MX2011010814A - Conjugados de fragmentos cristalizables de inmunoglobulina 1 resistentes a la fragmentacion. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos que se refieren a los conjugados de Fc de IgG1 e IgG3 que son resistentes a la fragmentación y la agregación mediadas por radicales libres. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para fabricar los conjugados de Fc de la invención.

Description

CONJUGADOS DE FRAGMENTOS CRISTALIZABLES DE INMUNOGLOBULINA 1 RESISTENTES A LA FRAGMENTACION Campo de la Invención La presente invención se refiere a inmunoglobulinas para su uso en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico que son resistentes a la fragmentación de las especies de oxígeno reactivas .

Antecedentes de la Invención Las moléculas de inmunoglobulina humana (IgG) consisten de dos copias idénticas de cadenas ligeras (LCs, por sus siglas en inglés) y cadenas pesadas (HCs, por sus siglas en inglés)). Un enlace de disulfuro de la inter-cadena entre LC y HC las conecta para formar un semi-anticuerpo; los HCs de las dos copias idénticas del semi-anticuerpo están conectadas por enlaces de disulfuro en la así llamada secuencia de articulación para formar el anticuerpo natural . La secuencia de articulación de IgGl humana incluye dos pares de residuos de cisterna (Cys) que pueden formar dos enlaces de disulfuro separados. Sin embargo, se ha sugerido que solamente un disulfuro de articulación único es necesario para la lisis mediada por el complemento y la citotoxicidad y la fagocitosis mediadas por las células dependientes del anticuerpo. Michaelsen, T. E. et al., Proc . Nati. Acad . Sci . USA 91: 9243-9247, 1994. Solamente un enlace de disulfuro de Ref .224170 una sola cadena inter-pesada ha sido observado en la estructura cristalina de IgGl bl2 - los autores sugieren que el enlace de disulfuro roto puede ser dinámico o puede ser el resultado de un daño de radiación sincrotrónica . Stanfield, R. et al., Science 248: 712-719, 1990; Saphire, E. et al., J". Mol. Biol. 319: 9-18, 2002; eik, M. et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 97: 623-628, 2000. En efecto, las conformaciones tanto oxidadas como reducidas para un par de una cisteína única expuesta al solvente en una estructura cristalina han sido señaladas. Burling, F. T. et al., .Science 271: 72-77, 1996. En un IgGl, el residuo Cys C-terminal del LC se conecta al primer residuo de HC Cys en la articulación; sin embargo, LC y HC todavía podrían asociarse fuertemente de manera conjunta sin el enlace de disulfuro, porque la constante de asociación entre ellas se estima que va ser de ~1010 M"1. Bigelow. C. et al., Biochemistry 13: 4602-4609, 1978; Horne, C. et al., J". Biol. Chem. 129: 660-664, 1982. Tomadas juntas, estas observaciones sugieren que los enlaces de disulfuro en un IgGl son vulnerables a ciertos ataques, y los residuos de cisteína relacionados podrían permanecer sin daño .

Las especies de oxígeno reactivas (ROS, por sus siglas en inglés) ) son una causa principal de tensión oxidante. Las ROS, tales como los peróxidos y los hidroperóxidos de alquilo, pueden regular la función biológica de las proteínas. Poole, L. B. et al., Annu. Rev. Pharmacol . Toxicol . 44: 325-347, 2004; Philip, E., Free Rad . Biol. Med. 40: 1889-1899; 2006; Salmeen, A. et al., iVature 423: 769-773, 2003; Claiborne, A. et al., Adv. Protein Chem. 58: 215-276, 2001; Paget, M. S. B. y Buttner, M. J., Annu Rev. Genet . 37: 91-121, 2003. Las proteínas que son reguladas por el H202 tienen las cisteínas características, que son sensibles a la oxidación a causa de que su medio ambiente promueve la ionización del grupo tiol (Cys-SH) hasta el anión de tiolato (Cys-S") , que es oxidado más fácilmente hasta el ácido sulfénico (Cys-SOH) que el Cys-SH. Rhee, S. G. et al., (2000) Sci. STKE 20009, peí; Kim, J. R. et al., Anal. Biochem. 283: 214, 2000. El ácido sulfénico es inestable y ya sea que reaccione como cualquier tiol accesible para formar un disulfuro o que padezca una oxidación adicional hasta el ácido sulfínico (Cys-S02H) o como un ayudante sulfónico (Cys-S03H) Kice, J. L, Adv. Phys. Org. Chem. 17: 65, 1980; Claiborne, A., Biochemistry 38 : 15407-15412, 1999.

Los radicales a base de cisteína pueden ser formados por ya sea la abstracción del átomo de hidrógeno de intervalo corto o las reacciones de transferencia de un electrón. Giles, N. M. et al., Chemistry & Biology 10: 677-693, 2003; Garrison, W. M. , Chem. Rev. , 87: 381-398, 1987; Bonifacic, M. et al., J. Chem. Soc . Pekín Trans . , 2: 675-685, 1975; Elliot, A. J. et al., J" Phys. Chem. 85: 68-75, 1981; Jacob, C. et al., Biol . Chem. 387: 1385-1397, 2006. Los radicales de tiilo (RS) , sulfinilo (RSO) , y sulfonilo (RSOO) se ha encontrado que existen durante la tensión oxidante. Harman, L. S. et al., J Biol. Chem. 259: 5606-5611, 1984; Giles, G. I. y Jacob, C, Biol. Chem. 383: 375-388, 2002; Witting, P. K. , y Mauk, A. G. , J. Biol. Chem. 276: 16540-16547, 2001; Stadtman. E. R. y Levine, R. L . , Amino Acids . 25: 207-218, 2003; Berlett, B. S. y Stadtman, E. R. , J" Biol. Chem. 272: 20313-20316, 1997. La transferencia electrónica entre un radical Cys y otros residuos se ha determinado como responsable de la formación de un producto oligomérico de la mioglobina (Witting, P. K. y Mauk, A. G . , J. Biol. Chem. 276: 16540-16547, 2001) aunque los residuos de Pro y His se encontraron como objetivos para los ataques de ROS que condujeron a la fragmentación de BSA y el colágeno. Garrison, W. M . , Chem. Rev. 87: 381-398, 1987; Davies, M. J. y Dean, R. T. , 1997, Radical mediated protein oxidation. Oxford University press, pp 50-120; Zhang, N. et al., J. Phys . Chem. 95: 4718-4722, 1991; Zhang, H. et al. J Biol. Chem. 280: 40684-40698, 2005; Uchida, K. y Kawakishi, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138: 659-665, 1986; Dean, R. T. et al., Free Radical Res., Commun. 7: 97-103, 1989. Sin embargo, permanece poco claro si los radicales a base de Cys están involucrados en la segmentación de los enlaces de los péptidos. Stamler y Hausladen (Stamler, J. S. y Hausladen A.

Nat. Struct. Biol . 5: 247-251, 1998) han propuesto un ciclo de modificaciones mediadas por H202 que constituye eventos de señalización biológica importantes por una parte y marcas características irreversibles de la tensión oxidante por otra parte.

Muchos procesos fisiológicos y del medio ambiente diferentes conducen a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) in vitro e in vivo. El nivel de ROS en una célula depende de su edad y de las condiciones fisiológicas y es una función de factores tales como las proteasas, vitaminas (A, C, y E) y iones metálicos redox. Bigelo , C. et al., Biochemistry 13: 4602-4609, 1978. Las mitocondrias son una fuente importante de generación de ROS en las células. Salmeen, A. et al., Nature 423: 769-773, 2003. La tasa de producción de H202 en las mitocondrias aisladas es de aproximadamente 2 % de la absorción del oxígeno total bajo condiciones fisiológicas. Salmeen, A. et al., Nature 423: 769-773, 2003; Claiborne, A. et al., Adv. Protein C em. 58: 215-276, 2001; Paget, M. y Buttner, M . , Annu . Rev. Gene . 37: 91-121, 2003.

