CN114829407B - 利用哺乳动物展示筛选FcγR特异性结合Fc - Google Patents
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Abstract
公开了将哺乳动物展示与流式分选术、二代测序等技术相结合，筛选与特定FcγR结合能力增强的Fc变体的方法，以及由此筛选获得的Fc变体。
Description
技术领域
本发明涉及Fc区变体、包含该Fc区变体的多肽以及含有该多肽的药物组合物，以及利用哺乳动物展示技术与二代测序的Fc筛选方法，所述Fc区变体通过在抗体的Fc区导入氨基酸突变，与野生型人IgG的Fc区相比时，可以增强对FcγR受体，例如FcγRIIB或FcγRIIIA的结合能力。
背景技术
抗体类药物如今在疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。在人体内的Fc受体是一类能与抗体Fc段结合的受体，对一些抗体药物发挥疗效至关重要。如今大部分抗体类药物为IgG型，人体内与IgG结合的受体称为FcγR，主要分为FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16B)、FcRn。在人群中FcγRIIIA还存在158位氨基酸的遗传多态性(F158或V158),FcγRIIA也存在131位氨基酸的遗传多态性(H131或R131)。其中FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIIA(CD16A)通过其胞内域中的ITAM向细胞内传递激活信号，FcγRIIB(CD32B)通过其胞内域含有的ITIM模序向细胞内传递抑制信号。
抗体通过其Fab段靶向抗原，而抗体Fc可以与自然杀伤细胞表面表达的FcγRIIIA结合，从而引起自然杀伤细胞介导的ADCC作用，对靶细胞进行杀伤。FcγRIIA可以介导巨噬细胞的ADCP作用。FcγRIIB在抗TNF受体家族的激动性抗体的激动活性中发挥重要作用。
通过点突变的方式改变抗体Fc与FcγR的结合能力，被证明可用于改善抗体药的疗效。例如，Xencor公司拥有的XmAb平台通过对抗体Fc区进行氨基酸的替换从而改变抗体的效应子功能。此平台根据已经报道的Fc/FcR复合体结构，结合“directed diversity”和“quality diversity”的策略，利用计算机模拟出对于结合重要的氨基酸突变，例如通过Fc/FcR接触界面，优化Fc相应区域的氨基酸，之后将Fc变体候选物通过构建成完整alemtuzumab并表达纯化，利用Xencor公司开发的半自动的AlphaScreen assay检测与FcR的结合力。Xencor公司开发的抗CD19抗体XmAb5574，通过Fc上S239D/I332E位点的突变，在体外可以增强ADCC效应100至1000倍，在猕猴体内B细胞清除实验中，含有S239D/I332E突变的Rituximab比野生型显示出更好的杀伤效果(ADCC)。
MacroGenics公司拥有Fc优化平台(MacroGenics’Fc Optimization platform)，已将该平台成功应用于margetuximab和enoblituzumab的开发。该Fc优化平台涉及：通过error-prone PCR的方式将IgG1恒定区(包括CH1、铰链区、CH2和CH3区)突变文库构建入酵母表达载体，利用Yeast Display展示该突变文库，最后FACS分选与FcγRIIIA结合力较强的酵母克隆，将其亚克隆至真核细胞中表达，用ELISA方法鉴定。MacroGenics开发的MGAH22(margetuximab)是一款针对癌细胞抗原her2的单克隆抗体，其Fc区域含有L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L五个突变，使其与CD16A(V158)的亲和力从415nM提高到了89nM，与CD16A (F158)的亲和力从1059nM提高到了161nM，在CD16A人源化小鼠乳腺癌模型中显示出优于野生型的疗效。
Chugai Pharmaceutical公司筛选了超过500个突变体(通过comprehensivemutagenesis获得)，确定P238D或L328E可以在增加FcγRIIB结合的同时，减弱与其他受体的结合。以P238D突变体为模板进一步突变，通过筛选约400个突变体，最终确认E233D,G237D,H268D,P271G,Y296D，A330R可以增加与FcγRIIB的结合。进一步组合这些突变得到V12变体(E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)，该变体与FcγRIIB结合力增强217倍，与FcγRIIA(R131)结合力较野生型相当，与其他受体结合力降低。
李福彬等人发现在增加Fc与FcγRIIB(CD32B)结合能力后，抗CD40激动型抗体在小鼠结肠癌模型中能发挥更好的疗效。
基于增加Fc与特定Fc受体的结合能力可以使抗体药发挥更好的疗效,目前有一些针对Fc的筛选方法。
William等人构建了4个Fc突变文库，并将其构建入phagemid噬菌体表达载体之中，可以将Fc表达在噬菌体的表面，利用表面包被有FcRn的孔板在pH为6的时候，对噬菌体进行结合，在pH为7的时候对噬菌体进行洗脱，经过几轮富集时候可以将在酸性条件下(pH＝6)与FcRn结合的噬菌体选择出来。该方法利用了噬菌体库容量大的优势，库容量可以达到107-108，但是Fc作为一种在哺乳动物细胞表达的蛋白，其二硫键的形成以及糖基化在噬菌体表面并不能很好的完成(Dall’Acqua WF,Woods RM,Ward ES,Palaszynski SR,PatelNK,Brewah YA,Wu H,Kiener PA,Langermann S(2002)Increasing the affinity ofahuman IgG1 for the neonatal Fc receptor:biological consequences.J Immunol169:5171–5180)。
Jeffrey等人通过易错PCR的方式将抗体CH1-CH3的区域扩增出来，从而在其中引入随机突变，并将其构建入pYD1表达载体中并转化EBY100酵母，构建了一个1.8x 107的文库。在诱导培养基中使抗体CH1-CH3段表达在酵母的表面，之后利用生物素化的FcγR，以及mouse anti-hFc F(ab)2-FITC抗体进行染色并流式分选出1.2％阳性细胞群，从中鉴定Fc变体。尽管在该方法中利用真核酵母单细胞生物可以更加接近人源抗体的表达环境，但与完全人源表达的抗体还是有一定的差别，尤其酵母和人的细胞糖基化修饰差别很大。而糖基化修饰对Fc与FcγR的亲和力具有非常大的影响，例如去除Fc糖基化的岩藻糖可以显著增强Fc与FcγR的亲和力。(Fc Optimization of Therapeutic Antibodies EnhancesTheir Ability to Kill Tumor Cells In vitro and Controls Tumor Expansion Invivo via Low-Affinity Activating FcγReceptors)。
综上，通过点突变的方式提高Fc与相应受体的结合能力，对于提高抗体药的疗效至关重要。因此，需要开发一套新的Fc筛选方法，该方法具有提高的筛选成功率和效率，能够更为有效地选择出符合Fc药物的哺乳动物应用环境的Fc变体。
发明简述
本发明至少部分地建立在本发明人的如下发现上：将哺乳动物展示与流式分选术、二代测序等技术相结合，能够高效地筛选出与期望的FcγR结合能力改变的Fc变体。
因此，本发明提供了一种新的Fc筛选平台，所述平台包括：(1)构建哺乳动物细胞展示Fc突变文库；(2)分选(尤其是通过流式细胞术分选)展示文库成员；(3)对分选所得的文库成员进行深度测序和聚类分析；和任选地(4)对筛选获得的Fc变体的期望结合性质进行检测/验证。
本发明也提供通过本发明筛选方法获得的、具有改变的FcγR结合性能和/或改变的效应子功能(例如ADCC活性或细胞激活效应)的Fc变体。
本发明的筛选平台具有如下优势：
一方面，尽管现有技术中已经报告过噬菌体展示筛选和酵母展示筛选系统，但这些系统在非天然环境中表达Fc多肽。相比而言，在本发明筛选平台中Fc区在其天然环境，即哺乳动物细胞中表达。因此，在本发明的方法中，可以确保，在正常情况下参与抗体/Fc合成和加工(折叠、二硫键形成、糖基化等)的所有细胞组分，均可以以生理形式和浓度用于表达的Fc区多肽。由此，通过本发明的筛选方法，将获得更为适应于哺乳动物细胞中生产和应用的Fc变体。
再一方面，尽管有文献报道可以在哺乳动物细胞上展示全长抗体(参见例如CN104011080A)，但所有相关报道都用于筛选与特定抗原结合的抗体可变区，而未报道利用展示的全长抗体或Fc恒定区来筛选Fc变体的具体应用。相对于现有技术，本发明人令人意外地发现，独立于抗体可变区，单独表达的Fc区不仅可以以正确折叠的功能形式展示在哺乳动物细胞表面上，而且Fc区变体与Fc受体的结合性质变化可以通过分选展示细胞表面的Fc受体结合信号和后续的深度测序及聚类分析，进行有效的筛选/鉴定。本发明的筛选平台表现出具有如下优势：
-由于有效包装的目的，病毒表达载体的长度将受到限制。相比于展示全长抗体，展示小得多的Fc区多肽的本发明方法，更有利于载体操作和促进载体有效包装在病毒粒子中，相应地也促进了筛选效率；
-通过将哺乳动物展示系统与流式细胞术和深度测序相结合，显著改善Fc变体选择的通量和有效性，并适于鉴定Fc区域中对于期望性质的改善而言更为有效的突变区域和优势氨基酸位置；
-如本申请实施例中所证实的，经本发明展示和筛选方法获得的Fc变体，在装配为全长抗体之前和之后，表现出了相当一致的期望Fc/FcγR结合活性。
再一方面，现有技术的筛选方法大多数要求在文库筛选后，将筛选获得的文库进行单克隆，之后在挑取的单克隆上逐一进行表达、性质检测和测序。在这些技术中，单克隆步骤显著地限制了文库的筛选通量，将文库成员的分析局限于挑取的少数单克隆文库成员，例如几十个或至多数百个成员上。
与现有技术的文库筛选方法不同，在本发明的方法中，取代对文库筛选后成员的单克隆步骤，本发明人使用了深度测序和聚类分析的方式，将分选后细胞群体的分析由常规的几十种或几百种扩大到几千或上万种文库成员上，极大地提升了整个筛选方法的通量，显著地缩短了筛选的时间和成本，并增加了筛选可获得的突变变体种类。此外，将文库筛选与深度测序结果相结合，可以通过正负筛选的组合以及对筛选细胞深度测序结果的比较，找到具有增强的一种或多种FcγR结合能力且具有不变或减弱的另一种或多种FcγR结合能力的Fc突变体。同时，通过分选富集程度分析，本发明方法可以减少筛选循环数，例如，如实施例所示可以将细胞分选减少到1-2个循环，并仍能够有效地获得具有期望性质的Fc变体。
附图简述
图1是膜展示型Fc表达载体的表达框的示意图。图中，IL-2signal sequence为IL2蛋白信号肽；PDGFR TM为PDGFR蛋白的跨膜区；Linker为接头序列；hinge为抗体铰链区；Fc为抗体重链的C段区域，包括CH2和CH3区，以及任选地CH4区。
图2表示表面展示不同Fc分子的293FT细胞，用生物素化FcγRIIB(抗原)、streptavidin-PE和anti-FLAG-FITC抗体染色并进行流式分析的图。
图3A表示，以FcγRIIIA(F158)驱动的突变库1-4的第一轮分选的流式图。图3B表示，在第一轮分选的细胞增殖后的细胞染色和流式分析图。图3C表示，对突变库1、突变库2、突变库3经过两轮FcγRIIIA(F158)分选之后的增殖细胞，分别用FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)进行染色和流式分析的图；以及，对突变库4经过一轮FcγRIIIA(F158)分选之后的增殖细胞，分别用FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)进行染色和流式分析的图。
图4表示，与未经过分选的原始库比较，经过FcγRIIIA(F158)染色并流式分选之后的突变库2、突变库3、突变库4的二代测序结果。横轴表示库中所含有序列的种类计数，纵轴表示相应序列占总序列条数的累计情况。
图5表示，与未经过分选的原始库比较，在经过FcγRIIIA(F158)染色并流式分选之后的突变库2、突变库3、突变库4中，通过二代测序检测到的相应突变区域的氨基酸富集程度。
图6表示，相对于野生型Fc，筛选获得的一些突变体在FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)以及FcγRIIB的结合强度上的变化。所述突变体为，经过FcγRIIIA(F158)富集之后，在突变库2、突变库3、突变库4中出现的一些高频Fc突变体。通过表面等离子共振进行结合强度的测量。
图7表示，利用表面等离子共振测量(图7A)和利用基于细胞的试验测量(图7B)，与野生型Fc(WT)相比，Fc变体在FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、以及FcγRIIB的结合强度上的变化。所述Fc变体为图6中选择的突变库2和突变库4的突变的组合。
图8A-C表示，在人外周血单核细胞上测量的、在Fc区包含突变的抗体的ADCC效应，其中检测的抗体在Fc区含有图7中的组合突变。
图9A表示，突变库1、突变库2、突变库3、突变库4经过每轮FcγRIIB分选和增殖之后，分别用FcγRIIB进行染色和流式分析的图。图9B表示，经FcγRIIB二轮富集后的突变库2和突变库4分别用FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)进行染色的流式细胞分析图。
图10表示，经过两轮FcγRIIB分选之后，突变库2分别用FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)进行染色和负筛选的流式细胞图。
图11表示，经过两轮FcγRIIB分选之后，突变库4分别用FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)和FcγRIIA(R131)进行染色和负筛选的流式细胞图。
图12表示，经过四轮FcγRIIB染色和流式分选的突变库1和突变库3，以及经过两轮FcγRIIB染色和流式分选的突变库2和突变库4，与未经过分选的原始库，在二代测序结果上的比较。横轴表示库中所含有序列的种类计数，纵轴表示相应序列占总序列条数的累计情况。
图13表示，突变库1、突变库2、突变库3、突变库4经过FcγRIIB染色和流式分选之后，通过二代测序，与未经过分选的原始库之间，在相应突变区域的氨基酸富集程度上的比较。
图14表示，先经过两轮FcγRIIB染色和流式分选，再经过负筛选之后的突变库2和4，与未经过分选的原始库，在二代测序结果上的比较。横轴表示库中所含有序列的种类计数，纵轴表示相应序列占总序列条数的累计情况。
图15表示，突变库2先经过两轮FcγRIIB染色和流式分选，再分别经过FcγRIIIA(F158)或FcγRIIIA(V158)负筛选之后，通过二代测序，与未经过分选的原始库之间，在相应突变区域的氨基酸富集程度上的比较。
图16表示，突变库4先经过两轮FcγRIIB染色和流式分选，再分别经过FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)负筛选之后，通过二代测序，与未经过分选的原始库之间，在相应突变区域氨基酸富集程度上的比较。
图17表示，在实施例11中，经过FcγRIIB正筛和/或后续负筛后突变库1-4中出现的一些高频Fc突变体，与野生型Fc(WTFc)相比，在表面等离子共振测量中，显示出的FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)以及FcγRIIB的结合强度变化。
图18表示，包含图17中的突变库2和突变库4突变组合的Fc变体，与野生型Fc(WT)，通过表面等离子共振测量，在FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)以及FcγRIIB结合强度上的变化。
图19A和B表示，含有不同Fc变体的CD40激动型抗体或4-1BB激动型抗体对于Jurkat-CD40细胞系或Jurkat-4-1BB细胞系的激活程度。
图20显示，用于实施例中的慢病毒表达载体pCDH的质粒图谱。
图21A-B显示，天然人IgG1恒定区的序列以及根据EU编号系统进行的氨基酸编号。
图22A-B显示，用于制备Fc突变文库的引物的序列。
图23显示,用于实施例中Fc多肽表达的载体pFUSE的质粒图谱。
图24显示，用于实施例中Fc变体构建的亲本人IgG1 Fc区的氨基酸序列(SEQ IDNo:1)和编码核苷酸序列(SEQ ID No:2)。
图25A-C显示，由含有野生型Fc区或含有不同Fc区变体的CD40激动型抗体介导的细胞激活效应。
图26显示，以去岩藻糖细胞CHO作为展示平台，对展示在细胞表面的Fc多肽的受体FcγRIIIA结合荧光信号的影响。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1：用于构建实施例Fc变体的亲本人IgG1 Fc区的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：编码亲本人IgG1 Fc区序列(SEQ ID no:1)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:3：IL2蛋白信号肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4：PDGFR蛋白跨膜区的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5：FLAG标签的氨基酸序列。
SEQ IID NO:6:赫赛汀的VH-CH1的序列
SEQ ID NO:7：赫赛汀的轻链序列：
SEQ ID NO:8：Rituximab的VH-CH1的序列
SEQ ID NO:9：Rituximab的轻链序列
SEQ ID NO:10：CD40激动型抗体重链的氨基酸序列(具有野生型hIgG1 Fc区)
SEQ ID NO:11：CD40激动型抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：Utomilumab激动型抗体重链的氨基酸序列(具有野生型hIgG1 Fc区)
SEQ ID NO:13：Utomilumab激动型抗体轻链的氨基酸序列。
发明详述
除非明确指明相反，否则本发明的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。这些方法的描述可以参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版,2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新)；ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,GreenePub.Associates和Wiley-Interscience；Glover,DNACloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1998)Current Protocolsin Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊专著如Advances in Immunology。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项的任意两项或多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述及的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的多肽时，也旨在涵盖由该具体序列组成的多肽。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，该区域不包括重链恒定区CH1。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。通常，免疫球蛋白的两条相同重链的二聚化通过CH3结构域的二聚化来介导，并且通过将CH1恒定结构域连接至Fc恒定结构域(例如CH2和CH3)的铰链区中的二硫键来稳定。因此，在本发明中，Fc区可以是IgA、IgD和IgG的最后两个免疫球蛋白恒定区、或IgE和IgM的最后三个免疫球蛋白恒定区，以及任选地这些恒定区N末端方向上的铰链区。
在本发明中，在一个实施方案中，Fc区包含CH2和CH3结构域。在优选实施方案中，Fc区还包含铰链区的氨基酸残基。在一个实施方案中，Fc区是人IgG重链Fc区，从重链的Glu216延伸至羧基端，其中位于Fc区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。在再一实施方案中，Fc区优选包括完整的IgG铰链区(EU编号位置216-230)，并且通过所述铰链区的二硫键形成二聚体。在一个实施方案中，形成Fc二聚体的两条链分别包含部分或全部的铰链区和CH2和CH3结构域。
在本文中，术语Fc区包括天然序列Fc-区和变体Fc区。在一个实施方案中，Fc区可以是来自任何IgG的Fc区，优选是哺乳动物或人的IgG Fc区，例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4Fc区。在一个实施方案中，人IgG1的Fc区的氨基酸序列起始于铰链区并终止于CH3区的羧基末端，如图21中所示。天然或野生型人IgG1 Fc区在本文中旨在涵盖这些天然等位基因形式。
在本文中，Fc区可以是分离的该区域，或者在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这一区域。
在本文中，除非另外指出，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统进行，如Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述。该文献描述该编号系统的部分并入本文作为参考。关于Fc区或恒定区的EU编号，也可以从EU编号查询网站：http://www.imgt.org/ IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html容易地获得。在本文中，根据该编号系统，述及抗体IgG恒定区的特定氨基酸残基。例如，“I332”是指位于EU位置332的异亮氨酸。在恒定区特定位置的氨基酸突变用(原始氨基酸,氨基酸位置,突变氨基酸)来表示。例如，“I332E”是指，位于EU位置332的异亮氨酸(I)被谷氨酸取代(E)。当述及突变组合时，组合的突变之间用加号(+)连接。“K326I+I332E”表示Fc区同时包含突变K326I和I332E。当在一个特定位置可以具有多种突变可能性时，在本文中，通过符号“/”来表示。例如，突变“K326I/S”表示326位的残基K可以替代为I或S残基。
“Fc蛋白”或“Fc多肽”在本文中可互换使用，用于指包含Fc区的蛋白或多肽。此外，根据表述所用的上下文，可以理解，该表述也可以指基本上由Fc区组成的多肽、或由Fc区组成的多肽。
在一个实施方案中，Fc蛋白是展示在细胞膜外表面上的Fc多肽。优选地，在本发明中，通过包含编码在细胞膜表面上展示的本发明Fc蛋白的载体，将Fc蛋白展示在细胞膜外表面。在一个实施方案中，载体是病毒载体，优选慢病毒载体。在一个实施方案中，将包含编码Fc蛋白的多核苷酸的载体引入哺乳动物细胞，并在适于表达Fc蛋白编码核酸的条件下培养所述哺乳动物细胞，从而产生在细胞表面展示Fc蛋白的哺乳动物。
在再一个实施方案中，Fc蛋白是不与细胞膜结合的、包含铰链区和CH2和CH3区的可溶性蛋白。
在本文中，“Fc区变体”与“变体Fc区”可以互换使用，是指相对于修饰前的Fc区(即，亲本Fc区)，在Fc区的任何位置上引入了一个或多个氨基酸修饰(即，氨基酸替代、缺失和/或插入)的Fc区。在一些实施方案中，亲本Fc区是天然免疫球蛋白Fc区，即野生型Fc区。在另一实施方案中，亲本Fc区是在野生型Fc区中已经引入了突变的Fc区。在一个实施方案中，亲本Fc区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在再一实施方案中，亲本Fc区包含与SEQ IDNO；1具有至少85％，90％，91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或以上的百分比序列同一性。在一些实施方案中，亲本Fc区是在野生型Fc区例如SEQ ID NO:1中引入了改变Fc性质的氨基酸突变的氨基酸序列，其中所述的Fc性质可以选自，包括但不限于，与特定Fc受体的结合亲和力，Fc的异二聚化，Fc的糖基化模式。所述氨基酸突变可以是本领域已知的或通过本发明筛选方法获得的突变。在本发明方法中使用此类亲本Fc区在一些情况下可能是期望的，例如，当期望对某种Fc性质作进一步改善、或叠加多种不同Fc性质时。
