CN102459333B - 抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用 - Google Patents

抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102459333B
CN102459333B CN201080025548.1A CN201080025548A CN102459333B CN 102459333 B CN102459333 B CN 102459333B CN 201080025548 A CN201080025548 A CN 201080025548A CN 102459333 B CN102459333 B CN 102459333B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
tau
antibody
disease
phosphorylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080025548.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102459333A (zh
Inventor
贝恩德·博尔曼
乌尔里希·格普费特
菲奥娜·格吕宁格尔
瓦尔特·胡贝尔
汉斯-威利·克雷尔
瓦莱里娅·利夫可
奥拉夫·蒙迪戈尔
索尼亚·奥夫纳
劳伦斯·奥兹曼
迈克尔·施雷尔姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN102459333A publication Critical patent/CN102459333A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102459333B publication Critical patent/CN102459333B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段，所述抗体在Tau病治疗中是有用的。

Description

抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用
本发明涉及特异性结合SEQ ID NO：9的磷酸化Tau片段(pS422)的抗体用于治疗脑病的应用。
发明背景
人Tau(微管相关蛋白Tau(神经原纤维缠结蛋白，配对螺旋丝-Tau(Paired helical filament-Tau)，PHF-Tau)是主要在轴突中发现的神经元的微管相关蛋白，其功能是促进微管蛋白聚合并稳定微管。在人脑中发现六种同种型(同种型A，B，C，D，E，F，G，胎儿-Tau)，最长的同种型包含441个氨基酸(同种型F，Uniprot P10636-8)。Tau及其性质也被Reynolds，C.H.等，神经化学杂志(J.Neurochem.)69(1997)191-198描述。
处于超磷酸化形式的Tau是配对螺旋丝(PHF)的主要成分，配对螺旋丝(PHF)是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)脑中神经原纤维损伤的结构单元。Tau可在其丝氨酸或苏氨酸残基被数种不同的激酶(包括GSK3β，cdk5，MARK和MAP激酶家族的成员)磷酸化。
Tau病(tauopathies)以Tau的异常超磷酸化为特征，并且根据Iqbal，K.等(Biochimica et Biophysica Acta(BBA)1739(2005)198-210)，Tau病是：
·阿尔茨海默病(Alzheimer disease)，包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form)
·唐氏综合征，成人病例(Down syndrome，adult cases)
·关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam parkinsonism dementiacomplex)
·拳击员痴呆(Dementia pugilistica)
·皮克病(Pick disease)
·具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia with argyrophilic grains)
·额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)
·皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)
·苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigral degeneration)
·进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)
·具有缠结的格-施-沙病(Gerstmann--Scheinker disease withtangles)。
迄今为止，在阿尔茨海默病的脑中已经发现近40种丝氨酸(S)/苏氨酸(T)磷酸化位点(Hanger，D.P.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)282(2007)23645-23654)。在阿尔茨海默病中Tau病理学的发展与其磷酸化状态有关。然而，40个磷酸化位点的大部分不与疾病病理学相关，因为它们也在从健康的胎儿脑组织提取的Tau中发现。仅有一些磷酸化位点是疾病状态特有的，推测其负责定义了阿尔茨海默脑PHFs中的Tau的异常的、特征性的不溶性和聚集(Morishima-Kawashima，M.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)270(1995)823-829)。根据Pei，J.J.等，阿尔茨海默病杂志(Journal ofAlzheimer’s Disease)14(2008)385-392，现有文献对于这些位点中的哪些是AD脑特异性的提供了有限且不清楚的信息。Pei使用一系列Tau的磷酸特异性抗体并测量它们在来自22个AD和10个对照的内侧颞叶皮质的匀浆中的水平。
Bussiere，T.等(神经病理学学报(Acta Neuropathol.)97(1999)221-230)描述了Tau蛋白上磷酸化的丝氨酸422是在数种具有神经原纤维变性的疾病中发现的病理性表位。Augustinack，J.C.等，(神经病理学学报(ActaNeuropathol)103(2002)26-35)描述了pS422与阿尔茨海默病中神经元病理学的严重性相关。Guillozet-Bongaarts，A.(神经化学杂志(J.Neurochem)97(2006)1005-1014)描述了Tau在S422的磷酸化是PHFs成熟过程的一部分。也发现Tau pS422与多种阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的病理学发展相关。因此，Deters，N.等在生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)379(2009)400-405中提到双重转基因Dom5/pR5小鼠显示增加7倍数目的含有特异性磷酸化病理性S422表位的海马神经元。Goetz，J.等(科学(Science)293(2001)1491-1495)报道注射Aβ42原纤维的Tau P301L转基因小鼠脑中出现在S422磷酸化的Tau。
EP 2 009 104涉及来自阿尔茨海默病PHFs的Tau蛋白磷酸化状态中存在的Tau蛋白的表位，以及所述表位用于产生特异性检测阿尔茨海默Tau蛋白的抗体中的应用。WO 2002/062851和US 7,446,180涉及对异常截短形式的Tau蛋白具有特异性的抗体以及与阿尔茨海默病和相关Tau病有关的诊断和治疗方面。
WO 98/22120涉及治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，包括向该患者施用针对氨基酸约207至约222，氨基酸约224至约240和氨基酸约390至约408的磷酸化Tau片段的抗体的步骤。使用磷酸化Tau片段379-408[P-Ser396，404]来疫苗接种Tau转基因小鼠的动物研究在Asuni，A.A.等，神经科学杂志(J.Neuroscience)27(2007)9115-9129中提及。US 2008/0050383涉及通过施用Tau蛋白片段治疗和预防受试者中阿尔茨海默病或其它Tau病的方法。
针对Tau pS422的单克隆抗体在，例如EP 1 876 185中描述。针对TaupS422的多克隆抗体是可商购的(例如ProSci Inc.和BiosourceInternational)。
发明概述
本发明包括结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合磷酸化的Tau片段Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ ID NO：9)和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段，所述抗体应用于治疗Tau病和此类治疗方法。
本发明包括结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段，所述抗体应用于制备治疗Tau病的药物和此类制备方法。
本发明包括结合磷酸化的Tau的抗体，其特征在于特异性结合与Mab2.10.3(抗-Tau pS422抗体)所结合的表位相同的表位。
本发明包括结合磷酸化的Tau的抗体的应用，其特征在于特异性结合与Mab 2.10.3(抗-Tau pS422抗体)所结合的表位相同的表位，所述应用为用于治疗Tau病中的应用或用于制备用于治疗Tau病的药物的应用。
本发明所述的抗体特异性结合Tau pS422和聚集的(原纤维的)磷酸化的Tau。本发明所述的抗体不结合未磷酸化的Tau、SEQ ID NO：10的未磷酸化的Tau片段和SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段。
本发明所述的抗体优选是人IgG1亚型。在本发明的又一个实施方案中，本发明所述的抗体优选是人IgG4亚型。
本发明包括抗-Tau pS422抗体，其特征是包含
a)SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，和SEQ ID NO：8的CDR3H，
b)SEQ ID NO：23的CDR1H，SEQ ID NO：24的CDR2H，和SEQ IDNO：25的CDR3H，
c)SEQ ID NO：31的CDR1H，SEQ ID NO：32的CDR2H，和SEQ IDNO：33的CDR3H，
d)SEQ ID NO：39的CDR1H，SEQ ID NO：40的CDR2H，和SEQ IDNO：41的CDR3H，
e)SEQ ID NO：47的CDR1H，SEQ ID NO：48的CDR2H，和SEQ IDNO：49的CDR3H，
f)SEQ ID NO：55的CDR1H，SEQ ID NO：56的CDR2H，和SEQ IDNO：57的CDR3H，或
g)SEQ ID NO：63的CDR1H，SEQ ID NO：64的CDR2H，和SEQ IDNO：65的CDR3H。
优选地所述抗体特征是包含
a)SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：3的CDR1L，SEQ ID NO：4的CDR2L，SEQ ID NO：5的CDR3L，
b)SEQ ID NO：23的CDR1H，SEQ ID NO：24的CDR2H，和SEQ IDNO：25的CDR3H，和SEQ ID NO：27的CDR1L，SEQ ID NO：28的CDR2L，SEQ ID NO：29的CDR3L，
c)SEQ ID NO：31的CDR1H，SEQ ID NO：32的CDR2H，和SEQ IDNO：33的CDR3H，和SEQ ID NO：35的CDR1L，SEQ ID NO：36的CDR2L，SEQ ID NO：37的CDR3L，
d)SEQ ID NO：39的CDR1H，SEQ ID NO：40的CDR2H，和SEQ IDNO：41的CDR3H，和SEQ ID NO：43的CDR1L，SEQ ID NO：44的CDR2L，SEQ ID NO：45的CDR3L，
e)SEQ ID NO：47的CDR1H，SEQ ID NO：48的CDR2H，和SEQ IDNO：49的CDR3H，和SEQ ID NO：51的CDR1L，SEQ ID NO：52的CDR2L，SEQ ID NO：53的CDR3L，
f)SEQ ID NO：55的CDR1H，SEQ ID NO：56的CDR2H，和SEQ IDNO：57的CDR3H，和SEQ ID NO：59的CDR1L，SEQ ID NO：60的CDR2L，SEQ ID NO：61的CDR3L，或
g)SEQ ID NO：63的CDR1H，SEQ ID NO：64的CDR2H，和SEQ IDNO：65的CDR3H，和SEQ ID NO：67的CDR1L，SEQ ID NO：68的CDR2L，SEQ ID NO：69的CDR3L。
优选地所述抗体特征是包含
a)SEQ ID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：2的可变重链，
b)SEQ ID NO：26的可变轻链和SEQ ID NO：22的可变重链，
c)SEQ ID NO：34的可变轻链和SEQ ID NO：30的可变重链，
d)SEQ ID NO：42的可变轻链和SEQ ID NO：38的可变重链，
e)SEQ ID NO：50的可变轻链和SEQ ID NO：46的可变重链，
f)SEQ ID NO：58的可变轻链和SEQ ID NO：54的可变重链，或
g)SEQ ID NO：66的可变轻链和SEQ ID NO：62的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 2.10.3的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 2.10.3的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 2.10.3的T细胞表位缺失变体(T-cell epitope depleted variant)。Mab2.10.3的特征在于其可变链SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 005的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 005的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab005的T细胞表位缺失变体。Mab 005的特征在于其可变链SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：22。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 019的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 019的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab019的T细胞表位缺失变体。Mab 019的特征在于其可变链SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：30。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 020的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 020的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab020的T细胞表位缺失变体。Mab 020的特征在于其可变链SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：38。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 085的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 085的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab085的T细胞表位缺失变体。Mab 085的特征在于其可变链SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：46。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 086的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 086的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab086的T细胞表位缺失变体。Mab 086的特征在于其可变链SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：54。