Las ROS pueden conducir a una fragmentación mediada por radicales y a la agregación de las proteínas in vitro así como in vivo. Estas modificaciones oxidantes pueden reducir el rendimiento de fabricación de los productos terapéuticos y de diagnóstico, así como reducir su eficacia. Los anticuerpos han probado ser una clase particularmente útil de proteínas terapéuticas y de diagnóstico. Sin embargo, la región de articulación de Fe de los anticuerpos está propensa a modificación oxidante. Esta vulnerabilidad al ataque por los radicales hace a la estabilización de la región de la articulación de Fe una prioridad para el desarrollo terapéutico y de diagnóstico de los candidatos de los anticuerpos, así como para los compuestos conjugados de Fe en general .

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un Fe de inmunoglobulina que comprende una secuencia de articulación de la clase de IgGl o IgG3 que es resistente a la fragmentación mediada por radicales. La resistencia a la fragmentación es manifestada en una reducción en una escisión del enlace de disulfuro que podría conducir de otra manera a dos semi -anticuerpos , así como a una reducción en los eventos de fragmentación dentro de los polipéptidos que componen cada uno de estos semi-anticuerpos . En una modalidad, la invención es un conjugado de Fe en donde el Fe es un Fe de IgGl o IgG3 humanas. El Fe de IgGl e IgG3 comprende una secuencia del núcleo de articulación, la cual en un código de aminoácido de una sola letra es THTCPXCP, en donde X representa un residuo o P. En la presente invención, el residuo de H (histidina) en la secuencia del núcleo de la articulación del Fe del IgGl o IgG3 natural está substituido con un residuo de Ser (serina) , Gln (glutamina) , Asn (asparagina) , o de Thr (treonina) . En algunas modalidades el conjugado de Fe es un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también está dirigida a un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica el Fe o el conjugado de Fe de la presente invención, así como un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado, y una célula hospedera que comprende el vector de expresión mencionado anteriormente. Por consiguiente, la presente invención también incluye las composiciones y métodos de fabricación del Fe o el conjugado de Fe de la invención que puede abarcar el cultivo en una céula hospedera adecuada del vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la invención bajo condiciones adecuadas para expresar el ácido nucleico, y aislar el Fe o el conjugado de Fe expresado desde la célula hospedera.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra la extensión de la fragmentación mediada por radicales de un anticuerpo de IgGl que resulta del H202 en combinación con un reactivo adicional como se detalla en los Ejemplos.

La Figura 2 muestra la extensión de la fragmentación mediada por radicales medida en unidades de mili-absorbencia (mAU) de la escisión del enlace de disulfuro de la inter-cadena de varias variantes de substitución de la secuencia de articulación de IgGl como se detalla en los Ej emplos .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona composiciones y métodos que se refieren al Fe y los conjugados de Fe de IgGl y IgG3 humanas que son modificados para que sean más resistentes a la fragmentación mediada por radicales que el Fe de IgGl o IgG3 natural . Estos Fe de IgGl y IgG3 resistentes a la fragmentación pueden ser utilizados en, por ejemplo, la producción de anticuerpos para el uso terapéutico y de diagnóstico que tienen una resistencia más grande a la fragmentación o agregación in vitro o in vivo. Las composiciones de la invención incluyen: conjugados de Fe, polinucleótidos que comprenden ácidos nucleicos que codifican el Fe o los conjugados de Fe de la invención, vectores que comprenden éstos ácidos nucleicos, células hospederas que comprenden y células hospederas que expresan, estos vectores, y a las composiciones farmacéuticas. Los métodos de fabricación y uso de cada una de estas composiciones, también son provistos.

Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su forma aceptada del SI . A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos son escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' hasta 3'; las secuencias de aminoácidos son escritas de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi . Los intervalos numéricos descritos aquí son inclusivos de los números que definen el intervalo e incluyen y son un soporte para cada número entero dentro del intervalo definido. Los aminoácidos pueden ser referidos aquí ya sea por sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura de IUPAC-IUBMB. Los nucleótidos, de manera semejante, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra aceptados comúnmente. A menos que se indique de otra manera, los términos "un" o "una" van a ser interpretados que significan "al menos uno de" . Los títulos de las secciones utilizados aquí son para propósitos de organización solamente y no van a ser interpretados como limitativos de la materia objeto descrita. A. Definiciones Cuando se utilice aquí, el término "anticuerpo" incluye la referencia a las inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase, incluyendo las humanas (por ejemplo, injertadas con CDR) , humanizadas, quiméricas, multi-específicas , monoclonales , policlonales , y oligómeros de los mismos, sin importar si tales anticuerpos son producidos, totalmente o en parte, por medio de inmunización, por medio de tecnología recombinante , por medio de utilizar medios sintéticos in vitro, o de otra manera. Por consiguiente, el término "anticuerpo" es inclusivo de aquellos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes , tales como: (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, de un ratón) que son transgénicos para los genes de inmunog1obulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) los anticuerpos aislados de una célula hospedera transfectada para expresar el anticuerpo (por ejemplo, a partir de un trasfectoma) , (c) los anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios, recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalme de las secuencias de los genes de inmunoglobulina a otras secuencias del ADN. Tales anticuerpos tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de dos especies distintas de animales. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro, (o, cuando un animal transgénico para las secuencias de inmunoglobulina humana es utilizado, en la mutagénesis somática in vivo) y por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de las regiones de VH y VL de los anticuerpos son secuencias que, aunque son derivadas de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la línea germinal de una especie particular (por ejemplo, del ser humano), pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo de la especie in vivo.

Cuando se utilice aquí, "conjugado" significa cualquier porción química o biológica, la cual, cuando es conjugada con un Fe sirve para una función diagnóstica o terapéutica. El conjugado puede ser unido covalentemente de manera directa o indirecta (es decir, por medio de un espaciador químico) . Los conjugados ejemplares incluyen: los agentes citotóxicos o citostáticos (por ejemplo, los agentes anti -tumorales o anti-angiogénicos) , polietilen glicol, lípidos, y receptores o fragmentos del receptor, tales como el dominio extracelular del receptor de la superficie de la célula .

Una "célula hospedera" es una célula que puede ser utilizada para expresar una ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la presente invención. Una célula hospedera puede ser una procariota, por ejemplo, E. Coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, una eucariota de una sola célula (por ejemplo, una levadura u otro hongo) , una célula de una planta (por ejemplo, una célula de una planta de tabaco o de tomate) , una célula de un animal (por ejemplo, una célula de un ser humano, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón, o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de las células hospederas incluyen la línea COS-7 de las células del riñon del mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al . , Cell 23: 175, 1981), las células L, las células C127, las células 3T3 (ATCC CCL 163) , las células de los ovarios del hámster chino (CHO) o sus derivados tales como las líneas celulares de CHO vegetal y otras relacionadas, que crecen en el medio libre del suero (véase Rasmussen et al., Citotechnology 28: 31, 1998) o la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (véase Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77: 4216-4220, 1980).

Típicamente, una célula hospedera es una célula cultivada que puede ser transfectada con un ácido nucleico que codifica el polipéptido, que entonces puede ser expresado en la célula hospedera. La frase "célula hospedera recombinante" puede ser utilizada para denotar una célula hospedera que ha sido transfectada con un ácido nucleico que va a ser expresado. Típicamente, una célula hospedera comprende el ácido nucleico pero no lo expresa a un nivel apreciable a menos que una secuencia reguladora sea introducida en la célula hospedera de tal modo que la secuencia reguladora llegue a ser enlazada operativamente con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula hospedera no se refiere solamente a la célula objeto particular sino a la progenie o a la progenie potencial de tal célula. A causa de que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas a causa ya sea de su mutación o por las influencias ambientales, tal progenie puede no- ser idéntica, en efecto, a la célula original, pero todavía está incluida dentro del alcance de los términos como se utilizan aquí.

