CN113490687A - 抗ctla4抗体和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗体、双特异性抗体和嵌合受体)以及其在治疗和预防癌症中的用途，以及包含所述抗CTLA4结合蛋白质的组合物和试剂盒。

Description

抗CTLA4抗体和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请案要求2018年12月26日提交的美国临时申请案62/785,111的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。
以ASCII文本文件形式提交的序列表
以下以ASCII文本文件形式提交的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：737762002540.txt，记录日期：2019年12月23日，大小：39.5KB)。
技术领域
本发明涉及抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体)和其相关使用方法。
背景技术
在美国，癌症是排名第二的主要死亡原因，引起比随后的五种主要原因(慢性呼吸道疾病、中风、事故、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)和糖尿病)更多的死亡。尽管已经取得长足进步，尤其在靶向疗法方面，但这一领域中仍有大量工作要做。免疫疗法和这一领域的分支，免疫肿瘤学，正在产生用于治疗恶性病的可行且令人振奋的治疗选项。具体地说，现认识到癌症的一个特点是免疫逃避，且已进行大量工作以发现目标且研发出针对这些目标的疗法，以便重新激活免疫系统从而识别和治疗癌症。实际上，抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)抗体，即伊派利单抗(ipilimumab)，已实现罹患III/IV期恶性黑素瘤的患者的长期存活。伊派利单抗是免疫检查点拮抗剂，其通过阻断CTLA4来中断T细胞抑制，且可能引起T调节性细胞(Treg)的消耗(Korman，A.等人，2005.《肿瘤免疫疗法：抗CTLA4抗体的临床前和临床活性(Tumor immunotherapy：preclinical and clinicalactivity of anti-CTLA4 antibodies)》，《对研究药物的当前观点(Current Opinion inInvestigational Drugs)》6：582-591；Quezada等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，206(8)：1717-1725，2009；Selby等人，《癌症免疫研究(Cancer Immunol Res.)》，1(1)；32-42，2013)。不幸的是，伊派利单抗引起T细胞依赖性免疫反应的全身性(非肿瘤特异性)活化，其引起可危及生命且通常限制剂量和治疗持续时间的免疫相关副作用(Weber，J.S.等人，2008.《转移性黑素瘤患者中的伊派利单抗的I/II期研究(Phase I/II study ofipilimumab for patients with metastatic melanoma)》，《临床肿瘤学杂志(Journal ofClinical Oncology)》26：5950-5956)。这些副作用包括小肠结肠炎、皮炎、垂体炎、葡萄膜炎、肝炎、肾炎和死亡。小肠结肠炎是最常见的主要毒性(影响约20％的患者)。与免疫介导的不良反应相关的严重安全性风险促使FDA批准对伊派利单抗实施风险评估和缓解策略(Risk Evaluation and Mitigation Strategy；REMS)。最近，已证实当与单独的伊派利单抗相比时，伊派利单抗和靶向PD1的第二免疫检查点调节剂(例如，尼沃单抗(nivolumab))的共同给药可显著提高黑素瘤的免疫疗法的功效。然而，这一增益与3/4级副作用的发生率增加相关联，所述副作用影响超过50％的接受组合治疗的患者(Wolchok，J.D.等人，2013.《晚期黑素瘤中的尼沃单抗加伊派利单抗(Nivolumab plus Ipilimumab in AdvancedMelanoma)》，《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》)。
这些结果说明需要研发可有效靶向肿瘤而不引起与某些抗CTLA4抗体，如伊派利单抗相关联的副作用的抗CTLA4蛋白质治疗剂。本文中提供用于解决这一需求的抗CTLA结合蛋白质、其组合物以及其使用方法。
本文中所引用的所有参考文献，包含专利申请案、专利案公开案和科学文献，都以全文引用的方式并入本文中，就像各个参考文献特别地且单独地被指示为以引用的方式并入一般。
发明内容
本文中提供抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)结合蛋白质、包含其的组合物和其使用方法。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：VL结构域包含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：6的氨基酸0列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQID NO：26的氨基酸序列；或VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO∶26的氨基酸序列。在任何所提供的实施例中的一些中，VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
在任何所提供的实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。在任何所提供的实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。在任何所提供的实施例中的一些中，CH包含氨基酸取代S239D或I332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在任何所提供的实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
在任何实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。在任何实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
在任何实施例中的一些中，轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列且重链包含SEQID NO：29的氨基酸序列；或轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列且重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在任何实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
在任何实施例中的一些中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。在任何实施例中的一些中，药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何实施例中的一些中，药剂是类美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中：VL结构域包含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或VL结构域包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO∶22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中VL结构域包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域且第一对的重链包含VH结构域，且其中：VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
在任何实施例中的一些中，VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。在任何实施例中的一些中，CH包含氨基酸取代S239D或I332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
在任何实施例中的一些中，轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列且重链包含SEQID NO：29的氨基酸序列；或轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列且重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对包含有包含SEQID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
本文中提供双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对包含有包含SEQID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
在任何实施例中的一些中，双特异性抗体或其抗原结合片段与药剂结合。在任何实施例中的一些中，药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何实施例中的一些中，药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
本文中还提供编码任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸。
还提供包含本文中任何所提供的核酸的载体。
还提供包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或本文中任何所提供的核酸的宿主细胞。
在任何这类实施例中的一些中，宿主细胞能够产生去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段。在任何这类实施例中的一些中，宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。在任何这类实施例中的一些中，宿主细胞过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。在任何这类实施例中的一些中，宿主细胞过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶I(ManII)。
还提供用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其涉及在产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养任何所提供的宿主细胞。
还提供用于制备去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段的方法，其涉及在产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养任何所提供的宿主细胞。
在任何这类实施例中的一些中，所述方法还涉及从宿主细胞回收所制备的抗体或其抗原结合片段。
还提供通过本文中任何所提供的用于制备抗体或其抗原结合片段的方法制备的抗体或其抗原结合片段。
还提供一种组合物，其包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或任何所提供的抗体或其抗原结合片段。
还提供一种医药组合物，其包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或任何所提供的抗体或其抗原结合片段以及医药学上可接受的载剂。
还提供用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的医药组合物，其包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或任何所提供的抗体或其抗原结合片段以及医药学上可接受的载剂。
还提供一种医药组合物的用途，其是用于制造用以治疗或预防受试者中的赘生性疾病的药剂，所述医药组合物包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或任何所提供的抗体或其抗原结合片段以及医药学上可接受的载剂。
还提供一种试剂盒，其包含任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段或任何所提供的抗体或其抗原结合片段。
还提供用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法涉及向受试者给予有效量的任何所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、任何所提供的双特异性抗体或其抗原结合片段、任何所提供的抗体或其抗原结合片段或任何所提供的组合物。
应理解，本文中所描述的各种实施例的一种、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它实施例。本发明的这些和其它方面将变得对所属领域的技术人员显而易见。通过以下详细说明进一步描述本发明的这些和其它实施例。
附图说明
图1A-1B是展示在某一抗体浓度范围内，抗CTLA4抗体与人类CTLA4-Fc的结合的图。图1A展示在某一抗体浓度范围内，抗体1的各形式(抗体1-1和抗体1-2)与人类CTLA4-Fc的结合，其显示所展示的抗体的类似结合。图1B展示在某一抗体浓度范围内，抗体2的各形式(抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5)与人类CTLA4-Fc的结合，其显示所展示的抗体的类似结合。图1C-1E展示人类CTLA-Fc与人类化抗CTLA4抗体以及抗体1(图1C)、抗体2(图1D)或伊派利单抗(图1E)的变体(例如，在Fc区中含有突变或去海藻糖基化版本)的结合结果，如通过ELISA分析。如所展示，每种抗体的所有变体都以类似方式结合于人类CTLA4-Fc。
图2A展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，抗体2-6(抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变的版本)或伊派利单抗与人类CTLA4(huCTLA4)之间的结合。图2B提供针对图2A中所展示的结果的缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)以及抗体2-6与伊派利单抗之间的倍数差。图2C展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，伊派利单抗的Fab(伊派利单抗-Fab)或抗体2的Fab(抗体2-Fab)与rhCTLA4-Fc之间的结合。图2D提供针对图2C中所展示的结果的缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、平衡解离常数(KD)和Chi2值。图2E展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，伊派利单抗的Fab(伊派利单抗-Fab)或抗体2的Fab(抗体2-Fab)与cynoCTLA4-Fc之间的结合。图2F提供针对图2E中所展示的结果的缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、平衡解离常数(KD)和Chi2值。
图3展示SPR分析的结果，其显示在各种浓度下，抗体2-1(抗体2的具有野生型Fc区的版本)、抗体2-6(抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变的版本)或伊派利单抗与人类FcγRIIIa(CD16a)之间的结合。
图4A-4D是描绘抗体1和抗体2的IL-2水平(pg/mL)(图4A和4C)或IL-2水平的倍数变化(图4B和4D)的图，如使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)分析法确定。使用SEB分析法测试抗体1(抗体1-1和1-2)(图4A和4B)和抗体2(抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5)(图4C和4D)促进周边单核细胞的IL-2产生的能力。与无抗体对照相比，抗体1和抗体2的所有所测试的形式都显示提高IL-2水平的能力(图4A和4C)。图4E展示用抗CTLA4抗体1[具有野生型Fc区(抗体1-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体1-2)和抗体1的去海藻糖基化版本(抗体1-aFuc)]、抗体2[具有野生型Fc区(抗体2-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体2-6)和抗体2的去海藻糖基化版本(抗体2-aFuc)]或伊派利单抗[具有野生型Fc(伊派利单抗)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(伊派利单抗-m)和伊派利单抗的去海藻糖基化版本(伊派利单抗-aFuc)]的各种版本进行的SEB分析法的结果。
图5A-5D展示来自抗体1变体(图5A)、抗体2变体(图5B)、伊派利单抗变体(图5C)和所有3种抗体的去海藻糖基化变体(图5D)的ADCC、FcγRIIIa报导子生物分析法的报导子活化和EC50值的曲线。
图6A-6D描绘评估表达标记物的CD45+细胞的比例的免疫表型研究的结果，所述细胞包括以下：CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+。所测试的抗体是：第1组：IgG，第2组：抗体2-1；第4组：伊派利单抗；第5组：伊派利单抗-aFuc。
图7A-7D描绘展示在给予20μg、7μg或2μg测试抗体的单次注射之后随时间推移的肿瘤体积的图。图7A(组平均值)和图7B(各个小鼠)展示被注射抗体2-6、伊派利单抗或伊派利单抗的去海藻糖基化形式(伊派利单抗-aFuc)的小鼠中随时间推移的肿瘤体积(mm3)；图7C(20μg)、图7D(7μg)和图7E(2μg)展示在每种剂量的不同抗体情况下，随时间推移的肿瘤体积(mm3)的比较。
图8A描绘具有在给药后第5天，对周边血液中的CD4+Ki67+细胞(左侧)和CD4+ICOS+细胞(右侧)的百分比的功效研究的结果的图，所述百分比表示T细胞活化水平。图8B描绘展示肿瘤重量(左侧)和CD8/Treg比率(右侧)的图，如在用10mg/kg(RSV-m对照物)或3mg/kg(伊派利单抗或抗体2-6)处理的小鼠中在第7天评估。图8C描绘展示在小鼠中，在给予RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6之后，肿瘤微环境中的调节性T细胞(左侧)和肿瘤微环境中的CD8+T细胞(右侧)的图。图8D描绘展示在给予0.3mg/kg的包括RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6的抗体之后，随时间推移的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。
图9描绘展示两组实验(实验1和实验2)的结果的图，所述实验通过评估在抗体2-6、伊派利单抗或同型对照的给药之后，全部CD4+细胞中的Ki67+细胞的百分比来评估在食蟹猕猴中的药效学作用。
具体实施方式
如检查点抑制剂等治疗剂在癌症中显示前所未有的反应，但其用途受到免疫相关不良事件(irAE)和其它毒性(例如，垂体炎)限制。本文中提供蛋白质治疗剂，其例如在肿瘤微环境中结合CTLA4以实现增加的持久反应率和改善的安全性概况。所提供的CTLA4结合蛋白质(如抗体、双特异性抗体或其抗原结合片段)的改善的结合亲和力、增加的功能活性(如ADCC)和如本文中所描述的其它优点可以引起改善的对疗法的反应和改善的安全性概况，如减少或最小化与某些免疫疗法相关联的不良事件。
I.定义.
