CN101511871A - 抗肌肉生长抑制因子抗体 - Google Patents

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Abstract

抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF－11，有很强的结合肌肉生长抑制因子的结合亲和力并且耐受化学降解。本发明的抗体用于在哺乳动物和禽类中增加肌肉量，增加骨密度，或者治疗或预防各种病症。

Description

抗肌肉生长抑制因子抗体
本专利申请要求2006年9月5日提交的第60/824498号美国临时专利申请的权益。
发明领域
本发明属于医学领域，特别属于抗肌肉生长抑制因子的单克隆抗体领域。更具体的讲，本发明涉及优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11且耐受蛋白质裂解的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，还涉及所述抗体在哺乳动物和禽类中用于治疗、预防或诊断各种紊乱或疾病的用途。
发明背景
肌肉生长抑制因子(也称为生长分化因子8(GDF-8))是TGF-β蛋白超家族的成员，与其他的TGF-β家族成员有类似的结构。肌肉生长抑制因子在发育的和成熟的骨骼肌中大量表达，并发挥骨骼肌负调节物的功能。肌肉生长抑制因子也参与其他的生理过程，包括脂肪前体细胞(preadipocyte)向脂肪细胞的分化，以及间接地参与葡萄糖稳态和骨形成的抑制。
生长分化因子-11，也称为GDF-11或者BMP-11，是与肌肉生长抑制因子最相似的TGF-β蛋白超家族成员。成熟形式的人类肌肉生长抑制因子与GDF-11的氨基酸序列大约90％是相同的；然而，GDF-11在组织中的表达范围比肌肉生长抑制因子更广，包括牙髓，脑，心脏，肾脏和肺以及肌肉和脂肪组织。最近发现人GDF-11调控临时窗口期，其间多能祖细胞保留分化为不同神经细胞后代的潜能。
存在特异性抑制肌肉生长抑制因子活性而最小程度抑制其他TGF-β蛋白超家族(尤其是GDF-11)的活性的治疗需要。另外，为了更准确地监测或测定样本中的肌肉生长抑制因子水平，诊断上需要与其他TGF-β蛋白超家族(尤其是GDF-11)有最低交叉反应的抗肌肉生长抑制因子抗体。优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11的抗肌肉生长抑制因子抗体公开于国际公开号WO 2005/094446中。优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11的人源化单克隆抗体公开于国际公开号WO 2007/044411中。
治疗性的抗体可以发生多种降解反应，例如脱酰胺作用或裂解，其可以在体内或制造，配制，贮存或治疗过程中发生。例如，抗体或其他多肽类中的天冬酰胺(Asn)在水性溶液中对裂解特别敏感。因此，需要优选结合肌肉生长抑制因子而不是结合GDF-11的，对肌肉生长抑制因子有很强的结合亲和力(即，不超过大约3×10-8M)，并且耐受化学降解的抗肌肉生长抑制因子抗体。
发明概要
本发明抗体优选结合肌肉生长抑制因子而不是结合GDF-11，即，它们与GDF-11的反应显著低于与肌肉生长抑制因子的反应。通过本领域方法，例如通过竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)，或者通过BIACORE或KINEXA测定法测量的，本发明的抗体与肌肉生长抑制因子的结合力比与GDF-11的结合力大至少大约2、3、5、10、20、22或者25倍，证明抗体与GDF-8的亲和力比与GDF-11的亲和力高(即，低KD)。最为优选地，在结合试验中所采用的本发明抗体与GDF-11的结合并未超过背景水平。
本发明包括优选与肌肉生长抑制因子结合而不是与生长分化因子-11(GDF-11)结合的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其中所述抗体结合肌肉生长抑制因子的亲和力不超过大约3×10-8M，并且其中至少95％的单克隆抗体在抗体溶液中于4℃保存一年，25℃保存六个月，37℃保存2个月或者40℃保存4周的条件下不裂解。示例性的抗体溶液包含1mg/mL的本发明抗体，10mM磷酸盐，pH7.4和150mM NaCl。优选地，在本文实施例4中所述的体外肌肉生长抑制因子/SBE报告分子试验中，本发明的抗体的另一特征是具有低于25nM的IC50。
在一个实施方案中，本发明的抗体当其在选自下列各温度和时间的抗体溶液中保存时耐受化学降解：4℃为期1年、25℃为期6个月、37℃为期2个月和40℃为期4周，即100％、99％、98％、97％、96％、或者95％的抗体不裂解。优选的温度和时间是40℃为期4周。
在一个实施方案中，本发明抗体的另一个特征在于其在成熟肌肉生长抑制因子的氨基酸40-64[人类ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：29)]，43-57[人类CSGECEFVFLQKYPH(SEQ ID NO：30)]或45-59[人类GECEFVFLQKYPHTH(SEQ ID NO：31)]区域结合肌肉生长抑制因子。在另外一个实施方案中，本发明抗体的另一个特征在于结合由成熟肌肉生长抑制因子氨基酸40-64，43-57或45-59组成的多肽。
在一个实施方案中，本发明抗体包含序列如SEQ ID NO：11显示的重链可变区(HCVR)，和具有选自SEQ ID NO：4、5、6和7的序列的轻链可变区(LCVR)。在另外一个实施方案中，本发明的单克隆抗体包含SEQ IDNO：12所示序列的HCVR和具有选自SEQ ID NO：9和10的序列的LCVR。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含HCVR和LCVR，其中所述的HCVR包含序列如SEQ ID NO：23所显示的位于CDRH1的肽，序列如SEQ ID NO：25所显示的位于CDRH2的肽，序列如SEQ ID NO：27所显示的位于CDRH3的肽，其中所述的LCVR包含序列如SEQ ID NO：13所显示的位于CDRL1的肽，序列如SEQ ID NO：14所显示的位于CDRL2的肽，和具有选自SEQ ID NO：16、17、18和19的序列的位于CDRL3的肽。
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含HCVR和LCVR，其中所述的HCVR包含序列如SEQ ID NO：24所显示的位于CDRH1的肽，序列如SEQ ID NO：26所显示的位于CDRH2的肽，以及序列如SEQ ID NO：28所显示的位于CDRH3的肽，其中所述的LCVR包含序列如SEQ ID NO：13所显示的位于CDRL1的肽，序列如SEQ ID NO：14所显示的位于CDRL2的肽，和具有选自SEQ ID NO：21和22的序列的位于CDRL3的肽。
在一个实施方案中，本发明的抗体另外包含恒定区，其中所述的恒定区来源于人类基因组或选自家畜，运动性动物或食源性动物的基因组。在更优选的实施方案中，本发明抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示的轻链和氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示的重链。
在另一个实施方案中，本发明提供包含本发明抗体的组合物(例如，药物组合物)。本发明组合物可以进一步包含可药用载体。在所述组合物中，本发明抗体是活性成分。优选地该组合物包含同型的或基本上同型的本发明抗肌肉生长抑制因子抗体群。用于治疗或预防用途的组合物是无菌的，可以是冻干的，并且优选地与适当的稀释剂一起提供。
本发明提供一种在有需要的动物，优选在哺乳动物或禽类，优选在人类中抑制至少一种肌肉生长抑制因子生物学活性的方法，包括给予所述哺乳动物或禽类治疗有效量或者预防有效量的本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体。本发明进一步提供通过中和或者拮抗肌肉生长抑制因子生物活性来增强肌肉量或治疗或预防疾病或紊乱或改善病症的方法，包括给予需要此类治疗或预防的患者(例如，人类)治疗或预防有效量的本发明抗体。
