JP2022516503A - 活性化可能なマスクされた抗ｃｔｌａ４結合タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗体、二重特異性抗体、およびキメラ受容体）、ならびに癌の治療および予防におけるそれらの使用、ならびに活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を含む組成物およびキットを提供する。【選択図】図１０Ｂ

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年１２月２６日に出願された米国仮出願第６２／７８５，１１１号からの優先権を主張し、その内容の全体が参照により組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７７６２００１６４０．ｔｘｔ、作成日：２０１９年１２月２３日、サイズ：５１８ＫＢ）。
発明の分野
本発明は、活性化可能なマスクされた抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体）、およびそれらの使用に関連する方法に関する。
発明の背景
癌は米国で２番目に多い死因であり、次の５つの主要な原因（慢性呼吸器疾患、脳卒中、事故、アルツハイマー病、および糖尿病）よりも多くの死因を占めている。標的療法では特に大きな進歩が遂げられたが、この分野ではまだ多くの研究が残されている。免疫療法およびこの分野の分科である免疫腫瘍学は、悪性腫瘍を治療するための実行可能で刺激的な治療選択肢を生み出している。特に、癌の１つの特徴は免疫回避であり、顕著な努力が、癌を認識および治療するために免疫系を再活性化するための標的を特定し、これらの標的に対する療法を開発してきたことが現在では認識されている。事実、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）抗体であるイピリムマブは、ステージＩＩＩ／ＩＶ悪性黒色腫を患う患者の長期生存をもたらした。イピリムマブは、ＣＴＬＡ４を遮断することによってＴ細胞の阻害を中断する免疫チェックポイントアンタゴニストであり、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇をもたらし得る。［Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ ６：５８２－５９１（非特許文献１）、Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０６（８）：１７１７－１７２５，２００９（非特許文献２）、Ｓｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１（１）；３２－４２，２０１３（非特許文献３）］残念なことに、イピリムマブは、生命を脅かし得る免疫関連有害作用をもたらすＴ細胞依存性免疫応答の全身的（腫瘍特異的ではない）活性化を引き起こし、しばしば用量および治療期間が制限される（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：５９５０－５９５６（非特許文献４））。これらには、腸炎、皮膚炎、下垂体炎、ブドウ膜炎、肝炎、腎炎、および死亡が含まれる。腸炎は、最も一般的な主な毒性である（患者の約２０％に影響する）。免疫媒介性有害反応に関連する重度の安全性リスクがあったため、ＦＤＡは、リスク評価および軽減戦略（ＲＥＭＳ）を伴ってイピリムマブを承認した。最近、イピリムマブと、ＰＤ１を標的とする第２の免疫チェックポイント調節因子（例えば、ニボルマブ）との併用投与は、イピリムマブ単独と比較して、黒色腫の免疫療法の有効性を有意に増加させることが示されている。しかしながら、この増加は、併用療法を受けている患者の５０％超に影響するグレード３／４の有害作用の頻度の増加と関連していた（Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（非特許文献５））。
これらの所見は、全身免疫活性化に関連する副作用のない、腫瘍を効果的に標的化する抗ＣＴＬＡ４タンパク質治療薬の開発の必要性を説明している。この必要性に対処するための抗ＣＴＬＡ結合タンパク質、その組成物、およびその使用方法が本明細書に提供される。
特許出願、特許公開、および科学文献を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、各個々の参考文献が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ ６：５８２－５９１ Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０６（８）：１７１７－１７２５，２００９ Ｓｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１（１）；３２－４２，２０１３ Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：５９５０－５９５６ Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ
活性化可能なマスクされた抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）結合タンパク質、それを含む組成物、およびそれを使用する方法が本明細書に提供される。
ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片を含むマスクされた抗体が本明細書に提供され、抗体またはその抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖を含み、マスキングペプチドは、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含み、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖または第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであるか、またはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変ドメインであるか、またはそれを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗原結合断片は、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端は、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドを含むリンカーは、スペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、スペーサーリンカーは、切断可能なペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、アミノ酸配列を含むスペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、マスクされた抗体は、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、マスクされた抗体は、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーを含み、マスクされた抗体は、切断可能なペプチドと、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片との間にスペーサーリンカーを含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、マウス抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；またはＫ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／もしくはＫ３２６Ｅを含み、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６もしくは３８０～３９７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３８０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、抗体またはその抗原結合断片は、薬剤と複合体化される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、本明細書に提供されるマスクされた抗体は、約２０対約１０，０００の最適な閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）比を呈する。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約２０対約１，０００である。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約８０対約１００である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、マスクされた抗体は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖、ならびに配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含むマスクされた二重特異性抗体もまた本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の対の軽鎖または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端は、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドを含むリンカーは、スペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドを含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、スペーサーリンカーは、切断可能なペプチドのＮ末端またはＣ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、アミノ酸配列を含むスペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対の軽鎖または重鎖は、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）軽鎖または重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーリンカーを含み、第１の対は、切断可能なペプチドと軽鎖または重鎖との間にスペーサーリンカーを含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、マウス抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、ＩｇＧ１は、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；またはＫ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／もしくはＫ３２６Ｅなどのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６もしくは３８０～３９７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３６６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３８０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の対は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、薬剤と複合体化される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、薬剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、本明細書に提供されるマスクされた二重特異性抗体の第１の対および第２の対は各々、同じであっても互いに異なっていてもよい最適な閉塞比を呈する。いくつかの実施形態では、最適な閉塞比は、約２０対約１０，０００である。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約２０対約１，０００である。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約８０対約１００である。
ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメインと、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと、膜貫通ドメインと、シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと含む、マスクされたキメラ受容体もまたは本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、リガンド結合ドメインの第１の鎖または第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端は、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドを含むリンカーは、スペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドを含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、スペーサーリンカーは、切断可能なペプチドのＮ末端またはＣ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、アミノ酸配列を含むスペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、リガンド結合ドメインの第１の鎖または第２の鎖は、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）第１の鎖または第２の鎖を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、リガンド結合ドメインは、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーリンカーを含み、リガンド結合ドメインは、切断可能なペプチドと第１の鎖または第２の鎖との間にスペーサーリンカーを含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、リガンド結合ドメインは、第１の鎖および第２の鎖を含み、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、第２の鎖は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、第２の鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。
任意のかかる実施形態のうちのいくつかでは、本明細書に提供されるマスクされたキメラ受容体は、約２０対約１０，０００の最適な閉塞比を呈する。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約２０対約１，０００である。さらなる実施形態では、最適な閉塞比は、約８０対約１００である。
前述の実施形態のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体をコードする核酸もまた提供される。前述の実施形態の核酸を含むベクターもまた提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。前述の核酸の実施形態を含む宿主細胞もまた提供される。
マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を生成する方法も提供され、前述の宿主細胞を、マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を生成する条件下で培養することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、さらに、ゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。任意のかかる実施形態のうちのいくつかは、宿主細胞によって生成されるマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の方法によって生成されるマスクされた二重特異性抗体またはマスクされたキメラ受容体。
前述の実施形態のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を含む組成物もまた提供される。いくつかの実施形態は、前述の実施形態のマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的組成物である。
前述の実施形態のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、マスクされたキメラ受容体、または組成物を含むキットもまた提供される。
対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法もまた提供され、方法は、前述の実施形態のうちのいずれか１つの、有効量のマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、マスクされたキメラ受容体、または組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、腫瘍性疾患は、癌である。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌である。
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、またはすべてを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者にとって明らかとなるであろう。本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明によってさらに説明される。
図１Ａおよび１Ｂは、マスキングペプチドによる抗ＣＴＬＡ４抗体の閉塞のインビトロ分析を示す一連のグラフである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行い、Ａ）反応速度論と、Ｂ）９Ｄ９抗体（リガンド）およびマスキングペプチドＣＮＬＩＶＥＧＨＣ（分析物）の間の親和性とを調べた。分析物を、３７℃で、０．１～５０μＭの２倍連続希釈の増加する濃度で実行した。参照減算された応答をプロットした。ＳＰＲを３回行い、１つの実験からの代表的なトレースを示す。 図２Ａ～２Ｃは、マスクされたマウス抗ＣＴＬＡ４抗体のプロテアーゼ活性化を示す一連のグラフである。図２Ａ）活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９、黒色の丸）と比較して、マウスＣＴＬＡ４－Ｆｃ（９Ｄ９、黒色の四角）への９０倍低い結合を呈した。活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のプロテアーゼ活性化は、親ＣＴＬＡ４抗体と同等のレベルで、マウスＣＴＬＡ４－Ｆｃ（プロテアーゼ活性化、アスタリスク）への結合を完全に回復させた。Ｘ軸は、試験された抗体の量を示す。図２Ｂ）活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９、黒色の逆三角）および非切断性（ｎｏｎ－ｃｌｅａｖａｂｌｅ）のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（ＮＣマスク９Ｄ９、白色の四角）は、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９、黒色の丸）と比較して、それぞれ、マウスＣＴＬＡ４への約１５６倍および約２１８倍低い結合を示した。Ｘ軸は、試験された抗体の量を示す。図２Ｃ）ＥＣ５０を、組換えＭＭＰ２の不在下または存在下で、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）、非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（ＮＣマスク９Ｄ９）、および親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９）について、ＥＬＩＳＡにより決定した。各群を少なくとも３回行い、平均ＥＣ５０＋／－ＳＥを報告する。 図３Ａ～３Ｄは、腫瘍体積の低減におけるプロテアーゼ活性化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）の有効性が、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９ ＩｇＧ２ａ）の有効性と同等であったことを示す一連のグラフである。ＭＣ３８同系腫瘍を、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに移植した。図３Ａ）ｍｕＩｇＧ２ａ対照抗体、図３Ｂ）ＩｇＧ２ａアイソタイプ（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ）を有する親抗ＣＴＬＡ４抗体、図３Ｃ）活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）の単一２００μｇ用量を、腫瘍のサイズが６０～１２０ｍｍ３に達するとマウスに腹腔内投与し、図３Ｄ）ヒト化ＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ４抗体１（抗体１）は、３Ｂ）親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９ ＩｇＧ２ａ）または３Ａ）ｍｕＩｇＧ２ａ対照抗体で処置されたマウスと比較して、ＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおける腫瘍体積の低減において類似のインビボ有効性を示した。 プロテアーゼ活性化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）および親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９ ＩｇＧ２ａ）による、腫瘍浸潤物における制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の同等の枯渇を示すグラフである。対照は、ｍｕＩｇＧ２ａ対照抗体を用いた処置を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、プロテアーゼ活性化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）が、処置されたマウスの脾臓におけるＡ）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を著しく低減させたことを示す一連のグラフである。矢印は、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９ ＩｇＧ２ａ）およびプロテアーゼ活性化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）を用いた治療群間の平均値を指している。 図６Ａ～６Ｄは、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性および安全性研究を示す一連のグラフである。図６Ａ）アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ２ａ対照）、図６Ｂ）非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（ＮＣマスク９Ｄ９）、図６Ｃ）親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９）、および図６Ｄ）活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）の腫瘍抑制活性を、ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）で調べた。 図７Ａおよび７Ｂは、Ａ）腫瘍における制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の枯渇と、Ｂ）アイソタイプ対照抗体（ＩｇＧ２ａ対照）、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９）、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）、および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（ＮＣマスク９Ｄ９）で処置されたマウス（ｎ＝６）の脾臓におけるＴｒｅｇ増殖とを示す一連のグラフである。 マスクされたヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１のプロテアーゼ活性化を示すグラフである。マスクされたヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１は、親ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１（親、白色の丸）と比較して、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（マスクされた、黒色の四角）へのより低い結合を呈した。マスクヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体のプロテアーゼ活性化は、親ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１と同等のレベルで、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（プロテアーゼ活性化、アスタリスク）への結合を完全に復元した。Ｘ軸は、試験された抗体の量を示す。ｙ軸上の親の分子／ＲＬＵのＲＬＵは、親ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１と比較した相対光単位の割合を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへのマスクされていない抗ＣＴＬＡ４抗体の結合を示すグラフである。図９Ａは、示される抗体間で類似の結合を示した、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの抗体１（抗体１－１および抗体１－２）の形態の結合を示す。図９Ｂは、示される抗体間で類似の結合を示す、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへの抗体２（抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５）の形態の結合を示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ある範囲の抗体濃度にわたるヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへのマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の結合を示すグラフである。図１０Ａは、プロテアーゼによる活性化の不在下でのマスクされた抗体による結合を示す。図１０Ｂは、プロテアーゼによる活性化後のマスクされた抗体による結合を示す。抗体２－６は、抗体２－７、抗体２－８、抗体２－９、抗体２－１０、抗体２－１１、抗体２－１２、および抗体２－１３のマスクされていない親抗体である。図１０Ａおよび１０Ｂは、プロテアーゼによる活性化の後、マスクされた抗体が、マスクされていない親抗体である抗体２－６と類似の結合特性を示すことを示す。 図１０Ａの説明を参照のこと。 図１１Ａ～１１Ｈは、様々な切断可能なペプチド配列を含む抗体２のマスクされた形態のレーダープロットを示す。抗体２－１５は、切断可能ではない切断可能ペプチド配列を含む。レーダープロット上に示される各プロテアーゼによる図１１Ａ～１１Ｈに示される各抗体の活性化は、活性化が０（活性化なし）から１．０（完全活性化）までの範囲で表されるレーダープロットを使用して示される。 図１１－１の説明を参照のこと。 図１１Ｉ～１１Ｍは、健康なマウスの血漿中（図１１Ｉおよび１１Ｊ）、およびＭＣ３８腫瘍担持マウスの血漿中（図１１Ｋ～１１Ｍ）の選択抗体を用いたプロテアーゼ切断の、ＳＤＳＰ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析の結果を示す。 図１１－３の説明を参照のこと。 図１１－３の説明を参照のこと。 図１２Ａおよび１２Ｂは、プロテアーゼ活性化の存在下または不在下での、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへのマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の結合を示すグラフである。プロテアーゼの存在下で、マスクされた抗体は、切断可能なペプチドのプロテアーゼ切断によって「活性化」される。図１２Ａは、対照として活性化可能ではないアイソタイプ対照、およびその切断可能なペプチド配列が非切断性であるために活性化可能ではないマスクされた抗体（抗体２－１５）を含む。図１２Ｂは、対照としてアイソタイプ対照、およびその切断可能なペプチド配列が非切断性であるために活性化可能ではないマスクされた抗体（抗体２－１０）を含む。抗体２－１４の活性化は、マスクされてない親抗体である抗体２－６と類似のレベルでのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃへのその結合を完全に回復させた（図１２Ｂ）。 図１３Ａ～１３Ｄは、抗体１および抗体２のマスクされていない形態について、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイを使用して決定された場合の、ＩＬ－２レベル（ｐｇ／ｍＬ）（図１３Ａおよび１３Ｃ）、またはＩＬ－２レベルの変化倍率（図１３Ｂおよび１３Ｄ）を示すグラフである。抗体１（抗体１－１および１－２）のマスクされていない形態（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ならびに抗体２（抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５）のマスクされていない形態（図１３Ｃおよび１３Ｄ）を、ＳＥＢアッセイを使用して末梢単核細胞からのＩＬ－２生成を促進する能力について試験した。すべての試験された抗体１および抗体２の形態は、非抗体対照と比較してＩＬ－２レベルを増加させる能力を示した（図１３Ａおよび１３Ｃ）。 図１３Ａの説明を参照のこと。 図１３Ａの説明を参照のこと。 図１３Ａの説明を参照のこと。 図１４Ａ～１４Ｄは、抗体２のマスクされた形態について、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイを使用して決定された場合の、ＩＬ－２レベル（ｐｇ／ｍＬ）（図１４Ａおよび１４Ｃ）、またはＩＬ－２レベルの変化倍率（図１４Ｂおよび１４Ｄ）を示すグラフである。抗体２のマスクされていない形態（抗体２－６）を、抗体２－６（抗体２－７、抗体２－８、抗体２－９、抗体２－１０、抗体２－１１、抗体２－１２、および抗体２－１３）のマスクされた形態とともに試験した。図１４Ａおよび１４Ｂは、非活性化状態（すなわち、プロテアーゼへの曝露なし）での、ＩＬ－２レベルに対する抗体の影響（図１４Ａ）およびＩＬ－２レベルの変化倍率（図１４Ｂ）を示す。マスクされていない親抗体である抗体２－６は、ＩＬ－２レベルを著しく増加させる能力を示し、マスクされた抗体（抗体２－１２）のうちの１つのみがＩＬ－２レベルの著しい増加を示すが、抗体２－６よりもはるかに低いレベルである（図１４Ａおよび１４Ｂ）。図１４Ｃおよび１４Ｄは、活性化状態（すなわち、プロテアーゼへの曝露後）での、ＩＬ－２レベルに対する抗体の影響（図１４Ｃ）およびＩＬ－２レベルの変化倍率（図１４Ｄ）を示す。図１４Ｃおよび１４Ｄは、プロテアーゼへの曝露が、マスクされていない親抗体である抗体２－６と類似のレベルでＩＬ－２生成を促進する抗体２－７、抗体２－８、および抗体２－９の能力をレスキューすることを示す。 図１４Ａの説明を参照のこと。 図１４Ａの説明を参照のこと。 図１４Ａの説明を参照のこと。 図１５Ａ～１５Ｄは、ウェスタンブロット分析によって示されるように、健康なマウスの血漿中のマスクされた抗ＣＴＬＡ４ 抗体のインビボでの切断の程度を示す。健康なマウスにおける抗体２（抗体２－１４、抗体２－１９、および抗体２－２０）のマスクされた形態のインビボでの切断は、抗体の腹腔内投与後２、４、および７日目に示されている。インビトロでプロテアーゼの存在下または不在下でマスクされた抗体を処置した標準試料を、切断の対照として使用した。抗体２－１４（図１５Ａ）および抗体２－２０（図１５Ｃ）の両方をインビボで活性化した。図１５Ｂは、抗体２－１９の活性化の欠如を示す。２日目から７日目までの活性化の割合の増加を、抗体２－１４および抗体２－２０について図１５Ｄに示す。 図１５Ａの説明を参照のこと。 図１５Ａの説明を参照のこと。 図１５Ａの説明を参照のこと。 図１６Ａ～１６Ｄは、ウェスタンブロット分析によって示されるように、腫瘍担持マウスの血漿中のマスクされた抗ＣＴＬＡ４ 抗体のインビボでの切断の程度を示す。ＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける抗体２（抗体２－１４、抗体２－１９、および抗体２－２０）のマスクされた形態のインビボでの切断は、抗体の腹腔内投与後２、４、および７日目に示されている。インビトロでプロテアーゼの存在下または不在下でマスクされた抗体を処置した標準試料を、切断の対照として使用した。抗体２－１４（図１６Ａ）および抗体２－２０（図１６Ｃ）の両方をインビボで活性化した。図１６Ｂは、抗体２－１９の活性化の欠如を示す。２日目から７日目までの活性化の割合の増加を、抗体２－１４および抗体２－２０について図１６Ｄに示す。抗体２－１４の活性化率は、二元配置分散分析（調整されたＰ値＝０．０１１３）によって決定された場合に、健康な非腫瘍担持マウスと比較して、ＭＣ３８腫瘍担持マウスで有意に大きかった（図１６Ｄ）。 図１６Ａの説明を参照のこと。 図１６Ａの説明を参照のこと。 図１６Ａの説明を参照のこと。 プロテアーゼへの以前の曝露の結果として、マスクされた状態および「活性化された」状態で、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイを使用して決定された場合に、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体がＡＤＣＣ活性を促進する能力を示すグラフである。図１７は、マスクされていない親抗体（抗体２－６）および抗体２－６（抗体２－１４および抗体２－１５）のマスクされたバージョンによるレポーター活性化の程度を示す。抗体２－１５は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。また、アイソタイプ対照も試験された。以前のプロテアーゼへの曝露を有する抗体は、「活性化された」ものとして示される。以前のプロテアーゼへの曝露を有することなく試験した場合、マスクされた抗体である抗体２－１４および抗体２－１５は、マスクされていない親抗体（抗体２－６）と比較して、低減されたレポーター活性化を示した（図１７）。プロテアーゼによって活性化可能ではない抗体２－１５の低減されたレポーター活性化は、以前のプロテアーゼへの曝露によってレスキューされなかった（図１７）。プロテアーゼによって活性化可能な抗体２－１４のレポーター活性化は、マスクされていない親抗体である抗体２－６によって誘導されるものに似ているレベルにレスキューされた（図１７）。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイを使用して決定された、抗ＣＴＬＡ４抗体が、そのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６を含むＣＴＬＡ４の相互作用を遮断する能力を示すグラフである。図１８Ａは、ＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合を遮断する、抗体２のマスクされていない形態（抗体２－２）および抗体２のマスクされた形態（抗体２－１４）の能力を示す。抗体２－１４を、マスクされた状態（すなわち、以前のプロテアーゼへの曝露なし）で、および以前のプロテアーゼへの曝露のために「活性化された」状態で試験した。比較のために、アッセイもアイソタイプ対照を使用して実行し、また抗体なしで（すなわち、抗体なし対照として）実行した。図１８Ａは、プロテアーゼの不在によりマスクされた（非活性化された）形態にある場合、抗体２－１４が、そのリガンドへのＣＴＬＡ４結合を効果的に遮断する能力を示さなかったことを示す。抗体なし対照を上回る変化倍率の分析は、マスクされた（非活性化された）形態にある場合の抗体２－１４の能力と、ＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合を遮断するアイソタイプ対照の能力との間に有意差を示さなかった（図１８Ｂ）。しかしながら、図１８Ａは、抗体２－１４が以前のプロテアーゼへの曝露のために「活性化された」形態にある場合、それは、ある範囲の濃度にわたってＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合を効果的に遮断する能力を示したことを示す。そのリガンドへのＣＴＬＡ４結合を遮断する「活性化された」抗体２－１４の能力は、マスクされていない抗体２－２のものと類似していた（図１８Ａおよび１８Ｂ）。抗体対照なしを上回る変化倍率の分析は、そのリガンドへのＣＴＬＡ４結合を遮断する「活性化された」抗体２－１４とマスクされていない抗体２－２の能力の間に有意差（「ｎｓ」）を示さなかった（図１８Ｂ）。 図１８Ａの説明を参照のこと。 図１９Ａ～１９Ｄは、以下を含むマーカーを発現するＣＤ４５＋細胞の割合を評価した免疫表現型研究の結果を示す：ＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇｓ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋。 図１９Ａの説明を参照のこと。 図１９Ａの説明を参照のこと。 図１９Ａの説明を参照のこと。 図１９Ｅおよび１９Ｆは、試験された抗体を比較する統計量を提供する（群１：ＩｇＧ、群２：抗体２－１、群３：抗体２－１０、群４：イピリムマブ、群５：イピリムマブ－ａＦｕｃ）。 図１９Ｅの説明を参照のこと。 図２０Ａおよび２０Ｂは、２０μｇ、７μｇ、または２μｇの試験抗体の単回注射の投与後の経時的な腫瘍体積を示すグラフを示す。 図２０Ａの説明を参照のこと。 抗体２－６、抗体２－１０、抗体２－１４、抗体２－１６、またはアイソタイプ対照の投与後の、総ＣＤ４＋細胞のうちのＫｉ６７＋細胞の割合を評価することによって、カニクイザルにおける薬力学的効果を評価した、２つの実験のセット（実験１および実験２）の結果を示すグラフを示す。 以下の試験抗体のうちの１つの投与後のカニクイザルにおける薬物動態を評価した実験の結果を示す：ＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１０、抗体２－１４、抗体２－１６、またはイピリムマブ－ｍ－マスク。図２２は、１４日間の期間にわたるμｇ／ｍＬ単位の各投与された抗体のレベルを示すグラフを示す。 投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞（左）およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞（右）の割合に関する有効性研究の結果を示すグラフであり、これはＴ細胞活性化のレベルを表す。 １０ｍｇ／ｋｇ（ＲＳＶ－ｍ対照）または３ｍｇ／ｋｇ（イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１５）で処置されたマウスにおいて、７日目に評価された腫瘍重量（左）およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（右）を示すグラフを示す。 マウスにおけるＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１４、または抗体２－１５の投与後の、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞（左）および腫瘍微小環境におけるＣＤ８＋Ｔ細胞（右）を示すグラフを示す。 ＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５を含む抗体の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの投与後の、マウスにおける経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフを示す。 血漿、腎臓、肝臓、および腫瘍組織における、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１６、および抗体２－１０の切断を評価したＭＣＡ２０５線維肉腫細胞を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析の結果を示す。 血漿、腎臓、および肝臓組織における、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１６、および抗体２－１０の切断を評価したＭＢ４９細胞を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析の結果を示す。 血漿、腎臓、肝臓、および腫瘍組織における、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１６、および抗体２－１０の切断を評価したＭＣ３８細胞を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析の結果を示す。 切断を評価したＭＣ３８細胞を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥウェスタンブロット分析の結果を示し、選択試料に対する切断の割合を提供する。切断の割合は、デンシトメトリー強度（切断％＝下側バンド／（下側バンド＋上側バンド））に基づいて計算された。 各抗体とＣＴＬＡ４との間の結合を示すグラフを示し、各抗体は、ＭＢ４９担持Ｂ－ｈＣＴＬＡ４トランスジェニックマウスへの投与後に血漿、腎臓、肝臓、または脾臓から単離された。 例示的なプロテアーゼのパネルによる切断可能なペプチド基質のインビトロでの切断のヒートマップを示す。 図２５Ａ～２５Ｆは、識別されたマウスモデル（Ｃ５７／Ｂｌ６－ｗｔ、ＭＣ３８－ｗｔ、ＭＣ３８－ｈＣＴＬＡ４、ＭＢ４９－ｗｔ、ＭＣＡ２０５－ｗｔ、Ｂ１６－ｗｔ）を使用して、調整された培地における切断の頻度を示すレーダープロットを示す。培地を、脾臓、肝臓、腎臓、血漿、または腫瘍など、示されるように組織で調整した。 図２５Ａの説明を参照のこと。 図２５Ａの説明を参照のこと。 図２５Ａの説明を参照のこと。 図２５Ａの説明を参照のこと。 図２５Ａの説明を参照のこと。 図２６Ａおよび２６Ｂは、抗体２－１４を使用した健康なカニクイザルの血漿におけるインビボでの切断研究の結果を示す。図２６Ａに示されるように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および質量分析法（ＭＳ）を使用して、示されように、抗体２－１４の切断を計算した。図２６Ｂは、１時間、２４時間、および７２時間での抗体２－１４のインタクトな切断生成物の割合を示すグラフを示す。 図２６Ａの説明を参照のこと。 示されるように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）および質量分析法（ＭＳ）を使用して計算された切断の評価を含む、抗体２－１６を使用した健康なカニクイザルの血漿におけるインビボでの切断研究の結果を示す。 図２７Ａおよび２７Ｂは、ヒトの肺または結腸腫瘍試料で調整された培地を使用したエクスビボでの切断研究の結果を示す。 図２７Ａの説明を参照のこと。 図２８Ａ～２８Ｄは、結腸腫瘍上清との質量分析を使用した、切断された分子（抗体２－１４、図２８Ａ；抗体２－１５、図２８Ｂ；抗体２－１６、図２８Ｃ；抗体２－１０、図２８Ｄ）の割合（％）の分析を示す。 図２８－１の説明を参照のこと。 図２８Ｅは、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１０、抗体２－１６、およびマスクされたイピリムマブ－ｍを使用して行われたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、各試験された抗体は、結腸腫瘍調整培地（結腸２ ４ｓｅｐｔ結腸腫瘍試料）または対照としてのＲＰＭＩのいずれかで培養された。 示される細胞株または腫瘍／ＮＡＴ組織から調整された無血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）補充培地において完了したＬＤＨ放出アッセイを使用して測定された細胞の細胞傷害性を示す。 ＭＣ３８およびＨ２２２８細胞株の基質切断を、ｉｃｅＬｏｇｏグラフィックとして示す。 図３１Ａおよび３１Ｂは、ＮＡＴおよび腫瘍（ＴＵＭ）組織の基質切断を、ｉｃｅＬｏｇｏとして示す。 図３１Ａの説明を参照のこと。 Ｐ４－Ｐ４’位置でのＺスコアの差をヒートマップとして示し、ＮＡＴまたは腫瘍特異的切断で好ましい残基を強調表示する。ノルロイシン（ｎ）は、ライブラリ内のＭｅｔのプロキシである。 Ｐ４－Ｐ４’位置でのＺスコアの差をヒートマップとして示し、ＮＡＴまたは腫瘍試料のいずれかと比較して、Ｈ２２２８特異的切断で好ましい残基を強調表示する。ノルロイシン（ｎ）は、ライブラリ内のＭｅｔのプロキシである。 図３２Ａおよび３２Ｂは、ＭＣ３８調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３２Ａ、左）、ＡＫ１０－０２（図３２Ａ、右）、ＡＫ１０－０４（図３２Ｂ、左）、およびＡＫ１０－０５（図３２Ｂ、右）。 図３２Ａの説明を参照のこと。 ＡＫ１０ライブラリペプチドとのＭＣ３８ ＡＭＳＰ－ＭＳ反応からの主要な切断生成物の相対効率を示す。 図３４Ａおよび３４Ｂは、Ｈ２２２８調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３４Ａ、左上）、ＡＫ１０－０２（図３４Ａ、右上）、ＡＫ１０－０４（図３４Ａ、下）、ＡＫ１０－０９（図３４Ｂ、左）、およびＡＫ１０－１０（図３４Ｂ、右）。 図３４Ａの説明を参照のこと。 それらの相対効率とともにＡＭＳＰ－ＭＳを介してＨ２２２８調整培地によって切断された上位の基質を示す。 図３６Ａ～３６Ｃは、腫瘍調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３６Ａ、左上）、ＡＫ１０－０２（図３６Ａ、上中央）、ＡＫ１０－０３（図３６Ａ、下）、ＡＫ１０－０４（図３６Ｂ、左上）、およびＡＫ１０－０５（図３６Ｂ、右上）、ＡＫ１０－０９（図３６Ｂ、下）、ＡＫ１０－０９酸化ペプチド（図３６Ｃ、左）、およびＡＫ１０－１０（図３６Ｃ、右）。 図３６Ａの説明を参照のこと。 図３６Ａの説明を参照のこと。 それらの相対効率とともに示されるＡＭＳＰ－ＭＳを介して腫瘍調整培地によって切断された上位の基質を示す。 図３７Ａ～３７Ｄは、ＮＡＴ調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３７Ａ、上）、ＡＫ１０－０２（図３７Ａ、下）、ＡＫ１０－０４（図３７Ｂ、上）、およびＡＫ１０－０５（図３７Ｂ、下）、ＡＫ１０－０９（図３７Ｃ、上）、ＡＫ１０－０９酸化ペプチド（図３７Ｃ、下）、およびＡＫ１０－１０（図３７Ｄ）。 図３７Ａの説明を参照のこと。 図３７Ａの説明を参照のこと。 図３７Ａの説明を参照のこと。 相対効率とともにペプチドのＡＫ１０ライブラリを有するＮＡＴ調整培地によって生成された上位の切断を示す。 腫瘍対ＮＡＴ組織試料において、火山型プロットとして差次的に発現されたタンパク質を示す。統計的に有意なタンパク質は、≧２倍の変化の差の閾値倍率を有する。腫瘍（右側上、セクション２）またはＮＡＴ（左側上、セクション１）に顕著に富むタンパク質が、これらのセクションに存在する。
詳細な説明
チェックポイント阻害剤などの治療は、癌において前例のない応答を示すが、その使用は、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）および他の毒性（例えば、下垂体炎）によって制限される。例えば、腫瘍微小環境で、標的部位でのプロテアーゼによる活性化後に特異的にＣＴＬＡ４を結合させ、持続的な応答速度の増加および有意に改善された安全性プロファイルを達成するために、タンパク質治療薬が本明細書に提供される。本明細書に提供されるタンパク質治療薬は、癌の特徴のうちの１つである高局所濃度の活性プロテアーゼを利用することによって、腫瘍微小環境に対する薬理学的活性を正確に標的化するように操作される。腫瘍微小環境のこの特徴は、全身的に不活性な分子を局所的に活性な薬物へと形質転換するために使用される。腫瘍微小環境での薬物の活性化は、活性形態で対象に投与される薬物と関連付けられ得る全身毒性を有意に低減させる。
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、当然のことながら変化し得る特定の組成物または生物学系に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、制限を意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、抗体への言及は、任意に、２つ以上のかかる抗体の組み合わせなどを含む。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータを本質的に対象とする実施形態を含む（および記載する）。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」を含むことが理解される。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（イムノグロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、および単鎖分子、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。「イムノグロブリン（Ｉｇ）」という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。
塩基性４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに、５個の塩基性ヘテロ四量体ユニットからなり、１０個の抗原結合部位を含むが、一方でＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせた多価集合体を形成するように重合することができる２～５個の塩基性４鎖ユニットからなる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、概して、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されるが、一方で２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖およびＬ鎖はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて各α鎖およびγ鎖に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。ＶＨおよびＶＬの対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる、２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれ、指定されたα、δ、ε、γ、およびμの重鎖を有する。γおよびαのクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さな差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７）に存在してもよく、そのいずれも本発明での使用に好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚという文字で示されるものである。
「単離された」抗体は、その生成環境（例えば、天然または組換え）の構成要素から識別され、分離され、および／または回収された抗体である。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その生成環境から他のすべての構成要素と無関連である。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどのその生成環境の汚染成分は、抗体の研究、診断、または治療用途に典型的には干渉する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％超まで、およびいくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（１）回転カップシークエンサーの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーまたは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然発生型変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＣ末端で切断される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リジンを除去する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖でＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基は、重鎖および／または軽鎖のＮ末端で切断される。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の短縮型形態は、組換え技術によって作製され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に配向されている。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、複数の抗原部位（例えば、二重特異性抗体または多重特異性抗体など）に配向されている。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体群から取得されたときの抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の生成が必要とはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ提示技術、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部もしくはすべてまたはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を生成するための技術を含む、様々な技術によって作製され得る。
「ネイキッド抗体」という用語は、細胞傷害性部分または放射性標識と複合体化されていない抗体を指す。
「親抗体」という用語は、マスキングペプチドを用いた抗体のマスキングなど、修飾前の抗体を指す。
「マスクされた抗体」という用語は、マスキングペプチド、およびいくつかの実施形態では、好ましい環境でマスキングペプチドの活性化または除去を可能にする他の構成要素を含むように修飾された抗体を指す。
「抗体－薬物複合体」または「ＡＤＣ」は、細胞傷害性薬剤を含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子（複数可）と複合体化された抗体を指す。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すように互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖および軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有してもよい。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、抗原結合、および／またはインタクトな抗体の可変領域を含む。抗原結合抗体断片の例としては、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；抗体；線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。単一の重鎖抗体または単一の軽鎖抗体は、操作することができ、または重鎖の場合には、単一の重鎖分子を生成するように操作されたラクダ、サメ、ライブラリ、またはマウスから単離することができる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」断片とを生成した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（ＶＨ）の可変領域ドメイン、および１つの重鎖（ＣＨ１）の第１の定常ドメインとともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合したＦａｂ断片にほぼ対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を産出し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合もまた既知である。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列およびグリカンによって決定され、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域は、ある特定の細胞型上に見られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、緊密な非共有結合の会合における１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、かつ抗体に抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（それぞれＨ鎖およびＬ鎖から３ループ）が発せられる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
また、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と省略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に結合されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
本発明の抗体の「機能性断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、概して、インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、または修飾ＦｃＲ結合能を保持するもしくは有する抗体のＦｖ領域を含む。抗体断片の例としては、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である、「キメラ」抗体（イムノグロブリン）を含むが、残りの鎖（複数可）は、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片の対応する配列と同一であるか、または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書の目的のキメラ抗体は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含み、抗体の抗原結合領域は、例えば、目的の抗原を有するマカクザルを免疫化することによって生成される抗体に由来する。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲからの残基が、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲからの残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに精密化するために行われてもよい。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中で、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体性能を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含み得る。いくつかの実施形態では、ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、Ｈ鎖では６個以下であり、Ｌ鎖では３個以下である。またヒト化抗体は任意に、少なくとも、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）、Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および第７，０８７，４０９号もまた参照されたい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、単一の抗原部位に対して配向される。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、複数の抗原部位に対して配向される。代替的なヒト化方法は、米国特許第７，９８１，８４３号および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号に記載されている。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「可変領域」および「可変ドメイン」は、互換的に使用され得る。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、概して、抗体の最も可変な部分（同じクラスの他の抗体と比較して）であり、抗原結合部位を含む。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、任意の利用可能な方法または番号付けスキームを使用して決定することができ、例えば、ＷＯ２０１８／２０７７０１に記載される可変ドメインを含んでもよく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインは、可変ドメインのカルボキシル末端上に（すなわち、第４のフレームワークドメインのカルボキシル末端に）１つ以上のアミノ酸残基を欠いていてもよく、そうでなければ、ある特定の番号付けスキームに基づく可変ドメインの説明に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインは、可変ドメインのカルボキシル末端上に（すなわち、第４のフレームワークドメインのカルボキシル末端に）１つ以上のアミノ酸残基を含んでもよく、そうでなければ、ある特定の番号付けスキームに基づく可変ドメインの説明に含まれていなくてもよい。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」は、配列において超可変であり、かつ／または構造的に画定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。概して、抗体は、６つのＨＶＲを含み、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然抗体では、Ｈ３およびＬ３は、６つのＨＶＲの最も多様性を示し、特にＨ３は、抗体に微細な特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３））を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然発生型ラクダ科抗体は、軽鎖の不在下で機能的かつ安定的である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）およびＳｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。
いくつかのＨＶＲの説明が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列変動性に基づき、最も一般的に使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＶＲは、代わりに構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９６：９０１－９１７（１９８７））。「コンタクト」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下に記載する。
Figure 2022516503000002
別段の示唆が無い限り、可変ドメイン残基（ＨＶＲ残基およびフレームワーク領域残基）は、Ｋａｂａｔらの上記に従って番号付けされる。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔにある可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるアミノ酸位置番号付け」という表現、またはその変形は、Ｋａｂａｔらの上記の抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはＦＲもしくはＨＶＲへの挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含んでもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２後の挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準」のＫａｂａｔ番号付けされた配列とともに抗体の配列の相同性の領域での整列によって決定されてもよい。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来」するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、または既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、それらの配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する、ある一定のアミノ酸配列同一性％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと代替的に称され得る）は、以下のように計算される。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、そのプログラムのＡおよびＢの整列における配列によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されよう。
特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「結合する」、「特異的に結合する」、または「特異的である」抗体は、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の、関連のない抗ＣＴＬＡ４ポリペプチドへの結合は、当該技術分野で既知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって測定された場合、ＣＴＬＡ４への抗体結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４（例えば、マウスＣＴＬＡ４および／またはヒトＣＴＬＡ４）に結合する結合タンパク質（例えば、抗体）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．７ｎＭ、≦０．６ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
本明細書に提供される「ＣＴＬＡ４」または「ＣＴＬＡ４タンパク質」という用語は、ＣＴＬＡ４タンパク質活性（例えば、ＣＴＬＡ４と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性以内）を維持する、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）またはそのバリアントもしくは相同体の組換え型または天然発生型の形態のうちのいずれかを含む。いくつかの態様では、バリアントまたは相同体は、天然発生型ＣＴＬＡ４ポリペプチドと比較して、配列全体または配列の一部（例えば、５０、１００、１５０、または２００の連続アミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ＮＣＢＩ配列参照ＧＩ：８３７００２３１、相同体、またはその機能性断片によって識別されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、マウスＣＴＬＡ４である。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上で結合された分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、その後、標的細胞を細胞毒素で殺傷することを可能にする、ある形態の細胞傷害を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「アーム」し、この機構によって標的細胞を殺傷するために必要である。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページ目の表３に要約されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、Ｆｃグリカンをフコシル化してＡＤＣＣを強化させる能力を欠く細胞において操作または発現される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるアッセイなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいてインビボで評価されてもよい。ＡＤＣＣ活性および他の抗体特性を変化させる他のＦｃバリアントには、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７－４０，１９９７、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３－５６４，１９８８、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７－２６６２，１９９１、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３－５９，１９９２、Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３，１９９４、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１９８０－１１９８４，１９９５、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１－１１７，１９９５、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ９：１１５－１１９，１９９５、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１－１０４，１９９６、Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３－４９６９，１９９６、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４，１９９９、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８－４１８４，２００、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３，２０００、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６－２６，２０００、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１－２５７５，２００１、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６６０４，２００１、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５．２００２、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０，２００２、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５－４０１０，２００６、米国特許第５，６２４，８２１号、第５，８８５，５７３号、第５，６７７，４２５号、第６，１６５，７４５号、第６，２７７，３７５号、第５，８６９，０４６号、第６，１２１，０２２号、第５，６２４，８２１号、第５，６４８，２６０号、第６，１９４，５５１号、第６，７３７，０５６号、第６，８２１，５０５号、第６，２７７，３７５号、第７，３３５，７４２号、および第７，３１７，０９１号によって開示されるものを含む。
本明細書の「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を画定するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと画定される。本発明の抗体で使用するための好適な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原）の単一結合部位間の非共有結合相互作用の強度を指す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に対する結合タンパク質（例えば、抗体）の親和性は、概して、平衡解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原）の複数の結合部位の結合強度を指す。
本明細書の抗体をコードする「単離された」核酸分子は、それが生成された環境で通常関連する少なくとも１つの汚染核酸分子から識別および分離される核酸分子である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、生成環境と関連付けられたすべての構成要素と無関連である。本明細書のポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態または環境以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチドおよび抗体をコードする核酸と区別される。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の構成要素を含まない、調製物を指す。かかる製剤は滅菌されている。
本明細書で使用される場合、「担体」は、用いられる用量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床病理の経過中に治療されている個体または細胞の自然経過を変えるように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解または予後の改善が含まれる。個体は、例えば、障害（例えば、腫瘍性疾患）に関連する１つ以上の症状が軽減または除去される場合、首尾よく「治療される」。例えば、治療が、疾患を患う個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、疾患の再発頻度の低減、疾患の重症度の低減、疾患の発症もしくは進行の遅延、および／または個体の生存の延長をもたらす場合、個体は、首尾よく「治療される」。
本明細書で使用される場合、「と併用して」または「と組み合わせて」は、別の治療モダリティに加えて、１つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併用して」または「と組み合わせて」は、個体への他の治療モダリティの投与の前、その間、またはその後の、１つの治療モダリティの投与を指す。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、個体における疾患の発生または再発に関して予防を提供することを含む。個体は、障害の素因がある、障害にかかりやすい、または障害を発症するリスクがあるが、障害と診断されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体）は、障害の発症を遅らせるために使用される。
本明細書で使用される場合、障害を発症する「リスクがある」個体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有してもよく、または有さなくてもよく、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を示していても、または示さなくてもよい。「リスクがある」とは、当該技術分野で既知であるように、個体が、疾患の発症と相関する測定可能なパラメータである１つ以上のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子のうちの１つ以上を有する個体は、これらのリスク因子のうちの１つ以上を有しない個体よりも、障害を発症する確率が高い。
「有効量」は、少なくとも、治療結果または予防的結果を含む、所望のまたは示された効果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。有効量は、１つ以上の投与で提供され得る。「治療有効量」は、少なくとも、特定の障害の測定可能な改善に影響を与えるために必要な最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が抗体の任意の毒性または有害な効果を上回る量であり得る。「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防用量は、疾患の前または早期の段階の対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくてもよい。
「慢性的」投与は、長期間にわたる初期治療効果（活性）を主流にするように、急性モードとは対照的に、連続での医薬（複数可）の投与を指す。「断続的」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」は、哺乳動物である。治療の目的のための「哺乳動物」には、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどの動物園、スポーツ、またはペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
ＩＩ．活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質
一態様では、（ｉ）ＣＴＬＡ４結合ドメイン、（ｉｉ）ＣＴＬＡ４結合ドメインマスキングペプチド（本明細書では「マスキングペプチド」とも称される）、および（ｉｉｉ）マスキングペプチドをＣＴＬＡ４結合ドメインに結合する切断可能なペプチドを含むリンカーを含む、活性化可能なマスクされた細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合するマスクされた二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合するマスクされたキメラ受容体である。
本明細書に提供される活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質は、様々な種に由来するＣＴＬＡ４に結合することができ、例えば、ヒトＣＴＬＡ４および／またはマウスＣＴＬＡ４、もしくはカニクイザルＣＴＬＡ４に結合するものもある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：（１）ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）を結合する、（２）マスキングペプチドを結合タンパク質に連結するペプチドリンカーのプロテアーゼ切断後のより高い親和性でＣＴＬＡ４を結合する（例えば、活性化）、および（３）ＣＴＬＡ４を腫瘍部位でインビボで結合する。
