RU2811912C2

RU2811912C2 - Антитела против альфа-субъединицы ил-7r и их применение

Info

Publication number: RU2811912C2
Application number: RU2021124794A
Authority: RU
Inventors: Аарон Пол ЯМИНЮК; Скотт Роналд БРОДЕУР; Екатерина Деянова; Ричар Ю-Чэн ХУАН; Юнь ВАН; Альфред Роберт ЛАНГИШ; Годун Чэнь; Стивен Майкл Карл; Хун Шэнь; Ачал Мукундрао ПАШИНЕ; Линь Хуэй СУ
Original assignee: Бристол-Маерс Сквибб Компани
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2024-01-18

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенному антителу или его антигенсвязывающей части, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека (ИЛ-7R), а также к иммуноконъюгату и набору, его содержащим. Изобретение эффективно для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 29 ил., 18 табл., 14 пр.

Description

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ ЧЕРЕЗ EFS-WEB

[0001] Содержимое представленного в электронном виде перечня последовательностей в текстовом файле ASCII (имя: 4521.001РС02 Seqlisting ST25.txt; размер: 100565 байт; и дата создания: 17 января, 2020), поданном вместе с заявкой, полностью включено в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Интерлейкин-7 (ИЛ-7) является членом семейства цитокинов общей у-цепи (ус), которое также включает ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-9, ИЛ-15 и ИЛ-21. Nguyen V., et al., J Immunol Res 2017: 4807853 (2017). Подобно другим членам, ИЛ-7 передает сигналы через тройной комплекс, образованный с его уникальным α-рецептором. ИЛ-7Яа (CD 127), и общим γ-рецептором. Carrette, F., et at, Semin Immunol 24(3): 209-17 (2012). Это взаимодействие стимулирует Янус-киназу (JAK) и трансдуктор сигналов и активатор белков транскрипции (STAT) с последующей активацией путей фосфоинозитол-3-киназы (PI3K)/Akt или Src для облегчения транскрипции гена-мишени. ИЛ-7 Ra также используется лимфопоэтином, происходящим из стромы тимуса (TSLP), в виде части комплекса, который содержит вторую рецепторную цепь TSLPR. Durum, S.K., Blood 124(1):4-5 (2014).

[0003] ИЛ-7 играет решающую роль в развитии нормальной иммунной системы, поскольку он необходим для развития тимуса, поддержания в периферической крови и выживаемости лимфоцитов. Maraskovsky, Ε., et at, J Immunol 157(12): 5315-5323 (1996). Предшественникам тимусных Т-клеток необходим ИЛ-7 для пролиферации, дифференцировки и выживаемости. В периферической крови ИЛ-7 регулирует гемостаз Т-клеток, увеличивая выживаемость и пролиферацию наивных Т-клеток и Т-клеток памяти.

[0004] ИЛ-7 представляет собой цитокин тканевого происхождения, который в основном продуцируется стромальными и эпителиальными клетками в различных тканях. Например, в тонкой и толстой кишке ИЛ-7 продуцируется эпителиальными клетками бокаловидного кишечника, и на животных моделях был описан как необходимый для сохранения хронического колита. Tomita, Т., et al., J Immunol 180(1): 383-390 (2008). Было также показано, что ИЛ-7 влияет на иммуносупрессивные свойства регуляторных Т-клеток (Treg). Heninger, А.K., et al., J Immunol 189(12): 5649-5658 (2012). Таким образом, агенты, которые могут модулировать активность ИЛ-7 in vivo и тем самым снижать выживаемость/функцию патогенных Т-клеток и/или увеличивать индукцию регуляторных Т-клеток, очень желательны для лечения воспалительных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В данном документе предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, причем антитело

(a) способно связываться с Т-клетками (CD4⁺CD45RA⁺, CD4⁺CD45RA, CD8⁺CD45RA⁺, и/или CD8⁺CD45RA) в цельной крови с ЕС50 около 5 нМ или меньше (например, меньше около 3 нМ);

(b) не способно связываться с клетками, отличными от Т-клеток, цельной крови;

(c) не способно эффективно блокировать активацию моноцитов, опосредованную стромальным лимфопоэтином тимуса (ТСЛП);

(d) не агонизирует сигналинг рецептора ИЛ-7 при связывании с рецептором ИЛ-7, например, минимальную активацию pSTAT5; или

(e) любая их комбинация.

[0006] В некоторых вариантах осуществления CDR3 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R (например, описанного в данном документе) включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15 (DEYSRGYYVLDV).

[0007] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению имеет одно или более свойств, выбранных из группы, состоящей из следующего:

(a) способно избирательно связываться с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека и яванского макака (ИЛ-7R);

(b) способно связываться с альфа-цепью растворимого и мембраносвязанного ИЛ-7R;

(c) способно блокировать экспансию и/или выживаемость патогенных Т-клеток при введении субъекту, нуждающемуся в этом;

(d) способно восстанавливать функцию регуляторных Т-клеток (Трег) и/или способствовать выживаемости Трег при введении нуждающемуся в этом субъекту;

(e) способно поддерживать ремиссию без лекарственных средств дольше, чем ремиссию с CTLA4-Ig (ORENCIA®);

(f) способно блокировать воспаление и повреждение слизистой оболочки, например, индуцированное патогенными Т-клетками, в ткани кишечника нуждающегося в этом субъекта;

(g) способно снижать частоту эффекторных Т-клеток в мезентериальных лимфатических узлах (МЛУ) и/или собственной пластинке (СП) у нуждающегося в этом субъекта;

(h) способно снижать или ингибировать опосредованную ИЛ-7 активацию pSTAT в Т-клетках (например, CD4⁺CD45RA⁺);

(i) способно блокировать экспансию клеток, продуцирующих ИЛ-17 и/или ИФН-гамма;

(j) способно лечить субъекта с воспалительным заболеванием (например, воспалительным заболеванием кишечника); и (k) любая их комбинация.

[0008] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR1 тяжелой цепи, причем CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13 (DHAMH). В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR2 тяжелой цепи, где CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14 (GISWNSRGIGYADSVKG). В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR1 легкой цепи, причем CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (RASQGISSALA). В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR2 легкой цепи, причем CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17 (DASSLES). В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR3 легкой цепи, причем CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18 (QQFNSYPLWIT).

[0009] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем VH включает аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на около 100% идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19. В определенных вариантах осуществления VL содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на около 100% идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20.

[0010] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека в эпитопе, выбранном из группы, состоящей из: ²⁴SQLEVNGSQHSLTCAF³⁹ (SEQ ID NO: 8); ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸ (SEQ ID NO: 9); ⁸⁹VKVGEKSLTCKKIDLTT¹⁰⁵ (SEQ ID NO: 10); ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹ (SEQ ID NO: 11); ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶ (SEQ ID NO: 12); и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека в эпитопе, содержащем один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Н33, Е75, F79, 182, K84, М144, R186, Н191, Y192 и их комбинации.

[0011] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианта. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит Fc IgG1, который не является эффекторным.

[0012] В данном документе также описано выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора человеческого ИЛ-7 («антитело к ИЛ-7R»), содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и при этом легкая цепь включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

[0013] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека с Kd менее 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ (например, 1,3 нМ), по данным измерения методом поверхностного плазмонного резонанса. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 яванского макака с Kd менее 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ (например, 1,7 нМ), по данным измерения методом поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления связывание с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 или альфа-цепью рецептора ИЛ-7 яванского макака зависит от рН. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека с Kd около 1,3 нМ при рН 7,4 и с Kd около 5,3 нМ при рН 6. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 яванского макака с Kd около 1,7 нМ при рН 7,4 и с Kd около 7,0 нМ при рН 6.

[0014] В данном документе предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где CDR1 НС включает аминокислотную последовательность GX₁X₂FDDHAX₃H (SEQ ID NO: 260), где Χ₁ представляет собой F или Υ; Х₂ представляет собой Τ, Р, A, S, V, L, I, Μ, Н, F, Υ, N, D, Ε или Q; и Х₃ представляет собой L или М. В некоторых аспектах Х₂ представляет собой D или Е.

[0015] В некоторых аспектах CDR2 НС включает аминокислотную последовательность GIX₁WX₂SRGX₃GYX₄X₅X₆X₇X₈X₉ (SEQ ID NO: 261), где Χ₁ представляет собой S или Т; Х₂ представляет собой Η или Ν; Х₃ представляет собой I или V. Х₄ представляет собой G, A, S, Τ, V, L, I, R, Н, или Ν; Х₅ представляет собой Ρ, Τ, N, D, Е, Q, S, Н, или Υ; Х₆ представляет собой Р, G, A, S, Τ, V, R, Н, F, Υ, N, D, или Ε; Х₇ представляет собой V или I, Х₈ представляет собой A, S, Τ, V, L, I, М, K, R, Н, F, Υ, N, D, Е, или Q, и Х₉ представляет собой G, Н, D, или Q. В определенных аспектах Χ₁ представляет собой Т.

[0016] В некоторых аспектах CDR3 НС включает аминокислотную последовательность DEYX₁X₂GYYX₃LDX₄ (SEQ ID NO: 262), где Χ1 представляет собой S, Τ, N, D, или Е; Х₂ представляет собой L, М, R, или S; Х₃ представляет собой G, A, S, Τ, V, Μ, Ν, Е, или Q; и Х₄ представляет собой A, S, Τ, V, R, Η, Y, W, Ν, Е, Q, или М. В некоторых аспектах Х₃ представляет собой A, S, или Т. В некоторых аспектах Х₄ представляет собой Е.

[0017] В некоторых аспектах CDR1 LC включает аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇SX₈X₉A (SEQ ID NO: 263), где Χ₁ представляет собой S, Τ, V, K, R, Η, Υ, или I; Х₂ представляет собой A, S, Т, или V, Х₃ представляет собой Р, G, A, S, Τ, V, L, I. М, K, R, Η, Ν, Е, или Q: Х₄ представляет собой Р, G, A, S, Τ, V, L, I, Μ, Н, F, Υ, Ν, Е, или Q; Х₅ представляет собой Р, G, A, S, Τ, Η, Е, Q, Μ, Ν, или D, Х₆ представляет собой Р, G, A, S, Т, V, L, I, или Ν; Х₇ представляет собой S, Τ, V, L, I, Μ, Η, F, Υ, Ν, D, Ε, или Q; X₈ представляет собой Ρ или А; и Х₉ представляет собой A, L, или V. В некоторых аспектах Х₆ представляет собой Р. В дополнительных аспектах Х₈ представляет собой Р. В некоторых аспектах Х₇ представляет собой D или Е.

[0018] В некоторых аспектах CDR2 LC включает аминокислотную последовательность DX₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 264), где Χ₁ представляет собой G, A, S, Μ, Η, N, D, Е, или Q; Х₂ представляет собой G, A, S, Τ, V, Μ, Н, F, Υ, N, D, Е, или Q; Х₃ представляет собой A, S, F, Y, W, N, D, Е, или L, Х₄ представляет собой Р, S, Т, L, К, Н, или Ν; Х₅ представляет собой D, Е, или Q, и Х₆ представляет собой G, S, Τ, N, D, Q, Р, или Е.

[0019] В некоторых аспектах CDR3 LC включает аминокислотную последовательность X₁X₂FX₃X₄YPLX₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 265), где Χ₁ представляет собой Μ или Q; Х₂ представляет собой G, A, D, Е, или Q; Х₃ представляет собой N или Ε, Х₄ представляет собой Р, А, или S, Х₅ представляет собой Τ, I, М, K, W, Ν, Е, или Q, Х₆ представляет собой L или I, и Х₇ представляет собой Τ, Μ, K, Η, Υ, Е, или Q.B определенных аспектах, Х₂ представляет собой А. В дополнительных аспектах Х₄ представляет собой Ρ или А.

[0020] В некоторых аспектах CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31-46. В определенных аспектах CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 44. В некоторых аспектах CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47-96. В определенных аспектах CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47. В дополнительных аспектах CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 97-122. В определенных аспектах CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, или SEQ ID NO: 120. В некоторых аспектах CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 123-194. В некоторых аспектах CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, или SEQ ID NO: 192. В некоторых аспектах CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 195-237. В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 238-259. В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244, или SEQ ID NO: 245.

[0021] В данном документе предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31 46; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. В определенных аспектах CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 44.

[0022] В данном документе также предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47-96; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. В определенных аспектах CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47.

[0023] В данном изобретении выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС), и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 97-122; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. В некоторых аспектах CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, или SEQ ID NO: 120.

[0024] В данном документе предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 123-194; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18. В некоторых аспектах CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, или SEQ ID NO: 192.

[0025] В данном документе также предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 195-237; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18.

[0026] В данном документе предложено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), содержащее CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13; (ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14; (iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15; (iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16; (v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и (vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 238 259. В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244, или SEQ ID NO: 245.

[0027] В данном изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело к ИЛ-7R по данному изобретению, векторы, содержащие указанные нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие указанные векторы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетки СНО, клетки HEK293, клетки HBK, клетки COS, клетки NSO или клетки НТ1080.

[0028] В данном документе также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к ИЛ-7R, как описано в данном документе, связанное с агентом.

[0029] В данном документы также предложены композиции, содержащие антитело к ИЛ-7R, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку или иммуноконъюгат, как описано в данном документе, и носитель.

[0030] В данном документе также предложены наборы, содержащие антитело к ИЛ-7R, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку или иммуноконъюгат, как описано в данном документе, и инструкцию по применению.

[0031] В данном документе предложен способ ингибирования активности ИЛ-7 у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антитела к ИЛ-7R, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или иммуноконъюгата, как описано в данном документе.

[0032] В данном документе предложен способ ингибирования пролиферации эффекторных Т-клеток и/или индукции образования и/или выживаемости регуляторных Т-клеток у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антитела к ИЛ-7R, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или иммуноконъюгата, как описано в данном документе.

[0033] В данном документе также предложен способ лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту антитела к ИЛ-7R, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки или иммуноконъюгата, как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из следующего: воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатический артрит, системная красная волчанка (СКВ), волчаночный нефрит, васкулит, сепсис, синдром системной воспалительной реакции (ССВР), диабет I типа, болезнь Грейвса, рассеянный склероз (PC), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическая болезнь сердца, хроническая обструктивная болезнь легких, интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермия, системный склероз, остеоартрит, атопический дерматит, витилиго, реакция «трансплантат против хозяина», синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, аллергия, астма, другие аутоиммунные заболевания, которые являются результатом острого или хронического воспаления, а также любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника. В дополнительных вариантах осуществления воспалительное заболевание кишечника представляет собой язвенный колит или болезнь Крона.

[0034] В некоторых вариантах осуществления субъект (например, описанный в данном документе) недостаточно ответил предыдущую терапию ингибитором ФНО-α (субъект, недостаточно ответивший на анти-ФНО-α).

[0035] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе способ может дополнительно включать введение одного или более дополнительных терапевтических средств. В определенных вариантах осуществления дополнительные терапевтические средства включают антитело к ФНО-а.

[0036] В некоторых вариантах осуществления описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R вводят субъекту в фиксированной дозе или основанной на массе тела дозе. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутрикожно или внутрибрюшинно. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R вводят внутривенно или подкожно.

[0037] В данном документе также предложен способ получения антитела, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека («антитело к ИЛ-7R»), включающий культивирование клетки, описанной в данном документе, в подходящих условиях, и выделение антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ/ФИГУР

[0038] На Фиг. 1 показана кривая связывания антитела к ИЛ-7R с CD3^- клетками (т.е. клетками, отличными от Т-клеток), по данным измерения методом проточной цитометрии. По оси абсцисс показана концентрация (пг/мл) антитела к ИЛ-7R, а по оси ординат средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) для связывания.

[0039] На Фиг. 2А и 2В показана перекрестная реактивность антитела к ИЛ-7R с ИЛ-7Rα яванского макака после однократного внутривенного введения антитела у яванских макак. На Фиг. 2А показан процент общего количества ИЛ-7Rα, экспрессируемого на CD4⁺CD45RA⁺Т-клетках, которые заняты, в виде функции концентрации антитела к ИЛ-7R в сыворотке (нг/мл). На Фиг. 2В показана активация pSTATS в CD4⁺CD45RA⁺Т-клетках в зависимости от концентрации антитела к ИЛ-7R (нМ) в сыворотке. Активация pSTAT5 показана в виде процента от общего количества STAT5, который подвергается морфорилированию. Как на Фиг. 2А, так и на Фиг. 2В концентрация антитела в сыворотке предназначена для представления измеренного воздействия на CD4⁺CD45RA⁺ Т-клеток антитела к ИЛ-7R.

[0040] На Фиг. 3 показана фармакокинетика (концентрация в сыворотке) антитела к ИЛ-7R после однократного внутривенного введения мышам линии NOD/SCID-GAMMA (NSG) с переносом МКПК человека. Мыши получили одну из двух доз антитела к ИЛ-7R: 0,5 мг/кг (черный квадрат со сплошной линией) или 5 мг/кг (белый квадрат с пунктирной линией). Контрольные мыши получали антитело A3312F: 0,5 мг/кг (черный кружок со сплошной линией) или 5 мг/кг (белый кружок со сплошной линией). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

[0041] На Фиг. 4 показаны как фармакокинетика (концентрация в сыворотке), так и образование антител к лекарственному средству (ADA) после однократного внутривенного введения антитела к ИЛ-7R у яванских макак. Животные получили одну из трех доз антитела: 0,1 мг/кг (квадрат), 0,5 мг/кг (кружок) или 3 мг/кг (треугольник). Концентрации антитела в сыворотке (левая ось Y) при различных дозах показаны сплошными линиями. Образование антитела к лекарственному средству (т.е. против введенного антитела к ИЛ-7R) (правая ось у) показано пунктирными линиями. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

[0042] На Фиг. 5 показано сравнение фармакокинетики (концентрации в сыворотке) антитела к ИЛ-7R и антитела A3312F после однократного внутривенного введения у яванских макак. Животные получали одну из трех доз антитела к ИЛ-7R: 0,1 мг/кг (черный квадрат со сплошной линией), 0,5 мг/кг (черный кружок со сплошной линией) или 3 мг/кг (черный треугольник со сплошной линией). Контрольные животные получали антитело A3312F в одной из следующих доз: 0,1 мг/кг (белый квадрат с пунктирной линией), 0,5 мг/кг (белый кружок с пунктирной линией) или 3 мг/кг (белый треугольник с пунктирной линией). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.

[0043] На Фиг. 6 показана активация pSTAT5 в CD4⁺CD45RA⁺Т-клетках после однократного внутривенного введения антитела к ИЛ-7R (квадрат) или антитела A3312F (треугольник) у яванских макак. Активация pSTAT5 показана в виде процента от общего количества STAT5, который подвергается морфорилированию. Концентрация антитела в сыворотке предназначена для представления измеренного воздействия антитела на CD4⁺CD45RA⁺Т-клетки.

[0044] На Фиг. 7А, 7В и 7С показана частота различных популяций Т-клеток, наблюдаемых в периферической крови после однократного внутривенного введения антитела к ИЛ-7R (3 мг/кг) у различных яванских макак. На Фиг. 7А показана частота CD3⁺ Т-клеток в процентах от общего числа лимфоцитов. На Фиг. 7В и Фиг. 7С показана частота CD4⁺ Τ клеток и CD8⁺ Т-клеток, соответственно, в процентах от общей популяции CD3⁺ Т-клеток. На Фиг. 7А, 7В и 7С, частоту различных популяций Т-клеток определяли при предварительном введении (первый столбец слева в каждом наборе столбцов для отдельной обезьяны) и на 4-й (второй столбец слева в каждом наборе столбцов для отдельной обезьяны), 8-й (третий столбец слева в каждом наборе столбцов для отдельной обезьяны) и 15-й дни (четвертый столбец слева в каждом наборе столбцов для отдельной обезьяны) после введения антитела. По оси абсцисс приведен идентификационный номер каждой обезьяны.

[0045] На Фиг. 8 показан потенциальный риск иммуногенности различных производственных партий антитела к ИЛ-7R, измеренный in vitro с использованием анализа пролиферации дендритных клеток: Т-клеток. К различным протестированным антителам к ИЛ-7R относятся: (i) Р1-061895-2, (ii) Pl-066930-3, (iii) Pl-066930-9, и (iv) антитело A RACIR. Авастин и антитело к ИЛ-21R (мкАт к ИЛ-21R) показаны как отрицательный и положительный контроль, соответственно.

[0046] На Фиг. 9 показано покрытие последовательностей ИЛ-7Rα человека с использованием анализа методом картирования эпитопов HDX-MS. Каждая полоса указывает на пепсиновый пептид.

[0047] На Фиг. 10 показаны различия в захвате дейтерия для пяти эпитопов антитела к ИЛ-7R, идентифицированных с использованием анализа методом картирования эпитопов HDX-MS. Приведенные пять эпитопов включают: (i) ²⁴SQLEVNGSQHSLTCAF³⁹; (ii) ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸; (iii) ⁸⁹VKVGEKSLTCKKIDLTT¹⁰⁵; (iv) ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹; и (v) ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶. Черные вертикальные полосы указывают на суммарные различия в дейтерировании для каждого пептида. Линии представляют различия в дейтерировании для каждого пептида в разные моменты времени, то есть 1 минута («(2)»), 10 минут («(3)») и 240 минут («(1)»).

[0048] На Фиг. 11А и 11В представлены сводные данные анализа методом картирования эпитопов для антитела к ИЛ-7R. На Фиг. 11А, эпитопы были картированы на линейную последовательность ИЛ-7Rα человека. Эпитопы, идентифицированные с помощью анализа HDX-MS, обозначены сплошной линией. Эпитопы, идентифицированные с помощью анализа FPOP/GEE, обозначены пунктирной линией. Наиболее защищенные остатки эпитопов, идентифицированные с помощью анализа FPOP, обозначены кружками. Наиболее защищенные остатки эпитопов, идентифицированные с помощью анализа GEE, обозначены треугольниками. Показанная нумерация соответствует зрелой последовательности ИЛ-7Rα человека. На Фиг. 11В эпитопы картированы на кристаллическую структуру ИЛ-7Ra человека. Кристаллическая структура слева показывает эпитопы, идентифицированные с помощью анализа HDX-MS. Кристаллическая структура справа показывает эпитопы, идентифицированные с помощью анализа FPOP/GEE. Последовательности эпитопов представлены под кристаллическими структурами.

[0049] На Фиг. 12А и 12В показана схематическая диаграмма ФК модели антитела к ИЛ-7R (Фиг.12А) и механистической ФК/ФД модели (Фиг. 12В), используемой для характеристики данных ФК и ФД у обезьян и людей.

[0050] На Фиг. 13 показана прогнозируемая фармакокинетика человека (на основе концентрации антитела к ИЛ-7R в сыворотке) (левая ось Y) и кривая занятости рецептора (правая ось Y) при прогнозируемой дозе антитела к ИЛ-7R для человека (110 мг каждые две недели подкожно для 70 кг взрослого). Верхняя строка («ЗР») демонстрирует данные о занятости рецепторов. Нижняя строка («ФК») демонстрирует фармакокинетические данные.

[0051] На Фиг. 14А и 14В показано связывание антитела 18В1 (антитело А) с ИЛ-7R человека после переформатирования в scFv. На Фиг. 14А представлено сравнение связывания scFv 18В1 при различных концентрациях. На Фиг. 14В представлены значения ka, kd, и KD.

[0052] На Фиг. 15 показаны конкретные аминокислотные остатки в CDR тяжелой и легкой цепей, которые по отдельности подвергали процессу мутации для анализа методом мутационного сканирования, описанного в Примере 11.

[0053] На Фиг. 16 показаны результаты одного раунда отбора для scFv 18В1. Процент связывания тяжелой цепи и легкой цепи 18В1 с ИЛ-7R человека показан по сравнению с биотин-ИЛ-7R. Тяжелую цепь и легкую цепь 18В1 тестировали при двух различных концентрациях (0,2 нМ и 1 нМ).

[0054] На Фиг. 17А и 17В схематически показан общий процесс создания библиотеки для мутационного сканирования, описанной в Примере 11, и использования секвенирования нового поколения (NGS) для идентификации 1) положений CDR, критических для связывания, 2) положений CDR, где мутации допускаются, и 3) мутаций, которые могут улучшить связывание антитела с чИЛ-7R. На Фиг. 17А показаны различные аспекты самого процесса. На Фиг. 17В представлено краткое описание интерпретации результатов тепловых карт.

[0055] На Фиг. 18А, 18В, 18С, 18D, 18Е и 18F представлены результаты для тепловых карт для вариантов антитела 18В1 с мутацией в CDR3 LC, CDR3 НС, CDR1 LC, CDR2 LC, CDR1 НС и CDR2 НС, соответственно. Для каждой из фигур варианты антител тестировали при двух различных концентрациях (0,2 нМ и 1 нМ). На каждой из фигур в крайнем левом столбце представлена конкретная мутация, произведенная в конкретном аминокислотном остатке. Оценки обогащения для различных мутаций указаны в соответствующих полях. Как объясняется на Фиг. 17В, оценка обогащения >1 указывает на благоприятную мутацию (т.е. улучшает связывание), а более высокая оценка обогащения указывает на более благоприятную мутацию. Оценка обогащения 1 предполагает нейтральную мутацию (т.е. не оказывает значительного влияния на связывание). Оценка обогащения <1 указывает на неблагоприятную мутацию (т.е. нарушение связывания).

[0056] На Фиг. 19 представлено (i) значение KD (показанное как отношение исходного антитела 18В1 к варианту антитела) и (ii) коэффициент обогащения, полученный посредством анализа тепловой карты NGS для различных вариантов антитела 18В1.

[0057] На Фиг. 20А и 20В представлен обзор формата кинетического анализа Biacore, используемого для оценки связывания 18В1 (антитело А) и аланиновых вариантов 18В1, описанных в Примере 11. Конкретные используемые условия представлены в левой части Фиг. 20А. Сенсограмма Biacore для антитела 18В1 представлена в правой части Фиг. 20А. На Фиг. 20В показана схема использованного анализа Biacore.

[0058] На Фиг. 21 представлены данные о связывании различных вариантов антитела 18В1 с ИЛ-7R человека, по данным измерения при помощи анализа Biacore.

[0059] На Фиг. 22 представлен профиль поверхностного плазмонного резонанса (ППР) иллюстративных вариантов антитела 18В1. Для каждого из вариантов антител значения ka, kd и KD приведены под профилем ППР.

[0060] На Фиг. 23 представлена графическая сводка распределения значений KD для различных вариантов антитела 18В1. Каждый из вариантов антител разделяют на основании того, в какой из CDR произошла мутация. Каждый кружок представляет собой отдельное антитело.

[0061] На Фиг. 24 показана корреляция между значениями KD (квадрат) и результатами тепловой карты, полученной с использованием NGS (белый кружок) для различных аланиновых вариантов. Специфические мутации (либо в CDR легкой цепи, либо в CDR НС) представлены по оси X.

[0062] На Фиг. 25А и 25В представлена кристаллическая структура фрагмента Fab антитела 18В1. На Фиг. 25А обозначены тяжелые (темно-серый) и легкие цепи (светло-серый) антитела 18В1. На Фиг. 25В остатки, важные для связывания с ИЛ-7Rα, показаны темно-серым цветом. Остатки, которые можно изменить для улучшения связывания, показаны черным.

[0063] На Фиг. 26 представлено сравнение экспрессии ИЛ-7Rα на CD3⁺ лейкоцитах, выделенных от обезьян, которым подкожно вводили антитело 18В1 в одной из следующих доз: (i) 2 мг/кг («квадрат»), (ii) 10 мг/кг («треугольник») и (iii) 50 мг/кг («ромб»). Животных, которые не получали антитело 18В1, использовали в качестве контроля («кружок»). Экспрессия ИЛ-7Rα показана в виде средней интенсивности флуоресценции (СИФ), измеренной с помощью проточной цитометрии. Экспрессию ИЛ-7Rα измеряли в следующие дни после введения антитела: 1-й день, 4 часа; 5-й день; 8-й день; 22-й день; 36-й день; 36-й день, 4 часа; 40-й день; 43-й день; 64-й день; и 99-й день.

[0064] На Фиг. 27А и 27В представлено сравнение индуцированного гемоцианином моллюска Megathura crenulata (KLH) образования антител IgM (Фиг. 27А) и IgG (Фиг. 27В) у обезьян, которым подкожно вводили антитело 18В1 в одной из следующих доз: (i) 2 мг/кг («квадрат»), (ii) 10 мг/кг («треугольник») и (iii) 50 мг/кг («ромб»). Животных, которые не получали антитело 18В1, использовали в качестве контроля («кружок»). KLH-индуцированное образование IgM и IgG показаны путем предоставления конечных титров KLH-специфических антител IgM и IgG, измеренных в сыворотках животных с помощью ИФА. Как показано на Фиг. 27А, KLH-специфический IgM измеряли через 15, 22,и 29 дней после введения антитела 18В1 (т.е. через 0, 7 и 14 дни после иммунизации KLH, соответственно). Как показано на Фиг. 27В, KLH-специфический IgG измеряли на 15, 29, 36 и 43 дни после введения антитела 18В1 (то есть 0, 14, 21 и 28 дни после иммунизации KLH, соответственно).

[0065] На Фиг. 28А, 28В и 28С показаны различия в захвате дейтерия для разных эпитопов для трех эталонных антител к ИЛ-7R (4А8, 13А10 и PFE A3312F, соответственно), идентифицированных с помощью анализа методом картирования эпитопов HDX-MS. Эпитопы, показанные на Фиг. 28А, для антитела 4А8 включают: (i) ⁵⁷LVEVKCLNF⁶⁵, (ii) ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸, (iii) ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹, и (iv) ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶. Эпитопы, показанные на Фиг. 28В, для антитела 13А10 включают: (i) ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸, (ii) ⁸⁹VKVGEKSLTCKKIDLTT¹⁰⁵, (iii) ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹, и (iv) ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶. Эпитопы, показанные на Фиг.28С, для PFE A3312F включают: (i) ²⁴SQLEVNGSQHSLTCA³⁸, (ii) ⁵²EICGALVEVKCLNF⁶⁵, (iii) ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸, (iv) ⁸⁹VKVGEKSLTCKKIDLTT¹⁰⁵, (v) ¹⁰⁴TTIVKPEAPFDLSV¹¹⁷, (vi) ¹⁰⁹PEAPFDLSVIYRE¹²¹, (vii) ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹, (viii) ¹⁶⁹TLLQRKLQPAAM¹⁸⁰, и (ix) ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶. Черные вертикальные полосы указывают на суммарные различия в дейтерировании для каждого пептида. Линии представляют различия в дейтерировании для каждого пептида в разные моменты времени, то есть 1 минута («(2)»), 10 минут («(3)») и 240 минут («(1)»).

[0066] На Фиг. 29А, 29В и 29С показаны эпитопы трех эталонных антител к ИЛ-7R (4А8, 13А10 и PFE A3312F, соответственно), картированные на кристаллической структуре белка ИЛ-7Rα человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0067] Для облегчения понимания настоящего изобретения сначала даны определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании. [0068] Следует отметить, что термины в форме единственного числа включают ссылки на одно или более, например, «нуклеотидная последовательность» означает одну или более нуклеотидных последовательностей. Следовательно, термины в форме единственного числа, а также выражения «один или более» и «по меньшей мере один» могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо.

[0069] Кроме того, в данном контексте «и/или» следует рассматривать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов с другим или без него. Таким образом, термин «и/или», используемый в такой фразе, как «А и/или В», предназначен для включения «А и В», «А или В»; «А» (отдельно) и «В» (отдельно). Аналогичным образом, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «А, В и/или С», предназначен для охвата каждого из следующих аспектов: А, В, и С; А, В, или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно); и С (отдельно).

[0070] Понятно, что везде, когда аспекты описаны в данном документе с формулировкой «содержащий», также предложены аналогичные аспекты, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».

[0071] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится это изобретение. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, обеспечивают специалиста общим словарем многих терминов, используемых в данном описании.