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于具体组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例，并且不打算作为限制。除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，对“抗体”的参考任选地包括两种或更多种这类抗体的组合等。
如本文中所使用，术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包括(且描述)针对所述值或参数本身的实施例。
应理解，本文中所描述的本发明的各方面和实施例包括“包含”各方面和实施例、“由各方面和实施例组成”和“基本上由各方面和实施例组成”。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。在本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)可以与“抗体”互换地使用。
碱性4链抗体单元是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。IgM抗体由5个碱性异四聚体单元和称为J链的其它多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个碱性4链单元，所述单元可以聚合以与J链组合形成多价集合物。在IgG的情况下，4链单元通常是约150,000道尔顿(dalton)。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，而视H链同型而定，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。各H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。各H链在N端具有可变结构域(VH)，接着是针对α和γ链中的每一个的三个恒定结构域(CH)以及针对μ和ε同型的四个CH结构域。各L链在N端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对准且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。相信具体的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对共同形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如《基础临床免疫学(Basic andClinical Immunology)》，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以指定为不同种类或同型。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能中的相对较小差异而将γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本发明。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z标示的变体。
“被分离的”抗体是已从其生产环境的组分鉴别、分离和/或回收(例如，天然地或以重组方式)的抗体。在一些实施例中，被分离的多肽与其生产环境中的所有其它组分无关。其生产环境中的污染物组分(如由重组转染细胞产生)是将通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，多肽被纯化：(1)达到大于抗体的95重量％，如通过例如劳里法(Lowry method)测定，并且在一些实施例中，达到大于99重量％；(1)通过使用旋杯式测序仪，达到足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用考马斯(Coomassie)蓝或银染色，在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE，达到均质。被分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备被分离的多肽。
如本文中所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，组成所述群体的各个抗体是相同的。在一些实施例中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有C端裂解。举例来说，在重链和/或轻链的C端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基裂解。在一些实施例中，C端裂解从重链去除C端赖氨酸。在一些实施例中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有N端裂解。举例来说，在重链和/或轻链的N端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基裂解。
在一些实施例中，可以通过重组技术来制备单克隆抗体的截短形式。在一些实施例中，单克隆抗体针对单一抗原位点具有高特异性。在一些实施例中，单克隆抗体针对多个抗原位点具有高特异性(如双特异性抗体或多特异性抗体)。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本同源的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括例如融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现技术以及用于在具有一部分或所有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人类或人类样抗体的技术。
术语“裸抗体”是指未与细胞毒性部分或放射性标记结合的抗体。
术语“亲本抗体”是指修饰之前的抗体。
“抗体-药物结合物”或“ADC”是指与一种或多种异源分子结合的抗体，所述异源分子包括(但不限于)细胞毒性剂。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可以互换地用于指相对于抗体片段，呈基本上完整形式的抗体。具体地说，完全抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是原生序列恒定结构域(例如，人类原生序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分、完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗原结合抗体片段的实例包括结构域抗体(dAb)、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线抗体(参见美国专利案第5,641,870号，实例2；Zapata等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。单重链抗体或单轻链抗体可以被工程改造，或在重链的情况下，可以从被工程改造成产生单重链分子的骆驼、鲨鱼、库或小鼠分离。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，此名称反映易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链和H链的可变区结构域(VH)以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。各Fab片段相对于抗原结合是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大型F(ab′)2片段，所述片段大致对应于两个二硫键连接的具有不同的抗原结合活性且仍能够与抗原交联的Fab片段。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，CH1结构域的羧基端具有少数额外残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。在本文中，Fab′-SH是关于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是以其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对形式产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能是由Fc区中的序列和聚糖决定，所述区域也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段是由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠得到六个高变环(H链和L链各3个环)，这些高变环提供用于抗原结合的氨基酸残基且使抗体具有抗原结合特异性。然而，尽管单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原具有特异性的HVR)具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”，又简称为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，sFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽连接子，其使得sFv能够形成抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
本发明的抗体的“功能片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体中保留或具有被修饰的FcR结合能力的Fv区域。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的线抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。
本文中的单克隆抗体特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，以及这类抗体的片段，只要其呈现所需生物活性即可(美国专利案第4,816,567号；Morrison等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，81：6851-6855(1984))。在本文中，相关嵌合抗体包括
Figure BDA0003191468650000181
抗体，其中抗体的抗原结合区是来源于通过例如用相关抗原对猕猴进行免疫接种而产生的抗体。如本文中所使用，“人类化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
非人类(例如，鼠类)抗体的“人类化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人类化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基由来自非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人类灵长类动物的HVR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残基由相应的非人类残基置换。此外，人类化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人类化抗体将包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环，且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的FR区，但FR区可以包括一个或多个改良抗体性能(如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的单独FR残基取代。在一些实施例中，FR中的这些氨基酸取代的数目在H链中不超过6个，且在L链中不超过3个。人类化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的至少一部分。关于其它细节，参见例如Jones等人，《自然(Nature)》321：522-525(1986)；Reichmann等人，《自然》332：323-329(1988)；以及Presta，《结构生物学新观点(Curr.Op.Struct.Biol.)》2：593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton，《过敏性哮喘与免疫学年鉴(Ann.Allergy，Asthma&Immunol.)》1：105-115(1998)；Harris，《生物化学学会学报(Biochem.Soc.Transactions)》23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，《生物技术新观点(Curr.Op.Biotech.)》5：428-433(1994)；以及美国专利案第6,982,321号和第7,087,409号。在一些实施例中，人类化抗体是针对单一抗原位点。在一些实施例中，人类化抗体是针对多个抗原位点。替代性人类化方法描述于美国专利案第7,981,843号和美国专利申请公开案第2006/0134098号中。
抗体的“可变区“或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。因此，如本文中所使用的术语“可变区”和“可变结构域”可以互换地使用。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体中可变性最高的部分(相对于相同类别的其它抗体)且含有抗原结合位点。重链和轻链的可变结构域可以使用任何可用的方法或编号方案确定，且可以包括如例如WO 2018/207701中所描述的可变结构域，其内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，重链和/或轻链的可变结构域可能不具有可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而包括于所述可变结构域的描述中。在一些实施例中，重链和/或轻链的可变结构域可以包括可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而不包括于所述可变结构域的描述中。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域中在序列方面具有高可变性和/或形成以结构方式定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。在原生抗体中，H3和L3显示六HVR中最高的多样性，且尤其相信H3在赋予抗体优良的特异性方面起到独特作用。参见例如Xu等人，《免疫学(Immunity)》13：37-45(2000)；Johnson和Wu，《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》248：1-25(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是具有功能性且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人，《自然》363：446-448(1993)和Sheriff等人，《自然结构生物学(NatureStruct.Biol.)》3：733-736(1996)。
正在使用许多HVR描述且涵盖于本文中。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是基于序列可变性且是最常用的(Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》，第5版，公共卫生服务部(Public HealthService)，国立卫生研究院(National Institute ofHealth)，Bethesda，MD(1991))。而Chothia HVR是指结构环的位置(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》
196：901-917(1987))。“Contact”HVR是基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基标注于下文中。
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除非另有指示，否则可变结构域残基(HVR残基和构架区残基)是根据Kabat等人，见上文编号。
“构架”或“FR”残基是除如本文中所定义的HVR残基以外的可变结构域残基。
表述“根据Kabat编号的可变结构域残基”或“根据Kabat编号的氨基酸位置”以及其变化形式是指Kabat等人，见上文中的用于抗体编译中的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际线形氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域中的FR或HVR的缩短或其中的插入。举例来说，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(残基52a，根据Kabat)和在重链FR残基82之后的被插入的残基(例如，残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区域处的比对来确定既定抗体的残基的Kabat编号。
出于本文中的目的，“受体人类构架”是包含来源于人类免疫球蛋白构架或人类共同构架的VL或VH构架的氨基酸序列的构架。“来源于”人类免疫球蛋白架构或人共同架构的受体人类架构可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施例中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对序列且视需要引入空位以实现最大序列一致性百分比且不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分之后，候选序列中的与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以由所属领域的技术内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包含在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。举例来说，如下计算既定氨基酸序列A与、和或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性百分比(其可以替代地表述为与、和或针对既定氨基酸序列B包含某一氨基酸序列一致性百分比的既定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是以程序中A与B的比对中的序列的一致匹配形式评分的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应了解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列一致性百分比将不等于B与A的氨基酸序列一致性百分比。
“结合于”、“特异性结合于”具体多肽或具体多肽上的表位或对所述多肽或表位“具有特异性”的抗体是与具体多肽或具体多肽上的表位结合且基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与非相关、非CTLA4多肽的结合小于抗体与CTLA4的结合约10％，如通过所属领域中已知的方法(例如，酶联结免疫吸附分析法(ELISA))所测量。在一些实施例中，与CTLA4(例如，小鼠CTLA4和/或人类CTLA4)结合的结合蛋白质(例如，抗体)的平衡解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤2nM、≤1nM、≤0.7nM、50.6nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
如本文中所提供的术语“CTLA4”或“CTLA4蛋白质”包括细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)或其可维持CTLA4蛋白质活性(例如，与CTLA4相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性范围内)的变体或同源物的任何重组或天然存在的形式。在一些方面中，与天然存在的CTLA4多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在一些实施例中，CTLA4如由NCBI序列参考GI：83700231鉴别的蛋白质，其同源物或功能性片段。在一些实施例中，CTLA4是人类CTLA4。在一些实施例中，CTLA4是小鼠CTLA4。
抗体“效应功能”是指可由抗体的Fc区(原生序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性且随抗体同型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中所分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒性效应细胞能够与携带抗原的目标细胞特异性结合且随后利用细胞毒素杀伤目标细胞。抗体将细胞毒性细胞“武装”起来且是通过这种机制杀伤目标细胞所需的。用于介导ADCC的原生细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概述于以下文献中的第464页中的表3中：Ravetch和Kinet，《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》9：457-92(1991)。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)在不具有将Fc聚糖海藻糖基化以具有增强的ADCC的能力的细胞中被工程改造或表达。为了评估相关分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC分析法，如美国专利案第5,500,362号或第5,821,337号中描述的分析法。适用于这类分析法的效应细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，相关分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》，95：652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。改变ADCC活性和其它抗体特性的其它Fc变体包括以下文献中所公开的变体：Ghetie等人，《自然生物技术(Nat Biotech.)》15：637-40，1997；Duncan等人，《自然》332：563-564，1988；Lund等人，《免疫学杂志(J.Immunol)》147：2657-2662，1991；Lund等人，《分子免疫学(Mol Immunol)》29：53-59，1992；Alegre等人，《移植(Transplantation)》57：1537-1543，1994；Hutchins等人，《美国国家科学院院刊》92：11980-11984，1995；Jefferis等人，《免疫学期刊(ImmunolLett.)》44：111-117，1995；Lund等人，《美国实验生物学学会联合会(FASEB)》J9：115-119，1995；Jefferis等人，《免疫学期刊》54：101-104，1996；Lund等人，《免疫学杂志》157：4963-4969，1996；Armour等人，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》29：2613-2624，1999；Idusogie等人，《免疫学杂志》164：4178-4184，200；Reddy等人，《免疫学杂志》164：1925-1933，2000；Xu等人，《细胞免疫学(Cell Immunol)》200：16-26，2000；Idusogie等人，《免疫学杂志》166：2571-2575，2001；Shields等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》276：6591-6604，2001；Jefferis等人，《免疫学期刊》82：57-65.2002；Presta等人，《生物化学学会学报(Biochem Soc Trans)》30：487-490，2002；Lazar等人，《美国国家科学院院刊》103：4005-4010，2006；美国专利案第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；和第7,317,091号。
在本文中，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括原生序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界限可能变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基端。适用于本发明的抗体的原生序列Fc区包括人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文中所使用，“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)之间的非共价相互作用的强度。在一些实施例中，结合蛋白质(例如，抗体)对CTLA4的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常用方法，包括本文中所描述的方法来测量。
如本文中所使用，“结合亲合力”是指分子(例如，抗体)的多个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)的结合强度。
在本文中，编码抗体的“被分离的”核酸分子是被鉴别且从至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，其与所述至少一种污染核酸分子通常在其生产环境中相关联。在一些实施例中，被分离的核酸与和生产环境相关联的所有组分都无关。在本文中，编码多肽和抗体的被分离的核酸分子呈与其在自然界中被发现的形式或环境不同的形式。因此，被分离的核酸分子与细胞中天然存在的编码本文中的多肽和抗体的核酸不同。
术语“医药配制物”是指呈允许活性成分的生物活性有效，并且不含对将被施用所述配制物的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。这类配制物是无菌的。
如本文中所使用，“载剂”包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其对暴露于所使用的剂量和浓度的所述载剂的细胞或哺乳动物无毒性。生理学上可接受的载剂通常是水性pH值缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；和/或非离子性表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文中所使用，术语“治疗”是指被设计成在临床病理学过程期间改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入。合乎需要的治疗作用包括降低疾病进展率、改善或减轻疾病病况以及缓解或改善预后。举例来说，如果与病症(例如，赘生性疾病)相关联的一种或多种症状得到缓解或消除，那么成功地“治疗”个体。举例来说，如果治疗引起罹患疾病的个体的生活质量提高、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、降低疾病的复发频率、减轻疾病的严重程度、延缓疾病的发展或进展和/或延长个体的存活期，那么成功地“治疗”个体。
如本文中所使用，“与......结合”或“与......组合”是指施用除一种治疗方法以外的另一种治疗方法。因此，“与......结合”或“与......组合”是指在向个体施用一种治疗方法之前、期间或之后施用另一种治疗方法。