一態様では、特にＣＴＬＡ４が役割を果たす腫瘍性疾患の治療に有用な活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質が本明細書に提供される。本明細書に提供される活性化可能なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質は、細胞（例えば、癌細胞またはＴ細胞）の表面上に発現されるＣＴＬＡ４タンパク質と相互作用（例えば、結合）することができる結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、マスキングペプチドが、ＣＴＬＡ４結合ドメインがＣＴＬＡ４タンパク質に結合するのを妨げるように、切断可能なペプチドを含むリンカーによりマスキングペプチドに結合される。切断可能なペプチドの切断時に、マスキングペプチドが放出され、それによって結合ドメインがＣＴＬＡ４タンパク質と相互作用することを可能にする。
また、いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、第１の鎖および第２の鎖を含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）、および（ｂ）マスキングペプチドを含む、マスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、第１の鎖および第２の鎖を含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であり、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖もしくは第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、スペーサーリンカー、切断可能なペプチド、およびスペーサーリンカーを含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＣ末端は、切断可能なペプチドを含むリンカーのＮ末端に連結され、切断可能なペプチドを含むリンカーのＣ末端は、第１の鎖、例えば、軽鎖または軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。
ＣＴＬＡ４結合タンパク質
本明細書に提供される「ＣＴＬＡ４結合タンパク質」という用語は、ＣＴＬＡ４タンパク質に結合することができるか、またはそうでなければＣＴＬＡ４タンパク質に対する親和性を呈することができるＣＴＬＡ４結合ドメインを含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、二重特異性抗体、抗原結合断片、一本鎖抗体などである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合するキメラ抗原受容体の構成要素である。
「ＣＴＬＡ４結合ドメイン」という用語は、細胞中または細胞上に見出されるＣＴＬＡ４タンパク質に結合することができるか、またはそうでなければＣＴＬＡ４タンパク質に対する親和性を呈することができる組換え発現ポリペプチドドメインを指す。ＣＴＬＡ４結合ドメインのＣＴＬＡ４への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ホモ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖を含むヘテロ二量体などの第１の鎖および第２の鎖を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、または第１の鎖は、軽鎖可変領域であるかもしくはそれを含み、第２の鎖は、重鎖可変領域であるかもしくはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第１の鎖および第２の鎖（例えば、軽鎖および重鎖）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖（例えば、２つの軽鎖および２つの重鎖）を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号２３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号２３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号３２３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号３２３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ／または配列番号３２４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号３２４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３６６もしくは３８０～３９７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するアミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、二重特異性抗体の抗原結合アームの軽鎖および重鎖を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、重鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３２３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む。
二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２７～３４１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号３６６、３８０～３９７、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３３４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または重鎖は、配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、軽鎖は、配列番号３３４のアミノ酸配列を含み、重鎖は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、ヒトＣＴＬＡ４である。二重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４は、マウスＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、マウス抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するアミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、キメラ受容体で使用するためのリガンド結合ドメインの一部など、ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０２もしくは４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３もしくは４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４もしくは４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖は、（ｉ）配列番号４０５もしくは４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６もしくは４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７もしくは４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。
キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３を含む。
キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む。キメラ受容体のいくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、第２の鎖は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む。
マスキングペプチド
本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合ドメインマスキングペプチド（「マスキングペプチド」とも称される）は、ＣＴＬＡ４結合ドメインに結合することができるか、またはそうでなければＣＴＬＡ４結合ドメインに対する親和性を呈することができるペプチドを指す。ＣＴＬＡ４結合ドメインに結合したとき、マスキングペプチドは、その同族受容体またはタンパク質（すなわち、ＣＴＬＡ４）に対するＣＴＬＡ４結合ドメインの活性または結合を遮断、閉塞、阻害（例えば、減少する）するか、またはそうでなければ防ぐ（例えば、マスキングする）。ＣＴＬＡ４結合ドメインのＣＴＬＡ４タンパク質への結合の程度を決定する方法は、当該技術分野で周知である。
実施形態では、マスキングペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、線形ペプチドである。いくつかの実施形態では、線形ペプチドは、４ｍｅｒ～２４ｍｅｒである。実施形態では、マスキングペプチドは、環状ペプチドである。実施形態では、環状ペプチドは、２つのシステイン間のアミノ酸数によって定義されるように、３ｍｅｒ～１２ｍｅｒである。実施形態では、環状ペプチドは、３ｍｅｒ～２０ｍｅｒである。マスキングペプチドが環化ペプチドである場合、環化ペプチドは、２つのシステインアミノ酸残基を結合するジ－スルフィド結合によって形成される。いくつかの実施形態では、システインアミノ酸残基は、末端システインである（すなわち、マスキングペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端またはその近くに位置する）。実施形態では、ジ－スルフィド結合は、Ｎ末端システインをＣ末端システインと結合させる。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＣ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または重鎖のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＣ末端に連結される。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。したがって、実施形態では、マスキングペプチドは、
Figure 2022516503000003
のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列に対して約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、マスキングペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列に対して約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、マスキングペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列に対して約７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、マスキングペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドアミノ酸配列は、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列である。例えば、マスキングペプチドアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが３０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが４０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000004
である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含むマスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、配列番号１～４６からなる群から選択されるマスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、配列番号１～４６からなる群から選択されるマスキングペプチドのＮ末端に直接連結され、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、配列番号１～４６からなる群から選択されるマスキングペプチドのＮ末端に直接連結され、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）である。
リンカー
いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、リンカー、例えば、スペーサーリンカーを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、リンカー、例えば、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、切断可能なペプチドを含むリンカーを含む。本明細書で使用される場合、「切断可能なペプチドを含むリンカー」は、ＣＴＬＡ４結合ドメインに共有結合され、かつマスキングペプチドに共有結合される酵素的に切断可能なリンカーを指す。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、組換え発現される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、例えば、複合体化学を使用して、リンカーに結合された官能性（反応性）基をマスキングペプチドと反応させることによって形成されるリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、例えば、複合体化学を使用して、リンカーに結合された官能性（反応性）基をＣＴＬＡ４結合ドメインと反応させることによって形成されるリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、マスキングペプチドをＣＴＬＡ４結合ドメインのＮ末端（例えば、軽鎖のＮ末端）に結合する。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、マスキングペプチドをＣＴＬＡ４結合ドメインのＣ末端（例えば、軽鎖のＣ末端）に結合する。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、核酸がリンカーおよびマスキングペプチドをコードする時などにマスキングペプチドと融合され、リンカーおよびマスキングペプチドをコードするアミノ酸配列として細胞から発現される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、核酸がリンカーおよびＣＴＬＡ４結合ドメインをコードする時などにＣＴＬＡ４結合ドメインと融合され、リンカーおよびＣＴＬＡ４結合ドメインをコードするアミノ酸配列として細胞から発現される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、マスキングペプチドをＣＴＬＡ４結合ドメインのＮ末端（例えば、軽鎖のＮ末端）に結合する。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、マスキングペプチドをＣＴＬＡ４結合ドメインのＣ末端（例えば、軽鎖のＣ末端）に結合する。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、１つ以上のグリシン残基、セリン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、および／またはプロリン残基を含む可撓性リンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、切断可能なペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結したスペーサーリンカーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、１つ以上のグリシン残基、セリン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、および／またはプロリン残基を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、スペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカーを含む。したがって、いくつかの実施形態では、マスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、切断可能なペプチドのＮ末端に連結されたスペーサーリンカー（例えば、第１のスペーサーリンカー、またはスペーサーリンカー１）と、切断可能なペプチドのＣ末端に連結されたスペーサーリンカー（例えば、第２のスペーサーリンカー、またはスペーサーリンカー２）とを含む切断可能なペプチドを含むリンカーを含み、各スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーのＣ末端は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または軽鎖可変ドメインに連結され、切断可能なペプチドを含むリンカーのＮ末端は、マスキングペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーのＣ末端は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の重鎖または重鎖可変ドメインに連結され、切断可能なペプチドを含むリンカーのＮ末端は、マスキングペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーのＮ末端は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の軽鎖または軽鎖可変ドメインに連結され、切断可能なペプチドを含むリンカーのＣ末端は、マスキングペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーのＮ末端は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の重鎖または重鎖可変ドメインに連結され、切断可能なペプチドを含むリンカーのＣ末端は、マスキングペプチドに連結される。
いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能なペプチドのＮ末端に直接連結され、配列番号８９～１００から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能なペプチドのＣ末端に直接連結され、配列番号１０１～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスキングペプチドは、スペーサーリンカーのＮ末端に直接連結される。したがって、いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）スペーサーリンカー（例えば、配列番号８９～１１２および４１５～４２０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー）、２）本明細書に記載されるものなどの切断可能なペプチド（例えば、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド）、および３）スペーサーリンカー（例えば、配列番号８９～１１２および４１５～４２０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、ならびに３）配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４２０のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号５０のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号９６のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号８６のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１５のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号８６のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１６のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号４７のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号５７のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号４８のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１７のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号７２のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１８のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号５１のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）配列番号４１９のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー、２）配列番号５４のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド、および３）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、配列番号４５４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含むリンカーは、配列番号４５５のアミノ酸配列を含む。
リンカーは、当該技術分野で周知の様々な方法によって、マスキングペプチドおよび／またはＣＴＬＡ４結合タンパク質と複合体化され得る。「複合体」および「複合体化学」という用語は、比較的軽度の条件下で進行する既知の反応性基との反応を指す。これらには、求核置換（例えば、アミンおよびアルコールの、ハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子多重結合（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）への付加が含まれるが、これらに限定されない。これらの反応および他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、およびＦｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２で議論されている。
本明細書の複合体化学に使用される有用な反応性官能性基には、例えば、（ａ）これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、および芳香族エステルを含むカルボキシル基およびその様々な誘導体、（ｂ）エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得るヒドロキシル基、（ｃ）ハロアルキル基であって、ハロゲン化物が後に、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基で置き換えられ得、それによりハロゲン原子の部位における新しい基の共有結合をもたらす、ハロアルキル基、（ｄ）例えば、マレイミド基などの、ディールス・アルダー反応に関与することができるジエノフィル基、（ｅ）グリニャール付加またはアルキルリチウム付加などの機構を介して、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、またはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介してその後の誘導体化が可能になるようなアルデヒド基またはケトン基、（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成する、アミンとのその後の反応のためのスルホニルハロゲン基、（ｇ）ジスルフィドに変換することができ、ハロゲン化アシルと反応することができ、または金などの金属に結合され得る、チオール基、（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化され得る、アミン基またはスルフヒドリル基、（ｉ）例えば、環状付加、アシル化、マイケル追加などの経ることができる、アルケン、（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応し得る、エポキシド、（ｋ）核酸合成に有用なホスホロアミダイトおよび他の標準的な官能性基、（ｉ）金属酸化ケイ素結合、ならびに（ｌ）例えば、リン酸ジエステル結合を形成する反応性リン基（例えば、ホスフィン）への金属結合が含まれる。
反応性官能性基は、本明細書に記載される組成物の化学的安定性に関与しないか、または干渉しないように選択することができる。あるいは、反応性官能性基は、保護基の存在によって架橋反応に関与することから保護され得る。
いくつかの実施形態では、リンカーは、当該技術分野で周知の様々な方法によって、マスキングペプチドおよび／またはＣＴＬＡ４結合タンパク質に融合されるように操作され得る。例えば、核酸は、宿主細胞から組換え発現されたときに融合タンパク質を生成するために、マスキングペプチドおよび／またはＣＴＬＡ４結合タンパク質を含むリンカーをコードするように操作され得る。
切断可能なペプチド
本明細書に提供されるマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカー内に含まれる。本明細書に提供される切断可能なペプチドを含むリンカーは、切断可能なペプチド内にプロテアーゼ切断部位を含み得る。本明細書で使用される場合、「切断部位」は、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４結合タンパク質中に見出されるリンカー（例えば、上述の切断可能なペプチドを含むリンカー）の一部の切断のための認識可能な部位を指す。したがって、切断部位は、その実施形態を含む、本明細書に記載される切断可能なペプチドの配列に見出され得る。いくつかの実施形態では、切断部位は、切断剤によって認識され、切断されるアミノ酸配列である。例示的な切断剤としては、タンパク質、酵素、ＤＮＡザイム、ＲＮＡザイム、金属、酸、および塩基が挙げられる。切断可能なペプチドは、プロテアーゼ切断部位を含む任意のペプチドであり得る。例示的な切断可能なペプチドを表１に示す。
（表１）代表的な切断可能なペプチド
Figure 2022516503000005
したがって、いくつかの実施形態では、切断可能ペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、腫瘍関連プロテアーゼ切断部位である。本明細書に提供される「腫瘍関連プロテアーゼ切断部位」は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列であり、その発現は、腫瘍細胞またはその腫瘍細胞環境に対して特異的である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって認識される切断部位である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって認識される切断部位である。
実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位、ジインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン含有（ＡＤＡＭ）メタロプロテアーゼ切断部位、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロテアーゼ切断部位、ウロキナーゼ型プラズミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）プロテアーゼ切断部位、膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ－ＳＰ１）プロテアーゼ切断部位、マトリプターゼプロテアーゼ切断部位（ＳＴ１４）、またはレグマインプロテアーゼ切断部位である。実施形態では、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位は、ＭＭＰ９切断部位、ＭＭＰ１３切断部位、またはＭＭＰ２切断部位である。実施形態では、ジインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン含有（ＡＤＡＭ）メタロプロテアーゼ切断部位は、ＡＤＡＭ９メタロプロテアーゼ切断部位、ＡＤＡＭ１０メタロプロテアーゼ切断部位、またはＡＤＡＭ１７メタロプロテアーゼ切断部位である。プロテアーゼ切断部位は、特定のアミノ酸配列によって指定されてもよい。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される。
実施形態では、切断可能なペプチドは、５ｍｅｒ（すなわち、５アミノ酸長のペプチド）、６ｍｅｒ（すなわち、６アミノ酸長のペプチド）、７ｍｅｒ（すなわち、７アミノ酸長のペプチド）、８ｍｅｒ（すなわち、８アミノ酸長のペプチド）、９ｍｅｒ（すなわち、９アミノ酸長のペプチド）、１０ｍｅｒ（すなわち、１０アミノ酸長のペプチド）、１１ｍｅｒ（すなわち、１１アミノ酸長のペプチド）、１２ｍｅｒ（すなわち、１２アミノ酸長のペプチド）、または１３ｍｅｒ（すなわち、１３アミノ酸長のペプチド）である。
したがって、いくつかの実施形態では、マスキングペプチドと切断可能なペプチドを含むリンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１）マスキングペプチド（例えば、配列番号１～４６のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチド）、２）スペーサーリンカー（例えば、配列番号８９～１１２および４１５～４２０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー）、３）本明細書に記載されるものなどの切断可能なペプチド（例えば、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチド）、および４）スペーサーリンカー（例えば、配列番号８９～１１２および４１５～４２０のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが３０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが４０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000006
である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、スペーサーリンカー、および切断可能なペプチドを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号１１３～２３１から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、スペーサーリンカー、および切断可能なペプチドを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号１１３～１９３から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、スペーサーリンカー、および切断可能なペプチドを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号１９４～２０６から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、スペーサーリンカー、および切断可能なペプチドを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号２０７～２３１から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカーを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号１１３～２３１、４４４、４４６～４４８、および４５０～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカーを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号１１３～２３１、４４４、４４６～４４８、および４５０～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカーを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号４４４、４４６～４４８、および４５０～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、マスキングペプチド、第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカーを含むペプチドを含み、ペプチドは、配列番号４４４、４４６～４４８、および４５０～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
例示的なマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質
上述のある特定の特徴を含むマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質のある特定の例示的な実施形態を以下に記載する。これらの実施形態は、単に例示的であり、限定するものであると解釈されるべきではない。
いくつかの実施形態では、ａ）抗体またはその抗原結合断片が第１の鎖および第２の鎖を含む、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびｂ）マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖または第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含む、マスクされた抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000007
である。
いくつかの実施形態では、ａ）抗体またはその抗原結合断片が第１の鎖および第２の鎖を含む、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびｂ）マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖および第２の鎖のアミノ末端に連結される、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含む、マスクされた抗体もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000008
である。
いくつかの実施形態では、ａ）抗体またはその抗原結合断片が第１の鎖および第２の鎖を含む、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびｂ）マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖および第２の鎖のカルボキシ末端に連結される、配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含む、マスクされた抗体が本明細書にさらに提供される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は軽鎖であり、第２の鎖は重鎖である。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000009
である。
いくつかの実施形態では、ａ）ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する抗体またはその抗原結合断片、およびｂ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含むマスキングペプチドが本明細書にさらに提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体の第１の鎖のＣ末端またはＮ末端に連結され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体の第２の鎖のＣ末端またはＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される任意の抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ａ）抗体の第１の鎖は軽鎖であり、抗体の第２の鎖は軽鎖であり、ｂ）抗体の第１の鎖は重鎖であり、抗体の第２の鎖は重鎖であり、またはｃ）抗体の第１の鎖は軽鎖であり、抗体の第２の鎖は重鎖である。したがって、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、２つの軽鎖の各々のＣ末端および／またはＮ末端、ならびに２つの重鎖の各々のＣ末端および／またはＮ末端上にマスキングペプチドを含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000010
である。
いくつかの実施形態では、ａ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域とを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ｂ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチド、ならびにｃ）配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000011
である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドに連結され、切断可能なペプチドは、軽鎖可変領域または重鎖可変領域に連結される。いくつかの実施形態では、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、マスキングペプチドを切断可能なペプチドに連結する配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーをさらに含み、切断可能なペプチドを軽鎖可変領域または重鎖可変領域に連結する配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサーリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドを切断可能なペプチドに連結するスペーサーリンカーは、配列番号４２０のアミノ酸配列を含み、切断可能なペプチドを軽鎖可変領域または重鎖可変領域に連結するスペーサーリンカーは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドを切断可能なペプチドに連結するスペーサーリンカーは、配列番号９６のアミノ酸配列を含み、切断可能なペプチドを軽鎖可変領域または重鎖可変領域に連結するスペーサーリンカーは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一態様では、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