本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 097的人源化变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab 097的嵌合变体。本发明包括抗-Tau pS422抗体Mab097的T细胞表位缺失变体。Mab 097的特征在于其可变链SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：62。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ IDNO：8的CDR3H和SEQ ID NO：3的CDR1L，SEQ ID NO：4的CDR2L，SEQID NO：5的CDR3L或SEQ ID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：2的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：23的CDR1H，SEQ ID NO：24的CDR2H，和SEQ ID NO：25的CDR3H，和SEQ ID NO：27的CDR1L，SEQ ID NO：28的CDR2L，SEQ ID NO：29的CDR3L，或SEQ ID NO：26的可变轻链和SEQ IDNO：22的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：31的CDR1H，SEQ ID NO：32的CDR2H，和SEQ ID NO：33的CDR3H，和SEQ ID NO：35的CDR1L，SEQ ID NO：36的CDR2L，SEQ ID NO：37的CDR3L或SEQ ID NO：34的可变轻链和SEQ IDNO：30的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：39的CDR1H，SEQ ID NO：40的CDR2H，和SEQ ID NO：41的CDR3H，和SEQ ID NO：43的CDR1L，SEQ ID NO：44的CDR2L，SEQ ID NO：45的CDR3L或SEQ ID NO：42的可变轻链和SEQ IDNO：38的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：47的CDR1H，SEQ ID NO：48的CDR2H，和SEQ ID NO：49的CDR3H，和SEQ ID NO：51的CDR1L，SEQ ID NO：52的CDR2L，SEQ ID NO：53的CDR3L或SEQ ID NO：50的可变轻链和SEQ IDNO：46的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：55的CDR1H，SEQ ID NO：56的CDR2H，和SEQ ID NO：57的CDR3H，和SEQ ID NO：59的CDR1L，SEQ ID NO：60的CDR2L，SEQ ID NO：61的CDR3L或SEQ ID NO：58的可变轻链和SEQ IDNO：54的可变重链。
本发明包括抗-Tau pS422抗体的嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的变体，其包含SEQ ID NO：63的CDR1H，SEQ ID NO：64的CDR2H，和SEQ ID NO：65的CDR3H，和SEQ ID NO：67的CDR1L，SEQ ID NO：68的CDR2L，SEQ ID NO：69的CDR3L或SEQ ID NO：66的可变轻链和SEQ IDNO：62的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：3的CDR1L，SEQ ID NO：4的CDR2L，SEQ ID NO：5的CDR3L或SEQ ID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：2的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：3的CDR1L，SEQ ID NO：4的CDR2L，SEQ ID NO：5的CDR3L或SEQ ID NO：1的可变轻链和SEQ ID NO：2的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：23的CDR1H，SEQ ID NO：24的CDR2H，和SEQ ID NO：25的CDR3H，和SEQ ID NO：27的CDR1L，SEQ ID NO：28的CDR2L，SEQ ID NO：29的CDR3L，或SEQ IDNO：26的可变轻链和SEQ ID NO：22的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：31的CDR1H，SEQ ID NO：32的CDR2H，和SEQ ID NO：33的CDR3H，和SEQ ID NO：35的CDR1L，SEQ ID NO：36的CDR2L，SEQ ID NO：37的CDR3L或SEQ IDNO：34的可变轻链和SEQ ID NO：30的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：39的CDR1H，SEQ ID NO：40的CDR2H，和SEQ ID NO：41的CDR3H，和SEQ ID NO：43的CDR1L，SEQ ID NO：44的CDR2L，SEQ ID NO：45的CDR3L或SEQ IDNO：42的可变轻链和SEQ ID NO：38的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：47的CDR1H，SEQ ID NO：48的CDR2H，和SEQ ID NO：49的CDR3H，和SEQ ID NO：51的CDR1L，SEQ ID NO：52的CDR2L，SEQ ID NO：53的CDR3L或SEQ IDNO：50的可变轻链和SEQ ID NO：46的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：55的CDR1H，SEQ ID NO：56的CDR2H，和SEQ ID NO：57的CDR3H，和SEQ ID NO：59的CDR1L，SEQ ID NO：60的CDR2L，SEQ ID NO：61的CDR3L或SEQ IDNO：58的可变轻链和SEQ ID NO：54的可变重链。
本发明包括对抗-Tau pS422抗体进行人源化、T细胞表位缺失或嵌合的方法，所述抗-Tau pS422抗体的特征在于包含SEQ ID NO：63的CDR1H，SEQ ID NO：64的CDR2H，和SEQ ID NO：65的CDR3H，和SEQ ID NO：67的CDR1L，SEQ ID NO：68的CDR2L，SEQ ID NO：69的CDR3L或SEQ IDNO：66的可变轻链和SEQ ID NO：62的可变重链。
优选地结合Tau pS422并且特征在于上面提及的氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗体是人IgG1亚型。优选地结合Tau pS422并且特征在于上面提及的氨基酸序列和氨基酸序列片段的抗体是人IgG4亚型。
本发明的又一个实施方案是包含本发明所述抗体的药物组合物。
本发明的又一个实施方案是本发明所述抗体用于制备药物组合物的应用。
本发明的又一个实施方案是本发明所述抗体用于制备Tau病的应用，所述Tau病选自由下列各项组成的组：阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)(包括该病的仅有缠结的形式(tangle-only form of the disease)，唐氏综合征，成人病例(Down syndrome，adult cases))，关岛型帕金森综合征痴呆复合征(Guam parkinsonism dementia complex)，拳击员痴呆(Dementiapugilistica)，皮克病(Pick disease)，具有嗜银颗粒的痴呆(Dementia withargyrophilic grains)，额颞叶痴呆(Fronto-temporal dementia)，皮质基底节变性(Cortico-basal degeneration)，苍白球脑桥黑质变性(Pallido-ponto-nigraldegeneration)，进行性核上性麻痹(Progressive supranuclear palsy)，和具有缠结的格-施-沙病(Gerstmann--Scheinker disease with tangles)。
本发明的又一个实施方案是用于制备包含本发明所述抗体的药物组合物的方法。
本发明的又一个实施方案是编码本发明所述抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸。
本发明还提供含有本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，以及提供用于重组产生此类抗体的含有此类载体的宿主细胞。
本发明还包括原核或真核宿主细胞，该宿主细胞包含本发明所述的载体。
本发明还包括用于产生本发明所述重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达本发明所述的核酸并且从所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。本发明还包括可通过此类重组方法获得的抗体。
本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau pS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段、Tau和SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对Tau的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少10,000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的MCAK片段Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala(SEQID NO：17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少100-倍的特异性结合。
优选地本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau pS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段、Tau pS422、Tau和SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对Tau的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和所述Tau pS422具有至少10,000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的MCAK片段Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala(SEQID NO：17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段具有至少100-倍的特异性结合。
优选地本发明还包括选择本发明所述单克隆抗体的方法，其特征在于提供一些结合Tau pS422的单克隆抗体，确定所述抗体与SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段、Tau pS422、Tau和SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段的结合，和选择这样的抗体，即与其对Tau的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和所述Tau pS422具有至少10,000-倍的特异性结合，和与其对磷酸化的MCAK片段Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala(SEQID NO：17)的结合相比，对所述磷酸化的Tau片段和Tau pS422具有至少100-倍的特异性结合。
本发明所述抗体显示出对于需要Tau靶向治疗的患者的益处。本发明所述抗体具有新的和创造性的性质，该性质产生对于患有Tau病(特别是AD)的患者的益处。
本发明还提供治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的方法，包括向诊断为患有此类疾病(并因而需要此类治疗)的患者施用本发明所述的结合pS422的抗体。优选地以药物组合物形式施用该抗体。
本发明还一个实施方案是治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的方法，其特征在于向患者施用本发明所述的抗体。
本发明还包括本发明所述的抗体用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的用途，以及在制备本发明所述药物组合物中的用途。此外，本发明包括制备本发明所述药物组合物的方法。
本发明还包括药物组合物，该药物组合物包含本发明所述的抗体，任选地连同在配制药用目的的抗体中有用的缓冲液和/或辅剂。
本发明还提供药物组合物，该药物组合物包含在药学上可接受载体中的本发明所述的抗体。在一个实施方案中，该药物组合物可包含于制品或试剂盒中。
本发明的抗体可通过检测磷酸化的Tau多肽用于诊断神经病学病症，诸如阿尔茨海默病。本发明的抗体也可用于特异性检测Tau pS422或聚集的磷酸化的Tau。
发明详述
本发明所述的术语“Tau”包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型F，Uniprot P10636-8)。
本发明所述的术语“磷酸化的Tau(pTau)”包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型F，Uniprot P10636-8)的磷酸化形式，其通过激酶ERK2在S422磷酸化产生。
本发明所述的术语“聚集的磷酸化的Tau”或“聚集的(原纤维的)磷酸化的Tau”包括包含441个氨基酸的人Tau的最长同种型(同种型F，UniprotP10636-8)的聚集的和磷酸化的形式，其通过激酶ERK2磷酸化聚集的Tau产生。
本发明所述的术语“Tau片段”包括Tau片段Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ IDNO：10)。
本发明所述的术语“磷酸化的Tau片段”包括磷酸化的Tau片段Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ ID NO：9)。
