EA015916B1 - Моноклональные антитела к миостатину и их применения - Google Patents

Abstract

В изобретении представлены моноклональные антитела к миостатину, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с GDF-11, обладающие высоким сродством к миостатину и устойчивые к химическому разложению. Антитела настоящего изобретения можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости или для лечения или предотвращения различных заболеваний у видов млекопитающих и птиц.

Description

По настоящей заявке на патент испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 60/824498, поданной 5 сентября 2006 года.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к области моноклональных антител к миостатину. Более конкретно, изобретение относится к моноклональным антителам к миостатину, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с ΟΌΡ-11, и устойчивы к протеолитическому расщеплению, и применению таких антител для лечения, профилактики или диагностики различных нарушений или заболеваний у видов млекопитающих и птиц.

Предпосылки создания изобретения

Миостатин, который также называют фактором роста и дифференцировки-8 (дго\\111 бйГегепйайоп Гас1ог-8. ΟΌΡ-8), является представителем суперсемейства белков ΤΟΡ-β и имеет структурное сходство с другими представителями семейства ΤΟΡ-β. Миостатин экспрессируется в основном в развивающихся и зрелых скелетных мышцах и функционирует как отрицательный регулятор скелетных мышц. Миостатин может также вовлекаться в другие физиологические процессы, включая дифференцировку преадипоцитов в адипоциты и, опосредованно, поддержание гомеостаза глюкозы и ингибирование образования кости.

Фактор роста и дифференцировки-11, который также называют ΟΌΡ-11 или ВМР-11, является представителем суперсемейства белков ΤΟΡ-β и близким гомологом миостатина. Последовательности аминокислот зрелых форм миостатина и ΟΌΡ-11 человека идентичны почти на 90%, однако ΟΌΡ-11 экспрессируется в более широком диапазоне тканей, чем миостатин, в том числе в зубной пульпе, мозге, сердце, почках и легких, а также в мышцах и жировой ткани. Как было недавно показано, ΟΌΡ-11 человека определяет временной период, в течение которого мультипотентные клетки-предшественники сохраняют способность производить дочерние нервные клетки различного типа.

Существует терапевтическая необходимость специфичного ингибирования активности миостатина при минимальном ингибировании активности других белков суперсемейства ΤΟΡ-β, в частности ΟΌΡ11. Кроме того, существует диагностическая потребность в антителах к миостатину, характеризующихся минимальной перекрестной реакцией с другими белками суперсемейства ΤΟΡ-β, в частности ΟΌΡ-11, для более точного наблюдения или определения уровней миостатина в образце. Антитела к миостатину, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с ΟΌΡ-11, описаны в международной публикации \УО 2005/094446. Гуманизированные моноклональные антитела, которые предпочтительно связываются с миостатином, но не с ΟΌΡ-11, описаны в международной публикации \УО 2007/044411.

Терапевтические антитела могут подвергаться различным реакциям деградации, например дезаминирования или протеолиза, которые могут происходить ίη νίνο или в процессе производства, приготовления препарата, хранения и терапевтического применения. Например, остатки аспарагина (Аки) в антителах или других полипептидах, в частности, подвержены протеолизу в водном растворе. Таким образом, существует потребность в антителах к миостатину, которые преимущественно связывают миостатин, но не ΟΌΡ-11, обладают сильным сродством к миостатину (то есть не выше чем приблизительно 3х 10^-8 М) и устойчивы к химической деградации.

Краткое описание изобретения

Антитела по настоящему изобретению предпочтительно связываются с миостатином, но не с ΟΌΡ11, то есть они являются, по существу, менее реакционноспособными по отношению к ΟΌΡ-11, чем к миостатину. Антитело по настоящему изобретению связывается с миостатином с большей силой, примерно по меньшей мере в 2, 3, 5, 10, 20, 22 или 25 раз больше, чем оно связывается с ΟΌΡ-11, как можно оценить с помощью способа, известного в данной области, например конкурентного твердофазного ЕЫ8А (ИФА), или анализа с помощью В1АСОВЕ или ΚΙΝΕΧΑ, для подтверждения более высокого сродства (то есть более низкой К_с) антитела к ΟΌΡ-8, чем к ΟΌΡ-11. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с ΟΌΡ-11 выше уровня фона в используемом анализе связывания.

Настоящее изобретение охватывает моноклональное антитело к миостатину, которое предпочтительно связывается с миостатином, но не с фактором дифференцировки и роста-11 (ΟΌΡ-11), при этом указанное антитело связывает миостатин со сродством не выше приблизительно 3х10^-8 М и при этом по меньшей мере 95% моноклональных антител не подвергаются протеолизу при хранении в течение года при 4°С, в течение шести месяцев при 25°С, в течение двух месяцев при 37°С или четырех недель при 40°С в растворе антитела. Типичный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела согласно изобретению, 10 мМ фосфата, рН 7,4 и 150 мМ №С1. Предпочтительно антитела согласно изобретению также характеризуются 1С₅₀ менее 25 нМ при анализе ίη νίίτο в системе 8ВЕ миостатин/репортер, описанном в примере 4 в данной заявке.

В одном варианте осуществления антитело согласно изобретению устойчиво к химической деградации, т.е. 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител не подвергаются деградации в растворе антител в течение времени и при температуре, выбранных из группы, состоящей из одного года при 4°С, шести месяцев при 25°С, двух месяцев при 37°С и четырех недель при 40°С в растворе антитела. Предпочтительное время и температура составляют четыре недели при 40°С.

- 1 015916

В одном варианте осуществления антитела по изобретению характеризуются связыванием с миостатином в пределах домена, включающего аминокислоты 40-64 |АНУС8СЕСЕЕУЕБО1<УРНТНБУНОА (8ЕО ΙΌ N0:29) для человека], 43-57 [С80ЕСЕЕУЕЬрКУРН (8 НО ΙΌ N0:30) для человека] или 45-59 |СЕСЕЕУЕБОКУРНТН (8Е0 ΙΌ N0:31) для человека] зрелого миостатина. В другом варианте осуществления антитела согласно изобретению дополнительно характеризуются связыванием с полипептидом, включающим аминокислоты 40-64, 43-57 или 45-59 зрелого миостатина.

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи (НСУК) с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:11, и вариабельную область легкой цепи (ЬСУК) с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:4, 5, 6 и 7. В другом варианте осуществления моноклональное антитело по настоящему изобретению включает НСУК с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:12, и ЬСУК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:9 и 10.

В одном варианте осуществления антитело по изобретению включает области НСУК и ЬСУК, при этом указанная область НСУК включает пептид в СЭКН1 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:23, пептид в СЭКН2 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:25, и пептид в СЭКН3 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:27, и при этом указанная область ЬСУК включает пептид в СВКЕ1 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:13, пептид в С0КБ2 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:14, и пептид в С0КБ3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:16, 17, 18 и 19.

В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению включает области НСУК и ЬСУК, при этом указанная область НСУК включает пептид в СЭКН1 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:24, пептид в СЭКН2 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:26, и пептид в СЭКН3 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:28, и при этом указанная область ЬСУК включает пептид в СВКЕ1 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:13, пептид в СВКЕ2 с последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:14, и пептид в С0КБ3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0:21 и 22.

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению дополнительно включает константную область, при этом указанная константная область получена из генома человека или генома животного, выбранного из группы, состоящей из домашних животных, животных для спорта и животных, имеющих важное сельскохозяйственное значение. В более предпочтительном варианте осуществления антитело согласно изобретению включает легкую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:32, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ N0:33.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает композицию (например, фармацевтическую композицию), включающую антитело по настоящему изобретению. Композиция по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной композиции антитело по настоящему изобретению является активным компонентом. Предпочтительно композиция включает гомогенную или по существу гомогенную популяцию антител к миостатину согласно настоящему изобретению. Композиция для терапевтического или профилактического применения является стерильной, может быть лиофилизированной и предпочтительно поставляется с подходящим растворителем.

Изобретение обеспечивает способ ингибирования по меньшей мере одной биологической активности миостатина у животного, предпочтительно представителя вида млекопитающих или птиц, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества моноклональных антител к миостатину согласно изобретению указанному представителю вида млекопитающих или птиц. Изобретение дополнительно обеспечивает способ увеличения мышечной массы или лечения или предотвращения заболевания или нарушения, или патологического состояния, облегчаемого путем нейтрализации или противодействия биологической активности миостатина, включающий введение пациенту (например, человеку), нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по настоящему изобретению.

Изобретение включает антитело согласно изобретению для применения в терапии.

Изобретение включает применение такого антитела согласно изобретению для приготовления лекарственного средства для лечения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии.

Изобретение включает применение антитела согласно изобретению для приготовления лекарственного средства для предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии.

Изобретение включает способ лечения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии у млекопитающего, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, путем введения терапевтически эффективного количества антитела согласно изобретению.

Изобретение включает способ предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии у млекопитающего, предпочтительно человека, нуж

- 2 015916 дающегося в этом, путем введения профилактически эффективного количества антитела согласно изобретению.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А представлено выравнивание аминокислотной последовательности зрелой формы миостатина человека и СЭР-11 человека; подчеркнут антигенный эпитоп МАТ (МаЬ) 510С2 и С12 и их вариантов, жирным шрифтом выделены остатки в пределах антигенного эпитопа, различающиеся у миостатина и 6ΌΡ-11;

на фиг. 1В перечислены антигенные эпитопы, с которыми связываются МАТ (МаЬ) 510С2 и С12 и их варианты;

на фиг. 2А и В представлены аминокислотные последовательности вариабельных областей родительских МАТ 510С2 и С12 соответственно, а также нескольких вариантов, включая домены СОВ и каркасные области; жирным шрифтом выделены домены СОВ, а вариабельные участки в областях СОВ подчеркнуты;

на фиг. 3 представлено выравнивание аминокислотной последовательности областей СОВ родительских МАТ 510С2 и С12 и антител по настоящему изобретению; вариабельные участки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты;

на фиг. 4 перечислены аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению, т.е. Ы93Н-С12;

на фиг. 5А и В представлено сравнение сродства связывания некоторых моноклональных антител по настоящему изобретению с родительским антителом, как было определено с помощью твердофазного ИФА (ЕЬ18А).

Подробное описание изобретения

Определения.

Используемый в данной заявке термин зрелый миостатин (см. 8ЕО ΙΌ N0:1 для видов человека, мыши, крысы, курицы, индюка, собаки, лошади и свиньи) относится к белку в мономерной или гомодимерной форме, образующемуся в результате протеолитического расщепления, например, в случае человека, по Агд 266 белка-предшественника миостатина, включающего 375 аминокислот. Используемый в данной заявке термин миостатин относится к зрелому миостатину, если не указано иначе.

Полноразмерное антитело в той форме, в какой он существует в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей (примерно 5070 кДа в случае полноразмерного антитела) и двух легких (Ь) цепей (примерно 25 кДа в случае полноразмерного антитела), соединенных дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область аминокислот примерно 100-110 или более, главным образом, ответственную за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи соответствует константной области, главным образом, ответственной за эффекторную функцию.

