Кроме того, антитела и молекулы Fc-слитого белка, полученные этим способом, также входят в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область, где указанный способ включает введение в вариант Fc-области полипептида антитела, содержащего вариант Fc-области, по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Примером способа продуцирования является способ, включающий стадии:
(a) добавления по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептидов, содержащих Fc-область;
(b) определения активности связывания полипептидов, модифицированных в стадии (а), с FcγRIIa и с FcγRIIb; и
(c) отбора полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ продуцирования полипептидов, содержащих вариант Fc-области, где указанный способ включает стадии:
(a) модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий родительскую Fc-область, для повышения селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от указанного полипептида;
(b) введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и культивирования этой клетки в условиях, подходящих для экспрессии такой нуклеиновой кислоты; и
(c) сбора полипептида из культуры клеток-хозяев.
Антитела и молекулы слитого белка Fc, полученные этим способом, также входят в объем настоящего изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающей повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область, где указанный способ включает добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в вариант Fc-области полипептида антитела, содержащего вариант Fc-области антитела.
Примером способа продуцирования является способ, включающий стадии:
(a) добавления по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область;
(b) определения активности связывания полипептида, модифицированного в стадии (а), с FcγRIIa и с FcγRIIb; и
(c) отбора полипептида, содержащего вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является способ продуцирования полипептидов, содержащих вариант Fc-области, где указанный способ включает стадии:
(a) модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий родительскую Fc-область, для повышения активности связывания с FcγRIIb и повышения селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa (R-типа), в отличие от указанного полипептида;
(b) введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и культивирования этой клетки в условиях, подходящих для экспрессии такой нуклеиновой кислоты; и
(c) сбора полипептида из культуры клеток-хозяев.
Антитела и молекулы Fc-слитого белка, полученные этим способом, также входят в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования полипептида, в которых уровень продуцирования антитела против полипептида ниже, чем уровень продуцирования антитела против полипептида, содержащего родительскую Fc-область, при его введении in vivo, где указанные способы включают добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область антитела.
Примером способа продуцирования является способ, включающий следующие стадии:
(a) добавление по меньшей мере одной аминокислотной модификации в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область;
(b) подтверждение подавления продуцирования антитела при введении in vivo полипептида, содержащего Fc-область, модифицированную в стадии (а), по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Подавление продуцирования антител против полипептида может быть подтверждено способами введения полипептида животному и т.п. Альтернативно, подавление продуцирования антитела может быть определено путем измерения активности связывания с FcγRIIa и с FcγRIIb и мониторинга повышения величины, полученной путем деления величины KD для FcγRIIa на величину KD для FcγRIIb. Считается, что такие полипептиды могут быть использованы в качестве фармацевтических средств, поскольку они могут подавлять продуцирование антитела без активации активирующего FcγR.
В вышеупомянутых способах продуцирования предпочтительно, чтобы активность связывания с FcγRIIb и селективность связывания с FcγRIIb была выше, чем активность и селективность связывания с FcγRIIa (R-типа).
Примером предпочтительного варианта вышеупомянутого способа продуцирования является модификация Fc-области человеческого IgG, а именно, замена аминокислоты в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) другой аминокислотой и замены по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 234, 235, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271, 272, 274, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333, 334, 355, 356, 358, 396, 409 и 419 в соответствии с Европейской нумерацией, другой аминокислотой, введенной в Fc-область. Другими аминокислотными модификациями, объединенными с аминокислотной модификацией в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительно являются модификации аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296, 327, 330, 332, 333 и 396 в соответствии с Европейской нумерацией, а в частности, модификации аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396. В частности, предпочтительная комбинация аминокислотных модификаций, вводимых для повышения активности связывания с FcγRIIb или повышения селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa, включает, например, комбинацию аминокислотных модификаций в положениях 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) вместе модификацией по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислот в положениях 233, 237, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией).
Модифицированные аминокислоты не имеют конкретных ограничений, при условии, что эти аминокислоты будут способствовать повышению активности связывания с FcγRIIb или повышению селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa, по сравнению с активностью до их модификации, при этом предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 234 является Tyr, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 265 является Glu, аминокислотой в положении 266 является Phe, Leu или Met, аминокислотой в положении 267 является Ala, Glu, Gly или Gln, аминокислотой в положении 268 является Asp, Gln или Glu, аминокислотой в положении 269 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, Phe, Не, Met, Asn, Pro или Gln, аминокислотой в положении 274 является Gln, аминокислотой в положении 296 является Asp или Phe, аминокислотой в положении 326 является Ala или Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Lys, Arg или Ser, аминокислотой в положении 331 является Ser, аминокислотой в положении 332 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 333 является Lys, Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 334 является Arg, Ser или Thr, аминокислотой в положении 355 является Ala или Gln, аминокислотой в положении 356 является Glu, аминокислотой в положении 358 является Met, аминокислотой в положении 396 является Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr, аминокислотой в положении 409 является Arg, а аминокислотой в положении 419 является Glu. Более предпочтительными модифицированными аминокислотами являются аминокислоты, способствующие повышению активности связывания с FcγRIIb, а также повышению селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa, по сравнению с немодифицированными аминокислотами. В частности, при объединении модификаций аминокислот в положениях 238, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) с модификациями по меньшей мере одной аминокислоты в положениях, выбранных из положений 233, 264, 267, 272, 296, 327, 330, 332 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией), предпочтительной аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp или Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, аминокислотой в положении 332 является Thr, а аминокислотой в положении 396 является Leu или Met в соответствии с Европейской нумерацией.
Из этих модификаций предпочтительными являются модификации, которые приводят к значительному повышению активности связывания с FcγRIIb или к значительному повышению селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа). Примерами таких предпочтительных комбинаций аминокислотных замен, используемых в качестве модификаций, являются нижеследующие комбинации модификаций (а)-(х):
(а) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(b) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(c) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(d) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(e) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 267. 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(f) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268. 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(g) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 327 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(h) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(i) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(j) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(k) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(l) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(m) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(n) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(о) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(р) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(q) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 327, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(r) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(s) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(t) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(u) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267. 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(v) аминокислотные модификации в положениях 238, 237, 267, 268. 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области;
(w) аминокислотные модификации в положениях 238, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области; и
(х) аминокислотные модификации в положениях 238, 233, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области.
Кроме того, из этих комбинаций более предпочтительными комбинациями аминокислотных модификаций являются нижеследующие комбинации модификаций аминокислотных последовательностей (а)-(х), таких как:
(a) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(b) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Gly или Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, a аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, a аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(k) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(l) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(m) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(n) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(о) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(р) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(q) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met в соответствии с Европейской нумерацией;
(r) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, и аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(s) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(t) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, a аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(u) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(v) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Gly, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(w) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией; и
(х) аминокислотная последовательность Fc-области, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией.
Настоящее изобретение также относится к способу модификации полипептида для продуцирования полипептида, обладающего повышенной активностью связывания с FcγRIIb или селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа), по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область. Настоящее изобретение также относится к способу модификации полипептида для продуцирования полипептида, обладающего повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа), по сравнению с полипептидом, содержащим родительскую Fc-область.
Настоящее изобретение также относится к способам модификации полипептида для продуцирования полипептида, в которых подавляется продуцирование антитела против этого полипептида, вводимого in vivo, по сравнению с продуцированием антитела против полипептида, содержащего родительскую Fc-область.
Пример предпочтительного варианта осуществления изобретения включает комбинацию аминокислотных модификаций, описанных в способе продуцирования полипептидов, содержащих варианты Fc-области, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа). Пример более предпочтительного варианта осуществления изобретения включает комбинацию аминокислотных модификаций, описанных в способе продуцирования полипептидов, содержащих варианты Fc-области, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа).
Кроме того, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий Fc-область, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, где указанный полипептид включает вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий Fc-область, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, где указанный полипептид включает вариант Fc-области, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа), в отличие от полипептида, содержащего родительскую Fc-область. Нуклеиновой кислотой согласно изобретению может быть любая форма нуклеиновой кислоты, например, ДНК или РНК.
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим описанные выше нуклеиновые кислоты согласно изобретению. Тип вектора может быть соответствующим образом выбран специалистом в зависимости от клеток-хозяев, в которые вводят этот вектор. Такими векторами являются, например, векторы, описанные выше.
Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным вышеописанными векторами согласно изобретению. Соответствующие клетки-хозяева могут быть выбраны самим специалистом. Клетками-хозяевами являются, например, клетки-хозяева, описанные выше. Конкретными примерами являются нижеследующие клетки-хозяева.
Если в качестве клеток-хозяев используются эукариотические клетки, то такими клетками могут быть клетки животных, клетки растений или клетки грибов. В частности, клетками животных являются, например, следующие клетки:
(1) клетки млекопитающих: CHO (клеточная линия яичника китайского хомячка); COS (клеточная линия почек обезьян), клетки миеломы (Sp2/O, NS0 и т.п.), ВНК (клеточная линия почек детеныша хомячка), клетки Hela, клетки Vero, клетки НЕК293 (клеточная линия почек человеческого эмбриона, содержащая фрагментированную ДНК аденовируса (Ad5), клетки Freestyle 293, клетки PER.C6 (клеточная линия сетчатки человеческого эмбриона, трансформированная генами Е1А и Е1 В аденовируса типа 5 (Ad5) и т.п.(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1));
(2) клетки амфибий: ооциты Xenopus или т.п.; и
(3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 или т.п.
Кроме того, известно, что в качестве системы для экспрессии гена антитела могут быть использованы клетки растений, происходящие от растений рода Nicotiana, таких как Nicotiana tabacum. Для трансформации клеток растений могут быть соответствующим образом использованы культивированные клетки каллуса.
Кроме того, в качестве клеток грибов могут быть использованы следующие клетки:
дрожжи рода Saccharomyces, такие как Saccharomyces serevisiae, и рода Pichia, такие как Pichia pastoris; и
- нитчатые грибы рода Aspergillus, такие как Aspergillus niger.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу повышения активности связывания с FcγRIIb и/или повышения селективности связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа), по сравнению с активностью полипептида, содержащего родительскую Fc-область, где указанный способ включает добавление в Fc-область полипептида, содержащего Fc-область, по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Настоящее изобретение также относится к способу подавления продуцирования антител против полипептида, содержащего Fc-область, по сравнению с продуцированием антител против полипептида, содержащего родительскую Fc-область, при введении этого полипептида in vivo, где указанный способ включает добавление в Fc-область указанного полипептида по меньшей мере одной аминокислотной модификации.
Примером предпочтительного варианта осуществления изобретения является комбинация аминокислотных модификаций, описанных в способе продуцирования полипептидов, содержащих варианты Fc-области, обладающие повышенной активностью связывания с FcγRIIb и/или повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, а не с FcγRIIa (R-типа).
Полипептиды, полученные с применением любого из вышеупомянутых способов, также входят в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, включающий вариант Fc-области согласно изобретению.
Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть приготовлены известными методами и, помимо вышеописанных молекул антитела или слитого белка Fc согласно изобретению, содержат фармацевтически приемлемые носители. Так, например, если антитела приготовлены в виде стерильного раствора или суспензии для инъекции с использованием воды или любой другой фармацевтически приемлемой жидкости, то такие композиции могут быть введены парентерально. Так, например, такие композиции могут быть приготовлены путем соответствующего объединения молекул антител или слитого белка Fc с фармацевтически приемлемыми носителями или средами, а в частности, со стерильной водой или физиологическим раствором, растительными маслами, эмульгаторами, суспендирующими агентами, поверхностно-активными веществами, стабилизаторами, ароматизаторами, наполнителями, носителями, консервантами, связывающими агентами и т.п., путем их смешивания с получением унифицированной дозы в форме, отвечающей общеизвестным фармацевтическим требованиям. Конкретными примерами таких носителей являются легкая безводная кремневая кислота, лактоза, кристаллическая целлюлоза, маннит, крахмал, кальций-содержащая кармеллоза, натрий-содержащая кармеллоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, диэтиламиноацетат поливинилацетала, поливинилпирролидон, желатин, триглицерид со средней длиной цепи, отвержденное полиоксиэтиленсодержащее касторовое масло 60, сахароза, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганическая соль и т.п. Содержание активного ингредиента в такой композиции корректируют так, чтобы получить его соответствующую дозу в требуемом интервале.
Стерильные композиции для инъекции могут быть приготовлены с использованием носителей, таких как дистиллированная вода для инъекций, в соответствии со стандартными протоколами.
Водными растворами для инъекций являются, например, физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу или другие адъюванты, такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия. Эти растворы могут быть использованы в комбинации с подходящими солюбилизаторами, такими как спирт, а в частности, этанол, многоатомные спирты, такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль, и неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 80(ТМ) и НСО-50.
Маслами являются кунжутное масло и соевое масло, и эти масла могут быть объединены с солюбилизаторами, такими как бензилбензоат или бензиловый спирт.Эти композиции могут быть также приготовлены с использованием буферов, например, фосфатных буферов и натрий-ацетатных буферов; аналгетиков, например, гидрохлорида прокаина; стабилизаторов, например, бензилового спирта или фенола; или антиоксидантов. Приготовленные инъекции обычно разделяют на аликвоты и разливают по соответствующим ампулам.
Предпочтительным способом введения является парентеральное введение, а в частности, введение путем инъекции, интраназальное введение, внутрилегочное введение и чрескожное введение. Так, например, инъекции могут быть введены системно или местно путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции.
Кроме того, способ введения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от возраста и симптомов пациента. Разовая доза фармацевтической композиции, содержащая антитело или полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть выбрана, например, так, чтобы она составляла, например, в пределах от 0,0001 до 1000 мг/кг массы тела. Альтернативно, такая доза может, например, составлять в пределах от 0,001 до 100000 мг/пациента. Однако эта доза не ограничивается указанными величинами. Доза и способ введения варьируются в зависимости от массы тела и возраста пациента, а также от симптомов его заболевания, и могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом.
Вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активных ингредиентов фармацевтических средств, которые подавляют активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов. Полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, посредством селективного воздействия на FcγRIIb без активации активирующего FcγR. Активация В-клеток включает пролиферацию, продуцирование IgE, продуцирование IgM и продуцирование IgA. Вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, перекрестие связываются с FcγRIIb и IgE, что приводит к подавлению продуцирования IgE В-клетками; перекрестно связываются с FcγRIIb и IgM, что приводит к подавлению продуцирования IgM В-клетками; и перекрестно связываются с FcγRIIb и IgA, что приводит к подавлению продуцирования IgA В-клетками. Помимо этого, ингибирующее действие, аналогичное вышеупомянутому действию, осуществляется посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами, которые экспрессируются на В-клетках и содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM, таким как BCR, CD19 и CD79b. Кроме того, активация тучных клеток включает пролиферацию, активацию посредством IgE и т.п. и дегрануляцию. В тучных клетках вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять пролиферацию, активацию посредством IgE и т.п. и дегрануляцию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами рецептора IgE, которые экспрессируются на тучных клетках и содержат домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM, таким как FcεRI, DAP12 и CD200R3. Активация базофилов включает их пролиферацию и дегрануляцию. В базофилах вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять пролиферацию, активацию и дегрануляцию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами на клеточной мембране, которые содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM. Активация дендритных клеток включает их пролиферацию и дегрануляцию. В дендритных клетках вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут также подавлять активацию, дегрануляцию и пролиферацию посредством прямого или опосредованного перекрестного связывания FcγRIIb с молекулами на клеточной мембране, которые содержат внутриклеточный домен ITAM или взаимодействуют с доменом ITAM.
В настоящем изобретении вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в терапевтических или профилактических средствах для лечения иммунных воспалительных заболеваний. Поскольку, как описано выше, полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут подавлять активацию В-клеток, тучных клеток, дендритных клеток и/или базофилов, то введение полипептидов, содержащих вариант Fc-области согласно изобретению, может быть осуществлено для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний. Термин «иммунные воспалительные заболевания» включает, но не ограничивается ими, ревматоидный артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный тиреоидит, буллезные аутоиммунные заболевания, аутоиммунное заболевание коры надпочечника, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, мегалоцитарную анемию, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунный орхит, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунное заболевание, ассоциированное с рецепторными функциями, аутоиммунное бесплодие, хронический активный гепатит, гломерулонефрит, интерстициальный фиброз легких, рассеянный склероз, болезнь Пэджета, остеопороз, множественную миелому, увеит, острый и хронический спондилит, подагрический артрит, воспалительное заболевание кишечника, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), псориаз, болезнь Крона, базедову болезнь, ювенильный диабет, болезнь Аддисона, тяжелую миастению, увеит, вызываемый поражением хрусталика, системную красную волчанку, аллергический ринит, аллергический дерматит, язвенный колит, гиперчувствительность, мышечную дегенерацию, кахексию, системную склеродермию, локализованную склеродермию, синдром Сьегрена, болезнь Бехчета, синдром Рейтера, диабет типа I и типа II, расстройства, ассоциированные с резорбцией кости, реакцию «трансплантат против хозяина», ишемическое реперфузионное повреждение, атеросклероз, травму головного мозга, церебральную малярию, сепсис, септический шок, синдром токсического шока, лихорадку, миалгии, ассоциированные с окрашиванием, апластическую анемию, гемолитическую анемию, идиопатическую тромбоцитопению, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, пузырчатку, IgA-нефропатию, поллиноз, антифосфолипидный синдром, полимиозит, гранулематоз Вегенера, нодозный артерит, смешанное заболевание соединительных тканей, фибромиалгию, астму, атопический дерматит, хронический атрофический гастрит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный панкреатит, аортит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегалобластную анемию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, первичный гипотиреоидит, идиопатическую болезнь Аддисона, инсулине зависимый сахарный диабет, хроническую дисковидную красную волчанку, пемфигоид, герпес беременных, буллезный дерматоз, вызываемый линейными цепями IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, гнездную алопецию, вульгарное витилиго, центробежную приобретенную лейкодермию Саттона, болезнь Харады, аутоиммунную невропатию зрительного нерва, идиопатическую азооспермию, привычный выкидыш, гипогликемию, хроническую крапивницу, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, энтеропатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, энтезопатию, синдром раздраженного кишечника, синдром хронической усталости, дерматомиозит, миозит, вызываемый тельцами включения, синдром Шмидта, болезнь Грэйвса, пернициозную анемию, волчаночный гепатит, пресенильную деменцию, болезнь Альцгеймера, демиелинизирующее расстройство, амиотрофический боковой склероз, гипопаратиреоидит, синдром Дресслера, синдром Итона-Ламберта, герпетиформный дерматит, алопецию, прогрессирующий системный склероз, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейно, нарушение перистальтики пищевода, склеродактилия и телангиэктазия), саркоидоз, ревматическую лихорадку, мультиформную эритему, синдром Кушинга, заболевание, вызываемое переливанием крови, болезнь Хансена, артерит Такаясу, ревматическую полимиалгию, височный артерит, гигантоклеточный артрит, экзему, лимфоматозный гранулематоз, болезнь Кавазаки, эндокардит, фиброз эндомиокарда, эндофтальмит, эритробластоз плода, эозинофильный фасцит, синдром Фэлти, пурпуру Геноха-Шенлейна, отторжение трансплантата, паротит, кардиомиопатию, гнойный артрит, наследственную средиземноморскую лихорадку, синдром Макла-Уэлса и гипер-IgD-синдром.
Кроме того, при аутоиммунных заболеваниях, которые могут быть вызваны продуцированием антител против аутоантигенов (аутоантител), полипептиды, содержащие вышеупомянутый вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в фармацевтических средствах для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний посредством подавления продуцирования этих аутоантител. Сообщалось, что использование молекулы, продуцируемой путем присоединения Fc-части антитела к AchR (аутоантигену тяжелой миастении), позволяет ингибировать пролиферацию В-клеток, которые экспрессируют AchR-распознающий BCR и индуцируют апоптоз (J. Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010). С использованием слитого белка, образованного антигеном, распознаваемым аутоантителом и Fc-областью антитела согласно изобретению, можно осуществлять перекрестное связывание FcγRIIb с BCR на В-клетках, экспрессирующих BCR для этого аутоантигена, подавлять пролиферацию В-клеток, экспрессирующих BCR для этого аутоантигена, и индуцировать их апоптоз. Такими аутоиммунными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, синдром Гийена-Барре, тяжелая миастения, хронический атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный панкреатит, аортит, синдром Гудпасчера, быстро прогрессирующий гломерулонефрит, мегалобластная анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунная нейтропения, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, базедова болезнь, тиреоидит Хашимото, первичный гипотиреоидит, идиопатическая болезнь Аддисона, инсулине зависимый сахарный диабет, хроническая дисковидная красная волчанка, локализованная склеродермия, пузырчатка, пемфигоид, герпес беременных, буллезный дерматоз, вызываемый линейными цепями IgA, приобретенный буллезный эпидермолиз, гнездная алопеция, вульгарное витилиго, центробежная приобретенная лейкодермия Саттона, болезнь Харады, аутоиммунная невропатия зрительного нерва, идиопатическая азооспермия, привычный выкидыш, диабет типа II, гипогликемия и хроническая крапивница.
Кроме того, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в терапевтических средствах для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом жизненно необходимых белков. Для лечения заболеваний, ассоциированных с дефицитом жизненно необходимых белков, могут быть применены методы терапии, включающие введение белка в качестве фармацевтического средства и в качестве добавки. Однако, поскольку у пациента изначально отсутствует такой белок, то экзогенно вводимый белок будет распознаваться как чужеродное вещество, в результате чего будут продуцироваться антитела против этого белка. Поэтому такой белок становится легко удаляемым, что будет приводить к снижению эффекта фармацевтического средства. С использованием слитого белка, содержащего указанный белок и Fc-область антитела согласно изобретению, можно осуществлять перекрестное связывание FcγRIIb с BCR на В-клетках, распознающих этот белок, и подавлять продуцирование антитела против указанного белка. Белками, вводимыми в качестве добавки, являются фактор VIII, фактор IX, TPO, EPO, α-идуронидаза, идуронат-сульфатаза, гепаран-N-сульфатаза типа А, α-N-ацетилглюкозаминидаза типа В, ацетил-СоА-*а-глюкозаминидаза-ацетилтрансфераза типа С, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза типа D, галактоза-6-сульфатаза, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза, β-глюкуронидаза, α-галактозидаза, кислотная α-галактозидаза и глюкоцереброзидаза. Эти белки могут быть введены в качестве добавок для лечения заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, гемофилия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, почечная анемия и заболевание, ассоциированное с лизосомами (мукополисахаридоз, болезнь Фабри, болезнь Помпе и болезнь Гуше).
Кроме того, вышеупомянутые полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента противовирусных средств. Антитела, содержащие Fc-область согласно изобретению, и антивирусные антитела могут подавлять антитело-зависимое иммунологическое усиление, наблюдаемое при использовании антивирусных антител. Антитело-зависимое иммунологическое усиление представляет собой явление, при котором вирус вырабатывает нейтрализующие антитела против этого вируса и подвергается фагоцитозу посредством активирующих FcγR, что приводит к инфицированию FcγR-экспрессирующих клеток и к дальнейшему распространению этой инфекции. Сообщалось, что связывание нейтрализующих антител против вируса денге с FcγRIIb играет важную роль в ингибировании антитело-зависимого иммунологического усиления (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 12479-12484, 2011). Перекрестное связывание FcγRIIb с иммунным комплексом вируса денге, образованным нейтрализующими антителами против вируса денге, ингибирует FcγR-опосредуемый фагоцитоз и подавляет антитело-зависимое иммунологическое усиление. Примерами таких вирусов являются, но не ограничиваются ими, вирус денге (DENV1, DENV2 и DENV4) и ВИЧ.
Кроме того, вышеописанные полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в профилактических или терапевтических средствах для лечения артериосклероза. Антитела против окисленного ЛНП, вызывающего артериосклероз, то есть антитела, содержащие Fc-область согласно изобретению, могут способствовать предупреждению FcγRIla-зависимой адгезии воспалительных клеток. Сообщалось, что антитела против окисленного ЛНП ингибируют взаимодействие окисленного ЛНП с CD36 и связываются с эндотелиальными клетками, а моноциты распознают Fc-часть этих антител по FcγRIIa-зависимому или FcγRI-зависимому механизму, что приводит к адгезии моноцитов (Immunol. Lett., 108, 52-61, 2007). С использованием антител, содержащих Fc-область согласно изобретению, можно ингибировать FcγRIIa-зависимое связывание и подавлять адгезию моноцитов под действием FcγRIIb-опосредуемых ингибирующих сигналов.