如本文中所使用，术语“预防”包括提供与个体中的疾病的发生或复发相关的防治。个体可能易患病症、对病症敏感或具有产生病症的风险，但尚未被诊断患有病症。在一些实施例中，使用本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体)延缓病症的发展。
如本文中所使用，“具有产生病症的风险”的个体在本文中所描述的治疗方法之前可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状，且可能显示或可能不显示可检测的疾病或疾病症状。“具有风险”表示个体具有一种或多种风险因素，所述风险因素是与疾病的发展相关的可测量的参数，如所属领域中已知。具有这些风险因素中的一种或多种的个体与不具有这些风险因素中的一种或多种的个体相比具有更高的产生病症的可能性。
“有效量”是指至少在必需的剂量和时段下有效实现所需或所指示的作用，包括治疗性或预防性结果的量。可以按一次或多次给药的方式来提供有效量。“治疗有效量”至少是实现具体病症的可测量的改善所需的最小浓度。在本文中，治疗有效量可以根据如疾病病况、患者的年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也可以是其中治疗有益作用超过抗体的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时段下有效实现所需预防性结果的量。通常但未必，因为预防性剂量是在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者，所以预防有效量可以小于治疗有效量。
“慢性”给药是指以与急性模式相反的连续模式给予(一种或多种)药剂，以便将初始治疗作用(活性)维持长期时段。“间歇性”给药是在不中断的情况下非连续地进行，但实际性质是循环性的治疗。
如本文中所使用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗的目的，“哺乳动物”包括人类、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如犬、马、兔、牛、、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施例中，个体或受试者是人类。
II.抗CTLA4结合蛋白质
本文中提供结合细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)的蛋白质。在一些实施例中，所提供的CTLA4结合蛋白质是抗体或其抗原结合片段，或是包含CTLA4结合结构域的蛋白质。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是结合于CTLA4的双特异性抗体或其抗原结合片段。举例来说，含有CTLA结合结构域的双特异性抗体。在一个方面中，提供包含CTLA4结合结构域的CTLA4结合蛋白质，如包含本文中所描述的CTLA4结合结构域的融合蛋白质。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质结合于CTLA4的嵌合受体，例如借助于可以结合CTLA4的抗原结合结构域。
本文中所提供的CTLA4结合蛋白质可以结合于来自各种物种的CTLA4，举例来说，一些结合于人类CTLA4和/或小鼠CTLA4，或食蟹猕猴CTLA4。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质具有以下特征中的一种或多种：(1)结合CTLA4(例如，人类CTLA4)；和(2)体内结合肿瘤位点处的CTLA4。
在一个方面中，本文中提供CTLA4结合蛋白质，其尤其适用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病。如本文中所提供的CTLA4结合蛋白质包括能够与表达于细胞(例如，癌细胞或T细胞)表面上的CTLA4蛋白质相互作用(例如，结合)的结合结构域。
在一些实施例中，本文中还提供CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)，包含CTLA4结合蛋白质(例如，包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是二聚体。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是同源二聚体。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是异源二聚体。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是包含第一链和第二链的异源二聚体，如包含重链和轻链的异源二聚体。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施例中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是单链蛋白质，如包含重链和轻链的单链蛋白质。
还提供编码根据前述实施例中任一项所述的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段或嵌合受体的核酸。还提供包含根据前述实施例的核酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体。还提供包含前述核酸实施例的宿主细胞。
还提供用于制备抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段或嵌合受体的方法，其包含在产生抗体、双特异性抗体或嵌合受体的条件下培养前述宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。在一些实施例中，其中宿主细胞过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。在一些实施例中，宿主细胞还过表达高尔基体(Golgi)μ-甘露糖苷酶II(ManII)。任何这类实施例中的一些进一步包括回收由宿主细胞产生的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段或嵌合受体。在一些实施例中，通过上述方法产生双特异性抗体或嵌合受体。
还提供一种组合物，其含有根据前述实施例中任一项所述的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段或嵌合受体。一些实施例涵盖包含根据前述实施例所述的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段或嵌合受体的组合物。在一些实施例中，组合物是医药组合物。
还提供一种试剂盒，其含有根据前述实施例中任一项所述的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段、嵌合受体或组合物。
还提供用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据前述实施例中任一项所述的抗体、双特异性抗体或其任何抗原结合片段、嵌合受体或组合物。在一个实施例中，赘生性疾病是癌症。在一些实施例中，癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
CTLA4结合蛋白质
如本文中所提供的术语“CTLA4结合蛋白质”是指包含CTLA4结合结构域的多肽，其能够结合于CTLA4蛋白质或以其它方式呈现对CTLA4蛋白质的亲和力。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗原结合片段、单链抗体等。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。因此，在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是结合CTLA4的嵌合抗原受体的组分。
术语“CTLA4结合结构域”是指以重组方式表达的多肽结构域，其能够结合于在细胞中或细胞上发现的CTLA4蛋白质或以其它方式呈现对所述CTLA4蛋白质的亲和力。用于确定CTLA4结合结构域与CTLA4的结合程度的方法是所属领域中众所周知的。
在一些实施例中，本文中所提供的CTLA4结合结构域是能够结合于CTLA4的抗体。在一些实施例中，CTLA4是人类CTLA4。在一些实施例中，CTLA4是鼠类CTLA4。在一些实施例中，抗体是鼠类抗体。
在一些实施例中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是同源二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是异源二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是包含第一链和第二链的异源二聚体，如包含重链和轻链的异源二聚体。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含第一链和第二链。在一些实施例中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施例中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链(例如，轻链和重链)。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链(例如，两条轻链和两条重链)。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：1或13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3或15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：4或16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5或17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施例中，VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些实施例中，第一链是轻链；且第二链是重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段含有两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域；且第二链是重链可变结构域。在任何这类实施例中的一些中，抗原结合片段是dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。
在任何这类实施例中的一些中，抗体是鼠类抗体。
在任何这类实施例中的一些中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施例中的一些中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何这类实施例中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和I332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V3051和P396L；G236A、S239D和I332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变区。
在任何实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区。
在任何实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO∶30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQID NO：28的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO∶28的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ IDNO∶28的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQID NO：29的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ IDNO：29的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQID NO：33的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO∶33的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ IDNO：33的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQID NO：34的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ IDNO：34的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：27和32的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：28、29、33和34的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
本文中还提供双特异性抗体，其含有特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链以及特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链，例如作为肿瘤抗原的抗原。
在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体是鼠类抗体。
在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何这类实施例中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，如S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和1332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V3051和P396L；G236A、S239D和1332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：1或13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3或15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：4或16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5或17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL结构域，和包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH结构域。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL结构域，和包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH结构域。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中第一对含有包含选自SEQ ID NO：27和32的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：28、29、33和34的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO∶27的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和/或包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链；和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体含有第一链和第二链，其中第一链含有(i)包含SEQ ID NO：1或13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3或15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链含有(i)包含SEQ ID NO：4或16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5或17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链含有包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，第一链含有包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL结构域，和包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH结构域。在任何这类实施例中的一些中，第一链含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，第一链含有包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL结构域，和包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH结构域。在任何这类实施例中的一些中，第一链含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；且包含有包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1同型，其包含增强如本文中所描述的效应功能的氨基酸取代。
在一些实施例中，CTLA4结合结构域包含双特异性抗体的抗原结合臂的轻链和重链。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：1或13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3或15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链包含(i)包含SEQ ID NO：4或16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5或17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO∶19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施例中，VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列；和/或重链可变区包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列。
在双特异性抗体的任何实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。在双特异性抗体的任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变区。
在双特异性抗体的任何实施例中的一些中，VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。在双特异性抗体的任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：27和32；和/或重链包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：28、29、33和34。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含选自SEQ ID NO：27和32的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO：28、29、33和34的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：34的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，CTLA4是人类CTLA4。在双特异性抗体的一些实施例中，CTLA4是鼠类CTLA4。在一些实施例中，双特异性抗体是鼠类抗体。
在一些实施例中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1同型，其包含增强如本文中所描述的效应功能的氨基酸取代。
在一些实施例中，双特异性抗体或其抗原结合片段是二聚体。在一些实施例中，双特异性抗体或其抗原结合片段是同源二聚体。在一些实施例中，双特异性抗体或其抗原结合片段是异源二聚体。在一些实施例中，双特异性抗体或其抗原结合片段是包含第一链和第二链的异源二聚体，如包含重链和轻链的异源二聚体。在一些实施例中，双特异性抗体或抗原结合片段包含第一链和第二链。在一些实施例中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施例中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。
在一些实施例中，CTLA4结合结构域包含结合于CTLA4的第一链和第二链，如用于嵌合受体中的配体结合结构域的一部分。在嵌合受体的一些实施例中，第一链是轻链可变结构域。在一些实施例中，第二链是重链可变结构域。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：1或13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3或15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链包含(i)包含SEQ ID NO：4或16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5或17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6或18的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ IDNO：18的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
可以通过所属领域中众所周知的各种方法使CTLA4结合蛋白质与其它分子结合。术语“结合”和“结合化学反应”是指由已知的反应性基团在相对温和条件下进行的反应。这些反应包括(但不限于)亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯发生的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和对碳-碳和碳-杂原子多重键进行的加成反应(例如，迈克尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿德尔加成反应(Diels-Alder addition))。这些和其它适用的反应论述于例如March，《高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)》，第3版，JohnWiley&Sons，New York，1985；Hermanson，《生物结合技术(Bioconjugate Techniques)》，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，《蛋白质修饰(Modification ofProteins)》；《化学进展(Advances in Chemistry Series)》，第198卷，American ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982中。
适用于本文中的结合化学反应的反应性官能团包括例如：(a)羧基和其各种衍生物，包括(但不限于)N-羟基丁二酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酸卤化物、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；(c)卤烷基，其中卤离子可随后由如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳阴离子或醇盐离子等亲核性基团置换，由此在卤素原子的位点处产生新基团的共价连接；(d)亲二烯物基团，其能够参与狄尔斯-阿德尔反应，例如顺丁烯二酰亚胺基；(e)醛或酮基团，使得有可能通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过如格林纳加成(Grignard addition)或烷基锂加成等机制进行后续衍生作用；(f)磺酰基卤化物基团，其用于与胺的后续反应，例如以形成磺酰胺；(g)硫醇基，其可以转化成二硫化物、与酰基卤化物反应或与如金等金属键结；(h)胺或巯基，其可以例如酰化、烷基化或氧化；(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成(Michael addition)等；(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；(k)氨基亚磷酸酯和其它适用于核酸合成的标准官能团；(i)金属氧化硅键结；和(1)与反应性磷基团(例如，膦)键结以形成例如磷酸二酯键的金属。
可以选择反应性官能团使得其不影响或干扰本文中所描述的组合物的化学稳定性。或者，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团不参与交联反应。
在一些实施例中，可以通过所属领域中众所周知的各种方法将连接子工程改造成与其它分子和/或CTLA4结合蛋白质融合。举例来说，核酸可以被工程改造成编码连接子以及其它分子和/或CTLA4结合蛋白质，以在由宿主细胞以重组方式表达时产生融合蛋白质。
例示性CTLA4结合蛋白质
以下描述含有如上文所描述的某些特征的CTLA4结合蛋白质的某些例示性实施例。这些实施例仅是例示性的且不应解释为限制性。
在一些实施例中，本文中提供结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，a)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是轻链；b)抗体的第一链是重链且抗体的第二链是重链；或c)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是重链。
在一些实施例中，本文中还提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，轻链可变区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且重链可变区包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链。
在一个方面中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ IDNO：25或30的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变区。
在另一个方面中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO：27和32的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO：28、29、33和34的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO∶27的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：26或31的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：25或30的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链可变结构域。