一態様では、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。また別のさらなる態様では、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３６６もしくは３８０～３９７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号２３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２３または３２４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２３または３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２１または３２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３２１または３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ａ）マスキングペプチド、切断可能なペプチドを含むリンカー、および軽鎖を含むアミノ酸配列、ならびにｂ）重鎖を含むアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、マスキングペプチド、切断可能なペプチドを含むリンカー、および軽鎖を含むアミノ酸配列は、配列番号３５８、４２２、４２４～４２６、および４２８～４３１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、重鎖を含むアミノ酸配列は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキングペプチド、切断可能なペプチドを含むリンカー、および軽鎖を含むアミノ酸配列は、配列番号３５８、４２２、４２４～４２６、および４２８～４３１からなる群から選択され、重鎖を含むアミノ酸配列は、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２２のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２２のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号３５８のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３５８のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２３のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２３のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２４のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２４のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２５のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２５のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２６のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２７のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２７のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２８のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２８のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４２９のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４２９のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４３０のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４３０のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４３１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４２１のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の相同性を有するかまたは約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４３１のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む。
免疫グロブリンには５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、それぞれ、指定された、α、δ、ε、γ、およびμの重鎖を有する。γおよびαのクラスは、サブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７）に存在してもよく、そのいずれも本明細書の実施形態のうちのいくつかでの使用に好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚ、またはその組み合わせの文字によって指定されるものである。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号２３５または２３６のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載されるプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断時にＣＴＬＡ４を結合する。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である。
本発明の一態様では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある特定の実施形態では、かかるベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の別の態様では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体、または本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＴＬＡ４が、本明細書に列挙されるものなどの役割を果たす腫瘍性疾患の治療のための薬学的製剤である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合することができる二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、結合特異性のうちの一方は、ＣＴＬＡ４に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、ｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖、ならびにｃ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含むマスクされた二重特異性抗体が本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の対の軽鎖および／または重鎖のアミノ末端に連結される。いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖、ｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖、ならびにｃ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドを含むマスクされた二重特異性抗体が本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の対の軽鎖および／または重鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＴＬＡ４とは異なる抗原である。いくつかの実施形態では、第１の対または第２の対の軽鎖は、本明細書に記載される任意の軽鎖である。いくつかの実施形態では、第１の対または第２の対の重鎖は、本明細書に記載される任意の軽鎖である。いくつかの実施形態では、第１の対の軽鎖は、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第１の対の重鎖は、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、第２の対の軽鎖は、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、第２の対の重鎖は、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＴＬＡ４の異なるエピトープに対するものである。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000012
である。
マスクされた二重特異性抗体で使用するための本明細書で企図される二重特異性抗体には、マウス二重特異性抗体、ヒト化二重特異性抗体、キメラ二重特異性抗体、およびヒト二重特異性抗体が含まれる。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸置換を含むＩｇＧ１アイソタイプを有するか、または本明細書に記載されるエフェクター機能を強化するＦｃグリカンをフコシル化する低減された能力を有さない細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマスクされた二重特異性抗体は、配列番号２３５または２３６のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマスクされた二重特異性抗体は、配列番号３２６のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマスクされた二重特異性抗体は、配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖定常ドメインを含む。
一態様では、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。
一態様では、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。また別のさらなる態様では、配列番号３２７、３３４、もしくは３４２～３６５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、かつ／または配列番号３６６もしくは３８０～３９７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、配列番号２３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２３または３２４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、配列番号３２３または３２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３２１または３２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で発生する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、配列番号３２１または３２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に結合することができるキメラ受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））である。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に対する抗体ベースの特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞活性を呈するキメラタンパク質を生成する分子である。一実施形態では、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合された、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作されたキメラ受容体が本明細書に提供される。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、本明細書に記載されるものなどのマスキングペプチドに連結されるように操作される。本明細書に提供される活性化可能なマスクされたキメラ受容体は、Ｔ細胞中で発現された場合、切断可能なペプチドを認識するプロテアーゼによる切断時に抗原結合特異性に基づいて抗原認識をリダイレクトすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、共刺激分子およびゼータ鎖のうちの１つ以上からの細胞内ドメインと融合することが好ましい。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、およびそれらの任意の組み合わせの群から選択される１つ以上の細胞内ドメインと融合される。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメイン、ｂ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチド、ｃ）膜貫通ドメイン、ならびにｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、マスクされたキメラ受容体が本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、リガンド結合ドメインの第１の鎖および／または第２の鎖のアミノ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。本明細書に記載される活性化可能なマスクされたキメラ受容体の実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、ａ）ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメイン、ｂ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチド、ｃ）膜貫通ドメイン、ならびにｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、マスクされたキメラ受容体が本明細書に提供され、マスキングペプチドは、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、リガンド結合ドメインの第１の鎖および／または第２の鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、軽鎖可変ドメインであり、第２の鎖は、重鎖可変ドメインである。本明細書に記載される活性化可能なマスクされたキメラ受容体の実施形態のうちのいくつかでは、第１の鎖は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の鎖は、配列番号３２１もしくは３２２から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖は、配列番号３２３もしくは３２４から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される活性化可能なマスクされたキメラ受容体の実施形態のうちのいくつかでは、切断可能なペプチドは、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、切断可能ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、スペーサーリンカーは、配列番号８９～１１２および４１５～４２０から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸であるが２０、３０、４０、または５０以下のアミノ酸は、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、検出可能なタグである。いくつかの実施形態では、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結された少なくとも１つのアミノ酸は、
Figure 2022516503000013
である。
１．結合親和性
抗体と抗体が特異的である抗原との間のものなど、免疫学的結合相互作用の強度、または親和性は、相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）に関して表すことができ、ＫＤが小さいほどより高い親和性を表す。タンパク質の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化することができる。例えば、１つの方法は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを含み、この速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。「オンレート定数」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの速度は、親和性に関連しないすべてのパラメータの削除を可能にし、平衡解離定数ＫＤと等しい。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９－４７３，（１９９０）を参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、切断可能なペプチドを含まない親抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質と比較して、プロテアーゼとの切断時にほぼ同じまたはより高い親和性でＣＴＬＡ４に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約５０ｐＭ～約５ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）で標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）に結合する。結合親和性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、本明細書の実施例３Ａおよび実施例３Ｂに記載されるアッセイなどである。
いくつかの態様では、所望の閉塞比を呈する、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）が提供される。本明細書で使用される場合、「閉塞比」という用語は、（ａ）第１の条件セットの下でのパラメータの最大検出レベルと、（ｂ）第２の条件セットの下でのそのパラメータの最小検出値との比を指す。例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の文脈において、閉塞比は、（ａ）活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の切断可能なペプチドを切断することができる少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片に結合する標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）の最大検出レベルと、（ｂ）プロテアーゼの不在下で、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片に結合する標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）の最小検出レベルとの比を指す。活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の閉塞比は、プロテアーゼによる切断前の、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の解離定数と、プロテアーゼによる切断後の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の解離定数との比として計算することができる。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片のより大きな閉塞比は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片によって結合された標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）が、プロテアーゼの不在下よりも、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の切断可能なペプチドを切断することができるプロテアーゼの存在下で、より大きな程度に生じる（例えば、主に生じる）ことを示す。いくつかの実施形態では、最適な閉塞比を有する活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の最適な閉塞比は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が、本明細書に企図される方法または組成物に有用な望ましい特性を有することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、約２０対約１０，０００、例えば、約８０対約１００の最適な閉塞比を呈する。さらなる実施形態では、閉塞比は、約２０対約７，５００、約２０対約５，０００、約２０対約２，５００、約２０対約２，０００、約２０対約１，０００、約２０対約９００、約２０対約８００、約２０対約７００、約２０対約６００、約２０対約５００、約２０対約４００、約２０対約３００、約２０対約２００、約２０対約１００、約２０対約５０、約３０対約１００、約４０対約１００、約５０対約１００、約６０対約１００、約７０対約１００、約８０対約１００、または約１００対約１，０００である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、約８０対約１００の最適な閉塞比を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、約２０対約１，０００の最適な閉塞比を呈する。切断前および／またはプロテアーゼによる切断後の、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）への結合は、ＥＬＩＳＡなど当該技術分野で周知の技術を使用して決定することができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるマスキングペプチドは、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質と標的タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４タンパク質）との間の親和性よりも低い親和性で、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供されるマスキングペプチドは、≦１ｍＭ、≦１μＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－５Ｍ以下、例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－５Ｍ～１０－７Ｍ）の平衡解離定数（ＫＤ）で、抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマスキングペプチドは、約５０ｎＭ～約５０μＭの平衡解離定数（ＫＤ）で抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）に結合する。マスキングペプチドと抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）との間の結合親和性を評価するための例示的なアッセイは、本明細書の実施例２に見出され得る。
２．生物学的活性アッセイ
いくつかの態様では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、インビボでのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍体積を低減させる。腫瘍体積の低減を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、例えば、本明細書の実施例４Ａおよび実施例４Ｂに記載されるアッセイなどである。
ＩＩＩ．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の調製
本明細書に記載されるマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、当該技術分野で利用可能な技術を使用して調製され、その例示的な方法は、以下のセクションにより詳細に記載される。
１．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：抗体断片
本発明は、マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質として抗体断片を包含する。マスクされた抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によって、または組換え技術によって生成され得る。ある特定の状況では、全抗体よりもマスクされた抗体断片を使用する利点がある。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４を参照されたい。
抗体断片の生成のために様々な技術が開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接的に生成され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細胞型で発現され、それから分泌されてもよく、したがって、大量のこれらのマスクされた断片の容易な生成を可能にする。あるいは、マスクされたＦａｂ’－ＳＨ断片は、培養培地から直接回収され、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的に結合され得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによると、マスクされたＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。ＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期の増加を伴うマスクされたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。マスクされた抗体断片の生成のための他の技術は、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、マスクされた抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、および第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、したがって、それらは、インビボでの使用中に低減された非特異的結合に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。また、ポリペプチドリンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖを含む二重ｓｃＦｖを、二重特異性抗体として使用することができる。あるいは、３つ以上のｓｃＦｖを含むマルチｓｃＦｖを、多重特異性抗体として使用してもよい。
本発明は、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような）、または適切なリンカーを介して連結された抗体の重鎖配列および軽鎖配列を含む一本鎖免疫グロブリンを含む。かかる線形抗体または免疫グロブリンは、単一特異性または二重特異性であってもよい。かかる一本鎖免疫グロブリンは、二量体化されて、それにより元々四量体である抗体のものと類似の構造および活性を維持することができる。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、かつ軽鎖の配列を有さない抗体であってもよい。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはナノボディと呼ばれる、かかる抗体。これらの抗体はまた、本発明による抗体の機能性断片の意味に包含される。
２．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：ヒト化抗体
本発明は、マスクされたヒト化抗体を包含する。ヒト化抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従ってマスクされる。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる「輸入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に超可変領域の配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）の後に本質的に行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、より実質的に少ないインタクトなヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
３．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：ヒト抗体
本発明のヒト抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を、既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＣＴＬＡ４抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。ヒト抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従ってマスクされる。
４．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性のうちの一方は、ＣＴＬＡ４に対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、ＣＴＬＡ４を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。二重特異性抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従ってマスクされる。
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２０（７）：８３８－８４７を参照されたい。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体内の抗体の一方は、アビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。ヘテロ複合体抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、いくつかの架橋技術とともに、当該技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
５．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、本明細書に提供されるガイダンスに従ってマスクされる。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む単一ポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１を参照されたい）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部からなる。
６．マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質：抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされた抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、マスクされた抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行い、最終構築物を得ることができるが、ただし、最終構築物は、所望の特徴を保有していることを条件とする。アミノ酸変化は、配列が作製されたときに対象の抗体アミノ酸配列に導入されてもよい。
変異誘発に好ましい位置である抗体のある特定の残基または領域を特定する有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基または群が識別され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、または置換部位のために、さらなるまたは他のバリアントを導入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は、予め決められているが、変異自体の性質は予め決められる必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域においてＡｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が実施され、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、１残基から数百以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を含み、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントには、酵素またはポリペプチドに対する、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれ、それにより抗体の血清半減期が延長される。
いくつかの実施形態では、薬物動態を改善するＦｃＲｎ変異には、これらに限定されないが、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１１、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｖ３０８Ｐが含まれる。いくつかの実施形態では、かかる変異は、低いｐＨでＦｃＲｎへの抗体結合を強化するが、中性ｐＨでは抗体親和性を変化させない。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少するように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、これらトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的にグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型のグリコシル化とは、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリシンもまた使用されてもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位の）のうちの１つ以上が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより好都合に達成される。改変はまた、元の抗体の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位の）に対して、１つ以上のセリン残基またはスレオニン残基の付加、欠失、または置換により行われてもよい。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合された炭水化物は改変され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に結合されたフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）もまた参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合された炭水化物中のバイセクティングＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、および米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．で参照されている。抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ１９９７／３００８７、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．に報告されている。また、そのＦｃ領域に結合された改変炭水化物を有する抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）もまた参照されたい。修飾グリコシル化を有する抗原結合分子に関するＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）もまた参照されたい。
ある特定の実施形態では、グリコシル化バリアントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合された炭水化物構造は、フコースを欠くか、または低減されたフコースを有する。そのようなバリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意に、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する、その中に１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、および／または３３４での置換（残基のＥＵナンバリング）をさらに含む。「アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」抗体、「脱フコシル化」抗体、または「フコース欠損」抗体に関連する刊行物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を生成する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、およびアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））などのノックアウト細胞株、およびβ１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）とゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）とを過剰発現する細胞が挙げられる。
本明細書の実施形態のうちのいずれかでは、マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するために操作され得る。いくつかの実施形態では、マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で生成されてもよい。いくつかのさらなる実施形態では、マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で生成されてもよい。さらなる実施形態では、細胞株は、さらに、ゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、マスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