В настоящем изобретении вышеописанные полипептиды, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы в качестве активного ингредиента в терапевтических или профилактических средствах для лечения рака. Как описано выше, известно, что повышение активности связывания с FcγRIIb усиливает агонистическую активность антитела-агониста и повышает противоопухолевый эффект антитела. Поэтому антитела-агонисты, содержащие вариант Fc-области согласно изобретению, могут быть использованы для лечения или предупреждения рака. В частности, вариант Fc-области согласно изобретению усиливает агонистическую активность антител-агонистов, направленных, например, против рецепторов, принадлежащих к семейству рецепторов TNF, таких как А-лиазы, CD120a, CD120b, рецептор лимфотоксина β, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, остеопротегерин, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, рецептор фактора роста нервных клеток, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25 и рецептор эктодисплазина А2, и может быть использован для лечения или предупреждения рака. Кроме того, в дополнение к вышеописанному можно сказать, что наблюдается также усиление агонистической активности антител-агонистов против молекул, которым, для их агонистической активности, необходимо взаимодействие с FcγRIIb. Кроме того, при введении варианта Fc-области согласно изобретению в полипептид, обладающий активностью связывания с молекулой, такой как Kit, то есть тирозинкиназный рецептор (RTK), который подавляет пролиферацию клеток после перекрестного связывания с FcγRIIb, ингибирующий эффект, направленный против клеток, экспрессирующих такую молекулу, может усиливаться. Раковыми заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, рак легких (включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких), рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак печени, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почек, рак предстательной железы, рак яичника, рак щитовидной железы, холангиокарцинома, рак брюшной полости, мезотелиома, плоскоклеточная карцинома, рак шейки матки, рак эндометрия, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак головы и шеи, рак носоглотки, опухоль слюнных желез, тимома, рак кожи, базальноклеточная опухоль, злокачественная меланома, рак заднего прохода, рак пениса, рак яичек, опухоль Вильмса, острый миелоидный лейкоз (включая острый миелолейкоз, острый миелобластный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миеломоноцитарный лейкоз и острый моноцитарный лейкоз), хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, ходжкинская лимфома, неходжкинская лимфома (лимфома Беркитта, хронический лимфоцитарный лейкоз, грибовидный микоз, лимфома клеток коры головного мозга, фолликулярная лимфома, диффузная крупноклеточная лимфома, лимфома маргинальной зоны, пилоцитарная лейкоплазмацитома, лимфома периферических Т-клеток и Т-клеточный лейкоз/Т-клеточная лимфома взрослых), гистиоцитоз клеток Лангерганса, множественная миелома, миелодиспластический синдром, опухоль головного мозга (включая глиому, астроглиому, глиобластому, менингиому и эпендимому), нейробластома, ретинобластома, остеосаркома, саркома Капоши, саркома Юинга, ангиосаркома и гемангиоперицитома.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний, где указанные способы включают стадию введения индивидууму (пациенту) полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептида, содержащего вариант Fc-области и полученного способами продуцирования согласно изобретению.
Настоящее изобретение также относится к наборам, используемым в способах терапии или профилактики согласно изобретению, где указанные наборы содержат по меньшей мере полипептид, содержащий вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептид, содержащий вариант Fc-области и полученный способами продуцирования согласно изобретению, или фармацевтическую композицию согласно изобретению. Кроме того, в набор могут быть включены фармацевтически приемлемые носители и среды, а также к нему могут прилагаться инструкции по применению такого набора. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению полипептида, содержащего вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептида, содержащего вариант Fc-области и полученного способами продуцирования согласно изобретению, в целях приготовления средств для лечения или предупреждения иммунных воспалительных заболеваний. Настоящее изобретение также относится к полипептиду, содержащему вариант Fc-области согласно изобретению, или полипептиду, содержащему вариант Fc-области и полученному способами продуцирования согласно изобретению, где указанные полипептиды могут быть применены в способах терапии или профилактики согласно изобретению.
Используемые здесь аминокислоты имеют нижеследующие трехбуквенные и однобуквенные обозначения:
Аланин: Ala (А)
Аргинин: Arg (R)
Аспарагин: Asn (N)
Аспарагиновая кислота: Asp (D)
Цистеин: Cys (С)
Глутамин: Gln (Q)
Глутаминовая кислота: Glu (E)
Глицин: Gly (G)
Гистидин: His (Н)
Изолейцин: Ile (I)
Лейцин: Leu (L)
Лизин: Lys (K)
Метионин: Met (М)
Фенилаланин: Phe (F)
Пролин: Pro (Р)
Серин: Ser (S)
Треонин: Thr (Т)
Триптофан: Trp (W)
Тирозин: Tyr (Y)
Валин: Val (V)
Все цитируемые здесь предшествующие документы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Примеры
Ниже приводится конкретные примеры осуществления настоящего изобретения, которые не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
[Пример 1]. Оценка способности антител, содержащих Fc-вариант, обладающий повышенной активностью связывания с FcγRIIb, к агрегации тромбоцитов
Как показано в таблице 16 сравнительного примера 4, существующий метод повышения активности связывания с FcγRIIb, в котором осуществляют модификации, а именно, замену Ser на Glu в положении 267 и замену Leu на Phe в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) в нативном человеческом IgGI (непатентный документ 28), позволяет в 408 раз повышать активность связывания с FcγRIIb ив 0,51 раз снижать активность связывания с FcγRIIaH, а также в 522 раза повышать активность связывания с FcγRIIaR по сравнению с активностью IgG1. Как описано в разделе «Предшествующий уровень техники», даже при повышении активности связывания с FcγRIIb, которое происходит в клетках, таких как тромбоциты, экспрессирующие только FcγRIIa, такие эффекты усиления могут наблюдаться только для FcγRIIa. To есть, существующие методы повышения активности связывания с FcγRIIaR повышают риск агрегации тромбоцитов и риск развития тромбоза. Для подтверждения этого факта необходимо провести анализ для того, чтобы определить, может ли повышаться активность в агрегации тромбоцитов при повышении активности связывания антитела с FcγRIIa.
С применением метода, описанного в сравнительном примере 1, омализумаб_VH-G1d. (SEQ ID NO:25) был получен в виде тяжелой цепи, а омализумаб_VL-CK (SEQ ID N0:26) был получен в виде легкой цепи человеческого антитела IgG1, которое связывается с IgE. Кроме того, для повышения активности связывания омализумаб_VH-G1d. с человеческим FcγRIIb был получен омализумаб_VH-G1d-v3 путем замены Ser на Glu в положении 267 и замены Leu на Phe в положении 328 омализумаб_VH-G1d в соответствии с Европейской нумерацией. С применением метода, описанного в сравнительном примере 1, были получены омализумаб_VH-G1d-v3 в виде тяжелой цепи и омализумаб_VL-CK в виде легкой цепи. С использованием этого антитела была оценена способность к агрегации тромбоцитов.
Агрегацию тромбоцитов оценивали на агрегометре тромбоцитов HEMATRACER 712 (LMS Со.). Сначала, приблизительно 50 мл цельной крови собирали в фиксированном количестве в 4,5-миллилитровые пробирки для забора крови с откаченным воздухом, содержащие 0,5 мл 3,8% цитрата натрия, а затем эти пробирки центрифугировали при 200xg в течение 15 минут.Полученный супернатант собирали и использовали в качестве плазмы, богатой тромбоцитами (PRP). После этого, PRP промывали буфером 1 (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 0,42 мМ NaH2PO4, 2 мМ MgCl2, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстрозы, 1,5 ед/мл апиразы, 0,35% BSA), а затем этот буфер заменяли на буфер 2 (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 0,42 мМ NaH2PO4, 2 мМ MgCl2, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстрозы, 2 мМ CaCl2, 0,35% BSA) и получали приблизительно 300000/мкл промытых тромбоцитов. 156 мкл промытых тромбоцитов разделяли на аликвоты и помещали в аналитические кюветы агрегометра для тромбоцитов, содержащие стержневую мешалку. Тромбоциты перемешивали стержневой мешалкой со скоростью 1000 об/мин в кюветах агрегометра для тромбоцитов при 37,0°С. Затем в кюветы добавляли 44 мкл иммунного комплекса омализумаб-G1d-v3 и IgE в молярном соотношении 1:1 (в конечных концентрациях 600 мкг/мл и 686 мкг/мл, соответственно). Тромбоциты подвергали реакции с иммунным комплексом в течение пяти минут. После этого к реакционной смеси добавляли аденозиндифосфат (ADP, SIGMA) в концентрации, при которой не наблюдалась вторичная агрегация тромбоцитов, для того чтобы определить, происходит ли повышение уровня такой агрегации.
Результаты для каждого донора с полиморфной формой FcγRIIa
(Н/Н или R/H), полученные в вышеописанном анализе, представлены на фиг. 1 и 2. Результат, представленный на фиг. 1, показал, что уровень агрегации тромбоцитов повышается в случае полиморфной формы FcγRIIa (R/H) при добавлении иммунного комплекса. С другой стороны, как показано на фиг. 2, полиморфизм FcγRIIa (Н/Н) не приводил к повышению уровня агрегации тромбоцитов.
Затем оценивали активацию тромбоцитов с использованием маркеров активации. Активация тромбоцитов может быть оценена по повышению уровней экспрессии маркера активации, такого как CD62p (р-селектин) или активный интегрин на мембранной поверхности тромбоцитов. К 7,7 мкл промытых тромбоцитов, полученных описанным выше методом, добавляли 2,3 мкл иммунного комплекса. После прохождения реакции в течение пяти минут при комнатной температуре, активацию индуцировали путем добавления ADP в конечной концентрации 30 мкМ и определяли, может ли иммунный комплекс усиливать ADP-зависимую активацию. Образец, в который был добавлен фосфатный буфер (рН7,4, Gibco) вместо иммунного комплекса, использовали в качестве негативного контроля. Окрашивание осуществляли путем добавления в образец, полученный после реакции, ФЭ-меченного анти-CD62 антитела (BECTON DICKINSON), PerCP-меченного анти-CD61 антитела и ФИТЦ-меченного антитела РАС-1 (BD bioscience). Все величины интенсивности флуоресценции измеряли на проточном цитометре (FACS CantoII, BD bioscience).
Данные по экспрессии CD62p, полученные вышеописанным аналитическим методом, представлены на фиг. 3. Данные по экспрессии активированного интегрина представлены на фиг. 4. Используемые промытые тромбоциты были взяты у здорового индивидуума с полиморфной формой FcγRIIa R/H. Экспрессия CD62p и активированного интегрина на мембранной поверхности тромбоцитов, индуцированная посредством ADP-стимуляции, повышалась в присутствии иммунного комплекса.
Эти результаты показали, что в имеющихся антителах, содержащих Fc-вариант, обладающий повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb и полученный путем замены Ser на Glu в положении 267 и замены Leu на Phe в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc IgG1, генетические полиморфы FcγRIIa, в которых аминокислотой в положении 131 является R, обладали повышенной активностью в агрегации тромбоцитов, чем полиморфы, в которых аминокислотой в положении 131 является Н. То есть, можно предположить, что имеющиеся антитела, содержащие Fc-вариант, обладающий повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb, представляют повышенный риск развития тромбоза, что обусловлено агрегацией тромбоцитов у человека, несущего FcγRIIa R-типа, а поэтому очевидно, что такая проблема может быть решена с использованием Fc-варианта, обладающего повышенной селективностью связывания с FcγRIIb.
[Пример 2]. Продуцирование вариантов, обладающих повышенной активностью связывания с FcγRIIb
Как показано в примере 1, если требуется повышение активности связывания с FcγRIIb, то при этом также необходимо ингибировать связывание с другими активирующими FcγR, если это возможно. Поэтому Продуцирование вариантов, обладающих повышенной активностью или селективностью связывания с FcγRIIb, было оценено путем объединения замен, которые способствуют повышению активности связывания или селективности связывания с FcγRIIb. В частности, взятая за основу модификация P238D, которая дает превосходный эффект в отношении повышения активности и селективности связывания с FcγRIIb, может быть также объединена с модификациями, которые, как было обнаружено, являются эффективными для такого повышения активности и селективности связывания, как описано в сравнительных примерах 6, 8 и 9.
Вариабельная область IL6R-H (SEQ ID NO:18), которая описана в WO2009/125825 и которая представляет собой вариабельную область антитела против рецептора человеческого интерлейкина 6, была получена как вариабельная область Н-цепи антитела, a IL6R-G1d (SEQ ID NO:19), которая имеет G1d, продуцированную путем удаления С-концевого Gly и Lys человеческого IgG1, была получена как константная область Н-цепи антитела. Кроме того, IL6R-B3 (SEQ ID NO:23) получали путем введения K439E в IL6R-G1d. Затем были получены варианты IL6R-B3 путем объединения E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R, A330K, которые, как было обнаружено, являются эффективными при их использовании в комбинации с P238D, как описано в сравнительных примерах 6, 8 и 9. IL6R-L (SEQ ID NO:21) обычно используют как L-цепь антитела. Эти варианты были использованы для экспрессии и очистки антитела методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 1. В данной таблице «модификации» означают модификации, вводимые в IL6R-B3 (SEQ ID NO:23). При этом IL6R-B3/IL6R-L, которые используются в качестве матрицы для продуцирования каждого из вариантов, отмечены звездочкой (*). В этой таблице «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность к FcγRIIb. «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIaR. В таблице 1 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, вычисленным по следующему уравнению:
описанному в сравнительном примере 2, где, как было установлено, связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа.
Если принять активность связывания IL6R-B3/IL6R-L, продуцируемого путем введения K439E в IL6R-Gld/IL6R-L, с соответствующими FcγR за 1, то активность связывания IL6R-Gld/IL6R-L, который несет нативную последовательность человеческого IgGI, будет в 1,3 раза выше для FcγRIa, в 1,1 раза выше для FcγRIIaR, 1,1 раза выше для FcγRIIaH, в 1,2 раза выше для FcγRIIb и в 0,9 раза выше для FcγRIIlaV, а все активности связывания с FcγR будут эквивалентны активности связывания с IL6R-Gld/IL6R-L. Поэтому сравнение связывания каждого варианта с IL6R-B3/IL6R-L до модификации может рассматриваться как эквивалентное сравнению активности связывания каждого варианта с антителом IL6R-Gld/IL6R-L, имеющим нативную последовательность человеческого IgGI. В соответствии с этим, как описано ниже в примерах, активность связывания каждого варианта сравнивают с активностью связывания IL6R-B3/IL6R-L до модификации.
В таблице 1 показано, что все варианты обладают повышенной аффинностью связывания с FcγRIIb по сравнению с аффинностью связывания с IL6R-B3 до модификации, причем IL6R-BF648/IL6R-L обладает в 2,6 раза большей аффинностью связывания, и эта величина является наименьшей, a IL6R-BP230/IL6R-L обладает в 147,6 раз большей аффинностью связывания, и эта величина является наибольшей. Кроме того, величина KD(IIaR)/KD(IIb), которая определяет степень селективности, составляет 10,0 для IL6R-BP234/IL6R-L, где такая величина является наименьшей, и 32,2 для IL6R-BP231/IL6R-L, где такая величина является наибольшей, причем все варианты обладают повышенной селективностью связывания по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L до модификации, и такая величина составляет 0,3. Все варианты обладают более низкой активностью связывания с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIlaV по сравнению с активностью IL6R-B3/IL6R-L до модификации.
[Пример 3] Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного между Fc с повышенной активностью связывания с FcγRIIb и внеклеточной областью FcγRIIb, и комплекса, образованного между этим Fc и внеклеточной областью FcγRIIaR
Вариант IL6R-BP230/IL6R-L, имеющий наибольшую активность связывания с FcγRIIb, как описано в примере 2, обладал приблизительно в 150 раз большей активностью связывания с FcγRIIb, а активность связывания с FcγRIIa R-типа ингибировалась до уровня активности, который был приблизительно в 1,9 раз выше активности IL6R-B3/IL6R-L до модификации. Поэтому IL6R-BP230/IL6R-L представляет собой превосходный вариант с точки зрения активности и селективности связывания с FcγRIIb, однако, для получения еще лучших вариантов, предпочтительно, чтобы активность связывания с FcγRIIb была еще выше, а активность связывания с FcγRIIaR была как можно ниже.
Как показано на фиг. 28 сравнительного примера 7, в Fc с модификацией P238D, сильное электростатическое взаимодействие наблюдалось между Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена В и Arg в положении 131 FcγRIIb. В FcγRIIIa и FcγRIIa Н-типа, таким остатком в положении 131 является His, а в FcγRIIa R-типа, как и в случае FcγRIIb, таким остатком является Arg. В результате было обнаружено, что какого-либо отличия во взаимодействиях в этой части не наблюдалось, и по этой причине трудно определить селективность связывания с FcγRIIa R-типа.
С другой стороны, внеклеточные области FcγRIIa и FcγRIIb имеют аминокислотные последовательности с гомологией, составляющей 93%, то есть с очень высокой гомологией. Анализ кристаллической структуры комплекса, образованного между нативным Fc IgG1 (далее обозначаемым «Fc(WT)») и внеклеточной областью FcγRIIa R-типа (J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217), показал, что на границе взаимодействия между FcγRIIa R-типа и FcγRIIb, аминокислоты отличались лишь в трех положениях (Gln127, Leu132 и Phe160), а поэтому, как и ожидалось, очень трудно определить повышение селективности связывания по отношению к FcγRIIa R-типа.
Поэтому авторы настоящего изобретения считают, что для дополнительного повышения селективности и активности связывания с FcγRIIb, вводимые аминокислотные мутации должны быть детально оценены с помощью конформационного анализа тонких различий во взаимодействиях, вызываемых различиями в рецепторах путем получения не только трехмерной структуры комплекса, образованного между Fc, обладающим повышенной активностью связывания с FcγRIIb, и внеклеточной областью FcγRIIb, но также одновременно получения трехмерной структуры комплекса, образованного внеклеточной областью FcγRIIa R-типа, для которой очень трудно определить повышение селективности. Затем были проведены рентгеноструктурные анализы комплекса, образованного между внеклеточной областью FcγRIIb и Fc(P208), где модификация K439E была удалена из Fc комплекса IL6R-BP208/IL6R-L (полученного как описано в сравнительном примере 9), который представляет собой вариант, взятый за основу для продуцирования IL6R-BP230/IL6R-L, и комплекса, образованного между внеклеточной областью FcγRIIa R-типа и Fc(P208).
3-1. Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного между Fc(P208) и внеклеточной областью FcγRIIb
Трехмерную структуру комплекса внеклеточной области Fc(Р208)/FcγRIIb определяли с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,81 Å. Структура, полученная в результате такого анализа, представлена на фиг. 5. Внеклеточная область FcγRIIb расположена между двумя СН2-доменами Fc, структура которых аналогична трехмерным структурам комплексов, образованных между областью Fc(WT), представляющей собой Fc нативного IgG, и соответствующей внеклеточной областью FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 12 669-12 6674), FcγRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem 2011, 276, 16469-16477) или FcγRIIa, проанализированных ранее.
Однако детальный анализ показал, что в комплексе Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb петлевая структура в положениях 233-239 (в соответствии с Европейской нумерацией), происходящая от шарнирной области СН2-домена A Fc, отличалась от петлевой структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа, что было обусловлено введением замен G237D и P238D (фиг. 6). В результате, между главной цепью Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc(P208) и боковой цепью Tyr в положении 160 FcγRIIb (фиг. 7) образовывалась сильная водородная связь. В случае, когда в FcγRIIa Н-типа и R-типа, Tyr160 заменяли на Phe, то водородная связь не образовывалась. Поэтому можно сказать, что такая водородная связь играет важную роль в сообщении селективности, которая обеспечивает повышение активности связывания с FcγRIIb и снижение активности связывания с FcγRIIa.
С другой стороны, боковая цепь Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc(P208) не обнаруживала каких-либо явных взаимодействий с FcγRIIb, при этом также не наблюдалось взаимодействия с остатками в Fc. В Fc Ile в положении 332 (в соответствии с Европейской нумерацией), Glu в положении 333 (в соответствии с Европейской нумерацией) и Lys в положении 334 (в соответствии с Европейской нумерацией) расположены в непосредственной близости от остатка Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) (фиг. 8). Если петлевая структура была стабилизирована путем замены остатков в этих положениях гидрофильными остатками, что обеспечивало взаимодействие с боковой цепью Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), то потеря энергии в результате ее энтропии после образования водородной связи с Tyr в положении 160 FcγRIIb может быть уменьшена, что может приводить к повышению свободной энергии связывания и, тем самым, к усилению активности связывания.
Сравнение кристаллической структуры комплекса, образованного между Fc(P238D), имеющего модификацию P238D, и внеклеточной областью FcγRIIb, которая описана в сравнительном примере 7, и кристаллической структуры комплекса, образованного между Fc(P208) и внеклеточной областью FcγRIIb, где указанное сравнение проводили с помощью рентгеноструктурного анализа, показало, что Fc(P208) по сравнению с Fc(P238D) содержит пять новых мутаций, и большинство из них представляет собой замены только в боковой цепи. Однако в результате замены Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Gly в СН2-домене В Fc происходит изменение локализации на уровне главной цепи, и такие структурные изменения наблюдаются в области выше петли, образованной остатками в положениях 266-270 (в соответствии с Европейской нумерацией) (фиг. 9). Как указывается в сравнительном примере 8 для Fc(P238D), было высказано предположение, что Pro-часть в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) может иметь стереохимические затруднения, если Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) вступает в сильное электростатическое взаимодействие с Arg в положении 131 FcγRIIb. Структурные изменения, наблюдаемые после введения Gly в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией), могут быть обусловлены снятием структурного напряжения, аккумулированного в Pro-части до модификации, и при этом считается, что количество такого снятия напряжения приводит к повышению свободной энергии связывания с FcγRIIb, то есть к повышению активности связывания.
Кроме того, было подтверждено, что Arg в положении 292 (в соответствии с Европейской нумерацией) подвергается структурным изменениям, принимая две формы в результате структурных изменений петли в положениях 266-271 (в соответствии с Европейской нумерацией). В данном случае Arg в положении 292 (в соответствии с Европейской нумерацией) вступает в электростатическое взаимодействие с аминокислотой Asp в положении 268 (в соответствии с Европейской нумерацией), которая представляет собой один из других модифицированных остатков в Fc(P208) (фиг. 9), что может способствовать стабилизации этой петлевой структуры. Электростатическое взаимодействие между Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) этой петли и Arg в положении 131 FcγRIIb оказывает значительное влияние на активность связывания с FcγRIIb, а поэтому введение модификации H268D может приводить к снижению потери энергии в результате ее энтропии после связывания и к повышению свободной энергии связывания, то есть к усилению активности связывания благодаря стабилизации конформации этой петлевой структуры в FcγRIIb-связанной форме.
После проведения дополнительных исследований на возможность повышения активности посредством введения модификаций, осуществляемых на основе имеющихся результатов структурного анализа, было обнаружено, что Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) является одним из положений-кандидатов на введение модификаций. Как показано на фиг. 10, этот остаток Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена В расположен в области, в которой остаток Lys в положении 117 FcγRIIb простирается в направлении области, имеющей структуру, наиболее близкую к природной. Однако, поскольку электронная плотность Lys в положении 117 FcγRIIb не была детектирована в данном анализе, то этот остаток Lys не образует какую-либо стабильную структуру. Таким образом, в настоящее время считается, что участие этого остатка Lys во взаимодействии с Fc(P208) имеет определенные ограничения, однако, если этот остаток Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена В заменить на отрицательно заряженный остаток Asp или Glu, то можно ожидать возникновение электростатического взаимодействия с положительно заряженным остатком Lys в положении 117 FcγRIIb, которое, как предполагается, будет способствовать усилению активности связывания с FcγRIIb.
С другой стороны, анализ структуры Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене А показал, что боковая цепь этой аминокислоты образует водородные связи с главной цепью Gly в положении 236 (в соответствии с Европейской нумерацией) и стабилизирует петлевую структуру в положениях 233-239, которые являются продолжением шарнирной области и включают остаток Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), образующий водородную связь с боковой цепью Tyr160 FcγRIIb (фиг. 7). Стабилизация этой петлевой структуры с образованием нужной конформации во время связывания может приводить к снижению потери энергии в результате ее энтропии после связывания и, тем самым, к повышению свободной энергии связывания, то есть, к усилению активности связывания. С другой стороны, если этот остаток Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене А заменить на Asp или Glu, то водородная связь с главной цепью Gly в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) может быть потеряна, что, в свою очередь, может приводить к электростатическому отталкиванию между остатком Glu и остатком Asp в положении 265 (в соответствии с Европейской нумерацией), который присутствует в непосредственной близости от указанного остатка Gly, и, тем самым, будет способствовать значительной дестабилизации петлевой структуры. Такая энергия дестабилизации будет снижать свободную энергию связывания с FcγRIIb, что может приводить к снижению активности связывания.
[Экспрессия и очистка Fc(P208)]
Fc(P208) получали следующим образом. Сначала получали IL6R-ВР208 путем замены Glu в положении 439 (в соответствии с Европейской нумерацией) IL6R-BP208 (SEQ ID NO: 24) на Lys, где указанная последовательность представляет собой последовательность нативного человеческого IgG1. Затем Cys в положении 220 (в соответствии с Европейской нумерацией) IL6R-Р208 заменяли на Ser. После этого генную последовательность Fc(P208), в которой у С-конца в положении 216 присутствует Glu (в соответствии с Европейской нумерацией), клонировали с помощью ПЦР. С использованием этой клонированной генной последовательности получали экспрессионные векторы, а также осуществляли экспрессию и очистку Fc(P208) методом, описанным в сравнительном примере 1. Cys в положении 220 (в соответствии с Европейской нумерацией) образует дисульфидную связь с Cys L-цепи в природном IgG1. При получении одного Fc, L-цепь не экспрессировалась, а поэтому, для предотвращения образования нежелательных дисульфидных связей, этот остаток заменяли на Ser.