[0072] Единицы, префиксы и символы обозначаются в их принятой форме для метрической системы единиц измерений (СИ). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записываются слева направо в ориентации от 5'- до 3'-конца. Аминокислотные последовательности записываются слева направо в ориентации от амино до карбокси. Заголовки, представленные в данном документе, не являются ограничениями различных аспектов изобретения, которые могут быть осуществлены со ссылкой на спецификацию в целом. Соответственно, термины, определенные ниже, определены в более полном объеме со ссылкой на это описание в целом.

[0073] Термин «около» используется в данном документе для обозначения приблизительно, примерно, около или в областях. Если около термин «около» применяется в сочетании с числовым диапазоном, то он изменяет этот диапазон, расширяя границы выше и ниже указанных числовых значений. В целом, термин «около» может изменить числовое значение выше и ниже указанного значение с отклонением, например, 10 процентов, вверх или вниз (выше или ниже).

[0074] Используемые в данном документе термины «ИЛ-7R» и «рецептор ИЛ-7» относятся к любой форме ИЛ-7R, включая его варианты, которые сохраняют по меньшей мере часть активности ИЛ-7R. ИЛ-7R представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединицы (ИЛ-7Rα или CD 127) и общей у-цепи цитокинового рецептора (ус). Субъединица ИЛ-7Rα экспрессируется на различных типах клеток, включая наивные Т-клетки и Т-клетки памяти, а также развивающиеся В-клетки. Используемый в данном документе в некоторых аспектах термин ИЛ-7R относится к субъединице α и используется взаимозаменяемо с ИЛ-7Rα.

[0075] Идентифицированы четыре изоформы ИЛ-7Rα человека. Изоформа 1 (номер доступа NP_002176.2; SEQ ID NO: 1) состоит из 459 аминокислот и представляет собой каноническую последовательность. Изоформа 2 (номер доступа Ρ16871-4; SEQ ID NO: 2) состоит из 252 аминокислот и растворима. В нем отсутствуют аминокислотные остатки 253-459, которые кодируют часть трансмембранного домена и весь цитоплазматический домен. Аминокислоты 237-252 также отличаются от канонической последовательности (т.е. изоформы 1). Изоформа 3 (номер доступа Р16871-2, SEQ ID NO: 3) состоит из 298 аминокислот и имеет усеченный цитоплазматический домен. Она отличается от канонической последовательности аминокислотными остатками 293-459. Изоформа 4 (номер доступа Р16871-3; SEQ ID NO: 4) состоит из 261 аминокислоты и является растворимой. Она отличается от канонической последовательности аминокислотными остатками 237-459.

[0076] Ниже приведены аминокислотные последовательности четырех известных изоформ ИЛ-7Rα человека.

(A) Изоформа 1 ИЛ-7Rα человека (номер доступа NP_002176.2; SEQ ID NO: 1, кодируется нуклеотидной последовательностью с номером доступа NM_002185.4; SEQ ID NO: 5):

(B) Изоформа 2 ИЛ-7Rα человека (номер доступа Р16871-4; SEQ ID NO: 2):

(C) Изоформа 3 ИЛ-7Rα человека (номер доступа Р16871-2; SEQ ID NO: 3):

(D) Изоформа 4 ИЛ-7Rα человека (номер доступа Р16871-3; SEQ ID NO: 4):

[0077] Сигнальная последовательность изоформ 1-4 соответствует аминокислотным остаткам 1-20 (подчеркнуты). Таким образом, зрелая форма, например, канонической последовательности (изоформа 1) состоит из аминокислот 21-459. Внеклеточный домен зрелого ИЛ-7Rα человека (например, изоформа 1) состоит из аминокислотных остатков 21-239 и имеет следующую аминокислотную последовательность:

[0078] Белок ИЛ-7Rα яванского макака состоит из следующей аминокислотной последовательности (включая сигнальную последовательность, которая подчеркнута):

[0079] Используемый в данном документе термин «TSLP» относится к фактору роста, который очень похож на ИЛ-7 и играет роль в созревании и активации миелоидных клеток (например, моноцитов и дендритных клеток). TSLP продуцируется различными типами клеток, такими как фибробласты, эпителиальные клетки и стромальные клетки. Повышенные уровни TSLP были связаны с такими заболеваниями, как астма, атопический дерматит и воспалительный артрит, которые, как известно, также связаны с аномальной регуляцией ИЛ-7. Nguyen V., et at, JImmunol Res 2017: 4807853 (2017).

[0080] Используемый в данном документе термин «антитело» относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи (обозначаемой в данном документе сокращенно как СН). В определенных антителах, например, встречающихся в природе антителах IgG, константная область тяжелой цепи состоит из шарнира и трех доменов, CHI, СН2 и СН3. В определенных антителах, например, встречающихся в природе антителах IgG, каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена (сокращенно CL). Области VH и VL могут быть дополнительно поделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся более консервативными областями, называемыми каркасными областями (PR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: PR1, CDR1, PR2, CDR2, PR3, CDR3, PR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента. Тяжелая цепь может иметь С-концевой лизин или не иметь его. Если в данном документе не указано иное, аминокислоты в вариабельных областях нумеруются с использованием системы нумерации Kabat, а аминокислоты в константных областях нумеруются с использованием системы EU. «Антитело» включает, например, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе антитела; моноклональные и поликлональные антитела; химерные и гуманизированные антитела; человеческие и нечеловеческие антитела и полностью синтетические антитела.

[0081] «Антитело IgG», например, антитело IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, используемое в данном документе, в некоторых вариантах осуществления имеет структуру встречающегося в природе антитела IgG, т.е. оно имеет такое же количество тяжелых и легких цепей и дисульфидных связей как и у встречающегося в природе антитела IgG того же подкласса. Например, антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 к ИЛ-7R состоит из двух тяжелых цепей (НС) и двух легких цепей (LC), при этом две тяжелые цепи и легкие цепи связаны одинаковым числом и расположением дисульфидных мостиков, которые встречаются во встречающихся в природе антителах IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, соответственно (если антитело не было мутировано для модификации дисульфидных мостиков).

[0082] Антитела, как правило, специфически связываются со своим родственным антигеном с высокой аффинностью, что отражается по константе диссоциации (Kd) от 10^-5 до 10^-11 Μ или меньше. Как правило, считается, что значение Kd, превышающее около 10^-4 М, указывает на неспецифическое связывание. В данном контексте антитело, которое «специфически связывается» с антигеном, относится к антителу, которое связывается с антигеном и практически идентичными антигенами с высокой аффинностью, что означает наличие Kd 10^-7 Μ или меньше, 10^-8 Μ или меньше, 5 х 10^-9 Μ или меньше, или от 10^-8 Μ до 10^-10 Μ или меньше, но не связывается с высокой аффинностью с неродственными антигенами. Антиген «по существу идентичен» данному антигену, если он проявляет высокую степень идентичности последовательности с данным антигеном, например, если он проявляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, или по меньшей мере 99% идентичности последовательности с последовательностью данного антигена. В качестве примера, антитело, которое специфически связывается с ИЛ-7Rα человека, в некоторых вариантах осуществления может также обладать перекрестной реактивностью с антигенами ИЛ-7Rα определенных видов приматов (например, ИЛ-7Rα яванского макака), но не может перекрестно реагировать с антигенами ИЛ-7Rα других видов или с антигеном, отличным от ИЛ-7Rα.

[0083] Используемый в данном документе термин «изотип» относится к классу антител (например, антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи. Изотип IgG у определенных видов делится на подклассы: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 у людей и IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 у мышей. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R относятся к изотипу IgG1. Иммуноглобулины, например, IgG1, существуют в виде нескольких аллотипов, которые отличаются друг от друга не более чем несколькими аминокислотами.

[0084] Используемый в данном документе термин «аллотип» относится к встречающимся в природе вариантам в пределах конкретной группы изотипов, где варианты различаются несколькими аминокислотами (см., например, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут быть любого аллотипа. В контексте данного документа антитела, обозначаемые как «IgGlf», «IgG1.1f» или «изотип IgG1.3f», представляют собой антитела IgG1, IgG1.1, который не является эффекторным, и IgG1.3, который не является эффекторным, соответственно, аллотипа «f», т.е. имеющие 214R, 356Е и 358М согласно индексу EU, как у Kabat, как показано, например, в SEQ ID NO: 21.

[0085] Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающая часть» антитела относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ИЛ-7Rα человека). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, например, описанного в данном документе антитела к ИЛ-7R, включают (i) фрагмент Fab (фрагмент от расщепления папаином) или аналогичный моновалентный фрагмент, состоящий из домены V_L, V_H, LC и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2 (фрагмент от расщепления пепсином) или аналогичный двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов V_H и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR) и (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью рекомбинантных способов синтетическим линкером, который обеспечивает возможность создания ими одной белковой цепи, в которой пара областей V_L и V_H образуют моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Fv (scFv); смотрите, например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, и проводят скрининг фрагментов в отношении функциональности таким же образом, что и для интактных антител. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК или ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов.

[0086] «Биспецифическое» или «бифункциональное антитело» представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелой/легкой цепи и два разных сайта связывания. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp.Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

[0087] Термин «моноклональное антитело», как он используется в данном документе, относится к антителу из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в популяцию, по существу похожи и связываются с одним и тем же эпитопом (например, антитела демонстрируют одну специфичность связывания и аффинность), за исключением возможных вариантов, которые могут возникнуть во время продукции моноклонального антитела, такие варианты, как правило, присутствуют в незначительных количествах. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и не должно быть истолковано как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Термин «человеческое моноклональное антитело» относится к антителу из популяции по существу гомогенных антител, которые демонстрируют одну специфичность связывания и которые имеет вариабельные и необязательные константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В одном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая содержит В-клетки, полученные от трансгенного отличного от человека животного, например, трансгенной мыши, имеющей геном, содержащий трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитые с иммортализованными клетками.

[0088] Используемый в данном документе термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, такие как (а) антитела, выделенные из организма животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов человеческого иммуноглобулина, или из полученных из них гибридом, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из комбинаторных библиотек рекомбинантных человеческих антител, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные и константные области, которые используют определенные последовательности иммуноглобулинов зародышевой линии человека, кодируемые генами зародышевой линии, но включают последующие реаранжировки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антител. Как известно в данной области техники (см., например, Lonberg, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), вариабельная область содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые перестраиваются с образованием антитела, специфичного в отношении чужеродного антигена. В дополнение к реаранжировке вариабельная область может быть дополнительно модифицирована путем множественных замен одной аминокислоты (называемых соматической мутацией или гипермутацией) для увеличения аффинности антитела к чужеродному антигену. Константная область изменится при дальнейшем ответе на антиген (т.е. при переключении изотипа). Следовательно, перестроенные и соматически мутированные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды иммуноглобулинов легкой и тяжелой цепей в ответ на антиген, не могут иметь идентичные последовательности с исходными молекулами нуклеиновой кислоты, а вместо этого будут практически идентичными или похожими (т.е. иметь по меньшей мере 80% идентичности).

[0089] «Человеческое» антитело (HuMAb) относится к антителу, имеющему вариабельные области, в которых как каркасная область, так и области CDR происходят из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, константную область также получают из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин «антитело человека», как он используется в данном документе, не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты в каркасные последовательности человека. Термины «человеческие» антитела и «полностью человеческие» антитела используются как синонимы.

[0090] «Гуманизированное» антитело относится к антителу, в котором некоторые, большая часть или все аминокислоты вне доменов CDR нечеловеческого антитела заменены соответствующими аминокислотами, полученными из человеческих иммуноглобулинов. В одном варианте гуманизированной формы антитела некоторые, большая часть или все аминокислоты вне доменов CDR были заменены аминокислотами из человеческих иммуноглобулинов, тогда как некоторые, большая часть или все аминокислоты в одной или более областях CDR не изменены. Небольшие добавления, делеции, вставки, замены или модификации аминокислот допустимы до тех пор, пока они не отменяют способность антитела связываться с конкретным антигеном. «Гуманизированное» антитело сохраняет антигенную специфичность, аналогичную исходному антителу.

[0091] «Химерное антитело» относится к антителу, в котором вариабельные области происходят от одного вида, а константные области происходят от другого вида, например, антитело, в котором вариабельные области происходят от антитела мыши, а константные области происходят от человеческого антитела.

[0092] Фразы «антитело, распознающее антиген» и «антитело, специфичное к антигену» используются в данном документе взаимозаменяемо с термином «антитело, которое специфически связывается с антигеном».

[0093] Используемый в данном документе термин «выделенное антитело» предназначен для обозначения антитела, которое по существу не содержит других белков и клеточного материала.

[0094] В контексте данного документа антитело, которое «ингибирует связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα», предназначено для обозначения антитела, которое ингибирует связывание ИЛ-7Ra с его лигандом, например, интерлейкином-7 (ИЛ-7), например, в анализах связывания с использованием Т-клеток из цельной крови, которые экспрессируют ИЛ-7Rα, с ЕС50 около 1 пг/мл или меньше, например, около 0,9 пг/мл или меньше, около 0,85 пг/мл или меньше, около 0,8 пг/мл или меньше, около 0,75 пг/мл или меньше, около 0,7 пг/мл или меньше, около 0,65 пг/мл или меньше, около 0,6 пг/мл или меньше, около 0,55 пг/мл или меньше, около 0,5 пг/мл или меньше, около 0,45 пг/мл или меньше, около 0,4 пг/мл или меньше, около 0,35 пг/мл или меньше, около 0,3 пг/мл или меньше, около 0,25 пг/мл или меньше, около 0,2 пг/мл или меньше, около 0,15 пг/мл или меньше, около 0,1 пг/мл или меньше, или около 0,05 пг/мл или меньше, в признанных в данной области методах, например, описанных в данном документе анализах связывания на основе проточной цитометрии.

[0095] Термин «эффекторная функция» относится к взаимодействию области Fc антитела с Fc-рецептором или лигандом или к биохимическому событию, которое возникает в результате этого. Примеры «эффекторных функций» включают связывание Clq, комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ), связывание Fc-рецептора, FcyR-опосредованные эффекторные функции, такие как АЗКЦ и антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (АЗКФ), и снижение количества рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR). Такие эффекторные функции, как правило, необходимы, чтобы область Fc была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела).

[0096] «Рецептор Fc» или «FcR» представляет собой рецептор, который связывается с областью Fc иммуноглобулина. FcR, которые связываются с антителом IgG, содержат рецепторы семейства FcγR, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Семейство FcyR состоит из трех активирующих рецепторов (FcyRI, FcyRIII и FcyRIV у мышей; FcyRIA, FcyRIIA и FcyRIIIA у людей) и одного ингибирующего (FcyRIIB) рецептора. Различные свойства человеческих FcyR известны в данной области техники. Большинство типов врожденных эффекторных клеток коэкспрессируют один или более активирующих FcyR и ингибирующих FcyRIIB, тогда как натуральные клетки-киллеры (NK) избирательно экспрессируют один активирующий Fc-рецептор (FcyRIII у мышей и FcyRIIIA у людей), но не ингибирующий FcyRIIB у мышей и людей. IgG1 человека связывается с большинством Fc-рецепторов человека и считается эквивалентным мышиному IgG2a в отношении типов активирующих Fc-рецепторов, с которыми он связывается.

[0097] Термины «область Fc» (кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина) или «домен Fc» или «Fc» относится к С-концевой области тяжелой цепи антитела, которая опосредует связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая связывание с Fc рецепторами, расположенными на различных клетках иммунной системы (например, эффекторных клетках) или с первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Таким образом, область Fc содержит константную область антитела, за исключением первой константной области иммуноглобулина (например, СН1 или CL). В изотипах антител IgG, IgA и IgD область Fc содержит два идентичных белковых фрагмента, полученных из второго (СН2) и третьего (СН3) константных доменов двух тяжелых цепей антитела; области Fc IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (домены СН - 2-4) в каждой полипептидной цепи. Для IgG область Fc содержит домены иммуноглобулина СН2 и СН3 и шарнир между доменами СН1 и СН2. Хотя определение границ области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина может варьироваться, как определено в данном документе, область Fc тяжелой цепи IgG человека определяется как участок от аминокислотного остатка D221 для IgG1, V222 для IgG2, L221 для IgG3 и Р224 для IgG4 до карбокси-конца тяжелой цепи, где нумерация соответствует индексу EU, как у Kabat. Домен СН2 области Fc IgG человека простирается от аминокислоты 237 до аминокислоты 340, и домен СНЗ расположен на С-концевой стороне домена СН2 в области Fc, т.е. он простирается от аминокислоты 341 до аминокислоты 447 или 446 (если С-концевой остаток лизина отсутствует) или 445 (если С-концевой остаток глицина и лизина отсутствуют) IgG. Используемая в данном документе фраза «область Fc» может быть Fc с нативной последовательностью, включая любой аллотипический вариант, или вариант Fc (например, не встречающийся в природе Fc). Fc также может относиться к этой области отдельно или в контексте полипептида, содержащего Fc, такого как «связывающий белок, содержащий область Fc», также называемый «Fc-слитый белок» (например, антитело или молекула иммуноадгезии).

[0098] «Область Fc с нативной последовательностью» или «Fc с нативной последовательностью» включает аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Области Fc человека с нативной последовательностью включают область Fc IgG1 человека с нативной последовательностью; область Fc IgG2 человека с нативной последовательностью; область Fc IgG3 человека с нативной последовательностью; и область Fc IgG4 человека с нативной последовательностью, а также их встречающиеся в природе варианты. Fc с нативной последовательностью включает различные аллотипы Fc (см., например, Jefferis et al. (2009) mAbs 1: 1).

[0099] Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на антигене (например, ИЛ-7Rα), с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело, например, как определено конкретным методом, используемым для его идентификации. Эпитопы могут быть образованы как из смежных аминокислот (как правило, линейный эпитоп), так и из несмежных аминокислот, наложенных друг на друга путем укладки в третичную структуру белка (как правило, конформационный эпитоп). Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, но не всегда, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные укладкой в третичную структуру, как правило, теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, какие эпитопы связаны с данным антителом (т.е. картирование эпитопов), хорошо известны в данной области техники и включают, например, анализы методом иммуноблоттинга и иммунопреципитации, в которых анализируют перекрывающиеся или смежные пептиды (например, из ИЛ-7Rα) в отношении реактивности с данным антителом (например, антителом к ИЛ-7R). Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методы в данной области техники и методы, описанные в данном документе, например, рентгеновскую кристаллографию, мутационный анализ антигена, 2-мерный ядерный магнитный резонанс и HDX-MS (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[0100] Термин «картирование эпитопа» относится к процессу идентификации молекулярных детерминант распознавания антитело-антиген.

[0101] Термин «связывается с одним и тем же эпитопом» применительно к двум или более антителам означает, что антитела связываются с одним и тем же сегментом аминокислотных остатков, как определено при помощи данного способа. Методы определения того, связываются ли антитела с «одним и тем же эпитопом на ИЛ-7Rα» с описанными в данном документе антителами, включают, например, методы картирования эпитопа, такие как рентгеноструктурный анализ кристаллов комплексов антиген:антитело, который обеспечивает атомарное разрешение эпитопа, и масс-спектрометрия водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS). Другие методы контролируют связывание антитела с фрагментами антигена или мутированные вариации антигена, где потеря связывания из-за модификации аминокислотного остатка в последовательности антигена часто считается признаком компонента эпитопа. Кроме того, также могут использоваться вычислительные комбинаторные методы для картирования эпитопов. Эти методы основаны на способности представляющего интерес антитела к аффинному выделению специфических коротких пептидов из фагового дисплея пептидных комбинаторных библиотек. Ожидается, что антитела, имеющие одинаковые последовательности VH и VL или одинаковые последовательности CDR1, 2 и 3, будут связываться с одним и тем же эпитопом.

[0102] Антитела, которые «конкурируют с другим антителом за связывание с молекулой-мишенью», относятся к антителам, которые ингибируют (частично или полностью) связывание другого антитела с молекулой-мишенью. Конкурируют ли два антитела друг с другом за связывание с молекулой-мишенью, то есть, ингибирует ли одно антитело связывание другого антитела с молекулой-мишенью и в какой степени, можно определить с помощью известных экспериментов по конкурентному связыванию, например, анализа методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE® (ППР). В определенных вариантах осуществления антитело конкурирует с другим антителом и ингибирует его связывание с мишенью по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. Уровень ингибирования или конкуренции может быть различным в зависимости от того, какое антитело является «блокирующим антителом» (т.е. холодовое антитело, которое сначала инкубируют с молекулой-мишенью). Конкурентные анализы можно проводить, как описано, например, в Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Два антитела «перекрестно конкурируют», если антитела блокируют друг друга в обоих направлениях по меньшей мере на 50%, то есть независимо от того, контактирует ли с антигеном одно или другое антитело первым в конкурентном эксперименте.

[0103] Анализы конкурентного связывания для определения того, конкурируют ли два антитела или взаимно конкурируют за связывание, включают: конкуренцию за связывание с Т-клетками, экспрессирующими ИЛ-7Rα, например, с помощью проточной цитометрии, такой как описано в Примерах. Другие способы включают: ППР (например, BIACORE™), твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); твердофазный прямой ИФА с биотином-авидином (см. Kirkland et al, J. Immunol. 137:3614 (1986)); твердофазный прямой анализ с мечением, твердофазный прямой сэндвич-анализ с мечением (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный прямой РИА с мечением с применением метки 1-125 (см. Morel et al, Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); твердофазный прямой ИФА с биотином-авидином (Cheung et al, Virology 176:546 (1990)); и прямой РИА с мечением. (Moldenhauer et al, Scand. J. Immunol. 52:77(1990)).

[0104] Используемые в данном документе термины «специфическое связывание», «селективное связывание», «избирательно связывается» и «специфически связывает» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Обычно антитело (i) связывается с константой равновесной диссоциации (Kd) составляющей приблизительно меньше чем 10^-7 М, например, приблизительно меньше чем 10^-8 Μ, 10^-9 Μ или 10^-10 Μ или даже меньше, если определяется, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на инструменте BIACORE™ 2000 с применением, например, заранее определенного антигена, рекомбинантного ИЛ-7Rα человека в качестве аналита и антитела в качестве лиганда, или с помощью анализа Скэтчарда для определения связывания антитела с антигенположительными клетками, и (ii) связывается с предопределенным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза выше ее аффинности, в отношении связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), отличным от предопределенного антигена или близкородственного антигена. Соответственно, антитело, которое «специфически связывается с ИЛ-7Rα человека», относится к антителу, которое связывается с растворимым или связанным с клеткой ИЛ-7Ra человека с Kd 10^-7 Μ или менее, например, около менее 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М, или даже ниже. Антитело, которое «перекрестно реагирует с ИЛ-7Rα яванского макака», относится к антителу, которое связывается с ИЛ-7Rα яванского макака с Kd 10^-7 Μ или меньше, например, приблизительно менее 10^-8 Μ, 10^-9 Μ или 10^-10 Μ и ниже. В определенных вариантах осуществления такие антитела, которые не реагируют перекрестно с ИЛ-7Rα от видов, отличных от человека, демонстрируют практически неопределяемое связывание с этими белками в стандартных анализах связывания.

[0105] Термин «kαssoc» или «kα» в контексте данного документа относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин «k_dis» или «kd» в контексте данного документа относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Используемый в данном документе термин «Kd» предназначен для обозначения константы диссоциации, которая получается из отношения kd к ka (т.е. kd/ka) и выражается в виде молярной концентрации (М). Значения Kd для антител можно определить с использованием методов, хорошо известных в данной области техники. Доступные методы определения Kd антитела включают поверхностный плазмонный резонанс, биосенсорную систему, такую как система BIACORE®, или проточную цитометрию и анализ Скэтчарда.

[0106] Используемый в данном документе термин «высокая аффинность» к антителу IgG относится к антителу, имеющему Kd 10^-8 Μ или менее, 10^-9 Μ или менее или 10^-10 Μ или менее для антигена-мишени. Однако связывание с «высокой аффинностью» может варьироваться для других изотипов антител. Например, «высокоаффинное» связывание изотипа IgM относится к антителу, имеющему Kd 10^-10 Μ или меньше, или 10^-8 Μ или меньше.

[0107] Термин « ЕС50» в контексте анализа in vitro или in vivo с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента относится к концентрации антитела или его антигенсвязывающей части, которая вызывает ответ, который составляет 50% от максимального ответа, т.е. посредине между максимальным ответом и исходным уровнем.

[0108] Термин «встречающийся в природе» применительно к объекту в данном документе относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), который может быть выделен из природного источника и который не был намеренно модифицирован человеком в лаборатории, является естественным.

[0109] «Полипептид» относится к цепи, содержащей по меньшей мере два последовательно связанных аминокислотных остатка без верхнего предела длины цепи. Один или более аминокислотных остатков в белке могут содержать модификацию, такую как, помимо прочего, гликозилирование, фосфорилирование или образование дисульфидной связи. «Белок» может включать один или более полипептидов.

[0110] В контексте данного документа термин «молекула нуклеиновой кислоты» предназначен для включения как молекул ДНК, так и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может быть кДНК.

[0111] «Консервативные аминокислотные замены» относятся к заменам аминокислотного остатка на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают в себя аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В определенных вариантах осуществления прогнозируемый заменимый аминокислотный остаток в антителе к ИЛ-7R заменен другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации консервативных замен последовательностей нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180- 1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Set. USA 94:412-417 (1997)).

[0112] В случае нуклеиновых кислот термин «существенная гомология» указывает, что две нуклеиновые кислоты или их указанные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными, с учетом соответствующих нуклеотидных вставок и делеций, в по меньшей мере около 80% нуклеотидов, по меньшей мере от около 90% до 95%, или по меньшей мере от около 98% до 99,5% нуклеотидов. В альтернативном варианте существенная гомология существует, когда сегменты гибридизируются в селективных условиях гибридизации, с комплементарной последовательностью цепи.

[0113] В случае полипептидов термин «существенная гомология» указывает, что два полипептида или их указанные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными, с учетом соответствующих аминокислотных вставок и делеций, в по меньшей мере около 80% аминокислот, по меньшей мере от около 90% до 95%, или по меньшей мере от около 98% до 99,5% аминокислот.

[0114] Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от числа совпадающих положений в последовательностях (т.е. % гомологии = число идентичных положений/общее число позиций х 100) с учетом числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с помощью математического алгоритма, например, как описано в неограничивающих примерах ниже.

[0115] Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с помощью программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступен на сайте worldweb.gcg.com), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и штрафа за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Идентичность в процентах между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также может быть определена с использованием алгоритма Е. Meyers и W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов замен остатков РАМ120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за гэп 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять, используя алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), который был включен в программ GAP из пакета программного обеспечения GCG (доступную на http://www.gcg.com), используя матрицу Blossum 62 или матрицу РАМ250 и штраф за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

[0116] Последовательности нуклеиновых кислот и белков, описанные в данном документе, дополнительно можно использовать в качестве «запрашиваемой последовательности» для проведения поиска по общедоступным базам данных, например, для определения родственных последовательностей. Такой поиск можно проводить, используя программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0) по Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Нуклеотидный поиск BLAST можно осуществлять с помощью программы NBLAST, показатель = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных с молекулами нуклеиновых кислот, описанных в данном документе. Белковый поиск BLAST можно осуществлять с помощью программы XBLAST, показатель = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных с белковыми молекулами, описанными в данном документе. Для получения выравнивания с внесенными в целях сравнения гэпами можно использовать BLAST с гэпами, как описано в Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и BLAST с гэпами можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov.

[0117] Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота «выделяется» или «становится практически чистой» при очистке от других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот (например, других частей хромосомы) или белков с помощью стандартных методов, включая обработку щелочью/SDS, разделение в CsCl, хроматографию на колонке, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области техники. См. L. Ausubel, et al, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[0118] Нуклеиновые кислоты, например, кДНК, можно мутировать в соответствии со стандартными методами для получения последовательностей генов. Для кодирующих последовательностей эти мутации могут по желанию влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, по существу гомологичные или полученные от нативных последовательностей V, D, J, константных последовательностей, переключателей и других подобных последовательностей, описанных в данном документе (где «полученные» означает, что последовательность идентична или модифицирована из другой последовательности).

[0119] Термин «вектор» в контексте данного документа предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один из типов вектора представляет собой «плазмиду», которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к независимой репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную природу репликации и эписомные векторы млекопитающего). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после внесения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы могут управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе «рекомбинантными векторами экспрессии» (или просто «векторами экспрессии»). В общем, векторы экспрессии, применимые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид. В данном описании «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако также включены другие формы векторов экспрессии, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

[0120] Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») в контексте данного описания предназначен для обозначения клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая в природе не присутствует в клетке, и может представлять собой клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной рассматриваемой клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях из-за мутаций или влияний окружающей среды, такое потомство может фактически не быть идентичным исходной клетке, но все же включено в объем термина «клетка-хозяин», который используется в данном документе.

[0121] Используемый в данном документе термин «иммунный ответ» понятен в данной области техники и обычно относится к биологическому ответу позвоночных организмов на чужеродные агенты или аномальные, например, раковые клетки, который защищает организм от этих агентов и заболеваний, вызываемых ими. Иммунный ответ опосредован действием одной или более клеток иммунной системы (например, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, натуральных клеток-киллеров (NK), макрофагов, эозинофилов, тучных клеток, дендритных клеток или нейтрофилов) и растворимых макромолекул, продуцируемых любой из этих клеток или печенью (включая антитела, цитокины и систему комплемента), что приводит к избирательному нацеливанию, связыванию, повреждению, разрушению и/или удалению из тела позвоночного вторгающихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых или других аномальных клеток или, в случае аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека. Иммунная реакция включает, например, активацию или ингибирование Т-клеток, например, эффекторных Т-клеток, Th-клеток, CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток или регуляторных Т-клеток, или активацию или ингибирование любых других клеток иммунной системы, например, NK-клеток.

[0122] Используемый в данном документе термин «аберрантный иммунный ответ» относится к неспособности иммунной системы субъекта отличить себя от чужого или к неспособности реагировать на чужеродные антигены. Термин также охватывает гипериммунные ответы на чужеродные антигены, как в случае аллергических расстройств. Таким образом, ответ присутствует как при аутоиммунных расстройствах, так и при аллергических расстройствах. Аберрантные иммунные ответы включают, помимо прочего, повреждение тканей и воспаление, вызванные выработкой антител к собственной ткани организма, нарушение выработки цитокинов и повреждение тканей, вызванное цитотоксическими или нецитотоксическими механизмами действия. В некоторых вариантах осуществления аберрантные иммунные ответы представляют собой неправильно регулируемые иммунные ответы, которые приводят к симптомам у пациента. Как правило, аутоиммунные ответы возникают, когда иммунная система субъекта распознает аутоантигены как чужеродные, что приводит к образованию аутореактивных эффекторных иммунных клеток. Аутореактивные эффекторные иммунные клетки включают клетки различных линий, включая, помимо прочего, цитотоксические Т-клетки, Т-хелперы и В-клетки. Хотя точные механизмы различаются, присутствие аутореактивных эффекторных иммунных клеток у пациента, страдающего аутоиммунным заболеванием, может привести к разрушению тканей и клеток пациента, что приводит к патологическим симптомам. Точно так же наличие клеток, которые подвергаются гиперчувствительной реакции на чужеродные антигены, на которую нормальные люди реагируют более сдержанно, свидетельствует о гиперчувствительности (аллергии). Примеры включают, помимо прочего, пищевую аллергию, сенную лихорадку и аллергическую астму. Многочисленные анализы для определения присутствия таких клеток у пациента и, следовательно, наличия аутоиммунного расстройства, такого как антиген-специфическое аутоиммунное расстройство у пациента или аллергическое расстройство, известны специалистам в данной области техники и могут быть легко использованы в рассматриваемых способах.

[0123] Используемый в данном документе термин «аутоиммунное заболевание» относится к заболеванию или нарушению, при котором иммунная система вырабатывает иммунный ответ (например, В-клеточный или Т-клеточный ответ) против антигена, который является частью нормального хозяина, (т.е. аутоантигена) с последующим повреждением тканей. Аутоантиген может происходить из клетки-хозяина или может происходить из комменсального организма, например, микроорганизмов (известных как комменсальные организмы), которые, как правило, колонизируют слизистые оболочки.

