TWI695068B - 用於結合生長分化因子１１的核酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述能夠結合生長分化因子11(GDF11)蛋白質之適體(aptamer)；包括GDF11結合適體與GDF11蛋白質之組合物；及製備與使用其之方法。

Description

用於結合生長分化因子11的核酸化合物 相關申請案之交差參考
此申請案主張2014年11月24日申請之美國臨時申請案第62/083,582號、及2015年2月9日申請之美國臨時申請案第62/113,864號之優先權，其各者之全文以引用的方式出於任何目的併入本文中。
序列表
本申請案連同呈電子格式之序列表申請。該序列表係創建於2015年11月21日之標題為「2015-11-22_01137-0011-00PCT_ST25.txt」的文字檔案，大小122,816個位元組。呈序列表電子格式之資訊其全文以引用的方式併入本文中。
本發明一般係關於核酸領域，及更明確言之，關於能結合生長分化因子11(GDF11)蛋白質之適體；包括GDF11結合適體與GDF11蛋白質之組合物；及製備與使用其之方法。
生長分化因子11(GDF11)或骨成形性蛋白質11(BMP-11)屬於藉由調節Hox基因表現發展期間控制前-後圖案化的轉變生長因子β超家族。GDF11已顯示在調節心肌細胞增殖、腎臟器官發生、胰臟發育、充當神經生成及軟骨生成之負調控物方面之作用。
GDF11與肌肉生長抑制素(myostatin)(GDF8)(肌肉生長之負調控 物)密切相關。如同GDF11，肌肉生長抑制素涉及調節心肌細胞增殖。GDF11與肌肉生長抑制素間之相似性意味著在肌肉與神經生成期間使用相同調節機制控制組織大小之可能性。機械地，GDF11之作用可能由WFIKKN2(一種由濾泡抑素、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑、及NTR域構成的大型細胞外多域蛋白質)調節。WFIKKN2對GDF11具有高親和力，且先前已發現抑制肌肉生長抑制素之生物活性。
GDF11與GDF8(肌肉生長抑制素)均在生長期間及在成人組織中調節細胞生長與分化時起重要作用。定位及/或測量此兩種蛋白質之能力係重要以進一步瞭解並區分其在生長及成人組織(例如，心臟及骨骼肌)中的作用。然而，由於其同源性，難於使用當前蛋白質結合試劑(例如，抗體)區分此等蛋白質之存在及/或含量。由此，需要能夠區分蛋白質GDF11與GDF8的蛋白質結合試劑。本發明藉由提供具有GDF11蛋白質結合特異性的適體滿足此等需求。
本發明描述能夠結合生長分化因子11(GDF11)蛋白質之適體。在一些實施例中，提供具有小於100nM平衡結合常數(Kd)之結合GDF11之適體。在另一態樣中，Kd係約0.1nM至約100nM(或約0.1nM至約50nM，或約0.1nM至約10nM，或約0.5nM至約10nM，或約0.5nM至約5nM)。
在一些實施例中，提供以小於10nM親和力結合GDF11之適體。在一些實施例中，該適體以小於10nM親和力結合GDF11，且在相同條件下，該適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。在一些實施例中，該適體不結合GDF8。在一些實施例中，該適體以至少20倍、或至少30倍、或至少50倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。在一些實施例中，該適體以大於50nM、或大於100nM、或大於150nM、或大於200nM、或大於250nM、或大於300nM 之親和力結合GDF8。在一些實施例中，該適體以小於8nM、或小於7nM、或小於6nM、或小於5nM、或小於4nM、或小於3nM、或小於2nM、或小於1nM之親和力結合GDF11。在一些實施例中，使用包括多陰離子抑制劑的結合分析來測定親和力。在一些實施例中，該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。在一些實施例中，該適體包括序列5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：110)或5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：151)，其中：各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；各個S在每次出現時獨立地係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
在一些實施例中，提供一種結合GDF11之適體，其中該適體包括序列5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3'(SEQ ID NO：110)或5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3'(SEQ ID NO：151)，其中：各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；各個S在每次出現時獨立地係G或C； 各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括選自下列之序列：a)5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：111)；b)5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：152)；c)5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：112)；d)5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：153)；e)5'-RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC-3’(SEQ ID NO：113)；及f)RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS-3’(SEQ ID NO：154)。
在上文序列之一些實施例中，若R係G，則第一個W可係A，及其中若R係A，則第一個W可係C。在一些實施例中，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6個n係0。在一些實施例中，各個n係0。在一些實施例中，至少1、至少2、至少3個n係1。在一些實施例中，至少一個m係0。在一些實施例中，至少一個m係1。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列5’-CPPGMPPP-3’(SEQ ID NO：114)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，及其中M係C或A。在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列5’-PPPAGC-3’(SEQ ID NO：115)或5’-PPPAGG-3’(SEQ ID NO：155)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶。在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列5’-CPPGMPPPNxPPPAGC-3’(SEQ ID NO：116)或5’-CPPGMPPPNxPPPAGG-3’(SEQ ID NO：160)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，其中x係2、3、4或5，其中M係C或A，及其中各個N在每次出現時獨立地係選自A、C、G、T、及U。在一些實施例中x係3或4。在一些實施例中，Nx包括序列5’-AAG-3’或5’-ACG-3’或5’-AGG-3’。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列5’-NNCPPGRPPPAMGPPPAGS-3’(SEQ ID NO：141)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，R係A或G；各個N在每次出現時獨立地係A、G、或C；M係A或C；及S係G或C。
在一些實施例中，各個P在每次出現時獨立地選自：5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)，5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-苯乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(PEdU)，5-(N-苯硫基甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)，5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)，5-(N-酪胺醯基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TyrdU)，5-(N-3,4-亞甲基二氧苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(MBndU)，5-(N-4-氟苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(FBndU)，5-(N-3-苯丙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(PPdU)，5-(N-咪唑基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ImdU)，5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-R-蘇胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ThrdU)，5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷， 5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，氯化5-(N-[1-(3-三甲銨)丙基]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-[1-(2,3-二羥丙基)]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，各個P在每次出現時獨立地選自：5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)， 5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6個P係各自獨立地選自5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、及5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，該適體包括選自SEQ ID NO：12、13、15至109、及117至140之序列。在一些實施例中，該適體包括選自SEQ ID NO：12、15、26、105至109、及142至150之序列。
在本文描述之實施例之任一項中，該適體可由18至200個核苷酸、或18至150個核苷酸、或18至100個核苷酸、或18至75個核苷酸、或18至50個核苷酸、或20至150個核苷酸、或20至100個核苷酸、或20至75個核苷酸、或20至50個核苷酸構成，其中各個核苷酸可獨立地係經修飾或未經修飾之核苷酸。在本文描述之實施例之任一項中，該適 體可包括可檢測標誌。
在一些實施例中，GDF11係人類GDF11及GDF8係人類GDF8。在一些實施例中，GDF11係包括序列SEQ ID NO：118的成熟人類GDF11及GDF8係包括序列SEQ ID NO：119的成熟人類GDF8。
在一些實施例中，提供一種檢測樣品中GDF11之方法，包括使獲自樣品的蛋白質與本文描述之適體接觸。在一些實施例中，該適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。在一些實施例中，該適體不結合GDF8。
在一些實施例中，一種測定樣品是否包括GDF11之方法，包括使獲自該樣品的蛋白質與本文描述之適體接觸。在一些實施例中，該樣品包括GDF8。在一些實施例中，該方法包括使該樣品與適體在嚴格條件下接觸。在一些實施例中，該嚴格條件包括多陰離子抑制劑。在一些實施例中，該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。
在一些實施例中，該樣品係獲自人類之樣品。在一些實施例中，該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。在一些實施例中，該組織樣品係選自心臟肌肉組織、骨骼肌組織、胰臟組織、軟骨組織及神經組織。
在一些實施例中，該蛋白質已與該樣品之至少一其他組分分離。在一些實施例中，該蛋白質未與該樣品之其他組分分離。
在一些實施例中，提供包括本文描述之適體及獲自樣品之蛋白質的組合物。在一些實施例中，該樣品包括GDF8。在一些實施例中，該組合物包括多陰離子抑制劑。在一些實施例中，該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。在一些實施例 中，該樣品係獲自人類之樣品。在一些實施例中，該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。在一些實施例中，該組織樣品係選自心臟肌肉組織、骨骼肌組織、胰臟組織、軟骨組織及神經組織。在一些實施例中，該蛋白質已與該樣品之至少一其他組分分離。在一些實施例中，該蛋白質未與該樣品之其他組分分離。
在另一態樣中，該適體長度係至少25個核苷酸。在另一態樣中，該適體長度係至少30個核苷酸。在另一態樣中，該適體長度係至少40個核苷酸。在另一態樣中，該適體長度係約40至約100個核苷酸(或長度40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個核苷酸)。
本發明進一步提供一種包括適體及GDF11蛋白質之組合物，其中該適體及該GDF11蛋白藉由非共價相互作用結合。
自以下參照附圖所進行之具體陳述當可明瞭本發明之前述及其他目的、特徵、及優點。
圖1顯示在存在或缺乏多陰離子抑制劑(Z阻斷劑)時適體純系12060-28_3對人類GDF11蛋白質與人類肌肉生長抑制素(GDF8)蛋白質之結合親和力的比較。x軸顯示各個蛋白質之濃度而y軸顯示結合至蛋白質之適體的百分比(1.0係100%)。
圖2顯示在存在或缺乏多陰離子抑制劑(Z阻斷劑)時適體12058-6_3對人類GDF11蛋白質與人類肌肉生長抑制素(GDF8)蛋白質之結合親和力的比較。x軸顯示各個蛋白質之濃度而y軸顯示結合至蛋白質之適體純系的百分比(1.0係100%)。
圖3顯示適體純系12060-28_3(50-mer序列)之截斷分析及各個序列對GDF11之結合親和力。
I.術語及方法
儘管與某些代表實施例結合描述本發明，應瞭解本發明由申請專利範圍定義，及並非受限於彼等實施例。
一般技術者應瞭解相似或等效於本文描述之彼等的眾多方法及材料可用於實踐本發明。本發明不以任何方式受限於描述之方法及材料。
除非另外定義，否則本文中使用的技術及科學術語具有與如具有本領域普通技術之人士通常所瞭解相同的含義。在分子生物學中常規術語之定義可於Benjamin Lewin,GenesV，由Oxford UniversityPress出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中發現。儘管相似或等效於本文描述之彼等的任何方法、設備、及材料可用於實踐本發明，本文描述特定方法、設備、及材料。
本文所引用之所有公開案、公開之專利文件及專利申請案係以引用的方式併入文中，其程度就好像各個別公開案、公開之專利文件或專利申請案特定地且個別地以引用的方式併入。