一実施形態では、マスクされた抗体は、その血清半減期を改善するために改変される。抗体の血清半減期を増加させるために、１つは、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、抗体（特に抗体断片）にＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープを組み込み得る。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加する要因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，８３４，５９７号）。
バリアントの別のタイプは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異なる残基により置き換えられた抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発についての目的の部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで、表２に示されている。そのような置換により生物活性に望ましい変化が生じる場合、より大きな置換変化は、表２において「例示的な置換」で表示され、またはアミノ酸のクラスに関して以下に詳述されるように、そうした置換変化が導入され、生成物はスクリーニングされ得る。
（表２）
Figure 2022516503000014
抗体の生物学的特性における置換修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の例えばシート立体構造またはヘリカル立体構造としての構造、（ｂ）標的部位の分子の荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の体積、の維持に対する効果において、大きく異なる置換を選択することにより実現される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））。
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然発生型残基は、以下の一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分けられ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴う。かかる置換残基はまた、保存的置換部位、または残りの（非保存的）部位に導入されてもよい。
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。概して、さらなる開発のために選択された得られたバリアント（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して、修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。かかる置換バリアントを生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７部位）を変異させて、各部位ですべての可能なアミノ酸置換を生成する。したがって、生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物）の少なくとも一部への融合として、繊維状ファージ粒子からディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイバリアントを、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための超可変領域部位候補を特定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行い、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を特定することができる。あるいは、または追加的に、抗体と抗原の間の接触点を特定するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接残基は、本明細書に詳述されるものを含む、当該技術分野で既知の技術による置換の候補である。かかるバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の技術を使用してスクリーニングされ、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。
マスクされた抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、これらに限定されないが、天然源からの単離（天然発生型アミノ酸配列バリアントの場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位指向型）変異誘発による調製、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製された抗体のバリアントもしくは非バリアントバージョンのカセット変異誘発が含まれる。
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合断片、または活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体）は、強化されたエフェクター機能を有するＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、アフコシル化される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、マンノース部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、バイセクティンググリカン部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、マンノース部分の増加されたレベルを有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体もしくはその抗原結合性断片、または活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８Ｄを有するかもしくは有さないＫ２９０Ｓ、またはＳ２９８Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＫ３２６Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる。
この説明および当該技術分野の教示によれば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ｆｃ領域において、野生型の対応する抗体と比較して、１つ以上の改変を含み得ることが企図される。しかしながら、これらの抗体は、その野生型の対応するものと比較して、治療的有用性のために必要とされる実質的に同じ特徴を保持するであろう。例えば、ある特定の改変は、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善されたまたは減少されたのいずれか）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすであろうＦｃ領域において行われ得る。Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、およびＦｃ領域バリアントの他の例についてのＷＯ９４／２９３５１もまた参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲへの結合が改善されたまたは減少した抗体バリアントを説明する。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）もまた参照されたい。増加された半減期と、母体のＩｇＧの胎児への移入の要因となる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する、その中の１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合能が増加または減少したポリペプチドバリアントは、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）もまた参照されたい。
７．マスクされた抗体－薬物複合体
本発明はまた、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体などの１つ以上の細胞傷害性薬剤と複合体化された、本明細書に提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を含むマスクされた抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）も提供する。
一実施形態では、抗体－薬物複合体に複合体化される１つ以上の薬物には、これらに限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照されたい）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのアウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号を参照されたい）；ドラスタチン；カリチアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、および第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、およびＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、および米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；およびＣＣ１０６５が含まれる。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体に複合体化される１つ以上の薬物は、これらに限定されないが、チューブリン重合の阻害剤（例えば、メイタンシノイドおよびアウリスタチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアミシン、デュオカルマイシン、およびインドリノベンゾジアゼピン二量体）、およびＤＮＡ合成阻害剤（例えば、エキサテカン誘導体Ｄｘｄ）が含まれる。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体は、酵素的に活性な毒素またはその断片に複合体化された本明細書に記載される抗体を含み、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ジェロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。
別の実施形態では、抗体－薬物複合体は、放射性原子に複合体化された本明細書に記載される抗体を含み、放射性複合体を形成する。放射性複合体の生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体が検出に使用される場合、放射性複合体は、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３などのシンチグラフィー研究用の放射性原子、または再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）用のスピン標識を含み得る。
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）および細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミジン酸塩ＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、およびビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に複合体化するための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書のＡＤＣは、これらに限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ）から）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、およびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む、架橋試薬で調製されたかかる複合体を明確に企図する。
８．ベクター、宿主細胞、および組換え法
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の組換え生成については、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために、それをコードする核酸を単離し、複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用することにより（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、シーケンシングされる。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。概して、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞（概して哺乳動物）起源のいずれかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域をこの目的に使用することができること、ならびにかかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されよう。
９．原核宿主細胞を使用した結合タンパク質の生成
ａ）ベクター構築
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体生成細胞から単離され、配列決定されてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器またはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。得られると、ポリペプチドをコードする配列は、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入される。当該技術分野で利用可能かつ既知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、およびベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）、およびそれが常駐する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な構成要素を含む。ベクター構成要素には、概して、これらに限定されないが、複製の起源、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、および転写終結配列が含まれる。
概して、レプリコンを含むプラスミドベクターおよび宿主細胞と適合する種に由来する対照配列は、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を担持する。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌の種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、遺伝子コードアンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性を含み、したがって形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージもまた、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含み得るか、または含むように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４８，２３７号に記載されている。
さらに、レプリコンを含むファージベクターおよび宿主微生物と適合する制御配列を、これらの宿主と関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えベクターを作製する際に、λＧＥＭ．ＴＭ．－１１などのバクテリオファージが利用されてもよい。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成要素の各々をコードする２つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導性および恒常性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してプロモーターをソースＤＮＡから除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに動作可能に連結することができる。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅および／または発現を配向することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、それらが、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写量およびより高い収率を一般的に許容するため、利用される。
原核宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能する他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーターなど）も同様に好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それによって、当業者が、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖および重鎖をコードするシストロンに動作可能にライゲーションすることが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたって発現ポリペプチドの転座を配向する分泌シグナル配列構成要素を含む。概して、シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに対して天然のシグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、およびＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのバリアントである。
別の態様では、本発明による免疫グロブリンの生成は、宿主細胞の細胞質内で発生し得るため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点において、免疫グロブリン軽鎖および重鎖は、マスキングペプチド、リンカー配列などの配列ありまたはなしで発現され、フォールディングされ、アセンブリされて、細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切なフォールディングおよびアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、本発明の分泌および適切にアセンブリされた抗体の収率を最大化するために、発現ポリペプチド構成要素の定量的比を調節することができる発現系を使用することによって生成することができる。かかる調節は、ポリペプチド構成要素の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を発現するのに好適な原核宿主細胞には、例えば、グラム陰性またはグラム陽性の生物などの古細菌および真正細菌が含まれる。有用な細菌の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種（例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、またはパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、大腸菌細胞は、本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例としては、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）、およびその誘導体が挙げられる。大腸菌 ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、および大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）などの他の株およびその誘導体もまた好適である。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体を構築するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、大腸菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、細胞培養に組み込まれ得ることが望ましい。
ｂ）結合タンパク質生成
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体統合体によってのいずれかで複製可能となるように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準的な技術を使用して行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、電気穿孔法である。
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を生成するために使用される原核細胞は、当該技術分野で既知の培地中で増殖され、選択された宿主細胞の培養に好適である。好適な培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に加えて、必要な栄養補助剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許容する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンが培地に添加される。
炭素、窒素、および無機リン酸源以外の任意の必要な補助剤もまた、単独で、または別の補助剤もしくは複合窒素源などの培地との混合物として、適切な濃度で導入されてもよい。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタアミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、およびジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含み得る。
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。ある特定の実施形態では、大腸菌の増殖については、増殖温度は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃、または約３０℃の範囲である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５～約９の範囲の任意のｐＨであってもよい。ある特定の実施形態では、大腸菌については、ｐＨは約６．８～約７．４、または約７．０である。
誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。ある特定の実施形態では、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照されたい）。当該技術分野で既知であるように、用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導剤が使用されてもよい。
一実施形態では、本発明の発現された活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、宿主細胞の周辺質に分泌され、宿主細胞の周辺質から回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などのかかる手段によって微生物を破壊することを伴う。細胞が破壊されると、細胞片または細胞全体が、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞を培養物から除去され得、培養上清は、生成されたタンパク質のさらなる精製のために濾過され、濃縮される。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロットアッセイなどの一般的に既知である方法を使用して、さらに単離および特定することができる。
本発明の一態様では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質生成は、発酵プロセスによって大量に実施される。組換えタンパク質の生成には、様々な大規模な流加発酵手順が利用可能である。大規模な発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を有し、ある特定の実施形態では、約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵剤は、酸素および栄養素、特にグルコースを分配するために撹拌器インペラーを使用する。小規模の発酵とは、一般的に、体積容量が約１００リットル以下であり、かつ約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る発酵機での発酵を指す。
発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で、所望の密度、約１８０～２２０のＯＤ５５０へと成長した後に開始され、その段階では細胞は、初期静止期である。様々な誘導剤が、当該技術分野で既知であり、上述されるように、用いられるベクター構築物に従って使用されてもよい。細胞は、誘導の前により短い期間にわたって成長し得る。細胞は通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間が使用されてもよい。
本発明のポリペプチドの生成収率および品質を改善するために、様々な発酵条件を修飾することができる。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、および／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（カペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス－イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で生成される異種タンパク質の適切なフォールディングおよび溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。
発現された異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のタンパク質）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠損したある特定の宿主株を本発明に使用することができる。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、およびそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内の遺伝的変異（複数可）に影響するように修飾され得る。いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株は、例えば、上記のＪｏｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素を欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株は、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
ｃ）結合タンパク質精製
一実施形態では、本明細書の生成されるマスクされた抗体タンパク質は、さらなるアッセイおよび使用のために、実質的に均質な調製物を得るためにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は、好適な精製手順の例である：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過。
一態様では、固相上に固定されたプロテインＡは、本発明の抗体生成物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質であり、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３。プロテインＡが固定される固相は、ガラスもしくはシリカ表面、または制御された細孔ガラスカラムもしくはケイ酸カラムを含むカラムであり得る。いくつかの用途では、カラムは、グリセロールなどの試薬でコーティングされ、汚染物質の非特異的な付着を防止する可能性がある。
精製の第１のステップとして、上述の細胞培養に由来する調製物を、プロテインＡ固定化固相に適用して、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を可能にすることができる。次いで、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合された汚染物質を除去する。最後に、目的の抗体は、溶出によって固相から回収される。
１０．真核宿主細胞を使用した結合タンパク質の生成
真核宿主細胞で使用するためのベクターには、概して、以下の非限定的な構成要素：シグナル配列、複製の起源、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれる。
ａ）シグナル配列構成要素
真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくは目的のポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドを含み得る。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで、抗体をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
ｂ）複製の起源
概して、複製構成要素の起源は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起源は、典型的には、早期プロモーターを含むためにのみ使用され得る。
ｃ）選択遺伝子構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子を含んでもよく、選択マーカーとも称される。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠損を相補するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するために薬物を利用する。異種遺伝子で正常に形質転換すること成功したそれらの細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を生成し、したがって選択レジメンを生き延びる。かかる優性の選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンの薬物を使用する。
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉおよび－ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの核酸をコードする活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を取り出す能力を有する細胞の識別を可能にするものである。
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって特定される。いくつかの実施形態では、野生型ＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）である。
あるいは、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列と形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またＧ４１８などの選択可能マーカーの選択剤を含む培地中の細胞増殖によって選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）を欠損した細胞株を含むＮＳ０を含んでもよい。哺乳動物細胞用の選択マーカーとしてのＧＳの使用方法は、米国特許第５，１２２，４６４号および米国特許第５，８９１，６９３号に記載されている。
ｄ）プロモーター構成要素
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、かつ目的の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質をコードする核酸に動作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーター配列は、真核生物について既知である。例えば、ほぼすべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであってもよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある特定の実施形態では、これらの配列のうちのいずれかまたはすべては、真核生物発現ベクターに好適に挿入されてもよい。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、ファウルポックスウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーター得られるプロモーターによって制御され、かかるプロモーターが、ただし、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起源も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾については、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載している、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
ｅ）エンハンサー要素構成要素
より高い真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによってしばしば増加される。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）から既知である。しかしながら、典型的には、１つは真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起源の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、ヒトサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のエンハンサー要素について記載している、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、５’または３’の位置で抗体ポリペプチドコード配列にベクター内にスプライスされてもよいが、概して、プロモーターから５’の部位に位置する。
ｆ）転写終結構成要素
真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み得る。かかる配列は、真核またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’の非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびその中に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載されるより高い真核細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質生成のために上述の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適切な場合に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
ｈ）宿主細胞の培養
本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質を生成するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養されてもよい。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行３０，９８５に記載される培地のうちのいずれかは、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれも、必要な場合、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源で補充されてもよい。任意の他のサプリメントも、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
ｉ）結合タンパク質の精製
組換え技術を使用する場合、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、細胞内で生成され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体が第１のステップとして細胞内で生成される場合、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子状破片は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去され得る。活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質が培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、最初に、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮されてもよい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するための前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、抗生物質は、外来性汚染物質の成長を防止するために含まれてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは簡便な技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、アガロースであってもよいが、他のマトリックスが利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製に有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップ（複数可）に続いて、目的のマスクされた結合タンパク質および汚染物質を含む混合物は、例えば、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で行われる、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、さらなる精製に晒されてもよい。
概して、研究、試験、および臨床使用における使用のための抗体を調製するための様々な方法論は、上述の方法論と一致し、かつ／または特定の目的の抗体について当業者によって適切であるとみなされるように、当該技術分野で定着している。
ＩＶ．組成物
いくつかの態様では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質のうちのいずれかを含む組成物（例えば、薬学的組成物）もまた本明細書に提供される。