存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本文中的一些实施例中。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z或其组合标示的变体。在本文中的一些实施例中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一些实施例中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在本发明的一个方面中，提供编码抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸。在某些实施例中，提供包含编码抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸的载体。在某些实施例中，提供包含这类载体的宿主细胞。在本发明的另一方面中，提供一种组合物，其包含本文中所描述的抗CTLA4抗体或本文中所描述的编码抗CTLA4抗体的聚核苷酸。在某些实施例中，本发明的组合物是医药配制物，其用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病，如本文中所列举的赘生性疾病。
在一些实施例中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白质是能够结合于CTLA4的双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施例中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。
在一些方面中，本文中提供双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链，和b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链。在一些方面中，本文中提供双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；和b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链。在一些实施例中，抗原是与CTLA4不同的抗原。在一些实施例中，第一对或第二对的轻链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施例中，第一对或第二对的重链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施例中，第一对的轻链包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；且第一对的重链包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，第二对的轻链包含有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；且第二对的重链包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗原是针对CTLA4的不同表位。
本文中所涵盖的用于双特异性抗体的双特异性抗体包括鼠类双特异性抗体、人类化双特异性抗体、嵌合双特异性抗体和人类双特异性抗体。在本文中的一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，本文中所提供的双特异性抗体具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一些实施例中，抗体具有包含氨基酸取代的IgG1同型或由不具有或具有降低的将Fc聚糖海藻糖基化的能力以增强如本文中所描述的效应功能的细胞表达。在一些实施例中，本文中所提供的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在一个方面中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：25和30的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含选自SEQ ID NO：26和31的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：27和32的氨基酸序列的轻链和/或包含有包含选自SEQ ID NO：28、29、33和34的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：26和31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：26氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：26和31的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：25和30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：25氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：25和30的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施例中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白质是能够结合于CTLA4的嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))。CAR是将针对所需抗原(例如，CTLA4)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以产生呈现特异性抗肿瘤细胞活性的嵌合蛋白质的分子。在一个实施例中，本文中提供嵌合受体，其被工程改造成包含具有本文中所描述的CTLA4结合结构域的细胞外结构域与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的融合物。当在T细胞中表达时，本文中所提供的嵌合受体能够借助于细胞外结构域基于抗原结合特异性来重新引导抗原识别。在一些实施例中，CTLA4结合结构域优选与来自共刺激性分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。在一些实施例中，CTLA4结合结构域与选自以下群组的一个或多个细胞内结构域融合：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合。
在一些方面中，本文中提供嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的包含第一链和第二链的配体结合结构域；b)跨膜结构域；和c)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，第一链包含选自SEQ ID NO：25和30的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO：26和31的氨基酸序列。
在一些方面中，本文中提供嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的包含第一链和第二链的配体结合结构域；b)跨膜结构域；和d)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，第一链包含选自SEQ ID NO：25和30的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO：26和31的氨基酸序列。
在一些方面中，本文中提供嵌合受体，其包含1)结合于CTLA4的包含VL结构域和VH结构域的配体结合结构域，其中：a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；或b)VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列内所含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列内所含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；2)跨膜结构域；和3)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
在一些方面中，本文中提供嵌合受体，其包含1)结合于CTLA4的包含VL结构域和VH结构域的配体结合结构域，其中：a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3；2)跨膜结构域；和3)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。
在一些方面中，在任何所提供的嵌合受体中，a)VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或b)VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
在一些方面中，在任何所提供的嵌合受体中，a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或b)VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
1.结合亲和力
免疫结合相互作用(如抗体与所述抗体对其具有特异性的抗原之间)的强度或亲和力可以由所述相互作用的平衡解离常数(KD)来表示，其中Kd越小表示亲和力越大。蛋白质的免疫结合特性可以使用在所属领域中众所周知的方法定量。举例来说，一种方法包含测量抗原结合蛋白质(例如，抗体)/抗原复合物形成和解离速率，其中这些速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响所述速率的几何参数。可以通过计算浓度以及实际缔合和解离速率来确定“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比能够消除所有与亲和力无关的参数且等于平衡解离常数KD。参见Davies等人，《生物化学年鉴(Annual Rev Biochem.)》59：439-473，(1990)。
在一些方面中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与不同的抗CTLA4结合蛋白质相比以大致相同或更高的亲和力结合于CTLA4。在某些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质的平衡解离常数(KD)≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)。在一些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约50pM至约5nM的平衡解离常数(KD)结合于目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)。用于评估结合亲和力的分析法是所属领域中众所周知的，例如在本文中的实例1中描述的分析法中。
1.生物活性分析法
在一些方面中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质在体内小鼠肿瘤模型中减小肿瘤体积。用于评估肿瘤体积的减小的分析法是所属领域中众所周知的，例如在本文中的实例1中所描述的分析法中。
III.抗CTLA4结合蛋白质制备
使用所属领域中可用的技术制备本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质，其例示性方法更详细地描述于以下章节中。
1.抗CTLA4结合蛋白质：抗体片段
本发明涵盖作为抗CTLA4结合蛋白质的抗体片段。抗体片段可以由传统方法(如酶促消化)或重组技术产生。在某些情形下，使用抗体片段而非完全抗体可能具有优点。关于某些抗体片段的评述，参见Hudson et al.(2003)《自然医学(Nat.Med.)》9∶129-134。
已经研发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如Morimoto等人，《生物化学和生物物理学方法杂志(Journalof Biochemical and Biophysical Methods)》24：107-117(1992)；和Brennan等人，《科学(Science)》，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌和其它细胞类型中表达和分泌，由此实现大量的这些片段的便捷产生。或者，可以从培养基直接回收Fab′-SH片段且以化学方式偶合以形成F(ab′)2片段(Carter等人，《生物技术(Bio/Technology)》10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab′)2片段。包含FcRN/救助受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利案第5,869,046号中。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练技术人员是显而易见的。在某些实施例中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利案第5,571,894号；和第5,587,458号。Fv和scFv是仅有的具有不含恒定区的完整组合位点的物质；因此，其可以适用于在体内使用期间的降低的非特异性结合。scFv融合蛋白质可以被构造成引起scFv的氨基或羧基端处的效应蛋白质的融合。参见《抗体工程改造(Antibody Engineering)》，Borrebaeck编，见上文。此外，包含通过多肽连接子连接的两个scFv的双重scFv可以用作双特异性抗体。或者，包含三个或更多个scFv的多重scFv可以用作多特异性抗体。
本发明包括线抗体(例如，美国专利案第5,641,870号中所描述)或单链免疫球蛋白，其包含通过适当的连接子连接的抗体的重链和轻链序列。这类线抗体或免疫球蛋白可以是单特异性或双特异性的。这类单链免疫球蛋白可以二聚化，从而维持与抗体类似的结构和活性，所述抗体最初是四聚体。此外，本发明的抗体可以是具有单一重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这类抗体称为单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体。这些抗体也涵盖于本发明的抗体的功能性片段的含义中。
2.抗CTLA4结合蛋白质：人类化抗体
本发明涵盖人类化抗体。根据本文中所提供的指南来产生人类化抗体。用于将非人类抗体人类化的各种方法是所属领域中已知的。举例来说，人类化抗体可以具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入(import)”残基，其通常从“输入”可变结构域获得。基本上可以根据Winter的方法(Jones等人(1986)《自然》321：522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332：323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学》239：1534-1536)，通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行人类化。因此，这类“人类化”抗体是嵌合抗体(美国专利案第4,816,567号)，其中实质上少于完整的人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人类化抗体通常是其中一些高变区残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
3.抗CTLA4结合蛋白质：人类抗体
可以通过组合选自人类衍生的噬菌体呈现库的Fv纯系可变结构域序列与已知的人类恒定结构域序列来构建本发明的人类抗CTLA4抗体。或者，本发明的人类单克隆抗CTLA4抗体可以由融合瘤方法制备。用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系已由例如Kozbor《免疫学杂志(J.Immunol.)》，133：3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)》，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)；和Boerner等人，《免疫学杂志》，147：86(1991)描述。根据本文中所提供的指南来产生人类抗体。
4.抗CTLA4结合蛋白质：双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，双特异性抗体是人类或人类化抗体。在某些实施例中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达CTLA4的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。根据本文中所提供的指南来产生双特异性抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是所属领域中已知的。参见Milstein和Cuello，《自然》，305：537(1983)；1993年5月13日公开的WO 93/08829；Traunecker等人，《欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)》，10：3655(1991)；Kontermann和Brinkmann，《当今药物探索(DrugDiscovery Today)》，20(7)：838-847。关于产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，121：210(1986)。双特异性抗体包括交联或“异结合”抗体。举例来说，异结合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶合，另一种与生物素偶合。异结合抗体可以使用任何便利的交联方法制备。合适的交联剂以及许多交联技术是所属领域中众所周知的且公开于美国专利案第4,676,980号中。
5.抗CTLA4结合蛋白质：单结构域抗体
在一些实施例中，根据本文中所提供的指南来产生单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的单一多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，Mass.；参见例如美国专利案第6,248,516 B1号)。在一个实施例中，单结构域抗体由抗体的全部或一部分重链可变结构域组成。
6.抗CTLA4结合蛋白质：抗体变体
在一些实施例中，涵盖本文中所描述的抗体的氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。可以在制备序列时将氨基酸变化引入标的抗体氨基酸序列。
适用于鉴别抗体中可以作为用于突变诱发的优选位置的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”，如由Cunningham和Wells(1989)《科学》，244：1081-1085所描述。在本文中，鉴别残基或目标残基的群组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)且由中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。接着，通过在取代位点处引入或引入针对取代位点的另外或其它变体来优化这些显示对取代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的，但突变本身的性质无需是预定的。举例来说，为了分析既定位点处的突变的性能，在目标密码子或区域处进行Ala扫描或随机突变诱发且针对所需活性来筛选被表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多的残基的多肽范围内的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变体包括延长抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合。
在一些实施例中，改善药物动力学的FcRn突变包括(但不限于)M428L、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、P257I/N434H、D376V/N434H、P257I/Q3111、N434A、N434W、M428L/N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A、V308P/N434A、N434H、V308P。在一些实施例中，这类突变增强在低pH值下抗体与FcRn的结合，但不改变在中性pH值下的抗体亲和力。
在某些实施例中，改变本发明的抗体以提高或降低抗体的糖基化程度。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，多肽中的这些三肽序列中任一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最通常丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列来便利地实现抗体中糖基化位点的添加或缺失，使得产生或去除上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)。所述变化也可以通过原始抗体的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代来实现(对于O-连接的糖基化位点)。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。举例来说，具有成熟的碳水化合物结构的抗体描述于美国专利申请案第US 2003/0157108号(Presta，L.)中，所述成熟的碳水化合物结构不具有连接至抗体的Fc区的海藻糖。还参见US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd)。在连接至抗体的Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体论述于Jean-Mairet等人，WO 2003/011878和Umana等人，美国专利案第6,602,684号中。在连接至抗体的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体报道于Patel等人，WO 1997/30087中。关于具有与Fc区连接的改变的碳水化合物的抗体，还参见WO1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)。关于具有被修饰的糖基化的抗原结合分子，还参见US2005/0123546(Umana等人)。
在某些实施例中，糖基化变体包含Fc区，其中连接至Fc区的碳水化合物结构不具有海藻糖或具有减少的海藻糖。这类变体具有改善的ADCC功能。任选地，Fc区还包含进一步改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如，Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。与“去海藻糖基化”、“去海藻糖化”或“海藻糖缺失型”抗体相关的公开案的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等人《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87：614(2004)。产生去海藻糖化抗体的细胞系的实例包括蛋白质海藻糖基化中的Lec13 CHO细胞缺失(Ripka等人，《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249：533-545(1986)；美国专利申请案第US 2003/0157108 A1号，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实例11)，和基因敲除细胞系，如α-1，6-海藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人，《生物技术与生物工程》87：614(2004))，以及过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)和高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞。
在本文中的任何实施例中，抗CTLA4结合蛋白质可以被工程改造以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施例中，可以在具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除的细胞系中产生抗CTLA4结合蛋白质。在一些其它实施例中，可以在过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)的细胞系中产生抗CTLA4结合蛋白质。在其它实施例中，细胞系还过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的一些实施例中，抗CTLA4结合蛋白质可以在Fc区中包含至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。
在一个实施例中，改变抗体以改善其血清半衰期。为了延长抗体的血清半衰期，可以将FcRN/救助受体结合表位并入抗体(尤其抗体片段)中，如例如美国专利案第5,739,277号中所描述。如本文中所使用，术语“救助受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子的体内血清半衰期的表位(US2003/0190311、美国专利案第6,821,505号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,624,821号；美国专利案第5,648,260号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,834,597号)。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体的抗体分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基置换。用于取代型突变诱发的相关位点包括高变区，但也涵盖FR变化。保守性取代展示于表1中的标题“优选取代”下。如果这类取代引起生物活性的所需变化，那么可以引入表1中命名为“例示性取代”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化且筛选产物。
表1.
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通过选择在保持以下各者的作用方面显著不同的取代来实现抗体的生物学特性中实质性修饰：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如呈片状或螺旋状构形，(b)目标位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体。可以根据氨基酸的侧链的特性的类似性来将其分组(A.L.Lehninger，《生物化学(Biochemistry)》，第二版，第73-75页，WorthPublishers，New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、G1u(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可以基于共有的侧链特性将天然存在的残基分成各组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要将这些类别中的一种的成员与另一种类别交换。也可以将这类被取代的残基引入保守性取代位点或其余(非保守性)位点。