在本文中，“Fc变体蛋白”，“Fc变体多肽”，和“Fc变体”可互换使用，指包含了变体Fc区的多肽。本发明的细胞表面展示方法可以用于展示和筛选Fc变体蛋白。本发明的”哺乳动物细胞展示Fc突变文库“为包含了多数个在细胞表面展示不同Fc变体蛋白的哺乳动物细胞的细胞集合。
“Fc配偶体”在本文中是指，可以与抗体Fc区结合并形成Fc/Fc配偶体复合物的任何分子，例如来自生物体的蛋白或多肽。Fc配偶体包括但不限于FcγRIs,FcγRIIs,FcγRIIIs,FcRn,C1q,C3,甘露聚糖结合性凝集素,甘露糖受体、蛋白A，蛋白G和病毒FcγR。Fc配偶体也包括Fc受体同源物(FcRH)。FcRH是与FcγR同源的Fc受体(Davis等,2002,Immunological Reviews 190:123-136,该文献并入本文作为参考)。优选，Fc配偶体是FcRn和FcγR。在本申请中，在本发明Fc变体筛选方法的大多数实施方案中，采用FcγR作为例子进行描述，但是如本领域技术人员明了的，在这些实施方案中，可以采用其他Fc配偶体替代示例性FcγR进行。
在本文中，“Fc受体”可以是与抗体Fc结合的任何Fc受体，包括但不限于Fcγ受体和FcRn受体。
已知对于IgG抗体存在3类人Fcγ受体(FcγR),FcγRI,FcγRII和FcγRIII。这3类受体可以分为亚型，包括FcγRIA,FcγRIB,FcγRIIA,FcγRIIB,FcγRIIC,FcγRIIIA和FcγRIIIB。此外，已经发现几种具有不同的IgG亚型结合能力的等位基因变体，例如FcγRIIIA-F158和FcγRIIIA-V158；和FcγRIIA-H131和FcγRIIA-R131。
所有FcγR均结合IgG Fc上的同一区域——铰链区与CH2交界处，但亲和力不同，例如FcγRI是高亲和力结合性受体，而FcγRII和III是低亲和力结合性受体。抗体与FcRn的结合位点位于CH2和CH3交界处。
在哺乳动物中，体液免疫大多数通过抗体Fc区与C1q的相互作用以及补体级联来介导。而细胞免疫反应大多数由抗体Fc区与Fcγ受体的相互作用来介导。FcγRI,FcγRIIA,FcγRIIIA和FcγRIIIB为激活性FcγR。而FcγRIIB为抑制性FcγR。激活性受体的细胞内信号传导由受体的胞内ITAM基序的磷酸化介导，这导致效应子功能如ADCC,ADCP、以及通过诱导细胞因子释放引起的炎症反应。抑制性受体FcγRIIB的细胞信号传导通过受体胞内的ITIM基序的磷酸化介导，起到平衡激活性信号传导途径的作用。抗体与FcγR和C1q的相互作用主要取决于铰链和CH2氨基酸序列以及CH2区的糖基化。
在一个方面中，因此，本发明涉及，使用本发明哺乳动物细胞展示Fc突变文库筛选Fc变体的用途，其中所述Fc变体具有精细调节的Fc/Fc受体结合性质，从而具有改善的抗体性质，例如改善的效应子功能。
在此方面，本发明的一个实施方案涉及改变基于FcγR的效应子功能。例如，在一个实施方案中，本发明涉及Fc区变体及其筛选方法，其中相对于野生型Fc区，所述Fc区变体对FcγRIIIAF158和/或V158具有增强的结合能力，并优选地改善的ADCC活性，例如增强的ADCC活性和/或更大的ADCC反应人群(即，人群中有更大比例的个体对包含该Fc变体的抗体产生反应)。再一实施方案中，本发明涉及Fc区变体及其筛选方法，其中相对于野生型Fc区，所述Fc区变体对FcγRIIB具有增强的结合能力。在再一实施方案中，本发明涉及Fc区变体及其筛选方法，其中相对于野生型Fc区，所述Fc区变体具有改变的FcγRIIB与FcγRIIIA结合比值。在一个优选的实施方案中，相对于野生型Fc区，所述Fc区变体具有增强的FcγRIIB结合并同时对FcγRIIIA具有基本相当或减低的结合能力。在一个优选的实施方案中，包含所述Fc区变体的抗体表现出增强的细胞激活效应，优选地还表现出降低的ADCC活性。
在本发明的再一方面涉及改变Fc区对新生儿Fc受体(FcRn)的结合能力。FcRn在IgG的细胞运输和血清半衰期方面具有重要作用。在一个实施方案中，因此，本发明涉及Fc区变体及其筛选方法，其中相对于野生型Fc区，所述Fc区变体对FcRn具有改变的结合，并由此具有改变的循环半衰期。
在再一方面，本发明涉及在改变FcRn结合和相应的抗体半衰期的情况下进一步改造Fc与FcγR的亲和力。在一个实施方案中，因此，本发明涉及具有改变的FcRn结合能力和改变的FcγR结合能力的Fc区变体及其筛选方法，其中所述Fc区变体优选具有增强的半衰期并同时具有改善的效应子功能。
在本文中，“抗体”是指包含重链和/或轻链可变区的蛋白质，例如全长抗体、或抗体片段如单链scFv抗体,Fab,F(ab)2’,Fab’。优选地，本发明的抗体还包含Fc区，所述Fc区可以是天然Fc区或包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的Fc区变体，优选Fc区变体。在一个实施方案中，抗体是包含重链和轻链的全长抗体，其中Fc区通过铰链区与重链可变区VH和CH1连接。在另一个实施方案中，抗体由抗体片段与Fc区连接形成。在一个实施方案中，所述抗体片段是scFv，其中scFv通过铰链区与Fc区连接。
“Fc融合蛋白”在本文中指包含与其它多肽融合的Fc区的蛋白质。其它多肽可以是能够特异性结合靶分子的多肽，例如免疫球蛋白多肽，例如可以与靶分子结合的抗体的重链和/或轻链可变区，或可以与靶分子结合的受体的可溶性部分。因此，抗体例如scFv-Fc形式的抗体和免疫融合物属于Fc融合蛋白的范畴。
术语“效应子功能”是指，可归因于抗体的Fc-区的那些生物活性，其随抗体类别而改变。已知存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgGFc区可以介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)、以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。在一些情况下，取决于治疗目的，这些效应子功能对于治疗性抗体是理想的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至是有害的。因此，在一个实施方案中，本发明提供在Fc区中具有氨基酸残基改变从而改变了抗体效应子功能的变体Fc区及其筛选方法。例如，可以在抗体的Fc区中替换至少一个氨基酸残基，从而改变抗体的效应子功能。
“ADCC”是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。ADCC在人体中主要由自然杀伤细胞(NK细胞)介导。在ADCC中，抗体与靶细胞表面上展示的抗原结合，NK细胞表面的FcγRIIIA识别抗体的Fc区，从而NK细胞被激活，释放穿孔素和颗粒溶解酶，导致靶细胞的裂解和凋亡。
评价目标分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于US5,500,362(也可以参见，例如Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(也可以参见Bruggemann，M.等，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者，可采用非放射性测定方法(例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.MountainView，CA)和非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可以在体内评价目标分子的ADCC活性，例如，在如Clynes，R.等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评价。
“CDC”是指补体依赖性细胞毒性。在CDC中，抗体的Fc区与补体分子C1q结合，继而形成膜攻击复合物，导致靶细胞的清除。参见，例如Liszewski和Atkinson,ch.26,Fundamental immunology,第3版,Paul编，Raven Press,New York,1993,pp917-940。
“ADCP”是指抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。在Fc受体介导的该过程中，与抗体结合的靶细胞被吞噬细胞例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突细胞所吞噬。多种Fc受体可以参与该过程。Richards等,Mol.Cancer Ther.7(8):2517-2527(2008)描述了用于ADCP的体外试验。
“标记”或“标记物”在本文中指可以用于本发明的直接或间接标记目的的可检测物质。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；合适的放射性物质的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
“细胞膜锚定区间”和“膜锚定物”在本文中可以互换使用，指能够使包含该区域的多肽或蛋白质跨越并锚定在细胞膜上的氨基酸序列。优选所述细胞膜锚定区间是跨膜结构域或跨膜区。
“感染复数”(MOI)是指每个细胞感染病毒颗粒的数量。
在本文中，“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列同一性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
以下就本发明筛选平台的各个方面，分别进行描述。
I..构建哺乳动物细胞Fc多肽展示系统
在一个方面，本发明提供哺乳动物细胞展示系统，所述展示系统是由多数个在表面展示Fc多肽的细胞克隆组成的细胞文库；优选地每个细胞克隆分别展示一种不同的Fc多肽；优选地文库的库容量达到1-5x105。但是，本发明也可以在含有更多或更少文库成员的展示文库上进行筛选。
为了构建本发明的哺乳动物细胞展示文库，可以用编码多种不同Fc多肽的核酸汇集物(在本文中，也称作Fc变体文库)，转化哺乳动物细胞；在允许Fc多肽在细胞克隆中表达并在其表面展示的条件下，培养所述哺乳动物细胞。
如实施例所证实，利用本发明展示系统，哺乳动物细胞膜组分的空间位阻不实质性影响Fc区的功能性展示以及Fc区与目的Fc受体的结合。
在文库细胞成员表面展示的Fc多肽
在本发明中，在哺乳动物细胞上表达和展示的多肽为包含Fc区的多肽(在本文中，也称为Fc多肽)。在一个实施方案中，Fc区为来自免疫球蛋白的Fc区，包含铰链区、CH2区和CH3区中的至少一个或多个。可以将序列多样性引入Fc区的铰链区、CH2区和/或CH3区。可以从引入了序列多样性的Fc区展示文库中筛选具有改变的Fcγ受体亲和力和/或特异性的Fc变体，这样的Fc变体可以赋予例如改变的效应子功能。或者也可以从该展示文库中筛选对FcRn具有增加或降低的相互作用的Fc变体，这样的Fc变体可以用于与例如抗体可变区融合以改变其在施用后的半衰期。
为了在细胞表面展示，Fc区变体多肽编码核酸可以与编码前导序列的DNA融合以允许通过内质网(ER)分泌，并与膜锚定物融合以允许Fc变体多肽固定在细胞表面上。
在本发明中，因此，在一个实施方案中，用于构建展示文库的本发明Fc变体多肽为一种Fc融合多肽，由N端至C端包含：
-分泌性信号序列，优选信号序列为可以引导Fc区多肽分泌出细胞的信号肽，例如，IL-2蛋白信号肽；
-任选地，标签序列，优选标签序列为表位标签序列，例如HA表位标签，Flag标签序列，c-myc表位标签；
-Fc区变体多肽，所述Fc区优选来自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4的Fc区以及不同的同种型形成的嵌合体，更优选人IgG1 Fc区，最优选为SEQ ID No:1中所示的人IgG1 Fc区多肽的变体，例如所述变体包含1-10个突变，如1，2，3，4或5个突变；
-膜锚定物，优选跨膜结构域；其中所述跨膜结构域将Fc区锚定在细胞膜表面，优选跨膜结构域来自哺乳动物细胞表面表达的膜结合型蛋白质，例如PDGFR蛋白的跨膜区，例如SEQ ID NO:4所述的跨膜区序列；
在该Fc多肽中，优选，Fc区变体与标签序列和跨膜结构域可操作地连接，优选地利用接头，例如短的柔性接头序列，共价连接。在一个实施方案中，标签序列连接在Fc区变体的N端，在再一实施方案中，标签序列连接在Fc区变体的C端且在跨膜区的N端。
Fc区变体
在本发明的展示系统中，在一个实施方案中，用于展示的Fc区包含CH2和CH3区，优选地还包含(全部或部分的)铰链区，或由其组成。在另一实施方案中，展示的Fc多肽还包含抗体重链的VH-CH1区或CH1连接在Fc区N端。在再一实施方案中，展示的Fc多肽优选地不包含抗体重链的VH区，且不包含抗体重链的CH1区。在一些实施方案中，铰链区可以与CH2和CH3区来自相同或不同的IgG类型，例如均可以来自IgG1；或者铰链区可以来自IgG2或IgG3，而CH2和CH3区可以来自IgG1或IgG4型。
在一个实施方案中，在Fc区引入的突变可以是一个或多个氨基酸的替代、缺失或添加，优选氨基酸的替代。突变可以集中于一个特定的区域，或多个例如两个特定区域。例如，可以在经本发明方法鉴定为对目的FcγR受体的结合具有显著影响的两个或多个突变区域和/或突变位置，引入突变；也可以向Fc上某区域引入随机突变，例如用5个连续随机氨基酸替换Fc中4个氨基酸。或者，可以通过将Fc中的一段氨基酸序列替代为另一段更长或更短的氨基酸序列，来引入突变。
在本发明中，本发明Fc区变体通过在亲本Fc区上引入突变而构建。在一些实施方案中，亲本Fc多肽是天然Fc多肽(即，野生型Fc多肽)。在另一些实施方案中，亲本Fc多肽是相对于野生型Fc多肽已经包含了突变的Fc多肽。
在本发明中，在一个优选实施方案中，自亲本Fc多肽构建Fc变体文库，其中可以向预定的突变区/突变位置引入突变，也可以随机向亲本Fc区引入突变，以形成Fc变体文库。因此，在一方面，本发明的筛选方法在展示“亲本Fc多肽”的变体的细胞克隆群体上进行。相应地，在一方面，本发明提供了哺乳动物细胞Fc展示文库，其中细胞克隆文库成员在细胞表面上展示“亲本Fc多肽”的变体，其中所述变体是相对于亲本Fc多肽而言经修饰的Fc多肽。在一个实施方案中，所述细胞克隆通过如下方式产生：在亲本Fc多肽序列的Fc区的区域/位置上引入突变，将编码变体的核酸序列引入细胞，优选地通过病毒载体引入哺乳动物细胞，从而使该核酸整合在细胞的基因组中。
为了构建Fc变体文库，任选地，可以在引入突变之前，进行亲本Fc多肽序列的生物信息学评估，以提供预期将可能影响目的性质(例如，与特定FcγR的结合性质)的突变区域和/或突变位置。之后，可以根据该生物信息评估，设计突变策略。也可以使用结构建模的方式，辅助鉴定待诱变的氨基酸。
在之前的一些突变分析，已经发现IgG上对FcγR的结合具有关键作用的一些氨基酸位于下铰链区和CH2区(参见例如,Xinhua Wang等,IgG Fc engineering to modulateantibody effector functions,Protein Cell2018,9(1):63-73)。在一些实施方案中，可以将这些氨基酸位置选择为有待引入突变的Fc区突变区域。
此外，人IgG1 Fc与多种FcγR的共晶结构已经报道(FcγRI(PDBID：4W4O)；FcγRIIA(PDBID:3RY6)；FcγRIIB(PDBID:3WJJ)；FcγRIIIA(PDBID:5D6B))，由此允许高分辨作图Fc与FcγR的结合界面。根据结合界面的信息，可以选择待引入突变的Fc区域，例如，将在结合界面上与FcγR相距5埃的Fc区氨基酸位置选择为待引入突变的位置。
此外，已知可以对Fc进行改变以增加或降低其糖基化程度和/或改变其糖基化模式，从而改变Fc对受体的结合性质。对Fc的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。举例而言，可实施一或多种氨基酸取代以消除一或多个糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。因此，在一个实施方案中，可以将可能影响糖基化修饰的Fc区域选择为待引入突变的位置。
在一个优选的实施方案中，为了构建Fc变体文库的多样性，可以按照如下方式选择Fc区的突变区域：
-基于Fc区与目的Fc受体的复合体结构，选取Fc中与FcR靠近的区域，例如5埃之内的区域作为待引入突变的区域；
-具有改变的FcR结合能力的已知Fc变体所在的区域；
-影响糖基化修饰取向的Fc区域
优选，突变区选自：IgG1 Fc上EU编号的第233-238位(ELLGGP)、EU编号的第265-271位(DVSHEDP)、EU编号的第295-300位(QYNSTY)、EU编号的第326-332位(KALPAPI)。
优选地，对于改善FcγRIIIA结合或改善FcγRIIB结合，突变区域选自：EU编号的第265-271位(DVSHEDP)和EU编号的第326-332位(KALPAPI)；更优选EU编号的第326-332位。
可以在上述突变区域中随机地引入1、2、3、或更多个突变；也可以将不同突变区域的突变组合，引入Fc区中来构建突变体文库。
在确定待引入突变的区域和/或位置后，可以采用本领域已知的任何突变引入方法例如核酸诱变方法，产生Fc变体编码核酸序列。一般，核酸诱变可以使用本领域已知的方法进行，例如寡核苷酸指导的诱变(分子克隆：实验室手册，第3版,Russell等,2001,冷泉港实验室出版)。在一个实施方案中，例如，可以向生物信息评估鉴定的氨基酸位置/区域，利用包含例如MNN的简并引物(其中M代表A/C，N代表A/G/C/T)，通过PCR，在编码亲本Fc多肽的DNA中于这些特定位置/区域引入随机突变。
在一些优选实施方案中，在确定待引入突变的区域后，进行单个氨基酸或一个特定区域的1-3个氨基酸的突变扫描。在一个优选的实施方案中，构建随机突变文库用于本发明的展示文库筛选。在再一实施方案中，可以将已经通过本发明方法筛选确定的突变或将本领域中已知的突变作为基础，进行组合诱变，其中序列在多个位置同时改变。
在一些实施方案中，通过PCR装配，使用参考Fc多肽如野生型Fc多肽编码核酸为模板，获得引入了突变的Fc变体多肽编码序列。
标签序列
如本领域技术人员明了的，对于在测量Fc变体与目的FcγR的结合能力(动态结合和平衡结合)时，标化Fc的细胞表面表达水平是重要的。
因此，优选地，展示在细胞膜表面的本发明Fc多肽包含与Fc区融合的标签序列。在一个实施方案中，与Fc变体多肽融合的标签序列可以用作有用的内对照，指示Fc融合多肽在细胞表面的展示情况。例如，可以使用标记(例如荧光标记)的标签序列结合分子(例如抗标签序列抗体)，检测细胞上标签序列的存在，从而独立于Fc多肽与其受体的结合活性，定量细胞表面上Fc多肽的存在。因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括：在分选步骤前，通过标签序列的染色(例如，用与抗标签序列抗体偶联的荧光染色)，以显示Fc多肽的细胞表面展示水平。
标签序列可以放置于Fc区多肽的N端或C端，优选N端。
可以使用的标签序列包括，但不限于，表位标签序列，例如HA表位标签，Flag标签序列，c-myc表位标签。
信号序列
就本发明而言，为了产生分泌出细胞的Fc多肽，编码Fc多肽的核酸可以包括编码“信号序列”或“前导肽”的DNA区段。如本领域已知，信号序列可以指导新合成的多肽抵达并穿过ER膜，在此，多肽进入分泌路线。在蛋白质跨越ER膜期间，信号序列则由信号肽酶切去。就信号序列的功能而言，宿主细胞分泌机器对其的识别是至关重要的。
在一个实施方案中，因此，本发明提供带信号肽的Fc多肽及其编码核酸，其中所述信号肽指导该Fc多肽自哺乳动物细胞中分泌，其中特别地，所述信号肽位于Fc区的N端，优选地可以在信号肽和Fc区多肽之间插入标签序列和/或肽接头。在哺乳动物细胞中所述信号肽优选在加工和运输期间从Fc融合多肽上切下。
指导蛋白质抵达哺乳动物细胞分泌途径的信号肽通常是本领域已知的并且例如公开于Nielsen等人，Protein Engineering 10(1997)1-6中。在一个实施方案中，信号肽源自分泌型或I型跨膜蛋白。在一个实施方案中，信号肽源自分泌型蛋白，如细胞因子家族成员(例如白介素2，IL-2)，血清蛋白家族成员(白蛋白、转铁蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白)、胞外基质蛋白(胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖)、肽激素(胰岛素、胰高血糖素、内啡肽、脑啡肽、ACTH)、消化酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)或乳蛋白(酪蛋白、乳白蛋白)。在一个实施方案中，信号肽源自免疫球蛋白，特别是抗体重链或轻链，如Igκ轻链信号肽。在一个实施方案中，信号肽是人IL-2信号肽，优选SEQ ID NO:3所示的信号肽序列。
膜锚定物
展示文库的一个特征在于，Fc蛋白在细胞表面的停留，由此可以在细胞展示的Fc蛋白与细胞包含的编码DNA之间建立物理联系。基于此物理联系，可以在物理分选分离表达具有期望性质的Fc蛋白的细胞的同时，实现相应的编码DNA的获取。
为了实现Fc蛋白在细胞表面的停留，可以使用多种方式，包括但不限于，与膜锚定物，例如跨膜结构域如PDGF受体的跨膜结构域直接融合，或者与GPI识别序列直接融合。
在一个实施方案中，为了产生Fc变体的哺乳动物展示文库，表达膜结合形式的Fc区多肽。
在一些实施方案中，所述膜结合形式的Fc区多肽由Fc区多肽在C末端融合至跨膜结构域而形成，任选地，所述连接通过连接序列(例如，柔性接头)来实现。所述跨膜结构域能使Fc区多肽锚定在细胞膜表面。
跨膜结构域通常包含三个不同的结构区：N端胞外区、中间保守的跨膜区和C端胞质区。在一个实施方案中，用于形成本发明Fc多肽的跨膜结构域仅由跨膜区组成。在一个实施方案中，跨膜结构域以N末端至C末端方向包含胞外区和跨膜区。在再一实施方案中，跨膜结构域可以额外地包含胞内区或胞质区。
在带有跨膜区的Fc蛋白中，优选地，跨膜区位于Fc区的C端，即Fc CH3的C端，并且在Fc蛋白分泌出细胞时能够导致Fc保持结合在细胞的外表面。
在一个实施方案中，跨膜区源自整合型膜蛋白。
在一个实施方案中，跨膜区是源自I型跨膜蛋白(Do等人,Cell 85(1996)369-78；Mothes等人,Cell 89(1997)523-533)如细胞黏附分子(整联蛋白、黏蛋白、钙黏着蛋白)、凝集素(唾液酸黏附素、CD22、CD33)或受体酪氨酸激酶(胰岛素受体、EGF受体、FGF受体、PDGF受体)的内在停止转移膜锚定序列(internal stop-transfer membrane-anchorsequence)。
在一个实施方案中，跨膜区是人G类膜结合型免疫球蛋白的跨膜区。
在一个实施方案中，跨膜区源自受体酪氨酸激酶，更特别地源自人血小板衍生生长因子受体(hPDGFR)、最特别地源自hPDGFR B链(登录号NP002600)。
在一个实施方案中，跨膜区源自人PDGFRβ链。在一个实施方案中，跨膜区包含SEQID NO:4的序列或基本相似的序列(例如同一性至少90％或95％或99％以上的序列)，或由其组成。
也可以例如通过GPI连接，实现Fc多肽在细胞膜中的锚定(Moran和Caras,TheJournal of Cell Biology115(1991)1595-1600)。因此，在另一些实施方案中，Fc多肽也可以通过与GPI-锚信号肽融合来实现细胞表面的展示。“GPI-锚”在本申请中指，与多肽或蛋白质的C末端连接的翻译后修饰。“GPI-锚”具有包含至少一个磷酸乙醇胺残基、三甘露糖苷、氨基葡萄糖残基和肌醇磷脂的核心结构。术语“GPI-锚信号肽”指多肽或蛋白质的C末端氨基酸序列，所述C末端氨基酸序列由GPI-锚可以与之结合的一个氨基酸、任选的间隔序列肽和一个疏水肽组成。该信号肽的几乎全部，即任选的间隔序列肽和疏水肽，在翻译后将被酶GPI-氨基转移酶移除，并且在GPI-锚的核心磷酸乙醇胺的氨基和GPI-锚所结合的氨基酸之间形成键。
接头序列
在本发明的Fc多肽中，Fc区变体与标签序列和跨膜结构域可操作地连接。在一个优选实施方案中，Fc区变体直接或优选通过接头，例如短的柔性接头序列，与标签序列和/或跨膜结构域融合。
