CN116234830A - Flt3配体融合蛋白及使用方法 - Google Patents

Flt3配体融合蛋白及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种无效应子免疫球蛋白Fc蛋白、无效应子Fc蛋白与Flt3配体的融合物及其使用方法。

Description

FLT3配体融合蛋白及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月7日提交的美国临时专利申请第63/062,713号的优先权权益，该临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已于2021年7月28日以ASCII副本的形式以电子方式提交，其全文以引用方式并入本文，名为P36298-WO_SL.txt，并且大小为128,413字节。
技术领域
本发明涉及Flt3配体融合蛋白及其使用方法。
背景技术
许多研究支持免疫系统成分的差异存在在癌症进展中的重要性(Jochems和Schlom,Exp Biol Med,236(5):567-579(2011))。临床数据表明，高密度的肿瘤浸润性淋巴细胞与改善的临床结果有关(Mlecnik等人，Cancer Metastasis Rev.；30:5-12,(2011))。肿瘤免疫浸润包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)、肥大细胞、自然杀伤(NK)细胞、初始淋巴细胞和记忆淋巴细胞、B细胞和效应T细胞(T淋巴细胞)，它们主要负责对肿瘤细胞表达的抗原的识别和随后T细胞对肿瘤细胞的破坏。
尽管癌细胞呈递抗原并且存在可能与肿瘤细胞发生反应的免疫细胞，但在许多情况下，免疫系统不会被活化或被肯定地抑制。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。总体结果是T细胞应答受损和细胞凋亡诱导或CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫能力降低。抗原呈递功能和树突状细胞(DC)的抑制另外有助于逃避抗肿瘤免疫力(Gerlini等人，Am.J.Pathol.165(6),1853-1863(2004)。
此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质可导致不表达靶抗原的癌细胞亚群逃逸。因此，找到一种促进免疫系统抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有相当大的治疗益处。
免疫检查点与肿瘤介导的抗肿瘤免疫力下调有关。已经证明，T细胞功能障碍与抑制性受体CTLA-4和程序性死亡1多肽(PD-1)(CD28家族受体的成员)的诱导表达同时发生。然而，尽管近年来进行了广泛的研究，但免疫疗法在临床环境中的成功仍然有限。监管机构批准的治疗剂很少，并且其中大多数患者并未体验到益处。近年来，免疫检查点与抗肿瘤免疫力的下调有关，并被用作治疗靶标。这些观察结果强调需要开发利用免疫系统对抗癌症的新治疗方法。
人Flt3L(Fms样酪氨酸激酶3配体)是一种刺激骨髓细胞增殖的I型跨膜蛋白，于1994年被克隆(Lyman等人，1994)。可溶性hFlt3L的用途已在各种临床前和临床环境中进行了探索，包括为骨髓移植做准备的干细胞动员、癌症免疫疗法(如树突状细胞的扩增)以及疫苗佐剂。然而，还没有基于Flt3L的药物组合物在临床上取得超过2期的进展。
一个挑战是优化对Flt3L配体的暴露并确定最佳给药方案，同时最大限度地减少不良副作用或潜在的不利免疫效应。例如，可以通过改变给药方案、改变给药量或改变治疗分子的药代动力学和/或药效学特性来调节暴露。本文提供具有有益PK/PD特性的Flt3L-Fc融合蛋白，其有益于增强对癌症患者的免疫疗法。
发明内容
本发明提供无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白(包括包含与无效应子免疫球蛋白Fc蛋白融合的活性Flt3配体(Flt3L)的Flt3配体融合蛋白)及其使用方法。使用无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白和Flt3L-Fc融合蛋白的方法包括治疗癌症，尤其是治疗接受检查点免疫疗法的患者的癌症。本发明进一步提供无效应子IgGFc蛋白。
在一方面，提供无效应子Fc蛋白，其包含与残基SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID No:20)或者SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID No:20)并且SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含PVAGP(SEQ IDNO:20)，这在本文中可称为涵盖PVA#变体，并且其中SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为N297G突变，其中297是指抗体的EU编号。
在一些实施例中，无效应子Fc蛋白包含SEQ ID NO:2、4、5、6、13或15的蛋白质序列。
在又一些实施例中，无效应子IgG1 Fc蛋白相对于包含SEQ ID NO:12的野生型IgG1 Fc区是减弱的。
在一些方面，提供了包含无效应子Fc蛋白的抗体，其包含与残基SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)或者SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。
在一些实施例中，抗体与Flt3L受体结合。
在一些实施例中，抗体与检查点抑制剂蛋白结合。在其他实施例中，检查点抑制剂蛋白是PD-L1、PD-1和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。
在一些方面，提供了包含本公开的无效应子Fc蛋白和第二蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，无效应子Fc蛋白和第二蛋白彼此共价连接。在其他实施例中，无效应子Fc蛋白和第二蛋白通过二硫键连接。
在一些方面，提供了编码本公开的无效应子Fc蛋白的经分离的核酸、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含如本文和上文所述的无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，经分离的核酸编码SEQ ID NO:2、4、5、6、13或15的蛋白质序列。在其他实施例中，经分离的核酸进一步编码在无效应子Fc蛋白的N末端的信号序列。在一个优选实例中，经分离的核酸编码SEQ ID NO:13的蛋白质序列。
在一些方面，提供了如本文和上文所述的包含编码本公开的无效应子Fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白。
在一些方面，提供了产生本公开的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白的方法，该方法包括培养包含编码本公开的无效应子Fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白，使得产生所述蛋白质中的每一个。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞回收本公开的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是CHO细胞。
在一些方面，提供了包含编码本公开的无效应子Fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白。
在一些方面，提供了产生本公开的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白的方法，该方法包括培养包含编码本公开的无效应子Fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白，使得产生本公开的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞回收本公开的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体和/或包含无效应子Fc蛋白的异二聚体蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是CHO细胞。
在一方面，提供了包含无效应子Fc蛋白的融合蛋白，其包含无效应子Fc蛋白(SEQID NO:13或其变体)和第二蛋白，其中所述第二蛋白是靶蛋白的配体。在一些实施例中，配体在配体与靶蛋白结合时调节靶蛋白。在一些实施例中，第二蛋白是Flt3L。在其他实施例中，靶蛋白是Flt3L受体。在优选的实施例中，第二蛋白位于无效应子Fc蛋白的N末端。
在一些实施例中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的Fc蛋白，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID No:20)或者SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ IDNO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID No:20)并且SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含PVAGP(SEQ ID NO:20)，这在本文中可称为涵盖PVA#变体，并且其中SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为N297G突变，其中297是指抗体的EU编号。
在一方面，融合蛋白包含Flt3配体(Flt3L)和无效应子IgG1 Fc区，其中所述Flt3L-Fc融合蛋白具有相对于包含SEQ ID NO:12的野生型IgG1 Fc区减弱的效应子功能。
在Flt3L-Fc融合蛋白的一些实施例中，Flt3L包含蛋白质，所述蛋白质包含与SEQID NO:21的残基27-167至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，Flt3L包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代。在其他实施例中，1、2或3个氨基酸取代不存在于结合FcRn蛋白的Flt3L区域中。在一些实施例中，所述突变Flt3L多肽包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
在Flt3L-Fc融合蛋白的一些实施例中，Flt3L包含蛋白质，所述蛋白质包含SEQ IDNO:21的氨基酸27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184或27-185。在Flt3L-Fc融合蛋白的优选实施例中，Flt3L包含由SEQ ID NO:21的氨基酸27-167或SEQ IDNO:21的氨基酸27-168组成的氨基酸序列。在其他实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白的Flt3L不包含SEQ ID NO:21的168-235、169-235、170-235、171-235、172-235、173-235。在又一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白的Flt3L不包含氨基酸序列PWSPRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:48)、WSPRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:49)、SPRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:50)、PRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:51)、RPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:52)或PLEATAPTAPQPP(SEQID NO:53)。
在Flt3L-Fc融合蛋白的一些实施例中，Flt3L包含与包含SEQ ID NO:21的氨基酸27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184或27-185的蛋白质至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的蛋白质。