本发明涉及本发明抗体在治疗中的应用。
本发明涉及本发明抗体在制造用于治疗肌肉萎缩、虚弱、年龄相关性少肌症、废用性萎缩和恶病质的药物中的用途。
本发明涉及本发明抗体在制造用于预防肌肉萎缩、虚弱、年龄相关性少肌症、废用性萎缩和恶病质的药物中的用途。
本发明涉及通过给予治疗有效量的本发明抗体，在有需要的哺乳动物，优选在人类中治疗肌肉萎缩、虚弱、年龄相关性少肌症、废用性萎缩和恶病质的方法。
本发明涉及通过给予预防有效量的本发明抗体，在有需要的哺乳动物，优选在人类中预防肌肉萎缩、虚弱、年龄相关性少肌症、废用性萎缩和恶病质的方法。
附图简要说明
图1A显示人类肌肉生长抑制因子成熟形式和人类GDF-11的氨基酸序列比对，其中Mab 510C2和C12及其变体结合的抗原表位用下列线标出，并且用粗体表示在抗原表位内肌肉生长抑制因子和GDF-11之间的不同残基。
图1B列出了Mab 510C2和C12以及其变体结合的抗原表位。
图2A和B分别显示了亲本Mab 510C2和C12以及几种变体可变区的氨基酸序列，包括CDR结构域和框架区。CDR结构域用粗体表示，CDR结构域内的变异用下划线示出。
图3显示了亲本Mab 510C2和C12以及本发明抗体的CDR结构域的氨基酸序列比对。变异用粗体和下划线示出。
图4列出本发明的单克隆抗体，即N93H-C12的轻链和重链的氨基酸序列。
图5A和B通过ELISA测定比较了本发明的某些单克隆抗体与它们亲本抗体的结合亲和力。
发明详述
定义
本文使用的术语“成熟肌肉生长抑制因子”(见人类、鼠类、大鼠、鸡、火鸡、犬、马和猪等物种的SEQ ID NO：1)是指蛋白水解裂解后产生的蛋白质的单体或同源二聚形式，所述裂解例如在人类肌肉生长抑制因子375个氨基酸的前体蛋白形式的Arg 266上的裂解。本文使用的术语“肌肉生长抑制因子”是指成熟的肌肉生长抑制因子，除非本文有另外说明。
天然状态下存在的全长抗体是4条肽链的免疫球蛋白分子，包含通过二硫键互相联接的2条重链(H)(全长大约50-70kDa)和2条轻链(L)(全长大约25kDa)。每条链的氨基末端部分包括大约100-110个或更多的氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分定义了主要负责效应子功能的恒定区。
轻链分为κ或λ，其特征在于本领域中已知的特定恒定区。每一条重链的特征在于本领域中已知的特定恒定区。IgG1和IgG4是本发明优选的抗体同种型。每条重链包含N末端重链可变区(本文称为“HCVR”)和重链恒定区。对于IgG，IgD和IgA，重链恒定区包含3个结构域(CH1、CH2和CH3)；而对于IgM和IgE，则包含4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。每条轻链包含轻链可变区(本文称为“LCVR”)和轻链恒定区CL。HCVR和LCVR区可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，间隔分布于更加保守的称为框架区(FR)的区域中。每个HCVR和LCVR包含3个CDR和4个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。在此，重链的3个CDR称为“CDRH1、CDRH2和CDRH3”，轻链的3个CDR称为“CDRL1、CDRL2和CDRL3”。CDR包含形成与抗原特异作用的大多数的残基。根据公知惯例将氨基酸指定到每个结构域中[Kabat，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)]。抗体结合特定抗原的功能在很大程度上受6个CDR的影响。
如本文使用的，涉及本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体(或者简称为“本发明的单克隆抗体”或“本发明抗体”)的术语“抗体”是指单克隆抗体。本文使用的“单克隆抗体”或者“Mab”，除非有特别的说明，是指嵌合抗体、人源化抗体或者完全的人类抗体。优选地，本发明单克隆抗体以同型或者基本上同型抗体群的形式存在。本发明的单克隆抗体可以利用本领域公知的细胞杂交瘤技术，以及重组技术，噬菌体展示技术，合成技术或这些技术的组合或本领域已知的其它技术来生产。“单克隆抗体”是指源自单拷贝或者单克隆的抗体，包括例如任何真核的、原核的或者噬菌体克隆，而不是生产其的方法。“单克隆抗体”可以是完整的抗体(包含完整的或全长的Fc区域)，基本上完整的抗体，或者包含抗原结合部分的抗体部分或片段，例如，嵌合体、人源化或人类抗体的Fab片段，Fab’片段或F(ab’)2片段。
每个轻链/重链对的可变区形成抗体的抗原结合位点。因此，完整的IgG抗体有两个结合位点。除了在双功能抗体或者双特异抗体，这两个结合部位是相同的。如本文所用的，“抗原结合部分”或“抗原结合区域”或“抗原结合片段”可以交替使用，是指可变区域内的抗体分子那一部分，其含有与抗原相互作用并赋予抗体对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含维持抗原结合残基的正确构象所必需的框架区氨基酸残基。优选地，本发明的抗体框架区是人类起源的或者基本上是人类起源的(至少85％、90％、95％、97％或99％是人类起源)。
此外，本文所用的“单克隆抗体”可以是单链Fv片段，此片段可通过使用接头序列将编码LCVR和HCVR的DNA连接而生成(见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，pp 269-315，1994)。要理解不管片段或部分是否是特别指出，本文使用的术语“抗体”包含这样的片段或者部分以及单链形式。只要蛋白质保持特异性地或优选地结合其预期靶位(例如表位或者抗原)的能力，则其属于术语“抗体”的范畴。
如本文使用的，“亲本”抗体是用于制备修饰抗体或变体的氨基酸序列编码的抗体。亲本抗体可能包含鼠类框架，但是优选地包含人类框架区域。亲本抗体可能是鼠类、嵌合体、人源化的或者人类抗体。
“修饰的”或“变体”抗肌肉生长抑制因子抗体本文是指通过在亲本抗体序列中添加、删除和/或取代一个或者多个氨基酸残基形成的与亲本抗肌肉生长抑制因子抗体氨基酸序列不同的分子。在一个优选的实施方案中，相比亲本抗体，变体抗体在可变区域包含一个或者多个氨基酸取代。本发明的抗体(变体抗体)保持亲本抗体优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11的能力，具有与亲本抗体类似或者更大的肌肉生长抑制因子的结合亲和力，并且相比那些亲本抗体有更加稳定的特性(即，化学稳定性)。
“化学稳定性”是指耐受化学降解的能力，例如，肽键断裂(“裂解”)。本文使用的“耐受化学降解”的本发明抗体是指与亲本抗体相比耐受自发的肽键断裂且具有增强的化学稳定性的抗体。优选地，100％、99％、98％、97％、96％或95％的本发明抗体耐受化学降解，即，在抗体溶液中4℃保存一年，25℃保存6个月，37℃保存2个月，或40℃保存4周而不裂解。抗体溶液是用于抗体药物组合物的溶液。优选的抗体溶液包含1mg/mL的抗体，10mM磷酸盐，pH7.4和150mM NaCl。
本文特别提出的经修饰的抗肌肉生长抑制因子抗体是比亲本抗体具有增高的化学稳定性的单克隆抗体，其中除去了亲本抗体中Asn-Pro二肽的不稳定Asn残基，优选用天然氨基酸残基取代，甚至更加优选用组氨酸(H)、色氨酸(S)、苏氨酸(T)、丙氨酸(A)或精氨酸(R)残基取代。另外，此经修饰抗体的特点在于优选结合肌肉生长抑制因子而不是结合GDF-11，与肌肉生长抑制因子结合的KD小于大约3×10-8M，优选地其进一步的特点在于在如本文实施例4给出的体外肌肉生长抑制因子/SBE报告分子试验中具有的IC50低于25nM。
本文使用的术语“不稳定Asn残基”是指在抗体，蛋白质或者多肽中的天冬酰胺残基，其在体外或者体内可能发生自发脱酰胺作用或者肽键断裂。