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIb]
Экспрессия и очистка были проведены методом, описанным в сравнительном примере 2.
[Очистка комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
К 1,5 мг образца внеклеточной области FcγRIIb, полученного в целях кристаллизации, добавляли 0,15 мг Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы. Этот белок выдерживали при комнатной температуре в течение трех дней в 0,1 М бис-трис-буфере при рН 6,5, и N-связанный олигосахарид отделяли, в результате чего оставался N-ацетилглюкозамин, непосредственно связанный с Asn. Затем этот образец внеклеточной области FcγRIIb, подвергнутый реакции отщепления углевода, концентрировали путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 5000, после чего его очищали с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 20 мМ HEPES при рН 7,5, содержащем 0,1М NaCl. Кроме того, к полученной фракции внеклеточной области FcγRIIb, от которой был отщеплен углевод, добавляли Fc(P208) так, чтобы молярное отношение внеклеточной области FcγRIIb было слегка повышенным, и после концентрирования этого образца путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000 получали образец комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb с последующей очисткой с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 25 мМ HEPES при рН 7,5, содержащего 0,1М NaCl.
[Кристаллизация комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
Образец комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb концентрировали с получением концентрации приблизительно 10 мг/мл с использованием фильтра для ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000, и кристаллизовали методом паровой диффузии с висячей каплей в комбинации с методом затравки кристалла. Для кристаллизации использовали пластину VDXm (Hampton Research). С использованием резервуарного раствора, содержащего 0,1М бис-трис (рН 6,5), 19% (масс/об) PEG3350 и 0,2М двухосновного фосфата калия, капли для инициации кристаллизации были получены путем смешивания резервуарного раствора и образца кристаллизации в отношении 0,85 мкл:0,85 мкл. Кристаллы комплекса, полученного в тех же условиях, измельчали с использованием сфер Seed Bead (Hampton Research) для получения раствора затравочного кристалла. 0,15 мкл разведенного раствора, полученного из раствора затравочного кристалла, добавляли к каплям для инициации кристаллизации, которые были герметично закрыты в лунках, находящихся в резервуарах, и оставляли при 20°С. В результате этого были успешно получены пластинчатые кристаллы.
[Получение рентгенографических данных для кристалла комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
Один из полученных монокристаллов комплекса Fc(P208)/внеклеточной области FcγRIIb заливали в раствор 0,1М бис-трис (рН 6,5), 24% (масс/об) PEG3350, 0,2М двухосновного фосфата калия, 20% (об/об) этиленгликоля. Кристалл промывали раствором с помощью иглы, к которой была подсоединена тонкая нейлоновая петля, и замораживали в жидком азоте, а затем проводили рентгенографический анализ с использованием BL32XU на приборе Spring-8. Во время измерений кристалл постоянно выдерживали в потоке азота при -178°С для поддержания этого кристалла в замороженном состоянии, и все 300 дифракционных изображений получали на ПЗС-детекторе МХ-225НЕ (RAYONIX), подсоединенном к источнику луча света, с одновременным вращением кристалла под углом 0,6°. Определение параметров ячейки, идентификацию пятен дифракции и обработку рентгенографических данных после получения дифракционных изображений проводили с использованием программы Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190), пакета программ XDS (Acta Cryst. 2010, D66: 125-132) и программы Scala (Acta Cryst. 2006, D62:72-82), и наконец, получали данные интенсивности дифракции с разрешением Этот кристалл принадлежал к пространственной группе C2221 и имел следующие параметры ячейки: α=90°, β=90°, γ=90°.
[Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
Кристаллическую структуру комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb определяли методом молекулярной замены с использованием программы Phaser (J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674). Исходя из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb было предположено, что число комплексов в асимметрической ячейке равно 1. Исходя из структурных координат кода PDB: 3SGJ, который представляет собой кристаллическую структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, были определены отдельные координаты аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 239-340 и В-цепи в положениях 239-340, а затем эти координаты были использованы, соответственно, в качестве моделей для поиска СН2-доменов Fc. Исходя из тех же самых структурных координат кода PDB: 3SGJ, были определены отдельные координаты аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 341-444 и В-цепи в положениях 341-443, а затем эти координаты были использованы, соответственно, в качестве моделей для поиска СН3-доменов Fc. И наконец, исходя из структурных координат кода PDB: 2FCB, который представляет собой кристаллическую структуру внеклеточной области FcγRIIb, были определены отдельные координаты аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 6-178, а затем эти координаты были использованы в качестве моделей для поиска Fc(P208). Авторами настоящего изобретения были предприняты попытки определить ориентации и положения в качестве модели для поиска каждого из СН3-доменов Fc-области, внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена Fc-области в кристаллических решетках с использованием функций вращения и функций трансляции, однако, попытка определить положение одного из СН2-доменов оказалась безуспешной. Затем, исходя из кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, было определено положение последнего СН2-домена по карте электронной плотности, которую вычисляли исходя из фазы, определенной из трех остальных частей. Таким образом, авторами настоящего изобретения была получена первоначальная модель кристаллической структуры комплекса «Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb». Если уточнение параметров твердого тела, относящегося к двум СН2-доменам Fc, двум СН3-доменам Fc и внеклеточной области FcγRIIb, осуществляли исходя из полученной первоначальной модели, то фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор, составлял 42,6%, а свободный R-фактор (R-free) составлял 43,7%, как было определено по данным интенсивности дифракции с разрешением от до Кроме того, уточнение структуры проводили с использованием программы REFMAC5 (Acta Cryst. 2011, D67, 355-367), коррекцию модели для наблюдения карт электронной плотности с коэффициентами 2Fo-Fc или Fo-Fc, которые вычисляли исходя из экспериментально определенного структурного фактора Fo, определенного фактора Fc и фазы, определенной с использованием такой модели, осуществляли с помощью программы Coot (Acta Cryst. 2010, D66: 486-501), а уточнение модели осуществляли путем повторения этих стадий. И наконец, в результате введения молекул воды в модель, полученную исходя из карты электронной плотности, где 2Fo-Fc и Fo-Fc использовали в качестве коэффициента, и после уточнения был получен фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор и R-free модели, содержащей 4786 не-водородных атомов, которые составляли 24,5% и 28,2% соответственно, как было определено по 27259 данным интенсивности дифракции с разрешением от до соответственно.
3-2. Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного между Fc(P208) и внеклеточной областью FcγRIIa R-типа
В результате структурного анализа была определена кристаллическая структура комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа с разрешением Кристаллическую структуру комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа сравнивали с кристаллической структурой комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, описанного в примере 3-1, в результате чего было обнаружено, что эти два рецептора имеют очень высокую гомологию аминокислот, причем во всех этих структурах не наблюдалось почти никаких различий (фиг. 11). Однако при детальном анализе этой структуры на уровне электронной плотности были обнаружены различия, которые могут быть использованы для повышения селективности. В FcγRIIa R-типа, остатком в положении 160 является Phe вместо Tyr, и как показано на фиг. 12, этот Phe не может образовывать водородную связь с главной цепью аминокислотного остатка в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена A Fc, который участвует в связывании между FcγRIIb и Fc, содержащим модификацию P238D. Хотя введение модификации P238D является главным фактором в повышении селективности связывания с FcγRIIa R-типа, однако, дополнительное сравнение на уровне электронной плотности показало, что в комплексе, образованном FcγRIIb, электронная плотность боковых цепей Leu в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) или Leu в положении 234 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене A Fc может быть зарегистрирована, тогда как электронные плотности этих боковых цепей в комплексе, образованном FcγRIIa R-типа, не были детектированы, а петля, расположенная рядом с положением 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), может подвергаться флуктуации, что обусловлено снижением степени взаимодействия с FcγRIIa R-типа вокруг этой области. С другой стороны, при сравнении структур той же самой области со структурой СН2-домена В (фиг. 13) было обнаружено, что электронная плотность Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) может быть подтверждена в структуре комплекса, образованного FcγRIIb, тогда как электронная плотность приблизительно трех остатков, расположенных выше Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), может быть подтверждена для комплекса, образованного FcγRIIa R-типа, и по сравнению с уровнем связывания с FcγRIIb, эта область, вероятно, является более широкой для взаимодействия. Полученные данные позволяют предположить, что в области, простирающейся от положения 234 до положения 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc(P208), боковая цепь СН2-домена А может вносить значительный вклад в связывание с FcγRIIb, а боковая цепь СН2-домена В может вносить значительный вклад в связывание с FcγRIIaR.
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIa R-типа]
Экспрессия и очистка были проведены методом, описанным в сравнительном примере 2.
[Очистка комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа]
К 1,5 мг очищенного образца внеклеточной области FcγRIIa R-типа добавляли 0,15 мг Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы, 20 мкл 5 ед/мл Endo F2 (QA-bio) и 20 мкл 5 ед/мл Endo F3 (QA-bio). Этот белок выдерживали при комнатной температуре в течение девяти дней в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 4,5), а затем добавляли 0,07 мг Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы, 7,5 мкл 5 ед/мл Endo F2 (QA-bio) и 7,5 мкл 5 ед/мл Endo F3 (QA-bio). Этот белок выдерживали при комнатной температуре в течение еще трех дней, и N-связанный олигосахарид отделяли, в результате чего оставался N-ацетилглюкозамин, непосредственно связанный с Asn. Затем этот образец внеклеточного домена FcγRIIa R-типа, подвергнутый реакции отщепления сахарной цепи, концентрировали путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000, после чего его очищали с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 25 мМ HEPES (рН 7), содержащем 0,1М NaCl. Кроме того, к полученной фракции внеклеточной области FcγRIIa R-типа, от которой была отщеплена сахарная цепь, добавляли Fc(P208) так, чтобы молярное соотношение внеклеточной области FcγRIIa R-типа было слегка повышенным, и после концентрирования этого образца путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000 получали образец комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа с последующей очисткой с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 25 мМ HEPES (рН 7), содержащем 0,1М NaCl.
[Кристаллизация комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа]
Образец комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа, концентрированный приблизительно до 10 мг/мл с помощью фильтра для ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000, кристаллизовали методом паровой диффузии с сидячей каплей. С использованием резервуарного раствора, содержащего 0,1М бис-трис (рН 7,5), 26% (масс/об) PEG3350 и 0,2М сульфата аммония, капли для инициации кристаллизации были получены путем смешивания резервуарного раствора и образца кристаллизации в соотношении 0,8 мкл:1,0 мкл. Затем капли герметично закрывали и оставляли при 20°С. В результате этого были успешно получены пластинчатые кристаллы.
[Данные рентгенографических анализов для кристалла комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа]
Полученный монокристалл комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа заливали в раствор 0,1М бис-трис (рН 7,5), 27,5% (масс/об) PEG3350, 0,2М сульфата аммония, 20% (об/об) глицерина. Затем кристалл промывали раствором с помощью иглы, к которой была подсоединена тонкая нейлоновая петля, и замораживали в жидком азоте. Рентгенографический анализ монокристалла проводили на синхротронном излучателе Photon Factory BL-17A в научно-исследовательском институте высоких энергий. Во время измерений кристалл постоянно выдерживали в потоке азота при -178°С для его поддержания в замороженном состоянии. Все 225 дифракционных изображений этого монокристалла получали на ПЗС-детекторе Quantum 315r (ADSC), подсоединенном к источнику луча света, с одновременным вращением кристалла под углом 0,6°. Исходя из полученных дифракционных изображений, определение констант ячейки, идентификацию пятен дифракции и обработку рентгенографических данных проводили с использованием программы Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010), 43, 186-190), пакета программ XDS (Acta Cryst. (2010), D66: 125-132) и программы Scala (Acta Cryst. (2006), D62:72-82). И наконец, получали данные интенсивности дифракции с разрешением Этот кристалл принадлежал к пространственной группе C2221 и имел следующие параметры ячейки: α=90°, β=90°, γ=90°.
[Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа]
Структуру комплекса определяли методом молекулярной замены с использованием программы Phaser (J. Appl. Cryst. (2007), 40, 658-674). Исходя из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIa R-типа было предположено, что число комплексов в асимметрической ячейке равно 1. С использованием кристаллографической структуры комплекса Fc(Р208)/внеклеточная область FcγRIIb в качестве поисковой модели, полученной как описано в примере 3-1, были определены ориентация и положение в в кристаллических решетках с использованием функций вращения и функций трансляции. После уточнения параметров твердого тела, относящегося к двум СН2-доменам Fc, двум СН3-доменам Fc и внеклеточной области FcγRIIa R-типа, исходя из полученной первоначальной модели, определяли фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор, который составлял 38,4%, а свободный R-фактор (R-free) составлял 38,0%, как было определено по данным интенсивности дифракции с разрешением от до Затем уточнение структурной модели проводили путем повторения уточнений структуры с использованием программы REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367), с последующей коррекцией модели, проводимой с использованием программы Coot (Acta Cryst. 2010, D66: 486-501) по картам электронной плотности с коэффициентами 2Fo-Fc и Fo-Fc, которые вычисляли исходя из экспериментально определенного структурного фактора Fo, определенного фактора Fc и фазы, определенной с использованием такой модели. И наконец, в результате введения молекул воды в модель, полученную исходя из карты электронной плотности, где 2Fo-Fc или Fo-Fc использовали в качестве коэффициента, и последующего уточнения получали фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор и R-free модели, содержащей 4758 не-водородных атомов, которые составляли 26,3% и 29,8% соответственно, как было определено по 24838 данным интенсивности дифракции с разрешением от до соответственно.
[Пример 4] Fc-варианты, в которых сайты с модификациями были определены исходя из кристаллических структур
Как указывалось в примере 3, предполагается, что электростатическое взаимодействие между Asp в положении 268 (в соответствии с Европейской нумерацией) и Arg в положении 292 (в соответствии с Европейской нумерацией) является результатом структурных изменений, которые, вероятно, обусловлены введением модификации P271G в СН2-домен В варианта Fc(P208) с повышенной активностью связывания с FcγRIIb (фиг. 9). Такое взаимодействие способствует стабилизации петлевой структуры в положениях 266-271 (в соответствии с Европейской нумерацией) и может вносить свой вклад в повышение активности связывания с FcγRIIb. В соответствии с этим, был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли такое усиление электростатического взаимодействия с Arg в положении 292 в FcγRIIb стабилизировать эту петлевую структуру посредством замены Asp в положении 268 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu и повышать активность взаимодействия с FcγRIIb. Кроме того, как показано на фиг. 8, Tyr в положении 160 (в соответствии с Европейской нумерацией) FcγRIIb образует водородные связи с главной цепью Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена A Fc(P208) и играет важную роль в связывании с FcγRIIb. Хотя часть боковой цепи Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) не вступает в какое-либо конкретное взаимодействие, однако, Ile в положении 332 (в соответствии с Европейской нумерацией), Glu в положении 333 (в соответствии с Европейской нумерацией) и Lys в положении 334 (в соответствии с Европейской нумерацией) расположены в непосредственной близости в этой молекуле. Был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли замена остатков в этих сайтах гидрофильными остатками усиливать взаимодействие с Asp в положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) и стабилизировать петлевую структуру, находящуюся поблизости от этого остатка, а также усиливать взаимодействие с Tyr в положении 160 FcγRIIb.
Варианты были получены путем введения замен Н268Е, I332T, I332S, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, Е333Т, K334S, K334T и K334E в антитело IL6R-BP230/IL6R-L (SEQ ID NO: 27/SEQ ID NO: 21), которое было продуцировано, как описано в примере 2. IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используют как L-цепь антитела. Эти варианты были использованы для экспрессии и очистки антител методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 2. В данной таблице «модификации» означают модификации, вводимые в IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 23). IL6R-B3/IL6R-L, которые используются в качестве матрицы для продуцирования IL6R-BP230, отмечены звездочкой (*). В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 2 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, указывающим на то, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа, а поэтому они были вычислены по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2.
Активность связывания IL6R-BP264/IL6R-L, IL6R-BP465/IL6R-L, IL6R-BP466/IL6R-L и IL6R-BP470 с FcγRIIb и селективность связывания этих антител с FcγRIIb после введения модификаций Н268Е, E333K, E333R и Е333Т, соответственно, в IL6R-BP230/IL6R-L повышались по сравнению с активностью и селективностью IL6R-BP230/IL6R-L. Селективность связывания IL6R-BP391/IL6R-L с FcγRIIb после введения модификации I332T снижалась, а активность связывания этого антитела с FcγRIIb повышалась по сравнению с активностью и селективностью связывания IL6R-BP230/IL6R-L.
[Пример 5] Введение всех возможных модификаций в область, находящуюся возле положения 271 (в соответствии с Европейской нумерацией)
При сравнении рентгенографической кристаллической структуры комплекса, образованного между Fc(P238D), несущего модификацию P238D, и внеклеточной областью FcγRIIb, и рентгенографической кристаллической структуры комплекса, образованного между Fc(P208) и внеклеточной областью FcγRIIb, было обнаружено, что структура, находящаяся возле положения 271 (в соответствии с Европейской нумерацией), подвергается наибольшему изменению (фиг. 9). Как указывалось в сравнительном примере 8, предполагается, что в Fc(P238D), если Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) вступает в сильное электростатическое взаимодействие с Arg в положении 131 FcγRIIb, то Pro-часть в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) может иметь стереохимические затруднения. В структуре Fc(Р208)/FcγRIIb введение модификации P271G приводит к позитивным изменениям на уровне главной цепи и способствует устранению такого структурного затруднения. В результате, структура, находящаяся поблизости от положения 271 (в соответствии с Европейской нумерацией), может подвергаться значительным изменениям. При эффективном введении модификаций, которые стабилизируют такую измененную структуру, потеря энергии в результате ее энтропии после электростатического взаимодействия с Arg в положении 131 FcγRIIb может быть уменьшена, что будет способствовать повышению активности связывания. В соответствии с этим, в область, расположенную возле положения 271 (в соответствии с Европейской нумерацией), были введены все возможные модификации для проведения скрининга на модификации, которые будут способствовать повышению активности связывания с FcγRIIb или селективности связывания с FcγRIIb.
Антитело IL6R-BP267 (SEQ ID NO: 29), полученное путем введения E233D, G237D, P238D, Н268Е и P271G в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23), использовали в качестве матрицы для введения всех возможных модификаций. Аминокислоты в положениях 264, 265, 266, 267, 269 и 272 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-ВР267 были по отдельности заменены любой из 18 аминокислот, не являющихся исходными аминокислотами и Cys. IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используют как L-цепь антитела. Эти варианты были использованы для экспрессии и очистки антител методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2. Все полученные варианты, обладающие повышенной активностью или селективностью связывания с FcγRIIb, по сравнению с вариантом IL6R-BP267/IL6R-L, в который не была введена модификация, систематизированы в таблице 3.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 3. В данной таблице «модификация, введенная в IL6R-BP267» означает модификацию, введенную в антитело IL6R-BP267 (SEQ ID NO: 29), которое используется в качестве матрицы. IL6R-B3/IL6R-L, которое используется в качестве родительского антитела для продуцирования IL6R-B3, отмечено звездочкой (*). В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 3 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, указывающим на то, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа, а поэтому они были вычислены по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2.
Все активности связывания вариантов, представленных в таблице 3, с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV, были аналогичны активностям IL6R-B3/IL6R-L или ниже этих активностей. Кроме того, FcγRIIb-связывающая активность вариантов, полученных путем введения модификаций S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G и V266M, соответственно, в IL6R-BP267/IL6R-L, превышала активность IL6R-BP267/IL6R-L до введения модификации. Кроме того, величины KD(IIaR)/KD(IIb) для вариантов, полученных путем введения S267A, S267G, Е272М, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I и E272F, соответственно, в IL6R-BP267/IL6R-L, превышали величины для варианта IL6R-BP267/IL6R-L до введения модификации, что указывало на повышение селективности связывания с FcγRIIb.
[Пример 6] Повышение активности связывания с FcγRIIb путем введения модификаций в СН3-область
Сообщалось, что замена Pro на Leu в положении 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) приводит к повышению активности связывания с FcγRIIb (Cancer Res., (2007) 67, 8882-8890). Аминокислота в положении 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) не принимает непосредственного участия во взаимодействии с FcγR. Однако было высказано предположение, что такая аминокислота может влиять на взаимодействие с FcγR после изменения структуры антитела. Таким образом, авторами настоящего изобретения был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли повышение активности связывания с FcγRIIb или повышение селективности связывания с FcγRIIb стимулироваться введением всех возможных аминокислотных модификаций в положение 396 (в соответствии с Европейской нумерацией).
Антитело IL6R-BP423 (SEQ ID NO: 33), полученное путем введения модификаций E233D, G237D, P238D, S267A, Н268Е, P271G и A330R в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23), использовали в качестве матрицы. Варианты были получены путем замены аминокислоты в положении 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-BP423 любой из 18 аминокислот, не являющихся исходной аминокислотой и цистеином. IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используют как L-цепь антитела. Эти варианты были использованы для экспрессии и очистки антител методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2. Связывание полученных вариантов с каждым FcγR систематизировано в таблице 4.
В этой таблице термин «модификация, введенная в IL6R-BP423» означает модификацию, введенную в антитело IL6R-BP423. Антитело IL6R-B3/IL6R-L, которое используется в качестве матрицы для продуцирования IL6R-BP423, отмечено звездочкой (*). В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 4 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, указывающим на то, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа, а поэтому они были вычислены по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2.
Результаты, представленные в таблице 4, продемонстрировали, что FcγRIIb-связывающая активность антитела IL6R-BP456/IL6R-L, полученного путем введения Р396М в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP455/IL6R-L, полученного путем введения P396L в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP464/IL6R-L, полученного путем введения P396Y в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP450/IL6R-L, полученного путем введения P396F в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP448/IL6R-L, полученного путем введения P396D в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP458/IL6R-L, полученного путем введения P396Q в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP453/IL6R-L, полученного путем введения P396I в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP449/IL6R-L, полученного путем введения Р396Е в IL6R-BP423/IL6R-L; антитела IL6R-BP454/IL6R-L, полученного путем введения P396K в IL6R-BP423/IL6R-L, и антитела IL6R-BP459/IL6R-L, полученного путем введения P396R в IL6R-BP423/IL6R-L, превышала активность IL6R-BP423/IL6R до введения модификаций. Кроме того, величина KD(IIaR)/KD(IIb) для IL6R-BP456/IL6R-L, полученного путем введения Р396М в IL6R-BP423/IL6R-L, превышала величину для IL6R-BP423/IL6R-L до введения модификации, что указывало на повышение селективности связывания с FcγRIIb. Как видно из таблицы 4, аффинность связывания полученных вариантов с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV была ниже, чем аффинность IL6R-B3/IL6R-L, который представляет собой родительский полипептид.
[Пример 7] Получение вариантов с повышенной активностью связывания с FcγRIIb с использованием последовательностей различных подклассов
Человеческие IgG имеют различные подклассы, и профили их связывания с FcγR варьируются. Авторами настоящего изобретения был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли различие в аффинностях связывания IgG1 и IgG4 с каждым FcγR приводить к повышению активности и/или селективности связывания с FcγRIIb.
Сначала, IgG1 и IgG4 были проанализированы на их аффинность связывания с каждым из FcγR. Антитело IL6R-G4d (SEQ ID NO: 30), содержащее G4d, было сконструировано в виде Н-цепи. В G4d отсутствуют С-концевые Gly и Lys, а в человеческом IgG4 Ser заменен на Pro в положении 228 (в соответствии с Европейской нумерацией). IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используют как L-цепь антитела. IL6R-G1d/IL6R-L и IL6R-G4d/IL6R-L были использованы для экспрессии и очистки методом, описанным в сравнительном примере 1. Эти варианты были оценены на связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb или FcγRIIIa V-типа) методом, описанным в сравнительном примере 2. Связывание полученных вариантов с каждым FcγR систематизировано в таблице 5.
При сравнении IL6R-G4d/IL6R-L с IL6R-G4d/IL6R-L было обнаружено, что IL6R-G4d/IL6R-L обладает в 1,5 раза большей активностью связывания с FcγRIIb ив 2,2 раза меньшей активностью связывания с FcγRIIaR. Кроме того, IL6R-G4d/IL6R-L, по сравнению с IL6R-G1d/IL6R-L, обладал меньшей аффинностью связывания с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV. Вышеупомянутые результаты показали, что IL6R-G4d, по сравнению с IL6R-G1d, обладает превосходной селективностью и активностью связывания с FcγRIIb.
На фигуре 14 проиллюстрировано сравнение последовательностей G1d и G4d, простирающихся от CH1-домена и до С-конца (в положениях 118-445 (в соответствии с Европейской нумерацией)). Представленные в рамках аминокислоты на фиг. 14 означают остатки, которые отличаются в G1d и G4d. Несколько сайтов, которые, как было предсказано, участвуют во взаимодействии с FcγR, были выбраны из сайтов, имеющих различные аминокислоты, и был проведен анализ для того, чтобы определить, можно ли достичь еще большего повышения селективности и активности связывания путем переноса последовательности G4d, обладающей превосходной селективностью и активностью связывания с FcγRIIb, в варианты с повышенной активностью связывания с FcγRIIb.