Легкие цепи подразделяют на классы каппа или лямбда, и они характеризуются конкретными константными областями, как известно в данной области. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретной константной областью, известной в данной области техники. 1дО! и 1дС₄ являются предпочтительными изотипами антител согласно изобретению. Каждая тяжелая цепь включает Ν-концевую вариабельную область тяжелой цепи (здесь НСУВ) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех областей (СН1, СН2 и СН3) в случае 1дО, 1дЭ и 1дА и четырех областей (СН1, СН2, СН3 и СН4) в случае 1дМ и 1дЕ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь ЬСУВ) и константной области легкой цепи, СЬ. Каждую область НСУВ и ЬСУВ можно дополнительно подразделить на гипервариабельные области, которые называют областями, определяющими комплементарность (сотр1етеп1ап1у ФДепшпшд гедюпу СОВ), расположенные между более консервативными областями, называемыми каркасными областями (РВ, Ртатетеотк тедюпк). Каждая область НСУВ и ЬСУВ состоит из трех СОВ и четырех РВ, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: РВ1, СЭВ1, РВ2, СЭВ2. РВ3, СЭВ3 и РВ4. В данной заявке 3 СОВ тяжелой цепи называют СЭВН1, СЭВН2 и СЭВН3, а 3 СОВ легкой цепи называют СОВЫ, СЭРЕ2 и СЭРЕ3. СОВ содержат большинство остатков, участвующих в специфическом взаимодействии с антигеном. Обозначения аминокислот в каждой области соответствуют стандартным [КаЬа1, 8ес.|иепсе5 о£ Рто1е1П8 о£ 1ттипо1од1са1 1п1еге81, №Шопа1 ЕъШШех о£ НеаИй, ВеФекба, Мб. (1991)]. Функциональная способность антитела связываться с конкретным антигеном обусловлена в основном шестью участками СОВ.

Термин антитело по отношению к моноклональному антителу к миостатину согласно настоящему изобретению (или просто, моноклональное антитело настоящего изобретения или антитело настоящего изобретения) при использовании в данной заявке относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело или МАТ (МаЬ) при использовании в данной заявке относится к химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иначе. Предпочтительно моноклональное антитело настоящего изобретения существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции. Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть получены с применением технологии гибридомы, известной в данной области, а также технологии рекомбинантной ДНК, технологии фагового дисплея, технологии синтеза или сочетания таких технологий или других

- 3 015916 технологий, известных в данной области. Моноклональное антитело относится к антителу, которое получено от одной копии или клона, в том числе, например, любого эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого такое антитело было получено. Моноклональное антитело может представлять собой интактное антитело (включая полное антитело или полноразмерную Ес-область), по существу интактное антитело, или часть или фрагмент антитела, включающий антигенсвязывающий участок, например ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент или Е(аЬ')2-фрагмент химерного, гуманизированного или человеческого антитела.

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело 1дО имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифичных антител, два связывающих сайта идентичны. Используемые в данной заявке термины антигенсвязывающая часть или антигенсвязывающая область либо антигенсвязывающий фрагмент используются равнозначно для обозначения части молекулы антитела в пределах вариабельной области, которая содержит остатки аминокислот, взаимодействующие с антигеном и сообщающие антителу специфичность и сродство к антигену. Антигенсвязывающая часть антитела включает остатки аминокислот каркасной области, необходимые для поддержания соответствующей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно каркасные области антител согласно изобретению происходят от человека или по существу происходят от человека (по меньшей мере на 85, 90, 95, 97 или 99% происходят от человека).

Кроме того, моноклональное антитело при использовании в данной заявке может представлять собой одноцепочечный Εν-фрагмент, который может быть получен соединением ДНК, кодирующей ЬСУК. и НСУК, с линкерной последовательностью (см. Р1иск1йип, Т11С Рйагшасо1о§у οί Мопос1опа1 ΑηΐίЬоШек, νο1. 113, КокепЬигд апб Мооге ебк., 8ргшдег-Уег1ад, №\ν Уогк, р. 269-315, 1994). Очевидно, что вне зависимости от того, идет ли речь о фрагментах или участках, термин антитело при использовании в данной заявке включает такие фрагменты или участки, а также одноцепочечные формы. Если белок сохраняет способность специфично или предпочтительно связываться с его предполагаемой мишенью (т.е. эпитопом или антигеном), он входит в понятие термина антитело.

Используемый в данной заявке термин родительское антитело означает антитело, кодируемое аминокислотной последовательностью, применяемой для получения модифицированного антитела или варианта. Родительское антитело может иметь каркасную область, полученную от мыши, но предпочтительно имеет каркасную область, полученную от человека. Родительское антитело может представлять собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело.

Модифицированное антитело или вариант антитела к миостатину в данной заявке означает молекулу, которая отличается по аминокислотной последовательности от аминокислотной последовательности родительского антитела к миостатину вследствие добавления, делеции и/или замены одного или более остатков аминокислоты в последовательности родительского антитела. В предпочтительном осуществлении вариант антитела включает один или более остатков аминокислоты в вариабельной области по сравнению с родительским антителом. Антитело настоящего изобретения (вариант антитела) сохраняет способность его родительского антитела предпочтительно связываться с миостатином, но не с ΟΌΕ-11, обладает сродством к миостатину, идентичным или превышающим сродство родительского антитела, и характеризуется стабильностью (т. е. химической стабильностью), превышающей стабильность родительского антитела.

Химическая стабильность относится к способности противостоять химической деградации, например расщеплению по пептидной связи (протеолитическому расщеплению). Используемые в данной заявке антитела настоящего изобретения, устойчивые к химической деградации, устойчивы к спонтанному расщеплению по пептидной связи и обладают повышенной химической устойчивостью по сравнению с родительским антителом. Предпочтительно 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител настоящего изобретения устойчивы к химической деградации, то есть не подвергаются расщеплению при хранении в течение одного года при 4°С, шести месяцев при 25°С, двух месяцев при 37°С или четырех недель при 40°С в растворе антитела. Раствор антитела представляет собой раствор, применяемый в фармацевтической композиции антитела. Предпочтительный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела, 10 мМ фосфата, рН 7,4 и 150 мМ ИаС1.

Модифицированное антитело к миостатину, представляющее интерес в данной заявке, представляет собой моноклональное антитело к миостатину с повышенной химической стабильностью по сравнению с родительским антителом, в котором лабильный остаток Акп дипептида Акп-Рго в пределах родительского антитела удален предпочтительно путем замены на природный аминокислотный остаток, еще более предпочтительно путем замены на остаток гистидина (Н), серина (8), треонина (Т), аланина (А) или аргинина (К). Кроме того, такое модифицированное антитело характеризуется предпочтительным связыванием с миостатином, но не с ΟΌΕ-11, и наличием К_с для миостатина менее примерно 3х10^-8 М, предпочтительно также характеризуется наличием 1С₅₀ менее 25 нМ при анализе ш νίΙΐΌ в системе 8ВЕ миостатин/репортер, описанном в примере 4 в данной заявке.

Используемый в данной заявке термин лабильный остаток Акп относится к остатку аспарагина в

- 4 015916 молекуле антитела, белка или полипептида, при наличии которого может происходить спонтанное дезаминирование или расщепление пептидной связи ίη νίΐτο или ίη νίνο.

Используемый в данной заявке термин расщепленный или расщепление относится к расщеплению пептидной связи в молекуле антитела. Сайтом расщепления, представляющим особый интерес, является остаток Άδη в антителе, либо амино- или карбоксиконец остатка Άδη. Расщепление антитела может приводить к уменьшению стабильности и/или к уменьшению или потере активности белка, или потере сродства связывания с антителом. Спонтанная модификация, приводящая к расщеплению, может происходить ех νίνο в процессе приготовления терапевтического препарата, что оказывает негативное влияние на производство и хранение фармацевтического агента. Расщепление может также происходить ех νίνο в процессе производства или хранения антитела. Кроме того, спонтанная модификация может происходить ίη νίνο, оказывая влияние на эффективность белка или антитела и длительность действия. Тем не менее, простая замена аминокислоты в сайте расщепления на любую другую аминокислоту может негативно повлиять на желательную биологическую активность антитела, например сродство связывания или нейтрализацию.

Термин эпитоп относится к части молекулы, которая может распознаваться и с которой может связываться одна или более антигенсвязывающих областей антитела. Эпитопы часто содержат химически активные группировки на поверхности молекулы, например аминокислоты или боковые цепи из сахара, и обладают специфическими особенностями трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда.

Используемый в данной заявке термин эпитоп, кроме того, относится к части полипептида, обладающей антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши или человека Используемый в данной заявке термин антигенный эпитоп означает часть полипептида, с которой может специфично связываться антитело, как определяют любым способом, хорошо известным в данной области, например стандартным иммунологическим анализом. Антигенные эпитопы необязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными. Иммуногенный эпитоп при использовании в данной заявке означает часть полипептида, которая запускает иммунный ответ у животного, как может быть определено любым способом, известным в данной области (см., например, Сеуδеη еΐ а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 81:3998-4002 (1983)).

Выражения биологическое свойство или биоактивность, активность или биологическая активность по отношению к антителу настоящего изобретения используются в данной заявке равнозначно и включают, но не ограничиваются перечисленными, сродство и специфичность по отношению к эпитопу/антигену, способность нейтрализовать или противодействовать активности миостатина ίη νίνο или ίη νίΐτο, 1С₅₀ в системе анализа с помощью 8ВЕ миостатин/репортер, как показано в примере 4 в данной заявке, или другой системы для оценки активности ίη νίΐτο, стабильность антитела ίη νίΐτο или ίη νίνο. Другие биологические свойства антитела, которые можно выявить, включают, например, перекрестную реактивность (например, по отношению к гомологу пептида-мишени, не принадлежащего человеку, или к другим белкам или тканям, в целом), и способность сохранять высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающего. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерить либо оценить с применением способов, известных в данной области, включающих, но не ограниченных перечисленными, твердофазный ИФА, конкурентный твердофазный ИФА, поверхностный плазмонный резонанс, способы анализа нейтрализации ίη νίΐτο и ίη νίνο без ограничений, связывания рецептора, анализ с помощью В1АСОКЕ или ΚΙΝΕΧΑ, систему анализа на основе продукции и/или секреции цитокина или фактора роста, развития анимального полюса у Хешрш, сигнальной трансдукции или иммуногистохимический анализ срезов ткани из различных источников, в том числе человека, примата или любого другого источника, по необходимости.

Используемый в данной заявке термин активность миостатина относится к одному или более видам регулирующей рост или морфогенетической активности, ассоциированной с активным белком миостатином. Например, активный миостатин является негативным регулятором массы скелетных мышц. Активный миостатин может также модулировать продукцию специфичных для мышц ферментов (например, креатинкиназы), стимулирует пролиферацию миобластов и модулирует дифференцировку преадипоцитов в адипоциты.

Используемый в данной заявке термин ингибирует или нейтрализует в отношении активности антитела настоящего изобретения означает способность, по существу, противодействовать, ингибировать, предотвращать, сдерживать, замедлять, нарушать, устранять, останавливать, уменьшать или отменять, например, прогрессирование или степень проявления активности, которая ингибируется, включающей, без ограничения, биологическую активность. Ингибирование или нейтрализация составляет по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или более активности в отсутствие антитела.

Используемые в данной заявке термины индивид, субъект и пациент равнозначно относятся к животному, предпочтительно млекопитающему (включая млекопитающих, не относящихся к приматам, и приматов) или видам птиц, включая, без ограничения перечисленным, мышей, человекоподобных обезьян, человека, важных для сельского хозяйства млекопитающих (например, быка, свинью, овцу),

- 5 015916 животных для спорта (например, лошадь) и домашних животных (например, собаку и кошку); предпочтительно термин относится к человеку. Термин также относится к видам птиц, включающих, но не ограниченных перечисленными, курицу и индейку. В некотором варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек, также характеризуется наличием заболевания или нарушения, или патологического состояния, при котором уменьшение уровня или уменьшение биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект. В другом варианте осуществления субъект, предпочтительно млекопитающее, предпочтительно человек, также характеризуется наличием риска развития нарушения, заболевания или патологического состояния, облегчаемого уменьшением уровня миостатина или уменьшением биологической активности миостатина.

Характеристика антитела.