一种取代型变体涉及取代亲本抗体(例如，人类化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得变体相对于产生其的亲本抗体将具有被修饰的(例如，改善的)生物学特性。产生这类取代型变体的便利方式涉及使用噬菌体呈现的亲和力成熟。简单来说，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体由丝状噬菌体粒子显示为与包装于各粒子内的噬菌体鞘蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。接着，针对生物活性(例如，结合亲和力)来筛选噬菌体呈现的变体。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可以进行扫描突变诱发(例如，丙氨酸扫描)以鉴别显著促进抗原结合的高变区残基。或者或另外，可能有利的是，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点。根据所属领域中已知的技术，包括本文中详细描述的技术，这类接触残基和相邻残基是用于取代的候选物。在产生这类变体后，变体集合经历使用所属领域中已知的技术(包括本文中所描述的技术)进行的筛选，且可以选择在一种或多种相关分析法中具有优良特性的抗体以用于进一步研究。
通过所属领域中已知的各种方法制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括(但不限于)从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变异体的情况下)分离，或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变诱发、PCR突变诱发以及抗体的早期制备的变体或非变体型式的盒式突变诱发来制备。
可能需要在本发明的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)，包括铰链半胱氨酸的氨基酸修饰。
在一些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，或抗CTLA4双特异性抗体)具有IgGl同型，其具有增强的效应功能。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化的。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体是去海藻糖基化的。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施例中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的等分聚糖部分水平。在一些实施例中，抗CTLA4双特异性抗体具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施例中，IgG1包含氨基酸突变。
在一些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或抗CTLA4双特异性抗体具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S298A、E333A和K334A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S239D和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S239D、A330L和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代P247I和A339D或A339Q，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P和Y300L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P、Y300L和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代G236A、S239D和1332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K326A和E333A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K326W和E333S，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一些方面中，包含于所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段中的例示性重链恒定区包括SEQ ID NO：35-38中所阐述的重链恒定区序列。在一些方面中，包含于所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段中的例示性轻链恒定区包括SEQ ID NO：39中所阐述的轻链恒定区序列。
在一些方面中，所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段，包括包含SEQ ID NO：38中所阐述的序列的重链恒定区。在一些方面中，所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段，包括包含SEQ ID NO：35中所阐述的序列的重链恒定区。在一些方面中，所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段，包括包含SEQ ID NO：39中所阐述的序列的轻链恒定区。
在一些方面中，所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段，包括包含SEQ ID NO∶38中所阐述的序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO：39中所阐述的序列的轻链恒定区。在一些方面中，所提供的CTLA4结合蛋白质，如抗体或其抗原结合片段，包括包含SEQ ID NO：35中所阐述的序列的重链恒定区和包含SEQ ID NO：39中所阐述的序列的轻链恒定区。
根据本说明书和所属领域的教示，经考虑，在一些实施例中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可以包含一个或多个变化，例如在Fc区中。这些抗体与其野生型对应物相比将仍保留治疗效用所需的实质上相同的特征。举例来说，认为可以在Fc区中进行某些变化，其将引起改变(即，改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如WO99/51642中所描述。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan和Winter《自然》322：738-40(1988)；美国专利案第5,648,260号；美国专利案第5,624,821号；和WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些专利公开案的内容以引用的方式具体地并入本文中。还参见Shields等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》9(2)：6591-6604(2001)。具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合(其负责母体IgG转移至胎儿，Guyer等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》117：587(1976)和Kim等人，《免疫学杂志》24：249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。这些抗体包含具有一或多个取代的Fc区，其中所述取代改善Fc区与FcRn的结合。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利案第6,194,551B1号、WO99/51642中。这些专利公开案的内容以引用的方式具体地并入本文中。还参见Idusogie等人《免疫学杂志》164：4178-4184(2000)。
7.抗体-药物结合物
本发明还提供抗体-药物结合物(ADC)，其包含与一种或多种细胞毒性剂结合的本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质，所述细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施例中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)类美登素(参见美国专利案第5,208,020号、第5，416,064号和欧洲专利案EP 0 425 235 B1)；阿瑞他汀，如单甲基奥利斯坦(monomethylauristatin)药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利案第5,635,483号和第5,780,588号以及第7,498,298号)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利案第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号；Hinman等人，《癌症研究(Cancer Res.)》53：3336-3342(1993)；和Lode等人，《癌症研究》58：2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)，如柔红霉素(daunomycin)或小红莓(doxorubicin)(参见Kratz等人，《当前医学化学(Current Med.Chem.)》13：477-523(2006)；Jeffrey等人，《生物有机和医学化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)》16：358-362(2006)；Torgov等人，《生物结合物化学(Bioconj.Chem.)》16：717-721(2005)；Nagy等人，《美国国家科学院院刊》97：829-834(2000)；Dubowchik等人，《生物有机和医学化学通讯》12：1529-1532(2002)；King等人，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》45：4336-4343(2002)；和美国专利案第6,630,579号)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(1arotaxel)、特西他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一实施例中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)微管蛋白聚合抑制剂(例如，类美登素和奥瑞他汀)、DNA损伤剂(例如，吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素和吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体)和DNA合成抑制剂(例如，依昔替康衍生物Dxd)。
在另一实施例中，抗体-药物结合物包含与酶活性毒素或其片段结合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、康乃馨蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素。
在另一实施例中，抗体-药物结合物包含与放射性原子结合以形成放射性结合物的如本文中所描述的抗体。各种放射性同位素可以用于产生放射性结合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，其可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的旋转标记，如同样的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与细胞毒性剂的结合物可以使用各种双功能蛋白质偶合剂制备，如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如二丁二酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人，《科学》238：1098(1987)中所描述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体的结合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。连接子可以是促进细胞中细胞毒性药物的释放的“可裂解连接子”。举例来说，可以使用酸不稳定连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定连接子、二甲基连接子或含有二硫键的连接子(Chari等人，《癌症研究》52：127-131(1992)；美国专利案第5,208,020号)。
在本文中，ADC明确地涵盖(但不限于)用交联剂制备的这类结合物，所述交联剂包括(但不限于)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC和磺酸基-SMPB，以及可商购(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)的SVSB(丁二酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
8.载体、宿主细胞和重组方法
关于本发明的抗CTLA4结合蛋白质的重组产生，将编码其的核酸分离且插入可复制的载体中以用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)将编码抗体的DNA容易地分离和测序。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于所使用的宿主细胞。通常，宿主细胞是原核或真核(通常哺乳动物)来源的。应了解，任何同型的恒定区都可以用于这一目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，且这类恒定区可以从任何人类或动物物种获得。
9.使用原核宿主细胞产生结合蛋白质
a)载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本发明的抗CTLA4结合蛋白质的多肽组分的聚核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞(如融合瘤细胞)分离所需聚核苷酸序列且测序。或者，可以使用核苷酸合成器或PCR技术来合成聚核苷酸。在获得后，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源聚核苷酸的重组载体中。所属领域中可用和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于插入载体中的核酸的大小以及用载体转化的具体宿主细胞。各载体视其功能(异源聚核苷酸的扩增或表达或其两者)以及其与其所驻存的具体宿主细胞的相容性而含有各种组分。载体组分通常包括(但不限于)：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
通常，将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质体载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在被转化的细胞中提供表型选择的标记序列。举例来说，通常使用pBR322，一种来源于大肠杆菌物种的质体，将大肠杆菌转化。pBR322含有编码安比西林(ampicillin；Amp)和四环素(Tet)抗性的基因且因此提供用于鉴别被转化的细胞的简单方法。pBR322、其衍生物或其它微生物质体或细菌噬菌体也可以含有或被修饰成含有可以由微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。用于具体抗体的表达的pBR322衍生物的实例详细地描述于Carter等人，美国专利案第5,648,237号中。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。举例来说，细菌噬菌体(如λGEM.TM.-11)可以用于制备重组载体，所述重组载体可以用于将敏感宿主细胞(如大肠杆菌LE392)转化。
本发明的表达载体可以包含编码各多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5′)的未被翻译的调节序列，其调节顺反子的表达。原核启动子通常分成两个类别，即诱导性和组成性。诱导性启动子是响应于培养条件的变化(例如，存在或不存在营养物，或温度的变化)而起始在其控制下的顺反子的增加的转录水平的启动子。
由各种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。借助于通过限制酶消化从源DNA移出启动子且将被分离的启动子序列插入本发明的载体，所选择的启动子可以可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。原生启动子序列和许多异源启动子都可以用于引导目标基因的扩增和/或表达。在一些实施例中，利用异源启动子，因为其与原生目标多肽启动子相比通常允许被表达的目标基因的更大的转录和更高的产率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、Δ-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子，如tac或trc启动子。然而，在细菌中具有功能性的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适用的。其核苷酸序列已被公开，由此使得熟练的工作人员能够使用连接子或衔接子将其以可操作地方式接合至编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人，(1980)《细胞(Cell)》20：269)，以提供任何所需的限制位点。
在本发明的一个方面中，重组载体内的各顺反子包含分泌信号序列组分，其引导被表达的多肽跨越膜的易位。通常，信号序列可以是载体的组分，或其可以是插入载体中的目标多肽DNA的一部分。被选择用于本发明的目的的信号序列应是可以由宿主细胞识别和处理(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和处理异源多肽的原生信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用例如选自由以下组成的群组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)引导物、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施例中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面中，本发明的免疫球蛋白的产生可以在宿主细胞的细胞质中进行，且因此不需要在各顺反子内存在分泌信号序列。在此方面，免疫球蛋白轻链和重链是在存在或不存在其它分子的序列等的情况下表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主品系(例如，大肠杆菌trxB品系)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此允许被表达的蛋白质子单元的适当折叠和组装。Proba和Pluckthun《基因(Gene)》，159：203(1995)。
本发明的抗CTLA4结合蛋白质也可以使用其中可以调节被表达的多肽组分的定量比率，以最大化本发明的被分泌和适当组装的抗体的产率的表达系统来产生。这类调节是至少部分通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。
适用于表达本发明的抗CTLA4结合蛋白质的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物。适用的细菌的实例包括埃希氏杆菌(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、杆菌(例如，枯草杆菌(B.subtilis))、肠内细菌(Enterobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)物种(例如，绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏杆菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一个实施例中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施例中，使用大肠杆菌细胞作为用于本发明的宿主。大肠杆菌品系的实例包括品系W3110(Bachmann，《细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology)》，第2卷(Washington，D.C.：美国微生物学学会(American Society for Microbiology)，1987)，第
1190-1219页；ATCC保藏号27,325)和其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的品系33D3(美国专利案第5,639,635号)。其它品系和其衍生物也是合适的，如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、
大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)。这些实例是说明性而非限制性的。用于构建上文提及的任何具有既定基因型的细菌的衍生物的方法是所属领域中已知的且描述于例如Bass等人，《蛋白质(Proteins)》，8：309-314(1990)中。考虑到细菌的细胞中的复制子的复制能力，通常需要选择适当的细菌。举例来说，当使用众所周知的质体(如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供应复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以适合地用作宿主。通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，且可能需要将其它蛋白酶抑制剂并入细胞培养物中。
b)结合蛋白质产生
用上述表达载体将宿主细胞转化且在视需要被改良的常规营养培养基中培养以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得DNA是可复制的(以染色体外元件形式或通过染色体整合体)。取决于所使用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙进行的钙处理用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种用于转化的方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本发明的抗CTLA4结合蛋白质的原核细胞是在所属领域中已知且适用于培养所选择的宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括卢里亚培养液(luriabroth；LB)加必要的营养补充剂。在一些实施例中，培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。举例来说，向培养基中添加安比西林以用于表达安比西林抗性基因的细胞的生长。
除碳、氮和无机磷酸盐来源以外，也可以包括适当浓度的以单独或与另一种补充剂或培养基(如复合氮来源)的混合物形式引入的任何必要的补充剂。任选地，培养基可以含有一种或多种选自由以下组成的群组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度下培养原核宿主细胞。在某些实施例中，对于大肠杆菌生长，生长温度在约20℃至约39℃、约25℃至约37℃范围内，或是约30℃。主要视宿主生物而定，培养基的pH值可以是在约5至约9范围内的任何pH值。在某些实施例中，对于大肠杆菌，pH值是约6.8至约7.4，或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导性启动子，那么在适合启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面中，使用PhoA启动子控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养被转化的宿主细胞以进行诱导。在某些实施例中，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P.培养基(参见例如Simmons等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》(2002)，263：133-147)。如所属领域中已知，根据所使用的载体构建体，可以使用各种其它诱导剂。
在一个实施例中，被表达的本发明的抗CTLA4结合蛋白质被分泌至宿主细胞的周质中且从其中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过如渗透休克、声波处理或溶解等手段。在破坏细胞后，通过离心或过滤来移出细胞碎片或完整细胞。可以例如通过亲和树脂色谱来进一步纯化蛋白质。或者，可以将蛋白质运送至培养基中且在其中分离。可以从培养物移出细胞，并且过滤且浓缩培养物上清液以进行所产生的蛋白质的进一步纯化。可以使用通常已知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析法(Westernblot assay))进一步分离和鉴别被表达的多肽。
在本发明的一个方面中，抗CTLA4结合蛋白质产生是通过发酵方法来大量进行。各种大规模分批进料发酵程序可以用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升容量且在某些实施例中，约1,000至100,000升容量。这些发酵器使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物，尤其葡萄糖。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约100升且可以在约1升至约100升范围内的发酵器中发酵。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常是在细胞在合适的条件下生长至所需密度(例如，OD550是约180-220)之后起始，在此阶段细胞处于早期固定相。根据所使用的载体构建体，可以使用各种诱导剂，如所属领域中已知和上文所描述。细胞可以在诱导之前生长较短的周期。通常将细胞诱导约12-50小时，但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以改良各种发酵条件。举例来说，为了改善所分泌的抗体多肽的适当组装和折叠，可以使用过表达伴随蛋白质(如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴随蛋白质活性的肽基脯氨酰顺，反-异构酶))的其它载体共同转化宿主原核细胞。已经证明伴随蛋白质可以促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等人，(1999)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》274：19601-19605；Georgiou等人，美国专利案第6,083,715号；Georgiou等人，美国专利案第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275：17106-17113；Arie等人，(2001)《分子微生物学(Mol.Microbiol.)》39：199-210。
