JP6768651B2 - 増殖分化因子11と結合するための核酸化合物 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年11月24日出願の米国特許仮出願第62/083,592号明細書、及び2015年2月9日出願の米国特許仮出願第62/113,864号明細書の優先権の利益を主張し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、2015年11月23日に作成された「2015−11−23_01137−0011−00PCT_ST25.txt」と題したファイルとして提供され、サイズは122,816バイトである。配列表の電子形式における情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。
a)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111);
b)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:152);
c)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112);
d)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:153);
e)5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113);及び
f)RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS−3’(配列番号:154)から選択される配列を含む。
上記配列のいくつかの実施形態では、RがGである場合、最初のWはAであってよく、RがAである場合、最初のWはCであってよい。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのnが、0である。いくつかの実施形態では、各nは0である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つのnが、1である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、0である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのmが、1である。
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾリルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニニルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアモニウム(trimethylamonium))プロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのPは各々、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される。
本発明は、ある種の代表的な実施形態に関連して記載されるだろうが、本発明は特許請求の範囲により定義され、それらの実施形態に限定されないことが理解されるだろう。
L GLDCDEHSSE SRCCRYPLTV DFEAFGWDWI IAPKRYKANY CSGQCEYMFM QKYPHTHLVQ QANPRGSAGP CCTPTKMSPI NMLYFNDKQQ IIYGKIPGMV VDRCGCS(配列番号:118)。
いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、GDF11アプタマーは、GDF8と結合しない。非限定的で例示的な成熟ヒトGDF8タンパク質は、以下に示される(UniProtKB/Swiss−Prot:O14793.1のアミノ酸267〜375):
FGL DCDEHSTESR CCRYPLTVDF EAFGWDWIIA PKRYKANYCS GECEFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCC TPTKMSPINM LYFNGKEQII YGKIPAMVVD RCGCS(配列番号:119)。
A.増殖分化因子11(GDF11)及びミオスタチン(GDF8)タンパク質
GDF11及びミオスタチンの天然成熟型はホモ二量体であり、配列アラインメントにより約90%同一であり、109のアミノ酸残基のうち98がマッチングする。GDF11(タンパク質ID095390;アミノ酸1〜407;配列番号:4)及びミオスタチン(タンパク質ID014793;アミノ酸1〜375;配列番号:5)のアミノ酸配列アラインメント、灰色のバーで示される成熟型を参照のこと。GDF11及びミオスタチンプレプロペプチドのアミノ酸配列のアラインメントは、以下に示される。成熟タンパク質部分は、灰色のバーで強調表示される。
SELEXは一般に、核酸の候補混合物を調製すること、この候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、この親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、核酸を親和性複合体から分離及び単離すること、この核酸を精製すること、ならびに特異的アプタマー配列を同定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに改良するために複数のラウンドを含んでよい。このプロセスは、プロセス中に1回以上の時点で増幅ステップを含み得る。例えば、「Nucleic Acid Ligands」と題した米国特許第5,475,096号明細書を参照のこと。SELEX法は、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用され得る。例えば、「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi−SELEX」と題した米国特許第5,705,337号明細書を参照のこと。
アプタマーは、その特質及び特性を改善する修飾ヌクレオチドを含有してよい。このような改善の非限定的例としては、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び/または送達特性の改善が挙げられる。
式中、
R’’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C20);ハロゲン(F、Cl、Br、I);ニトリル(CN);ボロン酸(BO2H2);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’);一級アミド(CONH2);二級アミド(CONHR’’);三級アミド(CONR’’R’’’);スルホンアミド(SO2NH2);N−アルキルスルホンアミド(SONHR’’)からなる群から選択される。
式中、
R’’、R’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C2));フェニル(C6H5);R’’’’置換フェニル環(R’’’’C6H4)(式中、R’’’’は上で定義される);カルボン酸(COOH);カルボン酸エステル(COOR’’’’’)(式中、R’’’’’は分岐鎖または直鎖低級アルキル(C1〜C20)である);及びシクロアルキルからなる群から独立して選択され、式中、R’’=R’’’=(CH2)nであり;式中、n=2〜10である。
GDF11と結合するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、10nM未満の親和性でGDF11と結合する。いくつかのこのような実施形態では、アプタマーは、両方の親和性が同じ結合条件下で測定される場合、GDF11に対する親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、0.5nM〜10nMの親和性でGDF11と結合し、50nM超、または100nM超、または150nM超、または200nM超、または300nM超の親和性でGDF8と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、アプタマーが10nM未満の親和性でGDF11と結合する場合と同じ条件下でGDF8と結合しない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、8nM未満、もしくは7nM未満、もしくは6nM未満、もしくは5nM未満、もしくは4nM未満、もしくは3nM未満、もしくは2nM未満、もしくは1nM未満;または0.1nM〜10nM、0.1nM〜8nM、もしくは0.1nM〜5nMの親和性でGDF11と結合する。
いくつかの実施形態では、GDF11と結合するアプタマーは、配列:
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC− 3’(配列番号:110)(式中:
各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;
Rは、AまたはGであり;
各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;
各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;
Sは、GまたはCであり;
各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;
各mは独立して、かつ各存在について0または1である)を含む。
a)5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111);
b)5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112);及び
c)5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113)
(式中、R、W、P、M、S、n、及びmは、上記の通りに定義される)から選択される配列を含む。
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも6つのPは各々、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される。
いくつかの実施形態では、試料中のGDF11を検出する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、GDF8の存在下でGDF11を検出または定量化する方法が提供され、これはGDF11とGDF8の両方を含有すると推測される試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料中のGDF11をGDF8と区別する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で試料を本明細書に記載されるGDF11アプタマーと接触させることを含む。
本開示は、本明細書に記載されるGDF11アプタマーのいずれかを含むキットを提供する。このようなキットは、例えば、(1)少なくとも1種のGDF11アプタマー;及び(2)少なくとも1種の薬学的に許容される担体、例えば溶媒または溶液などを含み得る。追加のキット成分は、例えば:(1)本明細書で同定される薬学的に許容される賦形剤、例えば安定剤、緩衝剤などのいずれか、(2)キット成分を保持及び/または混合するための少なくとも1種の容器、バイアルまたは類似の装置;ならびに(3)送達装置を場合により含み得る。
本実施例は、成熟GDF11タンパク質と結合するアプタマーの選択及び作製の代表的な方法を提供する。
GDF11を用いるSELEXを、本明細書に記載されるSELEX方法を使用して実施した。加えて、異なる2種類の対抗選択を含むプロトコール変更を、ミオスタチンと結合しない、またはミオスタチンよりもGDF11に対してより高い親和性を有するGDF11アプタマーを選択するために適用した:すなわち、受動的対抗選択及び能動的対抗選択。
部分的にランダム化したssDNAオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ssDNA鋳型にアニーリングしたDNAプライマーのポリメラーゼ伸長により調製した(以下の表2に示す)。候補混合物は、dATP、dGTP、dCTP及び5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン三リン酸(NapdUTP)を含有する40ヌクレオチドのランダム化カセットを含有した。
E.coli中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトGDF11タンパク質(Peprotech、カタログ番号120−11)を、NHS−PEO4−ビオチン(PIERCE、EZ−Link NHS−PEG4−ビオチン)と、一級アミンを含有する残基との共有結合によりビオチン化した。タンパク質(80μL中に1600pmol)を4倍モル過剰のNHS−PEG4−ビオチンと混合し、反応物を20℃で1時間放置してインキュベートした。反応が完了した後、未反応のNHS−PEG4−ビオチンを、緩衝液をSB18T0.05に交換してからZeba(商標)スピン脱塩カラム(PIERCE)を使用して除去した。
E.coli中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトミオスタチンタンパク質(Peprotech、カタログ番号120−00)を、上に記載の通りにビオチン化した。
MYONE−SA常磁性ビーズ(MYONE SA、INVITROGEN、または以後SAビーズと称する)を、14mLの20mMのNaOHで1回、14mLのSB18T0.05で2回ビーズを洗浄することにより調製した。最後に、SAビーズをSB18T0.05中に10mg/mLで懸濁し、使用するまで4℃で保存した。ビオチン標識ミオスタチンタンパク質(500pmol)を、SELEXの全てのラウンドのために固定化した。これは、SAビーズ(5mg)をビオチン標識ミオスタチン(500pmol)と30分間振盪しながら混合し、続いてSB18T0.05で3回洗浄することにより達成した。SA−ミオスタチンビーズを0.5mLのSB18T0.05中に再懸濁し(1μMのミオスタチンが結合した10mg/mLのビーズ)、使用するまで4℃で保存した。
合計で11ラウンドのSELEX法を、親和性及び遅いオフ速度についての選択により完了した。各ラウンド前に、対抗選択を実施してバックグラウンドを減少させ、タンパク質に非特異的に結合するアプタマーを得る可能性を減少させた。加えて、異なる種類の対抗選択を適用し、密接に関連した90%同一のタンパク質ミオスタチンと結合しないGDF11アプタマーの選択を進めた。対抗選択を以下の通りに実施した。
各ラウンドからの選択したアプタマーDNAをQPCRにより増幅し、定量化した。48μLのDNAを、12μLのQPCR混合物(5倍に希釈した10倍KOD DNA Polymerase緩衝液;Novagen番号71157、25mMのMgCl2、10μMのフォワードPCRプライマー(プライマー1、配列番号:2)、10μMのビオチン化リバースPCRプライマー(プライマー2、配列番号:3)、5倍SYBR Green I、0.075U/μLのKOD XL DNA Polymerase、ならびに各々1mMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP)に添加し、BIO−RAD MyIQ QPCR機器において次のプロトコール:96℃で15秒間、55℃で10秒間、及び68℃で30分間を1サイクル;続いて、96℃で15秒間、68℃で1分間を30サイクルで熱サイクルを行った。定量化を機器ソフトウェアで行い、標的タンパク質の有無にかかわらず、選択したDNAのコピー数を比較してシグナル/バックグラウンド比を決定した。
選択ステップの標的タンパク質相対濃度を、以下の規則に従いQPCRシグナル(ΔCt)に応答して各ラウンドで低下させた。
ΔCt<4の場合、[P](i+1)=[P](i)
4≦ΔCt<8の場合、[P](i+1)=[P](i)/3.2
ΔCt≧8の場合、[P](i+1)=[P](i)/10
式中、[P]=タンパク質濃度、i=現ラウンド数。
SELEXの11ラウンド後、収束したプールを配列決定した。配列調製を以下の通りに実施した。プールを、特有のバーコード/インデックス配列(各プールについての特有の配列識別子)を含有するSELEXライブラリー特異的プライマーを使用して、PCRにより増幅した。個々のPCR産物をQuant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNA Reagent(LIFE TECHNOLOGIES)アッセイを使用して定量化し、等モル濃度で混合して、AMICON Ultra−0.5遠心式フィルターデバイス(MILLIPORE)を使用して濃縮/緩衝液交換を行った。次いで、混合物をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製し、溶出液を、Amicon Ultra−0.5遠心式フィルターデバイスを使用して濃縮し、最終混合物のサイズ、純度及び収率を確認するためにPAGEで可視化した。試料を、Ion Torrent PGM配列決定のためにSeqWright Genomic Services(GE HEALTHCARE、ヒューストン、テキサス州)に提出した。40,000超の配列を含有する配列プールから、384をランダムに選択し、配列数/コピー数を決定し、かつローカルアラインメントアルゴリズムを使用して共通収束パターンを同定するカスタムソフトウェアを使用して収束について分析した。プール内で最高表示/コピー数を有する配列及び全ての収束パターンから少なくとも1つの配列を、さらなる特徴付けのために選択した。留意することとして、「低い」配列クオリティスコア(すなわち、20以下のPhredクオリティスコア)を有した、SELEXアプタマープールからのこれらの配列読み取り結果は、配列分析及びモチーフ同定から除去した。
収束パターン1を、GDF11及びミオスタチンを用いる比較結合アッセイにより配列12060−28_3(配列番号:12)及び12060−16_3(配列番号:13)から最初に同定した(実施例2を参照のこと)。配列中の「P」という文字は、NapdUを示す。
アプタマーID 12060−28_3:
5’−ccctgCGCCPPCGGACPPGCPPPAAGPPPAGCCGCPPGCPCACAPcacaa−3’(配列番号:12)
アプタマーID 12060−16_3:
5’−ccctgPGAGACPPGAPPPACGPPPAGCPGCPAACAPGGGGAACCAcacaa−3’(配列番号:13)
サンドイッチSELEXアッセイを使用し、GDF11と結合する2NEdU含有アプタマーを使用して追加のGDF11特異的アプタマーを同定した。サンドイッチSELEXは、WO2015/048084に記載されている。簡潔に述べると、SELEXを標的−アプタマー複合体(すなわち、2NEdU含有アプタマーと複合化したGDF11)を使用して実施する。サンドイッチSELEXを使用してスクリーニングしたNapdUプール中で同定したアプタマーのいくつかが、アプタマー12060−28と類似していることを見出した。これらのクローンを以下でさらに考察する。
本実施例は、アプタマー−GDF11及びアプタマー−ミオスタチンタンパク質のタンパク質結合親和性(Kd)、ならびにミオスタチンよりもGDF11と選択的に結合するアプタマーの同定を提供する。
本実施例は、SELEX後の、12060−28_3アプタマーの切断配列に対するGDF11結合親和性及びGDF11に結合することができるコア最小配列長の同定を提供する。
本実施例は、SELEX法により選択したその他のアプタマー配列を有する主要なGDF11選択的アプタマーバインダー(12060−28_3)の配列アラインメントを提供する。これは、SELEXにより選択した配列プール中における複数の配列中のモチーフ配列の同定をもたらした。選択した配列についての親和性データをさらに提供する。配列(50mer)のアラインメント及び結合親和性については表6を参照のこと。表7は、アプタマープール12060及び12058からの追加の配列ならびにそれらのアラインメントを提供する。表7の配列は、配列(40mer)の5’末端及び3’末端の各々で5つ(5)のヌクレオチドを除去したものを示す。表6及び表7の両方とも、配列中で共有される「コア配列」モチーフの基礎を提供する。この配列は、GACPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:106);GACPPGAPPPAAGPPPAGC(配列番号:107);GACPPGCPPPAAGPPPAGC(配列番号:108);GACPPGCPPPACGPPPAGC(配列番号:109);GCCPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:142);CACPPGAPPPACGPPPAGG(配列番号:143);GACPPGGPPPACGPPPAGC(配列番号:144);GCCPPGCPPPACGPPPAGC(配列番号:145);GCAPPGAPPPACGPPPAGC(配列番号:146);GGCPPGCPPPACGPPPAGA(配列番号:147);CGCPPGAPPPAAGPPPAGG(配列番号:148);AACPPGAPPPAAGPPPAGG(配列番号:149);またはGACPPGAPPPAGGPPPAGC(配列番号:150)(式中、各場合においてPはNapdUである)であってよい。いくつかの実施形態では、保存モチーフは、NNCPPGRPPPAMGPPPAGS(配列番号:141)(式中、各場合においてPはNapdUであり、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCである)である。表6の配列12060−209_3は、12060−28中の1つの保存NapdUの代わりにシトシンを含有し、GDF11と結合しないことを見出した。
本実施例は、主要なGDF11選択的アプタマーバインダー配列(12060−28_3)を使用した、SELEXアプタマープールのBLAST分析結果を提供する。この分析は、実施例5で実施したアラインメントよりも低ストリンジェントであって、共通モチーフまたはコアモチーフをさらに含有した追加のアプタマー配列の同定をもたらした。配列のアラインメントについては表8を参照のこと。
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:110)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;SはGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)。
5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:111)。第3モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGC−3’(配列番号:112)。第4モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGC−3’(配列番号:113)。第2、第3及び第4モチーフの各々において、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;SはGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である。
5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:151)(式中、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である)。
5’−RWnACnCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:152)。第3モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RWnMCnCPPGMmMPPPAnACnMCmGWnPPGnPASnGS−3’(配列番号:153)。第4モチーフは、以下の通りであってよい:5’−RMCPPGMmMPPPAnACnMCmRWnPPPASnGS−3’(配列番号:154)。第2、第3及び第4モチーフの各々において、各Pは独立して、かつ各存在についてC−5修飾ピリミジンであり;RはAまたはGであり;各Wは独立して、かつ各存在についてA、T、またはUであり;各Mは独立して、かつ各存在についてAまたはCであり;各Sは独立して、かつ各存在についてGまたはCであり;各nは独立して、かつ各存在について0または1であり;各mは独立して、かつ各存在について0または1である。
Claims (38)
- 配列5’−CPPGCPPPANGPPPAGC−3’(配列番号:105)又は配列5’−NNCPPGRPPPAMGPPPAGS−3’(配列番号:141)(式中、RはAまたはGであり;各Nは独立して、かつ各存在についてA、G、またはCであり;MはAまたはCであり;SはGまたはCであり、各Pは独立して、かつ各存在について、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される)を含む、
GDF11と結合するアプタマー。 - 10nM未満の親和性でGDF11と結合し、同一の条件下で、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合するか、GDF8と結合しない、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも20分の1弱い親和性でGDF8と結合する、請求項2に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、100nM超の親和性でGDF8と結合する、請求項2または請求項3に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、5nM未満の親和性でGDF11と結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーがGDF8と結合しない、請求項2に記載のアプタマー。
- 親和性が、ポリアニオン性阻害剤を含む結合アッセイを使用して決定される、請求項2〜6のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項7に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、配列5’−NNCPPGRPPPAMGPPPAGS−3’(配列番号:141)を含み、RはAである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 少なくとも1つのPが5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 各Pが、5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジンから独立して選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、配列番号:12、13、15、16、19〜24、27、29〜34、37、47、106〜109、120、124、125、131〜133、136〜140、142〜150及び157から選択される配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、配列番号:12、15、106〜109、及び142〜150から選択される配列を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、18〜100のヌクレオチドからなり、各ヌクレオチドが、独立して修飾または非修飾ヌクレオチドであってよい、請求項1〜13のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが検出可能な標識を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアプタマー。
- GDF11がヒトGDF11であり、GDF8がヒトGDF8である、請求項2〜15のいずれか1項に記載のアプタマー。
- GDF11が、配列番号:118の配列を含む成熟ヒトGDF11であり、GDF8が、配列番号:119の配列を含む成熟ヒトGDF8である、請求項2〜16のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 試料中のGDF11の検出方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項1〜17のいずれか1項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。
- 前記アプタマーが、GDF11に対する前記親和性よりも少なくとも10分の1の弱い親和性でGDF8と結合する、またはGDF8とは結合しない、請求項18に記載の方法。
- 試料がGDF11を含むかどうかの決定方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項1〜17のいずれか1項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。
- 前記試料がGDF8を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記方法が、ストリンジェントな条件下で前記試料を前記アプタマーと接触させることを含む、請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ストリンジェントな条件が、ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記試料がヒト由来の試料である、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記組織試料が、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記タンパク質が、前記試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている、請求項18〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項18〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載のアプタマーと試料からのタンパク質とを含む、組成物。
- 前記試料がGDF8を含む、請求項30に記載の組成物。
- ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項30または請求項31に記載の組成物。
- 前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Z−ブロック、ポリdI/dC、超音波処理または剪断したサケ精子DNA、仔ウシ胸腺DNA、及びdNTPから選択される、請求項32に記載の組成物。
- 前記試料がヒト由来の試料である、請求項30〜33のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項34に記載の組成物。
- 前記組織試料が、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項35に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、前記試料の少なくとも1つのその他の成分から分離されている、請求項30〜36のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項30〜36いずれか1項に記載の組成物。
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