在Flt3L-Fc融合蛋白的一些实施例中，Flt3L包含与包含SEQ ID NO:21的氨基酸24-167、25-167、26-167、24-168、25-168、26-168、24-169、25-169或26-169的蛋白质至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的蛋白质。
在Flt3L-Fc融合蛋白的一些实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)或者SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID No:20)并且SEQ IDNO:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子IgG1 Fc区包含与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含PVAGP(SEQ ID NO:20)，这在本文中可称为涵盖PVA#变体，并且其中SEQ ID NO:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为N297G突变，其中297是指抗体的EU编号。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:26至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:26至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:26的残基154-158包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:26的残基217是甘氨酸。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:25至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:25的残基155-159包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:25的残基218是甘氨酸。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:32至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:32的残基153-157包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:32的残基216是甘氨酸。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:33至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:33的残基152-156包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:33的残基215是甘氨酸。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:34至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:34的残基151-154包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:34的残基214是甘氨酸。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白包含与选自由SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:44组成的蛋白质至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白在体外测定中以一定活性水平活化抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，所述活性水平低于包含与野生型IgG1 Fc(SEQ ID NO:12)融合的野生型Flt3L的Flt3L-Fc融合蛋白在体外测定中的活性水平的约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施例中，ADCP体外测定包括使用原代巨噬细胞作为效应细胞和使用表达Flt3L受体的细胞系作为靶细胞。在又一些实施例中，原代巨噬细胞是来自健康人类供体的单核细胞来源的巨噬细胞。在其他实施例中，靶细胞是人急性成淋巴细胞性白血病细胞，任选地是SEM细胞系细胞。在一些实施例中，活性以吞噬作用百分比(％ADCP)的形式测量，其中吞噬作用通过测量从靶细胞摄取视觉标记物来确定。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白在已施用该融合蛋白的受试者中活化DC扩增。在其他实施例中，在受试者的全血中测量DC扩增。在又一些实施例中，DC扩增通过流式细胞术或FACS测量。在一些实施例中，DC扩增至少是施用未与异源蛋白融合的Flt3L蛋白导致的DC扩增的5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍或10,000倍。在其他实施例中，异源蛋白是野生型人IgG Fc蛋白。在其他实施例中，野生型人IgG Fc蛋白是野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc蛋白。在一些实施例中，Flt3L蛋白不与野生型IgG1 Fc蛋白或人血清白蛋白融合。在一些实施例中，受试者是啮齿动物、兔、食蟹猴或人。在其他实施例中，啮齿动物是小鼠或大鼠。
在一些实施例中，与具有SEQ ID NO:14的Flt3L-Fc融合蛋白的热稳定性相比，Flt3L-Fc融合蛋白具有增加的热稳定性。在其他实施例中，热稳定性使用差示扫描荧光测定法测量。在又一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白的解链温度(Tm)比具有SEQ ID NO:14的Flt3L-Fc融合蛋白的Tm高至少1.5℃、2℃、3℃、4℃或5℃。
在一些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白在Flt3L结构域中含有单个氨基酸取代。在其他实施例中，取代降低体内免疫原性但不使功能活性降低超过10％、20％或30％。在其他实施例中，功能活性测定是动物中树突状细胞的扩增。
在一些方面，提供了编码如本文和上文所述的Flt3L-Fc融合蛋白的经分离的核酸。在一些实施例中，经分离的核酸编码SEQ ID NO:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44的蛋白质序列。在其他实施例中，经分离的核酸进一步编码在Flt3L-Fc融合蛋白的N末端的信号序列。在一个优选实例中，经分离的核酸编码SEQ IDNO:45的蛋白质序列。
在一些方面，提供了包含编码如本文和上文所述的Flt3L-Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞。
在一些方面，提供了产生Flt3L-Fc融合蛋白的方法，该方法包括培养包含编码无效应子Flt3L-Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，使得产生Flt3L-Fc融合蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞中回收Flt3L-Fc融合蛋白。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是CHO细胞。
在一些方面，提供了药物制剂，其包含如本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白以及药用载体。
在一些实施例中，该药物制剂进一步包含附加的治疗剂。在又一些实施例中，附加的药物药剂是佐剂、树突状细胞成熟因子和/或检查点抑制剂。
在一些方面，提供了用于扩增施用Flt3L-Fc融合蛋白的受试者中树突状细胞(DC)的数量的方法。在一些实施例中，DC是cDC1和/或cDC2细胞。在其他实施例中，该方法包括向受试者施用本发明的Flt3L-Fc融合蛋白。
在一些实施例中，该方法包括向受试者施用约0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.1mg/kg至25mg/kg、0.1mg/kg至20mg/kg、0.1mg/kg至15mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至25mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg或1mg/kg至10mg/kg的剂量的Flt3L-Fc融合蛋白。
在一些实施例中，该方法包括约每天一次、每周一次、每周两次、每2周一次、每3周一次、每月一次或每隔一个月一次向受试者施用Flt3L融合蛋白。
在一些实施例中，该方法包括通过静脉内施用、肠胃外施用、肌内注射或皮下注射向受试者施用Flt3L融合蛋白。
在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白。在一些实施例中，该方法包括施用治疗有效量的Flt3L-Fc融合蛋白和施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂。在其他实施例中，免疫检查点抑制剂压制或抑制PD-1或PD-L1的作用。在又一些实施例中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、BMS 936559、阿特珠单抗或阿维单抗。在其他实施例中，检查点抑制剂在施用Flt3L-Fc融合蛋白之前、同时或之后施用。
在一些实施例中，该方法进一步包括施用树突状细胞(DC)成熟因子。在其他实施例中，DC成熟因子选自polyIC、poly-ICLC、CD40激动剂、放射疗法和化学疗法。在其他实施例中，DC成熟因子在施用Flt3L-Fc融合蛋白之前、同时和/或之后施用给个体。在特定实施例中，DC成熟因子是放射疗法。在一些实施例中，该方法包括在受试者已接受DC成熟因子之后向受试者施用Flt3L-Fc融合蛋白。在其他实施例中，该方法包括在受试者接受DC成熟因子之前向受试者施用Flt3L-Fc融合蛋白。在又一些实施例中，方法包括在受试者接受DC成熟因子的大约同时向受试者施用Flt3L-Fc融合蛋白
在一些实施例中，癌症选自由以下各项组成的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、黑素瘤、胰腺导管腺癌(PDAC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、结直肠癌(CRC)、乳腺癌、膀胱癌、肾癌或其组合。
在一些实施例中，先前曾用检查点抑制剂治疗受试者。在其他实施例中，受试者对检查点抑制剂疗法没有应答，其中所述检查点抑制剂疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。
在一些实施例中，用放射疗法治疗受试者，其中所述放射疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。
在一些实施例中，用化学疗法治疗受试者，其中所述化学疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。
在一些实施例中，受试者的癌症已表征为包含免疫沙漠型肿瘤。在其他实施例中，癌症已被表征为包含相对于反应性发炎肿瘤(“热肿瘤”)具有减轻的炎症的肿瘤(“冷肿瘤”)。
附图说明
图1显示了具有野生型或变体Fc结构域的抗Her2抗体的不同ADCP活性水平。将原代M1巨噬细胞与SkBr3靶细胞一起孵育。x轴显示抗体浓度，并且y轴显示吞噬作用百分比。
图2A-2E显示了当具有野生型或变体Fc结构域的抗Her2抗体与原代M1巨噬细胞和SkBr3靶细胞一起孵育时巨噬细胞释放的细胞因子。x轴显示抗体浓度，并且y轴显示pg/ml细胞因子。图2A：G-CSF；图2B：GM-CSF；图2C：IL-10；图2D：IL-1ra；图2E：IL-6。
图2F-2J显示了当具有野生型或变体Fc结构域的抗Her2抗体与原代M1巨噬细胞和SkBr3靶细胞一起孵育时巨噬细胞释放的细胞因子。x轴显示抗体浓度，并且y轴显示pg/ml细胞因子。图2F：IL-8；图2G：MIP-1α；图2H：MIP-1β；图2I：RANTES；图2J：TNFα。
图2K显示了具有野生型和变体Fc蛋白的抗CD20抗体的ADCC活性。
图2L显示了具有野生型和变体Fc蛋白的抗Her2抗体的ADCC活性。