El término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el cual tanto las regiones constantes como el soporte consisten de secuencias totalmente humanas o substancialmente humanas de tal modo que el anticuerpo humano substancialmente no produzca una reacción inmunogénica contra sí mismo cuando es administrado a una célula hospedera humana y preferentemente, ninguna reacción inmunogénica detectable.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el cual substancialmente la totalidad de la región constante es derivada de o corresponde a las inmunoglobulinas humanas, aunque la totalidad o una parte de una o más regiones variables son derivadas de otras especies, por ejemplo de un ratón.

Cuando se utilice aquí, "aislado" en el contexto de un ácido nucleico significa el ADN o el ARN, el cual como un resultado de la intervención humana directa: 1) es integrado en un sitio de un genoma en donde el mismo no es encontrado en la naturaleza, 2) está enlazado operativamente a un ácido nucleico al cual el mismo no está enlazado operativamente en la naturaleza, o, 3) está substancialmente purificado (por ejemplo, al menos 70 %, 80 %, o 90 %) apartándolo de los componentes celulares con los cuales el mismo está mezclado en su estado natural .

El término "aislado" en el contexto de un Fe o un conjugado de Fe significa: (1) que está substancialmente purificado (por ejemplo, al menos 60 %, 70 %, 80 %, o 90 %) aparte de los componentes celulares con los cuales el mismo está mezclado en su estado expresado, de tal modo que esté la especie predominante presente, (2) que está conjugado con un polipéptido u otra porción a la cual la misma no está enlazada en la naturaleza, (3) que no está presente en la naturaleza como una parte de una secuencia de un polipéptido más grande, (4) que está combinado con otros agentes biológicos o químicos que tienen diferentes especificidades en una composición bien definida, o (5) que comprende una secuencia diseñada humana no encontrada de otra manera en la naturaleza.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición del anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí, se refiere a una preparación de las moléculas del anticuerpo de una sola composición molecular, típicamente codificada por la misma molécula del ácido nucleico. Una composición del anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad y afinidad de aglutinación únicas para un epítopo particular. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales son producidos por un solo hibridoma u otra línea celular (por ejemplo, un transfectoma) , o por un mamífero transgénico. El término "monoclonal" no está limitado a ningún método particular para la fabricación de una anticuerpo.

Cuando se utilice aquí, "ácido nucleico" y "pol inucleótido" incluye una referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o de ribonucleótido, o las quimeras del mismo, y a menos que esté limitado de otra manera, abarca la hebra complementaria de la secuencia referida.

Una secuencia del ácido nucleico está "enlazada operativamente" a una secuencia reguladora, si la secuencia reguladora afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, la temporización, o la localización de la expresión) de la secuencia nucleica. Una "secuencia reguladora" es un ácido nucleico que afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, la temporización, o la localización de la expresión) de un segundo ácido nucleico. Así, una secuencia reguladora y una segunda secuencia están enlazadas operativamente si un enlace funcional entre la secuencia reguladora y la segunda secuencia es tal que la secuencia reguladora inicie y tenga un papel de mediación en la trascripción de la secuencia de ADM que corresponde a la segunda secuencia. Los ejemplos de las secuencias reguladoras incluyen promotores, mej oradores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Los ejemplos adicionales de las secuencias reguladoras se describen en, por ejemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Techonolgy: Methods in Enzymology 185, 1 Academic Press, San Diego, CA y Barón et al., Nucleic Acids Res. 23: 3605-3606, 1995.

Los términos "péptido", "polipéptido" , y "proteína" son utilizados intercambiablemente de principio a fin y se refieren a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces de péptidos. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también son inclusivos de las modificaciones que incluyen, pero no están limitadas a, la glucosilación, la fijación de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de los residuos del ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

Los términos "polinucléotido" , "oligonucléotido" y "ácido nucleico" son utilizados intercambiablemente de principio a fin e incluyen las moléculas del ADN (por ejemplo, el ADNc o el ADN genómico) , las moléculas de ARN (por ejemplo, el ARNm) , y los híbridos de las mismas. La molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra.

Cuando se utilice aquí, "se aglutina específicamente" o "que se aglutina específicamente" o "de aglutinación específica" se refiere a una reacción de aglutinación que es determinante de la presencia del objetivo (por ejemplo, una proteína) en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otras substancias biológicas. Por consiguiente, bajo las condiciones del inmunoensayo diseñadas, los conjugados de Fe especificados tales como los anticuerpos o los pepticuerpos , u otros polipéptidos de aglutinación, se aglutinan a una proteína particular y no se aglutinan en una cantidad estadísticamente significativa a otras proteínas presentes en la muestra. Típicamente, los conjugados de Fe (por ejemplo, los anticuerpos, pepticuerpos ) son seleccionados para verificar su capacidad para aglutinarse específicamente a una proteína por métodos de selección (por ejemplo, la exhibición de fagos) o por inmunización utilizando la proteína o un epítope del mismo. Véase, Harlow y Lañe (1998), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de los formatos del inmunoensayo que pueden ser utilizados para determinar la aglutinación específica. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA de fase sólida pueden ser utilizados para determinar la aglutinación específica. La aglutinación específica procede con una · constante de asociación de al menos aproximadamente 1 x 107 M"1, y frecuentemente de al menos 1 x 108 M"1, 1 x 109 M"1, o, 1 x 1010 M"1.

Cuando se utilice aquí, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico utilizado en la introducción de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedera. Los vectores frecuentemente son replicones. Los vectores de la expresión permiten la trascripción de un ácido nucleico insertado en el mismo cuando está presente en una célula hospedera adecuada o bajo condiciones in vitro adecuadas .

B. Conjugados de Fe La presente invención proporciona Fe y conjugados de Fe de IgGl e IgG3 aislados, y métodos de fabricación y uso de estas composiciones, que son resistentes a la fragmentación y/o la agregación con relación al Fe de IgGl o de IgG3 natural . Aunque no se desea que esté limitado por la teoría, el mecanismo de la fragmentación mediada por radicales libres ha implicado un residuo de histidina presente en la secuencia del núcleo de articulación- de las inmunoglobulinas IgGl en la fragmentación del Fe. La substitución o supresión apropiadas de este residuo de histidina de la secuencia del núcleo de articulación en un Fe de IgGl e IgG3 puede reducir el grado de la fragmentación y/o la agregación mediada por radicales con relación a un Fe o un conjugado de Fe no modificado.

La presente invención proporciona Fe y conjugados de Fe aislados que tienen una modificación que lo vuelve resistente a la fragmentación y/o la agregación de las especies de oxígeno reactivas. El Fe (fragmento cristalizable) de una inmunoglobulina de mamífero es una estructura bien caracterizada que comprende una región de articulación que tiene una "secuencia del núcleo de articulación" . La tabla 1 muestra una lista de las secuencias del núcleo de articulación, presentadas en un código de aminoácidos de una letra, encontrado en los subtipos de IgGl humanos. En el sistema de numeración de Edelman et al. {Proc. Nati. Acad. Sci . USA 63: 78-85, 1969) la secuencia del núcleo de articulación de IgGl corresponde a los residuos 216-130 de la cadena pesada de IgGl mientras que la secuencia del núcleo de articulación de IgG3 corresponde a los residuos 214-230 de la cadena pesada de IgG3. En la presente invención, el residuo de histidina ( "H" ) presente en la secuencia del núcleo de articulación de IgGl o IgG3 (en el residuo 224) como se presenta en la Tabla 1 está substituido con un residuo de aminoácido polar que es capaz de formar enlaces de hidrogeno. Los ejemplos específicos de los residuos de aminoácidos que se pueden sustituir por el residuo de histidina en la secuencia del núcleo de articulación de IgGl e IgG3 son los residuos de Ser, Gln, Asn, o Thr. Alternativamente, el residuo de histidina es delecionado de la secuencia del núcleo de articulación.

Tabla 1. La secuencia del núcleo de articulación de subtipos de IgG. La porción de CPxCP está subrayada.