可以用于本发明中的接头序列优选是由肽键连接的氨基酸残基组成的柔性连接肽或肽接头。这样的肽接头通常富含表现柔性的甘氨酸以及表现溶解性的丝氨酸或苏氨酸。例如可以单独或组合使用甘氨酸和/或丝氨酸残基。柔性肽接头的非限定性例子公开于Shen等人，Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)、WO2012/138475和WO2014/087010，将其内容全文并入作为参考。
在一些实施方案中，肽接头由氨基酸残基组成，所述氨基酸选自二十种天然氨基酸。在某些其他实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个优选实施方案中，一个或多个氨基酸选自Gly,Ser,Thr,Lys,Pro,和Glu。
在一些实施方案中，接头的长度是约1-30个氨基酸、或约10个至约25个氨基酸、约15个至约20个氨基酸或约10个至约20个氨基酸或者任意介于中间的氨基酸长度。在优选实施方案中，接头具有15-25个氨基酸残基长度，在更优选实施方案中，具有15-18个氨基酸残基的长度。在一些实施方案中，接头的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个氨基酸。在一个实施方案中，Fc区通过接头连接标签序列，所述接头优选为3-10个氨基酸，更优选5个氨基酸长度。在又一实施方案中，Fc区通过接头连接跨膜区，所述接头优选为15-30个氨基酸长度，更优选20-25个，例如23个氨基酸长度。
可以用于本发明的肽接头的实例包括：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n是至少1、2、3、4或5的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。本领域技术人员可以理解，在一些实施方案中，接头可以完全由柔性连接肽组成，或者接头可以由柔性连接肽部分以及赋予较小柔性结构的一个或多个部分组成。在一个实施方案中，用于连接Fc区和标签序列的接头具有序列GGGGS。在又一实施方案中，用于连接Fc区和跨膜区的接头具有序列GGGGSGSTSGSGKPGSGEGSTKG。
在一个实施方案中，肽接头是Gly/Ser连接肽。在一个实施方案中，肽接头是(GxS)n接头，其中G＝甘氨酸、S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8、9或10)或(x＝4和n＝6、7或8)，在一个实施方案中，x＝4，n＝6或7。在一些实施方案中，接头可以包括氨基酸序列(G4S)n，其中n是等于或大于1的整数，例如，n是1－7的整数。在一个优选实施方案中，x＝4，n＝7。在一个实施方案中，接头是(G4S)3。在一个实施方案中，接头是(G4S)4。在一个实施方案中，接头是(G4S)6G2。
其它示例性接头包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP(参见，例如，Liu等人,PNAS5525-5530(1997))；GGRR(Pomerantz等人.1995,同上)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(Kim等人,PNAS 93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人,1988,Science242:423-426)，GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；LRQKD(GGGS)2ERP。可选地，可以使用计算机程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS91:11099-11103(1994))，或者通过噬菌体或酵母展示方法，合理地设计柔性接头。
用于将Fc变体序列文库引入哺乳动物的载体系统
在获得Fc变体文库后，可以通过本领域已知的任何方式，包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射等，将Fc变体文库编码核酸导入哺乳动物细胞，由此形成哺乳动物细胞文库，其中文库中每个细胞克隆表面展示Fc变体多肽。
将外来核酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域是已知的。例如，可以使用载体(包括，但不限于病毒载体、质粒载体)，转染哺乳动物细胞来实现所述导入。为了在哺乳动物细胞表面上展示Fc变体多肽以及实现之后的筛选，优选Fc变体多肽编码核酸在通过载体引入细胞中后，整合在宿主细胞基因组中。
适用于将Fc区变体引入哺乳动物的病毒载体可以是本领域已知的任何适宜的病毒载体，例如包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等，优选慢病毒载体。
载体通常可以包含插入外源编码序列的限制性位点。在一个实施方案中，可以采用标准分子克隆方法，在编码序列两端通过引物引入限制性位点，以允许按确定的方向将编码序列连接入病毒(尤其是慢病毒)表达载体中。在一个实施方案中，限制性位点彼此不同，并且它们中的至少一者产生单链突出端(“粘末端”)，由此允许定向克隆。
载体可以编码选择性标记基因，例如G418、潮霉素、嘌呤霉素等抗体基因。由此，以在外源核酸导入宿主细胞后，利用选择标记基因，选择稳定转染的细胞系。
为了驱动插入的外源核酸在宿主细胞中的表达，载体可以包含启动子。在一个实施方案中，通过选择不同强度的启动子，可以调节外源核酸编码多肽在细胞表面的展示水平，以利于基于亲和力的Fc变体筛选。
可以用于本发明的载体的一个示例性例子是慢病毒表达载体，例如，如图20所示的pCDH载体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选Fc区变体的方法，所述方法包括构建哺乳动物细胞Fc多肽展示系统，所述构建包括步骤：
提供在细胞表面展示经修饰的Fc区多肽的哺乳动物细胞文库，其中所述细胞文库包含展示Fc变体文库的哺乳动物细胞的集合，其中每一哺乳动物细胞优选展示不同的经修饰的Fc区多肽；
其中，利用病毒载体(优选慢病毒载体)，构建所述的哺乳动物细胞展示文库，其中病毒载体包含表达盒，所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子编码从N端到C端方向包含如下序列的多肽：
-任选地，分泌性信号序列，优选信号序列为可以引导Fc区多肽分泌出细胞的信号肽，例如，IL-2蛋白信号肽；
-任选地，标签序列，优选标签序列为表位标签序列，例如HA表位标签，Flag标签序列，c-myc表位标签；
-Fc区变体多肽，优选IgG1,IgG2,IgG3,IgG4的Fc区，更优选人IgG1 Fc区，最优选SEQ ID No:1中所示的人IgG1 Fc区多肽的变体，例如包含1-10个突变，如1，2，3，4或5个突变；
-膜锚定物(优选跨膜结构域)；其中所述跨膜结构域将Fc锚定在细胞膜表面，优选跨膜区来自哺乳动物细胞表面表达的蛋白质，例如PDGFR蛋白的跨膜区，例如SEQ ID NO:4所述的跨膜区序列；
优选，Fc区变体通过接头与标签序列和跨膜结构域连接；
优选，该表达盒在启动子，例如诱导性启动子控制下；
优选通过随机化编码Fc区多肽的核酸的至少一个密码子来获得文库的多样性；在一些实施方案中，基于结构分析，选择待引入突变的突变区域以构建变体文库。
在一个优选实施方案中，使用慢病毒载体系统来形成本发明的哺乳动物展示系统。
本领域已知多种慢病毒载体系统。在这些系统中，慢病毒基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)与编码反式作用蛋白的序列分离。由此，载体系统包括包装成分和载体成分。包装成分由病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；而载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点以及在此位点插入的目的基因。
在一个实施方案中，用于本发明的慢病毒载体系统可以包含慢病毒表达载体和包装辅助病毒成分，其中慢病毒表达载体在细胞中不能复制。可以在构建Fc变体文库后，将编码Fc变体的表达盒插入慢病毒表达载体。然后，慢病毒表达载体在包装辅助病毒成分存在下共转染哺乳动物细胞。使用此慢病毒表达系统，可以将Fc表达盒整合到哺乳动物细胞核基因组中。
在本发明的一些实施方案中，与本发明慢病毒表达载体，可以组合使用三质粒包装系统，该包装系统由分别表达gag/pol,Rev,VSV-G(水泡性口炎病毒G蛋白)的三种包装质粒组成。此外，也可以使用其他的慢病毒包装系统，例如五质粒系统(分别提供gag-pro,vpr-pol,VSV-G，Tet-off,tat-IRES-rev表达元件的质粒)。这些慢病毒包装质粒系统可以例如从Invitrogen,Clontech,Didier Trono等处商业购买获得。
在本发明中，在一些实施方案中，使用由如下4个质粒构成的慢病毒载体系统，分别是：
(1)1个具有目的基因的慢病毒表达质粒，即如上所述的表达本发明Fc变体的慢病毒表达载体，其包含病毒包装、转染、稳定整合所需的遗传信息。在该载体中，Fc多肽编码核酸插入两个LTR(长末端重复序列)之间，LTR序列可以促使该编码核酸整合到哺乳动物宿主细胞的基因组中。在一个实施方案中，表达质粒的3’LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
(2)2个包装质粒，其中一个质粒编码Rev，另一个质粒编码Gag和Pol；
(3)1个编码包膜蛋白的质粒，优选包膜蛋白是水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)。
在进行文库筛选前，可以使用慢病毒载体系统如上述的4个质粒共转染哺乳动物细胞，组装产生具有感染性的假病毒颗粒。之后，可以使用收获的感染性病毒颗粒，任选地在浓缩和/或检测病毒滴度后，感染哺乳动物细胞，并筛选细胞表面表达的Fc变体。
Fc多肽在细胞表面的展示
在本发明中，利用本发明展示系统，本发明Fc蛋白在细胞中表达，并向细胞膜转运，并作为膜结合蛋白停留在细胞表面上。
不受理论的限制，在哺乳动物细胞中，Fc蛋白将在细胞内质网ER中合成并进入高尔基器，之后在胞内小泡中向细胞表面转运，小泡与细胞表面融合后，Fc蛋白借助于C末端的跨膜结构域或膜锚定物而停留在细胞表面上，实现细胞外展示。在此过程中，Fc区如果包含铰链区，则可以通过铰链区二硫键装配为二聚体，并以Fc二聚体的形式展示在细胞表面。
在一些实施方案中，本发明表达载体仅表达一种Fc多肽，由此在细胞表面展示Fc同源二聚体。但是，也可以使用包含双顺反子的病毒表达载体，在同一载体上同时表达两种Fc成员或使同一细胞感染两个编码不同Fc变体的病毒，由此在细胞表面上展示不对称的Fc变体二聚体(即，二聚化的Fc多肽中一者和另一者具有不同的序列)。在展示不对称Fc变体二聚体的实施方案中，优选，可以将随机突变引入两种Fc多肽编码核酸的一者中，而保持另一多肽编码核酸不变，例如编码一种特定的野生型Fc多肽，或编码一种特定的含突变的Fc多肽，由此构建Fc变体展示文库，筛选不对称突变的Fc变体二聚体。
哺乳动物细胞
许多包含Fc多肽的药物蛋白，尤其是抗体，在哺乳动物细胞中生产并最终应用于哺乳动物。例如，CHO细胞被用于生产赫赛汀(一种抗HER-2抗体，被批准用于乳腺癌治疗)。在这些抗体和治疗性蛋白的筛选过程中，因此有利的是，利用表现相同或尽可能相近的表达环境和翻译后修饰机制的哺乳动物细胞。这样可以更好地模拟药物生产和应用环境，促进获得在药物生产和应用中有效的Fc变体。而细菌和酵母细胞不同，其不能重现哺乳动物细胞的糖基化、表达和分泌机制。因此，本发明在哺乳动物细胞上的展示在药物开发上具有优势。此外，哺乳动物细胞表面能够展示大文库的能力，也允许直接筛选数万的克隆的结合性质。
在本发明中，适用于本发明筛选方法和展示文库构建的哺乳动物细胞可以是任何来自哺乳动物的细胞或细胞系。例如所述细胞可以是来自小鼠、非人灵长类动物、和人的细胞。或者，所述细胞可以是细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和HEK293细胞，NS0细胞、Vero细胞。
在一个实施方案中，用于构建展示文库的哺乳动物细胞，包含选自以下的细胞或特别地由其组成：(a)BHK细胞，例如BHK21细胞、特别是ATCC CCL-10；(b)Neuro-2a细胞；(c)HEK-293T细胞、特别是ATCC CRL-11268；(d)CHO细胞，例如CHO-K1细胞、特别是ATCC CRL-62；和(e)HEK293细胞，例如293FT细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞是适宜产生高滴度的慢病毒的细胞，例如293FT细胞。
本发明中，筛选也可以在糖基化修饰改造的细胞中进行，例如通过基因手段将哺乳动物细胞的FUT8基因敲除，用这种细胞生产的抗体不含岩藻糖残基，具有很强的ADCC活性，向该细胞中导入Fc变体文库可以筛选同时具有糖基化修饰改造和氨基酸改造的Fc变体。
在一个实施方案中，因此，用于构建展示文库的哺乳动物细胞具有改变的糖基化机器，从而影响在细胞中表达的Fc多肽的糖基化。在一个实施方案中，本发明涉及使用该哺乳动物细胞筛选在此糖基化改变的基础上对目的Fc受体结合亲和力改变的Fc变体。在一个实施方案中，所述的糖基化改变是低或无岩藻糖基化。能够产生去岩藻糖基化或低岩藻糖基化Fc区的细胞系在本领域是已知的。此类细胞的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka，J.等，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)：533-545；US2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是实施例11)；及基因敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；和WO 2003/085107)。再例如，细胞系Ms704、Ms705及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，从而可以在Ms704、Ms705及Ms709细胞系中表达缺乏岩藻糖的抗体。此外，EP 1,176,195也描述了具有功能受破坏的FUT8基因的细胞系，在这类细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖化。备选地，还可使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基；举例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14:5516-23)。
文库容量
本发明的细胞展示文库为多数个细胞克隆的集合，其中每个细胞克隆都包含编码Fc多肽的重组DNA。文库的多样性是由这些克隆编码的不同Fc多肽的数目的函数。文库的每个克隆可以通过将编码Fc多肽的DNA整合在细胞DNA中形成重组细胞而产生(例如，在实施例中，通过使用慢病毒载体，将编码Fc多肽的DNA整合到哺乳动物细胞的基因组中)。在Fc多肽DNA整合在细胞DNA中后，可以培养得到的重组细胞以允许重组细胞的复制，由此从每一个最初形成的重组细胞产生一个细胞克隆。因此，文库中每个克隆来源自整合了供体DNA的一个原始细胞。
在药物开发中，有利的是提供大的多样性文库，以最大化鉴定出符合要求的结合分子的可能性。在本发明中，本发明的哺乳动物展示文库可以包含至少100,103，104,105,106,107个克隆。在一些优选的实施方案中，本发明的文库具有高度的多样性，编码和/或表达至少103、至少104或至少105或至少106种不同的Fc多肽。
分选展示文库成员
一旦获得转导细胞的文库(即展示Fc变体的哺乳动物细胞群体)，可以就细胞表面上展示的Fc区与目的Fc受体的结合能力，选择一个或多个细胞克隆亚群。
通常，选择细胞克隆、或细胞克隆群体包括从文库中物理分离多个细胞克隆。因此，选择典型地包括将文库成员分为一组待收集的细胞克隆群体，和另一组待丢弃的细胞克隆群体。由此，在收集的细胞克隆群体中实现具有期望性质的细胞克隆成员的富集。在本文中，应理解，富集是指具有期望性质的细胞克隆成员在群体中的相对丰度增加。如果需要，可以对收集的细胞群体进行再次选择。
例如，在利用本发明的哺乳动物细胞展示Fc突变文库的筛选方法中，为了从文库中富集对目的FcγR具有特定结合性质的细胞克隆文库成员，可以基于Fc变体的表面展示和Fc变体与目的FcγR的结合，从文库分离细胞克隆。在表达和展示带标签序列的Fc变体多肽的实施方案中，可以用抗标签序列抗体-FITC和目的FcγR-生物素/链霉亲和素-PE，染色细胞，通过FACS基于细胞上的FITC和PE染色强度来分选细胞，以选择细胞克隆亚群。
选择阈值
在选择时，可以设置所要选取的“最高”或“最好”克隆的百分比。例如，在基于亲和力的选择中，可以设置选取的克隆的百分比或分数，其中所述克隆在收集的细胞克隆群体中表现出最高的靶FcγR结合活性，或表现出最低的靶FcγR结合活性。
选择阈值可以由本领域技术人员确定，或者可以基于对选择群体的样本的初步分析来确定。对于富集细胞克隆的正向选择，可以设置为选择表现出期望性质的最高信号水平的克隆，例如，前50％的细胞，前30％、前25％，前20％，前15％，前10％或前5％，例如前0.5-10％的细胞克隆。对于负向选择，可以设置为选择表现出非期望性质的最低信号水平的克隆，例如，前50％的细胞，前30％、前25％，前20％，前15％，前10％或前5％，例如前0.5-10％的细胞克隆。
在一个实施方案中，例如，从收集的细胞群体中，选取在期望性质上具有最高或最佳数值的前10％或前5％克隆，例如前0.5-10％。在一个实施方案中，期望性质是对特定的FcγR受体的结合能力，细胞表面上结合的FcγR受体量是Fc多肽的结合能力的量度。
在再一个实施方案中，例如，从收集的细胞群体中，选取在非期望性质上具有最低数值的前10％或前5％克隆，例如前0.5-10％。在一个实施方案中，非期望性质是对特定的FcγR受体的结合能力，细胞表面上结合的FcγR受体量是Fc多肽的结合能力的量度。
在一个实施方案中，可以相对于细胞上Fc多肽的展示水平来标化与细胞表面展示的Fc结合的FcγR受体量，由此量化该结合能力。例如，在使用荧光标记的靶受体分子驱动的筛选中，该结合活性可以测量为：细胞克隆上结合的该荧光标记的量，相对于Fc展示水平标化后的值。
在一个实施方案中，在分选中，收集展示具有目的FcγR结合能力的Fc多肽的细胞群体，并自收集的群体中选取与该目的FcγR受体的结合能力最高的前0.5-10％细胞克隆(在正向选择中)，或者选取与该目的FcγR受体的结合能力最低的前0.5-10％细胞克隆(在负向选择中)。
选择方法
文库的选择通常可以包括如下步骤：将特定的靶FcγR重组蛋白或FcRn重组蛋白加入文库，从而使得展示在细胞表面的Fc多肽与靶受体分子接触并形成复合物。通过限制加入文库中的靶分子的浓度，可以优先地选出具有高亲和力的Fc多肽。当细胞展示的Fc多肽不结合该靶分子或具有弱结合能力时，细胞将不结合靶受体分子，或将在细胞上结合较少的靶受体分子。由此，可以选出富集了高亲和力Fc多肽展示细胞的细胞群体。
选择过程可以任选地重复。例如，可以使用递减浓度的靶受体分子，以递进地增加选择的严格性和增加高亲和力克隆的富集程度。或者，可以使用不同的靶受体分子，以选择组合具有多种不同的受体分子结合性质的Fc变体。
在一个优选的实施方案中，选择包括基于细胞上结合的靶受体分子的水平，将细胞成员分选到有待收集的群体中，或有待丢弃的群体中。分选门设可以相对于对照细胞(例如展示野生型Fc多肽的细胞)在相同的实验条件下的靶受体分子结合水平来设置。或者，分选门设可以由本领域技术人员根据经验加以确定。在正向选择中，高于门设的细胞成分被收集，相反低于门设的细胞成员被丢弃；相反，在负向选择中，低于门设的细胞成员被收集。在优选的实施方案中，细胞上的靶受体分子结合水平，相对于细胞上的Fc展示水平进行标化。根据该标化后的结合水平予以设置分选门设。
在一个实施方案中，通过双重细胞染色，来检测细胞上的靶受体分子结合水平和细胞上的Fc展示水平。例如，可以使细胞接触标签序列结合分子和目的靶受体分子，进行双重染色，其中标签序列结合分子与靶受体分子使用不同的染料标记(直接或间接标记)。在一个实施方案中，所述的双重染色可以同时进行，或者相继进行，优选同时进行。在所述染色后，可以通过测量细胞上存在的标记的标签序列结合分子的量，来定量细胞上的Fc多肽展示水平；通过测量细胞上存在的标记的目的靶受体分子的量，来定量细胞展示的Fc多肽对靶受体分子的结合水平。在一个优选实施方案中，对细胞进行双重荧光染色，其中使细胞接触以不同荧光标记物标记的标签序列结合分子和目的Fc受体。
在一个实施方案中，可以使用多种不同的FcγR同时或相继地进行文库细胞成员的选择，其中所述选择可以是正选择，也可以是负选择，或可以是对一种FcγR的正选择与对另一种FcγR的负选择的组合，从而获得对特定FcγR(一种或多种)具有期望的结合亲和力的Fc变体。
在一个优选的实施方案中，本发明提供通过本发明方法选择的Fc变体，所述变体相对于野生型Fc，表现出对一种或多种FcγR的改善的亲和力。在进一步优选的实施方案中，所述Fc变体相对于野生型Fc在另一种或多种FcγR上具有不改变的或降低的结合亲和力。
可以使用各种分选技术来筛选本发明的哺乳动物展示文库。例如，可以进行正选择，富集文库成员，即，表达具有期望性质的Fc变体的细胞克隆，或增加此类成员在文库中的丰度或频数；和/或可以进行负选择，从文库中去除特定的文库成员，例如，表达具有不期望性质的Fc变体的细胞克隆，或降低此类成员在文库中的丰度或频数。
分选方法可以是，例如但不限于，流式分选、磁珠分离、以及其他可以实现文库成员富集或淘汰的分离方法。在本发明中，优选采用荧光标记物来染色展示在细胞表面的Fc多肽，并使用流式荧光分选方法进行文库成员的正选择和/或负选择。
每次选择都会在文库的克隆成员上施加一定的进化压力，有利于符合选择标准的文库成员的富集。重复就单一参数性质(例如同一FcγR受体结合能力)进行选择，可以驱动进化朝向有利于该性质出现的方向发展，但是同时也存在导致文库成员在其他性质上出现变化的可能性。
本发明人发现，在本发明的方法中，采用FcγRIIIA-F158进行突变库的筛选，可以获得对FcγRIIIA(F158)和FcγRIIIA(V158)的结合亲和力同时增加的Fc变体。因此，在一个实施方案中，本发明提供筛选对FcγRIIIA(F158)和FcγRIIIA(V158)的结合亲和力同时增加的Fc变体的方法，其中使用标记的FcγRIIIA(F158)驱动筛选本发明的哺乳动物细胞Fc突变体展示文库。
此外，本发明人发现，通过针对特定的一种或多种FcγR进行一轮或两轮的正向富集选择后，针对结构明显不同的另一种或多种FcγR进行负向选择，可以获得协同效应。例如，如实施例中所示，采用FcγRIIB进行正向选择后，在分选的细胞上进行FcγRIIIA的负向选择，可以协同增加具有优势氨基酸和期望的结合性质的Fc变体在文库中的富集。(参见，图13-15)
在进行细胞文库成员选择时，可以以可溶形式提供靶FcγR受体分子来驱动选择的进行。可以对靶受体分子进行标记以利于选择。可以使用直接或间接方式标记靶分子。例如，可以将标记物如荧光染料与靶分子直接融合。或者可以使用带标记物如荧光染料的抗生物素分子，与生物素化的靶分子接触，来间接地标记靶分子。在使用荧光染料的情况下，通过Fc/FcγR的相互作用而与荧光标记的靶分子结合的细胞，可以通过流式细胞术检测并分离。
还可以使用固相分离的方法来进行文库细胞成员的选择。例如，可以将靶受体分子或能够结合靶分子的第二物质固定在固相支持物例如磁珠或琼脂糖珠上，使细胞与靶受体分子和该固相支持物接触。展示与靶受体分子结合的Fc变体的细胞将结合在固相上。通过改变结合和/或洗涤条件的严格性，可以选择性地去除展示的Fc变体无结合能力或结合能力弱的细胞成员。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种筛选Fc变体的方法，所述方法包括：
使用哺乳动物细胞Fc变体多肽展示系统，根据细胞表面展示的Fc区多肽的特性，从哺乳动物细胞文库选择细胞群；任选地，将分选出的细胞进行增殖，并就相同结合性质或不同结合性质，重复该选择；
其中，所述选择包括：
-通过用不同标记(优选荧光标记)的目的Fc受体和标签序列结合分子，染色展示在细胞表面的Fc区变体多肽，其中使用第二标记物标记目的Fc受体，使用第一标记物标记标签序列结合分子；