[0124] Примеры аутоиммунных заболеваний, поражающих млекопитающих, включают ревматоидный артрит, ювенильный олигоартрит, коллаген-индуцированный артрит, адъювант-индуцированный артрит, синдром Шегрена, рассеянный склероз, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит), аутоиммунную атрофию желудка, обыкновенную пузырчатку, псориаз, витилиго, диабет 1 типа, диабет без ожирения, миастению, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, склерозирующий холангит, склерозирующий сиаладенит, системную красную волчанку, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, системный склероз, полимиозит, дерматомиозит, аутоиммунную гемолитическую анемию, пернициозную анемию и тому подобное.

[0125] Используемый в данном документе термин «воспалительное заболевание кишечника» (ВЗК) относится к гетерогенной группе хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта. В некоторых вариантах осуществления ВЗК включает болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК).

[0126] Используемый в данном документе термин «иммунодепрессивный агент» относится к молекуле, например, химическому соединению, небольшой молекуле, стероиду, молекуле нуклеиновой кислоты или другому биологическому агенту, который может снижать иммунный ответ, такой как воспалительная реакция. Иммунодепрессивные агенты включают, но не ограничиваются ими, агент, применяемый при лечении артрита (противоартритный агент). Конкретными неограничивающими примерами иммунодепрессивных агентов являются нестероидные противовоспалительные агенты, циклоспорин A, FK506 и анти-CD4. В дополнительных примерах агент представляет собой модификатор биологического ответа, такой как KINERET® (анакинра), ENBREL® (этанерцепт) или REMICADE® (инфликсимаб), модифицирующий заболевание противоревматический препарат (DMARD), такой как ARAVA® (лефлуномид), нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), в частности ингибитор циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), такой как CELEBREX® (целекоксиб) и VIOXX® (рофекоксиб), или другой продукт, такой как HYALGAN® (гиалуронан) и SYNVISC® (хилан G-F20). Рапамицин представляет собой дополнительный пример иммунодепрессивного агента.

[0127] Термин «воспаление» или «воспалительный процесс» в контексте данного документа относится к сложной серии явлений, включая расширение артериол, капилляров и венул с повышенной проницаемостью и кровотоком, экссудацию жидкостей, включая белки плазмы и миграцию лейкоцитов, в воспалительный очаг.Воспаление можно измерить многими способами, хорошо известными в данной области техники, такими как количество лейкоцитов, количество полиморфно-ядерных нейтрофилов (PMN), измерение степени активации PMN, такой как усиленный люминолом хемилюминесценции, или измерение количества присутствующих провоспалительных цитокинов (например, ИЛ-6 или ФНО-α).

[0128] «Иммуномодулятор» или «иммунорегулятор» относится к агенту, например, агенту, нацеленному на компонент сигнального пути, который может участвовать в модулировании, регулировании или модификации иммунного ответа. «Модуляция», «регулирование» или «модификация» иммунного ответа относится к любому изменению в клетке иммунной системы или в активности такой клетки (например, эффекторной Т-клетки, такой как Th1-клетка). Такая модуляция включает стимуляцию или подавление иммунной системы, что может проявляться увеличением или уменьшением количества различных типов клеток, увеличением или уменьшением активности этих клеток или любыми другими изменениями, которые могут происходить в иммунной системе. Были идентифицированы как ингибирующие, так и стимулирующие иммуномодуляторы, некоторые из которых могут иметь усиленную функцию в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулятор нацелен на молекулу на поверхности Т-клетки. «Иммуномодулирующая мишень» или «иммунорегуляторная мишень» представляет собой молекулу, например, молекулу клеточной поверхности, которая нацелена на связывание и активность которой изменяется в результате связывания вещества, агента, фрагмента, соединения или молекулы. Иммуномодулирующие мишени включают, например, рецепторы на поверхности клетки («иммуномодулирующие рецепторы») и лиганды рецепторов («иммуномодулирующие лиганды»).

[0129] «Иммунотерапия» относится к лечению субъекта, страдающего или подверженного риску заражения или страдающего рецидивом заболевания, с помощью способа, включающего индукцию, усиление, подавление или иное изменение иммунной системы или иммунного ответа.

[0130] Используемый в данном документе термин «патогенные Т-клетки» относится к Т-клеткам (например, CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеткам), которые вызывают основные симптомы и/или повреждения, связанные с заболеванием или нарушением, например, воспалительным заболеванием, например, воспалительным заболевание кишечника. В некоторых вариантах осуществления термин является взаимозаменяемым с «эффекторными Т-клетками» (ТЭф), который относится к Т-клеткам (например, CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеткам) с цитолитической активностью, а также к Т-хелперам (Th), например, клеткам Th1 которые могут секретировать воспалительные цитокины (например, ФНО-α, ИФН-γ или ИЛ-17), а также активировать и направлять другие иммунные клетки (например, моноциты) на производство провоспалительных медиаторов и, таким образом, вызывать основные симптомы и/или повреждение, связанные с заболеванием или расстройством. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой клетки Th 17, которые относятся к CD4⁺ Т-клеткам, которые продуцируют провоспалительный цитокин ИЛ-17. В некоторых вариантах осуществления эффекторные Т-клетки представляют собой цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), которые относятся к CD8⁺ Т-клеткам, которые обладают способностью уничтожать другие клетки (например, посредством высвобождения перфорина или гранзима В).

[0131] Используемый в данном документе термин «регуляторные Т-клетки» (Трег) относится к популяции Т-клеток, способных снижать или подавлять индукцию и пролиферацию эффекторных Т-клеток и, таким образом, модулировать иммунный ответ.В некоторых вариантах осуществления Трег могут подавлять иммунный ответ путем секреции противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-10, TGF-J3 и ИЛ-35, которые могут препятствовать активации и дифференцировке наивных Т-клеток в эффекторные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления Трег могут также продуцировать цитолитические молекулы, такие как гранзим В, которые могут индуцировать апоптоз эффекторных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления регуляторные Т-клетки представляют собой природные регуляторные Т-клетки (пТрег) (т.е. развившиеся в тимусе). В некоторых вариантах осуществления регуляторные Т-клетки представляют собой индуцированные регуляторные Т-клетки (иТрег) (то есть наивные Т-клетки, которые дифференцируются в Трег в периферической ткани при воздействии определенных стимулов). Способы идентификации Трег известны в данной области техники. Например, Трег экспрессируют определенные фенотипические маркеры (например, CD25, Foxp3 или CD39), которые можно измерить с помощью проточной цитометрии. См., например, международную публикацию № WO 2017/062035 A1; Gu J., et al., Cell Mol Immunol 14(6): 521-528 (2017). В некоторых вариантах осуществления Трег представляют собой CD45RA^- CD39⁺ Т-клетки.

[0132] Используемый в данном документе термин «связанная» относится к ассоциации двух или более молекул. Связь может быть ковалентной или нековалентной. Связь также может быть генетической (т.е. рекомбинантно слитой). Такие связи могут быть достигнуты с использованием широкого спектра методов, известных в данной области техники, таких как химическая конъюгация и получение рекомбинантного белка.

[0133] Используемый в данном документе термин «введение» относится к физическому введению композиции, содержащей терапевтический агент, субъекту с использованием любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в данной области техники. Различные пути введения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R включают внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. В контексте данного документа выражение «парентеральное введение» означает режимы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрилимфатическую, внутриочаговую, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, интрадермальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интрас пинал ьную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию, а также электропорацию in vivo. Альтернативно, описанное в данном документе антитело можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или мукозальный путь введения, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно. Введение также может быть выполнено, например, один раз, много раз и/или в течение одного или нескольких продолжительных периодов.

[0134] Используемые в данном документе термины «ингибирует» или «блокирует» (например, относящиеся к ингибированию/блокированию связывания ИЛ-7 с ИЛ-71Rα на клетках) используются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R ингибирует связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα на по меньшей мере около 50%, например, на около 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, или 100%, определяемого, например, как дополнительно описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R ингибирует связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα не более чем на 50%, например, на около 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или 1%, определяемого, например, как дополнительно описано в данном документе.

[0135] Термины «лечить», «процесс лечения» и «лечение» в контексте данного документа относятся к любому типу вмешательства или процессу, выполняемому у субъекта, или введению активного агента субъекту с целью обращения, улучшения, облегчения, ингибирования или замедления или предотвращения прогрессирования, развития, тяжести или рецидива симптома, осложнения, патологического состояния или биохимических показателей, ассоциированных с заболеванием, или повышения общей выживаемости. Лечение может относиться к субъекту, страдающему заболеванием, или субъекту, у которого нет заболевания (например, в целях профилактики).

[0136] Термин «эффективная доза» или «эффективная дозировка» определяется как количество, достаточное для достижения или по меньшей мере частичного достижения желаемого эффекта. «Терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная дозировка» лекарственного препарата или терапевтического агента представляет собой любое количество лекарственного препарата, которое при использовании отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом способствует регрессии заболевания, о чем свидетельствует уменьшение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания или предотвращению нарушений или инвалидности из-за болезни. Терапевтически эффективное количество или дозировка лекарственного препарата включает «профилактически эффективное количество» или «профилактически эффективную дозировку», которая представляет собой любое количество лекарственного препарата, которое при введении отдельно или в комбинации с другим терапевтическим агентом субъекту с риском развития заболевание или рецидива заболевания ингибирует развитие или рецидив заболевания. Способность терапевтического агента способствовать регрессии заболевания или ингибировать развитие или рецидив заболевания может быть оценена с использованием множества способов, известных квалифицированному практикующему врачу, например, у людей во время клинических испытаний, в системах животных моделей, предсказывающих эффективность применения у людей или путем анализа активности агента в анализах in vitro.

[0137] Термин «пациент», включает людей и других субъектов-млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

[0138] В контексте данного документа термин «субъект» включает любого человека или отличное от человека животное. Например, способы и композиции, описанные в данном документе, можно использовать для лечения субъекта, страдающего раком. Термин «отличное от человека животное» включает всех позвоночных, например, млекопитающих и отличных от млекопитающих позвоночных, таких как отличные от человека приматы, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.

[0139] Термин «доза на основе массы» или дозировка, как упоминается в данном документе, означает, что доза, вводимая пациенту, рассчитывается на основе массы пациента. Например, когда пациенту с массой тела 60 кг требуется 3 мг/кг антитела к ИЛ-7R, можно рассчитать и использовать соответствующее количество антитела к ИЛ-7R (т.е. 180 мг) для введения.

[0140] Использование термина «фиксированная доза» применительно к способу изобретения означает, что два или более разных антитела в одной композиции (например, антитело к ИЛ-7R и второе антитело, например, антитело к РФНО) присутствуют в композиции в определенных (фиксированных) соотношениях друг с другом. В некоторых вариантах осуществления фиксированная доза основана на массе (например, мг) антител. В определенных вариантах осуществления фиксированная доза основана на концентрации (например, мг/мл) антител. В некоторых вариантах осуществления соотношение двух антител (например, анти-ИЛ-7R и анти-РФНО) составляет по меньшей мере около 1:1, около 1:2, около 1:3, около 1:4, около 1:5, около 1:6, около 1:7, около 1:8, около 1:9, около 1:10, около 1:15, около 1:20, около 1:30, около 1:40, около 1:50, около 1:60, около 1:70, около 1:80, около 1:90, около 1:100, около 1:120, около 1:140, около 1:160, около 1:180, около 1:200, около 200:1, около 180:1, около 160:1, около 140:1, около 120:1, около 100:1, около 90:1, около 80:1, около 70:1, около 60:1, около 50:1, около 40:1, около 30:1, около 20:1, около 15:1, около 10:1, около 9:1, около 8:1, около 7:1, около 6:1, около 5:1, около 4:1, около 3:1 или около 2:1 мг первого антитела (например, антитела к ИЛ-7R) к мг второго антитела. Например, соотношение 2:1 антитела к ИЛ-7R и антитела к рецептору ФНО, такого как атросаб, может означать, что флакон или инъекция может содержать около 480 мг антитела к ИЛ-7R и 240 мг антитела к РФНО или около 2 мг/мл антитела к ИЛ-7R и 1 мг/мл антитела к РФНО.

[0141] Использование термина «постоянная доза» в отношении способов и дозировок, описанных в данном документе, означает дозу, которая вводится пациенту без учета массы или площади поверхности тела (BSA) пациента. Таким образом, постоянная доза преложена не в виде дозы в мг/кг, а в виде абсолютного количества агента (например, антитела к ИЛ-7R). Например, человек массой 60 кг и человек массой 100 кг получат одинаковую дозу антитела (например, 480 мг антитела к ИЛ-7R).

[0142] В контексте данного документа термины «μг» и «μМ» используются взаимозаменяемо с «мкг» и «мкМ», соответственно.

[0143] Различные аспекты, описанные в данном документе, более подробно описаны в следующих подразделах.

I. Антитела к ИЛ-7R человека

[0144] В данном документе описаны антитела, например, полностью человеческие антитела, которые характеризуются конкретными функциональными особенностями или свойствами. Например, антитела специфически связываются с ИЛ-7Rα человека и, более конкретно, с конкретным доменом (например, функциональным доменом) внутри внеклеточного домена ИЛ-7Rα человека. В некоторых вариантах осуществления антитела специфически связываются с сайтом на ИЛ-7Rα, с которым связывается ИЛ-7. В определенных вариантах осуществления антитела являются антагонистическими антителами, т.е. они ингибируют или подавляют опосредованное ИЛ-7 экспансию и/или выживаемость патогенных Т-клеток (например, эффекторных CD8⁺ Т-лимфоцитов). В определенных вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, перекрестно реагируют с ИЛ-7Rα одного или более отличных от человека приматов, таких как ИЛ-7Rα яванского макака. В некоторых вариантах осуществления антитела специфически связываются с внеклеточной областью ИЛ-7Rα человека и внеклеточной областью ИЛ-7Rα яванского макака. В определенных вариантах осуществления антитела связываются с ИЛ-7Rα человека с высокой аффинностью.

[0145] Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R обладают одним или более из следующих функциональных свойств:

(a) способны связываться с растворимым и/или связанным с мембраной ИЛ-7Rα человека;

(b) способны связываться с растворимым и/или связанным с мембраной ИЛ-7Rα яванского макака;

(c) способны связываться с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на Т-клетках (CD4⁺ CD45RA⁺, CD4⁺ CD45RA^-, CD8⁺ CD45RA⁺, и/или CD8⁺ CD45RA^-) в цельной крови, например, цельной крови человека;

(d) не способны связываться с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на клетках, отличных от Т-клеток, (например, моноцитах) в цельной крови, например, цельной крови человека;

(e) не способны эффективно блокировать активацию моноцитов, опосредованную стромальным лимфопоэтином тимуса (ТСЛП);

(f) не способны агонизировать сигналинг рецептора ИЛ-7 при связывании с ИЛ-7Rα, например, минимальную активацию pSTATS;

(g) способны восстанавливать функцию регуляторных Т-клеток (Трег) и/или способствовать выживаемости Трег;

(h) способны блокировать экспансию клеток, продуцирующих ИЛ-17 и/или ИФН-гамма;

(i) способны поддерживать ремиссию без лекарственных средств дольше, чем, например, CTLA4-Ig (ORENCIA®);

(j) способны блокировать воспаление и повреждение слизистой оболочки (например, индуцированное патогенными Т-клетками) в ткани кишечника;

(k) способны снижать частоту эффекторных Т-клеток, например, в мезентериальных лимфатических узлах (МЛУ) и/или собственной пластинке (СП);

(l) способны лечить субъекта с воспалительным заболеванием, например, воспалительным заболеванием кишечника;

(m) способны связываться с ИЛ-7Rα человека по эпитопу, выбранному из группы, состоящей из: ²⁴SQLEVNGSQHSLTCAF³⁹ (SEQ ID NO: 8), ⁷³FIETKKFLLIGKSNIC⁸⁸ (SEQ ID NO: 9), ⁸⁹VKVGEKSLTCKKIDLTT¹⁰⁵ (SEQ ID NO: 10), ¹³⁶QKKYVKVLMHDVAY¹⁴⁹ (SEQ ID NO: 11), ¹⁸¹YEIKVRSIPDHYFKGF¹⁹⁶ (SEQ ID NO: 12) и их комбинации, например, как определено при помощи масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS); и/или

(n) способны связываться с ИЛ-7Rα человека по одному или более аминокислотным остаткам, выбранным из группы, состоящей из Н33, Е75, F79, 182, K84, M144, R186, Н191, Y192 и их комбинаций, например, как определено с помощью подходов футпринтинга белков на основе масс-спектрометрии, такие как фотохимическое окисление белков (FPOP) и мечение этиловым эфиром глицина (GEE).

[0146] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, связываются с ИЛ-7Rα человека с высокой аффинностью, например, с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М или меньше, 10^-10 М или меньше, 10^-11 М или меньше, 10^-12 М или меньше, от 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-7 М, от 10^-10 М до 10^-7 М или от 10^-9 М до 10^-7 М. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с растворимым ИЛ-7Rα человека, например, как определено с помощью BIACORE™, с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М (1 нМ) или меньше, 10^-10 М или меньше, от 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-7 М, от 10^-10 М до 10^-7 М, от 10^-9 М до 10^-7 М или от 10^-8 М до 10^-7 М. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с ИЛ-7Rα человека (например, связывается с клеточной мембраной), например, на Т-клетках человека, но не на человеческих клетках, отличных от Т-клеток, например, как определено с помощью проточной цитометрии и анализа Скэтчарда. с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М (1 нМ) или меньше, 5×10^-10 М или меньше, 10^-10 М или меньше, от 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-8 М, от 10^-10 М до 10^-8 М, от 10^-9 М до 10^-8 М, от 10^-11 до до 10^-9 М, или от 10^-10 М до 10^-9 М. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, связывается с ИЛ-7Rα человека (например, связывается с клеточной мембраной), например, на Т-клетках человека, но не на человеческих клетках, отличных от Т-клеток, например, как определено с помощью проточной цитометрии, с ЕС₅₀ 10 мкг/мл или менее, 5 мкг/мл или менее, 1 мкг/мл или менее, 0,9 мкг/мл или менее, 0,8 мкг/мл или менее, 0,7 мкг/мл или менее, 0,6 мкг/мл или менее, 0,5 мкг/мл или менее, 0,4 мкг/мл или менее, 0,3 мкг/мл или менее, 0,2 мкг/мл или менее, 0,1 мкг/мл или менее, 0,05 мкг/мл или менее или 0,01 мкг/мл или менее. В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, связываются с ИЛ-7Rα яванского макака, например, с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М или меньше, 10^-10 М или меньше, 10^-11 М или меньше, 10^-12 М или меньше, 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-7 М, 10^-10 М до 10^-7 М или 10^-9 М до 10^-7 М. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с растворимым ИЛ-7Rα яванского макака, например, как определено с помощью BIACORE™, с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М (1 нМ) или меньше, 10^-10 М или меньше, 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-7 М, 10^-10 М до 10^-7 М, 10^-9 М до 10^-7 М, или от 10^-8 М до 10^-7 М. Антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению могут связываться со связанным (например, связанным с мембраной) ИЛ-7Rα яванского макака, например, на Т-клетках яванского макака, но не на клетках, отличных от Т-клеток, яванского макака, например, с ЕС₅₀ 100 нМ или менее, 10 нМ или меньше, от 100 нМ до 0,01 нМ, от 100 нМ до 0,1 нМ, от 100 нМ до 1 нМ или от 10 нМ до 1 нМ, например, по данным измерения методом проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается со связанным (например, связанным с клеточной мембраной) ИЛ-7Rα яванского макака, например, на Т-клетках яванского макака, но не на клетках, отличных от Т-клеток, яванского макака, например, как определено с помощью проточной цитометрии и анализа Скэтчарда, с Kd 10^-7 М или меньше, 10^-8 М или меньше, 10^-9 М (1 нМ) или меньше, 5×10^-10 или меньше, 10^-10 М или меньше, от 10^-12 М до 10^-7 М, от 10^-11 М до 10^-8 М, от 10^-10 М до 10^-8 М, от 10^-9 М до 10^-8 М, от 10^-11 М до 10^-9 М или от 10^-10 М до 10^-9 М.

[0147] Стандартные анализы для оценки связывающей способности антител к ИЛ-7Rα различных видов известны в данной области техники, включая, например, ИФА, вестерн-блоттинг и РИА. Подходящие анализы также описаны в примерах. Кинетику связывания (например, аффинность связывания) антител также можно оценить стандартными анализами, известными в данной области техники, такими как анализ Biacore. Анализы для оценки эффектов антител на функциональные свойства иммунных клеток (например, связывание лиганда, фосфорилирование / активация STAT5, продукция цитокинов) более подробно описаны ниже и в примерах.

[0148] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R являются селективными в отношении ИЛ-7Rα, экспрессируемого на Т-клетках (например, CD4⁺ CD45RA⁺, CD4⁺ CD45RA, CD8⁺ CD45RA⁺, CD8⁺ CD45RA), но не на клетках, отличных от Т-клеток, (например, моноцитах). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R могут эффективно блокировать связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα на Т-клетках, но не могут блокировать связывание TSLP с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на клетках, отличных от Т-клеток (например, моноцитах). В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R могут ингибировать или снижать опосредованное ИЛ-7 фосфорилирование STAT5 («активация pSTAT5») в Т-клетках. В некоторых вариантах осуществления активация pSTATS ингибируется или снижается на по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с эталоном (например, соответствующими Т-клетками, которые не обрабатываются описанными в данном документе антителами к ИЛ-7R). В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, не снижают или не предотвращают опосредованную TSLP активацию моноцитов.

[0149] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R способны модулировать (например, увеличивать) соотношение регуляторных Т-клеток к эффекторным Т-клеткам у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R модулируют соотношение, восстанавливая функцию и/или способствуя выживаемости Трег (например, CD45RACD39⁺ Т-клеток) у субъекта. В определенных вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению увеличивают функцию Трег (например, способность подавлять пролиферацию Т-клеток и/или продукцию ИЛ-10) на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или на по меньшей мере 100% по сравнению с эталоном (например, соответствующих Трег у субъекта, который не получал антитело к ИЛ-7R). В некоторых вариантах осуществления частота Трег у субъекта увеличивается на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100% по сравнению с эталоном (например, соответствующими Трег у субъекта, который не получал антитело к ИЛ-7R).

[0150] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, модулируют соотношение регуляторных Т-клеток к эффекторным Т-клеткам путем блокирования экспансии эффекторных Т-клеток (например, Т-клеток, продуцирующих ИЛ-17 и/или ИФН-γ) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления частота эффекторных Т-клеток у субъекта снижается на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или на по меньшей мере 100% по сравнению с эталоном (например, соответствующими Трег у субъекта, который не получал антитело к ИЛ-7R). В определенных вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению модулируют соотношение как путем восстановления функции, так и/или способствуя выживаемости Трег, и блокируя экспансию эффекторных Т-клеток у субъекта.

[0151] В некоторых вариантах осуществления соотношение регуляторных Т-клеток к эффекторным Т-клеткам увеличивается на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или на по меньшей мере 100% по сравнению с эталоном (например, соответствующее соотношение у субъекта, который не получал антитело к ИЛ-7R).

[0152] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, связываются с эпитопом, например, конформационным эпитопом, во внеклеточной части Hn-7Rα человека, например, в Ig-подобном домене внеклеточной области, то есть с аминокислотами 21 239 из SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с эпитопом или с эпитопом внутри области, состоящей из аминокислотных остатков с 44 по 59 SEQ ID NO: 1 (т.е. остатки с 24 по 39 SEQ ID NO: 6 (SQLEVNGSQHSLTCAF, «Эпитоп 1»; SEQ ID NO: 8). В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с эпитопом или с эпитопом внутри области, состоящей из аминокислотных остатков 93 108 SEQ ID NO: 1 (т.е. остатки с 73 по 88 SEQ ID NO: 6) (FIETKKFLLIGKSNIC, «Эпитоп 2»; SEQ ID NO: 9). В других вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с эпитопом или с эпитопом внутри области, состоящей из аминокислотных остатков 109-125 SEQ ID NO: 1 (т.е. остатки с 89 по 105 SEQ ID NO: 6) (VKVGEKSLTCKKIDLTT, «Эпитоп 3»; SEQ ID NO: 10). В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с эпитопом или с эпитопом внутри области, состоящей из аминокислотных остатков 156-169 SEQ ID NO: 1 (т.е. остатки с 136 по 149 SEQ ID NO: 6) (QKKYVKVLMHDVAY, «Эпитоп 4»; SEQ ID NO: 11). В других вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R связывается с эпитопом или с эпитопом внутри области, состоящей из аминокислотных остатков 201-216 SEQ ID NO: 1 (т.е. остатки с 181 по 196 SEQ ID NO: 6) (YEIKVRSIPDHYFKGF, «Эпитоп 5»; SEQ ID NO: 12).

[0153] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению связывается с эпитопом (или областью ИЛ-7Rα человека), содержащим один или более аминокислотных остатков Н53, Е95, F99, 1102, K104, М164, R206, Н211 и Y212 из SEQ ID NO: 1 (т.е. Н33, Е75, F79, 182, К84, М144, R186, Н191, и Y192 of SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, не связывается в значительной степени или только со значительно сниженной аффинностью связывания с ИЛ-7Rα человека, в котором один или более аминокислотных остатков Н53, Е95, F99, 1102, K104, М164, R206, Н211 и Y212 из SEQ ID NO: 1 заменены на другую аминокислоту, например, при неконсервативной аминокислотной замене.

[0154] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, не являются нативными антителами или не являются встречающимися в природе антителами. Например, в определенных вариантах осуществления, антитела к ИЛ-7R имеют посттрансляционные модификации, которые отличаются от модификаций антител, встречающихся в природе например, за счет большего, меньшего количества или другого типа посттрансляционной модификации.

[0155] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R не обладают агонистической активностью, как определено, например, путем измерения активации pSTAT после культивирования Т-клеток с антителом к HR-7R, в котором такие антитела не усиливают активность, превышающую только антитело к HR-7R. В определенных вариантах осуществления антитела к Hn-7R блокируют взаимодействие ИЛ-7Rα с ИЛ-7, не способствуя агонистической активности.

[0156] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению не способны блокировать активацию моноцитов, опосредованную стромальным лимфопоэтином тимуса (ТСЛП).

[0157] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7Я способны поддерживать ремиссию без лекарственных средств дольше, чем, например, CTLA4-Ig (ORENCIA®).

[0158] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R способны блокировать воспаление и повреждение слизистой оболочки (например, индуцированное патогенными Т-клетками) в ткани кишечника. В некоторых вариантах осуществления антитела к способны снижать частоту эффекторных Т-клеток, например, в мезентериальных лимфатических узлах (МЛУ) и/или собственной пластинке (СП). В некоторых вариантах осуществления антитела к IM-7R способны лечить субъекта с воспалительным заболеванием, например воспалительным заболеванием кишечника.

[0159] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ. ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14. В определенных вариантах осуществления CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16. В других вариантах осуществления CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18.

[0160] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи включают последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, указанные как SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно, где CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи включают последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, указанные как SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно, и где антитело к ИЛ-7R имеет одно или несколько свойств, описанных в данном документе.

[0161] В некоторых аспектах антитело к HR-7R по настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где CDR3 тяжелой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две, три или четыре замены, например, такие, которые показаны на Фиг. 18 В как имеющие коэффициент обогащения >1,00) относительно SEQ ID NO: 15. В некоторых аспектах CDRT тяжелой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две или три замены, например, такие, которые показаны на Фиг. 18Е как имеющие коэффициент обогащения>1,00) относительно SEQ ID NO: 13. В определенных аспектах CDR2 тяжелой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять замен, например, такие, которые показаны на Фиг. 18F как имеющие коэффициент обогащения>1,00) относительно SEQ ID NO: 14. В дополнительных аспектах CDR1 легкой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять замен, например, такие, которые показаны на Фиг. 18С как имеющие коэффициент обогащения >1,00) относительно SEQ ID NO: 16. В некоторых аспектах CDR2 легкой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть замен, например, таких как те, что показаны на Фиг. 18D как имеющие коэффициент обогащения >1,00) относительно SEQ ID NO: 17. В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи содержит одну или более аминокислотных модификаций (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть или семь замен, например, таких как те, что показаны на фиг. 18А как имеющие коэффициент обогащения >1,00) относительно SEQ ID NO: 18.

[0162] В некоторых аспектах CDR1 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, включает аминокислотную последовательность GX₁X₂FDDHAX₃H (SEQ ID NO: 260), где X₁ представляет собой F или Y; Х₂ представляет собой Т, Р, A, S, V, L, I, М, Н, F, Y, N, D, Е, или Q; и Х₃ представляет собой L или М. В определенных аспектах Х₂ представляет собой D или Е. В дополнительных аспектах Х₂ представляет собой D. В других аспектах Х₂ представляет собой Е. Неограничивающие примеры последовательностей CDR1 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, представлены в таблице 13.

[0163] В некоторых аспектах CDR2 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, включает аминокислотную последовательность

GIX₁WX₂SRGX₃GYX₄X₅X₆X₇X₈X₉ (SEQ ID NO: 261), где X₁ представляет собой S или Т; Х₂ представляет собой Н или N; Х₃ представляет собой I или V; Х₄ представляет собой G, A, S, Т, V, L, I, R, Н, или N; Х₅ представляет собой Р, Т, N, D, Е, Q, S, Н, или Y; Х₆ представляет собой Р, G, A, S, Т, V, R, Н, F. Y, N, D, или Е; Х₇ представляет собой V или I; Х₈ представляет собой A, S, Т, V, L, I, М, K, R, Н, F, Y, N, D, Е, или Q; и Х₉ представляет собой G, Н, D, или Q. В определенных аспектах X₁ представляет собой Т. Неограничивающие примеры последовательностей CDR2 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, раскрытого в данном документе, представлены в таблице 14.

[0164] В некоторых аспектах CDR3 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, включает аминокислотную последовательность DEYX₁X₂GYYX₃LDX₄ (SEQ ID NO: 262), где X₁ представляет собой S, Т, N, D, или Е; Х₂ представляет собой L, М, R, или S; Х₃ представляет собой G, A, S, Т, V, М, N, Е, представляет собой Q; и Х₄ представляет собой A, S, Т, V, R, Н, Y, W, N, Е, Q, или М. В определенных аспектах Х₃ представляет собой A, S, или Т. В некоторых аспектах Х₃ представляет собой А. В других аспектах Х₃ представляет собой S. В дополнительных аспектах Х₃ представляет собой Т. В некоторых аспектах Х₄ представляет собой Е. Неограничивающие примеры последовательностей CDR3 тяжелой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, представлены в таблице 15.

[0165] В некоторых аспектах CDR1 легкой цепи антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇SX₈X₉A (SEQ ID NO: 263), где X₁ представляет собой S, Т, V, K, R, Н, Y, или I; Х₂ представляет собой A, S, Т, или V; Х₃ представляет собой Р, G, A, S, Т, V, L, I, М, K, R, Н, N, Е, или Q; Х₄ представляет собой Р, G, A, S, Т, V, L, I, V, Н, F, Y, N, D, Е или Q; Х₅ представляет собой Р, G, A, S, Т, Н, Е, Q, М, N или D; Х₆ представляет собой Р, G, A, S, Т, V, L, I, N; Х₇ представляет собой S, Т, V, L, I, М, Н, F, Y, N, D, Е, Q; Х₈ представляет собой Р или Q; и Х₈ представляет собой L или V. В некоторых аспектах Х₆ представляет собой Р. В некоторых аспектах X₈ представляет собой Р. В дополнительных аспектах Х₇ представляет собой D или Е. В некоторых аспектах Х₇ представляет собой Е. Неограничивающие примеры последовательностей CDR1 легкой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, представлены в таблице 16.

[0166] В некоторых аспектах CDR2 легкой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, включает аминокислотную последовательность DX₁X₂X₃X₄X₅X₆ (SEQ ID NO: 264), где X₁ представляет собой G, A, S, М, Н, N, D, Е или Q; Хг представляет собой G, А, S, Т, V, М, Н, F, Y, N, D, Е, I, R, Q; Х₃ представляет собой S, F, Y, W, N, D, Е, или L, Х₄ представляет собой Р, S, Т, L, K, Н, или N; Х₅ представляет собой D, Е, или Q; и Х₆ представляет собой G, S, Т, N, D, Q, Р, или Е. Неограничивающие примеры последовательностей CDR2 легкой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, представлены в таблице 17.