本文使用的术语“裂解的或裂解”是指抗体中肽键的裂解。特别关注的裂解位点是抗体中的Asn残基，位于Asn残基的氨基端或羧基端。抗体裂解可能导致稳定性下降和/或蛋白质活性的下降或丧失，或者抗体结合亲和力的丧失。导致裂解的自发修饰可能发生在体外治疗制剂的制备过程中，不良影响药物制剂的制造和储存。裂解也可能发生在体外抗体的制造或储存过程中。此外，自发修饰可能发生在体内，影响蛋白质和抗体的效果和作用持续时间。然而，在裂解位点的任何其他氨基酸的简单取代可能对抗体预期的生物作用(例如结合亲和力或者中和作用)产生负面影响。
术语“表位”指分子的能够被一个或者多个抗体的抗原结合区域识别和结合的那部分。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或者糖支链)构成，并且具有特定的立体结构以及特定的电荷特征。
本文使用的术语“表位”另外是指在动物，优选地在哺乳动物(例如小鼠或者人类中)具有抗原和/或免疫原活性的多肽部分。本文使用的术语“抗原性表位”，定义为抗体可以特异性结合的多肽部分，该特异结合可以用本领域熟知的任何方法测定，例如通过传统的免疫测定。抗原的表位不一定是免疫原性的，但是可能是免疫原性的。本文使用的“免疫原性的表位”定义为在动物中引起可由本领域任何已知方法进行测定的抗体应答的多肽部分。(参见，例如Geysen等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002(1983))。
涉及本发明的抗体时，短语“生物学特性”或“生物活性”、“活性”或“生物学活性”，在本文可交替使用并且包含，但不局限于表位/抗原亲和力和特异性，体内或者体外中和或者拮抗肌肉生长抑制因子活性的能力，本文实施例4所示的肌肉生长抑制因子/SBE报告分子试验中的IC50，或体外活性试验中的其他，抗体在体内或体外的稳定性。抗体其他确定的生物学特性包括，例如交叉反应性(即，通常与靶肽的非人类同源物，或者与其他的蛋白质或组织的交叉反应性)，以及在哺乳动物细胞中保持蛋白质高水平表达的能力。可以使用本领域公认的技术观察或测量或评估前面提到的特性或者特征，这些技术包括，但不局限于ELISA、竞争性ELISA、表面等离子体共振分析、体外或体内无限制中和试验、受体结合、BIACORE或KINEXA试验，细胞因子或生长因子生成和/或分泌，非洲蟾蜍属动物冠发育(Xenopus animal cap development)，来自包括人类，灵长类或其他根据需要的任何不同来源的组织的信号传导和免疫组织化学。
本文使用的术语“肌肉生长抑制因子活性”是指与活性肌肉生长抑制因子蛋白相关的一种或者多种生理性生长调节或者形态发生的活性。例如活性肌肉生长抑制因子是骨骼肌质量的负调节子。活性肌肉生长抑制因子也可以调整肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生，刺激肌原细胞增殖，并且调节脂肪前体细胞向脂肪细胞的分化。
本文使用的术语“抑制”或“中和”涉及本发明的抗体活性时是指充分地拮抗、禁止、妨碍、抑制，减缓，破坏，排除，终止，降低或者逆转例如正被抑制的包括但不局限于生物学活性的进展或严重性的能力。优选地抑制或中和是在抗体缺乏时活性的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者更高。
术语“个体”、“受试者”、“患者”在本文可交替使用，是指动物，优选哺乳动物(包含非灵长类和灵长类)或者禽类，包含但不局限于：鼠类、猿类、人类、哺乳类农场动物(即，牛、猪、羊)、哺乳类运动动物(即，马)、以及哺乳类宠物(即，犬科动物和猫科动物)；优选地，此术语是指人类。此术语也指禽类，包含但不局限于鸡和火鸡。在某个实施方案中，受试者(优选哺乳动物，更优选人类)其进一步的特点在于患有其治疗受益于降低水平的或者降低生物学活性的肌肉生长抑制因子的疾病或者紊乱或者病症。在另外一个实施方案中，受试者(优选哺乳动物，优选人类)其进一步的特点在于具有罹患紊乱、疾病或者病症的危险，该紊乱、疾病或者病症的治疗受益于降低水平或者降低生物学活性的肌肉生长抑制因子。
抗体表征
本发明提供这样的抗体，其优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11，并且比亲本抗体更加稳定(即，相比亲本抗体更加耐受化学降解)，同时维持，或改善亲本抗体表现出来的与肌肉生长抑制因子的结合力。在一个实施方案中，如图2中显示的亲本抗体Mab C12或Mab 510C2中位于CDRL3的不稳定Asn残基由其它氨基酸取代。
本发明抗体中优选的氨基酸取代是：1)减低对自发化学降解(即，裂解或者脱酰胺作用)的敏感性，和2)维持正如亲本抗体表现出的抗原抗体结合亲和力的那些取代。在一个优选的实施方案中，Mab C12的位于CDRL3上的Asn残基被H或R取代。在另外一个优选的实施方案中，Mab 510C2的位于CDRL3上的Asn残基被H、S、T或A取代。
在一个实施方案中，本发明抗体耐受自发化学降解，即，当在选自下列各温度和时间的条件下：4℃下1年，25℃下6个月，37℃下2个月，和40℃下4周，于抗体溶液中保存时，100％、99％、98％、97％、96％或95％的抗体不裂解。抗体溶液是指适用于包含抗体的药物组合物的任何溶液。示例性的抗体溶液包含1mg/mL抗体，10mM磷酸盐，pH7.4和150mM NaCl。
在一个实施方案中，本发明抗体的进一步特征在于具有与肌肉生长抑制因子的强结合亲和力(KD)，即，低于大约3×10-8M、1×10-8M或1×10-9M，优选低于大约9×10-10M、8.7×10-10M或更优选地低于大约8×10-11M。或者，本发明抗体的特征在于与肌肉生长抑制因子的KD不超过大约3×10-8M、1×10-8M、1×10-9M或9×10-10M，更优选地不超过大约8.7×10-10M或最优选地不超过大约8×10-11M。本发明抗体的结合亲和力与其亲本抗体的结合亲和力类似或者高于其亲本抗体的结合亲和力。
优选地，特征为如上文描述的强结合亲和力的本发明抗体还具有如本文实施例4所示体外肌肉生长抑制因子/SBE报告分子试验中的IC50，其低于25nM、20nM、16nM、14nM、10nM、9nM、6nM或5.2nM。优选地，本发明抗体的IC50与其亲本抗体的类似或者优于其亲本抗体的IC50。本发明的所有抗体与GDF-11的反应显著低于与肌肉生长抑制因子的反应。即，它们优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11。
本发明抗体优选是嵌合体，人源化或人类抗体或者其抗原结合部分，并且优选结合肌肉生长抑制因子，其结合于成熟形式肌肉生长抑制因子氨基酸40-64或者更加优选地结合于成熟形式肌肉生长抑制因子氨基酸43-57和/或45-59的区域。此外，本发明抗体在体内或体外中和肌肉生长抑制因子生物学活性。本发明抗肌肉生长抑制因子的单克隆抗体的特异性结合使得本发明抗体可以用于治疗或预防与肌肉生长抑制因子相关的病症、疾病或者紊乱，即这些病症、疾病或者紊乱的治疗或预防受益于降低的肌肉生长抑制因子水平或者受拮抗的或者受抑制的肌肉生长抑制因子的生物学活性。此外，本发明抗体可以用于诊断或者监测治疗或预防受益于改变的肌肉生长抑制因子水平或者其生物学活性的病症、疾病或者紊乱，或者用于在样本中测定肌肉生长抑制因子的水平。
本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体结合的抗原性表位发现位于成熟肌肉生长抑制因子(人类SEQ ID NO：1)的氨基酸40-64，优选地位于成熟肌肉生长抑制因子的氨基酸43-57和/或45-59。此外，本发明的肌肉生长抑制因子免疫原性表位位于成熟肌肉生长抑制因子(人类SEQ IDNO：1)的氨基酸40-64，优选位于任何哺乳动物或者鸟类成熟肌肉生长抑制因子的氨基酸43-57和/或45-59。本发明的免疫原性表位也是抗原性表位。此外，肌肉生长抑制因子的氨基酸40-64外的残基可能影响抗原性结构域的构象结构，从而改变本发明抗体与抗原性表位的结合。
包含来自不同物种的部分的单链抗体，和嵌合、人源化抗体，以及嵌合或CDR移植的单链抗体等等，也包含在本发明和术语“抗体”或“修饰抗体”中。这些抗体的不同部分可以通过传统技术化学地，合成地结合在一起或使用基因工程技术制成连续蛋白质。例如，可以表达编码嵌合或人源化链的核酸从而产生连续蛋白质。