Subtipo de IgG Secuencia del núcleo de articulación IgGl EPKSCDKTHTCPPCP (SEC ID NO.-l) IgG2 ERKCCVECPPCP (SEC ID NO: 2) IgG3 ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEC ID NO : 3 ) IgG4 ESKYGPPCPSCP (SEC ID NO : 4 ) Típicamente, el Fe del conjugado de Fe de la presente invención que está sometido a la substitución o supresión produciendo un Fe resistente a la fragmentación mediada por un radical será un Fe de IgGl o IgG3 humano. Sin embargo, un número limitado de substituciones, adiciones, o deleciones para un IgGl o IgG3 humano se pueden hacer al mismo tiempo que se retienen las propiedades del subtipo del IgG. Así, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos del IgGl o del IgG3 pueden ser modificados y todavía están dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, un Fe de IgGl o IgG3 modificado será 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o' 99 % idéntico a una Fe de IgGl o de IgG3 humano, natural. En algunas modalidades, la única modificación para la secuencia del núcleo de articulación del IgGl o del IgG3 de la presente invención (como se presentó en la Tabla 1) es una substitución del residuo de histidina en la secuencia del núcleo de articulación como se describió anteriormente. El conjugado de Fe puede ser monovalente o de una estructura bivalente. Cada conjugado de un conjugado de Fe bivalente puede ser el mismo o un conjugado diferente.

El conjugado que está unido covalentemente o no covalentemente al Fe para formar el conjugado de Fe puede comprender o consistir de un fármaco tal como un compuesto quimioterapéutico, una etiqueta de diagnóstico tal como una radioe iqueta, o una proteína tal como el dominio extracelular de un receptor de la superficie de la célula humana. En algunas modalidades, el conjugado comprende o consiste de un segmento del anticuerpo de Fab de tal modo que el conjugado de Fe sea un anticuerpo de IgGl o IgG3. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal . En algunas modalidades el conjugado de Fe es monoclonal totalmente humano, o monoclonal humanizado con CDR (regiones de determinación de la complementariedad) injertado desde una fuente no humana (por ejemplo, de murino) sobre un IgGl o IgG3 totalmente humano de otra manera. El anticuerpo puede ser un anticuerpo agonista o antagonista de tal modo que el mismo active o inhiba la activación de un receptor. En algunas modalidades, este receptor es un receptor de la superficie de la célula humana en donde el conjugado de Fe se aglutina específicamente al dominio extracelular del receptor de la superficie de la célula. En otras modalidades, el conjugado de Fe se aglutina específicamente a un ligando de un receptor de la superficie de la célula humana de tal modo que la misma prevenga la aglutinación del ligando al receptor. Los ejemplos de los receptores de la superficie de la célula humana a la cual los conjugados de Fe pueden aglutinarse incluyen el receptor de comportamiento suicida 4 (Receptor 1 de TRAIL) , el receptor de comportamiento suicida 5 (receptor 2 de TRAIL) , el receptor de VEGF, por sus siglas en inglés (factor del crecimiento endotelial vascular), un TNFR, por sus siglas en inglés (receptor del factor de la necrosis tumoral) , el receptor de RANK, por sus siglas en inglés (factor kappa b nuclear del activador del receptor) , o los receptores de Tie-1 y Tie-2. En otras modalidades, el conjugado del conjugado de Fe es un péptido (un "pepticuerpo" ) que se aglutina específicamente a un objetivo deseado. Los pepticuerpos son enseñados en la Solicitud Internacional que tiene el número de publicación WO 2000/24782 (incorporado aquí para referencia) .

C. Ácidos nucleicos La presente invención también está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende un ácido nucleico que codifica el Fe de los conjugados de Fe de la presente invención. Convenientemente, cuando el conjugado del conjugado de Fe es una proteína (un "conjugado de proteína de Fe) y codifica, por ejemplo, un anticuerpo, pepticuerpo, o la fusión de un receptor de la superficie de la célula de Fe (o un fragmento del mismo) , un ácido nucleico de la presente invención puede codificar el conjugado de proteína-Fc en su totalidad .

Los métodos recombinantes para la producción de los Fe y los conjugados de Fc-proteína de la presente invención emplean comúnmente un polinucleótido que comprende un ácido nucleico aislado que codifica el Fe de IgGl o IgG3 de la presente invención. Un ácido nucleico que codifica un conjugado de Fc-proteína de la invención puede ser sintetizado directamente por los métodos de una síntesis de oligonucleótidos in vitro conocidos en el arte. Alternativamente, los fragmentos más pequeños pueden ser sintetizados y unidos para formar un fragmento más grande utilizando los métodos recombinantes conocidos en el arte. En algunas modalidades, los cebadores de los ácidos nucleicos con la substitución o supresión de la secuencia del núcleo de la articulación deseados son empleados en la mutagénesis in vitro basada en PCR para crear el Fe o los conjugados de Fe de la presente invención. Los polinucleoótidos de la presente invención también pueden ser construidos por medios sintéticos in vitro (por ejemplo, la síntesis de fosforamidita en fase sólida), o combinaciones de los mismos. Tales métodos son bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds . , Greene Publishing y Wiley- Interscience , New York (1995).

D. Construcción de los conjugados de Fe Para expresar el Fe aislado o los conjugados de Fc-proteína de la presente invención, el ADN aislado que codifica estas composiciones puede ser obtenido por técnicas de biología molecular estándares (por ejemplo, la amplificación de PCR, la mutagénesis dirigida al sitio) , y pueden ser insertados en los vectores de expresión de tal modo que los genes sean enlazados operativamente a las secuencias reguladoras de la transcripción y la traslación.

La presente invención incluye así los vectores de expresión (polinucleótidos) que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores de la expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV, y semejantes. Los vectores de la expresión pueden codificar un péptido de la señal que facilita la secreción de la Fe o del conjugado de Fc-proteína de la presente invención a partir de una célula hospedera. El gen de Fe o del conjugado de Fc-proteína puede ser clonado en el vector de tal modo que el péptido de la señal sea enlazado en el mismo marco con respecto a la terminación de amino del gen del conjugado de Fc/Fc-proteína . El péptido de la señal puede ser un péptido de la señal de inmunoglobulina o un péptido de la señal heteróloga (es decir, un péptido de la señal de una proteína diferente de la inmunoglobulina) .

Las secuencias del vector de la expresión y de control de la expresión son elegidas para que sean compatibles con la célula hospedera de la expresión utilizada. Un sistema de vector y célula hospedera compatible puede permitir, por ejemplo, la co-expresión y el ensamblaje de las cadenas ligera variable y pesada variable del conjugado de Fe que es un anticuerpo. Los sistemas adecuados para la expresión pueden ser determinados por aquellos expertos en el arte. En algunas modalidades, los vectores de la expresión son vectores de DHFR divididos, PDC323 o PDC324; véase, McGrew, J. T. y Bianchi, A. A. (2002) "Selection of cells expressing heteromeric proteins", Solicitud de patente U.S. No. 20030082735; y, Bianchi, A. A. y McGrew, J. T . , "High-level expression of full . antibodies using trans-complementing expression vectors, " Bioengineering an Biotechnology 84(4) : 439-444, 2003. Cuando el conjugado de Fe es un anticuerpo, el ácido nucleico de cadena pesada variable y los ácidos nucleicos de cadena ligera variable del anticuerpo de la presente invención pueden ser insertados en vectores separados o, frecuentemente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los ácidos nucleicos pueden ser insertados en el vector de expresión por los métodos estándares (por ejemplo, la ligadura de los sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del ácido nucleico del anticuerpo y el vector, o la ligadura del extremo romo si ningún sitio de restricción está presente) .