-(优选通过流式细胞分选)基于细胞上两种标记物的染色强度，选择相对于展示亲本Fc的细胞呈现期望的FcR受体结合能力增强或降低的细胞克隆。
在所述实施方案中，优选地，基于文库细胞克隆成员上第一标记物的染色强度，并与阴性对照细胞进行比较，来确定文库中的Fc展示阳性细胞，其中，阴性对照细胞为例如未经本发明病毒表达载体的转染的对应细胞。在一个实施方案中，第一标记物是具有第一波长的荧光染料，第二标记物是具有第二波长的荧光染料，其中，根据阴性对照在第一波长下的发射荧光设置阈值以确定细胞是否为Fc展示阳性。
在所述实施方案中，优选地，在Fc展示阳性的细胞亚群中，选取细胞表面的目的Fc受体结合活性值最高(在正选择中)或最低(在负选择中)的前0.1-10％细胞克隆。优选地，Fc受体结合活性值为相对于Fc展示水平标化后的值。优选地该结合活性值可以测量为：细胞克隆上结合的第二标记物的量，相对于细胞克隆上结合的第一标记物的量进行标化后的值。
对于Fc区变体，根据突变位置所在的区域和用于驱动选择的具体靶受体分子，用于达到富集需要的选择循环次数可能不同。例如，对于FcγRIIIA或FcγRIIB驱动的Fc变体筛选，在Fc区残基326-332(EU编号)，通过一轮或两轮筛选，可以获得亲和力提升的克隆的良好富集。在一些情况中，对于此类在分选中较为快速出现良好克隆富集的突变区域/位置，通过本发明方法筛选获得阳性Fc变体的几率显著更大。因此，在一些优选的实施方案中，选择这样的突变区域/位置用作Fc变体筛选的候选区域。然而，本领域技术人员也将理解，在一些情况下，为了增加筛选出的Fc变体的多样性，和/或为了精细调节Fc变体与不同Fc受体的结合性质(如结合能力比值)，将不同突变区域/位置的突变进行组合(包括在分选之前组合，或在分选之后组合)，可能是有利的。
流式细胞分选(FACS分选法)
在本发明中，优选通过FACS分选法，分离与目的FcγR或FcRn具有期望结合性质的细胞。在此方面，优选地，通过使用不同荧光染料标记的标签序列结合分子和目的FcγR或FcRn，染色细胞，以指示细胞展示的Fc变体的性质。
可以用于本发明中标记的荧光染料包括，但不限于，：(a)PerCP、别藻蓝蛋白(APC)、(b)德克萨斯红、(c)罗丹明、(d)Cy3、(e)Cy5、(f)Cy5。5、(f)Cy7、(g)Alexa Fluor染料，特别是Alexa 647nm或Alexa 546nm、(h)藻红蛋白(PE)、(i)绿色荧光蛋白(GFP)、(j)叠层染料(tandem dye)(例如PE-Cy5)和(k)异硫氰酸荧光染料(FITC)。
在一个实施方案中，用于标记标签序列结合分子和FcγR或FcRn的荧光染料分别是FITC和PE。
可以通过本领域已知的任何方法，用荧光染料标记标签序列结合分子和目的FcγR分子。例如，可以通过将荧光染料偶联至化合物例如抗标签序列抗体或目的Fc受体上而直接标记该化合物，其中所述偶联可以借助共价结合以及非共价结合实现。备选地，可以通过化合物与包含荧光染料的能与所述化合物结合的第二化合物接触，间接地用荧光染料标记所述化合物。
在一个实施方案中，荧光染料与标签序列结合分子(例如抗标签序列抗体)共价连接。在一个实施方案中，目的FcγR通过直接或间接方式进行荧光标记。直接标记可以是荧光染料与目的FcγR的共价结合。间接标记可以，例如在一个实施方案中，通过使生物素化的目的FcγR与带有荧光染料的亲和素或链霉亲和素接触来实现。
因此，在一个实施方案中，细胞的染色包括：使细胞接触荧光染料标记的抗标签序列抗体、和生物素化的目的FcγR以及荧光染料标记的亲和素分子。
染色后，检测细胞的荧光水平，其中，标签序列结合分子的标记荧光的存在及其水平，表明细胞上Fc的展示及其水平；其中目的Fc受体的标记荧光的存在，表明细胞上Fc变体与目的受体的结合及其结合强度。优选地，所述检测通过流式细胞分选仪进行。可以根据所用的荧光染料和期望筛选的FcγR结合强度，设置细胞分选所用的门设。
在一个优选实施方案中，从构建的Fc突变文库细胞群体选择细胞亚群或单一细胞，包括步骤：
(a)使文库细胞群体的细胞与目的FcγR接触，其中目的FcγR用第二荧光染料标记，其中优选地通过间接方式标记目的FcγR，更优选地使用荧光染料-链霉亲和素分子间接标记生物素化的目的FcγR，其中第二荧光染料特别是PE；
(b)使文库细胞群体的细胞与抗标签序列抗体接触，其中抗标签序列抗体用第一荧光染料标记，其中第二荧光染料与第一荧光染料发射不同波长的荧光，其中第一荧光染料优选是FITC；以及
(c)通过流式细胞术，鉴定细胞上第一荧光和第二荧光的强度，和
(d)分选细胞。
在上述实施方案中，优选地，还包括步骤：
(a‘)构建在细胞表面表达和展示亲本Fc多肽或野生型Fc多肽的第二哺乳动物细胞群；
(b’)通过用第二荧光染料标记目的FcγR和用第一荧光染料标记标签序列结合分子，染色第二细胞群体；
(c’)通过流式细胞术，鉴定第二细胞群的细胞的第一荧光和第二荧光的强度和分布；和
(d’)将第一细胞群与该第二细胞群的第一和第二荧光强度和分布进行比较，以确定FACS分选第一细胞群所用的门设。
在一个实施方案中，在FACS分选中包括未经Fc引入且未染色的细胞作为blank对照，用于指示细胞本身FITC通道和PE通道上的自发荧光。在一个优选的实施方案中，在正筛选中，分选设门时,选取FIFC方向强于该blank对照的细胞群(X轴方向),在此基础上选取PE方向最强的前0.5-1％左右的细胞。在再一个优选的实施方案中，在负筛选中，分选设门时,选取FIFC方向强于该blank对照的细胞群(X轴方向),在此基础上选取PE方向最弱的前0.5-1％左右的细胞。
在又一个实施方案中，借助FACS分选法分离细胞个体后，还可以进一步针对第二、第三和/或第四FcγR的正选择或负选择，优选所述正选择或负选择采用流式细胞分选术进行。
在一些实施方案中，负选择可以包括针对与一种或多种不想要的FcγR结合活性进行的负选择，以便淘汰出，例如相对于参考Fc多肽如野生型Fc多肽，表达的Fc变体对该FcγR具有不希望的高结合活性的细胞。
在一个实施方案中，本发明方法还包括步骤：在每次分选后，对获得的分选细胞群体，进行培养增殖，例如，在下一轮分选前，将细胞增殖例如20天。
因此，在一个实施方案中，本发明方法还包括：
-在分选富集细胞后，增殖富集的细胞，
-将得到的细胞群体进行再一轮或多轮筛选，
其中所述筛选使用相同的靶FcγR进行，任选地其中靶FcγR的浓度递进式降低以增加筛选的严格性；和/或
其中所述筛选使用不同的靶FcγR进行，以选择展示具有期望的不同靶FcγR结合水平的Fc融合多肽的细胞克隆。
优选，在细胞增殖后，在进行下一次分选之前，检测细胞上Fc多肽的展示水平以及对目的FcR的结合能力，任选地与未经分选的原始突变文库进行比较，或与上一轮进行比较，以决定是否实施下次分选。在使用荧光分选方法的技术方案中，所述检测可以通过荧光染色和流式细胞分析术进行。例如，在针对目的Fc受体进行正筛选时，可以以第一荧光染料标记Fc多肽中的标签序列并以第二荧光染料标记目的Fc受体，进行分选后增殖细胞的荧光染色，通过流式细胞术检测双荧光染色阳性细胞亚群的数量以及向第二荧光染色增强方向上的迁移趋势。优选，相比于分选前的细胞群，经分选增殖后的细胞群经荧光染色确认具有明显增加的双阳性细胞亚群数，或者双阳性细胞亚群的数目达到整个染色细胞群的50％以上，且更优选具有向第二荧光染色增强方向上的整体迁移。
在一个实施方案中，在对分选后增殖细胞的染色分析中，包括未经Fc引入且未染色的细胞作为blank对照。在利用流式细胞术进行所述染色分析时，在一个实施方案中，以第一荧光染料(例如FITC)标记Fc多肽中的标签序列并以第二荧光染料(例如PE)标记目的Fc受体。在一个实施方案中，设门是以所述blank对照上的本底荧光值确定门的左边界，并且在正筛选时，以展示WT Fc的细胞群上第二荧光染料(例如PE)的荧光值确定门的下边界；而在负筛选时，以展示WT Fc的细胞群上第二荧光染料(例如PE)的荧光值确定门的上边界。在一个实施方案中，根据门中的细胞群数量和分布，分析分选后增殖的细胞，以例如确定细胞库中Fc变体的富集程度和/或是否需要进行下轮富集。
分选成员的深度测序和聚类分析
在常规的展示文库平台和方法中，在文库筛选后共同的下一个步骤是，分离，鉴定编码展示分子的核酸。为此，通常将编码展示分子的核酸从分选的细胞中分离出来，克隆到表达载体和宿主细胞中，形成单克隆，挑取有限数量的单克隆，逐一进行性质检测和测序。
与常规方法不同，本发明的方法在展示文库筛选后，对选择的细胞群体进行深度测序和聚类分析。深度测序分选的细胞群体，可以获得多达十万条以上的读数。由此，本发明可以实现对分选的序列变体的彻底分析。
深度测序能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。相对于第一代测序技术，即sanger测序法，深度测序也称作下一代测序(NGS，next-generationsequencing)或高通量测序(High-throughput sequencing)。NGS测序包括二代测序(SGS)和三代测序(TGS)。SGS技术适用于获得短读长度，而三代测序(TGS)可以获得较长的读取长度。
用于二代测序的方法包括合成测序法(Sequencing-by-synthesis,SBS)和连接测序法(Sequencing by Ligation,SBL)。SBS法包括焦磷酸测序法、可逆终止子测序法(sequencing by reversible terminator)、和基于氢离子检测的测序方法(Sequencingby Detection of Hydrogen Ion)。SBL法包括基于杂交和连接的测序方法。用于三代测序的方法包括单分子实时测序(SMRT)法等。
可以获得多种商业深度测序平台，包括但不限于，用于二代测序的各种商业测序平台，例如GS FLX测序平台(454Life Sciences/Roche diagnostics)，Genome Analyzer,HiSeq,MiSeq和NextSeq测序平台(Illumina公司)，SOLiD测序平台(ABI公司),和IonTorrent PGMTM和Ion Torrent ProtonTM测序平台(Thermo Fisher)；可用于三代测序的各种商业测序平台，HelicosTM Genetic Analysis System(SeqLL,LLC)，SMRT Sequencing(Pacific Biosciences),Nanopore测序平台(Oxford Nanopore)。
在本发明的一些优选实施方案中，采用SGS技术进行深度测序。SGS包括两个步骤：模板制备步骤和测序步骤。在模板制备步骤中，通常包括准备用于测序的DNA文库，其中包括对DNA片段进行末端处理并与衔接子(adaptor)连接。取决于所用的测序平台，用于测序的DNA片段的长度可以为150-800bp。在测序DNA文库制备后，文库中的DNA片段进行克隆扩增，其中待测序的DNA片段被分别单个地结合在珠、离子表面或flow cell等固相上。根据测序平台的不同，锚定在固相上的DNA片段可以使用乳化PCR(emulsion PCR,emPCR)或桥式PCR(bridge PCR)扩增，从而形成在空间上分离的数百万模板片段。在用于测序的模板文库制备后，可以进行SBS测序或SBL测序。
关于深度测序方法，可以参见文献：例如US2019/0185933。Eid,J.et al.Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science 323,133-138,doi:10.1126/science.1162986(2009)；Giordano,F.et al.De novo yeast genomeassemblies from MinlON,PacBio and MiSeq platforms.Scientific Reports 7,3935,doi:10.1038/s41598-017-03996-z(2017)；和Sheetal Ambardar等,High ThroughputSequencing:An overview of sequencing Chemistry,2016,56(4):394-404。这些文献并入本文作为参考
在本发明中，在一些实施方案中，在进行深度测序前，自分选获得的细胞群中，将Fc多肽编码核酸的突变区扩增出来。扩增优选采用聚合酶链式反应进行。可以根据所用的深度测序方法和待分析的突变区，确定进行扩增的序列和长度。简言之，采用与待扩增的目的突变区互补的两个合成引物加入例如分选细胞群的裂解物(可以纯化或不经纯化)中，由此扩增出两个引物之间的Fc DNA编码区域。在扩增过程中，可以向扩增的靶核酸分子添加barcode，例如使用携带barcode的引物进行扩增以实现barcode的加入。在合并多个突变库的分选细胞群进行测序的情况下，barcode可是突变库barcode,即，不同的突变库对应于不同的barcode。在一个实施方案中，因此，用于扩增的引物包括位于3'端与靶扩增区域互补的第一部分和位于5'端包括突变库barcode的第二部分。使用这样的引物进行扩增，产生barcode标记的核酸分子。
自分选细胞群扩增产生核酸分子文库后，可以使用本领域公知的方法，进行深度测序(例如二代测序)。例如，可以采用桥式PCR的二代测序方法。此外，可以采用商业可获得的深度测序平台，例如Illumina MiSeq测序平台。
在深度测序后，可以进行读数的聚类分析，确定分选群体的富集程度和群体中不同序列的丰度。任选地，可以与参考群体例如分选前的原始群体的深度测序结果相比。经实验证实，通过使用本发明的方法，利用深度测序和聚类分析，选择分选群体中的高出现频数的序列(即，优势氨基酸序列)，优选地进一步结合优势氨基酸残基的检测，可以快速有效地获得具有期望Fc受体结合性质的Fc变体。
本发明人进一步发现，采用结构不同的FcγR受体，例如FcγRIIB相对于FcγRIIIA，进行相继的正负展示文库成员分选，可以协同增加与目的FcγRIIB结合性质相关的优势氨基酸残基在深度测序和聚类分析结果中的出现频数，促进符合期望结合性质的Fc变体的鉴定。
在本发明中，优选地，聚类分析包括，将测序获得的核酸序列转化为氨基酸序列，根据每种突变体序列出现的频数从高到低进行排序。
在一些实施方案中，聚类分析还包括通过绘制突变体累积曲线，判断突变库(例如在流式分选富集后)的突变体富集程度。突变体累积曲线的绘制中，假定所有序列条数累计在一起为100％，从数量最多的突变体开始，不断向上累积排名依次靠后的每一种突变体的数量，直到所有突变体累积完成。在累积曲线上，一般，X轴代表突变体的种类，Y轴代表累积的突变体条数占总突变体比例。将分选前后的突变库进行比较，曲线斜率的变化可以反映分选后突变库的富集程度变化。
在一个实施方案中，在对深度测序数据进行氨基酸序列转化后，确定在特定氨基酸位置上的优势氨基酸，和/或在所测序列区域上的优选序列基序。在本文中，优势氨基酸残基为在突变库的所有氨基酸序列中显著地出现在一个特定氨基酸位置的残基。在一些实施方案中，优势氨基酸残基是在突变文库深度测序得到的所有氨基酸序列读数上，于一个特定的氨基酸位置上出现频数较高的氨基酸残基，优选频数最高的前1-5种氨基酸，优选前1-3种氨基酸，或前1-2种氨基酸。然而，本领域技术人员也可以根据筛选的具体需要，决定优势氨基酸残基的范围，以例如涵盖频数排序相对更低的氨基酸。在一个实施方案中，将筛选后的突变库相对于未经筛选的原始突变库在特定氨基酸位置上的优势氨基酸残基进行比较，确定在该位置是否存在优势氨基酸残基突变。在再一个实施方案中，根据所测序列各位置的优势氨基酸，可以确定所测序列区域的优选序列基序。可以通过对文库测序所得的氨基酸序列进行多重序列比对，确定优势氨基酸残基和优选序列基序。
在一些实施方案中，通过WebLogo作图显示优势氨基酸残基。Weblogo基于多序列比对信息，可以将多序列的保守信息通过图形表示出来。每个logo由一系列碱基(氨基酸)组成，在logo的每一个序列位置上，不同碱基(氨基酸)字母的高度表示其出现频率的高低，而由该位置上出现的碱基种类及其频数分布可以反映此位置的序列保守性。WebLogo作图方法可以参见例如，Crooks,Gavin E.,et al."WebLogo:ASequence Logo Generator."Genome Research 14.6(2004):1188-1190；和Schneider,T.D.and R.M.Stephens,Sequence logos:a new way to display consensus sequences.Nucleic Acids Res,1990.18(20):p.6097-100。这些文献均并入本文作为参考。可以使用http://weblogo.threeplusone.com提供的WebLogo绘制工具，进行序列Logo绘制。
在一个实施方案中，因此，本发明提供了一种筛选Fc变体多肽的方法，包括：
将分选展示文库步骤后获得的细胞群，进行深度测序，例如二代测序(NGS)，鉴定具有期望的FcγR结合性质的Fc变体，其中所述选择包括对测序得到氨基酸序列进行聚类分析；优选地，通过如下方式进行：
(c1)从细胞群PCR扩增经分选步骤富集后的突变库，任选地同时扩增未经分选富集的原始突变库作为对照；优选地，PCR扩增长度为50-200bp之间，优选150bp；
(c2)采用二代测序，优选基于桥式PCR的二代测序，如HiSeqTM测序平台，获得突变库的突变区氨基酸序列；
(c3)对获得的测序结果，按照突变区氨基酸序列的种类和频数，进行聚类分析；
(c4)选择频数最高的前1-3％突变体，例如频数最高的前100个突变体，优选前50、前20、前10个突变体，优选选择的突变体包含优势氨基酸残基和/或优选序列基序，在一个优选实施方案中，通过WebLogo作图，确定突变库的优势氨基酸残基和优选序列基序。
Fc变体结合性质检测
如上指出，与常规的平台筛选方法不同，本发明采用深度测序(如二代测序)和聚类分析，可以直接获得Fc变体的序列信息。由此，本发明省去了对筛选所得Fc变体群体进行单克隆逐一分离、检测和测序的步骤。此外，本发明人发现，通过采用深度测序和聚类分析，可以通过在选取的有限数量的(例如大约10个或30个或不超过100个)具有最高出现频数和/或优势突变的Fc变体群中，获得具有预期的结合性质改善(几倍、10倍、几十倍、或甚至100倍以上改善)的Fc变体。由此，相对于常规筛选平台，本发明方法显著地减少了鉴定Fc变体的时间和成本。
在本发明中，可以理解，将一个Fc鉴定为具有某种性质将包括，基于本发明获得的数据，预期该Fc具有该性质。通过本发明的方法，可以鉴定富集了具有期望性质的Fc变体的候选群体。任选地，对于该群体中各Fc变体的性质然后可以进行验证。
所述检测/验证可以包括例如采用本领域技术人员的方法进行选取的Fc变体或包含Fc变体的蛋白(例如抗体)的表达、纯化和性质检测。在性质检测中，优选可以包括Fc变体所来源的亲本Fc(例如野生型Fc)或包含其的蛋白作为参照。
在本发明中，在通过二代测序和聚类分析选择了Fc变体后，在一个实施方案中，进一步检测所选Fc变体的(一项或多项)性质，所述性质包括例如但不限于，Fc变体与目的FcγR或其他(一种或多种)FcγR的结合亲和力，相应于所选的目的FcγR的效应子功能或其他效应子功能。
在一个实施方案中，在进行性质分析前，根据前述深度测序获得的序列信息，在哺乳动物细胞中体外表达编码所选Fc融合多肽中Fc区的DNA，任选地以分泌表达可溶性Fc区的形式表达。在Fc区多肽表达后，任选地进行分离和纯化。
在一个实施方案中，检测Fc与Fc受体之间的结合能力。例如，可以通过检测Fc与Fc受体之间的结合亲和力、结合特异性、和/或由结合引起的效应子功能，来表征所述结合能力。
在一些实施方案中，所述结合能力的检测包括，测定Fc变体多肽与目的FcγR和/或其他(一种或多种)FcγR的结合亲和力。例如，可以采用SPR表面等离子体共振(SPR,Surface Plasmon Resonance)进行结合亲和力分析，其中检测Fc变体与固定在芯片上的FcγR的结合量，其中该结合量与Fc/FcγR之间的亲和力呈正相关。在另一些实施方案中，所述结合能力的检测包括，测定由Fc变体多肽与目的FcγR和/或其他(一种或多种)FcγR的结合引起的效应子功能。在一些实施方案，Fc与Fc受体之间的结合能力通过引发效应子功能的EC50值来表示。
在一个实施方案中，检测选自如下的Fc变体的性质：
-与FcγRIIIA(F158),FcγRIIIA(V158),FcγRIIB,FcγRIIA(H131),FcγRIIA(R131)中一或多种，例如两种，或三种，或所有四种FcγR受体的结合亲和力；
-依赖于目的FcγR的效应子功能，包括例如，ADCC活性，ADCP活性，细胞的免疫激活、细胞的免疫抑制、杀肿瘤细胞作用等。
在进行效应子功能检测时，在一些实施方案中，将Fc变体转化为全长抗体的形式。例如，可以通过标准重组手段，将Fc变体与抗体的重链可变区融合形成全长抗体重链，并与抗体的对应轻链组合，构建全长抗体。优选，根据所要检测的效应子功能，选择进行组合的抗体可变区。之后，可以检测带有所选Fc变体的抗体的效应子功能，并与带有野生型Fc段的抗体进行比较。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体相对于野生型Fc多肽具有增加的FcγRIIIA结合能力。本领域已知，FcγRIIIA结合能力与抗体的ADCC活性相关。因此，可以检测本发明的Fc变体相对于野生型Fc多肽在ADCC活性上的增加。
Fc变体的ADCC功效可以通过如下方式检测：
-将抗体(例如依赖性ADCC发挥主要功能活性的抗体，如赫赛汀)的重链可变区与本发明的Fc变体融合，形成抗体全长重链；
-将所得的抗体重链与抗体的相应轻链组合，形成全长抗体；
-在抗体所对应的靶细胞存在下，检测抗体与效应细胞(例如外周血单核细胞)孵育后，对靶细胞的杀伤效果。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体相对于野生型Fc多肽具有增加的FcγRIIB结合能力。因此，可以采用激动型抗体，例如CD40激动型抗体，通过将抗体的原重链Fc替换为本发明的Fc变体，检测与FcγRIIB结合能力相关的效应子功能。在一个实施方案中，将包含Fc变体的抗体与表达FcγRIIB的哺乳动物细胞、以及表面表达抗体所针对的抗原的靶细胞一起孵育，检测抗体对靶细胞的激活效应。在一个实施方案中，靶细胞包含报道基因系统，通过检测报道基因系统的表达水平，测量靶细胞的激活程度。
本发明的方法不仅可以用于从文库中排除(或减少丰度或频数)具有不期望的结合性质的Fc多肽成员，也可以用于促进从文库中选择(通过增加频数或丰度、或通过富集)具有期望的结合性质的Fc多肽成员。在本发明的方法中，可以利用参考Fc多肽来验证本发明方法筛选的Fc变体的性质改变。
与本发明Fc变体比较的参考多肽例如，可以是在利用本发明方法进行筛选之前Fc变体所来源自的Fc亲本。所述Fc亲本可以是野生型Fc多肽，也可以是已经包含了突变的Fc多肽，所述突变可以位于待在突变文库建立时引入氨基酸变化的突变区之外，以便通过本发明方法获得性能的进一步改善、或多种不同期望性能的组合。
与本发明Fc变体比较的多肽也可以是例如，针对旨在Fc变体文库筛选中选择的改变性质，具有改善的或降低的已知Fc变体。
在本发明，应当理解，在涉及期望性质时，表述“更大”或“更小”，“更高水平”或“更低水平”，“增加的”或“降低的”等，是指，在相关的实验条件下，相对于对照Fc或展示对照Fc的细胞克隆，Fc变体或展示Fc变体的细胞克隆在期望性质上存在一定差异，该差异允许将该Fc变体或展示其的细胞克隆与对照区分开来。该差异可以是统计学显著的差异。差异可以任选地以％量化，例如至少10％、或20％或25％的差异。或者，可以使用差异倍数，例如至少1倍、1.5倍、2倍、3倍、10倍、或至少100倍。
具有改善的FcγR结合能力的Fc变体
人群中包括5种主要的FcγR受体，FcγRIIIA(F158),FcγRIIIA(V158),FcγRIIB,FcγRIIA(H131),FcγRIIA(R131)。FcγRIIB为免疫抑制性受体；其余4种为免疫刺激性受体。Fc蛋白与这些不同FcγR受体的结合引发不同的效应子功能。
本发明再一方面提供，可以通过本发明方法筛选或鉴定的、具有改善的FcγR结合能力的Fc变体。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体，相对于野生型Fc多肽，具有改变的(一种或多种)FcγR受体结合亲和力，其中所述改变的亲和力为增加的或减少了至少1倍、例如至少5倍、至少10倍、至少50倍的结合亲和力。在一个优选方案中，亲和力增加至少1-100倍，例如，至少10-50倍。在一个优选实施方案中，亲和力减少至少1-100倍，例如，至少10-50倍。