本发明所述的术语“MCAK”包括人有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白(驱动蛋白样蛋白KIF2C，UniProt Q99661))。MCAK_人(88-102)[95-pSer]是磷酸化的MCAK片段，由在丝氨酸95磷酸化的氨基酸88-102组成(SEQID NO：17)。这种磷酸化的MCAK片段相比于SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段没有序列同一性或相似性。发明人认识到现有技术中针对磷酸化的Tau片段的抗体可显示与不相关的磷酸化的人肽和蛋白质相当大的交叉反应性。对于本发明所述抗体，其不结合磷酸化的MCAK片段，不能检测到此类不想要的交叉反应性。
对Tau pS422的结合和对Tau的结合通过具有电化学发光读出的ELISA来研究。Tau或Tau pS422以2μg/ml的浓度固定并添加测试抗体(例如人或小鼠的抗体)。为检测结合的测试抗体，具有罗丹明标签的抗人或抗小鼠IgG分别以0.5μg/ml的浓度添加。如果在Tau pS422的最大结合信号使用Tau pS422和Tau的检测信号之间的关系是至少10,000-倍，则发现对Tau pS422的特异性结合。
通过ELISA研究对SEQ ID NO：9的磷酸化的Tau片段的结合，对SEQID NO：10的未磷酸化的Tau片段的结合，对SEQ ID NO：17的磷酸化的MCAK片段的结合。测试抗体与所述固定的磷酸化的Tau片段温育，并用于与所述固定的未磷酸化的Tau片段或MCAK片段相比较。抗体进行标记并检测所述标记。如果在磷酸化的Tau片段的最大结合信号使用磷酸化的Tau片段和未磷酸化的Tau片段的检测信号的关系是至少100，和如果在磷酸化的Tau片段的最大结合信号使用磷酸化的Tau片段和磷酸化的MCAK片段的检测信号的关系是至少100，则发现对磷酸化的Tau片段的特异性结合。
术语“Mab 2.10.3的表位”包括位于磷酸化的Tau片段Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp(SEQ ID NO：9)内的被Mab 2.10.3特异性识别的表位。本发明所述的Tau抗体的表位结合性质通过体外交叉阻断结合测定(诸如BiacoreTM体外交叉阻断结合测定)来确定，以确定Mab 2.10.3空间阻碍测试抗体对pTau的结合的能力。对于此类测定，Mab 2.10.3作为一级抗体捕获到Biacore传感器，随之顺次注射pTau和待测的二级抗体。如果二级抗体不显示任何可检测的结合信号，则二级抗体结合与Mab 2.10.3相同的表位。
本发明所述抗体以通过如上描述的BiacoreTM分析确定的5x10-8M-1至10-12M-1的亲和力结合Tau pS422。
通过Biacore分析研究对Tau pS422的原纤维聚集体的结合。对于这种测定，固定聚集的Tau pS422并且添加使用2的稀释因子且最大浓度为200nM的不同浓度的测试抗体。本发明所述抗体以0.1至30的Kd，优选地以10至20nM的Kd结合原纤维的Tau pS422。
术语“单克隆抗体或抗体”涵盖各种形式的抗体，优选为单克隆抗体，并且特别优选为IgG1或IgG4单克隆抗体。本发明所述的抗体优选地是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或进一步遗传工程化的抗体，只要保留了本发明所述的特征性性质。T细胞表位缺失抗体可使用WO 98/08097中描述的方法产生。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选为其可变结构域或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体是例如Huston，J.S.在酶学方法(Methodsin Enzymol.)203(1991)46-88中描述的抗体。另外，抗体片段包括单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域组装在一起或者具有结合Tau pS422的VL结构域的特征，即能够与VH结构域组装在一起成为功能性抗原结合位点。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中构架和/或“互补决定区”(CDR)已被修饰成包括与亲本免疫球蛋白相比具有不同种类(species)的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，
a)SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H和SEQ ID NO：3的CDR1L，SEQ ID NO：4的CDR2L，SEQ ID NO：5的CDR3L，
b)SEQ ID NO：23的CDR1H，SEQ ID NO：24的CDR2H，和SEQ IDNO：25的CDR3H，和SEQ ID NO：27的CDR1L，SEQ ID NO：28的CDR2L，SEQ ID NO：29的CDR3L，
c)SEQ ID NO：31的CDR1H，SEQ ID NO：32的CDR2H，和SEQ IDNO：33的CDR3H，和SEQ ID NO：35的CDR1L，SEQ ID NO：36的CDR2L，SEQ ID NO：37的CDR3L，
d)SEQ ID NO：39的CDR1H，SEQ ID NO：40的CDR2H，和SEQ IDNO：41的CDR3H，和SEQ ID NO：43的CDR1L，SEQ ID NO：44的CDR2L，SEQ ID NO：45的CDR3L，
e)SEQ ID NO：47的CDR1H，SEQ ID NO：48的CDR2H，和SEQ IDNO：49的CDR3H，和SEQ ID NO：51的CDR1L，SEQ ID NO：52的CDR2L，SEQ ID NO：53的CDR3L，
f)SEQ ID NO：55的CDR1H，SEQ ID NO：56的CDR2H，和SEQ IDNO：57的CDR3H，和SEQ ID NO：59的CDR1L，SEQ ID NO：60的CDR2L，SEQ ID NO：61的CDR3L，或
g)SEQ ID NO：63的CDR1H，SEQ ID NO：64的CDR2H，和SEQ IDNO：65的CDR3H，和SEQ ID NO：67的CDR1L，SEQ ID NO：68的CDR2L，SEQ ID NO：69的CDR3L
被移植到人抗体的构架区，以制备“人源化抗体”。参见，例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。
“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)，重链可变结构域(VH))，当用于本发明时，指每对轻链和重链结构域的每个结构域，其直接参与抗体与抗原的结合。轻链和重链的可变结构域具有相同的通用结构，并且每个结构域包括序列是广泛保守的4个构架(FR)区，其由3个“高可变区”(或互补决定区，CDR)连接。所述构架区采用β-折叠构象，并且所述CDR可以形成连接所述β-折叠结构的环。在每条链中的CDR通过构架区保持在它们的三维结构中，并且与另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和性中起着特别重要的作用，并且因此提供本发明的另一个目的。
术语“抗体的抗原-结合部分”，当用于本发明时，是指抗体负责抗原-结合的氨基酸残基。抗体的抗原-结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除超变区残基之外的那些可变结构域区域，如本文所定义的。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域，并且限定所述抗体的性质。CDR和FR区按照Kabat等，免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，公共健康服务(Public Health Service)，美国全国卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或来自于“高变环”的那些残基来确定。
术语“CDR1H”是指根据Kabat计算的重链可变区的CDR1区。CDR2L，CDR3H等意思是来自重链(H)或轻链(L)的各自的区域。例如，其特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H的抗体意思是所述抗体在其可变重链中包含作为重链可变链CDR1区的这种氨基酸序列。例如，其特征在于包含SEQ ID NO：6的CDR1H，SEQ ID NO：7的CDR2H，SEQ ID NO：8的CDR3H的抗体意思是所述抗体在其重链中包含作为CDR1的序列SEQ IDNO：6，作为CDR2的序列SEQ ID NO：7和作为CDR3的序列SEQ ID NO：8。
用于本文时，术语“核酸”或“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选地是双链的DNA。
当在本申请中应用时，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母符号：ala，单字母符号：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
当核酸置于与另外的核酸的功能性关联中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，其可操作地与编码序列连接；或如果将核糖体结合部位定位以促进翻译，其可操作地与编码序列连接。通常，“可操作地连接”意味着连接的DNA序列是在同一直线上的，并且在分泌前导区的情况中，是连续的，并且在阅读框中。但是，增强子不一定是连续的。通过在适宜限制性位点的连接反应来完成连接。如果这些位点不存在，依照常规惯例，使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。
用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以交换使用，并且所有这些命名都包括后代。因而，单词“转化子”和“经转化的细胞”包括原代所述细胞及源于它的培养物，不考虑转移的次数。还理解由于有意或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上并不精确相同。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的不同后代。
抗体的“Fc部分”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是技术人员熟知的术语并基于木瓜蛋白酶切割抗体进行定义。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成下列种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成亚类(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1与IgA2。按照重链恒定区，不同种类的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、γ和μ。本发明所述的抗体优选地包括人来源的IgG1或IgG4亚型的Fc部分。
人恒定轻链和重链和IgG1或IgG4亚型恒定链是本领域熟知的，并且例如被Kabat(参见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)28(2000)214-218)描述。例如，有用的人重链恒定区包含氨基酸序列SEQ ID NO：13或14(IgG1)或SEQ ID NO：15或16(IgG4)。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO：11的κ轻链恒定区的氨基酸序列。还优选的是所述抗体是小鼠来源并且包含根据Kabat(参见例如，免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，Kabat，E.A.等，第五版(5th edition)，DIANE Publishing(1992))的小鼠抗体的抗体可变序列框架。
本发明包括用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用本发明所述抗体。
本发明包括本发明所述抗体用于治疗的应用。
本发明包括本发明所述抗体用于制备治疗Tau病(特别是AD)的药物的应用。
本发明包括本发明所述抗体用于治疗脑病，优选地用于治疗Tau病(特别是AD)的应用。
本发明又一个实施方案是产生本发明所述的抗体的方法，其特征在于编码本发明所述抗体重链的核酸序列和编码所述抗体轻链的核酸插入到一个或两个表达载体，所述载体插入到真核宿主细胞，所编码的抗体被表达并从该宿主细胞或上清液回收。
本发明所述的抗体优选地通过重组方法产生。此类方法在本领域内是众所周知的并且包括在原核细胞和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽并且通常纯化至可药用的纯度。为了表达蛋白质，通过标准方法将编码重链和轻链或其片段的核酸插至表达载体内。在适宜的原核宿主细胞或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞内进行表达，并且从细胞(从上清液或细胞裂解后)回收抗体。
抗体的重组生成，例如，记述在综述文章Makrides，S.C.，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)17(1999)183-202；Geisse，S.等，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-160；Werner，R.G.，等，药物研究(Drug Res.)48(1998)870-880中。
抗体可以存在于完整细胞、细胞裂解产物中或以部分纯化或基本纯形式存在。通过标准技术(参见Ausubel，F.等，编辑，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing and WileyInterscience，纽约(1987))进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。
在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.等，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.等，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.等，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；Norderhaug，L.等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲合层析法，从培养基中适当分离单克隆抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以起所述DNA和RNA来源的作用。一旦分离后，可以将DNA插入到表达载体中，所述表达载体随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
通过本领域内所知的多种方法制备了编码抗-pS422抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体情况下)或通过对较早制备的人源化抗-pS422抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或位点定向的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变制备。
本发明所述的重链和轻链可变结构域与启动子、翻译起始、恒定区、3′非翻译区、多腺苷酸化和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合成单个载体、共转染、顺次转染或单独转染进入宿主细胞，然后其融合以形成表达两条链的单个宿主细胞。