如此申請案(包括申請專利範圍)所使用，除非本文另作清楚說明，否則單數形式「一(a/an」」及「該」包括複數，及可與「至少一者」或「一或多個」交換使用。由此，提及「適體」包括適體混合物，提及「探針」包括探針混合物等等。
如本文所使用之術語「包括(comprises/comprising)」、「包含(includes/including)」、「含有(contains/containing)」及任何其變異，係意在涵蓋非排斥性納入，由此包括、包含或含有要素或列表要素的處理、方法、處理產物、或物質組合物可包含其他未明文列出之要素。
應進一步瞭解給定核酸或多肽之全部鹼基大小或胺基酸大小、及全部分子量或分子量值係近似值，及出於描述之目的提供。
為便於檢視本發明之各種實施例，提供特定術語之以下解釋：適體：如本文所使用之「適體」指對靶分子具有特異性結合親和力之核酸。應瞭解親和交互作用係程度問題；然而，在本文中，適體對其靶之「特異性結合親和力」意指該適體通常遠高於其結合測試樣品之其他組分相比一般具有較高程度親和力結合其靶。「適體」係一組一類型或數類具有特殊核苷酸序列之核酸分子的複製體。適體可包括任何適宜數量之核苷酸，包括任何數量之經化學修飾之核苷酸。「數個適體」指一個以上此組分子。不同適體可具有相同或不同數量核苷酸。適體可係DNA或RNA或經化學修飾之核酸及可係單股、雙股、或含有雙股區域，及可包括更高度有序結構。適體亦可係光適體，其中光反應或化學反應官能團包括於該適體以容許將其共價連接至其相應靶。任何本文揭示之適體方法可包括使用二或多個特異性結合相同靶分子的適體。如下文進一步描述，適體可包括標籤。若適體包括標籤，全部適體之複製體不需要具有相同標籤。此外，若不同適體各者包括標籤，此等不同適體可具有相同標籤或不同標籤。
可使用任何已知方法(包括SELEX方法)識別適體。一旦識別，可依照任何已知方法(包括化學合成方法及酶合成方法)製備或合成適體。
GDF11適體：如本文所使用之GDF11適體指能結合成熟GDF11蛋 白質之適體。非限制例示性成熟人類GDF11蛋白質於下文顯示(UniProtKB/Swiss-Prot：O95390.1之胺基酸299至407)：L GLDCDEHSSE SRCCRYPLTV DFEAFGWDWI IAPKRYKANY CSGQCEYMFM QKYPHTHLVQ QANPRGSAGP CCTPTKMSPI NMLYFNDKQQ IIYGKIPGMV VDRCGCS(SEQ ID NO：118)。在一些實施例中，GDF11適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。在一些實施例中，GDF11不結合GDF8。非限制例示性成熟人類GDF8蛋白質於下文顯示(UniProtKB/Swiss-Prot：O14793.1之胺基酸267至375)：FGL DCDEHSTESR CCRYPLTVDF EAFGWDWIIA PKRYKANYCS GECEFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCC TPTKMSPINM LYFNGKEQII YGKIPAMVVD RCGCS(SEQ ID NO：119)。
抑制：如本文所使用之術語抑制意指將肽或多肽表現阻止或降低至該肽或多肽不再具有可測量活性或生物活性之程度；或降低穩定性及/或將肽或多肽活性降低或阻止至該肽或多肽不再具有可測量活性或生物活性之程度。如本文描述，受抑制之蛋白質係GDF11。
核酸：如本文所使用指「核酸」、「寡核苷酸」、及「多核苷酸」係交換用於指核苷酸之聚合物及包括DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及此類核酸、寡核苷酸及多核苷酸之修飾，其中包括各種個體或部分於任何位置結合核苷酸單元。術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙或單股分子以及三重螺旋分子。與術語適體相比核酸、寡核苷酸、及多核苷酸係更廣泛術語，及由此術語核酸、寡核苷酸、及多核苷酸包括為適體之核苷酸之聚合物而術語核酸、寡核苷酸、及多核苷酸不限於適體。
修飾：如本文所使用之術語「修飾(modify/modified/modification)」、及任何其變異，當關於寡核苷酸使 用時，意指該寡核苷酸之四個成分核苷酸鹼基(即，A、G、T/U、及C)至少一者係天然核苷酸之類似物或酯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸賦予該寡核苷酸核酸酶抗性。在一些實施例中，經修飾之核苷酸引起適體與蛋白質靶之主要為疏水性交互作用，從而導致高結合效率及穩定共結晶體複合物。於C-5位置取代之嘧啶係經修飾核苷酸之實例。修飾可包括主鏈修飾、甲基化、非常規鹼基配對組合諸如異鹼基異胞嘧啶核苷及異胍等等。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如封端。其他修飾可包括經由類似物取代一或多個天然核苷酸，核苷酸間修飾，諸如例如具有不帶電荷的鍵聯(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等等)者及具有帶電荷之鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)者、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等等)者、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等等)者、含有烷化劑者、及具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)者。此外，任何一般存在於核苷酸之糖上之羥基可由膦酸基團或磷酸基團替代；由標準保護基團保護；或活化以製備至額外核苷酸或固體撐體的額外鍵聯。5'及3'末端OH基團可經磷酸化或經由胺、約1至約20個碳原子之有機封端基團部分、在一些實施例中從約10至約80kDa之聚乙二醇(PEG)聚合物、在一些實施例中從約20至約60kDa之PEG聚合物、或其他親水或疏水生物或合成聚合物取代。在一實施例中，修飾係嘧啶之C-5位置。可通過醯胺鍵聯於C-5位置直接或藉由其他類型鍵聯產生此等修飾。
多核苷酸亦可含有一般在此項技術中熟知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟基-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。如上文提及，一或多個磷酸二酯鍵聯可由 可選擇之鍵聯基團替代。此等可選擇鍵聯基團包括其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2(「醯胺酸酯」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)替代之實施例，其中各個R或R'獨立係H或經取代或未經取代之烷基(1至20個C)，視情況含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烴基。在多核苷酸中並非全部鍵聯均需要相同。糖、嘌呤、及嘧啶之取代類似形式可有利於設計最終產物，例如可選擇主鏈結構如聚醯胺主鏈一般。
核酸酶：如本文所使用之術語「核酸酶」指能清除在寡核苷酸之核苷酸次單元間的磷酸二酯鍵之酶。如本文所使用之術語「核酸內切酶」指清除於寡核苷酸內部位點之磷酸二酯鍵(等)之酶。如本文所使用之術語「核酸外切酶」指清除連接寡核苷酸之末端核苷酸的磷酸二酯鍵(等)之酶。生物流體通常含有核酸內切酶與核酸外切酶二者之混合物。
如本文所使用之術語「抗核酸酶」及「核酸酶抗性」指降低寡核苷酸充當核酸內切酶或核酸外切酶基質之能力，使得當與此酶接觸時，與由未經修飾之核苷酸構成的寡核苷酸相比該寡核苷酸並未降解或更加緩慢降解。
C-5經修飾之嘧啶：如本文所使用之術語「C-5經修飾之嘧啶」指於C-5位置修飾之嘧啶，包括但不限於本文闡明之彼等部分。C-5經修飾之嘧啶之實例包括在美國專利第5,719,273號及第5,945,527號中描述之彼等。C-5修飾之實例包括於C-5位置經由獨立地選自下列之取代基取代去氧尿苷：苄基羧基醯胺(或者苄基胺基羰基)(Bn)、萘甲基羧基醯胺(或者萘甲基胺基羰基)(Nap)、色胺基羧基醯胺(或者色胺基羰基)(Trp)、苯乙基羧基醯胺(或者苯乙基胺基羰基)(Pe)、苯硫基甲基羧基醯胺(或者苯硫基甲基胺基羰基)(Th)及異丁基羧基醯胺(或者異丁基胺基羰基)(iBu)，如下文即將闡明。
C-5經修飾之嘧啶之化學修飾亦可單獨或以任何組合與2'-位置糖修飾、於環外胺修飾、及取代4-硫尿苷等等結合。
代表性C-5經修飾之嘧啶包括：5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苯乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(PedU)、5-(N-苯硫基甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、氯化5-(N-[1-(3-三甲銨)丙基]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羥丙基)]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷。
可在合成寡核苷酸前或後修飾核苷酸。在寡核苷酸中之核苷酸序列可由一或多個非核苷酸組分中斷。在聚合後可進一步修飾經修飾之寡核苷酸，諸如例如，藉由與任何適宜標誌組分結合。
如本文所使用之術語「至少一嘧啶」，當關於修飾核酸時，指在核酸中之一、若干、或全部嘧啶，表明在核酸中任何或全部C、T或U之任何或全部出現可係經修飾或未經修飾。
調節：如本文所使用之術語調節意指藉由關於參考表現程度增加或降低其表現程度來改變肽、蛋白質或多肽之表現程度，及/或藉由關於參考穩定性及/或活性程度增加或降低其穩定性及/或活性程度來改變肽、蛋白質或多肽之穩定性及/或活性。
醫藥上可接受：如本文所使用之「醫藥上可接受」意指可通過聯邦或州政府之管理機構核准或在美國藥典或其他普遍認可之藥典用於動物，及更特定言之，用於人類中列出者。
醫藥上可接受之鹽：如本文使用之醫藥上可接受之鹽或化合物鹽(例如適體)指含有離子鍵之產物及通常藉由反應該化合物與酸或鹼來製備，適宜用於投予個體。醫藥上可接受之鹽可包括但不限於酸加成鹽，包括氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烷磺酸鹽、芳基磺酸鹽、芳基烷磺酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、及酒石酸鹽；鹼金屬陽離子，諸如Li、Na、K，鹼土金屬鹽，諸如Mg或Ca，或有機胺鹽。
醫藥組合物：如本文所使用之醫藥組合物指包括呈適宜投與個體形式之GDF11適體的調配物。通常將醫藥組合物調配為與其意圖給藥途徑相容。給藥途徑之實例包括但不限於口服及非口服，例如，靜脈內、皮內、皮下、吸入、局部、經皮、經黏膜、及直腸給藥。
SELEX：術語「SELEX」及「SELEX處理」本文交換用於一般指(1)選擇以期望方式(例如以高親和力結合蛋白質)與靶分子交互作用之適體，與(2)擴增彼等所選擇之核酸之組合。SELEX處理可用於識別對特定靶或生物標記具有高親和力之適體。
序列一致性：在二或多個核酸序列中如本文所使用之序列一致性係由該等序列共用之相同核苷酸位置的數量之函數(即%一致性=一致位置數量/位置總數x100)，同時考慮間隙之數量，及需要引入以最佳化二或多個序列之比對的各個間隙之長度。在二或多個序列間比較序列及測定一致性百分比可使用數學算法完成，諸如於其預設參數之BLAST及Gapped BLAST程式(例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403,1990；亦參見BLASTN at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。對於序列比較而言，通常一序列充當測試序列與其比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試及參考序列輸入電腦，若需要則指定子序列坐標，及指定序列演算程式參數。隨後序列比較算法基於指定程式參數計算測試序列(等)相對於參考序列之百分比序列一致性。可例 如藉由Smith與Waterman,Adv.Appl.Math.,2：482,1981之局部同源算法、Needleman與Wunsch,J.Mol.Biol.,48：443,1970之同源比對算法、Pearson與Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之搜索相似法、此等算法之計算機化實現(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中GAP、BESTFIT、FASTA、及TFASTA)、或肉眼檢查(一般參見Ausubel,F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987))進行用於比較之序列之最佳比對。如本文所使用，當描述核酸(諸如GDF11適體)之百分比一致性時，其序列係至少例如約95%與參考核苷酸序列一致，旨在除該核酸序列每100個參考核酸序列之核苷酸可包括多達五點突變外，該核酸序列係與參考序列一致。換言之，為獲得期望核酸序列，其序列係至少約95%與參考核酸序列一致，在參考序列中多達5%核苷酸可刪除或由另一核苷酸取代，或在參考序列中多達5%核苷酸總量之一些核苷酸可插入參考序列(本文稱為插入)。此等參考序列之突變以產生期望序列可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或在彼等末端間之任何其他位置，分別在參考序列之核苷酸中或在參考序列中一或數個相鄰基團中散佈。
SOMAmer：如本文所使用之術語SOMAmer指具有經改良之解離速率特徵的適體。SOMAmer或者稱為緩慢解離速率修飾之適體，或可經由在標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國公開案第20090004667號中(其全文以引用的方式併入本文中)描述之經改良SELEX方法選擇。在一些實施例中，緩慢解離速率適體(包括含至少1個經疏水性修飾之核苷酸的適體)具有
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2分鐘、
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4分鐘、
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5分鐘、
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8分鐘、
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10分鐘、
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15分鐘、
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30分鐘、
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60分鐘、
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90分鐘、
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150分鐘、
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180分鐘、
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210分鐘、或
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240 分鐘的解離速率(t½)。