Изобретение представляет антитело, которое предпочтительно связывается с миостатином, но не с СИР-11, является более стабильным по сравнению с родительским антителом (т.е. более устойчивым к химической деградации по сравнению с родительским антителом), при этом сохраняет сродство связывания или обладает более высоким сродством связывания с миостатином по сравнению с родительским антителом. В одном варианте осуществления лабильный остаток Аки в СИКЬ3 родительского антитела, МАТ С12 или МАТ 510С2, как показано на фиг. 2, заменен другой аминокислотой.

Предпочтительной заменой аминокислоты в антителе настоящего изобретения является замена, которая: (1) снижает восприимчивость к спонтанной химической деградации, то есть к расщеплению или дезаминированию, и (2) сохраняет сродство связывания с антителом, характерное для родительского антитела. В одном предпочтительном варианте осуществления остаток Акп в СИКЬЗ МАТ С12 заменен на Н или К. В другом предпочтительном варианте осуществления остаток Акп в СИКЬЗ МАТ 510С2 заменен на Н, 3, Т или А.

В одном варианте осуществления антитело настоящего изобретения устойчиво к спонтанной химической деградации, то есть 100, 99, 98, 97, 96 или 95% антител не расщепляются в растворе антитела в течение времени и при температуре, выбранных из группы, состоящей из одного года при 4°С, шести месяцев при 25°С, двух месяцев при 37°С и четырех недель при 40°С в растворе антитела. Раствор антитела представляет собой любой раствор, подходящий для фармацевтической композиции, содержащей антитело. Типичный раствор антитела включает 1 мг/мл антитела, 10 мМ фосфата, рН 7,4 и 150 мМ ЫаС1.

В одном варианте осуществления антитело настоящего изобретения дополнительно характеризуется высоким сродством (Ки) к миостатину, то есть ниже примерно 3χ10^-8 М, 1 χ 10^-8 М или 1 χ 10^-9 М, предпочтительно ниже примерно 9χ10^-10 М, 8,7χ10^-10 М или более предпочтительно ниже примерно 8χ10^-11 М. Альтернативно, антитело настоящего изобретения характеризуется К_с для миостатина не выше примерно 3χ10^-8 М, 1 χ 10^-8 М, 1 χ 10^-9 М или 9χ10^-10 М, более предпочтительно не выше примерно 8,7χ10^-10 М и наиболее предпочтительно не выше примерно 8χ10^-11 М. Сродство связывания антитела настоящего изобретения аналогично или превышает сродство связывания для родительского антитела.

Предпочтительно антитела настоящего изобретения, характеризующиеся высоким сродством связывания, как описано выше, также имеют 1С₅₀ менее 25, 20, 16, 14, 10, 9, 6 или 5,2 нМ при анализе в системе 3ВЕ миостатин/репортер ίη νίίτο, описанном в примере 4 в данной заявке. Предпочтительно значение 1С₅₀ для антитела настоящего изобретения аналогично или превышает значение для родительского антитела. Все антитела настоящего изобретения в значительно меньшей степени реагируют с СИР-11, чем с миостатином, то есть они предпочтительно связываются с миостатином, но не с СИР-11.

Антитела настоящего изобретения предпочтительно представляют собой химерные, гуманизированные или человеческие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и предпочтительно связываются с миостатином в пределах области зрелой формы миостатина, включающей аминокислоты 40-64, или более предпочтительно в пределах области зрелой формы миостатина, включающей аминокислоты 43-57 и/или 45-59. Кроме того, антитела настоящего изобретения нейтрализуют биологическую активность миостатина ίη νίνο или ίη νίίτο. Специфичное связывание моноклональных антител к миостатину согласно настоящему изобретению позволяет применять антитела настоящего изобретения как терапевтические или профилактические средства для ассоциированных с миостатином патологических состояний, заболеваний или нарушений, то есть патологических состояний, заболеваний или нарушений, при которых снижение уровня миостатина или противодействие, или ингибирование биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект. Кроме того, антитела настоящего изобретения можно применять для диагностики или наблюдения патологических состояний, заболеваний или нарушений, при которых изменение уровня или биологической активности миостатина производит благоприятный терапевтический эффект, или для определения уровня миостатина в образце.

Моноклональные антитела к миостатину согласно настоящему изобретению связывают антигенный эпитоп, который, как показано, локализуется в пределах аминокислот 40-64 (3ЕО 1И N0:1 для человека) зрелого миостатина, предпочтительно в пределах аминокислот 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина. Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина настоящего изобретения локализован в пределах аминокислот 40-64 зрелого миостатина (3ЕО ГИ N0:1 для человека), предпочтительно в пределах аминокислот

- 6 015916

43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина любого вида млекопитающих или птиц. Также предусмотрено, что иммуногенный эпитоп согласно настоящему изобретению является антигенным эпитопом. Кроме того, аминокислотные остатки в молекуле миостатина вне аминокислот 40-64 могут влиять на конформационную структуру антигенной области и, таким образом, изменять связывание антитела настоящего изобретения с антигенным эпитопом.

Одноцепочечные антитела, а также химерные, гуманизированные антитела и химерные или одноцепочечные антитела с пересаженными СЭК и т.п., включающие участки, полученные от антитела другого вида, также охвачены настоящим изобретением и термином антитело или модифицированное антитело. Различные участки таких антител можно химически соединить стандартными способами, путем синтеза, или они могут быть объединены в одном белке с помощью генно-инженерных методов. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или гуманизированную цепь, могут экспрессироваться с образованием единого белка.

Кроме того, также можно получить функциональные фрагменты антител, в том числе антигенсвязывающие участки химерных, гуманизированных, человеческих или одноцепочечных антител. Функциональные фрагменты указанных антител сохраняют по меньшей мере одну антигенсвязывающую функцию и/или биологическую функцию или биологическую активность полноразмерного антитела, от которого они были получены. Предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего полноразмерного антитела (например, способность связываться со зрелой формой миостатина). Особенно предпочтительные функциональные фрагменты или части сохраняют способность ингибировать одну или более функций или видов биологической активности, характерной для зрелого миостатина млекопитающих, например связывающую активность, сигнальную активность и/или стимуляцию клеточного ответа. Например, в одном варианте осуществления функциональный фрагмент или часть может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или более его лигандами и/или может ингибировать одну или более опосредованных рецептором функций.

Части или фрагменты антитела, способные связываться со зрелым миостатином или его частью (предпочтительно в пределах аминокислот 40-64, 43-57 и/или 45-59 зрелого миостатина), включают, но не ограничиваются перечисленным, Ρν, РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')₂-фрагменты и охвачены настоящим изобретением. Такие фрагменты могут быть получены ферментативным расщеплением или рекомбинантными способами. Например, при расщеплении с помощью папаина или пепсина могут образовываться РаЬ или Р(аЬ')₂-фрагменты соответственно. Минимальным антигенсвязывающим фрагментом является Ρν, включающий области НСУК и ЬСУК. РаЬ-фрагмент включает области НСУК-СН1 и ЬСУК-СЬ, ковалентно соединенные дисульфидной связью между константными областями. Для преодоления тенденции к диссоциации нековалентно соединенных областей НСУК и ЬСУК в Ρν-фрагменте при экспрессии в клеткаххозяевах может быть создан так называемый одноцепочечный (кшд1е ейаш, кс) Ρν-фрагмент (κεΡν), в котором подвижный полипептид соответствующего размера соединяет либо С-конец НСУК с Ν-концом ЬСУК, либо С-конец ЬСУК с Ν-концом НСУК. Часто в качестве линкера используют пептид из 15 аминокислотных остатков (О1у₄§ет)₃, но в данной области известны также другие линкеры. Антитела можно также получить в укороченной форме с применением генов антител, в которых в направлении 3'-5' (слева) от природного стоп-кодона введен один или более стоп-кодонов. Например, химерный ген, кодирующий фрагмент тяжелой цепи Р(аЬ')₂, может быть сконструирован таким образом, что он будет включать последовательности ДНК, кодирующие СН1 доменный и шарнирный участок тяжелой цепи.

Выявление лабильного остатка (остатков) Аки.

Существует множество способов для выявления и количественной оценки спонтанной модификации лабильных остатков Акп в белке, например, в молекуле антитела. При дезаминировании, модификации, приводящей к преобразованию остатка аспарагина в смесь изоаспартата и аспаратата, которая может явиться сигналом к деградации белка, вводится отрицательный заряд и изменяется масса белка (ΝΠ₂ в сравнении с ОН, Δ=1 Да) и гидрофобность. Для разделения или выделения дезаминированных или укороченных форм антитела или белка либо полипептида можно применять технологии разделения, включающие способы, основанные на применении электрического поля и хроматографии, например ИЭФ, капиллярное ИЭФ, гель-электрофорез с мочевиной, обращенно-фазную ВЭЖХ, ионообменную ВЭЖХ и гидрофильное взаимодействие. Ионообменную хроматографию широко применяют для выделения дезаминированных белков. Сайт и степень спонтанных модификаций антитела или белка либо полипептида можно дополнительно охарактеризовать с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) и Ν-концевого секвенирования.

Замена лабильного остатка (остатков) Акп или другая модификация антител.

Для удаления, например, путем замены аминокислоты лабильного остатка Акп в молекуле антитела, или другого белка, лабильный остаток Акп можно заменить другой аминокислотой. Желательно, чтобы такая аминокислотная замена не изменяла (то есть не влияла отрицательно) или минимально изменяла (например, на 10, 5, 4, 3, 2% или менее) сродство антитела к антигену. Также желательно, чтобы замена аминокислоты не изменяла (то есть не влияла отрицательно) или минимально изменяла нейтрализацию антитела, специфичность к эпитопу и способность антитела преимущественно связываться с миостатином, но не с ΟΌΡ-11. Для определения влияния отдельных аминокислотных замен на сродство связыва

- 7 015916 ния антитела настоящего изобретения с миостатином или его антигенным эпитопом можно применять твердофазный ИФА, и значения, полученные при ИФА, сравнивают со значениями, полученными для родительского антитела (например, антитела С12 или 510С2), связывающегося с этим же антигеном. Кроме того, для оценки сродства связывания антитела можно применять технологию В1АСОЯЕ® или ΚΙΝΕΧΑ®.

В антитела настоящего изобретения можно дополнительно внести мутацию (или внести мутацию перед удалением остатка Аки, наличие которого способствует нестабильности родительского антитела), например, в пределах участка (участков) СОЯ с получением варианта антитела с оптимизированным интересующим свойством, например сродством связывания, 1С₅₀, специфичностью и т.д. Антитело настоящего изобретения, полученное путем замены аминокислоты, является предпочтительным, и в таком антителе по меньшей мере один остаток аминокислоты родительской молекулы антитела удален и заменен другим остатком. Сайты, представляющие наибольший интерес для замены с помощью мутагенеза, включают участки СЭЯ, но также возможны замены в пределах ЕЯ.

Удобным способом получения вариантов, содержащих замены, является процесс созревания сродства с помощью фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов в участках СЭЯ подвергают мутагенезу с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антитела экспонируют моновалентным способом на частицах нитевидных фагов в виде белков, слитых с продуктом гена III М13, упакованных в пределах каждой частицы. Затем осуществляют скрининг экспонируемых вариантов бактериофага на биологическую активность (например, сродство связывания, специфичность, 1С₅₀), как описано в данной заявке. Для идентификации сайтов участков СЭЯ, которые могут быть модифицированы, может быть осуществлен аланиновый сканирующий мутагенез с целью выявления остатков в участках СЭЯ, важных для связывания с антигеном. В качестве альтернативы или дополнения, можно проанализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации участков контакта между антителом и миостатином. Остатки аминокислот в таких участках контакта и прилегающие к ним остатки являются кандидатами на замену согласно способам, описанным в настоящей заявке или известным в данной области техники. В качестве альтернативы или дополнения, можно осуществлять произвольный мутагенез одной или более последовательностей СЭЯ в одном или более положениях аминокислотного остатка, при этом СЭЯ связан с сохранением функции с вариабельной областью, либо СОЯ не связан с последовательностью другого вариабельного домена, а затем измененный участок СЭЯ может быть возвращен в вариабельную область с применением технологии рекомбинантной ДНК. После того как будут синтезированы и экспрессированы такие варианты антител, совокупность таких вариантов подвергают скринингу, как описано в данной заявке, и для дальнейшей работы могут быть отобраны антитела с наиболее высокими показателями в одной или более соответствующих системах анализа.