Los ácidos nucleicos y los vectores de expresión de la presente invención pueden ser introducidos en una célula hospedera por medio de transíección . Las diferentes formas del término " transfección" están propuestas para que abarquen una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción del ADN exógeno en una célula hospedera procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección de DEAE- dextrano y semejantes. Aunque teóricamente es posible expresar los conjugados de Fe de la invención en las células hospederas ya sea procarióticas o eucarióticas , la expresión de los anticuerpos en las células eucarióticas, y aún más preferentemente las células hospederas de mamífero, es lo más típico a causa de que tales células eucarióticas, y en particular las células de mamíferos, es más probablemente que se ensamblen y secreten un anticuerpo activo inmunológicamente y plegado apropiadamente, que las células procarióticas .

Los vectores de la expresión de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia en una célula hospedera. Tales secuencias reguladoras se describen por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) . Se apreciará por aquellos expertos en el arte que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, y semejantes. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de la célula hospedera del mamífero incluye elementos virales que dirigen los niveles elevados de la expresión de la proteína en las células de mamíferos, tales como los promotores y/o mejoradores derivados del citomegalovirus (CMV) , Virus 40 del Simio (SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío mayor del adenovirus AdMLP) ) y polioma. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de beta-globina .

Los vectores de la expresión de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por ejemplo, los orígenes de la replicación) y los genes marcadores seleccionables . El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células hospederas en las cuales el vector ha sido introducido (véanse por ejemplo, las Patentes U. S. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al . ) . Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato, sobre una célula hospedera en la cual el vector ha sido introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en las células hospederas de dhfr con una selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418) .

Las células hospederas de mamífero preferidas para la expresión del Fe o los conjugados de Fe de la invención incluyen las células de los ovarios del hámster chino (células de CHO) (incluyendo las células de dhfr-CHO descritas en Urlaub y Chasin, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 77: 4216-4220, 1980, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufmann, R. J. y Sharp, P. A., Mol. Biol . 159: 601-621, 1982), células del mieloma de NS/0, las células de COS y las células de SP2.0. En particular, para su uso con las células del mieloma del NS/0, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen de GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338841. Cuando los vectores de la expresión de la invención son introducidos en las células hospederas de mamífero, el Fe o los conjugados de Fe son producidos por el cultivo de las células hospederas en el medio de cultivo apropiado durante un periodo de tiempo suficiente para permitir su expresión en las células hospederas o, más preferentemente, la secreción del Fe o el conjugado de Fe en el medio de cultivo en el cual se hacen crecer las células hospederas .

Una vez que se han expresado, el Fe o el conjugado de Fe pueden ser purificados por aislamiento de acuerdo con los métodos estándares en el arte, incluyendo la purificación de HPLC, la cromatografía en columna fraccionada, la electrof resis en un gel y semejantes (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982) . En ciertas modalidades, los polipéptidos son purificados utilizado las técnicas cromatográficas y/o electroforéticas .

Los métodos de purificación ejemplares incluyen, pero no están limitados a, precipitación con sulfato de amonio, precipitación con PEG; inmunoprecipitación; desnaturalización con calor seguida por centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero sin estar limitado a, cromatografía por afinidad (por ejemplo, proteína-A-Sefarosa) , cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, y cromatografía de fase inversa; filtración en gel; cromatografía de hidroxilapatita ; enfocamiento isoeléctrico; electrofóresis con un gel de poliacrilamida ; y combinaciones de tales y otras técnicas. En ciertas modalidades, un polipéptido es purificado por cromatografía líquida de proteínas, rápida, o por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .

E. Composiciones farmacéuticas La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden Fe y conjugados de Fe de la presente invención formulados con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el portador farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración en seres humanos. Cuando se utilice aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y para el retardo de la absorción, y semejantes, que son compatibles fisiológicamente cuando son administrados a un sujeto particular. Las composiciones farmacéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas en una terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. Los agentes son inclusivos de, pero no están limitados a, las composiciones químicas preparadas sintéticamente in vitro, anticuerpos, regiones de aglutinación del antígeno, radionúclidos , y combinaciones y conjugados de los mismos.

Los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un bolo único puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas durante el transcurso del tiempo o las dosis pueden ser aumentadas o reducidas proporcionalmente como está indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma de la unidad de dosificación cuando se utilice aquí, se refiere a unidades discretas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en el arte de las composiciones tales como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

F. Conjugados terapéuticos y de diagnóstico Las diversas porciones terapéuticas descritas aquí que mejoran el beneficio terapéutico y/o de diagnóstico pueden ser enlazados covalentemente , directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de un "grupo de enlace") a un Fe de la presente invención para dar un conjugado de Fe. Un grupo de enlace es opcional. El enlazador está compuesto frecuentemente de aminoácidos enlazados conjuntamente por enlaces del péptido. Uno o más de estos aminoácidos pueden ser glucosilados , como se entiende bien por aquellos con experiencia en el arte. Los enlazadores diferentes de los péptidos también son posibles. Un enlazador diferente de un péptido, ejemplar, es un enlazador de PEG (polietilenglicol ) .

Las técnicas para la conjugación de tales porciones terapéuticas con respecto a los anticuerpos ya son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy" , in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al . (eds.), pp. 243-256 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2/a. Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-316 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol . Rev. 62: 119-158, 1982. Las composiciones de la presente invención pueden ser acopladas a los radionúclidos , tales como 1311, 90Y, 105Rh, indio- 111, etc., como se describe en Goldenberg, D. M. et al. Cáncer Res. 41: 4354-4360, 1981, y en EP 0 365 997.

Ej emplos Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados logrados, son provistos para propósitos ilustrativos solamente y no van a ser interpretados como limitativos de la presente invención. Ejemplo 1 Este ejemplo describe los resultados de una fragmentación de articulación específica de un anticuerpo de IgGl humano por una segmentación de radicales mediada por H202 que conduce a la pérdida del dominio de Fab y la formación de una molécula parcial. El ataque por H202 del IgGl condujo a la ruptura del enlace de disulfuro de la inter-cadena entre los dos residuos de cisteína cargados en la posición 226 (Cys226) en la región de articulación y seguido por la formación del ácido sulfénico (Cys225 SOH) y un radical de tiilo (Cys226 S*) , que inicializa una transferencia de electrones hasta los residuos de la articulación superior, conduciendo a una fragmentación de la estructura del polipéptido mediada por los radicales.

El anticuerpo utilizado fue un anticuerpo totalmente humano, recombinante , de la subclase de IgGl. La molécula fue expresada en células de CHO y purificada cromatográficamente utilizando las técnicas convencionales. Los fragmentos de los anticuerpos fueron separados por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) . La escisión del anticuerpo se midió por un porcentaje de las moléculas parciales (Cl y C2) .

Brevemente, una mezcla de reacción (1.0 mi) que contiene 2 mg hasta 10 mg del anticuerpo de IgGl en un amortiguador fue incubada con concentraciones variables de H202. Para remover el H202, las muestras fueron intercambiadas con el amortiguador por centrifugación en unidades de 4 filtración. Las moléculas parciales purificadas (~1 mg/ml) fueron reducidas y alquiladas. La alquilación se efectuó a temperatura ambiente en la oscuridad y se agrega una solución en almacenamiento de DTT 0.5 M para apagar la alquilación. La cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP/HPLC) fue efectuada seguida por ionización por electrorrociado (ESI) espectroscopia para verificar el tiempo de vuelo (TOF) y espectroscopia de masa (MS) .

El anticuerpo volumétrico purificado fue analizado por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) , y mostró -0.9 % de una molécula parcial (Pl) . Este no es, el caso único de un lote, sino que estuvo presente en varias cantidades con un intervalo de 0.9-1.1 %. La especie Pl fue purificada adicionalmente por SEC a una pureza más grande que el 95 %, y analizado por RP-HPLC-TOF/MS . Los resultados indicaron que Pl es un anticuerpo parcial oxidado ampliamente que pierde un dominio de Fab.