图3A-3C显示了Flt3L-FcNG2LH融合蛋白在聚集和二硫键特性方面的不同特征。hFLT3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA#聚集和在CHO细胞和HEK293细胞中表达的蛋白质二聚体形成的分析通过SDS-PAGE(图3A)和SEC-HPLC(图3B：293细胞和(图3C：HEK297细胞)显示。对于图3B-3C，x轴是时间，并且y轴是mAU。
图3D-3F显示了Flt3L-FcNG2LH融合蛋白在聚集和二硫键特性方面的差异特征。hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#聚集和在CHO细胞和HEK293细胞中表达的蛋白质二聚体形成的分析通过SDS-PAGE(图3D)和SEC-HPLC(图3E：293细胞和图3F：HEK297细胞)显示。对于图3E-3F，x轴是时间，并且y轴是mAU。
图4A-4B显示了Flt3L在体外诱导OCI-AML5细胞的增殖。图4A显示了hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH和gCDX-301的剂量应答曲线。显示的数据是一式三份值的平均值±SD。将数据标准化为作为最大(100％)响应的10ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH。图4B显示了hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH和gCDX-301的EC50效力。结果显示自5个独立实验，线条标记为平均值±SEM。
图5显示了在给予0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg融合蛋白的动物中检测到的Flt3L-Fc(SEQ ID NO:28)融合蛋白的血清浓度。
图6A-6B显示了施用0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg融合蛋白的动物中单核细胞(图6A)和DC(图6B)的剂量依赖性细胞扩增。抗gD是阴性对照人源化IgG抗体。
图7显示了施用0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg融合蛋白的动物中Flt3L-Fc(NG2LH)的血浆浓度。抗gD是阴性对照人源化IgG抗体。
图8A-8C显示了施用0.1mg/kg、1mg/kg或10mg/kg融合蛋白的动物中单核细胞(图8A)、cDC1细胞(图8B)和cDC2细胞(图8C)的剂量依赖性细胞扩增。抗IgD是阴性对照人源化IgG抗体。
图9A显示了所选的含Fc蛋白的免疫原性。
图9B显示了所选的含Fc蛋白的免疫原性。
图10显示了来自如实例10中所述的一种代表性体外ADCP测定的结果，该结果比较了各种Flt3L-Fc蛋白的ADCP活性。
具体实施方式
I.定义
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
术语“Flt3配体”也称为“Flt3L”，是指能够以足够的亲和力结合Flt3受体的蛋白质，使得该蛋白质可用作靶向Flt3受体(Flt3R)的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中，如例如通过放射免疫测定(RIA)所测量，Flt3配体与不相关的非Flt3R蛋白的结合程度小于该蛋白质与Flt3L的结合的约10％。在某些实施例中，与Flt3R结合的蛋白的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，Flt3L与Flt3R结合，该Flt3R在来自不同物种的Flt3R中是保守的。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“Flt3L”是指切割的可溶性Flt3L(例如，SEQ ID NO:21的大约残基27-185)，但也可以指来自任何脊椎动物来源的任何天然Flt3L，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语可以涵盖“全长”、未加工的Flt3L以及任何形式的Flt3L，该Flt3L是在细胞中加工，例如，去除信号肽(前导序列)或从TM结构域切割而产生的。该术语还涵盖Flt3L的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。具有内源信号序列的示例性人Flt3L的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:21中，并且也提供在GenBank登录记录P49771中，而在其他实施例中，没有外源前导序列的成熟Flt3L蛋白的氨基酸序列作为SEQ ID NO:21的残基27-167提供。本发明还考虑了较小的序列变异，尤其是不影响Flt3L功能和/或活性(例如，结合Flt3受体(GenBank登录号NP_004110)的Flt3L的保守氨基酸取代。
如本文所用，术语“Flt3L-Fc融合蛋白”或可替代地“Fc-无效应子Flt3L-Fc融合蛋白”是指其中Flt3L多肽直接或间接连接至变体IgG Fc区的融合蛋白，其中变体Fc区相对于其对应的野生型Fc区具有减弱的效应子功能。应注意，对于术语“无效应子Flt3L-Fc融合蛋白”的任何使用，术语“无效应子”适用于融合蛋白的Fc部分。在某些优选的实施例中，本发明的Flt3L-Fc融合蛋白包含与人IgG Fc区连接的人Flt3L蛋白或多肽。在某些实施例中，人Flt3L蛋白包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。然而，应当理解，本发明也涵盖Flt3L或Fc的微小序列变异如插入、缺失、取代，尤其是保守氨基酸取代，该序列变异不会显著影响本发明的Flt3L或无效应子Flt3L-Fc融合蛋白(例如，SEQ ID NO:26)的功能和/或活性。本发明的无效应子Flt3L-Fc融合蛋白可以结合Flt3受体蛋白(Flt3)，这可以导致Flt3受体下游信号传导。如本文所用，CDX-301是指具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的Flt3L。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“效应子功能”是指归因于抗体的Fc区、分离的Fc区或与另一种蛋白质融合的Fc区的那些生物活性，其中Fc区随来源抗体的同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。在某些实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白不表现出任何效应子功能或任何可检测的效应子功能。在某些其他实施例中，Flt3L-Fc融合蛋白表现出显著降低的效应子功能，例如相对于包含与具有SEQ ID NO:12的野生型Fc蛋白融合的本发明的Flt3L蛋白的融合蛋白降低约50％、60％、70％、80％或90％的效应子功能。
如本文所用，“树突状细胞扩增”、“树突状细胞的扩增”或“树突状细胞数量的增加”是指在体外测定中或在体内实验中测量的树突状细胞数量的增加。
药剂(例如，药物制剂)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所期望的治疗或预防结果的量。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
如本文所用，“T细胞活化”是指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞响应，选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于该原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该个体或受试者为人。
“分离的”蛋白质或多肽为已经从其自然环境的组分中分离的蛋白质或肽。在一些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将蛋白质纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“编码Flt3L-Fc融合蛋白的经分离的核酸”是指编码Flt3L-Fc融合蛋白的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列相同的百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列相同的百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列相同的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从该源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，该UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以另选地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用载体”是指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的融合蛋白用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
短语“治疗有效量”是指用于以下情况的本发明的蛋白质的量：(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。在癌症的情况下，如本文所述的治疗剂或药剂组合的治疗有效量可以减少癌细胞数；减小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)癌细胞浸润周围器官；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解癌症相关的一种或多种症状。在某种程度上，如本文所述的治疗剂或药剂组合可阻止生长和/或杀死既存癌细胞，它可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。对于癌症治疗，例如，可以通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定缓解率(RR)来衡量疗效。
如本文所用，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受控制为特征的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。肿瘤包括实体瘤和液体瘤。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更多特定实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”))、肺腺癌和肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、恶性脑肿瘤、黑素瘤、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌(AML)。
如本文所用，术语“冷肿瘤”或“免疫沙漠”是指癌性肿瘤，其免疫原性低或以肿瘤特异性免疫力的不充分引发和对免疫原性细胞毒性的抗性为特征。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
A.无效应子Fc蛋白
在一方面，本发明提供了一种新的无效应子IgG1 Fc蛋白，其效应子活性出人意料地降低。本文设计和描述的Fc蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，并且在本文中也称为“FcNG2LH”或“Fc NG PVA#”。如本文所示，与具有野生型IgG1 Fc结构域的蛋白质相比，FcNG2LH Fc蛋白具有显著降低的ADCP活性(参见例如，至少在实例1和10中)，以及降低的巨噬细胞释放细胞因子的活化(参见例如，实例1)和降低的ADCC活性。同样值得注意的是，相对于仅含N297G突变的IgG1 Fc结构域的热稳定性，FcNG2LH蛋白的热稳定性令人惊讶地增加。
无效应子IgG1 Fc结构域蛋白的设计除了在如本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白中的用途外，还具有在许多治疗分子方面的应用。例如，设计为通过将两个或更多个分子桥接在一起来结合并活化分子(例如细胞表面受体)的抗体，靶向检查点抑制剂的抗体，具有至少一个结合并诱导ADCC和/或ADCP活性的臂的双特异性或多特异性抗体。普通技术人员将理解本文所述的无效应子Fc蛋白用于生成融合蛋白的用途，其中无效应子Fc蛋白(例如，通过氨基酸键)连接至第二蛋白的N末端和/或C末端(分别连接至无效应子Fc蛋白的C末端和/或N末端)。第二蛋白优选是具有所需治疗功能的蛋白质。无效应子Fc结构域可以防止不良反应，如由IgG Fc受体结合引起的中性白细胞增多症。治疗性蛋白质领域需要不断开发改进Fc效应子功能控制的方法。