В частности, антитело IL6R-BP473 было получено путем введения A327G в IL6R-BP230; антитело IL6R-BP472 было получено путем введения A330S в IL6R-BP230; антитело IL6R-BP471 было получено путем введения P331S в IL6R-BP230; антитело IL6R-BP474 было получено путем введения A330S и P331S в IL6R-BP230; антитело IL6R-BP475 было получено путем введения A327G и A330S в IL6R-BP230; антитело IL6R-BP476 было получено путем введения A327G, A330S и P331S в IL6R-BP230; а антитело IL6R-BP477 было получено путем введения A327G и P331S в IL6R-BP230. Кроме того, IL6R-BP478 (SEQ ID NO: 31) получали путем замены последовательности, простирающейся от Ala в положении 118 и до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией), в IL6R-BP230, последовательностью G4d (с Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией)). IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используют как L-цепь антитела. Эти варианты были использованы для экспрессии и очистки методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание этих вариантов с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb или FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым из FcγR представлены в таблице 6. В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Термин «модификация(и), введенная(ые) в IL6R-ВР230» означает модификацию, введенную в антитело IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L, которое используется в качестве матрицы для продуцирования IL6R-BP230, отмечено *1. Кроме того, антитело IL6R-B478 (SEQ ID NO: 31), в котором сегмент, простирающийся от Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-BP230, заменен последовательностью G4d (от Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией)), обозначено *2. Термин «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 6 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, указывающим на то, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа, а поэтому они были вычислены по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2.
Из вариантов, описанных в таблице 6, антитело IL6R-BP473/IL6R-L, в которое была введена замена A327G, обнаруживало активность связывания с FcγRIIb, которая в 1,2 раза превышала активность IL6R-BP230/IL6R-L. По сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L, антитело IL6R-BP478/IL6R-L, полученное путем замены последовательности, простирающейся от Ala в положении 118 и до Thr в положении 225 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-BP230, последовательностью G4d (от Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (в соответствии с Европейской нумерацией)), обнаруживало 1,1-кратное увеличение активности связывания с FcγRIIb и с FcγRIIaR. По сравнению с антителом IL6R-B3/IL6R-L, которое представляет собой родительский пептид, все варианты обладали более низкой аффинностью связывания с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV.
Кроме того, как показано на фиг. 14, другие сайты, в которых аминокислоты отличаются в последовательности G1d и G4d, включают положения 268, 274, 296, 355, 356, 358, 409, 419 и 445 (в соответствии с Европейской нумерацией). Поэтому, в результате замены этих сайтов аминокислотами, происходящими от IgG4, может быть повышена селективность и активность связывания с FcγRIIb.
Проведенные ранее исследования показали, что введение замены A327G, которая имеется в последовательности человеческого IgG4, в вариант IL6R-BP230/IL6R-L приводило к повышению активности связывания с FcγRIIb. Части, которые не соответствовали последовательностям IgG4 и IgG1, были подвергнуты дополнительному анализу.
В частности, были получены варианты путем введения в антитело IL6R-BP230, которое представляет собой Н-цепь антитела, следующих модификаций: K274Q, введенной для продуцирования IL6R-ВР541; Y296F, введенной для продуцирования IL6R-BP542; H268Q, введенной для продуцирования IL6R-BP543; R355Q, введенной для продуцирования IL6R-BP544; D356E, введенной для продуцирования IL6R-BP545; L358M, введенной для продуцирования IL6R-BP546; K409R, введенной для продуцирования IL6R-BP547; и Q419E, введенной для продуцирования IL6R-BP548. Кроме того, IL6R-L обычно используют как L-цепь антитела. Антитела, содержащие вышеуказанный вариант тяжелой цепи и IL6R-L легкой цепи, очищали методами, описанными в сравнительном примере 1. Очищенные антитела оценивали на их связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 7. В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. В этой таблице «модификации, введенные в IL6R-BP230» означают модификации, введенные в антитело IL6R-ВР230. Кроме того, IL6R-B3/IL6R-L, которое используется в качестве матрицы для продуцирования IL6R-BP230, отмечено *1. «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 7 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, вычисленным по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2, где было показано, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа.
Как показано в таблице 7, по сравнению с вариантом IL6R-BP230/IL6R-L до модификации, вариант IL6R-BP541/IL6R-L, полученный путем введения K274Q в IL6R-BP230/IL6R-L; вариант IL6R-BP544/IL6R-L, полученный путем введения R355Q в IL6R-BP230/IL6R-L; вариант IL6R-BP545/IL6R-L, полученный путем введения D356E в IL6R-BP230/IL6R-L; и вариант IL6R-BP546/IL6R-L, полученный путем введения L358M в IL6R-BP230/IL6R-L, обладали повышенной активностью связывания с FcγRIIb. Из этих вариантов вариант IL6R-BP544/IL6R-L, полученный путем введения R355Q в IL6R-BP230/IL6R-L; вариант IL6R-BP545/IL6R-L, полученный путем введения D356E в IL6R-BP230/IL6R-L; и вариант IL6R-BP546/IL6R-L, полученный путем введения L358M в IL6R-BP230/IL6R-L, имели более высокие величины KD(IIaR)/KD(IIb) по сравнению с величинами для IL6R-BP230/IL6R-L до модификации, что указывает на то, что такие модификации также повышают селективность связывания с FcγRIIb.
[Пример 8] Оценка комбинаций модификаций, которые приводят к повышению селективности и активности связывания с FcγRIIb
Комбинации модификаций, которые, как было обнаружено в предыдущих исследованиях, повышают селективность или активность связывания с FcγRIIb, оценивали для дополнительной оптимизации.
Комбинацию модификаций, которая повышает активность и/или селективность связывания с FcγRIIb, как было обнаружено в предыдущих исследованиях, вводили в IL6R-B3. Для сравнения с контролем был продуцирован вариант IL6R-BP253 путем введения модификаций S267E и L328F, которые, как известно, повышают активность связывания с FcγRIIb (Seung et al., Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933), в IL6R-B3. IL6R-L использовали в качестве L-цепи антитела. Антитело, содержащее вышеупомянутый вариант тяжелой цепи и легкой цепи IL6R-L, который был экспрессирован методом, описанным в сравнительном примере 1, очищали. Связывание очищенного антитела с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb и FcγRIIIaV) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 8. В этой таблице «модификация» означает модификации, введенные в IL6R-B3. Кроме того, антитело IL6R-B3/IL6R-L, которое используется в качестве матрицы для продуцирования каждого из вариантов, отмечено звездочкой (*). «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания соответствующего варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого соответствующего варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIaR. «KD(IIaH)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH на величину KD для связывания этого соответствующего варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIaH. В таблице 8 числа в закрашенных серым ячейках относятся к величинам, вычисленным по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2, где было показано, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа.
Из вариантов, описанных в таблице 8, антитело IL6R-BP253/IL6R-L, полученное путем введения известных модификаций, повышающих активность связывания с FcγRIIb, обладало активностью связывания с FcγRIIb и FcγRIIaR, которая, соответственно, в 277 раз и 529 раз превышала активность связывания IL6R-B3/IL6R-L до модификации. Кроме того, FcγRIa-связывающая активность IL6R-BP253/IL6R-L также превышала активность IL6R-B3/IL6R-L. С другой стороны, активность связывания IL6R-BP253/IL6R-L с FcγRIIaH и FcγRIIIaV была ниже активности IL6R-B3/IL6R-L. Что касается других вариантов, то активность связывания IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP438/IL6R-L, IL6R-BP567/IL6R-L и IL6R-BP568/IL6R-L с FcγRIa слегка превышала активность связывания IL6R-B3/IL6R-L до модификации, однако, все другие варианты имели пониженную активность связывания с FcγRIa. Кроме того, активность связывания всех вариантов с FcγRIIaH и FcγRIIIaV была ниже, чем активность связывания IL6R-B3/IL6R-L.
Проводимое в этом исследовании сравнение полученных вариантов с существующим вариантом IL6R-BP253/IL6R-L, обладающим повышенной активностью связывания с FcγRIIb, показало, что величина KD(IIaH)/KD(IIb) для IL6R-BP480/IL6R-L составляла 107,7 и является наименьшей величиной, а для IL6R-BP426/IL6R-L она составляла 8362 и является наибольшей величиной, причем величины для всех вариантов превышали величину 107,1 для IL6R-BP253/IL6R-L. Кроме того, величина KD(IIaR)/KD(IIb) для IL6R-BP479/IL6R-L составляла 16,1 и является наименьшей величиной, а для IL6R-BP567/IL6R-L она составляла 64,4 и является наибольшей величиной, причем величины для всех вариантов превышали величину 0,2 для IL6R-BP253/IL6R-L. Исходя из этих результатов было установлено, что все варианты, представленные в таблице 8, обладают повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с существующим вариантом, в который была(и) введена(ы) модификация(и) для повышения активности связывания с FcγRIIb. В частности, все варианты IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R-BP493/IL6R-L, IL6R-BP557/IL6R-L, IL6R-BP492/IL6R-L, IL6R-BP500/IL6R-L и IL6R-BP567/IL6R-L обладали активностью связывания с FcγRIIaR, которая не более чем в 1,5 раза превышала активность IL6R-B3/IL6R-L, и в то же время активность связывания с FcγRIIb была выше в 100 раз или более, а поэтому эти варианты, как и предполагалось, обладали повышенной активностью связывания с FcγRIIb, но при этом не давали побочных эффектов, вызываемых повышением активности связывания с FcγRIIaR.
Кроме того, что касается вариантов IL6R-BP489/IL6R-L, IL6R-BP487/IL6R-L, IL6R-BP499/IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, IL6R-BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, IL6R-BP552/IL6R-L, IL6R-BP507/IL6R-L, IL6R-BP536/IL6R-L, IL6R-BP534/IL6R-L, IL6R-BP491/IL6R-L, IL6R-BP553/IL6R-L, IL6R-BP532/IL6R-L, IL6R-BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, IL6R-BP531/IL6R-L, IL6R-BP510/IL6R-L, IL6R-BP535/IL6R-L, IL6R-BP497/IL6R-L, IL6R-BP533/IL6R-L, IL6R-BP555/IL6R-L, IL6R-BP554/IL6R-L, IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP440/IL6R-L, IL6R-BP538/IL6R-L, IL6R-BP429/IL6R-L, IL6R-BP438/IL6R-L, IL6R-BP565/IL6R-L, IL6R-BP540/IL6R-L, IL6R-BP426/IL6R-L, IL6R-BP437/IL6R-L, IL6R-BP439/IL6R-L, IL6R-BP551/IL6R-L, IL6R-BP494/IL6R-L, IL6R-BP537/IL6R-L, IL6R-BP550/IL6R-L, IL6R-BP556/IL6R-L, IL6R-BP539/IL6R-L, IL6R-BP558/IL6R-L, IL6R-BP425/IL6R-L и IL6R-BP495/IL6R-L, то их активность связывания с FcγRIIb превышает активность связывания существующего варианта IL6R-BP253/IL6R-L, в который была введена модификация для повышения активности связывания с FcγRIIb. Кроме того, активность связывания с FcγRIIb для вариантов от IL6R-BP489/IL6R-L до IL6R-BP495/IL6R-L была выше, чем активность связывания IL6R-B3/IL6R-L (которая принималась за 1), и в 321 раз (наименьшая) - 3100 раз (наибольшая) превышала активность связывания IL6R-B3/IL6R-L, соответственно. Поэтому можно сказать, что, с точки зрения селективности и активности связывания с FcγRIIb, эти варианты являются наилучшими из всех вариантов, полученных по существующей технологии.
В настоящем изобретении варианты, родственные варианту IL6R-BP567/IL6R-L, который рассматривается как наилучший с точки зрения селективности и активности связывания с FcγRIIb, были исследованы на их перспективность в отношении иммуногенности. Модификация Y296D была введена в вариант IL6R-BP567/IL6R-L, который обнаруживал наивысшую селективность связывания, и в вариант IL6R-BP493/IL6R-L, который обнаруживал активность связывания с FcγRIIaR, полностью эквивалентную активности нативной формы и в 147 раз превышающую активность связывания с FcγRIIb. Сообщалось, что в последовательность Tregitope была введена модификация Y296 (De Groot et al. Blood (2008) 112, 3303-3311), и введение модификаций в этот сайт может приводить к потере иммуносупрессорных функций, которыми обычно обладает нативный IgG1. Поэтому варианты, в которые не была введена модификация Y296D, являются более предпочтительными с точки зрения возможной иммуногенности. IL6R-BP568/IL6R-L и IL6R-BP492/IL6R-L были получены путем удаления модификации Y296D из IL6R-BP567/IL6R-L и IL6R-BP493/IL6R-L, соответственно. Принимая во внимание селективность и активность связывания с FcγRIIb, следует отметить, что удаление модификации Y296D из IL6R-BP492/IL6R-L и IL6R-BP568/IL6R-L будет приводить к снижению селективности и активности связывания по сравнению с селективностью и активностью связывания варианта, имеющего Y296D. Однако, по сравнению с нативной формой, активность связывания IL6R-BP568/IL6R-L с FcγRIIaR была в 1,6 раза выше, а с FcγRIIb - в 211 раз выше; а активность связывания IL6R-BP492/IL6R-L с FcγRIIaR была в 1,2 раза выше, а с FcγRIIb - в 131 раз выше; и отсюда следует, что высокая активность и селективность связывания этих вариантов все еще сохранялась. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что IL6R-BP568/IL6R-L и IL6R-BP492/IL6R-L являются превосходными вариантами не только с точки зрения селективности и активности связывания с FcγRIIb, но также и с точки зрения иммуногенности.
[Пример 9] Повышение активности связывания гетеродимеризованного антитела с FcγRIIb
9-1. Оценка результатов введения P238D только в одну из цепей
Как показано на фиг. 26 в сравнительном примере 7, причина того, что Fc(P238D) приобретает высокую активность связывания с FcγRIIb после введения модификации P238D, заключается в том, что область, которая имеет гидрофобную сердцевину с окружающими ее остатками в случае Pro, не может существовать в гидрофобной сердцевине после замены этого остатка на Asp и расширяется в сторону растворителя, что приводит к значительному изменению петлевой структуры домена А. Однако, следует проверить, необходимо ли введение модификации P238D в обе цепи и допустимо ли введение этой модификации в одну из цепей, и других модификаций - в другую цепь. В соответствии с этим, для такого подтверждения были использованы гетеродимеризованные антитела с различными модификациями, вводимыми в каждую Н-цепь антитела.
Вариабельная область (SEQ ID NO: 15) антитела против глипикана 3, содержащая CDR антитела GpH7, которое представляет собой антитело против глипикана 3, обладающее повышенной кинетикой в плазме, как описано в WO 2009/041062, была использована в качестве Н-цепи антитела. Было использовано антитело GpH7-A5 (SEQ ID NO: 35), полученное путем введения модификаций D356K и H435R в GpH7-G1d (SEQ ID NO: 34), где Gly и Lys были удалены из С-конца IgG1, несущего GpH7 в качестве вариабельной области, и антитело GpH7-B3 (SEQ ID NO: 17), полученное путем введения модификации K439E в GpH7-G1d. Модификации D356K и K439E были введены в соответствующие Н-цепи для более эффективного образования гетеродимеров в каждой Н-цепи при продуцировании гетеродимеризованных антител, содержащих две Н-цепи (WO 2006/106905). H435R представляет собой модификацию, которая ингибирует связывание с белком А, и которая была введена для эффективного отделения димерного гетеромера, содержащего две Н-цепи, в каждую из которых были введены различные модификации, от димерного гомомера, содержащего две Н-цепи, в каждую из которых были введены одинаковые модификации. Варианты, в которых аминокислоты в положениях 236, 237 и 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) антитела GpH7-B3 (SEQ ID NO: 17), полученного, как описано в сравнительном примере 1, были заменены исходными аминокислотами и Cys, использовали в качестве одной из Н-цепей. Антитело GpH7-AP001, полученное путем введения P238D в GpH7-A5 (SEQ ID NO: 35), использовали в качестве другой цепи. Вариант GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16) антитела против глипикана 3, обладающего повышенной кинетикой в плазме, как описано в WO 2009/041062, был использован в качестве L-цепи антитела. Эти варианты были экспрессированы и очищены методом, описанным в сравнительном примере 1, а активность связывания с FcγRIIa R-типа и с FcγRIIb оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2. Активность связывания каждого варианта с FcγR представлена на фиг. 15.
Модификации G237W, G237F, G236N, P238G, P238N, Р238Е и P238D, представленные на фиг. 15, означают модификации, вводимые в GpH7-B3. А5/В3 означает вариант GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, в который не были введены модификации ни в одну из цепей, а вариант, содержащий P238D только в одной из этих цепей, обозначен GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0. Полученные результаты представлены в таблице 9.
В таблице 9 «активность связывания с FcγRIIb/активность связывания с FcγRIIaR» означает величины, полученные путем деления активности связывания каждого варианта с FcγRIIb на активность связывания каждого варианта с FcγRIIaR, и, как было показано, чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. Кроме того, «модификация, введенная в GpH7-А5» и «модификация, введенная в GpH7-B3» означает модификации, введенные в GpH7-A5 и GpH7-B3, соответственно, а вариант GpH7-G1d, который был использован в качестве матрицы при продуцировании GpH7-A5 и GpH7-B3, показан звездочкой (*). Результаты, представленные в таблице 9, показали, что вариант GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0, имеющий модификацию P238D, введенную в обе цепи, имеет наивысшую селективность связывания с FcγRIIb. Варианты GpH7-AP001/GpH7-BP061/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP069/GpL16-k0 и GpH7-AP001/GpH7-BP063/GpL16-k0, которые содержат модификации Р238Е, P238N и P238G в другой цепи, имеют величины «активности связывания с FcγRIIb/активности связывания с FcγRIIaR», составляющие 2,9, 2,2 и 1,7, соответственно, и эти варианты сохраняют высокую селективность связывания с FcγRIIb даже по сравнению с селективностью связывания вариантов GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0, имеющих модификацию P238D в обеих цепях. Кроме того, поскольку вариант GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0, имеющий модификацию P238D в обеих цепях, также сохраняет 69% аффинности связывания с FcγRIIb или более, то можно сказать, что, если модификация P238D присутствует в одной из этих цепей, то другая цепь может иметь модификацию Р238Е, P238N или P238G. Кроме того, что касается активности связывания с FcγRIIb, то по сравнению с вариантом GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0, имеющим модификацию P238D в обеих цепях, вариант GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0, который имеет модификацию P238D только в одной из цепей и не имеет модификации в другой цепи, обладает более высокой активностью с FcγRIIb, а варианты GpH7-AP001/GpH7-BP032/GpL16-k0, GpH7-AP001/GpH7-BP044/GpL16-k0 и GpH7-AP001/GpH7-BP057/GpL16-k0, которые имеют модификацию P238D в одной из цепей и модификации G236N, G237F и G237W, соответственно, в другой цепи, обладают еще большей активностью связывания с FcγRIIb.
9-2. Подтверждение модификаций на основе информации о структуре Fc(Р208)/FcγRIIb
Как показано на фиг. 10, в кристаллической структуре Fc(Р208)/FcγRIIb электронная плотность Lys в положении 117 FcγRIIb не наблюдалась, и этот остаток не рассматривался как остаток, играющий важную роль в связывании с Fc(P208), однако, после замены Ser на Asp или Glu в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) СН2-домена В, который расположен поблизости, этот остаток Lys может вступать в электростатическое взаимодействие в положении 117 FcγRIIb. С другой стороны, как показано на фиг. 7, в СН2-домене А остаток Ser в положении 239 (в соответствии с Европейской нумерацией) образует водородную связь с Gly в положении 236 (в соответствии с Европейской нумерацией), а стабилизация петлевой структуры в положениях 233-239 (в соответствии с Европейской нумерацией) может вносить свой вклад в повышение активности связывания с Tyr в положении 160 (в соответствии с Европейской нумерацией), и введение замен в эту часть, как было предсказано, будет способствовать снижению активности связывания и будет приводить к дестабилизации петлевой структуры в СН2-домене А, где такие эффекты, как было предсказано, будут подавлять друг друга в случае гомологичных модификаций. В соответствии с этим, в данном исследовании модификацию S239D или модификацию S239E вводили только в одну из цепей посредством гетеродимеризации, а затем оценивали эффекты повышения активности связывания с FcγRIIb.
Антитела IL6R-BP256 и IL6R-BP257, используемые в качестве одной из Н-цепей, продуцировали путем введения модификаций S239D и S239E, соответственно, в IL6R-BP208 (SEQ ID NO: 24). Аналогичным образом, модификацию S239D вводили в IL6R-BP230 (SEQ ID NO: 27) с получением IL6R-BP259, а модификацию S239E вводили в IL6R-BP230 с получением IL6R-BP260. IL6R-AP002 получали путем введения тех же самых модификаций, которые были введены в СН2 IL6R-BP208, то есть E233D, G237D, P238D, H268D, P271G и A330R в IL6R-A5 (SEQ ID NO: 69), a IL6R-AP009 получали путем введения тех же самых модификаций, которые были введены в СН2 IL6R-BP230, то есть E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, Y296D и A330R в IL6R-A5, и эти варианты были использованы в качестве другой Н-цепи антитела. В противоположность этому, IL6R-BP253 (SEQ ID NO: 32) получали путем введения S267E и L328F в IL6R-B3, и такое введение является известным методом повышения активности связывания с FcγRIIb (непатентный документ 28). IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно используется как L-цепь антитела. Антитела экспрессировали с использованием этих вариантов, а затем очищали методом, описанным в сравнительном примере 1, и их связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb или FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины KD для связывания каждого варианта с каждым FcγR представлены в таблице 10. «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 10 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, вычисленным по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2, где было показано, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа.
Как показано в таблице 10, по сравнению с вариантом IL6R-BP208/IL6R-L, оба варианта IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L и IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L, продуцированные путем введения модификаций S239D и S239E, соответственно, в одну из цепей IL6R-BP208/IL6R-L, обладали повышенной активностью связывания с FcγRIIb. Кроме того, величина KD (IIaR)/KD(IIb) этого варианта превышала величину для IL6R-BP256/IL6R-L, и его селективность связывания с FcγRIIb также была более высокой. С другой стороны, по сравнению с IL6R-BP208/IL6R-L, вариант IL6R-BP256/IL6R-L, продуцированный путем введения S239D в обе цепи IL6R-BP208/IL6R-L, и вариант IL6R-BP257/IL6R-L, продуцированный путем введения S239E в обе цепи IL6R-BP208/IL6R-L, обладали значительно более низкой селективностью и активностью связывания с FcγRIIb. Таким образом, при введении модификаций S239D или S239E только в одну из цепей наблюдалось повышение уровня связывания с FcγRIIb, тогда как при введении модификаций S239D или S239E в обе цепи, активность связывания с FcγRIIb значительно снижалась. Главной причиной такого эффекта может быть дестабилизация петлевой структуры в СН2-домене А, описанная выше. Аналогичные результаты были получены при введении модификаций S239D или S239E в IL6R-BP230/IL6R-L, используемый в качестве матрицы. Варианты IL6R-AP009/IL6R-BP259/IL6R-L и АРО09/IL6R-BP260/IL6R-L, продуцированные путем введения модификаций S239D или S239E, соответственно, в одну из цепей IL6R-BP230/IL6R-L, обладали более высокой селективностью и активностью связывания с FcγRIIb, чем IL6R-BP230/IL6R-L. С другой стороны, варианты IL6R-BP259/IL6R-L и IL6R-BP260/IL6R-L, продуцированные путем введения модификаций S239D или S239E, соответственно, в обе цепи, обладали значительно меньшей селективностью и активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L. Кроме того, все варианты, продуцированные путем введения модификаций S239D или S239E, соответственно, в одну из цепей IL6R-BP208/IL6R-L и IL6R-BP230/IL6R-L, обладали повышенной селективностью и активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с IL6R-BP253/IL6R-L, как было определено с применением известного метода повышения активности связывания с FcyRIIb.