在一个实施方案中，本发明提供FcγRIIIA(F158)和/或FcγRIIIA(V158)的结合能力增加的Fc变体。在另一实施方案中，本发明提供FcγRIIB的结合能力增加的Fc变体。在再一实施方案中，本发明提供FcγRIIB的结合能力增加，而FcγRIIIA(F158),FcγRIIIA(V158)和/或FcγRIIA(H131)的结合能力基本上不改变或降低的Fc变体。在一个实施方案中，本发明提供FcγRIIB的结合能力/FcγRIIIA的结合能力的比值增大的Fc变体。在一个实施方案中，本发明提供FcγRIIB的结合能力/FcγRIIA-R131的结合能力的比值增大的Fc变体。在一些实施方案中，结合能力通过结合亲和力表示。在另一些实施方案中，结合能力通过引发效应子功能的EC50值来表示。
在一个实施方案中，Fc变体是IgG1 Fc变体，包含位于以下四个区域之一或多个中的氨基酸突变，优选在突变区域2-4的一个或多个中的突变。
-突变区域1：残基233-238位，
-突变区域2：残基265-271位，
-突变区域3：残基295-300位和
-突变区域4：残基326-332位。
在一个优选实施方案中，Fc变体包含突变区2的突变与突变区4的突变的组合。
在一个实施方案中，本发明提供具有增加的FcγRIIIA结合能力的Fc变体，所述Fc变体包含选自以下的一个或多个序列基序：
区2(EU编号265-271位)：DVX1X2X3X4P，其中X1＝S/A/D，优选S/A；X2＝E/G/H/D，优选E/G/H，更优选E/G；X3＝E/D，优选E；X4＝E/D；
区3(EU编号295-300位)：X1X2NX3TX4,其中X1＝C/Q/L,优选C或Q；X2＝Y/W，优选Y；X3＝S/A，优选S；X4＝任何氨基酸残基，优选Y/L，更优选Y；
区4(EU编号326-332位)：X1ALPX2PX3，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝任何氨基酸，优选A/M/L,更优选A/M；X3＝E/I/D，优选E/D。
在一个实施方案中，具有增加的FcγRIIIA结合能力的本发明Fc变体优选包含选自以下的一个或多个突变：S267A、H268E、H268G、D270E、Q295C、I332E、I332D。优选地，所述Fc变体包含选自以下的突变：K326M/S/I/T+I332E/D；A330T/G/V/Y+I332E/D；K326T+A330M；H268E/D；H268E/D+S267A；H268G+D270E，I332D；Q295C；Q295L+Y296W
更优选包含选自以下的突变：
| K326M+I332E | A330T+I332E |
| K326S+I332E | A330G+I332D |
| K326I+I332E | A330V+I332D |
| L328T+I332E | A330Y+I332D |
| K326T+A330M | H268G+D270E |
| H268E | S267A+H268E |
| I332D | |
| Q295C | Q295L+Y296W |
更优选地包含如下突变：
| H268E+K326I+I332E |
| H268E+K326M+I332E |
| H268E+K326S+I332E |
| H268E+A330Y+I332D |
| H268E+A330T+I332E |
在一个优选实施方案中，相对于野生型Fc多肽，本发明的Fc变体，在FcγRIIIA-F158和V158结合能力方面，均提高。
在再一优选实施方案中，相对于野生型Fc多肽，本发明的Fc变体具有提高的FcγRIIIA结合能力，同时具有基本不改变的FcγRIIB结合能力。
在再一实施方案中，相对于野生型Fc多肽，本发明的Fc变体具有提高的FcγRIIIA结合，并具有提高的FcγRIIIA结合能力/FcγRIIB结合能力比值，例如结合亲和力比值。
在一个实施方案中，本发明的Fc变体相对于野生型Fc多肽具有增加的FcγRIIIA结合能力,且表现出增加的ADCC活性。
在一个实施方案中，本发明提供具有增加的FcγRIIB结合能力的Fc变体，所述Fc变体包含选自以下的一个或多个序列基序：
区1(EU编号233-238位)：ELX1X2GX3，其中X1＝任何氨基酸，优选L；X2＝G/N/D；X3＝P/V/D/W/F，优选P/V；
区2(EU编号265-271位)：DX1X2X3X4DP，其中X1＝V/I/L，优选V；X2＝E/S/D，优选E；X3＝H/D；X4＝E/G；
区3(EU编号295-300位)：QX1NSTX2,其中X1＝S/Y,优选S；X2＝K/Y，优选K；
区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝任何氨基酸，优选L/S/T/W/A/F。
在一个实施方案中，优选地，具有增加的FcγRIIB结合能力的本发明Fc变体包含选自以下的一个或多个突变：G236N、P238V，S267E，Y296S，Y300K。
在一个实施方案中，具有增加的FcγRIIB结合能力的本发明Fc变体包含选自以下的一个或多个序列基序：
区2(EU编号265-271位)：DX1X2X3X4DP，其中X1＝V/I/L，优选V；X2＝E/S/Q,优选E；X3＝H/D/Q；X4＝E/G/P，优选E/G；
区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝任何氨基酸，优选L/S/W/F/T/A/Y，其中X3更优选为L/F/W/Y，优选L/F，最优选F。
在一些优选实施方案中，所述的Fc变体还具有基本不变或降低的FcγRIIA-H131结合能力。
在一个实施方案中，具有增加的FcγRIIB结合能力的本发明Fc变体优选包含选自以下的一个或多个突变：S267E、A327E和L328F。所述Fc变体优选具有基本不变或减少的FcγRIIA-R131或FcγRIIIA结合能力。
在一些实施方案中，优选，具有增加的FcγRIIB结合能力的本发明Fc变体包含选自以下的突变：
| P331N+I332M | S267E+E269G |
| K326V+L328A | V266I+S267E |
| A330R+I332D | S267E+H268D |
| L328F+A330S | V266L+S267Q+H268Q |
| A327E+L328F | E269P |
| K326D+P331S | G236N+P238V |
| A327E+L328W | Y296S+Y300K |
| K326P+L328F |
更优选包含选自以下的突变：
| K326V+L328A | S267E+E269G |
| A327E+L328F | V266I+S267E |
| S267E+H268D |
最优选包含选自以下的突变：K326V+L328A，A327E+L328F，S267E+H268D。
在一些优选实施方案中，所述Fc变体包含如下组合突变：
| S267E+E269G+K326V+L328A |
| V266I+S267E+K326V+L328A |
| S267E+H268D+K326V+L328A |
| S267E+E269G+A327E+L328F |
| V266I+S267E+A327E+L328F |
| S267E+H268D+A327E+L328F |
| G236D+V266I+S267E+K326V+L328A |
| P238D+V266I+S267E+K326V+L328A |
优选地，包含本发明FcγRIIB结合能力增加的本发明Fc区变体的抗体表现出增强的激活靶细胞的效应。更优选地，相对于包含亲本Fc区或野生型Fc区的抗体，包含本发明FcγRIIB结合能力增加的本发明Fc区变体的抗体，表现出增加的FcγRIIB与FcγRIIA或FcγRIIIA结合能力比值，尤其是FcγRIIB与FcγRIIAR131结合能力比值。优选地，结合能力可以通过所述抗体激活靶细胞的EC50值表示。
优选地，抗体为抗CD40激活型抗体，更优选所述抗体具有SEQ ID NO:10/11中所示的VH和VL序列。优选地，抗体为抗4-1BB激活型抗体，更优选所述抗体具有SEQ ID NO:12/13中所示的VH和VL序列。
在一些优选的实施方案中，根据本发明提供的Fc变体多肽具有去岩藻糖基化或低岩藻糖基化的Fc区。
包含Fc变体的蛋白
本发明再一方面提供包含本发明Fc变体的蛋白，例如免疫融合蛋白和抗体。
在一个实施方案中，本发明提供包含Fc变体的抗体，其中Fc变体相对于野生型Fc具有改变的FcγR受体结合能力，其中所述受体选自：FcγRIIA(R131)、FcγRIIA(H131),FcγRIIB、FcγRIIIA(F158)和FcγRIIIA(V158)。在一些实施方案中，结合能力通过结合亲和力表示。在另一些实施方案中，结合能力通过引发效应子功能的EC50值来表示。
在一个实施方案中，本发明提供包含Fc变体的抗体，其中Fc变体相对于野生型Fc具有增加的FcγRIIIA能力(例如结合亲和力)，优选地所述抗体用于杀伤表达与抗体可变区结合的抗原的靶细胞。优选地，抗体的Fc变体包含选自以下的一个或多个突变：S267A、H268E、H268G、D270E、Q295C、Q295L、Y296W、I332E、I332D；优选包含突变：K326M/S/I/T+I332E/D；A330T/G/V/Y+I332E/D；K326T+A330M；H268E/D；H268E/D+S267A；H268G+D270E；Q295L+Y296W；更优选包含突变组合：H268E+K326I+I332E；H268E+K326M+I332E；H268E+K326S+I332E；H268E+A330Y+I332D；H268E+A330T+I332E。优选地，所述抗体相对于包含野生型Fc多肽的对应抗体，具有增强的ADCC活性，优选地，ADCC活性增强至少10-100倍。在一个优选的实施方案中，包含Fc变体的抗体也具有增加的FcγRIIA结合，表现出增强的ADCP活性。在一个实施方案中，抗体为抗HER2抗体，例如包含SEQ ID NO:6/7中所示的VH/VL序列或与其具有至少85％或90％或95％同一性且具有相同CDR序列的VH/VL序列，优选赫赛汀抗体。在一个实施方案中，抗体为抗CD20抗体，例如包含SEQ ID NO:8/9中所示的VH/VL序列或与其具有至少85％或90％或95％同一性且具有相同CDR序列的VH/VL序列，优选Rituximab抗体。在一个实施方案中，本发明也提供了利用所述抗体治疗疾病的方法，其中向需要的个体施用有效率的抗体，其中所述疾病将得益于抗体所引发的对靶细胞的ADCC活性和/或ADCP活性。所述疾病为例如肿瘤，如乳腺癌、淋巴瘤、白血病。
在一个实施方案中，本发明提供包含Fc变体的抗体，其中Fc变体相对于野生型Fc具有增加的FcγRIIB结合能力(例如结合亲和力)，优选地所述抗体用于激活表达与抗体可变区结合的抗原的靶细胞。在一个优选方案中，所述包含Fc变体的抗体表现出增加的FcγRIIB与FcγRIIA或FcγRIIIA结合能力比值，尤其是FcγRIIB与FcγRIIA-R131结合能力比值。在一个优选方案中，抗体的Fc变体包含选自以下的一个或多个突变：S267E、A327E和L328F。在一个优选方案中，抗体的Fc变体包含突变：P331N+I332M、S267E+E269G、K326V+L328A、V266I+S267E、A330R+I332D、S267E+H268D、L328F+A330S、V266L+S267Q+H268Q、A327E+L328F、E269P、K326D+P331S、G236N+P238V、A327E+L328W、Y296S+Y300K、或K326P+L328F。在再一优选实施方案中，抗体的Fc变体包含突变：
K326V+L328A，A327E+L328F，S267E+E269G，V266I+S267E；且更优选包含突变组合：S267E+E269G+K326V+L328A、V266I+S267E+K326V+L328A、S267E+H268D+K326V+L328A、S267E+E269G+A327E+L328F、V266I+S267E+A327E+L328F、S267E+H268D+A327E+L328F、G236D+V266I+S267E+K326V+L328A、P238D+V266I+S267E+K326V+L328A。在一个实施方案中，抗体是抗TNF受体家族的激动性抗体。在再一实施方案中，抗体是抗CD40激动型抗体，优选地，所述抗体具有SEQ ID NO:10/11中所示的VH和VL序列或与其具有至少85％或90％或95％同一性且具有相同CDR序列的VH/VL序列。在再一实施方案中，抗体是抗4-1BB激动型抗体，优选地，所述抗体具有SEQ ID NO:12/13中所示的VH和VL序列或与其具有至少85％或90％或95％同一性且具有相同CDR序列的VH/VL序列。在一个实施方案中，本发明也提供了利用所述抗体治疗疾病的方法，其中向需要的个体施用有效率的抗体，其中所述疾病将得益于抗体所引发的对靶细胞的激活活性。所述疾病为例如肿瘤，如结肠癌症。
在一些优选的实施方案中，根据本发明提供的包含Fc变体的抗体在Fc区具有去岩藻糖基化或低岩藻糖基化。
Fc变体的组合物
本发明的Fc变体，可以以Fc多肽的形式、或以包含该Fc变体的融合蛋白(优选全长抗体或免疫融合蛋白)的形式、或表达所述多肽或融合蛋白的细胞(优选哺乳动物细胞)的形式，包含在组合物中。这样的组合物是本发明的一个方面。所述组合物还可以包含例如可药用载体。
组合物可以包含合适的载体、赋形剂、和常规加入制剂中以提供改善的递送等性能的试剂。示例性制剂可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences。预期用于体内施用的含Fc区多肽，可以配制用于期望的施用途径，例如，注射液体。各种药物递送系统是本领域已知的，并可以用于施用本发明的组合物。例如，施用途径包括但不限于：皮内、肌内、口服、胃肠外、腹膜内、皮下等。此外，可以与其他生物活性剂一起联合施用本发明的组合物。施用可以是全身或局部施用。
本发明还涉及本发明组合物的应用，例如医学应用，包括用于人或动物个体的治疗方法中。在治疗方法中，可以包括：向有需要的个体施用本发明组合物。
实施例
实施例1
pCDH载体用于抗体Fc段的细胞表面展示
采用慢病毒载体pCDH载体(System Biosciences公司，货号：CD510B-1)，在细胞表面展示抗体Fc段。
构建如图1所示的pCDH表达框，其中IL2 signal sequence(IL2蛋白信号肽(氨基酸序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS，SEQ ID NO:3))可以引导Fc蛋白分泌出细胞，PDGFR TM(PDGFR蛋白跨膜区(氨基酸序列：HSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR，SEQ ID NO:4))可以将Fc锚定在细胞膜的表面，Fc蛋白氮端的FLAG标签(氨基酸序列：N-DYKDDDDK-C，SEQ ID NO:5)可以用相应抗FLAG荧光抗体进行染色。表达框中的铰链区和Fc区分别表示免疫球蛋白铰链区和位于铰链区后的免疫球蛋白恒定区。图20显示了用于插入该表达框的pCDH载体，其中表达框将插入载体的MCS多克隆位点，置于CMV启动子控制下。
1.1慢病毒载体质粒的构建
将图1所示的表达框，插入经XbaI和NotI消化的pCDH载体，其中所述表达框包含野生型人IgG1Fc(wtFc)的编码核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列)。经测序验证后，构建的新质粒命名为pCDH2。该质粒将表达产生包含如图24所示SEQ ID No:1序列的野生型Fc蛋白。利用EcoRI和NheI消化野生型人IgG1Fc(wtFc)的N297A突变体(Fc N297A)和V12突变体(Fc V12)(V12的突变位点：E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R；关于FcV12突变体，参见文献F.Mimoto等，Engineered antibody Fc variant with selectivelyenhanced FcγRIIb binding over both FcγRIIaR131 and FcγRIIaH131，ProteinEngineering,Design&Selection,Vol.26,No.10,pp589-598,2013)的编码核苷酸序列,同时通过EcoRI和NheI消化pCDH2。利用New England BioLabs公司的T4 DNA连接酶(货号：M0202L)，按照载体：片段＝1：7的摩尔比例，将经酶切消化的片段和载体进行连接。经测序验证，构建产生分别表达Fc N297A变体蛋白和Fc V12变体蛋白的另外2个表达质粒。
1.2 293FT细胞的转染
将构建好的质粒转染293FT细胞(购买自ATCC)，并表达Fc蛋白。
简言之，提前24小时在6孔板中铺293FT细胞，每孔5×105于2ml DMEM培养基中培养，24小时后，细胞可以用于转染。将1ug pCDH2质粒、1ug pMDLg/pRRE(购买自Addgene，货号：12251)、1ug pRSV-Rev(购买自Addgene，货号：12253)、1ug pCMV-VSV-G(购买自Addgene，货号：8454)加入100ul Opti-MEM(购自Thermo Fisher Scientific，货号：31985088)中，再加入20ul PEI(购自Polysciences，Inc.货号：24885)，混合均匀后，室温孵育10min，滴加入孔板中。转染6小时后，换成新鲜DMEM培养基再表达48h。将含有病毒上清的培养基收集起来，1000rpm离心5min去除细胞碎片，取上清，加入提前24小时铺于6孔板中的293FT细胞(5×105/每孔)。感染12小时后，换成新鲜培养基，继续表达24小时。
1.3细胞染色和流式细胞检测
24h后将细胞，在去除培养基后，用2ml PBS洗一遍，加入1ml STEMPRO ACCUTASE(Thermo Fishier Scientific，货号：A1110501)，于培养箱中放置1min。用1ml新鲜培养基将细胞吹下来。取2×105个细胞，重悬于200ul含有5％胎牛血清FBS(购自BI，货号04-001-1A)的FACS buffer(FACS Buffer配方：PBS中加入1％葡萄糖(W/V)，1mM Na2EDTA,1nMHEPES)中，4摄氏度封闭30min。1000rpm离心5min后，将细胞重悬于200ul含有0.5ug/ml生物素化FcγRIIB(制备方法如下1.4节所述)的含5％血清的FACS Buffer中，4摄氏度孵育30min。1000rpm离心5min后，用500ul FACS buffer洗涤细胞，重复洗涤步骤3次。之后加入含有streptavidin-PE(1:1000稀释，购买自Thermo Fishier Scientific，货号21627)和anti-FLAG-FITC(1:200稀释，购买自SIGMA，货号F4049-.2MG)的含5％血清的FACS Buffer，于4摄氏度孵育20min。之后，1000rpm离心5min，用500ul FACS buffer洗三次，重悬于500ulFACS Buffer中。使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞上携带的PE荧光染料和FITC荧光染料的荧光。
如图2所示，与对照组blank(未用慢病毒感染且未染色的293FT细胞)相比，3种Fc均锚定并展示在细胞膜表面，细胞群往FITC荧光增强方向迁移，并能被FLAG抗体检测到。此外，如图2所示，与对照组blank相比，转染wtFc的细胞群还表现出向PE荧光染色增强方向的一些迁移，出现FITC和PE荧光强度均高于对照背景荧光的双阳性细胞亚群(0.728％)，这表明能与抗原FcγRIIB结合的wtFc在展示于细胞表面后可以被streptavidin-PE检测到。而去除了FcγRIIB结合能力的Fc N297A变体，尽管能展示在细胞膜表面，但不能与抗原FcγRIIB结合，如图2所示，几乎没有FITC和PE荧光染色均增强的双阳性细胞亚群存在(0.352％)，FITC阳性细胞群不往PE方向迁移。而增强了FcγRIIB结合能力的Fc V12变体在呈递于细胞表面后，显示出与抗原FcγRIIB强的结合能力，如图2所示，相比野生型，Fc V12转染细胞群中FTIC和PE双阳性细胞亚群的数量显著增多(2.56％)，且向PE荧光增强方向的迁移幅度更大，也就是说细胞群往PE方向迁移比野生型wt更明显。
上述结果表明，Fc蛋白可以有效地展示在哺乳动物真核细胞表面；并且通过荧光素标记FLAG抗体染色的方式可以检测到细胞表面展示的Fc，并且进一步，通过对展示于细胞表面的Fc蛋白进行PE荧光染色，相对于wtFc展示细胞，Fc变体展示细胞上PE荧光的强弱变化可以体现Fc变体与Fc受体抗原的结合能力强弱变化。但野生型Fc与FcγRIIB结合很弱，为了获得结合增强的Fc变体，需要进行筛选富集。
1.4生物素化FcγRIIB蛋白的制备
FcγRIIB基因购买自sino biological(货号；HG10259-M)，将胞外域序列与avitag(GLNDIFEAQKIEWHE)序列连接，并在C端连接6×his标签序列，之后插入EcoRI和NheI消化的pFUSE表达载体(购自Invivogen,货号：pfuse-hg1fc1)中。在293F细胞中表达后，用histrap FF层析柱(GE Healthcare)纯化。纯化出的FcγRIIB蛋白用Biotin Ligase(购买自GeneCopoeia，货号BI001)将生物素连接到avitag上，从而得到生物素化的FcγRIIB。
实施例2
Fc突变文库的构建
2.1确定突变区域
一般认为Fc与其受体距离较近的区域极为可能是它们相互作用的区域，因此在本实施例中将突变区设置在这样的区域中，但如本领域技术人员在阅读本说明书后可以理解的，突变区也可以设置在这些区域之外。
具体而言，根据人IgG1/FcγRIIB复合体结构(PDB NO:3wjj)以及人IgG1/FcγRIIIA复合体结构(PDB NO:5d6d)，选取IgG1 Fc中与FcγR距离5埃之内的区域为相互作用区域。由此确定IgG1 Fc上EU编号的第233-238位(ELLGGP)、EU编号的第265-271位(DVSHEDP)、EU编号的第295-300位(QYNSTY)、EU编号的第326-332位(KALPAPI)为引入突变的区域，分别命名为突变区1、突变区2、突变区3和突变区4。(IgG1 Fc上EU编号可以参见图21)
2.2制备Fc突变文库
可以采取野生型Fc区作为模板构建Fc突变文库。也可以采用修饰的野生型Fc区为模板。例如，以在待突变的区域中引入了一个终止密码子的野生型Fc区为模板，可以有效减少以突变库构建的细胞展示文库中表达和展示野生型Fc蛋白的细胞群数量，促进筛选效率。
在本实施例，以待突变区中引入了一个终止密码子的野生型IgG1 Fc序列编码序列(SEQ ID NO:2)为模板，通过PCR的方式分别扩增获得DNA片段1和DNA片段2，构建文库。
用于不同突变区的DNA片段1和2扩增的引物组合如下：
突变区1片段1：正向引物TAA-5(20μM)，反向引物1-1至1-15等摩尔量混合(20μM)
突变区1片段2：正向引物fr1-F(20μM)，反向引物TAA-4(20μM)
突变区2片段1：正向引物TAA-5(20μM)，反向引物2-1至2-21等摩尔量混合(20μM)
突变区2片段2：正向引物fr2-F(20μM)，反向引物TAA-4(20μM)
突变区3片段1：正向引物TAA-5(20μM)，反向引物3-1至3-15等摩尔量混合(20μM)
突变区3片段2：正向引物fr3-F(20μM)，反向引物TAA-4(20μM)
突变区4片段1：正向引物TAA-5(20μM)，反向引物4-1至4-15等摩尔量混合(20μM)
突变区4片段2：正向引物fr4-F(20μM)，反向引物TAA-4(20μM)
用于制备Fc突变文库的上述引物的序列显示在图22中。
用于扩增的PCR体系如下：
扩增程序如下：
将扩增产物用DNA回收试剂盒进行回收，并将片段1和片段2进行overlap PCR从而将两个片段连接成一个完整的Fc突变体。
overlap PCR体系如下：
Overlap PCR扩增程序：
利用overlap PCR的方式将DNA片段1和DNA片段2连接后，分别在上述4个突变区中随机引入了2个氨基酸突变。将overlap后的片段用EcoRI和NheI酶切消化后，插入经EcoRI和NheI酶切后的pCDH2载体中，利用T4 DNA连接酶(New England BioLabs，货号：M0202L)将两者按照载体：片段＝1：7的摩尔比例，并按照厂商说明书进行连接。取10ul的连接产物，转化Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell(全式金，货号：CD501-03)，每个突变库做3个转化反应，根据长出来的克隆计算每个库的库容量，并将长出来的克隆全部收集起来后提取质粒。由此构建获得4个Fc突变文库：突变库1、突变库2、突变库3、突变库4。经分析，4个文库的库容量见下表1。