在一方面，本发明提供了其中重链恒定结构域包含SEQ ID NO:2的FcNG2LH蛋白的抗体。在一些实施例中，本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白包括免疫球蛋白和抗体。本领域的普通技术人员可以容易地设想多种抗原特异性抗体的格式，该抗体格式可以适应NG2LH突变的存在以及由此导致的效应子功能的缺乏或降低并从中受益。例如，本公开的人IgG1FcNG2LH可以是单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体的一部分。换言之，包括或可以包括IgG1 Fc结构域的任何免疫球蛋白结构。
B.示例性Flt3L-Fc融合蛋白
在一方面，本发明提供了与Flt3受体(Flt3R)结合的Flt3L-Fc融合蛋白，并且其中该Fc蛋白如与野生型Fc蛋白相比，几乎没有效应子功能或具有大大降低的效应子功能。这些融合蛋白可用于通过多种癌症免疫疗法治疗方案治疗癌症，尤其是在患者对检查点抑制剂免疫疗法无应答或对检查点抑制剂免疫疗法应答有限的情况下。认为在“冷肿瘤”或“免疫沙漠”中缺乏抗肿瘤免疫应答至少部分是由于抗肿瘤T细胞应答不足或缺乏。有效的抗肿瘤T细胞应答需要树突状细胞(DC)交叉呈递肿瘤抗原。
因此，提高癌症免疫疗法功效的一种方法是增加肿瘤内抗原呈递DC的数量。众所周知，Flt3L的部分功能是通过祖细胞的增殖、分化、发育和动员来增加受试者中的DC。虽然有证据表明对健康受试者施用Flt3L蛋白确实可以扩增DC和造血干细胞(例如，Anandasabapathy等人，2015,Bone Marrow Transplant.,50:924-930)，但一个问题是重组Flt3L在血液中的半衰期较短，可能导致治疗功效较低和/或需要过于频繁的给药。
延长治疗性蛋白质血清半衰期的成熟策略是将其连接或融合到免疫球蛋白Fc结构域(例如，通过肽键，优选在Fc蛋白的N末端连接或融合)(例如，Czajkowsky等人，2012,EMBO,4:1015-1028；Ha等人，2016,Front Immunol,7:394)。然而，在Flt3L-Fc融合蛋白用于例如癌症免疫疗法的情况下，具有功能性Fc结构域可能是不利的，该结构域可能原位活化许多不可预测的免疫性或炎性过程。事实上，重要的是将导致细胞因子风暴或细胞因子释放综合征(CRS)的施用风险最小化。此外，Flt3L-Fc融合蛋白结构域的野生型Fc与免疫效应细胞上的Fc受体之间的相互作用可能导致Flt3L-Fc融合蛋白结合的DC的吞噬破坏。重要的是最小化并由此控制Flt3L-Fc融合蛋白Fc区的作用，同时保持Fc区赋予的优势。本文描述了一种新的无效应子IgG Fc区，在本文中称为“Fc-NG2LH”或“Fc-PVA#N297G”，其显示出令人惊讶的低效应子功能(参见例如实例7)，尤其是与例如野生型IgG1 Fc、IgG1 Fc-N297G和IgG4 Fc区相比时。此外，如实例8所示，引入NG2LH变体导致Fc结构域的热稳定性意外增加以及对动物血清半衰期的影响。
Flt3L-Fc融合蛋白变体的其他表征显示如在体外T细胞增殖测定中所确定的，取代Flt3L W144会显著增加免疫原性，这表明去除Flt3L(SEQ IDNO:21)第149位的潜在氧化倾向可能不利于治疗性无效应子Flt3L-Fc融合蛋白产物。然而，相比之下，实例9显示，如通过体外T细胞增殖测定所确定的，在第149位和第151位的潜在糖基化位点的取代没有增加免疫原性，这表明这些和其他位置的突变可能适合制造Flt3L-Fc融合蛋白。
重要的是，如本文所公开的不同剂量的无效应子Flt3L-Fc融合蛋白的体内施用产生了树突状细胞的大量扩增(例如参见实例5)。此外，DC扩增水平可以说比用等效剂量的CDX-301观察到的要大得多。
Flt3L-Fc融合蛋白包含连接到IgG1 Fc区的Flt3配体(Flt3L)蛋白，其中IgG1Fc相对于融合到野生型IgG1 Fc Fc的相同Flt3L具有降低的效应子功能或没有效应子功能。Flt3L-Fc融合蛋白的Flt3L部分可以与细胞表面Flt3受体(Flt3R)结合。Flt3L蛋白的序列在GenBank登录号P49771(在本文中作为SEQ ID NO:21提供)中描述为长度为235个氨基酸的蛋白质，信号肽延伸自大约残基1-26，并且跨膜结构域延伸自大约残基185-205。残基29-159在GenBank记录中描述为Flt3配体，而Savvides等人(Nat Struct Bio,7:486-491)指出单独的残基27-160已显示出足以实现生物活性。在一些实施例中，本公开设想包含SEQ IDNO:21残基的Flt3配体结构域，N末端是SEQ ID NO:21的第24至30位的任何氨基酸残基，并且C末端是SEQ ID NO:21的第167-190位的任何氨基酸残基。虽然Savvides等人(同上)显示包含单独的残基27-160的多肽(并配置为二聚体)足以实现配体的功能活性，但是下文实例2中描述的研究显示使用N末端终止于SEQ ID NO:21的残基167的Flt3L蛋白例如共价连接至Fc N末端残基(SEQ ID NO:13的N末端残基)。应当理解，在本公开中也设想了Flt3L的变体，如包含与SEQ ID NO:21残基27-167具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质序列的成熟Flt3L蛋白。此处显示(例如，下面的实例3)与Fc蛋白融合的Flt3的片段大小可对融合蛋白的聚集产生显著影响。
在一个方面，本发明提供了一种Flt3L-Fc融合蛋白，其包含Flt3L蛋白和与SEQ IDNO:13至少95％相同的IgG Fc分子，该Flt3L蛋白包含与SEQ ID No:21的残基27-167至少95％相同的氨基酸序列。IgG Fc分子相对于野生型IgG1 Fc多肽(SEQ ID No:12)具有减弱的Fc效应子功能，其中Fc效应子功能选自CDC、ADC、ADCC和/或ADCP。在一些实施例中，IgGFc分子相对于野生型IgG1 Fc多肽具有减弱的ADCP活性。不受理论的束缚，认为Fc(NG2LH)蛋白的效应子功能低至不存在是由于在Fc(NG2LH)蛋白下铰链中存在N297G突变(在SEQ IDNO:13的第76位)和氨基酸PVAGP(SEQ ID NO:13的残基13-17)的独特组合。
a)取代、插入和删除性变体
在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的蛋白质变体。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表1中的“示例性取代”标题下，并且在下文中关于氨基酸侧链类别予以进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标融合蛋白中，并对产物进行所需活性(例如降低的免疫原性或降低的ADCP)筛选。
表1
Figure BDA0004113436180000211
Figure BDA0004113436180000221
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的Flt3L-Fc融合蛋白。Flt3L-Fc融合蛋白的其他插入变体包括Flt3L-Fc融合蛋白的N末端或C末端与增加Flt3L-Fc融合蛋白的血清半衰期的酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施例中，改变本文提供的Flt3L-Fc融合蛋白以增加或减少Flt3L-Fc融合蛋白的Fc部分被糖基化的程度。糖基化位点向Fc结构域的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
对于Fc区，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的Flt3L-Fc融合蛋白中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的无效应子Fc变体。
在一个实施例中，提供了Fc融合变体，其具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，岩藻糖的含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量为通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱测得的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，糖链中在Asn297处的岩藻糖的平均量，确定，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于297位上游或下游大约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd)。有关“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，特别是实例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供了包含两分型寡糖的Fc变体，例如，其中连接至融合变体的Fc区的双角寡糖被GlcNAc两分。此类Fc变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利号6,602,684(Umana等人)和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的Flt3L-Fc融合蛋白变体。此类Flt3L-Fc融合蛋白(以及因此Fc)变体可能具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)蛋白质衍生物
在某些实施例中，可进一步修饰本文提供的无效应子Fc蛋白、包含无效应子Fc蛋白的抗体或融合蛋白或Flt3L-Fc融合蛋白以含有本领域已知且容易获得的额外非蛋白质部分。适用于Flt3L-Fc融合蛋白衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接至Fc融合蛋白的聚合物的数目可变，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于Flt3L-Fc融合蛋白待改善的特定特性或功能、Flt3L-Fc融合蛋白衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
在另一个实施例中，提供了Flt3L-Fc融合蛋白和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分为碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害、但是将非蛋白质性部分加热至融合蛋白-非蛋白质性部分近端的细胞被杀死的温度的波长。
C.重组方法和组合物
Flt3L融合蛋白可以使用普通技术人员容易知道的重组方法和组合物来产生。在一个实施例中，提供了编码本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白的经分离的核酸。此类核酸可以编码包含Flt3L-Fc融合蛋白的Flt3L和Fc部分的氨基酸序列。在进一步的实施例中，提供一或多个包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施例中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施例中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各物转化)：(1)包含编码根据本发明的Flt3L多肽和Fc多肽的核酸的载体。在优选的实施例中，编码Flt3L多肽的核酸在编码Fc多肽的核酸的上游。此外，2个核酸位于单个操纵子中。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施例中，提供一种制备Flt3L-Fc融合蛋白的方法，其中该方法包括在适于表达Flt3L-Fc融合蛋白的条件下培养如上所提供的包含编码该Flt3L-Fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该Flt3L-Fc融合蛋白。