9-3. Подтверждение модификаций на основе информации о структуре Fc(Р208)/FcγRIIaR
Сравнение кристаллических структур Fc(P208) с FcγRIIb и FcγRIIaR, как описано в примере 3, указывало на различие электронной плотности возле положения 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), где водородная связь образовывалась с остатком Tyr в положении 160 FcγRIIb, и было высказано предположение, что боковая цепь СН2-домена А вносит значительный вклад в связывание с FcγRIIb, а боковая цепь СН2-домена В вносит значительный вклад в связывание с FcγRIIaR (фиг. 12 и 13). Так, например, исходя из оценки потенциальной электронной плотности при связывании с FcγRIIa R-типа, было высказано предположение, что Leu в положении 234 и Leu в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) в СН2-домене В участвуют в связывании с рецептором, тогда как эти остатки могут оказывать лишь незначительное влияние на связывание с FcγRIIb. Поэтому, в результате замены этих двух остатков другими остатками, не являющимися гидрофобными остатками, взаимодействие с FcγRIIa R-типа может быть значительно снижено. Однако считается, что в боковой цепи СН2-домена А остатки Leu в положении 234 и Leu в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) вносят определенный вклад в стабилизацию петлевой структуры возле положения 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), а в частности, существует большая вероятность того, что они будут принимать большее участие в связывании с FcγRIIb. Поэтому замена этих остатков другими остатками, не являющимися гидрофобными остатками, будет приводить к снижению взаимодействия СН2-домена А с FcγRIIb. В частности, остаток Leu в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) способствует гидрофобному взаимодействию в СН2-домене А комплексной структуры, образованной FcγRIIb, и поскольку такой остаток вносит значительный вклад в стабилизацию петлевой структуры возле положения 237 (в соответствии с Европейской нумерацией), этот остаток был заменен негидрофобным остатком только в одной из цепей. В частности, если гидрофобное взаимодействие в СН2-домене А может еще больше стабилизировать петлевую структуру возле положения 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) после замены Leu в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) гидрофобными аминокислотами, не являющимися Leu в обеих цепях, то это может также приводить к снижению потери энергии в результате ее энтропии с последующим образованием водородной связи с Tyr в положении 160 FcγRIIb и способствовать повышению селективности и активности связывания с FcγRIIb, как было определено в данном анализе.
Антитело IL6R-BP264 (SEQ ID NO:28), используемое как Н-цепь, было продуцировано путем введения модификаций E233D, G237D, P238D, Н268Е, P271G, Y296D и A330R в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23) и служило в качестве матрицы. Были продуцированы варианты, в которых остаток Leu в положении 234 (в соответствии с Европейской нумерацией) IL6R-BP264 был заменен остатками Asn, Ser, Asp, Gln, Glu, Thr, Arg, His, Gly, Lys и Tyr. Были также продуцированы варианты, в которых аминокислота в положении 235 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-BP264 была заменена любой из 18 аминокислот, не являющихся исходной аминокислотой и Cys. Вариант IL6R-AP029 (SEQ ID NO: 42), который используется в качестве другой Н-цепи антитела, был продуцирован путем введения модификаций E233D, G237D, P238D, Н268Е, P271G, Y296D и A330R в IL6R-A5 (SEQ ID NO: 69). IL6R-L (SEQ ID NO: 21) обычно использовали как L-цепь антитела. Варианты, продуцированные путем введения модификаций L234N, L234S, L234D, L234Q, L234E, L234T, L234R, L234H, L234G, L234K и L234Y в IL6R-ВР264, и варианты, продуцированные путем введения модификаций L235W, L235M, L235P, L235F, L235A, L235V и L235I, соответственно, в IL6R-BP264, получали в виде гомологичных антител, содержащих одинаковые модификации в обеих цепях, а варианты, продуцированные путем введения комбинации модификаций L235N, L235S, L235D, L235Q, L235E, L235T, L235R, L235H, L235G, L235K и L235Y, соответственно, в IL6R-AP029, получали в виде гетеродимерных антител, а затем эти антитела анализировали.
Эти варианты использовали для экспрессии и очистки антител методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2. На фиг. 16 представлен график, в котором на горизонтальной оси отложены величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR.
Как показано на фиг. 16, вариант IL6R-BP404/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L234Y в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L, обладал несколько более высокой активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IL6R-BP264/IL6R-L до модификации.
Из этих вариантов, систематизированных в таблице 11, вариант IL6R-BP404/IL6R-L обладал повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb. В этой таблице «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. «KD(IIaR) родительского полипептида/KD(IIaR) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания IL6R-B3/IL6R-L с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIaR. «KD(IIaR)/KD(IIb)» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания этого варианта с FcγRIIb. Чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. В таблице 11 закрашенные серым ячейки относятся к величинам, вычисленным по уравнению:
описанному в сравнительном примере 2, где было показано, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для его точной оценки с помощью кинетического анализа.
Как показано в таблице 11, вариант IL6R-BP404/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L234Y в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L, обнаруживал 1,1-кратное увеличение активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IL6R-BP264/IL6R-L до введения модификаций. Вариант IL6R-BP408/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235Q в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L; вариант IL6R-BP419/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235F в обе цепи IL6R-BP264/IL6R-L; вариант IL6R-AP029/IL6R-BP407/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235D в одну из цепей IL6R-BP264/IL6R-L; вариант AP029/IL6R-BP408/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235Q в одну из цепей IL6R-BP264/IL6R-L; вариант IL6R-AP029/IL6R-BP409/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235E в одну из цепей IL6R-BP264/IL6R-L; и вариант IL6R-AP029/IL6R-BP410/IL6R-L, продуцированный путем введения модификации L235T в одну из цепей IL6R-BP264/IL6R-L, имели величины KD(IIaR)/KD(IIb), которые были выше, чем величины для IL6R-BP264/IL6R-L до введения модификации, и эти варианты обладали повышенной селективностью связывания с FcγRIIb.
[Пример 10] Оценка иммуногенности Fc-вариантов, обладающих повышенной активностью связывания с FcγRIIb, с использованием программы по предсказанию иммуногенности in silico
При использовании Fc-вариантов, описанных в этом примере, в качестве терапевтических антител предпочтительно, чтобы не происходило продуцирование антитела против лекарственных средств, которое ослабляет фармакологический эффект лекарственного средства. Поскольку антитела с высокой иммуногенностью имеют тенденцию к образованию антител против лекарственного средства, то иммуногенность терапевтических антител предпочтительно должна быть как можно более низкой. В целях предотвращения, насколько это возможно, повышения иммуногенности этих вариантов, могут быть использованы программы для предсказания иммуногенности in silico, например, программы для предсказания Т-клеточных эпитопов, такие как Epibase и EpiMatrix. Epibase Light (Lonza) представляет собой программу для предсказания иммуногенности in silico, позволяющую определить способность к связыванию 9-мерного пептида с МНС класса II, содержащего главные аллели DRB1, с использованием алгоритма FASTER (Expert Opin Biol Ther., 2007, Mar; 7 (3): 405-18). Эта программа позволяет идентифицировать Т-клеточные эпитопы с высоким уровнем связывания (сильные эпитопы) и средним уровнем связывания (слабые эпитопы) с МНС класса II.
Для вычисления использовали частоту встречаемости аллотипа DRB1 у группы индивидуумов, то есть частоту встречаемости этого аллотипа у группы индивидуумов индоевропейской расы, как показано ниже в таблице 12.
Эта программа была использована для сравнения общего числа Т-клеточных эпитопов с высокой и низкой связывающей способностью, которые были включены в последовательности (последовательность, простирающуюся от положения 118 до С-конца (в соответствии с Европейской нумерацией)) различных Fc-вариантов, описанных в литературе, и Fc-вариантов, обладающих повышенной селективностью связывания с FcγRIIb, как описано в примере. В частности, в качестве сравниваемого контроля, используемого для проведения анализа уже известными методами, были продуцированы следующие антитела: антитело Fc (DLE) (SEQ ID NO: 78), представляющее собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями S239D, A330L и I332E, которые, как уже сообщалось, повышают активность связывания с FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006, 103: 4005-10); антитело Fc (YTE) (SEQ ID NO: 79), представляющее собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями M252Y, S254T и Т256Е, которые, как сообщалось, повышают активность связывания с FcRn (J. Biol. Chem. 2006, 281: 23514-24); антитело Fc (EF) (SEQ ID NO: 80), представляющее собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями S267E и L328F, которые, как сообщалось, повышают активность связывания с FcγRIIb (Mol. Immunol. 2008, 45: 3926-33); и антитело Fc (P208) (SEQ ID NO: 81), представляющее собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями E233D, G237D, P238D, H268D, P271G и A330R, которые, как сообщалось, повышают активность связывания с FcγRIIb и описаны в WO 2012/115241. Кроме того, было получено антитело Fc (P587) (SEQ ID NO: 70), которое представляет собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями E233D, P238D, S264I, S267A, Н268Е и P271G, аналогичными модификациям варианта ВР568, способствующим повышению активности связывания с FcγRIIb и описанным в примерах, и антитело Fc (P588) (SEQ ID NO: 71), которое представляет собой Fc-область антитела с введенными в нее модификациями P238D, S264I, S267A, Н268Е и P271G, аналогичными модификациям варианта ВР492. Общее число эпитопов с сильной и слабой активностью связывания в этих Fc-вариантах сравнивали с использованием программы Epibase. Результаты представлены в таблице 13.
Эти результаты показали, что из уже существующих Fc-вариантов, варианты Fc (P587) и Fc (P588), которые представляют собой Fc-области вариантов, описанных в примерах, имеют небольшое число Т-клеточных эпитопов и низкий риск развития иммуногенности. Это свойство указывает на то, что, при использовании этих вариантов в качестве фармацевтических средств, вероятность продуцирования антител против лекарственных средств будет мала, и что эти варианты обладают превосходными функциями.
[Пример 11] Оценка кинетики Fc-вариантов с повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb в кровотоке, проводимая с использованием трансгенных мышей, несущих человеческий FcγRIIb
(11-1) Описание метода оценки
Как указывается в WO 2013/047752, по сравнению с нативным человеческим IgG, концентрация растворимого антигена-мишени в плазме живого организма может быть значительно снижена путем введения антигенсвязывающей молекулы, которая обладает активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН и содержит антигенсвязывающий домен, где антигенсвязывающая активность такой антигенсвязывающей молекулы изменяется в зависимости от концентрации ионов, и которая также содержит FcγR-связывающий домен с более высокой FcγR-связывающей активностью, чем FcγR-связывающий домен Fc-области нативного человеческого IgG, где сахарная цепь, присоединенная в положении 297 (в соответствии с Европейской нумерацией), представляет собой сахарную цепь, содержащую фукозу. Также сообщалось, что при введении in vivo антигенсвязывающей молекулы, которая обладает повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с другими FcγR, скорость элиминации растворимых антигенов из плазмы увеличивается, а концентрация растворимых антигенов в плазме может значительно снижаться. В этом примере Fc-вариант с повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb вводили генетически модифицированным трансгенным мышам, несущим человеческий FcγRIIb, для того чтобы определить, может ли скорость элиминации растворимых антигенов-мишеней увеличиваться под действием Fc-варианта, который фактически обладает повышенной активностью связывания с описанным здесь человеческим FcγRIIb.
(11-2)_Получение антител с повышенной активностью связывания с FcγRIIb
Нижеследующие антитела были использованы в качестве Fc-вариантов с повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb.
Вариант IL6R-P587 был получен путем введения модификаций E233D, P238D, S264I, S267A, Н268Е и P271G, аналогичных модификациям, вводимым в ВР568 варианта IL6R-G1d (SEQ ID NO: 19), состоящего из константной области антитела G1d, которое имеет С-концевые Gly и Lys, удаленные из человеческого IgG1, и вариабельные области антитела против рецептора человеческого интерлейкина-6 (человеческого IL-6R), описанного в WO 2009/125825. Вариант Fv4-P587, содержащий IL-6R-P587 в качестве Н-цепи антитела, и вариант IL6R-L2 (SEQ ID NO: 74), который представляет собой L-цепь антитела против человеческого IL-6R, описанного в WO 2009/125825 и используемого в качестве L-цепи антитела, получали методом, описанным в сравнительном примере 1. В качестве контроля для сравнения, вариант Fv4-IgG1, содержащий антитела IL6R-G1d (SEQ ID NO: 19) и IL6R-L2 (SEQ ID NO: 74), используемые в качестве Н-цепи и L-цепи антитела, соответственно, получали методом, аналогичным методу, описанному в сравнительном примере 1. Как описано в WO 2009/125825, варианты Fv4-G1d и Fv4-P587, полученные в настоящем изобретении, содержат антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от концентрации протонов, то есть антигенсвязывающая активность этого антигенсвязывающего домена, связывающегося с человеческим IL-6R (антигеном) при кислотном рН, ниже, чем соответствующая активность при нейтральном рН.
(11-3) Получение трансгенных мышей, имеющих человеческий FcγRIIb
Трансгенные мыши, имеющие человеческий FcγRIIb, получали нижеследующим методом.
Трансгенные мыши были получены путем введения мышам C57BL/6(В6) человеческого гена FcγRIIb. Получение трансгенных мышей осуществляли в соответствии с процедурой, описанной в публикациях «Nagy et al. (Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)» и «Ueda, et al., (Latest technology of gene targeting, Yodosha. (2000) 190-207)». Более конкретно, трансгенных мышей получали путем микроинъекции в пронуклеарные оплодотворенные яйца мышей В6 бактериальной искусственной хромосомы, в которую была клонирована геномная область человеческого гена FcγRIIb (GeneBank # NW_004077999:18307411-18381603). Мышей, которым был перенесен человеческий ген FcγRIIb, отбирали путем Саузерн-блот-анализа с использованием зонда, который специфически гибридизуется с человеческим геном FcγRIIb, и с помощью ПЦР. У трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb брали кровь и печень, и экспрессию гена человеческого FcγRIIb подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) с использованием праймеров, которые специфически амплифицируют человеческий ген FcγRIIb. В результате была детектирована экспрессия человеческого гена FcγRIIb. Кроме того, мышиные мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из крови трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb, и экспрессию человеческого FcγRIIb в МКПК подтверждали с помощью анализов методом клеточного сортинга с активацией флуоресценции (FACS). В результате была детектирована экспрессия человеческого FcγRIIb. Вышеописанный анализ подтвердил получение трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb, экспрессирующих человеческий FcγRIIb.
(11-4) Jn vivo тест на одновременное введение антигенов и антител трансгенным мышам с человеческим FcγRIIb
Трансгенным мышам с человеческим FcγRIIb, полученным как описано в (11-3), одновременно вводили растворимый человеческий IL-6R в качестве антигена и антитело против человеческого IL-6R, полученное как описано в (11-2), и после их введения оценивали концентрации растворимого человеческого IL-6R и антитела против человеческого IL-6R в плазме.
В хвостовую вену вводили смешанный раствор растворимого человеческого IL-6R и антитела против человеческого IL-6R (5 мкг/мл и 0,1 мг/мл, соответственно) в одной дозе, составляющей 10 мл/кг. Поскольку в этом случае антитело против человеческого IL-6R присутствует в значительном избытке по сравнению с растворимым человеческим IL-6R, то считается, что почти весь растворимый человеческий IL-6R связывался с антителом. Кровь брали через 5 минут, 1 час, 4 часа, 7 часов, 1 день, 3 дня, 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после введения. Взятую кровь сразу центрифугировали при 4С и при 15000 об/мин в течение 15 минут с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в холодильнике при температуре -20°С или менее до начала проведения анализа. Вышеописанные Fv4-P587 и Fv4-IgG1 использовали в качестве антитела против человеческого IL-6R.
(11-5) Измерение концентрации антитела против человеческого IL-6R в плазме с помощью ELISA
Концентрацию антитела против человеческого IL-6R в плазме мышей измеряли с помощью ELISA. Сначала F (ab')2-фрагмент антитела против человеческого IgG (специфичного к γ-цепи) (Sigma) разделяли на аликвоты и помещали в планшет Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International), а затем оставляли на ночь при 4°С для приготовления планшета, на котором было иммобилизовано антитело против человеческого IgG. Затем строили калибровочные кривые для образцов плазмы при концентрациях 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0125 мкг/мл, и образцы мышиной плазмы для анализа разводили 100-кратно или более. Затем смеси, полученные путем добавления 200 мкл 20 нг/мл растворимого человеческого IL-6R к 100 мкл образцов для построения калибровочных кривых или образцов для анализа плазмы, перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем, планшет с иммобилизованным антителом против человеческого IgG, в который были добавлены смеси, снова перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре. После этого биотинилированное антитело против человеческого IL-6R (R&D) подвергали реакции взаимодействия с образцами при комнатной температуре в течение одного часа, и стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) также подвергали реакции взаимодействия с образцами при комнатной температуре в течение одного часа. Хромогенную реакцию осуществляли с использованием микролуночного субстрата, конъюгированного с ПХ и содержащего один компонент ТМВ (BioFX Laboratories). После этого реакцию завершали путем добавления 1н серной кислоты (Showa Chemical), и измеряли оптическую плотность на 450 нм на микропланшете-ридере. Концентрации антитела в мышиной плазме вычисляли исходя из величин оптической плотности по калибровочной кривой с использованием программы для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). После внутривенного введения антитела трансгенным мышам с человеческим FcγRIIb измеряли концентрацию антитела в плазме мышей в зависимости от времени в соответствии с методом, описанным на фиг. 33.
(11-5) Измерение концентрации человеческого IL-6R в плазме с помощью электрохемилюминесценции
Концентрацию человеческого IL-6R в мышиной плазме измеряли методом электрохемилюминесценции. Затем строили калибровочные кривые для образцов человеческого IL-6R в плазме при концентрациях 12,5, 6,25, 3,13, 1,56, 0,781, 0,391 и 0,195 нг/мл, и приготавливали образцы мышиной плазмы для анализа путем их 50-кратного разведения или более. Моноклональное антитело против человеческого IL-6R (R&D) было помечено рутением с использованием сложного эфира SULFO-TAG NHS (Meso Scale Discovery), а затем биотинилированное антитело против человеческого IL-6R (R&D) и раствор тоцилизумаба перемешивали и оставляли на ночь при 37°С для прохождения реакции. Затем смешанный раствор разделяли на аликвоты и помещали в покрытый стрептавидином планшет Streptavidin Gold Multi-ARRAY (Meso Scale Discovery), после чего блокировали с использованием раствора PBS-Tween, содержащего 0,5% BSA (масс/об), в течение ночи при 5°С.После реакции в течение более двух часов при комнатной температуре, планшет промывали. Сразу после промывки, в планшет добавляли аликвоты буфера Read Buffer Т(×2)(Meso Scale Discovery), и проводили измерения на устройстве SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию hSIL-6R вычисляли по калибровочной кривой с использованием аналитической компьютерной программы SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрацию растворимого человеческого IL-6R в плазме в зависимости от времени у трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb после внутривенного введения антитела измеряли методом, описанным на фиг. 34.
(11-6) Эффекты повышения уровня связывания с человеческим FcγRIIb
Проводили сравнение результатов in vivo теста, полученных для Fv4-P587, который обладал повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb, и для Fv4-IgG1. Как показано на фиг. 33, время нахождения обоих антител в плазме было почти одинаковым, однако, как показано на фиг. 34, было подтверждено, что элиминация человеческого IL-6R была выше в случае, когда человеческий IL-6R вводили одновременно с Fv4-P587, обладающим повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb, чем элиминация при одновременном введении человеческого IL-6R с Fv4-IgG1. Более конкретно, было обнаружено, что антитело, которое связывается с человеческим IL-6R в зависимости от рН, способно снижать концентрацию растворимого человеческого IL-6R благодаря повышению способности связываться с человеческим FcγRIIb.
Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, авторы лишь отмечают, что, как показали результаты, представленные на фиг. 35, растворимые антигены плазмы, которые связываются с этим антителом, элиминируются в результате их включения в FcγRIIb-экспрессирующие клетки посредством человеческого FcγRIIb.
Растворимый человеческий IL-6R, связанный с антителом, которое связывается с растворимым человеческим IL-6R, подвергается рециклингу в плазме посредством FcRn вместе с антителом. В противоположность этому, Fv4-IgG1, которое представляет собой антитело, связывающееся с растворимым человеческим IL-6R в зависимости от рН, подвергается реакции диссоциации с растворимым человеческим IL-6R, связанным с антителом, в эндосоме в кислотных условиях. Поскольку диссоциированный растворимый человеческий IL-6R разлагается под действием лизосомы, то элиминация растворимого человеческого IL-6R может значительно повышаться, a Fv4-IgG1, которое представляет собой антитело, связывающееся с растворимым человеческим IL-6R в зависимости от рН, связывается с FcRn в эндосоме, а затем подвергается рециклингу в плазме. Это подвергнутое рециклингу антитело может снова связываться с растворимым человеческим IL-6R, а поэтому связывание с антигеном (с растворимым человеческим IL-6R) и рециклинг в плазме под действием FcRn могут повторяться. В результате можно сказать, что одна молекула антитела может связываться с растворимым человеческим IL-6R несколько раз. Кроме того, считается, что благодаря повышению активности связывания Fv4-IgG1 с FcγRIIb, то есть связывания с антигеном в зависимости от рН, комплекс, образованный антителом, которое связывается с растворимым человеческим IL-6R, и с растворимым человеческим IL-6R, быстро включается в клетки посредством FcγRIIb, что приводит к более быстрому снижению концентрации растворимого человеческого IL-6R (фиг. 35).
[Пример 12] Оценка кинетики Fc-вариантов с повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb в кровотоке, проводимая с использованием трансгенных мышей, несущих человеческий FcγRIIb и человеческий FcRn
(12-1) Описание метода оценки
Как указывается в WO 2013/047752, использование антигенсвязывающей молекулы, обладающей более высокой FcγR-связывающей активностью по сравнению с Fc-областью нативного IgG и более высокой активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, подтвердило, что такая молекула имеет повышенную способность сохраняться в плазме по сравнению с антигенсвязывающими молекулами, которые не обладают повышенной активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН. С другой стороны, сообщалось, что антигенсвязывающая молекула, обладающая более высокой FcγR-связывающей активностью по сравнению с Fc-областью нативного человеческого IgG и более высокой активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, способствовала снижению концентрации антигена-мишени в плазме по сравнению с антигенсвязывающей молекулой, которая обладает более высокой активностью связывания с FcγR, чем Fc-область нативного человеческого IgG и которая не обладает повышенной активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН. В соответствии с этим, было проведено исследование для того, чтобы определить, имеют ли антигенсвязывающие молекулы, несущие варианты Fc-области с повышенной активностью связывания с человеческим FcγRIIb, как описано в примерах, одинаковые свойства.
(12-2) Получение антигенсвязывающей молекулы, обладающей более высокой FcγR-связывающей активностью по сравнению с Fc-областью нативного человеческого IgG и более высокой активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН
Помимо Fv4-IgG1 и Fv4-P587, описанных в примере 11-2, был получен вариант Fv4-P587-LS методом, описанным в сравнительном примере 1, где Fv4-P587-LS содержит IL6R-L2 в качестве L-цепи антитела и IL6R-P587-LS (SEQ ID NO: 73) в качестве Н-цепи антитела. IL6R-P587-LS получали путем введения в IL6R-P587, то есть в Н-цепь Fv4-P587, модификаций, состоящих из замены Met в положении 428 на Leu и замены Asn в положении 434 на Ser в соответствии с Европейской нумерацией, где указанные замены, как уже сообщалось, способствуют повышению кинетики антител в кровотоке (Nat. Biotechnol. 2010, 28: 157-159).
(12-3) Анализ взаимодействия с человеческим FcRn
Анализ взаимодействия полученного антитела и человеческого FcRn осуществляли с использованием Biacore Т200. Соответствующее количество белка L (BioVision) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare) методом связывания с амином, а затем на этом чипе иммобилизовали представляющие интерес антитела. После этого впрыскивали разведенный FcRn и рабочий буфер (используемый в качестве контрольного раствора) в целях осуществления взаимодействия антител, иммобилизованных на этом сенсорном чипе, с человеческим FcRn. В качестве рабочего буфера использовали 50 ммоль/л фосфата натрия, 150 ммоль/л NaCl и 0,05% (масс/об) твина 20 (рН 6,0), и этот рабочий буфер также использовали для разведения FcRn. Для регенерации чипа использовали 10 ммоль/л глицина - HCl (рН 1,5). Все измерения проводили при 25°С. Кинетические параметры, такие как константы скорости ассоциации ka (1/Мс) и константы скорости диссоциации kd (1/с), определяли по сенсограмме, построенной по данным этих измерений, a KD (М) для связывания каждого антитела с человеческим FcRn вычисляли по величинам этих констант. Вычисление каждого параметра проводили с помощью компьютерной программы Biacore Т200 Evaluation Software (GE Healthcare). Величины KD для связывания полученных антител с человеческим FcRn вычисляли методом, описанным в таблице 14. Как показано в таблице 14, было подтверждено, что Fv4-P587-LS, по сравнению с Fv4-P587, обладал повышенной активностью связывания с FcRn в кислотных условиях.
(12-4) Получение трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb и человеческим FcRn
Трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb и человеческим FcRn и мышей, дефицитных по мышиному FcRn (нокаут-мышей), получали нижеследующим методом.