靶分子：「靶」、「靶分子」、及「分析物」本文交換用於指存在於樣品中之所關注之任何分子。該術語包括特定分子之任何較小變異，諸如在蛋白質情形下，例如，在胺基酸序列中較少變異，二硫鍵形成、糖苷化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾，諸如與標誌組分結合，其實質上不改變該分子之一致性。「靶分子」、「靶」、或「分析物」指一組一類型或數類分子或多分子結構之複製體。「靶分子」、「靶」、或「分析物」指超過一類型或數類分子或多分子結構。例示性靶分子包括蛋白質、多肽、核酸、碳水化合物、脂質、多醣、醣蛋白、內分泌素、受體、抗原、抗體、分子配體、抗體模擬、病毒、病原體、有毒物質、基質、代謝產物、過渡態類似物、輔助因子、抑制劑、藥物、染料、營養素、生長因子、細胞、組織、及任何前述者之片段或部分。在一些實施例中，靶分子係蛋白質，在此情況下該靶分子可稱為「靶蛋白」。
多陰離子抑制劑：多陰離子抑制劑係包括或模擬核酸分子之多陰離子磷酸酯主鏈之抑制劑分子。在一些實施例中，多陰離子抑制劑於與適體之結合反應中包括以增加結合條件之嚴格性。非限制例示性多陰離子抑制劑包括硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、dNTPs等等。
Z阻斷劑：如本文所使用之Z阻斷劑係單股寡核苷酸序列5'-(AC-BndU-BndU)7-AC-3'，其中BndU表示經苄基取代之去氧尿苷殘基。可使用常規胺基亞磷酸酯化學合成Z阻斷劑。
本文提供之範圍應理解為在此範圍內全部值之速記。例如，範圍1至50應理解為包括獲自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、或50之任何數字、數字組合或子範圍(以及其部分除非本文另作清楚說明)。除非另作說明，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比例範圍、或整數範圍應理解為包括在指出範圍內之任何整數值，及，當適當時，其分數(諸如整數的十分之一及百分之一)。此外，除非另作說明，否則本文關於任何物理特徵(諸如聚合物子單元、尺寸或厚度)指出之任何數字範圍應理解為包括在指出範圍內之任何整數。除非另作說明，否則如本文所使用之「約」或「基本上由下列構成」意指±20%指出之範圍、值、或結構。如本文所使用之術語「包含」及「包括」係開放及同義使用。應瞭解如本文所使用之術語「一(a/an」」指「一或多個」列舉組分。使用可供選擇者(例如，「或」)應理解為意指一、二、或該等可供選擇者之其任何組合。
II．概述
A．生長分化因子11(GDF11)及肌肉生長抑制素(GDF8)蛋白質
GDF11及肌肉生長抑制素之原生成熟形式係同型二聚體及係由序列比對約90%一致，其中109中之9個8匹配胺基酸殘基。參見GDF11(蛋白質ID 095390；胺基酸1至407；SEQ ID NO：4)及肌肉生長抑制素(蛋白質ID 014793；胺基酸1至375；SEQ ID NO：5)胺基酸序列比對，由灰色條指出成熟形式。GDF11與肌肉生長抑制素前元肽之胺基酸序列比對係如下顯示。使用灰色條突出顯示成熟蛋白質部分。
Figure 104138832-A0202-12-0020-1
吾人認為GDF11及GDF8共用常規系譜及常規調節機制，儘管關於其組織特異性(分別主要係心臟及肌肉)具有分歧。
在人類與小鼠間成熟GDF11係100%一致，及在大鼠中99%一致。人類、小鼠及大鼠GDF11蛋白質(成熟)之胺基酸序列比對係如下顯示。人類GDF11蛋白質ID係O95390；例示性人類成熟GDF11係如下顯示；SEQ ID NO：6)。小鼠GDF11蛋白質ID係Q9Z1W4；例示性小鼠成熟GDF8係如下顯示；SEQ ID NO：7)。大鼠GDF11蛋白質ID係Q9Z217；例示性大鼠成熟GDF8係如下顯示；SEQ ID NO：8)。
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在人類、小鼠、及大鼠間肌肉生長抑制素(GDF8)係100%一致。人類、小鼠及大鼠肌肉生長抑制素蛋白質(成熟)之胺基酸序列比對係如下顯示。人類肌肉生長抑制素(GDF8)蛋白質ID係O14793；例示性人類成熟GDF8係如下顯示；SEQ ID NO：9)。小鼠GDF8蛋白質ID係O08689；例示性小鼠成熟GDF8係如下顯示；SEQ ID NO：10)。大鼠GDF11蛋白質ID係O35312；例示性大鼠成熟GDF8係如下顯示；SEQ ID NO：11)。
Figure 104138832-A0202-12-0021-3
B．SELEX
SELEX一般包括製備核酸之候選混合物，使該候選混合物結合至期望靶分子以形成親和力複合物，從未結合之候選核酸分離該親和力複合物，從該親和力複合物分離及單離核酸，純化該核酸，及識別特定適體序列。該方法可包括多個回合以進一步改進所選擇適體之親和力。該方法可包括於該方法中一或多個點之擴增步驟。參見例如美國專利第5,475,096號，標題為「Nucleic Acid Ligands」。該SELEX方法可用於產生共價結合其靶之適體以及非共價結合其靶之適體。參見例如美國專利第5,705,337號，標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX」。
該SELEX方法可用於識別含有賦予適體改良特徵(諸如，例如，改良之體內穩定性或改良傳遞特徵)的經修飾核苷酸的高親和力適體。此等修飾之實例包括於核糖及/或磷酸酯及/或鹼基位置之化學取代。含有經修飾核苷酸的經SELEX方法識別之適體係描述於美國專利第5,660,985號，標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」，其描述含有於嘧啶之5'-及2'-位置化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見前述)描述含有一或多個經由2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟基(2'-F)、及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸的高特異性適體。亦參見美國專利申請案公開案20090098549，標題為「SELEX and PHOTOSELEX」，其描述具有擴展之物理及化學性質的核酸庫及其在SELEX及光SELEX之用途。
SELEX亦可用於識別具有期望解離速率特徵之適體。參見美國專利申請案公開案20090004667，標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」，其描述用於產生可結合靶分子之適體的改良之SELEX方法。如上文提及，此等緩慢解離速率適體稱為「SOMAmers」。描述用於製備具有緩慢從其各自靶分子解離之速率的適體或SOMAmers及光適體或SOMAmers之方法。該方法包括接觸候選混合物與靶分子，容許形成核酸-靶複合物，及進行緩慢解離速率富集方法，其中具有快速解離速率之核酸-靶複合物可解離及不再形成，同時具有緩慢解離速率之複合物可保持完整。此外，該方法包括在製備候選核酸混合物時使用經修飾之核苷酸以產生具有改良之解離速率效能的適體或SOMAmer。
此分析之變異採用包括能使該適體共價結合或「光交聯」其靶分子之光反應官能團的適體。參見例如美國專利第6,544,776號，標題為「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」。此等光反應適體亦稱為光適體。參見例如美國專利第5,763,177號、美國專利第6,001,577號及美國專利第6,291,184號，其各者標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」；亦參見例如美國專利第6,458,539號，標題為「Photoselection of Nucleic Acid Ligands」。在微陣列與該樣品接觸及該光適體已具有結合其靶分子之機會後，光活化該光適體，及清洗固體撐體以移除任何非特異性結合分子。由於在該光適體上由經光活化之官能團(等)產生之共價鍵，結合至光適體之靶分子通常未移除，由此可使用嚴格清洗條件。
在二者此等分析形式中，在與樣品接觸前均將適體或SOMAmer固定在固體撐體上。然而，在特定環境下，在與樣品接觸前固定適體或SOMAmer不提供最佳分析。例如，預固定該適體或SOMAmer可導 致該適體或SOMAmer與靶分子在該固體撐體表面無效混合，或許導致延長反應時間及，由此，延長培養期以容許該適體或SOMAmer有效結合其靶分子。此外，當在該分析中採用光適體或光SOMAmer且取決於用作固體撐體之材料時，該固體撐體可趨於分散或吸收用於實現在光適體或光SOMAmer與其靶分子間形成共價鍵的光。此外，由於該固體撐體表面亦暴露於及受任何使用之標誌劑影響，取決於採用之方法，結合至其適體或光SOMAmer之靶分子的檢測可係不準確。最終，在固體撐體上固定適體或SOMAmer一般包括在將該適體或SOMAmer暴露於樣品前之適體或SOMAmer預備步驟(即，固定)，及此預備步驟會影響適體或SOMAmer之活性或官能性。
容許SOMAmer在溶液中捕獲其靶及隨後在檢測前採用設計以移除該SOMAmer-靶混合物之特異性組分的分離步驟的SOMAmer分析亦己描述(參見美國專利申請案公開案20090042206，標題為「Multiplexed Analyses of Test Samples」)。此描述之SOMAmer分析方法能夠藉由檢測及定量核酸(即，SOMAmer)來檢測及定量測試樣品中非核酸靶(例如，蛋白質靶)。描述之方法產生用於檢測及定量非核酸靶之核酸代用品(即，SOMAmer)，由此容許包括擴增之各式核酸技術應用於更廣泛範圍期望靶，包括蛋白質靶。
其中該靶係肽的SELEX方法實例係描述於美國專利第6,376,190號，標題為「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」。在此實例情形下，該靶係GDF11蛋白質。
C．經化學修飾之適體
適體可含有改良其性質及特徵的經修飾核苷酸。此等改良之非限制性實例包括體內穩定性、抗降解穩定性、對於其靶之結合親和力、及/或經改良之傳遞特徵。
此等修飾之實例包括於核苷酸之核糖及/或磷酸酯及/或鹼基位置 之化學取代。含有經修飾核苷酸之經SELEX方法識別之適體係描述於美國專利第5,660,985號，標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」，其描述含有於嘧啶之5'-及2'-位置化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見前述)描述含有一或多個經由2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟基(2'-F)、及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸的高特異性適體。亦參見美國專利申請案公開案第20090098549號，標題為「SELEX and PHOTOSELEX」，其描述具有擴展之物理及化學性質的核酸庫及其在SELEX及光SELEX之用途。
C-5修飾之特殊實例包括於C-5位置經由獨立地選自下列之取代基取代去氧尿苷：苄基羧基醯胺(或者苄基胺基羰基)(Bn)、萘甲基羧基醯胺(或者萘甲基胺基羰基)(Nap)、色胺基羧基醯胺(或者色胺基羰基)(Trp)、及異丁基羧基醯胺(或者異丁基胺基羰基)(iBu)，如下文隨即闡明。
Figure 104138832-A0202-12-0024-4
C-5經修飾之嘧啶的化學修飾亦可單獨或以任何組合與2'-位置糖修飾、於環外胺修飾、及取代4-硫尿苷等等結合。
代表性C-5經修飾之嘧啶包括：5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N- 色胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-氟尿苷、氯化5-(N-[1-(3-三甲銨)丙基]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羥丙基)]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷。
若存在，可在組裝多核苷酸前或後賦予核苷酸結構之修飾。核苷酸序列可由非核苷酸組分打斷。可在聚合後進一步修飾多核苷酸，諸如介於與標誌組分結合。
可結合至本發明之核酸序列的經修飾核苷酸(例如，C-5經修飾之嘧啶)之額外非限制性實例包括如下：
Figure 104138832-A0202-12-0025-5
鹼基=尿苷(U)或胞嘧啶核苷(C)(連接係至5-位置)
K=R'基團加(CH2)n連接基團，其中n=0至3
R'係如下定義：
Figure 104138832-A0202-12-0026-6
及，R"、R'''及R''''係如下定義：其中R''''係選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1至C20)；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR")；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHR")；三級醯胺(CONR"R''')；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHR")組成之群。
其中R"、R'''係獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1至C2)；苯基(C6H5)；經R''''取代之苯環(R''''C6H4)(其中R''''係如上定義)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR''''')(其中R'''''係支鏈或直鏈低碳烷基(C1至 C20))；及環烷基組成之群；其中R"=R'''=(CH2)n；其中n=2至10。
額外C-5經修飾之嘧啶核苷酸包括如下：
Figure 104138832-A0202-12-0027-7
在一些實施例中，經修飾之核苷酸賦予該適體核酸酶抗性。於C-5位置取代之嘧啶係經修飾核苷酸之實例。修飾可包括主鏈修飾、甲基化、非常規鹼基配對組合諸如異鹼基異胞嘧啶核苷及異胍等等。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如封端。其他修飾可包括經由類似物取代一或多個天然核苷酸，核苷酸間修飾，諸如例如具有不帶電荷的鍵聯(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等等)者及具有帶電荷之鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)者、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等等)者、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等等)者、含有烷化劑者、及具有經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)者。此外，任何一般存在於核苷酸之糖上的羥基可由膦酸基團或磷酸基團替代；由標準保護基團保護；或活化以製備至額外核苷酸或固體撐體之額外鍵聯。5'與3'末端OH基團可經磷酸化或經由胺、約1至約20個碳原子的有機封端基團部分、在一實施例中從約10至約80kDa之聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一實施例中從約20至約60kDa之PEG聚合物、或其他親水或疏水生物或合成聚合 物取代。在一實施例中，修飾係嘧啶之C-5位置。可通過醯胺鍵聯於C-5位置直接或藉由其他類型鍵聯產生此等修飾。
適體亦可含有一般在此項技術中熟知之核糖或去氧核糖的類似形式，包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟基-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α變旋異構糖、差向異構糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物諸如甲基核糖苷。如上文提及，一或多個磷酸二酯鍵聯可由可選擇之鍵聯基團替代。此等可選擇鍵聯基團包括其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2(「醯胺酸酯」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)替代之實施例，其中各個R或R'獨立係H或經取代或未經取代之烷基(1至20個C)，視情況含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烴基。在適體中並非全部鍵聯均需要相同。糖、嘌呤、及嘧啶之取代類似形式可有利於設計最終產物，例如可選擇主鏈結構如聚醯胺主鏈一般。