此外，也可以产生抗体的功能部分，包含嵌合的、人源化、人类或者单链抗体的抗原结合部分。上述抗体的功能部分保留来源其的全长抗体的至少一个抗原结合功能和/或生物学功能或生物学活性。优选的功能部分保留相应全长抗体的抗原结合功能(例如，结合哺乳动物成熟形式肌肉生长抑制因子的能力)。特别优选的功能部分或片段保留抑制哺乳动物成熟肌肉生长抑制因子的一个或者多个功能或生物活性(例如结合活性、信号活性，和/或细胞反应的刺激)的能力。例如，在一个实施方案中，功能部分或者片段可以抑制成熟肌肉生长抑制因子与一个或者多个其配体的相互作用，和/或可以抑制一个或者多个受体介导的功能。
本发明也包含能够结合成熟肌肉生长抑制因子或其部分(优选地在成熟肌肉生长抑制因子氨基酸40-64、43-57和/或45-59)的抗体部分或片段，包含但不仅局限于：Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。这样的片段可以通过酶法裂解或重组技术产生。例如，木瓜酶或者胃蛋白酶裂解可以分别产生Fab或F(ab’)2片段。最小的抗原结合片段是Fv，由HCVR和LCVR结构域组成。由HCVR-CH1和LCVR-CL结构域组成的Fab片段通过恒定区间的二硫键共价连接。当在宿主细胞中共表达时，为了克服Fv中非共价键连接的HCVR和LCVR结构域解离的趋势，可以构成所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)，其中柔性的和适当长度的多肽或者将HCVR的C-末端连接到LCVR的N-末端或者将LCVR的C-末端连接到HCVR的N-末端。通常使用的接头是15残基(Gly4Ser)3的肽，但是本本领域也已知其他接头。也可以使用在自然终止位点上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因生成各种截短形式的抗体。例如，编码F(ab’)2重链部分的嵌合基因可以设计成包含编码重链CH1区域和铰链区DNA序列的基因。
不稳定Asn残基的识别
很多方法可以用来检测或者量化蛋白质(例如抗体)中不稳定Asn残基的自发修饰。脱酰胺作用(一种导致天冬酰胺残基转变成异天冬氨酸和天冬氨酸混合物，其可提供蛋白质降解的信号的修饰)引入负电荷并改变蛋白质质量(NH2vs OH，Δ＝1Da)和疏水性。分离技术包括电学方法或层析法，例如，IEF、cIEF、尿素凝胶电泳、反相PHLC、离子交换PHLC和亲水性相互作用，可用来分开或者分离抗体或蛋白质或多肽的脱酰胺化或经裂解的形式。离子交换层析法广泛应用于分离脱酰胺化的蛋白质。抗体或蛋白质或多肽的自发修饰的位置以及程度可以通过液相层析/质谱分析(LC/MS)和N-末端序列测定而进一步地得到表征。
不稳定Asn残基的取代或抗体的其他修饰
为了除去抗体或其他蛋白质中的不稳定Asn残基，例如通过氨基酸取代，不稳定Asn残基可由单一氨基酸取代。希望的是氨基酸取代不改变(即，阴性的)或者很少(例如，10％、5％、4％、3％、2％或者更小)改变抗体和抗原的结合亲和力。更加希望的是氨基酸取代不改变(即，阴性的)或者很少改变抗体的中和作用，表位特异性和抗体优先结合肌肉生长抑制因子而不是结合GDF-11的能力。ELISA可以用来测定单独的氨基酸取代对本发明抗体与肌肉生长抑制因子或其抗原性表位的结合亲和力的影响，并且将ELISA值与其亲本抗体(例如，C12或510C2抗体)结合同样抗原的值进行比较。或者，可以使用
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或
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试验测量抗体的结合亲和力。
本发明抗体可以进一步地例如在CDR结构域中诱变(或者在除去导致亲本抗体不稳定的Asn残基前诱变)，以产生具有例如结合亲和力、IC50、特异性等等最佳目标特性的变异抗体。优选通过氨基酸取代产生的本发明抗体，且其具有至少一种亲本抗体分子的氨基酸残基被除去并且在其位置插入一种不同的残基。此类取代诱变最希望发生的部位包括CDR区域，但是也涵盖FR改变。
生成取代变体的简便方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简要地讲，突变一些CDR区的位点以在各个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以与包装于每个颗粒中的M13的基因III产物的融合在丝状噬菌体颗粒上以单价形式展示。正如本文公开的，筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如，结合亲和力、特异性、IC50)。为了识别用于修饰的候选CDR区域位点，进行丙氨酸扫描诱变以用来识别对抗原结合有显著作用的CDR区域残基。或者或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构有益于识别抗体和肌肉生长抑制因子间的接触点。根据本文详细描述的技术或者本领域已知的技术，此类接触残基和附近的残基是取代的候选者。或者或此外，随机诱变可能发生在一个或者多个CDR序列的一个或者多个残基位置上，其间该CDR或者有效地连接于可变区或者该CDR区相对其他可变区序列是独立的，然后使用重组DNA技术使该改变的CDR返回到可变区。一旦产生和表达这样的变异抗体，正如本文描述的对变体组进行筛选，可以筛选出在一个或者多个相关试验中具有较好特性的抗体并且将其用作进一步的研究。
抗体表达
本发明还涉及表达本发明抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体或其中部分的细胞系。可以通过使用本领域已知的标准技术来制造和分离产生本发明单克隆抗体的细胞系。优选的细胞系包括COS、CHO、SP2/0、NS0和酵母(可以从公共保藏单位获得，例如ATCC，美国典型培养物中心，Manassas，VA)。
多种宿主表达系统可以用来表达本发明的抗体，包含原核(细菌的)和真核表达系统(例如酵母，杆状病毒，植物，哺乳动物和其他动物细胞，转基因动物，和杂交瘤细胞)，以及噬菌体展示表达系统。适当的细菌表达载体的实例是pUC119而适当的真核表达载体是DHFR选择系统减弱的经修饰的pcDNA3.1载体。其他的抗体表达系统也是本领域已知的并且涵盖于本文中。
本发明抗体可以通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白重链和轻链基因而制备。为了表达重组抗体，一个或者多个携带编码抗体免疫球蛋白轻链和/或重链的DNA片段的重组表达载体经转化，转导，感染或者类似方式而导入到宿主细胞中，从而使得轻链和/或重链在宿主细胞中表达。可从在一个载体中的与重链和/或轻链有效连接的不同启动子独立地表达重链和/或轻链，或者可选择地，从在两个载体中的与重链和/或轻链有效连接的不同启动子独立地表达重链和/或轻链——一个表达重链，一个表达轻链。任选地重链和轻链可在不同的宿主细胞中表达。优选地，重组抗体被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从其中回收和纯化抗体。用标准的重组DNA方法获得抗体重链和轻链基因，将这些基因合并到重组表达载体中，并将这些载体导入到宿主细胞中。
编码HCVR区域的分离的DNA可以通过将HCVR编码DNA有效连接到另一个编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的DNA分子而转化为全长重链基因。人类重链恒定区基因序列是本领域已知的。参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242(1991)。可以通过例如标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是如Kabat(同上)所描述的任何类型，(例如IgG、IgA、IgE、IgM或IgD)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类恒定区及其任何异型的变体。或者，抗原结合部分可以是Fab片段，Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd或单链Fv片段(scFv)。对于Fab片段重链基因，编码HCVR的DNA可以有效地连接到另一个仅仅编码重链CH1恒定区的DNA分子上。