另一方面，本发明提供一种组合物(例如药物组合物)，其含有一种本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分或其组合，与药学上可接受的载体配制在一起。
用于本文时，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于注射或输注。
可以通过许多本领域已知的各种方法施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。
药学上可接受的载体包括用于制备无菌可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。这些介质和试剂用于药学上可接受的活性物质的应用为本领域所知。除了水，载体可以是例如等渗的缓冲盐溶液。
无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药学上可接受的剂型。
对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得对特定患者、组合物、和施用模式有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量(有效量)。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，与所用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史等医学领域众所周知的类似因素。
本发明包括本发明所述的抗体用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的用途。
本发明还包括通过向患者施用本发明所述的抗体来治疗患有此类疾病的患者的方法。
本发明还提供制备药物组合物的方法，该组合物包括本发明所述的抗体以及药学上可接受的载体，提供用于此类方法的本发明所述的抗体的用途。
本发明还提供本发明所述的抗体在制备用于治疗患有Tau病(特别是AD)的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。
本发明还提供本发明所述的抗体在制备用于治疗患有癌症(特别是Tau病，特别是AD)的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。
提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其真正的范围在后附的权利要求中设定。应该理解，在不背离本发明的精神的条件下，可以在描述的方法中进行修改。
序列表的描述
SEQ ID NO：1    Mab 2.10.3的可变轻链
SEQ ID NO：2    Mab 2.10.3的可变重链
SEQ ID NO：3    CDR1L
SEQ ID NO：4    CDR2L
SEQ ID NO：5    CDR3L
SEQ ID NO：6    CDR1H
SEQ ID NO：7    CDR2H
SEQ ID NO：8    CDR3H
SEQ ID NO：9    磷酸化的Tau片段
SEQ ID NO：10   未磷酸化的SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：11   人κ轻链恒定区
SEQ ID NO：12   人λ轻链恒定区
SEQ ID NO：13   人γ1(同种异型G1m1，17)恒定区
SEQ ID NO：14   人γ1(同种异型G1m17)恒定区
SEQ ID NO：15   人IgG4恒定区
SEQ ID NO：16   人IgG4SPLE-突变的恒定区
SEQ ID NO：17   磷酸化的MCAK片段(MCAK_人(88-102)[95-pSer]
SEQ ID NO：18   引物
SEQ ID NO：19   引物
SEQ ID NO：20   引物
SEQ ID NO：21   引物
SEQ ID NO：22   Mab 005的可变重链
SEQ ID NO：23   CDRH1
SEQ ID NO：24   CDRH2
SEQ ID NO：25   CDRH3
SEQ ID NO：26   Mab 005的可变轻链
SEQ ID NO：27   CDRL1
SEQ ID NO：28   CDRL2
SEQ ID NO：29   CDRL3
SEQ ID NO：30   Mab 019的可变重链
SEQ ID NO：31   CDRH1
SEQ ID NO：32   CDRH2
SEQ ID NO：33   CDRH3
SEQ ID NO：34   Mab 019的可变轻链
SEQ ID NO：35   CDRL1
SEQ ID NO：36   CDRL2
SEQ ID NO：37   CDRL3
SEQ ID NO：38   Mab 020的可变重链
SEQ ID NO：39   CDRH1
SEQ ID NO：40   CDRH2
SEQ ID NO：41   CDRH3
SEQ ID NO：42   Mab 020的可变轻链
SEQ ID NO：43   CDRL1
SEQ ID NO：44   CDRL2
SEQ ID NO：45   CDRL3
SEQ ID NO：46   Mab 085的可变重链
SEQ ID NO：47   CDRH1
SEQ ID NO：48   CDRH2
SEQ ID NO：49   CDRH3
SEQ ID NO：50   Mab 085的可变轻链
SEQ ID NO：51   CDRL1
SEQ ID NO：52   CDRL2
SEQ ID NO：53   CDRL3
SEQ ID NO：54   Mab 086的可变重链
SEQ ID NO：55   CDRH1
SEQ ID NO：56   CDRH2
SEQ ID NO：57   CDRH3
SEQ ID NO：58   Mab 086的可变轻链
SEQ ID NO：59   CDRL1
SEQ ID NO：60   CDRL2
SEQ ID NO：61   CDRL3
SEQ ID NO：62   Mab 097的可变重链
SEQ ID NO：63   CDRH1
SEQ ID NO：64   CDRH2
SEQ ID NO：65   CDRH3
SEQ ID NO：66   Mab 097的可变轻链
SEQ ID NO：67   CDRL1
SEQ ID NO：68   CDRL2
SEQ ID NO：69   CDRL3
SEQ ID NO：70   兔免疫球蛋白恒定区(κ)
SEQ ID NO：71   兔免疫球蛋白恒定区(γ)
SEQ ID NO：72   小鼠免疫球蛋白恒定区(κ)
SEQ ID NO：73   小鼠免疫球蛋白恒定区(γ)
附图的描述
图1：在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后pS422 IgG1的脑内定位。用多色荧光染色的共聚焦显微照片显示结合的IgG1(A)和pTau(B)与用于细胞核的DAPI(C)一起沉积，所述染色用缀合Alexa488的针对IgG1的一级抗体和缀合Alexa555的抗pTau抗体AT8进行。合并图片显示在一些pTau阳性细胞中抗IgG1和pTau的共定位染色(D)。
图2：在TauPS2APP小鼠模型中IgG1的脑内定位的赋形剂对照。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示海马结构的CA1区的概况。用缀合Alexa488的针对IgG1的一级抗体的多色染色是阴性的(A)。缀合Alexa555的抗-pTau抗体AT8显示pTau沉积(B)。DAPI染色细胞核(C)。合并图片显示于(D)。在注射赋形剂后的TauPS2APP小鼠中没有观察到可见的抗IgG1免疫荧光。
图3：在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgG1的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在额前皮质内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgG1的一级抗体和缀合Alexa555的抗p-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgG1(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与蓝色的细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgG1和pTau的核周和树状染色(C)。
图4：在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgG1的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在海马的CA1区域的锥体层内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgG1的一级抗体和缀合Alexa555的抗p-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgG1(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgG1和pTau的核周和树状染色(C)。
图5：在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgG2a的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在海马的CA1区域的锥体层内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgG2a的一级抗体和缀合Alexa555的抗p-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgG2a(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示与细胞核的DAPI染色一起共定位的抗-IgG2a和pTau的核周染色(C)。
图6：在TauPS2APP小鼠模型中ip施用后IgG2b的脑内定位。TauPS2APP脑切片的多色荧光染色之后的共聚焦显微照片显示在额前皮质区域内的阳性标记的细胞。缀合Alexa488的针对IgG2b的一级抗体和缀合Alexa555的抗p-Tau抗体AT8的多色染色显示结合的IgG2b(A)和pTau沉积(B)。合并的图片显示共定位的抗-IgG2b和pTau的核周染色，通过箭头标示(C)。
图7：TauPS2APP小鼠的分析。A：16月龄TauPS2APP小鼠矢状脑切片的Gallyas银染色。可见黑色的典型缠结样神经元内结构并且确认了通过免疫荧光显微镜揭示的pTau阳性神经元。B：16月龄TauPS2APP小鼠免疫金标记的超薄切片。如通过缀合10nm胶体金的二级抗体所揭示的(箭头)，抗-Tau pS422mAb特异性结合海马CA1区的树状突的原纤维结构。标记的原纤维的大小和密度表明它们可与在阿尔茨海默病的变性神经元中发现的磷酸化的Tau蛋白的配对螺旋丝相比较。
图8：抗-Tau pS422抗体对AD脑切片的体外结合。用标示浓度的抗-Tau pS422单克隆抗体(克隆2.10.3，2.20.4和5.6.11)染色人皮质AD脑切片后的荧光显微照片显示阳性标记的pTau沉积。细胞内pTau沉积，像大的神经原纤维缠结和延伸的神经纤维网线是显著的。
图9：与Tau相比抗-Tau pS422抗体对Tau pS422的选择性。使用Tau(▲)或Tau pS422(●)包被的板通过ELISA测量抗-Tau pS422抗体的选择性。作为参照，Tau-选择性抗体4/2显示于顶部左手组图中。
图10：体外聚集的Tau是原纤维的。电子显微照片显示负性染色的聚集的Tau。
图11：用抗-Tau pS422兔单克隆抗体Mab 005(第一行)，Mab 019(第二行)，Mab 020(第三行)，Mab 085(第四行)，Mab 086(第五行)和Mab097(第六行)染色的人皮质AD脑切片的荧光显微照片显示阳性标记的pTau沉积和细丝。系列稀释的IgGs显示于每排中，起始于2.0μg/ml(左)，0.4μg/ml，0.08μg/ml和0.016μg/ml。
实施例1
制备和纯化抗体
a)抗体产生
小鼠用SEQ ID NO：9(Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp)的Tau片段免疫，该片段对应于Tau的最长人同种型的氨基酸416-430。为了允许通过硫醇直接偶联至KLH，N端添加半胱氨酸至Tau片段。随后的免疫方案、融合和克隆和筛选抗-TaupS422特异性抗体描述于EP 1 876 185。
b)纯化克隆2.10.3，2.20.4和5.6.11
无细胞杂交瘤培养上清液(250-300ml)装载于25ml MEP Hypercell柱(pall Biosciences)上，柱用50mM TrisCl pH8.0平衡。用平衡缓冲液洗涤后，抗体用30mM柠檬酸钠，100mM NaCl pH4.1洗脱。汇集含抗体的级分，然后在Spectra-Por 6-8000透析管中针对5升10mM TrisCl pH8.0在4℃透析过夜。透析过的材料装载于10ml Source 17Q柱(GE Healthcare)上，柱用10mM TrisCl pH8.0(缓冲液A)平衡。用缓冲液A洗涤后，抗体用10倍柱体积的梯度0-25％的缓冲液B洗脱。缓冲液B含有10mM TrisCl，1MNaCl pH8.0。抗体以约200mMNaCl洗脱。单个级分的纯度通过SDS-PAGE检查并且汇集最纯的级分。
在注射至小鼠中的前一天，每种抗体针对PBS透析并且将抗体浓度调整至3.2mg/ml。
实施例2
制备Tau，Tau pS422，聚集的Tau和聚集的Tau pS422
含有N端(His)6-SUMO融合标签的Tau在大肠杆菌(E.coli)中表达并且通过在HiTrapQ(GE Healthcare，瑞士)上的离子交换层析、随之通过在Ni-NTA Sepharose(Qiagen，瑞士)上的亲和层析纯化。融合标签随后通过用SUMO蛋白酶(Invitrogen，荷兰)消化裂解，随之通过第二次Ni-NTASepharose层析步骤去除融合标签。
Tau-pSer422通过将Tau与ERK2蛋白激酶一起温育来制备。选择ERK2∶Tau(ca∶1∶10)的摩尔比通过在37℃在含有1mM MgCl2和2mM ATP的10mM TrisCl pH8.0中温育过夜以产生在S422的最大磷酸化。然后推定这代表在422位点的化学计量磷酸化。通过蛋白质印迹使用特异于Tau中的pS422的内部单克隆抗体检查磷酸化。
聚集的(原纤维的)Tau通过温育含有50μM的花生四烯酸(Sigma，瑞士)的10mM TrisCl pH8.0中终浓度5μM的纯化的Tau来制备。温育在37℃进行16h。聚集状态通过在存在10μM Thio S时的荧光光谱法(Barghorn和Mandelkow[2002]生物化学(Biochemistry)41：14885-14896)和通过电子显微镜(图10)进行检查。如图10所示，聚集的Tau具有原纤维外观。聚集的磷酸化的Tau通过如上所述与ERK2激酶一起温育预-聚集的Tau来制备。
实施例3
抗-Tau pS422单克隆抗体对在S422磷酸化的Tau是高度选择性的
a)肽合成
肽合成在自动肽合成仪上使用Fmoc化学进行。在重复循环中，肽序列通过顺次偶联相应的Fmoc-氨基酸组装。在每个偶联步骤中，N端Fmoc-基团通过用N-甲基吡咯烷酮中的20％哌啶处理处理树脂来去除。偶联使用通过DMF中HBTU/HOBt(各1mmol)和DIPEA(2mmol)活化的Fmoc-保护的氨基酸(1mmol)来进行。每个偶联步骤后，未反应的氨基通过用NMP中的乙酸(0.5M)，DIPEA(0.125M)和HOBt(0.015M)混合物处理(10min震荡)来封端。各个步骤之间，树脂用N-甲基吡咯烷酮和DMF洗涤。空间阻碍氨基酸的并入通过自动双偶联完成。为此目的，树脂用1mmol活化的结构单元处理两次，在偶联循环之间不进行封端步骤。在磷酸化肽序列中相应的丝氨酸衍生物作为Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH结构单元并入。完成靶序列时，使用标准氨基酸偶联条件将Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH(经PEG-间隔臂附着的生物素)偶联至MCAK肽，而4xβ-丙氨酸(U)和1xε-赖氨酸使用标准条件附着至磷酸-Tau序列。随后，DMTr-生物素缀合至磷酸-Tau肽，产生生物素化的靶序列。在最后Fmoc去保护(仅对MCAK)之后，所有肽树脂单独放置于过滤器玻璃料中并用三氟乙酸、水和三异丙基硅烷(19mL∶0.5mL∶0.5mL)的混合物处理2.5h。过滤裂解溶液并且通过添加冷的(0℃)二异丙醚(300mL)沉淀肽以提供无色固体，其用二异丙醚重复洗涤。粗制品重溶解于乙酸/水混合物中，冻干并且随后通过制备级反相HPLC使用含有0.1％TFA的乙腈/水梯度纯化。
HBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：羟基苯并三唑
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮
b)用磷酸化的Tau肽的测定
合成并生物素化代表Tau pS422序列416-430(磷酸化的和未磷酸化的)和MCAK_人(88-102)[95-pSer]的肽以允许包被至链霉抗生物素蛋白标记的微量滴定板。为了测试Tau磷酸肽对测定板的最大结合，范围在1ng/ml至2000ng/ml的不同浓度的Tau磷酸肽，用于包被。最后50ng/ml Tau磷酸肽用于在室温包被60min。抗Tau pS422抗体2.10.3.，2.20.4.和5.6.11以至多1000ng/ml的浓度在肽标记的微量滴定板中温育60min。洗涤后，抗体的结合使用抗小鼠-IgG Fc抗体(其是POD标记的)来检测。与在室温温育20min后，测量在405nm-492nm的吸光度(O.D.)。抗体结合通过EC50确定。可以确定的典型的EC50值范围对于2.10.3.是100ng/ml，对于2.20.4.是8ng/ml，和对于5.6.11.是1ng/ml。未磷酸化的Tau片段和(MCAK_人(88-102)[95-pSer])用作对照。不能观察到对照肽的结合。典型的背景值是大约30mE(表1)，其是用磷酸化的Tau片段测量的最大值的大约1％。因此，相比于SEQ ID NO：10的未磷酸化的Tau肽和MCAK_人(88-102)[95-pSer]，Mab 2.10.3以至少100倍的选择性结合磷酸化的Tau片段。结果显示于表1。
表1：
c)用全长Tau和Tau pS422的测定
测定使用Meso Scale DiscoveryTM测定平台(MSD，Gaithersburg，Maryland，USAMD)进行。MSD 96-孔微量滴定板用PBS缓冲液中浓度为2μg/ml的Tau或Tau pS422在室温包被1h。然后通过添加含有5％BSA和1％Tween 20的PBS封闭1h。抗体用含有0.1％BSA和0.1％20的低交叉缓冲液(Low Cross Buffer，MSD)以浓度30pg/ml至20ng/ml(除了克隆2.10.3，其浓度范围是3ng/ml至250ng/ml)进行稀释并且添加至包被的封闭的板并且在室温温育3小时。然后用含有1％Tween的PBS缓冲液洗涤板三次。为了检测结合的抗体，添加浓度0.5μg/ml的具有SULFO标签的抗小鼠IgG(MSD)，并且在室温温育板1小时。添加读数缓冲液(MSD)后，板在MSD Sector Imager 6000板读数器中读数。图9显示使用Tau或Tau pS422作为抗-Tau pS422单克隆抗体(克隆5.6.11，2.20.4和2.10.3)的结合配偶体获得的数据。Tau pS422抗体相对于识别Tau和Tau pS422两者的抗-Tau抗体(克隆4/2)进行比较。通过比较对Tau pS422和Tau的结合，发现对Tau的结合的信号不能从背景中区分，因此没有检测到对Tau的结合。因此，据计算三种抗-Tau pS422抗体中的每种以相比于Tau的至少10,000-倍的选择性结合Tau pS422。
实施例4
抗-Tau pS422抗体结合Tau pS422的原纤维聚集体
BiacoreTM分析用于测量抗-Tau pS422(克隆2.10.3)对聚集的原纤维的Tau pS422制品的结合。磷酸化的原纤维被认为体外代表存在于阿尔茨海默病脑的Tau的PHF形式。如实施例2中的描述制备和磷酸化原纤维材料。
在传感器芯片上固定：
聚集的Tau pS422通过胺偶联固定于CM5-传感器芯片上。为了该目的，聚集的Tau pS422在10mM乙酸钠pH 5.0中稀释19倍。活化的传感器表面与蛋白溶液接触直至期望水平的蛋白固定于芯片上。然后剩余的反应性N-羟基琥珀酰亚胺-酯通过注射1M乙醇胺pH 8.0封闭。固定450反应单位(RU)的蛋白质以便表征抗-Tau pS422(克隆2.10.3)的结合性质。固定测定在RT进行并且用PBS用作运行缓冲液。
动力学滴定：
为表征抗体，运行缓冲液改变为10mM Tris-Cl pH 8.0，250mM NaCl，并且制备浓度系列的抗体：5种不同浓度，稀释因子2，最大浓度200nM。不同抗体溶液以最低浓度开始连续注射。在所谓的动力学滴定后用100mM H3PO4再生传感器表面。测量进行三次。
数据评价使用Biaeval软件进行。参数计算基于以下假定：抗体聚集的Tau pS422的结合是完全单价的。表征抗体对固定蛋白的结合行为的动力学和热动力学参数显示于表2。
表2：
KD        kd         Ka         Rmax
nM        s-1        Mxs        RU
17.0      1x10-2     6.2x105    208
因此抗-Tau pS422(克隆2.10.3)以17nM的KD结合原纤维的磷酸Tau。
实施例5
抗-Tau pS422单克隆抗体对来自阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的体外结合。
在阿尔茨海默病脑组织中特异性和灵敏性免疫装饰(immunodecoration)病理学相关pTau病理学通过免疫组织化学染色实验使用来自AD患者人脑组织的低温切片(cryosections)进行研究。使用来自神经病理学分期为Braak VI的AD患者的冰冻死后脑组织进行评估。脑组织进行低温切片并免疫组织化学处理，不用任何化学剂即乙醛固定。pTau沉积的检测使用荧光标记的特异于小鼠IgG的二级抗体进行并且通过荧光光学显微镜进行监测。
简言之，来自阿尔茨海默病阳性诊断的患者死后获得的皮质脑区域的未固定的低温恒温切片通过间接免疫荧光标记。在本报告中显示了来自AD患者(病例01-05；内部脑库)的眼眶额回组织获得的图片。使用连续的两步温育来检测来自不同克隆的结合的鼠抗体，其通过亲和-纯化的缀合至Cy3的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Jackson Immuno Research)显示。切片、染色和荧光显微镜检查根据标准程序进行。
pTau病理学的特异性和灵敏性染色对于克隆2.10.3，2.20.4和5.6.11是明显的(图8)。所有类型的pTau沉积，即神经原纤维缠结、神经纤维网线和营养不良的轴突的一致染色是清晰可见的。对于所有研究的克隆，最小有效浓度0.05μg/ml被确定，其表明对真正人pTau沉积的高度灵敏的结合。
pTau沉积的检测也可通过使用本发明所述的IgG4抗体和特异于人IgG4的荧光标记二级抗体来进行并且通过荧光光学显微镜监测。
实施例6
产生TauPS2APP三重转基因小鼠
转基因TauPS2APP小鼠通过将来自于品系B6.172H(Ozmen，L.等，神经变性疾病(Neurodegen.Dis.)6(2009)29-36)的纯合PS2APP雌性与来自于品系TauP301L(Goetz等，科学(Science)293(2001)1491-1495)的纯合Tau雄性杂交而产生。产生的转基因小鼠对于人APP Swedish突变，人Presenilin 2 N141I突变和人Tau P301L突变均是杂合的。转基因的表达在人APP和Tau转基因的情况中通过鼠Thy-1启动子驱动，在人Presenilin 2转基因的情况中通过朊病毒(prion)启动子驱动。
动物以12小时光暗周期圈养并无限制地提供食物和水。圈养条件经过实验动物护理评审委员会(Accreditation of Laboratory Animal Care)认可。所有程序严格遵守瑞士联邦动物保护条例和实验动物评估和评审协会的规章并且经过当地兽医机构的明确批准。
小鼠免疫组织化学分析的处理：小鼠使用4％异氟烷麻醉并通过斩首处死。血液收集在EDTANaF包被的管(Milian)中。取出脑，立即在干冰上冰冻并且储存在-80℃直至进一步使用。
20月龄的雄性和雌性小鼠用于实验中。在该年龄，在迄今测试的来自所有小鼠的脑中增强的细胞内超磷酸化的Tau积累和神经原纤维病理学是明显的。
实施例7
TauPS2APP小鼠模型中pTau沉积的组织和超微结构分析
TauPS2APP小鼠发生神经元内pTau沉积的年龄依赖性和进行性表型，该沉积具有类似于在数个脑区域中可检测的神经原纤维缠结的结构。在24月龄观察到大量的pTau病理学。典型地在额前皮质和海马CA1区和下脚(subiculum)附近的锥体细胞层内发现数个细胞内Tau pS422阳性的神经元。发现在这一年龄pTau扩展到起层并且沿着海马白质边界进入CA3和伞区并且也进入纹(stria)。
Gallyas银染色如描述(Gallyas，F.，Acta Morphologica Acad.Sci.Hung.19(1971)1-8)进行，具有小的改进，即在3％的高碘酸中预温育并且在0.5％的乙酸洗涤后另外在5％硫代硫酸钠中洗涤2分钟。复染法用标准的苏木素和伊红进行。Gallyas银染色确认在TauPS2APP小鼠的海马和皮质中存在许多缠结样沉积(图7A)。
pTau沉积的超微结构通过免疫电子显微镜研究。16月龄的TauPS2APP小鼠用PBS中的2％甲醛和0.5％戊二醛灌注。脑薄片包埋入Lowicryl HM20中并且如以前的描述(Richards，J.G.等，神经科学杂志(J.Neurosci.)23(2003)8989-9003)制备超薄切片。简言之，切片与具有2％BSA的PBS中10μg/ml的抗-Tau pS422温育1小时。在PBS/2％BSA中6次洗涤后，切片与缀合至10nm金的二级山羊抗-小鼠IgG(Amersham，Arlington Heights，IL)以1∶20与PBS/2％BSA/0.1％20温育1小时并且用2％BSA的PBS溶液洗涤。对于对照，我们使用正常小鼠血清处理的切片，其在10μm2的面积中产生可忽略的低于10个金颗粒的背景。电子显微照片用JEOL1210在100kV采集。
对16月龄的TauPS2APP小鼠具有许多pTau阳性神经元的海马超微结构检查揭示了对于树状突中配对螺旋丝(PHF)典型的免疫金标记的原纤维沉积(图7B)。用抗-Tau pS422 mAb标记的超薄切片揭示了对海马CA1区中树状突内的原纤维结构的特异性结合，如通过缀合10nm胶体金的二级抗体所揭示的，其作为黑点可见(图7B)。免疫金标记证明Tau的pS422表位定位于所研究的TauPS2APP小鼠的神经元中的细胞内原纤维结构。标记原纤维的尺寸和密度表明它们在结构上可与AD患者变性神经元中观察到的PHFs相比较。pTau PHF的定位清楚地证明转基因TauPS2APP小鼠中聚集的pTau沉积的细胞内分布。
实施例8
通过免疫组织化学和共聚焦激光扫描显微镜揭示的抗-Tau pS422单克隆抗体对阿尔茨海默病pTau小鼠模型脑中细胞内pTau的体内结合
选择的抗-Tau pS422抗体(表1)在24月龄的TauPS2APP三重转基因小鼠中测试，并且评估对于体内pTau沉积的结合。研究在TauPS2APP小鼠模型中进行，该模型发生具有神经元内pTau沉积的年龄依赖性和进行性表型，该沉积包括类似于在数个脑区域中可检测的神经原纤维缠结(如实施例4中所述)的结构。
所用的针对Tau pS422的抗体以20mg/kg的剂量i.p.施用。ip施用后两天进行免疫组织化学染色以检测pTau沉积和结合的小鼠IgG亚型抗体。给药后两天杀死每三只小鼠的组。小鼠被深麻醉(在5％v/v ForeneTM中～2分钟，直至几乎达到窒息状态)，然后开胸并去除心包，并且用PBS灌注且斩首，将脑分成两半，迅速冰冻在干冰中。新鲜冰冻脑的矢状低温恒温切片用低温恒温切片机(CM3050S，Leica)切成20μm厚度，封固于预冷的Histobond载玻片(Marienfeld，Lauda-德国)上并且保存于-20℃。
应用三重免疫荧光染色以检测结合的抗-Tau pS422抗体。切片在PBS中水合并用预冷至-20℃的100％丙酮处理2分钟。所有进一步的步骤在染色自动装置(Autostainer Plus DakoCytomation，High Wycombe，UK)在室温顺次进行。带有脑切片的载玻片用含有0.01％Tween 20的PBS，pH 7.4洗涤5分钟，并且通过在含有1％牛血清白蛋白，1％卵白蛋白和1％正常山羊血清的PBS中顺次温育20分钟封闭非特异性结合位点。用PBS和0.01％Tween 20洗涤后，载玻片与20ug/ml的IgG同种型特异性检测抗体一起在1％BSA的PBS pH 7.4溶液中温育1小时，所述抗体即亲和纯化的山羊抗小鼠IgG1，IgG2a或IgG2b，其共价缀合至Alexa488染料(A21121，A21131或A21141，Molecular Probes)。在用含0.01％Tween 20的PBS洗涤后，pTau的定位如下评估：通过用5ug/ml的抗pTau抗体(AT-8，PierceBiotechnology)标记，该抗体是针对Tau蛋白中磷酸化的S202/205表位的鼠单克隆抗体，其共价缀合至Alexa Fluor 555染料并应用于含有1％牛血清白蛋白，1％卵白蛋白和1％正常山羊血清的PBS中1小时。用含0.01％Tween 20的PBS洗涤后，细胞核在1ug/ml的4，6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS溶液中复染5分钟。在含有0.01％20的PBS中洗涤后，脂褐质的自发荧光经过在4mM CuSO4于50mM乙酸铵pH 5中温育30分钟通过淬灭来降低。用双蒸水淋洗载玻片和用PBS和0.01％20最后洗涤后，载玻片用荧光封固剂(S3023 DakoCytomation，High Wycombe，UK)包埋。最大投影图片在非重叠发射通道顺次记录，记录用Leica SP2，AOBS共聚焦激光扫描显微镜在1艾里(Airy)的针孔设置下进行。
在24月龄的TauPS2APP小鼠中注意到大量pTau病理学。典型地，对于细胞内Tau pS422强阳性的数个神经元发现处于额前皮质和海马CA1区和邻近下脚的锥体细胞层。在这一年龄，发现pTau扩展到起层并且沿着海马槽边界进入CA3和伞区并且也进入终纹(stria terminalis)。
来自24月龄的TauPS2APP小鼠额前皮质和海马结构的CA1区的免疫染色显示于共聚焦显微镜图片(图1-6)中。清楚地，细胞内pTau和施用的IgG亚型抗体是可检测的，并且发现共定位于具有大量pTau病理学的脑区域中的细胞。细胞内IgG1定位的代表性实例显示于图1，3和4中，有赋形剂对照(图2)。IgG2a阳性细胞(图5)和IgG2b(图6)也在一些细胞中发现。一些pTau阳性细胞显示典型的神经原纤维形态学，其提示在来自AD的患者脑组织的变性神经元中发现的神经原纤维缠结。小鼠IgG亚型抗体(特别是对于IgG1和pTau的)共定位的免疫反应性在树状突中观察到，典型地在额前皮质和海马结构的CA1区的颗粒细胞层(图3和4)。
所有测试的抗-Tau pS422抗体显示对细胞内pTau沉积的特异性结合。然而，结合的程度在三种IgG同种型之间不同，如表3中所示。
表3：
其中X＝轻度，XX＝中度，和XXX＝强IHC反应性
实施例9
在阿尔茨海默病小鼠模型中用抗-Tau pS422单克隆抗体慢性治疗减少Tau病理学
鼠抗-Tau pS422Mab在阿尔茨海默病小鼠模型中减少Tau病理学的能力通过在4个月的期间施用所述抗体至Tau.PS2APP三重转基因小鼠来测试。因此，一组7月龄的20只Tau.PS2APP三转基重因小鼠通过每周一次ip施用鼠抗-Tau pS422Mab(克隆2.10.3)处理。抗体以赋形剂(20mM组氨酸，140mM NaCl pH6.0)中2mg/ml的浓度施用至给予终剂量20mg/kg。第二组20只三重转基因小鼠接受等同体积的赋形剂。4个月后杀死所有小鼠并如实施例5中所述取出脑。然后每个脑分成两个半球，其中一个制备用于如实施例5所述的免疫组织化学分析。第二个半球用于通过下述的免疫测定来定量pTau水平。