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって保管のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｋｌｉｎｓ，Ｐｕｂ．，Ｇｅｎｎａｒｏ Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２０００）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、ピロ亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化物質；防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；ＥＤＴＡおよび／または非イオン性界面活性剤などのキレート剤を含む。
緩衝剤を使用して、特に安定性がｐＨ依存性である場合に、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを調整することができる。緩衝剤は、約２０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。本発明とともに使用するための好適な緩衝剤は、有機酸および無機酸ならびにその塩の両方を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。さらに、緩衝剤は、トリスなどの、ヒスチジン塩およびトリメチルアミン塩からなってもよい。
防腐剤は、微生物の成長を防止するために添加することができ、典型的には、約０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内に存在する。本発明とともに使用するための好適な防腐剤には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ベンゼトニウム塩化物；チメロサール、フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾールが含まれる。
等張剤は、時には「安定剤」として知られ、組成物中の液体の等張性を調整または維持するために存在し得る。タンパク質および抗体などの大きな荷電生体分子とともに使用された場合、それらはアミノ酸側鎖の荷電群と相互作用し、それによって分子間相互作用および分子内相互作用の可能性を低減することができるため、しばしば「安定剤」と称される。等張剤は、他の成分の相対量を考慮に入れて、約０．１重量％～約２５重量％または約１～約５重量％の任意の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、等張剤としては、多価糖アルコール、三価または価数がより多い糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールが挙げられる。
追加の賦形剤には、（１）増量剤、（２）溶解性エンハンサー、（３）安定剤、および（４）ならびに容器壁への変性または付着を防止する薬剤のうちの１つ以上として作用し得る薬剤が含まれる。かかる賦形剤には、多価糖アルコール（上記に列挙）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；ならびにデキストリンまたはデキストランなどの多糖類が含まれる。
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤を可溶化させるのを助け、ならびに撹拌誘導凝集から治療用タンパク質を保護するために存在することができ、これはまた、活性治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤がせん断表面応力に曝露されることを可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌまたは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在する。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．１％ｗ／ｖ、または約０．０１％～約０．０２５％ｗ／ｖの範囲内で存在する。
好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール ４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、および６０、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオン性洗剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、およびジオクチルスルホン酸ナトリウムが含まれる。陽イオン性洗剤には、ベンザルコニウム塩化物またはベンゼトニウム塩化物が含まれる。
製剤をインビボでの投与に使用するためには、製剤は滅菌でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を介する濾過によって滅菌され得る。本明細書の治療用組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静注液バッグ、または皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、もしくは関節内経路、局所投与、吸入による、または徐放性もしくは持続放出手段による、注射または注入などの好適な様式で、単回もしくは複数回のボーラス、または長期間にわたる注入など、既知の許容された方法に従う。
本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、本明細書に記載される方法にあるのと同じように使用することができる。「と組み合わせて」という用語は、同一または別個の製剤に含まれる２つ以上の治療剤（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質および治療剤）を包含する。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、「同時」投与を指し、その場合、本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与に同時に発生する（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与（複数可）と、１つ以上の追加の治療剤の投与との間と同時または１時間以内）。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、逐次的投与を指し、その場合、本発明の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与の前および／または後に発生する（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質の投与（複数可）と、１つ以上の追加の治療剤の投与との間の１時間超）。本明細書で意図される薬剤には、これらに限定されないが、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤、免疫刺激分子を標的とする薬剤、または成長阻害剤が含まれる。
本明細書の製剤はまた、治療されている特定の適応症、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する適応症に必要な場合に、複数の活性化合物を含み得る。あるいは、または追加的に、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子もしくは刺激分子を標的とする薬剤、または成長阻害剤を含んでもよい。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて好適に存在する。
Ｖ．治療方法
本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）またはその組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における疾患を治療または予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、腫瘍性障害（例えば、癌）と診断されたか、またはかかる障害を発症するリスクがある。
疾患の予防または治療について、活性薬剤の適切な投与量は、上に定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、予防または治療目的のために薬剤が投与されるかどうか、以前の治療、対象の臨床歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医師の裁量に依存する。薬剤は、一度に、または一連の治療にわたって、対象に好適に投与される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与の間の間隔は、約１ヶ月またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、投与の間の間隔は、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、またはそれ以上である。本明細書で使用される場合、投与の間の間隔は、抗体の１つの投与と抗体の次の投与との間の期間を指す。本明細書で使用される場合、約１ヶ月の間隔は、４週間を含む。いくつかの実施形態では、投与の間の間隔は、約２週間、約３週間、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、治療は、抗体の複数回投与を含み、投与の間の間隔は、変化し得る。例えば、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月であり、その後の投与の間の間隔は、約３ヶ月である。いくつかの実施形態では、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月であり、第２の投与と第３の投与との間の間隔は、約２ヶ月であり、その後の投与の間の間隔は、約３ヶ月である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、フラット用量で投与される。疾患の種類および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体は、例えば、１つ以上の別個の投与によって、または連続注入によってにかかわらず、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が発生するまで治療が概して維持されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、用量あたり約２５ｍｇ～約５００ｍｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０．０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇもしくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇもしくは約１０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇもしくは約２０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇもしくは約３０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇもしくは約４０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ～６０ｍｇ／ｋｇもしくは約５０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ～７０ｍｇ／ｋｇもしくは約６０ｍｇ／ｋｇ～約７０ｍｇ／ｋｇ、または７０ｍｇ／ｋｇ～８０ｍｇ／ｋｇもしくは約７０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。上述の投与頻度のうちのいずれかを使用してもよい。
本明細書に企図される治療方法は、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）による、障害または疾患の治療である。本発明の製剤により治療可能な障害または疾患には、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌）、または精巣癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による癌の治療または予防の方法が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経内分泌腫瘍、癌腫および肉腫を含む、哺乳動物に見られるすべてのタイプの癌、新生物、または悪性腫瘍を指す。本明細書に提供される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な癌には、リンパ腫、肉腫、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、骨髄腫、甲状腺癌、白血病、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ、ＥＲ陽性、ＥＲ陰性、化学療法抵抗性、ハーセプチン耐性、ＨＥＲ２陽性、ドキソルビシン耐性、タモキシフェン耐性、腺管癌、小葉癌、原発性、転移性）、卵巣癌、脾臓癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞肺癌、腺癌、肺大細胞癌、小細胞肺癌、カルチノイド、肉腫）、多形性膠芽腫、神経膠腫、黒色腫、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膠芽腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭、首、または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫が含まれる。追加の例としては、甲状腺の癌、内分泌系の癌、脳の癌、乳房の癌、子宮頸部の癌、結腸の癌、頭頸部の癌、食道の癌、肝臓の癌、腎臓の癌、肺の癌、非小細胞肺癌、黒色腫、中皮腫、卵巣の癌、肉腫、胃の癌、子宮の癌、または髄芽腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、多形性膠芽腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、原発性原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱癌、前癌性皮膚病変、精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽腫、食道癌、泌尿生殖器癌、悪性高カルシウム血症、子宮内膜癌、副腎皮質癌、内分泌または外分泌脾臓の新生物、甲状腺髄様癌、甲状腺髄様癌、黒色腫、結腸直腸癌、甲状腺乳頭癌、肝細胞癌、乳頭パジェット病、葉状腫瘍、小葉癌、腺管癌、膵星細胞の癌、肝星細胞の癌、または前立腺癌が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による白血病の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「白血病」という用語は、血液形成器官の進行性の悪性疾患を広く指し、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の歪んだ増殖および発生によって一般的に特徴付けられる。白血病は一般的に、（１）疾患急性または慢性の期間および特徴、（２）関与する細胞の種類、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ性（リンパ行性）、または単球性、および（３）血液白血病または白血病（亜白血病）における異常細胞数の増加または非増加に基づいて、臨床的に分類される。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な白血病には、例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽球性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血芽球性白血病、血球芽細胞白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ）白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、または未分化細胞白血病が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による肉腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「肉腫」という用語は、一般に、胚性結合組織のような物質からなり、かつ線維状または均質な物質に埋め込まれた密接に充填された細胞から一般に構成される腫瘍を指す。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る肉腫には、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞肉腫（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛上皮腫、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血病肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性間葉腫肉腫、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、または毛細管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による黒色腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると取られる。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る黒色腫には、例えば、末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング・パッセイ黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫、爪下黒色腫、または表在拡大型黒色腫が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による癌腫の治療または予防の方法が本明細書に提供される。「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある上皮細胞からなる悪性の新しい成長を指す。本明細書に提供される化合物、薬学的組成物、または方法により治療され得る例示的な癌腫には、例えば、甲状腺髄様癌、家族性甲状腺髄様癌、腺房癌（ａｃｉｎａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺房癌（ａｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞上皮癌、肺胞上皮細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底有棘細胞癌、気管支肺胞癌、気管支癌、気管支原性癌、脳状癌腫、胆管細胞癌、絨毛癌、膠様癌、面皰癌、子宮体癌（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌、鎧状癌、皮膚の癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、円筒形癌、円筒細胞癌、導管癌、導管性癌、硬性癌、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｘ ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、膠状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子様癌（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌（ｈｙｐｅｒｎｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小児胎児性癌（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪性癌、小葉癌、リンパ上皮癌、髄様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌、燕麦細胞癌、骨化性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌（ｏｓｔｅｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌、予備細胞癌（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、ソラノイド癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錐細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ストリング癌（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張症様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、管状癌（ｔｕｂｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結節性癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌、または絨毛癌が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の投与による転移性癌の治療または予防の方法が本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、「転移」、「転移性」、および「転移性癌」という用語は、互換的に使用され、腫瘍性疾患または障害、例えば、癌の、１つの器官または別の非隣接器官または身体部分からの広がりを指す。癌は、原発性腫瘍、例えば、原発性乳癌と称される、例えば、乳房などの起源部位で発生する。原発性腫瘍または起源部位の一部の癌細胞は、局所領域の正常な組織を取り囲むように浸透し浸潤する能力、および／または系を循環するリンパ系または血管系の壁を体内の他の部位および組織に浸透する能力を獲得する。原発性腫瘍の癌細胞から形成される第２の臨床的に検出可能な腫瘍は、転移性または二次性腫瘍と称される。癌細胞が転移すると、転移性腫瘍およびその細胞は、元の腫瘍のものと類似していると推定される。したがって、肺癌が乳房に転移した場合、乳房の部位の二次性腫瘍は、異常な肺細胞からなり、異常な乳房細胞からではない。乳房の二次性腫瘍は、転移性肺癌を指す。したがって、転移性癌という語句は、対象が原発性腫瘍を有するかまたは有した、かつ１つ以上の二次性腫瘍を有する疾患を指す。非転移性癌、または転移性ではない癌を有する対象という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが、１つ以上の二次性腫瘍を有さない疾患を指す。例えば、転移性肺癌は、原発性肺腫瘍を有するか、もしくは原発性肺腫瘍の既往歴を有する、および例えば、乳房の第２の位置もしくは複数の位置において１つ以上の二次性腫瘍を有する対象における疾患を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＣＴＬＡ４結合タンパク質によって有益であり得る疾患または障害には、（全体的または部分的に）ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４の活性もしくは機能によって引き起こされる疾患（例えば、糖尿病、癌（例えば、前立腺癌、腎臓癌、転移性癌、黒色腫、去勢抵抗性前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、膠芽腫、卵巣癌、肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば、頭、首、または食道）、結腸直腸癌、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫））が含まれるか、または疾患の症状は、（全体的または部分的に）ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ４の活性もしくは機能によって引き起こされる。
ＶＩ．製造物品またはキット
別の態様では、本明細書に記載される活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）を含む製造物品またはキットが提供される。製造物品またはキットは、本発明の方法における結合タンパク質の使用のための説明書をさらに含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、製造物品またはキットは、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の有効量を個体に投与することを含む、個体において障害（例えば、癌）を治療または予防するための方法における、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）の使用のための説明書を含む。ある特定の実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌からなる群から選択される疾患を有する。
製造物品またはキットは、容器をさらに含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングルチャンバーシリンジまたはデュアルチャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は製剤を保持する。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤である。
製造物品またはキットは、容器上のまたは容器と関連付けられるラベルまたは添付文書をさらに含んでもよく、製剤の再構成および／または使用の指示を示してもよい。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体における障害（例えば、癌）を治療または予防するための、皮下、静脈内、または他の投与様式に有用であるか、または意図されていることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、単回使用バイアルまたは複数回使用バイアルであってもよく、これは再構成された製剤の反復投与を可能にする。製造物品またはキットは、好適な希釈剤を含む第２の容器をさらに含み得る。製造物品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書を含む、商業的、治療的、およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本発明は、単回用量投与ユニット用のキットを提供する。かかるキットは、単一または複数チャンバーのプレフィルドシリンジの両方を含む治療用抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なプレフィルドシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ（Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
本明細書の製造物品またはキットは、任意に、第２の医薬を含む容器をさらに含み、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４結合タンパク質（例えば、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片）は、第１の医薬であり、その物品またはキットは、有効量で、第２の医薬で対象を治療するためのラベルまたは添付文書上の説明書をさらに含む。
別の実施形態では、自動注射器での投与のための本明細書に記載される製剤を含む製造物品またはキットが本明細書に提供される。自動注射器は、起動時に、患者または投与者からの追加の必要な措置なしにその内容物を送達する、注射装置として説明され得る。これらは、送達速度が一定でなければならず、かつ送達時間が数瞬よりも長い場合、治療用製剤のセルフメディケーションに特に好適である。
例示的な実施形態
提供される例示的な実施形態のうち、以下が挙げられる。
１．ａ）抗体またはその抗原結合断片が第１の鎖および第２の鎖を含む、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片と、
ｂ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖または第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされた抗体。
２．ａ）第１の鎖が、軽鎖であり、
ｂ）第２の鎖が、重鎖である、
実施形態１のマスクされた抗体。
３．抗体またはその抗原結合断片が、２つの第１の鎖および２つの第２の鎖を含む、実施形態１または２のマスクされた抗体。
４．ａ）第１の鎖が、軽鎖可変ドメインであり、
ｂ）第２の鎖が、重鎖可変ドメインである、
実施形態１のマスクされた抗体。
５．抗原結合断片が、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２断片である、実施形態１～４のいずれか１つのマスクされた抗体。
６．マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端が、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結されている、実施形態１～５のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
７．切断可能なペプチドを含むリンカーが、
ａ）第１のスペーサーリンカーおよび切断可能なペプチド、または
ｂ）第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカー
を含む、実施形態１～６のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
８．切断可能なペプチドが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～７のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
９．ａ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に直接連結されている、または
ｂ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端に直接連結されており、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＣ末端に直接連結されている、
実施形態１～８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０．第１のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態７～９のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１１．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１２．少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸が、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結されている、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１３．少なくとも１つのアミノ酸が、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である、実施形態１２のマスクされた抗体。
１４．マスクされた抗体が、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片の第１の鎖または第２の鎖を含む、実施形態１～１３のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１５．ａ）マスクされた抗体が、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーリンカーを含み、かつ
ｂ）マスクされた抗体が、切断可能なペプチドと、ＣＴＬＡ４に結合する抗体またはその抗原結合断片との間にスペーサーリンカーを含む、
実施形態１４のマスクされた抗体。
１６．マスクされた抗体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１５のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１７．抗体またはその抗原結合断片が、マウス抗体である、実施形態１～１６のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１８．抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である、実施形態１～１６のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１９．抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、実施形態１～１８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２０．ＩｇＧ１が、以下のアミノ酸置換を含み、
ａ）Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；
ｂ）Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；
ｃ）Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；
ｄ）Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；
ｅ）Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；
ｆ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；
ｇ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；
ｈ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；
ｉ）Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；
ｊ）Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；
ｋ）Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；または
ｌ）Ｋ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＫ３２６Ｅ
アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる、実施形態１９のマスクされた抗体。
２１．抗体またはその抗原結合断片が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、
ａ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態１～２０のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２２．抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、実施形態１～２１のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２３．抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２２のマスクされた抗体。
２４．抗体またはその抗原結合断片が、
ａ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／もしくは配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または
ｂ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／もしくは配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、実施形態１～２１のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２５．抗体が、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２４のマスクされた抗体。
２６．抗体もしくはその抗原結合断片が、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含むか、または抗体もしくはその抗原結合断片が、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態２４または実施形態２５のマスクされた抗体。
２７．切断可能なペプチドが、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である、実施形態１～２６のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２８．切断可能なペプチドが、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態１～２７のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
２９．切断可能なペプチドが、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態２８のマスクされた抗体。
３０．マスクされた抗体が、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２９のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
３１．抗体またはその抗原結合断片が、薬剤と複合体化されている、実施形態１～３０のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
３２．薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、実施形態３１のマスクされた抗体。
３３．薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、実施形態３２のマスクされた抗体。
３４．ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
ｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と、
ｃ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた二重特異性抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の対の前記重鎖または前記軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされた二重特異性抗体。
３５．マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端が、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結されている、実施形態３４のマスクされた二重特異性抗体。
３６．切断可能なペプチドを含むリンカーが、
ａ）第１のスペーサーリンカーおよび切断可能なペプチド、または
ｂ）第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカー
を含む、実施形態３４または３５のマスクされた二重特異性抗体。