[0167] В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, включает аминокислотную последовательность X₁X₂FX₃X₄YPLX₅X₆X₇ (SEQ ID NO: 265), где X₁ представляет собой М или Q; Х₂ представляет собой G, A, D, Е, или Q; Х₃ представляет собой N или Е; Х₄ представляет собой Р, А, или S; Х₅ представляет собой Т, I, М, K, W, N, Е, или Q; Х₆ представляет собой L или I;

и Х₇ представляет собой Т, М, K, Н, Y, Е или Q. В некоторых аспектах Х₂ представляет собой А. В некоторых аспектах Х₄ представляет собой Р или А. В некоторых аспектах Х₄ представляет собой Р. В некоторых аспектах Х₄ представляет собой А.Неограничивающие примеры последовательностей CDR3 легкой цепи антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, представлены в таблице 18.

[0168] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где

(i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ IDNO: 31-46;

(ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14;

(iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15;

(iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16;

(v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17; и

(vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18.

[0169] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQIDNO: 13;

(ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47-96;

(iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQIDNO: 15;

(iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQIDNO: 16;

(v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQIDNO: 17; и

(vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQIDNO: 18.

[0170] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13;

(iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 97-122;

[0171] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 123-194;

[0172] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 195-237; и

[0173] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 238-259.

[0174] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где

(i) CDR1 тяжелой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 13 и 31 46;

(ii) CDR2 тяжелой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 14 и 47-96;

(iii) CDR3 тяжелой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 15 и 97 122;

(iv) CDR1 легкой цепи содержит любую одну из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 16 и 123-194;

(v) CDR2 легкой цепи содержит любую из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NOs: 17 и 195-237; и/или

(vi) CDR3 легкой цепи содержит любую одну из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 18 и 238-259.

[0175] В некоторых аспектах CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 44. В некоторых аспектах CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47. В некоторых аспектах CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, или SEQ ID NO: 120. В некоторых аспектах CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, или SEQ ID NO: 192. В некоторых аспектах CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244, или SEQ ID NO: 245.

[0176] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где:

(i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 44;

[0177] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, где:

(ii) CDR2 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47;

[0178] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(iii) CDR3 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 120;

[0179] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где: (i) CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13;

(iv) CDR1 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 или SEQ ID NO: 192;

[0180] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, и CDR1, CDR2, и CDR3 легкой цепи, где:

(vi) CDR3 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 244 или SEQ ID NO: 245.

[0181] В некоторых аспектах описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, при этом одна из CDR тяжелой цепи или легкой цепи содержит аминокислотную модификацию, описанную в данном документе, и CDR другой тяжелой цепи или легкой цепи не модифицированы относительно соответствующих CDR антитела 18 В1 (также называемого в данном документе «антителом А»), описанного в данном документе. В некоторых аспектах две из CDR тяжелой цепи или легкой цепи содержат аминокислотную модификацию, описанную в данном документе, а другие CDR тяжелой цепи или легкой цепи не модифицированы относительно соответствующих CDR антитела 18 В1. В дополнительных аспектах три из CDR тяжелой цепи или легкой цепи содержат аминокислотную модификацию, описанную в данном документе, и другие CDR тяжелой цепи или легкой цепи не модифицированы относительно соответствующих CDR антитела 18 В1. В некоторых аспектах четыре из CDR тяжелой цепи или легкой цепи содержат аминокислотную модификацию, описанную в данном документе, а другие CDR тяжелой цепи или легкой цепи не модифицированы относительно соответствующих CDR антитела 18 В1. В дополнительных аспектах пять из CDR тяжелой цепи или легкой цепи содержат аминокислотную модификацию, описанную в данном документе, и другие CDR тяжелой цепи или легкой цепи не модифицированы относительно соответствующих CDR антитела 18 В1. В некоторых аспектах все шесть CDR тяжелой цепи и легкой цепи содержат описанную в данном документе аминокислотную модификацию относительно соответствующих CDR антитела 18 В1. Как описано в данном документе, антитело 18 В1 содержит CDR1 тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 14, CDR3 тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 15, CDR1 легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 17, и CDR3 легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 18.

[0182] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем VH включает аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на около 100% идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, где VL включает аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 96%, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на около 100% идентична аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 20, и где антитело к ИЛ-7R имеет одно или более из описанных в данном документе свойств.

[0183] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R содержит VH и VL, где VH содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 19, где VL содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID NO: 20, и где антитело к ИЛ-7R имеет одно или более из описанных в данном документе свойств.

[0184] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению перекрестно конкурирует за связывание с ИЛ-7Rα человека с эталонным антителом к FDI-7R, которое содержит VH и VL, где VH включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и где VL включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, связывается с тем же эпитопом на человеческом FDI-7Rα, что и эталонное антитело к ИЛ-7R, которое содержит VH и VL, где VH содержит набор аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 19, и где VL включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления как антитело к ИЛ-7R, так и эталонное антитело связываются с эпитопом, выбранным из группы, состоящей из SQLEVNGSQHSLTCAF (SEQ ID NO: 8), FIETKKFLLIGKSNIC (SEQ ID NO: 9), VKVGEKSLTCKKIDLTT (SEQ ID NO: 10), QKKYVKVLMHDVAY (SEQ ID NO: 11), YEIKVRSIPDHYFKGF (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах осуществления как антитело к ИЛ-7R, так и эталонное антитело связываются с эпитопом, содержащим один или более аминокислотных остатков Н53, Е95, F99, 1102, K104, М164, R206, Н211 и Y212 из SEQ ID NO: 1 (т.е. Н33, Е75, F79,182, K84, М144, R186, Н191 и Y192 из SEQ ID NO: 6).

[0185] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R, описанное в данном документе, ингибирует связывание эталонного антитела к ИЛ-7R с ИЛ-7Rα человека на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или на 100%. Конкурирующие антитела связываются с одним и тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом или с соседними эпитопами (например, что подтверждается стерическими затруднениями). Конкурируют ли два антитела друг с другом за связывание с мишенью, можно определить с помощью экспериментов по конкурентному связыванию, известных в данной области техники, таких как РИА и ИФА.

[0186] Домен VH или одна или более его CDR, описанные в данном документе, могут быть связаны с константным доменом для образования тяжелой цепи, например, полноразмерной тяжелой цепи. Аналогичным образом, домен VL или одна или более его CDR, описанные в данном документе, могут быть связаны с константным доменом для образования легкой цепи, например, полноразмерной легкой цепи. Полноразмерная тяжелая цепь (за исключением С-концевого лизина (K) или за исключением С-концевых глицина и лизина (GK), которые могут отсутствовать) и полноразмерная легкая цепь объединяются, чтобы образовать полноразмерное антитело.

[0187] В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе домен VH может быть слит с константным доменом IgG человека, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, которые являются либо встречающимися в природе, либо модифицированными, например, как дополнительно описано в данном документе. Например, домен VH может содержать аминокислотную последовательность любого описанного в данном документе домена VH, слитого с человеческим IgG, например, с константной областью, такой как следующая аминокислотная последовательность константного домена человеческого IgG1 дикого типа:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS

VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 23)

или аллотипический вариант SEQ ID NO: 23, и имеет следующие аминокислотные последовательности:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24; аминокислотные остатки, специфичные для аллотипов, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты).

[0188] В некоторых вариантах осуществления домен VH антитела к ИЛ-7R может содержать аминокислотную последовательность любого домена VH, описанного в данном документе, слитого с не являющейся эффекторной константной областью, например, со следующими аминокислотными последовательностями константного домена человеческого IgG1, который не является эффекторным:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 25; «IgG1.1f», содержащий замены L234A, L235E, G237A, A330S и P331S, которые подчеркнуты).

или

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 26; «IgG1.3f, содержащий замены L234A, L235E и G237A, которые подчеркнуты).

[0189] Например, аллотипический вариант IgG1 содержит K97R, D239E и/или L241M (подчеркнуты и выделены жирным шрифтом выше) и имеют нумерацию в соответствии с SEQ ID NO: 24-26. В пределах полноразмерной тяжелой области и в соответствии с нумерацией EU эти аминокислотные замены пронумерованы как K214R, D356E и L358M. В некоторых вариантах осуществления константная область антитела к ИЛ-7R может дополнительно содержать одну или более мутаций или замен в аминокислотах L117, А118, G120, А213 и Р214 (подчеркнуто выше), пронумерованных в SEQ ID NO: 24-26, или L234, А235, G237, АЗЗО и Р331 согласно нумерации EU. В дополнительных вариантах осуществления константная область антитела к ИЛ-7R содержит одну или более мутаций или замен в аминокислотах L117A, А118Е, G120A, A213S и P214S из SEQ ID NO: 23, или L234A, L235E, G237A, A330S и P331S согласно нумерации EU. Константная область антитела к ИЛ-7R может также содержать одну или более мутаций или замен L117A, A118E и G120A из SEQ ID NO: 23, или L234A, L235E и G237A, согласно нумерации EU.

[0190] Описанный в данном документе домен VL может быть слит с константным доменом легкой каппа- или лямбда-цепи человека. Например, домен VL антитела к ИД-7Я может содержать аминокислотную последовательность любого домена VL, описанного в данном документе, слитого со следующей аминокислотной последовательностью легкой каппа-цепи IgG1 человека:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 20).

[0191] В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи содержит лизин или другую аминокислоту на С-конце, например, она содержит следующие последние аминокислоты: LSPGK (SEQ ID NO: 28) в тяжелой цепи. В определенных вариантах осуществления в константной области тяжелой цепи отсутствует одна или более аминокислот на С-конце и имеется, например, С-концевая последовательность LSPG (SEQ ID NO: 29) или LSP.

[0192] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь (НС) и легкую цепь (LC), где НС включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и где LC включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

II. Сконструированные и модифицированные антитела

[0193] Также предложены сконструированные и модифицированные антитела, которые могут быть получены с использованием антитела, имеющего одну или более последовательностей VH и/или VL, описанных в данном документе, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, при этом модифицированное антитело может иметь свойства, измененные по сравнению с исходным антителом. Антитело можно сконструировать путем модификации одного или более остатков в одной или обеих вариабельных областях (т.е. VH и/или VL), например, в одной или более областях CDR и/или в одной или более каркасных областях. Дополнительно или альтернативно антитело можно сконструировать путем модификации остатков в константной(-ых) области(-ях), например, для изменения эффекторной функции(-й) антитела.

[0194] Одним из типов конструирования вариабельной области, который может быть выполнен, является прививание CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести определяющих комплементарность областях (CDR) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в CDR более разнообразны между отдельными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, путем конструирования векторов экспрессии, которые включают последовательности CDR из специфического встречающегося в природе антитела, привитого в каркасные последовательности из другого антитела, с разными свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Set. U.S.A. 86: 10029-10033; патенты США №5225539, выданный Winter, и патенты США №5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al).

[0195] Соответственно, вариант осуществления, описанный в данном документе, относится к выделенному моноклональному антителу, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где VH содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, указанные как SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно, где VL содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, обозначенные как SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно, и где антитело имеет одно или более свойств, описанных в данном документе. Таким образом, описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут содержать последовательности CDR VH и VL, перечисленные выше, и при этом могут содержать различные каркасные последовательности.

[0196] Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека можно также найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступной в Интернете по адресу www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase) как в Kabat, Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" /. Mol. Biol. 221:116-19%; и Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836; содержание каждого из которых прямо включено в данный документ посредством ссылки.

[0197] В некоторых вариантах осуществления каркасные последовательности для использования в описанных в данном документе антителах к ИЛ-7R представляют собой те, которые структурно подобны каркасным последовательностям, используемым в описанных в данном документе антителах к ИЛ-7R. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL могут быть привиты на каркасные области, которые имеют последовательность, идентичную последовательности, обнаруженной в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого происходит последовательность каркасной области, или последовательности CDR могут быть привитым в каркасные области, которые содержат одну или более мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях полезно мутировать остатки в каркасных областях для поддержания или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, патенты США №№5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al).

[0198] Сконструированные антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, включают те, в которых были внесены модификации в каркасные остатки в VH и/или VL, например, для улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркаса делают для снижения иммуногенности антитела. Например, один из подходов заключается в «мутировании к первоначальному виду» одного или более остатков каркаса в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое претерпело соматическую мутацию, может содержать остатки каркаса, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасной области антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых происходит антитело. Чтобы вернуть последовательности каркасной области к их конфигурации зародышевой линии, соматические мутации могут быть «мутированы обратно» в последовательность зародышевой линии, например, посредством сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза. Подразумевается, что такие антитела с «обратной мутацией» также включены. Другой тип модификации каркасной области включает мутирование одного или более остатков в каркасной области или даже в одной или более областях CDR для удаления эпитопов Т-, чтобы тем самым снизить потенциальную иммуногенность антитела. Этот подход также клеток называется «деиммунизацией» и более подробно описан в публикации патента США №20030153043, выданного Carr et at.

[0199] Другой тип модификации вариабельной области заключается в мутировании аминокислотных остатков в областях CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VL, чтобы тем самым улучшить одно или более свойств связывания (например, аффинности) представляющего интерес антитела. Сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез могут быть выполнены для введения мутации(-й), и влияние на связывание антитела или другое представляющее интерес функциональное свойство можно оценить в анализах in vitro или in vivo, как описано в данном документе и представлено в Примерах. В некоторых вариантах осуществления вводятся консервативные модификации (как описано выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции. Более того, как правило, изменяется не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков в области CDR.

[0200] Соответственно, в данном документе также предложены выделенные антитела к ИЛ-7R, содержащие VH и VL, где VH содержит (i) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13 (DHAMH), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 13; (ii) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14 (GISWNSRGIGYADSVKG), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 14; и (iii) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 15 (DEYSRGYYVLDV), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 15; где VL содержит (iv) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 (RASQGISSALA), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 16; (v) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17 (DASSLES), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 17; и (vi) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 18 (QQFNSYPLWIT), или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или добавлений по сравнению с SEQ ID NO: 18; и где антитела имеют одно или более свойств, описанных в данном документе. Неограничивающие примеры таких последовательностей CDR VH и VL представлены в таблице 13 (CDR1 VH), таблице 14 (CDR2 VH), таблице 15 (CDR3 VH), таблице 16 (CDR1 VL), таблице 17 (CDR2 VL) и таблице 18 (CDR3 VL).

[0201] Остатки метионина в CDR антител могут окисляться, что приводит к потенциальной химической деградации и, как следствие, снижению активности антитела. Соответственно, также предложены антитела к ИЛ-7R, в которых один или более остатков метионина в CDR тяжелой и/или легкой цепи заменены аминокислотными остатками, которые не подвергаются окислительной деградации.

[0202] Точно так же сайты дезамидирования могут быть удалены из описанных в данном документе антител к ИЛ-7R, особенно в CDR.

[0203] Описанные в данном документе вариабельные области анти-ИЛ-7R могут быть связаны (например, ковалентно или слиты) с Fc, например, с Fc IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, который может быть любого аллотипаили изоаллотипа, например, для IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); для IgG2: G2m, G2m23(n); для IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m1l(b0), G3m5(bl), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); и для K: Km, Km1, Km2, Km3 {см., например, Jefferies et at. (2009) mAbs 1:1).

[0204] В определенных вариантах осуществления вариабельные области анти-ИЛ-7R, описанные в данном документе, связаны с Fc, который не является эффекторным или не является в основном эффекторным, например, IgG1. If или IgG1.3f.

[0205] Как правило, описанные в данном документ вариабельные области могут быть связаны с Fc, содержащим одну или более модификаций, как правило, для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с Fc-рецептором и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, описанное в данном документе антитело может быть химически модифицировано (например, к антителу может быть присоединено одно или более химических фрагментов) или модифицировано для изменения его гликозилирования, для изменения одного или более функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов осуществления более подробно описан ниже. Нумерация остатков в области Fc совпадает с нумерацией индекса EU по Kabat.

[0206] Область Fc включает домены, полученные из константной области иммуноглобулина, включая фрагмент, аналог, вариант, мутант или производное константной области. Подходящие иммуноглобулины включают IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и другие классы, такие как IgA, IgD, IgE и IgM. Константная область иммуноглобулина определяется как встречающийся в природе или полученный синтетическим путем полипептид, гомологичный С-концевой области иммуноглобулина, и может включать домен СН1, шарнир, домен СН2, домен СН3 или домен СН4, отдельно или в комбинации.

[0207] Молекулы Ig взаимодействуют с несколькими классами клеточных рецепторов. Например, молекулы IgG взаимодействуют с тремя классами рецепторов Fey (FcγR), специфичными для класса антител IgG, а именно с FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Сообщалось, что важные последовательности для связывания IgG с рецепторами FcγR расположены в доменах СН2 и СН3. На время полужизни антитела в сыворотке крови влияет способность этого антитела связываться с Fc-рецептором (FcR).

[0208] В некоторых вариантах осуществления область Fc представляет собой вариант области Fc, например, последовательность Fc, которая была модифицирована (например, путем аминокислотной замены, делеции и/или вставки) относительно исходной последовательности Fc (например, немодифицированного полипептида Fc, который впоследствии модифицируется для создания варианта), чтобы обеспечить желаемые структурные особенности и/или биологическую активность.

[0209] Как правило, варианты константной области или ее частей, например, домены СН1, CL, шарнир, СН2 или СН3, могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более мутаций и/или максимум 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мутацию, или 1-10 или 1-5 мутаций, или содержат аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична соответствующей области или домену дикого типа (домен CH1, CL, шарнир, СН2 или СН3, соответственно), при условии, что константная область тяжелой цепи, содержащая конкретный вариант, сохраняет необходимую биологическую активность.

[0210] Например, можно внести модификации в область Fc для создания варианта Fc, который (а) имеет повышенную или пониженную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ), (b) повышенную или пониженную опосредованную комплементом цитотоксичность (КЗЦ), (с) имеет повышенную или пониженную аффинность в отношении C1q и/или (d) имеет повышенную или пониженную аффинность в отношении Fc-рецептора по сравнению с исходным Fc. Такие варианты области Fc, как правило, содержат по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в области Fc. Считается, что особенно желательно комбинировать аминокислотные модификации. Например, вариант области Fc может содержать две, три, четыре, пять и т.д. замен, например, в определенных положениях области Fc, указанных в данном документе.

[0211] Вариант области Fc может также содержать изменение последовательности, при котором аминокислоты, участвующие в образовании дисульфидной связи, удаляются или заменяются другими аминокислотами. Такое удаление может избежать реакции с другими цистеин-содержащими белками, присутствующими в клетке-хозяине, используемой для получения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R. Даже когда остатки цистеина удалены, одноцепочечные домены Fc все еще могут образовывать димерный домен Fc, который удерживается вместе нековалентно. В других вариантах осуществления область Fc может быть модифицирована, чтобы сделать ее более совместимой с выбранной клеткой-хозяином. Например, можно удалить последовательность РА рядом с N-концом иллюстративной нативной области Fc, которая может распознаваться пищеварительным ферментом в E.coli, таким как пролин-иминопептидаза. В других вариантах осуществления один или более сайтов гликозилирования в домене Fc могут быть удалены. Гликозилированные остатки (например, аспарагин) могут вызывать цитолитический ответ.Такие остатки можно удалить или заменить негликозилированными остатками (например, аланином). В других вариантах осуществления сайты, участвующие во взаимодействии с комплементом, такие как сайт связывания Clq, могут быть удалены из области Fc. Например, можно удалить или заменить последовательность ЕКК IgG1 человека. В определенных вариантах осуществления сайты, которые влияют на связывание с Fc-рецепторами, могут быть удалены, предпочтительно сайты, отличные от сайтов связывания рецептора реутилизации. В других вариантах осуществления область Fc может быть модифицирована для удаления сайта АЗКЦ. Сайты АЗКЦ известны в данной области техники; см., например, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) в отношении сайтов АЗКЦ в IgG1. Конкретные примеры вариантов доменов Fc раскрыты, например, в WO 97/34631 и WO 96/32478.

[0212] В одном варианте осуществления шарнирная область Fc модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменяется, например, увеличивается или уменьшается. Этот подход дополнительно описан в патенте США №5677425 Bodmer et al. Число остатков цистеина в шарнирной области Fc изменяется, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела. В одном варианте осуществления шарнирная область Fc антитела мутирована для уменьшения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одна или более аминокислотных мутаций вводятся в область взаимодействия домена СН2-СН3 шарнирного фрагмента Fc, так что антитело нарушает связывание стафилококкового белка A (SpA) по сравнению со связыванием нативного шарнирного домена Fc SpA. Этот подход более подробно описан в патенте США№6165745 Ward et al.

[0213] В еще других вариантах осуществления область Fc изменяют путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной функции(-й) антитела. Например, одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318,320, 322, 330 и/или 331, можно заменить другим аминокислотным остатком, так что антитело имеет измененную аффинность к эффекторному лиганду, но сохраняет антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность в отношении которого изменяется, может быть, например, Fc-рецептором или компонентом комплемента С1. Этот подход более подробно описан в патентах США №№5624821 и 5648260, оба принадлежат Winter et al.

[0214] В еще одном примере одна или более аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, могут быть заменены другим аминокислотным остатком, так что антитело изменяет связывание C1q и/или снижает или отменяет комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ). Этот подход более подробно описан в патенте США №6194551, выданном Idusogie et al.

[0215] В еще одном примере один или более аминокислотных остатков в аминокислотных положениях 231 и 239 изменены, чтобы тем самым изменить способность антитела фиксировать комплемент.Этот подход дополнительно описан в публикации РСТ WO 94/29351 Bodmer et al.

[0216] В еще одном примере область Fc может быть модифицирована для снижения антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или для уменьшения аффинности в отношении Fcy-рецептора путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 или 439. Примеры замен включают 236А, 239D, 239Е, 268D, 267Е, 268Е, 268F, 324Т, 332D и 332Е. Примеры вариантов включают 239D/332E, 236А/332Е, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267Е/324Т и 267E/268F7324T. Другие модификации для усиления взаимодействий FcγR и комплемента включают, но не ограничиваются ими, замены 298А, 333А, 334А, 326А, 2471, 339D, 339Q, 280Н, 290S, 298D, 298V, 243L, 292Р, 300L, 396L, 3051 и 396L. Эти и другие модификации рассматриваются в Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691.

[0217] Модификации Fc, которые увеличивают связывание с Fcy-рецептором, включают модификации аминокислот в любом одном или более аминокислотных положениях 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 области Fc, где нумерация остатков в области Fc соответствует индексу EU, как в Kabat (WO 00/42072).

[0218] Другие модификации Fc, которые могут быть внесены в Fc, представляют собой модификации для уменьшения или отмены связывания с FcγR и/или белками комплемента, тем самым снижая или отменяя опосредованные Fc эффекторные функции, такие как АЗКЦ, АЗФК и КЗЦ. Иллюстративные модификации включают, но не ограничиваются, замены, вставки и делеций в положениях 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325, 328, 330 и/или 331 (например, 330 и 331), где нумерация соответствует индексу EU. Примеры замен включают, но не ограничиваются ими, 234А, 235Е, 236R, 237А, 267R, 269R, 325L, 328R, 330S и 33IS (например, 330S и 33IS), при этом нумерация соответствует индексу EU. Вариант Fc может содержать 236R/328R. Другие модификации для уменьшения взаимодействий FcγR и комплемента включают замены 297А, 234А, 235А, 237А, 318А, 228Р, 236Е, 268Q, 309L, 330S, 331 S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233Р и 234V, а также удаление гликозилирования в положении 297 с помощью мутационных или ферментативных средств или путем продуцирования в организмах, таких как бактерии, которые не гликозилируют белки. Эти и другие модификации рассматриваются в Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

[0219] Необязательно, область Fc может содержать не встречающийся в природе аминокислотный остаток в дополнительных и/или альтернативных положениях, известных специалисту в данной области техники (см., например, патенты США №№5624821; 6277375; 6737056; 6194551; 7317091; 8101720; патентные публикации PCX WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 и WO 06/0201 14).

[0220] Также можно использовать варианты Fc, которые увеличивают аффинность в отношении ингибирующего рецептора FcγRIIb. Такие варианты могут обеспечивать Fc-слитый белок с иммуномодулирующей активностью, связанной с клетками FcγRIIb, включая, например, В-клетки и моноциты. В одном варианте осуществления варианты Fc обеспечивают селективно повышенную аффинность в отношении FcγRIIb по сравнению с одним или более активирующими рецепторами. Модификации для изменения связывания с FcγRIIb включают одну или более модификаций в положении, выбранном из группы, состоящей из 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, 330, 331 и 332, согласно индексу EU. Примеры замен для повышения аффинности FcγRIIb включают, но не ограничиваются ими, 234А, 234D, 234Е, 234F, 234W, 235D, 235Е, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237А, 237D, 237N, 239D, 239Е, 266М, 267D, 267Е, 268D, 268Е, 327D, 327Е, 328F, 328W, 328Y, 330S, 33IS, и 332Е. Примеры замен включают 235Y, 236D, 239D, 266М, 267Е, 268D, 268Е, 328F, 328W, и 328Y. Другие варианты Fc для усиления связывания с FcγRIIb включают 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267Е/268Е, и 267E/328F.

[0221] Аффинность и связывающие свойства области Fc с его лигандом могут быть определены различными способами анализа in vitro (биохимическими или иммунологическими анализами), известными в данной области техники, включая, помимо прочего, равновесные методы (например, иммуноферментный анализ (ИФА) или радиоиммуноанализ (РИА)), или кинетические методы (например, анализ BIACORE™) и другие методы, такие как анализы непрямого связывания, анализы конкурентного ингибирования, резонансный перенос энергии флуоресценции (РПЭФ), гель-электрофорез и хроматография (например, гель-фильтрация). Эти и другие способы могут использовать метку на одном или более исследуемых компонентах и/или использовать различные способы обнаружения, включая, но не ограничиваясь ими, хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки. Подробное описание аффинностей связывания и кинетики можно найти в Paul, W. Е., ed., Fundamental immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), в котором основное внимание уделяется взаимодействиям антитело-иммуноген.

[0222] В определенных вариантах осуществления антитело модифицировано для увеличения его биологического периода полужизни. Возможны разные подходы. Например, это можно сделать, увеличив аффинность связывания области Fc с FcRn, например, один или более из следующих остатков могут быть мутированы: 252, 254, 256, 433, 435, 436, как описано в патенте США №6277375. Конкретные примерные замены включают одно или более из следующего: T252L, T254S и/или T256F. Альтернативно, для увеличения биологического периода полужизни антитело можно изменить в области СН1 или CL, чтобы он содержал эпитоп, связывающий рецептор реутилизации, взятый из двух петель домена СН2 области Fc IgG, как описано в патентах США №5869046 и 6121022, выданных Presta et al. Другие иллюстративные варианты, которые увеличивают связывание с FcRn и/или улучшают фармакокинетические свойства, включают замены в положениях 259, 308, 428 и 434, включая, например, 2591, 308F, 428L, 428М, 434S, 43411. 434F, 434Y и 434X1. Другие варианты, которые увеличивают связывание Fc с FcRn, включают: 250Е, 250Q, 428 L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311 S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall'Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, DalfAcqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Другие модификации для модулирования связывания FcRn описаны в Yeung et al, 2010, J Immunol, 182:7663-7671.

[0223] В определенных вариантах осуществления можно использовать изотипы гибридного IgG с конкретными биологическими характеристиками. Например, гибридный вариант IgG1/IgG3 может быть сконструирован путем замены положений IgG1 в области СН2 и/или СН3 аминокислотами из IgG3 в положениях, где два изотипа различаются. Таким образом, можно сконструировать гибридный вариант антитела IgG, который содержит одну или более замен, например, 274Q, 276K, 300F, 339Т, 356Е, 358М, 384S, 392N, 397М, 4221, 435R и 436F. В других вариантах осуществления, описанных в данном документе, гибридный вариант IgG1/IgG2 может быть сконструирован путем замены положений IgG2 в области СН2 и/или СН3 аминокислотами из IgG1 в положениях, где два изотипа различаются. Таким образом, можно сконструировать гибридный вариант антитела IgG, который содержит одну или более замен, например, одну или более из следующих аминокислотных замен: 233Е, 234L, 235L, -236G (относится к вставке глицина в положение 236) и 327А.

[0224] Более того, были картированы сайты связывания на человеческом IgG1 для FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn, и были описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Было показано, что специфические мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с FcyRIII. Кроме того, было показано, что следующие комбинированные мутанты улучшают связывание FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A, которые, как было показано, проявляют повышенное связывание FcyRIIIa и активность АЗКЦ (Shields et al., 2001). Были идентифицированы другие варианты IgG1 с сильно усиленным связыванием с FcyRIIIa, включая варианты с мутациями S239D/I332E и S239D/I332E/A330L, которые показали наибольшее увеличение аффинности в отношении FcyRIIIa, снижение связывания FcyRIIb и сильную цитотоксическую активность у яванских макак (Lazar et al, 2006). Введение тройных мутаций в антитела, такие как алемтузумаб (специфичный для CD52), трастузумаб (специфичный для HER2/neu), ритуксимаб (специфичный для CD20) и цетуксимаб (специфичный для EGFR), транслировался в значительно усиленную активность АЗКЦ in vitro, а вариант S239D/I332E продемонстрировал повышенную способность истощать В-клетки у обезьян (Lazar et al, 2006). Кроме того, были идентифицированы мутанты IgG1, содержащие мутации L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L, которые проявляли усиленное связывание с FcyRIIIa и сопутствующее усиление активности АЗКЦ у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий FcyRIIIa, на моделях В-клеточных злокачественных новообразований и рака молочной железы (Stavenhagen et al., 2007; Nordstrom et al., 2011). Другие мутанты Fc, которые можно использовать, включают: S298A/E333A/L334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L и M428L/N434S.

[0225] В определенных вариантах осуществления выбран Fc, который снижает связывание с FcyR. Иллюстративный Fc, например, Fc IgG1, с пониженным связыванием FcyR содержит следующие три аминокислотные замены: L234A, L235E и G237A.

[0226] В определенных вариантах осуществления выбран Fc, который имеет пониженную фиксацию комплемента. Иллюстративный Fc, например, Fc IgG1, с пониженной фиксацией комплемента имеет следующие две аминокислотные замены: A330S и P331S.

[0227] В определенных вариантах осуществления выбран Fc, который по существу не выполняет эффекторной функции, то есть имеет пониженное связывание с FcyR и пониженную фиксацию комплемента. Иллюстративный Fc, который не является эффекторным, например, Fc IgG1, содержит следующие пять мутаций: L234A, L235E, G237A, A330S и P331S.

[0228] При использовании константного домена IgG4 он может включать замену S228P, которая имитирует шарнирную последовательность в IgG1 и тем самым стабилизирует молекулы IgG4.

[0229] В других вариантах осуществления гликозилирование антитела изменяется. Например, может быть получено агликозилированное антитело (т.е. в антителе отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменить, например, для увеличения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем изменения одного или более сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно произвести одну или более аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или более сайтов гликозилирования каркасной области вариабельной области, чтобы тем самым устранить гликозилирование в этом сайте. Такое агликозилирование может увеличить аффинность антитела к антигену. Такой подход более подробно описан в патентах США №№5714350 и 6350861, выданных Со et al.

[0230] Гликозилирование константной области на N297 можно предотвратить путем мутации остатка N297 на другой остаток, например, N297A, и/или путем мутации соседней аминокислоты, например, 298, чтобы тем самым уменьшить гликозилирование на N297.