1.提取小鼠脑用于Tau和pTau测定
称重脑并用玻璃匀浆器在10体积的含有25mM TrisCl，800mM NaCl，10％蔗糖pH7.5的冰冷缓冲液中匀浆。然后匀浆在20,000x g离心。产生的上清液用PBS/1％BSA/1％20以1∶100(对于Tau测定)或1∶10(对于pTau测定)稀释。
2.Tau和pTau测定
所有测定使用Meso Scale Discovery测定平台(MSD，Gaithersburg，Maryland，USAMD)进行。捕获和检测抗体根据MSD提供的标准方案分别用生物素和SULFO-TagTM标记。在测定中使用下述抗体：(i)5A6，针对Tau中氨基酸19-46的鼠抗体，如Johnson，G.V.等，神经化学杂志(J.Neurochem)68(1997)430-433中所述；(ii)AT180，针对Tau中pT231检测的鼠抗体[Innogenetics，Belgium]；(iii)如EP1876185A1中描述的鼠抗-Tau pS422克隆2.5.2；(iv)针对全长Tau产生的鼠抗-Tau克隆4/53。抗体5A6用作捕获抗体，其余抗体用作检测抗体。
链霉抗生物素蛋白包被的96孔MSD板在RT用5％BSA封闭1小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.05％20)洗涤板三次。然后添加在测定缓冲液(PBS/1％BSA/1％20)中稀释的捕获抗体，在4℃温育板30分钟。随后洗涤板一次。接着，向每个孔添加75μl的测定缓冲液，随之添加25μl稀释的脑上清液和25μl具有硫标签(Sulfo-tagged)的检测抗体。板在4℃振荡1小时然后洗涤一次。最后，添加170μl的MSD读数缓冲液并且在MSD Sector Imager 6000上对板进行读数。
为了允许定量小鼠脑提取物中的Tau和Tau pS422，使用实施例2所述制备的Tau和Tau pS422构建标准曲线。
与相同年龄的赋形剂处理的小鼠相比，在抗体处理的11月龄的小鼠中观察到典型的Tau病理学减少，证明了通过用抗-Tau pS422单克隆抗体慢性处理降低Tau.PS2APP三重转基因小鼠中的Tau病理学。这种减少表现为减少的神经原纤维缠结负荷(如通过免疫组织化学检测的)和减少脑提取物中存在的各种pTau种类的水平(如通过定量免疫测定测量的)。
实施例10
制备和纯化兔抗体
a)免疫
来自查尔斯河实验室国际公司(Charles River Laboratories International，Inc.)的NZW兔用于免疫。偶联在KLH上的磷酸肽Tau(416-430)[pS422]以浓度为1mg/ml溶解于K3PO4缓冲液pH 7,0并且与完全弗氏佐剂(CFA)(1∶1)混合直至产生稳定乳剂。三只兔接收真皮内(i.d.)注射2ml的乳剂，随之为第二次肌内(i.m.)和第三次皮下(s.c)注射，每次用1ml以一周的间隔注射。两周后进行第四次i.m.注射1ml，随之为以四周的间隔进行两次进一步的s.c注射1ml。在第三、四、五、六次注射后4-6天收集每只动物的10ml外周全血细胞样品，并用于FACS中的单细胞分选。在相同时间收集每只动物的另外0,5ml血清并且用于确定Tau(416-463)[pS422]特异性抗体应答。
b)抗体应答
对免疫的抗体应答使用ELISA通过连续稀释的血清来确定，其中30ng/孔的生物素化的Tau(416-430)[pS422]在1x PBS中在4℃于链霉抗生物素蛋白预包被的96孔微量滴定板(MC1347，Micro Coat BiotechnologieGmbH，Bernried，德国)上温育过夜。对于检测，连接至辣根过氧化物酶(TheJackson laboratory)的山羊抗兔IgG以1∶16000稀释使用。来自罗氏诊断(RocheDiagnostics GmbH)的随时可用的BM Blue POD Substrat(起沉淀四甲基联苯胺(TMB)的作用)用于显示。通过1N HCl终止反应并且在TecanInfinite通过450/690nm测量。
c)B-细胞克隆
板的包被
无菌链霉抗生物素蛋白包被的6孔板(细胞培养级)与3个生物素化的对照肽(未磷酸化的Tau(416-430)，MCAK_人(88-102)[95-pSer]和MAP2_人(1802-1816)[pSer-1802])的混合物或与生物素化的磷酸肽Tau(416-430)[pS422]一起温育，每种以PBS中0.5-1μg/ml的浓度在室温温育1小时。使用前以无菌PBS洗涤板三次。细胞培养6孔板以碳酸盐缓冲液(0，1M碳酸氢钠，34mM碳酸氢二钠(Disodiumhydrogencarbonate)，pH9.55)中2μg/ml KLH(匙孔血蓝蛋白)在4℃包被过夜。使用前在无菌PBS中洗涤板三次。
分离兔外周血单核细胞(PBMC)
在进行分离兔PBMC的淋巴细胞分离哺乳动物(lympholyte mammal)(Cedarlane Laboratories)上密度离心之前，含EDTA的全血用1xPBS稀释两倍。用抗体染色之前洗涤PBMCs两次。
EL-4 B5培养基
RPMI 1640(Pan Biootech，Aidenbach，德国)，补充10％FCS(Hyclone，Logan，UT，USA)，2mM谷氨酰胺(Glutamin)，1％青霉素/链霉素溶液(PAA，Pasching，Austria)，2mM丙酮酸钠，10mM HEPES(PAN Biotech，Aidenbach，德国)和0,05mM β-巯基乙醇(Gibco，Paisley，苏格兰)。
巨噬细胞/单核细胞的清除
无菌6孔板(细胞培养级)用于通过非特异性粘附清除巨噬细胞和单核细胞。孔用KLH(匙孔血蓝蛋白)或用链霉抗生物素蛋白和对照肽包被。每个孔填充最大4ml培养基和至多6x106个来自免疫的兔的外周血单核细胞，并且允许在恒温箱中37℃结合1小时。上清液中50％的细胞用于淘选(panning)步骤；剩余的50％的细胞直接进行免疫荧光染色和单细胞分选。
在肽上淘选B细胞
用链霉抗生物素蛋白和生物素化的肽Tau(416-430)[pS422]包被的6孔组织培养板接种至多6x106细胞/4ml培养基并且允许在恒温箱中在37℃结合1小时。未粘附的细胞通过用1xPBS小心地洗涤孔1-2次去除。剩余的粘着细胞通过胰蛋白酶在恒温箱中在37℃10分钟进行解离，然后在培养基中洗涤两次。细胞保持在冰上直至进行免疫荧光染色。
免疫荧光染色和单细胞分选
用于单细胞分选的抗兔IgG FITC来自AbD Serotec(STAR121F，Düsseldorf，德国)。对于表面染色，来自清除和淘选步骤的细胞与PBS中抗兔IgG FITC抗体在冷室内于暗中在4℃滚动温育30分钟。离心后，上清液通过抽吸去除。PBMCs用冰冷PBS进行2个循环的离心和洗涤。最后，PBMCs在冰冷PBS中重悬浮并且立即进行FACS分析。在FACS分析前添加5μg/ml浓度的碘化丙啶(BD Pharmingen，San Diego，CA，USA)以便分辨死亡细胞和活细胞。FACS使用带有FACSDiva软件的BectonDickinson FACSAria(BD Biosciences，USA)进行，单个、FITC-标记的活细胞沉积于96孔板中。
B细胞培养
B细胞培养通过类似于Zubler，R.H.等，免疫学杂志(J Immunol.)134(1985)3662-3668.所述的方法制备。简言之，单个分选的B细胞在96孔板中培养，用210μl/孔EL-4 B5培养基和Pansorbin细胞(1∶20000)(Calbiochem(Merck)，Darmstadt，德国)，5％兔胸腺细胞上清液和γ-照射的EL-4-B5鼠胸腺瘤细胞(2×104/孔)于恒温箱中在5％CO2的气氛中37℃培养7天。为了筛选去除B细胞培养上清液，立即收获细胞用于可变区基因克隆或在100μl RLT缓冲液(Qiagen，Hilden，德国)中冰冻于-80℃。
d)B-细胞克隆筛选
通过ELISA筛选B细胞培养上清液对生物素化的Tau(416-430)[pS422]的结合。非磷酸化的Tau(416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]用作对照抗原。对于ELISA板的制备，链霉抗生物素蛋白预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。KLH或对照肽的包被在1μg/ml进行。B细胞上清液以1∶5至1∶10稀释并且与抗原包被的板温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(ChemiconAQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。与生物素化的Tau(416-430)[pS422]但是不与KLH和MCAK_人(88-102)[95-pSer]产生高于背景信号的B细胞克隆被进一步考虑，并且进行可变区基因克隆。
e)PCR扩增V结构域和测序
总RNA使用8/96RNA试剂盒(Macherey&Nagel；740709.4，740698)根据制造商的方案制备。所有步骤在epMotion 5075液体处理系统(Eppendorf)上进行。RNA用60μl无RNase水洗脱。6μl的RNA用于通过逆转录酶反应使用Superscript III第一链合成超混合物(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix，Invitrogen 18080-400)和寡聚dT引物根据制造商的说明产生cDNA。4μl的cDNA用于扩增免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)，使用AccuPrime Supermix(Invitrogen12344-040)，终体积50μl，使用引物rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和使用引物rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(表4)。PCR条件如下：热启动于94℃5min；94℃，20s，70℃，20s，68℃，45s，35个循环；最终延伸在68℃进行7min。
表4：
50μl PCR溶液的8μl装载于48E-Gel 2％(Invitrogen G8008-02)上。阳性PCR反应使用Extract II试剂盒(Macherey&Nagel；740609250)根据制造商的方案清洁并且洗脱在50μl洗脱缓冲液中。12μl的纯化的PCR产物在两个方向上使用rbHCfinal.up和rbHCfinal.do用于重链和rbLCfinal.up和rbLCfinal.do用于轻链(表4)进行直接测序。
d)重组表达兔单克隆抗体和兔/小鼠嵌合抗体
为了重组表达兔单克隆抗体，编码VH或VL的PCR产物作为cDNA通过悬突克隆方法(Haun，R.S.等，生物技术(Biotechniques)13(1992)515-518；Li，M.Z.，等，自然方法(Nature Methods)4(2007)251-256)克隆至表达载体中。编码兔κ或γ恒定区的线性化表达质粒和VL或VH插入物通过PCR使用重叠引物扩增。纯化的PCR产物与产生单链悬突的T4DNA聚合酶温育。反应通过添加dCTP终止。下一步，质粒和插入物组合并且与诱导位点特异性重组的recA温育。重组质粒转化入大肠杆菌中。次日，挑选生长的克隆并且通过质粒制备、限制性分析和DNA测序测试正确重组的质粒。对于抗体表达，分离的HC和LC质粒瞬时共转染至HEK293细胞中，1周后收获上清液。为了克隆和表达兔小鼠嵌合抗体，VH和VL区通过PCR扩增并且亚克隆至含有小鼠恒定κ区或小鼠恒定γ1区的表达载体中。兔/小鼠嵌合HC和LC质粒被分离，通过限制性分析和DNA测序检测正确的插入，并且瞬时共转染至HEK293细胞中。转染后一周收集上清液。
e)抗体纯化
在MabSelectSuReTM柱(GE Healthcare)上从细胞培养上清液中纯化重组表达的兔抗体。样品装载前，柱用25mmol/L Tris-HCl，25mmol/L NaCl，pH 7.4平衡。抗体洗脱用50mmol/L乙酸盐pH 3.14完成。洗脱的样品立即装载于脱盐柱(Sephadex G25，GE Healthcare)并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。来自细胞培养上清液的重组表达的兔/小鼠嵌合抗体在MabSelectSuReTM柱(GEHealthcare)上纯化。样品装载前，柱用1x PBS，pH 7.4平衡。抗体洗脱用100mmol/L柠檬酸盐pH 3.0完成。洗脱的样品立即用2mol/L Tris/HCl pH9.0中和。然后，抗体装载于尺寸排阻柱(Superdex 200，GE Healthcare)上并且在20mmol/L His-HCl，140mmol/L NaCl pH 6.0中洗脱。这种缓冲液也用于储存纯化的抗体。在纯化过程中一般存储温度是4℃，室温，在分装后为-80℃。
实施例11
抗-Tau pS422单克隆兔抗体对在pS422磷酸化的Tau是高度选择性的并且结合Tau pS422的原纤维聚集体
a)ELISA
兔单克隆抗体在HEK 293细胞中重组表达。通过ELISA测试细胞培养上清液或纯化的兔抗体对生物素化的Tau(416-430)[pS422]，非磷酸化的Tau(416-430)，KLH(匙孔血蓝蛋白)和不相关的磷酸肽MCAK_人(88-102)[95-pSer]结合。为了制备ELISA板，链霉抗生物素蛋白预包被的微量滴定板与50ng/ml的生物素化的Tau(415-430)[pS422]在室温温育1小时。用KLH或对照肽的包被在1μg/ml进行。不同浓度的兔抗Tau pS422抗体(Abcam AB51071)或含有兔抗体的上清液在抗原标记的微量滴定板中温育60分钟。强烈洗涤后，兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。抗体结合生物素化的Tau(416-430)[pS422]和非磷酸化的Tau(416-430)肽通过其EC50值表征。与KLH或MCAK磷酸肽的交叉反应性在高浓度(即细胞培养上清液的1∶5稀释)通过单点测量来估计。结果显示于表5。发现结合Tau磷酸肽的EC50值比结合Tau肽的EC50值低超过100倍，表明与非磷酸化的Tau肽相比较，对磷酸化的Tau片段至少100倍的选择性。对于所有抗体结合KLH和MCAK对照磷酸肽在背景水平，其是用Tau磷酸肽测量的最大值的约1＜3％。
表5：
也测试了对可溶性和全长Tau pS422的特异性。Tau pS422的原纤维聚集体(300μg/ml)在RT过夜包被于基于聚苯乙烯的MaxiSorb微量滴定板(Nunc)。以类似的方式，可溶性全长Tau和Tau pS422包被于MaxiSorb微量滴定板。添加兔抗Tau pS422抗体对照(Abcam AB51071)或纯化的兔抗体并且以至多1000ng/ml的浓度温育60分钟。强烈洗涤后，对兔抗体的结合用绵羊抗兔IgG地高辛缀合的检测抗体(Chemicon AQ301D)检测。与TMB在室温温育后，测量在370nm-492nm的吸光度。抗体结合通过其EC50值表征。结果显示于表6.
表6：
兔单克隆抗体以低于1ng/ml的EC50值结合Tau-pS422蛋白。检测的原纤维的Tau pS422的EC50值范围为0.4ng/ml至14ng/ml。结合非磷酸化的全长Tau蛋白的信号与背景水平不可区分。因此，估计相比于Tau，每种抗体以至少100倍的选择性结合Tau pS422和原纤维的Tau pS422。
b)BiacoreTM