对于Flt3L-Fc融合蛋白的重组产生，将编码Flt3L-Fc融合蛋白的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码融合蛋白的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达无效应子Fc蛋白、含有Fc蛋白的抗体或融合蛋白或例如编码Flt3L-Fc融合蛋白的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生Flt3L-Fc融合蛋白，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达多肽，参见例如美国专利No.5,648,237、No.5,789,199和No.5,840,523。(另请参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)Flt3L-Fc融合蛋白可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码Flt3L-Fc融合蛋白的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的Flt3L-Fc融合蛋白。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化Flt3L-Fc融合蛋白的合适宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
D.测定
本文所提供的可以促进DC扩增的Flt3L-Fc融合蛋白的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域已知的各种测定进行鉴定、筛选或表征。
E.免疫缀合物
本发明还提供了免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本文的Flt3L-Fc蛋白，所述一种或多种细胞毒性剂为诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或它们的片段)或放射性同位素。
在一个实施例中，以类似于生成抗体-药物缀合物(ADC)的方式生成Flt3L-Fc蛋白的免疫缀合物，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登素类生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，CancerRes.53:3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类药物，诸如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地碱；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他他赛；单端孢菌素和CC1065。
在另一个实施例中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的Flt3L-Fc蛋白，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一个实施例中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的Flt3L-Fc蛋白。多种放射性同位素可用于制备放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备Flt3L-Fc蛋白和细胞毒剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。连接基可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割连接基”。例如，可以使用对酸不稳定的连接基、肽酶敏感的连接基、对光不稳定的连接基、二甲基连接基或含二硫键的连接基(Chari等人，Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
F.药物制剂
如本文所述的Flt3L-Fc融合蛋白的药物制剂通过将此类具有所需纯度的蛋白质与一种或多种任选的药用载体混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))，制成冻干制剂或水溶液的形式。药用载体在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体还包括间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0004113436180000291
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，可能需要进一步提供树突状细胞成熟因子和/或佐剂。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.编(1980)中。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有Fc融合蛋白的固态疏水聚合物的半透性基质，该基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何Flt3L-Fc蛋白可用于治疗方法。
在一个方面，提供一种用作药物的Flt3L-Fc蛋白。在进一步的方面，提供了用于癌症的Flt3L-Fc蛋白。在某些实施例中，提供一种用于治疗方法中的Flt3L-Fc蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了Flt3L-Fc蛋白以用于治疗患有癌症的个体的方法中，该方法包括向所述个体施用有效量的所述Flt3L-Fc蛋白。在一个此类实施例中，方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所述的治疗剂。在进一步的实施例中，本发明提供了用于扩增树突状细胞的Flt3L-Fc蛋白。在某些实施例中，本发明提供了用于扩增个体的树突状细胞的方法中的Flt3L-Fc蛋白，该方法包括向所述个体施用有效的Flt3L-Fc蛋白以扩增树突状细胞。根据上述实施中的任一者的“个体”优选地是人。
在进一步的方面，本发明提供了Flt3L-Fc蛋白在生产或制备药物中的用途。在一个实施例中，所述药物用于治疗癌症。在进一步的实施例中，该药物用于治疗癌症的方法，该方法包含向患有癌症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施例中，方法进一步包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所述的治疗剂。在进一步的实施例中，所述药物用于扩增树突状细胞。在进一步的实施例中，所述药物用于扩增个体的树突状细胞的方法中，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述药物以扩增树突状细胞。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。
在进一步的方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个实施例中，该方法包括向患有此类癌症的个体施用有效量的Flt3L-Fc蛋白。在一个此类实施例中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种如下文所述的另外的治疗剂。根据任何上述实施例的“个体”可以为人。
在进一步的方面，本发明提供了扩增个体的树突状细胞的方法。在一个实施例中，该方法包括向所述个体施用有效量的Flt3L-Fc蛋白以扩增树突状细胞。在一个实施例中，个体是人。
在进一步的方面，本发明提供了包含本文提供的Flt3L-Fc蛋白中的任一种的药物制剂，其例如用于以上治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物制剂包含本文提供的任何Flt3L-Fc蛋白以及药用载体。在另一个实施例中，药物制剂包含本文提供的任何Flt3L-Fc蛋白，以及至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。
本发明的Flt3L-Fc蛋白可以单独使用或与其他药剂组合用于疗法中。例如，本发明的Flt3L-Fc蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在单独施用的情况下，本发明的Flt3L-Fc蛋白的施用可以在施用另外的治疗剂或药剂之前、同时和/或之后进行。在一个实施例中，Flt3L-Fc蛋白的施用和另外的治疗剂的施用在彼此相距约1个月内，或在约1周、2周或3周内，或在约1天、2天、3天、4天、5天或6天内进行。本发明的Flt3L-Fc蛋白也可以与放射疗法组合使用。
本发明的Flt3L-Fc融合蛋白(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本发明的Flt3L-Fc融合蛋白将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。Flt3L-Fc融合蛋白不是必须地而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的药剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的Flt3L-Fc融合蛋白的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文该相同的剂量和施用途径使用，或以本文该剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的Flt3L-Fc融合蛋白的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病类型、Flt3L-Fc融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、是否以预防或治疗目的施用Flt3L-Fc融合蛋白、既往疗法、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的判断。Flt3L-Fc融合蛋白适当地一次性或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的Flt3L-Fc融合蛋白可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用至患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。Flt3L-Fc融合蛋白的一个示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的融合蛋白)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。
应当理解，任何上述制剂或治疗方法都可以使用本发明的免疫缀合物代替或补充Flt3L-Fc融合蛋白来进行。
H.制品
在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。所述制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。所述容器容纳组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合以有效治疗、预防和/或诊断病症，并且所述容器可具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的Fc融合蛋白。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，所述制品可包括(a)第一容器，该第一容器中含有包含本发明的Fc融合蛋白的组合物；以及(b)第二容器，该第二容器中含有包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂组合物。本发明该实施例中的制品还可包含包装插页，该包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。可替代地或另外地，该制品还可包含第二(或第三)容器，该第二(或第三)容器包含药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述制品还可包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制品可以包括本发明的免疫缀合物来代替或补充Flt3L-Fc融合蛋白。
III.实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
实施例1.无效应子Fc蛋白的设计