可包括或併入至適體的C-5經修飾之嘧啶之特殊實例包括但不限於本文之結構。當用於該結構之命名習慣假定X係-H(即，DNA)時，其亦包含其中X可係-OH(RNA)、或其他本文描述之取代基(例如-OCH3；-O-烯丙基；-F、-OEt；-OPr、-NH2；-疊氮基或-OCH2CH2OCH3)，R'可係-H；-OAc；-OBz；-OCH2CH2OCH3及-OSiMe2tBu及R"可係-H；DMT及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)、及其鹽的結構。
例示性NapdU結構(5-[N-(1-萘甲基)羧醯胺]-2'-去氧尿苷)：
Figure 104138832-A0202-12-0029-8
例示性2NapdU結構(5-[N-(2-萘甲基)羧醯胺]-2'-去氧尿苷)：
Figure 104138832-A0202-12-0029-9
例示性PPdU結構(5-[N-(苯基-3-丙基)羧醯胺]-2'-去氧尿苷)：
Figure 104138832-A0202-12-0029-10
例示性TrpdU結構(5-[N-(3-吲哚-2-乙基)羧醯胺]-2'-去氧尿苷)：
Figure 104138832-A0202-12-0029-11
例示性2NEdU結構5-[N-(2-萘基-2-乙基)羧醯胺]-2'-去氧尿苷：
Figure 104138832-A0202-12-0029-12
提供以下實例來闡明特定特徵及/或實施例。此等實例不應理解 為將本發明限制為特殊特徵或描述之實施例。
例示性GDF11適體
本文提供結合GDF11之適體。在一些實施例中，適體以小於10nM之親和力結合GDF11。在一些此等實施例中，當在相同結合條件下測量二者親和力時，適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。在一些實施例中，適體以在0.5nM與10nM間之親和力結合GDF11及大於50nM，或大於100nM，或大於150nM，或大於200nM，或大於300nM之親和力結合GDF8。在一些實施例中，在該適體以小於10nM親和力結合GDF11的相同條件下，該適體不結合GDF8。在一些實施例中，該適體以小於8nM，或小於7nM，或小於6nM，或小於5nM，或小於4nM，或小於3nM，或小於2nM，或小於1nM；或在0.1nM與10nM間，0.1nM與8nM間，或0.1nM與5nM間之親和力結合GDF11。
在一些實施例中，使用本文描述之分析來測定親和力。在一些實施例中，在多陰離子抑制劑存在時測定親和力。本文描述非限制例示性多陰離子抑制劑。在一些實施例中，在Z阻斷劑存在時測定親和力。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列；5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：110)，其中：各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；S係G或C； 各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括選自下列之序列：a)5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：111)；b)5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：112)；及c)5'-RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC-3’(SEQ ID NO：113)；其中R、W、P、M、S、n、及m係如上定義。
在一些實施例中，若R係G，則第一個W係A；或若R係A，則第一個W係C。在一些實施例中，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個n係0。在一些實施例中，各個n係0。在一些實施例中，至少1、至少2、至少3個n係1。在一些實施例中，至少1個m係1。在一些實施例中，至少1個m係0。
在一些實施例中，提供一種GDF11適體，其中該適體包括序列5'-CPPGMPPP-3'(SEQ ID NO：114)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，及其中M係C或A。在一些實施例中，提供一種GDF11適體，其中該適體包括序列5’-PPPAGC-3’(SEQ ID NO：115)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶。在一些實施例中，該適體包括序列5’-CPPGMPPPNxPPPAGC-3’(SEQ ID NO：116)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，其中x係2、3、4、或5，其中M係C或A，及其中各個N在每次出現時獨立地係選自A、C、G、T、及U。在一些此等實施例中，x係3或4。在一些實施例中，Nx包括序列5’-AAG-3’或5’-ACG-3’或5’-AGG-3’。
在一些實施例中，結合GDF11之適體包括序列5’- NNCPPGRPPPAMGPPPAGS-3’(SEQ ID NO：141)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，R係A或G；各個N在每次出現時獨立地係A、G、或C；M係A或C；及S係G或C。
在本文描述之實施例之任一項中，各個P係獨立地選自本文描述之C-5經修飾之嘧啶。在一些實施例中，各個P係選自5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟代苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個P係各自獨立地選自5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、及5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)- 2'-氟尿苷。
在一些實施例中，GDF11適體包括選自SEQ ID NO：12、13、15至109、及117至140之序列。在一些實施例中，GDF適體包括選自SEQ ID NO：12、15、26、105至109、及142至150之序列。
在一些實施例中，GDF11適體可包括多達約100個核苷酸、多達約95個核苷酸、多達約90個核苷酸、多達約85個核苷酸、多達約80個核苷酸、多達約75個核苷酸、多達約70個核苷酸、多達約65個核苷酸、多達約60個核苷酸、多達約55個核苷酸、多達約50個核苷酸、多達約45個核苷酸、多達約40個核苷酸、多達約35個核苷酸、多達約30個核苷酸、多達約25個核苷酸、及多達約20個核苷酸。
在本發明另一態樣中，該GDF11適體可與SEQ ID NO：1或2中任一者至少約95%一致，至少約90%一致，至少約85%一致，至少約80%一致，或至少約75%一致。在另一實施例中，該GDF11適體包括獲自SEQ ID NO：1或2任一者、及其片段之序列。在相關態樣中，其片段係長度自約25至49個核苷酸(或長度自約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸)。
在本發明另一態樣中，該GDF11適體可具有約10nM或更低之GDF11解離常數(Kd)。在另一例示性實施例中，該GDF11適體具有約15nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約20nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約25nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約30nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約35nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約40nM或更低之 GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約45nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有約50nM或更低之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。在又一例示性實施例中，該GDF11適體具有在約3至10nM範圍(或3、4、5、6、7、8、9或10nM)之GDF11蛋白質解離常數(Kd)。可藉由如本文描述使用多點滴定並擬合等式y=(最大值-最小值)(蛋白質)/(Kd+蛋白質)+最小值之結合分析來測定適宜解離常數。在另一實施例中，該GDF11適體係具有小於或等於包括序列SEQ ID NO：12之適體Kd的Kd之適體。
在一些實施例中，該適體包括可檢測標誌。
檢測GDF11之方法
在一些實施例中，提供檢測樣品中GDF11之方法，包括使該樣品與本文描述之適體接觸。在一些實施例中，提供在GDF8存在時檢測或定量GDF11之方法，包括使疑似含有GDF11與GDF8二者之樣品與本文描述之適體接觸。在一些實施例中，提供區分樣品中GDF11與GDF8之方法，包括使該樣品與本文描述之適體接觸。在一些實施例中，該方法包括在多陰離子抑制劑存在時使該樣品與本文描述之GDF11適體接觸。
可使用在此項技術中之方法及/或本文描述之方法完成藉由GDF11適體檢測及/或定量所結合的GDF11。在一些實施例中，該GDF11適體包括可檢測標誌。在一些實施例中，該GDF11適體係結合至固體撐體，或包括可被捕獲在固體撐體上之結合對部分(例如，可結合至包括鏈親和素(streptavidin)之固體撐體的生物素化適體)。
包括GDF11適體組合物之套組
本發明提供包括任何本文描述之GDF11適體之套組。此等套組可包括，例如，(1)至少一GDF11適體；及(2)至少一醫藥上可接受載 劑，諸如溶劑或溶液。額外套組成分可視情況包括，例如：(1)本文認定之任何醫藥上可接受賦形劑，諸如穩定劑、緩衝劑等等，(2)至少一用於盛裝及/或混合該套組成分的容器、小瓶或相似裝置；及(3)傳遞裝置。
實例
實例1：選擇及識別具有GDF11結合特異性之適體
此實例提供選擇及製備結合成熟GDF11蛋白質適體之代表方法。
選擇具有GDF11特異性之適體的先前嘗試已受到挑戰。使用如在下文表1中顯示之SELEX方法比較若干所選擇適體的GDF11與肌肉生長抑制素(GDF8)之蛋白質結合親和力。
Figure 104138832-A0202-12-0035-13
如在表1中顯示，所選擇結合GDF11之適體一般亦具有肌肉生長抑制素親和力。對於各個適體而言GDF11與肌肉生長抑制素結合親和力之比例亦在表1中顯示。該比例從小於一(1)(即，與GDF11相比該適體具有較高肌肉生長抑制素親和力)，至約1.6至約6.3之比例(即，與肌肉生長抑制素相比該適體具有較高GDF11親和力)變化。然而，此等親和力差異不足以在蛋白質結合分析中區分GDF11與肌肉生長抑制素。由此，不能區分GDF11與GDF8之存在及/或含量。根據識別可區 分GDF11與肌肉生長抑制素之GDF11適體的嘗試，將反選自策略引入SELEX方法。
經由緩慢解離速率富集方法之適體選擇
使用本文描述之SELEX方法進行GDF11之SELEX。此外，應用涉及兩種不同類型反選擇之方案修飾以選擇不結合肌肉生長抑制素或與肌肉生長抑制素相比具有較高GDF11親和力的GDF11適體：被動反選擇及主動反選擇。
使用呈未標記形式之不想要靶(肌肉生長抑制素)藉由在選擇期間將其添加至PCB(含有凝血酶原、酪蛋白及白蛋白的蛋白質競爭緩衝液)，移除缺乏優於肌肉生長抑制素之GDF11趨向的序列進行被動反選擇。在第一回合中(各100pmol)肌肉生長抑制素與GDF11之比例係1：1，在第二回合中(20pmol肌肉生長抑制素及10pmol GDF11)係2：1，及隨著GDF11靶濃度降低在隨後SELEX回合中增加(20pmol肌肉生長抑制素及0.3pmol GDF11或約67：1)。
經由固定在鏈親和素(SA)珠粒上之生物素化之肌肉生長抑制素進行主動反選擇。在SELEX各個回合前，經由反選擇珠粒培養該庫10min並於37℃搖晃。隨後回收上清液及移動至經由GDF11選擇，留下在珠粒後結合肌肉生長抑制素之序列。第一回合使用100pmol肌肉生長抑制素來反選擇1000pmol庫，各個隨後回合使用20pmol肌肉生長抑制素來反選擇約20至50pmol庫。
製備候選混合物
藉由黏著至生物素化之ssDNA模板的DNA引子之聚合酶延伸製備部分無規化之ssDNA寡核苷酸的候選混合物(如在下文表2中顯示)。該候選混合物含有40個核苷酸無規化序列盒，其含有dATP、dGTP、dCTP及5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷三磷酸酯(NapdUTP)。
表2.模板及引子之序列
Figure 104138832-A0202-12-0037-14
B'=生物素
使用2.5mL 20mM NaOH清洗五毫升50% Streptavidin Plus UltraLink Resin(PIERCE)漿液一次，使用2.5mL SB18T0.05(使用NaOH調節至pH7.5的40mM HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸)緩衝液、102mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2及0.05%TWEEN 20)清洗兩次及使用2.5mL 16mM NaCl清洗兩次。將八十奈莫耳具有兩種生物素殘基(在序列中命名為B')及40個無規化位置(在序列中命名為N40)的模板1(SEQ ID NO：1)添加至經清洗之UltraLink SA珠粒及於37℃旋轉2.5小時。隨後使用16mM NaCl清洗該珠粒三次。在各個清洗間，藉由離心回收該珠粒。將目前含有捕獲之模板的珠粒懸浮於3.75mL延伸反應緩衝液中[含有80nmol引子(SEQ ID NO：2)、1X SQ20緩衝液(120mM Tris-HCl，pH7.8，10mM KCl，7mM MgSO4，6mM(NH4)2SO4，0.001% BSA及0.1% Triton X-100)，470單位KOD XL DNA聚合酶(EMD MILLIPORE)，及1mM dATP、dCTP、dGTP及NapdUTP各者]。容許經由於68℃旋轉培養該珠粒2小時。隨後使用SB18T0.01(如上之SB18，但具有0.01%TWEEN-20)清洗該珠粒一次及使用16mM NaCl清洗兩次。使用2.5mL 40mM NaOH從該珠粒洗脫該適體庫。立即使用50μL中和劑(700mM HCl、180mM HEPES、0.45% TWEEN-20)中和洗脫之庫。重複洗脫再兩次，合併洗脫液。使用AMICON Ultracel YM-10過濾器將該庫濃縮至約0.4mL並藉由紫外線吸收光譜測定庫濃度。
生物素標誌之人類GDF11
藉由NHS-PEO4-生物素(PIERCE，EZ-Link NHS-PEG4-生物素)之共價偶合將在大腸桿菌(Peprotech，目錄編號120-11)中過表現後呈同型二聚體形式純化之未標記的重組人類GDF11蛋白質生物素化為含有一級胺之殘基。蛋白質(在80μL中1600pmol)與4倍莫耳過量之NHS-PEG4-生物素混合及容許於20℃培養該反應1小時。在反應完成後，使用其中緩衝液交換至SB18T0.05的ZebaTM旋轉脫鹽柱(PIERCE)移除未反應之NHS-PEG4-生物素。
生物素標誌之人類肌肉生長抑制素
如上文描述生物素化在大腸桿菌(Peprotech，目錄編號120-00)中過表現後呈同源二聚體形式純化的未標記之重組人類肌肉生長抑制素-蛋白質。
固定肌肉生長抑制素