表1：突变库1-4的库容量
| 突变库1 | 突变库2 | 突变库3 | 突变库4 | |
| 库容量 | 2×105 | 1.4×105 | 2×105 | 1.6×105 |
实施例3
通过流式分选，筛选出与FcγRIIIA(F158/V158)结合增强型细胞群
3.1感染性病毒的产生
提前24h接种5×106个293FT细胞于10cm2 dish。分别将突变库1至突变库4和3个慢病毒包装质粒：4ug pMDLg/pRRE(购买自Addgene，货号：12251)、4ug pRSV-Rev(购买自Addgene，货号：12253)、4ug pCMV-VSV-G(购买自Addgene，货号：8454)混合，加入500ulOpti-MEM中，再加入80ul PEI。混合均匀后，室温孵育10min，滴加入dish中。转染6小时后，换成新鲜培养基再表达48h。将含有病毒的培养基上清收集起来，1000rpm离心10min后，取上清，通过0.45um的滤膜(购自赛多利斯，货号：16533-K)，获得的滤液中加入1/4体积的慢病毒浓缩液(购自BIOMIGA公司，货号V2001-02)，4摄氏度沉淀12小时。之后，在4摄氏度的条件下1500g离心45min使慢病毒沉淀到离心管的底部，弃上清，用2ml DMEM培养基重悬。浓缩后的病毒液用Lenti-X p24 Rapid Titer Kit(购自Clontech，货号：632200)根据厂商说明书检测慢病毒滴度。
3.2生物素化FcγRIIIA蛋白的制备
FcγRIIIA(F158)基因购买自sino biological，货号HG10389-G。将胞外域序列与avitag(GLNDIFEAQKIEWHE)序列连接，并在C端连接6×his标签序列，之后插入EcoRI和NheI消化的pFUSE表达载体(购自Invivogen,货号：pfuse-hg1fc1)中。在293F细胞中表达后，用histrap FF层析柱(GE Healthcare)纯化。纯化出的FcγRIIIA(F158)蛋白用BiotinLigase(购买自GeneCopoeia，货号BI001)将生物素连接到avitag上，从而得到生物素化的FcγRIIIA(F158)。
3.3通过细胞染色和流式细胞分选，筛选突变库
在检测病毒滴度后，以4×105pg的慢病毒量，感染1×107个293FT细胞。感染12小时后换成新鲜DMEM培养基，继续培养48小时后，进行细胞染色。用STEMPRO ACCUTASE(ThermoFishier Scientific，货号：A1110501)将细胞消化下来，重悬于1ml含5％血清的FACSBuffer(FACS Buffer配方：PBS中加入1％葡萄糖(W/V)，1mM Na2EDTA,1nM HEPES)中，4摄氏度封闭30min。1000rpm离心5min，取细胞沉淀，重悬于含有1ml 250nM生物素化的FcγRIIIA(F158)的含5％血清的FACS Buffer中，4摄氏度孵育30min。1000rpm离心5min后，用500ulFACS buffer洗涤细胞，重复洗涤步骤3次。之后加入含有streptavidin-PE(1:1000稀释，购买自Thermo Fishier Scientific，货号21627)和anti-FLAG-FITC(1:200稀释，购买自SIGMA，货号F4049-.2MG)的含5％血清的FACS Buffer，于4摄氏度孵育20min。之后1000rpm离心5min，用500ul FACS buffer洗三次，重悬于500ul FACS Buffer中。通过BD公司FACSAria III流式细胞仪分选出PE+FITC+双阳性细胞群。图3A所示为第一轮分选的流式图,blank组为未病毒感染且未染色的细胞,可用于指示细胞本身在FITC通道和PE通道上的自发荧光。分选设门时,选取FITC方向强于blank的细胞群(X轴方向),在此基础上选取PE方向最强的前0.5-1％左右的细胞。
分选出的细胞相继于24孔板、6孔板和T75细胞培养瓶中培养。细胞增殖20天后，在确定是否需要进行第二轮分选之前，应先对第一轮分选后增殖后的细胞，进行染色分析。取2×105个细胞用125nM的生物素化的FcγRIIIA(F158)进行染色(染色方法如前所述)，如图3B所示。在该图中，对于每一个库，流式图中圈门是以blank的FITC的本底荧光值确定门的左边界，以WT的PE荧光确定门的下边界。从图中可以看出，突变库1-4中的双阳性细胞群均强于野生型WT；在突变库4中，FITC阳性细胞群几乎均为PE阳性，因此不需要进行下一轮富集，而突变库1,2,3富集不明显，需要进行第二轮富集。
用生物素化FcγRIIIA(F158)进行第二轮分选，第二轮分选方法和设门策略同第一轮分选。第二轮分选后的突变库1,2,3经扩增后，分别取2×105个细胞，同时取经过第一轮FcγRIIIA(F158)分选并增殖后的突变库4的2×105个细胞，将这4种细胞分别用125nM的生物素化的FcγRIIIA(F158)和生物素化的FcγRIIIA(V158)进行染色，如图3C所示。
3.4筛选结果
FcγRIIIA F158V单核苷酸多态性(SNP)是在人群中自然存在的突变形式，在人群中的等位基因频率分布，例如在中国汉族人群中为大约66％F和34％V。(张昀等，中国汉族人群FcγRIIIAF158V基因多态性与系统性红斑狼疮及狼疮肾炎相关，基础医学与临床，2017年5月，37卷第5期，709-713)。FcγRIIIAF158和V158只有一个氨基酸的差别，且在期望利用抗体的ADCC效应子功能的一些治疗情形下可能期望获得对FcγRIIIA F158和V158均具有增强结合亲和力的抗体。因此，在本实施例中，检测了突变库在筛选富集后对F158和V158两者的结合能力。
如图3C所示，突变库1经过两轮FcγRIIIA(F158)染色富集后，相对于野生型wtFc，细胞群未出现向PE荧光增强方向上的整体偏移。突变库2和突变库3经过两轮FcγRIIIA(F158)染色富集后，对FcγRIIIA(V158)以及FcγRIIIA(F158)的结合都有显著提高，与野生型wtFc相比，细胞群出现向PE荧光增强方向的整体偏移；突变库4只经过一轮FcγRIIIA(F158)染色富集后，与野生型wtFc相比，细胞群已表现出向PE荧光增强方向的显著整体偏移，表明对FcγRIIIA(V158)以及FcγRIIIA(F158)的结合都有显著提高。
上述结果表明，通过哺乳动物展示和流式细胞分选，可以实现对FcγRIIIA高亲和力Fc突变体的富集。而且，通过用F158进行分选后，不仅分选出了对F158增强结合的细胞，也分选出对V158也显示很强结合的细胞。基于这个结果，我们认为用F158可以筛选到对F158,V158都增强的克隆。
后续的深度测序和SPR结果证实，在突变区2和突变区3经过两轮分选后，在突变区4经过一轮分选之后鉴定的这些PE荧光增强的双阳性细胞群中，均包含了比野生型结合能力更强的克隆。
实施例4
二代测序(NGS)鉴定针对FcγRIIIA富集的Fc突变体
4.1富集的突变文库的二代测序
将经过上述FcγRIIIA染色富集后的突变库2、突变库3、突变库4的细胞，各取5×105个细胞，加入100ul裂解液(lysis buffer)(500ul lysis buffer：455ul去离子水、25ul1M KCl、5ul 1M Tris-HCl(pH：9.0)、5ul 10％TritonX-100(购自Sigma公司，货号：X100-100ML)、10ul proteinase K(购自NEB公司货号：P8107S))于60摄氏度裂解60min后，94摄氏度灭活10min(去除proteinase K活性)。以细胞裂解液为模板，通过如下程序，将整合在细胞中的Fc突变区域通过PCR扩增出来。
(1)全长Fc片段的扩增
将每个库的细胞裂解后，以细胞裂解液为模板，用正向引物FLAG-F和反向引物PDGFR-R将细胞中整合的Fc序列扩增出来。
扩增所用PCR体系如下：
扩增程序：
将扩增产物用DNA回收试剂盒(公司MACHEREY-NAGEL，NucleoSpin Gel and PCRClean-up货号740609.50)进行回收，回收于30ul ddH20。
(2)二代测序样品制备
巢式PCR：以回收的含有Fc库双链DNA的水溶液为模板，用含barcode的引物将相应突变区扩增出来。
扩增程序：
下表2中显示了用于每个富集后突变库扩增的正向和反向引物。作为对照，同时也对未进行富集的突变库2(原始库2)、突变库3(原始库3)、突变库4(原始库4)，采用下表3中的引物，进行Fc突变区域的PCR扩增。
表2：用于富集后的突变库扩增的引物
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
表3：用于富集前的突变库(即，原始库)扩增的引物
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
将扩增产物用DNA回收试剂盒(公司MACHEREY-NAGEL，NucleoSpin Gel and PCRClean-up货号740609.50)进行回收。富集后的突变库2,3,4的回收产物各取200ng进行等质量混合后进行二代测序。同时也对未进行富集的突变库2(原始库2)、突变库3(原始库3)、突变库4(原始库4)的PCR扩增回收产物各取200ng进行混合后，进行二代测序。
采用二代测序，可以一次性对DNA混合物，即所有突变库中的序列进行合并测序。桥式PCR二代测序由金唯智公司使用HiSeq 2x150bp平台完成(该平台测序长度为正向150bp，反向150bp)。因为来自同一库的扩增序列在其两端都含有相同的一对barcode，故合并测序后得到的测序结果，在CLC Genomics Workbench V12中，根据不同barcode，进行拆解，从而获得不同突变库中的Fc变体序列。
4.2测序结果分析
将测序获得的DNA序列翻译成氨基酸序列，编写JAVA代码统计不同突变库在富集前后不同氨基酸序列出现的频数，并根据每种突变体序列出现的频数从高到低进行排序。
比较每个突变库富集前后的突变体种类及其出现频数的累积曲线。如图4的累积曲线图，X轴代表突变体的种类，Y轴代表累积的突变体条数占总突变体比例。由图4可见，3个原始库在未富集之前，累积曲线接近45度，即呈现一个均匀的累积，表明库中每种序列的出现频数基本相当。但是富集之后，X轴范围较富集之前明显缩小，表明经过FcγRIIIA富集后突变库中的Fc变体种类明显减少，一些突变体得到大量富集。从突变体频数累积曲线可以判断突变库2-4在流式分选后出现突变体的富集。
4.3 WebLogo作图显示优势氨基酸突变
将FcγRIIIA富集后的突变库和富集前的对应原始库的二代测序结果进行WebLogo作图。
如图5，比较富集前后相应突变区域的优势氨基酸的变化情况：突变库2中S267A、H268E、H268G、D270E得到明显富集，突变库3中的Q295C得到明显富集，突变库4中的I332E、I332D得到明显富集。这些富集说明这些氨基酸突变对结合亲和力的改善有利。
根据WebLogo图，富集后，突变区2-4分别表现出如下优选的序列基序：
突变区2(EU编号265-271位)：DVX1X2X3X4P，其中X1＝S/A/D，优选S/A；X2＝E/G/H/D，优选E/G/H，更优选E/G；X3＝E/D，优选E；X4＝E/D；
突变区3(EU编号295-300位)：X1X2NX3TX4,其中X1＝C/Q/L,优选C或Q；X2＝Y/W，优选Y；X3＝S/A，优选S；X4＝任何氨基酸残基，优选Y/L，更优选Y；
突变区4(EU编号326-332位)：X1ALPX2PX3，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝任何氨基酸，优选A/M/L,更优选A/M；X3＝E/I/D，优选E/D。
实施例5
FcγRIIIA结合的Fc突变体的SPR分析
5.1 Fc突变体的表达
根据实施例4.2中对二代测序结果的分析，将突变库中每种突变体序列出现的频数从高到低进行排序。
针对突变区2：选取排名第一的变体2-4、排名第2的变体2-7、排名第4的变体2-11；针对突变区3：选取排名第1的变体3-4，排名第3的变体3-14；针对突变区4：选取排名第1的变体4-5，排名第2的变体4-12，排名第3的变体4-6，排名第5的变体4-14，排名第7的变体4-30，排名第8的变体4-10，排名第10的变体4-25，排名第13的变体4-11，排名第15的4-8，排名第16的变体4-16，排名第20的变体4-19。
根据选取的变体的突变位点，以野生型Fc编码序列(SEQ ID NO:2)为模板，利用点突变的方式获得包含所述突变的Fc序列，并插入EcoRI和NheI消化的pFUSE载体(购自Invivogen,货号：pfuse-hg1fc1)中，构建得到Fc变体蛋白表达质粒。以质粒转染293FT细胞，在DMEM培养基中培养转染后的细胞进行Fc蛋白的表达。由带铰链区的Fc区组成的Fc蛋白会分泌到培养基中。将培养基吸出，1000RPM离心10min，取上清(约2ml)，用proteinAbeads(GE healthcare)进行纯化。
5.2测定突变体与受体的结合能力
根据实施例5.1中的方法表达并纯化不同的Fc变体蛋白。与野生型Fc(WT)，比较Fc变体蛋白与人FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB的结合能力。
将待测Fc蛋白溶液用PBS调整至400nM，体积500μl。制备带his标签的FcγR受体蛋白。将带his标签的FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB蛋白的浓度都调整至400nM,体积1ml。使用Biacore T200(GE Healthcare)进行各Fc突变体与FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB受体的相互作用分析。以下实验均在20摄氏度的条件下进行。首先，通过胺偶联法将抗his标签抗体(GE Healthcare)共价结合于S系列传感芯片CM5(GEHealthcare)上。使用蛋白溶液流速10s/min和捕获时间60s，芯片2通道捕获FcγRIIIA(F158)；芯片3通道捕获FcγRIIIA(V158)；芯片4通道捕获FcγRIIB。三个通道捕获蛋白完毕之后，Fc蛋白溶液以30μl/min依次流经1-2-3-4通道90s。检测信号稳定时的RU值，该值反映FcγR上的Fc结合量，该Fc结合量与Fc/FcγR之间的亲和力呈正相关。每次检测后，用10mM Glycine-HCl(pH＝1.5)进行洗脱，使传感芯片再生。各Fc突变体与FcγR受体之间的亲和力如图6，其中检测的各Fc突变体的突变区的氨基酸序列见下表4。
表4：进行SPR检测的Fc变体的序列
如图6所示，所有检测的克隆对于F158与V158的结合能力是趋同的。该结果与前面的流式分选结果相一致，进一步证实，在本发明方法中，用F158可以筛选到对F158,V158都增强的克隆。
相对于野生型Fc，所检测的Fc突变体中，除了变体4-10以外，其余15个对FcγRIIIA V158和F158的亲和力都不同程度的提高，RU值高于野生型的Fc。这些亲和力提高的变体的序列，与实施例5中weblogo分析得出的优势氨基酸残基和优选序列基序，相吻合。
在突变区4中，亲和力增强的突变体大部分均具有优势残基I332E/I332D。该结果与之前文献的报告——I332E是FcγRIIIA结合增强型突变——相一致。类似地，与文献报道的H268D是FcγRIIIA结合增强型突变相一致，在突变区2中，利用本发明方法筛选获得的包含H268E的Fc变体2-11在SPR检测中也表现出对FcγRIIIA结合的增强。
此外，利用本发明方法，还筛选获得了多种性能改善的新变体，例如，变体4-12(具有突变K326T,A330M)。此外，发现变体4-16，4-25，4-14，4-19与仅具有I332E突变的变体4-5相比，对FcγRIIIA的结合能力进一步提高，说明K326M，K326S，K326I，A330T可以在I332E的基础上进一步增强Fc与FcγRIIIA(F/V158)的结合。
实施例6组合突变体的构建和亲和力检测
利用点突变的方式将实施例4和实施例5中筛选到的突变库2中的突变体2-11中的H268E单点突变构建到4-14、、4-16、4-25、4-30、4-19突变体中(组合后的突变体在克隆号之前加上了2E-前缀)。检测组合突变体与FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB的结合能力，并与未组合前的突变体以及野生型Fc(WT)比较。
将待测Fc蛋白溶液用PBS调整至400nM，体积500μl。制备带his标签的FcγR受体蛋白。将带his标签的FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB蛋白浓度都调整至400nM,体积1ml。使用Biacore T200(GE Healthcare)进行各Fc蛋白与FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB受体的相互作用分析。分析方法同实施例5.2。
各Fc突变体与FcγR受体之间的亲和力，即同一Fc检测浓度下的结合量RU，如图7A所示。
进一步，利用基于Jurkat-LuciaTMNFAT-CD16细胞系的激活试验，检测组合后的Fc突变体对细胞表面表达的FcγRIIIA受体的结合和激活情况。
将图7A中组合之后的Fc变体，即2E-4-16,2E-4-14,2E-4-25,2E-4-19,2E-4-30表达纯化。根据厂商说明书，于96孔板中加入1ug纯化的蛋白，4℃包被12小时，之后加入1×105Jurkat-LuciaTMNFAT-CD16细胞系(InvivoGen,货号：jktl-nfat-cd16)，刺激24h后，用试剂盒(Promega，货号E1500)提供的裂解液将细胞裂解，并检测细胞中表达的luciferase。如图7B所示，所有突变体对应的luciferase活性均强于野生型。
实施例7Fc变体的ADCC活性检测
将Fc突变体：2E-4-14、2E-4-16、2E-4-25、2E-4-30、2E-4-19(由铰链区和CH2和CH3区组成)与赫赛汀的VH-CH1段进行连接，插入EcoRI/NheI消化的pFUSE表达载体中，构建5种赫赛汀重链突变体表达质粒。
赫赛汀的VH-CH1的序列：(SEQ ID NO:6)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
赫赛汀的轻链序列：(SEQ ID NO:7)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
用赫赛汀重链突变体表达质粒与赫赛汀轻链表达质粒共转染293F细胞(购自Thermo Fisher Scientific，货号：R79007)。转染后，于37摄氏度细胞培养箱中培养4天。之后，利用proteinA(GE healthcare)层析柱，从细胞培养物上清液中，纯化表达的抗体。
在RPMI 1640培养基(购自Thermo Fisher Scientific，货号：C11875500CP)中，将终浓度为2ng/mL的纯化抗体、1×104个人乳腺癌细胞SKBR3细胞，分别与1.5×105个来源于5个健康人的外周血单核细胞于37℃共孵育4h。之后，检测SKBR3细胞由于ADCC作用而从胞质中泄露的乳酸脱氢酶(LDH)量,其中该检测使用CytoToxNon-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒(购自Promega，货号：G1780)进行。根据检测到的上清中的乳酸脱氢酶含量，计算ADCC效应程度。结果如图8A所示。相对于野生型，检测的5个组合变体，在供体3中均导致了更高的ADCC％，且组合变体2E-4-16,2E-4-14和2E-4-25在5个供体中引起更高的平均ADCC％。
针对选择的组合变体，在不同抗体中，进行ADCC剂量曲线的绘制：
(1)根据实施例7中的结果，挑选2E-4-16,2E-4-14和2E-4-25的赫赛汀组合变体，用不同剂量，检测其ADCC效应。将终浓度分别为104至0.001ng/ml的抗体变体(10倍稀释，共8个浓度梯度)与1×104个人乳腺癌细胞SKBR3细胞和2×105个人外周血单核细胞于37℃共孵育4h，检测SKBR3细胞由于ADCC作用而从胞质中泄露的乳酸脱氢酶(LDH)量。如图8B所示，所有变体的ADCC效应均强于野生型。
(2)根据实施例7中的结果，挑选2E-4-16,2E-4-14和2E-4-25，按照类似于包含这些组合变体的赫赛汀抗体的上述构建方式，构建包含这些组合突变的Rituximab抗体。用不同的抗体剂量，检测其ADCC效应。将终浓度分别为104至0.01ng/ml的抗体变体(10倍稀释，共7个浓度梯度)与1×104个人B淋巴细胞瘤细胞Ramos和2×105个人外周血单核细胞于37℃共孵育4h，检测Ramos细胞由于ADCC作用而从胞质中泄露的乳酸脱氢酶(LDH)量。如图8C所示所有变体的ADCC效应均强于野生型。
Rituximab的VH-CH1的序列：(SEQ ID NO:8)
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
Rituximab的轻链序列：(SEQ ID NO:9)
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例8
通过流式分选，筛选出与FcγRIIB结合增强型细胞群
按照与实施例2和3中所述的相同操作方式，进行突变库的构建和变体的筛选。简言之，将突变库1至突变库4，分别与3个慢病毒包装质粒：pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G组合，共同转染293FT细胞。转染后，换成新鲜培养基再表达48h。收集培养基上清中的慢病毒并浓缩。用Lenti-X p24 Rapid Titer Kit(购自Clontech，货号：632200)检测慢病毒滴度后，以4×105pg的慢病毒量，感染1×107个293FT细胞。之后，用250nM生物素化的FcγRIIB、streptavidin-PE(1:1000稀释)和anti-FLAG-FITC(1:200稀释)进行细胞染色。使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞上携带的PE荧光染料和FITC荧光染料的荧光。通过流式细胞分选仪分选出前0.5％-1％PE+FITC+双阳性细胞群。
分选出的细胞相继于24孔板、6孔板和T75细胞培养瓶中培养。细胞增殖20天后，继续进行下一轮分选。后续分选的方法同上但之后的分选用125nM生物素化的FcγRIIB进行。在每次进行下一轮分选之前从增殖的细胞中取2×105个细胞进行染色(染色方法如前所述)，并与野生型进行对比，观察染色是否增强。
图9A显示分选和增殖之后的染色分析，其中每一个库流式图中圈门是以blank的FITC的本底荧光值确定门的左边界，以WTFc的PE荧光确定门的下边界。从图中可以看出，突变库1和突变库3经过四轮FcγRIIB染色富集后，与野生型相比，出现PE荧光染色增强的一部分双阳性细胞群。突变库2和突变库4经过两轮FcγRIIB染色富集后，相较于野生型，双阳性细胞群数量显著增多，且细胞群表现出在PE荧光增强方向上的整体迁移，表明大部分细胞对FcγRIIB的结合都有显著提高。
上述结果表明，通过哺乳动物展示和流式分选可以实现对FcγRIIB高亲和力Fc突变体的富集，特别是突变库2和4实现了较好的富集效果。
实施例9
通过流式分选，对FcγRIIB结合阳性细胞群进行负筛选
根据图9A所示，突变库2和突变库4在二轮富集后细胞群的几乎一半以上都对FcγRIIB表现出高亲和力，呈现阳性染色。为了确认筛选的FcγRIIB阳性群中是否有FcγRIIA(H131或R131)和FcγRIIIA(F158或V158)不结合或结合弱的克隆，即只对FcγRIIB高结合，而与其他受体维持原野生型结合力或结合力减弱的克隆。我们将FcγRIIB富集后的突变库2和突变库4分别用FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)进行染色。