编码LCVR区域的分离的DNA可以通过将编码LCVR的DNA有效连接到另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子而转化为全长轻链基因(以及转化为Fab轻链基因)。本领域已知人类轻链恒定区基因序列。参见，例如Kabat(同上)。可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是K或λ恒定区。
为了生成scFv基因，编码HCVR和LCVR的DNA片段有效地连接到另一个编码柔性接头的片段上，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的片段，这样HCVR和LCVR序列可表达为连续的单链蛋白质，LCVR和HCVR区域通过柔性接头而连接在一起。
为了表达本发明的抗体，将如上描述所获得的编码部分或者全长轻链和/或重链的DNA插入到表达载体中，从而使得基因有效地与转录和翻译控制序列相连接。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同的载体，或者更典型地，将两种基因插入相同的表达载体。抗体基因通过标准方法插入表达载体。此外，重组表达载体可以编码促进抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体轻链和/或重链从宿主细胞分泌的信号肽。抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体轻链和/或重链基因可以克隆到载体，这样信号肽可以有效地以符合读框的方式连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可能是免疫球蛋白信号肽或者异源性信号肽。
除了抗体重链和/或轻链基因外，本发明的重组表达载体携带控制宿主细胞内抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”包括启动子，增强子和其他的表达控制元件(例如多腺苷酸信号)，根据需要，控制抗体链基因的转录或翻译。表达载体的设计，包括调控序列的选择，可以取决于诸如转化宿主细胞的选择，预期蛋白质的表达水平等因素。针对哺乳动物宿主细胞表达，优选的调控序列包括导致在哺乳动物细胞中蛋白质高水平表达的病毒元件，诸如来源于巨细胞病毒(CMV)，猿猴病毒(SV40)，腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。
除了抗体重链和/或轻链基因和调控序列以外，本发明重组表达载体可携带其他序列，例如在宿主细胞调控载体复制的序列(例如复制起点)以及一个或者多个可选择的标记基因。可选择的标记基因有利于已经导入了载体的宿主细胞的选择。例如，典型的可选择标记基因导致载体已导入的宿主细胞对药物，诸如G418、均霉素或氨甲喋呤的抗性。优选地，可选择的标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(与氨甲喋呤一起用于DHFR阴性宿主细胞的选择/扩增)，neo基因(用于G418选择)，和用于GS阴性细胞系(例如NS0)的选择/扩增的谷氨酰胺合成酶(GS)。
为了表达轻链和/或重链，将编码重链和/或轻链的表达载体通过标准方法导入到宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、转导、感染等等。尽管从理论上讲，无论在原核或真核宿主细胞中皆可能表达本发明的抗体，但是优选真核细胞，并且最优选哺乳动物宿主细胞，因为这样的细胞更容易组装和分泌正确折叠的和免疫活性的抗体。优选地表达本发明重组抗体的哺乳宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、和SP2/0细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳宿主细胞中后，通过培养宿主细胞产生抗体，宿主细胞培养时间为足以允许宿主细胞表达抗体的时间，或者优选地，将抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。可以通过标准纯化方法从宿主细胞和/或培养基中回收抗体。
通过传统的技术，宿主细胞可以用来产生完整抗体的部分或者片段，例如，Fab片段或者scFV分子。熟练的技术人员理解上述步骤的变化仍然属于本发明的范围。例如，可以用编码本发明抗体的轻链或者重链的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术也可以用于除去编码并非结合肌肉生长抑制因子所必须的重链或者轻链中的一种或者两种的部分或者全部DNA。此类截短的DNA分子表达的分子也包含在本发明的抗体中。
在本发明抗体重组表达的优选系统中，编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体通过例如磷酸钙介导的转染而引入到CHO细胞中。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因分别有效连接到增强子/启动子调控元件以驱动该基因的高水平转录。重组表达载体也携带DHFR基因，允许通过氨甲喋呤选择/扩增而选择已转染载体的CHO细胞。培养挑选出的转化宿主细胞从而表达抗体重链和轻链并从培养基中回收完整的抗体。使用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化的细胞，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。本发明抗体，或其抗原结合部分可在人类免疫球蛋白转基因的动物(例如小鼠)中表达(参见例如Taylor等人，Nucleic Acids Res.20：6287-95，1992)。
用途
正如本文描述的，本发明抗体可以用于治疗，预防，诊断和研究。本发明的抗体可以用于诊断与人类肌肉生长抑制因子表达相关的紊乱或者疾病。以相似的方式，本发明抗体可以用于正在进行肌肉生长抑制因子相关病症治疗的患者的肌肉生长抑制因子水平监测试验。
抗体的治疗用途
肌肉生长抑制因子在肌肉发育和许多相关紊乱和疾病中发挥作用。对于成年人，肌肉生长抑制因子mRNA主要在骨骼肌中检测到，也可以在脂肪组织和心脏组织中检测到低浓度的肌肉生长抑制因子(Sharma，M.等人，J.Cell Physiol.180：1，1999)。肌肉生长抑制因子敲除的小鼠的肌肉量是同窝出生的野生型小鼠的两倍到三倍。增加的肌肉量是纤维肥大和增生的结果(McPherron，A.等人，Nature387：83-90，1997和Zhu，X.等人，FEBSLetters474：71)。此外，肌肉生长抑制因子敲除的小鼠脂肪积累少于同窝出生的野生型小鼠，但是其他方面表现为正常和健康。最近显示肌肉生长抑制因子是脂肪生成的重要调节子(Rebbapragada，A.等人，Mol.and Cell.Bio.23：7230-7242，2003)。此外，最近在肌肉生长抑制因子缺陷的小鼠中研究了其骨结构和含量(Hamrick M.W.等人，J.Orthopaedic Research21：1025，2003；Hamrick，M.W.等人，CalcifTissue Int71：63，2002)。
因此，包含本发明抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体的组合物可以用来增加肌肉量，增加骨密度，降低肌肉萎缩，或者可以用于治疗或者预防其中存在的肌肉生长抑制因子导致或者促使不良病理影响的病症，或者肌肉生长抑制因子水平的降低在哺乳动物，优选在人类中具有治疗作用。优选地，可以使用包含本发明抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体的组合物来增加肌肉量。