３７．切断可能なペプチドが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４～３６のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
３８．ａ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に直接連結されている、または
ｂ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端に直接連結されており、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＣ末端に直接連結されている、
実施形態３６または実施形態３７のマスクされた二重特異性抗体。
３９．第１のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３６～３８のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４０．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４～３９のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４１．少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸が、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結されている、実施形態３４～４０のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４２．少なくとも１つのアミノ酸が、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である、実施形態４１のマスクされた二重特異性抗体。
４３．第１の対の軽鎖または重鎖が、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）軽鎖または重鎖を含む、実施形態３４～４２のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４４．ａ）第１の対が、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーリンカーを含み、かつ
ｂ）第１の対が、切断可能なペプチドと軽鎖または重鎖との間にスペーサーリンカーを含む、
実施形態４３のマスクされた二重特異性抗体。
４５．マスクされた二重特異性抗体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４～４４のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４６．二重特異性抗体が、マウス抗体である、実施形態３４～４５のいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４７．二重特異性抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である、実施形態３４～４５のいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４８．二重特異性抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプを有する、実施形態３４～４７のいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
４９．ＩｇＧ１が、以下のアミノ酸置換を含み、
ａ）Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａ；
ｂ）Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ；
ｃ）Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅ；
ｄ）Ｐ２４７ＩおよびＡ３３９ＤまたはＡ３３９Ｑ；
ｅ）Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８ＤありまたはなしのＫ２９０Ｓ、もしくはＳ２９８Ｖ；
ｆ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、およびＹ３００Ｌ；
ｇ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、およびＰ３９６Ｌ；
ｈ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ３９６Ｌ；
ｉ）Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、およびＩ３３２Ｅ；
ｊ）Ｋ３２６ＡおよびＥ３３３Ａ；
ｋ）Ｋ３２６ＷおよびＥ３３３Ｓ；または
ｌ）Ｋ２９０ＥもしくはＫ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、および／またはＫ３２６Ｅ
アミノ酸残基が、ＫａｂａｔのようにＥＵインデックスに従って番号付けされる、実施形態４８のマスクされた二重特異性抗体。
５０．第１の対が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、
ａ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態３４～４９のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
５１．第１の対が、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／または配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、実施形態３４～５０のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
５２．第１の鎖が、配列番号２３７～３１８から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３１９もしくは３２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態５１のマスクされた二重特異性抗体。
５３．第１の対が、
ａ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／もしくは配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または
ｂ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および／もしくは配列番号３２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、実施形態３４～５０のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
５４．第１の鎖が、配列番号３２７～３４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、ならびに／または配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態５３のマスクされた二重特異性抗体。
５５．第１の対が、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含むか、または第１の対が、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態５３または５４のマスクされた二重特異性抗体。
５６．切断可能なペプチドが、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である、実施形態３４～５５のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
５７．切断可能なペプチドが、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態３４～５６のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
５８．切断可能なペプチドが、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態５７のマスクされた二重特異性抗体。
５９．マスクされた二重特異性抗体が、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４～５８のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
６０．マスクされた二重特異性抗体が、薬剤と複合体化されている、実施形態３４～５９のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
６１．薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、実施形態６０のマスクされた二重特異性抗体。
６２．薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、実施形態６０のマスクされた二重特異性抗体。
６３．ａ）ＣＴＬＡ４に結合する第１の鎖および第２の鎖を含むリガンド結合ドメインと、
ｂ）配列番号１～４６から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと、
ｃ）膜貫通ドメインと、
ｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、マスクされたキメラ受容体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の鎖または第２の鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされたキメラ受容体。
６４．ａ）第１の鎖が、軽鎖可変ドメインであり、
ｂ）第２の鎖が、重鎖可変ドメインである、
実施形態６３のマスクされたキメラ受容体。
６５．マスキングペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端が、切断可能なペプチドを含むリンカーに連結されている、実施形態６３または６４のマスクされたキメラ受容体。
６６．切断可能なペプチドを含むリンカーが、
ａ）第１のスペーサーリンカーおよび切断可能なペプチド、または
ｂ）第１のスペーサーリンカー、切断可能なペプチド、および第２のスペーサーリンカー
を含む、実施形態６３～６５のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
６７．切断可能なペプチドが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６３～６６のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
６８．ａ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に直接連結されている、または
ｂ）第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＮ末端に直接連結されており、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのＣ末端に直接連結されている、
実施形態６６または実施形態６７のマスクされたキメラ受容体。
６９．第１のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２のスペーサーリンカーが、配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６８のマスクされたキメラ受容体。
７０．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６３～６９のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７１．少なくとも１つのアミノ酸であるが２０以下のアミノ酸が、マスキングペプチドのＮ末端に直接連結されている、実施形態６３～７０のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７２．少なくとも１つのアミノ酸が、アラニン（Ａ）またはグリシン－アラニン（ＧＡ）である、実施形態７１のマスクされたキメラ受容体。
７３．リガンド結合ドメインの第１の鎖または第２の鎖が、ＮからＣ末端またはＣからＮ末端方向に、ａ）マスキングペプチド、ｂ）切断可能なペプチド、およびｃ）第１の鎖または第２の鎖を含む、実施形態６３～７２のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７４．ａ）リガンド結合ドメインが、マスキングペプチドと切断可能なペプチドとの間にスペーサーリンカーを含み、かつ
ｂ）リガンド結合ドメインが、切断可能なペプチドと軽鎖または重鎖との間にスペーサーリンカーを含む、
実施形態７３のマスクされたキメラ受容体。
７５．マスクされたキメラ受容体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態６３～７４のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７６．ａ）第１の鎖が、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖が、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）第１の鎖が、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または第２の鎖が、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）第１の鎖が、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）第１の鎖が、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態６３～７５のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７７．第１の鎖が、配列番号２３２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖が、配列番号２３３のアミノ酸配列を含む、実施形態６３～７６のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７８．ａ）第１の鎖が、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖が、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、あるいは
ｂ）第１の鎖が、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつ／または第２の鎖が、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
実施形態６３～７６のいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
７９．切断可能なペプチドが、ＣＴＬＡ４を発現する細胞または組織を含む領域内で共局在化されるプロテアーゼの基質である、実施形態６３～７８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
８０．切断可能なペプチドが、ＡＢＨＤ１２、ＡＤＡＭ１２、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＡＢＨＤ１３、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭ８、ＡＢＨＤ１７Ａ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ２０、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＢＨＤ１７Ｂ、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＡＤＡＭＴＳＬ２、ＡＤＡＭＴＳＬ３、ＡＢＨＤ１７Ｃ、ＡＤＡＭＴＳＬ５、ＡＳＴＬ、ＢＭＰ１、ＣＥＬＡ１、ＣＥＬＡ２Ａ、ＣＥＬＡ２Ｂ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＣＥＬＡ３Ｂ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ４、ＣＴＳＥ、ＣＴＳＦ、ＡＤＡＭＴＳＬ４、ＣＭＡ１、ＣＴＲＢ１、ＣＴＲＣ、ＣＴＳＯ、ＣＴＲｌ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＷ、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＥＳＰ１、ＣＴＳＧ、ＣＴＳＨ、ＧＺＭＡ、ＧＺＭＢ、ＧＺＭＨ、ＣＴＳＫ、ＧＺＭＭ、ＣＴＳＬ、ＣＴＳＳ、ＣＴＳＶ、ＣＴＳＺ、ＨＴＲＡ４、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＤＰＰ４、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫＢ１、ＥＣＥ１、ＥＣＥ２、ＥＣＥＬ１、ＭＡＳＰ２、ＭＥＰ１Ａ、ＭＥＰ１Ｂ、ＥＬＡＮＥ、ＦＡＰ、ＧＺＭＡ、ＭＭＰ１１、ＧＺＭＫ、ＨＧＦＡＣ、ＨＰＮ、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＨＴＲＡ２、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ＫＥＬ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ＫＬＫ５、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＬＧＭＮ、ＬＮＰＥＰ、ＭＡＳＰ１、ＰＡＰＰＡ、ＰＡＰＰＡ２、ＰＣＳＫ１、ＮＡＰＳＡ、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１０、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＰＲＳＳ１、ＰＲＳＳ１２、ＰＲＳＳ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＲＳＳ３、ＰＲＳＳ３３、ＰＲＳＳ４、ＰＲＳＳ５５、ＰＲＳＳ５７、ＭＭＰ１２、ＰＲＳＳ８、ＰＲＳＳ９、ＰＲＴＮ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＳＴ１４、ＴＭＰＲＳＳ１０、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｄ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｆ、ＴＭＰＲＳＳ１２、ＴＭＰＲＳＳ１３、ＭＭＰ１５、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＭＭＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＭＰＲＳＳ５、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＭＰＲＳＳ７、ＴＭＰＲＳＳ９、ＮＲＤＣ、ＯＶＣＨ１、ＰＡＭＲ１、ＰＣＳＫ３、ＰＨＥＸ、ＴＩＮＡＧ、ＴＰＳＡＢ１、ＴＰＳＤ１、およびＴＰＳＧ１からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態６３～７９のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
８１．切断可能なペプチドが、ＡＤＡＭ１７、ＨＴＲＡ１、ＰＲＳＳ１、ＦＡＰ、ＧＺＭＫ、ＮＡＰＳＡ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ７、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ２８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＨＧＦＡＣ、およびＨＴＲＡ３からなる群から選択される１つ以上の酵素によって切断される、実施形態８０のマスクされたキメラ受容体。
８２．実施形態１～３３、１００～１１２、および１３９～１４８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態３４～６２および１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態６３～８２および１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体をコードする、核酸。
８３．実施形態８２の核酸を含む、ベクター。
８４．発現ベクターである、実施形態８３のベクター。
８５．実施形態８２の核酸を含む、宿主細胞。
８６．マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を生成する方法であって、マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を生成する条件下で、実施形態８５の宿主細胞を培養すること含む、方法。
８７．宿主細胞が、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する、実施形態８６の方法。
８８．宿主細胞が、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する、実施形態８６または８７の方法。
８９．宿主細胞が、さらに、ゴルジμ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する、実施形態８８の方法。
９０．宿主細胞によって生成されるマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を回収することをさらに含む、実施形態８６～８９のいずれか１つの方法。
９１．実施形態８６～９０のうちのいずれか１つの方法によって生成される、マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体。
９２．実施形態１～３３、１００～１１２、および１３９～１４８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態３４～６２および１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態６３～８２および１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体を含む、組成物。
９３．実施形態９１のマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を含む、組成物。
９４．実施形態１～３３、１００～１１２、および１３９～１４８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態３４～６２および１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態６３～８２および１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
９５．実施形態９１のマスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
９６．実施形態１～３３、１００～１１２、および１３９～１４８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態３４～６２および１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、実施形態６３～８２および１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体、または実施形態９２～９５のうちのいずれか１つの組成物を含む、キット。
９７．対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、有効量の、実施形態１～３３、１００～１１２、および１３９～１４８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、実施形態６３～８２および１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体、または実施形態９２～９５のうちのいずれか１つの組成物を対象に投与することを含む、方法。
９８．腫瘍性疾患が、癌である、実施形態９７の方法。
９９．癌が、白血病、リンパ腫、頭頸部癌、結腸直腸癌、前立腺癌、脾臓癌、黒色腫、乳癌、神経芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、骨肉腫、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、または精巣癌である、実施形態９８の方法。
１００．ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
ｂ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされた抗体。
１０１．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、実施形態１００のマスクされた抗体。
１０２．切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含むリンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのアミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのカルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１００または１０１のマスクされた抗体。
１０３．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１００～１０２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０４．マスクされた抗体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１００～１０３のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０５．抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である、実施形態１００～１０４のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０６．ａ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態１００～１０５のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０７．ａ）ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号 ３２４のアミノ酸配列を含む、
実施形態１００～１０６のいずれか１つのマスクされた抗体。
１０８．ＶＬドメインが、配列番号３２７～３４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖内に含まれ、かつＶＨドメインが、配列番号３６６～３８０、４２１、および４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖内に含まれる、実施形態１００～１０７のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１０９．マスクされた抗体が、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１００～１０８のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１１０．抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が、薬剤と複合体化されている、実施形態１００～１０９のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１１１．薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、実施形態１１０のマスクされた抗体。
１１２．薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、実施形態１１０のマスクされた抗体。
１１３．ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
ｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と、
ｃ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた二重特異性抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、第１の対の前記重鎖または前記軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされた二重特異性抗体。
１１４．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、実施形態１１３のマスクされた二重特異性抗体。
１１５．切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含むリンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのアミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのカルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３または１１４のマスクされた二重特異性抗体。
１１６．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３～１１５のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１１７．マスクされた二重特異性抗体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３～１１６のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１１８．第１の対の軽鎖が、ＶＬドメインを含み、第１の対の重鎖が、ＶＨドメインを含み、
ａ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態１１３～１１７のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１１９．ａ）ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
実施形態１１３～１１８のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１２０．第１の対の軽鎖が、配列番号３２７～３４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第１の対の重鎖が、配列番号３６６～３８０、４２１および４７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３～１１９のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１２１．マスクされた二重特異性抗体が、配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１１３～１２０のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体。
１２２．ａ）ＣＴＬＡ４に結合するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むリガンド結合ドメインと、
ｂ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと、
ｃ）膜貫通ドメインと、
ｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、マスクされたキメラ受容体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
マスクされたキメラ受容体。
１２３．切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、実施形態１２２のマスクされたキメラ受容体。
１２４．切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含むリンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、第１のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのアミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のスペーサーリンカーが、切断可能なペプチドのカルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１２２または１２３のマスクされたキメラ受容体。
１２５．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１２２～１２４のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
１２６．マスクされたキメラ受容体が、配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１２２～１２５のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
１２７．ａ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｂ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｃ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
ｄ）ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／またはＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
実施形態１２２～１２６のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
１２８．ａ）ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
ｂ）ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
実施形態１２２～１２７のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体。
１２９．実施形態１００～１１２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体をコードする、核酸。
１３０．実施形態１２９の核酸を含む、ベクター。
１３１．実施形態１２９の核酸を含む、宿主細胞。
１３２．マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体を生成する方法であって、マスクされた抗体を生成する条件下で、実施形態１３１の宿主細胞を培養することを含む、方法。
１３３．実施形態１３２の方法によって生成される、マスクされた抗体、マスクされた二重特異性抗体、またはマスクされたキメラ受容体。
１３４．実施形態１００～１１２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体を含む、組成物。
１３５．実施形態１００～１１２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
１３６．実施形態１００～１１２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体を含む、キット。
１３７．対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、有効量の、実施形態１００～１１２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体、実施形態１１３～１２１のうちのいずれか１つのマスクされた二重特異性抗体、または実施形態１２２～１２８のうちのいずれか１つのマスクされたキメラ受容体を対象に投与することを含む、方法。
１３８．対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、実施形態１３５の薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、方法。
１３９．ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、ＶＬドメインのアミノ末端に連結されており、
切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号８６のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含み、
（ａ）ＶＬドメインが、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、または
（ｂ）ＶＬドメインが、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
マスクされた抗体。
１４０．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５４のアミノ酸配列を含む、実施形態１３９のマスクされた抗体。
１４１．ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、実施形態１３９または１４０のマスクされた抗体。
１４２．ＶＬドメインが、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖中に含まれ、ＶＨドメインが、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖中に含まれる、実施形態１３９～１４１のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１４３．マスクされた抗体が、配列番号３５８のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１３９～１４２のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１４４．ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
を含む、マスクされた抗体であって、
マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、ＶＬドメインのアミノ末端に連結されており、
切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含み、
（ａ）ＶＬドメインが、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、または
（ｂ）ＶＬドメインが、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、ＶＨドメインが、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
マスクされた抗体。
１４５．切断可能なペプチドを含むリンカーが、配列番号４５５のアミノ酸配列を含む、実施形態１４４のマスクされた抗体。
１４６．ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、実施形態１４４または１４５のマスクされた抗体。