各取5×105个二轮富集后突变库2或突变库4的FcγRIIB阳性群细胞，按照与实施例3.3中所述相同的方式，使用250nM生物素化的FcγR(即，FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIIA(F158)、或FcγRIIIA(V158))、以及streptavidin-PE(1:1000稀释)和anti-FLAG-FITC(1:200稀释)进行细胞染色，并使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞上携带的PE荧光染料和FITC荧光染料的荧光。
结果如图9B所示，其中每一个库流式图中圈门是以blank的FITC的本底荧光值确定门的左边界，同时因为是负染色，以WT的PE荧光确定门的上边界，以显示不被相应受体染色或染色较弱的细胞群。从图中可以看出，突变库2中有分别针对FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)的阴性群(参见，图中的门内细胞)，突变库4中有分别针对FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)的阴性群(参见，图中的门内细胞)。但是突变库4中针对FcγRIIA(R131)的阴性群并不明显，这与后续SPR结果和现有技术中的报道是一致的，即，很难将Fc克隆对FcγRIIB和FcγRIIA(R131)的结合进行区分，这可能由于两种受体在结构上极度相似导致的。
根据上述流式染色分析结果，对经过FcγRIIB正筛选的上述突变库2和4分别进行负筛选。方法如下：
将二轮正筛选后分选的细胞培养于DMEM中增殖，之后用STEMPRO ACCUTASE(Thermo Fishier Scientific，货号：A1110501)将细胞消化下来，重悬于1ml含5％血清的FACS Buffer中，4摄氏度封闭30min。1000rpm离心5min，取细胞沉淀，重悬于含有1ml 250nM生物素化的FcγR的含5％血清的FACS Buffer中，4摄氏度孵育30min。1000rpm离心5min，用500ul FACS buffer洗涤细胞，重复洗涤步骤3次。之后加入含有streptavidin-PE(1:1000稀释，购买自Thermo Fishier Scientific，货号21627)和anti-FLAG-FITC(1:200稀释，购买自SIGMA，货号F4049-.2MG)的含5％血清的FACS Buffer，于4摄氏度孵育20min。1000rpm离心5min，用500ul FACS buffer洗三次，重悬于500ul FACS Buffer中。使用BD公司FACSAria III流式细胞仪分选出前1％PE-FITC+细胞群。分选出的细胞于24孔板中继续增殖，随着细胞的增殖将其转移至6孔板，T75细胞培养瓶中继续培养。
针对突变库2经过两轮FcγRIIB染色已经富集的细胞群，以FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)分别进行负筛选。如图10所示，从图示分选门中按1％比例选取FcγRIIIA(F158)或FcγRIIIA(V158)结合阴性的细胞群。
针对突变库4经过两轮FcγRIIB染色已经富集的细胞群，以FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)分别进行负筛选。如图11所示，从图示分选门中按1％比例分别选取对FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)结合阴性的细胞群。
实施例10
二代测序(NGS)鉴定针对FcγRIIB富集的Fc突变体
(1)FcγR2B正筛选之后的细胞群(突变库1,2,3,4)与未筛选之前的原始库细胞群(原始库1,2,3,4)的比较。
将利用FcγRIIB富集后的突变库1、突变库2、突变库3、突变库4的细胞，通过lysisbuffer裂解后，分别用带不同barcode的正反向引物将Fc突变区序列通过PCR扩增出来，并进行二代测序，相应引物见表6。同时也对未进行富集的突变库1(原始库1)、突变库2(原始库2)、突变库3(原始库3)、突变库4(原始库4)进行二代测序，相应引物见表7。测序方法同实施例4.1中所述。
表6：用于富集后的突变库扩增的引物
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
表7：用于富集前的突变库(即，原始库)扩增的引物
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
比较每个突变库富集前后的突变体种类及其出现频数的累积曲线。结果如图12所示。经过FcγRIIB富集后的突变库Fc种类明显减少，高亲和力Fc突变体得到富集。
将FcγRIIB富集后的突变库和原始库的二代测序结果，按照实施例4中所述相同的方式，进行WebLogo作图，结果如图13所示。比较相应突变区域优势氨基酸的变化情况：突变库1中G236N、P238V得到明显富集；突变库2中S267E得到明显富集，突变库3中Y296S、Y300K得到明显富集；突变库4中并未出现特定氨基酸富集，但328位的优势氨基酸种类变化明显，除了L残基外，出现了其它数种频数明显增多的氨基酸残基。
根据WebLogo图，富集后，突变区1-4分别表现出如下优选的序列基序：
突变区1(EU编号233-238位)：ELX1X2GX3，其中X1＝任何氨基酸，优选L；X2＝G/N/D；X3＝P/V/D/W/F，优选P/V；
突变区2(EU编号265-271位)：DX1X2X3X4DP，其中X1＝V/I/L，优选V；X2＝E/S/D，优选E；X3＝H/D；X4＝E/G；
突变区3(EU编号295-300位)：QX1NSTX2,其中X1＝S/Y,优选S；X2＝K/Y，优选K；
突变区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝任何氨基酸，优选L/S/T/W/A/F。
(2)FcγRIIB正筛选并且负筛之后的细胞群与未筛选之前的原始库细胞群的比较(突变库2,4)
将突变库2经过两轮FcγRIIB染色富集并经过FcγRIIIA(F158)或FcγRIIIA(V158)负筛选后得到的细胞，通过lysis buffer裂解后，分别用带不同barcode的正反向引物，将Fc突变区序列通过PCR扩增出来，并进行二代测序，相应引物见表8。
表8：用于正负筛选富集后的突变库2扩增的引物
| 突变库2[FcγRIIIA(F158)负筛选] | 突变库2[FcγRIIIA(V158)负筛选] | |
| 正向引物(5’到3’) | ACAGTG AAAACTCACACATGC | CAGATC AAAACTCACACATGC |
| 反向引物(5’到3’) | GCCAAT CAGCCAGTCCTGGTG | ACTTGA CAGCCAGTCCTGGTG |
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
将上述两个筛选后的突变库2与原始库2进行突变体累积曲线的比较，结果如图14所示。
将上述两个筛选后的细胞库与原始库2的二代测序结果进行WebLogo作图，结果如图15所示。比较相应突变区域优势氨基酸的变化情况：S267E得到明显富集。
根据WebLogo图，负筛后突变区2分别表现出如下优选的序列基序：
FcγRIIIA(V158)负筛选：
突变区2(EU编号265-271位)：DX1X2X3X4DP，其中X1＝V/L，优选V；X2＝E/S/Q；X3＝H/Q；X4＝E/G/P；
FcγRIIIA(F158)负筛选：
突变区2(EU编号265-271位)：DX1X2X3X4DP，其中X1＝V/I/L，优选V；X2＝E/S/Q,优选E；X3＝H/D/Q；X4＝E/G。
将突变库4经过两轮FcγRIIB染色富集并经过FcγRIIIA(F158)或FcγRIIIA(V158)或FcγRIIA(H131)或FcγRIIA(R131)负筛选，得到的细胞通过lysis buffer裂解后，分别用带不同barcode的正反向引物将Fc突变序列通过PCR扩增出来，并进行二代测序，相应引物见下表9。
表9：用于正负筛选富集后的突变库4扩增的引物
注：用于不同库扩增的引物分别在5’端携带有不同的barcode
将上述四个筛选后的突变库4与原始库4进行突变体累积曲线的比较，结果如图14所示。
将上述四个筛选后的细胞库与原始库4的二代测序结果进行WebLogo作图，结果如图16所示。比较相应突变区域优势氨基酸的变化情况：
相对于突变库4正筛选后得到的weblogo图，FcγRIIA(R131)负筛选后，各位置的优势氨基酸残基变化不大，这与之前获得的结果——难于区分Fc对FcγRIIB和FcγRIIA(R131)的结合——相符。
但，相对于突变库4正筛选后得到的weblogo图，FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)和FcγRIIA(H131)负筛后，可以看出A327 E的频数进一步增加，尤其是在FcγRIIIA(V158)和FcγRIIA(H131)负筛后。此外，经过FcγRIIIA(V158)或FcγRIIA(H131)负筛后，L328F的频数也得到进一步明显富集。
根据WebLogo图，富集后，突变区4分别表现出如下优选的序列基序：
FcγRIIIA(F158)负筛选：
突变区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝任何氨基酸，优选L/S/W/F/T。
FcγRIIIA(V158)负筛选：
突变区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝F/L/W/Y，优选F；
FcγRIIA(H131)负筛选：
突变区4(EU编号326-332位)：X1X2X3PAPI，其中X1＝任何氨基酸，优选K；X2＝A/E；X3＝L/F/W/Y，优选L/F。
实施例11
FcγRIIB结合的Fc突变体的SPR分析
根据深度测序结果：
(1)突变库2中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIIA(F158)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：2F-10、2F-3、2V-3、2V-9。
(2)突变库2中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIIA(V158)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：2F-10、2V-9、D2-1、2V-3.
(3)突变库4中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIIA(F158)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：4F-6、4R-18、4R-14、D4-1.
(4)突变库4中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIIA(V158)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：4F-6、D4-1、4R-3、4H-21.
(5)突变库4中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIA(H131)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：4F-6、4R-3、D4-3、4H-21.
(6)突变库4中经过两轮FcγRIIB正筛选并经过FcγRIIA(R131)负筛选后富集程度前4名的突变体分别是：4R-18、4R-14、4V-14、4R-3.
(7)突变库1中经过4轮FcγRIIB正筛选后富集程度最高的突变体分别是：1B-7。
(8)突变库3中经过4轮FcγRIIB正筛选后富集程度最高的突变体分别是：3B-4。
以上突变体的序列见下表10.
表10：进行检测的Fc变体的序列
按照与实施例5中所述相同的方式，进行上述Fc变体的表达和SPR分析。简言之，将上述Fc突变体，通过pFUSE载体在293FT细胞中表达并纯化。通过使用Biacore T200(GEHealthcare)，测量这些Fc变体与FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB的结合能力，并与野生型Fc(WT)进行比较。
各Fc突变体与FcγR受体之间的亲和力，即在同一Fc测定浓度下检测到的结合量RU，如图17所示。从图17可见，绝大部分测定的Fc变体对FcγRIIB都表现出高于野生型Fc的结合亲和力(RU值)。这些高亲和力的Fc变体在序列上与之前weblogo分析得出的优势氨基酸残基和优选序列基序相符合。此外，从结果可见，与FcγRIIB结合能力强的克隆都伴随着与FcγRIIA(R131)结合能力的增强，即Fc无法对这两种FcR进行区分，该结果与图9B的流式图和图16的weblogo图的结果是一致的。
实施例12
组合突变体的构建和SPR分析
在实施例11检测的突变Fc中，与野生型WTFc相比，突变库2中的2F-10,2F-3,2V-3和突变库4中的4R-14,4F-6显示出对FcγRIIB较高的结合能力。将4R-14分别与2F-10,2F-3,2V-3进行组合，产生的组合变体Fc分别命名为VAA-2F-10,VAA-2F-3,VAA-2V-3。将4F-6分别与2F-10,2F-3,2V-3进行组合，产生的组合变体Fc分别命名为KEF-2F-10,KEF-2F-3,KEF-2V-3。组合变体的序列见下表。
表：包含突变区2和4的组合突变的Fc变体
将这些组合突变体，通过pFUSE载体在293FT细胞中表达并纯化后，测定对FcγRIIIA(F158)、FcγRIIIA(V158)、FcγRIIB、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)的结合能力，并与野生型Fc(wt)以及组合前的对应克隆进行比较。SPR分析方法与实施例6中所述方法相同。各Fc突变体与FcγR受体之间的亲和力，即在使用同一Fc测定浓度下的结合量RU，如图18所示。
实施例13
FcγRIIB结合Fc变体的功能性分析
激动剂抗体中Fab结构域的靶向结合特性是关键的因素，但抗体Fc结构域和FcγR(IgG Fc段受体)之间的相互作用也可以决定激动剂的潜力。研究证明FcγRIIB为共刺激受体如CD28、CD40、OX40和4-1BB的最佳激动剂激活所需。为此，在本实施例中，将实施例12筛选获得的Fc组合突变引入激动型抗体中，检测其介导的细胞激活效应。
将实施例12的Fc组合突变VAA-2F-10,VAA-2F-3,VAA-2V-3、KEF-2F-10,KEF-2F-3,KEF-2V-3和突变2F-10，引入野生型hIgG1 Fc区(SEQ ID NO:1，由铰链区和CH2和CH3组成)序列中。将得到的变体Fc区与CD40激动型抗体的VH-CH1段进行连接，通过插入EcoRI/NheI消化的pFUSE表达载体中，构建获得重链突变体的表达质粒。
将提前培养的293F细胞密度调整至5×105个/ml，共50ml培养物，用于抗体表达质粒的转染。在转染当天，将25ug重链突变体表达质粒和25ug轻链表达质粒与150ul PEI(购自Polysciences，Inc.货号：24885)混合。室温孵育20min后，将混合液滴加入293F细胞培养物中，于37摄氏度细胞培养箱中转染并表达4天。4天后，3000rpm离心细胞培养物20min，取上清，过0.45um滤膜(津隆，货号：JKLM50-0.45S)，根据1ml亲和层析柱Protein A(GE Healthcare,17-0402-01)操作说明书在GE公司纯化仪AKTA pure上对抗体进行纯化。
CD40激动型抗体重链的氨基酸序列(具有野生型hIgG1 Fc区)：(SEQ ID NO:10)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARERVGATPTYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CD40激动型抗体轻链的氨基酸序列：(SEQ ID NO:11)
DVVMTQSPLSLPVTPGESATISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLLKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQGLETPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
提前铺5×106个293FT于10cm2 dish中，于10ml DMEM培养基中培养24小时。将16ugpCDH-FcγRIIB(在pCDH载体多克隆位点中插入全长FcγRIIB基因)质粒与80ul PEI于1mlOpti-MEM(购自Thermo Fisher Scientific，货号：31985088)中孵育10min，滴加入细胞中。转染6小时后，换成新鲜DMEM培养基，继续表达24h。转染后的细胞命名为293FT-FcγRIIB，该细胞表面表达FcγRIIB。
以pCDH-CD40(CD40表达质粒)、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G共同转染293FT细胞，收集慢病毒，感染NF-κB/Jurkat/GFP细胞(System Biosciences，货号TR850A-1)，挑选单克隆细胞，构建成Jurkat-CD40-GFP细胞系。
以1×105个/孔的密度将293FT-FcγR2B细胞铺于48孔板中，每孔加入1×105个Jurkat-CD40-GFP细胞系，并与不同浓度抗体孵育24h，其中抗体的起始浓度3ug/ml,作3倍稀释，最终浓度0.0002ug/ml，共10个浓度梯度。之后，使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测Jurkat-CD40-GFP细胞中GFP的强弱，据此计算MFI，以比较各突变体与野生型(wt)引起的细胞激活程度。结果如图19A所示。所有组合后的11-1突变体的激活能力都强于野生型11-1。这与这些突变体在前面SPR实验中表现出的更高的FcγRIIB结合力是一致的。
从非线性回归曲线(图19A)，计算抗体的EC50值,即半数激活浓度(由GraphPad软件得出)。各Fc变体的EC50列于下表10中。
表10：包含Fc变体的CD40抗体的激活能力
相对于野生型Fc，筛选获得的Fc变体在EC50值上达到了大约27倍或50倍的改善。而且，相对于单突变区中的突变，在突变区2和4中的组合突变进一步改善了抗体的激活效应。例如，相对于11-1 2F-10，11-1KEF-2F-10和11-1VAA-2F-10都表现出了更低的EC50，说明引发了更强的激活效应。这表明KEF突变和VAA突变可以在原突变2F-10的基础上增强激活细胞系的能力，这与这些组合变体在SPR实验中表现的更高的FcγRIIB结合能力相一致。
实施例14FcγRIIB结合Fc变体的功能性分析
本实施例检测上述组合突变在另一激动型抗体中的作用。将实施例12的Fc组合突变VAA-2F-10,VAA-2F-3,VAA-2V-3、KEF-2F-10,KEF-2F-3,KEF-2V-3和突变2F-10引入野生型hIgG1 Fc区(SEQ ID NO:1，由铰链区和CH2和CH3组成)序列中。将得到的变体Fc区与4-1BB激动型抗体(Utomilumab)的VH-CH1段进行连接。表达纯化方法如实施例13。
以pCDH-4-1BB(4-1BB表达质粒)、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pCMV-VSV-G共同转染293FT细胞，收集慢病毒，感染NF-κB/Jurkat/GFP细胞(System Biosciences，货号TR850A-1)，挑选单克隆细胞，构建成Jurkat-4-1BB-GFP细胞系。
以1×105个/孔的密度将如实施例13中构建的293FT-FcγR2B细胞铺于48孔板中，每孔加入1×105个Jurkat-4-1BB-GFP细胞系，并与6.5ug/ml抗体孵育24h。使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测Jurkat-4-1BB-GFP细胞中GFP的强弱，据此计算MFI，并做柱状图以比较各突变体与野生型(wt)引起的细胞激活程度。结果显示，所有变体MFI均强于WT，如图19B。
Utomilumab激动型抗体重链的氨基酸序列(具有野生型hIgG1 Fc区)：(SEQ IDNO:12)
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Utomilumab激动型抗体轻链的氨基酸序列：(SEQ ID NO:13)
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
实施例15FcγRIIB结合Fc变体的功能性分析
将实施例12中包含突变区2和4的组合突变的Fc变体VAA-2F-3，与实施例10中针对FcγRIIB正筛确定的突变区1的优势残基G236D或P238D，进一步组合，形成如下组合突变：
按照实施例13所述的方法，将这些组合突变引入CD40激动剂型抗体中，检查其介导的细胞激活效应。
(1)体外激活过表达FcγRIIB、FcγRIIA(R131)、FcγRIIA(H131)的293FT细胞
按照实施例13所述的方法，构建过表达FcγRIIB、FcγRIIA(R131)、FcγRIIA(H131)的293FT细胞，使用Jurkat-CD40-GFP细胞系检测引入了组合突变的抗体和野生型抗体在这些293FT细胞上介导的细胞激活效应。结果如图25A和下表所示。
表11：包含Fc变体多肽vs.野生型Fc多肽的CD40抗体介导的细胞激活效应
(2)体外激活人B细胞
用Miltenyi Biotec公司的CD19 MicroBeads从健康人外周血单核细胞(PBMC)中分离B细胞。将1×105个B细胞重悬于100μl RPMI培养基并加入96孔板中，然后加入10倍梯度稀释的CD40抗体，对照组抗体(Ctrl IgG，同种型无关抗体)以最高浓度加入，即100μg/ml。刺激48小时后，将细胞重悬于含5％血清的FACS Buffer中，4摄氏度孵育30min。200g离心5min后，用500ul FACS buffer洗涤细胞，重复洗涤步骤3次。之后加入含有anti-CD19-PE(1:200稀释，购买自BioLegend)和anti-CD86-APC(1:200稀释，购买自BioLegend)或anti-HLA-DR-FITC(1:200稀释，购买自BioLegend)的含5％血清的FACS Buffer，于4摄氏度孵育20min。200g离心5min，用500ul FACS buffer洗三次，重悬于500ul FACS Buffer中。使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞表面因激活而上调的CD86或者HLA-DR。
结果如图25B所示，组合Fc变体相对于野生型Fc多肽，不同程度地加大了体外对B细胞的激活。
(3)体内免疫激活效应
实施OVA特异性CD8+T细胞激活实验，检测具有不同Fc区的CD40抗体的体内免疫激活效应。
提前一天，将2×106个CD45.1+splenic OT-I细胞通过尾静脉注射FcγR/CD40人源化小鼠，其中OT-I细胞来源于OT-I小鼠(The Jackson Laboratory,货号003831)的脾脏经裂红后获得。一天后，腹腔注射2μgDEC-OVA蛋白和10μg对照抗体(Ctrl IgG，同种型无关抗体)或者CD40抗体。第6天，将小鼠脾脏取出，研磨成单细胞。在裂解红细胞后，用anti-CD4(ebioscience,clone RM4-5),anti-CD8(Biolegend,clone53-6.7),anti-CD45.1(Biolegend,clone A20),anti-TCR-Vα2(Biolegend,clone B20.1)抗体对OVA特异性CD8+T(即CD45.1+splenic OT-I)细胞进行染色。其中加入DAPI(Invitrogen,D3571)用于在圈门时去除死细胞。OVA特异性CD8+T细胞被定义为CD45.1+CD8+TCR-Vα2+细胞。使用BD公司的LSRFortessa流式细胞仪检测并计算CD45.1+splenic OT-I细胞和CD8+T细胞的数量。
结果显示在图25C中，具有不同Fc区突变的CD40抗体表现出不同的体内免疫激活效应，其中具有最大FcγRIIb/FcγRIIaR131结合能力比值(表11，EC50比值＝0.06)的Fc组合突变P238D+V266I+S267E+K326V+L328A表现最佳。