优选地，本发明抗体可以用来治疗或者预防肌肉萎缩、肌损伤、外科、损伤肌肉的修复、虚弱、年龄相关少肌症、废用性萎缩、骨质疏松症、骨关节炎、韧带生长和修复、肥胖症、抑制机体脂肪堆积、肥胖症、任何类型的肌营养不良、病危护理肌病、酒精中毒性肌病、恶病质(例如，癌症相关的或者HIV诱导的，或者COPD，慢性肺病，脓毒症恢复，肾衰竭、肝衰竭、心衰竭或者心脏病所导致的)、代谢综合症、烧伤后肌肉萎缩以及II型糖尿病。更加优选地，本发明的抗体可以用于治疗和预防肌肉萎缩、虚弱、年龄相关少肌症、废用性萎缩和恶病质。最为优选地，本发明抗体用于治疗和预防废用性萎缩或恶病质。
废用性萎缩可能由多种原因和包括任何导致长期固定或者废用或者卧床的紊乱或者疾病或者状况的事件引起，包括但不局限于，实体器官移植、关节置换、中风、脊髓损伤、严重烧伤恢复、坐式的长期血液透析、脓毒症后恢复和暴露于微重力。因为肌肉生长抑制因子的序列和功能在物种间高度保守，本发明抗体可以用于非人类哺乳动物或者禽类[例如家畜(例如犬科和猫科)、运动性动物(例如马类)、食源性动物(例如牛、猪和羊)、禽类(例如鸡、火鸡、其他猎鸟或家禽)]的增加肌肉量，增加骨密度或治疗或预防疾病。其中存在的肌肉生长抑制因子导致或者促使不良病理影响或者降低的肌肉生长抑制因子水平有治疗作用。
本文涵盖了使用本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体治疗或预防至少一种前述紊乱，其中肌肉生长抑制因子活性是有害的或者该紊乱的治疗或预防受益于降低的肌肉生长抑制因子生物活性水平。此外，涵盖了本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体在制造用于治疗至少一种前述紊乱的药物中的用途。
如本文使用的，术语“治疗”“处理”等等，是指获得预期的药理的和/或生理效应。从部分或者完全治愈疾病和/或疾病导致的不良反应角度而言，这种效应可能是治疗性的。本文使用的“治疗”，包括向哺乳动物，尤其是人施用本发明化合物来治疗其疾病或者病症，包括：(a)抑制疾病，即，抑制其发展；和(c)缓解疾病，即，使得疾病或者紊乱消退或者缓解其症状或并发症。可以调整给药方案以提供最佳的预期反应。
如本文使用的，术语“预防”是指完全或者部分预防疾病或其症状。如本文使用的“预防”，包含向受试者施用本发明的化合物来预防疾病的发生，该受试者可能易于罹患该疾病但是还未被诊断出来罹患该疾病。
组合物
本发明的抗体可以合并到适合患者服用的药物组合物中。本发明化合物可以单独给药或者与可药用载体，稀释剂和/或辅料组合，单剂量或者多倍剂量给药。设计给药组合物以适合选定的给药模式，且适当地使用可药用稀释剂，载体和/或辅料，例如分散剂，缓冲液，表面活性剂，防腐剂，增溶剂、等渗剂，稳定剂等等。所述的组合物是根据传统技术设计的，例如Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro编著，Mack Publishing Co.，Easton，PA 1995，它提供了本领域技术人员公知的配制技术的一览表。
本发明组合物优选是“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体。“治疗有效量”是指在必要的剂量和持续时间有效获得预期治疗效果的量。抗体的治疗有效量可能根据多种因素而不同，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个体中引发预期反应的能力。治疗有效量也是指抗体的治疗有益效果优于其任何的毒性或有害影响的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和持续时间有效获得预期预防效果的量。典型地，因为预防剂量是在受试者患病之前或者在疾病早期使用，所以预防有效剂量可能比治疗有效量低。
治疗有效量或预防有效量至少是对患者提供治疗效果所必需的活性剂的最小剂量，但是低于毒性剂量。用另一种方式来讲，本发明抗体的治疗有效量是指在哺乳动物，优选在人类中增加肌肉量，增加骨密度，或者治疗其中存在的肌肉生长抑制因子导致或者促使不良病理影响，或者在哺乳动物，优选在人类中降低肌肉生长抑制因子水平导致有效治疗效果的剂量，包含但不局限于：肌肉萎缩、肌损伤、外科虚弱、年龄相关少肌症、废用性萎缩、骨质疏松症、骨关节炎、韧带生长和修复、肥胖症、抑制机体脂肪堆积、任何类型的肌营养不良、病危护理肌病、恶病质(例如癌症相关或者HIV诱导的，或者COPD、肾衰竭、肝衰竭、心衰竭或者心脏病导致的)、代谢综合症以及II型糖尿病。废用性萎缩可能由多种原因或事件导致，包括导致长期固定或废用或卧床的任何紊乱或疾病或状况，其中包括但不局限于，实体器官移植、关节置换、中风、脊髓损伤、严重烧伤恢复、坐式长期血液透析、脓毒症后恢复和暴露于微重力。
本发明抗体的给药途径是胃肠外给药。优选地，本发明抗体可以合并入适合胃肠外给药的药物组合物中。本文使用的术语胃肠外给药包含静脉内，肌肉内，皮下，直肠，阴道或者腹膜内给药。优选静脉内或腹膜内或皮下注射的外周系统给药。适于这些注射的介质是本领域公知的。
所述组合物典型地必须是无菌的并且在制造条件下和在提供的容器中保存的情况下是稳定的，容器包括例如密封小瓶或注射器。因此，组合物在配制后必须经过无菌过滤，或者制成微生物学上可接受的。静脉输注的典型组合物的体积是20-1000mL的液体，例如无菌林格氏溶液、生理盐水、葡萄糖溶液和Hank氏溶液和治疗有效量(例如1到1000mg)的抗体浓度。剂量可能根据疾病的类型和严重程度而不同。正如在医学技术中所熟知的，任何一个患者的剂量取决于很多因素，包括患者的体积、体表面积、年龄、施用的特定组合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况、和同时施用的其他药物。例如，典型的剂量可能是1到1000mg；然而，也考虑低于或者超出该示例范围的剂量，尤其是在考虑到上面的因素时。典型的给药方案可能是每天，每周，每两周或者每月。典型的胃肠外给药方案可能是总体重大约10μg/kg到大约20mg/kg，优选地从大约20μg/kg到大约10mg/kg。通过定期评估监测整个过程。关于重复给药，取决于状态，可在发生疾病症状预期的抑制或者疾病症状预期的预防前进行重复治疗。然而，其他的给药方案也可能有用，因此不排除。
这些建议的抗体量受很多治疗学考虑的影响。选择合理的剂量和计划安排的关键因素是获得的结果。本文中考虑的因素包括治疗的特定紊乱，治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，紊乱的原因，抗体给药的部位，抗体的特定类型，给药方法，给药的计划安排和医生已知的其他因素。
本发明的治疗制剂可能采用冷冻或冻干的形式储藏，使用前在适当的无菌载体中重构。冻干和重构可能导致抗体活性不同程度的损失。可能需要调整剂量进行补偿。一般情况下优选pH6-8。
制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含用于治疗或预防上述描述的病症或状况的材料的制品。制品包括容器和标签。适当的容器包括，例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以使用玻璃或塑料等各种材料制成。容器储藏能有效预防或治疗紊乱或病症的本发明组合物，可能有无菌通道(例如容器可能是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉溶液包或小瓶)。组合物的活性成分是本发明的抗肌肉生长抑制因子抗体。容器的或与容器相关的标签指示本组合物用来治疗选择的病症。制品可能进一步包含第二个容器，其中包含可药用缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。其可能进一步包括其他商业者和使用者需要的其他材料，包括其他的缓冲液，稀释液，过滤器，针头，注射器，和说明用法的包装说明书。
以下的实施例仅仅是为说明目的而提供的，在任何方面都不希望限制本发明的范围。
实施例
实施例1：确定Mab C12和510C2的裂解位点