[0231] Дополнительно или альтернативно можно получить антитело с измененным типом гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, имеющее пониженные количества фукозильных остатков, или антитело, имеющее повышенное количество структур GlcNac в точках ветвления. Было продемонстрировано, что такие измененные паттерны гликозилирования увеличивают способность антител к АЗКЦ. Такие углеводные модификации могут быть выполнены, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в данной области техники и могут использоваться в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, для получения таким образом антитела с измененным гликозилированием. Например, В ЕР 1176195 от Hanai et al. описана клеточная линия с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессируемые в такой клеточной линии, проявляют гипофукозилирование. В публикации РСТ WO 03/035835 от Presta описан вариант клеточной линии СНО, клетки Led 3, с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn (297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации РСТ WO 99/54342 от Umana et al. описаны клеточные линии, сконструированные для экспрессии модифицирующих глико протеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4) -N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), так что антитела, экспрессируемые в сконструированных клеточных линиях, демонстрируют повышенное количество структуры GlcNac в точках ветвления, что приводит к увеличению активности АЗКЦ антитела (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).

[0232] Еще одной модификацией описанных в данном документе антител к ИЛ-7R является пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения биологического (например, сывороточного) периода полужизни антитела. Для пегилирования антитела антитело или его фрагмент обычно подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или более групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. В некоторых вариантах осуществления пегилирование осуществляется посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Используемый в данном документе термин «полиэтиленгликоль» предназначен для охвата любых форм ПЭГ, которые использовались для дериватизации других белков, таких как моно (CI-CIO) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. В определенных вариантах осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Способы получения пегилированных белков известны в данной области техники и могут применяться к описанным в данном документе антителам к ИЛ-7R. См., например, ЕР 0154316. выданный Nishimura et al., и ЕР 0401384, выданный Ishikawa et al.

III. Физические свойства антител

[0233] Антитела к ИЛ-7R, например, описанные в данном документе, обладают некоторыми или всеми физическими характеристиками, описанными в данном документе, такими как характеристики, описанные в Примерах.

[0234] Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Такие сайты гликозилирования могут приводить к повышенной иммуногенности антитела или изменению рК антитела из-за изменения связывания антигена (Marshall et al., (1972) Anna Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R не имеет гликозилирования вариабельной области. Это может быть достигнуто либо путем выбора антител, которые не содержат мотив гликозилирования в вариабельной области, либо путем мутации остатков в области гликозилирования.

[0235] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R не содержат сайтов изомерии аспарагина. Дезамидирование аспарагина может происходить в последовательностях N-G или D-G и приводить к образованию остатка изоаспарагиновой кислоты, который вносит излом в полипептидную цепь и снижает ее стабильность (эффект изоаспарагиновой кислоты).

[0236] Каждое антитело будет иметь уникальную изоэлектрическую точку (pi), которая, как правило, находится в диапазоне рН от 6 до 9,5. pi для антитела IgG1, как правило, находится в диапазоне рН 7-9,5, a pi для антитела IgG4, как правило, находится в диапазоне рН 6-8. Есть предположение, что антитела с pi вне нормального диапазона могут иметь некоторое разворачивание и нестабильность в условиях in vivo. Таким образом, антитело к ИЛ-7R может иметь значение pi, которое находится в нормальном диапазоне. Это может быть достигнуто либо путем отбора антител с pi в нормальном диапазоне, либо путем мутирования заряженных поверхностных остатков.

[0237] Каждое антитело будет иметь характерную температуру плавления, причем более высокая температура плавления указывает на большую общую стабильность in vivo (Krishnamurthy R and Manning M С (2002) Curr PharmBiotechnol3:36l-71). Как правило, T_мi (температура начала разворачивания) может быть больше 60°С, больше 65°С или больше 70°С. Точку плавления антитела можно измерить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (Chen et al., (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52) или кругового дихроизма (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

[0238] В одном варианте осуществления выбираются антитела, которые быстро не деградируют. Деградацию антитела можно измерить с помощью капиллярного электрофореза (КЭ) и MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32).

[0239] В некоторых вариантах осуществления выбираются антитела, которые обладают минимальными эффектами агрегации, которые могут привести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или измененным или неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. Как правило, приемлемы антитела с агрегацией 25% или меньше, 20% или меньше, 15% или меньше, 10% или меньше, 5% или меньше. Агрегацию можно измерить несколькими методами, включая эксклюзионную колонку (ЭХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и светорассеяние.

IV Методы конструирования антител

[0240] Как обсуждалось выше, антитела к ИЛ-7R, имеющие последовательности VH и VL, описанные в данном документе, могут быть использованы для создания новых антител к FDI-7R путем модификации последовательностей VH и/или VL или присоединенных к ним константных областей. Таким образом, в другом аспекте, описанном в данном документе, структурные особенности антитела к ИЛ-7R, описанного в данном документе, используются для создания структурно родственных антител к ИЛ-7R, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител к ИЛ-7R, описанных в данном документе, такое как связывание с ИЛ-7Rα человека и ИЛ-7Rα яванского макака. Например, одна или более областей CDR описанного в данном документе антитела к ИЛ-7R могут быть рекомбинантно объединены с известными каркасными областями и/или другими CDR для создания дополнительных сконструированных с помощью рекомбинантных технологии антител к ИЛ-7R, как обсуждалось выше. Другие типы модификаций включают те, которые описаны в предыдущем разделе. Исходным материалом для метода конструирования является одна или более последовательностей VH и/или VL, представленных в данном документе, или одна или более их областей CDR. Для создания сконструированного антитела нет необходимости фактически получать (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или более последовательностей VH и/или VL, представленных в данном документе, или одну или более их областей CDR. Скорее, информация, содержащаяся в последовательности(-ях), используется в качестве исходного материала для создания последовательности(-ей) «второго поколения», полученной из исходной последовательности(-ей), а затем получения по следовательности(-ей) «второго поколения» и экспрессии в виде белка.

[0241] Соответственно, в данном документе представлены способы получения антитела к ИЛ-7R, включающие:

(a) обеспечение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела содержащей последовательность CDR1, указанную как SEQ ID NO: 13, или любую одну из последовательностей, представленных в таблице 13, последовательность CDR2, указанную как SEQ ID NO: 14, или любую из последовательностей, представленных в таблице 14, и/или последовательность CDR3, указанную как SEQ ID NO: 15, или любую из последовательностей, представленных в таблице 15; и (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, указанную как SEQ ID NO: 16, или любую одну из последовательностей, представленных в таблице 16, последовательность CDR2, указанную как SEQ ID NO: 17, или любую из последовательностей, представленных в таблице 17, и/или последовательность CDR3, указанную как SEQ ID NO: 18, или любую из последовательностей, представленных в таблице 18;

(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельной области легкой цепи антитела для создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела; и

(c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.

[0242] Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно использовать стандартные методы молекулярной биологии. В некоторых вариантах осуществления антитело, кодируемое измененной последовательностью(-ями) антитела, представляет собой антитело, которое сохраняет одно, некоторые или все функциональные свойства антител к ИЛ-7R, описанных в данном документе. Функциональные свойства измененных антител можно оценить с помощью стандартных анализов, доступных в данной области и/или описанных в данном документе, таких как анализы, изложенные в Примерах (например, ИФА, проточная цитометрия).

[0243] В некоторых вариантах осуществления мутации могут быть введены случайным образом или выборочно вдоль всей или части кодирующей последовательности антитела к ИЛ-7R, и полученные модифицированные антитела к ИЛ-7R могут быть проверены на связывающую активность и/или другие функциональные свойства, как описано в настоящем документе. Мутационные методы описаны в данной области техники. Например, в публикации РСТ WO 02/092780, выданной Short, описаны способы создания и скрининга мутаций антител с использованием насыщающего мутагенеза, синтетической сборки на основе лигирования или их комбинации. В качестве альтернативы, в публикации PCT WO 03/074679 Lazar et al. Описаны способы использования компьютерных методов скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.

V Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки

[0244] В данном документе также описаны молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота является «выделенной» или «по существу чистой» при очистке от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот (например, другой хромосомной ДНК, например, хромосомной ДНК, которая связана с выделенной ДНК в природе) или белков стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, разделение в CsCl, колоночную хроматографию, рестрикционные ферменты, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области техники. См., F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Описанная в данном документе нуклеиновая кислота может быть, например, ДНК или РНК и может содержать или не может содержать интронные последовательности. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.

[0245] Описанные в данном документе нуклеиновые кислоты могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридом, полученных из трансгенных мышей, несущих гены иммуноглобулина человека, как описано ниже), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, полученные с помощью гибридомы, могут быть получены стандартными методами ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с использованием методов фагового дисплея), нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть извлечена из библиотеки.

[0246] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, представляют собой нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательности VH и VL антител к ИЛ-7R по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, кодируют последовательности VH и VL, которые гомологичны описанным в данном документе антителам к ИЛ-7R. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты кодируют последовательности VH и VL, которые идентичны на по меньшей мере 70%, например, на по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или на по меньшей мере 99% идентичны молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим последовательности VH и VL описанных в данном документе антител к ИЛ-7R.

[0247] В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы для удаления определенных последовательностей, например, последовательностей узнавания рестрикционного фермента. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты содержат консервативные замены (т.е. замены, которые не изменяют получаемую аминокислотную последовательность при трансляции молекулы нуклеиновой кислоты), например, для оптимизации кодонов.

[0248] Описанный в данном документе способ получения антитела к ИЛ-7R может включать экспрессию тяжелой и легкой цепей в клеточной линии, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи, с сигнальным пептидом, например, SEQ ID NO: 21 и 22, соответственно. Клетки-хозяева, содержащие эти нуклеотидные последовательности, включены в данный документ.В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева получены из клеточной линии CHOZN.

[0249] Сразу после получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL, можно проводить последующие манипуляции с этими фрагментами ДНК с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены фрагментов Fab или в ген scFv. В ходе данных манипуляций фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. В контексте данного документа термин «функционально связанный» означает, что два фрагмента ДНК объединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.

[0250] Выделенная ДНК, кодирующая область VH, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (шарнир, СН1, СН2 и/или СН3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, Е. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, например, областью IgG1. Для гена тяжелой цепи Fab-фрагмента ДНК, кодирующая VH, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область СН1 тяжелой цепи.

[0251] Выделенная ДНК, кодирующая область VL, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген Fab легкой цепи) путем оперативного связывания ДНК, кодирующей VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область CL легкой цепи. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области техники (см., например, Kabat, Е.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены при помощи стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа- или лямбда-типа.

[0252] Настоящее изобретение также относится к клеткам (например, клеткам-хозяевам), экспрессирующим (например, рекомбинантно) антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, и родственные полинуклеотиды и векторы экспрессии. В данном документе также предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к ИЛ-7R или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления векторы можно использовать для рекомбинантной экспрессии антител к ИЛ-7R, описанных в данном документе, в клетках-хозяевах, например, в клетках млекопитающих, например, в клетках CHOZN. В некоторых вариантах осуществления векторы можно использовать для генной терапии. Подходящие векторы для настоящего изобретения включают векторы экспрессии, вирусные векторы и плазмидные векторы.

[0253] Используемый в данном документе вектор экспрессии относится к любой конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности, или, в случае вирусного вектора РНК, необходимые элементы для репликации и трансляции, при введении в подходящую клетку-хозяина. Векторы экспрессии могут включать плазмиды, фагмиды, вирусы и их производные.

[0254] Векторы экспрессии по данному изобретению могут включать полинуклеотиды, кодирующие антитело или его антигенсвязывающую часть, описанное в данном документе. В некоторых вариантах осуществления кодирующие последовательности для антитела или его антигенсвязывающей части функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии. В контексте данного документа две последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, что каждая составляющая последовательность нуклеиновой кислоты сохраняет свою функциональность. Считается, что кодирующая последовательность и последовательность контроля экспрессии гена функционально связаны, если они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности попадает под влияние или контроль последовательности контроля экспрессии гена. Считается, что две последовательности ДНК функционально связаны, если индукция промотора в 5'-последовательности экспрессии гена приводит к транскрипции кодирующей последовательности и если природа связи между двумя последовательностями ДНК не (1) приводит к введению мутации со сдвигом рамки считывания, (2) препятствует способности промоторной области управлять транскрипцией кодирующей последовательности, или (3) мешает способности соответствующего транскрипта РНК транслироваться в белок. Таким образом, последовательность экспрессии гена была бы функционально связана с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если бы последовательность экспрессии гена была способна влиять на транскрипцию этой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты, так чтобы полученный транскрипт транслировался в желаемое антитело или его антигенсвязывающую часть.

[0255] Вирусные векторы включают, помимо прочего, последовательности нуклеиновых кислот из следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус мышиного лейкоза Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; лентивирус; аденовирус; аденоассоциированный вирус; вирусы типа SV40; полиомавирусы; вирусы Эпштейна-Барра; вирусы папилломы; вирус герпеса; вирус коровьей оспы; вирус полиомиелита; и РНК-вирус, такой как ретровирус. Можно легко использовать другие векторы, хорошо известные в данной области техники. Некоторые вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотических вирусах, в которых неосновные гены были заменены на представляющий интерес ген. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующей интеграцией провирусов в клеточную ДНК хозяина. Ретровирусы были одобрены для испытаний генной терапии на людях. Наиболее подходящими являются те ретровирусы, которые являются дефектными по репликации (т.е., способны управлять синтезом желаемых белков, но неспособны продуцировать инфекционные частицы). Такие генетически измененные ретровирусные векторы экспрессии имеют общее применение для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы получения ретровирусов с дефектом репликации (включая этапы включения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекцию линии клеток с дефектом упаковки плазмидой, получение рекомбинантных ретровирусов линией клеток с дефектом упаковки, сбор вирусных частиц из среды культивирования тканей, и инфицирование клеток-мишеней вирусными частицами) представлены в Kriegler, М., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

VI. Получение антител

[0256] Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут быть получены с использованием множества известных методик, таких как стандартная методика гибридизации соматических клеток, описанная Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, также могут использоваться другие способы получения моноклональных антител, например вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов, метод фагового дисплея с использованием библиотек генов антител человека.

[0257] Предпочтительной системой животных для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридом у мышей представляет собой очень хорошо отлаженную процедуру. Протоколы иммунизации и способы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области техники. Также известны партнеры по слиянию (например, мышиные миеломные клетки) и процедуры слияния.

[0258] Химерные или гуманизированные антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, могут быть получены на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующая иммуноглобулины тяжелой и легкой цепей, может быть получена из представляющей интерес гибридомы мышей и сконструирована так, чтобы она содержала отличные от мышиных (например, человеческие) последовательности иммуноглобулинов с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела вариабельные области мыши могут быть связаны с константными областями человека с использованием способов, известных в данной области техники (см., например, патент США №4816567, выданный Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиные области CDR могут быть вставлены в каркасную область человека с использованием способов, известных в данной области техники (см., например, патент США №5225539, выданный Winter, и патенты США №№5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданный Queen et al.).

[0259] В одном варианте осуществления описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против ИЛ-7Rα, могут быть получены с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не мышиной системы. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых в данном документе мышами HuMAb и мышами KM, соответственно, и в совокупности именуются в данном документе «мышами с человеческим Ig».

[0260] HUMAB-MOUSE® (Medarex, Inc.) содержит минилокусы гена иммуноглобулина человека, который кодирует нереаранжированные последовательности иммуноглобулина тяжелой (р и у) цепи и легкой каппа-цепи человека, а также целевые мутации, которые инактивируют локусы эндогенных цепей р и k (см., например, Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859). Соответственно, мыши демонстрируют сниженную экспрессию мышиного IgM или к, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием моноклонального человеческого IgGK с высокой аффинностью (Lonberg, N. et al. (1994), выше, рассмотрено в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и использование мышей HuMab, а также модификации генома таких мышей дополнительно описаны в Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al, (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; и Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. См. также патенты США №№5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; и 5770429; все выданы Lonberg и Kay; патент США №5545807, выданные Surani et al, публикации РСТ №№WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, выданные Lonberg и Kay; и публикацию РСТ №WO 01/14424, выданную Korman et al.

[0261] В определенных вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, получают с использованием мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека на трансгенах и трансхромосомах, например, мыши, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такие мыши, называемые в данном документе «мышами КМ», подробно описаны в публикации РСТ WO 02/43478, выданной Ishida et al.

[0262] Кроме того, альтернативные системы трансгенных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, доступны в данной области техники и могут быть использованы для получения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R. Например, можно использовать альтернативную трансгенную систему, называемую XENOMOUSE® (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в патентах США №№5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданные Kucherlapati et al.

[0263] Более того, альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, доступны в данной области и могут быть использованы для получения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому тяжелой цепи человека, так и транхромосому легкой цепи человека, называемых «мышами ТС»; такие мыши описаны в Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:122-121. Кроме того, коровы, несущие трансхромосомы тяжелых и легких цепей человека, описаны в данной области техники (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) и могут быть использованы для получения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R.

[0264] Дополнительные мышиные системы, описанные в данной области для получения человеческих антител, например человеческих антител к ИЛ-7R, включают (i) мышь VELOCLMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), в которой эндогенные вариабельные области тяжелой и легкой цепи мыши были заменены посредством гомологичной рекомбинации вариабельными областями тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанными с эндогенными константными областями мыши, так что химерные антитела (человеческие V / мышиные С) вырабатываются у мышей, а затем превращаются в полностью человеческие антитела с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК; и (ii) мышь MEMO® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), для которой мышь содержит нереаранжированные вариабельные области тяжелой цепи человека, но единственную реаранжированную вариабельную область общей легкой цепи человека. Такие мыши и их использование для получения антител описаны, например, в WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, США 2012/0070861 и US 2012/0073004.

[0265] Описанные в данном документе человеческие моноклональные антитела к ИЛ-7R также могут быть получены с использованием методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов иммуноглобулина человека. Такие методы фагового дисплея для выделения человеческих антител известны в данной области техники. См., например: патенты США №№5223409; 5403484; и 5571698, выданные Uadner et al; патенты США №№5427908 и 5580717, выданные Dower et al.; патенты США №№5969108 и 6172197, McCafferty et al.; и патенты США №№5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные Griffiths et al.

[0266] Описанные в данном документе человеческие моноклональные антитела к ИЛ-7R также могут быть получены с использованием мышей SCID, в которых восстановлены человеческие иммунные клетки, так что при иммунизации может образовываться антитела человека. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№5476996 и 5698767, выданные Wilson et al.

VI.A. Иммунизации

[0267] Для создания полностью человеческих антител к ИЛ-7Rα трансгенных или трансхромосомных мышей, имеющих гены иммуноглобулинов человека (например, мышей HCol2, НСо7 или KM), можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-7Rα и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-7Rα или его фрагмент, как описано для других антигенов, например, в публикации Uonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 и WO 98/24884. Альтернативно мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей ИЛ-7Rα человека или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления возраст мышей может составлять 6-16 недель после первой инфузии. Например, очищенный или обогащенный препарат (5-50 пг) рекомбинантного антигена ИЛ-7Rα можно использовать для внутрибрюшинной иммунизации мышей HuMAb. В случае, если иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена ИЛ-7Rα не приводит к появлению антител, мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими ИЛ-7Rα, например, линией клеток, для стимулирования иммунных ответов. Иллюстративные линии клеток включают стабильную линию клеток СНО (CHOZN), сверхэкспрессирующую ИЛ-7Rα.

[0268] Накопленный опыт с различными антигенами показал, что трансгенные мыши HuMAb лучше всего отвечают при первоначальной внутрибрюшинной (в/б) или подкожной (п/к) иммунизации антигеном в адъюванте Риби с последующими в/б / п/к иммунизациями каждые две недели (всего до 10) антигеном в адъюванте Риби. Иммунный ответ можно контролировать в ходе протокола иммунизации с помощью образцов плазмы, полученных путем ретроорбитального кровотечения. Плазма может быть проверена с помощью ИФА и проточной цитометрии (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина к ИЛ-7R можно использовать для слияния. Мышей можно усилить внутривенно антигеном за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки и лимфатических узлов. Ожидается, что может потребоваться 2-3 слияния для каждой иммунизации. Как правило, иммунизируют от 6 до 24 мышей для каждого антигена. Как правило, используют штаммы НСо7, HCol2 и КМ. Кроме того, трансген НСо7 и HCol2 можно скрестить вместе в одну мышь, имеющую два разных трансгена тяжелой цепи человека (НСо7/НСо12).

VLB. Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к ИЛ-7Rα

[0269] Для создания гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов от иммунизированных мышей могут быть выделены и слиты с соответствующей линией иммортализованных клеток, такой как линия клеток миеломы мыши. Полученные гибридомы можно подвергнуть скринингу на продукцию антигенспецифических антител. Например, суспензии единичных клеток лимфоцитов селезенки от иммунизированных мышей могут быть слиты с несекретирующими клетками миеломы мыши Sp2/0 (АТСС, CRL 1581) с помощью ПЭГ. Клетки можно высеять на плоскодонный планшет для микротитрования с последующей инкубацией в селективной среде. Через несколько недель клетки можно культивировать в среде. Затем отдельные лунки можно подвергнуть скринингу с помощью ИФА на человеческие моноклональные антитела IgM и IgG. После того, как происходит экстенсивный рост гибридомы среду контролируют, как правило, делают это через 10-14 дней. Выделяющие антитела гибридомы могут быть заменены, снова подвергнуты скринингу, и, если они все еще положительны на человеческий IgG, моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды путем ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны можно культивировать in vitro для получения небольших количеств антител в среде для культивирования тканей для определения характеристик.

[0270] Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых вращающихся колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией с протеином А-сефарозой (Pharmacia, Пискатауэй, штат Нью-Джерси). Элюированный IgG можно проверить с помощью гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии для обеспечения чистоты. Буферный раствор можно заменить на PBS, и концентрацию можно определить по ОП280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно разделить на аликвоты и хранить.

VI. С. Создание трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела к ИЛ-7Rα

[0271] Антитела могут быть получены в трансфектоме клетки-хозяина, например, с использованием комбинации методов рекомбинантной ДНК и методов трансфекции генов, которые хорошо известны в данной области техники (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0272] Например, для экспрессии антител или их фрагментов антител ДНК, кодирующая частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии (например, амплификацией ПЦР или клонированием кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует представляющее интерес антитело) и ДНК могут быть вставлены в векторы экспрессии, так что гены были функционально связаны с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте термин «функционально связанный» означает, что ген антитела лигируется в вектор таким образом, что транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности в векторе выполняют свою предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбираются так, чтобы они были совместимы с используемой клеткой-хозяином для экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельный вектор или оба гена могут быть вставлены в один и тот же вектор экспрессии. Гены антител вставляют в вектор(-ы) экспрессии стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте и векторе гена антитела или лигированием тупого конца, в случае отсутствия сайтов рестрикции). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител к ИЛ-7R, описанные в данном документе, можно использовать для создания полноразмерных генов антител любого изотипа антитела путем вставки их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи желаемого изотипа, так что сегмент V_H функционально связан с сегментом(-ами) C_H в векторе, а сегмент V_Lфункционально связан с сегментом C_L в векторе.

[0273] Дополнительно или альтернативно рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор так, чтобы сигнальный пептид в рамке был связан с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть сигнальный пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином). В данной области техники известны примеры последовательностей сигнального пептида, которые можно использовать. См., например, международную публикацию №WO 2018/013818 А2.

[0274] В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные векторы экспрессии могут нести регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Предполагается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые регулируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Специалистам в данной области техники будет понятно, что конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, желаемый уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии клеток-хозяев млекопитающих включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяны 40 (SV40), аденовируса (например, главного позднего промотора аденовируса (AdMLP) и полиомы. Альтернативно можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор β-глобина. Кроме того, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из разных источников, таких как промоторная система SRa, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинного концевого повтора вируса Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (Takebe, Y. et al. (1988) AfoZ. Celt. Biol. 8:466-472).

[0275] В дополнение к генам цепи антител и регуляторным последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии могут иметь дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации), и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США №№4399216, 4634665 и 5179017, все выданы Axel et al). Например, селектируемый маркерный ген обычно придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Предпочтительные гены селективных маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в DHFR- клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией с помощью метотрексата) и ген neo (для селекции G418).

[0276] Для экспрессии легкой и тяжелой цепей вектор(-ы) экспрессии, кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными методами. Предполагается, что различные формы термина «трансфекция» охватывают широкий спектр методов, широко используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию DEAE-декстраном, и тому подобное.

[0277] Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела к ИЛ-7R, описанные в данном документе, в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, собирают и секретируют правильно свернутое и иммунологически активное антитело. Сообщалось, что экспрессия генов антител у прокариот неэффективна для получения высоких выходов активных антител (Boss, М.А. and Wood, С.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

[0278] Некоторые клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии описанных в данном документе рекомбинантных антител к ИЛ-7R включают яичник китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки DHFR-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, используемые с селективным маркером DHFR, например, как описано в R. J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 759:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности, для использования с клетками миеломы NSO другой системой экспрессии является система экспрессии гена GS, описанная в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841. При введении рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антитела, в клетки-хозяева млекопитающего, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяев. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белка.

III. Иммуноконъюгаты, производные антител и средства диагностики

[0279] Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут быть использованы для диагностических целей, включая тестирование образцов и визуализацию in vivo, и для этой цели антитело (или его связывающий фрагмент) можно конъюгировать с подходящим обнаруживаемым агентом с образованием иммуноконъюгата. Для диагностических целей подходящими агентами являются обнаруживаемые метки, которые включают радиоизотопы, для визуализации всего тела и радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные метки и другие подходящие метки антител для тестирования образцов.

[0280] Обнаруживаемые метки, которые могут быть связаны с любым описанным в данном документе антителом к ИЛ-7R, могут быть любого из различных типов, используемых в настоящее время в области диагностики in vitro, включая метки в виде частиц, включая золи металлов, такие как коллоидное золото, изотопы, такие как I¹²⁵ или Тс⁹⁹ представленные, например, пептидным хелатирующим агентом типа N₂S₂, N₃S или N₄, хромофорами, включая флуоресцентные маркеры, люминесцентные маркеры, фосфоресцентные маркеры и т.п., а также ферментными метками, которые превращают данный субстрат в обнаруживаемый маркер, и полинуклеотидными метками, которые выявляются после амплификации, например, с помощью полимеразной цепной реакции. Подходящие ферментные метки включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и т.п. Например, метка может быть ферментом щелочной фосфатазой, обнаруживаемой путем измерения наличия или образования хемилюминесценции после превращения 1,2-диоксетановых субстратов, таких как адамантилметоксифосфорилоксифенилдиоксетан (AMPPD), динатрий 3-(4-(метоксиспиро{1,2-диоксетан-3,2'-(5'-хлор)трицикло{3.3.1.1 3,7}декан}-4-ил)фенилфосфат (CSPD), а также CDP и CDP-STAR® или другие люминесцентные субстраты, хорошо известные специалистам в данной области техники, например, хелаты подходящих лантаноидов, таких как тербий (III) и европий (III). Средство обнаружения определяется выбранной меткой. Обнаружение метки или продуктов ее реакции может быть достигнуто невооруженным глазом в случае, если метка представляет собой твердые частицы и накапливается на соответствующих уровнях, или с помощью таких инструментов, как спектрофотометр, люминометр, флуориметр и т.п.в соответствии со стандартной практикой.

[0281] В некоторых вариантах осуществления способы конъюгации приводят к связям, которые являются по существу (или почти) неиммуногенными, например, пептидные (т.е. амидные), сульфидные (пространственно затрудненные), дисульфидные, гидразоновые и эфирные связи. Эти связи почти неиммуногенны и демонстрируют разумную стабильность в сыворотке (см., например, Senter, P.D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886).

[0282] В зависимости от биохимической природы фрагмента и антитела можно использовать разные стратегии конъюгации. В случае если полипептид является природным или получен рекомбинантным способом и содержит от 50 до 500 аминокислотных остатков, специалист в данной области техники может легко следовать стандартным процедурам, описывающим химию синтеза белковых конъюгатов, описанным в руководствах (см., например, Hackenberger, С.P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). В одном варианте осуществления используется реакция малеинимидного фрагмента с остатком цистеина в антителе или фрагменте. Эта реакция связывания является особенно подходящей в случае, например, использования Fab или Fab'-фрагмента антитела. Альтернативно, в одном варианте осуществления проводят связывание с С-терминальным концом антитела или фрагмента. С-терминальная модификация белка, например, фрагмента Fab, может быть выполнена как описано в (Sunbul, М. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).

[0283] В целом, сайт-специфическая реакция и ковалентное связывание основаны на преобразовании природной аминокислоты в аминокислоту с реакционной способностью, которая ортогональна реакционной способности других присутствующих функциональных групп. Например, конкретный цистеин в контексте редкой последовательности может ферментативно преобразован в альдегид (см. Frese, М.A., and Dierks, Т., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). Также возможно получить желаемую модификацию аминокислоты, используя специфическую ферментативную реактивность определенных ферментов с природной аминокислотой в данном контексте последовательности (см., например, Taki, М. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; и катализируемое протеазой образование связей С-N используется Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403). Сайт-специфическое взаимодействие и ковалентное связывание также может быть достигнуто путем селективной реакции концевых аминокислот с соответствующими модифицирующими реагентами.

[0284] Реакционная способность N-терминального цистеина с бензонитрилами (см. Ren, Н. et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) может быть использована для достижения сайт-специфического ковалентного связывания.

[0285] Нативное химическое лигирование также может быть основано на С-терминальных остатках цистеина (Taylor, Е. Vogel; Imperiali, В, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).

[0286] В US 6437095 B1 описан способ конъюгации, который основан на более быстрой реакции цистеина в отрезке отрицательно заряженных аминокислот с цистеином, расположенным на участке положительно заряженных аминокислот.

[0287] Фрагмент также может быть синтетическим пептидом или пептидомиметиком. В случае химического синтеза полипептида во время такого синтеза могут быть включены аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью (см., например, de Graaf, A. J. et al, Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Поскольку большое разнообразие ортогональных функциональных групп имеется и может быть введено в синтетический пептид, конъюгация такого пептида с линкером является стандартной химической реакцией.

[0288] Чтобы получить мономеченый полипептид, конъюгат со стехиометрией 1:1 может быть отделен с помощью хроматографии от других побочных продуктов конъюгации. Эта процедура может быть облегчена с помощью меченного красителем элемента связывающей пары и заряженного линкера. При использовании этого типа меченого и сильно отрицательно заряженного элемента связывающей пары моноконъюгированные полипептиды легко отделяются от немеченых полипептидов и полипептидов, которые несут более одного линкера, поскольку разница в заряде и молекулярном весе может быть использована для разделения. Флуоресцентный краситель может быть полезен для очистки комплекса от несвязанных компонентов, например, меченого одновалентного связующего элемента.

[0289] В одном варианте осуществления фрагмент, присоединенный к антителу к ИЛ-7R, выбран из группы, состоящей из связывающего фрагмента, фрагмента для мечения и биологически активного фрагмента.

[0290] Описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R также могут быть конъюгированы с терапевтическим агентом с образованием иммуноконъюгата, такого как конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). Подходящие терапевтические агенты включают антиметаболиты, алкилирующие агенты, связывающие малые бороздки ДНК, интеркаляторы ДНК, сшивающие агенты ДНК, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы ядерного экспорта, ингибиторы протеасом, ингибиторы топоизомеразы I или II, ингибиторы белков теплового шока, ингибиторы тирозинкиназы, антибиотики и антимитотические агенты. В ADC антитело и терапевтический агент предпочтительно конъюгированы через расщепляемый линкер, такой как пептидиловый, дисульфидный или гидразоновый линкер. В других вариантах осуществления линкер представляет собой пептидильный линкер, такой как Val-Cit, Ala-Vai, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 30), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, или Glu. ADC могут быть получены, как описано в патентах США №№7087600; 6989452; и 7129261; публикациях РСТ WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; и WO 08/103693; патентных публикациях США 20060024317; 20060004081; и 20060247295.

[0291] Антитела к ИЛ-7R, например, описанные в данном документе, также можно использовать для обнаружения ИЛ-7Rα, такого как ИЛ-7Rα человека, например, ИЛ-7Rα человека, в тканях или образцах тканей. Антитела можно использовать, например, в анализе методом ИФА или в проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R приводят в контакт с клетками, например, клетками в ткани, в течение времени, подходящего для возникновения специфического связывания, а затем с реагентом, например, антителом, которое обнаруживает антитело к ИЛ-7R. Иллюстративные анализы представлены в примерах. Антитело к ИЛ-7R может быть полностью человеческим антителом или может быть химерным антителом, таким как антитело, имеющее вариабельные области человека и константные области мыши или их часть. Этапы промывки могут быть включены после инкубации с антителом и/или реагентом обнаружения. Антитела к ИЛ-7R для использования в этих методах не обязательно должны быть связаны с меткой или агентами обнаружения, поскольку можно отдельно использовать агент обнаружения.