Сначала получали мышей, дефицитных по мышиному FcRn. Получение нокаут-мышей осуществляли методом, описанным в публикации «Nagy et al. (Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)». Более конкретно, был получен нацеливающий вектор для разрушения мышиного гена FcRn, а затем этот вектор вводили в клетки ES (взятые у мышей C57BL/6) для разрушения мышиного гена FcRn посредством гомологичной рекомбинации. РНК экстрагировали из печени выведенных мышей с дефицитом мышиного FcRn, и на основе кДНК, синтезированной из этой РНК и используемой в качестве матрицы, осуществляли ОТ-ПЦР с помощью праймеров, которые специфически амплифицируют мышиный FcRn. В результате, у мышей с дефицитом мышиного FcRn, этот мышиный ген FcRn не детектировался. Затем получали трансгенных мышей путем введения человеческих генов FcγRIIb и FcRn мышам, дефицитным по мышиному FcRn. Трансгенных мышей получали в соответствии с процедурами, описанными в публикациях «Nagy et al. (Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)» и «Ueda, et al., (Latest technology of gene targeting, Yodosha. (2000) 190-207)». Более конкретно, мышей получали путем микроинъекции в пронуклеарные оплодотворенные яйца мышей, дефицитных по мышиному FcRn, бактериальной искусственной хромосомы, в которую были клонированы геномные области человеческого гена FcRn (GeneBank # NC_000019.9:50000108-50039865) и человеческого гена FcγRIIb (GeneBank # NW_004077999:18307411-18381603). Мышей, которым были перенесены человеческий ген FcRn и человеческий ген FcγRIIb и которые были гомозиготными по аллелю, дефицитному по мышиному FcRn, отбирали с помощью Саузерн-блот-анализа с использованием зонда, который специфически гибридизуется с каждым из этих генов, и с помощью ПЦР. У трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb и человеческим FcRn и мышей, дефицитных по мышиному FcRn, брали кровь, и экспрессию человеческого гена FcRn и человеческого гена FcγRIIb подтверждали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, которые специфически амплифицируют человеческий ген FcRn и человеческий ген FcγRIIb. В результате была детектирована экспрессия человеческого гена FcRn и человеческого гена FcγRIIb. Полученные результаты подтвердили получение трансгенных мышей с человеческим FcγRIIb и человеческим FcRn и мышей с дефицитом мышиного FcRn, у которых экспрессировались человеческий FcRn и человеческий FcγRIIb, но не экспрессировался мышиный FcRn.
(12-5) Улучшение фармакокинетики путем повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН
Анализ in vivo осуществляли методом, аналогичным методу, описанному в примере 11, путем введения Fv4-IgG1, Fv4-P587 и Fv4-P587-LS трансгенным мышам с человеческим FcγRIIb и человеческим FcRn, и у мышей этих групп измеряли концентрацию растворимого IL-6R и антитела против человеческого IL-6R в плазме. Результаты измерения концентраций антитела против человеческого IL-6R и растворимого IL-6R в плазме представлены на фиг. 36 и фиг. 37, соответственно.
Было обнаружено, что у мышей, которым вводили Fv4-P587-LS и у которых наблюдалась повышенная активность связывания Fv4-P587 с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, время пребывания антител в плазме превышало время пребывания антител в плазме у группы мышей, которым вводили Fv4-P587. Кроме того, Fv4-P587-LS имело более длительное время пребывания в плазме, чем Fv4-IgG1. С другой стороны, концентрация растворимого IL-6R в плазме у группы мышей, которым вводили Fv4-P587-LS, была эквивалентна концентрации растворимого IL-6R у группы мышей, которым вводили Fv4-P587. У группы мышей, которым вводили Fv4-P587-LS или Fv4-Р587, концентрация растворимого IL-6R в плазме была ниже, чем у группы мышей, которым вводили Fv4-IgG1.
В соответствии с этим, введение антитела, то есть антигенсвязывающей молекулы с повышенной активностью связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, где активность связывания антигенсвязывающей молекулы с человеческим FcγRIIb была выше, чем активность связывания Fc-области нативного человеческого IgG, показало, что время удерживания вводимой молекулы антитела в плазме в живом организме может увеличиваться после такого введения. Кроме того, было обнаружено, что, даже при увеличении времени пребывания антигенсвязывающей молекулы в плазме живого организма, антиген-элиминирующий эффект у этого живого организма не снижался, а сохранялся на обычном уровне.
Модификации, используемые для повышения активности связывания с человеческим FcRn при кислотных значениях рН, не имеют конкретных ограничений, и такие модификации могут быть введены в IgG путем замены Met на Leu в положении 42 8 и замены Asn на Ser в положении 434 (в соответствии с Европейской нумерацией) (Nat. Biotechnol. (2010) 28: 157-159); замены Asn на Ala в положении 434 (Drug. Metab. Dispos. (2010) Apr.; 38(4): 600-605); замены Met на Thr в положении 252, замены Ser на Thr в положении 2 54 и замены Thr на Glu в положении 256 (J. Biol. Chem. (2006) 281: 23514-23524); замены Thr на Gin в положении 250 и замены Met на Leu в положении 428 (J. Immunol. (2006), 176(1): 346-356); замены Asn на His в положении 434 (Clin. Pharm. & Ther. (2011) 89(2): 283-290) или замен, описанных в WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, WO 2002/060919 и т.п.
[Сравнительный пример 1] Конструирование антитело-экспрессирующих векторов; и экспрессия и очистка антител
Синтез полноразмерных генов, содержащих нуклеотидные последовательности Н-цепи и L-цепи вариабельных областей антитела, осуществляли методами продуцирования, известными специалистам, посредством ПЦР-сборки и т.п. Введение аминокислотных замен осуществляли методами, известными специалистам, с помощью ПЦР или т.п. Полученный плазмидный фрагмент встраивали в экспрессионный вектор клеток животных и получали экспрессионный вектор для Н-цепи и экспрессионный вектор для L-цепи. Нуклеотидную последовательность полученного экспрессионного вектора определяли методами, известными специалистам. Полученные плазмиды транзиентно вводили в клеточную линию НЕК293Н, происходящую от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), или в клетки FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии антитела. Полученный супернатант культуры собирали, а затем пропускали через 0,22-мкм фильтр MILLEX(R)-GV (Millipore) или через 0,45-мкм фильтр MILLEX (R)-GV (Millipore). Антитела очищали из полученного супернатанта культуры методами, известными специалистам, с использованием рекомбинантного белка А-сефарозы Fast Flow (GE Healthcare) или G-белка-сефарозы 4 Fast Flow (GE Healthcare). Концентрацию очищенных антител определяли по оптической плотности на 280 нм, измеренной на спектрофотометре. По полученному значению вычисляли коэффициент возбуждения методами, такими как РАСЕ, а затем этот коэффициент использовали для оценки концентрации антитела (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
[Сравнительный пример 2] Метод получения FcγR и метод анализа взаимодействия между модифицированным антителом и FcγR
Внеклеточные домены FcγR получали следующим методом.
Сначала, ген внеклеточного домена FcγR синтезировали методом, хорошо известным специалистам. Затем получали последовательность каждого FcγR на основе информации, имеющейся в NCBI. В частности, FcγRI продуцировали на основе последовательности NCBI per. № NM_000566.3, FcγRIIa продуцировали на основе последовательности NCBI per. № NM_00113 6219.1, FcγRIIb продуцировали на основе последовательности NCBI per. № NM_004001.3, FcγRIIIa продуцировали на основе последовательности NCBI per. № NM_001127593.1, a FcγRIIIb продуцировали на основе последовательности NCBI per. № NM_000570.3, и к С-концу присоединяли His-метку. Кроме того, известно, что существует полиморфизм между FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb, и эти полиморфные сайты были получены, как описано в публикациях J. Exp.Med, 1990, 172: 19-25, для FcγRIIa; J. Clin Invest 1997, 100(5): 1059-1070, для FcγRIIIa; и J. Clin Invest, 1989, 84, 1688-1691, для FcγRIIIb.
Полученные генные фрагменты встраивали в экспрессионный вектор для клеток животных и получали нужные экспрессионные векторы. Полученные экспрессионные векторы транзиентно вводили в клетки FreeStyle293, происходящие от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), для экспрессии представляющих интерес белков. В случае FcγRIIb, используемого для кристаллографического анализа, представляющий интерес белок экспрессировали в присутствии кифуненсина в конечной концентрации 10 мкг/мл, так, чтобы сахарная цепь, присоединенная к FcγRIIb, имела высокое содержание маннозы. Клетки культивировали, и после сбора полученного супернатанта культуры его пропускали через 0,22-мкм фильтр. В принципе, полученные супернатанты культуры были очищены за нижеследующие четыре стадии. Эти стадии проводили следующим образом, а именно, в первой стадии осуществляли катионообменную колоночную хроматографию (SP Sepharose FF), во второй стадии проводили аффинную колоночную хроматографию (HisTrap HP) для присоединения His-метки, в третьей стадии проводили колоночную гель-фильтрацию (Superdex200), а в четвертой стадии проводили хроматографию в асептических условиях. Однако, для FcγRI, анионообменную колоночную хроматографию, проводимую с использованием сефарозы (Q sepharose FF), осуществляли, как описано в стадии 1. Очищенные белки оценивали путем измерения оптической плотности на 280 нм на спектрофотометре, и по полученным величинам вычисляли концентрации очищенных белков с использованием коэффициента поглощения, определенного таким методом, как РАСЕ (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
Анализ взаимодействия между модифицированным антителом и Fcγ-рецептором, полученными, как описано выше, осуществляли с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare), Biacore Т200 (GE Healthcare), Biacore A100 и Biacore 4000. В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+(GE Healthcare), а контрольную температуру устанавливали на 25°С. Были использованы чипы, полученные путем иммобилизации антигенного пептида, белка А (Thermo Scientific), белка А/G (Thermo Scientific) и белка L (ACTIGEN или BioVision), методом присоединения амина к сенсорным чипам серии S СМ5 (GE Healthcare) или серии S СМ4 (GE Healthcare), или, альтернативно, были использованы чипы, полученные путем предварительного взаимодействия биотинилированных антигенных пептидов с сенсорным чипом серии S SA (сертифицированным) (GE Healthcare) и их иммобилизации на этом чипе.
После захвата представляющих интерес антител на этих сенсорных чипах, Fcγ-рецептор, разведенный рабочим буфером, оставляли для взаимодействия с антителом, после чего определяли количество рецептора, связанного с антителами, и антитела сравнивали. Однако, поскольку количество связанного Fcγ-рецептора зависит от количества захваченных антител, то количество связанного Fcγ-рецептора делили на количество каждого захваченного антитела и получали скорректированные величины, которые затем сравнивали. Кроме того, антитела, иммобилизованные на чипах, смывали путем реакции с 10 мМ глицина - HCl, рН 1,5, и эти чипы регенерировали и использовали повторно.
Кинетические анализы для вычисления величин KD для связывания каждого модифицированного антитела с FcγR осуществляли описанным ниже методом. Сначала представляющие интерес антитела иммобилизовали на вышеупомянутых серсорных чипах, а затем Fcγ-рецептор, разведенный рабочим буфером, оставляли для взаимодействия. Для построения общей кривой зависимости использовали программу Biacore Evaluation Software, и по полученным результатам строили сенсограмму с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, а затем вычисляли константу скорости ассоциации ka (л/моль/с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), и по этим величинам вычисляли константы диссоциации KD (моль/л).
Если взаимодействие каждого из модифицированных антител и FcγR было слабым, и если было установлено, что коррекция не может быть проведена с помощью вышеупомянутого кинетического анализа, то KD для таких взаимодействий вычисляли по нижеследующему уравнению модели связывания 1:1, как описано в руководстве Biacore Т100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.
Характер взаимодействия молекул в соответствии с моделью связывания 1:1 на Biacore может быть представлен нижеследующим уравнением 1.
где
Req: график зависимости устойчивых уровней связывания от концентрации аналита
С: концентрация
RI: вклад объемного показателя преломления в образце
Rmax: способность аналита связываться с поверхностью чипа
При преобразовании этого уравнения, KD может быть вычислена по уравнению 2, представленному ниже.
KD может быть вычислена путем замены величин Rmax, RI и С в этом уравнении. Величины RI и С могут быть определены из сенсограммы, полученной по результатам и условиям измерений. Rmax вычисляли следующим методом. В качестве объекта для сравнения были выбраны антитела, которые обнаруживали достаточно сильное взаимодействие, как было оценено одновременно в одном и том же раунде измерений, и величину Rmax определяли путем построения общей кривой с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, а затем полученную величину делили на количество сравниваемого антитела, иммобилизованного на сенсорном чипе, и результат умножали на оцениваемое количество иммобилизованного модифицированного антитела.
[Сравнительный пример 3] Детальный анализ связывания Fc-вариантов с FcγR
В антитела IgG1 были введены мутации для получения антител, которые обладают пониженной Fc-опосредуемой активностью связывания с активирующим FcγR, а в частности, с обоими аллотипами FcγRIIa Н-типа и R-типа, и повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с антителом IgG1, а затем был проведен детальный анализ связывания с каждым FcγR.
Вариабельная область (SEQ ID NO: 15) антитела против глипикана 3, содержащая CDR антитела GpH7, которое представляет собой антитело против глипикана 3, обладающее повышенной кинетикой в плазме, как описано в WO 2009/041062, была использована в качестве Н-цепи природного антитела. Аналогичным образом, в качестве L-цепи природного антитела использовали GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16) антитела против глипикана 3, обладающего повышенной кинетикой в плазме, как описано в WO 2009/041062. Кроме того, антитело В3, содержащее область G1d, в которую была введена мутация K439E и которая была продуцирована путем удаления С-концевого Gly и Lys IgG1, использовали в качестве константной области Н-цепи антитела. Эта Н-цепь обозначается GpH7-B3 (SEQ ID NO: 17), а L-цепь обозначается GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16).
В GpH7-B3 аминокислоты, которые, как считается, участвуют в связывании с FcγR, и окружающие их аминокислоты (в положениях 234-239, 265-271, 295, 296, 298, 300 и 324-337 в соответствии с Европейской нумерацией) заменяли, соответственно, аминокислотами 18 типов, за исключением исходных аминокислот и Cys. Эти варианты называются вариантами В3. Варианты В3 были экспрессированы и очищены методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa) детально анализировали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Результаты анализа на взаимодействие с каждым FcγR, проводимого методом, описанным ниже, были представлены на графиках. Величину количества FcγR, связывающегося с каждым антителом, происходящим от варианта ВЗ, делили на величину количества FcγR, связывающегося с антителом, которое было использовано для сравнения и которое не имело мутаций, введенных в В3 (антитело, имеющее последовательность природного человеческого IgG1 в положениях 234-239, 265-271, 295, 296, 298, 300 и 324-337 в соответствии с Европейской нумерацией). Величину, полученную путем умножения данного результата на 100, использовали в качестве показателя относительной активности связывания FcγR с каждым вариантом. На горизонтальной оси отложены величины относительной активности связывания FcγRIIb с каждым вариантом, а на вертикальной оси отложены величины относительной активности связывания каждого варианта с активирующими FcγR: FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа и FcγRIIIa (фиг. 1, 2, 3 и 4).
Как отмечено на фиг. 1-4, результаты показали, что все модификации, а именно, только введенные мутации, называемые мутацией А (модификацией, полученной путем замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) и мутацией В (модификацией, полученной путем замены Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu), приводили к заметному повышению активности связывания с FcγRIIb и к заметному ингибированию связывания с FcγRIIa обоих типов по сравнению с активностью связывания до введения модификаций.
[Сравнительный пример 4] ППР-анализ вариантов, селективно связывающихся в FcγRIIb
После введения модификации, описанной в примере 1, а именно, замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, проводили детальный анализ активности связывания с каждым FcγR.
Вариабельную область IL6R-H (SEQ ID NO: 18), которая представляет собой вариабельную область антитела против рецептора человеческого интерлейкина-6, описанного в WO 2009/125825, использовали в качестве вариабельной области Н- цепи антитела, a IL6R-G1d (SEQ ID NO: 19), которая содержит G1d с делецией С-концевого Gly и Lys человеческого IgG1, использовали в качестве константной области Н-цепи антитела в Н-цепи IgG1. В IL6R-G1d Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменяли на Asp с получением IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 20). Затем аминокислоту Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) в IL6R-G1d заменяли аминокислотой Glu с получением IL6R-G1d-v2. Кроме того, для сравнения, аминокислоту Ser в положении 267 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменяли на Glu, а аминокислоту Leu в положении 32 8 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменяли на Phe в IL6R-G1d с получением IL6R-G1d-v3, как описано в непатентном документе 28. Антитело IL6R-L (SEQ ID NO: 21), которое представляет собой L-цепь тоцилизумаба, использовали как L-цепь общего антитела, и эти антитела, вместе с каждой Н-цепью, экспрессировали и очищали методом, описанным в сравнительном примере 1. Полученные антитела, которые содержат в качестве Н-цепи аминокислотную последовательность, происходящую от IL6R-G1d, IL6R-G1d-v1, IL6R-G1d-v2 или IL6R-G1d-v3, обозначаются IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3, соответственно.
Затем проводили кинетический анализ взаимодействия между этими антителами и FcγR с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). В качестве рабочего буфера использовали HBS-EP+(GE Healthcare), а контрольную температуру устанавливали на 25°С. Был использован чип, полученный путем иммобилизации белка А на сенсорном чипе серии S СМ5 (GE Healthcare) методом присоединения амина. Представляющее интерес антитело иммобилизовали на этом чипе для взаимодействия с каждым FcγR, который был разведен рабочим буфером, и оценивали активность связывания с антителом. После оценки активности связывания, антитело, иммобилизованное на чипе, смывали путем реакции с 10 мМ глицин - HCl, рН 1,5, и этот чип регенерировали и использовали повторно. Сенсограммы, построенные по результатам измерений, анализировали с использованием лангмюровской модели связывания 1:1 с помощью компьютерной программы Biacore Evaluation Software, и вычисляли константу скорости ассоциации (л/моль/с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), а затем по этим величинам вычисляли константу диссоциации KD (моль/л).
Если связывание IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa Н-типа и FcγRIIIa было слабым, то кинетические параметры, такие как KD, не могли быть вычислены с применением вышеупомянутого аналитического метода. Величины KD для таких взаимодействий вычисляли с использованием нижеследующей модели связывания 1:1, как описано в руководстве Biacore Т100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.
Характер взаимодействия молекул в соответствии с моделью связывания 1:1 на Biacore может быть представлен нижеследующим уравнением 1.
где
Req: график зависимости устойчивых уровней связывания от концентрации аналита
С: концентрация
RI: вклад объемного показателя преломления в образце
Rmax: способность аналита связываться с поверхностью чипа
При преобразовании этого уравнения, KD может быть вычислена по уравнению 2, представленному ниже.
KD может быть вычислена путем замены величин Rmax, RI и С в этом уравнении. Исходя из условий данного измерения могут быть использованы величины RI=0, С=2 мкмоль/л. Кроме того, величину Rmax, полученную путем построения общей кривой сенсограммы по результатам анализа взаимодействия каждого FcγR с IgG1 с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, делили на количество иммобилизованного IgG1, и результат умножали на количество иммобилизованного IgG1-v1 и IgG1-v2, а затем полученную величину использовали как Rmax - Это вычисление проводили исходя из гипотезы, что ограниченное количество каждого FcγR, который может быть связан с IgG1, остается неизменным для всех вариантов, полученных путем введения мутаций в IgG1, а величина Rmax пропорциональна количеству антитела, связанного с чипом на время проведения измерений. Величина Req определяется как количество каждого FcγR, связывающегося с каждым вариантом на сенсорном чипе на время проведения измерений.
В этих условиях измерения уровень связывания (Req) IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa Н-типа составляет приблизительно 2,5 RU и 10 RU (RU=относительная единица), соответственно, а уровень связывания (Req) IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIIa составляет приблизительно 2,5 RU и 5 RU, соответственно. Уровень связывания иммобилизованных IgG1, IgG1-v1 и IgG1-v2 в анализе на взаимодействие с FcγRIIa Н-типа составляет 452 RU, 469,2 RU и 444,2 RU, соответственно, а уровень связывания иммобилизованных IgG1, IgG1-v1 и IgG1-v, в анализе взаимодействия с FcγRIIIa составляет 454,5 RU, 470,8 RU и 447, 1 RU, соответственно. Величины Rmax, полученные путем построения общей кривой сенсограммы по результатам анализа на взаимодействие IgG1 с FcγRIIa Н-типа и FcγRIIIa с использованием лангмюровской модели связывания 1:1, составляли 69,8 RU и 63,8 RU, соответственно. Вычисленные величины Rmax для связывания IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa Н-типа составляли 72,5 RU и 68,6 RU, соответственно, а вычисленные величины Rmax для связывания IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIIa составляли 66,0 RU и 62,7 RU, соответственно. Эти величины были заменены в уравнении 2 для вычисления KD для связывания IgG1-v1 и IgG1-v2 с FcγRIIa Н-типа и FcγRIIIa.
Величины KD для связывания IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3 с каждым FcγR (величины KD для связывания каждого антитела с каждым FcγR) представлены в таблице 1, а относительные величины KD для IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3, полученные путем деления величин KD для связывания IgG1 с каждым FcγR на величины KD для связывания IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v3 с каждым FcγR (относительные величины KD для связывания каждого антитела с каждым FcγR), представлены в таблице 2.
В этой таблице 15 цифры, отмеченные «*», означают, что величина KD была вычислена по уравнению 2, поскольку какого-либо значимого уровня связывания FcγR с IgG не наблюдалось.
(Величина, полученная путем деления величины KD для связывания IgG1 с каждым FcγR на величину KD для связывания каждого антитела IgG1 с каждым FcγR).
Как показано в таблице 16, по сравнению с IgG1, активность связывания IgG1-v1 снижалась в 0,047 раза для FcγRIa; снижалась в 0,10 раза для FcγRIIa R-типа; снижалась в 0,014 раза для FcγRIIa Н-типа; снижалась в 0,061 раза для FcγRIIIa и увеличивалась в 4,8 раза для FcγRIIb.
Кроме того, как показано в таблице 16, по сравнению с IgG1, активность связывания IgG1-v2 снижалась в 0,74 раза для FcγRIa; снижалась в 0,41 раза для FcγRIIa R-типа; снижалась в 0,064 раза для FcγRIIa Н-типа; снижалась в 0,14 раза для FcγRIIIa и увеличивалась в 2,3 раза для FcγRIIb.
Более конкретно, полученные результаты продемонстрировали, что IgG1-v1, в котором остаток Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменен Asp, и что IgG1-v2, в котором остаток Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменен Glu, обладают более слабой активностью связывания со всеми активирующими FcγR, включая FcγRIIa обоих аллотипов, и повышенной активностью связывания с FcγRIIb, который представляет собой ингибирующий FcγR.
Затем оценивали селективность связывания полученного варианта с FcγRIIb с использованием отношения FcγRIIb-связывающей активности к активности связывания с FcγRIIa R-типа или Н-типа, где указанное соотношение служило в качестве индикатора. В частности, величина I/A(R) или I/А(Н), которая представляет собой величину, полученную путем деления величины KD для FcγRIIa R-типа или Н-типа на величину KD для FcγRIIb, использовали в качестве показателя селективности связывания FcγRIIb с каждым FcγRIIa. Этот показатель увеличивается, если величина KD для FcγRIIb снижается, или если KD для FcγRIIa увеличивается. То есть, вариант, имеющий большую величину, обладает повышенной активностью связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa. Эти показатели систематизированы в таблице 17 для каждого варианта.
В соответствии с результатами, представленными в таблице 17, по сравнению с IgG1, вариант IgG1-v3, который был получен с применением известной технологии, имел более высокую величину I/А(Н), чем IgG1, и более высокую селективность связывания с FcγRIIb, но меньшую величину I/A(R), чем IgG1, и более высокую селективность связывания с FcγRIIb. С другой стороны, как описано в примерах, IgG1-v1 и IgG1-v2, как было обнаружено, имеет большие величины I/A(R) и I/А(Н), чем IgG1, и более высокую селективность связывания с FcγRIIb по сравнению с FcγRIIa обоих аллотипов.
До сих пор не было получено каких-либо данных о модификациях, обладающих такими свойствами, и действительно, такие модификации являются очень редкими, как показано на фиг.18, 19, 20 и 21. Модификации, вводимые путем замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp или замены Leu в положении 32 8 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu, являются наиболее подходящими при получении терапевтических средств для лечения иммунных воспалительных заболеваний и т.п.
Кроме того, в таблице 2 было убедительно продемонстрировано, что IgG1-v3, описанный в непатентном документе 28, обладает в 408 раз большей активностью связывания с FcγRIIb, в 0,51 раза более низкой активностью связывания с FcγRIIa Н-типа и в 522 раза большей активностью связывания с FcγRIIa R-типа. Эти результаты показали, что поскольку IgG1-v1 и IgG1-v2 обладают пониженной активностью связывания с FcγRIIa R-типа и Н-типа и повышенной активностью связывания с FcγRIIb, то считается, что эти варианты связываются с FcγRIIb с большей селективностью, чем IgG1-v3. В частности, модификации, вводимые путем замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp или замены Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu, являются наиболее подходящими при получении терапевтических средств для лечения иммунных воспалительных заболеваний и т.п.
[Сравнительный пример 5] Эффекты объединения модификаций и аминокислотных замен в другой Fc-области, влияющих на селективность связывания с FcγRIIb, Были предприняты попытки достичь еще большего повышения селективности связывания с FcγRIIb с использованием варианта, который обладал повышенной селективностью связывания с FcγRIIb и имел замену Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, как описано в сравнительных примерах 3 и 4.