术语“NG2LH”是指包含IgG1 N297G取代并将IgG1的下铰链残基233-236(ELLG,SEQID NO:19)与人IgG2的残基233-236(PVA；在第236位无氨基酸，在本文中也称为“PVA#”)“互换”的人IgG1 Fc结构域，其中位置根据如Kabat中描述的EU索引编号。NG2LH Fc变体蛋白(在本文中也称为“PVA#NG”)的无效应子特性首先在全长抗体的背景下显示，并与野生型N297G和其他Fc变体IgG1以及IgG2和IgG4抗体进行比较，如下表2所定义。
表2
Figure BDA0004113436180000331
/>
Figure BDA0004113436180000341
构建了包含表2中列出的重链恒定区(CH1-CH3)的全长抗体，其编码抗Her2抗体(曲妥珠单抗(
Figure BDA0004113436180000342
Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.,USA)(在美国专利号6,407,213和Lee等人，J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中也有提及；本文称为SEQ ID NO:47)的轻链和重链可变结构域。这些抗Her2抗体的轻链包含天然人Cκ恒定区。将编码全长轻链和各种全长重链的核酸克隆到pRK哺乳动物表达载体中(Eaton等人，1986,Biochemistry 25:8343-47)。轻链和重链核酸载体在CHO细胞中共表达，并且抗体经由蛋白A亲和色谱法，然后经由尺寸排阻色谱法纯化。
然后使用原代巨噬细胞和过表达Her2的SK-BR-3人乳腺癌细胞系(
Figure BDA0004113436180000343
HTB-30)测试抗体对抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞因子释放(ADCR)的影响。抗gD抗体用作阴性对照抗体。将单核细胞从供体PBMC中分离出来，并用25ng/ml人MCSF-1刺激，并使其在T-175组织培养瓶中分化为巨噬细胞，持续5天至7天。在ADCP和细胞因子释放实验的前一天，所有巨噬细胞都用50ng/ml IFNγ(R&D Systems285-IF-100/CF)刺激以分化为M1巨噬细胞。通过accutase(Millipore SCR005)处理收获巨噬细胞和SK-BR-3GFP细胞。将取出的巨噬细胞和SK-BR-3细胞重新悬浮在培养基(X-Vivo 10；Lonza 04-743Q,10％HI FBS；Gibco 10438-026)中，浓度分别为2x106个细胞/ml和0.5x106个细胞/ml。设计96孔板图以确定测试条件(抗体变体和处理浓度)。在培养基中制备每种抗体变体的2X连续稀释液(6点10倍稀释系列：2000ng/ml、200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml、0.02ng/ml)。按照板图，将50ul巨噬细胞和50ul SK-BR-3添加到每个孔中，从而在每个孔中产生100k巨噬细胞和25k SK-BR-3细胞。将100uL的2X抗体连续稀释液按照板图加入96孔板的孔中。最终抗体处理浓度为1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml。将100uL培养基添加到含有巨噬细胞和SK-BR-3细胞的3个孔中作为“仅培养基”对照处理。将96孔板以20x g离心2分钟，然后在37℃下孵育约24小时。以400x g离心细胞4分钟，并收集上清液以通过Luminex Reader Millipore Multiplex分析ADCR。通过accutase处理将细胞从孔中取出。每个孔中的细胞用200ul FACS缓冲液(BD,554657)洗涤一次。用与Alexa 647(Invitrogen，Alexa Fluor 647抗体标记试剂盒，A20186)缀合的抗CD11b(BD,555385)和抗CD14(BD,555396)(FACS缓冲液中的1:100抗体缀合物)制备染色溶液。将50uL染色溶液添加到所有孔中，并在4℃下孵育30分钟至60分钟。用FACS缓冲液(每孔200ul)洗涤细胞两次。将每个孔中的细胞重悬于50ul FACS缓冲液中。通过FACS分析一个细胞板的ADCP效率。使用软件FlowJo分析FACS数据。在前向和侧向散射图中圈选细胞，然后针对Y轴上的GFP表达和X轴上的Alexa 647绘制。计算每个象限中的细胞百分比。SK-BR-3细胞主要位于第1象限(Q1，GFP阳性)，并且巨噬细胞主要位于第3象限(Q3，Alexa 647阳性)。计算每个孔的吞噬作用百分比：
％吞噬作用＝100％-(每个孔的Q1)/(3个仅培养基对照孔的平均Q1)
在图上相对于抗体处理浓度绘制抗体变体的吞噬作用百分比。
两个板由Luminex(Luminex Corp)分析。如图1所示，在增加浓度的LALAPG或NGLH2Fc抗Her2抗体的存在下，几乎没有观察到吞噬作用。使用IgG1野生型和IgG4抗体变体观察到最高水平的ADCP。对于IgG2野生型Fc和IgG1 PVA#Fc，观察到中等水平的吞噬作用。因此，图1显示IgG1 NG2LH和IgG1 LALAPG Fc结构域在体外测定中缺乏ADCP活性。实验显示在IgG1 NG PVAG和IgG1 NG PVA#GSS存在下ADCP活性的类似缺乏(数据未显示)。
来自ADCP测定的细胞因子释放概况结果提供于图2A-2J中。与吞噬作用数据一致，这些结果表明，与天然IgG1、IgG4和N297G(程度较小)相反，NG2LH变体在存在靶细胞的情况下不介导巨噬细胞的ADCR。
这些数据与来自和野生型IgG1 Fc相比的变体的ADCC报告基因测定的数据形成对比。来自奥瑞珠单抗(抗CD20)或曲妥珠单抗(抗Her2)的可变结构域与上述野生型和变体结构域融合，并在ADCC测定中进行测试。在此测定中，将NK细胞工程化为NFAT-RE-荧光素酶报告细胞，读出RcγRIIIa结合，然后在存在WIL2S CD20+细胞或SkBr3 Her2+细胞的情况下进行测定。对于具有野生型或变体结构域的抗CD20和抗Her2构建体二者，与野生型IgG1 Fc相比，所有非野生型Fc分子都具有最小的活性(参见图2K和2L)。
实施例2.Flt3L Fc融合蛋白的设计
使用常规核酸克隆、蛋白质表达和蛋白质纯化技术生成Flt3L-Fc融合蛋白。
PCR用于扩增含有编码所需嵌合Flt3L-Fc蛋白的Flt3L和Fc部分的核苷酸序列的cDNA(参见表3，SEQ ID NOS:10-31)。对于表3中描述的Flt3L-Fc蛋白(表10中提供的序列)的表达和产生，生成的cDNA包括人Flt3L的天然信号序列(GenBank登录号P49771的残基1-27；SEQ ID NO:21)。例如，为表达hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#蛋白而生成的cDNA包含编码具有Flt3L信号序列的融合蛋白的cDNA序列，在表10中提供为SEQ ID NO:45。
表3
Figure BDA0004113436180000361
Figure BDA0004113436180000371
将编码Flt3L-Fc融合体的cDNA亚克隆到哺乳动物表达载体pRK5(Gorman等人，DNAand Protein Engineering Techniques 2:1(1990)；美国专利号6,232,117)中并在CMV启动子的控制下表达。
CHO或HEK293细胞用所需的表达构建体瞬时转染，分别在适当的培养基中生长10天或6天，然后收获以用于纯化。
Flt3L-Fc融合构建体的纯化使用HiTrap MabSelect SuRe亲和捕获色谱法(GE)，然后使用Superdex 200SEC来实现，并且最后通过透析进行浓缩和缓冲液交换。
实施例3.Flt3L-Fc融合蛋白的表征
如实例2中所述生成的融合蛋白根据对溶液中聚集的敏感性以及二硫键的减少和损失进行表征，其各自通过SDS-PAGE(每孔3ug至5ug)和HPLC SEC(SuperDex 200；平衡缓冲液：200mM精氨酸，137mM琥珀酸，pH 5.0)来分析。来自使用从CHO细胞培养物纯化的Flt3L-Fc融合蛋白进行的实验的数据总结在下表4中，来自在CHO细胞和HEK293细胞中表达并从所述细胞中纯化的Flt3L-Fc融合构建体hFLT3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA#(SEQ ID NO:41)的示例性数据显示在图3A-3C中，并且来自在CHO细胞和HEK293细胞中表达并从所述细胞中纯化的Flt3L-Fc融合构建体hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#(SEQ ID NO:26)的数据显示在图3D-3F中。
表4
Figure BDA0004113436180000372
Figure BDA0004113436180000381
*ND＝未检测到
上表4中总结的变体数据分析显示存在于Flt3L分子的最后一个半胱氨酸和Fc(NG2LH)分子的第一个半胱氨酸之间的氨基酸残基数量(连接长度)可以影响聚集水平和/或二硫键形成。当连接长度小于14个残基时，每种构建体中多达30％似乎缺少分子间铰链二硫化物。5个氨基酸残基或更少的连接长度导致非常高的聚集。对于SEQ ID NOS.24、26、32、33和34的融合蛋白，观察到最低水平的聚集。对于SEQ ID NOS.25,26和32的融合蛋白，观察到最低水平的不完全铰链二硫键合，并且SEQ ID NOS.33和39还具有相对低水平的不完全铰链二硫化物。考虑到Flt3L和Fc蛋白的结构都已得到很好的表征并显示能够折叠为独立结构域，此处观察到的数据有些出乎意料。然而，值得注意的是，每个蛋白质结构域都含有对二硫键合和结构完整性很重要的半胱氨酸残基。因此，数据显示Flt3L-Fc(NG2LH)融合分子的设计需要仔细评估蛋白质产物，以确保充分的共价Fc-二聚化和最少或没有聚集。
实施例4.Flt3L活性的体外功能测定
进行体外测定以评估与Flt3L蛋白(无Fc融合；SEQ ID NO:23)的功能相比，Flt3L-Fc融合蛋白的功能特性。如此处所述进行的体外测定可用于测量Flt3L蛋白诱导表达Flt3受体的人细胞系增殖的效力。
Costar 96孔平底板(Cat#3610Thermo Fisher)在室温下用100uL聚-L-鸟氨酸(Cat#A-004-C EMD Millipore)包被过夜，用PBS洗涤3次并使其干燥。人OCI-AML5细胞(No.ACC 247,DSMZ)以每孔3000个细胞接种在100uL测定培养基(含有5％热灭活FBS、1XGlutamax的RPMI 1640)中。将Flt3L测试品在测定培养基中稀释至20ug/mL，并按1:10连续稀释。将100uL稀释的测试品添加到每个孔中(一式三份)以达到10ug/mL的最终起始浓度。最大和最小对照孔包括10ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH(SEQ ID NO:26)或单独的测定培养基。将测定板在37℃、5％ CO2下孵育7天。从每个孔中取出100uL上清液，然后将100uLCell Titer Glo(Cat#PR-G7572 Thermo Fisher)添加到每个孔中，并将板在黑暗中孵育8分钟至10分钟。用SpectraMax i3读板仪(Molecular Devices)测量发光。将原始值标准化为最大和最小对照孔。使用XLfit(IDBS)绘制每个测试品的剂量应答，并使用四参数逻辑曲线确定EC50值。显示在图4A-4B中的图是使用GraphPad Prism 7生成的。
这些数据显示hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH和gCDX-301均在体外诱导OCI-AML5细胞的剂量依赖性增殖。平均EC50效力值相当：hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH为2.5±0.5pM；gCDX-301为2.3±0.5pM。此外，hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH和gCDX-301可在体外诱导OCI-AML5细胞增殖，效力至少等同。
实施例5.小鼠PKPD研究
鉴于免疫系统的复杂性，在可以为该人Fc分子提供信息的哺乳动物受试者中显示药效学可能是重要的。如此处所述，用小鼠进行PK/PD研究。
该研究得到Genentech机构动物护理和使用委员会的批准，并使用SCID小鼠进行。动物被分成3组。第1组、第2组和第3组中的动物分别给予0.1mg/kg、1.0mg/kg和10mg/kg的FLT3L-Fc(SEQ ID NO:37--Flt3L.Q159.Fc.NG)。在选定的时间点收集全血以用于通过FACS进行细胞群计数。收集血浆并使用huFlt3L ELISA进行测定以确定每个样品中测试品的量。
下表5总结了组平均PK参数。
表5
Figure BDA0004113436180000391