[0292] Другие применения антител к ИЛ-7R, например, в качестве монотерапии или комбинированной терапии, представлены в другом месте данного документа, например, в разделе, относящемся к терапевтическим применениям.

VIII. Биспецифические молекулы

[0293] Описанные в данном документе антитела можно использовать для образования биспецифических молекул. Описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R может быть дериватизировано или связано с другой функциональной молекулой, например, с другим пептидом или белком (например, с другим антителом или лигандом для рецептора), для создания биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя разными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Было описано, что различные цитокины играют важную роль в возникновении многих воспалительных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают ФНО-а, TLla, ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-18, ИЛ-12, ИЛ-23, ИЛ-17 и ИЛ-27. Sanchez-Munoz F., et al., World J Gastroenterol 14(27): 4280-4288 (2008). Как описано выше, регуляторные Т-клетки также считаются важными при лечении воспалительных заболеваний. Некоторые из цитокинов, которые, как известно, играют важную роль в индукции регуляторных Т-клеток, включают ТФР-бета, ИЛ-10 и ИЛ-2. Hoeppli R.E., et al., Front Immunol 6:61 (2015). Соответственно, описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R могут быть связаны с антителом, которое специфически связывается с любым из вышеуказанных цитокинов и тем самым регулирует начало воспалительных заболеваний и/или индукцию регуляторных Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R могут быть связаны с антителом, которое лечит заболевание или нарушение, например, воспалительное заболевание. Неограничивающие примеры таких антител включают натализумаб (TYSABRI®), инфликсимаб, адалимумаб, устекинумаб, голимумаб, тоцилизумаб, ведолизумаб, секокинумаб.

[0294] Описанное в данном документе антитело может быть получено или связано с более чем еще одной функциональной молекулой для образования мультиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями; такие полиспецифические молекулы также охватываются термином «биспецифическая молекула», который используется в данном документе. Для создания биспецифической молекулы, описанной в данном документе, описанное в данном документе антитело может быть функционально присоединено (например, посредством химического связывания, сцепления генов, нековалентного связывания или каким-либо иным методом связывания) к одной или нескольким другим связывающим молекулам, таким как другое антитело, его антигенсвязывающую часть, пептид или связывающий миметик, с получением биспецифической молекулы.

[0295] Соответственно, в данном документе представлены биспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере одну первую специфичность связывания для ИЛ-7Rα и вторую специфичность связывания для второго эпитопа-мишени. В некоторых вариантах осуществления биспецифические молекулы могут дополнительно включать третью специфичность связывания.

[0296] В некоторых вариантах осуществления биспецифические молекулы, описанные в данном документе, содержат в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело, включая, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, или одноцепочечный Fv (scFv). Антитело также может быть димером легкой цепи или тяжелой цепи, или любым его минимальным фрагментом, таким как Fv или одноцепочечной конструкцией, как описано в Ladner et al., патенте США №4946778, содержание которого специально включено в посредством ссылки.

[0297] Хотя человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые можно использовать в биспецифических молекулах, описанных в данном документе, представляют собой мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.

[0298] Описанные в данном документе биспецифические молекулы могут быть получены конъюгированием составляющих специфичностей связывания с использованием способов, известных в данной области техники. Описанные в данном документе биспецифические молекулы могут быть получены конъюгированием составляющих специфичностей связывания с использованием способов, известных в данной области техники. Если молекулами, обладающими специфичностью связывания, являются белки или пептиды, то для ковалентной конъюгации может быть использован ряд связывающих или сшивающих агентов. Примеры сшивающих агентов включают белок А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис (2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогаксан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. (1984) J. Exp.Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985)Prac. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают способы, описанные в Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83), и Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Некоторые конъюгирующие агенты представляют собой SATA и сульфо-SMCC, оба доступны от Pierce Chemical Со. (Рокфорд, штат Иллинойс).

[0299] Когда специфичностями связывания являются антитела, они могут быть конъюгированы посредством сульфгидрильного связывания шарнирных областей С-конца двух тяжелых цепей. В конкретном варианте осуществления шарнирная область модифицируется, чтобы содержать нечетное количество сульфгидрильных остатков, предпочтительно один, перед конъюгацией.

[0300] Альтернативно, обе специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе, экспрессировать и собирать в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод особенно полезен, когда биспецифическая молекула представляет собой мкАт х мкАт, мкАт х Fab, мкАт х (scFv)₂, Fab х F(ab')₂ или лиганд х Fab-слитый белок. Биспецифическое антитело может включать антитело, содержащее scFv на С-конце каждой тяжелой цепи. Описанная в данном документе биспецифическая молекула может быть одноцепочечной молекулой, содержащей одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечной биспецифической молекулой, содержащей две детерминанты связывания. Биспецифические молекулы могут включать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США №5260203; патенте США №5455030; патенте США №4881175; патенте США №5132405; патенте США №5091513; патенте США №5476786; патенте США №5013653; патенте США№5258498; и патенте США№5482858.

[0301] Связывание биспецифических молекул с их конкретными мишенями может быть подтверждено с использованием признанных в данной области техники методов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммуноанализ (РИА), анализ методом проточной цитометрии, биоанализ (например, ингибирование роста) или анализ методом вестерн-блоттинга. При помощи каждого из этих анализов, как правило, определяют присутствие представляющих особый интерес комплексов белок-антитело с использованием меченого реагента (например, антитела), специфичного для представляющего интерес комплекса.

IX. Наборы

[0302] В данном документе предложены наборы, содержащие одно или более антител к ИЛ-7R, описанных в данном документе, или их антигенсвязывающие части, их биспецифические молекулы или иммуноконъюгаты. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предложена фармацевтическая упаковка или набор, включающая один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций, описанных в данном документе, такими как одно или более антител, предложенных в данном документе, или их антигенсвязывающая часть, необязательно инструкция по использованию. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, и любое профилактическое или терапевтическое средство, например, описанное в данном документе.

X. Фармацевтические композиции

[0303] В данном документе предложены композиции, содержащие описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающую часть, имеющую желаемую степень чистоты в физиологически приемлемом носителе, эксципиенте или стабилизаторе (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания). Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN®, PLURONICS® или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

[0304] В конкретном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат антитело или его антигенсвязывающую часть, биспецифическую молекулу или иммуноконъюгат, описанные в данном документе, и, возможно, один или более дополнительных профилактических или терапевтических агентов в фармацевтически приемлемом носителе. В конкретном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат эффективное количество антитела или его антигенсвязывающей части, описанного в данном документе, и, возможно, один или более дополнительных профилактических терапевтических агентов в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых вариантах осуществления антитело является единственным активным ингредиентом, включенным в фармацевтическую композицию. Описанные в данном документе фармацевтические композиции могут быть полезны для модулирования (например, снижения или ингибирования) активности ИЛ-7 в Т-клетке (например, патогенной Т-клетке) и лечении заболевания или нарушения, такого как воспалительное заболевание, например, воспалительное заболевание кишечника.

[0305] Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. В некоторых вариантах осуществления носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула, может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.

[0306] Соответственно, одной целью данного изобретения является предоставление фармацевтического состава, который улучшает стабильность антител к ИЛ-7R и, таким образом, обеспечивает их длительное хранение. В некоторых вариантах осуществления описанный в данном документе фармацевтический состав содержит: (а) антитело к ИЛ-7R; (b) буферный агент; (с) стабилизирующий агент; (d) соль; (е) объемообразующий агент; и/или (f) поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав стабилен в течение по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 5 лет или более. В некоторых вариантах осуществления состав является стабильным при хранении при 4°С, 25°С или 40°С.

Буферный агент

[0307] Буферные агенты, полезные в настоящем изобретении, могут быть слабой кислотой или основанием, используемыми для поддержания кислотности (рН) раствора около выбранного значения после добавления другой кислоты или основания. Подходящие буферные агенты могут максимизировать стабильность фармацевтических составов, поддерживая контроль рН состава. Подходящие буферные агенты также могут гарантировать физиологическую совместимость или оптимизировать растворимость. Реология, вязкость и другие свойства также могут зависеть от рН состава. Стандартные буферные агенты включают, но не ограничиваются ими, гистидин, цитрат, сукцинат, ацетат и фосфат. В некоторых вариантах осуществления буферный агент включает гистидин (например, L-гистидин) с изотоническими агентами и потенциальной регуляцией рН кислотой или основанием, известным в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления буферный агент представляет собой L-гистидин. В некоторых вариантах осуществления рН состава поддерживается от около 2 до около 10 или от около 4 до около 8.

Стабилизирующий агент

[0308] Стабилизирующие агенты добавляют к фармацевтическому продукту, чтобы стабилизировать этот продукт. Такие агенты могут стабилизировать белки разными способами. Обычные стабилизирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, аминокислоты, такие как глицин, аланин, лизин, аргинин или треонин, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, трегалоза, раффиноза или мальтоза, полиолы, такие как глицерин, маннит, сорбит, циклодекстрины. или декстраны любого вида и молекулярной массы, или ПЭГ. В одном аспекте изобретения стабилизирующий агент выбирают для того, чтобы максимизировать стабильность полипептида FIX в лиофилизированных препаратах. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующий агент представляет собой сахарозу и/или аргинин.

Объемообразующий агент

[0309] Объемообразующие агенты могут быть добавлены к фармацевтическому продукту для увеличения объема и массы продукта, тем самым облегчая его точное дозирование и обращение с ним. Обычные объемообразующие агенты включают, но не ограничиваются ими, лактозу, сахарозу, глюкозу, маннит, сорбит, карбонат кальция или стеарат магния.

Поверхностно-активное вещество

[0310] Поверхностно-активные вещества представляют собой амфипатические вещества с лиофильными и лиофобными группами. Поверхностно-активное вещество может быть анионным, катионным, цвиттерионным или неионогенным. Примеры неионных поверхностно-активных веществ включают, но не ограничиваются ими, алкилэтоксилат, нонилфенолэтоксилат, этоксилат амина, полиэтиленоксид, полипропиленоксид, жирные спирты, такие как цетиловый спирт или олеиловый спирт, кокамид МЭА, кокамид ДЭА, полисорбаты или додецилдиметилоксид. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80.

[0311] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав по настоящему изобретению содержит:

(a) от около 0,25 мг/мл до 250 мг/мл (например, от 10 до 200 мг/мл) антитела к ИЛ-7R;

(b) около 20 мМ гистидина;

(c) около 260 мМ сахарозы;

(d) около 0,5 мМ DTPA; и

(e) около 0,05% Твин-80.

[0312] Состав может дополнительно содержать одно или более из буферной системы, консерванта, тонизирующего агента, хелатирующего агента, стабилизатора и/или поверхностно-активного вещества, а также их различные комбинации. Использование консервантов, изотонических агентов, хелатирующих агентов, стабилизаторов и поверхностно-активных веществ в фармацевтических композициях хорошо известно специалисту в данной области техники. Ссылка может быть сделана на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995.

[0313] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой водный состав. Такой состав, как правило, представляет собой раствор или суспензию, но может также включать коллоиды, дисперсии, эмульсии и многофазные материалы. Термин «водный состав» определяется как состав, содержащий по меньшей мере 50% мае. воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» определяется как раствор, содержащий по меньшей мере 50% мас. воды, а термин «водная суспензия» определяется как суспензия, содержащая по меньшей мере 50% мас. воды.

[0314] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, к которому врач или пациент добавляют растворители и/или разбавители перед использованием.

[0315] Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, также можно вводить в рамках комбинированной терапии, т.е. в комбинации с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R в комбинации, по меньшей мере, с одним другим терапевтическим агентом. Примеры терапевтических агентов, которые можно использовать в комбинированной терапии, могут включать другие соединения, лекарственные средства и/или агенты, используемые для лечения заболевания или расстройства (например, воспалительного расстройства). Такие соединения, лекарственные средства и/или агенты могут включать, например, противовоспалительные лекарственные средства или антитела, которые блокируют или снижают продукцию воспалительных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты могут включать антитело к IP-10, антитело к ФНО-а (например, адалимумаб (HUMIRA®), голимумаб (SIMPONI®), инфликсимаб (REMICADE®), цертолизумаб пегол (CIMZIA®)), интерферон бета-1а (например, AVONEX®, REBIF®), интерферон бета-1b (например, BETAS Е RON®, EXTAVIA®), глатирамера ацетат (например, COPAXONE®, GLATOPA®), митоксантрон (например, NOVANTRONE®), нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), анальгетики, кортикостероиды и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты могут включать соединения, лекарственные средства и/или агенты, которые могут индуцировать образование регуляторных Т-клеток (например, индуцированных регуляторных Т-клеток). Неограничивающие примеры таких терапевтических агентов включают ТФР-бета, ИЛ-10, ИЛ-2 и их комбинации.

[0316] Фармацевтические соединения, описанные в данном документе, могут включать одну или более фармацевтически приемлемых солей. «Фармацевтически приемлемая соль» относится к соли, которая сохраняет необходимую биологическую активность родительского соединения и не приводит к каким-либо нежелательным токсическим эффектам (см., например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодисто водородная, фосфористая и тому подобные, а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и тому подобные. Основные соли включают в себя соли, полученные из щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и тому подобное, а также из нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и тому подобное.

[0317] Описанная в данном документе фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобное; и (3) хелатирующие металлы агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобное.

[0318] Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях, описанных в данном документе, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.

[0319] Эти композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно гарантировать с помощью как процедур стерилизации, см. выше, так и посредством включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.д. Также может быть желательно включать в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Кроме того, продленную абсорбцию инъекционной фармацевтической формы можно обеспечивать путем включения агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

[0320] Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для предусмотренного для немедленного приема приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Применение таких сред и агентов в отношении фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среды или агенты являются несовместимыми с активным соединением, предусматривается их применение в фармацевтических композициях описанных в данном документе. Фармацевтическая композиция может содержать или не содержать консервант. В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.

[0321] Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.д.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения материалов для покрытия, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях композиции могут включать изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Продленное всасывание инъекционных композиций можно обеспечить путем включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например, моностеаратных солей и желатина.

[0322] Стерильные инъекционные растворы можно готовить путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных в данном документе. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов некоторыми способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые обеспечивают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный ингредиент из его ранее стерильно профильтрованного раствора.

[0323] Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от субъекта, которого лечат, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом-носителем для получения единичной дозированной формы, обычно будет таким количеством композиции, которое оказывает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов это количество будет составлять от около 0,01 до около 99 процентов активного ингредиента, от около 0,1 до около 70 процентов, или от около 1 до около 30 процентов активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

[0324] Режимы дозировки подбираются так, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, может быть введена одноразовая доза, несколько разделенных доз может вводиться с течением времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как указано в зависимости от терапевтической ситуации. В частности, может быть выгодным приготовление парентеральных композиций в единичной дозированной форме для удобства введения и однородности дозировки. В контексте данного документа единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для подлежащих лечению субъектов; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы оказывать необходимое терапевтическое действие, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных дозированных форм, описанных в данном документе, диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, и (b) ограничений, при приготовлении такого активного соединения в случае индивидуальной чувствительности.

[0325] Для введения антитела к ИЛ-7R, например, описанного в данном документе, доза находится в диапазоне от около 0,0001 до 100 мг/кг, а чаще от 0,01 до 5 или 10 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 0,3 мг/кг массы тела, 1 мг/кг массы тела, 3 мг/кг массы тела, 5 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в диапазоне 1-10 мг/кг. Иллюстративная схема лечения включает введение один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз в месяц, один раз каждые 3 месяца или один раз каждые три-6 месяцев.

[0326] В некоторых вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R вводят в постоянной дозе (схема введения постоянных доз). В других вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R вводят в фиксированной дозе с другим антителом. В определенных вариантах осуществления антитело к ИЛ-7R вводят в дозе, основанной на массе тела.

[0327] В некоторых способах два или более моноклональных антитела с разной специфичностью связывания вводятся одновременно, в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в пределах указанных диапазонов. Антитело обычно вводят несколько раз. Интервал между разовыми дозами может представлять собой, например, неделю, месяц, три месяца или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, как показано при измерении уровня антител в крови к целевому антигену у пациента. В некоторых способах дозировка регулируется для достижения концентрации антител в плазме около 1-1000 пг/мл, а в некоторых способах - около 25-300 пг/мл.

[0328] Антитело можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полувыведения антитела у пациента. В общем, человеческие антитела показывают самый длительный период полувыведения, за ними следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела. Дозировка и частота приема могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических целях относительно небольшая доза вводится через относительно нечастые интервалы в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей своей жизни. В терапевтических целях иногда требуется относительно высокая доза с относительно короткими интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не уменьшится или не прекратится, и пока у пациента не появится частичное или полное улучшение симптомов заболевания. После этого пациенту может быть назначена профилактическая схема лечения.

[0329] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях, описанных в данном документе, можно варьировать, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсического эффекта для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций, описанных в данном документе, или их сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, приема других лекарств, соединений и/или материалов, используемых в сочетании с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, массы, патологического состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в медицине.

[0330] Композицию, описанную в данном документе, можно вводить одним или более путями введения с использованием одного или более способов, известных в данной области техники. Для специалиста в данной области техники очевидно, что путь и/или режим введения будет варьироваться в зависимости от необходимых результатов. Пути введения описанных в данном документе антител к ИЛ-7R могут включать внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. В контексте данного документа выражение «парентеральное введение» означает режим введения, отличный от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, интрадермальную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

[0331] Альтернативно, описанное в данном документе антитело можно потенциально вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или мукозальный путь введения, например интраназально, перорально, вагинально, ректально, сублингвально или местно.

[0332] Активные соединения можно готовить с носителями, которые будут обеспечивать защиту соединения от быстрого высвобождения, такими как составы для контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких составов запатентованы или обычно известны специалистам в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0333] Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в конкретном варианте осуществления описанная в данном документе терапевтическая композиция может вводиться с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, например, устройств, описанных в патентах США №№5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей для использования с антителами к ИЛ-7R, описанными в данном документе, включают: патент США №4487603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для подачи лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США №4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; патент США №4447233, в котором описан медицинский инфузионный насос для доставки лекарственного средства с точно определенной скоростью инфузии; патент США №4447224, в котором описан имплантируемый инфузионный аппарат с переменной скоростью потока для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США №4439196, в котором описана осмотическая система для доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отделения; и патент США №4475196, в котором описана осмотическая система для доставки лекарственного средства. Эти патенты включены в данный документ посредством ссылки. Многие такие имплантаты, системы для доставки и модули известны специалистам в данной области техники.

XI. Применение и способы

[0334] Антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению и композиции, содержащие такие антитела (например, фармацевтическая композиция, составы, полинуклеотиды, векторы и клетки), могут быть использованы для лечения воспалительного заболевания (например, путем модуляции отношения регуляторных Т-клеток к эффекторным Т-клеткам у субъекта).

[0335] Соответственно, в одном аспекте данное изобретение обеспечивает способы лечения воспалительного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту терапевтически эффективной дозы антитела к ИЛ-7R. Примеры воспалительных заболеваний, которые можно лечить с помощью данных антител к ИЛ-7R, включают, но не ограничиваются ими, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона (БК), язвенный колит (ЯК), синдром раздраженного кишечника, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатический артрит, системную красную волчанку (СКВ), волчаночный нефрит, диабет I типа, Болезнь Грейвса, рассеянный склероз (PC), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическую болезнь сердца, хроническую обструктивную болезнь легких, интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермию, системный склероз, остеоартрит, атопический дерматит, болезнь хозяина, болезнь «трансплантат против хозяина», аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, аллергию, астму и другие аутоиммунные заболевания, которые являются результатом острого или хронического воспаления.

[0336] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R подходят для использования при лечении людей с воспалительным заболеванием кишечника. Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) представляет собой заболевание, которое может поражать любую часть желудочно-кишечного тракта от рта до ануса, вызывая широкий спектр симптомов. ВЗК в первую очередь вызывает боль в животе, диарею (которая может быть кровянистой), рвоту или потерю веса, но также может вызывать осложнения за пределами желудочно-кишечного тракта, такие как кожная сыпь, артрит, воспаление глаз, усталость и отсутствие концентрации. Пациентов с ВЗК можно разделить на два основных класса: пациентов с язвенным колитом (ЯК) и пациентов с болезнью Крона (БК). БК, как правило, поражает подвздошную и толстую кишку, но может поражать любую область кишечника и часто носит прерывистый характер (целевые области болезни распространяются по кишечнику). ЯК всегда вовлекает прямую кишку (толстую кишку) и носит более непрерывный характер. При БК воспаление носит трансмуральный характер, приводя к абсцессам, свищам и стриктурам, тогда как при ЯК воспаление обычно ограничивается слизистой оболочкой. Не существует известного фармацевтического или хирургического лечения болезни Крона, тогда как некоторых пациентов с ЯК можно вылечить хирургическим удалением толстой кишки. Варианты лечения ограничиваются контролем над симптомами, поддержанием ремиссии и предотвращением рецидива. Эффективность при воспалительном заболевании кишечника в клинике может быть измерена как снижение балла по индексу активности болезни Крона (CDAI) для БК, которая представляет собой шкалу оценки, основанную на лабораторных тестах и опроснике качества жизни. В животных моделях эффективность в основном измеряется увеличением массы, а также индексом активности заболевания (DAI), который представляет собой комбинацию консистенции стула, массы и крови в стуле.

[0337] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению подходят для применения при лечении пациентов с ревматоидным артритом. Ревматоидный артрит (РА) представляет собой системное заболевание, которое поражает почти, если не все тело, и является одной из наиболее распространенных форм артрита. Для него характерно воспаление сустава, которое вызывает боль, скованность, тепло, покраснение и припухлость. Это воспаление является следствием проникновения воспалительных клеток в суставы, и эти воспалительные клетки выделяют ферменты, которые могут расщеплять кости и хрящи. В результате это воспаление может привести к серьезному повреждению костей и хрящей, а также к ухудшению состояния суставов и сильной боли, а также к другим физиологическим эффектам. Пораженный сустав может потерять форму и выравнивание, что приведет к боли и потере подвижности. В данной области известно несколько животных моделей ревматоидного артрита. Например, в модели коллаген-индуцированного артрита (КИА) у мышей развивается воспалительный артрит, напоминающий ревматоидный артрит человека. Поскольку КИА имеет сходные иммунологические и патологические характеристики с РА, это делает его подходящей моделью для скрининга потенциальных противовоспалительных соединений человека. Эффективность в этой модели измеряется уменьшением отека суставов. Эффективность при РА в клинике измеряется способностью уменьшать симптомы у пациентов, которая измеряется как комбинация отека суставов, скорости оседания эритроцитов, уровней С-реактивного белка и уровней сывороточных факторов, таких как антитела к цитруллинированному белку.

[0338] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R, описанные в настоящем документе, подходят для использования при лечении людей с псориазом. Псориаз представляет собой воспалительное заболевание кожи, опосредованное Т-клетками, которое может вызывать значительный дискомфорт. Это заболевание, от которого в настоящее время нет лекарственного средства, и оно поражает людей всех возрастов. Хотя люди с псориазом легкой степени тяжести часто могут контролировать свое заболевание с помощью местных препаратов, более миллиона пациентов во всем мире нуждаются в лечении ультрафиолетом или при помощи системной иммуносупрессивной терапии. К сожалению, неудобства и риски ультрафиолетового излучения и токсичность многих методов лечения ограничивают их долгосрочное использование. Более того, у пациентов, как правило, наблюдается рецидив псориаза, который в некоторых случаях восстанавливается вскоре после прекращения иммуносупрессивной терапии. Недавно разработанная модель псориаза, основанная на переносе CD4⁺ Т-клеток, имитирует многие аспекты псориаза человека и, следовательно, может использоваться для идентификации соединений, подходящих для лечения псориаза (Davenport et al., Internal. Immunopharmacol Т. 653-672, 2002). Эффективность в этой модели измеряется уменьшением кожной патологии с использованием балльной системы. Аналогичным образом эффективность у пациентов оценивается по уменьшению кожной патологии.

[0339] В некоторых вариантах осуществления антитела к ИЛ-7R подходят для использования при лечении людей с псориатическим артритом. Псориатический артрит (ПА) представляет собой тип воспалительного артрита, который возникает у некоторых пациентов с псориазом. У этих пациентов кожная патология/симптомы сопровождаются отеком суставов, аналогичным тому, который наблюдается при ревматоидном артрите. Он характеризуется пятнистыми, выпуклыми, красными воспаленными участками кожи с шелушением. Псориаз часто поражает кончики локтей и колен, кожу головы, пупок, а также области гениталий или ануса. Примерно у 10% пациентов с псориазом также развивается ассоциированное воспаление суставов.

[0340] В рамках настоящего раскрытия профилактическое, паллиативное, симптоматическое и/или лечебное лечение может представлять собой отдельные аспекты по изобретению. Антитело по изобретению можно вводить парентерально, например внутривенно, например внутримышечно, например, подкожно. Альтернативно, антитело по изобретению можно вводить непарентеральным путем, например, перорально или местно. Антитело по изобретению можно вводить для профилактики. Антитело по изобретению можно вводить в терапевтических целях (по необходимости).

[0341] Все ссылки, процитированные выше, а также все ссылки, процитированные в данном документе, полностью включены в данный документ посредством ссылки.

[0342] Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Характеристика человеческого антитела к ИЛ-7R

[0343] Описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R (содержащее VH, как указано в SEQ ID NO: 19 и VL, как указано в SEQ ID NO: 20, см. таблицу 12) («Антитело А»), исследовали на связывание с экспрессирующими ИЛ-7Rα клетками. ИЛ-7Rα экспрессируется в основном на Т-клетках человека и в меньшей степени на моноцитах.

[0344] Как показано в Таблице 1 (ниже), Антитело А способно связывать ИЛ-7Rα, экспрессируемый на различных подгруппах Т-клеток (CD4⁺ CD45RA⁺, CD4⁺CD45RA^-, CD8⁺CD45RA⁺, и CD8⁺CD45RA^-) из цельной крови (значение ЕС50 в диапазоне от около от 1,4 до 3,3 нМ). Более того, Антитело А не агонизировало сигналинг ИЛ-7Rα (см. Таблицу 2) и было способно эффективно блокировать связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на CD4⁺CD45RA⁺ Т-клетках (как измерено по активации pSTAT5). По сравнению с эталонным антителом к ИЛ-7R («PFE A3312F»), антитело А было намного более эффективным в блокировании связывания ИЛ-7 с ИЛ-7Rα. Когда CD4⁺CD45RA⁺ Т-клетки из цельной крови стимулировали ИЛ-7 (например, 2,0 нг/мл) в присутствии Антитела А, активация pSTAT5 была минимальной (IC50=2,1±1,4 нМ). Напротив, с PFE A3312F активация pSTAT5 была значительно выше (IC50=15,8±4,0).

[0345] Антитело А также отличалось от эталонного антитела своей способностью блокировать TSLP-опосредованную активацию моноцитов. Как показано в таблице 1 (последняя строка), моноциты, стимулированные TSLP в присутствии PFE A3312F, не смогли продуцировать моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (МСР-1) (IC50=0,08±0,3 нМ), что позволяет предположить, что PFE A3312F было способно связываться с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на моноцитах, и эффективно блокировать связывание TSLP с ИЛ-7Rα. Напротив, с антителом А моноциты, стимулированные TSLP, продуцировали значительно более высокие количества МСР1 (IC50=24±4,5).

[0346] Затем, чтобы оценить, связана ли неспособность блокировать стимулированную TSLP активацию моноцитов проблемами связывания, цельную кровь от человеческих доноров инкубировали с различными концентрациями антитела А. Затем определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) связывания антитела A. ИЛ-7Rα, экспрессируемого на клетках, отличных от Т-клеток, (CD3^-), измеряли с помощью проточной цитометрии. Как показано на Фиг. 1, даже при таких высоких концентрациях, как 70 нМ, было минимальное связывание антитела А с клетками, отличными от Т-клеток.

[0347] В совокупности приведенные выше данные демонстрируют, что, по сравнению с другими известными антителами (PFE A3312F), описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R (Антитело А) более эффективно блокирует связывание ИЛ-7 и является селективным в отношении ИЛ-7Rα, экспрессируемого на Т клетки, но не на клетках, отличных от Т-клеток, (например, моноциты и другие CD3^- клетки в цельной крови).

Пример 2. Анализ агонистической активности антитела к ИЛ-7R

[0348] Затем, чтобы оценить, может ли связывание антитела к ИЛ-7R индуцировать сигналинг ИЛ-7Rα, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и цельную кровь инкубировали с различными концентрациями антитела А (100, 50, 25, 13, 6, 3, 2, 1, и 0 нМ). Антитело изотопического контроля и ИЛ-7 (2 нМ) использовали в качестве отрицательного и положительного контролей, соответственно.

[0349] Как показано в таблице 2, при всех протестированных концентрациях антитело А не индуцировало активацию pSTAT5 по сравнению с отрицательным контролем. Этот результат демонстрирует, что антитело А не агонизирует сигналинг при связывании с ИЛ-7Rα.

Пример 3. Перекрестная реактивность антитела к ИЛ-7R у яванского макака

[0350] Для оценки перекрестной реактивности антитела А аффинность связывания с ИЛ-7Rα человека и яванского макака оценивали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Вкратце, эксперименты проводили на приборе BIACORE™ Т200 (GE Healthcare, Чикаго, штат Иллинойс, США) в рабочем буфере, состоящем из 10 мМ NaPO4, 130 мМ NaCl, 0,05% р20 (PBS-T) при рН 7,4 или 6,0. Поверхность чипа подготавливали путем иммобилизации белка А на проточной кювете 1, 2, 3 и 4 сенсорного чипа СМ5 с использованием этил(диметиламинопропил)карбодиимида/NHS до плотности 4000 RU. Антитело А захватывали, используя время контакта 30 секунд при 10 мкл/мин. Очищенные конструкции внеклеточного домена (созданные самостоятельно) His-меченного человеческого ИЛ-7R или ИЛ-7R яванского макака тестировали на связывание с использованием 2-кратного серийного разведения от 500 нМ до 7,8 нМ с временем ассоциации 180 с и временем диссоциации 360 с при 30 мкл/мин. Регенерацию между циклами осуществляли с помощью 2 инъекций по 30 секунд 10 мМ глицин-HCl, рН 1,5. Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation (GE Healthcare) и соответствовали модели Ленгмюра 1:1.

[0351] Как показано в таблице 3, антитело А способно связываться как с ИЛ-7Rα человека, так и с ИЛ-7Rα яванского макака с аналогичной аффинностью. Например, при рН 7,4 антитело А связывалось с ИЛ-7Rα человека и яванского макака со значениями KD 1,3 нМ и 1,7 нМ, соответственно. При рН 6,0 связывание было в около 4 раза слабее, что позволяет предположить, что связывание анти-ИЛ-7R как с ИЛ-7Rα человека, так и с ИЛ-7Rα животных зависит от рН. Напротив, PFE A3312F не демонстрировал рН-зависимого связывания со значениями KD 4,4 нМ при рН 7,4 и 3,9 нМ при рН 6,0. Анализ методом ППР также продемонстрировал очень слабое связывание со всеми FcγR человека и яванского макака при нейтральном рН и более сильное связывание при рН 6,0, как и ожидалось для изотипа hIgG1.3f.

[0352] Для подтверждения приведенных выше данных о перекрестной реактивности также оценивали клеточное связывание и функциональную блокаду. Вкратце, однократную дозу (0,1, 0,5 или 3,0 мг/кг) антитела А вводили яванским макакам. Затем, на 8-й день после введения, от животных выделяли МКПК. Для измерения способности блокировать связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα яванского макака, МКПК стимулировали рекомбинантным ИЛ-7 яванского макака (5 пМ) в течение 15 минут, а активность pSTAT5 и занятость рецептора на CD4⁺ Т-клетках оценивали с помощью проточной цитометрии.