Экспрессия антитела.

Настоящее изобретение также направлено на линии клеток, экспрессирующих моноклональное антитело к миостатину настоящего изобретения или его часть. Создание и выделение линии клеток, продуцирующих моноклональное антитело настоящего изобретения, можно осуществить с применением стандартных способов, известных в данной области. Предпочтительные линии клеток включают СО8, СНО, 8Р2/0, N80 и дрожжи (доступны в национальных банках линии клеток, таких как АТСС, Американская коллекция типовых культур, Мапаккак, УА).

Для экспрессии антитела настоящего изобретения можно применять разнообразные системы экспрессии в клетках-хозяевах, включающие прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы для экспрессии (например, дрожжевые, бакуловирусные, растительные, клетки млекопитающих и других животных, трансгенные животные и клетки гибридомы), а также системы для экспрессии на основе фагового дисплея. Примером подходящего бактериального вектора для экспрессии является рИС119, а примером подходящего эукариотического вектора для экспрессии является модифицированный вектор рс^NΑ3.1 с ослабленной системой селекции ОНЕЯ. Другие системы для экспрессии антитела также известны в данной области и предусмотрены настоящим изобретением.

Антитело настоящего изобретения можно получить путем рекомбинантной экспрессии иммуноглобулиновых генов легкой и тяжелой цепи в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т. п. одним или более векторами для рекомбинантной экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие иммуноглобулиновую легкую и/или тяжелую цепь антитела таким образом, что легкая и/или тяжелая цепь экспрессируется в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться независимо, находясь под контролем различных промоторов, с которыми они функционально соединены, в одном векторе, или же тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться независимо, находясь под контролем различных промоторов, с которыми они функционально соединены, в двух векторах, один из которых обеспечивает экспрессию тяжелой цепи, а другой - легкой цепи. Необязательно, тяжелая цепь и легкая цепь могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой затем антитела могут быть извлечены или очищены. Для полу

- 8 015916 чения генов тяжелой и легкой цепи применяют стандартные методики рекомбинантной ДНК эти гены встраивают в векторы для рекомбинантной экспрессии и вводят векторы в клетки-хозяева.

Выделенная молекула ДНК, кодирующая область НСУИ, может быть преобразована в полноразмерный ген тяжелой цепи путем соединения с сохранением функции ДНК, кодирующей НСУИ, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константных областей тяжелой цепи антител человека известны в данной области. См., например, КаЬа1, с1 а1., 8ес.|иепсе5 οί РгсНенъ οί 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. ΕίΠΙι Εάίΐίοη, ϋ.8. Эсраг1тсп1 οί НеаИй апб Нитап Зечуюек, МН РиЬ11са1юп Νο. 91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, включающие такие области, также можно получить, например, путем стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константные области тяжелой цепи могут относиться к любому типу (например, 1дС, 1дА, 1дЕ, 1дМ или 1§Ц), классу (например, ί§Οι, 1§С₂, 1дС₃ и 1§С₄) или подклассу константной области и любому его аллотипическому варианту, как описано в работе КаЬа! (выше). Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой ЕаЬ-фрагмент, ЕаЬ'-фрагмент, Е(аЬ')₂-фрагмент, Еб или одноцепочечный Εν-фрагмент (зсЕу). Для гена тяжелой цепи ЕаЬ-фрагмента ДНК, кодирующая НСУИ, может быть соединена с сохранением функции с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи СН1.

Выделенная ДНК, кодирующая область ЬСУВ, может быть преобразована в полноразмерный ген легкой цепи (а также в ген легкой цепи ЕаЬ-фрагмента) путем соединения с сохранением функции ДНК, кодирующей ЬСУВ, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи СЬ.

Последовательности генов константной области легкой цепи антитела человека известны в данной области, см., например, КаЬа! (выше). Фрагмент ДНК, включающий эти области, может быть получен путем стандартной амплификации с помощью ПЦР. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область типа каппа или лямбда.

Для получения гена ^Εν фрагменты ДНК, кодирующие НСУИ и ЬСУК, соединяют с сохранением функции с другим фрагментом, кодирующим подвижный линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (С1у₄-8ет)₃ таким образом, что последовательности НСУИ и ЬСУК могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка, при этом области ЬСУК и НСУИ соединены подвижным линкером.

Для экспрессии антитела настоящего изобретения ДНК, кодирующую часть или полноразмерную легкую и/или тяжелую цепь, полученную, как описано выше, встраивают в вектор для экспрессии таким образом, чтобы ген был соединен с сохранением функции с последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию. Вектор для экспрессии и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, применяемой для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть включены в разные векторы или, как правило, оба гена включены в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела включают в вектор для экспрессии стандартными способами. Кроме того, вектор для экспрессии может кодировать сигнальный пептид, облегчающий секрецию легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела к миостатину клеткой-хозяином. Ген легкой и/или тяжелой цепи моноклонального антитела к миостатину может быть клонирован в векторе таким образом, чтобы сигнальный пептид был соединен с сохранением функции в рамке считывания с аминоконцевой последовательностью гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид.

В дополнение к гену (генам) тяжелой и/или легкой цепи антитела вектор для рекомбинантной экспрессии содержит регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена (генов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигнальные последовательности для полиаденилирования), по необходимости, которые контролируют транскрипцию или трансляцию гена (генов) цепи антитела. Конструирование вектора для экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клеток-хозяев, которые необходимо трансформировать, уровень экспрессии необходимого белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают регуляторные элементы вирусов, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, например промоторы и/или энхансеры, полученные от цитомегаловируса (СМУ, ЦМВ), вируса обезьяны 40 (8У40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и вируса полиомы.

В дополнение к генам тяжелой и/или легкой цепи антитела и регуляторным последовательностям векторы для рекомбинантной экспрессии согласно настоящему изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации) и один или более маркерных селективных генов. Маркерный селективный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор. Например, как правило, селективный маркер сообщает клетке-хозяину, в которую он введен, устойчивость к лекарственному средству, такому как С418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные маркерные селективные гены включают ген дигидрофолатредуктазы ((Ό4ΕΡ) (для применения в клетках-хозяевах, лишенных ОНЕР, с селекцией/амплификацией с помощью метотрексата), ген ικο (для селекции 0418) и

- 9 015916 глутаминсинтетазу (08) для применения в линии клеток, лишенных С8 (как например, N80), для селекции/амплификации.

Для экспрессии легкой и/или тяжелой цепи экспрессионный вектор (векторы), кодирующий тяжелую и/или легкую цепи, вводят в клетку-хозяин стандартными способами, например путем электропорации, преципитации с фосфатом кальция, трансфекцией с применением ΌΕΑΕ-декстрана, трансдукции, инфицирования и т.п. Хотя теоретически возможна экспрессия антитела настоящего изобретения либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительными являются эукариотические клетки и наиболее предпочтительными - клетки-хозяева млекопитающих, поскольку в таких клетках более вероятна сборка и секреция антител с правильной укладкой и иммунологической активностью. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для рекомбинантной экспрессии антител настоящего изобретения включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), клетки миеломы N80, клетки СО8 и клетки 8Р2/0. Если векторы для рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, то антитела получают в процессе культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии антитела в клеткаххозяевах, или более предпочтительно при секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из клетки-хозяина и/или культуральной среды с применением стандартных способов очистки.

Клетки-хозяева можно также применять для продукции частей или фрагментов интактных антител, например ЕаЬ-фрагментов или молекул ксЕу, с помощью способов, которые являются стандартными. Как ясно специалисту в данной области, настоящее изобретение также включает варианты описанных выше способов.

Например, может быть желательна трансфекция клеток-хозяев ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь антитела настоящего изобретения. Технологию рекомбинантной ДНК можно также применять для удаления некоторых или всех участков ДНК, кодирующих либо легкую, либо тяжелую цепь, либо обе, которые не являются необходимыми для связывания с миостатином. Молекулы, экспрессируемые с таких укороченных молекул ДНК, также относятся к антителам согласно настоящему изобретению.

В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела настоящего изобретения вектор для рекомбинантной экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки СНО с помощью, например, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В пределах вектора для рекомбинантной экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела связан с сохранением функции с энхансерными/промоторными регуляторными элементами, обеспечивающими высокий уровень транскрипции генов. Вектор для рекомбинантной экспрессии также содержит ген ЭНЕК, который позволяет осуществлять отбор клеток СНО, трансфицированных вектором, путем селекции/амплификации с помощью метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для осуществления экспрессии тяжелой и легкой цепи антитела и извлекают интактное антитело из культуральной среды. Для получения вектора для рекомбинантной экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из культуральной среды применяют стандартные методики молекулярной биологии. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения можно экспрессировать в трансгенном животном (например, мыши), содержащем гены иммуноглобулинов человека (см., например, Тау1ог, с1 а1., М.1с1е1С Асΐάδ Кек. 20:6287-95, 1992).

Способы применения.

Антитела настоящего изобретения можно применять в терапевтических, профилактических, диагностических и научно-исследовательских целях, как описано выше. Антитело настоящего изобретения можно применять для диагностики нарушений или заболеваний, ассоциированных с экспрессией миостатина человека. Аналогично, антитело настоящего изобретения можно применять в системе для анализа уровня миостатина у субъекта, подвергаемого лечению от заболевания, ассоциированного с миостатином.

Терапевтическое применение антител.

Миостатин играет роль в развитии мышц и в развитии большого числа связанных с ним нарушений или заболеваний. У взрослых мРНК миостатина в основном выявляют в скелетной мускулатуре, хотя в меньших концентрациях мРНК миостатина также встречается в жировой ткани и сердечной ткани (811агша. М., е1 а1., 1. Се11 Р11укю1. 180:1, 1999). Мыши, нокаутированные по миостатину, имеют мышечную массу, в два-три раза превышающую мышечную массу мышей дикого типа. Увеличенная мышечная масса является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (МсРйеттоп, А., е1 а1. №11иге 387:83-90, 1997 апй ΖΗυ, X. е1 а1., ΕΕΒ8 Ьейетк 474:71). Кроме того, мыши, нокаутированные по миостатину, накапливают меньше жира, по сравнению с мышами дикого типа, но в других отношениях являются нормальными и здоровыми. Также недавно было показано, что миостатин является важным регулятором адипогенеза (КеЬЬаргадайа, А., е1 а1., Мо1. апй Се11. Βίο. 23:7230-7242, 2003). Кроме того, недавно была изучена структура и состав кости у мышей с недостатком миостатина (Натиск М.^., е1 а1., 1. Ойкораейк Кекеагск 21:1025, 2003; Натиск, М.^., е! а1., С’аЮГ Т188ие Ιηΐ. 71:63, 2002).

- 10 015916

Таким образом, композицию, включающую моноклональное антитело к миостатину согласно настоящему изобретению, можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости, уменьшения мышечного истощения, или ее можно применять для лечения или предотвращения патологических состояний, при которых присутствие миостатина вызывает или опосредует нежелательные патологические эффекты, или при которых снижение уровня миостатина вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека. Предпочтительно композицию, включающую моноклональное антитело к миостатину согласно настоящему изобретению, можно применять для увеличения мышечной массы.

Предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения мышечного истощения, повреждения мышц, хирургии, восстановления поврежденных мышц, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии, остеопороза, остеоартрита, роста и восстановления связок, ожирения, подавления накопления жира в организме, ожирения, дистрофии мышц любого типа, тяжелой формы миопатии, алкогольной миопатии, кахексии (например, связанной с раком или индуцированной ВИЧ, или обусловленной ХОЗЛ (СОРИ), хроническим заболеванием легкого, при восстановлении после сепсиса, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или заболевании сердца), метаболического синдрома, послеожогового мышечного истощения и диабета II типа. Более предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии. Наиболее предпочтительно антитело настоящего изобретения можно применять для лечения или предотвращения дисфункциональной атрофии или кахексии.

Дисфункциональная атрофия может быть обусловлена различными причинами или инцидентами, в том числе любым нарушением или заболеванием либо состоянием, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию либо постельному режиму, включающим, но не ограниченным перечисленным, пересадку солидного органа, замену сустава, удар, повреждение спинного мозга, восстановление после серьезных ожогов, малоподвижность при хроническом гемодиализе, восстановление после сепсиса и воздействие микрогравитации. Поскольку миостатин является высококонсерватиным по последовательности и функции у различных видов, антитела настоящего изобретения можно применять для увеличения мышечной массы, увеличения плотности кости или лечения или предотвращения патологического состояния у видов млекопитающих, отличных от человека, или птиц [например, домашних животных (например, собаки и кошки), животных для спорта (например, лошади), сельскохозяйственных животных (например, быка, свиньи и овцы), видов птиц (например, курицы, индейки, другой пернатой дичи или домашней птицы)], при котором присутствие миостатина вызывает или обуславливает нежелательные патологические эффекты, или при котором снижение уровня миостатина оказывает благоприятный терапевтический эффект.

Предусмотрено применение моноклонального антитела к миостатину согласно настоящему изобретению для лечения или предотвращения по меньшей мере одного из указанных нарушений, при которых активность миостатина вызывает неблагоприятный эффект или при которых уменьшение уровня биологически активного миостатина имеет благоприятный терапевтический эффект. Кроме того, предусмотрено применение моноклонального антитела к миостатину согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из указанных заболеваний.

Используемые в данной заявке термины лечение, излечение и т.п. относятся к достижению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть терапевтическим в отношении частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного воздействия на заболевание. Лечение при использовании в данной заявке включает введение соединения настоящего изобретения для лечения заболевания или патологического состояния у млекопитающего, в частности человека, и включает: (а) подавление заболевания, то есть подавление его развития; и (с) облегчение состояния заболевания, то есть обеспечение регрессии заболевания или нарушения, или облегчение симптомов или осложнений заболевания. Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желательного ответа.

Используемый в данной заявке термин предотвращение относится к полному или частичному предотвращению заболевания или его симптома. Предотвращение при использовании в данной заявке включает введение соединения настоящего изобретения для предотвращения появления заболевания у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию, но у которого оно еще не диагностировано.

Композиция.

Антитело настоящего изобретения может быть включено в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Соединения настоящего изобретения можно вводить по отдельности или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или эксципиентом, в однократной дозе или многократных дозах. Композиции для введения разработаны таким образом, что они подходят для выбранного способа введения с применением соответствующих фармацевтически приемлемых растворителей, носителей и/или эксципиентов, например диспергирующих агентов, буферов, поверхностно-активных веществ, консервантов, солюбилизирующих агентов, агентов, обеспечивающих

- 11 015916 изотоничность, стабилизирующих агентов и т.п. Указанные композиции разработаны в соответствии со стандартными способами, описанными, например, в справочнике К.стшд1ои. ТНс Заспсе аиб РтасИсс οί РНагтасу. 19⁴¹¹ ЕбШои, Сепиато, Еб., Маск РиЫЫшщ Со., Еайои, РА 1995, в котором представлены технологии приготовления композиций, известные специалистам в данной области.

В композиции настоящего изобретения предпочтительно представлено терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела настоящего изобретения. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивида, и от способности антитела или фрагмента антитела индуцировать необходимый ответ у индивида. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезные эффекты превосходят любой токсичный или негативный эффект антитела. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозах и в течение временных промежутков, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу вводят субъекту до заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество может быть меньше терапевтически эффективного количества.

Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой, по меньшей мере, минимальную дозу, но которая меньше токсичной дозы, активного агента, которая необходима для оказания терапевтически благоприятного эффекта у субъекта. Иными словами, терапевтически эффективное количество антитела изобретения представляет собой количество, которое у животного, предпочтительно человека, увеличивает мышечную массу, увеличивает плотность кости или лечит патологическое состояние, при котором присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или при котором уменьшение уровня миостатина имеет благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека, причем состояние включает, но не ограничивается перечисленным, мышечное истощение, повреждение мышц, хирургию, восстановление поврежденных мышц, слабость, возрастную саркопению, дисфункциональную атрофию, остеопороз, остеоартрит, рост и восстановление связок, ожирение, подавление накопления жира в организме, ожирение, дистрофию мышц любого типа, тяжелую форму миопатии, кахексию (например, связанную с раком или индуцированную ВИЧ либо обусловленную ХОЗЛ (СОРИ), почечной недостаточностью, печеночной недостаточностью, сердечной недостаточностью или заболеванием сердца), метаболический синдром и диабет II типа. Дисфункциональная атрофия может быть обусловлена различными причинами или инцидентами, в том числе любым нарушением или заболеванием либо состоянием, которое приводит к длительной неподвижности или бездействию либо постельному режиму, включающим, но не ограниченным перечисленным, пересадку солидного органа, замену сустава, удар, повреждение спинного мозга, восстановление после серьезных ожогов, малоподвижность при хроническом гемодиализе, восстановление после сепсиса и воздействие микрогравитации.

Способом введения антитела настоящего изобретения является парентеральный способ. Предпочтительно антитела настоящего изобретения могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Используемый в данной заявке термин парентеральный включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Предпочтительна доставка в периферическую систему путем внутривенной или внутрибрюшинной либо подкожной инъекции Подходящие наполнители для таких инъекций широко известны в данной области.

Композиция в большинстве случаев должна быть стерильной и стабильной при условиях производства и хранения в предусмотренном контейнере, включающем, например, герметизированный флакон или шприц. Следовательно, композиции можно стерилизовать путем фильтрования после получения композиции или иным способом сделать их микробиологически приемлемыми. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем 20-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1-1000 мг) антитела. Доза может варьировать в зависимости от типа и тяжести заболевания. Как хорошо известно, в области медицины дозы для конкретного субъекта зависят от многих факторов, в том числе от габаритов пациента, площади поверхности тела, возраста, конкретного соединения, предназначенного для введения, пола, периода и способа введения, общего состояния здоровья и других лекарственных средств, которые параллельно вводят пациенту. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 1-1000 мг, однако также предусмотрены дозы, меньшие или превышающие указанный диапазон, особенно с учетом рассмотренных выше факторов. Типичный режим дозирования может представлять собой ежедневное, еженедельное введение, введение два раза в неделю или ежемесячное введение. Типичный режим дозирования при парентеральном введении может составлять примерно от 10 до примерно 20 мг/кг общей массы тела, предпочтительно от примерно 20 до примерно 10 мг/кг. Прогрессирование заболевания можно наблюдать путем периодической оценки. При многократном введении, в зависимости от конкретного патологического состояния, лечение можно повторять до тех пор, пока не будет

- 12 015916 наблюдаться подавление симптомов заболевания или необходимое предотвращение появления симптомов заболевания. Однако можно применять и другие режимы дозирования, и их не исключает настоящее изобретение.

Предложенные количества антитела подвергаются тщательному рассмотрению врачом. Ключевым фактором при выборе подходящей дозы и графика лечения является достигаемый результат. Факторы, рассматриваемые в таком контексте, включают конкретное нарушение, подвергаемое лечению, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину нарушения, область доставки антитела, конкретный тип антитела, способ введения, график введения и другие факторы, известные врачу-практику.

Терапевтические агенты настоящего изобретения могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем стерильном носителе перед применением. Лиофилизация и восстановление могут приводить к потере активности антитела в различной степени. Для ее компенсации дозировки могут быть скорректированы. Как правило, предпочтительным является рН между 6 и 8.

Предметы производства.

В другом варианте осуществления изобретения предусмотрен предмет производства, содержащий вещества, применимые для лечения или предотвращения нарушений или патологических состояний, описанных выше. Предмет производства включает контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию настоящего изобретения, которая эффективна для предотвращения или лечения заболевания или патологического состояния, и может иметь отверстие, обеспечивающее сохранение стерильности (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Активный агент в композиции представляет собой антитело к миостатину согласно настоящему изобретению. Этикетка, прикрепленная к контейнеру или прилагаемая к нему, указывает, что композицию применяют для лечения выбранного заболевания. Предмет производства может также включать второй контейнер, содержащий фармацевтический приемлемый буфер, например, фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Предмет производства может также включать другие вещества, желательные с точки зрения производителя и потребителя, в том числе, другие буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и листовку-вкладыш, содержащую инструкции по применению.

Следующие примеры представлены лишь в качестве иллюстрации и никоим образом не ограничивают область настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Идентификация сайта расщепления в МАТ С12 и 510С2.

Растворы антител в 1 мг/мл различных буферов (10 мМ цитрат, рН 5, 10 мМ цитрат, рН 6, 10 мМ цитрат, рН 7, и 10 мМ цитрат/150 мМ ЫаС1, рН 7) инкубировали при различных температурах (-20, 4, 25 и 40°С) в течение 4 недель. После инкубации образцы анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Для антител, содержащих вариабельный домен С12 или 510С2 (различных Ре-изотипов), наблюдали дополнительные полосы, помимо полос ожидаемого размера для тяжелых и легких цепей антитела. Эти полосы наблюдали только для образцов, инкубированных при рН 7 (с добавлением или без ЫаС1); при восстанавливающих условиях получали две полосы с наблюдаемой массой ~8-10 и ~12-14 кДа, а при невосстанавливающих условиях наблюдали одну полосу с наблюдаемой массой ~8-10 кДа. Оказалось, что степень расщепления, которую определяли по относительной интенсивности этих полос, зависела от рН (поскольку полосы были менее интенсивными в образцах, которые инкубировали при рН 6, и не были заметны в образцах, которые инкубировали при рН 5) и зависела от температуры. Для определения сайта расщепления и для количественной оценки степени расщепления указанные растворы антител дополнительно анализировали путем жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) и Ν-концевого секвенирования.

Анализ образцов путем ЖХ/МС проводили следующим образом. Для частичного расщепления антител 4 мкл каждого образца смешивали с 36 мкл воды. Затем 15 мкл каждого раствора смешивали с 0,5 мкл 3 М трис-НС1 буфера, рН 8,0, и 0,5 мкл 50 мг/мл ЭТТ и 45 мкл воды. Оба раствора каждого образца анализировали путем ЖХ/МС. Для дегликозилирования антитела 3 мкл каждого образца смешивали с 60 мкл воды, 1,0 мкл 3 М трис-НС1 буфера, рН 8,0, и 1,0 мкл раствора Ν-гликозидазы ΡN6а8е Р (ΡΚΟΖΎΜΕ® 1ед./мл). Растворы инкубировали при 37°С в течение 6 ч и затем анализировали путем ЖХ/МС. Для полного гидролиза с помощью трипсина 20 мкл каждого образца лиофилизировали досуха в системе центрифугирования в вакууме и затем восстанавливали в 4,5 мкл раствора 7 М гуанидина-НС1, 0,4 М трис-НС1 буфера, рН 8,0, и 0,5 мкл 50 мг/мл ЭТТ. Растворы инкубировали при 37°С в течение 40 мин и затем разбавляли 95 мкл воды. Каждый раствор обрабатывали 2,0 мкл 0,5 мг/мл свиного трипсина при 37°С в течение 3 ч. Растворы подкисляли уксусной кислотой и затем анализировали путем ЖХ/МС или ЖХ/МС/МС. Интактные, частично расщепленные и дегликозилированные образцы анализировали с использованием \Уа1сг5 НРЬС/ЬСТ ртеш1ег или микромасс-спектрометра 0-ТОР. Параметры ВЭЖХ и

- 13 015916 масс-спектрометра устанавливали в зависимости от анализируемых образцов и согласно техническим требованиям.