实施例16使用具有蛋白岩藻糖基化缺陷的CHO细胞展示Fc多肽
在本实施例中研究了岩藻糖基缺陷哺乳动物细胞作为Fc多肽展示平台的应用。
基本上按照Yamane-Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)614-622中所述，产生α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞，命名为clone9细胞。
按照实施例1.1和1.2所述方法，构建表达野生型Fc蛋白(具有SEQ ID NO:1的Fc区)和Fc变体蛋白(具有突变组合2E-4-16(H268E/K326S/I332E)和2E-4-25(H268E/K326M/I332E))的pCDH2质粒，并转染CHO-K1细胞或clone9细胞。之后，按照如实施例1.3中所述，利用生物素化FcγRIIIA、streptavidin-PE和anti-FLAG-FITC进行细胞染色，并使用BD公司的LSR Fortessa流式细胞仪检测细胞上携带的PE荧光染料和FITC荧光染料的荧光。结果如图26所示。
如图26所示，去岩藻糖细胞CHO作为展示平台，相比于对照CHO-K1细胞展示平台，野生型和变体Fc多肽的细胞表面受体FcγRIIIA结合荧光信号都有增强，这有利于荧光分选信号的检查。
而且，如图26所示，去岩藻糖与有效FcγRIIIA增强性变体2E-4-16和2E-4-25的组合，对展示在细胞表面的受体结合荧光信号，表现出了协同增效作用。相对于CHO-K1展示平台，去岩藻糖细胞展示平台更FcγRIIIA增强性变体的荧光分选富集和后续有效变体的获得。
本发明涉及的一些实施方案如下：
1.用于筛选和/或鉴定具有Fc配偶体，优选Fc受体结合性质改变的Fc变体的方法，其中使用在细胞表面上展示Fc多肽的哺乳动物细胞文库。
2.前述实施方案的方法，其中细胞文库是表达多样的Fc变体序列的多数个细胞克隆，优选地，基于Fc与FcγR复合体结构，选取用于引入序列多样性的Fc区域。
3.前述实施方案的方法，其中细胞文库包含至少103、104、105、106、或107个细胞克隆。
4.前述实施方案的方法，其中Fc多肽是包含Fc区的融合蛋白，其从N端到C段包含：
信号序列；标签序列；Fc区；跨膜结构域，其中各部分之间任选地由接头连接。
5.前述实施方案的方法，其中Fc区包含CH2区和CH3区，以及任选地铰链区。
6.前述实施方案的方法，其中Fc多肽还可以包含CH1区，该CH1区通过铰链区连接在CH2区之前。
7.前述实施方案的方法，其中所述筛选和/或鉴定包括：
-使标记的Fc受体与细胞文库接触，从而允许标记的Fc受体与细胞展示的Fc多肽结合；
-检测与细胞表面结合的Fc受体的量；
-基于所述结合量，从文库中选择细胞克隆。
8.实施方案7的方法，其中所述筛选和/或鉴定还包括确定Fc多肽在细胞克隆上的展示水平的步骤，优选地包括：
-使标记的标签序列结合分子与细胞文库接触，从而允许标签序列结合分子与细胞展示的Fc多肽结合；
-检测与细胞表面结合的标签序列结合分子的量，以确定Fc多肽在细胞上的展示水平；
优选地，其中所述筛选和/或鉴定还包括如下步骤：
-基于所述展示水平，对测量的细胞上的Fc受体结合量进行标化，
-基于所述标化后的结合量，从文库中选择细胞克隆，以富集或去除对所述Fc受体具有高亲和力的Fc多肽。
9.实施方案7的方法，其中所述Fc受体为生物素化的，所述受体通过标记的抗生物素分子进行标记。
10.实施方案8的方法，其中，使细胞文库同时接触Fc受体和标签序列结合分子。
11.实施方案8的方法，其中，同时检测细胞上Fc多肽的展示水平和Fc多肽的Fc受体结合能力。
12.实施方案7-11的方法，其中所述标记为荧光标记，其中用于标记标签序列结合分子的荧光染料，与用于标记Fc受体的荧光染料，具有不同的波长。
13.实施方案8的方法，其中基于标化后的结合量，选择文库中所述结合量最高的前5％，或前1％，或前0.5％的细胞克隆成员；或者基于标化后的结合量，选择文库中所述结合量最低的前5％，或前1％，或前0.5％的细胞克隆成员。
14.实施方案1-13的方法，其中使用流式细胞分选，进行细胞克隆成员的选择。
15.实施方案1-14的方法，其中Fc受体为选自FcγRIIIA F158/V158，FcγRIIAR131/H131和FcγRIIB中的一者或多者。
16.实施方案1-15的方法，其中所述选择为正向选择，以富集展示的Fc多肽对Fc受体具有相对高亲和力的细胞克隆。
17.实施方案1-15的方法，其中所述选择为负向选择，以选择除去展示的Fc多肽对Fc受体具有相对高亲和力的细胞克隆。
18.实施方案1-16的方法，其中针对一种或多种Fc受体进行正向选择后，针对另一种或多种Fc受体进行负向选择，
19.实施方案18的方法，其中，所述筛选/鉴定包括：利用FcγRIIB对文库进行正向选择，收集显示相对高FcγRIIB结合量的细胞克隆群体，在收集的细胞群体上利用FcγRIIIA进行负向选择。
20.实施方案1的方法，其中，对筛选/鉴定获得的细胞克隆群体中的Fc变体多肽编码核酸，进行深度测序，基于测序结果，选择Fc变体多肽编码核酸。
21.实施方案20的方法，其中，采用二代测序，优选基于桥式PCR的二代测序方法，进行深度测序，例如HiSeqTM测序平台。
22.实施方案20的方法，其中，将深度测序获得的序列，转化为其编码的氨基酸序列，计数各氨基酸序列的出现频数并基于频数进行序列排序，由此确定优势氨基酸序列；
其中任选地，进一步通过所述氨基酸序列的多序列比对，确定一个或多个指定氨基酸位置的优势氨基酸残基，
优选地，优势氨基酸残基通过使用WebLogo作图进行确定；
优选地优势氨基酸残基是，在深度测序得到的序列读数上，于一个指定的氨基酸位置上出现频数最高的前1-20种、前1-15种、或前1-10种氨基酸，例如前1-9种、前1-7种、前1-6种，优选地前1-5种，前1-4种、前1-3种、更优选地前1-2种氨基酸；
优选地，将分选后的细胞群体的深度测序结果，与参考细胞群体的深度测序结果进行比较，以确定优势氨基酸残基，优选地参考细胞群体可以是例如，筛选前的文库细胞群体，或在进行多轮筛选的情况下，经历1轮或多轮筛选后收集的细胞群体。
23.实施方案22的方法，其中基于序列种类的排序和/或优势氨基酸的存在与否，选择Fc变体多肽编码核酸。
24.一种产生Fc变体多肽的方法，包括：
-构建Fc变体多肽展示文库，其中将多数个Fc变体编码核酸序列引入哺乳动物细胞中并表达，形成所述展示文库，其中文库中每个哺乳动物细胞克隆在其表面上展示Fc变体多肽；
-基于细胞表面上的Fc变体多肽与FcγR受体的结合性质，分选文库中的细胞克隆；
-对选择的具有所述结合性质的细胞克隆群体，进行Fc变体多肽编码核酸的深度测序；
-基于深度测序结果，选择Fc变体多肽。
25.一种鉴定Fc区中的优势氨基酸位置的方法，包括：
-构建Fc变体多肽展示文库，其中将多数个Fc变体编码核酸序列引入哺乳动物细胞中并表达，形成所述展示文库，其中文库中每个哺乳动物细胞克隆在其表面上展示Fc变体多肽；
-基于细胞表面上的Fc变体多肽与FcγR受体的结合性质，分选文库中的细胞克隆；
-对选择的具有所述结合性质的细胞克隆群体，进行Fc变体多肽编码核酸的深度测序；
-基于深度测序结果，确定Fc多肽序列中有利于引入突变以改变Fc多肽的FcγR结合性质的氨基酸位置。
26.一种鉴定Fc区中的优势突变区域或优势氨基酸序列的方法，包括：
-构建Fc变体多肽展示文库，其中将多数个Fc变体编码核酸序列引入哺乳动物细胞中并表达，形成所述展示文库，其中文库中每个哺乳动物细胞克隆在其表面上展示Fc变体多肽；
-基于细胞表面上的Fc变体多肽与FcγR受体的结合性质，分选文库中的细胞克隆；
-对选择的具有所述结合性质的细胞克隆群体，进行Fc变体多肽编码核酸的深度测序；
-基于深度测序结果，确定Fc多肽序列中有利于引入突变以改变Fc多肽的FcγR结合性质的优势突变区域，其中所述确定任选地包括与参考细胞克隆群体进行比较，所述参考群体例如为未经分选的展示文库。
27.实施方案25和26的方法，其中，对深度测序获得的细胞克隆群体序列，根据其编码的氨基酸序列，进行序列种类的排序，和/或确定指定氨基酸位置的优势氨基酸，优选地所述优势氨基酸是在深度测序所选细胞克隆群体后获得的序列上，于一个指定的氨基酸位置上出现频数最高的前1-20种、前1-15种、或前1-10种氨基酸，例如前1-9种、前1-7种、前1-6种，优选地前1-5种，前1-4种、前1-3种、更优选地前1-2种氨基酸。
28.实施方案27的方法，其中基于序列种类的排序和/或优势氨基酸的存在与否，选择Fc变体多肽中的优势氨基酸和/或优势突变区域。
29.实施方案1-28的方法，其中向IgG1 Fc区的以下四个区域中的一个或多个中引入突变，优选在突变区域2-4的一个或多个中引入突变，以产生用于文库构建的所述多数个Fc变体多核苷酸：
-突变区域1：残基233-238位，
-突变区域2：残基265-271位，
-突变区域3：残基295-300位和
-突变区域4：残基326-332位。
30.实施方案29的方法，其中相对于野生型Fc，选择FcγRIIIA受体结合能力增强的Fc变体，优选地所述Fc变体具有选自以下的选自：
-基本不变或降低的FcγRIIB结合能力；
-增加的FcγRIIIA/FcγRIIB受体结合能力比值；
-同时增加的FcγRIIIA-F158和V158结合能力。
31，实施方案29的方法，其中相对于野生型Fc，选择FcγRIIB结合能力增强，优选地FcγRIIIA或FcγRIIA受体结合能力不变或降低，的Fc变体，其中所述Fc变体更优选地具有增加的FcγRIIB与FcγRIIA或者FcγRIIIA结合能力比值，尤其是FcγRIIB与FcγRIIIA-R131结合能力比值。
32.通过实施方案1-31的方法产生的具有改变的FcγR结合性质的Fc变体多肽。
33.一种Fc变体多肽，其在IgG Fc序列中，优选地SEQ ID NO:1的序列中，包含选自如下的突变：
S267A、H268E、H268G、D270E、Q295C、Q295L、Y296W、I332E、I332D；
K326M/S/I/T+I332E/D；A330T/G/V/Y+I332E/D；K326T+A330M；H268E/D；H268E/D+S267A；H268G+D270E；Q295L+Y296W；
其中，所述Fc变体与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性，其中，残基位置为根据EU编号的位置。
34.根据实施方案33的Fc变体多肽，其中突变选自：
| K326M+I332E | A330T+I332E |
| K326S+I332E | A330G+I332D |
| K326I+I332E | A330V+I332D |
| L328T+I332E | A330Y+I332D |
| K326T+A330M | H268G+D270E |
| H268E | S267A+H268E |
| I332D | |
| Q295C | Q295L+Y296W |
35.实施方案34的Fc变体，包含突变：H268E，
且包含选自以下的突变：
K326M+I332E、K326S+I332E、K326I+I332E、L328T+I332E、A330T+I332E、A330G+I332D、A330V+I332D、A330Y+I332D、K326T+A330M。
36.实施方案34的Fc变体，包含突变：H268E，
且包含选自以下的突变：
K326M+I332E、K326S+I332E、K326I+I332E、A330T+I332E、A330Y+I332D，
优选，所述Fc变体相对于野生型Fc多肽引起增加的ADCC活性。
37.一种Fc变体多肽，其在IgG Fc序列中，优选地SEQ ID NO:1的序列中，包含选自如下的突变：
| P331N+I332M | S267E+E269G |
| K326V+L328A | V266I+S267E |
| A330R+I332D | S267E+H268D |
| L328F+A330S | V266L+S267Q+H268Q |
| A327E+L328F | E269P |
| K326D+P331S | G236N+P238V |
| A327E+L328W | Y296S+Y300K |
| K326P+L328F |
更优选包含选自以下的突变：
| K326V+L328A | S267E+E269G |
| A327E+L328F | V266I+S267E |
| S267E+H268D |
最优选包含选自以下的突变：K326V+L328A，A327E+L328F，S267E+H268D，
其中，所述Fc变体与SEQ ID NO:1具有至少95％的序列同一性，其中，残基位置为根据EU编号的位置。
38.实施方案36的Fc变体多肽，其包含选自如下的组合突变：
/>
其中，优选地包含所述Fc变体的抗体，相对于包含野生型Fc变体的抗体，具有增强的细胞激活效应。
39.一种融合蛋白，其包含实施方案32-38的Fc变体序列，优选所述融合蛋白是抗体。
40.一种组合物，其包含实施方案39的融合蛋白，例如抗体。
41.一种产生Fc变体方法，所述方法包括步骤：
(a)构建哺乳动物细胞Fc多肽展示系统；
(b)分选(尤其是通过流式细胞术分选)展示文库成员；
(c)对分选所得的文库成员进行深度测序和聚类分析，得到相对于参考Fc多肽结合性质改变的Fc变体；和任选地
(d)对获得的Fc变体进行结合性质检测。
42.实施方案41的方法，其中步骤(a)的展示系统构建包括：
提供在细胞表面展示经修饰的Fc区多肽的哺乳动物细胞文库，其中所述细胞文库包含至少两种哺乳动物细胞，其中每一哺乳动物包含不同的经修饰的Fc区多肽；
其中，利用病毒载体(优选慢病毒载体)，构建所述的哺乳动物细胞展示文库，
其中病毒载体包含表达盒，所述表达盒以多肽翻译的5’至3’方向包含
-任选地，编码分泌性信号序列的核酸，优选信号序列为可以引导Fc区多肽分泌出细胞的信号肽，例如，IL-2蛋白信号肽；
-编码标签序列的核酸，优选标签序列为表位标签序列，例如HA表位标签，Flag标签序列，c-myc表位标签；
-编码Fc区变体多肽的核酸，优选IgG1,IgG2,IgG3,IgG4的Fc区，更优选人IgG1 Fc区，最优选SEQ ID No:1中所示的人IgG1 Fc区多肽的变体，例如包含1-10个突变，如1，2，3，4或5个突变；
-编码跨膜结构域的核酸；其中所述跨膜结构域将Fc锚定在细胞膜表面，优选跨膜区来自哺乳动物细胞表面表达的蛋白质，例如PDGFR蛋白的跨膜区，例如SEQ ID NO:4所述的跨膜区序列；
优选，Fc区变体通过接头与标签序列和跨膜结构域连接；
优选，表达盒在启动子，例如诱导性启动子控制下；
优选通过随机化编码Fc区多肽的核酸的至少一个密码子来获得文库的多样性；优选地，在引入多样性之前，基于结构分析，选择待引入突变的突变区域。
43.根据实施方案41的方法，其中步骤(b)的展示文库成员分选包括：
(b1)使用哺乳动物细胞Fc多肽展示系统，根据细胞表面展示的Fc区多肽的特性，从哺乳动物细胞文库选择细胞群；
(b2)任选地，将分选出的细胞进行增殖，并就相同结合性质或不同结合性质，重复该选择；
其中，所述选择包括：
-通过用不同标记(优选荧光标记)的目的Fc受体和标签序列，染色展示在细胞表面的Fc区变体多肽；
-(优选通过流式细胞分选)，基于细胞上两种标记的染色强度，选择细胞。
44.根据实施方案41的方法，其中步骤(c)的深度测序和聚类分析包括：
将分选步骤(b)后获得的细胞群，进行深度测序，例如二代测序(NGS)，并对测序得到氨基酸序列进行聚类分析，以鉴定具有期望的FcγR结合性质的Fc变体；
优选地，所述鉴定通过如下方式进行：
(c1)从细胞群PCR扩增经分选步骤富集后的突变库，任选地并行扩增步骤(a)的未经富集的突变库作为对照；优选地，PCR扩增长度为50-100bp之间，优选150bp；
(c2)采用二代测序，优选桥式PCR二代测序，获得突变库的突变区氨基酸序列；
(c3)对获得的测序结果，按照突变区氨基酸序列的种类和频数，进行聚类分析；
(c4)选择频数最高的前1-3％突变体，优选地所述选择的突变体包含优势氨基酸残基，其中所述优势氨基酸残基为在突变库的所有氨基酸序列中显著地出现在各氨基酸位置的残基，可以例如通过WebLogo作图，显示突变库的优势氨基酸残基。
45.一种鉴定Fc区中的优势氨基酸序列的方法，其中所述优势氨基酸序列有利于改善Fc区对目的Fc受体的结合性质，所述方法包括：
-构建Fc变体多肽展示文库，其中将多数个Fc变体编码核酸序列引入哺乳动物细胞中并表达，形成所述展示文库，其中文库中每个哺乳动物细胞克隆在其表面上展示Fc变体多肽；
-基于细胞表面上的Fc变体多肽与目的Fc受体的结合性质，分选文库中的细胞克隆；
-对选择的具有所述结合性质的细胞克隆群体，进行Fc变体多肽编码核酸的深度测序；
-基于深度测序结果，按照突变区氨基酸序列的种类和频数进行排序，
其中，频数最高的前1-100个、前1-90个、前1-80个、前1-70个或前1-60个突变氨基酸序列，优选前1-50个、前1-40个、或前1-30个、更优选前1-20个突变氨基酸序列、更优选前1-10个，1-9个、1-8个、1-7个、1-6个或1-5个，更优选前1-4个突变氨基酸序列，鉴定为Fc区的优势氨基酸序列；
或者，其中频数最高的前1-5％，1-4％，前1-3％，前1-2％的突变氨基酸序列被鉴定为Fc区的优势氨基酸序列。
Claims (28)
1.用于筛选Fc受体结合性质改变的Fc变体多肽的方法，其中使用在细胞表面上展示Fc多肽的哺乳动物细胞文库, 其中所述Fc多肽从N端到C端为：(i) 信号序列、(ii)标签序列、(iii)由铰链区与CH2和CH3结构域组成的Fc区、和(iv)跨膜结构域，其中(ii)-(iv)之间任选地由接头连接，且其中所述哺乳动物细胞为具有蛋白质岩藻糖基化缺陷的细胞，
其中所述方法包括：
(a) 构建所述展示Fc多肽的哺乳动物细胞文库，其中将在Fc区的一个或多个区域中包含突变的多数个Fc变体多肽编码核酸序列，引入哺乳动物细胞中并表达，形成所述展示文库，其中文库中每个哺乳动物细胞克隆在其表面上展示Fc变体多肽；
(b) 通过流式细胞术，基于细胞表面上的Fc变体多肽与目的Fc受体的结合性质，分选文库中的细胞克隆；
(c) 对分选获得的细胞群体进行Fc变体多肽编码核酸中突变区域的深度测序和聚类分析，选择Fc受体结合性质改变的Fc变体多肽；
其中所述聚类分析包括：
- 将深度测序获得的序列，转化为其编码的氨基酸序列，根据每种氨基酸序列的出现频数进行序列排序，由此确定优势氨基酸序列；任选地，进一步通过对所述转化的氨基酸序列进行多序列比对，确定一个或多个指定氨基酸位置的优势氨基酸残基，
-选择包含优势氨基酸序列的Fc变体多肽，任选地，所述Fc变体多肽还包含一个或多个优势氨基酸残基,
其中，步骤(c)的聚类分析还包括：
将分选后的细胞群体的深度测序结果，与参考细胞群体的深度测序结果进行比较，显示优势氨基酸残基的变化，以确定Fc多肽序列中有利于引入突变以改变Fc多肽的Fc受体结合性质的优势氨基酸位置，和/或确定有利于改变Fc多肽的Fc受体结合性质的优选序列基序，
其中，参考细胞群体是未经分选的文库细胞群体，或在进行多轮分选的情况下，经历了1轮或多轮分选的文库细胞群体。
2.权利要求1的方法，其中，相对于亲本Fc多肽，选择FcγRIIIA受体结合能力增强的Fc变体多肽。
3.权利要求1的方法，其中，所述Fc区为IgG1 Fc区。
4.权利要求1的方法，其中，使用表达所述Fc变体多肽的慢病毒载体，构建所述哺乳动物细胞文库。
5.权利要求1的方法，其中，基于序列的频数排序，鉴定所述优势氨基酸序列, 其中，频数最高的前1-100个、前1-50个、前1-10个或前1-5个突变氨基酸序列，被鉴定为优势氨基酸序列。
6.权利要求1的方法，其中，通过使用WebLogo作图，确定所述优势氨基酸残基；
其中，所述优势氨基酸残基是，在WebLogo图中，于一个指定的氨基酸位置上出现频数最高的前1-10种，或前1-5种，或前1-3种，或前1-2种的氨基酸。
7.权利要求1的方法，其中，步骤(c)的聚类分析还包括：绘制突变体累积曲线，判断分选后的变体富集程度。
8.权利要求1的方法，其中，在步骤(a)中，向Fc多肽的Fc区的一个或多个区域中引入一个或多个突变，以产生用于文库构建的所述多数个Fc变体编码核酸序列，
其中所述Fc区为IgG1 Fc区，并且所述突变引入包括在以下四个区域的一个或多个中引入一个或多个突变，
-突变区域1：残基233-238位，
-突变区域2：残基265-271位，
-突变区域3：残基295-300位，和
-突变区域4：残基326-332位。
9.权利要求1的方法，其中组合在步骤(c)中选择的不同突变区域的Fc区突变，进一步改善Fc变体的受体结合性质。
10.权利要求1的方法，其中所述Fc区通过接头与标签序列和跨膜结构域连接。
11.权利要求1的方法，其中所述标签序列为表位标签序列，选自：HA表位标签，Flag标签序列，和c-myc表位标签。
12.权利要求1的方法，其中所述跨膜区为来自哺乳动物细胞的PDGFR蛋白的跨膜区。
13.权利要求1的方法，其中，在步骤(b)中，所述分选包括
-使第一荧光标记的标签序列结合分子与文库细胞克隆接触，确定Fc多肽在细胞克隆上的展示水平；
-使第二荧光标记的目的Fc受体与文库细胞克隆接触，检测与细胞克隆表面结合的目的Fc受体的量；
-基于所述展示水平，对测量的细胞上的Fc受体结合量进行标化，
-基于所述标化后的结合量，从文库中分选细胞克隆，以富集相对于野生型Fc多肽具有改变的Fc受体结合性质的Fc多肽，
其中，用于标记标签序列结合分子的第一荧光染料，与用于标记Fc受体的第二荧光染料，具有不同的波长。
14.权利要求1的方法，其中，所述方法用于选择相对于亲本Fc多肽具有增加的第一Fc受体结合能力和不变或减弱的第二Fc受体结合能力的Fc变体多肽，
其中第一和第二Fc受体不同。
15.权利要求14的方法，其中，第一Fc受体为抑制型Fc受体且第二Fc受体为激动型Fc受体，或第一Fc受体为激动型Fc受体且第二Fc受体为抑制型Fc受体。
16.权利要求15的方法，其中，所述方法包括：
-在步骤(b)的分选中组合进行第一Fc受体驱动的正向选择和第二Fc受体驱动的负向选择，和
-将正向选择分选的细胞群体，与负向选择分选的细胞群体，进行优势氨基酸残基的比较，
其中，所述分选组合导致具有与第一Fc受体结合性质相关的优势氨基酸的Fc变体多肽在分选文库中的增加富集。
17.权利要求1的方法，其中所述方法用于选择相对于亲本Fc多肽具有如下结合性质改变的Fc变体多肽：
-具有增强的FcγRIIB结合能力；或
-具有增加的FcγRIIB与FcγRIIA或者FcγRIIIA结合能力比值。
18.权利要求17的方法，其中所述结合能力比值是FcγRIIB与FcγRIIAR131结合能力比值。
19.权利要求1的方法，其中所述方法用于选择相对于亲本Fc多肽具有如下结合性质改变的Fc变体多肽：
-同时增强的FcγRIIIAF158和FcγRIIIAV158结合能力；或
-增加的FcγRIIIA结合能力，但不变或降低的FcγRIIB结合能力；或
-增加的FcγRIIIA/FcγRIIB受体结合能力比值。
20.权利要求17的方法，其中，分选步骤(b)包括：
-使用FcγRIIB与文库接触，进行正向选择，
-使用FcγRIIIA或者FcγRIIA与文库接触，进行负向选择，
-分选相对于野生型Fc多肽，具有所述结合性质改变的Fc变体多肽。
21.权利要求19的方法，其中，分选步骤(b)中，使用FcγRIIIAF158和FcγRIIIAV158与文库接触，进行正向选择，分选相对于野生型Fc多肽具有所述结合性质改变的Fc变体多肽。
22.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞为FUT8敲除的CHO细胞。
23.一种Fc变体多肽，其为在亲本IgG1 Fc序列的基础上选自如下的突变：
S267E+E269G+ K326V+L328A；
V266I+S267E+ K326V+L328A；
S267E+H268D+ K326V+L328A；
G236D+V266I+S267E+ K326V+L328A；
P238D+V266I+S267E+ K326V+L328A；
其中，残基位置为根据EU编号的位置。
24.权利要求23的Fc变体多肽，其中所述亲本IgG1 Fc序列为SEQ ID NO: 1。
25.权利要求23或24的Fc变体多肽，其为去岩藻糖基化形式或低岩藻糖基化形式。
26.一种编码权利要求23至25任一项的Fc变体多肽的核酸分子。
27.一种包含权利要求26的核酸分子的宿主细胞。
28.包含权利要求23至25任一项的Fc变体多肽的抗体。
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