表5中报告的NCA参数包括Cmax(首个剂量后观察到的最大血清浓度)；Cmax/剂量(剂量归一化的Cmax)；AUCinf(从第0天到无穷大的血清浓度-时间曲线下面积)；AUCinf/剂量(剂量归一化的AUC)；和CL(使用血清浓度-时间曲线计算的清除率)。
结果以图形示于图5中。
在第1组至第3组中，Cmax几乎与剂量成正比增加。观察到AUC的超过剂量比例的增加，表明靶标介导的药物处置(TMDD)影响所有剂量组的PK概况。此外，观察到总清除率(CL)具有剂量依赖性，表明靶标介导的CL。
来自外周血样品的平均单核细胞和DC计数显示在图6A(单核细胞)和图6B(DC)中。在所有三组中，在0.1mg/kg至10mg/kg的外周血中均观察到强烈的剂量依赖性细胞扩增。DC扩增的初始动力学在不同剂量之间是相似的，而扩增的持续时间是剂量/暴露依赖性的。
实施例6.食蟹猴的PKPD研究
使用施用于食蟹猴的不同剂量的Flt3L-Fc(NG2LH)蛋白(SEQ ID NO:26)进行额外的PKPD研究。这项研究是在Charles River Laboratories(Reno,NV)使用未经处理的食蟹猴进行的。动物被分成4组(2只雄性和1只雌性/组)。第1组的动物给予10mg/kg的抗gD(具有N297G突变的抗糖蛋白D人IgG1抗体)，而第2组、第3组和第4组的动物分别给予0.1mg/kg、1.0mg/kg和10mg/kg的FLT3L-Fc。第2组的动物接受单一剂量，而向其他组的动物施用两个剂量(研究第1天和第22天)。在选定的时间点收集全血以用于通过FACS进行细胞群计数。收集血清并使用抗huFlt3L-huFc ELISA进行测定以确定每个血清样品中测试品的量。
下表6A详细说明了每个动物组的给药。表6B中总结了组平均PK参数。
图6A
组 标称剂量 治疗
1 10mg/kg 抗gD(N297G)
2 0.1mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
3 1mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
4 10mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
表6B
Figure BDA0004113436180000401
结果以图形示于图7中。
在第2组至第3组中，Cmax增加几乎与剂量成正比。在第14天或之后在所有给药动物中检测到抗药物抗体(ADA)，并且暴露在具有高ADA滴度的动物中受到影响。在第一剂量后观察到AUC0-21的超过剂量比例的增加，表明靶标介导的药物处置(TMDD)影响PK概况，特别是在≤1mg/kg时。此外，观察到总清除率(CL)具有剂量依赖性，表明靶标介导的CL。在10mg/kg下，抗GD和FLT3L-Fc组具有相似的PK概况，并且FLT3L-Fc的总CL为4.92mL/天/kg。
所有四组的平均单核细胞、cDC1和cDC2计数显示在图8A-8C中。对于FLT3L-Fc处理的动物，在0.1mg/kg至1mg/kg的第一剂量后，在外周血中注意到强烈的剂量依赖性细胞扩增(单核细胞、cDC1和cDC2)。在10mg/kg下，观察到较少的扩增。不受理论的束缚，可能的扩增可能是高浓度的Flt3配体会阻止增殖和分化所需的受体二聚化。在1mg/kg至10mg/kg下，在第二剂量后观察到较低但持续的细胞扩增(可能是由于ADA的影响)。
实施例7.Fc(NG2LH)的FcγR和FcRn结合
Fc结构域的效应子功能会受到该结构域内某些氨基酸变化的影响。因此，通过Biacore测量Fc(NG2LH)与FcγR和FcRn受体的结合。对于这些测定，通过Biacore芯片上的抗His抗体捕获FcγR，或将FcRn直接固定在芯片上。在注射(缔合阶段)结束时收集数据，并通过将样品值除以标准值标准化来计算相对结合活性(％)。
PTD Biocore数据的总结提供于下表7中。该值显示在10ug/ml下的相对结合水平(％)。
表7
Figure BDA0004113436180000411
/>
Figure BDA0004113436180000421
实施例8.Fc(NG2LH)的热稳定性
FLT3L配体融合蛋白的热稳定性是开发治疗性生物制品的一个重要方面。在设计无效应子Fc(NG2LH)蛋白后，进行差示扫描荧光测定法(DSF)以了解氨基酸变化对Fc蛋白热稳定性的影响。DSF在存在荧光染料的情况下监测蛋白质的热展开，并且通常使用实时PCR仪器(例如，Bio-Rad CFX)执行。SYPRO橙色染料(Invitrogen，目录号S6650)在PBS中按1:20稀释。将1ul稀释染料添加到孔中的24ul Fab蛋白(约100ug/ml)中。随着实时PCR仪(Bio-Rad CFX)中温度从20℃升高至100℃，绘制荧光强度，并使用例如Boltzmann方程计算过渡曲线(Tm)的拐点。参见Nature Protocols,2007,2:2212-2221。
在全长抗体(具体而言，作为源自奥瑞珠单抗的抗CD20抗体和源自曲妥珠单抗的抗Her抗体)的背景下分析变体Fc蛋白。这些变体抗体的稳定性数据在下表8中提供。此外，还在包含表2中描述的序列但不存在CH1结构域并因此N末端开始于铰链序列DKTHT的分离的Fc区的背景下测试变体Fc蛋白。这些变体Fc蛋白的稳定性数据在下表9中提供。
表8
Figure BDA0004113436180000422
表9
Figure BDA0004113436180000431
数据显示，对于全长IgG和分离的Fc蛋白，将PVA#变体与N297G取代组合导致热稳定性相对于具有单独N297G突变的Fc构建体的热稳定性增加约2℃，这是出乎意料的。
实施例9.无效应子Flt3L-Fc融合蛋白的变体
进行实验以评估各种Flt3L-Fc融合蛋白的免疫原性。具体而言，在T细胞增殖测定中测试了某些蛋白质的免疫原性。如图9A所示，Flt3L.P167.Fc.NG2LH(SEQ ID NO:26)和Flt3L.L165.Fc.NG2LH(SEQ ID NO:33)都没有可检测的免疫原性。出乎意料的是，在引入Flt3L W144D突变(SEQ ID NO:42)后，检测到显著的免疫原性。
另一项实验评估了Flt3L蛋白糖基化变体的免疫原性。如图9A所示，N149E、S151D或S151E突变的引入没有引起任何可检测的CD4 T细胞增殖增加。N149E、S151D和S151E表示相对于SEQ ID NO:21的氨基酸变化和位置。
实施例10.ADCP测定中的无效应子Flt3L-Fc融合蛋白
进行实验以比较人重组蛋白Flt3L-Fc构建体的3种变体的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性：1)Flt3L-Fc-野生型IgG1(SEQ ID NO:27)；具有hIgG1.NG2LH的Fc的Flt3L(SEQ ID NO:26)；和3)具有hIgG1.N297G的Flt3L(SEQ ID NO:28)。EB10.hIgG1(抗Flt3单克隆抗体(Piloto等人，2006,Cancer Res.66:4843-4851))用作阳性对照。使用来自健康人类供体的原代单核细胞来源的巨噬细胞作为效应细胞和SEM(人类急性成淋巴性细胞白血病细胞)作为靶细胞进行ADCP测定。简而言之，通过阳性选择(Miltenyi Biotec Inc,Auburn,California)从健康人PBMC中分离出CD14阳性细胞来生成原代人巨噬细胞，并将其在巨噬细胞分化培养基(RPMI1640，10％ FBS，1％ Glutamax，1％青霉素/链霉素和20ng/mL M-CSF(R&D Systems,Minneapolis,MN))中在加湿培养箱中于37℃、5％ CO2下培养。第3天，用50ng/mL的M-CSF刺激细胞并再培养4天。第7天，巨噬细胞用10μM Cell Trace Violet(Thermo Fisher Scientific,Eugene,OR)染色，在ADCP测定培养基(IMDM，10％ FBS，1％Glutamax，1％青霉素/链霉素)中稀释至1×106个细胞/mL，并以50uL/孔添加到96孔低粘附U型底板(Costar,Corning,NY)中。靶SEM细胞在ADCP测定培养基中稀释至2×106个细胞/mL，用pHrodo(Thermo Fisher Scientific,Eugene,OR)预先标记，并添加(50uL/孔)到含有巨噬细胞的测定板中。然后将100uL测试抗体的连续稀释液(表1)添加到每个含有巨噬细胞和SEM细胞的孔中，然后在37℃和5％二氧化碳中孵育4.5小时。3倍连续稀释后，抗体的最终浓度范围为0.457ng/mL至3000ng/mL，每个测试抗体总共11个样品。孵育后，将细胞以1200rpm离心5分钟，并在PBS中洗涤，然后在4℃下固定在4％多聚甲醛中10分钟。用流式细胞仪(BD Biosciences FACSCanto IVD 10)分析细胞。通过FlowJo(Tree Star,Inc.；Ashland,OR)分析吞噬作用。Cell Trace Violet荧光用于对样品群中的巨噬细胞进行圈选。通过测量pHrodo Green阳性巨噬细胞的百分比来确定吞噬作用。通过从对照条件(不存在抗体)中减去pHrodo Green阳性巨噬细胞百分比来标准化吞噬作用的程度。所有数据点均一式两份收集。针对抗体浓度绘制吞噬作用百分比(％ADCP)，并使用GraphPad Prism(LaJolla,CA)拟合至四参数模型。该程序是在3名供体的独立实验中进行的。
在这项研究中，表达Flt3的SEM细胞用作靶细胞。SEM靶细胞用在酸性pH下发出明亮荧光的pHrodo AM预先标记。随着含靶细胞的吞噬体的酸性变得越来越大，pHrodo绿色荧光信号增加，这可以在流式细胞仪上检测到。在三个独立实验中使用来自三个不同供体的单核细胞来源的巨噬细胞检查和比较具有hIgG1.NG2LH的Fc的Flt3L(SEQ ID NO:26,5.1mg/mL)，具有hIgG1.N297G的Flt3L(SEQ ID NO:28,1.92mg/mL)，具有WT IgG1的Flt3L(SEQ ID NO:27,2.5mg/mL)和EB10.hIgG1(3.17mg/mL)诱导的ADCP活性。
所有数据点均一式两份收集，并针对测试分子的浓度(药物浓度：3ug/mL-0.457ng/mL)绘制吞噬作用百分比(％ADCP)的平均值。数据用四参数模型拟合。代表性的剂量应答ADCP曲线显示在图10中。受到ADCP测定的固有限制，在所有三个实验中，在Flt3表达细胞中观察到由具有WT IgG1的Flt3L和EB10.hIgG1诱导的ADCP活性。此外，FLT3L-Fc-IgG-N297G诱导相对低的ADCP，而FLT 3L-Fc-IgG NG2LH几乎没有检测到ADCP活性。
可以进行另外的研究以测量包含Fc NG2LH(SEQ ID NO:13)的另外的Flt3L-Fc融合蛋白(例如在Flt3L部分中含有1、2或3个氨基酸取代的Flt3L-Fc融合蛋白)的ADCP活性。此类研究可以显示，其他Flt3L-Fc融合蛋白几乎没有ADCP活性，但可以在体内活化DC的扩增。
表10序列表
Figure BDA0004113436180000451
/>
Figure BDA0004113436180000461
/>
Figure BDA0004113436180000471
/>
Figure BDA0004113436180000481
Figure BDA0004113436180000482
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Figure BDA0004113436180000491
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Figure BDA0004113436180000501
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Figure BDA0004113436180000511
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Figure BDA0004113436180000521
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Figure BDA0004113436180000531
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Figure BDA0004113436180000541
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Figure BDA0004113436180000551
/>
Figure BDA0004113436180000561
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。
序列表
<110> 基因泰克公司 (GENENTECH, INC.)