Обращенные масс-спектры для антитела С12, инкубированного при рН 7 и 40°С в течение четырех недель, характеризовались двумя пиками, соответствующими массам 134894 и 145116 Да. Различие этих значений по массе составляет примерно 10220 Да, что соответствует ожидаемой остаточной массе Ν’концевого пептида 1-93 (ожидаемое значение: 10221,4 Да) легкой цепи. Этот результат подтверждается анализом путем ЖХ/МС частично расщепленных образцов. В таком образце наблюдали три значения массы: 23312,7, 13091,3 и 10239,4 Да, соответствующие интактной легкой цепи 1-219 (ожидаемое значение: 23313,1 Да), С-концевому пептиду 94-219 (ожидаемое значение: 13091,6 Да) и Ν-концевому пептиду 1-93 (ожидаемое значение: 10239,4 Да) легкой цепи. По существу, идентичные результаты были получены и для антитела 510С2, хотя относительное количество продуктов расщепления для этого антитела было ниже. В таблице представлен процент расщепления легкой цепи, определенный при анализе образцов с частичным расщеплением.

Для исследования инкубированных образцов также применяли Ν-концевое секвенирование. Образцы анализировали путем автоматизированного расщепления белков по Эдману с нанесением проб на кассету ΡΡΟδΟΡΒ® с помощью способа Аррйеб Вюзуз!еш 1пс. (ΑΒΙ) с использованием газовой фазы (ОР-РУЭР). Каждый остаток анализировали на колонке зрйете-5 РТН 220x2,1 мм ΑΒΙ ΒΚΌ^ΝΡΕΕ® при 55°С со скоростью потока 325 мкл/мин. Данные анализировали с использованием программы для анализа данных ΑΒΙ'δ Мобе1 610А. Для образцов антитела, инкубированных при 40°С, были выявлены две последовательности: выявленные последовательности для С12 - последовательность Э1ОМТО (8ΕΟ ΙΌ N0:34), соответствующая ожидаемому Ν-концу легкой цепи С12, и последовательность РЬТРОО (8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:35), соответствующая остаткам 94-99 легкой цепи С12. Аналогичные результаты были получены при анализе инкубированных растворов антитела 510С2. Степень расщепления рассчитывали с использованием относительных величин для каждой последовательности, полученные результаты сведены в таблице.

Степень расщепления по пептидной связи Азп93-Рго94

МАТ	% расщепления (рН Ί, 4 нед., 40°С)
ЖХ/МС	Ν-концевое секвенирование
С12-1дС4	22%	15-20%
С12-1д61	21%	20-22%
С12-1д62	14%	5-10%
510С12-1дС4	3%	5-8%
510С12-1дС1	5%	5-9%

Пример 2. Удаление сайта химического расщепления в антителах С12 и 510С2.

Для удаления сайта расщепления в С12 и 510С2 использовали одну аминокислотную замену каждой отдельной аминокислоты для замены остатка аспарагина в СОКЕ3 обоих моноклональных антител. Для определения эффекта отдельной аминокислотной замены на сродство к миостатину, по сравнению с РаЬ-фрагментами С12 или 510С2, использовали твердофазный ИФА.

На планшеты для ИФА наносили миостатин, разбавленный до 4 мкг/мл в карбонатном буфере (50 мМ NаНСΟз, рН 8,3), и в каждую лунку добавляли по 50 мкл. Планшеты закрывали герметизирующей лентой и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты (планшеты с выпуклым (И) дном Отешет, Са! #650061) промывали три раза ФСБ-Т (РВ8-Т) (0,1% Твин-20) с помощью автоматического устройства для отмывки планшетов. К каждой лунке добавляли 200 мкл блокирующего буфера (ФСБ + 1% БСА + 0,1% Твин-20) и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли 50 мкл образца. Образцы включали рейртер РаЬ-фрагменты, разбавленные ФСБТ/БСА при начальном разведении 1:3 и с серией последующих полу-1од разведений. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора вторичного антитела (1:2000 козьих античеловеческих-каппа-ЩФ антител, 8ои!йетп Вю!есй Са! #2060-04 в ФСБТ/БСА). После дополнительной стадии отмывки в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата для ЩФ (щелочной фосфатазы) и инкубировали при комнатной температуре примерно 10 мин. Оптическую плотность (или ΟΌ) определяли при 560 нм. В качестве стандартов для определения сродства каждый планшет для ИФА содержал С12 или 510С2. Концентрацию РаЬ-фрагментов определяли количественным твердофазным ИФА с использованием антитела к Рб (овечьего антитела к Рб, Вюбезфп) для захвата белка и козьего античеловеческогокаппа-ЩФ антитела (8ои!йет Вю!есй) для детекции. Очищенный стандарт РаЬ включали в анализ каждого планшета для создания стандартной кривой для определения концентрации.

Модифицированные РаЬ-фрагменты, полученные от С12 и 510С2, в которых остаток Азп в СЭЯБ3 заменен Н или Я в С12, или Н, 8, Т или А в 510С2, сохраняли сродство к миостатину, схожее с таковым для родительского РаЬ, как было определено путем ИФА. Для каждого из таких вариантов с заменой наблюдали при ИФА кривые, схожие с соответствующим родительским контрольным РаЬ, как было определено путем определения оптической плотности при аналогичных параметрах и аналогичной концентрации РаЬ (см. фиг. 4). Тем не менее, при замене остатка аспарагина в СПЯЬ3 на валин, пролин, глицин, глутамин, триптофан, тирозин, цистеин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, треонин, серин,

- 14 015916 лизин, аланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту в С12, или аргинин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин, триптофан или пролин в 510С2, каждая из таких замен снижала сродство модифицированных РаЬ-фрагментов к миостатину, по сравнению со значением сродства родительского РаЬ. Кроме того, попытки модификации остатка Рго в дипептиде Акп-Рго не были успешными, поскольку любая замена снижала сродство связывания модифицированных РаЬ-фрагментов с миостатином, по сравнению со значением сродства родительского РаЬ.

Пример 3. Сравнение характера расщепления антитела С12 и варианта ΡΟ-Ν93Η.

Растворы антител в концентрации 1 мг/мл в 10 мМ фосфате, рН 7,4/150 мМ №С1, инкубировали при различных температурах (4, 25 и 40°С) в течение 4 недель. После инкубации образцы анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и Ν-концевого секвенирования, как описано выше. При этих условиях при анализе путем ДСН-ПААГ (8Б8-РАСЕ) для образца антитела С12, инкубированного при 40°С, наблюдали дополнительные полосы, помимо ожидаемых полос для тяжелой и легкой цепей антитела; при этом наблюдаемые полосы соответствовали ~8 кДа при невосстанавливающих условиях и ~8 кДа и ~14 кДа при восстанавливающих условиях. В противоположность этому, для варианта ΕΟ-Ν93Η не было обнаружено дополнительных полос. Ν-концевое секвенирование инкубированных образцов подтвердило, что в образце антитела С12 происходит расщепление между Акп93 и Рго94 легкой цепи, при этом новому Ν-концу соответствует ~10-20% последовательности (РЬТРСС (БЕС 1Б N0:35)), тогда как для варианта ΕΟ-Ν93Η не было обнаружено дополнительной последовательности легкой цепи, помимо ожидаемой Ν-концевой последовательности.

Пример 4. Репортерный анализ в системе миостатин/8ВЕ.

В данной репортерной системе анализа с плазмиды, кодирующей ген люциферазы, расположенный в направлении 5'-3' от δΜΆΌ-связывающего элемента, (система ’БВЕ-люцифераза), а именно (СЛСЛ)|₂. экспрессируется белок люцифераза в том случае, если происходит связывание молекулы, например, миостатина, СБР-11 или другого представителя семейства ТСР-β, с ее собственным рецептором, что приводит к активации сиганального пути через 8ΜΆΌ, приводящего к фосфорилированию комплекса 8ΜΆΌ, способного связываться с 8ВЕ. Последовательность САСА представляет собой ΤΟΡ-β-чувствительную последовательность в промоторе гена РА1-1, индуцируемого ТСР-β (Беппег с( а1., ЕМВ0 I., 17:30913100, 1998). Для конструирования плазмиды последовательность, содержащую повтор 8ВЕ

ЪсдададссадасааааадссадасаЪ^адссадасасЪсдададссадасааааадссада са1г£Ъадссадасас‘Ьсдададссадасааааадссадаса1:£Ладссадасас± сдададсс адааааааадссадасаЪ^ЪадссадасасЪсдададссадасааааадссадасаЬ'Ь^адсс адасас (ЗЕО ΙΟ N0:36), клонировали по сайтам ΝΜ-ΗίηάΙΙΙ основного вектора рСЬ3 (Рготеда #Е1751). Эту плазмиду использовали для транзиентной трансфекции клеток НЕК293 ЕВNА.

Количество выявляемого света пропорционально количеству образующейся люциферазы, которое, в свою очередь, пропорционально количеству миостатина, воздействующего на клетки. Присутствие ингибитора (например, антитела, связывающего миостатин) уменьшает количество миостатина, способного активировать 8ВЕ, что в конечном счете приводит к снижению видимого свечения.

В этой системе анализа клетки НЕК293 ЕВNА (Ебде Вюкуйетк) в среде БМЕМ/Р12 (3:1) (С1Ьсо 930152БК), 10% РВ8 (ЭБС), 20 мМ Нерек, 4 мМ Ь-глутамин (полная среда) высевали приблизительно в количестве 25000 клеток на лунку в покрытые полилизином лунки 96-луночного планшета (ВБ Вюсоа! 35-4461) и инкубировали в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки промывали ФСБ и в каждую лунку добавляли 50 мкл ΟρΐίΜΕΜ I (С1Ьсо 31985-070). Клетки трансфицировали с использованием 50 мкл следующей смеси, содержащей ДНК 8ВЕ-люциферазы: 80 мкл липофектамина (С1Ьсо 11668-019) с 1,5 мл ΟρΐίΜΕΜ и оставляли на 5 мин, затем добавляли в пробирку, содержащую 20 мкг ДНК 8ВЕлюциферазы с 1,5 мл ΟρΐίΜΕΜ и 200 мкл реагента Р1и§ (1пуйгодеп), смешивали и оставляли на 5 мин. После объединения двух смесей раствор интенсивно перемешивали и оставляли на 30 мин, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл такого раствора (трансфекционная среда). После этого клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% С0₂. Для каждого планшета с клетками миостатин (К&Б Буйетк 788-С8) разбавляли до 20 нг/мл в полной среде. Для каждого антитела настоящего изобретения, предназначенного для анализа, готовили титр в полной среде, например, от примерно 40 мкг/мл до примерно 50 нг/мл. Трансфекционную среду удаляли из лунок и добавляли 50 мкл разбавленных антител на лунку и 50 мкл СБР-8 (миостатин) или СБР-11 (К&Б 8у5(еш5) на лунку. Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи при 37°С в 5% С0₂. На следующий день среду аспирировали, клетки промывали ФСБ и добавляли 75 мкл буфера для лизиса (Рготеда Е266А). Активность люциферазы в клеточном лизате измеряли с помощью реагента для люциферазы (ЬиаЕегаке РеадегИ) согласно инструкциям изготовителя (Рготеда Е2620). Строили график зависимости значений люминесценции от Бод₁₀ концентрации ΜΑΤ (мкг/мл) и рассчитывали 1С₅₀ для каждого ΜΑΤ для миостатина и СБР-11.