[0353] Как показано на ФИГ. 2А, при концентрации сывороточного антитела к ИЛ-7R около 310-350 нг/мл (~2,1-2,3 нМ) было занято более 95% ИЛ-7Rα, экспрессированного на CD4⁺ Т-клетках яванского макака. Аналогично, как показано на Фиг. 2В, наблюдалась прямая обратная корреляция между концентрацией антител к ИЛ-7R в сыворотке и активностью pSTAT5. При концентрации в сыворотке от 670 до 2200 нг/мл (4,5-15 нМ) ингибирование STAT5 превышало 90%. Основываясь на этих результатах, для полного блокирования ИЛ-7Rα in vivo потребуются минимальные концентрации приблизительно 2-15 нМ.

[0354] Приведенные выше данные в совокупности демонстрируют, что описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R (антитело А) полностью перекрестно реагирует у яванских макак и может эффективно связываться с индуцированным ИЛ-7 сигналингом ИЛ-7Rα яванского макака и блокировать его.

Пример 4. Дополнительные характеристики антитела к ИЛ-7R

[0355] Аналитические и биофизические характеристики Антитела А представлены в таблице 4.

[0356] Аналитические и биофизические свойства антитела А были оптимальными для продолжения разработки. Идентичность антитела подтверждали масс-спектрометрическим анализом (анализ массы исходного вещества и картирование пептидов). Антитело было мономерным на >99%, как было проверено с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии. Единственный сайт N-гликозилирования был подтвержден на N297 на тяжелой цепи с гликановым профилем, совпадающим с гликановым профилем экспрессируемых СНО моноклональных антител (G0F, GIF и G2F). Профиль зарядового варианта, определенный с помощью динамического изоэлектрического фокусирования, показал pI для основного пика при 8,5 (60%) с 34% кислотными и 6% основными вариантами. Термическая стабильность (Tm1=70,0°С, Tm2=75,4°С, Tm3=84,2°С) находилась в пределах диапазона для типичного человеческого моноклонального антитела IgG1.3f.

[0357] Характеристики стабильности антитела A приведены в таблице 5.

[0358] Предварительная оценка состава, включая поиск оптимального рН, буферного состава и эксципиентов, а также ускоренное исследование стабильности была выполнена для описанного в данном документе антитела к ИЛ-7R с использованием материала, производного от HEK. Никаких проблем с физической стабильностью не наблюдалось во время стресса, вызываемого замораживанием-оттаиванием, (5 циклов) в составе усеченной платформы (20 мМ гистидина, 260 мМ сахарозы, 0,05 мМ DTPA, рН 6,0) или из-за стрессов вызываемых перемешиванием, с или без поверхностно-активного вещества, при 150 мг/мл. Добавление поверхностно-активного вещества в ходе этих исследований не оценивали. Исследования форсированной деградации при 150 мг/мл проводили при 4, 25 и 40°С. Химические модификации в области CDR наблюдали в условиях наивысшего стресса (3 месяца при 40°С), что коррелировало с изменениями как KD, так и Rmax в анализе активности методом ППР. Незначительные химические изменения наблюдались на тех же сайтах CDR при хранении при 25°С. Никаких изменений в активности образцов, хранимых при 4 или 25°С, не наблюдалось. Ожидаемые изменения дезамидирования VSNK также не наблюдались.

[0359] Оценка реализуемости, выполненная с использованием материала, полученного из HEK, также продемонстрировала изменения, зависящие от времени и температуры, как для вариантов ВМВ, так и для НМВ (увеличение ~1%/месяц и ~1,3%/месяц, соответственно, при 40°С). ВМВ оставались неизменными при хранении при 4°С, увеличиваясь на 0,3%/месяц при 25°С. Образование НМВ, наблюдаемое при хранении при 40°С, характеризовалось точной массой как кумулятивная потеря 1 Fab, а также ветви Fab, предположительно в результате химического обрезания консервативной последовательности в верхней шарнирной области. Изменения в ВМВ и НМВ в этих исследованиях, полученных на основе HEK, находятся в пределах ожидаемых для мкАт IgG13 и поддерживают увеличение молекулы.

[0360] Ограничение вязкости для Антитела А было отмечено как препятствие при ранней оптимизации. Профиль вязкость-концентрация, определенный в ходе оценки состава, продемонстрировал вязкость 8 сП при 100 мг/мл и ~19 сП при 140 мг/мл. Основываясь на профиле вязкости Антитела А, было подсчитано, что концентрация ~125 мг/мл будет верхним пределом того, что можно было бы вводить шприцем с помощью обычного устройства.

Пример 5. Фармакокинетика (ФК) антитела к ИЛ-7R у мышей линии NOD/SCID-GAMMA (NSG) с переносом МКПК человека

[0361] Поскольку Антитело А не реагирует перекрестно с мышиным ИЛ-7Rα, мыши линии NSG с переносом МКПК человека позволили оценить влияние опосредованного мишенью клиренса на ФК. Кроме того, было показано, что Антитело А проявляет дифференциальную рН-зависимую аффинность связывания с ИЛ-7Rα, например, относительно PFE A3312F (см. Пример 3). Для мкАт, демонстрирующих короткий период полужизни из-за опосредованного мишенью клиренса, было продемонстрировано, что связывание с антигеном в зависимости от рН приводит к улучшенному ФК профилю. См. Igawa Т., et al., Nat Biotechnol 28(11): 1203-7 (2010). Таким образом, эту модель также использовали для оценки того, может ли рН-зависимое связывание мишени привести к улучшению фармакокинетики.

[0362] Вкратце, мышам линии NSG с переносом МКПК человека однократно вводили Антитело А или эталонное антитело PFE A3312F. Мышам внутривенно вводили одну из двух доз: 0,5 мг/кг или 5 мг/кг. Затем у мышей брали кровь в различные моменты времени после введения и определяли концентрацию антител в сыворотке. Как показано на Фиг. 3, ФК PFE A3312F была нелинейной, так как клиренс крови (CL) снизился в 5,7 раза между дозами 0,5 и 5 мг/кг (см. Таблицу 6), предположительно из-за опосредованного мишенью распределения лекарственного средства (TMDD). В то время как ФК Антитела А при 5 мг/кг была аналогична PFE A3 312F, значительное улучшение экспозиции наблюдали при более низкой дозе (0,5 мг/кг). Чтобы не связывать себя какой-либо одной теорией, поскольку опосредованный мишенью клиренс лекарственного средства, как правило, более очевиден в более низком диапазоне доз, улучшенная ФК, наблюдаемая при более низкой дозе, обусловлено дифференциальной рН-зависимой аффинностью связывания антитела к ИЛ-7R с ИЛ-7Rα.

Пример 6. Фармакокинетика (PK) антитела к ИЛ-7R у яванских макак

[0363] Для дополнительной оценки ФК Антитела А яванские макаки получали однократную дозу Антитела А или эталонного антитела PFE A3312F в одной из следующих доз: 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 3 мг/кг внутривенно. Затем у животных брали кровь в различные моменты времени после введения и сравнивали активность антител in vivo (ФК, ЗР и активацию pSTAT5 ex vivo).

[0364] Как показано на ФИГ. 4, у животных, которые получали >0,5 мг/кг любого из антител, антитела к лекарственным средствам (ADA) (пунктирная линия) выявлялись на 10-й день и после него, что приводило к более низким концентрациям антител в сыворотке (сплошная линия) у животных. Как показано на Фиг. 5, фармакокинетика Антитела А и PFE A3312F была нелинейной при тестируемых дозах, что позволяет предположить TMDD. Однако, как показано в таблице 7, средние экспозиции (AUC) Антитела А были выше (от 1,6 до 2,1 раза) по сравнению с PFE A3312F. Аналогичным образом, значения клиренса Антитела А также были выше: при дозах 0,1, 0,5 и 3 мг/кг значения составляли 1,15±0,20, 0,64±0,10 и 0,44±0,02 мл/ч/кг, соответственно, в то время как у A3312F. составили 1,76±0,22, 1,16±0,39 и 0,94±0,12 мл/ч/кг, соответственно (таблица 7).

[0365] Обнаружена хорошая корреляция между ингибированием pSTAT5 и концентрацией Антитела А в сыворотке у яванских макак. См. Фиг. 6. При увеличении экспозиции Антитела А (о чем свидетельствует увеличение концентрации антител в сыворотке) наблюдалось соответствующее снижение опосредованной ИЛ-7 активации pSTAT5. Это было верно для обеих обезьян, получивших настоящее антитело к ИЛ-7R или PFE А3312 (IC50=-2 нМ).

[0366] В течение 3-недельного периода оценки не было никаких клинических наблюдений, связанных с антителами к ИЛ-7R, или неблагоприятных эффектов на массу тела, гематологию (с лейкоцитарной формулой), клиническую химию сыворотки или фенотипирование T/B/NK-клеток (CD4⁺ и CD8⁺, показанные на Фиг. 7А-7С).

[0367] Приведенные выше результаты предполагают, что по сравнению с эталонным антителом описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R (Антитело А) имеет аналогичную активность in vivo, но демонстрирует улучшенную фармакокинетику у яванских макак с минимальными проблемами, связанными с токсичностью.

Пример 7. Анализ иммуногенности антитела к ИЛ-7R

[0368] Потенциальный риск иммуногенности Антитела А оценивали методами in silico, а также анализами пролиферации ДК: Т-клеток in vitro. Анализ iDAB in silico показал некоторый потенциал связывания для CDR3 VL и мутацию в каркасе в положении 71 VH от серина к фенилаланину (F71S). Анализ ДК: Т-клеточной пролиферации in vitro, который включал 40 доноров МКПК, инкубированных с дендритными клетками, обработанными Антителом А, показал значительные иммуногенные ответы (-30-50% доноров) для партий Антитела А, не относящихся к RACIR (см. Р1-066930-3 и Р1-066930-9 на Фиг. 8). Интересно, что эти результаты коррелировали с наблюдаемой тяжестью ADA в ранее описанных исследованиях на обезьянах (см., например, Пример 6). Партия RACIR Антитела А имела минимальную иммуногенность у доноров (~12,5%), сравнимую с контрольным белком (Авастин). Учитывая низкий ответ на материал RACIR в анализе, было предсказано, что Антитело А будет безопасно для использования в клинике, например, для лечения воспалительного заболевания, описанного в данном документе.

Пример 8. Анализ способности антитела к ИЛ-7R блокировать сигналинг ИЛ-7 в Т-клетках человека

[0369] Для дальнейшей оценки способности Антитела А ингибировать связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα получали периферическую кровь здоровых добровольцев (NHV), пациентов с язвенным колитом (ЯК) и пациентов с болезнью Крона (БК). Затем МКПК инкубировали ex vivo и стимулировали ИЛ-7 в присутствии Антитела А в течение приблизительно 15 минут. После этого активность pSTAT5 в Т-клетках анализировали с помощью проточной цитометрии.

[0370] Как показано в таблице 8, активность pSTAT5 в Т-клетках всех испытуемых индивидуумов была минимальной, что позволяет предположить, что Антитело А может эффективно блокировать связывание ИЛ-7 с ИЛ-7Rα человека как у здоровых, так и у больных пациентов. Статистических различий между ответами доноров NHV и ЯК или БК не наблюдали. Этот результат демонстрируют, что описанное в данном документе антитело к ИЛ-7R (Антитело А) может быть эффективным при лечении воспалительных заболеваний in vivo путем эффективного блокирования сигналинга ИЛ-7 в патогенных Т-клетках.

Пример 9. Анализ методом картирования эпитопов

[0371] Масс-спектрометрию водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS) в сочетании с методами футпринтинга с ортогональным ковалентным мечением, такими как быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP) и мечение этиловым эфиром глицина (GEE), использовали для исследования связывающих эпитопов чИЛ-7Rα при взаимодействии с Антителом А.

HDX-MX

[0372] Перед экспериментами по картированию эпитопов были проведены эксперименты без дейтерирования для создания перечня общих пептидов для рекомбинантного человеческого чИЛ-7Rα (10 пМ), созданных самостоятельно, и белковых комплексов чИЛ-7Rα с Fab Антитела А (молярное соотношение 1:1).. Образцы вводили в колонку Waters Enzymate ВЕН Pepsin (2,1×30 мм) и расщепляли в течение 3 минут при 15°С. В охлаждающей камере системы СВЭЖХ, в которой размещались все хроматографические элементы, поддерживалась температура 0,0±0,1°С в течение всего времени измерений. Введенные пептиды улавливали и обессоливали в течение 3 мин при 40 мкл/мин, а затем разделяли в течение 6 мин градиентом 5-40% ацетонитрил-вода при 65 мкл/мин. Разделительная колонка представляла собой колонку ACQUITY UPLC ВЕН С18 (1,0 мм×100,0 мм) (Waters), содержащую частицы размером 1,7 мкм, и среднее обратное давление составляло 8500 фунтов на кв. дюйм при 0,1°С. Для сбора данных использовали масс-спектрометр Xevo G2. Конфигурация прибора была следующей: капиллярное напряжение 3,2 кВ, энергия соударений ловушки 6 В, напряжение пробоотборного конуса 35 В, температура источника 80°С и температура десольватации 175°С. Масс-спектры были получены в диапазоне m/z от 100 до 1900. Точность определения массы обеспечивали калибровкой с использованием 500 нМ [Glul]-фибринопептида В, и во всех экспериментах она составляла менее 10 м.д. Идентификацию пепсиновых пептидов осуществляли путем комбинации точного массового анализа и MSE с использованием ProteinLynx Global SERVER 2.5 (Waters).

[0373] В экспериментах HDX-MS 5 мкл каждого образца (чИЛ-7Rα или чИЛ-7Rα с Fab Антитела А, соответственно) разводили в 55 мкл буфера D2O (10 мМ фосфатного буфера, D2O, рН 7,0) для начала реакций мечения. Реакции проводили в разные периоды времени: 1 мин, 10 мин и 240 мин. К концу каждого периода реакции мечения реакцию гасили добавлением буфера для гашения (100 мМ фосфатного буфера с 4 М GdnCl и 0,4 М ТСЕР, рН 2,5, 1:1, об./об.). 50 мкл гашенного образца расщепляли в реальном времени в тех же условиях, что и в экспериментах без дейтерирования. Все сравнительные эксперименты проводили в идентичных экспериментальных условиях, так что уровни дейтерия не корректировали на обратный обмен и поэтому были указаны как относительные. Все эксперименты проводились в двух повторностях. Ошибка измерения массы каждого пептида составляла ±0,20 Да в этой экспериментальной установке, что согласуется с ранее полученными значениями. Захват дейтерия рассчитывали путем вычитания центра тяжести изотопного распределения пептидных ионов из недейтерированного белка из центроида изотопного распределения пептидных ионов из меченного дейтерием образца. Полученные относительные уровни дейтерия были нанесены на графики в зависимости от времени обмена с использованием программного обеспечения DYNAMX 3.0™ (Waters).

FFOP

[0374] Эксперименты FPOP проводили с комплексом чИЛ-7Rα и чИЛ-7Rα/Fab (Антитело А) (молярное соотношение 1:1, конечная концентрация 10 мкМ). Эксимерный KrF-лазер использовали для генерации гидроксильных радикалов путем фотолиза Н₂О₂, а длина волны возбуждения была установлена равной 248 нм. Непосредственно перед мечением к аликвоте белка добавляли по 5 мкл гистидина и Н₂О₂. Конечный объем белкового раствора составлял 50 мкл, а конечные концентрации гистидина и Н₂О₂ составляли 500 мкМ и 15 мМ, соответственно. Энергия лазера была доведена до 28 мДж/импульс (7,4 Гц). И FPOP, и эксперименты без лазерного контроля были выполнены в трех повторностях. Образцы из каждой повторности собирали в микроцентрифужную пробирку, содержащую 11 мкл раствора для гашения (800 нМ тетрамера каталазы и 200 мМ метионина). Образцы денатурировали, восстанавливали, алкилировали и расщепляли химотрипсином. Сбор данных осуществляли на масс-спектрометре Thermo Q Exactive Plus с системой Waters Acquity UPLC. Поисковую систему Byonic использовали для обеспечения охвата секвенированием и определения сайтов окисления. Относительные уровни окисления для триптических пептидов рассчитывали с использованием программного обеспечения Byologic (Protein Metrics, Сан-Карлос, штат Калифорния). Для дальнейшего анализа рассматривали только пептиды со статистически значимой разницей в относительном окислении между свободным и связанным состояниями (на основе р-значения <0,01 t-критерия). Анализ уровня остатков проводили с помощью программного обеспечения Byologic и проверяли вручную для каждой повторности. Только остатки со статистически значимой разницей в окислении между свободным от чИЛ-7Rα и чИЛ-7Rα/Fab-Антителом А (на основе значения р<0,01 t-критерия) считались защищенными остатками.

Меченые GEE

[0375] Мечение GEE было инициировано смешиванием 10 мкл каждого образца (hPAIl или hPAIl с мкАт в концентрации 1 мг/мл) с 1 мкл 2 М GEE и 1 мкл 50 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) при комнатной температуре в течение 1 мин. Реакцию гасили, добавляя к образцу 10 мкл 1 М ацетата аммония. 17,5 мкл каждого меченного GEE образца подвергали ферментативному расщеплению. Образец денатурировали в присутствии 0,5% поверхностно-активного вещества Rapigest, восстанавливали DTT при 56°С в течение 30 минут, алкилировали IAM при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте и расщепляли химотрипсином при 37°С в течение ночи в Tris рН 7,4. с последующей остановкой реакции добавлением кислоты. Расщепленные образцы анализировали с помощью масс-спектрометра Thermo Q Exactive Plus, а уровни модификации GEE контролировали на чИЛ-7Rα в отсутствие/в присутствии Антитела А.

Результаты

[0376] Как показано на Фиг. 9, охват последовательностей 97,3% чИЛ-7R был получен с использованием анализа методом HDX-MS. Анализ выявил следующие прерывистые эпитопы, которые покрывают четыре различные области в чИЛ-7R: (i) Область 1: (ii) Область 2: (iii) Область 3: и (iv) Область 4: Основываясь на относительных различиях в захвате дейтерия, пептидные области можно отнести к областям 1>2, 3, 4, причем область 1 имеет наиболее значительное изменение захвата дейтерия (Фиг. 10).

[0377] С помощью анализа FPOP были идентифицированы следующие пять эпитопов чИЛ-7R: (i) Область 1: (ii) Область 2: и (iii) Область 3: и (iv) Область 4: Эти эпитопы перекрывались с прерывистыми областями, идентифицированными выше с помощью анализа методом HDX-MS. Также, как показано в таблице 9, идентифицированные эпитопы также показали снижение уровней окисления по сравнению с контролями. Наиболее защищенные остатки были идентифицированы следующим образом: (i) Область 1: Н33; (ii) Область 2: F79, I82, и K84; (iii) Область 3: М144; и (iv) Область 4: R186, Н191 и Y192.

Остатки, которые демонстрируют значительную разницу в уровне окисления (значение р<0,01) при связывании с антителом А по сравнению с контролем чИЛ-7Rα, считаются наиболее защищенными остатками. Расчеты представляют n=3 повторности для каждого условия.

[0378] Наконец, мечение GEE (которое использовалось для получения дополнительных данных об остатках с ограниченной склонностью к окислению, которые могут не отражать FPOP, в частности, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты) идентифицировало Е75 как наиболее защищенный остаток на чИЛ-7Rα при взаимодействии с Антителом А (Таблица 10).

Остатки, которые демонстрируют значительную разницу в уровне мечения GEE (значение р<0,01) при связывании с Антителом А по сравнению с контролем чИЛ-7Rα, считаются наиболее защищенными остатками. Расчеты представляют n=2 повторности для каждого условия.

[0379] На основании приведенного выше анализа эпитопы чИЛ-7Rα при взаимодействии с Антителом А были картированы на линейную последовательность чИЛ-7Rα. (Фиг. 11А) и дополнительно картированы на кристаллическую структуру (Фиг. 11B).

[0380] Таким образом, эксперименты с масс-спектрометрией водородно-дейтериевого обмена (HDX-MS) показали, что сайты связывания Антитела А на ИЛ-7Rα человека картированы на остатки в следующих пептидных последовательностях: и Дополнительные подходы, основанные на масс-спектрометрии, включая FPOP и мечение GEE, обеспечили аминокислотное разрешение сайтов связывания Антитела А на ИЛ-7Rα человека в следующих аминокислотах: Н33, Е75, F79, 182, K84, М144, R186, Н191 и Y192.

Пример 10. Прогнозируемая доза для человека

[0381] ФК/ЗР/ФД человека для описанного в данном документе антитела к ИЛ-7R были спрогнозированы с использованием механистической модели мишень-опосредованного распределения лекарственного средства, о которой недавно сообщалось для PFE A3312F (nbc.aapsmeeting.org/event/member/373852) (Фиг. 12А и 12В). Эта механистическая модель была способна фиксировать динамику ФК/ЗР/ФД после введения мкАт PFE A3312F в клинических исследованиях с участием людей.

[0382] Для обеспечения возможности моделирования ФК и ФД антитела к ИЛ-7R у человека, в то время как большинство параметров модели были аналогичны описанной модели, предполагалось, что клиренс у человека в 2 раза ниже (по сравнению с PFE A3312F). Это подтверждается 2-кратным снижением CL по сравнению с A3312F, наблюдаемым у обезьян при фармакологически релевантной дозе (3 мг/кг; Фиг. 4). Кроме того, аффинность связывания антитела к ИЛ-7R была сходной между обезьянами и людьми, особенно при рН 7,4 (см. Пример 3). Следовательно, ФК прогнозы предполагали, что эта разница в CL будет аналогична у людей. Учитывая аналогичную эффективность in vivo настоящего антитела к ИЛ-7R и A3312F у обезьян (Фиг. 5), предполагалось, что кинетика связывания этих двух антител одинакова у людей.

[0383] Эффективную дозу для человека прогнозировали путем нацеливания на 95% ЗР после получения дозы один раз в две недели. Исследование ФК/ФД на обезьянах продемонстрировало, что более 95% ЗР приводит к 90% ингибированию pSTAT5. См. Пример 3. Таким образом, для прогнозирования дозы использовали ЗР, а не покрытие pSTAT5, поскольку ингибирование pSTAT5 было более вариабельным у обезьян и людей.

[0384] Обобщая приведенную выше информацию, было подсчитано, что поддерживающая и/к доза 110 мг для взрослого с массой 70 кг каждую вторую неделю (Q2W) позволит достичь 95% ЗР для ИЛ-7R во время лечения данным антителом к ИЛ-7R. Нагрузочная п/к доза для достижения этой ЗР после первой дозы была рассчитана и составляла 140 мг (Фиг. 13).

[0385] Прогнозируемая равновесная экспозиция у человека и ФК параметры при этой дозе перечислены в Таблице 11. Как и ожидалось, из-за нелинейной фармакокинетики прогнозируемый период полужизни антитела к ИЛ-7R у людей был защищен от увеличения с увеличением дозы. Прогнозируемый период полужизни составлял 53 часа при эффективной дозе 110 мг, но, по оценкам, он был больше при более высоких дозах (например, 85 часов при 125 мг).

Пример 11. Анализ методом мутационного сканирования антитела 18В1

[0386] Для проведения мутационного сканирования антитело 18В1 (Антитело А, таблица 12) сначала переформатировали в scFv и подтверждали связывание против связывания полноразмерного чИЛ-7R посредством дисплея мРНК (Xu L et al. (2002) Chemistry & Biology 9: 933; Roberts RW and JW Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297; Kurz et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(18):E83). Данные связывания переформатированного антитела представлены на Фиг. 14А и 14В.

[0387] После подтверждения связывания мы создали библиотеку для мутационного сканирования, в которой каждый вариант библиотеки содержал только одну мутацию в CDR. Были мутированы все шесть CDR антитела, причем каждое положение в CDR было мутировано на все возможные аминокислоты в этом положении. Конкретные положения, которые были мутированы, показаны на Фиг. 15. Эту библиотеку вариантов 18В1 scFv проводили через один раунд селекции против чИЛ-7R с использованием дисплея мРНК. Результаты одного раунда селекции представлены на Фиг. 16. Выходные данные селекции были проанализированы с помощью секвенирования нового поколения (NGS), и были созданы тепловые карты для визуализации данных NGS и быстрой идентификации 1) положений CDR, критических для связывания, 2) положений CDR, где мутации допускаются, и 3) мутаций, которые могут улучшить связывание антитела с чИЛ-7R. На Фиг. 17А и 17В схематично показан весь процесс. Результаты тепловой карты представлены на Фиг. 18A-18F.

[0388] Варианты с аланиновой заменой антитела 18В1 были сделаны для подтверждения приведенных выше данных NGS. Вкратце, была разработана серия вариантов с единственной мутацией, в которых единственная аланиновая мутация была введена в положение в CDR. Это было сделано для всех положений шести CDR, за исключением положений CDR, которые уже кодируют аланин. Эти варианты с аланиновой заменой были синтезированы геном, временно экспрессированы в Expi293 как IgG1.3 и очищены с использованием смолы на основе белка А.

[0389] 18В1 и варианты с аланиновой заменой тестировали на их связывание с чИЛ-7R посредством Biacore. Вкратце, чип СМ5 (с Fc на поверхности чипа) использовали для захвата 12,5 нМ антитела, чИЛ-7R вводили в качестве лиганда при 30, 10 и 3,3 нМ в HBS-Р, рН 7,4, 37°С. См. Фиг. 20А и 20В. Аффинность (Kd) связывания каждого варианта с чИЛ-7R получали с использованием этого подхода и сравнивали с коэффициентом обогащения (ER), полученным с помощью анализа тепловой карты NGS для того же варианта. На Фиг. 19 представлены значения для каждого из вариантов антител.

[0390] Как показано на ФИГ. 21, несколько вариантов 18В1 были способны связываться с чИЛ-7R с такой же аффинностью, что и антитело 18В1 (т.е. Антитело А). И, как показано на Фиг. 22 и 23, аланиновые мутации в CDR3 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи, по-видимому, оказывают наибольшее влияние на связывание. Наконец, как показано на Фиг. 24, результаты, показанные на тепловых картах, хорошо коррелировали с измеренными значениями Kd для аланиновых вариантов. На Фиг. 25 представлена кристаллическая структура фрагмента Fab антитела 18В1, в которой показаны остатки, которые являются критическими для связывания (красный), и остатки, которые могут улучшать связывание (синий).

Пример 12. Анализ интернализации антитела 18В1 при связывании с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 (ИЛ-7Rα)

[0391] Чтобы дополнительно охарактеризовать описанные в данном документе антитела к ИЛ-7R, антитело 18В1 (т.е. Антитело А) тестировали на его интернализацию при связывании с ИЛ-7Rα, экспрессируемым на лейкоцитах обезьян. Вкратце, яванским макакам подкожно вводили антитела 18В1 в одной из следующих доз: (i) 2 мг/кг, (ii) 10 мг/кг и (iii) 50 мг/кг. Животных, которые не получали антитело 18В1, использовали в качестве контроля. Затем в различные моменты времени после введения у животных собирали периферическую кровь и оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) экспрессии ИЛ-7Rα на CD3+ лейкоцитах с помощью проточной цитометрии.

[0392] Как показано на Фиг. 26, экспрессия ИЛ-7Rα на CD3+ лейкоцитах оставалась в значительной степени постоянной на протяжении всего эксперимента у всех животных, получавших антитело 18В1. По сравнению с контрольными животными введение антитела 18В1 не привело к снижению экспрессии ИЛ-7Rα на CD3+ лейкоцитах.

[0393] Этот результат демонстрирует, что описанное в данном документе антитело 18В1 не индуцирует интернализацию ИЛ-7Rα при связывании, что подтверждает, что антитело не оказывает какого-либо агонистического эффекта.

Пример 13. Анализ активности антитела 18В1

[0394] Для оценки активности описанных в данном документе антител к ИЛ-7R измеряли способность антитела 18В1 ингибировать индуцированное гемоцианином моллюска Megathura crenulata (KLH) образование антител. Вкратце, яванским макакам (как самцы, так и самки) подкожно вводили антитела 18В1 в одной из следующих доз: (i) 2 мг/кг, (ii) 10 мг/кг и (iii) 50 мг/кг. Животных, которые не получали антитело 18 В1, использовали в качестве контроля. Затем на 15 день после введения антител всех животных иммунизировали KLH (10 мг; внутримышечно в заднюю четырехглавую мышцу). Затем в различные моменты времени у животных собирали периферическую кровь (из бедренной вены, головной или подкожной вены) и определяли конечные титры (ЕРТ) KLH-специфических антител IgM и IgG в сыворотке с помощью ИФА.

[0395] Как показано на Фиг. 27А и 27В, после иммунизации KLH во всех группах лечения наблюдалось увеличение количества KLH-специфических антител IgM и IgG. Для KLH-специфического ответа IgM не было значительных различий между группами лечения (см. Фиг. 27А). Однако у животных, получавших антитело 18В1, наблюдалось статистически значимое снижение (до 80% подавления) KLH-специфического образования IgG на 2-ю («день 29»), 3-ю («день 36») и 4-ю («день 43») недели после иммунизации KLH по сравнению с контрольными животными (т.е. животными, которые были иммунизированы KLH, но не получали антитело 18В1) (см. Фиг. 27В). Наблюдаемое ингибирование KLH-специфического образования IgG не зависело от дозы, поскольку ответ оказался сопоставимым у всех животных, получавших антитело 18В1, независимо от дозировки.

[0396] Приведенные выше данные демонстрируют эффективность описанных антител к ИЛ-7R, и что даже при такой низкой дозе, как 2 мг/кг, антитело 18В1 может эффективно ингибировать KLH-специфическое образование IgG. Чтобы не связывать себя какой-либо одной теорией, подавление KLH-специфического образования IgG, но не образования IgM предполагает, что антитело 18В1 может ингибировать рекомбинацию переключения класса антитела в В-клетках, которые претерпевают переключение изотипа.

Пример 14. Дополнительной анализ методом картирования эпитопов

[0397] Чтобы дополнительно охарактеризовать антитела к ИЛ-7R по настоящему изобретению, были определены связывающие эпитопы трех эталонных антител (т.е. 4А8, 13А10 и PFE A3312F) и сравнивались со связывающими эпитопами антитела 18В1 (Антитело А, таблица 12). Связывающие эпитопы определяли, как описано ранее в Примере 9.

[0398] Как показано на Фиг. 28А-28С, на основе экспериментов HDX-MS сайты связывания для антитела 4А8 были картированы на остатки в следующих пептидных последовательностях: (i) (ii) (iii) и (iv) Сайты связывания для антитела 13А10 были картированы на следующие пептидные последовательности: (i) (ii) (iii) и (iv) И сайты связывания для PFE A3312F были картированы на следующие пептидные последовательности: (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (vii) (viii) и (ix) На Фиг. 29A-29C показаны сайты связывания для 4А8, 13А10 и PFE A3312F, картированные на кристаллической структуре белка ИЛ-7Rα человека.