在各种缓冲溶液(10mM柠檬酸盐pH5，10mM柠檬酸盐pH6，10mM柠檬酸盐pH7，和10mM柠檬酸盐/150mM NaCl pH7)中的1mg/mL抗体溶液在不同的温度(-20℃、4℃、25℃和40℃)下孵育4周。孵育后，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测样品的特征。对于包含C12或510C2可变结构域(在多个Fc同种型的情况中)的抗体，可以观察到抗体重链和轻链的预期条带外的其它条带。这些条带只能在pH7下(含有或者不含NaCl)孵育的样本中观察到；在样本裂解情况下，可以观察到两条带，具有～8-10kDa和～12-14kDa的表观质量，在样本不裂解下，可以观察到一条表观质量～8-10kI)a的条带。通过这些条带的相对强度测定的裂解程度似乎是pH值依赖的(因为在pH6孵育的样本，其条带的强度较低，对于在pH5孵育的样本，其条带不明显)和温度依赖的。为了进一步判断裂解位置，并且量化裂解的程度，使用液相色谱法/质谱分析法(LC/MS)和N-末端序列测定来进一步了解同种抗体溶液的特性。
通过LC/MS分析样本采取以下步骤进行。对于部分裂解的抗体，4μL的各个样本与36μL水混合。然后，15μL每种溶液与0.5μL的3M，pH8.0的Tris-HCl缓冲液以及0.5μL的50mg/mL DTT和45μL的水混合。每种样本的两份溶液使用LC/MS进行分析。对于去糖基化的抗体，3μL每种样本与60μL水，1.0μL的3M，pH8.0的tris-HCl缓冲液和1.0μL的PNGaseF溶液(
Figure A200780032787D00261
1U/mL)混合。将溶液在37℃孵育6小时，然后用LC/MS进行分析。对于完全胰蛋白酶消化的抗体，20μL每种样本在高速真空系统中冻干，然后在4.5μL的7M盐酸胍，pH8.0的0.4M tris-HCl缓冲液和0.5μL的50mg/mL DTT溶液中重构。该溶液在37℃孵育40分钟然后用95μL水稀释。每种溶液用2.0μL的0.5mg/mL猪胰蛋白酶在37℃处理3小时。用乙酸酸化溶液然后用LC/MS或LC/MS/MS分析。使用Waters HPLC/LCT premier或者Q-TOF微质谱仪对完整的、部分裂解的、或者去糖基化的样本进行分析。根据样本和需求对HPLC和质谱仪的参数设置进行调整。
在pH7，40℃时孵育4周的C12抗体的解卷积质谱(deconvoluted massspectra)表现为两个峰，质量为134894和145116Da。两者之间的质量区别大约为10220Da，与轻链N-末端肽1-93预期的残基质量(预期：10221.4Da)相匹配。通过LC/MS分析部分裂解样本而证实了该结果。在这个样本中，检测到3种质量；23312.7，13091.3和10239.4Da，与完整轻链1-219(预期：23313.1Da)，轻链C-末端肽94-219(预期：13091.6Da)和轻链N-末端肽1-93(预期：10239.4Da)一致。510C2抗体也得到基本相同的结果，尽管该抗体裂解产物的数量相对较低。表1总结了部分裂解样本分析测定的裂解的轻链的百分比。
N-末端序列分析也用于检测孵育样本的特征。使用Applied BiosystemInc.(ABI)气相(GP-PVDF)方法对施加于
Figure A200780032787D00271
样品制备柱的样本进行自动埃德曼(Edman)降解氨基酸序列分析。每个残基于55℃以325μL/分钟流速在sphere-5 PTH 220x2.1mm ABI
Figure A200780032787D00272
柱上进行分析。使用ABI的Model 610A数据分析程序进行数据分析。对于在40℃孵育的抗体样本，可以观察到两个序列；对于C12，观察到的两个序列是“DIQMTQ”(SEQ ID NO：34)，此序列对应C12轻链预期的N-末端和“PLTFGG”(SEQ ID NO：35)，此序列对应C12轻链的残基94-99。对孵育的510C2抗体溶液的分析得到同样的结果。使用每种序列的相对量，计算裂解的产品的含量，并总结在表1中。
表1.Asn93-Pro94肽键裂解程度小结
实施例2：在C12和510C2抗体中除去化学裂解位点
为了除去C12和510C2中的裂解位点，使用每种氨基酸的单一氨基酸取代代替两种单克隆抗体中位于CDRL3的天冬酰胺残基。使用ELISA测定相比较于C12或510C2 Fab的各个氨基酸取代对肌肉生长抑制因子亲和力的影响。
ELISA平板中每孔加入50μL用碳酸盐缓冲液(50mM NaHCO3pH8.3)稀释为4ug/ml的肌肉生长抑制因子。用密封带密封平板并在4℃孵育过夜。然后，使用自动平板清洗器将平板(Greiner U-bottom平板，目录号650061)用PBS-T(0.1％Tween-20)清洗3次。每孔加入200μL封闭缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％Tween-20)并在室温下孵育1小时。清洗平板并在每孔中加入50μl样本。样本由periprep Fab与PBST/BSA首先以1:3稀释，然后进行一系列半对数稀释而构成。清洗平板并在每孔中加入50μL二抗溶液(1:2000稀释在PBST/BSA中的山羊抗人-κ-AP，Southern Biotech，目录号2060-04)。再次清洗后，每孔加入100μL AP底物并且在室温下孵育大约10分钟。读取560nm的吸光度或OD值。每个ELISA平板中都包含C12或510C2作为亲和力参考标准。使用定量ELISA测定Fab浓度，使用抗Fd抗体(绵羊抗-Fd，Biodesign)结合蛋白质然后用山羊抗人-κ-AP(Southern Biotech)来测定。在每个平板中测定纯化的Fab标准样品，从而产生标准曲线来测定浓度。
如ELISA所测定的，从C12和510C2改良的Fab(其中位于CDRL3的Asn残基在C12中由H或R代替，而在510C2中由H、S、T或A代替)保持了与亲本Fab类似的对肌肉生长抑制因子的亲和力。如在同样Fab浓度下通过相似的吸光度读数确定的每种这些取代产生的ELISA亲和力曲线类似于相应的亲本Fab对照的(见图4)。然而，如果C12中位于CDRL3的天冬酰胺残基由缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，或者在510C2中由精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸或脯氨酸取代，相比其亲本的Fab，这些取代的每个都降低了修饰的Fab对肌肉生长抑制因子的结合亲和力。此外，对二肽Asn-Pro的Pro残基进行修饰的尝试都失败了，因为所有的取代相比于亲本Fab都减低了修饰的Fab对肌肉生长抑制因子的结合亲和力。
实施例3：C12抗体及变体LC-N93H之间的裂解比较
在10mM磷酸盐，pH7.4/150mM NaCl中的1mg/mL抗体溶液，在多个温度(4℃、25℃和40℃)下孵育4周。孵育后，样本的特征通过上述的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和N-末端序列测定。在这些情况下，40℃孵育的C12抗体样本在SDS-PAGE中观察到除预期的抗体重链和轻链条带之外的附加条带；在未裂解的情况下观察到的条带迁移到～8kDa的位置，而在裂解的情况下观察到的条带迁移到～8kDa和～14kDa的位置。相比之下，未观察到LC-N93H变体出现额外的条带。孵育样本的N-末端序列测定，证实C12抗体样本轻链中发生的裂解位于Asn93和Pro94之间，大约～10-20％的序列对应新N-末端(PLTFGG(SEQ ID NO：35))，然而，对于LC-N93H变体除了预期的N-末端序列没有额外的轻链序列。
实施例4 肌肉生长抑制因子/SBE报告分子试验
在本报告分子试验中，编码位于SMAD结合元件(更具体地讲(CAGA)12)下游的荧光素酶基因的质粒(“SBE-荧光素酶”)，当诸如肌肉生长抑制因子、GDF-11或者其他TGF-β超家族成员等的分子结合其受体时表达荧光素酶蛋白，因此触发SMAD信号，进而导致形成能够结合SBE的磷酸化SMAD复合物。CAGA序列是TGF-β诱导基因PAI-1的启动子中的TGF-β应答序列(Denner等人，EMBO J.，17：3091-3100，1998)。为了产生质粒，将SBE重复序列：tcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacac(SEQ ID NO：36)克隆到pGL3-基础载体(Promega#E1751)的NheI-HindIII位点。这种质粒用来瞬时转染到HEK293EBNA细胞。