藉由使用14mL 20mM NaOH清洗該珠粒一次及使用14mL SB18T0.05清洗兩次來製備MYONE-SA順磁性珠粒(MYONE SA,INVITROGEN，或後文稱為SA珠粒)。最終，該SA珠粒懸浮於10mg/mL SB18T0.05中及於4℃存放直至使用。全部回合之SELEX係將生物素標誌之肌肉生長抑制素-蛋白質(500pmol)固定。此藉由搖晃混合SA珠粒(5mg)與生物素標誌之肌肉生長抑制素(500pmol)30分鐘，接著藉由使用SB18T0.05清洗三次完成。該SA-肌肉生長抑制素珠粒再次懸浮在0.5mL SB18T0.05中(附著有1μM肌肉生長抑制素之10mg/mL珠粒)及於4℃存放直至使用。
經由緩慢解離速率富集方法之適體選擇
經由選擇親和力及緩慢解離速率完成共11回合之SELEX方法。在各個回合前進行反選擇以減少背景值及減少獲得非特異性結合至蛋白質之適體的可能性。此外，採用分離類型反選擇以迫使選擇不結合 密切相關之90%一致之蛋白質肌肉生長抑制素的GDF11適體。反選擇如下進行。
回合1，將在SB18T0.05中含有約1nmole DNA之100μL DNA候選混合物於95℃加熱5分鐘及隨後冷卻5分鐘至70℃，隨後5分鐘至48℃及隨後5分鐘轉移至37℃區塊。隨後該樣品與10μL蛋白質競爭混合物及1mg(100μL)反選擇珠粒結合且經由混合於37℃培養10分鐘。藉由磁分離移除該珠粒。蛋白質競爭混合物及反選擇珠粒如下構成。標準SELEX使用10μL標準蛋白質競爭混合物(在SB18T0.05中0.1% HSA、10μM酪蛋白、及10μM凝血酶原)，及1mg(100μL)SA珠粒。經由被動反選擇之SELEX使用10μL經修飾之蛋白質競爭混合物(在SB18T0.05中0.1% HSA、10μM酪蛋白、10μM凝血酶原、及10μM未標誌之肌肉生長抑制素)及1mg(100μL)SA珠粒。經由主動反選擇之SELEX使用10μL標準蛋白質競爭混合物(在SB18T0.05中0.1% HSA、10μM酪蛋白、及10μM凝血酶原)，及1mg(100μL)SA-肌肉生長抑制素珠粒(附著有1μM肌肉生長抑制素的SA珠粒)。
回合2-11，68μL獲自先前回合之DNA候選混合物等分試樣(68%獲自先前回合之eDNA)與13μL 5x SB18T0.05混合。將該樣品加熱3分鐘至95℃及於速度0.1℃/秒冷卻至37℃。隨後該樣品與9μL蛋白質競爭混合物(在SB18T0.05中0.1% HSA、10μM酪蛋白、及10μM凝血酶原)及0.1mg(10μL)SA珠粒結合且經由混合於37℃培養10分鐘(標準SELEX)。如回合1，該蛋白質競爭混合物補充10μM未標誌之肌肉生長抑制素(經由被動反選擇之SELEX)，及使用SA-肌肉生長抑制素珠粒(附著有1μM肌肉生長抑制素的SA珠粒)替代SA珠粒(經由主動反選擇之SELEX)。藉由磁分離移除該珠粒。
在第一反選擇後將靶蛋白預固定在SA珠粒上以用於回合1選擇處理。為完成此，0.5mg SA珠粒與50pmole生物素標誌之靶蛋白 (GDF11同源二聚體)混合並於37℃經由搖晃培養30分鐘。藉由使用SE18T0.05清洗該珠粒兩次移除未結合靶。將反選擇之DNA候選混合物(100μL)添加至珠粒及經由混合於37℃培養60分鐘。在第一回合中不採用緩慢解離速率富集方法及各自使用100μL SB18T0.05簡單清洗珠粒5次持續2分鐘。在清洗後，藉由添加45μL 8mM NaOH從該珠粒洗脫結合之適體，及經由混合於37℃培養5分鐘。在磁分離該珠粒後將含有適體之洗脫液(40μL)轉移至新試管。使用45μL 8mM NaOH重複洗脫一次且經由混合於37℃培養5分鐘。結合該洗脫液(80μL)及藉由添加20μL 32mM HCl及2μL Tris-HCl pH7.5中和該溶液。
對於回合2-11而言，使用如下文描述之DNA候選混合物及靶蛋白進行選擇，同時使用DNA候選混合物，但不使用靶蛋白並行進行一致性選擇。比較獲自具有靶蛋白之樣品(訊號S)與不具有靶蛋白之樣品(背景值B)PCR的Ct值係用作降低下一回合靶濃度之導引。若△Ct值大於4，但小於8，則靶蛋白在下一回合降低三倍。若△Ct值大於8，則靶在下一回合降低10倍。
在此等流程後，在標準SELEX回合後GDF11濃度之降低係3倍(回合5至6)、10倍(回合7至8)、30倍(回合9至10)，及100倍(回合11)。對於經由被動反選擇之選擇而言，靶濃度之降低係3倍(回合5至6)、10倍(回合7至10)、及30倍(回合11)。對於經由主動反選擇之選擇而言，靶濃度之降低係3倍(回合5至6)、10倍(回合7)、30倍(回合8至10)、及100倍(回合11)。「RX」，其中X係數字，代表SELEX回合數字(例如，R3表明SELEX回合3)。
Figure 104138832-A0202-12-0040-229
Figure 104138832-A0202-12-0041-16
對於回合2而言，經標誌之靶蛋白(在10μL中5pmole GDF11同源二聚體)與40μL經反選擇之DNA候選混合物混合及於37℃培養15分鐘。藉由添加50μL 10mM硫酸葡聚糖接著立即添加0.1mg SA珠粒開始緩慢解離速率富集方法。此容許經由混合於37℃培養15分鐘。隨後使用100μL SB18T0.05清洗該珠粒5次。藉由添加105μL過氯酸鈉洗脫緩衝液(1.8M NaClO4，40mM PIPES pH 6.8，1mM EDTA，0.05% Triton X-100)從珠粒洗脫適體股且經由混合於37℃培養10分鐘。藉由磁分離移除該珠粒並將100μL適體洗脫液轉移至含有引子捕獲珠粒(附著有12.5pmol引子2(SEQ ID NO：2)之25μL 2.5mg/mL SA珠粒)之新試管且容許經由混合於50℃培養30分鐘。隨後使用100μL SB18T0.05清洗該珠粒三次。藉由添加85μL 40mM NaOH從珠粒洗脫該適體股，及使用20μl 160mM HCl與2μL 500mM Tris-HCl pH7.5中和該洗脫液(80μL)。
如對回合2之描述進行回合3至回合11選擇，惟在添加珠粒前15分鐘(回合3至4)、30分鐘(回合5)、45分鐘(回合6)、60分鐘(回合7)、75分鐘(回合8)、或90分鐘(回合9至11)添加硫酸葡聚糖。使用0.1mg Neutravidin Coated Sera-Mag SpeedBeads(Fisher Scientific，目錄編號09-981-155，或後文稱為NA珠粒，回合3、5、7、9、11)或使用0.1mg SA珠粒(回合4、6、8、10)進行分配。
在SELEX11回合後獲得之混合液顯示良好活性以保證Ion Torrent ePCR及定序(表3)。從各個混合液獲得384個序列以用於對照序列分析接著前導候選物之結合分析。
Figure 104138832-A0202-12-0042-17
適體擴增及純化
藉由QPCR擴增及定量獲自各個回合之所選擇適體DNA。將48μL DNA添加至12μL QPCR Mix(10X KOD DNA聚合酶緩衝液；Novagen #71157，稀釋至5X，25mM MgCl2，10μM正向PCR引子(引子1，SEQ ID NO：2)，10μM生物素化之反向PCR引子(引子2，SEQ ID NO：3)，5X SYBR Green I，0.075U/μL KOD XL DNA聚合酶，及1mM dATP、dCTP、dGTP、及dTTP各者)及在BIO-RAD MyIQ QPCR儀器中經由如下方案熱循環：96℃持續15秒，55℃持續10秒，及68℃持續30分鐘循環1次；接著96℃持續15秒，68℃持續1分鐘循環30次。使用儀器軟體完成定量及比較具有或不具有靶蛋白的所選擇之DNA複製體數量以測定訊號/背景值比例。
接著擴增，通過生物素化之反義股在SA珠粒上捕獲PCR產物。使用14mL 20mM NaOH清洗1.25mL SA珠粒(10mg/mL)一次，使用14mL SB18T0.05清洗兩次，再懸浮在1.25mL 3M NaCl+0.05% TWEEN中，及於4℃存放。將25μL SA珠粒(在3M NaCl中10mg/mL)添加至50μL雙股QPCR產物且經由混合於25℃培養5分鐘。藉由添加100μL 40mM NaOH從珠粒洗脫「有意義」股，且經由混合於37℃培 養5分鐘。丟棄洗脫之股並使用SB18T清洗該珠粒兩次接著使用16mM NaCl清洗一次。
藉由引子從固定之反義股延伸製備含有NapdUTP之適體有意義股。該珠粒懸浮於40μL引子延伸反應混合物(1X引子延伸緩衝液(120mM Tris-HCl pH 7.8，10mM KCl，7mM MgSO4，6mM(NH4)2SO4，0.1% TRITON X-100及0.001%牛血清白蛋白)，2.5μM正向引子(引子1，SEQ ID NO：2)，0.5mM dATP、dCTP、dGTP、及NapdUTP各者，及0.015U/μL KOD XL DNA聚合酶)，且經由混合於68℃培養60分鐘。使用SB18T0.05清洗該珠粒3次，及藉由添加45μL 40mM NaOH從珠粒洗脫該適體股，且經由混合於37℃培養5分鐘。在磁分離後將40μL適體洗脫液轉移至新試管，使用45μL 40mM NaOH重複洗脫再一次，且經由混合於37℃培養5分鐘。結合該等洗脫液(80μL)及使用20μL 160mM HCl中和並使用10μL 0.1M HEPES，pH 7.5緩衝該溶液。
選擇嚴格性及反饋
各個回合選擇步驟之相對靶蛋白濃度順應以下規則之QPCR訊號(△Ct)而降低：若△Ct<4，[P](i+1)=[P](i)
若4
Figure 104138832-A0202-12-0043-226
△Ct<8，[P](i+1)=[P](i)/3.2
若△Ct
Figure 104138832-A0202-12-0043-227
8，[P](i+1)=[P](i)/10
其中[P]=蛋白質濃度及i=當前回合數。
在各個選擇回合後，測定富集DNA之混合物之收斂狀態。使用含有1X SYBR Green I之4mM MgCl2將10μL雙股QPCR產物稀釋至200μL。使用測量雙股寡核苷酸複合混合物之雜合時間的C0t分析分析樣品收斂。經由如下方案熱循環該樣品：98℃持續1分鐘，85℃持續1分鐘循環3次；98℃持續1分鐘，隨後85℃持續30分鐘循環2次。在於85℃之30分鐘期間，於5秒時間間隔測量螢光影像。將螢光強度描繪 為時間對數之函數，及觀察增加之與各個SELEX回合雜合速度，表示序列收斂。
富集之混合液定序&適體一致性
在11回合SELEX後，定序收斂之混合液。如下進行序列準備。藉由使用含有獨特條碼/索引序列(各個混合液之唯一序列識別符)的SELEX庫-特異性引子之PCR擴增該混合液。使用Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Reagent(Life Technologies)分析定量獨立PCR產物，以等莫耳濃度結合，及使用Amicon Ultra-0.5離心過濾器(Millipore)濃縮/緩衝交換。隨後藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)純化該混合物，及使用Amicon Ultra-0.5離心過濾器裝置濃縮該洗脫液並藉由PAGE視覺化以確定該最終混合物之尺寸、純度及產率。將該樣品呈送至SeqWright Genomic Services(GE Healthcare,Houston,TX)以用於Ion Torrent PGM定序。從含有超過40,000個序列之序列混合液中，隨機選擇384個及使用測定序列計數/複製體數量的定製軟體分析收斂及使用局部比對算法識別常規收斂圖案。選擇在混合液中具有最佳代表/複製體數量之序列及至少一獲自每個收斂圖案之序列以進一步特徵化。應注意，從該序列分析及模體識別中移除彼等來自具有「低」序列質量分數(即20或更低之Phred質量分數)的SELEX適體混合液之序列讀數。
藉由官能分析及藉由消減序列分析之適體識別
起初通過GDF11與肌肉生長抑制素之對照結合分析(參見實例2)自序列12060-28_3(SEQ ID NO：12)及12060-16_3(SEQ ID NO：13)識別收斂圖案1。在該序列中字母「P」表示NapdU。
適體ID 12060-28_3：5'-
Figure 104138832-A0202-12-0044-18
3'(SEQ ID NO：12)
適體ID 12060-16_3：5'-
Figure 104138832-A0202-12-0045-19
-3'(SEQ ID NO：13)
並行進行，通過對照及消減序列分析獲自經由不同SELEX變異獲得之混合液之序列以電腦模擬識別收斂圖案1。此等包括獲自混合液12058(GDF11標準SELEX)之768個序列、獲自混合液12060(GDF11經由被動反選擇之SELEX)之384個序列、獲自混合液12061(GDF11經由主動反選擇之SELEX)之384個序列、及獲自12059(肌肉生長抑制素標準SELEX)之384個序列。在此等結合之混合液中之全部序列的分析及比對係用於使具有存在於全部混合液之常規圖案的序列去優先，表示GDF11與肌肉生長抑制素之不可識別結合(參見表4)。收斂圖案1高度富集在獲自GDF11經被動反選擇之SELEX的混合液12060(15%)及較低富集在獲自GDF11標準SLEX之混合液12058(3%)及在獲自肌肉生長抑制素標準SELEX之混合液12059中缺乏，表示GDF11特異性。
Figure 104138832-A0202-12-0045-20
實例2：用於結合GDF11之適體的夾層SELEX
夾層SELEX分析可用於識別額外GDF11特異性適體，使用含有 2NEdU之結合GDF11之適體。夾層SELEX描述於WO 2015/048084。簡潔言之，使用靶-適體複合物(即，GDF11與含有2NEdU之適體複合)進行SELEX。已發現一些在使用夾層SELEX篩選之NapdU混合液中識別之適體係與適體12060-28相似。此等純系在下文進一步討論。
實例3：GDF11蛋白質與肌肉生長抑制素之適體之平衡結合常數(K d )
此實例提供適體-GDF11及適體-肌肉生長抑制素蛋白質之蛋白質結合親和力(Kd)，及識別比肌肉生長抑制素優先結合GDF11之適體。
通過反選擇SELEX方法及通過本文描述之夾層SELEX方法選擇之若干適體純系進一步特徵化及選擇以用於比肌肉生長抑制素優先結合GDF11(參見表5)。在缺乏及存在1μM作為非特異性競爭劑之Z阻斷劑(無規寡核苷酸序列)時進行結合分析。具有BndU作為C-5經修飾之嘧啶之適體(BndU GDF11適體)，其先前通過不具有反選擇步驟之SELEX選擇及用作結合GDF11與肌肉生長抑制素之對照。使用BndU GDF11適體之先前結合試驗顯示一般不能識別GDF11與肌肉生長抑制素。
Figure 104138832-A0202-12-0046-21
Figure 104138832-A0202-12-0047-22
已藉由經由被動反選擇之SELEX獲得的適體混合液12060(NapdU適體)含有若干具有親和力及不同程度對GDF11之選擇性(參見Kd比例，其中較大數值表明GDF11優於肌肉生長抑制素之較高特異性)的核苷酸序列。特定言之，當存在1μM Z阻斷劑測試時適體純系12060-16_3(NapdU)顯示GDF11優於肌肉生長抑制素之約50倍差異Kd(即，6.52nM對比>320nM之Kd)，及當存在1μM Z阻斷劑測試時構成9%核苷酸序列之12060適體混合液的12060-28_3(NapdU)顯示GDF11優於 肌肉生長抑制素之約100倍差異Kd(即，1.74nM對比>320nM之Kd)(參見圖1)。藉由夾層SELEX獲得之適體混合液16139(NapdU)亦含有若干具有對於GDF11高親和力或特異性之核苷酸序列。
表5之另一適體純系顯示GDF11親和力在肌肉生長抑制素親和力範圍。例如，獲自標準SELEX之適體混合液12058(NapdU)由序列12058-6(17%)主導。對於GDF11而言此適體純系具有0.09nM之Kd，但對於肌肉生長抑制素而言亦具有0.12nM之Kd(圖2)。
實例4：後SELEX截斷及GDF11適體12060-28之分析
此實例提供該12060-28_3適體之截斷序列的後SELEX GDF11結合親和力及識別能結合至GDF11的核心最小序列長度。
適體12060-28(NapdU)截斷表明20-mer序列5'-GACPPGCPPPAAGPPPAGCC-3'(適體12060-28_37；SEQ ID NO：156)能夠結合GDF11。然而，21-mer序列5'-GGACPPGCPPPAAGPPPAGCC-3'(適體純系12060-28_36；SEQ ID NO：157)之活性顯示與GDF11(4.43E-10之K d )的相對較佳結合(參見圖3)。此與在關於12060-28之活性純系族中發現之保留模體CPPGCPPPANGPPPAGC(SEQ ID NO：105)一致，即僅該40mer核心區域(模體)之位置12至24之NapdU殘基需要結合。