通过BIAcoreTM分析进一步研究和确认对原纤维的Tau pS422聚集体的结合。测量使用BIAcore 3000仪器在37℃实施。系统和样品缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v))。BIAcoreTM CM5传感器芯片进行预处理程序。对于流动池FC1，FC2，FC3和FC4相继注射0.1％SDS，50mM NaOH，10mM HCl和100mM H3PO4 30sec。使用BIAcore 3000TM wizard v.4.1根据制造商说明书进行胺偶联程序。在EDC/NHS活化传感器表面后，非-磷酸选择性的抗-Tau抗体mAb<TAU>M-4/53-IgG固定在传感器流动池FC2，FC3和FC4上。作为对照，针对CK-MM(肌酸激酶同种型)的抗体，其识别不相关抗原，被捕获于FC1。mAb<TAU>M-4/53-IgG和针对CK-MM的抗体以30μg/ml稀释在10mM NaAc pH 5.0中，并且以10μl/min注射7min接触时间以固定10.000RU的抗体捕获系统。表面通过1M乙醇胺去活化。传感器通过5个循环的用磷酸化的丝状Tau蛋白(原液0.3mg/ml，在HBS-EP中1∶100稀释)作为溶液中的分析物以10μl/min进行2min来适应。再生用10mM甘氨酸pH 2.5以30μl/min进行3min。推定结合mAb 4/53的分析物不解离pTau丝，因为没有观察到pTau丝从mAb 4/53的解离。对于所有进一步的测量循环，0.3mg/ml pTau丝在HBS-EP缓冲液中稀释1∶100并且以10μl/min注射1min，以便以异质夹心方式(heterogeneous sandwich-mode)将pTau呈递给相应抗体分析物。抗体分析物在HBS-EP缓冲液中稀释至浓度100nM并且以20μl/min注射3min至系统中。3min解离后，通过以100μl/min 2次注射10mM甘氨酸pH 2.51min随之以100μl/min HBS洗涤15sec使传感器表面再生。监测相互作用的结合相和解离相。由于溶液中的抗体分析物是二价的，抗体亲抗原性负荷的(avidity-burdened)抗体-pTAU动力学通过二相性解离模型表征，其由下述组成：快速的基于亲和力(affinity-based)的早期解离步骤，随之是后面的复合物解离中的抗体亲抗原性稳定的(avidity-stabilized)但是限速的动力学步骤。分析物注射结束后10sec(早期)和50sec(晚期)，如果可能，定量kd和t/2 diss。动力学测量使用双重参照程序评价。首先来自FC1参照的信号被扣除以纠正缓冲液体积效应和非特异性结合。次之0nM分析物注射被扣除以纠正来自各自捕获系统的一级抗体的解离。动力学速率使用Langmuir 1.1解离拟合模型根据BiacoreTM评价软件v.4.1.进行评价。抗原/抗体复合物稳定性半衰期(min)根据公式ln(2)/60*kd计算。
结果总结于表7中。
表7：
实施例12
抗-Tau pS422单克隆兔抗体对阿尔茨海默病患者脑切片中细胞内pTau的结合
通过免疫荧光染色实验，使用来自AD患者的人脑组织的低温切片来研究通过单克隆兔抗-Tau pS422抗体特异性和灵敏性免疫组织化学检测阿尔茨海默病脑组织中的pTau病理学。该程序与实施例X(鼠抗体)中所述的基本相同。兔IgGs通过山羊抗兔Alexa缀合的二级抗体(Invitrogen/MolecularProbes A11034)检测。对于克隆Mab 005，Mab 019，Mab 020，Mab 085，Mab 086和Mab 097，pTau沉积和丝的特异性和灵敏性染色是明显的。细胞内pTau沉积，如大的神经原纤维缠结和延长的神经纤维网线是显著的。对于所有研究的克隆，确定了范围在0.08和0.016μg/ml之间的最小有效浓度，其表明对真正的人pTau沉积的高敏感性的结合。

Claims (23)

1.结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体，其特征在于特异性结合SEQ ID NO:9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO:17的磷酸化的MCAK片段，其应用于治疗Tau病，其中所述抗体包含SEQ ID NO:55的CDR1H、SEQ ID NO:56的CDR2H和SEQ ID NO:57的CDR3H,并且包含SEQ ID NO:59的CDR1L、SEQ ID NO:60的CDR2L和SEQ ID NO:61的CDR3L。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于所述抗体是人IgG1或IgG4亚型。
3.结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体用于制备治疗Tau病的药物中的应用，其特征在于所述抗体特异性结合SEQ ID NO:9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ IDNO:17的磷酸化的MCAK片段，其中所述抗体包含SEQ ID NO:55的CDR1H、SEQ ID NO:56的CDR2H和SEQ ID NO:57的CDR3H,并且包含SEQ ID NO:59的CDR1L、SEQ ID NO:60的CDR2L和SEQ ID NO:61的CDR3L。
4.根据权利要求3的应用，其特征在于所述抗体是人IgG1或IgG4亚型。
5.根据权利要求1的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:58的可变轻链和SEQ ID NO:54的可变重链。
6.根据权利要求5的抗体,其特征在于是人IgG1或IgG4亚型。
7.根据权利要求1-2和5-6中任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合的、人源化的或T细胞表位缺失的抗体变体。
8.权利要求1-2和5-7中任一项的抗体用于制备治疗Tau病的药物的应用。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于所述抗体是人IgG1或IgG4亚型。
10.用于治疗Tau病的药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1-2和5-7中任一项的抗体。
11.权利要求1-2和5-7中任一项的抗体用于制备用于治疗Tau病的药物组合物的应用。
12.权利要求1-2和5-7中任一项的抗体用于制备治疗Tau病的药物的应用，所述Tau病选自由以下各项组成的组：阿尔茨海默病(AD),关岛型帕金森综合征痴呆复合征,拳击员痴呆,皮克病,具有嗜银颗粒的痴呆,额颞叶痴呆,皮质基底节变性,苍白球脑桥黑质变性,进行性核上性麻痹和具有缠结的格-施-沙病。
13.根据权利要求12的应用，其中所述阿尔茨海默病包括该病的仅有缠结的形式，唐氏综合征和成人病例。
14.用于制备用于治疗Tau病的药物组合物的方法，所述药物组合物特征在于包含根据权利要求1-2和5-7中任一项的抗体。
15.核酸，其特征在于编码根据权利要求1-2和5-7中任一项的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
16.产生权利要求1-2和5-7中任一项的抗体的方法，所述抗体是重组人抗体或人源化抗体，所述方法的特征是在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求15的核酸并从所述细胞或所述细胞培养上清液回收所述抗体。
17.权利要求1-2和5-7中任一项的抗体用于制备治疗患有Tau病的患者的药物的应用。
18.根据权利要求17的应用，其中所述Tau病是阿尔茨海默病。
19.抗体用于制备治疗Tau病的药物的应用，其中所述抗体包含SEQID NO:55的CDR1H、SEQ ID NO:56的CDR2H和SEQ ID NO:57的CDR3H,并且包含SEQ ID NO:59的CDR1L、SEQ ID NO:60的CDR2L和SEQ IDNO:61的CDR3L，所述抗体的特征在于特异性结合与包含SEQ ID NO:1的可变轻链和SEQ ID NO:2的可变重链的抗体所结合的在丝氨酸422磷酸化的Tau的表位相同的表位。
20.根据权利要求19的应用，其特征在于所述抗体是IgG1或IgG4亚型。
21.应用于治疗Tau病的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:55的CDR1H、SEQ ID NO:56的CDR2H和SEQ ID NO:57的CDR3H,并且包含SEQ ID NO:59的CDR1L、SEQ ID NO:60的CDR2L和SEQ ID NO:61的CDR3L，其特征在于特异性结合与包含SEQ ID NO:1的可变轻链和SEQID NO:2的可变重链的抗体所结合的在丝氨酸422磷酸化的Tau的表位相同的表位。
22.根据权利要求21的抗体，其特征在于所述抗体是IgG1或IgG4亚型。
23.用于治疗Tau病的药物组合物，其包含治疗有效量的结合在丝氨酸422磷酸化的Tau(Tau pS422)的抗体和药用载体，所述抗体特异性结合SEQ ID NO:9的磷酸化的Tau片段和结合Tau pS422，但是不结合Tau和不结合SEQ ID NO:17的磷酸化的MCAK片段，其中所述抗体包含SEQID NO:55的CDR1H、SEQ ID NO:56的CDR2H和SEQ ID NO:57的CDR3H,并且包含SEQ ID NO:59的CDR1L、SEQ ID NO:60的CDR2L和SEQ IDNO:61的CDR3L。
CN201080025548.1A 2009-06-10 2010-06-08 抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用 Active CN102459333B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09007656.3 2009-06-10
EP09007656 2009-06-10
EP09008487.2 2009-06-30
EP09008487 2009-06-30
PCT/EP2010/003437 WO2010142423A2 (en) 2009-06-10 2010-06-08 Use of an anti-tau ps422 antibody for the treatment of brain diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102459333A CN102459333A (zh) 2012-05-16
CN102459333B true CN102459333B (zh) 2015-07-15

Family

ID=42753372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080025548.1A Active CN102459333B (zh) 2009-06-10 2010-06-08 抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用

Country Status (23)

Country Link
US (2) US8609097B2 (zh)
EP (1) EP2440578B1 (zh)
JP (2) JP2012529275A (zh)
KR (1) KR101429367B1 (zh)
CN (1) CN102459333B (zh)
AR (1) AR077016A1 (zh)
AU (1) AU2010257799B2 (zh)
BR (1) BRPI1012993A2 (zh)
CA (1) CA2762594C (zh)
CL (1) CL2011003122A1 (zh)
CO (1) CO6450613A2 (zh)
CR (1) CR20110606A (zh)
EC (1) ECSP11011514A (zh)
HK (1) HK1166331A1 (zh)
IL (1) IL216509A0 (zh)
MA (1) MA33339B1 (zh)
MX (1) MX2011012837A (zh)
NZ (1) NZ596187A (zh)
PE (1) PE20120543A1 (zh)
RU (1) RU2536247C2 (zh)
SG (1) SG176754A1 (zh)
TW (1) TW201103560A (zh)
WO (1) WO2010142423A2 (zh)

Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4342995A3 (en) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
NZ597477A (en) 2009-06-10 2014-03-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Tetracyclic compounds
CN103052386B (zh) 2010-08-20 2016-03-02 中外制药株式会社 含有四环化合物的组合物
CA2813493C (en) 2010-10-11 2019-07-09 University Of Zurich Human anti-tau antibodies
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
GB201112056D0 (en) * 2011-07-14 2011-08-31 Univ Leuven Kath Antibodies
CN109265543B (zh) 2011-09-19 2022-04-26 阿克松神经系统科学公司 阿尔茨海默病中的tau蛋白介导病变的基于蛋白质的疗法和诊断
EA027975B1 (ru) 2011-12-20 2017-09-29 Янссен Байотек, Инк. Анти-псф-тау-антитела и их применение
WO2013092716A1 (en) * 2011-12-21 2013-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Rapid method for cloning and expression of cognate antibody variable region gene segments
TWI700296B (zh) 2012-05-31 2020-08-01 公立大學法人大阪市立大學 失智症治療劑或預防劑
MY176838A (en) 2012-08-16 2020-08-24 Ipierian Inc Methods of treating a tauopathy
TW202237660A (zh) 2012-08-24 2022-10-01 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
EP2889376A4 (en) 2012-08-24 2016-11-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIBODIES Fc SPECIFIC TO FCTRII OF MOUSE
HUE040055T2 (hu) 2012-09-25 2019-02-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd RET inhibitor
WO2014096321A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies specific to tau phosphorylated at serine 422 and uses for the treatment and diagnosis of tauopathies
LT2935326T (lt) * 2012-12-21 2020-12-10 Biogen Ma Inc. Žmogaus antikūnai prieš tau baltymą
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
MX2016007208A (es) * 2013-12-20 2016-07-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(ps422) humanizados y metodos de uso.
EP2899208A1 (en) 2014-01-28 2015-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Camelid single-domain antibody directed against phosphorylated tau proteins and methods for producing conjugates thereof