Se sabe que el H202 es capaz de provocar la oxidación y el daño a las proteínas. Para explorar si una tensión oxidante provocó la escisión, el H202 fue empleado para tratar el IgGl, y el impacto fue medido por SEC. Sobre el intervalo de 5-20 mM H202, ninguna escisión notable se encontró para las primeras 8 horas de incubación. Solo después de 48 horas de incubación con 20 mM H202 dos fragmentos parciales - Cl y C2 - fueron observados. Las cantidades de estos dos fragmentos crecieron en una proporción directa con respecto a la longitud de la incubación. Esta fragmentación también es dependiente de la concentración del anticuerpo y de las condiciones del pH . Además, la escisión procedió sin una fase permanente significativa aún hasta 8 semanas. El hecho de que solamente dos productos (Cl y C2 ) fueran observados sugieren que la escisión fue específica y probablemente fue impulsada por un mecanismo específico. El trabajo subsiguiente demuestra que la naturaleza altamente oxidada de Pl sugiere que la fragmentación de la articulación puede resultar de la tensión oxidante durante la producción de las células de CHO del anticuerpo. La semejanza entre Pl y Cl, particularmente los niveles de oxidación más elevados observados con un tratamiento de H202 prolongado, sugiere que la tensión oxidante provocó la fragmentación de la articulación.

El análisis de RP-HPLC-TOF/MS del Cl y Pl mostró que los mismos fueron de especies idénticas, cada una de ellas fue una molécula parcial oxidada ampliamente que tiene omitido un dominio de Fab, en particular, el HC complementario único del dominio de Fe comprendió una "escalera" única de los residuos N-terminales de Asp221, Lys222 , Thr223 , y Thr225 en la región de la articulación superior. Además, dos aductos de 45 Da y 71 Da fueron observados en algunos fragmentos de Fe, estos no son aductos comunes porque los mismos no son consistentes con las modificaciones conocidas.

El análisis de RP-HPLC-TOF/MS del fragmento de C2 reveló que se trata del dominio de Fab del IgGl , y está oxidado ampliamente. El LC de C2 exhibió un perfil semejante con respecto a su contraparte en Cl . La porción de Fab del HC (Fd) en C2 tuvo dos componentes, ambos de los cuales están oxidados ampliamente con una o tres adiciones de oxígeno. El componente más altamente oxidado contuvo una escalera de los residuos C- terminales de Asp221, Lys222 , Thr223 , His224 , y Thr225 ; el componente de Fd más ligeramente oxidado poseyó una escalera más amplia, que consiste de los residuos C-terminales de Ser218 hasta Thr225. Los resultados indicaron que el tratamiento con H202 condujo a una escisión de la articulación y a un nivel significativo de la oxidación en tanto el LC como el HC del IgGl.

Combinando la naturaleza de estos aductos y sus localizaciones, los datos sugieren que la escisión de los radicales fué responsable de la f agmentación de la articulación. Los peróxidos de hidrógeno pueden regular la función biológica de las proteínas por medio de las rutas de oxidación inducidas por radicales. La reacción con los radicales de hidroxilo podrían conducir a varias reacciones químicas que conducen a la degradación de una proteína (Garrison, W. M, Chem. Rev. 87: 381-398, 1987; Davies, M. J. y Dean, R. T., 1997, Radical mediated protein oxidation. Oxford University press, pp 50-120; Berlett, B. S. y Stadtman, E. R. , J. Biol . Chem. 272: 20313-20316, 1997).

Para examinar si los radicales de OH están involucrados en la fragmentación de la articulación y para evaluar algunos factores que pueden tener influencia en la escisión, el IgGl fue sometido al ataque por el H202 después de algunos pretratamientos . Estos incluyen el pretratamiento con N-etil-maleimida (NEM) hasta los residuos de Cys de bloques no agrupados por pares previo al tratamiento con H202 , o agregando catalasa o el ácido etilen-diamin-tetra-acético (EDTA) en el sistema de reacción. La SEC se efectuó para medir el impacto. Se encontró que la catalasa bloqueó casi completamente la escisión, indicando fuertemente que los radicales OH fueron importantes para la escisión. Los grupos de tiol libres, totales, se midió que van a ser -0.28 mol/mol del anticuerpo bajo las condiciones desnaturalizadas en la presencia de GdnHCl 4 M utilizando el reactivo de Ellman, 5 , 51 -ditiobis (ácido 2 -nitrobenzoico) (DTNB) . Previo al tratamiento con H202, el IgGl se incuba con NEM a pH 5.0 durante 3 horas a 37 °C. La muestra bloqueada por NEM mostró solamente una reducción de ~7 % en la escisión, mientras que los grupos de tiol libres (-SH) estuvieron bloqueados completamente por el tratamiento con NEM. Por lo tanto, los resultados sugirieron que los residuos de Cys no agrupados por pares no fueron críticos para la escisión.

El N-óxido de 5 , 5-dimetil-l-pirrolina con trampa de espín (DMPO) es utilizado ampliamente para proporcionar evidencia para el involucramiento de los radicales libres en muchas reacciones biológicas, particularmente para los radicales de OH. El DMPO ha sido utilizado para identificar los sitios de los radicales expuestos al daño por los radicales en mioglobina y otras moléculas. Por lo tanto, el IgGl se trató con H202 en la presencia de DMPO durante una semana, y la fragmentación fue verificada por SEC. En un intervalo de una relación molar de 50:1 hasta 5:1 de DMPO: H202, el DMPO bloqueó completamente la fragmentación durante un transcurso de tiempo de dos semanas de incubación.

Para identificar el sitio de formación de radicales, se efectuó el mapeo del péptido de Lys-C. Mientras que el péptido de articulación intacto que contiene el Cys231-S03H fue observado, solamente HC Cys231 se encontró que contiene el aducto de DMPO. El descubrimiento de que ninguna formación de radicales en los residuos de la articulación superior es improbable debido a problemas con la sensibilidad de la espectrometría de masa o las velocidades de la reacción entre los radicales OH y los residuos de articulación superiores. Se ha determinado que los radicales de OH tienen una velocidad constante con Cys de 3.4 x 1010 M"1s"1, mucho más rápido que His (1.3 x 1010 M'V1) , Thr (5.1 x 108 M'V1) , Asp (7.5 x 107 M^s"1) , y Lys (3.5 x 107 Nr 1) (Davies, . J. y Dean, R. T. , 1997, Radical mediated protein oxidation. Oxford University press, pp 50-120). Por lo tanto, estos resultados demostraron la necesidad de una transferencia de electrones desde el HC Cys231 hasta un residuo en la articulación superior que condujo a una escisión del radical por molécula. También se determinó que un electrón tiene una velocidad de la reacción constante con His de 6.4 x 107 M"1s"1, Thr de 2.0 x 107 M^s"1, Lys de 2.0 x 107 M' 1, Asp de 1.8 x 107 M^s"1 (Davies, M. J. y Dean, R. T. , 1997, Radical ediated protein oxidation. Oxford University press, pp 50-120) , indicando que estos residuos son capaces de localizar un electrón para que proceda hasta la escisión del soporte inducido por radicales. Este mecanismo explica la fragmentación de la articulación específica que generó los residuos C-terminales complementarios en el fragmento de Fab (C2) y los residuos N-terminales en el Fe del anticuerpo parcial (Cl) .