[0399] По сравнению с данными, представленными в Примере 9 (см. также Фиг. 10 и 11В), приведенные выше результаты демонстрируют, что антитело 18В1, описанное в настоящей заявке, связывается с различными областями белка ИЛ-7Rα человека по сравнению с эталонными антителами, описанными в данном Примере.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БРИСТОЛ-МАЕРС СКВИББ КОМПАНИ

< 120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦЫ ИЛ-7R И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 4521.001PC02/C-K/DKC

<150> US 62/795378

<151> 22.01.2019

<150> US 62/868791

<151> 28.06.2019

<160> 265

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 298

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp

20 25 30

Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val

35 40 45

Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val

50 55 60

Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val

65 70 75 80

Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr

85 90 95

Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly

100 105 110

Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys

115 120 125

Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn

130 135 140

Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn

165 170 175

Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile

195 200 205

Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro

225 230 235 240

Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu

245 250 255

Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val

260 265 270

Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys

275 280 285

Lys Pro Arg Lys Val Ser Val Phe Gly Ala

290 295

<210> 2

<211> 252

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp

20 25 30

Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val

35 40 45

Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val

50 55 60

Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val

65 70 75 80

Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr

85 90 95

Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly

100 105 110

Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys

115 120 125

Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn

130 135 140

Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn

165 170 175

Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile

195 200 205

Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Leu Ser Leu Ser

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Val Ser Pro Ile Ile Arg Gln Glu Leu

245 250

<210> 3

<211> 298

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp

20 25 30

Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val

35 40 45

Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val

50 55 60

Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val

65 70 75 80

Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr

85 90 95

Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly

100 105 110

Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys

115 120 125

Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn

130 135 140

Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn

165 170 175

Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile

195 200 205

Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro

225 230 235 240

Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu

245 250 255

Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val

260 265 270

Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys

275 280 285

Lys Pro Arg Lys Val Ser Val Phe Gly Ala

290 295

<210> 4

<211> 261

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp

20 25 30

Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val

35 40 45

Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val

50 55 60

Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val

65 70 75 80

Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr

85 90 95

Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly

100 105 110

Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys

115 120 125

Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn

130 135 140

Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn

165 170 175

Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile

195 200 205

Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Leu Ser Leu Ser

225 230 235 240

Tyr Gly Pro Val Ser Pro Ile Ile Arg Arg Leu Trp Asn Ile Phe Val

245 250 255

Arg Asn Gln Glu Lys

260

<210> 5

<211> 4643

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

gtggttagat aagtataaag ccctagatct aagcttctct gtcttcctcc ctccctccct

60

tcctcttact ctcattcatt tcatacacac tggctcacac atctactctc tctctctatc

120

tctctcagaa tgacaattct aggtacaact tttggcatgg ttttttcttt acttcaagtc

180

gtttctggag aaagtggcta tgctcaaaat ggagacttgg aagatgcaga actggatgac

240

tactcattct catgctatag ccagttggaa gtgaatggat cgcagcactc actgacctgt

300

gcttttgagg acccagatgt caacatcacc aatctggaat ttgaaatatg tggggccctc

360

gtggaggtaa agtgcctgaa tttcaggaaa ctacaagaga tatatttcat cgagacaaag

420

aaattcttac tgattggaaa gagcaatata tgtgtgaagg ttggagaaaa gagtctaacc

480

tgcaaaaaaa tagacctaac cactatagtt aaacctgagg ctccttttga cctgagtgtc

540

gtctatcggg aaggagccaa tgactttgtg gtgacattta atacatcaca cttgcaaaag

600

aagtatgtaa aagttttaat gcacgatgta gcttaccgcc aggaaaagga tgaaaacaaa

660

tggacgcatg tgaatttatc cagcacaaag ctgacactcc tgcagagaaa gctccaaccg

720

gcagcaatgt atgagattaa agttcgatcc atccctgatc actattttaa aggcttctgg

780

agtgaatgga gtccaagtta ttacttcaga actccagaga tcaataatag ctcaggggag

840

atggatccta tcttactaac catcagcatt ttgagttttt tctctgtcgc tctgttggtc

900

atcttggcct gtgtgttatg gaaaaaaagg attaagccta tcgtatggcc cagtctcccc

960

gatcataaga agactctgga acatctttgt aagaaaccaa gaaaaaattt aaatgtgagt

1020

ttcaatcctg aaagtttcct ggactgccag attcataggg tggatgacat tcaagctaga

1080

gatgaagtgg aaggttttct gcaagatacg tttcctcagc aactagaaga atctgagaag

1140

cagaggcttg gaggggatgt gcagagcccc aactgcccat ctgaggatgt agtcatcact

1200

ccagaaagct ttggaagaga ttcatccctc acatgcctgg ctgggaatgt cagtgcatgt

1260

gacgccccta ttctctcctc ttccaggtcc ctagactgca gggagagtgg caagaatggg

1320

cctcatgtgt accaggacct cctgcttagc cttgggacta caaacagcac gctgccccct

1380

ccattttctc tccaatctgg aatcctgaca ttgaacccag ttgctcaggg tcagcccatt

1440

cttacttccc tgggatcaaa tcaagaagaa gcatatgtca ccatgtccag cttctaccaa

1500

aaccagtgaa gtgtaagaaa cccagactga acttaccgtg agcgacaaag atgatttaaa

1560

agggaagtct agagttccta gtctccctca cagcacagag aagacaaaat tagcaaaacc

1620

ccactacaca gtctgcaaga ttctgaaaca ttgctttgac cactcttcct gagttcagtg

1680

gcactcaaca tgagtcaaga gcatcctgct tctaccatgt ggatttggtc acaaggttta

1740

aggtgaccca atgattcagc tatttaaaaa aaaaagagga aagaatgaaa gagtaaagga

1800

aatgattgag gagtgaggaa ggcaggaaga gagcatgaga ggaaagaaag aaaggaaaat

1860

aaaaaatgat agttgccatt attaggattt aatatatatc cagtgctttg caagtgctct

1920

gcgcaccttg tctcactcca tcctgacaat aatcctggga ggtgtgtgca attactacga

1980

ctactctctt ttttatagat cattaaattc agaactaagg agttaagtaa cttgtccaag

2040

ttgttcacac agtgaaggga ggggccaaga tatgatggct gggagtctaa ttgcagttcc

2100

ctgagccatg tgcctttctc ttcactgagg actgccccat tcttgagtgc caaacgtcac

2160

tagtaacagg gtgtgcctag ataatttatg atccaaactg agtcagtttg gaaagtgaaa

2220

gggaaactta catataatcc ctccgggaca atgagcaaaa actaggactg tccccagaca

2280

aatgtgaaca tacatatcat cacttaaatt aaaatggcta tgagaaagaa agagggggag

2340

aaacagtctt gcgggtgtga agtcccatga ccagccatgt caaaagaagg taaagaagtc

2400

aagaaaaagc catgaagccc atttggtttc atttttctga aaataggctc aagagggaat

2460

aaattagaaa ctcacaattt ctcttgtttg ttaccaagac agtgattctc ttgctgctac

2520

cacccaactg catccgtcca tgatctcaga ggaaactgtc gctgaccctg gacatgggta

2580

cgtttgacga gtgagaggag gcatgacccc tcccatgtgt atagacacta ccccaaccta

2640

aattcatccc taaattgtcc caagttctcc agcaatagag gctgccacaa acttcaggga

2700

gaaagagtta caagtacatg caatgagtga actgactgtg gctacaatct tgaagatata

2760

cggaagagac gtattattaa tgcttgacat atatcatctt gcctttcttg gtctagactg

2820

acttctaatg actaactcaa agtcaaggca actgagtaat gtcagctcag caaagtgcag

2880

caaacccatc tcccacaggc ctccaaaccc tggctgttca cagaaccaca aagggcagat

2940

gctgcacaga aaactagaga aggggtcata ggttcatggt tttgtttgag atttgttgct

3000

actgtttttc tgttttgaat tttcttcttt gttctgtttt tactttattt agggggacta

3060

ggtgtttctg atattttagt tttcttgttt gttttgtttt gtgttgtctg tgaatggggt

3120

tttaactgtg gatgaatgga ccttatctgt tggcttaaag gactggtaag atcagaccat

3180

cttattcttc aggtgaatgt tttactttcc aaagtgctct cctctgcacc agcagtaata

3240

aatacaatgc cataatccct taggtttgcc tagtgctttt gcaattttca aagcacttcc

3300

ataagcattc cttccacctc cttgataggc atttatggaa agcctgctac atgtcaatca

3360

tactgttagg cacaggggac ctaaagacac ataaaaggat ggcattctgc ctcataaatt

3420

gcaaaaccta atgaaagtga ctgcttggta aacaaattat tattatatta taaaatgcta

3480

taaaagagcc atattgaaag tgccctgttg gagacagggc aaatgccaca aaaatgatgt

3540

aaatttacat ggaggaaaag tagaatctgc ctggtttgta ggcagcagaa gacatttttc

3600

atcagtgggc aggtgttctt taccttttgt agaaatggga gtcaagtctc aaataggagg

3660

ctccacaaaa tctcatgcca ggtctctgat accttattca cagaagttct ttgaagtatt

3720

tattgttatt ttctttgact tatgggaaaa ctgggacaca ggaagacagg taaattaccc

3780

aacctcacac gttaagtcag aactgggagc cataattttg tatccctggt ataaatagac

3840

aatctcttga agaaatgaag agatgaccat agaaaaacat cgagatatct ccagctctaa

3900

aatcctttgt ttcaatgttg tttggcatat gttatctttg gaatttagtg tctgagcctc

3960

tgtctgttac tgtagtattt aaaatgcatg tattataatc atataatcat aactgctgtt

4020

aattcttgat tatataccta gggacaatgt gtaatgtaag attactaatt ggttctgccc

4080

aatctccttt cagattttat taggaaaaaa aaataaacct cctgatcgga gacaatgtat

4140

taatcagaag tgtaaactgc cagttctata tagcatgaaa tgaaaagaca gctaatttgg

4200

tccaacaaac atgactgggt ctagggcacc caggctgatt cagctgattt cctaccagcc

4260

tttgcctctt ccttcaatgt ggtttccatg ggaatttgct tcagaaaagc caagtatggg

4320

ctgttcagag gtgcacacct gcattttctt agctcttcta gaggggctaa gagacttggt

4380

acgggccagg aagaatatgt ggcagagctc ctggaaatga tgcagattag gtggcatttt

4440

tgtcagctct gtggtttatt gttgggacta ttctttaaaa tatccattgt tcactacagt

4500

gaagatctct gatttaaccg tgtactatcc acatgcatta caaacatttc gcagagctgc

4560

ttagtatata agcgtacaat gtatgtaata accatctcat atttaattaa atggtataga

4620

agaacaaaaa aaaaaaaaaa aaa

4643

<210> 6

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp

1 5 10 15

Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln

20 25 30

His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn

35 40 45

Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn

50 55 60

Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu

65 70 75 80

Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu

85 90 95

Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro

100 105 110

Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val

115 120 125

Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met

130 135 140

His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His

145 150 155 160

Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln

165 170 175

Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr

180 185 190

Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr

195 200 205

Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp

210 215

<210> 7

<211> 459

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 7

Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp

20 25 30

Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val

35 40 45

Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val

50 55 60

Asn Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val

65 70 75 80

Lys Cys Leu Ser Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr

85 90 95

Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly

100 105 110

Gly Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys

115 120 125

Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn

130 135 140

Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val

145 150 155 160

Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn

165 170 175

Lys Trp Met His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln

180 185 190

Arg Asn Leu Gln Pro Glu Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile

195 200 205

Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Pro Gly Glu Met Asp Pro

225 230 235 240

Ile Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu

245 250 255

Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val

260 265 270

Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys

275 280 285

Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu

290 295 300

Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val

305 310 315 320

Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Lys

325 330 335

Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Ser Cys Pro Ser Glu

340 345 350

Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Glu Arg Asp Ser Ser Leu Arg

355 360 365

Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser

370 375 380

Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val

385 390 395 400

Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro

405 410 415

Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala

420 425 430

Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala

435 440 445

Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln

450 455

<210> 8

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп 1

<400> 8

Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe

1 5 10 15

<210> 9

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп 2

<400> 9

Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys

1 5 10 15

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп 3

<400> 10

Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr

1 5 10 15

Thr

<210> 11

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп 4

<400> 11

Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Эпитоп 5

<400> 12

Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe

1 5 10 15

<210> 13

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 тяжелой цепи

<400> 13

Asp His Ala Met His

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 тяжелой цепи

<400> 14

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 тяжелой цепи

<400> 15

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 легкой цепи

<400> 16

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 легкой цепи

<400> 17

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 легкой цепи

<400> 18

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи (VH)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи (VL)

<400> 20

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Trp Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 22

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь

<400> 22

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Trp Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 23

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 24

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 25

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область IgG1.1f

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 26

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область IgG1.3f

<400> 26

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 27

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 27

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 28

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LSPGK (С-терминальный конец тяжелой цепи)

<400> 28

Leu Ser Pro Gly Lys

1 5

<210> 29

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> LSPG (С-терминальный конец тяжелой цепи)

<400> 29

Leu Ser Pro Gly

1

<210> 30

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 30

Pro Val Gly Val Val

1 5

<210> 31

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (18B1)

<400> 31

Gly Phe Thr Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (F27Y)

<400> 32

Gly Tyr Thr Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28P)

<400> 33

Gly Phe Pro Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28A)

<400> 34

Gly Phe Ala Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28V)

<400> 35

Gly Phe Val Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28L)

<400> 36

Gly Phe Leu Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28I)

<400> 37

Gly Phe Ile Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28M)

<400> 38

Gly Phe Met Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28H)

<400> 39

Gly Phe His Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 40

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28F)

<400> 40

Gly Phe Phe Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 41

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28Y)

<400> 41

Gly Phe Tyr Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 42

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28N)

<400> 42

Gly Phe Asn Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 43

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28D)

<400> 43

Gly Phe Asp Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 44

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28E)

<400> 44

Gly Phe Glu Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 45

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (T28Q)

<400> 45

Gly Phe Gln Phe Asp Asp His Ala Met His

1 5 10

<210> 46

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC (M34L)

<400> 46

Gly Phe Thr Phe Asp Asp His Ala Leu His

1 5 10

<210> 47

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S52T)

<400> 47

Gly Ile Thr Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 48

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (N53H)

<400> 48

Gly Ile Ser Trp His Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (I57V)

<400> 49

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 50

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60G)

<400> 50

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60S)

<400> 51

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ser Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 52

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60T)

<400> 52

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Thr Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 53

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60V)

<400> 53

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60L)

<400> 54

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Leu Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 55

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60I)

<400> 55

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ile Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 56

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60R)

<400> 56

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 57

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60H)

<400> 57

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (A60N)

<400> 58

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Asn Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 59

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61P)

<400> 59

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Pro Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 60

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61T)

<400> 60

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Thr Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61N)

<400> 61

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61E)

<400> 62

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 63

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61Q)

<400> 63

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Gln Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61S)

<400> 64

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (D61H)

<400> 65

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala His Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 66

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62P)

<400> 66

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Pro Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 67

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62G)

<400> 67

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 68

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62A)

<400> 68

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ala Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62T)

<400> 69

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 70

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62V)

<400> 70

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Val Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 71

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62R)

<400> 71

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Arg Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 72

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62H)

<400> 72

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp His Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 73

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62F)

<400> 73

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Phe Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 74

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62Y)

<400> 74

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Tyr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 75

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62N)

<400> 75

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Asn Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 76

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62D)

<400> 76

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Asp Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 77

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (S62E)

<400> 77

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Glu Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 78

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (V63I)

<400> 78

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Ile Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 79

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64A)

<400> 79

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 80

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64S)

<400> 80

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 81

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64T)

<400> 81

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Thr

1 5 10 15

Gly

<210> 82

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64V)

<400> 82

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Val

1 5 10 15

Gly

<210> 83

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64L)

<400> 83

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Leu

1 5 10 15

Gly

<210> 84

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64I)

<400> 84

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Ile

1 5 10 15

Gly

<210> 85

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64M)

<400> 85

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Met

1 5 10 15

Gly

<210> 86

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64R)

<400> 86

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 87

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64H)

<400> 87

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val His

1 5 10 15

Gly

<210> 88

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64F)

<400> 88

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Phe

1 5 10 15

Gly

<210> 89

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64Y)

<400> 89

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Tyr

1 5 10 15

Gly

<210> 90

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64N)

<400> 90

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 91

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64D)

<400> 91

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Asp

1 5 10 15

Gly

<210> 92

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64E)

<400> 92

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 93

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (K64Q)

<400> 93

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 94

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (G65H)

<400> 94

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

His

<210> 95

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (G65D)

<400> 95

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 96

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC (G65Q)

<400> 96

Gly Ile Ser Trp Asn Ser Arg Gly Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gln

<210> 97

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (S98T)

<400> 97

Asp Glu Tyr Thr Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 98

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (S98N)

<400> 98

Asp Glu Tyr Asn Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 99

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (S98D)

<400> 99

Asp Glu Tyr Asp Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 100

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (S98E)

<400> 100

Asp Glu Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 101

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (R99L)

<400> 101

Asp Glu Tyr Ser Leu Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 102

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (R99M)

<400> 102

Asp Glu Tyr Ser Met Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 103

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (R99S)

<400> 103

Asp Glu Tyr Ser Ser Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Val

1 5 10

<210> 104

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cG)

<400> 104

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 105

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cA)

<400> 105

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Val

1 5 10

<210> 106

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cS)

<400> 106

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Ser Leu Asp Val

1 5 10

<210> 107

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cT)

<400> 107

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Thr Leu Asp Val

1 5 10

<210> 108

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cM)

<400> 108

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Met Leu Asp Val

1 5 10

<210> 109

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cN)

<400> 109

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Asn Leu Asp Val

1 5 10

<210> 110

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cE)

<400> 110

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Glu Leu Asp Val

1 5 10

<210> 111

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V100cQ)

<400> 111

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Gln Leu Asp Val

1 5 10

<210> 112

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102A)

<400> 112

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Ala

1 5 10

<210> 113

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102S)

<400> 113

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Ser

1 5 10

<210> 114

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102T)

<400> 114

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Thr

1 5 10

<210> 115

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102R)

<400> 115

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Arg

1 5 10

<210> 116

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102H)

<400> 116

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp His

1 5 10

<210> 117

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102Y)

<400> 117

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 118

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102W)

<400> 118

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Trp

1 5 10

<210> 119

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102N)

<400> 119

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Asn

1 5 10

<210> 120

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102E)

<400> 120

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Glu

1 5 10

<210> 121

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102Q)

<400> 121

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Gln

1 5 10

<210> 122

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC (V102M)

<400> 122

Asp Glu Tyr Ser Arg Gly Tyr Tyr Val Leu Asp Met

1 5 10

<210> 123

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24S)

<400> 123

Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 124

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24T)

<400> 124

Thr Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 125

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24V)

<400> 125

Val Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 126

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24K)

<400> 126

Lys Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 127

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24H)

<400> 127

His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 128

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24Y)

<400> 128

Tyr Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 129

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (R24I)

<400> 129

Ile Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 130

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (A25S)

<400> 130

Arg Ser Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 131

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (A25T)

<400> 131

Arg Thr Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 132

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (A25V)

<400> 132

Arg Val Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 133

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26P)

<400> 133

Arg Ala Pro Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 134

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26G)

<400> 134

Arg Ala Gly Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 135

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26A)

<400> 135

Arg Ala Ala Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 136

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26T)

<400> 136

Arg Ala Thr Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 137

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26V)

<400> 137

Arg Ala Val Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 138

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26L)

<400> 138

Arg Ala Leu Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 139

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26I)

<400> 139

Arg Ala Ile Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 140

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26M)

<400> 140

Arg Ala Met Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 141

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26K)

<400> 141

Arg Ala Lys Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 142

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26R)

<400> 142

Arg Ala Arg Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 143

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26H)

<400> 143

Arg Ala His Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 144

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26N)

<400> 144

Arg Ala Asn Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 145

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26E)

<400> 145

Arg Ala Glu Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 146

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S26Q)

<400> 146

Arg Ala Gln Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 147

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27P)

<400> 147

Arg Ala Ser Pro Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 148

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27G)

<400> 148

Arg Ala Ser Gly Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 149

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27A)

<400> 149

Arg Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 150

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27S)

<400> 150

Arg Ala Ser Ser Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 151

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27T)

<400> 151

Arg Ala Ser Thr Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 152

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27V)

<400> 152

Arg Ala Ser Val Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 153

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27L)

<400> 153

Arg Ala Ser Leu Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 154

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27I)

<400> 154

Arg Ala Ser Ile Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 155

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27M)

<400> 155

Arg Ala Ser Met Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 156

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27H)

<400> 156

Arg Ala Ser His Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 157

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27F)

<400> 157

Arg Ala Ser Phe Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 158

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27Y)

<400> 158

Arg Ala Ser Tyr Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 159

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27N)

<400> 159

Arg Ala Ser Asn Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 160

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27D)

<400> 160

Arg Ala Ser Asp Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 161

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (Q27E)

<400> 161

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 162

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28P)

<400> 162

Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 163

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28A)

<400> 163

Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 164

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28S)

<400> 164

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 165

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28T)

<400> 165

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 166

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28H)

<400> 166

Arg Ala Ser Gln His Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 167

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28E)

<400> 167

Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 168

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28Q)

<400> 168

Arg Ala Ser Gln Gln Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 169

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28M)

<400> 169

Arg Ala Ser Gln Met Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 170

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28N)

<400> 170

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 171

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (G28D)

<400> 171

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 172

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29P)

<400> 172

Arg Ala Ser Gln Gly Pro Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 173

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29G)

<400> 173

Arg Ala Ser Gln Gly Gly Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 174

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29A)

<400> 174

Arg Ala Ser Gln Gly Ala Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 175

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29S)

<400> 175

Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 176

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29T)

<400> 176

Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 177

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29V)

<400> 177

Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 178

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29L)

<400> 178

Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 179

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (I29N)

<400> 179

Arg Ala Ser Gln Gly Asn Ser Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 180

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30T)

<400> 180

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Thr Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 181

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30V)

<400> 181

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Val Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 182

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30L)

<400> 182

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Leu Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 183

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30I)

<400> 183

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ile Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 184

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30M)

<400> 184

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Met Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 185

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30M)

<400> 185

Arg Ala Ser Gln Gly Ile His Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 186

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30F)

<400> 186

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Phe Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 187

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30Y)

<400> 187

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 188

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30N)

<400> 188

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 189

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30D)

<400> 189

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 190

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30E)

<400> 190

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Glu Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 191

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (S30Q)

<400> 191

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gln Ser Ala Leu Ala

1 5 10

<210> 192

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (A32P)

<400> 192

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Pro Leu Ala

1 5 10

<210> 193

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (L33A)

<400> 193

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 194

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 LC (L33V)

<400> 194

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Val Ala

1 5 10

<210> 195

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51G)

<400> 195

Asp Gly Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 196

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51S)

<400> 196

Asp Ser Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 197

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51M)

<400> 197

Asp Met Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 198

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51H)

<400> 198

Asp His Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 199

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51N)

<400> 199

Asp Asn Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 200

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51D)

<400> 200

Asp Asp Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 201

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51E)

<400> 201

Asp Glu Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 202

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (A51Q)

<400> 202

Asp Gln Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 203

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52G)

<400> 203

Asp Ala Gly Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 204

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52A)

<400> 204

Asp Ala Ala Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 205

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52T)

<400> 205

Asp Ala Thr Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 206

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52V)

<400> 206

Asp Ala Val Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 207

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52M)

<400> 207

Asp Ala Met Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 208

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52H)

<400> 208

Asp Ala His Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 209

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52F)

<400> 209

Asp Ala Phe Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 210

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52Y)

<400> 210

Asp Ala Tyr Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 211

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52N)

<400> 211

Asp Ala Asn Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 212

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52D)

<400> 212

Asp Ala Asp Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 213

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52E)

<400> 213

Asp Ala Glu Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 214

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S52Q)

<400> 214

Asp Ala Gln Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 215

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53A)

<400> 215

Asp Ala Ser Ala Leu Glu Ser

1 5

<210> 216

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53F)

<400> 216

Asp Ala Ser Phe Leu Glu Ser

1 5

<210> 217

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53Y)

<400> 217

Asp Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 218

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53W)

<400> 218

Asp Ala Ser Trp Leu Glu Ser

1 5

<210> 219

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53N)

<400> 219

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 220

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53D)

<400> 220

Asp Ala Ser Asp Leu Glu Ser

1 5

<210> 221

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53E)

<400> 221

Asp Ala Ser Glu Leu Glu Ser

1 5

<210> 222

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S53L)

<400> 222

Asp Ala Ser Leu Leu Glu Ser

1 5

<210> 223

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54P)

<400> 223

Asp Ala Ser Ser Pro Glu Ser

1 5

<210> 224

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54S)

<400> 224

Asp Ala Ser Ser Ser Glu Ser

1 5

<210> 225

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54T)

<400> 225

Asp Ala Ser Ser Thr Glu Ser

1 5

<210> 226

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54K)

<400> 226

Asp Ala Ser Ser Lys Glu Ser

1 5

<210> 227

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54H)

<400> 227

Asp Ala Ser Ser His Glu Ser

1 5

<210> 228

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (L54N)

<400> 228

Asp Ala Ser Ser Asn Glu Ser

1 5

<210> 229

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (E55D)

<400> 229

Asp Ala Ser Ser Leu Asp Ser

1 5

<210> 230

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (E55Q)

<400> 230

Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 231

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56G)

<400> 231

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Gly

1 5

<210> 232

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56T)

<400> 232

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Thr

1 5

<210> 233

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56N)

<400> 233

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Asn

1 5

<210> 234

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56D)

<400> 234

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Asp

1 5

<210> 235

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56Q)

<400> 235

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Gln

1 5

<210> 236

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56P)

<400> 236

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Pro

1 5

<210> 237

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC (S56E)

<400> 237

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Glu

1 5

<210> 238

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (Q89M)

<400> 238

Met Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 239

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (Q90G)

<400> 239

Gln Gly Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 240

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (Q90A)

<400> 240

Gln Ala Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 241

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (Q90D)

<400> 241

Gln Asp Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 242

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (Q90E)

<400> 242

Gln Glu Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 243

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (N92E)

<400> 243

Gln Gln Phe Glu Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 244

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (S93P)

<400> 244

Gln Gln Phe Asn Pro Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 245

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (S93A)

<400> 245

Gln Gln Phe Asn Ala Tyr Pro Leu Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 246

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bT)

<400> 246

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Ile Thr

1 5 10

<210> 247

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bI)

<400> 247

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Ile Ile Thr

1 5 10

<210> 248

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bM)

<400> 248

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Met Ile Thr

1 5 10

<210> 249

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bK)

<400> 249

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Lys Ile Thr

1 5 10

<210> 250

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bN)

<400> 250

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Asn Ile Thr

1 5 10

<210> 251

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bE)

<400> 251

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Glu Ile Thr

1 5 10

<210> 252

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (W95bQ)

<400> 252

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Gln Ile Thr

1 5 10

<210> 253

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (I96L)

<400> 253

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Leu Thr

1 5 10

<210> 254

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97M)

<400> 254

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Met

1 5 10

<210> 255

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97K)

<400> 255

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Lys

1 5 10

<210> 256

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97H)

<400> 256

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile His

1 5 10

<210> 257

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97Y)

<400> 257

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Tyr

1 5 10

<210> 258

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97E)

<400> 258

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Glu

1 5 10

<210> 259

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC (T97Q)

<400> 259

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Trp Ile Gln

1 5 10

<210> 260

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 HC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> где Xaa представляет собой Phe или Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> где Xaa представляет собой Thr,

Pro,Ala,Ser,Val,Leu,Ile,Met,His,Phe,Tyr,Asn,Asp,Glu, или Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> где Xaa представляет собой Leu, или Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту природного

происхождения

<400> 260

Gly Xaa Xaa Phe Asp Asp His Ala Xaa His

1 5 10

<210> 261

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 HC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> где Xaa представляет собой Ser или Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> где Xaa представляет собой His или Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> где Xaa представляет собой Ile или Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> где Xaa представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile,

Arg, His, или

Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> где Xaa представляет собой Pro, Thr, Asn, As, Glu, Gln, Ser,

His, или Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> где Xaa представляет собой

Pro,Gly,Ala,Ser,Thr,Val,Arg,His,Phe,Tyr,Asn,Asp,Arg, или Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> где Xaa представляет собой Val или Ile

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> где Xaa представляет собой Ala, Ser, Thr, Val,Leu, Ile,Met,

Lys, Arg, His,

Phe, Tyr, Asn, Asp, Glu, Arg, или Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> где Xaa представляет собой Gly, His, Asp, или Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(17)

происхождения

<400> 261

Gly Ile Xaa Trp Xaa Ser Arg Gly Xaa Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa

<210> 262

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 HC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> где X представляет собой Ser,Thr, Asn, Asp, Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> где X представляет собой Lys, Met, Arg, или Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> где Xaa представляет собой Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Met, Asn,

Glu, или Gln

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> где X представляет собой Ala, Ser, Thr, Val, Arg, His, Tyr,

Trp, Asn, Glu, или Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

происхождения

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

происхождения

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

происхождения

<400> 262

Asp Glu Tyr Xaa Xaa Gly Tyr Tyr Xaa Leu Asp Xaa

1 5 10

<210> 263

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> где Xaa представляет собой Ser, Thr, Val, Lys, Arg, His, Tyr

или Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> где Xaa представляет собой Ala, Ser, Thr, или Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> где Xaa представляет собой Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu,

Ile, Met, Lys,

Arg, His, Asn, Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

Ile, Met, His, Phe, Tyr, Asn, As, Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> где Xaa представляет собой Pro, Gly, Aal, Ser, Thr, His, Glu,

Gln, Met, Asn,

или Asp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

Ile, Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> где Xaa представляет собой Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Met, His,

Phe, Tyr, Asn,

Asp, Glu, или Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> где Xaa представляет собой Pro или Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> где Xaa представляет собой Ala, Leu, или Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

происхождения

<400> 263

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Ala

1 5 10

<210> 264

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 LC

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> где Xaa представляет собой Gly, Ala, Ser, Met, His, Asn, Asp,

Glu, или Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> где Xaa представляет собой

Gly,Ala,Ser,Thr,Val,Met,His,Phe,Tyr,Asn,Asp,Glu,Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> где Ala,Ser,Phe,Tyr,Trp,Asn,Asp,Glu,Arg, Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> где Xaa представляет собой Pro, Ser, Tyr, Leu, Lys, His, или

Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> где Xaa представляет собой Asp, Glu, или Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> где Xaa представляет собой Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Gln, Pro,

Glu

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

происхождения

<400> 264

Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 265

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 LC

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> где Xaa представляет собой Met или Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> где Xaa представляет собой Gly, Ala, Asp, Glu, или Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> где Xaa представляет собой Asn или Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> где Xaa представляет собой Pro, Ala, или Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> где Xaa представляет собой Thr, Ile, Met, Lys, Trp, Asn, Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> где Xaa представляет собой Leu или Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> где Xaa представляет собой Thr, Met, Leu, His, Tyr, Glu или

Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(11)

происхождения

<400> 265

Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Tyr Pro Leu Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<---

Claims

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть, которое специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека (ИЛ-7R), причем указанное антитело к ИЛ-7R и его антигенсвязывающая часть содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи (НС) и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи (LC), причем

(v) CDR2 легкой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 17;

2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть по п. 1, причем CDR1 тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, указанную в любом из SEQ ID NO: 31-46.

3. Иммуноконъюгат, который специфически связывается с альфа-цепью рецептора ИЛ-7 человека (ИЛ-7R), причем указанный иммуноконъюгат содержит антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающую часть по п. 1 или 2, связанное с терапевтическим агентом.

4. Набор для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания, причем указанный набор содержит антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающую часть по п. 1 или 2, а также инструкцию по применению.

5. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), в котором VH включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и VL включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20.

6. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 5, причем антитело к ИЛ-7R содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 21, и легкая цепь включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

7. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 1 или 2, в котором антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

8. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 7, в котором антитело представляет собой антитело IgG1.

9. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 8, содержащее Fc IgG1, который не является эффекторным.

10. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 5, в котором антитело выбрано из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

11. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 10, в котором антитело представляет собой антитело IgG1.

12. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 11, содержащее Fc IgG1, который не является эффекторным.

13. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 1 или 2, в котором его антигенсвязывающая часть представляет собой Fab, F(ab')2, Fv или scFv.

14. Антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающая часть по п. 5, в котором его антигенсвязывающая часть представляет собой Fab, F(ab')2, Fv или scFv

15. Композиция для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания, причем указанная композиция содержит антитело к ИЛ-7R или его антигенсвязывающую часть по любому из пп. 1 и 5-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Композиция по п. 15, причем воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника, ревматоидный артрит (РА), псориаз, псориатический артрит, системную красную волчанку (СКВ), волчаночный нефрит, васкулит, сепсис, синдром системной воспалительной реакции (ССВР), диабет I типа, болезнь Грейвса, рассеянный склероз (PC), аутоиммунный миокардит, болезнь Кавасаки, ишемическую болезнь сердца, хроническую обструктивную болезнь легких, интерстициальное заболевание легких, аутоиммунный тиреоидит, склеродермию, системный склероз, остеоартрит, атопический дерматит, витилиго, реакцию «трансплантат против хозяина», синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит, синдром Гудпасчера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, аллергию или астму.

17. Иммуноконъюгат по п. 3, в котором терапевтический агент представляет собой антиметаболит, алкилирующий агент, связывающий малые бороздки ДНК агент, интеркалятор ДНК, сшивающий ДНК агент, ингибитор гистондеацетилазы, ингибитор ядерного экспорта, ингибитор протеасом, ингибитор топоизомеразы I или II, ингибитор белков теплового шока, ингибитор тирозинкиназы, антибиотик или антимитотический агент.