为了最小化被表达的异源蛋白质(尤其对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解，可以将某些缺失蛋白水解酶的宿主品系用于本发明。举例来说，宿主细胞品系可以被修饰成实现编码已知细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI和其组合)的基因中的基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺失型品系是可用的且描述于例如Joly等人，(1998)，见上文；Georgiou等人，美国专利案第5,264,365号；Georgiou等人，美国专利案第5,508,192号；Hara等人，《微生物耐药性(Microbial DrugResistance)》，2：63-72(1996)中。
在一个实施例中，使用缺失蛋白水解酶且用过表达一种或多种伴随蛋白质的质体转化的大肠杆菌品系作为本发明的表达系统中的宿主细胞。
c)结合蛋白质纯化
在一个实施例中，进一步纯化本文中产生的抗体蛋白质以获得基本上均质的制剂，以用于其它分析法和用途。可以使用所属领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序示例：在免疫亲和力或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上进行的色谱、色谱焦聚、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如葡聚糖凝胶G-75的凝胶过滤。
在一个方面中，使用固定在固相上的蛋白质A进行本发明的抗体产物的免疫亲和力纯化。蛋白质A是来自金黄色葡萄球菌的41 kD细胞壁蛋白质，其以高亲和力结合于抗体的Fc区。Lindmark等人，(1983)《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62：1-13。固定蛋白质A的固相可以是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，或受控微孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱涂有试剂，如甘油，以可能防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步骤，可以将来源于如上文所描述的细胞培养物的制剂施用于蛋白质A固定的固相上以实现相关抗体与蛋白质A的特异性结合。接着，洗涤固相以去除非特异性结合于固相的污染物。最终，通过洗脱从固相回收相关抗体。
10.使用真核宿主细胞产生结合蛋白质
用于真核宿主细胞中的载体通常包括以下非限制性组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主细胞中的载体还可以含有信号序列或其它在相关成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性裂解位点的多肽。所选择的异源信号序列可以是由宿主细胞识别且处理(即，由信号肽酶裂解)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌引导物(例如，单纯疱疹病毒gD信号)是可用的。用于这类前体区域的DNA在阅读框架中接合至编码抗体的DNA。
b)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。举例来说，SV40起点通常可仅因为其含有早期启动子而被使用。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为可选标记物。典型选择基因编码满足以下条件的蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如，安比西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)在相关情况下，补体营养缺陷，或(c)提供不可从复合培养基获得的重要营养物。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且由此经受住选择方案。这类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选标记物的另一实例是使得能够鉴别能够吸收编码抗CTLA4结合蛋白质的核酸的细胞的标记物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II、灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例来说，在一些实施例中，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养全部转化体来首先鉴别用DHFR选择基因转化的细胞。在一些实施例中，当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺失DHFR活性的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary；CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，用编码抗CTLA4结合蛋白质、野生型DHFR蛋白质和另一种可选标记物(如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共同转化的宿主细胞(具体地说，含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有针对可选标记物(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中的细胞生长来选择。参见美国专利案第4,965,199号。宿主细胞可以包括NS0，包括缺失谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系。使用GS作为哺乳动物细胞的可选标记物的方法描述于美国专利案第5,122,464号和美国专利案第5,891,693号中。
d)启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子由宿主生物识别且可操作地连接至编码相关抗CTLA4结合蛋白质的核酸。已知真核生物的启动子序列。举例来说，几乎所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3′端处是AATAAA序列，其可以是用于将聚A尾区添加至编码序列的3′端的信号。在某些实施例中，可以将任何或所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
从哺乳动物宿主细胞中的载体进行的转录是例如通过从以下获得的启动子控制：病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；热休克启动子，限制条件是这类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以HindIII E限制性片段形式获得。用于使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利案第4,419,446号中。此系统的改进形式描述于美国专利案第4,601,978号中。还参见Reyes等人，《自然》297：598-601(1982)，其描述在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在鼠类细胞中表达人类β-干扰素cDNA。或者，劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可以用作启动子。
e)增强子元件组分
通常通过将增强子序列插入载体中来增加由高级真核生物进行的编码本发明的抗体的DNA的转录。现已从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)知晓许多增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点的晚期的SV40增强子(bp 100-270)、人类巨细胞病毒早期启动子增强子、小鼠巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的晚期的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv，《自然》297：17-18(1982)，其描述用于真核启动子的活化的增强子元件。可以在抗体多肽编码序列的5′或3′位置处将增强子剪接至载体中，但通常位于启动子的5′位点。
f)转录终止组分
真核宿主细胞中使用的表达载体还可以含有转录终止和使mRNA稳定所必需的序列。这类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′且偶尔3′非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适用于在本文中的载体中克隆或表达DNA的宿主细胞包括本文中所描述的高级真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已变成常规程序。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚肾系(亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞；Graham等人，《普通病毒学杂志(J.GenVirol.)》36：59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，《美国国家科学院院刊》77：4216(1980))；鼠类支持细胞(murine sertoli cells)(TM4，Mather，《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝瘤系(Hep G2)。
用上述用于产生抗CTLA4结合蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，且在视需要改良的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
h)培养宿主细胞
可以在各种培养基中培养用于产生本发明的抗CTLA4结合蛋白质的宿主细胞。可商购的培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，以下文献中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人，《酶学方法(Meth.Enz.)》58：44(1979)；Barnes等人，《生物化学期刊(Anal.Biochem.)》102：255(1980)；美国专利案第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利案Re.30,985。这些培养基中的任一种可以视需要补充有激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。所属领域的技术人员将已知，还可以包括适当浓度的任何其它补充剂。培养条件，如温度、pH值等，是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对所属领域的一般技术人员来说将是显而易见的。
i)结合蛋白质的纯化
当使用重组技术时，抗CTLA4结合蛋白质可以在细胞内产生，或直接分泌至培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除微粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。当将抗CTLA4结合蛋白质分泌至培养基中时，可以首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在任一前述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是便利的技术。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同型。蛋白质A可以用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，《免疫学方法杂志》62：1-13(1983))。建议将蛋白质G用于所有小鼠同型和人类γ3(Guss等人，《欧洲分子生物学会杂志》5：15671575(1986))。与亲和配体连接的基质可以是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质，如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与琼脂糖相比可以实现更快的流动速率和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)适用于纯化。取决于待回收的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，如在离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，包含相关结合蛋白质和污染物的混合物可以经历进一步纯化，例如通过在约2.5-4.5之间的pH值下使用洗脱缓冲液，在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行的低pH值疏水性相互作用色谱。
通常，用于制备用于研究、测试和临床用途的抗体的各种方法是所属领域中公认的、与上述方法一致和/或被所属领域的技术人员视为适用于相关具体抗体。
IV.组合物
在一些方面中，本文中还提供包含本文中所描述的任何抗CTLA4结合蛋白质的组合物(例如，医药组合物)。
通过将具有所需纯度的活性成分与任选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存的治疗配制物(《雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)》，第20版，Lippincott Williams&Wiklins，Pub.，Gennaro编，Philadelphia，Pa.2000)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，且包括缓冲剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸、甲硫胺酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)、螯合剂(如EDTA和/或非离子性表面活性剂)。
可以使用缓冲剂将pH值控制在使治疗有效性最佳化的范围内，尤其在稳定性是pH值依赖性的情况下。缓冲剂可以按约20mM至约250mM范围内的浓度存在。适合与本发明一起使用的缓冲剂包括有机和无机酸以及其盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。此外，缓冲剂可以包含组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
可以添加防腐剂以防止微生物成长，且通常以约0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。适合与本发明一起使用的防腐剂包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯甲烃铵卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可以存在张力剂，有时被称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型、带电生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，其通常被称为“稳定剂”，因为其可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张力剂可以按约0.1％至约25重量％之间或约1至约5重量％之间的任何量存在。在一些实施例中，张力剂包括多羟基糖醇、三羟基或更高级糖醇，如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其它赋形剂包括可以充当以下中的一种或多种的试剂：(1)膨胀剂，(2)溶解性增强剂，(3)稳定剂，和(4)防止变性或粘附至容器壁的试剂。这类赋形剂包括：多羟基糖醇(上文列举)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含有硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫基硫酸钠；低分子量蛋白质，如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉籽糖；和多糖，如糊精或聚葡萄糖。
可以存在非离子性表面活性剂或洗涤剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质避免搅拌诱导的聚集，其亦允许配制物暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子性表面活性剂是以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。在一些实施例中，非离子性表面活性剂是以约0.001％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.025％w/v的范围存在。
合适的非离子性表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)；聚氧化物(184、188等)；
Figure BDA0003191468650000821
多元醇；
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聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0003191468650000823
等)；聚桂醇400；硬脂酸聚烃氧40；聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60；丙三醇单硬脂酸酯；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子性洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基丁二酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将配制物用于体内给药，其必须是无菌的。可以借助于通过无菌过滤膜过滤来是配制物变得无菌。本文中的治疗性组合物通常置放于具有无菌接入端口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
给药途径是根据已知的和可接受的方法，如通过在长时段内以合适的方式进行单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径进行注射或输注、局部给药、吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)可以单独或与其它治疗剂组合使用，如在本文中所描述的方法中。术语“组合”涵盖相同或单独的配制物中所包括的两种或更多种治疗剂(例如，抗CTLA4结合蛋白质和治疗剂)。在一些实施例中，“组合”是指“同时”给药，在此情况下，本发明的抗CTLA4结合蛋白质的给药是与一种或多种其它治疗剂的给药同时进行(例如，在相同时间或抗CTLA4结合蛋白质的给药与一种或多种其它治疗剂的给药之间的间隔小于一小时)。在一些实施例中，“组合”是指依序给药，在此情况下，本发明的抗CTLA4结合蛋白质的给药是在一种或多种其它治疗剂的给药之前和/或之后进行(例如，抗CTLA4结合蛋白质的给药与一种或多种其它治疗剂的给药之间的间隔大于一小时)。本文中所涵盖的药剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子的药剂、靶向免疫刺激性分子的药剂或生长抑制剂。
本文中的配制物还可以含有超过一种视需要用于所治疗的具体适应症的活性化合物，优选具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性化合物。或者或另外，组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子或刺激性分子的药剂或生长抑制剂。这类分子宜以有效用于预期目的的量以组合方式存在。
V.治疗方法
本文中提供用于治疗或预防受试者中的疾病的方法，其包含向受试者给予有效量的本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)或其组合物。在一些实施例中，受试者(例如，人类患者)被诊断患有赘生性病症(例如，癌症)或具有产生这类病症的风险。
对于疾病的预防或治疗，活性剂的适当剂量将取决于如上文所定义的所治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和过程、所给予的药剂是否是用于预防性或治疗剂目的、先前疗法、个体的临床病史和对药剂的反应以及主治医生的判断。适当地一次性或在一系列治疗中向受试者给予药剂。在本文中所描述的方法的一些实施例中，所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)的给药之间的间隔是约一个月或更长。在一些实施例中，给药之间的间隔是约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月或更长。如本文中所使用，给药之间的间隔是指抗体的一次给药与抗体的下一次给药之间的时段。如本文中所使用，约一个月的间隔包括四周。在一些实施例中，给药之间的间隔是约一周、两周、约三周、约四周、约八周、约十二周、约十六周、约二十周、约二十四周或更长。在一些实施例中，治疗包括抗体的多次给药，其中给药之间的间隔可以变化。举例来说，第一次给药与第二次给药之间的间隔是约一个月，且后续给药之间的间隔是约三个月。在一些实施例中，第一次给药与第二次给药之间的间隔是约一个月，第二次给药与第三次给药之间的间隔是约两个月且后续给药之间的间隔是约三个月。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以均一剂量给予。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者给药的初始候选剂量，不管是例如通过一次或多次单独给药还是通过连续输注。取决于上文所提及的因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于在数天或更长时间内重复给药，取决于病状，治疗通常将是持续的，直至出现疾病症状的所需抑制。抗体的一个例示性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者给予约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以每次给药约25mg至约500mg的剂量给予受试者。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约10mg/kg的剂量给予受试者。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg或10.0mg/kg中的任一种的剂量给予受试者。可以使用上文所描述的任何给药频率。