NZ630610A (en) 2014-02-14 2019-05-31 Ipierian Inc Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
CN106458967A (zh) 2014-04-25 2017-02-22 中外制药株式会社 四环化合物的新结晶
CA2946518C (en) 2014-04-25 2022-07-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preparation containing tetracyclic compound at high dose
AR100978A1 (es) * 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
TW202136296A (zh) * 2014-06-27 2021-10-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
TWI803187B (zh) 2014-08-08 2023-05-21 日商中外製藥股份有限公司 包含４環性化合物的非晶質體之固體分散體及製劑
JP2017536102A (ja) * 2014-10-16 2017-12-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
BR112017010498A2 (pt) * 2014-11-19 2017-12-26 Axon Neuroscience Se anticorpos tau humanizados em doença de alzheimer
KR20180054923A (ko) 2014-12-19 2018-05-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
EP3246047A4 (en) 2015-01-16 2018-08-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Combination drug
EP3816179A3 (en) 2015-02-05 2021-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
TWI669314B (zh) 2015-02-26 2019-08-21 美國禮來大藥廠 針對ｔａｕ之抗體及其用途
JP6917899B2 (ja) 2015-04-16 2021-08-11 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 抗ｐａｃａｐ抗体及びそれらの使用
MX2017015464A (es) 2015-06-05 2018-03-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-tau y metodos de uso.
ES2809728T3 (es) * 2015-06-24 2021-03-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados y procedimientos de uso
KR20180027566A (ko) * 2015-07-06 2018-03-14 유씨비 바이오파마 에스피알엘 타우 결합 항체
MA42377A (fr) 2015-07-06 2018-05-16 Ucb Biopharma Sprl Anticorps se liant à tau
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
FI3334761T3 (fi) * 2015-08-13 2023-08-14 Univ New York Vasta-ainepohjaisia molekyylejä, jotka ovat selektiivisiä Taun {p}Ser404-epitoopille, ja niiden käyttöjä tauopatian diagnosoinnissa ja hoidossa
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
US10202435B2 (en) 2016-04-15 2019-02-12 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Anti-PACAP antibodies and uses thereof
DK3484916T3 (da) 2016-07-12 2021-04-06 H Lundbeck As Antistoffer specifikke for hyperphosphoryleret tau og fremgangsmåder til anvendelse deraf
TW202300168A (zh) 2016-08-05 2023-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物
JP6949102B2 (ja) 2016-08-09 2021-10-13 イーライ リリー アンド カンパニー 併用療法
KR20230146126A (ko) 2016-12-07 2023-10-18 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
JP2020511937A (ja) 2016-12-07 2020-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
GB201700487D0 (en) 2017-01-11 2017-02-22 Hermon-Taylor John Diagnostic
CA3053379A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
JP2018139530A (ja) 2017-02-27 2018-09-13 帝人ファーマ株式会社 認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤
JOP20180021A1 (ar) 2017-03-16 2019-01-30 Janssen Biotech Inc الأجسام المضادة لتكتلات خيوط بروتين تاو (tau) الحلزونية المزدوجة واستخداماتها
MX2020003857A (es) 2017-10-16 2021-01-08 Eisai R&D Man Co Ltd Anticuerpos anti-tau y uso de los mismos.
GB201720975D0 (en) * 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
KR20200116105A (ko) * 2018-02-01 2020-10-08 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 타우에 특이적으로 결합하는 결합 분자
KR102585973B1 (ko) 2018-07-03 2023-10-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 타우 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드
JP2021530552A (ja) 2018-07-31 2021-11-11 イーライ リリー アンド カンパニー 併用療法
SG11202100983XA (en) 2018-09-04 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method of producing tetracyclic compound
MX2022016322A (es) 2020-06-25 2023-01-24 Merck Sharp & Dohme Llc Anticuerpos de alta afinidad dirigidos a tau fosforilada en la serina 413.
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1876185A1 (en) * 2006-07-04 2008-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag An antibody which recognizes phosphorylated polypeptides
CN101108881A (zh) * 2006-07-04 2008-01-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 识别磷酸化多肽的抗体
EP2009104A1 (en) * 1991-12-06 2008-12-31 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Phosphorylation epitopes of Tau protein for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1997034145A1 (fr) * 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant
WO1998022120A1 (en) 1996-11-19 1998-05-28 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
IT1312107B1 (it) * 1999-05-14 2002-04-04 Umberto Cornelli Glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 d atti altrattamento della demenza senile
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
US8012936B2 (en) 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2009104A1 (en) * 1991-12-06 2008-12-31 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Phosphorylation epitopes of Tau protein for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
EP1876185A1 (en) * 2006-07-04 2008-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag An antibody which recognizes phosphorylated polypeptides
CN101108881A (zh) * 2006-07-04 2008-01-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 识别磷酸化多肽的抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Dysregulation of Protein Phosphorylation/Dephosphorylation in Alzheimer’s Disease:A Therapeutic Target;Cheng-XinGong et al.;《Journal of Biomedicine and Biotechnology》;20061231;第2006卷(第3期);第3页第1栏第3段，第3页第2栏第1段，第6页第1栏第2段 *
Tau pathology in Alzheimer disease and other tauopathies;Khalid Iqbal et al.;《Biochimica et Biophysica Acta》;20041003;第1793卷(第2-3期);表1 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20110059093A1 (en) 2011-03-10
JP2012529275A (ja) 2012-11-22
WO2010142423A3 (en) 2011-05-26
AU2010257799B2 (en) 2013-10-17
KR20120024952A (ko) 2012-03-14
EP2440578B1 (en) 2017-03-08
US9290567B2 (en) 2016-03-22
NZ596187A (en) 2013-11-29
CO6450613A2 (es) 2012-05-31
CA2762594C (en) 2017-02-28
AR077016A1 (es) 2011-07-27
AU2010257799A1 (en) 2011-12-01
TW201103560A (en) 2011-02-01
MX2011012837A (es) 2011-12-16
US8609097B2 (en) 2013-12-17
ECSP11011514A (es) 2012-01-31
WO2010142423A2 (en) 2010-12-16
JP2017031176A (ja) 2017-02-09
CN102459333A (zh) 2012-05-16
KR101429367B1 (ko) 2014-08-11
RU2536247C2 (ru) 2014-12-20
BRPI1012993A2 (pt) 2018-01-16
PE20120543A1 (es) 2012-05-23
MA33339B1 (fr) 2012-06-01
JP6513617B2 (ja) 2019-05-15
SG176754A1 (en) 2012-01-30
RU2011152816A (ru) 2013-07-20
EP2440578A2 (en) 2012-04-18
CL2011003122A1 (es) 2012-07-20
US20130310541A1 (en) 2013-11-21
CA2762594A1 (en) 2010-12-16
CR20110606A (es) 2012-01-12
HK1166331A1 (zh) 2012-10-26
IL216509A0 (en) 2012-02-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102459333B (zh) 抗-Tau pS422抗体用于治疗脑病的应用
US20220235123A1 (en) Synthetic antibodies against vegf and their uses
KR20160119196A (ko) IgA 다중-특이적 결합 분자
US8207307B2 (en) Antibodies against human CCN1 and uses thereof
CN115427454A (zh) 针对粘蛋白17的抗体及其用途
US20220026445A1 (en) Antibodies that bind to natively folded myocilin
TW202233678A (zh) 具有增強的剪切特徵的多肽
TW202225188A (zh) 與ｃｄ３結合的多肽構建體
TW202241949A (zh) 抗EphA4抗體
AU2013203453A1 (en) Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1166331

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1166331

Country of ref document: HK