Сначала в вариант IL6R-G1d_v1 (SEQ ID NO: 20) вводили в IL6R-G1d модификации, а именно, замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp и замены Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu, как описано в сравнительном примере 4, которые повышают селективность связывания с FcγRIIb, в результате чего получали вариант IL6R-G1d-v4. Полученный вариант объединяли с IL6R-L (SEQ ID NO: 21) методом, описанным в сравнительном примере 1. Полученное антитело, имеющее аминокислотную последовательность, происходящую от IL6R-G1d-v4, и служащее в качестве Н-цепи антитела, было обозначено IgG1-v4. Активности связывания IgG1, IgG1-v1, IgG1-v2 и IgG1-v4 с FcγRIIb оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2, и полученные результаты представлены в таблице 18.
Исходя из результатов таблицы 18, следует отметить, что поскольку модификация L328E приводит к 2,3-кратному повышению активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IgG1, то можно предположить, что комбинация этой модификации с заменой P238D, которая также приводит к 4,8-кратному повышению активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IgG1, будет еще больше повышать активность связывания с FcγRIIb, однако, фактически, FcγRIIb-связывающая активность варианта, содержащего комбинацию этих модификаций, была в 0,47 раза ниже активности IgG1. Этот результат указывает на то, что эффект от введения этих конкретных модификаций не может быть предсказан.
Аналогичным образом, IL6R-G1d-v1 (SEQ ID NO: 20) получали путем введения в IL6R-Gld модификации, а именно, замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, замены Ser в положении 267 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu и замены Leu в положении 328 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Phe, как описано в сравнительном примере 4, которые повышают активность связывания с FcγRIIb, в результате чего был получен вариант IL6R-G1d-v5 методом, описанным в сравнительном примере 1. Полученное антитело, имеющее аминокислотную последовательность, происходящую от IL6R-G1d-v5, и служащее в качестве Н-цепи антитела, было обозначено IgG1-v5. Активности связывания IgG1, IgG1-v1, IgG1-v3 и IgG1-v5 с FcγRIIb оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2, и полученные результаты представлены в таблице 19.
Модификацию S267E/L328F, повышающую активность связывания с FcγRIIb, как описано в сравнительном примере 4, вводили в P238D-вариант, а затем оценивали активность его связывания с FcγRIIb до и после введения такой модификации. Результаты представлены в таблице 19.
Исходя из результатов таблицы 19, следует отметить, что поскольку модификация S267E/L328F приводит к 408-кратному повышению активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IgG1, то можно предположить, что комбинация этой модификации с модификацией P238D, которая также приводит к 4,8-кратному повышению активности связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью IgG1, будет еще больше повышать активность связывания с FcγRIIb, однако, фактически, как описано в предыдущем примере, FcγRIIb-связывающая активность варианта, содержащего комбинацию этих модификаций, была только в 12 раз выше или т.п.по сравнению с активностью IgG1. Этот результат также указывает на то, что эффект от введения комбинации модификаций не может быть предсказан исходя из эффектов конкретных модификаций.
Эти результаты показали, что хотя одна замена Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp приводит к повышению активности связывания с FcγRIIb, однако, этот эффект не наблюдается при объединении с другими модификациями, которые повышают активность связывания с FcγRIIb. Причиной этого может быть то, что структура в пограничной области взаимодействия между Fc и FcγR после замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp изменяется, и эффекты таких модификаций, наблюдаемые в природном антителе, уже не дают ожидаемых результатов. В соответствии с этим, очевидно, что, с использованием в качестве матрицы Fc-области, содержащей замену Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, очень трудно получить Fc-область, которая обладала бы превосходной селективностью связывания с FcγRIIb, поскольку информация об эффектах модификаций, полученная для природных антител, не может быть применена.
[Сравнительный пример 6] Детальный анализ FcγRIIb-связывающей активности вариантов, в которые, помимо модификации P238D, была введена модификация в шарнирную область Как было показано в примере 5, в Fc-области, полученной путем замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp в природном человеческом IgG1, ожидаемый комбинаторный эффект не мог быть получен даже при объединении этой модификации с другой модификацией, которая, как предполагалось, повышает активность связывания с FcγRIIb. Поэтому, исходя из Fc-варианта, полученного путем замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, был проведен детальный анализ путем введения модификаций в Fc для поиска вариантов, которые также обладали бы повышенной активностью связывания с FcγRIIb. Для Н-цепей антитела получали вариант IL6R-F11 (SEQ ID NO: 22) путем введения модификации, а именно, замены Met в положении 2 52 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Tyr и замены Asn в положении 434 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Tyr в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 19), и вариант IL6R-F652 путем введения дополнительной замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp. Экспрессионные плазмиды, содержащие последовательность Н-цепи антитела, были получены для каждой последовательности Н-цепи антитела путем замены области возле остатка в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией)(в положениях 234-237 и 239 (в соответствии с Европейской нумерацией)) в IL6R-F652 каждой из 18 аминокислот, за исключением исходных аминокислот и цистеина. IL6R-L (SEQ ID NO: 21) использовали в качестве общей L-цепи для всех антител. Эти варианты были экспрессированы и очищены методом, описанным в сравнительном примере 1. Эти Fc-варианты были названы PD-вариантами. Взаимодействие каждого PD-варианта с FcγRIIa R-типа и с FcγRIIb детально оценивали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Результаты анализа взаимодействия с соответствующими FcγR, представленные на графике, были получены следующим методом. Величину, полученную путем деления величины активности связывания каждого PD-варианта с каждым FcγR на количество FcγR, связывающегося с предварительно модифицированным антителом, которое использовали в качестве контроля (антитело IL6R-F652/IL6R-L, которое имеет замену Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp), и умножения полученного результата на 100, использовали как относительную величину активности связывания каждого PD-варианта с каждым FcγR. На горизонтальной оси отложены относительные величины активности связывания FcγRIIb с каждым PD-вариантом, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания FcγRIIa R-типа с каждым PD-вариантом (фиг. 22).
В результате было обнаружено, что модификации одиннадцати типов обладали действием, усиливающим активность связывания с FcγRIIb и сохраняющим или усиливающим активность связывания с FcγRIIa R-типа по сравнению с активностью антитела до введения в него модификаций. Активности связывания этих одиннадцати вариантов с FcγRIIb и FcγRIIaR систематизированы в таблице 20. В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-F11 (SEQ ID NO: 22).
На фиг. 23 представлены относительные величины активности связывания с FcγRIIb, полученные путем дополнительного введения этих одиннадцати модификаций в вариант, имеющий модификацию P238D, и относительные величины активности связывания с FcγRIIb, полученные путем введения этих модификаций в Fc-область, которая не содержит модификации P238D, как описано в сравнительном примере 3. Эти одиннадцать модификаций повышали активность связывания с FcγRIIb, если они были дополнительно введены в вариант с P238D, по сравнению с активностью до введения, однако, с другой стороны, в случае введения этих восьми модификаций, за исключением G237F, G237W и S239D, эффект снижения активности связывания с FcγIIb наблюдался, только когда эти модификации были введены в вариант, не содержащий P238D (GpH7-B3/GpL16-k0), как описано в сравнительном примере 3.
Результаты, описанные в сравнительном примере 5, показали, что исходя из эффектов введения модификаций в природный IgG1 трудно предсказать эффекты введения тех же самых модификаций в вариант, содержащий Fc с модификацией P238D. Другими словами, эффект от введения этих восьми идентифицированных здесь модификаций невозможно предсказать без проведения описанного исследования.
Результаты измерения величин KD для связывания вариантов, указанных в таблице 20, с FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIaV методом, описанным в сравнительном примере 2, систематизированы в таблице 21. В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-F11 (SEQ ID NO:22). Матрица, используемая для продуцирования IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, отмечена звездочкой (*). Кроме того, в таблице «KD(IIaR)/KD(IIb)» и «KD(IIaH)/KD(IIb)», соответственно, означают величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb, и величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания родительского полипептида с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, в таблице 21 указаны величины KD для более высокой активности связывания каждого варианта с FcγRIIaR и FcγRIIaH/величины KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и FcγRIIaH. В данном случае «родительский полипептид» означает вариант, который содержит IL6R-F11 (SEQ ID NO: 22) в качестве Н-цепи. Было определено, что из-за слабого связывания FcγR с IgG невозможно провести точный кинетический анализ, а поэтому числа в закрашенных серым ячейках в таблице 21 относятся к величинам, вычисленным по уравнению 2 в сравнительном примере 2:
В таблице 21 показано, что все варианты обладали более высокой аффинностью связывания с FcγRIIb по сравнению с аффинностью IL6R-F11, и эта аффинность была выше в 1,9-5,0 раза. Отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb, и отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb означает отношение активности связывания с FcγRIIb к активности связывания с FcγRIIaR и активности связывания с FcγRIIaH, соответственно. То есть, эти величины указывают на степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. Для родительского полипептида IL6R-F11/IL6R-L, отношение величины KD для FcγRI IaR/величины KD для FcγRIIb и отношение величины KD для FcγRIIaH/величины KD для FcγRIIb составляют 0,7, и, соответственно, все варианты, представленные в таблице 21, обладают повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с родительским полипептидом. Если отношение «величина KD для более высокой активности связывания варианта с FcγRIIaR и с FcγRIIaH/величина KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и с FcγRIIaH» составляет 1 или более, то это означает, что более сильные FcγRIIaR-связывающие и FcγRIIaH-связывающие активности варианта являются эквивалентными FcγRIIaR-связывающей и FcγRIIaH-связывающей активности родительского полипептида или более низкими, чем активность родительского полипептида. Поскольку эта величина составляет от 0,7 до 5,0 для полученных здесь вариантов, то можно сказать, что связывание этих вариантов, имеющих более высокие FcγRIIaR-связывающие и FcγRIIaH-связывающие активности, являются почти аналогичными соответствующей активности родительского полипептида или более низкими, чем активность родительского полипептида. Эти результаты показали, что полученные варианты, по сравнению с родительским полипептидом, обладают повышенной активностью связывания с FcγRIIb, но обладают аналогичной или пониженной активностью связывания с FcγRIIa R-типа и Н-типа, а поэтому эти варианты обладают повышенной селективностью связывания с FcγRIIb. Кроме того, все эти варианты, по сравнению с IL6R-F11, обладают пониженной аффинностью связывания с FcγRIa и FcγRIIIaV.
[Сравнительный пример 7] Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного Fc-областью, содержащей P238D, и внеклеточной областью FcγRIIb
Как показано в сравнительном примере 5, даже если было обнаружено, что при введении в P238D-содержащую Fc-область модификации, которая повышает активность или селективность связывания с FcγRIIb, наблюдается снижение этой активности, то это может быть обусловлено тем, что структура пограничной области взаимодействия Fc и FcγRIIb изменяется в результате введения модификации P238D. Поэтому, чтобы понять причину такого явления, трехмерную структуру комплекса, образованного Fc-областью IgGl, содержащей мутацию P238D (далее обозначаемую Fc(P238D)), и внеклеточной областью FcγRIIb, оценивали с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры, а затем эту трехмерную структуру и характер связывания сравнивали с трехмерной структурой и характером связывания комплекса, образованного Fc-областью природного IgG1 (далее обозначаемой Fc(WT)) и внеклеточной областью FcγRIIb. Имеется множество данных о трехмерной структуре комплекса, образованного Fc и внеклеточной областью FcγR, и был проведен анализ трехмерных структур комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276, 164 69-16477), комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 12 669-12 6674) и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa (J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217). Хотя трехмерная структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb не была проанализирована, однако, трехмерная структура комплекса, образованного Fc(WT) и FcγRIIa, является известной, и также известно, что внеклеточые области FcγRIIa и FcγRIIb имеют аминокислотные последовательности, идентичные на 93%, то есть они имеют очень высокую гомологию. Таким образом, трехмерная структура комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb была предсказана путем моделирования с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa.
Трехмерная структура комплекса Fc (P238D)/внеклеточная область FcγRIIb была определена с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры с разрешением 2,6 Структура, полученная в результате такого анализа, представлена на фиг. 24. В настоящее время уже была проанализирована внеклеточная область FcγRIIb, образованная двумя СН2-доменами Fc, и было обнаружено, что структура этой области аналогична трехмерной структуре комплексов, образованных Fc(WT) и соответствующими внеклеточыми областями FcγRIIIa, FcγRIIIb или FcγRIIa.
Затем, для детального сравнения, осуществляли суперпозицию кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и смоделированной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, где такое сравнение проводили методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Сα для внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена A Fc (фиг. 25). В этом случае степень перекрывания между СН2-доменами В Fc была неудовлетворительной, и в этой части наблюдались конформационные различия. Кроме того, с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и смоделированной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, пары атомов, которые имеют расстояния 3,7 или менее между внеклеточной областью FcγRIIb и СН2-доменом В Fc, исключали, и проводили сравнение для выявления различий в межатомных взаимодействиях между FcγRIIb и СН2-доменом В Fc в Fc(WT) и Fc(P238D). Как показано в таблице 22, межатомные взаимодействия между СН2-доменом В Fc и FcγRIIb в Fc(P238D) и в Fc(WT) не соответствовали друг другу.
Кроме того, осуществляли суперпозицию кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и смоделированной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа, и проводили сравнение методом наименьших квадратов, исходя из расстояния между парами атомов Сα только для СН2-домена A Fc или только для СН2-домена В Fc, а затем проводили детальное сравнение структур, находящихся возле P238D. Локализации аминокислотного остатка в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией), которое представляет собой положение вводимой мутации, отличались для Fc(P238D) и в Fc(WT), то есть можно видеть, что наряду с таким изменением находящаяся рядом петлевая структура, являющаяся продолжением шарнирной области, отличалась для Fc(P238D) и Fc(WT) (фиг. 26). В природном Fc(WT) Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) присутствует на внутренней стороне белка и образует гидрофобную сердцевину с окружающими ее остатками. Однако, при замене этого остатка заряженным и в высокой степени гидрофильным Asp, присутствие такого остатка в той же самой гидрофобной сердцевине может вызывать энергетически неблагоприятную ситуацию, называемую десольватацией. Поэтому, в Fc(P238D), для устранения такой неблагоприятной энергетической ситуации, аминокислотный остаток в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) заменяют так, чтобы он был ориентирован в сторону растворителя, и это может вызывать изменение расположенной рядом петлевой структуры. Кроме того, поскольку такая петля является продолжением шарнирной области, пререкрестно связанной связью S-S, то такое структурное изменение не будет ограничиваться изменением в какой-либо конкретной области, а будет влиять на относительное расположение СН2-домена A Fc и СН2-домена В Fc. В результате происходит изменение межатомных взаимодействий между FcγRIIb и СН2-доменом В Fc. Поэтому предсказанные эффекты не наблюдались при введении модификаций, которые повышают селективность и активность связывания с FcγRIIb в природном IgG, в комбинации с модификациями в Fc-области, содержащей модификацию P238D.
Кроме того, в результате структурных изменений, обусловленных введением модификации P238D в СН2-домен A Fc, образовывалась водородная связь между главной цепью Gly в соседнем положении 237 (в соответствии с Европейской нумерацией) и Tyr в положении 160 FcγRIIb (фиг. 27). Остатком в FcγRIIa, который соответствует этому остатку Tyr 160, является Phe, а при связывании этого остатка с FcγRIIa, такая водородная связь не образуется. Аминокислота в положении 160 представляет собой одну из нескольких аминокислот, отличающихся в FcγRIIa и в FcγRIIb в пограничной области взаимодействия с Fc, и было высказано предположение, что такая водородная связь, которая является специфичной для FcγRIIb, будет способствовать повышению FcγRIIb-связывающей активности и снижению FcγRIIa-связывающей активности Fc(P238D), а также к повышению селективности такого связывания. Кроме того, в СН2-домене В Fc-области в FcγRIIb наблюдалось электростатическое взаимодействие между остатком Asp в положении 270 (в соответствии с Европейской нумерацией) и остатком Arg в положении 131 (фиг. 28). В FcγRIIa Н-типа, который представляет собой один из аллотипов FcγRIIa, соответствующим остатком является His, а поэтому этот остаток не может вступать в такое электростатическое взаимодействие. Этим объясняется снижение активности связывания Fc(P238D) с FcγRIIa Н-типа, а не с FcγRIIa R-типа. Оценка таких результатов рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры показала, что изменение петлевой структуры после введения модификации P238D с последующим изменением относительной локализации домена будет приводить к новым взаимодействиям, которые не наблюдаются в природном IgG, и к селективному характеру связывания P238D-вариантов с FcγRIIb.
[Экспрессия и очистка Fc(P238D)]
Fc-область, содержащую модификацию P238D, получали следующим образом. Сначала получали hIL6R-IgG1-v1 (SEQ ID NO:20) путем замены Cys в положении 220 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Ser. Затем генную последовательность Fc(P238D), в которой у С-конца в положении 216 присутствует Glu (в соответствии с Европейской нумерацией), клонироваали с помощью ПЦР. С использованием этой клонированной генной последовательности осуществляли конструирование экспрессионных векторов, и проводили экспрессию и очистку Fc(P238D) методом, описанным в сравнительном примере 1. Cys в положении 220 (в соответствии с Европейской нумерацией) образует дисульфидную связь с Cys L-цепи в природном IgG1. При получении одного Fc, L-цепь не экспрессируется, а поэтому, для предотвращения образования нежелательных дисульфидных связей, этот остаток заменяют на Ser.
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIb]
Экспрессия и очистка были проведены методом, описанным в сравнительном примере 2.
[Очистка комплекса Fc(P238D))/внеклеточная область FcγRIIb]
К 2 мг образца внеклеточной области FcγRIIb, полученного в целях кристаллизации, добавляли 0,29 мг Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы. Этот белок выдерживали при комнатной температуре в течение трех дней в 0,1 М бис-трис-буфера при рН 6,5, и N-связанный олигосахарид отделяли, в результате чего оставался N-ацетилглюкозамин, непосредственно связанный с Asn. Затем этот образец внеклеточного домена FcγRIIb, подвергнутый реакции отщепления углевода, концентрировали путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 5000, после чего его очищали с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 20 мМ HEPES при рН 7,5, содержащем 0,05М NaCl. Кроме того, к полученной фракции внеклеточной области FcγRIIb, от которой был отщеплен углевод, добавляли Fc(P238D) так, чтобы молярное отношение внеклеточной области FcγRIIb было слегка повышенным, и после концентрирования этого образца путем ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000 получали образец комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb с последующей очисткой с помощью гель-фильтрации (Superdex 200 10/300) на колонке, уравновешенной в 20 мМ HEPES при рН 7,5, содержащем 0,05М NaCl.
[Кристаллизация комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
Образец комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb концентрировали до получения концентрации приблизительно 10 мг/мл с использованием фильтра для ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10000, и кристаллизовали методом паровой диффузии с сидячей каплей. Для кристаллизации использовали Hydra II Plus One (MATRIX), а для резервуарного раствора, содержащего 100 мМ бис-трис, рН 6,5, 17% PEG3350, 0, 2М ацетата аммония и 2,7% (масс/об) D-галактозы, каплю для инициации кристаллизации получали путем смешивания резервуарного раствора и образца кристаллизации в соотношении 0,2 мкл:0,2 мкл, а затем этот раствор герметично закрывали и оставляли при температуре 20°С, в результате чего были успешно получены тонкие пластинчатые кристаллы.
[Получение рентгенографических данных для кристалла комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
Один из полученных монокристаллов комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb заливали в раствор 100 мМ бис-трис (рН 6,5), 20% PEG3350, ацетата аммония, 2,7% (масс/об) D-галактозы и 22,5% (об/об) этиленгликоля. Кристалл промывали раствором с помощью иглы, к которой была подсоединена тонкая нейлоновая петля, и замораживали в жидком азоте, а затем проводили рентгенографический анализ на синхротронном излучателе Photon Factory BL-1A в научно-исследовательском институте высоких энергий. Во время измерений кристалл постоянно выдерживали в потоке азота при -178°С для его поддержания в замороженном состоянии, и все 225 дифракционных изображений этого монокристалла получали на ПЗС-детекторе Quantum 270 (ADSC), подсоединенном к источнику луча света, с одновременным вращением кристалла под углом 0,8°. Исходя из полученных дифракционных изображений, определение констант ячейки, идентификацию пятен дифракции и обработку рентгенографических данных проводили с использованием программы Xia2 (пакета программ ССР4), программы XDS (Walfgang Kabsch) и Scala (пакета программ ССР4), и наконец, получали данные интенсивности дифракции с разрешением 2,46 Этот кристалл принадлежал к пространственной группе Р21 и имел следующие параметры ячейки: а=48, 85 b=76,01 с=115,09 α=90°, β=100, 70°, γ=90°.
[Рентгеноструктурный_анализ_комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
Кристаллическую структуру комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb определяли методом молекулярной замены с использованием программы Phaser (пакета программ ССР4). Исходя из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb было предсказано, что число комплексов в асимметрической ячейке равно 1. Исходя из структурных координат кода PDB: 3SGJ, который представляет собой кристаллическую структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, были определены отдельные координаты аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 239-340 и В-цепи в положениях 239-340, а затем эти координаты были использованы, соответственно, в качестве моделей для поиска СН2-доменов Fc. Исходя из тех же самых структурных координат кода PDB: 3SGJ, был определен отдельный ряд координат аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 341-444 и В-цепи в положениях 341-444, а затем эти координаты были использованы, соответственно, в качестве моделей для поиска СН3-доменов Fc. И наконец, исходя из структурных координат кода PDB: 2FCB, который представляет собой кристаллическую структуру внеклеточной области FcγRIIb, были определены отдельные координаты аминокислотных остатков части А-цепи в положениях 6-178, а затем эти координаты были использованы в качестве моделей для поиска внеклеточной области FcγRIIb. Затем определяли ориентацию и положение СН3-доменов Fc, внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена Fc для каждой модели поиска в кристаллических решетках с использованием функций вращения и функций трансляции, в результате чего была получена первоначальная модель кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. Если уточнение параметров твердого тела, относящегося к двум СН2-доменам Fc, двум СН3-доменам Fc и внеклеточной области FcγRIIb, осуществляли исходя из полученной первоначальной модели, то фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор, составлял 40,4%, а свободный R-фактор (R-free) составлял 41,9%, как было определено по данным интенсивности дифракции с разрешением от 25 до 3,0 Кроме того, уточнение структуры проводили с использованием программы REFMAC5 (пакета программ ССР4), а коррекцию модели с наблюдением карт электронной плотности с коэффициентами 2Fo-Fc или Fo-Fc, которые вычисляли исходя из экспериментально определенного структурного фактора Fo, вычисленного структурного фактора Fc и фазы, вычисленной с использованием такой модели, осуществляли с помощью программы Coot (Paul Emsley), а затем проводили уточнение модели путем повторения этих стадий. И наконец, в результате введения молекул воды в модель, полученную исходя из карты электронной плотности, где 2Fo-Fc и Fo-Fc использовали в качестве коэффициента, и после уточнения был получен фактор кристаллографической достоверности, то есть R-фактор и R-free модели, содержащей 4846 не-водородных атомов, которые составляли 23,7% и 27,6%, соответственно, как было определено по 24291 данным интенсивности дифракции с разрешением от 2 5 до 2,6 соответственно.
[Создание модели структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb]
Исходя из структурных координат кода PDB: 3RY6, который представляет собой кристаллическую структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa, функцию сконструированных мутантов, заложенную в программу Discovery Studio 3.1 (Accelrys), использовали для введения мутаций в FcγRIIa в целях поиска соответствий аминокислотной последовательности FcγRIIb и FcγRIIa в этих структурных координатах. В данном случае уровень оптимизации ставили на «высокий», а радиус отсечки устанавливали на 4,5, при этом получали пять моделей, и одну из этих моделей с наилучшей энергетической оценкой использовали в качестве смоделированной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb.
[Сравнительный пример 8] Анализ на FcγR-связывание Fc-вариантов, в которых сайты модификаций были определены исходя из кристаллических структур
На основе результатов рентгеноструктурного анализа комплекса, образованного Fc(P238D) и внеклеточной областью FcγRIIb, полученного как описано в сравнительном примере 7, было предсказано, что всевозможные модификации, которые были введены в сайты Fc-варианта, имеющего замену Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, влияют на взаимодействие с FcγRIIb (в положениях остатков 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 и 334 (в соответствии с Европейской нумерацией)), и были оценены варианты, имеющие комбинацию модификаций, повышающих активность связывания с FcγRIIb.
IL6R-B3 (SEQ ID NO:23) получали путем введения в вариант IL6R-G1d (SEQ ID NO:19), полученный как описано в сравнительном примере 4, модификации, а именно замены Lys в положении 439 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Glu. Затем получали IL6R-BF648 путем введения в вариант IL6R-B3 модификации, а именно, замены Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 21) использовали в качестве L-цепи антитела, которая является общей для всех антител. Эти варианты антител были экспрессированы и очищены методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) детально анализировали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Величины активности связывания вычисляли по результатам анализа на взаимодействие с соответствующим FcγR методом, описанным ниже. Величину активности связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на величину активности связывания предварительно модифицированного контрольного антитела (IL6R-BF648/IL6R-L с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) с каждым FcγR, и полученный результат умножали на 100, в результате чего получали относительную активность связывания каждого варианта с каждым FcγR. На горизонтальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIa R-типа (фиг. 29).