實例5：特異性GDF11適體序列
此實例提供前導GDF11選擇性適體結合劑(12060-28_3)與其他通過SELEX處理方法之適體序列的序列比對。這導致識別在通過SELEX選擇之序列混合液多個序列中之模體。進一步提供選擇序列之親和力數據。參見用於比對序列(50-mers)及結合親和力之表6。表7提供獲自適體混合液12060及12058之額外序列及其比對。表7中顯示具有在序列之(40-mers)5'與3'末端各者移除的五(5)個核苷酸之序列。表6及表7均提供在序列間共用之「核心序列」模體基礎。此序列可係 GACPPGAPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：106)；GACPPGAPPPAAGPPPAGC(SEQ ID NO：107)；GACPPGCPPPAAGPPPAGC(SEQ ID NO：108)；GACPPGCPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：109)；GCCPPGAPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：142)；CACPPGAPPPACGPPPAGG(SEQ ID NO：143)；GACPPGGPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：144)；GCCPPGCPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：145)；GCAPPGAPPPACGPPPAGC(SEQ ID NO：146)；GGCPPGCPPPACGPPPAGA(SEQ ID NO：147)；CGCPPGAPPPAAGPPPAGG(SEQ ID NO：148)；AACPPGAPPPAAGPPPAGG(SEQ ID NO：149)；或GACPPGAPPPAGGPPPAGC(SEQ ID NO：150)；其中在各個實例中P係NapdU。在一些實施例中，保留模體係NNCPPGRPPPAMGPPPAGS(SEQ ID NO：141)，其中在各個實例中P係NapdU，R係A或G；各個N在每次出現時獨立地係A、G、或C；M係A或C；及S係G或C。已發現在表6中在12060-28中含有胞嘧啶核苷代替保留的NapdU之一的序列12060-209_3不結合GDF11。
Figure 104138832-A0202-12-0049-23
Figure 104138832-A0202-12-0050-24
Figure 104138832-A0202-12-0051-26
Figure 104138832-A0202-12-0051-27
實例6：GDF11適體序列
此實例提供使用前導GDF11選擇性適體結合序列(12060-28_3)之SELEX適體混合液之BLAST分析的結果。與在實例5中進行之比對相比此分析係較不嚴格，及導致識別亦含有常規或核心模體之額外適體序列。參見用於序列比對之表8。
自表8中序列比對可衍生若干模體序列，其中各個模體維持與在實例3及4中12060-28_3適體序列比對識別之模體(或常規序列)重疊。
第一模體可如下定義：5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：110)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；S係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
第二模體可如下定義：5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：111)。第三模體可如下定義：5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：112)。第四模體可如下定義：5'-RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC-3’(SEQ ID NO：113)。在第二、第三及第四模體各者中，各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；S係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
第一模體可如下定義：5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：151)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或 G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；各個S在每次出現時獨立地係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
第二模體可如下定義：5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：152)。第三模體可如下定義：5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：153)。第四模體可如下定義：5'-RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS-3’(SEQ ID NO：154)。在第二、第三及第四模體各者中，各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；各個S在每次出現時獨立地係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1。
Figure 104138832-A0202-12-0053-28
Figure 104138832-A0202-12-0054-29
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<150> US 62/113,864
<151> 2015-02-09
<160> 160
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<221> 經修飾鹼基
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<223> 生物素
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0056-33
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0058-35
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<213> 現代人
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Figure 104138832-A0202-12-0059-37
Figure 104138832-A0202-12-0060-38
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0062-41
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<220>
<221> misc_feature
<223> 大鼠GDF11蛋白質ID係Q9Z217；例示性大鼠成熟GDF8
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Figure 104138832-A0202-12-0063-42
Figure 104138832-A0202-12-0064-44
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<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類肌肉生長抑制素(GDF8)蛋白質ID係014793；例示性人類成熟GDF8
<400> 9
Figure 104138832-A0202-12-0064-45
Figure 104138832-A0202-12-0065-46
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<213> 小鼠Sp.
<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0066-47
Figure 104138832-A0202-12-0067-48
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<212> PRT
<213> 大鼠sp.
<220>
<221> misc_feature
<223> 大鼠GDF11蛋白質ID係035312；例示性大鼠成熟GDF8
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Figure 104138832-A0202-12-0067-49
Figure 104138832-A0202-12-0068-50
Figure 104138832-A0202-12-0069-51
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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Figure 104138832-A0202-12-0069-52
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0070-53
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<211> 50
<212> DNA
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<220>
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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Figure 104138832-A0202-12-0071-55
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0072-56
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<211> 50
<212> DNA
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<220>
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<223> n係NapdU
<220>
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0072-57
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0073-58
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<400> 18
Figure 104138832-A0202-12-0074-59
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0075-60
<210> 20
<211> 50
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<210> 21
<211> 50
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<223> n係NapdU
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<221> misc_feature
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<220>
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0076-62
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<211> 50
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<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0077-63
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<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 23
Figure 104138832-A0202-12-0077-64
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
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<220>
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
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<220>
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<223> n係NapdU
<400> 24
Figure 104138832-A0202-12-0078-65
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<220>
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0079-66
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
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<220>
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<220>
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<400> 26
Figure 104138832-A0202-12-0079-67
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(32)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n係NapdU
<400> 27
Figure 104138832-A0202-12-0080-68
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
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<223> 合成
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Figure 104138832-A0202-12-0093-87
<210> 47
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<210> 48
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<223> 合成
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<222> (11)..(13)