<120> FLT3 配体融合蛋白及使用方法
<130> P36298-WO
<140>
<141>
<150> 63/062,713
<151> 2020-08-07
<160> 53
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 11
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
225
<210> 13
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 13
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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50 55 60
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
65 70 75 80
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100 105 110
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
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<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 14
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 15
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 15
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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65 70 75 80
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
165 170 175
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
180 185 190
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
210 215 220
Gly Lys
225
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 16
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
225
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 17
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 18
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
肽"
<400> 19
Glu Leu Leu Gly
1
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
肽"
<400> 20
Pro Val Ala Gly Pro
1 5
<210> 21
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu
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Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe
20 25 30
Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu
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Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu
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Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln
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Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala
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Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Trp Cys Leu His Trp Gln
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Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly Glu Gln Val Pro Pro Val
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Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu His
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<211> 141
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
20 25 30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
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<213> 智人
<400> 23
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
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<212> PRT
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<400> 24
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<210> 25
<211> 368
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<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 25
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
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180 185 190
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195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 26
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 26
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
20 25 30
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35 40 45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
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Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
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85 90 95
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100 105 110
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多肽"
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多肽"
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<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 36
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Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Val Thr Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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多肽"
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多肽"
<400> 38
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<220>
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多肽"
<400> 46
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85 90 95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
100 105 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
115 120 125
Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser
130 135 140
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Arg
145 150 155 160
Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
165 170 175
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
180 185 190
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
195 200 205
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
210 215 220
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
225 230 235 240
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
245 250 255
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
260 265 270
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
275 280 285
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
290 295 300
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
305 310 315 320
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
325 330 335
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
340 345 350
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
355 360 365
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370 375 380
Lys
385
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 48
Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 49
Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro
1 5 10 15
Pro
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 50
Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 51
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro
1 5 10 15
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<212> PRT
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<220>
<221> 源
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多肽"
<400> 52
Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 源
<223> /注意="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 53
Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro
1 5 10

Claims (45)

1.一种包含无效应子Fc蛋白的Fc融合蛋白，其包含Flt3配体(Flt3L)蛋白和所述无效应子Fc蛋白，其中所述无效应子Fc蛋白与残基SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同，并且其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)并且SEQ ID NO:13的残基76为甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的Fc融合蛋白，其中Flt3L蛋白不包含PWSPRPLEATAPTAPQPP(SEQID NO:48)、WSPRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:49)、SPRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:50)、PRPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:51)、RPLEATAPTAPQPP(SEQ ID NO:52)或PLEATAPTAPQPP(SEQIDNO:53)的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的Fc融合蛋白，其中Flt3L包含蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:22至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述Flt3L包含蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述Flt3L包含蛋白质，所述蛋白质与包含SEQ ID NO:21的氨基酸27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184或27-185的蛋白质至少约90％相同。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述无效应子Fc蛋白的N末端经由肽键连接至所述Flt3L蛋白的C末端。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO:26至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNO:13相同的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的Fc融合蛋白，其中所述Fc融合蛋白具有Fc效应子功能，所述Fc效应子功能相对于包含SEQ IDNO:12的野生型IgG1 Fc区的Fc效应子功能减弱。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的Fc融合蛋白，其中Fc-无效应子Flt3L-Fc融合蛋白在体外测定中使抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活化的活性水平不超过由包含融合至野生型IgG1 Fc(SEQID NO:12)的野生型Flt3L的Flt3L-Fc融合蛋白在所述体外测定中所达活性水平的20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
10.一种经分离的核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的Fc融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的经分离的核酸，其中所述经分离的核酸进一步编码所述Fc融合蛋白的N末端处的信号序列。
12.一种编码Flt3L-Fc融合蛋白的经分离的核酸，其中所述Flt3L-Fc融合蛋白包含SEQID NO:45。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10至12中任一项所述的核酸。
14.一种产生Fc融合蛋白的方法，其包括培养根据权利要求13所述的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
18.一种药物制剂，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的Fc融合蛋白以及药用载体。
19.根据权利要求18所述的药物制剂，其进一步包含第二治疗剂。
20.根据权利要求18或19所述的药物制剂，其中所述第二治疗剂为佐剂、树突状成熟因子和/或检查点抑制剂。
21.一种用于扩增受试者中的树突状细胞(DC)的数量的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的Flt3L-Fc融合蛋白。
22.根据权利要求21所述的方法，其包括向所述受试者施用约0.1mg/kg至50mg/kg剂量的所述Flt3L-Fc融合蛋白。
23.一种用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求1至9中任一项所述的Flt3L-Fc融合蛋白或根据权利要求18至20中任一项所述的药物制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其包括向所述受试者施用约0.1mg/kg至50mg/kg剂量的所述Flt3L-Fc融合蛋白。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第二治疗剂为佐剂、树突状成熟因子和/或检查点抑制剂。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用DC成熟因子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述DC成熟因子选自polyIC、polyICLC、DC40、放射疗法和化学疗法。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，其包括施用免疫检查点抑制剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在施用所述Fc-无效应子Flt3L-Fc融合蛋白之前、同时或之后施用所述检查点抑制剂。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、匹利珠单抗、BMS936559、阿特珠单抗和阿维单抗。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下项组成的组：非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、黑素瘤、胰腺导管腺癌(PDAC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、结直肠癌(CRC)、乳腺癌、膀胱癌、肾癌或其组合。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述受试者先前曾用检查点抑制剂治疗。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者对检查点抑制剂疗法无反应且/或在接受检查点免疫疗法的最后一剂后超过3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年对所述检查点抑制剂疗法无反应。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述癌症已表征为包含免疫沙漠型肿瘤。
36.一种无效应子Fc蛋白，其包含与残基SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ IDNO:20)或者SEQ IDNO:13的残基76为甘氨酸。
37.根据权利要求36所述的无效应子Fc蛋白，其中SEQ ID NO:13的残基13-17包含氨基酸序列PVAGP(SEQ ID NO:20)并且SEQ IDNO:13的残基76为甘氨酸。
38.根据权利要求36或37所述的无效应子Fc蛋白，其包含与SEQ IDNO:13相同的氨基酸序列。
39.一种无效应子Fc蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、5、6、13或15相同的氨基酸序列。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的无效应子Fc蛋白，其中所述Fc蛋白相对于包含SEQ ID NO:12的野生型IgG1 Fc区减弱。
41.一种抗体，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的无效应子Fc蛋白。
42.根据权利要求40所述的抗体，其包含重链可变结构域和轻链可变结构域。
43.根据权利要求41或42所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
44.根据权利要求41或42所述的抗体，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
45.根据权利要求41或42所述的抗体，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
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