Ejemplo 2 Este ejemplo resume los resultados de la fragmentación mediada por radicales del Fe de IgGl . 1. El anticuerpo volumétrico de IgGl contiene ~1 % de un anticuerpo truncado (Pl) , que se determinó que va a ser una forma ampliamente oxidada, con uno de los dominios de Fab faltante . 2. La reacción de H202 con la substancia farmacéutica volumétrica de IgGl (BDS) generó una molécula truncada y un fragmento del dominio de Fab libre por las escisiones específicas en la región de la articulación que condujeron a la formación de una escalera C-terminal de los residuos (Cys220- Asp221-Lys222-Thr223-His22 -Thr225) en el dominio de Fab de la cadena pesada (Fd) y una escalera N-terminal complementaria de residuos en el dominio de Fe. 3. En las muestras tratadas con H202, para la mayoría de las moléculas intactas y truncadas el enlace de disulfuro de la inter-cadena entre los residuos de Cys226 se encontró que va a estar intacta. 4. En la muestra de BDS, no existió un enlace de disulfuro no agrupado por pares en la región de articulación observada por el mapa del péptido de Lys-C natural que haya sido efectuada después del pre-bloqueo de cualquier Cys no agrupado por pares, potencial, por la N-etilmaleimida (NEM) . 5. El análisis de LC- S/MS identificó una cantidad pequeña de Cys-S03H en Cys226 tanto en el péptido de articulación intacto (THT Cys226PPCAPELLGGPSVFLFPPKPK) (SEC ID NO: 5) como en el péptido de articulación truncado (Cys226PPCAPELLGGPSVFLFPPKPK) (SEC ID NO : 6 ) . 6. En el anticuerpo truncado, los aductos fueron identificados en la región de articulación N-terminal del dominio de Fe como ya sea el isocianato o los derivados de N- -cetoacilo que introdujo una masa adicional de 45 o 71 Da, respectivamente . 7. El IgGl contiene -0.28 mol/mol de los residuos de Cys no agrupados por pares del anticuerpo, que no son críticos para la reacción de escisión como es demostrado por el hecho de que el bloqueo de todos los residuos de Cys no agrupados por pares no provocó nada o solo provocó un pequeño efecto sobre la fragmentación. 8. Un radical utilizado ampliamente, el N-oxido de 5 , 5 ' -dimetil-l-pirrolina con trampa de espín (DMPO) se encontró que va a ser capaz de bloquear la fragmentación de la articulación a causa de su aglutinación a Cys226. Sin embargo, la aglutinación de DMPO no bloquea la formación de Cys226-S03H.

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que los radicales hidroxilo y no el Cu2+ inducen la fragmentación de la articulación. Los peróxidos de hidrógeno pueden regular la función biológica de las proteínas por medio de las rutas de oxidación inducidas por radicales. Adicionalmente , la reacción con los radicales de hidroxilo puede conducir a varias reacciones químicas que conducen a la degradación de una proteína. Para examinar si los radicales de OH están involucrados en la fragmentación de la articulación y para evaluar diversos factores que pueden tener influencia en la escisión, el IgGl fue sometido a un ataque por H202. Como se muestra en la Figura 1, la fragmentación inducida por H202 fue bloqueada completamente por la catalasa, indicando que los radicales de OH fueron responsables de la escisión. Los grupos de tiol libres totales se determinó que van a ser de -0.28 mol/mol del anticuerpo bajo las condiciones desnaturalizadas en la presencia de GdnHCl 4 M utilizando el reactivo de Ellman's, 5 , 5 ' -ditiobis (ácido 2 -nitrobenzoico) (DTNB) . Previo al tratamiento con H202, el IgGl fue incubado con NEM a pH 5.0 durante 3 horas a 37 °C. La muestra bloqueada con NEM mostró solamente una reducción de -7 % en la escisión, mientras que los grupos de tiol libres (-SH) se encontró que fueron bloqueados completamente por el tratamiento con NEM sugiriendo que los residuos de Cys no agrupados por pares no fueron críticos para la escisión.

Además, se encontró que una pre-incubación con EDTA inhibió -90 % de la escisión inducida por H202 del IgGl, sugiriendo un involucramiento de los metales de transición en la reacción. Sin embargo, tal pretratamiento no bloqueó completamente la escisión con H202 todavía capaz de escindir el IgGl, a pesar de tener una velocidad de reacción más lenta. Estos resultados sugirieron que los radicales de OH son responsables de una fragmentación de la articulación, y que la reacción puede ser acelerada por una reacción catalizada por un metal para generar los radicales de OH. Esta hipótesis fue soportada por la observación de que el tratamiento con H202 en la presencia de 10 µ? de acetato de cobre (Cu(OAc)2) condujo a aproximadamente 4 veces más escisión que el tratamiento con H202 solo, mientras que 10 µ? Cu(OAc)2 solo produjo únicamente una escisión pequeña durante un periodo de incubación de 5 días.

Smith et al, reportaron una escisión del enlace de K-T en la articulación superior DKTHT (SEC ID NO : 7 ) que son los residuos de un IgGl (Smith, M. A. et al., Int. J. Pept . Protein. Res., 48: 48-55, 1996) con 1 mM de CuS0 a un pH neutral o básico por la examinación de un número de péptidos sintéticos. Bajo las condiciones experimentales descritas aquí (pH 5.2 y la incubación a 25 °C) , la aglutinación de Cu2+ a los residuos de la articulación superior (por ejemplo, His, Lys) es menos favorable que a pH neutral o básico, y condujo a un incremento de -30 % de la fragmentación de la articulación. Puesto que existen cantidades de traza de los iones de los metales de transición en los solventes o proteínas, su concentración podría ser suficiente para que funcione como un catalizador para la fragmentación de la articulación inducida por radicales. Esta conclusión también es consistente con la teoría de que algunos metales de transición (por ejemplo Cu+ y Fe3+) desempeñan un papel importante en el ataque por radicales selectivos con respecto al sitio ya sea por la aglutinación a una proteína o permaneciendo en la solución. En ambos casos, el metal acelera la reacción por la catalización de la generación de los radicales hidroxilo a través de una reacción semejante a la de Fenton. Colectivamente, estos hechos confirmaron independientemente un mecanismo de fragmentación de la articulación inducido por radicales.

Ejemplo 4 Este ejemplo propone un mecanismo de fragmentación de Fe mediada por radicales. Los resultados experimentales de la invención obtenidos por el estudio de un IgGl humano revelaron una fragmentación de la articulación mediada por radicales en este anticuerpo de IgGl humano.

La cantidad de trazas del metal de transición cataliza la generación de radicales OH en el sistema de la reacción. La reacción del anticuerpo de IgGl con los radicales OH codujo a la ruptura del enlace de disulfuro de la inter-cadena entre los dos residuos de cisteína localizados en la posición 226 (Cys226) en la región de articulación (Cys226-Pro-Pro-Cys-Pro) del anticuerpo. La ruptura del enlace de disulfuro fue seguida por la formación del ácido sulfénico (Cys226-SOH) y un radical de tiilo (Cys226-S*) . Las reacciones ' subsiguientes de estas especies en la presencia de oxígeno condujeron a la formación del ácido sulfínico (Cys226-S02H) y el ácido sulfónico (Cys226-S03H) como los productos principales. Mientras tanto, el radical tiilo inicia una corriente de transferencia de electrones, a lo largo del soporte del polipéptido de la articulación. Esta transferencia de electrones conduce a una fragmentación del soporte del polipéptido mediada por radicales, que está caracterizada por una escalera de residuos C-terminales en el dominio de Fab de la cadena pesada (Fd) , creada debido a la escisión en varios residuos de la articulación próximos (Asp221, Lys222 , Thr223 , His224 y Thr225) . Se observó la aglutinación del N-óxido de 5 , 5 ' -dimetil -pirrolina (DMPO), una trampa de espín de radicales utilizada ampliamente, solamente en Cys226 , el cual bloqueó la fragmentación de la articulación. La aglutinación específica de DMPO solamente a Cys226 confirmó que el radical solamente existe en Cys226 en la secuencia de CPPCP, la cual es una porción Cys-Pro-X-Cys -Pro (X = Pro, Arg, y Ser) de la secuencia de la articulación altamente conservada entre las moléculas de IgGl (Tabla 1) .