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Figure 104138832-A0202-12-0109-107
<210> 67
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 87
Figure 104138832-A0202-12-0124-129
<210> 88
<211> 44
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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<211> 40
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 合成
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<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
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<220>
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<220>
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Figure 104138832-A0202-12-0131-143
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<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0132-144
<210> 103
<211> 24
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
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<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0132-145
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<220>
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<220>
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<223> 合成
<220>
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<220>
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
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<221> misc_feature
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<220>
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<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0135-151
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<211> 19
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<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0135-152
<210> 110
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<220>
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<220>
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Figure 104138832-A0202-12-0136-153
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<211> 28
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 可或可不存在
<400> 111
Figure 104138832-A0202-12-0137-154
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (6)..(7)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 可或可不存在
<220>
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<220>
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<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 可或可不存在
<400> 112
Figure 104138832-A0202-12-0139-155
<210> 113
<211> 25
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<400> 113
Figure 104138832-A0202-12-0139-157
<210> 114
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 114
Figure 104138832-A0202-12-0140-159
<210> 115
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 115
Figure 104138832-A0202-12-0140-160
<210> 116
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(13)
<223> 若存在n，則係a、c、g、t、或u；缺乏多達3個核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 116
Figure 104138832-A0202-12-0141-161
<210> 117
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<400> 117
Figure 104138832-A0202-12-0141-162
<210> 118
<211> 108
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<220>
<221> misc_feature
<223> 例示性成熟人類GDF11蛋白質
<400> 118
Figure 104138832-A0202-12-0141-163
Figure 104138832-A0202-12-0142-164
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> 現代人
<220>
<221> misc_feature
<223> 例示性成熟人類GDF8蛋白質
<400> 119
Figure 104138832-A0202-12-0142-165
<210> 120
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n係NapdU
<400> 120
Figure 104138832-A0202-12-0143-166
<210> 121
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<400> 121
Figure 104138832-A0202-12-0144-167
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(28)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(34)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<400> 122
Figure 104138832-A0202-12-0144-168
<210> 123
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_featture
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<223> n係NapdU
<400> 123
Figure 104138832-A0202-12-0145-169
<210> 124
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(33)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n係NapdU
<400> 124
Figure 104138832-A0202-12-0146-170
<210> 125
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(36)
<223> n係NapdU
<400> 125
Figure 104138832-A0202-12-0146-171
<210> 126
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(44)
<223> n係NapdU
<400> 126
Figure 104138832-A0202-12-0147-172
<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n係NapdU
<400> 127
Figure 104138832-A0202-12-0148-173
<210> 128
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(28)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<400> 128
Figure 104138832-A0202-12-0149-174
<210> 129
<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(28)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(34)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n係NapdU
<400> 129
Figure 104138832-A0202-12-0149-175
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<400> 130
Figure 104138832-A0202-12-0150-176
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0150-177
<210> 132
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0151-178
<210> 133
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> n係NapdU
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Figure 104138832-A0202-12-0152-179
<210> 134
<211> 52
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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Figure 104138832-A0202-12-0152-180
<210> 135
<211> 47
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(27)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(38)
<223> n係NapdU
<400> 135
Figure 104138832-A0202-12-0153-181
<210> 136
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(28)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> n係NapdU
<400> 136
Figure 104138832-A0202-12-0154-182
<210> 137
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 137
Figure 104138832-A0202-12-0154-183
<210> 138
<211> 50
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 138
Figure 104138832-A0202-12-0155-184
<210> 139
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 139
Figure 104138832-A0202-12-0156-185
<210> 140
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(23)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(29)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n係NapdU
<400> 140
Figure 104138832-A0202-12-0156-186
<210> 141
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 141
Figure 104138832-A0202-12-0157-187
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 142
Figure 104138832-A0202-12-0157-188
<210> 143
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 143
Figure 104138832-A0202-12-0158-190
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 144
Figure 104138832-A0202-12-0158-191
<210> 145
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 145
Figure 104138832-A0202-12-0159-192
<210> 146
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 146
Figure 104138832-A0202-12-0159-193
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 147
Figure 104138832-A0202-12-0159-194
<210> 148
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 148
Figure 104138832-A0202-12-0160-195
<210> 149
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 149
Figure 104138832-A0202-12-0160-196
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 150
Figure 104138832-A0202-12-0161-197
<210> 151
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 可或可不存在
<400> 151
Figure 104138832-A0202-12-0162-198
<210> 152
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 可或可不存在
<400> 152
Figure 104138832-A0202-12-0163-199
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n係a、c、g、或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> 可或可不存在
<400> 153
Figure 104138832-A0202-12-0164-200
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可或可不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 可或可不存在
<400> 154
Figure 104138832-A0202-12-0165-201
<210> 155
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 155
Figure 104138832-A0202-12-0165-202
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係NapdU
<400> 156
Figure 104138832-A0202-12-0166-203
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n係NapdU
<400> 157
Figure 104138832-A0202-12-0166-204
<210> 158
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(24)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(30)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n係NapdU
<400> 158
Figure 104138832-A0202-12-0167-205
<210> 159
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(32)
<223> n係NapdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n係NapdU
<400> 159
Figure 104138832-A0202-12-0168-206
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(13)
<223> 若存在n，則係a、c、g、t、或u；缺乏多達3個核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n係C-5經修飾之嘧啶
<400> 160
Figure 104138832-A0202-12-0168-208

Claims (50)

  1. 一種結合GDF11之適體，其中：(a)該適體包括序列：5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：110)或5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：151)，其中：各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶；R係A或G；各個W在每次出現時獨立地係A、T、或U；各個M在每次出現時獨立地係A或C；各個S在每次出現時獨立地係G或C；各個n在每次出現時獨立地係0或1；及各個m在每次出現時獨立地係0或1，或(b)該適體包括序列5’-CPPGMPPPNxPPPAGC-3’(SEQ ID NO：160)或5’-CPPGMPPPNxPPPAGG-3’(SEQ ID NO：116)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，其中x係2、3、4、或5，其中M係C或A，及其中各個N在每次出現時獨立地選自A、C、G、T、及U。
  2. 如請求項1之適體，其中該適體以小於10nM之親和力結合GDF11，其中，在該相同條件下，該適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8或不結合GDF8。
  3. 如請求項2之適體，其中該適體以至少20倍、或至少30倍、或至少50倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8。
  4. 如請求項2之適體，其中該適體以大於50nM，或大於100nM， 或大於150nM，或大於200nM，或大於250nM，或大於300nM之親和力結合GDF8。
  5. 如請求項1之適體，其中該適體以小於8nM，或小於7nM，或小於6nM，或小於5nM，或小於4nM，或小於3nM，或小於2nM，或小於1nM之親和力結合GDF11。
  6. 如請求項2之適體，其中該適體不結合GDF8。
  7. 如請求項2-5中任一項之適體，其中使用包括多陰離子抑制劑之結合分析測定親和力。
  8. 如請求項7之適體，其中該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。
  9. 如請求項1之適體，其中該適體包括選自下列之序列：a)5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：111)；b)5'-RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：152)；c)5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC-3’(SEQ ID NO：112)；d)5'-RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS-3’(SEQ ID NO：153)；e)5'-RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC-3’(SEQ ID NO：113)；及f)RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS-3’(SEQ ID NO：154)。
  10. 如請求項1或9之適體，其中若R係G，則該第一個W係A，及其中若R係A，則該第一個W係C。
  11. 如請求項1或9之適體，其中至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6個n係0。
  12. 如請求項1或9之適體，其中各個n係0。
  13. 如請求項1或9之適體，其中至少1、至少2、至少3個n係1。
  14. 如請求項1或9之適體，其中至少1個m係0。
  15. 如請求項1或9之適體，其中至少1個m係1。
  16. 如請求項1之適體，其中該適體包括序列5’-CPPGMPPP-3’(SEQ ID NO：114)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，及其中M係C或A。
  17. 如請求項1之適體，其中該適體包括序列5’-PPPAGC-3’(SEQ ID NO：115)或5’-PPPAGG-3’(SEQ ID NO：155)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶。
  18. 如請求項1之適體，其中x係3或4。
  19. 如請求項18之適體，其中Nx包括序列5’-AAG-3’或5’-ACG-3’或5’-AGG-3’。
  20. 如請求項1之適體，其中該適體包括序列5’-NNCPPGRPPPAMGPPPAGS-3’(SEQ ID NO：141)，其中各個P在每次出現時獨立地係C-5經修飾之嘧啶，R係A或G；各個N在每次出現時獨立地係A、G、或C；M係A或C；及S係G或C。
  21. 如請求項1、9及16至20中任一項之適體，其中各個P在每次出現時獨立地選自：5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)，5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-苄基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-苯乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(PEdU)，5-(N-苯硫基甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)， 5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)，5-(N-酪胺醯基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TyrdU)，5-(N-3,4-亞甲基二氧苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(MBndU)，5-(N-4-氟苄基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(FBndU)，5-(N-3-苯丙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(PPdU)，5-(N-咪唑基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ImdU)，5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-異丁基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-R-蘇胺基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(ThrdU)，5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，氯化5-(N-[1-(3-三甲銨)丙基]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-[1-(2,3-二羥丙基)]羧基醯胺)-2'-去氧尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷， 5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
  22. 如請求項1、9及16至20中任一項之適體，其中各個P在每次出現時獨立地選自：5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯并苯硫基乙基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
  23. 如請求項1、9及16至20中任一項之適體，其中至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6個P各者獨立地選自5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、及5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
  24. 如請求項1、9及16至20中任一項之適體，其中各個P係獨立地選自5-(N-萘甲基羧基醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-O-甲基尿苷、及5-(N-2-萘甲基羧基醯胺)-2'-氟尿苷。
  25. 如請求項1之適體，其中該適體包括選自SEQ ID NO：12、13、15至109、117，及120至140之序列。
  26. 如請求項1之適體，其中該適體包括選自SEQ ID NO：12、15、26、105至109，及142至150之序列。
  27. 如請求項1、9、16至20、25及26中任一項之適體，其中該適體由18至200個核苷酸、或18至150個核苷酸、或18至100個核苷酸、或18至75個核苷酸、或18至50個核苷酸、或20至150個核苷酸、或20至100個核苷酸、或20至75個核苷酸、或20至50個核苷酸構成，其中各個核苷酸可獨立地係經修飾或未經修飾之核苷酸。
  28. 如請求項1、9、16至20、25及26中任一項之適體，其中該適體包括可檢測標誌。
  29. 如請求項1、9、16至20、25及26中任一項之適體，其中GDF11係人類GDF11及GDF8係人類GDF8。
  30. 如請求項29之適體，其中GDF11係包括SEQ ID NO：118序列之成熟人類GDF11，及GDF8係包括SEQ ID NO：119序列之成熟人類GDF8。
  31. 一種檢測樣品中GDF11或測定樣品是否包括GDF11之方法，包括使獲自該樣品之蛋白質與如請求項1至30中任一項之適體接觸。
  32. 如請求項31之方法，其中該適體以至少10倍弱於對GDF11親和力之親和力結合GDF8或不結合GDF8。
  33. 如請求項31之方法，其中該樣品包括GDF8。
  34. 如請求項31之方法，其中該方法包括在嚴格條件下使該樣品與該適體接觸。
  35. 如請求項34之方法，其中該嚴格條件包括多陰離子抑制劑。
  36. 如請求項35之方法，其中該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。
  37. 如請求項31之方法，其中該樣品係獲自人類之樣品。
  38. 如請求項37之方法，其中該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。
  39. 如請求項38之方法，其中該組織樣品係選自心臟肌肉組織、骨骼肌組織、胰臟組織、軟骨組織及神經組織。
  40. 如請求項31之方法，其中該蛋白質已經與該樣品之至少一其他組分分離。
  41. 如請求項31之方法，其中該蛋白質未與該樣品之其他組分分離。
  42. 一種組合物，包括如請求項1至30中任一項之適體及獲自樣品之蛋白質。
  43. 如請求項42之組合物，其中該樣品包括GDF8。
  44. 如請求項42之組合物，包括多陰離子抑制劑。
  45. 如請求項44之組合物，其中該多陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z阻斷劑、聚-dI/dC、經超音波處理或切斷的鮭魚精子DNA、小牛胸腺DNA、及dNTPs。
  46. 如請求項42之組合物，其中該樣品係獲自人類之樣品。
  47. 如請求項46之組合物，其中該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。
  48. 如請求項47之組合物，其中該組織樣品係選自心臟肌肉組織、骨骼肌組織、胰臟組織、軟骨組織及神經組織。
  49. 如請求項42之組合物，其中該蛋白質已經與該樣品之至少一其他組分分離。
  50. 如請求項42之組合物，其中該蛋白質未與該樣品之其他組分分離。
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