- 15 015916

При анализе в данной системе с миостатином МАТ С12 и модифицированное моноклональное антитело С12 (С12-Ы93Н) демонстрировали значения 1С₅₀ примерно 9,59 нМ и 7,03 нМ соответственно. Ни антитело С12, ни С12-Ы93Н не демонстрировали нейтрализующей активности в данной системе при использовании в анализе СЭЕ-11 вместо миостатина, что указывает на то, что модифицированное антитело, как и его родительское антитело, предпочтительно связывается с миостатином, но не с СЭЕ-11.

Список последовательностей

<110>	Ξ11 Ь111у апсЗ	Сотраду
<120>	Антитела к миостатину
<130>	Х17400
<150>	60/824498
<151>	2006-09-05
<160>	36
<170>	РаЕепЫп Уегзгоп	3.4
<210>	1
<211>	109
<212>	Белок
<213>	Ното зар1епз
<400>	1
Азр РЬе С1у Ьеи Азр	Суз	Азр <

01и

Н1з

Зег

ТЬг

Зег

Агд

Суз

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

РЬе

С1и

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр

Тгр

Не

Не А1а Рго

Ьуз

Агд Туг Ьуз А1а Азп Туг 40

Суз

5ег

С1у 45

<51и

Суз

С1и

35

РЬе

Уа1

РИе

Ьеи

61п

Ьув

Туг

Его

Н13

ТЬг

Нгз

Ьеи

Уа1

Н13

Θΐη

А1а

Азп 65

Рго

Агд

С1у

Зег

А1а 70

С1у

Рго

Суз

Суз

ТЬг 75

Рго

ТЬг

Ьуз

МеС

Зег 80

Рго

11е

Азп

Мэё

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

С1у

Ьуз

С1и

С1п

11е

11е

Туг

С1у

Ьуз

Не

Рго

А1а

100

МеЬ

Уа1

Уа1

Азр

Агд

105

Суз

С1у

Суз

Зег <210>

<211>

<212>

<213>

109 Белок Ногао :

заргепз <400>

Азп Ьеи С1у

Ьеи

Азр

Азр

С1и

Нхз

Зег

Зег

С1и

Зег

Агд

Суз

Суз

Агд Туг Рго

Ьеи

ТЬг ν₃ι

Азр

РЪе

С1и

А1а

РЬе <31у

Тгр

Азр

Тгр

11е

- 16 015916

Не

А1а

Рго Ьуз Агд Туг Ьуз А!а Азп Туг Суз

Зег С1у 45

С1п Суз

С1и

35

40

Туг

Μβΐ.

РЬе

Ме£

С1п

Ьуз

Туг

Рго

Н13

ТЬг

Н13

Ьеи

Уа!

С1п

С1п

А1а

50

55

60

Азп

Рго

Агд

С1у

Зег

А1а

61У

Рго

Суз

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЪ

Зег

65

70

75

80

Рго

11е

Азп

МеЬ

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

Азр

Ьуз

ΰΐη

С1п

Не

Не

Туг

С1у

85

90

95

Ьуз

Не

Рго

С1у

МеЬ

Уа!

Уа!

Азр

Агд

Су 5

С1у

Суз

Зег

100

105

<210>

3

<211>

106

<212> .

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

3

Азр

Не

61п

МеЬ

ТЬг

С1п

£ег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеЪ

20

25

30

ΗΪ3

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа!

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С51у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1П

С1п

Тгр

Туг

Агд

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

85

90

95

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуэ

Уа!

61и

11е

Ьуз

100

105

<210 4 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная

- 17 015916 <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 4

Азр Це

С1п

Мег

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

11е

Зег

Туг

Ме£

20

25

30

Нгз Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуэ

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

61у

Зег

50

55

60

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

ЗЬп

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Тгр

Туг

Агд

Нтз

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе С1у

<31У

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

<31и

Не

Ьуз

100

105

<210>

5

<211>

106

<212>

Велок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

5

Азр 11е

С1п

МеЬ

ТЬг

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Л/а1

С1у

1

5

10

15

Азр Агд

7а1

ТЬг

Це

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

Ме1

20

25

30

Нхз Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

АЬа

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Це

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

61у

7а1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Це

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

С1п

Тгр

Туг

Агд

Зег

Рго

Ьеи

ТЬг

- 18 015916

90 95

РЬе С1у 51у 51 у ТЬг Ьуз Уа1 51и Не Ьуз

100 105 <210> 6 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 6

Азр 1

Не

С1п

МеЬ

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго бег

Бег Ьеи 10

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеЬ

20

25

30

Нхз

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуэ

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

Д1а

Агд

<31у

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зех

&1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

01и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1П

Тгр

Туг·

Агд

ТЬг

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

Й1у

С1у

61у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 7 <211> 106 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 7

Азр 1

11е

61п

МеЬ

ТЬг 5

С1П

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

31у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг 20

I1е

ТЬг

Суз

Зег

А1а 25

Зег

Зег

Зег

Не

Зег 30

Туг

МеЬ

Н15

Тгр

Туг

Й1п

Сг1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

- 19 015916

35

40

45

кзр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рхо

Зег

Агд

РЬе

Зег

σι у

Зег

50

55

60

О1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

С1п

51п

Тгр

Туг

Агд

А1а

Рго

Ьеи

ты

85

90

95

РЬе С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуэ

100

105

<210>

8

<211>

106

<212>

Белок

<213> !

Искусственная

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

8

Азр Не

С1п

МеЬ

ТЬг

ΰΐη

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1

С1у

1

5

10

15

Азр Агд

Уа1

ТНг

Не

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

Мее

20

25

30

ЙГЗ Тгр

Туг

<51п

61п

Ьуз

Рго

61у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РНе

ТНг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

51и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТНг

Туг

Туг

Суз

С1п

<31п

Тгр

Туг

Ьеи

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РНе 61у

С1у

С1у

ТНг

Ьуз

Уа1

С1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 9 <2Н> 106 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция

- 20 015916

<400> :

9

Азр Не

С1п

МеЬ

ТЬг

С1л

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Зег

7а1

Ну

1

5

10

15

Азр Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Зег

АЬа

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеГ

20

25

30

Н15 Тгр

Туг

С1п

01л

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

7а1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

Ну

Зег

50

55

60

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Зег

Ьеи

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

СЬп

СЬп

Тгр

Туг

Ьеи

Нхз

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе С1у

С1у

сьу

ТЬг

Ьуз

Уа1

61и

11е

Ьуз

100

105

<210>

10

<211>

106

<212>

Белок

<213> :

Искусственная

<220>

<223>

синтетическая конструкция

<400>

10

Азр 11е

С1п

Μβΐ

ты

31п

Зег

Рго

Зег

Зег

Ьеи

Зег

АЬа

Зег

Уа1

СЬу

1

5

10

15

Азр Агд

Уа1

ТЬг

Це

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

Не

Зег

Туг

МеГ

20

25

30

Нтз Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1У

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Не

Туг

35

40

45

Азр ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зет

СЬу

Зег

50

55

60

С1у Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11э

Зег

Зег

Ьеи

С1п

Рго

С1и

65

70

75

80

Азр РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

01п

С1п

Тгр

Туг

Ьеи

Агд

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

- 21 015916

РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз

100 105 <210> 11 <211> 124 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 11

<л1п Уа1 1	ТНг	Ьеи Агд С1и Зег С1у Рго А1а	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	ТЬг 15	61п
5	10
ТЬг Ьеи	ТНг	Ьеи ТНг Суз ТНг РЬе Зег	С1у	РЬе	Зег	Ьеи	Агд	Ьуз	ν31
		20 25					30
С1у Агд	Зег	Уа1 Зег Тгр Не Агд С1п	Рго	Рго	С1у	Ьуз	А1а	Ьеи	С1и
	35	40				45
Тгр Ьеи	А1а	Нхз Не Туг Тгр Азр Азр	Азр	Ьуз	Агд	Туг	Азп	Рго	Зег
50		55			60
Ьеи Агд	Азп	Агд Ьеи ТНг Не 5ег Ьуз	Аар	ТНг	5ег	Ьуз	Азп	С1п	Уа1
65		70		75					80
Уа1 Ьеи	ТЬг	МеЬ ТНг Άδη МеЬ Азр Рго	Уа1	Аэр	ТЬг	А1а	ТНг	Туг	Туг
		85	90					95
Суз А1а	Агд	Агд А1а Не ТНг ТНг Уа1	Не	61у	Й1у	61 у	ТЬг	РЬе	Азр
		100 105					НО
Туг Тгр	61у	С1п С1у ТНг ТЬг Уа1 ТНг	ν&1	Зег	Зег
	115	120
<210	12
<211>	124
<212>	Белок
<213> .	Искусственная
<220
<223>	синтетическая конструкция
<400	12
С1п Ьеи	Б1п	Ьеи 31п 61и Зег 31у Рго	61у	Ьеи	Уа1	Ьуз	Рго	Зег	61и
1		5	10					15
ТНг Ьеи	Зег	Ьеи ТНг Суз ТНг Уа1 Зег	С1у	РНе	Зег	Ьеи	Агд	Ьуз	Уа1
		20 25					30

- 22 015916

С1у

Зел

Зег Уа1 35

Зег Тгр

Не Агд 40

С1п Рго Рго

61у

Ьуз 45

О1у

Ьеи

С1и

Тгр

Не

С1у

Нхз

Не

Туг

Тгр

Азр

Азр

Азр

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Рго

Зел

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зел

Ьуз

Азп

С1п

РНе

65

10

75

80

Зег

Ьеи

Ъу$

Ьеи

Зег

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

АЗр

ТНг

А1а

ν*ι

Туг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

Агд

А1а

Не

ТЬг

ТЬг

Уа1

11е

С1у

С1у

01у

ТЬг

РЬе

Азр

100

105

но

Ьеи

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зел

Зег

115

120

<210> 13 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <22ΰ>

<223> синтетическая конструкция <400>13

Зег А1а Зег Зег Зег Не Зел Туг МеЪ Нхз 1510 <210>14 <211>7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400>14

Азр ТНг Зег Ьуэ Ьеи А1а Агд <210>15 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 15

61п 31п Тгр Туг Агд Азп Рго Ьеи ТНг

- 23 015916

5

<210> <211> <212> <213>

16 9 Белок Искусственная

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	16

С1п С1п Тгр Туг Агд Низ Рго Ьеи ТЬг

1	5
<210> <211> <212> <213>	17 9 Белок Искусственная

<220> <223>	синтетическая конструкция
<40 0>	17

61п Е1п Тгр Туг Агд Зег Рго Ьеи ТЬг

1	5
<210> ^211> <212> <213>	18 9 Белок Искусственная

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	18

С52.П С1п Тгр Туг Агд ТЬг Рго Ьеи ТЬг

1	5
<210> <211> <212> <213>	19 9 Белок Искусственная

<220> <223>	синтетическая конструкция
<400>	19

С1П (31п Тгр Туг Агд АЬа Рго Ьеи ТЬг

1	5
<210> <211> <212> <213>	20 9 Белок Искусственная

- 24 015916 <220>

<223> синтетическая конструкция <400>20

С1п С1п Тгр Туг Теп Азп Рго Ьеи ТЬг <210> 21 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400>21