Результаты, представленные на фиг. 29, показали, что из всех модификаций модификации 2 4 типов способны сохранять или повышать активность связывания с FcγRIIb по сравнению с предварительно модифицированным антителом. Связывание этих вариантов с каждым FcγR проиллюстрировано в таблице 23. В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23; IL6R-2 В999 в таблице 23). Матрица, используемая для продуцирования IL6R-B3, IL6R-Gld/IL6R-L, показана звездочкой (*).
Результаты измерения величин KD для связывания вариантов, указанных в таблице 23, с FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа, проводимого методом, описанным в сравнительном примере 2, систематизированы в таблице 24. В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23). Матрица, используемая для продуцирования IL6R-B3, IL6R-Gld/IL6R-L, отмечена звездочкой (*). Кроме того, в этой таблице «KD(IIaR)/KD(IIb)» и «KD(IIaH)/KD(IIb)», соответственно, означают величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb, и величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания родительского полипептида с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, в таблице 24 указаны соотношения «величины KD для более высокой активности связывания каждого варианта с FcγRIIaR и FcγRIIaH/величины KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и FcγRIIaH». В данном случае родительский полипептид означает вариант, который содержит IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23) в качестве Н-цепи. Было определено, что из-за слабого связывания FcγR с IgG невозможно провести точный кинетический анализ, а поэтому числа в закрашенных серым ячейках, как показано в таблице 24, относятся к величинам, вычисленным по уравнению 2 в сравнительном примере 2:
В таблице 24 показано, что все варианты обладали более высокой аффинностью связывания с FcγRIIb по сравнению с аффинностью IL6R-B3 (IL6R-2B999 в таблице 24), и эта аффинность была выше в 2,1-9,7 раза. Отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb и отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb означает отношение активности связывания с FcγRIIb к активности связывания с FcγRIIaR и к активности связывания с FcγRIIaH, соответственно. То есть, эти величины указывают на степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку для родительского полипептида IL6R-B3/IL6R-L отношение величины KD для FcγRIIaR/величины KD для FcγRIIb и отношение величины KD для FcγRIIaH/величины KD для FcγRIIb составляют 0,3 и 0,2, соответственно, то все варианты, представленные в таблице 24, обладают повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с родительским полипептидом. Если отношение «величина KD для более высокой активности связывания варианта с FcγRIIaR и с FcγRIIaH/величина KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и с FcγRIIaH» составляет 1 или более, то это означает, что более сильные FcγRIIaR-связывающие и FcγRIIaH-связывающие активности варианта эквивалентны или ниже по сравнению с более высокими FcγRIIaR-связывающей и FcγRIIaH-связывающей активностями родительского полипептида. Поскольку эта величина составляет от 4,6 до 34,0 для полученных здесь вариантов, то можно сказать, что, по сравнению с родительским полипептидом, полученные здесь варианты имели более низкую активность связывания с FcγRIIaR и с FcγRIIaH. Эти результаты показали, что полученные варианты, по сравнению с родительским полипептидом, обладают одинаковой или пониженной активностью связывания с FcγRIIa R-типа и Н-типа, повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb. Кроме того, все эти варианты, по сравнению с IL6R-B3, обладают пониженной аффинностью связывания с FcγRIa и FcγRIIIaV.
При рассмотрении наиболее перспективных вариантов из числа полученных вариантов, имеющих комбинации модификаций, факторы, обеспечивающие действие этих вариантов, были исследованы с использованием данных кристаллической структуры. На фиг. 30 показана кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре, Н-цепь, расположенная слева, представляет собой цепь A Fc, а Н-цепь, расположенная справа, представляет собой цепь В Fc. Отсюда можно видеть, что сайт в положении 233 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи A Fc расположен рядом с Lys в положении 113 (в соответствии с Европейской нумерацией) FcγRIIb. Однако, в этой кристаллической структуре, боковая цепь Е233 находится в состоянии довольно высокой подвижности, а электронная плотность этой цепи не была точно определена. Таким образом, модификация, вводимая путем замены Glu в положении 233 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp, приводила к уменьшению степени свободы боковой цепи, поскольку боковая цепь становилась короче на один атом углерода. В результате этого, потеря энтропии при взаимодействии с Lys в положении 113 (в соответствии с Европейской нумерацией) в FcγRIIb может снижаться, что дает основание предположить, что указанный фактор может вносить свой вклад в увеличение свободной энергии связывания.
Аналогичным образом, на фиг. 31 показано окружение сайта в положении 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) в структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре показано, что окружение сайта в положении 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи A Fc(P238D) представляет собой гидрофильное окружение, состоящее из Ser в положении 85, Glu в положении 8 6, Lys в положении 163 и т.п. (в соответствии с Европейской нумерацией) в FcγRIIb. Таким образом, было высказано предположение, что модификация, полученная путем замены Ala в положении 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Lys или Arg, будет вносить свой вклад в усиление взаимодействия с Ser в положении 85 (в соответствии с Европейской нумерацией) или Glu в положении 8 6 (в соответствии с Европейской нумерацией) в FcγRIIb.
На фиг. 32 показаны структуры с Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) в цепи В Fc после суперпозиции кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa со структурой цепи В Fc, где указанную суперпозицию анализировали методом наименьших квадратов исходя из расстояния между парами атомов Сα. Эти две структуры имеют хорошее соответствие, но они имеют различия в трехмерной структуре у Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией). Если принять во внимание слабую электронную плотность вокруг этой области в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, то можно предположить, что существует вероятность того, что остаток Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) в Fc(P238D)/FcγRIIb будет создавать значительные стерические затруднения в этой структуре, а значит он будет препятствовать оптимизации петлевой структуры. Следовательно, можно сказать, что модификация, осуществляемая путем замены Pro в положении 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Gly, будет придавать этой петлевой структуре большую гибкость, а поэтому будет вносить свой вклад в повышение активности связывания благодаря снижению энергетического барьера, что даст возможность получить оптимальную структуру после взаимодействия с FcγRIIb.
[Сравнительный пример 9] Оценка комбинаторного эффекта модификаций, которые, при их объединении с P238D, будут повышать активность связывания с FcγRIIb
Из всех модификаций, полученных, как описано в сравнительных примерах 6 и 8, те модификации, которые повышали или сохраняли активность связывания с FcγRIIb и подавляли активность связывания с другими FcγR, объединяли друг с другом, а затем оценивали их эффекты.
В частности, хорошие модификации были выбраны из таблиц 19 и 22, и эти модификации были объединены и введены в Н-цепь антитела IL6R-BF64 8 методом, аналогичным методу, описанному в сравнительном примере 8. IL6R-L использовали в качестве L-цепи антитела, которая является общей для всех антител, и эти антитела были экспрессированы и очищены методом, описанным в сравнительном примере 1, а связывание с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа) детально анализировали методом, описанным в сравнительном примере 2.
Относительные активности связывания вычисляли по результатам анализа на взаимодействие с соответствующими FcγR методом, описанным ниже. Величину активности связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на величину активности связывания контрольного предварительно модифицированного антитела (IL6R-BF648/IL6R-L с заменой Pro в положении 238 (в соответствии с Европейской нумерацией) на Asp) с каждым FcγR, и полученный результат умножали на 100, в результате чего получали относительную активность связывания каждого варианта с каждым FcγR. На горизонтальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIb, а на вертикальной оси отложены относительные величины активности связывания каждого варианта с FcγRIIa R-типа (таблица 25).
В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23). Матрица, используемая для продуцирования IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, показана звездочкой (*).
Результаты измерения величин KD для связывания вариантов, указанных в таблице 25, с FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIa V-типа методом, описанным в сравнительном примере 2, систематизированы в таблице 26. В этой таблице «модификация» означает модификацию, введенную в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23). Матрица, используемая для продуцирования IL6R-B3, IL6R-Gld/IL6R-L, отмечена звездочкой (*). Кроме того, в таблице «KD(IIaR)/KD(IIb)» и «KD(IIaH)/KD(IIb)», соответственно, означают величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb, и величину, полученную путем деления величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. «KD(IIb) родительского полипептида/KD(IIb) модифицированного полипептида» означает величину, полученную путем деления величины KD для связывания родительского полипептида с FcγRIIb на величину KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb. Кроме того, в таблице 24 указаны отношения «величины KD для более высокой активности связывания каждого варианта с FcγRIIaR и FcγRIIaH/величины KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и FcγRIIaH». В данном случае родительский полипептид означает вариант, который содержит IL6R-B3 (SEQ ID NO: 23) в качестве Н-цепи. Было определено, что из-за слабого связывания FcγR с IgG невозможно провести точный кинетический анализ, а поэтому числа в закрашенных серым ячейках, как показано в таблице 26, относятся к величинам, вычисленным по уравнению 2 в сравнительном примере 2:
В таблице 26 показано, что все варианты обладали более высокой аффинностью связывания с FcγRIIb по сравнению с аффинностью IL6R-B3, и эта аффинность была выше в 3,0-99,0 раз. Отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaR/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb и отношение величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIaH/величины KD для связывания каждого варианта с FcγRIIb означает отношение активности связывания с FcγRIIb к активности связывания с FcγRIIaR и активности связывания с FcγRIIaH, соответственно. То есть, эти величины указывают на степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и чем выше эта величина, тем выше селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку для родительского полипептида IL6R-B3/IL6R-L отношение величины KD для FcγRIIaR/величины KD для FcγRIIb и отношение величины KD для FcγRIIaH/величины KD для FcγRIIb составляют 0,3 и 0,2, соответственно, то все варианты, представленные в таблице 2 6, обладают повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с родительским полипептидом. Если отношение «величина KD для более высокой активности связывания варианта с FcγRIIaR и с FcγRIIaH/величина KD для более высокой активности связывания родительского полипептида с FcγRIIaR и с FcγRIIaH» составляет 1 или более, то это означает, что более сильные FcγRIIaR-связывающие и FcγRIIaH-связывающие активности варианта эквивалентны или ниже FcγRIIaR-связывающей и FcγRIIaH-связывающей активности связывания родительского полипептида. Поскольку эта величина составляет от 0,7 до 29,9 для полученных здесь вариантов, то можно сказать, что полученные здесь варианты имели почти эквивалентную или более низкую активность связывания по сравнению с более сильной FcγRIIaR-связывающей и FcγRIIaH-связывающей активностью родительского полипептида. Эти результаты показали, что полученные варианты, по сравнению с родительским полипептидом, обладают одинаковой или пониженной активностью связывания с FcγRIIa R-типа и Н-типа, повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb. Кроме того, все эти варианты, по сравнению с IL6R-B3, обладают пониженной аффинностью связывания с FcγRIa и FcγRIIIaV.
Вариабельная область и константная область в соответствующих последовательностях SEQ ID NO систематизированы в нижеследующей таблице. В этой таблице «В3» означает «2 В999(В30)», «omlizH» означает «омализумаб_VH», a «omlizL» означает «омализумаб VL».
Промышленное применение
Настоящее изобретение относится к варианту Fc-области с повышенной активностью связывания с FcγRIIb и повышенной селективностью связывания с FcγRIIb по сравнению с активностью и селективностью с FcγRIIa (типа R), в отличие от полипептида, содержащего Fc-область, в которую не была(и) введена(ы) аминокислотная(ые) модификация(и); и к полипептиду, содержащему вариант Fc-области. Применение указанного полипептида позволяет осуществлять передачу сигнала, ингибирующего воспалительный иммунный ответ, опосредуемый фосфорилированием ITIM FcγRIIb. Кроме того, в результате сообщения Fc-части антитела способности селективно связываться с FcγRIIb, можно ингибировать продуцирование антитела против лекарственного средства благодаря FcγRIIb-опосредуемому иммуносупрессорному действию.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ FсγRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ
<130> C1-A1212P
<150> JP 2012-185868
<151> 2012-08-24
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1125
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
aaggcagtga tcactttgca gcctccatgg gtcagcgtgt tccaagagga aaccgtaacc 120
ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480
agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga 900
ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag 960
aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc 1020
cttcaagaag acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag 1080
ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag 1125 2
<210> 2
<211> 374
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 3
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290 295 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325 330 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355 360 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210> 3
<211> 951
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgactatgg agacccaaat gtctcagaat gtatgtccca gaaacctgtg gctgcttcaa 60
ccattgacag ttttgctgct gctggcttct gcagacagtc aagctgctcc cccaaaggct 120
gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac gtgctccagg aggactctgt gactctgaca 180
tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc 240
attcccaccc acacgcagcc cagctacagg ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag 300
tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc 360 4
gaatggctgg tgctccagac ccctcacctg gagttccagg agggagaaac catcatgctg 420
aggtgccaca gctggaagga caagcctctg gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa 480
tcccagaaat tctcccattt ggatcccacc ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac 540
agtggtgatt accactgcac aggaaacata ggctacacgc tgttctcatc caagcctgtg 600
accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc agctcttcac caatgggggt cattgtggct 660
gtggtcattg cgactgctgt agcagccatt gttgctgctg tagtggcctt gatctactgc 720
aggaaaaagc ggatttcagc caattccact gatcctgtga aggctgccca atttgagcca 780
cctggacgtc aaatgattgc catcagaaag agacaacttg aagaaaccaa caatgactat 840
gaaacagctg acggcggcta catgactctg aaccccaggg cacctactga cgatgataaa 900
aacatctacc tgactcttcc tcccaacgac catgtcaaca gtaataacta a 951
<210> 4
<211> 316
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20 25 30
Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
35 40 45
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
50 55 60
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
65 70 75 80
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
100 105 110
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
115 120 125 5
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
130 135 140
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
145 150 155 160
Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
165 170 175
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
180 185 190
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
195 200 205
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala
210 215 220
Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys
225 230 235 240
Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala
245 250 255
Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln
260 265 270
Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met
275 280 285
Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu
290 295 300
Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305 310 315
<210> 5
<211> 876
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
atgggaatcc tgtcattctt acctgtcctt gccactgaga gtgactgggc tgactgcaag 60
tccccccagc cttggggtca tatgcttctg tggacagctg tgctattcct ggctcctgtt 120
gctgggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 180 6
gtgctccagg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac 240
tccattcagt ggttccacaa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg 300
ttcaaggcca acaacaatga cagcggggag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc 360
agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggctgg tgctccagac ccctcacctg 420
gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaagga caagcctctg 480
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatcccaac 540
ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata 600
ggctacacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca 660
ccgatgggga tcattgtggc tgtggtcact gggattgctg tagcggccat tgttgctgct 720
gtagtggcct tgatctactg caggaaaaag cggatttcag ccaatcccac taatcctgat 780
gaggctgaca aagttggggc tgagaacaca atcacctatt cacttctcat gcacccggat 840
gctctggaag agcctgatga ccagaaccgt atttag 876
<210> 6
<211> 291
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1 5 10 15
Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20 25 30
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35 40 45
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu
50 55 60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp
65 70 75 80
Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln
85 90 95
Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr
100 105 110 7
Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val
115 120 125
Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu
130 135 140
Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu
145 150 155 160
Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg
165 170 175
Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180 185 190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys
195 200 205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile
210 215 220
Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala
225 230 235 240
Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro
245 250 255
Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr
260 265 270
Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln
275 280 285
Asn Arg Ile
290
<210> 7
<211> 765
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 7
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagggt gctcgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180 8
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gttgacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaagg caggaagtat tttcatcata attctgactt ctacattcca 480
aaagccacac tcaaagacag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tgtcagtgtc aaccatctca 600
tcattctttc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattc gaagctcaac aagagactgg 720
aaggaccata aatttaaatg gagaaaggac cctcaagaca aatga 765
<210> 8
<211> 254
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125 9
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
<210> 9
<211> 702
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgtggcagc tgctcctccc aactgctctg ctacttctag tttcagctgg catgcggact 60
gaagatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag 120
gacagtgtga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg 180
tttcacaatg agagcctcat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca 240
gtcaacgaca gtggagagta caggtgccag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg 300
cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccaggccc ctcggtgggt gttcaaggag 360
gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctctgca taaggtcaca 420
tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacattcca 480
aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat 540
gtgtcttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca 600
tcattctctc cacctgggta ccaagtctct ttctgcttgg tgatggtact cctttttgca 660 10
gtggacacag gactatattt ctctgtgaag acaaacattt ga 702
<210> 10
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 11
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225 230
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160 12
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 326
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 13
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 14
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 13
<211> 377
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125 15
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365 16
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 14
<211> 327
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 17
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 18
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 19
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 17
<211> 443
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 20
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335 21
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 22
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160 23
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400 24
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 20
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 25
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 26
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 21
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 27
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 28
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 29
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Tyr His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 23
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110 30
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350 31
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 24
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 32
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 33
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 25
<211> 449
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 34
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335 35
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro
<210> 26
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 26
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 36
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45 37
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285 38
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 28
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 39
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 40
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 29
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30 41
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270 42
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 30
<211> 444
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 43
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 44
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440
<210> 31
<211> 444
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 45
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255 46
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 32
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 47
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 48
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 33
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 33 49
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240 50
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ala Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 34
<211> 443
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность 51
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 52
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 35
<211> 443
<212> PRT
<213> Искусственная 53
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220 54
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440
<210> 36
<211> 447
<212> PRT 55
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 56
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Tyr Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 37 57
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205 58
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Gln Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445 59
<210> 38
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 60
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Phe Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro 61
435 440 445
<210> 39
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190 62
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Asp Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430 63
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 40
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 64
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Glu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 65
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 66
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Thr Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 67
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 68
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 69
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 43
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160 70
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 44
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 71
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 72
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 45
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125 73
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 46
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность 74
<400> 46
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 75
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 47
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 76
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Gly Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325 77
<210> 48
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 78
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 49
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 79
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Thr Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300 80
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 50
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 81
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 51
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 82
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Gly Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 83
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 52
<211> 325
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 84
130 135 140
Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 53
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 53 85
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240 86
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 54
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 87
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Met Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 55 88
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205 89
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 56
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 90
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Met Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 91
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 57
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175 92
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 58
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 93
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 94
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 59
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 95
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 60
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 96
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 97
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 61
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 98
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 62
<211> 328
<212> PRT 99
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 62
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Gly Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 63
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 101
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 102
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 64
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 103
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 65
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 65
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 104
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Gly Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Met Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 105
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 66
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 66
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Asp Val Lys Phe Asn Trp 106
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 67
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15 107
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Pro Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 108
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 68
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 68
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 109
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Pro Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 69
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная 110
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220 111
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 70
<211> 328
<212> PRT 112
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 113
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 71
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 71
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 114
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 115
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 72
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 116
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 117
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 73
<211> 447
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175 118
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Asp
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp
260 265 270
Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415 119
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu
420 425 430
Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 120
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 75
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 121
Val Val Val Asp Val Gly Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 76
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 76
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 122
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Asp Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 123
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 77
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 77
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 124
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ala Glu Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 78
<211> 328
<212> PRT 125
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 78
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 126
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 79
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 79
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 127
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 128
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 80
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 80
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Glu His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 129
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 81
<211> 328
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Искусственно полученная последовательность
<400> 81
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 130
<---
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Asp Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Gly Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Arg Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 131
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
Claims (52)
1. Способ получения варианта Fc-области антитела IgG, имеющей улучшенную связывающую активность с FcγRIIb, в котором способ включает введение в Fc-область антитела IgG в положении 238 в соответствии с Европейской нумерацией Asp и по меньшей мере в одну аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, состоящей из аминокислоты Tyr в положении 234, аминокислоты Phe в положении 235, аминокислоты Ile в положении 264, аминокислоты Glu в положении 265, аминокислот Phe, Leu или Met в положении 266, аминокислот Ala, Glu, Gly или Gln в положении 267, аминокислот Gln или Glu в положении 268, аминокислоты Asp в положении 269, аминокислот Asp, Phe, Ile, Met, Asn, Pro или Gln в положении 272, аминокислоты Gln в положении 274, аминокислоты Phe в положении 296, Asp в положении 326, аминокислоты Gly в положении 327, аминокислот Lys, Arg или Ser в положении 330, аминокислоты Ser в положении 331, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 332, аминокислот Lys, Arg, Ser или Thr в положении 333, аминокислот Arg, Ser или Thr в положении 334, аминокислот Ala или Gln в положении 355, аминокислоты Glu в положении 356, аминокислоты Met в положении 358, аминокислот Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp или Туr в положении 396, аминокислоты Arg в положении 409 и аминокислоты Glu в положении 419, где величина [KD для FcγRIIa тип R полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела IgG]/[KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела IgG] имеет значение, равное 20,0 или более.
2. Способ по п. 1, в котором величина [KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область антитела IgG, в которую не были/была введена/введены аминокислотные/аминокислотная замены/замена]/[KD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела IgG] имеет значение, равное 50,0 или более.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором величина [KD для FcγRIIb полипептида, содержащего Fc-область антитела IgG, в которую не были/была введена/введена аминокислотные/аминокислотная замены/замена]/[КD для FcγRIIb полипептида, содержащего вариант Fc-области антитела IgG] имеет значение, равное 100,0 или более.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором вариант Fc-области антитела IgG содержит любую из нижеследующих групп аминокислотных замен (а)-(х):
(а) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296 и 330 (всоответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(b) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(c) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG и;
(d) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(e) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(f) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296, 330 и 332 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(g) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 268, 271, 296, 327 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(h) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(i) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(j) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(k) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(l) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(m) аминокислотные замены в положениях 238, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(n) аминокислотные замены в положениях 238, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(о) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(р) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(q) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 296, 327, 330 и 396 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(r) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(s) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(t) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 264, 267, 268, 271, 272, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(u) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 264, 267, 268 и 271 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(v) аминокислотные замены в положениях 238, 237, 267, 268, 271, 296 и 330 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG;
(w) аминокислотные замены в положениях 238, 264, 267, 268, 271, 272 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG; и
(х) аминокислотные замены в положениях 238, 233, 264, 267, 268, 271 и 296 (в соответствии с Европейской нумерацией) Fc-области антитела IgG.
5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанный вариант Fc-области антитела IgG содержит любую из нижеследующих аминокислотных последовательностей (b)-(х):
(b) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp или Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(c) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(d) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Gly или Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(e) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(f) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 332 является Thr в соответствии с Европейской нумерацией;
(g) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(h) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(i) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(j) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 330 является Arg, ааминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(k) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(l) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(m) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(n) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(о) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Ala или Gly, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(р) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой вположении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met или Leu в соответствии с Европейской нумерацией;
(q) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, аминокислотой в положении 327 является Gly, аминокислотой в положении 330 является Arg, а аминокислотой в положении 396 является Met в соответствии с Европейской нумерацией;
(r) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией;
(s) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является ILe, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(t) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Pro, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(u) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, а аминокислотой в положении 271 является Gly в соответствии с Европейской нумерацией;
(v) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 237 является Asp, аминокислотой в положении 267 является Gly, аминокислотой в положении 268 является Asp, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 296 является Asp, а аминокислотой в положении 330 является Arg в соответствии с Европейской нумерацией;
(w) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, аминокислотой в положении 272 является Asp, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией; и
(х) аминокислотная последовательность Fc-области антитела IgG, в которой аминокислотой в положении 238 является Asp, аминокислотой в положении 233 является Asp, аминокислотой в положении 264 является Ile, аминокислотой в положении 267 является Ala, аминокислотой в положении 268 является Glu, аминокислотой в положении 271 является Gly, а аминокислотой в положении 296 является Asp в соответствии с Европейской нумерацией.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012-185868 | 2012-08-24 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015110250A Division RU2729831C2 (ru) | 2012-08-24 | 2013-08-23 | ВАРИАНТЫ FcγRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2820161C1 true RU2820161C1 (ru) | 2024-05-30 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2005112742A (ru) * | 2002-09-27 | 2006-01-20 | Ксенкор, Инк. (Us) | Оптимизированные варианты fc и способы их создания |
WO2008002933A2 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Macrogenics, Inc. | Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof |
WO2008091954A2 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Optimized cd40 antibodies and methods of using the same |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2005112742A (ru) * | 2002-09-27 | 2006-01-20 | Ксенкор, Инк. (Us) | Оптимизированные варианты fc и способы их создания |
WO2008002933A2 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Macrogenics, Inc. | Combination of fcgammariib antibodies and cd20-specific antibodies and methods of use thereof |
WO2008091954A2 (en) * | 2007-01-23 | 2008-07-31 | Xencor, Inc. | Optimized cd40 antibodies and methods of using the same |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210261648A1 (en) | FCgammaRIIB-SPECIFIC FC REGION VARIANT | |
US20230174655A1 (en) | Fc-gamma-RIIb-SPECIFIC Fc ANTIBODY | |
JP6774164B2 (ja) | マウスFcγRII特異的Fc抗体 | |
RU2820161C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ FcyRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ |