CN104736706B

CN104736706B - FcγRIIb特异性Fc区变体

Info

Publication number: CN104736706B
Application number: CN201380054911.6A
Authority: CN
Inventors: 坚田仁; 门野正次郎; 味元风太; 井川智之
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2033-08-23
Also published as: NZ705370A; HK1208490A1; TW201825521A; TWI697501B; EP2889377B1; CA2882272A1; BR112015001955A2; JP7308039B2; JP6501521B2; TWI766493B; RU2015110250A; KR20210084688A; US20210261648A1; KR20230110836A; SG11201500873XA; AU2013306700B2; TWI717591B; EP2889377A1; JPWO2014030728A1; TW202237660A

Abstract

本发明的技术问题是，提供与含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性增强、和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的Fc区变体，含有该Fc区变体的多肽，含有该多肽的药物组合物，含有该药物组合物的免疫炎性疾病的治疗剂或者预防剂，以及它们的制备方法，进一步地，提供增强对FcγRIIb的结合活性、并且增强与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性的方法。本发明的技术方案是，发现包含含有EU编号第238位的氨基酸改变与其它特定氨基酸改变组合的氨基酸序列的抗体Fc区变体的多肽对FcγRIIb的结合活性增强、和/或增强与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性。

Description

FcγRIIb特异性Fc区变体

技术领域

本发明涉及Fc区变体、含有该Fc区变体的多肽以及含有该多肽的药物组合物，所述Fc区变体在抗体Fc区中导入氨基酸改变，与未导入氨基酸改变的Fc区相比，所述Fc区变体对FcγRIIb的结合活性增强和/或与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性增强。

背景技术

抗体在血液中的稳定性高、副作用也少，因此作为药物受到关注(非专利文献1、非专利文献2)。目前市场销售的抗体药物几乎都是人IgG1亚类的抗体。已知IgG类抗体的功能之一是抗体依赖性细胞毒性(以下标记为ADCC活性)(非专利文献3)。抗体为了发挥ADCC活性，抗体的Fc区必须与存在于杀伤细胞、天然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上的抗体结合受体Fcγ受体(以下标记为FcγR)结合。

在人的FcγR蛋白质家族中已报告的有FcγRIa(CD64A)、FcγRIIa(CD32A)、FcγRIIb(CD32B)、FcγRIIIa(CD16A)、FcγRIIIb(CD16B)的同种型，还报告了各自的同种异型(非专利文献7)。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa具有免疫活性的功能，因此被称为活性型FcγR，FcγRIIb具有免疫抑制功能，被称为抑制型FcγR(非专利文献8)。

关于Fc区与FcγR的结合，显示抗体的铰链区和CH2结构域内的几个氨基酸残基、以及连接于与CH2结构域结合的EU编号第297位的Asn的糖链是重要的(非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。以向这些位置导入了突变所得的抗体为中心，目前研究了具有各种FcγR结合特性的变体，得到了对活性型FcγR具有更高的结合活性的Fc区变体(专利文献1、专利文献2、专利文献3、专利文献4)。

活性型FcγR通过免疫复合物进行交联，引起胞内结构域或作为相互作用对象的FcR共同γ链中所含的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化，激活信号转导物质SYK，引发活化信号级联，由此引发炎性免疫反应(非专利文献9)。

FcγRIIb是在B细胞中表达的唯一的FcγR(非专利文献10)。有报告通过抗体的Fc区与FcγRIIb相互作用来抑制B细胞的初次免疫(非专利文献11)。还有报告称：B细胞上的FcγRIIb和B细胞受体(BCR)经由血液中的免疫复合物进行交联，则B细胞的活化受到抑制，B细胞的抗体产生受到抑制(非专利文献12)。在由该BCR和FcγRIIb介导的免疫抑制性信号转导中，FcγRIIb的胞内结构域中所含的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)是必需的(非专利文献13、非专利文献14)。信号进入、ITIM被磷酸化，则募集含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SHIP)，抑制其它的活性型FcγR的信号级联的转导，抑制炎性免疫反应(非专利文献15)。还有报告称，即使只FcγRIIb缔合，BCR非依赖性地，在不使产生IgM的B细胞凋亡的情况下，也瞬时抑制B细胞的增殖和BCR交联导致的钙流入(非专利文献16)。

另外，FcγRIIb也在树突细胞、巨噬细胞、活化中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞中表达。在这些细胞中，FcγRIIb也抑制吞噬作用、炎性细胞因子的释放等的活性型FcγR的功能，抑制炎性免疫反应(非专利文献8)。

关于FcγRIIb的免疫抑制性功能的重要性，目前已通过使用FcγRIIb敲除小鼠的研究阐明。有如下的报告：在FcγRIIb敲除小鼠中，体液免疫未受到适当控制(非专利文献17)，对胶原诱导关节炎(CIA)的感受性增加(非专利文献18)，呈现狼疮样的症状，或呈现肺出血肾炎综合征样的症状(非专利文献19)。

还有报告称，FcγRIIb的调节缺陷与人的自身免疫疾病相关。例如有报告指出：FcγRIIb的启动子区或细胞跨膜区的基因多态性与系统性红斑狼疮(SLE)的发病频率相关(非专利文献20、非专利文献21、非专利文献22、非专利文献23、非专利文献24)、SLE患者的B细胞表面的FcγRIIb的表达降低(非专利文献25、非专利文献26)。

如此地，根据小鼠模型和临床上的认识认为，FcγRIIb通过尤其是与B细胞的关联，发挥着控制自身免疫疾病、炎性疾病的作用，是有望用于控制自身免疫疾病、炎性疾病的靶分子。

已知作为市售的抗体药物主要使用的IgG1不仅与FcγRIIb，还与活性型FcγR强力结合(非专利文献27)。通过利用增强对FcγRIIb的结合、或者提高与活性型FcγR相比与FcγRIIb的结合选择性的Fc区，开发与IgG1相比具有免疫抑制性性质的抗体药物是可能的。例如，暗示了通过利用具有与BCR结合的可变区和与FcγRIIb的结合增强的Fc的抗体，可抑制B细胞活化的可能性(非专利文献28)。据报告，B细胞上的FcγRIIb和与B细胞受体结合的IgE发生交联，由此，抑制了B细胞向浆细胞的分化，结果抑制IgE产生，在移植了人PBMC的小鼠中，维持人IgG和IgM浓度，但人IgE浓度降低(非专利文献29)。有报告指出：不仅是IgE，在B细胞受体复合物的组成分子CD79b和FcγRIIb通过抗体交联时，体外B细胞的增殖受到抑制，在胶原关节炎模型中症状缓和(非专利文献30)。

有报告，除B细胞以外，使用将与作为IgE的受体的FcεRI结合的IgE的Fc部分、和与FcγRIIb的结合增强的IgG的Fc部分融合而成的分子，使浆细胞上的FcεRI与FcγRIIb交联，从而引起FcγRIIb的磷酸化，抑制FcεRI依赖性的钙的流入，这暗示：通过增强与FcγRIIb的结合，可抑制FcγRIIb刺激介导的脱粒(非专利文献31)。

由此暗示，具有提高与FcγRIIb的结合活性的Fc的抗体有望作为自身免疫疾病等炎性疾病的治疗药物。

另外有报告，在抗体与抗原的免疫复合物存在下，LPS刺激引起的Toll样受体4介导的树突细胞、巨噬细胞活化得到抑制，暗示该效果也是免疫复合物的FcγRIIb介导的作用(非专利文献32、33)。因此，通过应用对FcγRIIb的结合增强的抗体，预期能够增强TLR介导的活化信号抑制作用，暗示该抗体有望作为自身免疫疾病等炎性疾病的治疗药。

另外暗示，与FcγRIIb结合增强的变体除有望作为自身免疫疾病等炎性疾病的治疗剂之外，还有望作为癌症治疗剂。目前已经阐明，FcγRIIb在抗TNF受体超家族的激动性抗体的激动活性中发挥重要作用。具体地，在TNF受体家族中所含的CD40、DR4、DR5、CD30、CD137的抗体的激动活性中，暗示与FcγRIIb的相互作用是必需的(非专利文献34、35、36、37、38、39、40)。非专利文献34中，通过使用与FcγRIIb的结合增强的抗体，显示抗CD40抗体的抗肿瘤效果增强。由此可以期待，与FcγRIIb的结合增强的抗体具有增强以抗TNF受体超家族的抗体为首的激动性抗体的激动作用的效果。

此外显示，应用识别受体酪氨酸激酶(RTK)之一的Kit的抗体，使表达Kit的细胞上的Kit与FcγRIIb交联，细胞增殖得以抑制。即使在该Kit组成型活化、具有引起癌症化的突变时，也报告了同样的效果(非专利文献41)。因此预期，应用对FcγRIIb的结合增强的抗体，可增强对表达具有组成型活化的突变的RTK的细胞的抑制作用。

目前已报告了具有与FcγRIIb的结合活性提高的Fc的抗体(非专利文献28)。该文献中，通过在抗体的Fc区加入S267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等改变，使其与FcγRIIb的结合活性提高。其中，导入了S267E/L328F突变的抗体与FcγRIIb的结合最强，且与FcγRIa和FcγRIIa的131位的残基为His的FcγRIIa H型的结合维持为与天然型IgG1同等程度。但是根据另外的报告，对于该改变，与FcγRIIa的131位的残基为His的FcγRIIa R型的结合和与FcγRIIb的结合是相同程度地增强数百倍，与FcγRIIa R型相比时，与FcγRIIb的结合选择性并未提高(专利文献5)。

对于不表达FcγRIIb而是表达FcγRIIa的血小板等细胞(非专利文献8)，认为不是与FcγRIIb的结合增强、只是与FcγRIIa的结合增强的效果产生影响。例如，已知在给予VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab)的患者组中，血栓栓塞的风险升高(非专利文献42)。还在抗CD40配体的抗体的临床开发试验中同样观察到血栓栓塞，临床试验终止(非专利文献43)。在这些抗体中任一种的情况下，使用动物模型等的之后的研究暗示，通过所给予的抗体与血小板上的FcγRIIa结合，使血小板凝集，形成血栓(非专利文献44、非专利文献45)。有报告指出：在自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮中，通过FcγRIIa依赖性机理，血小板活化，血小板的活化与严重程度相关(非专利文献46)。对于上述血栓栓塞发病风险原本较高的患者，给予与FcγRIIa的结合增强的抗体，血栓栓塞的发病风险进一步提高，极为危险。

还报告了，对于与FcγRIIa的结合增强的抗体，巨噬细胞介导的抗体依赖性吞噬活性(ADCP)增强(非专利文献47)。认为该抗体结合的抗原被巨噬细胞吞噬，同时抗体自身也被吞噬。在将抗体作为药物施用时，认为来自所施用抗体的肽片段也变得易于进行抗原呈递，认为该抗体药物的抗体(抗药物抗体)的产生风险升高。即，如果与FcγRIIa的结合增强，则抗药物抗体的产生风险提高，作为药物的价值显著降低。另外暗示，树突细胞上的FcγRIIb抑制抗原与抗体组成的免疫复合物引起的树突细胞活化、或抑制活性型Fcγ受体介导的向T细胞的抗原呈递，而有助于外周耐受(非专利文献48)。由于树突细胞上也表达FcγRIIa，在应用具有对FcγRIIb的选择性结合增强的Fc的抗体作为药物时，由于对FcγRIIb的选择性结合增强，树突细胞等难以进行抗原呈递，抗药物抗体产生的风险也能够相对降低，在这一点上，认为所述抗体也是有用的。

即，如果与FcγRIIa的结合增强，则血小板凝集介导的血栓形成风险升高，免疫原性变高，抗药物抗体产生的风险提高，由于这一点，作为药物的价值显著降低。

从上述观点来看，对于之前的与FcγRIIb的结合增强的Fc变体，与天然型IgG1相比，与FcγRIIaR型的结合显著增强，因此作为用于保有FcγRIIaR型的患者的药物，其价值显著降低。FcγRIIa的H型和R型在高加索人和非裔美洲人中以大致相同程度的频率被观察到(非专利文献49、非专利文献50)。由此，将该Fc变体用于自身免疫疾病的治疗时，享受作为药物的效果同时可安全利用的患者的数目是有限的。

还报告了，在缺失FcγRIIb的树突细胞或者抗FcγRIIb抗体引起的FcγRIIb与抗体Fc部分的相互作用受抑制的树突细胞中，树突细胞的成熟发生(非专利文献51、非专利文献52)。该报告暗示，FcγRIIb在未发生炎症等未活化的稳定状态下抑制树突细胞的成熟。除FcγRIIb之外，树突细胞表面还表达FcγRIIa，由此认为，即使例如与抑制型FcγRIIb的结合增强，如果与活性型FcγRIIa等的结合也增强，那么结果是促进树突细胞的成熟。即，据认为，不仅与FcγRIIb的结合活性，而且改善与FcγRIIb的结合活性相对于与FcγRIIa的结合活性的比例，在使抗体产生免疫抑制性作用方面是重要的。

由此，在考虑开发利用FcγRIIb结合介导的免疫抑制性作用的药物方面，需要Fc变体，其不仅增强与FcγRIIb的结合活性，而且将与FcγRIIa H型、R型中任意基因多态性的结合维持为与天然型IgG1相同程度或减弱至更低。

与此相对，目前已报告了通过在Fc区导入氨基酸改变，使其与FcγRIIb的结合选择性升高的实例(非专利文献53)。但是该文献中报告的据称对FcγRIIb的选择性改善的任何变体与天然型IgG1相比，与FcγRIIb的结合均降低。因此认为，这些变体实际上难以引起FcγRIIb介导的免疫抑制性反应至IgG1以上。

另外，之前所述的激动性抗体中FcγRIIb也发挥重要作用，因此期望通过增强其结合活性来增强激动活性。但是，与FcγRIIa的结合也同样增强，使得非所需的ADCC活性或ADCP活性等得到发挥，可能出现副作用。从上述角度考虑，优选可以选择性增强与FcγRIIb的结合活性。

由这些结果可知，在开发利用FcγRIIb的、以自身免疫疾病治疗或癌症治疗为目标的抗体药物时，与天然型IgG相比，维持或降低与FcγRIIa的任意基因多态性的结合活性，且增强与FcγRIIb的结合活性是重要的。但是，FcγRIIb与活性型FcγR之一的FcγRIIa，胞外区序列有93%同一性，结构极为类似，并且作为基因多态性，FcγRIIa中存在第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型，与抗体的相互作用各不相同(非专利文献54)。因此认为，区分FcγRIIa与FcγRIIb的极度类似序列、同时与FcγRIIa的两个基因多态性比较研制与FcγRIIb选择性结合增强的Fc区变体，是困难的课题，事实上目前尚未获得对FcγRIIb具有充分结合活性和选择性的变体。专利文献5中也报告了与FcγRIIb的结合活性增强的变体，但其程度弱，期望开发具有上述性质的变体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1 : WO 2000/42072

专利文献2 : WO 2006/019447

专利文献3 : WO 2004/99249

专利文献4 : WO 2004/29207

专利文献5 : US2009/0136485

非专利文献

非专利文献1 : Nat Biotechnol, 23, 1073-1078, 2005

非专利文献2 : Eur J Pharm Biopharm, 59(3), 389-96. 2005

非专利文献3 : Chem Immunol, 65, 88-110, 1997

非专利文献4 : J Biol Chem, 276, 16478-16483, 2001

非专利文献5 : Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993

非专利文献6 : Immunology, 86, 319-324, 1995

非专利文献7 : Immunol Lett, 82, 57-65, 2002

非专利文献8 : Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010

非专利文献9 : Nat Rev Immunol, 8, 34-47, 2008

非专利文献10 : Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989

非专利文献11 : J Exp Med 129, 1183-1201, 1969

非专利文献12 : Immunol Lett 88, 157-161, 2003

非专利文献13 : Science, 256, 1808-1812, 1992

非专利文献14 : Nature, 368, 70-73, 1994

非专利文献15 : Science, 290, 84-89, 2000

非专利文献16 : J Imunol, 181, 5350-5359, 2008

非专利文献17 : J Immunol, 163, 618-622, 1999

非专利文献18 : J Exp Med, 189, 187-194, 1999

非专利文献19 : J Exp Med, 191, 899-906, 2000

非专利文献20 : Hum, Genet, 117, 220-227, 2005

非专利文献21 : J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007

非专利文献22 : Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006

非专利文献23 : Nat Med, 11, 1056-1058, 2005

非专利文献24 : J Immunol, 176, 5321-5328, 2006

非专利文献25 : J Exp Med, 203, 2157-2164, 2006

非专利文献26 : J Immunol. 178, 3272-3280, 2007

非专利文献27 : Blood, 113, 3716-3725, 2009

非专利文献28 : Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008

非专利文献29 : J Allergy Clin Immunol, 2012, 129: 1102-1115

非专利文献30 : Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010

非专利文献31 : Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008)

非专利文献32 : J. Immunol, 2009, 183: 4509-4520

非专利文献33 : J. Immunol, 2009, 182: 554-562

非专利文献34 : Science, 333, 1030-1034, 2011

非专利文献35 : Cancer Cell 19, 101-113, 2011

非专利文献36 : J Clin Invest, 122 (3), 1066-1075, 2012

非专利文献37 : J Immunol 171, 562-, 2003

非专利文献38 : Blood, 108, 705-, 2006

非专利文献39 : J Immunol 166, 4891, 2001

非专利文献40 : doi: 10.1073/pnas.1208698109

非专利文献41 : Immunol let, 2002, 143: 28-33

非专利文献42 : J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007

非专利文献43 : Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003

非专利文献44 : J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008,

非专利文献45 : J Immunol, 185, 1577-1583, 2010

非专利文献46 : Sci Transl Med, vol 2, issue 47, 47-63, 2010

非专利文献47 : Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008

非专利文献48 : J. Immunol, 2007, 178: 6217-6226

非专利文献49 : J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996

非专利文献50 : Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998

非专利文献51 : J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005

非专利文献52 : Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005

非专利文献53 : Mol Immunol, 40, 585-593, 2003

非专利文献54 : J Exp Med, 172, 19-25, 1990。

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述情况作出的。本发明的目的是提供Fc区变体、含有该Fc区变体的多肽以及含有该多肽的药物组合物，通过在抗体Fc区中导入氨基酸改变，与未导入氨基酸改变的Fc区相比，所述Fc区变体对FcγRIIb的结合活性增强和/或与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性增强。

解决课题的手段

本发明人对Fc区变体、含有该Fc区变体的多肽进行了努力研究，通过在Fc区中导入氨基酸改变，所述Fc区变体与未导入氨基酸改变的Fc区比较，对FcγRIIb的结合增强，并且与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强。结果本发明人发现，通过在Fc区的EU编号第238位的氨基酸改变的Fc区变体中组合其它氨基酸改变，对FcγRIIb的结合活性增强和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强。

也即，本发明涉及下列。

[1] Fc区变体，其中，EU编号第238位的氨基酸以及选自EU编号第233位的氨基酸、234位的氨基酸、235位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、265位的氨基酸、266位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、269位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、274位的氨基酸、296位的氨基酸、326位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、331位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸、334位的氨基酸、355位的氨基酸、356位的氨基酸、358位的氨基酸、396位的氨基酸、409位的氨基酸以及419位的氨基酸的至少一个氨基酸改变为其它氨基酸，该变体对Fcγ受体的结合活性[含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是15.0以上。

[2] [1]中记载的Fc区变体，其中，EU编号第238位的氨基酸、268位的氨基酸以及271位的氨基酸改变为其它氨基酸，进一步地，选自EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸以及396位的氨基酸的至少1个氨基酸改变为其它氨基酸。

[3] Fc区变体，其中，EU编号第238位的氨基酸是Asp，并且具有选自下列氨基酸组的至少1个氨基酸：233位的氨基酸是Asp，234位的氨基酸是Tyr，235位的氨基酸是Phe，237位的氨基酸是Asp，264位的氨基酸是Ile，265位的氨基酸是Glu，266位的氨基酸是Phe、Leu或者Met，267位的氨基酸是Ala、Glu、Gly或者Gln，268位的氨基酸是Asp、Gln或者Glu，269位的氨基酸是Asp，271位的氨基酸是Gly，272位的氨基酸是Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或者Gln，274位的氨基酸是Gln，296位的氨基酸是Asp或者Phe，326位的氨基酸是Ala或者Asp，327位的氨基酸是Gly，330位的氨基酸是Lys、Arg或者Ser，331位的氨基酸是Ser，332位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，333位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，334位的氨基酸是Arg、Ser或者Thr，355位的氨基酸是Ala、Gln，356位的氨基酸是Glu，358位的氨基酸是Met，396位的氨基酸是Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或者Tyr，409位的氨基酸是Arg以及419位的氨基酸是Glu，该变体对Fcγ受体的结合活性[含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是15.0以上。

[4] [3]中记载的Fc区变体，其中，EU编号第238位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp或者Glu、以及271位的氨基酸是Gly，进一步地，其具有选自下列氨基酸组的至少1个氨基酸：233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala或者Gly、272位的氨基酸是Asp或者Pro、296位的氨基酸是Asp、327位的氨基酸是Gly、330位的氨基酸是Arg、332位的氨基酸是Thr、以及396位的氨基酸是Leu或者Met。

[5] [1]至[4]中任一项记载的Fc区变体，其中，[含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是50.0以上。

[6] [1]至[4]中任一项记载的Fc区变体，其中，[含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是100.0以上。

[7] [1]至[6]中任一项记载的Fc区变体，其中，[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIa(R型)的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是10.0以上。

[8] [1]至[6]中任一项记载的Fc区变体，其中，[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIa(R型)的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的值是20.0以上。

[9] [1]至[8]中任一项记载的Fc区变体，其中，前述Fc区变体含有下述 (a)～(x)中任一项记载的氨基酸改变：

(a)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(b)Fc区的EU编号第238位、237位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(c)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、268位、271位、296位、330位以及332位的氨基酸改变

(d)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位以及330位的氨基酸改变

(e)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、267位、268位、271位、296位、330位以及332位的氨基酸改变

(f)Fc区的EU编号第238位、237位、267位、268位、271位、296位、330位以及332位的氨基酸改变

(g)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、268位、271位、296位、327位以及330位的氨基酸改变

(h)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位以及271位的氨基酸改变

(i)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(j)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位、296位、330位以及396位的氨基酸改变

(k)Fc区的EU编号第238位、237位、264位、267位、268位、271位以及330位的氨基酸改变

(l)Fc区的EU编号第238位、237位、264位、267位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(m)Fc区的EU编号第238位、264位、267位、268位以及271位的氨基酸改变

(n)Fc区的EU编号第238位、264位、267位、268位、271位以及296位的氨基酸改变

(o)Fc区的EU编号第238位、237位、267位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(p)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位、330位以及396位的氨基酸改变

(q)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位、296位、327位、330位以及396位的氨基酸改变

(r)Fc区的EU编号第238位、233位、237位、264位、267位、268位、271位、272位以及296位的氨基酸改变

(s)Fc区的EU编号第238位、237位、264位、267位、268位、271位、272位以及330位的氨基酸改变

(t)Fc区的EU编号第238位、237位、264位、267位、268位、271位、272位、296位以及330位的氨基酸改变

(u)Fc区的EU编号第238位、233位、264位、267位、268位以及271位的氨基酸改变

(v)Fc区的EU编号第238位、237位、267位、268位、271位、296位以及330位的氨基酸改变

(w)Fc区的EU编号第238位、264位、267位、268位、271位、272位以及296位的氨基酸改变

(x)Fc区的EU编号第238位、233位、264位、267位、268位、271位以及296位的氨基酸改变。

[10] [1]至[8]中任一项记载的Fc区变体，其中，前述Fc区变体具有下述 (a)～(x) 中任一项记载的氨基酸序列：

(a)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(b)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp或者Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(c)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、330位的氨基酸是Arg以及332位的氨基酸是Thr的氨基酸序列

(d)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Gly或者Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(e)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、330位的氨基酸是Arg以及332位的氨基酸是Thr的氨基酸序列

(f)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、330位为Arg以及332位的氨基酸是Thr的氨基酸序列

(g)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、327位的氨基酸是Gly以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(h)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu以及271位的氨基酸是Gly的氨基酸序列

(i)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(j)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、330位的氨基酸是Arg以及396位的氨基酸是Met或者Leu的氨基酸序列

(k)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(l)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(m)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu以及271位的氨基酸是Gly的氨基酸序列

(n)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly以及296位的氨基酸是Asp的氨基酸序列

(o)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、267位的氨基酸是Ala或者Gly、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(p)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、330位的氨基酸是Arg以及396位的氨基酸是Met或者Leu的氨基酸序列

(q)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、327位的氨基酸是Gly、330位的氨基酸是Arg以及396位的氨基酸是Met的氨基酸序列

(r)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、272位的氨基酸是Asp以及296位的氨基酸是Asp的氨基酸序列

(s)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、272位的氨基酸是Pro以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(t)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、272位的氨基酸是Pro、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(u)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu以及271位的氨基酸是Gly的氨基酸序列

(v)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、267位的氨基酸是Gly、268位的氨基酸是Asp、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp以及330位的氨基酸是Arg的氨基酸序列

(w)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、272位的氨基酸是Asp以及296位的氨基酸是Asp的氨基酸序列

(x)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、233位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly以及296位的氨基酸是Asp的氨基酸序列。

[11] 由选自序列编号43～68、序列编号70、序列编号71和序列编号75～77中任一项的氨基酸序列组成的Fc区变体。

[12] 含有[1]至[11]中任一项记载的至少2个Fc区变体的多肽，其中该2个Fc区变体缔合。

[13] [12]中记载的多肽，其中，前述多肽中含有的缔合的2个Fc区变体是同一氨基酸序列。

[14] [12]中记载的多肽，其中，前述多肽中含有的缔合的2个Fc区变体是不同的氨基酸序列。

[15] [14]中记载的多肽，其中，前述缔合的2个Fc区变体的氨基酸序列中，选自Fc区变体的EU编号第235位的氨基酸、236位的氨基酸、237位的氨基酸、238位的氨基酸以及239位的氨基酸的至少1个氨基酸是不同的氨基酸。

[16] [15]中记载的多肽，其中，缔合的2个Fc区变体中任一个的氨基酸序列是具有选自下列的至少1个氨基酸的氨基酸序列：EU编号第235位的氨基酸是Asp、Gln、Glu或者Thr，236位的氨基酸是Asn，237位的氨基酸是Phe或者Trp，238位的氨基酸是Glu、Gly或者Asn，以及239位的氨基酸是Asp或者Glu。

[17] [12]至[16]中任一项记载的多肽，其中，含有前述Fc区变体的多肽是IgG抗体。

[18] [12]至[16]中任一项记载的多肽，其中，含有前述Fc区变体的多肽是Fc融合蛋白质分子。

[19] 包含[12]至[18]中任一项记载的多肽的药物组合物。

另外，本发明涉及通过导入本发明的Fc区的氨基酸改变而增强该Fc区对FcγRIIb的结合活性且增强与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性的方法。另外，本发明涉及通过导入发明的Fc区的氨基酸改变而抑制针对含有该Fc区的多肽的抗体的产生的方法。

另外，本发明涉及含有本发明的多肽的免疫炎性疾病的治疗或者预防剂。另外，本发明涉及免疫炎性疾病的治疗方法或者预防方法，包括将本发明的多肽施用于对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的免疫炎性疾病的治疗方法或者预防方法的试剂盒，其包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备免疫炎性疾病的治疗剂或者预防剂中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的免疫炎性疾病的治疗方法或者预防方法的本发明的多肽。

另外，本发明涉及B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂，其含有本发明的多肽。另外，涉及B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法，包括将本发明的多肽施用于对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法的试剂盒，其包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法的本发明的多肽。

另外，本发明涉及缺乏包含本发明的多肽的生物所必须的蛋白质的疾病的治疗剂。另外，本发明涉及缺乏生物所必须的蛋白质的疾病的治疗方法，包括将本发明的多肽施用于对象的步骤。另外，本发明涉及用于缺乏生物所必须的蛋白质的疾病的本发明治疗方法的试剂盒，其包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备缺乏生物所必须的蛋白质的疾病的治疗剂中的应用。另外，本发明涉及用于缺乏生物所必须的蛋白质的疾病的本发明治疗方法的本发明的多肽。

另外，本发明涉及包含本发明的多肽的病毒的增殖抑制剂。另外，本发明涉及病毒的增殖抑制方法，包括将本发明的多肽施用于对象的步骤。另外，本发明涉及用于本发明的病毒的增殖抑制方法的试剂盒，其包含本发明的多肽。另外，本发明涉及本发明的多肽在制备病毒的增殖抑制剂中的应用。另外，本发明涉及用于本发明的病毒的增殖抑制方法的本发明的多肽。

发明的效果

根据本发明，提供了与未导入氨基酸改变的Fc区比较，对FcγRIIb的结合活性增强、和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的Fc区变体。通过应用含有该Fc区变体的多肽，可以增强FcγRIIb的ITIM磷酸化介导的炎性免疫反应的抑制性信号。另外，通过将与FcγRIIb选择性结合的性质赋予Fc区，可以使抗药物抗体的产生的抑制成为可能。另外，通过在具有在pH酸性区条件下对人FcRn具有结合活性、且取决于离子浓度条件对抗原的抗原结合分子结合活性变化的抗原结合结构域的多肽中，应用本发明的Fc区变体，可以促进血浆中存在的该多肽结合的抗原的消失。

附图说明

图1显示了，在应用具有FcγRIIa的多态性(R/H)的供体来源的血小板的血小板凝集测定中，通过奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合物的血小板凝集能力的评价结果。

图2显示了，在应用具有FcγRIIa的多态性(H/H)的供体来源的血小板的血小板凝集测定中，通过奥马珠单抗-G1d-v3/IgE免疫复合物的血小板凝集能力的评价结果。

图3表示洗涤血小板膜表面的CD62p表达的评价结果。以黒色填充的图显示与PBS反应后加入ADP刺激时的结果，图中未填充部分显示与免疫复合物反应后用ADP刺激时的结果。

图4表示洗涤血小板膜表面的活性型整联蛋白表达的评价结果。以黒色填充的图显示与PBS反应后加入ADP刺激时的结果，图中未填充部分显示与免疫复合物反应后用ADP刺激时的结果。

图5是通过X线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的图。分别对于Fc部分CH2结构域、CH3结构域，左侧为构域A、右侧为结构域B。

图6将X线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的结构与Fc(WT)/FcγRIIa细胞外区复合物的结构(PDB编码:3RY6)通过基于Fc部分CH2结构域A中Cα原子间距离的最小二乘法重叠并比较。图中以粗线绘制的部分是Fc (P208)/FcγRIIb细胞外区复合物，以细线绘制的部分是Fc (WT)/FcγRIIa细胞外区复合物的结构。另外，Fc(WT)/FcγRIIa细胞外区复合物的结构中，仅绘制了Fc部分CH2结构域A。

图7详细示出Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构中，FcγRIIb的160位Tyr与主链部分中形成氢键的Fc部分CH2结构域A的EU编号第237位Asp附近的结构。

图8示出Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构中，FcγRIIb的160位的Tyr与主链部分中形成氢键的Fc部分CH2结构域A的EU编号第237位Asp侧链周围的氨基酸残基的结构。

图9将参考例7中示出的Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构与Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构通过基于Fc部分CH2结构域B中Cα原子间距离的最小二乘法重叠，比较EU编号第266位至271位的环周边。本环中，Fc(P208)与Fc(P238D)比较，具有EU编号第268位的位置处的H268D改变，和EU编号第271位的位置处的P271G改变。

图10示出 Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构中，Fc部分CH2结构域B的Ser239周边的结构、连同通过X线晶体结构分析得到的以2Fo-Fc为系数的电子密度。

图11将X线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的立体结构与Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的立体结构通过基于Cα原子间距离的最小二乘法重叠并比较。

图12在Fc部分CH2结构域A的EU编号第237位Asp附近比较Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的X线晶体结构与Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构，连同通过X线晶体结构分析得到的以2Fo-Fc为系数的电子密度。

图13在Fc部分CH2结构域B的EU编号第237位Asp附近比较Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的X线晶体结构与Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构，连同通过X线晶体结构分析得到的以2Fo-Fc为系数的电子密度。

图14比较G1d与G4d的恒定区的序列。该图中，框出的氨基酸示出G1d与G4d之间不同的氨基酸残基部位。

图15的横轴示出各变体对FcgRIIb的结合量的值，纵轴示出各变体对FcgRIIaR的结合量的值。图中示出的改变G237W、G237F、G236N、P238G、P238N、P238E、P238D指导入GpH7-B3中的改变。另外，A5/B3指任一链中都不导入改变的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，仅一条链含有P238D的变体指GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0。

图16的横轴示出各变体对FcgRIIb的KD值，纵轴示出各变体对FcgRIIaR的KD值。图中的IL6R-B3/IL6R-L和IL6R-G1d/IL6R-L表示评价各变体时作为比较对象的具有天然型人IgG序列的抗体。另外，IL6R-BP264/IL6R-L是制备各变体时的原始变体。IL6R-BP404/IL6R-L是IL6R-BP264/IL6R-L中两条链导入L234Y的变体，是与改变导入前的IL6R-BP264/IL6R-L比较与FcgRIIb的结合增强的变体。

图17示出与FcγRIa和FcγRIIb的结合的比较，EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合被标记。“突变A”指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。

图18示出与FcγRIIa H型和FcγRIIb的结合的比较，EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合被标记。“突变A”指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。

图19示出与FcγRIIa R型和FcγRIIb的结合的比较，EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合被标记。“突变A”指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。

图20示出与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合的比较，EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合被标记。“突变A”指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。

图21示出构成IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的恒定区的氨基酸残基与EU编号(本说明书也称为EU索引)的关联。

图22的横轴表示各PD变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各PD变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各PD变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前抗体IL6R-F652/IL6R-L(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc)对各FcγR的结合量的值、进一步地扩大100倍，得到的值作为各PD变体对各FcγR的相对结合活性的值。图中称为F652的区域表示IL6R-F652/IL6R-L的值。

图23的纵轴示出将各改变导入没有P238D改变的GpH7-B3的变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、横轴示出将各改变导入具有P238D改变的IL6R-F652的变体对FcγRIIb的相对结合活性的值。另外，将各变体对FcγRIIb的结合量的值除以改变导入前的抗体对FcγRIIb的结合量的值、进一步地扩大100倍，得到的值作为相对结合活性的值。此处，导入没有P238D的GpH7-B3中时与导入具有P238D的IL6R-F652中时均发挥对FcγRIIb的结合增强效果的改变包含在区A中，导入没有P238D的GpH7-B3中时发挥对FcγRIIb的结合增强效果、但导入具有P238D的IL6R-F652中时不发挥对FcγRIIb的结合增强效果的改变包含在区B中。

图24示出Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构。

图25示出将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构与Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构通过基于针对FcγRIIb细胞外区以及Fc CH2结构域A的Cα原子间距离的最小二乘法重叠。

图26对于Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构与Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构，在单独的Fc CH2结构域A以及单独的Fc CH2结构域B之间通过基于Cα原子间距离的最小二乘法重叠，比较P238D附近的详细结构。

图27示出，Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构中，Fc CH2结构域A的EU编号第237位的Gly的主链与FcγRIIb的160位的Tyr之间发现氢键。

图28示出，在Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构中，Fc CH2结构域B的EU编号第270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg之间发现静电相互作用。

图29的横轴示出各2B变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、纵轴示出各2B变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各2B变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc)对各FcγR的结合量的值、进一步地扩大100倍，得到的值作为各2B变体对各FcγR的相对结合活性的值。

图30示出Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构中，Fc链A的EU编号第233位的Glu与FcγRIIb细胞外区中其周边残基。

图31示出Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构中，Fc链A的EU编号第330位的Ala与FcγRIIb细胞外区中其周边残基。

图32将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物和Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物的晶体结构，通过基于对Fc链B的Cα原子间距离的最小二乘法重叠，示出Fc链B的EU编号第271位的Pro的结构。

图33示出Fv4-IgG1、Fv4-P587施用于人FcgRIIb转基因小鼠时，该小鼠血浆中施用的抗原结合分子的浓度推移。

图34示出Fv4-IgG1、Fv4-P587施用于人FcgRIIb转基因小鼠时，该小鼠血浆中施用的人IL-6R的浓度推移。

图35示出，通过施用与现有中和抗体相比在中性pH对FcγR的结合增强的、离子浓度依赖性地结合抗原的抗体，可溶型抗原从血浆中消失的非限定作用机制。

图36示出Fv4-IgG1、Fv4-P587、Fv4-P587_LS施用于人FcgRIIb和人FcRn转基因小鼠时，该小鼠血浆中施用的抗原结合分子的浓度推移。

图37示出Fv4-IgG1、Fv4-P587、Fv4-P587_LS施用于人FcgRIIb和人FcRn转基因小鼠时，该小鼠血浆中施用的人IL-6R的浓度推移。

具体实施方式

本发明提供Fc区变体以及含有该Fc区变体的多肽，与未导入氨基酸改变的Fc区比较，所述Fc区变体对FcγRIIb的结合活性增强、和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强。

更具体地，本发明提供包含EU编号第238位的氨基酸改变与其它特定氨基酸改变的组合的氨基酸序列的Fc区变体、以及含有该Fc区变体的多肽。进一步地，本发明提供通过在Fc区中导入该氨基酸改变，与未导入氨基酸改变的Fc区比较增强对FcγRIIb的结合活性、和/或增强与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性的方法。另外，本发明提供了通过在Fc区中导入该氨基酸改变，与未导入氨基酸改变的Fc区比较在施用于生物时抑制对Fc区的抗体的产生的方法。

本发明中的“多肽”通常指具有10个氨基酸左右以上长度的肽以及蛋白质。通常是来自生物的多肽，但没有特别限定，例如也可以是由人工设计的序列组成的多肽。另外，也可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等任意多肽。

本发明的多肽的优选例子可列举抗体。更优选的例子可列举天然型IgG、尤其是天然型人IgG。天然型IgG是指包含与天然存在的IgG相同的氨基酸序列，属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体类的多肽。例如天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包括由此天然产生的变体等。

抗体轻链恒定区中存在IgK(Kappa、κ链)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7 (Lambda、λ链)型恒定区，可以是任何轻链恒定区。作为人IgK(Kappa)恒定区和人IgL7 (Lambda)恒定区，由于遗传多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences of proteins ofimmunological interest, NIH Publication No.91-3242，本发明中可以是其中任意一种。进一步地，本发明中，轻链恒定区也可以是进行了氨基酸置换、添加、缺失、插入和/或修饰等改变的轻链恒定区。抗体的Fc区存在例如IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型的Fc区。本发明的抗体的Fc区可应用例如人IgG抗体的Fc区，优选地人IgG1抗体的Fc区。本发明的Fc区可应用例如由天然型IgG的恒定区，具体地，以天然型人IgG1为起源的恒定区(序列编号：11)、以天然型人IgG2为起源的恒定区(序列编号：12)、以天然型人IgG3为起源的恒定区(序列编号：13)、以天然型人IgG4为起源的恒定区(序列编号：14)得到的Fc区。图21示出天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区序列。天然型IgG的恒定区也包括由此天然产生的变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，由于遗传多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，本发明中可以是其中任意一种。特别地，对于人IgG1的序列，EU编号第356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。

Fcγ受体(本说明书中有时记为Fcγ受体、FcγR或FcgR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，实质上也指由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族中的任何成员。对于人，该家族包括：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同种型FcγRIIa(包含同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及含有同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。另外，对于人FcγRIIb报告了剪接变体FcγRIIb1和FcγRIIb2。另外，除此之外还报告了称为FcγRIIb3的剪接变体(J. Exp. Med, 1989, 170: 1369)。对于人FcγRIIb，除了这些剪接变体外，NCBI登录的NP_001002273.1、NP_001002274.1、NP_001002275.1、NP_001177757.1、NP_003992.3剪接变体全部包含在内。另外，人FcγRIIb中包含已知得到报告的所有基因多态性，也包含FcγRIIb(Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum Mol Genet, 2005,14: 2881-92、Arthritis Rheum. 2002 May;46(5):1242-54.)，另外，也包含今后报告的全部基因多态性。

FcγR包括来自人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限于此，可以来自任何生物。小鼠FcγR类包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。这样的Fcγ受体的优选实例可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)和/或FcγRIIIB(CD16)。

FcγRI的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于序列编号：1(NM_000566.3)以及2(NP_000557.1)，

FcγRIIA的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于序列编号：3(BC020823.1)以及4(AAH20823.1)，

FcγRIIB的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于序列编号：5(BC146678.1)以及6(AAI46679.1)，

FcγRIIIA的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于序列编号：7(BC033678.1)以及8(AAH33678.1)，以及

FcγRIIIB的多核苷酸序列以及氨基酸序列分别记载于序列编号：9(BC128562.1)以及10(AAI28563.1)(括号内表示RefSeq登录号)。

另外，FcγRIIa存在FcγRIIa的第131位氨基酸被置换为组氨酸(H型)或精氨酸(R型)的2种基因多态性(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。

本说明书中“未导入氨基酸改变的Fc区”是指本发明的氨基酸改变导入之前的Fc区。本发明中“未导入氨基酸改变的Fc区”可以是例如天然型IgG的Fc区，也可以是在天然型IgG中加入本发明的氨基酸改变以外的改变的IgG的Fc区。另外，本发明中的“Fc区变体”是指，在本发明的未导入氨基酸改变的Fc区中，将本发明的至少1个氨基酸改变为其它氨基酸的Fc区。此处“至少1个氨基酸改变为其它氨基酸”包含导入了该氨基酸改变的Fc区以及由与其同一的氨基酸序列组成的Fc区。

天然型IgG是指包含与天然存在的IgG相同的氨基酸序列，属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体类的多肽。例如天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包括由此天然产生的变体等。

天然型IgG的Fc区是指包含与以天然存在的IgG为起源的Fc区相同的氨基酸序列的Fc区。天然型IgG的重链恒定区如图21(序列编号：11～14)所示，例如是指以图21的天然型人IgG1为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG2为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG3为起源的重链恒定区中的Fc区、以天然型人IgG4为起源的重链恒定区中的Fc区。天然型IgG的Fc区也包括由此天然产生的变体等。

本发明中，本发明的含有Fc区变体的多肽或者Fc区变体对各种FcγR的结合活性是否增强、或者结合活性是否维持或减少，这例如可如本实施例所示，使用利用表面等离子体共振(SPR)现象的相互作用分析仪器BIACORE，根据由传感图谱的分析结果得到的解离常数(KD)值是降低或是增加来判断，其中，传感图谱是以各种FcγR作为分析物，使其与传感芯片相互作用得到的，传感芯片上固定有抗体，或者是被A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获的抗体。或者也根据以下的值是降低或是增加来判断：以各种FcγR作为分析物，使其与传感芯片上固定的或者被A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获的传感芯片上的抗体相互作用，将相互作用前后的传感图谱上共振单位(RU)值的变化量除以将抗体固定或捕获在传感芯片上前后的共振单位(RU)的变化量得到的值。还可以使用将FcγR直接固定在传感芯片上或者经由抗标签抗体等固定的传感芯片，以待评价的抗体等的试样作为分析物进行相互作用得到传感图谱，根据由传感图谱的分析得到的解离常数(KD)值是降低或是增加来判断。或者也可以待评价的抗体等的试样作为分析物，使其与将FcγR直接固定在传感芯片上或经由抗标签抗体等固定的传感芯片相互作用，根据相互作用前后的传感图谱的值的变化量是降低或是增加来判断。

具体来说，除了ELISA、FACS(荧光激活细胞分选术)之外，Fc区变体与Fcγ受体的结合活性还可以通过ALPHA筛选(放大发光接近匀相测定(Amplified LuminescentProximity Homogeneous Assay))、利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等测定(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010)。

ALPHA筛选是通过使用供体和受体两种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子发生生物学相互作用，只在两种珠接近的状态时才检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散到供体珠周边，到达相接近的受体珠，则引起珠内的化学发光反应，最终发出光。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。

例如，使生物素标记的多肽缔合物与供体珠结合，使谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的Fcγ受体与受体珠结合。在竞争性的含有Fc区变体的多肽缔合物不存在下，含有野生型Fc区的多肽缔合物与Fcγ受体相互作用，产生520-620nm的信号。未标记的含有突变Fc区的多肽缔合物与含有野生型Fc区的多肽缔合物竞争与Fcγ受体之间的相互作用。通过对竞争的结果所表现出的荧光降低进行定量，可确定相对结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等的多肽缔合物生物素化是公知的。将Fcγ受体用GST标记的方法可适当采用以下方法等：将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸框内融合，将由此得到的融合基因保持在可表达的载体上，在细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱纯化。所得信号例如可使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad，San Diego)等软件，通过拟合利用非线性回归分析的单一位点竞争(one-site competition)模型来适当分析。

将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感芯片的金薄膜上，从传感芯片的背面照射光，使得在金薄膜与玻璃的界面发生全反射，反射光的一部分形成了反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感芯片的表面，分析物与配体结合，则被固定的配体分子的质量增加，传感芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生位移(相反，如果结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore系统是以上述位移量，即传感芯片表面的质量变化为纵轴，以质量的时间变化作为测定数据表示(传感图谱)。可由传感图谱求出分析物与被捕获到传感芯片表面的配体的结合量。另外，由传感图谱的曲线求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求出解离常数(KD)。在BIACORE法中，也适合采用抑制测定法。抑制测定法的实例记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010。

与FcγR的结合活性降低的Fc区或者含有该Fc区的多肽是指：在使含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽(也称为含有亲本Fc区的多肽或者亲本多肽)与在该Fc区中含有至少一个氨基酸改变的多肽(也称为含有Fc区变体的多肽或者改变多肽)的量本质上相同地进行测定时，以比含有亲本Fc区的多肽本质上更弱的结合活性与FcγR结合的Fc区变体或者含有该Fc区变体的多肽。

另外，与FcγR的结合活性增强的Fc区或者含有该Fc区的多肽是指：在使含有亲本Fc区的多肽的量与含有Fc区变体的多肽的量本质上相同地进行测定时，以比含有亲本Fc区的多肽本质上更强的结合活性与FcγR结合的Fc区变体或者含有该Fc区变体的多肽。

维持与FcγR的结合活性(得到维持)的多肽是指：在使具有亲本Fc区的多肽与含有Fc区变体的多肽的量本质上相同地进行测定时，以与亲本多肽没有本质变化的同等的结合活性与FcγR结合。

本发明中，对FcγRIIb的结合活性增强是指，在例如通过上述测定法测定的KD值中，[含有亲本Fc区的多肽对FcγRIIb的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的KD值比优选为15.0以上、20.0以上、25.0以上、30.0以上、35.0以上、40.0以上、45.0以上，进一步优选为50.0以上、55.0以上、60.0以上、65.0以上、70.0以上、75.0以上、80.0以上、85.0以上、90.0以上、95.0以上、100.0以上。

另外，本发明的Fc区变体与FcγRIIa相比对FcγRIIb的结合选择性增强是指，

(i) 对FcγRIIb的结合活性增强，对FcγRIIa的结合活性维持或者减少，

(ii) 对FcγRIIb的结合活性增强，对FcγRIIa的结合活性也增强，但对FcγRIIa的结合活性的增强程度比对FcγRIIb的结合活性的增强程度低，或者，

(iii) 对FcγRIIb的结合活性减少，但该结合活性的减少程度比对FcγRIIa的结合活性的减少程度低。本发明的Fc区变体是否为与FcγRIIa相比对FcγRIIb的结合选择性增强，这可以通过例如比较下述比值来判断：根据上述实例求出的本发明的含有Fc区变体的多肽对FcγRIIa的KD值和对FcγRIIb的KD值的比(对FcγRIIa的KD值/对FcγRIIb的KD值)以及含有亲本Fc区的多肽对FcγRIIa的KD值和对FcγRIIb的KD值的比(对FcγRIIa的KD值/对FcγRIIb的KD值)。具体地，与含有亲本Fc区的多肽相比，上述KD值比的值是本发明的含有Fc区变体的多肽大时，则可以判断，与含有亲本Fc区变体的多肽相比，本发明的含有Fc区变体的多肽相对于FcγRIIa与FcγRIIb的结合选择性增强。特别地，对FcγRIIa(R型)的结合活性与对FcγRIIa(H型)的结合活性相比容易与对FcγRIIb的结合活性相关，因此，找到与FcγRIIa(R型)相比能够增强对FcγRIIb的结合选择性的氨基酸改变，对于与FcγRIIb以外的其它FcγR相比增强对FcγRIIb的结合选择性是重要的。

作为FcγRIIa(R型)和FcγRIIb之间的结合选择性，例如在上述测定方法测定的KD值中，[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIa(R型)的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的KD值比优选为10.0以上，进一步地优选地20.0以上。

作为FcγRIIa(H型)和FcγRIIb之间的结合选择性，例如在上述测定方法测定的KD值中，[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIa(H型)的KD值]/[含有Fc区变体的多肽对FcγRIIb的KD值]的KD值比，优选为100.0以上、200以上、300以上、400以上、500以上，进一步地优选地、600以上、700以上、800以上、900以上。

另外，本发明的多肽与各种FcγR的结合活性是否维持、增强或降低，这也可以通过根据上述实例求出的各种FcγR与本发明多肽的结合量的增减来判断。这里，各种FcγR与多肽的结合量是指：使作为分析物的各种FcγR与各多肽相互作用，将相互作用前后变化了的传感图谱中RU值的差除以在传感芯片上捕获多肽前后变化了的传感图谱中RU值的差得到的值。

另外，本发明的Fc区变体对FcγRIIb的KD值(mol/L)没有特别限制，例如，可以是9×10^-7以下、优选地5×10^-7以下、更优选地3×10^-7以下、更优选地1×10^-7以下、更优选地5×10^-8以下。

“Fc区”是指抗体分子中由铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域组成的片段。IgG类的Fc区是指EU 编号(本说明书中也称为EU索引)(参照图21)的例如第226位半胱氨酸至C末端或者第230位的脯氨酸至C末端，但并不限于此。

对于Fc区，可优选通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白质分解酶部分消化，然后再洗脱吸附于A蛋白柱上的级分来获得。所述蛋白质分解酶只要是通过适当设定pH等酶的反应条件，可限制性地消化全长抗体，产生Fab、F(ab’)2，就无特别限定，例如可例举胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

本发明提供Fc区变体，其包含相对于人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的Fc区EU编号第238位的氨基酸向其它氨基酸的改变，以及选自EU编号第233位的氨基酸、234位的氨基酸、235位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、265位的氨基酸、266位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、269位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、274位的氨基酸、296位的氨基酸、326位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、331位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸、334位的氨基酸、355位的氨基酸、356位的氨基酸、358位的氨基酸、396位的氨基酸、409位的氨基酸以及419位的氨基酸的至少1个氨基酸向其它氨基酸的改变的组合改变。通过组合人IgG的Fc区中EU编号第238位的氨基酸向其它氨基酸的改变，以及选自EU编号第233位的氨基酸、234位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、265位的氨基酸、266位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、269位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、274位的氨基酸、296位的氨基酸、326位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、331位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸、334位的氨基酸、355位的氨基酸、356位的氨基酸、358位的氨基酸、396位的氨基酸、409位的氨基酸以及419位的氨基酸的至少1个氨基酸向其它氨基酸的改变，可提供含有Fc区变体的多肽，与包含未导入该氨基酸改变的Fc区的多肽比较，其对FcγRIIb的结合活性增强，和/或与FcγRIIa比较对FcγRIIb的结合选择性、尤其是对FcγRIIa(R型)的选择性增强。与EU编号第238位的氨基酸改变组合的其它氨基酸改变优选EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸以及396位的氨基酸，特别优选EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、271位的氨基酸、296位的氨基酸、330位的氨基酸以及396位的氨基酸。特别地，就增强对FcγRIIb的结合活性、或者与FcγRIIa比较增强对FcγRIIb的结合选择性而言，优选的氨基酸改变组合可列举，组合了EU编号第238位的氨基酸、268位的氨基酸以及271位的氨基酸，以及选自EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸以及396位的氨基酸的至少1个氨基酸的改变。

改变的氨基酸没有特别限定，与改变前比较对FcγRIIb的结合活性增强、或者与FcγRIIa比较对FcγRIIb的结合选择性增强即可，优选地，EU编号第238位的氨基酸是Asp，233位的氨基酸是Asp，234位的氨基酸是Tyr，235位的氨基酸是Phe，237位的氨基酸是Asp，264位的氨基酸是Ile，265位的氨基酸是Glu，266位的氨基酸是Phe、Leu或者Met，267位的氨基酸是Ala、Glu、Gly或者Gln，268位的氨基酸是Asp、Gln或者Glu，269位的氨基酸是Asp，271位的氨基酸是Gly，272位的氨基酸是Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或者Gln，274位的氨基酸是Gln，296位的氨基酸是Asp或者Phe，326位的氨基酸是Ala或者Asp，327位的氨基酸是Gly，330位的氨基酸是Lys、Arg或者Ser，331位的氨基酸是Ser，332位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，333位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，334位的氨基酸是Arg、Ser或者Thr，355位的氨基酸是Ala、Gln，356位的氨基酸是Glu，358位的氨基酸是Met，396位的氨基酸是Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或者Tyr，409位的氨基酸是Arg，419位的氨基酸是Glu。特别地，在组合EU编号第238位的氨基酸、268位的氨基酸以及271位的氨基酸，以及选自EU编号第233位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸和396位的氨基酸的至少1个氨基酸时，优选地，EU编号第238位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp或者Glu、271位的氨基酸是Gly、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala或者Gly、272位的氨基酸是Asp或者Pro、296位的氨基酸是Asp、327位的氨基酸是Gly、330位的氨基酸是Arg、332位的氨基酸是Thr、396位的氨基酸是Leu或者Met。

本发明中，除了这些改变，可进一步加入另外的至少一个对Fc区的改变。加入的改变没有特别限定，只要增强对FcγRIIb的结合活性、和/或增强与FcγRIIa相比对FcγRIIb的结合选择性即可。另外，改变可通过将Fc区的一部分置换为不同同种型的其它Fc区的相应部位的改变进行组合来实施。例如，通过组合将IgG1来源的Fc区的EU编号第118位的Ala至第225位的Thr的氨基酸序列置换为IgG4来源的Fc区的EU编号第118位的Ala至第222位的Pro的氨基酸序列与上述氨基酸改变，可增强与FcγRIIb的结合活性和/或与FcγRIIb的结合选择性。具体地，例如，可列举如实施例7记载的IL6R-BP478/IL6R-L那样的，IL6R-BP230中导入的氨基酸改变、与G1d的EU编号第118位的Ala至第225位的Thr的氨基酸序列置换为G4d的EU编号第118位的Ala至第222位的Pro的氨基酸序列的改变的组合。

其中，优选更大增强对FcγRIIb的结合活性的改变、或者更大增强与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性的改变。该优选的氨基酸改变组合例如可列举以下(a)～(x)的组合。

此外，在这些改变的组合中，以下(a)～(x)的氨基酸改变的组合列举为更优选的组合。

(f)Fc区的EU编号第238位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、267位的氨基酸是Ala、268位的氨基酸是Glu、271位的氨基酸是Gly、296位的氨基酸是Asp、330位Arg以及332位的氨基酸是Thr的氨基酸序列

另外，本发明的含有Fc区变体的多肽中可组合为其它目的而实施的氨基酸改变。可以加入例如与FcRn的结合活性提高的氨基酸置换(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56、J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69.、Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于使抗体的异质性或稳定性提高的氨基酸置换(WO/2009/041613)。或者，本发明也包括，为本发明的含有Fc区变体的多肽赋予WO2011/122011、PCT/JP2011/072550所述的用于促进抗原消失的性质而得的多肽，和赋予WO2009/125825、WO2012/073992、WO2013/047752所述的用于与多个分子的抗原反复结合的性质而得的多肽。或者，本发明的含有Fc区变体的多肽中，以提高血中保留性为目的，可组合降低恒定区的pI的氨基酸改变(WO/2012/016227)。或者，本发明的含有Fc区变体的多肽中，以对使用的其它抗原具有结合能力为目的，可在CH3中组合EP1752471、EP1772465中记载的氨基酸改变。

本发明的含有Fc区变体的多肽是如抗体的抗原结合分子时，为了增强抗原结合分子从血浆中消除抗原的效果，可以组合用于在pH酸性范围条件下增强人FcRn结合活性的氨基酸改变。更具体地，例如，用于在pH酸性范围条件下增强人FcRn结合活性的改变可以通过应用IgG抗体的由EU编号表示的428位的Met置换为Leu、434位的Asn置换为Ser的方法(NatBiotechnol, 2010 28:157-159.)、434位的Asn置换为Ala的方法(Drug Metab Dispos.2010 Apr;38(4):600-5.)、252位的Met置换为Tyr、254位的Ser置换为Thr、256位的Thr置换为Glu的方法(J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524)、250位的Thr置换为Gln、428位的Met置换为Leu的方法(J Immunol. 2006, 176(1):346-56)、434位的Asn置换为His的方法(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290.)、以及WO2010106180、WO2010045193、WO2009058492、 WO2008022152、WO2006050166、WO2006053301、WO2006031370、WO2005123780、WO2005047327、WO2005037867、WO2004035752、WO2002060919等中记载的改变而实施。

另外，最近报告，对于人源化抗CD4抗体，为了增强pH酸性范围条件下对人FcRn的结合活性、增加血浆保留性，由EU编号表示的434位的Asn置换为His的抗体分子结合类风湿因子(RF)(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90)。该抗体具有人IgG1的Fc区，但通过将位于FcRn结合部位的434位的Asn置换为His，示出其结合识别该置换部位的类风湿因子。

如上述，作为用于在pH酸性范围条件下增强对人FcRn的结合活性的改变，报告了各种改变，但通过将这些改变导入Fc区中的FcRn结合部位，可增强对识别该部位的类风湿因子的结合性。

但是，通过在Fc区的该部位中导入不降低对FcRn的结合活性、仅降低对类风湿因子的结合活性的改变，可制备不存在对类风湿因子的结合性、在pH酸性范围条件下增强对人FcRn的结合活性的抗原结合分子。

如此地，降低对类风湿因子的结合活性的改变应用对EU编号表示的248-257、305-314、342-352、380-386、388、414-421、423、425-437、439、441-444位的改变。优选地，优选应用对387、422、424、426、433、436、438、440位的改变。特别优选地，应用422位的Val置换为Glu或者Ser的改变、424位的Ser置换为Arg的改变、433位的His置换为Asp的改变、436位的Tyr置换为Thr的改变、438位的Gln置换为Arg或者Lys的改变、440位的Ser置换为Glu或者Asp的改变。这些改变可以单独应用，也可以多个部位结合应用。

或者，为了降低对类风湿因子的结合活性，可以向该部位导入N型糖链添加序列。具体地，N型糖链添加序列已知Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx是除Pro之外的任意氨基酸)，通过将该序列导入Fc区的该部位添加N型糖链，可造成N型糖链的空间位阻引起的与RF结合的抑制。用于添加N型糖链的改变优选应用248位的Lys置换为Asn的改变、424位的Ser置换为Asn的改变、436位的Tyr置换为Asn和438位的Gln置换为Thr的改变、438位的Gln置换为Asn的改变。特别优选地，应用424位的Ser置换为Asn的改变。

本发明的含有Fc区变体的多肽的优选例子可列举，如IgG抗体那样、含有至少2个Fc区变体的多肽，该2个Fc区变体缔合。本发明的多肽使用IgG抗体时，其恒定区的种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚类)的IgG。本发明的IgG抗体优选人IgG，进一步地优选地人IgG1、人IgG4，人IgG1以及人IgG4的重链恒定区的氨基酸序列是公知的。作为人IgG1恒定区，由于基因多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences ofproteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242，本发明中可以是其中任意一种。

前述多肽中包含的缔合的2个Fc区变体可以是导入同一氨基酸改变的Fc区变体(下文称为含有同源Fc区变体的多肽)，也可以是包含导入各自不同的氨基酸改变的不同氨基酸序列的Fc区变体，另外，也可以是包含仅任一Fc区中导入氨基酸改变的不同氨基酸序列的Fc区变体(下文称为含有异源Fc区变体的多肽)。仅导入任一Fc区中的氨基酸改变优选与FcγRIIb以及FcγRIIa的结合相关的Fc区的CH2结构域的EU编号第233位至239位的环结构部位，优选地，导入使一个Fc区中的CH2区的环结构对FcγRIIb的结合活性增强、和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的改变，导入使另一Fc区中CH2区的环结构不稳定的氨基酸改变。使CH2区的环结构不稳定的氨基酸改变例如，通过将选自EU编号第235位的氨基酸、236位的氨基酸、237位的氨基酸、238位的氨基酸以及239位的氨基酸的至少1个氨基酸置换为其它氨基酸，可使环结构不稳定。具体地，例如，通过将EU编号第235位的氨基酸改变为Asp、Gln、Glu或者Thr，236位的氨基酸改变为Asn，237位的氨基酸改变为Phe或者Trp，238位的氨基酸改变为Glu、Gly或者Asn，以及239位的氨基酸改变为Asp或者Glu，可使CH2区的环结构不稳定。

为了制备本发明的含有异源Fc区变体的多肽，需要使具有相互不同的氨基酸的Fc区变体彼此缔合，或将包含目的异源Fc区变体的多肽与包含同源Fc区变体的其它多肽分离。

为了使具有不同氨基酸的多肽彼此缔合，可应用在抗体H链第二恒定区(CH2)或者H链第三恒定区(CH3)的界面引入静电排斥的抑制非目的H链彼此缔合的技术(WO2006/106905)。

在CH2或者CH3的界面引入静电排斥的抑制非目的H链彼此缔合的技术中，在H链的其它恒定区的界面接触的氨基酸残基可列举，例如，相对于CH3区中EU编号第356位的残基、EU编号第439位的残基，EU编号第357位的残基、EU编号第370位的残基、EU编号第399位的残基、EU编号第409位的残基的区域。

更具体地，例如，含有2种H链CH3区的抗体可为，在第一H链CH3区中选自以下(1)～(3)所示氨基酸残基的组的1至3组氨基酸残基具有同种电荷：

(1)H链CH3区中含有的氨基酸残基，EU编号第356位和439位的氨基酸残基、

(2)H链CH3区中含有的氨基酸残基，EU编号第357位和370位的氨基酸残基、

(3)H链CH3区中含有的氨基酸残基、EU编号第399位和409位的氨基酸残基。

进一步地，抗体可为，与上述第一H链CH3区不同的第二H链CH3区中的氨基酸残基组选自前述(1)～(3)所示氨基酸残基组，前述第一H链CH3区中具有同种电荷的前述(1)～(3)所示氨基酸残基组对应的1至3组氨基酸残基，具有与前述第一H链CH3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。

上述(1)～(3)中记载的各自氨基酸残基在缔合时相互接近。本领域技术人员能够针对期望的H链CH3区或者H链恒定区、利用市售软件通过同源建模等，发现与上述(1)～(3)记载的氨基酸残基对应的部位，可适当地改变该部位的氨基酸残基。

上述抗体中，“具有电荷的氨基酸残基”优选选自例如以下(X)或者(Y)中任一组中包含的氨基酸残基；

(X)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、

(Y)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

上述抗体中，“具有同种电荷”意味着，例如，2个以上氨基酸残基中的所有都具有上述(X)或者(Y)中任一组中包含的氨基酸残基。“具有相反电荷”意味着，例如，2个以上氨基酸残基中的至少1个氨基酸残基具有上述(X)或者(Y) 中任一组中包含的氨基酸残基时，其它氨基酸残基具有不同组中包含的氨基酸残基。

在优选实施方式中，上述抗体的第一H链CH3区与第二H链CH3区可通过二硫键交联。

本发明中要改变的氨基酸残基不限于上述抗体的可变区或者抗体的恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员能够利用市售软件通过同源建模等发现多肽变体或者异源多聚体中形成界面的氨基酸残基，并且可改变该部位的氨基酸残基而调节缔合。

本发明的异源Fc区变体的缔合中可应用进一步其它的公知技术。通过将抗体的一个H链的可变区中存在的氨基酸侧链置换为更大的侧链(knob；突起)、另一H链的相对可变区中存在的氨基酸侧链置换为更小的侧链(hole；空隙)，可将突起配置在空隙中，从而能够有效地引起具有Fc区的具有不同氨基酸的多肽彼此缔合(WO1996/027011、Ridgway JB etal., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. NatureBiotechnology (1998) 16, 677-681)。

此外，异源Fc区变体的缔合中也可应用进一步其它的公知技术。应用将抗体的一个H链的CH3的一部分制成与该部分对应的IgA来源的序列、另一H链的CH3的互补部分中导入与该部分对应的IgA来源的序列的链交换工程化结构域CH3，可通过CH3的互补缔合有效引起具有不同序列的多肽的缔合(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。应用该公知技术可有效引起具有Fc区的具有不同氨基酸的多肽之间的缔合。

也可应用WO2011/028952中记载的抗体的CH1与CL的缔合、VH、VL的缔合的异源二聚化抗体制备技术。

如WO2008/119353、WO2011/131746中记载的方法，也可应用下列制备异源二聚化抗体的技术，预先制备二种异源二聚化抗体，将它们在还原条件下温育而解离，并使它们再缔合。

另外，如J. Mol. (2012) 420, 204-219中记载的方法，也可应用下列制备异源二聚化抗体的技术，将如Lys、Arg、Glu、Asp的具有电荷的残基导入，使得静电排斥导入IgG1、IgG2的CH3中。

另外，如WO2012/058768记载的方法，也可应用通过在CH2、CH3区中加入改变制备异源二聚化抗体的技术。

另外，即使在无法有效形成含有异源Fc区变体的多肽的情况下，通过将含有异源Fc区变体的多肽与含有同源Fc区变体的多肽分离、纯化，也可得到含有异源Fc区变体的多肽。制备含有由序列相互不同的第一多肽和第二多肽组成的异源Fc区变体的多肽时，将包含仅由2个第一多肽组成的同源Fc区的多肽、与包含仅由2个第二多肽组成的同源Fc区的多肽作为杂质混入。有效去除这2种包含同源Fc区的多肽的方法可使用公知技术。报告了通过在2种H链可变区中导入氨基酸置换产生等电点差异、可将2种同源体与目的异源二聚化抗体通过离子交换层析而纯化的方法(WO2007114325)。作为纯化异源二聚化抗体的方法，迄今报告了，将由与蛋白A结合的小鼠IgG2a的H链和不与蛋白A结合的大鼠IgG2b的H链组成的异源二聚化抗体利用蛋白A纯化的方法(WO98050431, WO95033844)。

另外，通过应用将IgG与蛋白A的结合部位的EU编号第435位和436位的氨基酸残基置换为Tyr、His等与蛋白A的结合力不同的氨基酸的H链，使各H链与蛋白A的相互作用变化，通过应用蛋白 A柱，也可有效纯化单独的异源二聚化抗体。

这些置换、技术可多个组合使用，例如2个以上组合使用。另外，这些改变可对第一多肽和第二多肽分别适当进行。另外，本发明的多肽也可在进行了上述改变的产物的基础上进行制备。

本发明中的氨基酸改变是指置换、缺失、添加、插入或修饰的任一种或它们的组合。本发明中，氨基酸改变可与氨基酸突变互换，它们以相同含义应用。

置换氨基酸残基时，其目的是通过置换为另外的氨基酸残基，例如对以下(a)-(c)几点进行改变。

(a)片层结构或螺旋结构区中的多肽的主链结构；

(b)靶部位的电荷或疏水性；或

(c)侧链的大小。

氨基酸残基根据一般侧链的特性，分成以下组：

(1) 疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2) 中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；

(3) 酸性：asp、glu；

(4) 碱性：his、lys、arg；

(5) 影响链的取向的残基：gly、pro；以及

(6) 芳香性：trp、tyr、phe。

这些各组内的氨基酸残基的置换被称为保守性置换，另一方面，在其它组彼此之间的氨基酸残基的置换被称为非保守性置换。本发明的置换可以是保守性置换，也可以是非保守性置换，还可以是保守性置换与非保守性置换的组合。

氨基酸序列的改变可根据本领域公知的各种方法制备。这些方法中，可通过部位特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M.(1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction ofmutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR突变法、盒突变法等方法进行，但不限于此。

本发明的氨基酸修饰包含翻译后修饰。具体的翻译后修饰可示出糖链的添加或缺失。例如在由SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列组成的IgG1恒定区中，EU编号第297位的氨基酸残基可以用糖链修饰。进行修饰的糖链结构没有限定。通常，在真核细胞中表达的抗体在恒定区含有糖链修饰。因此，在以下细胞中表达的抗体通常是被一些糖链修饰。

DNA的表达载体转化的真核细胞

这里示出的真核细胞包括酵母和动物细胞。例如CHO细胞、HEK293H细胞是用于含有编码抗体的DNA的表达载体转化的代表性的动物细胞。另一方面，在该位置没有糖链修饰的恒定区也包括在本发明的恒定区中。恒定区未被糖链修饰的抗体可以是将编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达获得。

更具体地，例如可以是在Fc区的糖链上添加唾液酸(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.)。

进一步地，本发明提供含有上述中任一项记载的Fc区变体的抗体。

本发明中的“抗体”术语以最广泛意义使用，只要显示所需生物学活性即可，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体变体、抗体片段、多特异性抗体(多重特异性抗体)(例如双特异性抗体(双重特异性抗体))、嵌合抗体、人源化抗体等任何的抗体。

对于本发明的抗体，抗原种类、抗体的来源等没有限定，可以是任何抗体。抗体的来源没有特别限定，可举出人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。

制备抗体的方法是本领域技术人员熟知的，例如单克隆抗体可通过杂交瘤法(Kohler和Milstein, Nature 256: 495 (1975))、重组法(美国专利第4,816,567号)制备。还可以从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人., Nature 352: 624-628 (1991); Marks等人, J.Mol.Biol. 222: 581-597 (1991))。

人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中得到的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的。具体来说，作为将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠延伸PCR是公知的。

通过将编码3个CDR和4个FR连接而成的抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA以框内融合方式插入表达载体中，可制备人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主，建立重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此使该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。

还可以根据需要置换FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用在将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，可向FR中导入氨基酸序列的突变。

具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所需的人抗体。

进一步地，已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需的人抗体C区的序列框内融合，然后插入适当的表达载体，由此可制备表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可获得该人抗体。这些方法均已公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。

本说明书中，抗原没有特别限定，可以是任何抗原。抗原的实例例如可优选举出：配体(细胞因子、趋化因子等)、受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白和部分地含有免疫球蛋白的免疫复合物。

细胞因子的实例可举出：白细胞介素1-18、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生长因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、促红细胞生成素、瘦蛋白、SCF、TPO、MCAF、BMP。

趋化因子的实例可举出CCL1-CCL28等的CC趋化因子、CXCL1- CXCL17等的CXC趋化因子、XCL1- XCL2等的C趋化因子、CX3CL1等的CX3C趋化因子。

受体的实例例如可举出：造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联型受体家族、GPI锚型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘着因子家族、激素受体家族等属于受体家族的受体等。这些属于受体家族的受体及其特征在很多文献中有记载，例如Cooke BA., King RJB.,van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B “Hormones andtheir Actions Part II” pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV、Patthy(Cell (1990) 61 (1): 13-14)、Ullrich等人. (Cell (1990) 61 (2): 203-212)、Massagué (Cell (1992) 69 (6): 1067-1070)、Miyajima等人. (Annu. Rev. Immunol.(1992) 10: 295-331)、Taga等人. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396)、Fantl等人.(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481)、Smith等人. (Cell (1994) 76 (6):959-962)、Flower DR. (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3): 207-234)等。

属于上述受体家族的具体受体例如可优选举出：人或小鼠促红细胞生成素(EPO)受体(Blood (1990) 76 (1): 31-35、Cell (1989) 57 (2): 277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22): 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2): 341-350)、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Proc NatlAcad Sci U S A. (1992) 89 (12): 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7): 2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature (1985) 313 (6005): 756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc.Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2): 459-463)、人或小鼠血小板来源的生长因子(PDGF)受体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10): 3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell (1990) 60 (2): 225-234和Cell (1994) 77 (3): 391-400)、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。

癌抗原是伴随着细胞的恶化而表达的抗原，也称为肿瘤特异性抗原。细胞癌化时，出现在细胞表面或蛋白质分子上的异常的糖链也是癌抗原，也称为癌糖链抗原。癌抗原的实例例如可优选举出：作为上述受体属于GPI锚型受体家族、在以肝癌为代表的几种癌症中表达的GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4): 455-65),)、在以肺癌为代表的多种癌症中表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1): 27-31)、CA19-9、CA15-3、唾液酸SSEA-1(SLX)等。

MHC抗原主要分类为MHC I类抗原和MHC II类抗原，MHC I类抗原包括HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC II类抗原包括HLA-DR、-DQ、-DP。

分化抗原可包括CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。

免疫球蛋白包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。免疫复合物至少包含免疫球蛋白的任意成分。

其它的抗原可例举下述分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a, OP-2)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体调节因子(衰变加速因子)、des (1-3)-IGF-I (脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR (ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子1、EpCAM、ephrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择蛋白、ET-1、IIa因子、VII因子、VIIIc因子、IX因子、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、血纤蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激素、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14、CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8 (myostatin)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap or NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5 (αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP (TGF-1)、潜在TGF-1、潜在TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、副中肾管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘蛋白、NCA90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、C蛋白、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72 (肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan Specific、TGF-βRI (ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D (TRAILR4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A (RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B (OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEMATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITRAITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B (TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNFRIII、TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (FasApo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25 (DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接蛋白、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5 (CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7 (CD27配体 CD70)、TNFSF8 (CD30配体CD153)、TNFSF9 (4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关糖、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽释放酶、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、B因子、D因子、H因子、备解素、硬化蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、V因子、Va因子、VII因子、VIIa因子、VIII因子、VIIIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、Xa因子、XI因子、XIa因子、XII因子、XIIa因子、XIII因子、XIIIa因子、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4、LPA、S1P以及激素和生长因子的受体。

对于构成可变区的氨基酸序列，只要维持其抗原结合活性，就允许1或多个氨基酸残基的改变。使可变区的氨基酸序列改变时，改变的部位、改变的氨基酸数目没有特别限定。例如可以将存在于CDR和/或FR的氨基酸适当改变。使可变区的氨基酸改变时没有特别限定，优选维持结合活性，例如与改变前相比，优选具有50%以上、优选80%以上、进一步优选100%以上的结合活性。另外，可以通过氨基酸改变使结合活性升高，例如结合活性与改变前相比，可以是2倍、5倍、10倍等。本发明的抗体中，氨基酸序列的改变可以是氨基酸残基的置换、添加、缺失和修饰中的至少1种。

例如，可变区N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰化而修饰为焦谷氨酸，这是本领域技术人员熟知的修饰。因此，当N末端为谷氨酰胺时，本发明的抗体重链包含谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的可变区。

本发明的抗体的可变区可以是任意的序列，可以是小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体以及将这些非人抗体人源化而成的人源化抗体、以及人抗体等任何来源的抗体的可变区。“人源化抗体”也称为重构人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR所得。鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), NationalInstitute of Health, Bethesda, Md.；Chothia等人., Nature (1989) 342: 877)。另外，其常规基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。另外，对于这些抗体的可变区，为了改善与抗原的结合、药代动力学、稳定性、抗原性，可以导入各种氨基酸置换。本发明的抗体的可变区与抗原的结合具有pH依赖性，因此可以与抗原反复结合(WO2009/125825)。

抗体的轻链恒定区存在κ链和λ链类型的恒定区，可以是任何轻链恒定区。并且本发明中，轻链恒定区可以是进行了氨基酸置换、缺失、添加和/或插入等改变的轻链恒定区。

本发明的抗体的重链恒定区例如可以使用人IgG抗体的重链恒定区，优选为人IgG1抗体、人IgG4抗体的重链恒定区。

另外，本发明的Fc区变体可以与其它蛋白质、生理活性肽等结合，制成Fc融合蛋白质分子。此处，融合蛋白质指含有在天然情况下非自然连接的至少2个不同多肽的嵌合多肽。其它蛋白质、生理活性肽例如可举出受体、粘着分子、配体、酶，但并不限于这些。

本发明的Fc融合蛋白质分子的优选实例可举出使Fc区与结合靶标的受体蛋白融合所得的蛋白质，例如可举出TNFR-Fc融合蛋白质、IL1R-Fc融合蛋白质、VEGFR-Fc融合蛋白质、CTLA4-Fc融合蛋白质等(Nat Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52、BioDrugs. 2006; 20(3):151-60)。另外，与本发明的多肽融合的蛋白质只要与靶分子结合即可，可以是任何分子，例如可举出：scFv分子(WO2005/037989)、单结构域抗体分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、抗体样分子(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658、CurrentOpinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10、Current Opinion in Structural Biology1997, 7: 463-469、Protein Science 2006, 15: 14-27)例如DARPins(WO2002/020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。另外，抗体和Fc融合蛋白质分子还可以是与多数靶分子或表位结合的多特异性抗体。

另外，本发明的抗体也包括抗体修饰物。抗体修饰物的实例例如可举出：与聚乙二醇(PEG)和细胞毒性物质等各种分子结合的抗体。上述抗体修饰物可通过对本发明的抗体实施化学修饰获得。抗体修饰方法在该领域中已经建立。

进一步地，本发明的抗体可以是双特异性抗体(bispecific antibody)。双特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，该表位可以存在于不同分子中，也可以存在于同一分子中。

本发明的多肽可按照本领域技术人员公知的方法制备。例如抗体可按照以下方法制备，但并不限于此。

表达编码抗体重链的DNA和编码抗体轻链的DNA，编码抗体重链的DNA是编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA。编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA例如可如下获得：获得编码天然型重链的DNA的Fc区部分，适当导入置换，使编码该Fc区中特定的氨基酸的密码子编码其它目标氨基酸。

另外，预先设计DNA，使其编码天然型重链的Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的蛋白质，化学合成该DNA，由此也可以获得编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA。氨基酸的置换部位、置换的种类没有特别限定。另外并不限于置换，也可以是缺失、添加、插入的任意一种或它们的组合。

另外，编码Fc区中1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA可以分成部分DNA来制备。部分DNA的组合例如可举出：编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA，或者编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码轻链的DNA也同样可以分成部分DNA来制备。

表达上述DNA的方法可举出以下方法。例如，将编码重链可变区的DNA与编码重链恒定区的DNA一起掺入表达载体中，构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变区的DNA与编码轻链恒定区的DNA一起掺入到表达载体中，构建轻链表达载体。也可以将这些重链、轻链的基因掺入到单一的载体中。

将编码目标抗体的DNA掺入到表达载体中时，以在表达控制区例如增强子、启动子的控制下进行表达的方式掺入表达载体中。接着，用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。

载体的实例可举出：M13载体、pUC载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亚克隆、切除为目的时，除上述载体之外，例如还可以使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

在生产本发明的多肽的目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如在宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，具有可在大肠杆菌中高效表达的启动子是不可缺少的，例如lacZ启动子(Ward等人, Nature (1989) 341: 544-546；FASEBJ. (1992) 6: 2422-2427；其全文通过参照结合到本说明书中)、araB启动子(Better等人,Science (1988) 240: 1041-1043，其全文通过参照结合到本说明书中)或T7启动子等。除上述载体之外，这样的载体还可举出pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(QIAGEN)、pEGFP或pET(这种情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。

载体中还可以含有用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei, S. P.等人J. Bacteriol.(1987) 20 169: 4379，其全文通过参照结合到本说明书中)。载体向宿主细胞的导入例如可以采用脂质转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法进行。

除大肠杆菌表达载体之外，例如用于制备本发明的多肽的载体可举出：来自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)或pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17): p5322，其全文通过参照结合到本说明书中)、pEF、pCDM8)，来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(Gibco-BRL)、pBacPAK8)，来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)，来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)，来自反转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)，来自酵母的表达载体(例如“Pichia Expression Kit”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的时，具有用于在细胞内表达所必需的启动子是不可缺少的，例如SV40启动子(Mulligan等人., Nature(1979) 277, 108，其全文通过参照结合到本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人, Nucleic Acids Res. (1980) 18, 5322，其全文通过参照结合到本说明书中)、CAG启动子(Gene. (1991) 108, 193，其全文通过参照结合到本说明书中)、CMV启动子等，进一步优选具有用于筛选转化细胞的基因(例如可通过药物(新霉素、G418等)判别的耐药性基因)。具有上述特性的载体例如可举出：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

进一步地，以稳定表达基因和扩增细胞内的基因拷贝数目为目的时，可举出以下方法：在核酸合成途径缺失的CHO细胞中导入具有补偿该缺失的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲蝶呤(MTX)扩增；另外，以基因的瞬时表达为目的时，可以举出以下方法：使用在染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化。复制起点还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系内扩增基因拷贝数目，表达载体可以含有氨基葡糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。

抗体的回收例如可通过培养转化的细胞，然后从分子转化的细胞的细胞内或培养液分离来进行。对于抗体的分离、纯化，可以将离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、A蛋白、G蛋白柱、亲和柱色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等方法适当组合进行。

另外，本发明提供了含有Fc区变体的多肽的制备方法，其与含有亲本Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性增强，所述方法包含在含有抗体Fc区变体的多肽中，在该Fc区变体中加入至少一个氨基酸改变。

例如可举出包括以下步骤的制备方法：

(a)在含有Fc区的多肽中，在该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤；

(b)测定上述步骤(a)中改变的多肽与FcγRIIb的结合活性的步骤；和

(c)选择含有与含有亲本Fc区的多肽相比与FcγRIIb的结合活性增强的Fc区变体的多肽的步骤。

优选的方案是含有Fc区变体的多肽的制备方法，该方法包括：

(a)改变编码该多肽的核酸，使得与含有亲本Fc区的多肽相比，与FcγRIIb的结合活性增强的步骤、

(b)向宿主细胞中导入该核酸以表达的步骤、

(c)从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。

进一步地，通过该制备方法制备的抗体和Fc融合蛋白质分子也包含在本发明中。

另外，本发明提供含有Fc区变体的多肽的制备方法，与含有亲本Fc区的多肽比较，其与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性增强，所述方法包含在含有抗体Fc区变体的多肽中，在该Fc区变体中加入至少一个氨基酸改变。

例如可举出包括以下步骤的制备方法；

(a)在含有Fc区的多肽中，在该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤，

(b)测定前述步骤(a)中改变的多肽对FcγRIIa的结合活性和对FcγRIIb的结合活性的步骤，和

(c)选择与含有亲本Fc区的多肽相比，含有与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的Fc区变体的多肽的步骤。

优选的方案是含有Fc区变体的多肽的制备方法，包括：

(a)改变编码该多肽的核酸，使得与含有亲本Fc区的多肽相比，与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的步骤，

(b)向宿主细胞中导入该核酸，培养以表达的步骤，

(c)从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。

进一步地，本发明提供含有Fc区变体的多肽的制备方法，与含有亲本Fc区的多肽比较，其对FcγRIIb的结合活性增强，并且与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性增强，所述方法包含在含有抗体Fc区变体的多肽中，在该Fc区变体中加入至少一个氨基酸改变。

例如可举出包括以下步骤的制备方法：

(c)选择与含有亲本Fc区的多肽相比，含有对FcγRIIb的结合活性增强、并且与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的Fc区变体的多肽的步骤。

优选的方案是含有Fc区变体的多肽的制备方法，包括：

(a) 改变编码该多肽的核酸，使得与含有亲本Fc区的多肽相比，对FcγRIIb的结合活性增强、并且与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的步骤，

(b) 向宿主细胞中导入该核酸，培养以表达的步骤，

(c) 从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。

另外，本发明提供多肽的制备方法，在施用于生物时，与含有亲本Fc区的多肽比较，对于该多肽的抗体的产生得到抑制，所述方法包含在含有Fc区的多肽中，在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变。

例如可举出包括以下步骤的制备方法：

(a) 在含有Fc区的多肽中，在该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤，和

(b) 将含有在上述步骤(a)中改变的Fc区的多肽给予生物时，与含有亲本Fc区的多肽相比，确认抗体的产生受到抑制的步骤。

抗该多肽的抗体的产生是否受到抑制，这可通过对动物实际给予多肽等方法确认。或者，也可测定与FcγRIIa的结合活性和与FcγRIIb的结合活性，如果对FcγRIIa的KD值除以对FcγRIIb的KD值所得的值增加，则判断抗体的产生受到抑制。上述多肽可在不活化活性型FcγR的情况下抑制抗体的产生，因此认为可用作药物。

上述制备方法，优选使得与FcγRIIb的结合活性增强，且与FcγRIIa(R型)比较与FcγRIIb的结合选择性增强。

作为上述制备方法中的优选方案，例如，改变该Fc区，使得人IgG的Fc区中导入：EU编号第238位的氨基酸改变为其它氨基酸，选自EU编号第233位的氨基酸、234位的氨基酸、235位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、265位的氨基酸、266位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、269位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、274位的氨基酸、296位的氨基酸、326位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、331位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸、334位的氨基酸、355位的氨基酸、356位的氨基酸、358位的氨基酸、396位的氨基酸、409位的氨基酸以及419位的氨基酸的至少1个氨基酸改变为其它氨基酸。与EU编号第238位的氨基酸改变组合的其它氨基酸改变优选EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、271位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸、333位的氨基酸以及396位的氨基酸，特别优选EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、268位的氨基酸、271位的氨基酸、296位的氨基酸、330位的氨基酸以及396位的氨基酸。特别地，EU编号第238位的氨基酸、268位的氨基酸以及271位的氨基酸，以及选自EU编号第233位的氨基酸、237位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸以及396位的氨基酸的至少1个氨基酸进行组合的改变，从增强对FcγRIIb的结合活性或与FcγRIIa比较增强对FcγRIIb的结合选择性方面看来，被列举为优选的氨基酸改变组合。

改变的氨基酸没有特别限制，与改变前比较对FcγRIIb的结合活性增强、或者与FcγRIIa比较对FcγRIIb的结合选择性增强即可，优选地，EU编号第238位的氨基酸是Asp，233位的氨基酸是Asp，234位的氨基酸是Tyr，237位的氨基酸是Asp，264位的氨基酸是Ile，265位的氨基酸是Glu，266位的氨基酸是Phe、Leu或者Met，267位的氨基酸是Ala、Glu、Gly或者Gln，268位的氨基酸是Asp、Gln或者Glu，269位的氨基酸是Asp，271位的氨基酸是Gly，272位的氨基酸是Asp、Phe、Ile、Met、Asn、Pro或者Gln，274位的氨基酸是Gln，296位的氨基酸是Asp或者Phe，326位的氨基酸是Ala或者Asp，327位的氨基酸是Gly，330位的氨基酸是Lys、Arg或者Ser，331位的氨基酸是Ser，332位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，333位的氨基酸是Lys、Arg、Ser或者Thr，334位的氨基酸是Arg、Ser或者Thr，355位的氨基酸是Ala、Gln，356位的氨基酸是Glu，358位的氨基酸是Met，396位的氨基酸是Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或者Tyr，409位的氨基酸是Arg，419位的氨基酸是Glu。改变的氨基酸更优选与改变前比较对FcγRIIb的结合活性增强，并且与FcγRIIa比较对FcγRIIb的结合选择性增强。特别地，当EU编号第238位的氨基酸、268位的氨基酸以及271位的氨基酸与选自EU编号第233位的氨基酸、264位的氨基酸、267位的氨基酸、272位的氨基酸、296位的氨基酸、327位的氨基酸、330位的氨基酸、332位的氨基酸以及396位的氨基酸的至少1个氨基酸组合时，优选地，EU编号第238位的氨基酸是Asp、268位的氨基酸是Asp或者Glu、271位的氨基酸是Gly、233位的氨基酸是Asp、237位的氨基酸是Asp、264位的氨基酸是Ile、267位的氨基酸是Ala或者Gly、272位的氨基酸是Asp或者Pro、296位的氨基酸是Asp、327位的氨基酸是Gly、330位的氨基酸是Arg、332位的氨基酸是Thr、396位的氨基酸是Leu或者Met。

这些组合中，优选导入对FcγRIIb的结合活性更加增强的改变、或者与FcγRIIa(R型)相比对FcγRIIb的结合选择性更加增强的改变。作为这种改变的优选氨基酸置换组合，可列举例如以下(a)～(x)的组合。

进一步，这些改变的组合中，将以下(a)～(x)的氨基酸改变组合列举为更优选的组合。

进一步地，本发明提供改变多肽的方法，其用于制备与包含亲本Fc区的多肽相比对FcγRIIb的结合活性增强、或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的多肽。另外，本发明提供改变多肽的方法，其用于制备与包含亲本Fc区的多肽相比对FcγRIIb的结合活性增强、并且与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的多肽。

另外，本发明提供改变多肽的方法，其用于制备在给予生物时、与含有亲本Fc区的多肽相比抑制抗体产生的多肽。

优选实施方式可列举，例如，上述对FcγRIIb的结合活性增强、或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的含有Fc区变体的多肽的制备方法中记载的氨基酸改变组合。进一步地优选实施方式可列举，例如，上述对FcγRIIb的结合活性增强、并且与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的含有Fc区变体的多肽的制备方法中记载的氨基酸改变组合。

进一步地，本发明提供编码含有Fc区变体的多肽的核酸，所述多肽为含有Fc区的多肽，至少一个氨基酸被改变，与含有亲本Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性增强、或者与对FcγRIIa(R型)的结合活性比较对FcγRIIb的结合选择性增强。另外，本发明提供编码含有Fc区变体的多肽的核酸，所述多肽为含有Fc区的多肽，至少一个氨基酸被改变，与含有亲本Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性增强、并且与对FcγRIIa(R型)的结合活性比较对FcγRIIb的结合选择性增强。本发明的该核酸可为任何形式，是DNA、RNA等。

进一步地，本发明提供含有上述本发明的核酸的载体。对于载体的种类，根据导入载体的宿主细胞，本领域技术人员可适当选择，例如可使用上述的载体。

进一步地，本发明涉及由上述本发明的载体转化的宿主细胞。对于宿主细胞，本领域技术人员可适当选择，例如可使用上述宿主细胞。具体地，可列举例如以下宿主细胞。

真核细胞作为宿主细胞使用时，可适当应用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞可列举下列细胞。

(1)哺乳类细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、COS(猴肾细胞系)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK (幼仓鼠肾细胞系)、Hela、Vero、HEK293(人胚胎肾细胞系，具有已剪切的腺病毒(Ad)5 DNA)、Freestyle 293，PER.C6细胞(人胚胎视网膜细胞系，用腺病毒5型(Ad5) E1A和E1B基因转化)等(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9,Table 5.9.1))

(2)两栖类细胞：爪蟾卵母细胞等

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或作为植物细胞，公知应用普通烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属来源的细胞的抗体基因表达体系。植物细胞的转化可适当应用愈伤组织培养细胞。

进一步地，真菌细胞可利用下列细胞。

-酵母(yeasts)：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces )属、毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属

-丝状真菌：黑曲霉(Aspergillus niger) 等曲霉菌(Aspergillus )属。

进一步地，本发明提供增强与包含亲本Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性、和/或增强与对FcγRIIa(R型)的结合活性比较对FcγRIIb的结合选择性的方法，所述方法包含在含有Fc区的多肽中，在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变。

另外，本发明提供在施用于生物时、与包含亲本Fc区的多肽比较抑制对于该多肽的抗体的产生的方法，所述方法包含在含有Fc区的多肽中，在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变。

优选实施方式可列举，例如，上述对FcγRIIb的结合活性增强、和/或与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的含有Fc区变体的多肽的制备方法中记载的氨基酸改变的组合。

另外，上述任一方法制备的多肽也包含在本发明中。

本发明提供含有本发明的含有Fc区变体的多肽的药物组合物。

对于本发明的药物组合物，除了本发明的上述抗体或Fc融合蛋白质分子之外，还可以导入药学上可接受的载体，按照公知的方法制成制剂。例如可以以与水或其它药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以考虑将药理学上可接受的载体或介质，具体而言将无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常认可的制药实践所要求的单位用量形式进行混合，由此制成制剂。具体来说，载体可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。这些制剂中的有效成分量是可以获得所指示的范围的适当用量。

对于用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水等的载体，按照通常的制剂实践来配制。

注射用的水溶液例如可举出：含有生理盐水、含有葡萄糖或其它辅料的等渗液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，也可以结合使用适当的助溶剂，例如：醇，具体来说乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇；非离子性表面活性剂，例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50。

油性液体可举出：芝麻油、大豆油，助溶剂可结合使用苯甲酸苄基酯、苄基醇。还可以掺混缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄基醇、苯酚、抗氧化剂。所制备的注射液通常填充于安瓿中。

给予优选为非口服给予，具体可举出：注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予剂型等。注射剂型例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部性给予。

另外，本发明的药物组合物可以根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量例如可以是在每次每1kg体重为0.0001mg-1000mg的范围内选择。或者例如可在每位患者为0.001-100000mg/机体的范围内选择给予量，这些数值没有限定。给予量、给予方法根据患者的体重或年龄、症状等变化，本领域技术人员可适当选择。

上述本发明的含有Fc区变体的多肽可用作抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞活化的药物的有效成分。本发明的含有Fc区变体的多肽并不活化活性型FcγR，而是选择性地作用于FcγRIIb，可抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化。B细胞的活化包括增殖、IgE产生、IgM产生、IgA产生等。上述本发明的含有Fc区变体的多肽通过使FcγRIIb与IgE交联来抑制B细胞的IgE产生，通过与IgM交联来抑制B细胞的IgM产生，通过与IgA交联来抑制IgA产生。除此之外，通过使BCR、CD19、CD79b等在B细胞上表达的、在细胞内含有ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，可发挥与上述同样的抑制作用。另外，肥大细胞的活化包括增殖、IgE等引起的活化、脱粒等。在肥大细胞中，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可通过使IgE受体FcεRI、DAP12、CD200R3等在肥大细胞上表达的、含有ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接、间接交联，抑制增殖、IgE等引起的活化、脱粒。另外，嗜碱性粒细胞的活化包括增殖、脱粒等。在嗜碱性粒细胞中，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可通过使FcγRIIb与细胞膜上的、在细胞内含有ITAM结构域的分子或者与ITAM结构域相互作用的分子直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。另外，树突细胞的活化包括增殖、脱粒等。在树突细胞中，上述本发明的含有Fc区变体的多肽也可通过使细胞膜上的、在细胞内含有ITAM结构域或与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。

本发明中，上述本发明的含有Fc区变体的多肽作为免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂的有效成分是有用的。如上所述，本发明的含有Fc区变体的多肽可以抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化，因此，结果是，通过给予本发明的含有Fc区变体的多肽，可以治疗或预防免疫炎性疾病。“免疫炎性疾病”包括但不限于以下疾病：类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性疱病、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、巨红细胞性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、间质性肺纤维化、多发性硬化症、帕哲病(Paget's disease)、骨质疏松症、多发性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性和慢性脊椎炎、痛风性关节炎、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、银屑病、克罗恩病、巴塞杜氏病、青少年糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、晶体性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、变应性鼻炎、变应性皮肤炎、溃疡性结肠炎、超敏感症、肌变性、恶病质、系统性硬皮病、局限性硬皮病、干燥综合征、白塞病、赖特综合征、I型和II型糖尿病、骨吸收障碍、移植物抗宿主反应、缺血性再灌注损伤、动脉粥样硬化、脑损伤、脑型疟、败血症、败血性休克、中毒性休克综合征、发热、染色引发的肌痛(malgias)、再生障碍性贫血、溶血性贫血、突发性血小板降低、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、天疱疮、IgA肾病、花粉病、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、混合性结缔组织病、纤维肌痛症、哮喘、特应性皮炎、慢性萎缩性胃炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性甲状腺功能减退、特发性阿狄森病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、低血糖症、慢性荨麻疹、强直性脊椎炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、韧带附着端病、过敏性肠综合征、慢性疲劳综合征、皮肌炎、包涵体肌炎、施密特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、类狼疮性肝炎、初老期痴呆、阿尔茨海默病、脱髓鞘疾病、肌萎缩性侧索硬化症、副甲状腺功能减退、心肌梗死后综合征、肌无力综合征、疱疹样皮炎、脱毛症、进行性系统性硬化病、CREST综合征(钙沉着、雷诺现象、食道蠕动障碍、指端硬皮、毛细血管扩张)、结节病、风湿热、多形性红斑、库欣综合征、输血反应、麻风病、多发性大动脉炎、类风湿性多发性肌痛症、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎病、心内膜炎、心内膜心肌纤维化症、眼内炎、胎儿幼红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、过敏性紫癜、移植排斥反应、流行性腮腺炎、心肌病、化脓性关节炎、家族性地中海热、穆-韦二氏综合征、高IgD综合征。

另外，上述本发明的含有Fc区变体的多肽在可认为抗自身抗原的抗体(自身抗体)的产生是疾病原因的自身免疫疾病中，抑制该自身抗体的产生，可用作治疗或预防该自身免疫疾病的药物的有效成分。有报告称，通过使用重症肌无力的自身抗原AchR与抗体的Fc部分融合所得的分子，抑制了表达识别AchR的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡(JNeuroimmunol, 227, 35-43, 2010)。通过使用自身抗体所识别的抗原与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，可以使表达针对该自身抗原的BCR的B细胞的BCR与FcγRIIb交联，抑制表达针对自身抗原的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡。上述自身免疫疾病包括格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、肺出血肾炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜氏病、桥本氏甲状腺炎、原发性甲状腺功能减退、特发性阿狄森病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、局限性硬皮病、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、II型糖尿病、低血糖症、慢性荨麻疹，但不限于此。

另外，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可用作生物所需的蛋白质缺乏的疾病的治疗剂的有效成分。对于生物所需蛋白质缺乏的疾病，采用给予该蛋白质作为药物进行补充的治疗方法，但是患者原本就缺乏该蛋白质，因此由外部补充的该蛋白质被识别为异物，致使产生抗该蛋白质的抗体。结果，该蛋白质容易被除去，作为药物的效果减弱。通过使用上述蛋白质与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，在识别该蛋白质的B细胞上，使BCR与FcγRIIb交联，可抑制抗该蛋白质的抗体的产生。所补充的蛋白质包括：VIII因子、IX因子、TPO、EPO、α-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、A型类肝素N-硫酸酯酶、B型α-N-乙酰葡糖胺酶、C型乙酰CoA:α-葡糖胺酶乙酰转移酶、D型N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、半乳糖6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-半乳糖苷酶、酸性α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶。要补充这些蛋白质的疾病包括血友病、特发性血小板减少性紫癜、肾性贫血、溶酶体病(黏多糖贮积症、法布里病、庞贝氏病、戈谢病)等。但并不限于这些。

另外，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可用作抗病毒剂的有效成分。作为抗病毒抗体的含有本发明所述的Fc区的抗体可以抑制在抗病毒抗体中见到的抗体依赖性感染增强。抗体依赖性感染增强是指以下现象：病毒利用抗该病毒的中和抗体，被活性型FcγR介导吞噬，感染表达FcγR的细胞，由此使感染扩大。有报告称，抗登革病毒的中和抗体与FcγRIIb的结合在抑制抗体依赖性感染增强方面发挥重要的作用(Proc Natl Acad SciUSA, 108, 12479-12484, 2011)。登革病毒和抗登革病毒的中和抗体形成的免疫复合物与FcγRIIb交联，由此抑制FcγR介导的吞噬，结果抑制抗体依赖性感染增强。病毒包括登革病毒(DENV1、DENV2、DENV4)和HIV。但并仅限于这些。

另外，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可用作动脉硬化预防剂或治疗剂的有效成分。含有本发明所述的Fc区的抗体是抗作为动脉硬化原因的氧化LDL的抗体，可防止FcγRIIa依赖性的炎性细胞粘附。有报告称：抗氧化LDL抗体抑制氧化LDL与CD36的相互作用，但抗氧化LDL抗体与内皮细胞结合，单核细胞以FcγRIIa或FcγRI依赖性方式识别其Fc部分并粘附(Immunol Lett, 108, 52-61, 2007)。对于这样的抗体，可以认为，通过利用含有本发明所述的Fc区的抗体，FcγRIIa依赖性结合受到抑制，且通过FcγRIIb介导的抑制信号来抑制单核细胞粘附。

本发明中，上述本发明的含有Fc区变体的多肽可用作癌症治疗剂或预防剂的有效成分。如上所述，已知通过增强与FcγRIIb的结合，来增强激动性抗体的激动活性，该抗体所具有的抗肿瘤效果也增强，因此，使用本发明所述的Fc区的激动性抗体可用于癌症的治疗或预防。具体地，本发明记载的Fc区变体可增强例如抗Aliases、CD120a、CD120b、淋巴毒素β受体、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、护骨蛋白、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、神经生长因子受体、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、外胚层发育异常蛋白A2受体等TNF受体家族的激动性抗体的激动活性，用于癌症的治疗或预防。另外，除上述以外，针对与FcγRIIb的相互作用为其激动活性所需的分子的激动性抗体的激动活性也增强。此外，在对通过与FcγRIIb交联而抑制细胞增殖的分子如受体酪氨酸激酶(RTK)之一的Kit具有结合活性的多肽中，包含本发明的Fc区变体，对表达该分子的细胞的抑制作用可增强。癌症包括但不仅限于：肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺扁平上皮癌)、大肠癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、间皮瘤、扁平上皮癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌、鼻咽癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、皮肤癌、基底细胞瘤、恶性黑素瘤、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、急性髓性白血病(包括急性髓细胞白血病、急性成粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病和急性单核细胞白血病)、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病浆细胞瘤、周边T细胞淋巴瘤和成人T细胞白血病/淋巴瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、脑肿瘤(包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、脑膜瘤和室管膜瘤)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、血管肉瘤、血管外皮细胞瘤。

本发明还涉及免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法，该方法包括将本发明的含有Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的含有Fc区变体的多肽给予对象(患者)的步骤。

本发明还提供用于本发明的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒至少含有本发明的含有Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的含有Fc区变体的多肽、或者本发明的药物组合物。除此之外，该试剂盒中还可包装有药学上可接受的载体、介质、记载使用方法的说明书等。另外，本发明涉及本发明的含有Fc区变体的多肽或由本发明的制备方法制备的含有Fc区变体的多肽在免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂的制备中的用途。另外，本发明涉及用于本发明的治疗方法或者预防方法的、本发明的含有Fc区变体的多肽或者由本发明的制备方法制备的含有Fc区变体的多肽。

本说明书中使用的氨基酸的3字母标记和单字母标记的对应关系如下。

丙氨酸：Ala：A

精氨酸：Arg：R

天冬酰胺：Asn：N

天冬氨酸：Asp：D

半胱氨酸：Cys：C

谷氨酰胺：Gln：Q

谷氨酸：Glu：E

甘氨酸：Gly：G

组氨酸：His：H

异亮氨酸：Ile：I

亮氨酸：Leu：L

赖氨酸：Lys：K

甲硫氨酸：Met：M

苯丙氨酸：Phe：F

脯氨酸：Pro：P

丝氨酸：Ser：S

苏氨酸：Thr：T

色氨酸：Trp：W

酪氨酸：Tyr：Y

缬氨酸：Val：V。

本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。

实施例

本发明通过以下实施例进一步说明，但并不限于下述实施例。

[实施例1]具有对FcgRIIb的结合增强的Fc的现有抗体的血小板凝集能力的评价

如参考例4的表16所示，对于导入人天然型IgG1的EU编号第267位的Ser置换为Glu、328位的Leu置换为Phe的改变的现有FcgRIIb增强技术(非专利文献28)，与IgG1比较对FcgRIIb的结合增强408倍、对FcgRIIaH的结合减少0.51倍，另一方面，对FcgRIIaR的结合增强522倍。如“背景技术”所述，认为即使对FcgRIIb的结合增强，对于仅表达FcgRIIa的如血小板的细胞，也仅影响对FcgRIIa的增强效果。也即，对FcgRIIaR的结合增强的现有技术具有增强血小板凝集活性、增加引起血栓症风险的危险。为了确认这一点，验证实际上在抗体对FcgRIIa的结合增强时血小板凝集活性是否增强。

应用参考例1的方法制备奥马珠单抗_VH-G1d(序列编号：25) 作为与IgE结合的人IgG1抗体的重链、奥马珠单抗_VL-CK(序列编号：26)作为其轻链。另外，对于奥马珠单抗_VH-G1d，为了增强与人FcγRIIb的结合活性，将EU编号表示的267位的Ser置换为Glu、328位的Leu置换为Phe制备奥马珠单抗_VH-G1d-v3。应用参考例1的方法制备包含奥马珠单抗_VH-G1d-v3作为重链、包含奥马珠单抗_VL-CK作为轻链的奥马珠单抗-G1d-v3。使用该抗体，实施血小板凝集能力的评价。

血小板凝集应用血小板凝集能力测定装置HEMA TRACER 712 (LMS Co.)进行测定。首先，将约50 mL全血以固定量收集到含0.5 mL的3.8%柠檬酸钠的4.5 mL真空采血管中。将血液在200 g离心分离15分钟，回收上清作为富含血小板的血浆(PRP)。将得到的PRP用缓冲液1(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO₃、0.42 mM NaH₂PO₄、2 mM MgCl₂、5 mMHEPES、5.55 mM 右旋糖(dextrose)、1.5 U/mL腺苷三磷酸双磷酸酶、0.35 % BSA)洗涤后，进一步地置换为缓冲液2(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、12 mM NaHCO₃、0.42 mM NaH₂PO₄、2 mMMgCl₂、5 mM HEPES、5.55 mM 右旋糖、2 mM CaCl₂、0.35 % BSA)，调整为每1 μL约300,000个洗涤的血小板。在血小板凝集能力测定装置中设置包含搅棒的测定用比色皿(cuvette)，向其中分注156 μL洗涤血小板。在机器内比色皿保持在37.0℃，搅棒以1000 rpm搅拌血小板。向其中加入摩尔比1:1的奥马珠单抗-G1d-v3和IgE的免疫复合物(终浓度分别制备为600 μg/mL以及686 μg/mL)44 μL，使其反应5分钟。进一步地，加入不引起2次凝集的浓度的二磷酸腺苷(ADP、SIGMA)，确认到凝集增强。

通过该测定得到的FcγRIIa基因多态性(H/H或者R/H)的每个供体的结果显示于图1、图2。根据图1的结果，对于FcγRIIa的多态性(R/H)，添加免疫复合物时显示血小板凝集增强。另一方面，根据图2所示，对于FcγRIIa多态性(H/H)，血小板凝集不增强。

随后使用活化标记物评价血小板活化。血小板活化可根据如CD62p(p-选择蛋白)或活性型整联蛋白的活化标记物在血小板膜表面上的表达增加来测定。向按照上述方法调整的7.7μL洗涤血小板中加入2.3μL免疫复合物，在室温反应5分钟后，进一步地添加ADP使其终浓度为30μM而引起活化，确认免疫复合物是否增强ADP依赖的活化。阴性对照应用添加磷酸缓冲液(pH7.4、Gibco)替代免疫复合物的样品。反应后各样品用PE标记抗CD62抗体(BECTON DICKINSON)、PerCP标记抗CD61抗体、FITC标记PAC-1抗体(BD bioscience)染色，用流式细胞仪(FACS CantoII、BD bioscience)测定各荧光强度。

通过该测定法得到的CD62p表达的结果示于图3，活化整联蛋白表达的结果示于图4。洗涤血小板使用从FcγRIIa的多态性为R/H的1名健康人得到的血小板。通过ADP刺激在血小板膜表面表达诱导的CD62p以及活性型整联蛋白在免疫复合物存在下均增强。

根据这些结果明显的是，在具有IgG1的Fc中EU编号表示的267位的Ser置换为Glu、328位的Leu置换为Phe而成的Fc的、具有对人FcγRIIb的结合增强的Fc的现有抗体中，FcγRIIa的基因多态性中131位的氨基酸是R时，与131位的氨基酸是H时相比血小板凝集活性增强。也即，具有对人FcγRIIb的结合增强的Fc的现有抗体暗示了在具有FcγRIIa R型的人中增加血小板凝集引起的血栓症发病的风险的危险性，明确了通过克服该问题对FcγRIIb的选择性结合增强的Fc的有用性。

[实施例2] 对FcgRIIb的结合增强的变体的制备

如实施例1所示，对FcgRIIb的结合增强时，需要尽可能地抑制对其它活性型FcgR的结合、同时增强对FcgRIIb的结合。因此，组合具有对FcgRIIb的结合增强、或选择性增强效果的改变，进一步地研究对FcgRIIb的结合或选择性增强的变体的制备。具体地，以对FcgRIIb的结合增强、选择性增加两者均显示优异效果的P238D改变为基础，将参考例6、参考例8、参考例9中与P238D组合发现有效的改变彼此进一步组合。

作为抗体H链可变区，制备WO2009/125825公开的人白介素6受体的抗体的可变区即IL6R-H的可变区(序列编号：18)，作为抗体H链恒定区，制备具有除去人IgG1的C末端的Gly和Lys而成的G1d的IL6R-G1d(序列编号：19)。进一步地，制备在IL6R-G1d中导入K439E而成的IL6R-B3(序列编号：23)。根据IL6R-B3制备变体，其中组合了参考例6、参考例8、参考例9中与P238D组合发现有效的改变E233D、L234Y、G237D、S267Q、H268D、P271G、Y296D、K326D、K326A、A330R、A330K。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达、纯化抗体，按照参考例2的方法评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。

各变体对各FcgR的KD示于表1。另外，表中的改变表示IL6R-B3(序列编号：23)中导入的改变。但是，制备各变体时作为模板的L6R-B3/IL6R-L用*表示。表中的“KD(IIaR)/KD(IIb)”表示各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD得到的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值得到的值。另外，“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值得到的值。另外，表1中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表1]

对于具有人天然型IgG1的序列的IL6R-G1d/IL6R-L，在向其中导入K439E的IL6R-B3/IL6R-L对各FcgR的结合设为1时，IL6R-G1d/IL6R-L对FcgRIa的结合是1.3倍、对FcgRIIaR的结合是1.1倍、对FcgRIIaH的结合是1.1倍、对FcgRIIb的结合是1.2倍、对FcgRIIIaV的结合是0.9倍，所有这些与FcgR的结合都与IL6R-G1d/IL6R-L同等。因此认为，将各变体的结合与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L比较、与将各变体与具有人天然型IgG1的序列的IL6R-G1d/IL6R-L比较是同等的。因此在下列实施例中，将各变体的结合活性与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L相比较。

表1示出，所有变体与改变导入前的IL6R-B3比较对FcgRIIb的亲和性都增加，最低的IL6R-BF648/IL6R-L是2.6倍、最高的IL6R-BP230/IL6R-L是147.6倍。另外，对于显示选择性的KD(IIaR)/KD(IIb)的值，最低的IL6R-BP234/IL6R-L是10.0、最高的IL6R-BP231/IL6R-L是32.2，与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L的0.3比较，所有变体的选择性都增加。另外，所有变体对FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV的结合与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L相比都低。

[实施例3]对FcγRIIb的结合增强的Fc与FcγRIIb细胞外区的复合物及其与FcγRIIaR型细胞外区的复合物的X线晶体结构分析

实施例2中对FcgRIIb的结合增强最大的变体IL6R-BP230/IL6R-L与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合增强约150倍，对FcgRIIaR型的结合也抑制1.9倍左右。因此，IL6R-BP230/IL6R-L是对FcgRIIb的结合和选择性都优异的变体，为了制备更优异的变体，优选尽可能地抑制对FcgRIIaR的结合，同时能够进一步增强对FcgRIIb的结合。

如参考例7的图28中所示，包含P238D改变的Fc中，CH2结构域B的EU编号第270位的Asp与FcγRIIb的131位Arg之间形成强的静电相互作用，该第131位的残基在FcγRIIIa和FcγRIIaH型中是His，与之相比，在FcγRIIaR型中与FcγRIIb相同，为Arg，结果，该部分的相互作用没有差异，这是难以得到对FcγRIIaR型的选择性的原因。

另一方面，FcγRIIa与FcγRIIb的细胞外区的氨基酸序列的93%是一致的，具有非常高的同源性。分析天然型IgG1的Fc (下文称为Fc (WT))与FcγRIIaR型的细胞外区的复合物的晶体结构(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)，在两者相互作用界面附近仅发现FcγRIIaR型与FcγRIIb之间有3个氨基酸(Gln127, Leu132, Phe160)的差异，预期改善对FcγRIIaR型的选择性是相当困难的。

因此认为，为了进一步增强对FcγRIIb的结合活性和增加选择性，需要不仅获得对FcγRIIb的结合增强的Fc与FcγRIIb细胞外区的复合物的立体结构、而且同时获得与认为选择性改善最困难的FcγRIIaR型细胞外区的复合物的立体结构，在立体结构上阐明受体差异引起的相互作用的微妙差异，详细研究导入的氨基酸突变。因此，以Fc(P208)为对象进行与FcγRIIb细胞外区、以及FcγRIIaR型细胞外区的复合物的X线晶体结构分析，所述Fc(P208)为，从在IL6R-BP230/IL6R-L制备中作为基础的变体IL6R-BP208/IL6R-L(参考例9中制备)的Fc中除去K439E改变而成。

3-1. Fc(P208)与FcγRIIb细胞外区的复合物的X线晶体结构分析

结构分析的结果是，在分辨率2.81Å确定Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的立体结构，其分析结果获得的结构在图5示出。2个Fc CH2结构域间夹入FcγRIIb细胞外区而结合，与迄今分析的天然型IgG的Fc即Fc(WT)与FcγRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011, 108, 12669-126674)、FcγRIIIb(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem.2011, 276, 16469-16477)、FcγRIIa各细胞外区的复合物的立体结构类似。

但是，详细查看发现，由于G237D以及P238D突变的导入的影响，Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物与Fc(WT)/FcγRIIaR型细胞外区复合物比较，从Fc CH2结构域A的铰链区延续的EU编号第233位至239位的环结构产生变化(图6)。结果是，Fc(P208) 的EU编号第237位Asp的主链与FcγRIIb的160位Tyr侧链间观察到强的氢键的形成(图7)。该Tyr160在FcγRIIa中对于H型、R型都是Phe，氢键的形成是不可能的，因此，认为本氢键对于选择性的获得具有重要贡献，所述选择性指对FcγRIIb的结合活性的增加以及对FcγRIIa的结合活性的降低。

另一方面，Fc(P208)的EU编号第237位的Asp的侧链本身与FcγRIIb之间不形成显著的相互作用，也未观察到与Fc内部残基的相互作用。在该EU编号第237位的Asp周围，Fc内EU编号第332位的Ile、EU编号第333位的Glu、EU编号第334位的Lys在附近定位(图8)。认为如果将这些部位置换为亲水性残基而与EU编号第237位的Asp侧链形成相互作用能够使本环结构稳定化，可引起与FcγRIIb的160位的Tyr的氢键形成相伴的熵能量损失降低，可引起结合自由能增加、即结合活性的增加。

将参考例7示出的具有P238D改变的Fc(P238D)与FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构以及Fc(P208)与FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构比较，Fc(P208)与Fc(P238D)比较含有5个新突变，它们大多限于侧链水平的变化。但是，将Fc的CH2结构域B中EU编号第271位Pro改变为Gly，观察到在主链水平的位置变化，同时，上游的EU编号第266-270的环发生结构变化(图9)。如参考例8中所示，Fc(P238D)中EU编号第270位的Asp与FcγRIIb的131位Arg形成强的静电相互作用时，暗示该EU编号第271位Pro部分可受到立体化学应力。此次通过EU编号第271位的Gly导入观察到的结构变化考虑为改变前的Pro部分堆积的结构变形解除的结果，认为该解除部分引起与FcγRIIb的结合自由能的改善，即结合活性的增加。

进一步地，确认到该EU编号第266-271位的环结构变化引起的、EU编号第292位的Arg采取两种形式发生结构变化。此时，该EU编号第292位的Arg与Fc(P208)处其它改变残基之一的EU编号第268位的Asp形成静电相互作用(图9)，认为这可能促成本环结构的稳定化。本环中EU编号第270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg之间形成的静电相互作用大大促成与FcγRIIb的结合活性，因此，H268D改变的导入可通过使本环结构与FcγRIIb结合时的构象稳定化而引起结合所伴随的熵能量损失降低、结合自由能增加也即结合活性增加。

另外，基于本结构分析结果，详细研究了旨在进一步增加活性的改变的可能性，发现改变导入部位的候选者之一的EU编号第239位的Ser。如图10所示，该CH2结构域B的EU编号第239位的Ser定位于FcγRIIb的117位的Lys以结构上看来最天然的方式延伸的方向中。但是，此分析中FcγRIIb的117位的Lys的电子密度未确认，本Lys残基没有形成固定结构，因此，认为目前该Lys残基在与Fc (P208)的相互作用中的涉及是有限的，但该CH2结构域B的EU编号第239位的Ser改变为具有负电荷的Asp或者Glu时，可预期与带正电荷的FcγRIIb的117位的Lys之间的静电相互作用，该结果是，预期对FcγRIIb的结合活性增加。

另一方面，观察CH2结构域A中EU编号第239位Ser的结构，认为本氨基酸侧链与EU编号第236位的Gly的主链形成氢键，使得从铰链区延续且包含与FcγRIIb Tyr160侧链形成氢键的EU编号第237位Asp的233位至239位处的环结构稳定化(图7)。将本环结构稳定于结合时的构象可引起结合所伴随的熵能量损失降低、结果结合自由能增加也即结合活性增加。另一方面，该CH2结构域A的EU编号第239位改变为Asp或者Glu时，与EU编号第239位Gly主链的氢键丢失，可引起与紧密接近地存在的EU编号第265位Asp的静电排斥，认为可引起大的环结构的不稳定化。该不稳定化部分的能量使得与FcγRIIb的结合自由能减少，因此结果是，可引起结合活性降低。

［Fc(P208)的表达纯化］

Fc(P208)的制备如下进行。首先，使IL6R-BP208(序列编号：24)的EU编号第439位的Glu改变为天然型人IgG1的序列的Lys，制备IL6R-P208。随后，将EU编号第220位的Cys置换为Ser，将通过PCR克隆EU编号第216位的Glu至其C末端得到的基因序列Fc(P208)按照参考例1记载的方法进行表达载体的制备、表达、纯化。另外，EU编号第220位的Cys在通常的IgG1中与L链的Cys形成二硫键，但在制备仅Fc时，由于L链不共表达，将该残基置换为Ser以便避免不必要的二硫键形成。

［FcγRIIb细胞外区的表达纯化］

按照参考例2的方法制备。

［Fc(P208) FcγRIIb细胞外区复合物的纯化］

向对于结晶化得到的FcγRIIb细胞外区样品 1.5mg中，加入0.15mg作为与谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白的通过大肠杆菌表达纯化的Endo F1(Protein Science 1996, 5,2617-2622)，在0.1M Bis-Tris pH6.5缓冲液条件下，在室温静置3日，切断N型糖链留下与Asn直接结合的N-乙酰葡萄糖胺。随后，将实施了该糖链切断处理的FcγRIIb细胞外区样品通过5000MWCO的超滤膜浓缩，用20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)进行纯化。向进一步得到的糖链切断FcγRIIb细胞外区级分加入Fc(P208)，使得FcγRIIb细胞外区的摩尔比轻微过量，通过10000MWCO的超滤膜浓缩后，用25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)纯化，得到Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的样品。

［Fc(P208)/FcγRIIb复合物细胞外区复合物的结晶化］

将Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的样品通过10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，应用悬滴气相扩散法结合种晶法进行结晶化。结晶化中应用VDXm板(HamptonResearch)，对0.1M Bis-Tris pH6.5、19%(w/v) PEG3350, 0.2M磷酸氢二钾的储存溶液，制备以储存溶液：结晶化样品=0.85μl：0.85μl混合的结晶滴，将同样条件下得到的相同复合物的晶体用Seed Bead(Hampton Research)压碎制备种晶溶液，将由种晶溶液制备的0.15μl稀释液加入结晶滴，在放入储存液的孔中密闭，在20℃静置，成功得到板状晶体。

［来自Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物晶体的Ｘ线衍射数据的测定］

将得到的Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的单晶之一浸入0.1M Bis-TrispH6.5, 24%(w/v) PEG3350, 0.2M磷酸氢二钾, 20%(v/v) 乙二醇溶液后，用附有微小尼龙环的针将其从溶液中钓出，在液氮中冷冻，通过Spring-8的BL32XU测定X线衍射数据。另外，测定中恒定置于-178℃的氮气流中保持冷冻状态，通过附有束线的CCD检测器MX-225HE(RAYONIX)，将晶体以0.6°边旋转，边收集共300幅X线衍射图。在从得到的衍射图确定晶胞参数、衍射点的指标化、以及衍射数据处理中，应用程序Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132)以及Scala(Acta Cryst.2006, D62, 72-82)，最终得到直至分辨率2.81Å的衍射强度数据。本晶体属于空间群C222₁，晶胞参数a＝156.69Å、b＝260.17Å、c＝56.85Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

［Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构分析］

结构确定应用程序Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)通过分子置换法进行。根据得到的晶格的大小与Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的分子量，预期非对称单位中的复合物的数目是一个。从Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物的晶体结构PDB编码:3SGJ的结构坐标，作为单独的坐标取出A链239-340位以及B链239-340位的氨基酸残基部分，各自作为Fc的CH2结构域的研究用模型。从相同的PDB编码:3SGJ的结构坐标，取出A链341-444位与B链341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标，作为Fc CH3结构域的研究用模型。最后从FcγRIIb细胞外区的晶体结构PDB编码:2FCB的结构坐标取出A链6-178位的氨基酸残基部分用作Fc(P208)的研究用模型。通过旋转函数和位移函数(rotation functionand translation function)确定Fc CH3结构域、FcγRIIb细胞外区、Fc CH2结构域的各研究用模型的晶格内的取向和位置，但没有确定CH2结构域中的一个的位置。随后，对基于从剩余3个部分计算的位相计算的电子密度图，参考Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物的晶体结构确定最后的CH2结构域的位置，得到Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物晶体结构的初期模型。对得到的初期模型进行移动2个Fc的CH2结构域、2个Fc的CH3结构域以及FcγRIIb细胞外区的刚体修正(refinement)，此时对于25-3.0Å的衍射强度数据，结晶学可信度因子R值是42.6%，Free R值是43.7%。进一步地，应用程序REFMAC5(Acta Cryst. 2011,D67, 355-367)进行结构修正，应用程序Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)进行模型修正以观察电子密度图，其系数为根据实验确定的结构因子Fo与从模型计算的结构因子Fc以及从模型计算的位相算出的2Fo-Fc、Fo-Fc，重复这些步骤进行模型的修正。最后，基于利用2Fo-Fc、Fo-Fc作为系数的电子密度图将水分子掺入模型进行修正，最终应用分辨率25-2.81Å的27259个衍射强度数据，对包含4786个非氢原子的模型，结晶学可信度因子R值是24.5%，Free R值是28.2%。

3-2. Fc(P208)与FcγRIIaR型细胞外区的复合物的X线晶体结构分析

结构分析的结果是，Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的晶体结构在分辨率2.87Å下确定。Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的晶体结构与实施例3-1中所示Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构比较，反映了两受体的非常高的氨基酸同源性，对全体结构几乎未观察到差异(图11)。但是，在电子密度水平详细观察结构时，发现可用于改善选择性的差异。在FcγRIIaR型中，160位的残基不是Tyr而是Phe，如图12中所示，该Phe与包含P238D改变的Fc与FcgRIIb结合时存在的Fc CH2结构域A的EU编号第237位的氨基酸残基主链之间无法形成氢键。认为这是P238D改变的导入引起的对FcγRIIaR型的选择性改善的主要原因，但进一步在电子密度水平下比较显示，在与FcγRIIb的复合物中，可确认Fc CH2结构域A中EU编号第235位的Leu与EU编号第234位的Leu的侧链的电子密度，与之相对，与FcγRIIaR型的复合物中这些侧链的电子密度不明确，认为EU编号第237位周围的环伴随其附近与FcgRIIaR型的相互作用的降低而波动。另一方面，比较CH2结构域B中相同区域的结构时(图13)，能够确认与FcγRIIb的复合物结构中直至EU编号第237位的Asp的电子密度，与之相对，可确认与FcγRIIaR型的复合物中直至EU编号第237位的Asp上游的3个残基左右的电子密度，与FcgRIIb结合时比较，认为应用更宽的区域形成相互作用。以上暗示，Fc(P208)的EU编号第234位至238位的区域中，与FcγRIIb结合时CH2结构域A侧的贡献可比与FcγRIIaR结合时CH2结构域B侧的贡献大。

［FcγRIIaR型细胞外区的表达纯化］

按照参考例2的方法制备。

［Fc (P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的纯化］

向纯化的FcγRIIa R型细胞外区样品 1.5mg中，加入0.15mg作为与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白的通过大肠杆菌表达纯化的Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)、与20μl的5U/ml Endo F2(QA-bio)以及20μl的5U/ml Endo F3(QA-bio)，在0.1M乙酸钠 pH4.5的缓冲液条件下，于室温静置9日后，进一步地，追加0.07 mg作为与谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白的通过大肠杆菌表达纯化的Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622)、与7.5μl的5U/ml Endo F2(QA-bio)以及7.5μl的5U/ml Endo F3(QA-bio)，进一步地静置3日，切断N型糖链使得与Asn直接结合的N-乙酰葡萄糖胺残留。随后，将该进行了糖链切断处理的FcγRIIaR型细胞外区样品通过10000MWCO的超滤膜浓缩，通过用25mM HEPESpH7, 0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)纯化。进一步地，向得到的糖链切断FcγRIIaR型细胞外区级分加入Fc (P208)，使得FcγRIIaR型细胞外区的摩尔比轻微过量，通过10000MWCO的超滤膜浓缩后，通过用25mM HEPES pH7, 0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)纯化，得到Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的样品。

［Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的结晶化］

将Fc(P208)/FcγRIIa R型细胞外区复合物的样品通过10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，应用坐滴气相扩散法结晶化。对于0.1M Bis-Tris pH7.5、26%(w/v)PEG3350, 0.2M 硫酸铵的储存溶液，制备储存溶液：结晶化样品＝0.8μl：1.0μl混合而成的结晶滴，密封密闭，在20℃静置，成功得到板状晶体。

［来自Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物晶体的Ｘ线衍射数据的测定］

将得到的Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的单晶之一浸入0.1M Bis-TrispH7.5, 27.5%(w/v) PEG3350, 0.2M 硫酸铵, 20%(v/v)甘油溶液后，用附有微小尼龙环的针将其从溶液中钓出，在液氮中冷冻，通过高能加速器研究机构的放射光设备PhotonFactory BL-17A测定X线衍射数据。另外，测定中恒定置于-178℃的氮气流中保持冷冻状态，通过附有束线的CCD检测器Quantum 315r (ADSC) ，将晶体以0.6°边旋转，边收集共225幅X线衍射图。在从得到的衍射图确定晶胞参数、衍射点的指标化、以及衍射数据处理中，应用程序Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190)、XDS Package(Acta Cryst. 2010,D66, 125-132)以及Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)，最终得到直至分辨率2.87Å的衍射强度数据。本晶体属于空间群C222₁，晶胞参数ａ＝154.31Å、b＝257.61Å、ｃ＝56.19Å、α＝90°、β＝90°、γ＝90°。

［Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的X线晶体结构分析］

结构确定应用程序Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674) 通过分子置换法进行。根据得到的晶格的大小与Fc(P208)/FcγRIIaR型细胞外区复合物的分子量，预期非对称单位中的复合物的数目是一个。将实施例3-1得到的Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构作为研究用模型，通过旋转函数和位移函数确定晶格内的取向和位置，进一步地，对得到的初期模型进行移动2个Fc的CH2结构域、2个Fc的CH3结构域以及FcγRIIaR型细胞外区的刚体修正，此时对于25-3.0Å的衍射强度数据，结晶学可信度因子R值是38.4%，Free R值是38.0%。进一步地，应用程序REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)进行结构修正，应用程序Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)进行模型修正以观察电子密度图，其系数为根据实验确定的结构因子Fo与从模型计算的结构因子Fc以及从模型计算的位相算出的2Fo-Fc、Fo-Fc，重复这些步骤进行模型的修正。最后，基于利用2Fo-Fc、Fo-Fc作为系数的电子密度图将水分子掺入模型进行修正，最终应用分辨率25-2.87Å的24838个衍射强度数据，对包含4758个非氢原子的模型，结晶学可信度因子R值是26.3%、Free R值是29.8%。

[实施例4]基于晶体结构确定改变位点的Fc变体

如实施例3所示，FcgRIIb结合增强变体Fc(P208)的CH2结构域B中P271G改变导入所伴随的周围结构变化的结果是，暗示EU编号第268位Asp与EU编号第292位Arg形成静电相互作用(图9)。该相互作用形成的功能是EU编号第266-271位的环结构的稳定化，认为其结果可促成对FcγRIIb的结合增强。因此，研究通过将该EU编号第268位的Asp改变为Glu，与FcγRIIb292位的Arg的静电相互作用得到强化，使本环结构进一步地稳定化，是否使与FcgRIIb的相互作用增强。另外，如图8中所示，FcgRIIb的EU编号第160位Tyr与Fc(P208)CH2结构域A的EU编号第237位Asp的主链形成氢键，对与FcgRIIb的结合发挥重要作用。另一方面，EU编号第237位Asp的侧链部分不形成特定的相互作用，但是，分子内EU编号第332位Ile、EU编号第333位Glu、EU编号第334位Lys位于附近。验证通过将这些部位置换为亲水性残基增强与EU编号第237位Asp的相互作用、稳定化本残基附近的环结构，与FcγRIIb的160位的Tyr的相互作用是否增强。

对实施例2中制备的IL6R-BP230/IL6R-L(序列编号：27/序列编号：21)分别导入H268E、I332T、I332S、I332E、I332K、E333K、E333R、E333S、E333T、K334S、K334T、K334E制备变体。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达、纯化抗体，按照参考例2的方法，评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。

各变体对各FcgR的KD示于表2。另外，表中的改变表示对IL6R-B3(序列编号：23)导入的改变。但是，制备IL6R-BP230时作为模板的IL6R-B3/IL6R-L由*表示。表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。另外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表2中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表2]

对IL6R-BP230/IL6R-L导入H268E而成的IL6R-BP264/IL6R-L、导入E333K而成的IL6R-BP465/IL6R-L、导入E333R而成的IL6R-BP466/IL6R-L、导入E333T而成的IL6R-BP470，与IL6R-BP230/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合、选择性共同增加。另外，导入I332T而成的IL6R-BP391/IL6R-L与IL6R-BP230/IL6R-L比较对FcgRIIb的选择性降低，但是对FcgRIIb的结合增加。

[实施例5]向EU编号第271位周围导入广泛改变

比较携带P238D改变的Fc(P238D)与FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构以及Fc(P208)与FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构，观察到结构上最大变化的是EU编号第271位附近的结构(图9)。如参考例8中所示，在Fc (P238D)中，暗示EU编号第270位Asp与FcγRIIb的131位Arg形成强静电相互作用时，EU编号第271位Pro部分可受到立体化学应力。在Fc (P208)/FcγRIIb的结构中，通过导入P271G改变，引起主链水平的位置变化以去除该结构变形，其结果是，认为EU编号第271位附近的结构变化大。如果能够有效导入改变使得该变化的结构可进一步地稳定化，可导致与FcγRIIb 131位Arg形成静电相互作用所伴随的熵能量损失进一步减轻、以及结合活性增加。因此，对EU编号第271位周围导入广泛改变，搜索显示对FcgRIIb结合增强或选择性增加效果的改变。

对于导入广泛改变的模板，制备在IL6R-B3(序列编号：23)中导入了E233D、G237D、P238D、H268E、P271G的IL6R-BP267(序列编号：29)并应用。对IL6R-BP267，将EU编号第264位、265位、266位、267位、269位、272位的氨基酸分别置换为除原始氨基酸和Cys之外的18种氨基酸。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达、纯化抗体，通过参考例2的方法评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。在得到的变体中，与改变导入前的IL6R-BP267/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合增强的那些、或对FcgRIIb的选择性增加的那些总结于表3。

[表3]

各变体对各FcgR的KD示于表3。另外，表中的“IL6R-BP267中加入的改变”表示作为模板的IL6R-BP267(序列编号：29)中导入的改变。但是，制备IL6R-B3时作为亲本的IL6R-B3/IL6R-L由*表示。表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。另外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表3中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

表3中所示变体均与IL6R-B3/IL6R-L比较对FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV的结合维持或者减少。另外，对IL6R-BP267/IL6R-L分别加入S267A、V264I、E269D、S267E、V266F、S267G、V266M的变体与改变加入前L6R-BP267/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合增强。另外，对IL6R-BP267/IL6R-L分别加入S267A、S267G、E272M、E272Q、D265E、E272D、E272N、V266L、E272I、E272F的变体显示与改变加入前IL6R-BP267/IL6R-L比较KD(IIaR)/KD(IIb)的值增加、对FcgRIIb的选择性增加的效果。

[实施例6]通过向CH3区导入改变增强对FcgRIIb的结合

据报告，EU编号第396位的Pro置换为Leu的改变增强对FcgRIIb的结合(CancerRes., 2007, 67, 8882-8890)。EU编号第396位是不直接参与与FcgR相互作用的部位，但认为它通过改变抗体结构影响与FcgR的相互作用。因此，通过在EU编号第396位导入广泛改变，验证对FcgRIIb的结合或选择性是否增加。

制备对IL6R-B3(序列编号：23)导入E233D, G237D, P238D, S267A, H268E,P271G, A330R的IL6R-BP423(序列编号：33)，作为模板。对于IL6R-BP423，制备将EU编号第396位置换为原始氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸的变体。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达、纯化抗体，通过参考例2的方法，评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。得到的变体对各FcgR的结合总结于表4。

[表4]

另外，表中的“IL6R-BP423中加入的改变”表示IL6R-BP423中导入的改变，制备IL6R-BP423时作为模板的IL6R-B3/IL6R-L由*表示。表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。另外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表4中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

根据表4的结果，对IL6R-BP423/IL6R-L导入P396M的IL6R-BP456/IL6R-L、导入P396L的IL6R-BP455/IL6R-L、导入P396Y的IL6R-BP464/IL6R-L、导入P396F的IL6R-BP450/IL6R-L、导入P396D的IL6R-BP448/IL6R-L、导入P396Q的IL6R-BP458/IL6R-L、导入P396I的IL6R-BP453/IL6R-L、导入P396E的IL6R-BP449/IL6R-L、导入P396K的IL6R-BP454/IL6R-L、导入P396R的IL6R-BP459/IL6R-L均比改变导入前的IL6R-BP423/IL6R-L对FcgRIIb的结合增加。另外，根据KD(IIaR)/KD(IIb)的值，对IL6R-BP423/IL6R-L导入P396M的IL6R-BP456/IL6R-L与改变导入前的IL6R-BP423/IL6R-L比较KD(IIaR)/KD(IIb)的值大，对FcgRIIb的选择性增加。表4中制备的变体对FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV的亲和性均比亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L低。

[实施例7]利用亚类序列制备FcgRIIb增强变体

人IgG存在亚类，其与FcgR的结合曲线不同。在此验证IgG1和IgG4对各FcgR的亲和性的差异是否可用于增加对FcgRIIb的结合、增加选择性。

首先，分析IgG1和IgG4对各FcgR的亲和性。作为抗体H链，制备具有人IgG4的EU编号第228位的Ser置换为Pro、且除去C末端的Gly和Lys而成的G4d的IL6R-G4d(序列编号：30)。作为抗体L链，通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，表达纯化IL6R-G1d/IL6R-L和IL6R-G4d/IL6R-L，通过参考例2的方法，评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。得到的变体对各FcgR的结合总结于表5。

[表5]

得知IL6R-G4d/IL6R-L与IL6R-G1d/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合增强1.5倍，对FcgRIIaR的结合减少2.2倍。另外得知，IL6R-G4d/IL6R-L与IL6R-G1d/IL6R-L比较对FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV的亲和性弱。根据以上的结果，IL6R-G4d与IL6R-G1d比较对FcgRIIb的结合、选择性均优异。

图14比较G1d与G4d的CH1至C末端的序列(EU编号第118位至445位)。图14中框出的氨基酸表示G1d与G4d中不同的残基。这些不同的氨基酸中，选择几个预期牵涉与FcgR相互作用的部位，通过将对FcgRIIb的结合、选择性均优异的G4d的序列移植到FcgRIIb增强变体中，验证是否能够进一步增加结合、选择性。

具体地，制备对IL6R-BP230导入A327G的IL6R-BP473、导入A330S的IL6R-BP472、导入P331S的IL6R-BP471、导入A330S和P331S的IL6R-BP474、导入A327G和A330S的IL6R-BP475、导入A327G、A330S、P331S的IL6R-BP476、导入A327G和P331S的IL6R-BP477。另外，制备将IL6R-BP230的EU编号第118位的Ala至225位的Thr置换为G4d的序列(EU编号第118位的Ala至222位的Pro)的IL6R-BP478(序列编号31)。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达纯化抗体，按照参考例2的方法，评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。

各变体对各FcgR的KD示于表6。另外，表中的“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。“IL6R-BP230中加入的改变”表示IL6R-BP230中导入的改变，制备IL6R-BP230时作为模板的IL6R-B3/IL6R-L由*1表示，另外，IL6R-BP230的EU编号第118位的Ala至225位的Thr置换为G4d的序列(EU编号第118位的Ala至222位的Pro)的IL6R-BP478(序列编号31)由*2表示。“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表6中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表6]

在表6记载的变体中，导入A327G的IL6R-BP473/IL6R-L与IL6R-BP230/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合增强1.2倍。另外，IL6R-BP230的EU编号第118位的Ala至225位的Thr置换为G4d的序列(EU编号第118位的Ala至222位的Pro)而成的IL6R-BP478/IL6R-L与IL6R-BP230/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合、对FcgRIIaR的结合共增强1.1倍。所有变体对FcgRIa、FcgRIIaH、FcgRIIIaV的亲和性均比亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L低。

另外，如图14所示，G1d与G4d中氨基酸不同的其它部位可列举EU编号第268位、274位、296位、355位、356位、358位、409位、419位、445位。因此认为，通过将这些部位置换为IgG4来源的氨基酸，对FcgRIIb的结合和选择性可增加。

在迄今的研究中，通过对变体IL6R-BP230/IL6R-L移植作为人IgG4的序列的A327G，显示对FcγRIIb的结合活性增强。因此进一步研究IgG4与IgG1的序列中不同的部位。

具体地，作为抗体H链，制备对IL6R-BP230导入K274Q的IL6R-BP541、导入Y296F的IL6R-BP542、导入H268Q的IL6R-BP543、导入R355Q的IL6R-BP544、导入D356E的IL6R-BP545、导入L358M的IL6R-BP546、导入K409R的IL6R-BP547、导入Q419E的IL6R-BP548。抗体L链通用IL6R-L。按照参考例1的方法，纯化包含前述重链变体和IL6R-L轻链的抗体。通过参考例2的方法评价纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合。

各变体对各FcγR的KD在表7中示出。另外，表中的“亲本多肽的KD (IIb)/改变多肽的KD (IIb)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。表中的“IL6R-BP230中加入的改变”表示IL6R-BP230中导入的改变。但是，制备IL6R-BP230时作为模板的IL6R-B3/IL6R-L表示为*1。“亲本多肽的KD (IIaR)/改变多肽的KD (IIaR)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以该变体对FcγR IIaR的KD值的值。KD (IIaR)/KD (IIb)指各变体对FcγRIIaR的KD除以该变体对FcγRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcγRIIb的选择性越高。另外，表7中以灰色填充的方格判断为，FcγR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表7]

如表7所示，对IL6R-BP230/IL6R-L导入K274Q的IL6R-BP541/IL6R-L、导入R355Q的IL6R-BP544/IL6R-L、导入D356E的IL6R-BP545/IL6R-L、导入L358M的IL6R-BP546/IL6R-L与改变导入前的IL6R-BP230/IL6R-L比较对FcγRIIb的结合增强。另外，其中对IL6R-BP230/IL6R-L导入R355Q的IL6R-BP544/IL6R-L、导入D356E的IL6R-BP545/IL6R-L、导入L358M的IL6R-BP546/IL6R-L与改变导入前的IL6R-BP230/IL6R-L比较KD(IIaR)/KD(IIb)的值增加，显示为对FcγRIIb的选择性也增加的改变。

[实施例8]获得对FcgRIIb的结合增强、选择性增加的改变组合研究

对迄今为止的研究中见到的增加对FcγRIIb的结合活性或选择性的改变的组合进行研究，并尝试进一步最佳化。

在IL6R-B3中导入迄今为止的研究中获得对FcγRIIb的结合增强、和/或选择性增加的改变的组合。另外，作为比较对照，制备将现有的对FcγRIIb的结合增强的改变(Seung等(Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933))S267E和L328F改变导入IL6R-B3而成的IL6R-BP253。抗体L链应用IL6R-L。纯化按照参考例1的方法表达的含有前述重链的变体与IL6R-L的轻链的抗体。通过参考例2的方法评价纯化的抗体对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH、FcγRIIaR、FcγRIIb、FcγRIIIaV)的结合。

各变体对各FcγR的KD在表8中示出。另外，表中的改变表示在IL6R-B3中导入的改变。但是，制备各变体时作为模板的IL6R-B3/IL6R-L由*表示。亲本多肽的KD (IIb)/改变多肽的KD (IIb)指IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。另外，亲本多肽的KD (IIaR)/改变多肽的KD (IIaR)指IL6R-B3/IL6R-L对FcγR IIaR的KD值除以该变体对FcγR IIaR的KD的值。KD (IIaR)/KD (IIb)是各变体对FcγRIIaR的KD除以该变体对FcγRIIb的KD的值，该值越大，表示与FcγRIIaR比较对FcγRIIb的选择性越高。另外，KD (IIaH)/KD (IIb)是各变体对FcγRIIaH的KD除以该变体对FcγRIIb的KD的值，该值越大，表示与FcγRIIaH比较对FcγRIIb的选择性越高。另外，表8中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

KD＝C·R_max/(R_eq-RI)-C

[表8]

表8中记载的变体中，加入了增强对FcγRIIb的结合的现有改变的IL6R-BP253/IL6R-L对FcγRIIb和FcγRIIaR的结合活性与改变导入前的IL6R-B3/IL6R-L的该活性相比分别增强277倍和529倍。另外，IL6R-BP253/IL6R-L对FcγRIa的结合活性也比IL6R-B3/IL6R-L的该活性增强。另一方面，IL6R-BP253/IL6R-L对FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合与IL6R-B3/IL6R-L的该结合比较减弱。其它变体中，IL6R-BP436/IL6R-L、IL6R-BP438/IL6R-L、IL6R-BP567/IL6R-L、IL6R-BP568/IL6R-L对FcγRIa的结合与改变导入前IL6R-B3/IL6R-L的该结合比较轻微增强，但其余变体对FcγRIa的结合均减弱。另外，所有变体对FcγRIIaH和FcγRIIIaV的结合与IL6R-B3/IL6R-L的该结合比较均减弱。

本研究中制备的变体与现有对FcγRIIb的结合增强的变体IL6R-BP253/IL6R-L比较，KD(IIaH)/KD(IIb)的值最低为IL6R-BP480/IL6R-L的107.7，最高为IL6R-BP426/IL6R-L的8362，所有变体与IL6R-BP253/IL6R-L的107.1比较均高。另外，KD(IIaR)/KD(IIb)的值最低为IL6R-BP479/IL6R-L的16.1，最高为IL6R-BP567/IL6R-L的64.4，所有变体与IL6R-BP253/IL6R-L的0.2比较均高。根据这些结果显示，与加入了对FcγRIIb的结合增强改变的现有变体比较，表8中记载的变体均为对FcγRIIb的选择性增加的变体。特别地，与IL6R-B3/IL6R-L比较，IL6R-BP559/IL6R-L、IL6R-BP493/IL6R-L、IL6R-BP557/IL6R-L、IL6R-BP492/IL6R-L、IL6R-BP500/IL6R-L、IL6R-BP567/IL6R-L对FcγRIIaR的结合均维持在1.5倍以下，对FcγRIIb的结合活性增强100倍以上，因此，避免了对FcγRIIaR的结合增强引起的副作用，同时预期显示出对FcγRIIb的结合增强引起的效果。

另外，与加入了对FcγRIIb的结合增强的现有改变的IL6R-BP253/IL6R-L对FcγRIIb的结合比较，IL6R-BP489/IL6R-L、IL6R-BP487/IL6R-L、IL6R-BP499/IL6R-L、IL6R-BP498/IL6R-L、IL6R-BP503/IL6R-L、IL6R-BP488/IL6R-L、IL6R-BP490/IL6R-L、IL6R-BP445/IL6R-L、IL6R-BP552/IL6R-L、IL6R-BP507/IL6R-L、IL6R-BP536/IL6R-L、IL6R-BP534/IL6R-L、IL6R-BP491/IL6R-L、IL6R-BP553/IL6R-L、IL6R-BP532/IL6R-L、IL6R-BP506/IL6R-L、IL6R-BP511/IL6R-L、IL6R-BP502/IL6R-L、IL6R-BP531/IL6R-L、IL6R-BP510/IL6R-L、IL6R-BP535/IL6R-L、IL6R-BP497/IL6R-L、IL6R-BP533/IL6R-L、IL6R-BP555/IL6R-L、IL6R-BP554/IL6R-L、IL6R-BP436/IL6R-L、IL6R-BP423/IL6R-L、IL6R-BP440/IL6R-L、IL6R-BP538/IL6R-L、IL6R-BP429/IL6R-L、IL6R-BP438/IL6R-L、IL6R-BP565/IL6R-L、IL6R-BP540/IL6R-L、IL6R-BP426/IL6R-L、IL6R-BP437/IL6R-L、IL6R-BP439/IL6R-L、IL6R-BP551/IL6R-L、IL6R-BP494/IL6R-L、IL6R-BP537/IL6R-L、IL6R-BP550/IL6R-L、IL6R-BP556/IL6R-L、IL6R-BP539/IL6R-L、IL6R-BP558/IL6R-L、IL6R-BP425/IL6R-L、IL6R-BP495/IL6R-L对FcγRIIb的结合升高，以IL6R-B3/IL6R-L的结合为1时，最低的IL6R-BP495/IL6R-L至最高的IL6R-BP489/IL6R-L的增幅是321倍至3100倍。因此这些变体可称为在对FcγRIIb的结合、选择性两方面均比现有技术优异的变体。

此处，对于从对FcγRIIb的选择性而言考虑为最优异的IL6R-BP567/IL6R-L所关联的变体，从免疫原性进行考察。将Y296D改变导入选择性最高的IL6R-BP567/IL6R-L、和对FcγRIIaR的结合与天然型比较完全相等且对FcγRIIb的结合增强147倍的IL6R-BP493/IL6R-L。据报告，Y296包含在Tregitope序列中(De Groot等(Blood (2008) 112, 3303-3311))，向这些部位导入改变可导致天然型IgG1本来具有的免疫抑制功能损失。因此，从免疫原性的观点，不包含Y296D改变的变体更优选。IL6R-BP568/IL6R-L和IL6R-BP492/IL6R-L是分别从IL6R-BP567/IL6R-L和IL6R-BP493/IL6R-L去除Y296D改变产生的。从对FcγRIIb的结合活性和选择性看来，IL6R-BP492/IL6R-L和IL6R-BP568/IL6R-L通过去除Y296D改变，选择性、结合活性均比包含Y296D时降低。但是，与天然型比较，IL6R-BP568/IL6R-L对FcγRIIaR的结合是1.6倍，对FcγRIIb的结合是211倍，另外，IL6R-BP492/IL6R-L对FcγRIIaR的结合是1.2倍，对FcγRIIb的结合是131倍，仍然保持高选择性和结合活性。根据这些结果，IL6R-BP568/IL6R-L 和IL6R-BP492/IL6R-L，可称为除对FcγRIIb的结合活性、选择性而外在免疫原性方面也优异的变体。

[实施例9]异源二聚化抗体对FcgRIIb的结合增强

9-1. P238D仅导入一条链的研究

如参考例7的图26所示，Fc(P238D)获得对FcgRIIb的高结合的主要原因是，通过导入P238D改变，对于Pro与周边残基形成疏水性核心的区域，由于变化为Asp而无法再存在于疏水性核心中并向指向溶剂侧，结果导致结构域A的环结构大大变化。但是，是否需要对两条链导入P238D改变，另外，是否可对一条链导入P238D、对另一条链导入其它改变，仍然存在研究余地。因此，利用在抗体各H链中导入了不同改变的异源二聚化抗体对这几点进行验证。

作为抗体H链，应用包含WO2009/041062中公开的血浆动力学改善的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体GpH7的CDR的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的可变区(序列编号：15)。应用在可变区中具有GpH7的IgG1的C末端除去Gly和Lys而成的GpH7-G1d(序列编号：34)中导入D356K和H435R改变的GpH7-A5(序列编号：35)、在GpH7-G1d中导入K439E改变的GpH7-B3(序列编号：17)。各H链中导入的D356K和K439E改变是为了在由2个H链形成的异源二聚化抗体产生时有效形成各H链异源体而导入的(WO2006/106905)。H435R是妨碍与蛋白A结合的改变，是为了有效分离异源体即由导入不同改变的二个H链组成的二聚体与同源体即由导入相同改变的二个H链组成的二聚体而导入的。另一方面，作为H链，应用在参考例1制备的GpH7-B3(序列编号：17)中将EU编号第236位、237位、238位的氨基酸置换为原始氨基酸和Cys的变体。另外，作为另一链，制备在GpH7-A5(序列编号：35)中导入P238D的GpH7-AP001。作为抗体L链，通用WO2009/041062公开的血浆动力学改善的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的GpL16-k0(序列编号：16)。这些变体通过参考例1的方法表达纯化，通过参考例2的方法评价对各FcgRIIaR型、FcgRIIb的结合。各变体对FcgR的结合量示于图15。

图15中所示改变G237W、G237F、G236N、P238G、P238N、P238E、P238D指在GpH7-B3中导入的改变。另外，A5/B3表示在两条链中都不导入改变的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0，仅在一条链中包含P238D的变体指GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0。另外，这些结果在表9中示出。

[表9]

表9中“对FcgRIIb的结合量/对FcgRIIaR的结合量”指各变体对FcgRIIb的结合量除以各变体对FcgRIIaR的结合量的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，“GpH7-A5中导入的改变”和“GpH7-B3中导入的改变”分别表示在GpH7-A5和GpH7-B3中导入的改变，制备GpH7-A5和GpH7-B3时作为模板的GpH7-G1d由*表示。根据表9的结果，两条链中具有P238D改变的GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0对FcgRIIb的选择性最高。另外，另一链中具有P238E、P238N、P238G的GpH7-AP001/GpH7-BP061/GpL16-k0、GpH7-AP001/GpH7-BP069/GpL16-k0、GpH7-AP001/GpH7-BP063/GpL16-k0对FcgRIIb的结合量/对FcgRIIaR的结合量分别是2.9、2.2、1.7，即使与两条链中具有P238D改变的GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0比较，也维持对FcgRIIb的高选择性。另外，对FcgRIIb的亲和性保持为在两条链中具有P238D改变的GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0的69%以上，因此，可以说，如果一条链中存在P238D改变，另一条链可具有P238E、P238N、P238G替换。另外，旨在对FcgRIIb的结合，清楚的是，与两条链中包含P238D的GpH7-AP001/GpH7-BF648/GpL16-k0比较，仅一条链包含P238D、另一条链不包含改变的GpH7-A5/GpH7-BF648/GpL16-k0对FcgRIIb的结合强，一条链中包含P238D、另一条链分别包含G236N、G237F、G237W的GpH7-AP001/GpH7-BP032/GpL16-k0、GpH7-AP001/GpH7-BP044/GpL16-k0、GpH7-AP001/GpH7-BP057/GpL16-k0与FcgRIIb的结合更强。

9-2. 基于Fc(P208)/FcgRIIb的结构信息验证改变

如图10中所示，对Fc(P208)/FcgRIIb的晶体结构，未观察FcgRIIb的117位Lys的电子密度，认为该残基不较大牵涉与Fc(P208)的结合，通过将位于附近的CH2结构域B的EU编号第239位Ser置换为Asp或Glu，可与该FcgRIIb的117位Lys之间形成静电相互作用。另一方面，如图7中所示，CH2结构域A中，EU编号第239位Ser与EU编号第236位Gly形成氢键，认为稳定化EU编号第233位至239位的环结构促成FcgRIIb与EU编号第160位Tyr的结合强化，预期该部位的置换引起CH2结构域A中环结构的不稳定化及伴随的结合活性降低，预期在同源改变中这些效果彼此消除。因此在本研究中，通过异源二聚化仅在一条链中导入S239D或S239E改变，验证对FcgRIIb的结合增强效果。

作为一条抗体H链，制备IL6R-BP208(序列编号：24)中导入S239D的IL6R-BP256和导入S239E的IL6R-BP257。同样，制备IL6R-BP230(序列编号：27)中导入S239D的IL6R-BP259和导入S239E的IL6R-BP260。作为另一条抗体H链，应用IL6R-A5(序列编号：69)中导入与IL6R-BP208的CH2中包含的那些相同的改变即E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R而成的IL6R-AP002，和与IL6R-BP230的CH22中包含的那些相同的改变即E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、Y296D、A330R而成的IL6R-AP009。另外，作为比较对象，制备在现有FcgRIIb增强技术(非专利文献28)中将S267E、L328F导入IL6R-B3而成的IL6R-BP253(序列编号：32)。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。按照参考例1的方法，从这些变体表达纯化抗体，通过参考例2的方法，评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。

各变体对各FcgR的KD示于表10。表中的“亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。另外，“亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)”指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。“KD(IIaR)/KD(IIb)”是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表10中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表10]

根据表10的结果，对IL6R-BP208/IL6R-L的一条链导入S239D的IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、导入S239E的IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L与IL6R-BP208/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合均增强。另外，KD(IIaR)/KD(IIb)的值也比IL6R-BP256/IL6R-L升高，对FcgRIIb的选择性也增加。另一方面，对IL6R-BP208/IL6R-L的两条链导入S239D的IL6R-BP256/IL6R-L和在两条链中导入S239E的IL6R-BP257/IL6R-L对FcgRIIb的结合、选择性都比IL6R-BP208/IL6R-L大幅降低。如此地，对于与仅在一条链中导入S239D或S239E时见到对FcgRIIb的结合增强效果相比、在两条链中导入时对FcgRIIb的结合大幅降低的理由，如前述，认为CH2结构域A中环结构的不稳定化是主要原因。以IL6R-BP230/IL6R-L为模板导入S239D、S239E时见到同样的结果。IL6R-BP230/IL6R-L的一条链中分别导入S239D、S239E而成的IL6R-AP009/IL6R-BP259/IL6R-L、IL6R-AP009/IL6R-BP260/IL6R-L对FcgRIIb的结合、选择性均比IL6R-BP230/IL6R-L升高，在两条链中分别导入S239D、S239E而成的IL6R-BP259/IL6R-L、IL6R-BP260/IL6R-L中的任一对FcgRIIb的结合、选择性均比IL6R-BP230/IL6R-L大幅降低。另外，与利用现有FcgRIIb增强技术的IL6R-BP253/IL6R-L比较，IL6R-BP208/IL6R-L和IL6R-BP230/IL6R-L的一条链中导入S239D或S239E的变体均对FcgRIIb的结合、选择性都升高。

9-3. 基于Fc(P208)/FcgRIIaR的结构信息验证改变

比较实施例3中Fc(P208)与FcgRIIb的晶体结构以及与FcgRIIaR的晶体结构，发现与FcgRIIb 160位Tyr形成氢键的EU编号第237位附近的电子密度存在差异，暗示在与FcgRIIb的结合中CH2结构域A侧的贡献大，在与FcgRIIaR的结合中CH2结构域B侧的贡献大(图12、图13)。例如，从电位密度看，在与FcgRIIaR型的结合中，认为CH2结构域B的EU编号第234位Leu、235位Leu参与与受体的结合，另一方面，认为在与FcgRIIb的结合中这些残基的参与少。随后，通过将这2个残基置换为疏水性残基以外的残基，认为可更大降低与FcgRIIaR型的相互作用。但是，认为在CH2结构域Ａ侧，EU编号第234位Leu、235位Leu的残基促成EU编号第237位附近环结构的稳定化，尤其是很有可能更大地牵涉与FcgRIIb的结合。因此，将这些残基置换为疏水性残基以外的残基可更加降低CH2结构域A中与FcgRIIb的相互作用。尤其是EU编号第235位Leu在与FcgRIIb的复合物结构的CH2结构域A中形成良好的疏水相互作用，由于认为它大大促成EU编号第237位附近环结构稳定化，对本残基研究仅一条链置换为疏水性残基以外的残基。另外，如果通过将两条链的EU编号第235位的Leu置换为其它疏水性氨基酸，能够更加强化尤其是CH2结构域A处的疏水性相互作用、更加稳定化EU编号第237位附近的环结构，可导致与FcgRIIb 160位Tyr的氢键形成所伴随的熵能量损失减轻、可引起对FcgRIIb的结合和选择性增加，因此也对它们一并进行研究。

作为抗体H链，制备IL6R-B3(序列编号：23)中导入E233D、G237D、P238D、H268E、P271G、Y296D、A330R而成的IL6R-BP264(序列编号：28)，将其用作模板。制备将IL6R-BP264的EU编号第234位的Leu分别置换为Asn、Ser、Asp、Gln、Glu、Thr、Arg、His、Gly、Lys、Tyr而成的变体。另外，制备将IL6R-BP264的EU编号第235位的氨基酸置换为原始氨基酸与Cys之外的18种氨基酸而成的变体。另一方面，作为抗体H链，制备IL6R-A5(序列编号：69)中导入E233D、G237D、P238D、H268E、P271G、Y296D、A330R而成的IL6R-AP029(序列编号：42)。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)，将IL6R-BP264中导入L234N, L234S, L234D, L234Q,L234E, L234T, L234R, L234H, L234G, L234K, L234Y而成的变体以及导入L235W,L235M, L235P, L235F, L235A, L235V, L235I而成的变体制备为两条链含有相同改变的同源体，将导入L235N, L235S, L235D, L235Q, L235E, L235T, L235R, L235H, L235G,L235K, L235Y而成的变体与IL6R-AP029组合制备成异源二聚化抗体，对它们进行研究。

按照参考例1的方法，从这些变体表达纯化抗体，通过参考例2的方法评价对各FcgR (FcgRIa、FcgRIIaH型、FcgRIIaR型、FcgRIIb、FcgRIIIaV型)的结合。图16示出了以各变体对FcgRIIb的KD为横轴、对FcgRIIaR的KD为纵轴的图。

如图16所示，IL6R-BP264/IL6R-L的两条链中导入L234Y而成的IL6R-BP404/IL6R-L与改变导入前的IL6R-BP264/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合轻微增强。

在这些变体中，对FcgRIIb的结合增强的IL6R-BP404/IL6R-L和对FcgRIIb的选择性增加的变体总结于表11。表中的亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgRIIb的KD值除以各变体对FcgRIIb的KD值的值。另外，亲本多肽的KD(IIaR)/改变多肽的KD(IIaR)指IL6R-B3/IL6R-L对FcgR IIaR的KD值除以各变体对FcgR IIaR的KD值的值。KD(IIaR)/KD(IIb)是各变体对FcgRIIaR的KD除以各变体对FcgRIIb的KD的值，该值越大，表示对FcgRIIb的选择性越高。另外，表11中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

[表11]

如表11中所示，IL6R-BP264/IL6R-L的两条链中导入L234Y而成的IL6R-BP404/IL6R-L与改变导入前的IL6R-BP264/IL6R-L比较对FcgRIIb的结合升高1.1倍。IL6R-BP264/IL6R-L的两条链中导入L235Q而成的IL6R-BP408/IL6R-L、两条链中导入L235F而成的IL6R-BP419/IL6R-L、一条链中导入L235D而成的IL6R-AP029/IL6R-BP407/IL6R-L、一条链中导入L235Q而成的IL6R-AP029/IL6R-BP408/IL6R-L、一条链中导入L235E而成的IL6R-AP029/IL6R-BP409/IL6R-L、一条链中导入L235T而成的IL6R-AP029/IL6R-BP410/IL6R-L的KD(IIaR)/KD(IIb)的值均比改变导入前的IL6R-BP264/IL6R-L大，是对FcgRIIb的选择性增加的变体。

[实施例10] 应用计算机芯片(in silico)免疫原性预测工具评价FcgRIIb结合增强Fc变体的免疫原性

应用本实施例记载的Fc变体作为抗体药物时，优选不诱导减弱其药理作用的抗药物抗体的产生。免疫原性高的抗体容易诱导抗药物抗体产生，因此，优选抗体药物的免疫原性尽量低。为了使变体的免疫原性尽量不增大，可利用Epibase、EpiMatrix等预测T细胞表位的计算机芯片免疫原性预测工具。Epibase Light (Lonza)是应用FASTER算法(ExpertOpin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)计算9-mer肽与包含主要DRB1等位基因的MHCII类的结合能力的计算机芯片免疫原性预测工具。本工具能够鉴定对MHC II类具有强结合的T-细胞表位(强表位)和具有中等程度结合的T-细胞表位(中等表位)。

计算中反映了DRB1同种异型的存在比，对其可使用以下表12示出的高加索人（Caucasian）的存在比。

[表12]

应用该工具，比较迄今为止报告的各种Fc变体与本实施例记载的FcgRIIb选择性结合增强的Fc变体的序列中(EU编号第118位至C末端的序列)包含的具有强结合和中等程度结合的全部T细胞表位数目。具体地，制备下列作为用于评价现有技术的比较对象：之前报告对FcgRIIIa的结合增强(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006,103:4005-10.)的导入S239D、A330L、I332E改变的抗体的Fc区，Fc (DLE) (序列编号：78)；之前报告对FcRn的结合增强(J Biol Chem. 2006, 281:23514-24.)的导入M252Y、S254T、T256E改变的抗体的Fc区，Fc (YTE) (序列编号：79)；报告对FcgRIIb的结合增强(Mol Immunol. 2008, 45:3926-33.)的导入S267E、L328F改变的抗体的Fc区，Fc (EF) (序列编号：80)；WO2012/115241中记载的据报告对FcgRIIb的结合增强的导入E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R改变的抗体的Fc区，Fc (P208)(序列编号：81)；制备与本实施例中记载的对FcgRIIb结合增强的变体BP568同样地导入E233D、P238D、S264I、S267A、H268E、P271G改变的抗体的Fc区，Fc(P587)(序列编号：70)；以及与BP492同样地导入P238D、S264I、S267A、H268E、P271G改变的抗体的Fc区，Fc(P588) (序列编号：71)，应用Epibase比较这些Fc变体的强结合和中等程度结合的全部表位数目。其结果示于表13。

[表13]

根据该结果，即使在现有Fc变体中，本实施例记载的变体的Fc区Fc(P587)和Fc(P588)也显示T细胞表位数少，免疫原性风险低。在用作药物时，该性质表示诱导抗药物抗体的可能性降低，并且是优异的。

[实施例11]应用人FcgRIIb转基因小鼠评价人FcgRIIb结合增强Fc变体的血液动力学

(11-1)试验概要

如WO2013/047752所示的，与天然型人IgG比较，通过施用在pH酸性范围条件下对人FcRn具有结合活性、具有随离子浓度条件而改变抗原结合分子对抗原的结合活性的抗原结合结构域、且包含与EU编号第297位结合的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的FcgR结合结构域相比对FcgR的结合活性高的FcgR结合结构域的抗原结合分子，可大大降低生物中的其目的可溶性抗原的血浆浓度。也报告，在生物内施用在FcgR中尤其是对FcgRIIb结合活性增强的抗原结合分子时，血浆中可溶性抗原加速消失，血浆中可溶性抗原的浓度可有效降低。本实施例中，在将人FcgRIIb通过基因修饰而导入的转基因小鼠中，通过施用对人FcgRIIb的结合增强的Fc变体，验证本说明书记载的对人FcgRIIb结合增强的Fc变体实际上是否能够加速其目的可溶性抗原的消失速度。

(11-2)对FcgRIIb的结合增强的抗体的制备

应用下列抗体作为对人FcgRIIb结合增强的Fc变体。制备在由WO2009/125825中公开的人白细胞介素6受体(人IL-6R)的抗体的可变区与除去人IgG1的C末端Gly和Lys的G1d的恒定区组成的IL6R-G1d (序列编号：19)中，导入与BP568同样的E233D、P238D、S264I、S267A、H268E、P271G改变而成的IL6R-P587。按照参考例1的方法制备Fv4-P587，其具有IL-6R-P587作为抗体H链、WO2009/125825中公开的对人IL-6R的抗体的L链IL6R-L2(序列编号：74)作为抗体L链。另外，作为比较对象，同样按照参考例1的方法制备Fv4-IgG1，其具有IL6R-G1d(序列编号：19)和IL6R-L2(序列编号：74)分别作为抗体H链、L链。如WO2009/125825记载的，此处制备的Fv4-G1d和Fv4-P587具有在酸性pH条件下比中性pH条件下对作为抗原的人IL-6R的结合弱、抗原结合分子对抗原的结合活性取决于质子离子浓度条件而变化的抗原结合结构域。

(11-3)人FcgRIIb转基因小鼠的生产

通过下列方法制备人FcgRIIb转基因小鼠。

生产在C57BL/6(B6)小鼠中导入人FcgRIIb基因的转基因小鼠。转基因小鼠的生产根据“Nagy等(Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)”和“上田等(Latest Technology for Gene Targeting", Yodosha. (2000) 190-207)”中记载的顺序实施。也即，在B6小鼠的受精卵前核中，显微注射克隆了人FcgRIIb基因(GeneBank #NW_004077999：18,307,411-18,381,603)的基因组区的大肠杆菌人工染色体(细菌人工染色体)而生产。在得到的小鼠中，应用利用与人FcgRIIb基因特异性杂交的探针的DNA印迹法和PCR，选择导入了人FcgRIIb基因的小鼠。从人FcgRIIb转基因小鼠收集血液和肝脏，应用特异性扩增人FcgRIIb基因的引物，通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)确认人FcgRIIb基因的表达。结果，检测到人FcgRIIb基因的表达。另外，从人FcgRIIb转基因小鼠的血液分离小鼠PBMC(外周血单核细胞)，通过FACS(荧光激活细胞分选)分析确认PBMC中人FcgRIIb的表达。结果，检测到人FcgRIIb的表达。通过以上方法确认，能够建立表达人FcgRIIb的人FcgRIIb转基因小鼠。

(11-4)应用人FcgRIIb转基因小鼠同时施用抗原和抗体的体内试验

应用(11-3)中生产的人FcgRIIb转基因小鼠，同时施用作为抗原的可溶型人IL-6R与(11-2)中制备的抗人IL-6R抗体，评价该施用后血浆中可溶型人IL-6R浓度和抗人IL-6R抗体浓度。

向尾静脉中以10 mL/kg单次施用可溶型人IL-6R和抗人IL-6R抗体的混合溶液(分别为5μg/mL、0.1 mg/mL)。此时，由于针对可溶型人IL-6R的抗人IL-6R抗体充分过量地存在，认为几乎所有可溶型人IL-6R与抗体结合。施用5分钟后、1小时后、4小时后、7小时后、1日后、3日后、7日后、14日后、21日后、28日后收集血液。将收集的血液直接在4℃、15,000rpm离心分离15分钟，得到血浆。将分离的血浆在设定于-20℃以下直至实施测定的冷冻室中保存。抗人IL-6R抗体使用上述Fv4-P587、Fv4-IgG1。

(11-5)通过ELISA法测定血浆中抗人IL-6R抗体浓度

通过ELISA法测定小鼠血浆中的抗人IL-6R抗体浓度。首先，将抗人IgG(γ链特异性)F(ab')2抗体断片(Sigma)分注在Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge NuncInternational)中，在4℃静置一夜，制备抗人IgG固相化平板。制备血浆中浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/mL的标准曲线样品和稀释100倍以上的小鼠血浆测定样品，在100μL的这些标准曲线样品和血浆测定样品中加入200μL的20 ng/mL可溶型人IL-6R，在室温搅拌1小时。其后，在抗人IgG固相化平板中分注，进一步地在室温搅拌1小时。其后，使生物素化抗人IL-6 R抗体(R&D)在室温反应1小时，进一步地使链霉抗生物素-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)在室温反应1小时，应用TMB One ComponentHRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories)作为底物进行显色反应，用1N硫酸(Showa Chemical)终止反应后，用酶标仪(microplate reader)测定450 nm的吸光度。应用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)从标准曲线的吸光度算出小鼠血浆中浓度。该方法测定的静脉内施用后的人FcgRIIb转基因小鼠中的血浆中抗体浓度推移在图33中示出。

(11-5)通过电化学发光法测定血浆中人IL-6R浓度

通过电化学发光法测定小鼠血浆中的人IL-6R浓度。制备血浆中浓度调整为12.5,6.25, 3.13, 1.56, 0.781, 0.391, 0.195 ng/mL的人IL-6R标准曲线样品和稀释50倍以上的小鼠血浆测定样品，混合用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)钌化的单克隆抗人IL-6R抗体(R&D)和生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)和脱珠单抗(tocilizumab)溶液，在37℃反应1夜。其后，分注到应用含有0.5%BSA(w/v)的PBS-Tween溶液在5℃封闭1夜的Streptavidin Gold Multi-ARRAY Plate(Meso Scale Discovery)中。进一步地，在室温反应2小时和洗涤后，分注Read Buffer T(×2)(Meso Scale Discovery)，立即用SECTORImager 2400 (Meso Scale Discovery)测定。基于标准曲线的应答应用分析软件SOFTmaxPRO(Molecular Devices)算出hSIL-6R浓度。该方法测定的静脉内施用后的人FcgRIIb转基因小鼠中的血浆中可溶型人IL-6R浓度推移在图34中示出。

(11-6)人FcgRIIb结合增强的效果

比较Fv4-IgG1与对人FcgRIIb的结合增强的Fv4-P587的体内试验的结果。如图33中所示，二者的抗体血浆中保留性几乎相同，但如图34所示，与同时施用Fv4-IgG1的人IL-6R比较，同时施用对人FcgRIIb的结合增强的Fv4-P587的人IL-6R确认到人IL-6R的消失加速。也即，发现通过增强人FcgRIIb结合能力，pH依赖性地与人IL-6R结合的抗体能够降低可溶型人IL-6R浓度。

不限于特定理论，根据该结果可认为，按照图35中所示机制，通过经由人FcγRIIb掺入表达FcγRIIb的细胞，与该抗体结合的血浆中的可溶型抗原消失。

结合了与可溶型人IL-6R结合的抗体的可溶型人IL-6R连同抗体通过FcRn在血浆中再循环，与之相比，pH依赖性地与可溶型人IL-6R结合的抗体Fv4-IgG1在内体内的酸性条件下解离与抗体结合的可溶型人IL-6R。由于解离的可溶型人IL-6R通过溶酶体分解，可溶型人IL-6R的消失可显著加速，pH依赖性地与可溶型人IL-6R结合的抗体Fv4-IgG1进一步地在内体内与FcRn结合，然后在血浆中再循环。由于再循环的该抗体能够再次与可溶型人IL-6R结合，对抗原(可溶型人IL-6R)的结合以及通过FcRn在血浆中的再循环被重复。结果，认为一个抗体分子能够重复多次地与可溶型人IL-6R结合。进一步地，通过增强pH依赖性地与抗原结合的Fv4-IgG1的FcgRIIb结合活性，与可溶型人IL-6R结合的抗体和可溶型人IL-6R的复合物经由FcgRIIb快速掺入细胞内，而能够更有效降低可溶型人IL-6R浓度(图35)。

[实施例12]应用人FcgRIIb和人FcRn转基因小鼠评价人FcgRIIb结合增强Fc变体的血液动力学

(12-1)试验概要

如WO2013/047752所示，应用对FcγR的结合活性比天然型IgG的Fc区的结合活性高、在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性增强的抗原结合分子，确认到与在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性不增强的抗原结合分子比较，血浆中保留性的增加。另一方面，也报告了，与对FcγR的结合活性比天然型人IgG的Fc区的结合活性高、在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性不增强的抗原结合分子相比，对FcγR的结合活性比天然型人IgG的Fc区的结合活性高、在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性增强的抗原结合分子的血浆中目的抗原浓度降低。因此，验证本实施例中记载的具有对人FcgRIIb的结合增强的Fc区变体的抗原结合分子是否具有相同的性质。

(12-2)对FcγR的结合活性比天然型人IgG的Fc区的结合活性高、在pH酸性范围条件下人FcRn结合活性增强的抗原结合分子的制备

除实施例11-2中记载的Fv4-IgG1、Fv4-P587，也按照参考例1的方法制备Fv4-P587-LS，其具有IL6R- P587-LS(序列编号：73)作为抗体H链和IL6R-L2作为抗体L链，IL6R-P587-LS通过在Fv4-P587的H链IL6R-P587中导入由下列组成的改变而制备：之前报告为改善抗体血液动力学(Nat. Biotechnol. 2010. 28; 157-159)的EU编号表示的428位的Met置换为Leu、434位的Asn置换为Ser。

(12-3)与人FcRn的相互作用的分析

用Biacore T200进行制备的抗体与人FcRn的相互作用分析，其中通过胺偶联法将蛋白L (BioVision)适量固定在以下记载的传感芯片CM4 (GE Healthcare)上，对其捕捉目的抗体。随后，注射FcRn稀释液和运行缓冲液(作为参照对照溶液)，使传感芯片上捕捉的抗体与人FcRn相互作用。运行缓冲液应用50 mmol/L磷酸钠、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v)Tween20、pH6.0，也使用运行缓冲液进行FcRn稀释。芯片再生应用10 mmol/L甘氨酸-HCl,pH1.5。测定全部在25℃实施。从测定得到的传感图谱，计算作为动力学参数的结合速率常数ka (1/Ms)、和解离速率常数 kd (1/s)，以它们的值为基础计算各抗体对人FcRn的KD(M)。各参数的计算中应用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。用该方法测定时本次制备的抗体对人FcRn的KD值在表14中示出。如表14所示，确认到与Fv4-P587比较，Fv4-P587-LS对FcRn的结合在酸性条件下增强。

[表14]

(12-4)人FcgRIIb和人FcRn转基因小鼠的生产

通过以下方法制备人FcgRIIb、人FcRn转基因小鼠、和小鼠FcRn敲除小鼠。

首先，生产小鼠FcRn敲除小鼠。敲除小鼠的生产按照“Nagy等(Manipulating themouse embryo, CSHL press. (2003) 399-506)”中记载的顺序实施。也即，制备用于破坏小鼠FcRn基因的靶向载体，将该载体导入ES细胞(C57BL/6小鼠来源)，通过同源重组破坏小鼠FcRn的基因。从建立的小鼠FcRn敲除小鼠的肝脏提取RNA，以从RNA合成的cDNA为模板，应用特异性扩增小鼠FcRn的引物进行RT-PCR。结果，小鼠FcRn敲除小鼠中，未检测到小鼠FcRn基因。随后，生产在小鼠FcRn敲除小鼠中导入人FcgRIIb和人FcRn基因的转基因小鼠。转基因小鼠的生产按照“Nagy等(Manipulating the mouse embryo, CSHL press. (2003)399-506)”和“上田等(Latest Technology for Gene Targeting, Yodosha. (2000) 190-207)”中记载的顺序实施。也即，在小鼠FcRn敲除小鼠的受精卵前核中，显微注射克隆了人FcRn基因(GeneBank #NC_000019.9：50,000,108-50,039,865)和人FcgRIIb基因(GeneBank# NW_004077999：18,307,411-18,381,603)的基因组区的大肠杆菌人工染色体(细菌人工染色体)而生产。在得到的小鼠中，通过应用与各基因特异性杂交的探针的DNA印迹法和PCR，选择导入人FcRn基因和人FcgRIIb基因、且小鼠FcRn敲除等位基因纯合的小鼠。从人FcgRIIb、人FcRn转基因小鼠、和小鼠FcRn敲除小鼠收集血液，应用特异性扩增人FcRn基因和人FcgRIIb基因的引物，用RT-PCR确认人FcRn基因和人FcgRIIb基因的表达。结果，检测到人FcRn基因和人FcgRIIb基因的表达。通过以上确认，能够建立表达人FcRn和人FcgRIIb、不表达小鼠FcRn的人FcgRIIb、人FcRn转基因小鼠、和小鼠FcRn敲除小鼠。

(12-5)pH酸性范围条件下增强人FcRn结合活性而改善药代动力学

以实施例11的方法同样地实施在人FcgRIIb和人FcRn转基因小鼠中分别施用Fv4-IgG1、Fv4-P587和Fv4-P587-LS的体内试验，测定该小鼠群的血浆中可溶型IL-6R和血浆中抗人IL-6R抗体浓度。血浆中抗人IL-6R抗体浓度和血浆中可溶型IL-6R的测定结果分别示于图36、图37。

与施用Fv4-P587的小鼠组相比，在施用了在pH酸性范围Fv4-P587与人FcRn的结合活性增强的Fv4-P587-LS的小鼠组中，确认到抗体的血浆中保留性增加。此外，Fv4-P587-LS与Fv4-IgG1相比血浆中保留性增加。另一方面，施用Fv4-P587-LS的小鼠组的血浆中可溶型IL-6R浓度与施用Fv4-P587的小鼠组的该浓度相同。施用Fv4-P587-LS或者Fv4-P587的小鼠组与施用Fv4-IgG1的小鼠组相比血浆中可溶型IL-6R浓度降低。

根据以上示出，通过施用对人FcγRIIb的结合活性比天然型人IgG的Fc区的结合活性高的、抗原结合分子在pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性增强的抗体，接受该施用的生物中施用的抗原结合分子的血浆中保留性可增加。进一步地，即使施用抗原结合分子的生物的血浆中保留性增加，该生物中抗原消失效果也不显示减弱，更不要说可维持抗原消失效果。

用于增强pH酸性范围条件下的人FcRn结合活性的改变没有特别限定，可应用IgG抗体EU编号表示的428位Met置换为Leu、434位Asn置换为Ser的方法(Nat. Biotechnol.(2010) 28, 157-159)，434位Asn置换为Ala的方法(Drug Metab. Dispos. (2010) 38 (4)600-605)，252位Met置换为Tyr、254位Ser置换为Thr、256位Thr置换为Glu的方法(J. Biol.Chem. (2006) 281, 23514-23524)，250位Thr置换为Gln、428位Met置换为Leu的方法(J.Immunol. (2006) 176 (1), 346-356)，434位Asn置换为His的方法(Clin. Pharmcol.Ther. (2011) 89 (2) 283-290)，以及WO2010/106180、WO2010/045193、WO2009/058492、WO2008/022152、WO2006/050166、WO2006/053301、WO2006/031370、WO2005/123780、WO2005/047327、WO2005/037867、WO2004/035752、WO2002/060919等中记载的改变。

[参考例1]抗体表达载体的制备和抗体的表达和纯化

编码抗体的可变区H链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成是使用装配PCR等，按照本领域公知的方法进行。氨基酸置换的导入是使用PCR等，按照本领域公知的方法进行。将所得质粒片段插入动物细胞表达载体中，制备H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列按照本领域公知的方法确定。将制备的质粒瞬时导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，进行抗体的表达。回收所得培养上清液，然后过0.22μm的过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)或0.45μm的过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)，获得培养上清液。使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GEHealthcare)或ProteinG Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)，按照本领域公知的方法，从所得培养上清液纯化抗体。对于纯化抗体浓度，使用分光光度计，测定280nm下的吸光度，采用由所得值按照PACE等方法计算的消光系数，计算抗体浓度(Protein Science1995; 4: 2411-2423)。

[参考例2]FcγR的制备方法以及改变抗体与FcγR的相互作用分析方法

按照以下方法制备FcγR的胞外结构域。首先，按照本领域技术人员公知的方法实施FcγR的胞外结构域的基因的合成。此时，各FcγR的序列根据登记于NCBI的信息制备。具体来说，FcγRI根据NCBI的登录号NM_000566.3的序列、FcγRIIa根据NCBI的登录号NM_001136219.1的序列、FcγRIIb根据NCBI的登录号NM_004001.3的序列、FcγRIIIa根据NCBI的登录号NM_001127593.1的序列、FcγRIIIb根据NCBI的登录号NM_000570.3的序列制备，在C末端连接His标签。另外，已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb是多态性，关于多态性部位，FcγRIIa是参考J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25，FcγRIIIa是参考J. Clin.Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070，FcγRIIIb是参考J. Clin. Invest., 1989, 84,1688-1691制备。

将所得基因片段插入动物细胞表达载体中，制备表达载体。将制备的表达载体瞬时导入来自人胚肾癌细胞的FreeSyle293细胞(Invitrogen)，表达目标蛋白。对于在晶体结构分析中使用的FcγRIIb，在终浓度10μg/mL的几夫碱存在下表达目标蛋白，使连接在FcγRIIb上的糖链为高甘露糖型。进行培养，回收所得培养上清液，然后过0.22μm过滤器，获得培养上清液。所得培养上清液原则上按照以下4步纯化。第1步是实施阳离子交换柱色谱(SPSepharose FF)，第2步是实施对His标签的亲和柱色谱(HisTrap HP)，第3步是实施凝胶过滤柱色谱(Superdex200)，第4步是实施无菌过滤。但是，对于FcγRI，在第1步中实施使用Qsepharose FF的阴离子交换柱色谱。对于纯化的蛋白质，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，按照PACE等方法，由所得值计算消光系数，使用该消光系数计算纯化蛋白质的浓度(Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。

使用Biacore T100 (GE Healthcare)、Biacore T200 (GE Healthcare)、BiacoreA100、Biacore 4000，进行各改变抗体与上述制备的Fcγ受体的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用的芯片如下：通过胺偶联法将抗原肽、蛋白A(Thermo Scientific)、蛋白A/G(Thermo Scientific)、蛋白L(ACTIGEN或BioVision)固定于S系列传感芯片CM5 (GE Healthcare)或S系列传感芯片CM4 (GEHealthcare)上所得的芯片；或者使预先进行了生物素化的抗原肽与S系列传感芯片SA (经验证的)(GE Healthcare)相互作用并固定的芯片。

将目标抗体捕获在这些传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测定与抗体的结合量，在抗体之间进行比较。但是，Fcγ受体的结合量与被捕获的抗体的量相关，因此，用各抗体的捕获量除以Fcγ受体的结合量，用所得校正值进行比较。还用10mM甘氨酸-HCl、pH1.5与其反应，由此洗涤捕获在传感芯片上的抗体，使传感芯片再生，重复使用。

另外，用于计算各改变抗体对FcγR的KD值的动力学分析是按照以下方法实施。首先，将目标抗体捕获在上述传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，对于所得的传感图谱，通过Biacore评价软件(Biacore Evaluation Software)，将测定结果用1:1Langmuir结合模型进行全局拟合(global fitting)，计算结合速率常数ka (L/mol/s)、解离速率常数kd (1/s)，由该值计算解离常数KD (mol/L)。

另外，在判断各改变抗体与FcγR的相互作用微弱，用上述动力学分析无法正确分析时，对于该相互作用，利用Biacore T100软件手册BR1006-48版本AE中记载的以下的1:1结合模型式计算KD。

通过1:1结合模型相互作用的分子在Biacore上的行为可由下式1表示：

[式1]

R_eq：稳态结合水平相对于分析物浓度的关系

C：浓度

RI：样品中的体积折射率贡献

R_max：表面的分析物结合能力

将该式变形，则KD可如下式2表示：

[式2]

。

通过在该式中代入R_max、RI、C的值，可算出KD。RI、C的值可从测定结果的传感图谱、测定条件求得。R_max根据下列方法算出。对于其测定轮中同时评价的成为比较对象的相互作用十分强的抗体，应用上述1:1 Langmuir结合模型通过全局拟合时得到的R_max的值除以成为比较对象的抗体在传感芯片上的捕获量，乘以要评价的改变抗体的捕获量，得到的值为R_max。

[参考例3]Fc变体对FcγR的结合的广泛分析

为了制备与IgG1比较对活性型FcγR、尤其是FcγRIIa的H型和R型中任一基因多态性的Fc介导的结合减少、且对FcγRIIb的结合增强的抗体，在IgG1抗体中导入突变，对各FcγR的结合进行广泛分析。

抗体H链应用包含WO2009/041062中公开的血浆动力学改善的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体GpH7的CDR的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的可变区(序列编号：15)。同样地，抗体L链通用WO2009/041062中公开的血浆动力学改善的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的GpL16-k0(序列编号：16)。另外，抗体H链恒定区利用除去IgG1的C末端Gly和Lys的G1d中导入K439E突变的B3。该H链称为GpH7-B3(序列编号：17)、L链称为GpL16-k0(序列编号：16)。

对于GpH7-B3，将认为与FcγR结合相关的氨基酸与其周边氨基酸(EU编号第234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位)分别置换为除原始氨基酸和Cys的18种氨基酸。这些Fc变体称为B3变体。B3变体通过参考例1的方法表达纯化，通过参考例2的方法广泛评价对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa)的结合。

对与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法制图。将各B3变体来源的抗体对FcγR的结合量的值除以在B3中不导入突变的作为比较对象的抗体(EU编号第234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位是具有人天然型IgG1序列的抗体)对FcγR的结合量的值。该值再扩大100倍的值作为各变体对FcγR的相对结合活性的指标。分别地，横轴表示各变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各变体对活性型FcγR即FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIIa的相对结合活性的值(图1、2、3、4)。

结果，如图1～4中通过标记表示地，发现在所有改变中，仅导入称为突变A(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变)的突变和称为突变B(EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变)的突变时，与导入前相比，具有对FcγRIIb的结合显著增强，对两种FcγRIIa的结合显著抑制的效果。

[参考例4]FcγRIIb选择性结合变体的SPR分析

对实施例1中发现的EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，更详细地分析对各FcγR的结合。

作为IgG1的H链，抗体H链可变区应用WO2009/125825中公开的人白细胞介素6受体的抗体的可变区即IL6R-H的可变区(序列编号：18)，抗体H链恒定区应用具有除去人IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d的IL6R-G1d(序列编号：19)。制备IL6R-G1d的EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-G1d-v1(序列编号：20)。随后，制备IL6R-G1d的EU编号第328位的Leu置换为Glu的IL6R-G1d-v2。另外，为了比较，制备非专利文献28中记载的IL6R-G1d的EU编号第267位的Ser置换为Glu、EU编号第328位的Leu置换为Phe的IL6R-G1d-v3。抗体L链通用脱珠单抗的L链IL6R-L(序列编号：21)，与各H链共同地按照参考例1的方法表达纯化抗体。此处得到的具有IL6R-G1d、IL6R-G1d-v1、IL6R-G1d-v2、IL6R-G1d-v3来源的氨基酸序列作为抗体H链的抗体分别称为IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3。

随后，应用Biacore T100(GE Healthcare)实施这些抗体与FcγR的相互作用的动力学分析。运行缓冲液应用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度设为25℃。应用在Series SSensor Chip CM5(GE Healthcare)上通过胺偶联法固定了蛋白A的芯片。目的抗体捕获在该芯片上，与用运行缓冲液稀释的各FcγR相互作用，测定对抗体的结合。测定后通过与10mM甘氨酸-HCl、pH1.5反应，洗涤芯片上捕获的抗体，再生芯片并反复利用。通过Biacore评价软件用1:1 Langmuir结合模型分析作为测定结果的得到的传感图谱，算出结合速率常数ka (L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，从该值算出解离常数KD (mol/L)。

此次，由于IgG1-v1和IgG1-v2对FcγRIIa H型和FcγRIIIa的结合微弱，无法算出上述分析法中的KD等动力学参数。对于这些相互作用，利用Biacore T100软件手册BR1006-48版本AE中记载的以下1:1结合模型式算出KD。

[式1]

R_eq：稳态结合水平相对于分析物浓度的关系

C：浓度

RI：样品中的体积折射率贡献

R_max：表面的分析物结合能力。

将该式变形，则KD可如下式2表示：

[式2]

。

将R_max、RI、C的值代入该式中，可计算KD。根据此次的测定条件，可使RI=0、C=2 μmol/L。另外，用1:1 Langmuir结合模型对作为分析IgG1与各FcγR的相互作用的结果得到的传感图谱进行全局拟合时得到的R_max的值除以IgG1的捕获量，乘以IgG1-v1、IgG1-v2的捕获量，得到的值为R_max。这是基于下列假设的计算，对于所有在IgG1中导入突变的变体，与IgG1比较能够与各FcγR结合的限制量不变，测定时的R_max与该测定时芯片上结合的抗体的量成比例。R_eq为测定时观察的各FcγR对传感芯片上各变体的结合量。

在此次的测定条件下，IgG1-v1、IgG1-v2对FcγRIIa H型的结合量(R_eq)分别为约2.5、10 RU，IgG1-v1、IgG1-v2对FcγRIIIa的结合量(R_eq)分别为约2.5、5 RU。对FcγRIIa H型的相互作用分析时的IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2的捕获量是452、469.2、444.2 RU，对FcγRIIIa的相互作用分析时的IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2的捕获量是454.5、470.8、447.1 RU。另外，对作为IgG1对FcγRIIa H型、FcγRIIIa的相互作用分析结果得到的传感图谱，应用1:1Langmuir结合模型进行全局拟合时得到的R_max分别是69.8、63.8 RU。使用这些值，IgG1-v1、IgG1-v2对FcγRIIa H型的R_max分别计算为72.5、68.6 RU，IgG1-v1、IgG1-v2对FcγRIIIa的R_max分别计算为66.0、62.7 RU。将这些值代入下式

[式2]

，算出IgG1-v1、IgG1-v2对FcγRIIa H型和FcγRIIIa的KD。

IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3对各FcγR的KD值示于表1(各抗体对各FcγR的KD值)，另外，IgG1对各FcγR的KD值除以IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3对各FcγR的KD值得到的IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3的相对KD值示于表2(各抗体对各FcγR的相对KD值)。

[表15]

上述表15中，*意味着由于FcγR对IgG的结合观察不充分，利用下式算出的KD：

[式2]

。

[表16]

根据表16，与IgG1相比IgG1-v1对FcγRIa的结合活性降低0.047倍，对FcγR IIa的R型降低0.10倍，对FcγRIIa H型的结合活性降低0.014倍，对FcγRIIIa的结合活性降低0.061倍。另一方面，对FcγRIIb的结合活性增加4.8倍。

另外，根据表16，与IgG1相比IgG1-v2对FcγRIa的结合活性降低0.74倍，对FcγRIIa的R型降低0.41倍，对FcγRIIa H型的结合活性降低0.064倍，对FcγRIIIa的结合活性降低0.14倍。另一方面，对FcγRIIb的结合活性增加2.3倍。

即，根据该结果明确，具有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IgG1-v1和含有EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变的IgG1-v2，具有减弱对包含FcγRIIa两种基因多态性的所有活性型FcγR的结合、另一方面升高对作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合的性质。

随后，以对FcγRIIb的结合活性与对FcγRIIa R型或者H型的结合活性的比率为指标，评价得到的变体对FcγRIIb的选择性。具体地，对FcγRIIa R型或者H型的KD值除以对FcγRIIb的KD值得到的值I/A (R)或者I/A (H)用作相对于各FcγRIIa的FcγRIIb的选择性的指标。对FcγRIIb的KD值越小或对FcγRIIa的KD值越大，该指标显示为越大的值。即，显示较大值的变体表示，与FcγRIIa比较对FcγRIIb的相对结合活性增加。对于各变体，该指标总结于表17。

[表17]

根据表17的结果，与IgG1比较应用现有技术的IgG1-v3显示比IgG1大的I/A (H)值，对FcγRIIb更具选择性，但是，显示比IgG1小的I/A (R)值，对FcγRIIb的选择性改善。另一方面，本实施例中发现的IgG1-v1和IgG1-v2显示在I/A (R)和I/A (H)方面均比IgG1大的值，对于FcγRIIa的全部基因多态性也改善了对FcγRIIb的选择性。

迄今未报告具有这种性质的改变，实际上如图18、19、20、21所示是非常少的。EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变、EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变在免疫炎性疾病等治疗药的开发中非常有用。

另外，根据表2，非专利文献28中记载的IgG1-v3的确对FcγRIIb的结合增强408倍，对FcγRIIa H型的结合减少0.51倍，另一方面对FcγRIIa R型的结合增强522倍。根据该结果，由于IgG1-v1和IgG1-v2抑制对FcγRIIa R型和H型两者的结合，且增强对FcγRIIb的结合，认为它是与IgG1-v3相比对FcγRIIb更具选择性结合的变体。也即，EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变、EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变在免疫炎性疾病等治疗药的开发中非常有用。

[参考例5]FcγRIIb选择性结合改变与其它Fc区的氨基酸置换的组合的效果

基于参考例3和参考例4见到的对FcγRIIb的选择性增加的EU编号第238位的Pro置换为Asp的变体，尝试进一步增强对FcγRIIb的选择性。

首先，在IL6R-G1d中导入EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IL6R-G1d_v1(序列编号：20)中，导入参考例4记载的对FcγRIIb的选择性增强的EU编号第328位的Leu向Glu的置换，制备变体IL6R-G1d-v4，将其与IL6R-L (序列编号：21)组合，按照参考例1的方法制备。此处得到的具有来自IL6R-G1d-v4的氨基酸序列作为抗体H链的抗体称为IgG1-v4。按照参考例2的方法评价IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v4对FcγRIIb的结合活性，其结果在表18中示出。

[表18]

根据表18的结果，由于L328E对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比增加2.3倍，与同样地对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比增加4.8倍的P238D组合，预期对FcγRIIb的结合活性的增加程度进一步增强，但是实际上，组合了这些改变的变体对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比降低0.47倍。该结果是从各自改变效果无法预测的效果。

同样地，在IL6R-G1d中导入EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IL6R-G1d-v1(序列编号：20)中，导入参考例4记载的对FcγRIIb的结合活性增加的EU编号第267位的Ser向Glu的置换和EU编号第328位的Leu向Phe的置换，按照参考例1的方法制备变体IL6R-G1d-v5。此处得到的具有来自IL6R-G1d-v5的氨基酸序列作为抗体H链的抗体称为IgG1-v5。按照参考例2的方法评价IgG1、IgG1-v1、IgG1-v3、IgG1-v5对FcγRIIb的结合活性，其结果在表19中示出。

在P238D变体中，导入参考例4中具有对FcγRIIb的增强效果的S267E/L328F，评价改变导入前后对FcγRIIb的结合活性，其结果在表19中示出。

[表19]

根据表19的结果，由于S267E/L328F对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比增加408倍，组合同样地对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比增加4.8倍的P238D，预期对FcγRIIb的结合活性的增加程度进一步增加，但是，实际上与前一实例同样明显地，组合了这些改变的变体对FcγRIIb的结合活性与IgG1相比只增加12倍左右。该结果也是根据各自改变的效果无法预测的效果。

根据这些结果，单独的EU编号第238位的Pro置换为Asp增加对FcγRIIb的结合活性，但是，与其它对FcγRIIb的结合活性增加改变组合时，其效果不发挥。认为其原因之一是，Fc与FcγR的相互作用界面的结构由于导入EU编号第238位的Pro向Asp的置换而变化，不再反映在天然型抗体中观察的改变的效果。因此认为，以包含EU编号第238位的Pro置换为Asp的Fc为模板产生对FcγRIIb的选择性更优异的Fc，不能应用天然型抗体中得到的改变的效果的信息，是极其困难的。

[参考例6]除P238D改变之外也导入铰链部分的改变的变体对FcγRIIb的结合的广泛分析

如参考例5所示，在人天然型IgG1中EU编号第238位的Pro置换为Asp的Fc中，即使组合预期进一步增加对FcγRIIb的结合的其它改变，也得不到期待的组合效果。因此，基于EU编号第238位的Pro置换为Asp的Fc变体，通过广泛导入对该Fc的改变，进行发现进一步增强对FcγRIIb的结合的变体的研究。作为抗体H链，制备在IL6R-G1d(序列编号：19)中导入EU编号第252位的Met置换为Tyr的改变、EU编号第434位的Asn置换为Tyr的改变的IL6R-F11(序列编号：22)，对其进一步地导入EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，制备IL6R-F652。分别制备包含抗体H链序列的表达质粒，所述抗体H链序列如下制备，在IL6R-F652中将EU编号第238位的残基附近区域(EU编号第234位至237位、239位)分别置换为除原始氨基酸与半胱氨酸外的18种氨基酸。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。这些变体按照参考例1的方法表达纯化、表达。这些Fc变体称为PD变体。按照参考例2的方法广泛评价各PD变体对FcγRIIa R型和FcγRIIb的相互作用。

关于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下的方法制图。各PD变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前的抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，IL6R-F652/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进一步地扩大100倍，得到的值作为各PD 变体对各FcγR的相对结合活性的值。分别地，横轴示出各PD 变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴示出各PD变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图22)。

结果发现，11种改变具有与改变导入前的抗体比较增强对FcγRIIb的结合、维持或者增强对FcγRIIa R型的结合的效果。这11种变体对FcγRIIb和FcγRIIa R的结合活性的总结结果示于表20。另外，表中的改变表示在IL6R-F11(序列编号：22)中导入的改变。

[表20]

图23示出了对导入P238D的变体进一步额外导入这11种改变时对FcγRIIb的结合活性的相对值，以及参考例3中将这些改变导入不含P238D的Fc时对FcγRIIb的结合活性的相对值。这11种改变进一步导入P238D变体时，与导入前相比增强对FcγRIIb的结合量，但相反地，对于除G237F、G237W、S239D的8种改变，将其导入参考例3中应用的不含P238D的变体(GpH7-B3/GpL16-k0)中时，显示降低对FcγRIIb的结合的效果。

根据参考例5和该结果，根据天然型IgG1中导入的改变的效果，预测在Fc中包含P238D改变的变体中导入相同改变时的效果是困难的。换言之，此次鉴定的8种改变是在不进行本研究的情况下不可能发现的改变。

按照参考例2的方法测定表20中所示变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIaV的KD值，结果总结于表21。另外，表中的改变表示IL6R-F11(序列编号：22)中导入的改变。但是，制备IL6R-F11时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L以*表示。另外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各变体对FcγRIIaR的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值，各变体对FcγRIIaH的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。除这些之外，各变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值示于表21。此处的亲本多肽指H链中具有IL6R-F11(序列编号：22)的变体。另外，表21中以灰色填充的方格判断为，FcγR与IgG结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

根据表21，所有变体均增加与IL6R-F11比较对FcγRIIb的亲和性，该增加幅度为1.9倍至5.0倍。各变体对FcγRIIaR的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比、和各变体对FcγRIIaH的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比表示，相对于对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性的对FcγRIIb的相对结合活性。也即，该值是显示各变体对FcγRIIb的结合选择性大小的值，该值越大，对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-F11/IL6R-L的对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值的比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值的比均为0.7，因此，表21中的所有变体均比亲本多肽增强对FcγRIIb的结合选择性。变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值是1以上，意味着该变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相同或更低。此次得到的变体中，该值为0.7至5.0，因此可以说，此次得到的变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽的该结合相比几乎相同或更低。根据这些结果得知，此次得到的变体与亲本多肽相比维持或降低对FcγRIIa R型和H型的结合活性，增强对FcγRIIb的结合活性，增加对FcγRIIb的选择性。另外，对于FcγRIa和FcγRIIIaV，所有变体与IL6R-F11比较亲和性均降低。

[表21]

[参考例7]含有P238D的Fc与FcγRIIb细胞外区的复合物的X线晶体结构分析

如之前参考例5中所示，即使在包含P238D的Fc中导入增加与FcγRIIb的结合活性、或增加对FcγRIIb的选择性的改变，对FcγRIIb的结合活性也减弱，认为其原因是Fc与FcγRIIb的相互作用界面的结构通过导入P238D而变化。因此，为了寻求该现象的原因，通过X线晶体结构分析明确具有P238D突变的IgG1的Fc(下文称为Fc(P238D))与FcγRIIb细胞外区的复合物的立体结构，并且比较天然型 IgG1的Fc (下文称为Fc(WT))与FcγRIIb细胞外区的复合物的立体结构以及结合方式。另外，对于Fc与FcγR细胞外区的复合物的立体结构，已经有许多报告，分析了Fc(WT)/FcγRIIIb细胞外区复合物(Nature, 2000, 400,267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477)、Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674)、Fc(WT)/FcγRIIa细胞外区复合物(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)的立体结构。迄今为止没有分析Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的立体结构，但是，与Fc(WT)的复合物的立体结构已知的FcγRIIa以及FcγRIIb的细胞外区的氨基酸序列中的93%是一致的，具有非常的同源性，因此，根据Fc(WT)/FcγRIIa细胞外区复合物的晶体结构通过建模预测Fc (WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的立体结构。

通过X线晶体结构分析在分辨率2.6Å确定Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的立体结构。该分析结果的结构示于图24。2个Fc CH2结构域之间夹入FcγRIIb细胞外区而结合，这与迄今为止分析的Fc(WT)与FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa各细胞外区的复合物的立体结构类似。

随后为了详细比较，将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构通过基于对于FcγRIIb细胞外区以及Fc CH2结构域A的Cα原子间距离的最小二乘法重叠(图25)。此时知晓，Fc CH2结构域B彼此的重叠程度不佳，该部分中具有立体结构差异。进一步地，应用Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构以及Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构，提取FcγRIIb细胞外区与Fc CH2结构域B之间距离为3.7Å以下的原子对并比较，比较Fc(WT)和Fc(P238D)中FcγRIIb与Fc CH2结构域B之间的原子间相互作用的差异。如表22所示，在Fc(P238D)和Fc(WT)中，FcCH2结构域B与FcγRIIb之间的原子间相互作用不一致。

[表22]

进一步地，将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构通过基于仅Fc CH2结构域A以及仅Fc CH2结构域B之间Cα原子间距离的最小二乘法重叠，比较P238D附近的详细结构。Fc(P238D)与Fc(WT)中的突变导入位置EU编号第238位的氨基酸残基的位置变化，可知与之相伴从铰链区延续的其附近环结构在Fc(P238D)和Fc(WT)中变化(图26)。起初地，在Fc(WT)中，EU编号第238位的Pro位于蛋白内侧，与周围残基形成疏水性核，但是，将其改变为带电的非常亲水的Asp时，在该疏水性核中存在引起去溶剂化方面的能量不利。因此，在Fc(P238D)中，为了取消该能量不利，EU编号第238位的氨基酸残基变为面向溶剂侧的形态，认为这可引起附近环结构的变化。进一步地，该环从通过S-S键交联的铰链区延续，因此，其结构变化不限于局部变化，也影响FcCH2结构域A与结构域B的相对配置，结果推断，FcγRIIb与Fc CH2结构域B之间的原子间相互作用具有差异。因此，认为即使在已有P238D改变的Fc中组合在天然型IgG中增加对FcγRIIb的选择性、结合活性的改变，也得不到预测的效果。

另外，P238D导入引起的结构变化的结果是，在Fc CH2结构域A中，邻近的EU编号第237位的Gly的主链与FcγRIIb的160位的Tyr之间发现氢键(图27)。相应于该Tyr160的残基在FcγRIIa中是Phe，与FcγRIIa结合时该氢键不形成。160位的氨基酸是与Fc的相互作用界面中FcγRIIa与FcγRIIb之间的少数差异之一，推测FcγRIIb中特有的该氢键的有无引起Fc(P238D)对FcγRIIb的结合活性增加以及对FcγRIIa的结合活性的降低，并增加选择性。另外，Fc CH2结构域B中EU编号第270位的Asp与FcγRIIb的131位的Arg之间发现静电相互作用(图28)。在FcγRIIa的同种异型之一即FcγRIIa H型中，对应的残基是His，该静电相互作用无法形成。这可以解释与FcγRIIa R型比较FcγRIIa H型对Fc(P238D)的结合活性降低的理由。根据该X线晶体结构分析结果进行考察得知，P238D导入引起的其附近环结构变化和与之相伴的结构域配置的相对变化引起天然型IgG中不存在的新相互作用形成，导致P238D变体对FcγRIIb的选择性结合谱。

［Fc(P238D)的表达纯化］

如下进行包含P238D改变的Fc的制备。首先，将hIL6R-IgG1-v1(序列编号：20)的EU编号第220位的Cys置换为Ser，将EU编号第216位的Glu至其C末端通过PCR克隆，用得到的基因序列Fc(P238D)按照参考例1记载的方法制备表达载体、进行表达纯化。另外，EU编号第220位的Cys在通常的IgG1中与L链的Cys形成二硫键，仅制备Fc时L链不共表达，因此，为了避免不需要的二硫键形成将该残基置换为Ser。

［FcγRIIb细胞外区的表达纯化］

按照参考例2的方法制备。

［Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的纯化］

向2mg针对结晶化得到的FcγRIIb细胞外区样品中，加入0.29mg作为与谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白的、通过大肠杆菌表达纯化的Endo F1(Protein Science 1996, 5,2617-2622)，在0.1M Bis-Tris pH6.5的缓冲液条件，在室温静置3日，切断N型糖链留下与Asn直接结合的N-乙酰葡萄糖胺。随后，将实施了该糖链切断处理的FcγRIIb细胞外区样品通过5000MWCO的超滤膜浓缩，用20mM HEPES pH7.5, 0.05M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)进行纯化。向进一步地得到的糖链切断FcγRIIb细胞外区级分加入Fc (P208)，使得FcγRIIb细胞外区的摩尔比轻微过量，通过10000MWCO的超滤膜浓缩后，用25mM HEPES pH7.5, 0.05M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)纯化，得到Fc(P208)/FcγRIIb细胞外区复合物的样品。

［Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的结晶化］

将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的样品通过10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，应用坐滴气相扩散进行结晶化。结晶化中应用Hydra II Plus One (MATRIX)，对100mM Bis-Tris pH6.5、17% PEG3350, 0.2M醋酸铵, 2.7%(w/v) D-半乳糖的储存溶液，制备以储存溶液：结晶化样品＝0.2μl：0.2μl混合的结晶滴，密封后，在20℃静置，成功得到薄板状晶体。

［来自Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物晶体的Ｘ线衍射数据的测定］

将得到的Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的单晶之一浸入100mM Bis-TrispH6.5, 20% PEG3350, 醋酸铵, 2.7%(w/v) D-半乳糖, 乙二醇22.5%(v/v)溶液后，用附有微小尼龙环的针将其从溶液中钓出，在液氮中冷冻，通过高能加速器研究机构的放射光设备Photon Factory BL-1A测定X线衍射数据。另外，测定中恒定置于-178℃的氮气流中保持冷冻状态，通过附有束线的CCD检测器Quantum 270(ADSC)，将晶体以0.8°边旋转，边收集共225幅X线衍射图。在从得到的衍射图确定晶胞参数、衍射点的指标化、以及衍射数据处理中，应用程序Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)，最终得到直至分辨率2.46Å的衍射强度数据。本晶体属于空间群Ｐ2₁，晶胞参数ａ＝48.85Å、b＝76.01Å、ｃ＝115.09Å、α＝90°、β＝100.70°、γ＝90°。

［Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的X线晶体结构分析］

Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构确定应用程序Phaser(CCP4Software Suite)通过分子置换法进行。根据得到的晶格的大小与Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的分子量，预期非对称单位中的复合物的数目是一个。从Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物的晶体结构PDB编码:3SGJ的结构坐标，作为单独的坐标取出A链239-340位以及B链239-340位的氨基酸残基部分，各自作为Fc CH2结构域的研究用模型。从相同的PDB编码:3SGJ的结构坐标，作为一个坐标取出A链341-444位与B链341-443位的氨基酸残基部分，用作Fc CH3结构域的研究用模型。最后从FcγRIIb细胞外区的晶体结构PDB编码:2FCB的结构坐标取出A链6-178位的氨基酸残基部分用作FcγRIIb细胞外区的研究用模型。通过旋转函数和位移函数，以Fc CH3结构域、FcγRIIb细胞外区、Fc CH2结构域的顺序确定各研究用模型的晶格内的取向和位置，得到Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物晶体结构的初期模型。对得到的初期模型进行移动2个Fc CH2结构域、2个Fc CH3结构域以及FcγRIIb细胞外区的刚体修正，此时对于25-3.0Å的衍射强度数据，结晶学可信度因子R值是40.4%、Free R值是41.9%。进一步地，应用程序Refmac5(CCP4 Software Suite)进行结构修正，应用程序Coot(Paul Emsley)进行模型修正以观察电子密度图，其系数为根据实验确定的结构因子Fo与从模型计算的结构因子Fc以及从模型计算的位相算出的2Fo-Fc、Fo-Fc，重复这些步骤进行模型的修正。最后，基于利用2Fo-Fc、Fo-Fc作为系数的电子密度图将水分子掺入模型进行修正，最终应用分辨率25-2.6Å的24291个衍射强度数据，对包含4846个非氢原子的模型，结晶学可信度因子R值是23.7%，Free R值是27.6%。

［Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构产生］

基于Fc(WT)/FcγRIIa细胞外区复合物的晶体结构PDB编码:3RY6的结构坐标，应用程序Disovery Studio 3.1(Accelrys)的Build Mutants功能，在结构坐标中的FcγRIIa中导入突变，使得与FcγRIIb的氨基酸序列一致。这时，将Optimization Level设定为High、Cut Radius设定为4.5，产生5个模型，应用其中能量分最好的一个，作为Fc(WT)/FcγRIIb细胞外区复合物的模型结构。

[参考例8]基于晶体结构确定了改变位点的Fc变体对FcγR的结合的分析

基于参考例7得到的Fc (P238D)与FcγRIIb细胞外区的复合物的X线晶体结构分析的结果，在EU编号第238位的Pro置换为Asp的Fc变体上，对预测影响与FcγRIIb的相互作用的部位(EU编号第233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位的残基)导入广泛改变，进一步地研究与FcγRIIb结合增强的组合变体。

在参考例4制备的IL6R-G1d(序列编号：19)中导入EU编号第439位的Lys置换为Glu的改变，制备IL6R-B3(序列编号：23)。随后，在IL6R-B3中导入EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，制备IL6R-BF648。抗体L链通用IL6R-L(序列编号：21)。这些变体按照参考例1的方法进行抗体表达、纯化，通过参考例2的方法广泛评价对各FcγR(FcγRIa、 FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。

对于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法制图。将各变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-BF648/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进一步地扩大100倍，得到的值作为各变体对各FcγR的相对结合活性的值。分别地，横轴表示各变体对FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图29)。

如图29所示，其结果为，发现全部改变中的24种改变具有与改变导入前的抗体比较对FcγRIIb的结合维持或者增强的效果。这些变体各自对FcγR的结合示于表23。另外，表中的改变表示IL6R-B3(序列编号：23，表23中的IL6R-2B999)中导入的改变。但是，制备IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。

[表23]

用参考例2的方法测定表23中所示变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIa V型的KD值，结果总结于表24。表中的改变表示IL6R-B3(序列编号：23)中导入的改变。但是，制备IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。另外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示，各变体对FcγRIIaR的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值、各变体对FcγRIIaH的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。除这些之外，各变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值示于表24。此处，亲本多肽指具有IL6R-B3(序列编号：23)作为H链的变体。另外，表24中以灰色填充的方格判断为，FcgR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

根据表24，所有变体与IL6R-B3(表24中的IL6R-2B999)比较对FcγRIIb的亲和性都增加，其增加幅度为2.1倍至9.7倍。各变体对FcγRIIaR的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比、和各变体对FcγRIIaH的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比，表示相对于对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性的对FcγRIIb的相对结合活性。也即，该值是显示各变体对FcγRIIb的结合选择性的大小的值，该值越大，对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值的比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值的比分别为0.3、0.2，因此，表24中的所有变体均比亲本多肽增强对FcγRIIb的结合选择性。变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值是1以上，意味着该变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相同或更低。此次得到的变体中，该值为4.6至34.0，因此可以说，此次得到的变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽的该结合相比降低。根据这些结果可知，此次得到的变体与亲本多肽相比维持或降低对FcγRIIa R型和H型的结合活性，增强对FcγRIIb的结合活性，增强对FcγRIIb的选择性。另外，对于FcγRIa和FcγRIIIaV，所有变体与IL6R-B3比较亲和性均降低。

[表24]

对于得到的组合变体中有希望的变体，根据晶体结构考察其效果的原因。图30显示Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物的晶体结构。其中，位于左侧的H链为Fc链A，位于右侧的H链为Fc链B。此处可知，Fc链A中EU编号第233位的部位位于FcγRIIb的EU编号第113位的Lys附近。但是，本晶体结构中，E233的侧链的电子密度没有得到良好的观察，处于运动性相当高的状态。因此，EU编号第233位的Glu置换为Asp的改变由于侧链缩短1个碳而引起侧链自由度变小，其结果是，与FcγRIIb的EU编号第113位的Lys形成相互作用时的熵损失降低，结果推测其促成结合自由能的增加。

图31中类似地示出Fc (P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物结构中EU编号第330位的部位附近的环境。根据该图知晓，Fc (P238D)的Fc链A的EU编号第330位的部位周边是由FcγRIIb的EU编号第85位的Ser、86位的Glu、163位的Lys等构成的亲水环境。因此，推测将EU编号第330位的Ala置换为Lys或Arg的改变促成与FcγRIIb的EU编号第85位的Ser或EU编号第86位的Glu的相互作用强化。

图32将Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物和Fc(WT)/FcγRIIIa细胞外区复合物的晶体结构通过基于对于Fc链B的Cα原子间距离的最小二乘法重叠，示出EU编号第271位的Pro的结构。这二个结构一致性良好，但EU编号第271位的Pro部位具有不同的立体结构。另外，考虑Fc(P238D)/FcγRIIb细胞外区复合物晶体结构中该周边的电子密度弱，暗示Fc(P238D)/FcγRIIb中EU编号第271位是Pro在结构上引起大的负荷，因此该环结构可能得不到最佳结构。因此推测，EU编号第271位的Pro置换为Gly的改变赋予该环结构柔性，并且通过降低与FcγRIIb相互作用时得到最佳结构时的能量障碍而有助于结合增强。

[参考例9]通过与P238D组合增强与FcγRIIb的结合的改变的组合效果验证

组合在参考例6、参考例8得到的改变中观察到增强对FcγRIIb的结合的效果或维持对FcγRIIb的结合、及抑制对其它FcγR的结合的效果的改变，验证其效果。

与参考例8的方法同样地，从表19、22选择特别优异的改变，将其组合并导入抗体H链IL6R-BF648。抗体L链通用IL6R-L，按照参考例1的方法表达纯化抗体，通过参考例2的方法广泛评价对各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa V型)的结合。

按照以下方法，根据与各FcγR的相互作用分析结果算出相对结合活性。将各变体对各FcγR的结合量的值除以作为对照的改变导入前抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-BF648/IL6R-L)对各FcγR的结合量的值，进一步地扩大100倍，得到的值作为各变体对各FcγR的相对结合活性的值。分别地，横轴表示各变体对FcγRIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各变体对FcγRIIa R型的相对结合活性的值(表25)。

另外，表中的改变表示IL6R-B3(序列编号：23)中导入的改变。但是，制备IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L由*表示。

[表25]

用参考例2的方法测定表25中所示变体对FcγRIa、FcγRIIaR、FcγRIIaH、FcγRIIb、FcγRIIIa V型的KD值，结果总结于表26。表中的改变表示IL6R-B3(序列编号：23)中导入的改变。但是，制备IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L由*表示。另外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各变体对FcγRIIaR的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值、各变体对FcγRIIaH的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值的值。除这些之外，各变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值示于表26。此处，亲本多肽指具有IL6R-B3(序列编号：23)作为H链的变体。另外，表26中以灰色填充的方格判断为，FcγR与IgG的结合微弱而无法正确进行动力学分析，因此是利用参考例2记载的式算出的值：

[式2]

。

根据表26，所有变体与IL6R-B3比较对FcγRIIb的亲和性均增加，其增加幅度是3.0倍至99.0倍。各变体对FcγRIIaR的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比、和各变体对FcγRIIaH的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值的比，表示相对于对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性的对FcγRIIb的相对结合活性。也即，该值是显示各变体对FcγRIIb的结合选择性的大小的值，该值越大，对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIaR的KD值/对FcγRIIb的KD值的比、和对FcγRIIaH的KD值/对FcγRIIb的KD值的比分别是0.3、0.2，因此，表26中的所有变体均比亲本多肽增强对FcγRIIb的结合选择性。变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值/亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的KD值是1以上，意味着该变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的的结合与亲本多肽对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的结合相同或更低。此次得到的变体中，该值为0.7至29.9，因此可以说，此次得到的变体对FcγRIIaR和FcγRIIaH的结合活性中较强的一方的的结合与亲本多肽的该结合相比几乎相同或更低。根据这些结果可知，此次得到的变体与亲本多肽相比维持或降低对FcγRIIa R型和H型的结合活性，增强对FcγRIIb的结合活性，增强对FcγRIIb的选择性。另外，对于FcγRIa和FcγRIIIaV，所有变体与IL6R-B3比较亲和性均降低。

[表26]

另外，各序列编号的序列中的可变区和恒定区总结于下表。表中，“B3”表示“2B999(B3)”，“omlizH”表示“奥马珠单抗_VH”，“omlizL”表示“奥马珠单抗_VL”。

[表27]

产业实用性

根据本发明，提供了与含有未导入氨基酸改变的Fc区的多肽比较对FcγRIIb的结合活性增强、另外与FcγRIIa(R型)比较对FcγRIIb的结合选择性增强的Fc区变体，含有该Fc区变体的多肽。利用该多肽，可以转导FcγRIIb的ITIM的磷酸化介导的炎性免疫反应的抑制性信号。另外，通过对抗体的Fc赋予与FcγRIIb选择性结合的性质，通过FcγRIIb介导的免疫抑制性作用，可抑制抗药物抗体的产生。