本文中所涵盖的治疗方法是用本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)治疗病症或疾病。可以用本发明的配制物治疗的病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，梅克尔细胞癌(Merkelcell carcinoma))或睾丸癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防癌症的方法。如本文中所使用，术语“癌症”是指发现于哺乳动物中的所有癌症、赘瘤或恶性肿瘤类型，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌瘤和肉瘤。可以用本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)、医药组合物或方法治疗的例示性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳癌(例如，三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法抗性、赫赛汀抗性(Herceptinresistant)、HER2阳性、小红莓抗性、他莫昔芬(tamoxifen)抗性、乳腺管癌瘤、小叶癌瘤、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其它实例包含甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或神经管胚细胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性神经胶母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺赘瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质癌瘤、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌瘤、乳头佩吉特氏病(Paget′s Disease of the Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、乳腺管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防白血病的方法。术语“白血病”大体上是指血液形成器官的进行性恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中白细胞和其前体的畸变增殖和发育为特征。通常基于以下对白血病进行临床上分类：(1)疾病的持续时间和特征-急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型；骨髓(骨髓性)、淋巴(淋巴性)或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞数量的增加或不增加-白血病或白细胞缺乏症(亚白血性)。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的例示性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、白细胞缺乏性白血病、白细胞性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎白血病、嗜伊红白血病、鼠白血病、毛细胞白血病、血母细胞性白血病、血胚细胞白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、里德尔(Rieder)细胞白血病、希林氏白血病(Schilling′s leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病或未分化型细胞白血病。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防肉瘤的方法。术语”肉瘤”通常是指由如胚胎结缔组织的物质组成且通常由包埋于纤维状或均质物质中的紧密包装细胞构成的肿瘤。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西肉瘤(Abemethy′s sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软部分肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏瘤肉瘤(Wilms′tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤(Hodgkin′s sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen′s sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间皮瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(Roussarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防黑素瘤的方法。术语“黑素瘤”是指由皮肤和其它器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤(Cloudman′s melanoma)、S91黑素瘤、哈丁-帕西黑素瘤(Harding-Passeymelanoma)、青少年黑素瘤、雀斑样痣性黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤或浅表扩散性黑素瘤。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防癌瘤的方法。术语“癌瘤”是指由上皮细胞组成的恶性新生长，倾向于浸润周围组织且引起转移。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的例示性癌瘤包括例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌、腺样囊性癌症、腺癌、肾上腺皮质癌瘤、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、乳腺管癌瘤、硬癌、胚胎癌瘤、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶质癌、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌瘤、许特莱氏细胞腺癌(Hurthle cell carcinoma)、透明质癌、肾上腺样癌瘤、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher′s carcinoma)、库尔契茨基氏细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌、豆状癌瘤、脂瘤样癌、小叶癌瘤、淋巴上皮癌、髓质癌、髓质癌瘤、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液质癌、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬性癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭细胞癌、髓样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌、血管扩张癌、移行细胞癌、结节性皮癌、管状癌、结节状皮癌、疣状癌或绒毛状癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防转移性癌症的方法。如本文中所使用，术语“转移”、“转移性”和”转移性癌症”可以互换使用，并且是指赘生性疾病或病症(例如，癌症)从一个器官或另一个不相邻的器官或身体部分的扩散。癌症发生在起始位点处，例如乳房，所述位点被称为原发性肿瘤，例如原发性乳癌。原发性肿瘤或起始部位中的一些癌细胞获得了穿透和浸润局部区域中的周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁，通过系统循环到身体内的其它部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床上可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的细胞相似。因此，如果肺癌转移至乳房，那么乳房部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳房细胞组成。乳房中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤且患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的受试者是指其中受试者患有原发性肿瘤但不患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。举例来说，转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤的病史且在例如乳房中第二位置或多个位置处具有一个或多个继发性肿瘤的受试者的疾病。
在一些实施例中，可以由本文中所描述的CTLA4结合蛋白质获益的疾病或病症包括由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)的疾病(例如，糖尿病)、癌症(例如，前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑素瘤、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤)，或由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)的疾病的症状。
VI.制品或试剂盒
在另一方面中，提供制品或试剂盒，其包含本文中所描述的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。制品或试剂盒可以进一步包含结合蛋白质在本发明的方法中的使用说明书。因此，在某些实施例中，制品或试剂盒包含在用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)的方法中使用抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)的说明，其包含向个体给予有效量的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在某些实施例中，个体是人类。在一些实施例中，个体患有选自由以下组成的群组的疾病：白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
制品或试剂盒可以进一步包含容器。合适的容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(如单室或双室注射器)和试管。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。容器收纳配制物。在一些实施例中，配制物是冻干配制物。
制品或试剂盒可以进一步包含容器上或与容器相关联的标签或包装插页，其可以指示重组和/或使用配制物的说明。标签或包装插页可以进一步指示配制物适用于或意图用于皮下、静脉内或其它给药模式，以用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)。收纳配制物的容器可以是单次使用式小瓶或多次使用式小瓶，其允许被复原的配制物的重复给药。制品或试剂盒可以进一步包含第二容器，其包含合适的稀释剂。制品或试剂盒可以进一步包括由市售、治疗和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在特定实施例中，本发明提供用于单一剂量给药单元的试剂盒。这类试剂盒包含治疗性抗体的水性配制物的容器，包括单腔室或多腔室预填充注射器。例示性预填充注射器可以从Vetter GmbH，Ravensburg，Germany获得。
本文中的制品或试剂盒任选地进一步包含有包含第二药剂的容器，其中抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是第一药剂，且所述制品或试剂盒进一步包含标签或包装插页上的关于用有效量的第二药剂治疗受试者的说明。
在另一实施例中，本文中提供制品或试剂盒，其包含用于在自动注射器装置中给药的本文中所描述的配制物。自动注射器可以被描述为在启动后将递送其内含物，而无需患者或管理员采取其它必要措施的注射装置。其在递送速率必须是恒定的且递送时间超过数分钟时尤其适于治疗性配制物的自行给药。
例示性实施例
所提供的例示性实施例包括：
1.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：
a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO∶21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
2.根据实施例1所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
3.根据实施例1或2所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
4.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO∶31的氨基酸序列。
5.根据实施例1-4中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
6.根据实施例1-4中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
7.根据实施例1-6中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。
8.根据实施例1-7中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。
9.根据实施例7或8所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中CH包含氨基酸取代S239D或1332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
10.根据实施例1-9中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
11.根据实施例1-10中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。
12.根据实施例1-11中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
13.根据实施例1-12中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；或
b)轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
14.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
15.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
16.根据实施例1-15中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
17.根据实施例1-16中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
18.根据实施例17所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
19.根据实施例17所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
20.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域，且第一对的重链包含VH结构域，且其中：
a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
21.根据实施例20所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
22.根据实施例20或21所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
23.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对的轻链包含VL结构域，且第一对的重链包含VH结构域，且其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO∶26的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO∶30的氨基酸序列和/或VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
24.根据实施例20-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
25.根据实施例20-23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
26.根据实施例20-25中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。
27.根据实施例20-26中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。
28.根据实施例26或27所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CH包含氨基酸取代S239D或I332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
29.根据实施例20-28中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
30.根据实施例20-29中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。
31.根据实施例20-30中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
32.根据实施例20-31中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；或
b)轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
33.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
34.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中第一对包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
35.根据实施例20-34中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
36.根据实施例20-35中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
37.根据实施例36所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
38.根据实施例36所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
39.一种核酸，其编码根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段。
40.一种载体，其包含根据实施例39所述的核酸。
41.一种宿主细胞，其包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例39所述的核酸。
42.根据实施例41所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段。
43.根据实施例41或42所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。
44.根据实施例41-43中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。
45.根据实施例41-44中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶I(ManII)。
46.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据实施例41-45中任一项所述的宿主细胞。
47.一种用于制备去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据实施例42-45中任一项所述的宿主细胞。
48.根据实施例43-45中任一项所述的方法，其进一步包含回收由宿主细胞产生的抗体或其抗原结合片段。
49.一种抗体或其抗原结合片段，其是由根据实施例46-48中任一项所述的方法制备。
50.一种组合物，其包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段。
51.一种医药组合物，其包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂。
52.一种医药组合物，其包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂，其是用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病。
53.一种医药组合物的用途，所述医药组合物的包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂，其是用于制造用以治疗或预防受试者中的赘生性疾病的药剂。
54.一种试剂盒，其包含根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段。
55.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据实施例1-19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据实施例20-38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据实施例49所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施例50-52中任一项所述的组合物。
实例
通过参考以下实例将更充分地理解本发明。然而，其不应被解释为限制本发明的范围。应理解，本文中所描述的实例和实施例是仅出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将由所属领域的技术人员想到并且包括在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。
实例1：结合于CTLA4的抗CTLA4抗体的体外表征：低密度抗原结合ELISA和SPR
通过酶联结免疫吸附分析法(ELISA)或表面等离子共振(SPR)来评估例示性抗CTLA4抗体和变体与CTLA4或FcγRIIIa(CD16a)之间的结合。
方法
抗体
所测试的抗体包括称为抗体1和抗体2的人类化抗CTLA4抗体以及其变体/形式/版本。根据具体编号方案，抗体1包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3。根据Kabat编号方案，抗体1包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3。根据具体编号方案，抗体2包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：15的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3。根据Kabat编号方案，抗体2包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。产生且评估抗体1的各种形式，例如含有Fc结构域中的具体突变，或去海藻糖基化版本，各自具有名称“抗体1-#”，且产生且评估抗体2的各种形式，例如含有Fc结构域中的具体突变，或去海藻糖基化版本，各自具有名称“抗体2-#”。
ELISA
以与以下描述基本上类似且通常符合所属领域中已知的方法的方式进行所有ELISA。用每孔1μg/mL的人类CTLA4-Fc(R&D#7268-CT)涂布聚苯乙烯96孔微板(Fisher#07-200-591)且在4℃下储存过夜。板用含0.05％Tween的TBS(TBS-T)洗涤，用1％BSA(SigmaAldrich#B4287-25G)阻断且用TBS-T洗涤。在分析法缓冲液(PBS+0.05％Tween+1％BSA)中制备含有下文所描述的抗CTLA4抗体的样品的连续稀释物，添加至板中且在室温下，在100RPM下振荡一小时。在用TBS-T洗涤之后，向孔施用在分析法缓冲液中以1∶8000稀释的抗人类κ轻链[纯系：SB81a]-HRP(Abcam#ab79115)且在室温下振荡一小时。用TBS-T洗涤板，向板施用HRP底物(Super Signal Pico Chemiluminescent Substrate，Thermo#37069)且使用分光光度计(BioTek)记录发光。用GraphPad Prism分析数据。
SPR
以与以下描述基本上类似且通常符合所属领域中已知的方法的方式进行所有表面等离子共振(SPR)分析。对某些抗体进行SPR以评估抗体或其片段与目标蛋白质(如人类CTLA4(huCTLA4)、食蟹猕猴CTLA4(cynoCTLA4)或FcγRIIIa(CD16a))之间的结合。在一些研究中，进行SPR分析以测试某些抗体(例如，抗体2-6(抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变的版本)和抗CTLA4抗体伊派利单抗)与人类CTLA4的结合。在一些研究中，进行SPR分析以测试某些抗原结合片段(例如，抗体(如抗体2和伊派利单抗)的Fab)与重组人类CTLA4(rhCTLA4)的结合。在一些研究中，进行SPR分析以测试某些抗原结合片段(例如，抗体(如抗体2和伊派利单抗)的Fab)与cynoCTLA4-Fc的结合。用GE Biacore T200仪器在37C下进行SPR分析。在100RU固定水平下将抗体和同型对照(参考通道)与CM5芯片(GEHealthcare)偶合。合成肽且在HBS-EP+操作缓冲液(GE Healthcare)中稀释。使用Biacore评估软件，3.0版分析结合数据。
结果
ELISA
图1A和图1B展示如上文所描述的人类化抗CTLA4抗体，即抗体1和抗体2或其变体与人类CTLA-Fc的结合研究的结果，如通过ELISA分析。图1A展示抗体1的具有野生型Fc区的版本(抗体1-1)和抗体1的具有Fc区中S239D突变和I332E突变的版本(抗体1-2)与人类CTLA4-Fc的结合之间不存在可检测的差异。图1B比较抗体2的各种形式的CTLA4结合，所述形式包括抗体2的具有野生型Fc区的版本(抗体2-1)、抗体2的具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的版本(抗体2-2)、抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变和两个铰链区突变的版本(抗体2-3)、抗体2的具有Fc区中的S239D、I332E和A330L突变的版本(抗体2-4)以及抗体2的具有Fc区中的S239D、I332E、A330L突变和两个铰链区突变的版本(抗体2-5)。如图1B中所示，抗体的所有形式都以类似方式结合于人类CTLA4-Fc。所测试的抗体的平均EC50值提供于以下表2中。
表2.
Figure BDA0003191468650001011
图1C-1E展示人类化抗CTLA4抗体，即抗体1、抗体2或伊派利单抗，或其含有Fc区中的突变的变体或去海藻糖基化版本与人类CTLA-Fc的结合研究的结果，如通过ELISA分析。所测试的抗体的平均EC50值提供于相应的图中。图1C展示抗体1的具有野生型Fc区的版本(抗体1-1)、抗体1的具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的版本(抗体1-2)和抗体1的去海藻糖基化版本(抗体1-aFuc)与人类CTLA4-Fc的结合之间的不存在可检测的差异。图1D展示抗体2的具有野生型Fc区的版本(抗体2-1)、抗体2的具有Fc区中S239D突变和I332E突变的版本(抗体2-6)和抗体2的去海藻糖基化版本(抗体2-aFuc)与人类CTLA4-Fc的结合之间不存在可检测的差异。图1E展示伊派利单抗的具有野生型Fc的版本(伊派利单抗)、伊派利单抗的具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的版本(伊派利单抗-m)和伊派利单抗的去海藻糖基化版本(伊派利单抗-aFuc)与人类CTLA4-Fc的结合之间不存在可检测的差异。如图1C-1E中所示，每种抗体的所有变体都以类似方式结合于人类CTLA4-Fc。
SPR
图2A展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，抗体2-6(抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变的版本)或伊派利单抗与人类CTLA4(huCTLA4)之间的结合。图2B相对于抗体2-6与伊派利单抗之间的缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)来概述图2A中展示的结合结果。如图2B中所示，抗体2-6的KD是91pM，而伊派利单抗的KD是1640pM，表明抗体2-6对huCTLA4的结合亲和力比伊派利单抗大约18倍，如通过KD所测量。抗体2-6与cynoCTLA4之间的结合的SPR分析展示KD是131pM。
图2C展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，伊派利单抗的Fab(伊派利单抗-Fab)或抗体2的Fab(抗体2-Fab)与rhCTLA4-Fc之间的结合。图2D相对于缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、平衡解离常数(KD)和Chi2值来概述图2C中展示的结合结果。如图2D中所示，伊派利单抗-Fab的KD值是4.74nM，而抗体2-Fab的KD值是4.53pM，表明抗体2-Fab对rhCTLA4-Fc的结合亲和力比伊派利单抗-Fab大得多，如通过KD所测量。rhCTLA4-Fc与伊派利单抗-Fab或抗体2-Fab之间的其它结合亲和力数据提供于以下表3中，其展示伊派利单抗-Fab的平均KD是5.71+/-0.87nM，且抗体2-Fab的平均KD是3.86+/-2.1pM。
表3.
Figure BDA0003191468650001021
Figure BDA0003191468650001031
图2E展示SPR分析的结果，其显示在32nM、16nM、8nM、4nM和2nM下，伊派利单抗的Fab(伊派利单抗-Fab)或抗体2的Fab(抗体2-Fab)与cynoCTLA4-Fc之间的结合。图2F相对于缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)、平衡解离常数(KD)和Chi2值来概述图2E中展示的结合结果。如图2F中所示，伊派利单抗-Fab的KD值是28.6nM，而抗体2-Fab的KD值是0.623nM，表明就KD来说，抗体2-Fab对cynoCTLA4-Fc的结合亲和力比伊派利单抗-Fab大得多。cynoCTLA4-Fc与伊派利单抗-Fab或抗体2-Fab之间的其它结合亲和力数据提供于以下表4中，其展示伊派利单抗-Fab的平均KD是23.1+/-6.3nM，且抗体2-Fab的平均KD是0.779+/-0.15nM。
表4.