测量的光量与荧光素酶的产生量成比例，而荧光素酶的产生量与细胞接触的肌肉生长抑制因子数量成比例。抑制剂(例如，结合肌肉生长抑制因子的抗体)的出现降低了能够活化SEB的肌肉生长抑制因子的量，并最终导致光量产生的降低。
在本试验中，将DMEM/F12培养基(3:1)(Gibco93-0152DK)，10％FBS，20mM Hepes，4mM L-谷氨酰胺(“完全培养基”)中的HEK293EBNA细胞(Edge Biosystems)接种到多聚赖氨酸包被孔内测的96孔板(BDBiocoat 35-4461)中，每孔接种大约25000个细胞，并在37℃孵育过夜。第二天，用PBS清洗细胞并且每孔加入50μl OptiMEM I(Gibco31985-070)。用下述50μl的SBE-荧光素酶DNA混合物转染细胞：混合80μl Lipofectamine(Gibco 11668-019)和1.5ml OptiMEM并静置5分钟，然后将其加入到试管中，其中含有混合的20μg SBE-荧光素酶DNA和1.5mlOptiMEM以及200μL Plus试剂(Invitrogen)，混合并且静置5分钟。这两种混合物加到一起后，用力混合溶液并且静置30分钟，然后每个孔中加入50μL该溶液(“转染培养基”)。然后将细胞在5％CO2，37℃下孵育过夜。对于每种细胞的平板，将肌肉生长抑制因子(R&D Systems 788-G8)在完全培养基中稀释到20ng/ml。待检测的本发明的每种抗体都在完全培养基中进行滴定，例如从大约40μg/ml到大约50ng/ml。从孔中移走转染培养基并在每孔中加入50μL抗体稀释液和50μL GDF-8(肌肉生长抑制因子)或GDF-11(R&D Systems)。然后将细胞平板在5％CO2，37℃下孵育过夜。第二天，吸走培养基，用PBS清洗细胞并且加入75μL裂解缓冲液(PromegaE266A)。根据厂家说明书(Promega E2620)使用荧光素酶试剂测定细胞溶解产物的荧光素酶活性。以Log10Mab浓度(μg/ml)对荧光作图并且计算每种肌肉生长抑制因子和GDF-11的Mab的IC50。
Mab C12和来源于C12的改良单克隆抗体(C12-N93H)，在这些条件下用肌肉生长抑制因子检测时产生的IC50值分别是大约9.59nM和7.03nM。在本实验中，当用GDF-11而不是肌肉生长抑制因子检测C12和C12-N93H时，两者都不表现中和活性，表明改良的抗体与其亲本抗体一样都优先结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11。
序列表
<110>伊莱利利公司
<120>抗肌肉生长抑制因子抗体
<130>X17400
<150>60/824498
<151>2006-09-05
<160>36
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>109
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<213>人类
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Claims (18)

1.一种抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其优选结合肌肉生长抑制因子而不是GDF-11，其中所述的抗体结合肌肉生长抑制因子的亲和力不超过约3×10-8M，并且当其在选自：4℃为期1年，25℃为期6个月，37℃为期2个月，和40℃为期4周的条件下在抗体溶液中保存时，其中至少95％的单克隆抗体不裂解。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体结合肌肉生长抑制因子的亲和力不超过约9×10-10M。
3.权利要求1或2的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体在体外肌肉生长抑制因子/SBE试验中的IC50小于或者等于约25nM。
4.权利要求1至3中任一项的单克隆抗体，其中所述的抗体溶液包含1mg/mL该抗体，10mM磷酸盐，pH7.4和150mM NaCl。
5.根据权利要求1至4中任一项的单克隆抗体，其中所述的单克隆抗体结合由选自如ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQ ID NO：29)和CSGECEFVFLQKYPH(SEQ ID NO：30)所示的氨基酸序列组成的多肽。
6.一种抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其包含序列如SEQ ID NO：11所示的重链可变区(HCVR)和序列选自SEQ ID NO：4、5、6和7的轻链可变区(LCVR)。
7.一种抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其包含序列如SEQ ID NO：12所示的HCVR和序列选自SEQ ID NO：9和10的LCVR。
8.根据权利要求1至5中任一项的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其中所述抗体包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR包含序列如SEQ IDNO：23所示的位于CDRH1的肽，序列如SEQ ID NO：25所示的位于CDRH2的肽，和序列如SEQ ID NO：27所示的位于CDRH3的肽，且其中所述LCVR包含序列如SEQ ID NO：13所示的位于CDRL1的肽，序列如SEQ ID NO：14所示的位于CDRL2的肽，和序列选自SEQ ID NO：16、17、18和19的位于CDRL3的肽。
9.根据权利要求1至5中任一项的单克隆抗体，其中所述抗体包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR包含序列如SEQ ID NO：24所示的位于CDRH1的肽，序列如SEQ ID NO：26所示的位于CDRH2的肽，和序列如SEQ ID NO：28所示的位于CDRH3的肽，且其中所述LCVR包含序列如SEQ ID NO：13所示的位于CDRL1的肽，序列如SEQ ID NO：14所示的位于CDRL2的肽，和序列选自SEQ ID NO：21和22的位于CDRL3的肽。
10.权利要求8或9中的单克隆抗体，包含人框架区。
11.权利要求6至10中任一项的单克隆抗体，包含恒定区，其中所述的恒定区起源于人类基因组或起源于选自家畜、运动性动物和食源性动物的动物的基因组。
12.一种抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体，其包含序列如SEQ ID NO：32所示的轻链和序列如SEQ ID NO：33所示的重链。
13.组合物，包含根据权利要求1至12中任一项的抗体和可药用的载体。
14.根据权利要求1至12中任一项的抗体在治疗中的应用。
15.根据权利要求1至12中任一项的抗体在制造用于提高有需要的受试者的肌肉量的药物中的用途。
16.根据权利要求1至12中任一项的抗体在制造用于治疗或预防肌萎缩、虚弱、年龄相关的少肌症、废用性萎缩和恶病质中一种或者几种病症的药物中的用途。
17.一种治疗需要治疗的受试者的肌萎缩、虚弱、年龄相关的少肌症、废用性萎缩和恶病质的方法，其是通过施用治疗有效量的本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体来实现的。
18.一种预防需要预防的受试者的肌萎缩、虚弱、年龄相关的少肌症、废用性萎缩和恶病质的方法，其是通过施用预防有效量的本发明的抗肌肉生长抑制因子单克隆抗体来实现的。
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