СЬп СЬп Тгр Туг Ьеи Из Рго Ьеи ТЬг <210> 22 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400>22

С1п 61п Тгр Туг Ьеи Агд Рго Ьеи ТЬг <210>23 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная <220 <223> синтетическая конструкция <400>23

СЬу РИе Зет Ьеи Агд Ьуз 7а1 С1у Агд Зег Уз1 Зег 1510 <210>24 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная <220 <223> синтетическая конструкция <400> 24

С1у РЬе Зег Ьеи Агд Ьуз УаЬ СЬу Зег Зег УаЬ Зег 15 10

- 25 015916 <210> 25 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная <220 <223> синтетическая конструкция <400 25

Нтз Не	ί Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд	Туг	Азп	Рго	Зег	Ьеи	Агд А5П
1	5	10					15
<210>	26
<210	16
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220
<223>	синтетическая конструкция
<400	26
Н13 Не Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз Агд	Ьеи	Азп	Рго	Зег	Ьеи	Агд Азп
1	5	10					15
<210>	27
<211>	14
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	синтетическая конструкция
<400>	27
Агд А1а Не ТЬг ТЬг Уа1 11е С1у С1у	С1у	ТЬг	РНе	Азр	Туг
I	5	10
<210>	28
<211>	14
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220
<223>	синтетическая конструкция
<400>	28
Агд А1а Не ТЬг ТЬг Уа1 Не С1у С1у	С1у	ТЬг	РЬе	Азр	Ьеи
1	5	10

<210> <211> <212> <213>	29 25 Вепок Нотао зархепз
<400>	29

- 26 015916

А1а Азп	Туг Суз Зег	С1у	С1и	Суа	61и	РЬе	Уа1	РЬе	Ьеи	Й1п	Ьуз Туг
1	5					10					15
Рго 913	ТЬг Н15 Ьеи	Уа1	Н15	С1п	А1а
	20				25
<210>	30
<2И>	15
<212>	Велок
<213>	Ното зар1епз
<400>	30
Суз 5ег	С1у 61и Суз	С1и	РЬе	Уа1	РЬе	Ьеи	С1п	Ьуз	Туг	Рго	Н1з
1	5					10					15
<210>	31
<211>	15
<212>	Белок
<213>	Ното зархепз
<400>	31
С1у С1и	, Суз 61и РЬе	Уа1	РЬе	Ьеи	С1п	Ьуз	Туг	Рго	Н15	ТЬг	Н15
1	5					10					15

<210> 32 <211> 213 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 32

Азр 1

Не 61п Мег ТЬг 5

С1п Зег Рго Зег

Зег Ьеи 10

Зег А1а

Зег

Уа1 15

С1у

А эр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Зег

Зег

11е

5ег

Туг

МЫ

20

25

30

Н15

Тгр

Туг

С1п

С1п

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

5ег

С1у

5ег

50

55

60

С1у

Зег

61у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Эег

Ьеи

61п

Рго

61и

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Тух

Су$

С1п

С1п

Тгр

Туг

Ьеи

Н15

Рго

Ьеи

ТЫ

85

90

95

- 27 015916

РЬе С1у СЬу С1у ТЬг

Ьуз

УаЬ

С1и

Не Ьуз 105

Агд

ТЬг

УаЬ

АЬа АЬа 110

Рго

100

5ег

Уа1

РЬе

Не

РЬе

Рго

Рго

Зег

Азр

С1и

С1п

Ьеи

Ьуз

5ег

СЬу

ТЬг

115

120

125

А1а

Зег

УаЬ

УаЬ

Суз

Ьеи

Ьеи

Азп

Αδη

РЬе

Туг

Рго

Агд

СЬи

АЬа

Ьуз

130

135

140

Уа1

СЬп

Тгр

Ьуз

УаЬ

Азр

Азп

А1а

Ьеи

СЬп

Зег

СЬу

Азп

Зег

СЬп

СЬи

145

150

155

160

Зег

УаЬ

ТЬг

СЬи

СЬп

Азр

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зе£

Зег

165

170

175

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьуе

АЬа

Азр

Туг

С1и

Ьуз

Н1з

Ьуз

Уа1

Туг

АЬа

180

185

190

Суз

СЬи

Уа1

ТЬг

НЬз

СЬп

31у

Ьеи

Зег

5ег

Рго

УаЬ

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

195

200

205

Азп

Агд

С1у

СЬи

Суз

210 <210> 33 <211> 450 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 33

СЬп Ьеи 1

СЬп

Ьеи

СЬп 5

С1и Зег

С1у

Рго СЬу 10

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Рго

Зег 15

61и

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

УаЬ

Зег

СЬу

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

20

25

30

СЬу

Зег

Зег

УаЬ

Зег

Тгр

Не

Агд

С1п

Рго

Рго

СЬу

Ьуз

С1у

Ьеи

СЬи

35

40

45

Тгр

Не

СЬу

НЬз

Пе

Туг

Тгр

Азр

А5р

Азр

Ьуз

Агд

Ьеи

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

УаЬ

ТЬг

Не

Зег

УаЬ

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Азп

СЬп

РЬе

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег

УаЬ

ТЬг

АЬа

АЬа

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

85

90

95

Суз

АЬа Агд Агд 100

АЬа

11е

ТЬг ТЬг

УаЬ 105

Не 61у С1у

СЬу ТЬг 110

РЬе

Азр

Ьеи

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТНг

Уа1

Зег

Бег

А1а

Зег

ТЬг

Ьуз

115

120

125

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Суз

Зег

Агд

Зег

ТЬг

5ег

СЬи

130

135

140

Зег

ТЬг

АЬа

АЬа

Ьеи

СЬу

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

<31и

Рго

145

150

155

160

Уа1

ТНс

7а1

Бег

Тгр

Азп

Бег

61у

АЬа

Ьеи

ТЬг

Зег

61у

УаЬ

НЬз

ТНг

165

170

175

РЬе

Рго

АЬа

Уа1

Ьеи

СЬп

Бег

Зех

СЬу

Ьеи

Туг

Бег

Ьеи

Бег

Зег

УаЬ

180

185

190

Уа1

ТНг

ν^ι

Рго

Зег

Зег

Зег

Ьеи

СЬу

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Туг

ТЬг

Суз

Αδη

195

2 00

205

7а1

Азр

Ηϊβ

Ьуз

Рго

Зег

Азп

ТЬг

Ьуз

УаЬ

Азр

Ьуз

Агд

УаЬ

С1и

Зег

210

215

220

Ьуз

Туг

СЬу

Рго

Рго

Суэ

Рго

Рго

Суэ

Рго

АЬа

Рго

61 и

РНе

Ьеи

С1у

225

230

235

240

С1у

Рго

Зег

Уа1

РЬе

Ьеи

РЬе

Рго

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

МеС

245

250

255

Не

5ег

Агд

ТНг

Рго

С1и

УаЬ

ТЬг

Суз

Уа1

Уа1

ν»ι

Азр

Уа1

Зег

СЬп

260

265

270

СЬи

Азр

Рго

СЬи

УаЬ

СЬп

РНе

Азп

Тгр

Туг

УаЬ

Агр

СЬу

УаЬ

С1и

Уа1

275

280

285

НЬз

Азп

АЬа

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

СЬи

61и

СЬп

РЬе

Азп

Зег

ТЬг

Туг

290

295

300

Агд

УаЬ

УаЬ

Бег

Уа1

Ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

НЬз

С1п

Азр

Тгр

Ьеи

Азп

СЬу

305

310

315

320

Ьуз

СЬи

Туг

Ьуз

Суз

Ьуз

УаЬ

Зег

Азп

Ьуз

СЬу

Ьеи

Рго

Зег

Зег

11е

325

330

335

СЬи

Ьуз

ТНг

Не

Бег

Ьуг

АЬа

Ьуз

СЬу

СЬп

Рго

Агд

О1и

Рго

С1п

Уа1

340

345

350

- 29 015916

Туг

ТЬг

Ьеи Рго 355

Рго Зег

(31п 61и 360

С1и Ме£ ТЬг

Ьуэ

Азп 365

(31п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуэ

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Αερ

11е

А1а

ν^ι

С1и

370

375

380

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

ТЙГ

Рго

Рго

385

390

395

400

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Бег

РЬе

РЬе

Ьеи

Туг

5ег

Агд

Ьеи

ТЬг

7а1

405

410

415

Азр

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

С1п

61и

С1у

Азп

ν&ι

РНе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мег

420

425

430

Η13

С1и

А1а

Ьеи

Н1з

Азп

Низ

Туг

ТЬг

61п

Ьуз

Зег

Ьеи

5ег

Ьеи

Зег

435

440

445

Ьеи С1у

450 <210> 34 <211> б <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400>34

Азр Не С1п Ме5 ТЬг С1п <210>35 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400>35

Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у 31у <210>36 <211>195 <212> ДНК <213> Искусственная <220>

<223> синтетическая конструкция <400> 36

Ссдададсса	дасааааадс	садаса«Ла	дссадасасЪ	сдададссад	асааааадсс	60
адаса^ССад	есадасаеСс	дададссада	сааааадсса	даса£££адс	садасасСсд	120
ададссадас	ааааадссад	асаС’Ньадсс	адасасЬсда	дадссадаса	аааадссада	180
сабХЪадсса	дасас					195

Claims (9)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Моноклональное антитело к миостатину, включающее области НСУК и ЬСУК, в котором указанная область НСУК включает:

   a) СОКН1 с последовательностью 8ЕР ГО N0:23,

   b) СЭКН2 с последовательностью 8ЕР ГО N0:25,

   c) СОКН3 с последовательностью 8ЕР ГО N0:27, и в котором указанная область ЬСУК включает:

   a) СОКЫ с последовательностью 8ЕР ГО N0:13,

   b) СПКЬ2 с последовательностью 8ЕР ГО N0:14 и

   c) СОКЬЗ с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР ГО N0:16, 17, 18 и 19.
2. 2. Моноклональное антитело к миостатину, включающее области НСУК и ЬСУК, в котором указанная область НСУК включает:

   a) СОКН1 с последовательностью 8ЕР ГО N0:24,

   b) СОКН2 с последовательностью 8ЕР ГО N0:26,

   c) СГОЕНЗ с последовательностью 8ЕР ГО N0:28, и в котором указанная область ЬСУК включает:

   a) СОКЫ с последовательностью 8ЕР ГО N0:13,

   b) СПКЬ2 с последовательностью 8ЕР ГО N0:14 и

   c) СПКЬ3 с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР ГО N0:21 и 22.
3. 3. Моноклональное антитело по п.1 или 2, дополнительно содержащее каркасные области НСУК и ЬСУК, которые представляют собой каркасные области антитела человека.
4. 4. Моноклональное антитело к миостатину, включающее НСУК с последовательностью 8 Ер ГО N0:11 и ЬСУК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8ЕР ГО N0:4, 5, 6 и 7.
5. 5. Моноклональное антитело к миостатину, включающее НСУК с последовательностью 8 Ер ГО N0:12 и ЬСУК с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Ер ГО N0:9 и 10.
6. 6. Моноклональное антитело к миостатину, включающее легкую цепь с последовательностью 8Ер ΙΌ N0:32 и тяжелую цепь с последовательностью 8Ер ГО N0:33.
7. 7. Композиция, содержащая антитело по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. 8. Применение антитела по любому из пп.1-6 в производстве лекарственного средства для увеличения мышечной массы у пациента, нуждающегося в этом.
9. 9. Применение антитела по любому из пп.1-6 в производстве лекарственного средства для лечения или предотвращения одного или более патологических состояний, выбранных из мышечного истощения, слабости, возрастной саркопении, дисфункциональной атрофии и кахексии.