Figure BDA0003191468650001032
图3展示SPR分析的结果，其显示在各种浓度下，抗体2-1(抗体2的具有野生型Fc区的版本)、抗体2-6(抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变的版本)或伊派利单抗与人类FcγRIIIa(CD16a)之间的结合。无法基于结果来计算动力学和亲和力。
实例2：肠毒素分析
使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)分析法检验各种抗体促进周边血液单核细胞(PBMC)的IL-2产生的能力。
方法
SEB分析法
对于SEB分析法，在预先升温的培养基(RPMI+10％热灭活FBS+1％HEPES+1％MEMNEAA+1％丙酮酸钠)中制备所选择的抗体的稀释物。一式三份地涂布抗体溶液且仅向“PBMC+SEB”孔、“仅PBMC”孔和外边界壁中添加培养基。在预先升温的培养基中制备SEB溶液且添加至除“仅PBMC”以外的所有实验孔中。将PBMC(BioIVT)在37℃下，在水浴中解冻。将细胞逐滴转移至锥形管中且添加20x预先升温的培养基以洗涤细胞。将细胞离心且抽吸培养基。将细胞再悬浮于20mL预先升温的培养基中且获取等分试样以用于计数。将剩余细胞离心且以1×106个细胞/毫升的体积将细胞再悬浮。以100微升/孔涂布细胞且板在37℃，5％CO2培育箱中培育五天。在第五天，将板在1000RPM下旋转五分钟。从各孔将250μL细胞转移至新的96孔板中。再次将板旋转且将225μL细胞转移至PCR条带中。样品在-80℃下储存直到由ELISA进行分析。
IL-2ELISA
通过用Human IL-2ELISA MAX Deluxe集合(BioLegend，目录号431806)进行分析来确定使用上文所描述的方案制备的细胞上清液的IL-2水平。用分析法缓冲液稀释细胞上清液样品以处于标准曲线内。
使用GraphPad Prism分析样品且进行杜凯氏多重比较测试(Tukey′s multiplecomparisons test)(单因素ANOVA)以确定各处理组之间的统计显著性。
结果
在SEB分析法中测试抗体1和抗体2的各种形式。展示在存在抗体1-1或抗体1-2的情况下(如实例1中所描述)或在不存在抗体的情况下产生的IL-2的水平的数据展示于图4A中。展示在存在抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5的情况下(如实例1中所描述)或在不存在抗体的情况下产生的IL-2的水平的数据展示于图4C中。与无抗体的对照物相比，所有测试抗体都显示提高IL-2水平的能力。各抗体的高于无抗体的对照物的IL-2水平的倍数增加以及与同型对照的比较展示于图4B(对于抗体1和变体)和图4D(对于抗体2和变体)中。
图4E展示通过用抗CTLA4抗体1[具有野生型Fc区(抗体1-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体1-2)和抗体1的去海藻糖基化版本(抗体1-aFuc)]、抗体2[具有野生型Fc区(抗体2-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体2-6)和抗体2的去海藻糖基化版本(抗体2-aFuc)]或伊派利单抗[具有野生型Fc(伊派利单抗)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(伊派利单抗-m)和伊派利单抗的去海藻糖基化版本(伊派利单抗-aFuc)]的各种版本进行的SEB分析法进行的类似评估的结果。结果表明具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的抗体引起更高的IL-2产生。
实例3：抗CTLA4抗体的ADCC活性
使用FcγRIIIa报导子生物分析法评估抗CTLA4抗体引起抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力。
方法
FcγRIIIa报导子生物分析法
使用各种抗CTLA4抗体进行FcγRIIIa报导子生物分析法。在预先升温的完全培养基(具有RPMI1640的FBS)中稀释抗体。将CTLA4效应细胞(目标细胞：Promega J158A)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞混合且计数，且将细胞密度调节至1×106个细胞/毫升。向96孔板(Corning，目录号：3917)的各孔中添加目标细胞。向适当的孔中添加被稀释的抗体且一式两份地测试。温和地混合各孔的内含物且在37℃下培育板十五分钟。将效应细胞(表达FcγRIIIa的Jurkat细胞)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞混合且计数，且将细胞密度调节至3×106个细胞/毫升。立即将效应细胞分配至各孔中且温和地混合。用盖子将板覆盖且在37℃下保持六小时。在测量前一小时，在4℃下移出Bio-Glo底物和Bio-Glo缓冲液。将Bio-Glo缓冲液转移至Bio-Glo底物的瓶中以制备Bio-Glo试剂且通过翻转来温和地混合。将瓶保持在室温下。在培育之后，从培育箱移出分析板且在室温下保持十分钟。向各孔中添加Bio-Glo试剂且在室温下培育板五-十五分钟。接着，用光度计读取板。
所测试的抗体包括抗CTLA4抗体1[具有野生型Fc区(抗体1-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体1-2)和抗体1的去海藻糖基化版本(抗体1-aFuc)]、抗体2[具有野生型Fc区(抗体2-1)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(抗体2-6)和抗体2的去海藻糖基化版本(抗体2-aFuc)]或伊派利单抗[具有野生型Fc(伊派利单抗)、具有Fc区中的S239D突变和I332E突变(伊派利单抗-m)和伊派利单抗的去海藻糖基化版本(伊派利单抗-aFuc)]。
结果
图5A-5D展示来自抗体1变体(图5A)、抗体2变体(图5B)、伊派利单抗变体(图5C)和所有3种抗体的去海藻糖基化变体(图5D)的ADCC报导子生物分析法的报导子活化和EC50值的曲线。结果表明具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的抗体和去海藻糖基化抗体与各抗体的具有野生型Fc区的相应版本相比引起更高的活化。
实例4：在给予抗CTLA4抗体之后的表达人类CTLA4的携带肿瘤的小鼠模型中的免疫细胞的体内免疫表型分析
在被给予各种抗CTLA4抗体的进行人类CTLA4敲入的携带MC38肿瘤的被基因工程改造的小鼠模型中确定免疫细胞的免疫表型。
方法
将MC38细胞(1×106个)皮下注射至用人类CTLA4进行敲入的小鼠模型中。在第0天，基于肿瘤体积测量结果将小鼠随机分配且腹膜内注射200μg测试抗体(抗体2-1、伊派利单抗、伊派利单抗的去海藻糖基化形式(伊派利单抗-aFuc))或IgG对照物的单次注射。在注射之后第五天对CD45+脾细胞和CD45+瘤内细胞进行免疫表型分析。针对标记物的表达来评估CD45+细胞，所述标记物包括CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、
CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+，且评估表达这些标记物的CD45+细胞的相对比例。
结果
携带MC38肿瘤的人类CTLA4敲入小鼠的免疫表型分析的结果描绘于图6A-6D中，其中关于CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+的标记物提供CD45+脾(图6A和6B)或CD45+瘤内(图6C和6D)的相对比例。统计数据提供于表5(脾细胞)和表6(瘤内细胞)中。第1组：IgG，第2组：抗体2-1；第4组：伊派利单抗；第5组：伊派利单抗-aFuc。
表5
Figure BDA0003191468650001071
表6
Figure BDA0003191468650001072
Figure BDA0003191468650001081
实例5：表达人类CTLA4的携带肿瘤的小鼠模型中抗CTLA4抗体的体内肿瘤生长抑制
评估在进行人类CTLA4敲入的携带MC38肿瘤的被基因工程改造的小鼠模型中，在给药之后，各种抗CTLA4抗体的肿瘤生长抑制活性。
将MC38细胞(1×106个)皮下注射至含有人类CTLA4细胞外结构域编码区的敲入的小鼠模型中。向小鼠腹膜内注射20μg、7μg或2μg测试抗体[抗体2-6、伊派利单抗、伊派利单抗的去海藻糖基化形式(伊派利单抗-aFuc)，或具有Fc结构域中的S239D和I332E突变的RSV抗体(RSV-m)]的单次注射。在测试抗体的单次注射之后随时间推移测量肿瘤体积。
结果描绘于图7A-7D中。图7A(组平均值)和图7B(各个小鼠)展示被注射抗体2-6、伊派利单抗或伊派利单抗的去海藻糖基化形式(伊派利单抗-aFuc)的小鼠中随时间推移的肿瘤体积(mm3)，且结果表明所有测试抗体都展示肿瘤生长抑制。图7C(20μg)、图7D(7μg)和图7E(2μg)展示在各剂量的不同抗体情况下，随时间推移的肿瘤体积(mm3)的比较。结果表明抗体2-6在2μg和7μg剂量下显示最佳肿瘤生长抑制，且在20μg剂量下显示与伊派利单抗抗体类似的肿瘤生长抑制。
实例6：抗CTLA4抗体在MB49小鼠膀胱肿瘤模型中的功效和药效学
方法
使用MB49小鼠膀胱肿瘤模型评估抗CTLA4抗体的功效和药效学(PD)。通过给予各测试抗体(RSV-m对照抗体、伊派利单抗和抗体2-6)且接着评估肿瘤体积和体重来评估功效。抗RSV对照抗体含有S239D和I332E突变(RSV-m对照抗体)。还在第5天进行周边免疫表型分析，其评估在给药后第5天周边血液中的CD4+Ki67+细胞的百分比和CD4+ICOS+细胞的百分比。评估小鼠以进行功效研究，其中剂量以mg/kg计，如表7中所示。如本文中所使用，以mg/kg计的剂量也称为“mpk”。将MB49细胞皮下接种至C57/BL6-huCTLA4小鼠中。当肿瘤达到约350mm3时开始处理。进行单因素ANOVA和邓尼特事后检验(Dunnett′s post-test)以确定处理对比对照(RSV-m对照物)的统计显著性。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
表7
群组 抗体 剂量(mg/kg)
1 RSV-m对照物 10
2 伊派利单抗 0.3
3 伊派利单抗 1
4 伊派利单抗 3
5 抗体2-6 0.3
6 抗体2-6 1
7 抗体2-6 3
8 抗体2-6 10
通过向五个小鼠群组中的每一个给予抗体来评估药效学，其中剂量(mg/kg)如表8中所示。在肿瘤、肝脏、脾和血液中进行免疫表型分析和其它读取。通过以CD4+细胞的百分比形式测量Foxp3+CD25+细胞来评估T细胞，且以CD45+细胞的百分比形式测量CD8+细胞。
表8
群组 抗体 剂量(mg/kg)
1 RSV-m对照物 10
2 伊派利单抗 3
3 抗体2-6 3
结果
图8A展示在给药后第5天，对周边血液中的CD4+Ki67+细胞(左侧)和CD4+ICOS+细胞(右侧)的百分比的功效研究的结果，其表示T细胞活化水平。
如图8B中所示，在用10mg/kg(RSV-m对照物)或3mg/kg(伊派利单抗或抗体2-6)处理的小鼠中，在第7天评估肿瘤重量和CD8/Treg比率。在第7天，在3mg/kg下，用抗体2-6处理的小鼠呈现最低的肿瘤重量和肿瘤中较高的CD8/Treg比率。在任何处理组中都未观察到体重、脾重量、肾脏重量或肝脏重量的变化(数据未展示)。
如图8C中所示，在抗体2-6，但未在伊派利单抗的情况下观察到调节性T细胞消耗和CD8+T细胞活化。
如图8D中所示，在用抗CTLA4抗体处理后观察到强抗肿瘤活性。在0.3mg/kg剂量下，抗体2-6与伊派利单抗相比显示优良的抗肿瘤活性。
实例7：食蟹猕猴中抗CTLA4抗体的体内评估
在食蟹猕猴中评估抗CTLA4抗体的药效学(PD)作用。在两组不同的实验中，向食蟹猕猴给予伊派利单抗、抗体2-6或同型对照，且通过测量CD4+细胞中的Ki67+细胞百分比(％)来评估药效学(PD)作用。
第一组和第二组PD实验的结果展示于图9中。在诱导周边PD作用方面，抗体2-6比伊派利单抗更有效，如由与伊派利单抗相比升高的CD4+细胞中的Ki67+细胞百分比证实。
还使用食蟹猕猴在测试抗体(RSV-m对照物、伊派利单抗或抗体2-6)的10mg/kg静脉内给药后评估药物动力学。测量血浆中各抗体的水平，且在两个研究中确定半衰期(天)、Cmax(μg/mL)和曲线下面积(AUC)(天×微克/毫升)。计算各测试抗体的药物动力学研究的半衰期(天)、Cmax(μg/mL)和曲线下面积(AUC)(天×微克/毫升)结果。伊派利单抗具有最长的半衰期和最大的AUC。抗体2-6具有与伊派利单抗大致相同的Cmax。
序列表
<110> 西利欧发展公司
<120> 抗CTLA4抗体和其使用方法
<130> 73776-20025.40
<140> 未指定
<141> 一同提交
<150> US 62/785,111
<151> 2018-12-26
<160> 39
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<211> 11
<212> PRT
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Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
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<223> CDR-L2（Kabat）抗体1
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<223> CDR-H2（Kabat）抗体1
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Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
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Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp
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Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr
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<223> CDR-L2（Kabat）抗体2
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<211> 9
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His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1（Kabat）抗体2
<400> 22
Asn Tyr Phe Met Asn
1 5
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<211> 17
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<223> CDR-H2（Kabat）抗体2
<400> 23
Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys
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Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3（Kabat）抗体2
<400> 24
Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL结构域（抗体1）
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH结构域（抗体1）
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 27
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链（抗体1）
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 28
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链（抗体1）
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链（抗体1-S239D、I332E）
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL结构域（抗体2）
<400> 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 31
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH结构域（抗体2）
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 32
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链（抗体2）
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 33
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链（抗体2）
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 34
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链（抗体2-S239D、I332E）
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 35
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定结构域
<400> 35
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 36
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定结构域S239D
<400> 36
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 37
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定结构域I332E
<400> 37
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 38
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链恒定结构域S239D、I332E
<400> 38
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链恒定结构域
<400> 39
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (55)

1.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：
a)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且所述VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且所述VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
4.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。
9.根据权利要求7或8所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述CH包含氨基酸取代S239D或I332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且所述重链包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；或
b)所述轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且所述重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
14.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
15.一种抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
18.根据权利要求17所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
19.根据权利要求17所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是类美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
20.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中所述第一对的轻链包含VL结构域，且所述第一对的重链包含VH结构域，且其中：
a)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：20的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的CDR-H3。
21.根据权利要求20所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述VL结构域包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且所述VH结构域包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列，且所述VH结构域包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列。
22.根据权利要求20或21所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
23.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中所述第一对的轻链包含VL结构域，且所述第一对的重链包含VH结构域，且其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列和/或所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
25.根据权利要求20至23中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含重链恒定结构域(CH)。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的CH序列：SEQ ID NO：35-38。
28.根据权利要求26或27所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述CH包含氨基酸取代S239D或1332E或其两者，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
29.根据权利要求20至28中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38的CH序列。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定结构域(CL)。
31.根据权利要求20至30中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：39的CL序列。
32.根据权利要求20至31中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中：
a)所述轻链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，且所述重链包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列；或
b)所述轻链包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，且所述重链包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。
33.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中所述第一对包含有包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链。
34.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，其包含：
1)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
2)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；其中所述第一对包含有包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的重链。
35.根据权利要求20至34中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化或海藻糖缺失型。
36.根据权利要求20至35中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述双特异性抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
37.根据权利要求36所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
38.根据权利要求36所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呼(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
39.一种核酸，其编码根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段。
40.一种载体，其包含根据权利要求39所述的核酸。
41.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求39所述的核酸。
42.根据权利要求41所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段。
43.根据权利要求41或42所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达β1,4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶I(ManII)。
46.一种用于制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求41至45中任一项所述的宿主细胞。
47.一种用于制备去海藻糖基化或海藻糖缺失型抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求42至45中任一项所述的宿主细胞。
48.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其进一步包含回收由所述宿主细胞产生的所述抗体或其抗原结合片段。
49.一种抗体或其抗原结合片段，其是由根据权利要求46至48中任一项所述的方法制备。
50.一种组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段。
51.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂。
52.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂，所述医药组合物是用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病。
53.一种医药组合物的用途，所述医药组合物包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段和医药学上可接受的载剂，其是用于制造用以治疗或预防受试者中的赘生性疾病的药剂。
54.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段或根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段。
55.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、根据权利要求20至38中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求50至52中任一项所述的组合物。
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