La determinación del aducto de +45 Da sugirió un mecanismo de escisión de radicales que generó una estructura del isocianato (PM = 28 Da) en la N-terminal del Fe por medio de la ruta de la diamida. Debido a su naturaleza inestable, el grupo isocianato se hidroliza en el ácido carboxílico (el aducto de +45 Da) . Por otra parte, el ataque por el radical OH en la posición del carbono ? de la cadena lateral de ciertos aminoácidos podría conducir a una degradación oxidante que conduce a la formación de un producto insaturado de los deshidropéptidos , que solamente retiene un grupo ß-0?2 como una cadena lateral. Este compuesto puede ser hidrolizado fácilmente para dar las funciones de amida y de ceto ácido, el aducto de +71 Da (un grupo de N-piruvilo) . Para este fin, el aducto de +71 Da observado en la N-terminal de Thr225 podría haber resultado de la degradación oxidante de His224. Mientras tanto, la hidrólisis de estos compuestos intermedios inestables podría ser otra forma de reciclarlos, y este proceso condujo a algunos péptidos de articulación truncada que contienen residuos N-terminales regulares. Tomados conjuntamente, los aductos de +45 Da y de +71 Da en los residuos N-terminales de la región de articulación superior son los productos de la escisión de los radicales en el carbono-a del soporte de proteína y la posición del carbono ? de una cadena lateral del aminoácido, respectivamente, confirmando un mecanismo mediado por radicales para la escisión del soporte de proteína.

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra la resistencia a la fragmentación mediada por radicales por la mutación de los residuos de His y Lys en la secuencia del núcleo de articulación. Se llevó a cabo una investigación para determinar el efecto de la mutación de His224 y Lys222 en comparación con el IgGl del tipo silvestre humano. El IgGl del tipo silvestre y siete mutantes fueron incubados con H202 y la formación de la molécula parcial y en particular la liberación del fragmento del dominio de Fab fueron verificados por SEC . Los siete mutantes fueron: Lys222Ser (K/S) , Lys222Gln (K/Q) , Lys Ala (K/A) , His2 4Ser (H/S) , His22Gln(H/Q) , His224Ala (H/A) y Lys222Ser/His224Ser (K/S+H/S) . Entre estos mutantes, que remplazan a His con Gln o Ser casi bloqueó totalmente (> 97 %) la fragmentación inducida por el radical OH que condujo a una liberación del dominio de Fab (C2) y la molécula parcial Cl . La mutación de His/Ala mostró ~6 % de fragmentación contra -15 % para el IgGl natural durante un periodo de incubación de 8 días. En contraste, todos los mutantes de Lys únicos promovieron la escisión en el 31-33 %. De manera más importante, el doble mutante K/S+H/S mostró una inhibición > 97 % de la fragmentación, el mismo porcentaje medido para el mutante de His/Ser o His/Gln único, indicando la importancia del residuo de His en la fragmentación .

Aunque el mutante de His/Ala mostró escisión, no se sabe si el mutante comprendió las mismas degradaciones estructurales. Se ha documentado que el LC y el HC permanecieron fuertemente asociados sin el enlace de inter-disulfuro que los conecta (Bigelow. C. et al., Biochemistry, 13: 4602-4609, 1978). Por lo tanto, es posible que LC y HC son retenidos conjuntamente sin el enlace de inter-disulfuro y muestran un perfil de SEC similar que el fragmento del dominio de Fab. Por lo tanto, los mutantes fueron examinados adicionalmente por RP-HPLC-TOF/MS bajo condiciones no reductoras después de 1 día de tratamiento con H202. Bajo estas condiciones, se espera que solamente los componentes unidos no covalentemente podrían ser separados de las especies principales. Como se muestra en la Figura 2, además del pico principal que eluye a -21 minutos, un componente, que migra con un tiempo de retención de 16.5 minutos, fue observado para todos lo mutantes. En particular, el mutante de H/A liberó esta especie aproximadamente 15 veces más que los mutantes de H/S y H/Q. Los análisis de TOF/MS determinaron una masa molecular de 23,437.5 Da para esta especie, que es +48 Da más pesado que la masa teórica de 23,389.0 Da para el LC. El análisis de RP-HPLC-MS/MS del mapa del péptido de Lys-C confirmó que la especie mostró una conversión total del LC Cys215 al ácido sulfónico ( +48 Da) , sugiriendo que la ruptura del enlace del inter-disulfuro por el ataque de H202 condujo a la oxidación del LC . Estos resultados sugieren que la remoción de un grupo OH anula la capacidad de la formación del enlace de H en la cadena lateral y perjudicó adversamente la capacidad de este residuo para resistir un ataque de los radicales.

Utilizando un péptido sintético (FDK-THTY) (SEC ID NO: 8), Alien et al. (Alien, G. y Campbell, R. , Int. J. Peptide Protein Res. 48: 265-273, 1996) se encontró que una substitución de His/Ala previno la escisión inducida por Cu2+ (1 mM) del péptido, que comprende la misma secuencia (DKTHT) (SEC ID NO: 7) que la articulación superior de un IgGl . Sin embargo, los resultados de la invención claramente indican que el mutante de His/Ala no previno la liberación del LC debido a la ruptura inducida por H202 del enlace del inter-disulfuro entre LC y HC. La pérdida del LC podría destruir la función del IgG. Particularmente, la región de articulación en donde los dos enlaces de inter-disulfuro de la articulación conectan los dos HC con la articulación superior (DKTHT) (SEC ID NO: 7) que conectan con el dominio de Fab, es una estructura de doble hebra que restringe la articulación para que adopte una conformación que es más probablemente muy diferente que la conformación del péptido sintético en solución. En consecuencia, los resultados obtenidos de un péptido necesitan ser tomados con precaución cuando se aplican a una proteína que contiene la misma secuencia o una secuencia semejante. Tomados conjuntamente, los resultados de la invención claramente indicaron que los mutantes de His/Ser y His/Gln, pero no el mutante de His/Ala inhibieron la escisión mediada por el radical OH.

Dada la naturaleza de las cadenas laterales de His, Gln, Ser, Ala y Lys , los resultados de analizar estos mutantes permitieron concluir que el anillo de imidazol en lugar del carbono ? en la cadena lateral del residuo His es responsable de la escisión de la articulación. Esta hipótesis fue apoyada por la observación de que el mutante de His/Gln inhibió la escisión inducida por radicales mientras que Gln tiene un carbono ? en su cadena lateral. El sitio principal de fijación electrónica parece que va a ser en el anillo de imidazol de His224 a los valores de pH en donde este es protonado. Los radicales de OH ya se sabe que se fijan en la posición C-2, C-4 y C-5 del anillo de imidazol. Con base en la colocación de estos residuos de la articulación en la estructura tridimensional conocida de IgGl y la red de enlaces de hidrógeno alrededor de la articulación, se propone que la adición subsiguiente de oxígeno a estas especies haga que los radicales iniciales padezcan una pérdida catalizada por una base del agua para dar un radical bisalílico altamente estabilizado. El residuo de His funciona como el objetivo central para localizar un electrón, y subsiguientemente extrae los protones de los residuos cercanos, conduciendo a una escisión inducida por radicales por la diamida y las rutas de a-amidación. Tomados conjuntamente, los resultados demostraron la factibilidad de prevenir la fragmentación de la articulación utilizando un diseño racional.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un conjugado de fragmentos cristalizables resistente a la fragmentación mediada por radicales, aislado, caracterizado porque los fragmentos cristalizables son fragmentos cristalizables de inmunoglobulina 1 o inmunoglobulina 3 humanas y en donde los fragmentos cristalizables comprenden una secuencia del núcleo de articulación THTCPXCP (identificación N0:9 de la secuencia), en donde X es R o P, en donde el residuo H en la secuencia del núcleo de articulación está substituido con un residuo de Ser, Gln, Asn, o Thr .

2. El conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado de fragmentos cristalizables es un anticuerpo monoclonal, un pepticuerpo, o la fusión de un receptor de fragmentos cristalizables.

3. El conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal totalmente humano .

4. El conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el residuo de histidina en la porción es un residuo de serina o de glutamina.

5. El conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es llevado en un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica el conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 2.

7. Un vector de expresión aislado, caracterizado porque comprende el ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 6.

8. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.

9. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es una célula de los ovarios de hámster chino.

10. Un método de fabricación de un conjugado de fragmentos cristalizables de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende cultivar en una célula hospedera adecuada el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5 bajo condiciones adecuadas para expresar el vector, y aislar el conjugado de fragmentos cristalizables expresado de la célula hospedera.