１４７．ＶＬドメインが、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖中に含まれ、ＶＨドメインが、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖中に含まれる、実施形態１４４～１４６のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
１４８．マスクされた抗体が、配列番号４２２のアミノ酸配列、および配列番号４２１のアミノ酸配列を含む、実施形態１４４～１４７のうちのいずれか１つのマスクされた抗体。
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のためのみであり、それを考量したその様々な修飾または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および目的、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることが理解されるべきである。
実施例１：活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の生成
抗ＣＴＬＡ４抗体である９Ｄ９ ｍｕＩｇＧ２ｂ ｍＡｂ（９Ｄ９ ｍＡｂ）を、バイオパニング実験のためにＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。他のすべての実験については、マウスＣＴＬＡ４に対して反応性である親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９）、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）、および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（非切断性マスク９Ｄ９）を、ＡＴＵＭで生成および精製した。
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体、親抗ＣＴＬＡ４抗体、および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体を、発現プラスミドｐＤ２６１０－ｖ５（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ ＣＡ）を用いたＨＥＫ２９３一過性発現を使用して生成し、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを使用した遺伝子合成（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ ＣＡ）によって生成した。トランスフェクションの７日後、トランスフェクト細胞からの上清を採取し、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体ならびに親抗ＣＴＬＡ４抗体を、ＫａｎＣａｐＡ樹脂（Ｋａｎｅｋａ）で精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に交換した。次いで、抗体を、Ｓｏｕｒｃｅ ＳまたはＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ（ＧＥ）を使用したイオン交換によりさらに精製した。抗体濃度を、分光光度計によってＯＤ２８０の光学密度で決定した。
上述のマスク９Ｄ９抗体および非切断性のマスクされた９Ｄ抗体の両方に含まれるマスキングペプチドを、ファージディスプレイペプチドライブラリから立体閉塞ペプチドをバイオパニングすることによって得た。９Ｄ９ ｍｕＩｇＧ２ｂ ｍＡｂ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、まず、ＰｒｏｔｅｉｎＧ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（ＭＢ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、室温で３０分間捕捉した。９Ｄ９ ｍｕＩｇＧ２ｂ ｍＡｂをブロッキングした後、スキムミルクでＭＢを固定化し、Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ－Ｃ７Ｃファージペプチドライブラリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して、立体閉塞ペプチドをスクリーニングした。室温で３０分間インキュベーションした後、非結合ファージを勢いよく洗浄し、結合ファージを０．２ＭグリシンｐＨ２．２でｐＨ中和溶液に溶出した。溶出されたファージを、次のバイオパニングのラウンドのために大腸菌Ｋ１２ ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に感染させることによって増幅した。その後の３ラウンドのバイオパンニングを、アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を使用して追加のラウンドのネガティブソーティングで行い、９Ｄ９ ｍＡｂ ＣＤＲの外側のペプチド結合を除去した。９Ｄ９ ｍＡｂとマウス ＣＴＬＡ４との間の界面に特異的に結合したペプチドの特定および濃縮を達成した。
最後のバイオパニングのラウンドの後、濃縮集団からの個々のクローンを、ＥＬＩＳＡにより９Ｄ９ ｍＡｂへの特異的結合について評価した。等モルｍｕＣＴＬＡ４－ｈｓＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下または不在下での９Ｄ９ ｍＡｂを、４℃で一晩、９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にコーティングした。固有のペプチドを示す個々のファージを、スキムミルクでブロッキングされたプレートに三重で添加し、室温で１時間インキュベートした。非結合ファージを激しく洗浄した後、ＨＲＰ複合体化抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＨＲＰ基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して結合ファージを検出した。４０５ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ）で測定した。
高い９Ｄ９結合シグナルを生成し、かつ９Ｄ９ｍＡｂへのマウスＣＴＬＡ４の結合を阻害したクローンを選択し、ＤＮＡをシーケンシングのために抽出した。ペプチドＣＮＬＩＶＥＧＨＣをコードするファージからの配列を、その後の代表的な実験のために選択した。
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（マスク９Ｄ９）の設計については、ペプチドＣＮＬＩＶＥＧＨＣを含む複合体の９Ｄ９ Ｆａｂの構造特性を、高分解能（１．８Å、表３）で決定した。９Ｄ９を、３７℃で一晩、パパイン樹脂（Ｓｉｇｍａ）で切断した。Ｆａｂを、プロテインＡ、カチオン交換（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ－ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、およびサイズ排除（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ７５ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムクロマトグラフィーで精製した。１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ中の精製されたＦａｂの結晶を、０．２Ｍのギ酸ナトリウムおよび２３％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０を母液としたハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して得た。結晶を、氷晶防止剤（３５％（ｗ／ｖ）のメソ－エリスリトールと貯蔵溶液との１：１の混合）で採取し、Ｒｉｇａｋｕ ＲＡＸＩＳ ＩＶ＋＋検出器を用いたＲｉｇａｋｕ ＭｉｃｒｏＭａｘ００７－ＨＦ回転陽極回折計でデータを収集した。ネイティブデータを１００Ｋで、１．５４１８Åで収集し、ＸＤＳを使用して処理し、９８．５％の完全なデータセットを１．８Åまで得た。ＣＣＰ４ スイート内のＰｈａｓｅｒおよび検索モデルとしてのトラスツズマブＦａｂ（ＰＤＢ ＩＤ：４ＩＯＩ）の分子置換を使用して、初期相を生成した。Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ．，１１０：１７４５６－６１，（２０１３）を参照されたい。Ｃｏｏｔでの手動構築の数サイクル、続いてＰｈｅｎｉｘでの精密化を使用して、最終的なモデルを生成した。データ収集および精密化統計を、表３に列挙する。ソフトウェアＰＤＢｅＰＩＳＡを使用して、表４の抗体－ペプチド界面を特徴付けた。ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドが、９Ｄ９抗体の重鎖と軽鎖との間の界面においてＣＤＲループに結合することが決定された。ペプチド：９Ｄ９ Ｆａｂの界面は、５つの水素結合（表４）からなり、３７５ Å２の相互作用表面積をもたらす。９Ｄ９ Ｆａｂの静電表面表現は、重鎖および軽鎖の抗原結合部位界面において大きな疎水性領域を示した。ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドの中央のＬｅｕ－Ｉｌｅ－Ｖａｌモチーフは、この界面に埋没している。このモデルは、ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドのＣ末端が軽鎖のＮ末端に向いていることを示した。ペプチドのカルボキシ炭素と軽鎖（残基Ａｓｐ１）のアミド窒素との間の距離は、２０．４Åである。ＭＭＰ２／７／９切断部位を含むペプチドを、９Ｄ９抗体をペプチドに連結させるために選択した。Ｔｕｒｋ Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９：６６１－６６７，（２００１）を参照されたい。グリシンおよびセリンアミノ酸を使用して、Ｎ末端およびＣ末端のギャップを架橋した。さらに、ＭＭＰ２／７／９基質配列を変異させて、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の「非切断性の」バージョンを作成した（非切断性マスク９Ｄ９）。
（表３）Ｘ線回折データおよび精密化統計
Figure 2022516503000015
（表４）立体閉塞ペプチドと９Ｄ９－Ｆａｂとの間の水素結合
Figure 2022516503000016
実施例２：マスキングペプチドと抗ＣＴＬＡ４抗体との間の結合親和性の決定
合成ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドの９Ｄ９抗体に対する結合親和性を決定した。
方法
表面プラズモン共鳴を、３７℃でＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器で行った。９Ｄ９抗体およびアイソタイプ対照（参照チャネル）を、１００ＲＵの固定化レベルでＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合した。ペプチドを合成し、ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に希釈した。結合データを、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．０を使用して分析した。
結果
ＳＰＲにより決定された合成ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドの９Ｄ９抗体に対する結合親和性は、定常状態モデルを使用して１１Ｅ－６±２．３Ｅ－６Ｍであった（図１）。陰性対照ペプチドは９Ｄ９抗体に結合せず、ＣＮＬＩＶＥＧＨＣペプチドはアイソタイプ対照抗体に結合しなかった。これらの結果は、ファージライブラリから選択されたペプチドが９Ｄ９抗体に特異的であることを確認する。
実施例３Ａ：マウスＣＴＬＡ４に対する活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビトロ特徴付け
方法
マスクされた抗原結合部位の評価
ＥＬＩＳＡプレートを、マウスＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＴＢＳ中で一晩コーティングし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングし、続いて、Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中の親抗ＣＴＬＡ４抗体およびマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の希釈物を、ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する前に、６０分間ＣＴＬＡ４に結合させた。結合を、抗ｍｕＫａｐｐａ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）およびＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで検出した。親抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ５０に対する切断前マスク抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ５０から、マスクされた比を決定した。
プロテアーゼ切断試験
親抗ＣＴＬＡ４抗体およびマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０２％ＮＰ－４０）中で、３７℃で一晩、６ｎＭのＭＭＰ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともにインキュベートした。抗体希釈物を、上述のＥＬＩＳＡにより、および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、「Ａｎｙ Ｋｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストポリアクリルアミドゲル」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、マウスＣＴＬＡ４－Ｆｃへの結合について試験した。
結果
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、マウスＣＴＬＡ４への９０倍低い結合を呈した（図２Ａ）。マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のプロテアーゼ活性化は、親ＣＴＬＡ４抗体と同等のレベルで、マウスＣＴＬＡ４への抗体の結合を完全に回復させた（図２Ａ）。
実施例３Ｂ：マウスＣＴＬＡ４に対する活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体結合のインビトロ特徴付け
方法
低密度抗原結合ＥＬＩＳＡ
すべてのＥＬＩＳＡを、以下の記載と実質的に類似した様式で、または当該技術分野で既知の方法と概して一致した様式で行った。ポリステレン９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ウェルあたり３ｎｇのｍｕＣＴＬＡ４ｈｓＩｇＧタンパク質（Ａｂｃａｍ）でコーティングし、４℃で一晩保存した。プレートを、ＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）中０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、４℃で２時間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）でブロッキングし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。ＰＢＳ（ＰＢＳ－ＴＢ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋１％ＢＳＡ中の試験された抗体の連続希釈物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＢＳ－ＴＢ中１：４０００に希釈したＨＲＰ複合体化ヤギ抗マウスカッパ軽鎖抗体（Ａｂｃａｍ）を、ウェルに塗布し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、化学発光ＨＲＰ基質をプレートに塗布し、発光を分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ、ＢｉｏＴｅｋ）を使用して記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、バージョン７．０２を用いてデータを分析した。
マスクされた抗体の酵素活性化
親抗ＣＴＬＡ４抗体、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体、および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体をそれぞれ、切断緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５；１０ｍＭのＣａＣｌ２；０．０２％のＮＰ－４０）中の１μＭの溶液に希釈した。１ｍＭのｐ－アミノフェニル水銀アセテート（ＡＭＰＡ）で１時間、３７℃で活性化された組換えＭＭＰ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、各抗体溶液に４ｎＭの最終濃度まで添加し、３７℃で一晩インキュベートした。抗体希釈物を、マウスＣＴＬＡ４（ｍｕＣＴＬＡ４ｈｓＩｇＧタンパク質；Ａｂｃａｍ）への結合について、上述の低密度抗原結合ＥＬＩＳＡプロトコルにより試験した。
結果
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体および非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗ＣＴＬＡ４抗体と比較して、それぞれ、マウスＣＴＬＡ４への約１５６倍および２１８倍低い結合を示した（図２Ｂ）。３つの実験にわたって測定したとき、親抗ＣＴＬＡ４抗体の平均ＥＣ５０は、０．３１±０．０８ｎＭであり、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、４８．４±７．２ｎＭであり、非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、６７．７±１６．３ｎＭであった（図２Ｃ）。組換えＭＭＰ２で処置した場合、親抗ＣＴＬＡ４抗体と同等の結合は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（平均ＥＣ５０＝０．２９±０．０３ｎＭ、図２Ｃ）に回復され、一方で非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体による結合は変化しなかった（平均ＥＣ５０＝６４．３±１８．５ｎＭ、図２Ｃ）。
実施例４Ａ：活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ特徴付け
方法
インビボでの研究のための活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の生成
マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体を、発現プラスミドｐＤ２６１０－ｖ５（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ ＣＡ）を用いたＨＥＫ２９３一過性発現を使用して生成した。トランスフェクションの７日後、トランスフェクト細胞からの上清を採取し、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体をＫａｎＣａｐＡ樹脂（Ｋａｎｅｋａ）で精製し、続いてＳｏｕｒｃｅ Ｓカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してカチオン交換により精製し、ｐＨ５で、０～１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。次いで、抗体をＰＢＳ中に緩衝液交換した。抗体濃度を、分光光度計によってＯＤ２８０の光学密度で決定し、エンドトキシンレベルを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒエンドトキシンキットを使用して決定した。
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体による腫瘍根絶
５０～１００ｍｍ３のＭＣ３８腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスに、２００μｇのＩｇＧ２ａ対照（ＢｉｏＸｃｅｌ）、マウスＣＴＬＡ４に反応性の親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ、配列番号２３７を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、マウスＣＴＬＡ４に反応性の活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（配列番号２３８を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、マウスＣＴＬＡ４に反応性のマスクされたＣＴＬＡ４抗体１００５（配列番号２４０を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、またはヒトＣＴＬＡ４およびマウスＣＴＬＡ４に交差反応性の抗ＣＴＬＡ４抗体１（配列番号３２７を含む軽鎖、配列番号３６６を含む重鎖）の単回用量を腹腔内投与した。体重および腫瘍サイズを、隔週で測定した。
Ｔ細胞集団分析
５０～１００ｍｍ３のＭＣ３８腫瘍を有するＣ５７Ｂｌ／６マウスに、ＩｇＧ２ａ対照（ＢｉｏＸｃｅｌ）、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ、配列番号２３７を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体２（配列番号２３８を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体１００５（配列番号２４０を含む軽鎖、配列番号３１９を含む重鎖）、またはヒトＣＴＬＡ４およびマウスＣＴＬＡ４と交差反応性の抗ＣＴＬＡ４抗体１（配列番号３２７を含む軽鎖、配列番号３６６を含む重鎖）を、１、４、および８日目に３つの２００μｇ用量で投与した。９日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）プロトコル「Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｍｉｌｔｅｎｉ）を使用して解離させ、７０ミクロンの細胞ストレーナーを通して濾過し、ＰＢＳ／２．５％のＦＢＳ緩衝液中で２回すすぎ、酵素緩衝液を除去した。脾臓細胞は腫瘍浸潤であり、脾臓細胞を、組織をメッシュにわたって穏やかに粉砕することによって解離した。赤血球を、細胞の染色前にＡＣＫ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で溶解した。細胞の染色は、蛍光標識された抗ＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ２５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるものであった。抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗Ｋｉ６７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色する前に、細胞を透過処理した。染色細胞を、生（Ｌｉｆｅから購入したＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ）ＣＤ４５陽性細胞のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３＋（Ｔｒｅｇ）細胞の割合、ならびに細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７陽性であったこれら３つの細胞集団の割合について、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。
結果
ＩｇＧ２ａ対照抗体で処置されたマウスの腫瘍体積と比較して、親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ）は、マウスの腫瘍体積を低減した（図３Ａおよび３Ｂ）。活性化可能なマスク抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗ＣＴＬＡ４抗体（図３Ｂ）と比較して、腫瘍体積の低減において同等の有効性を示した（図３Ｃ）。ＴＭＥ中の制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）は、免疫抑制にとって重要である。親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ）および活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体２（マスク９Ｄ９）の両方が、エフェクター機能を介して腫瘍内の制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）集団を優先的に枯渇させた（図４）。インビボでのＴ細胞上のＣＴＬＡ４の遮断は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をもたらす。親抗ＣＴＬＡ４抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ）または活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体２（マスク９Ｄ９）の複数回用量投与後の脾臓におけるＴ細胞の増殖を、Ｋｉ６７＋％により評価した。マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗体（９Ｄ９．ＩｇＧ２ａ）と比較して、末梢でＣＤ４＋細胞（図５Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ｂ）の低減された増殖を示した。
ヒト化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体１は、ヒトＣＴＬＡ４に対するイピリムマブよりも高い親和性を有し（それぞれ、７倍および３８倍）、カニクイザルＣＴＬＡ４およびマウスＣＴＬＡ４と交差反応性である。ヒト化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体１は、親抗ＣＴＬＡ４抗体（図３Ｂ）と比較して、腫瘍体積の低減において同等の有効性を示した（図３Ｄ）。
実施例４Ｂ：活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ特徴付け
腫瘍成長ならびに腫瘍および末梢における免疫パラメータに対する活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の影響を、９Ｄ９抗体による治療に応答することが以前に示された、ＭＣ３８マウス結腸直腸癌モデルを使用して調査した。Ｐｅｇｇｓ Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，２０６：１７１７－１７２５，（２００９）およびＳｅｌｂｙ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１：３２－４２，（２０１３）を参照されたい。
方法
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体による腫瘍根絶
８～１２週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６に、０．５×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を皮下注射した。平均腫瘍体積が５０～１００ｍｍ３に達したとき、マウスを、同等の平均腫瘍体積の治療群に無作為化した。抗腫瘍有効性を評価するために、ＰＢＳ中に製剤化された抗体を、＜２５０μＬの体積で、用量あたり２００μｇで、無作為化後１日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍体積を週２回決定した。すべてのマウスを個々に監視し、無作為化後１５００ｍｍ３または４５日のいずれかに達したときに屠殺した。以下に記載されるように、ＦＡＣＳ分析によって制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上の抗体の生物学的機能を評価するために、腫瘍担持マウスを、＜２５０μＬの体積で、用量あたり２００μｇで無作為化後、１、４、および８日目に抗体を腹腔内投与した。対照抗体は、ｍｕＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）であった。すべてのマウスを９日目に屠殺し、ＦＡＣＳ分析のために腫瘍および脾臓を採取した。
Ｔ細胞集団分析
マウス腫瘍試料を、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ）により標準プロトコルに従って解離し、７０μｍの細胞ストレーナーを通過させた。脾臓試料を、７０μｍの細胞ストレーナー中のシリンジの後部で解離した。赤血球をＡＣＫ緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で溶解した。最終的な細胞懸濁液を洗浄し、２×１０７個の細胞／ｍＬで染色緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、２．５％ＦＢＳ、０．０９％ＮａＮ３）に再懸濁した。細胞を、ＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に対する抗体で染色される前に、Ｍｕ Ｔｒｕｓｔａｉｎ ｆｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理し、Ｆｃ受容体をブロックした。細胞内染色については、細胞を固定し、透過処理し、ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＫｉ－６７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体で染色した。単一色染色およびＦＭＯをゲーティング目的のために実行した。
結果
親抗ＣＴＬＡ４抗体（図６Ｃ）および活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（図６Ｄ）の投与は、皮下移植されたＭＣ３８腫瘍の腫瘍退縮を誘発したが、一方で、腫瘍は、アイソタイプ対照抗体（図６Ａ）または非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（図６Ｂ）のいずれかで処置されたマウスにおいて急速に成長した。これらの結果は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体が、腫瘍微小環境中のマスキングペプチドの効果的な切断および解離と一貫する抗腫瘍活性を保持したことを示す。さらに、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の完全な活性は、非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体が腫瘍成長を阻害することに失敗したため、プロテアーゼ切断に依存した。これらの結果は、抗ＣＴＬＡ４抗体の局所投与が、マウスにおける腫瘍退縮を効果的に誘発することを示す、以前の観察と一致している。Ｍａｒａｂｅｌｌｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ，１２３：２４４７－２４６３，（２０１３）を参照されたい。
活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体投与による腫瘍内および全身免疫活性化を分析した。これまでの研究で、ｍｕＩｇＧ２ａ抗ＣＴＬＡ４抗体が、処置されたマウスの脾臓におけるＴｒｅｇの活性化および拡大をもたらす一方で、ＦｃγＲ依存性の様式でＴｒｅｇ細胞を腫瘍内で枯渇させることが確立された。Ｓｅｌｂｙ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．，１：３２－４２，（２０１３）を参照されたい。したがって、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の局所活性および全身活性を評価するために、腫瘍内（図７Ａ）および脾臓内（図７Ｂ）のＴｒｅｇの存在量および増殖状態をそれぞれ評価した。腫瘍および脾臓試料を、抗体の最後の３回の用量の２４時間後に収集した。フローサイトメトリー分析により、Ｔｒｅｇが、親抗ＣＴＬＡ４抗体で処置されたマウスの腫瘍において著しく低減されたことが明らかになった（図７Ａ）。活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗ＣＴＬＡ４抗体と同等にＴｒｅｇを低減することにおいて効果的であった（図７Ａ）。対照的に、非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、腫瘍内Ｔｒｅｇ存在量に対して著しい効果はなかった（図７Ａ）。これらの結果は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体が、腫瘍関連プロテアーゼの活性に依存する様式で、親抗ＣＴＬＡ４抗体として腫瘍環境で同等の活性を有することを示す。
腫瘍組織におけるＴｒｅｇ細胞に対する効果とは対照的に、親抗ＣＴＬＡ４抗体は、処置されたマウスの脾臓において増殖する（Ｋｉ６７＋ ＦＯＸＰ３＋）Ｔｒｅｇの顕著な増加を引き起こした（図７Ｂ）。親抗ＣＴＬＡ４抗体と比較した場合、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、増殖する脾臓Ｔｒｅｇのわずかな増加をもたらしたが、非切断性のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較した場合、Ｔｒｅｇ増殖に対する効果はなかった（図７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の腫瘍活性化が、正常組織における活性の低減を伴う腫瘍環境に主に限定されているという結論を支持する。
実施例５：ヒトＣＴＬＡ４に対する活性化可能なマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビトロ特徴付け
方法
マスクされた抗原結合部位の評価
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＴＢＳ中で一晩コーティングし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングし、続いて、Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中の親抗ＣＴＬＡ４抗体およびマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体の希釈物を、ＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する前に、６０分間ＣＴＬＡ４に結合させた。結合を、抗ｈｕＫａｐｐａ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）およびＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで検出した。親抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ５０に対する切断前マスク抗ＣＴＬＡ４抗体のＥＣ５０から、マスクされた比を決定した。
プロテアーゼ切断試験
親抗ＣＴＬＡ４抗体およびマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体を、３７℃で一晩、５０ｍＭのトリス、ｐＨ９、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０中６ｎＭの１）マトリプターゼとともにインキュベートした。抗体希釈物を、上述のＥＬＩＳＡにより、および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、「Ａｎｙ Ｋｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅプレキャストポリアクリルアミドゲル」（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、ヒトＣＴＬＡ４への結合について試験した。
結果
ヒト化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体１は、ヒトＣＴＬＡ４への５０倍低い結合を呈した（図８）。ヒト化マスク抗ＣＴＬＡ４抗体１のプロテアーゼ活性化は、親抗ＣＴＬＡ４抗体と同等のレベルで、ヒトＣＴＬＡ４への抗体の結合を完全に回復させた（図８）。
実施例６：マスクされた抗体の酵素活性化
マスクされた抗体を、以下に記載されるプロトコルを用いて組換えプロテアーゼを使用して活性化した。
マスクされた抗体を、プロテアーゼとともにインキュベーションする前にＭＭＰ切断緩衝液に緩衝液交換した。活性化のために、プロテアーゼ（Ａｎａｓｐｅｃ、ＰｒｏｓｅｃＢｉｏ、およびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＭＭＰ切断緩衝液（５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２）中で１００ｎｇ／μＬに希釈した。ＡＰＭＡ（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、１ｍＭの最終濃度まで添加した。酵素を、３７℃で１時間インキュベートした。活性化プロテアーゼを、１：１０００の抗体：プロテアーゼの比率（例えば、１ｕｇのＭＭＰ対１ｍｇの抗体）でマスクされた抗体に添加したか、または同等の量の緩衝液を陰性対照試料に添加した。試料を、３７℃で一晩インキュベートした。
インキュベーション後、処理した抗体を、プロテインＡ樹脂を使用して精製した。簡潔には、１５０μＬのＭａｂＳｕｒｅ ＰｒｏＡスラリー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１．７ｍＬのチューブに添加した。スラリーを、ｍｙＳｐｉｎ ６遠心分離機で２分間スピンさせることにより、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。活性化抗体（５００μＬ）をスラリーに添加し、室温で３０分間、または４℃で３時間、ロッキングしながらインキュベートした。抗体スラリー混合物を、ｍｙＳｐｉｎ ６遠心分離機で２分間スピンし、フロースルーを収集した。樹脂を１ｍＬの１倍ＰＢＳで２回洗浄し、洗浄物を回収した。抗体を、少なくとも６回１００μＬの２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．５を使用して溶出した（６μＬの１ＭトリスｐＨ８．０を含む新しい１．７ｍＬチューブに）。溶出液の濃度を測定した。
すべての溶出液および緩衝液交換試料を、ＰＢＳ中にプールした。プールした試料に５００μＬのＰＢＳを添加した。試料をフィルターに添加し、３回スピンした。プールした試料を、フィルターの上部に１００μＬのＰＢＳを添加し、混合して、交換されたタンパク質を除去することによって収集した。精製抗体の濃度を測定した。試料をＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、試料を活性化について分析した。簡潔には、１０μＬの試料（１ｍｇ／ｍＬで）を、１０μＬのローディング緩衝液と混合し、９０℃で１０分間沸騰させた。１０μＬの試料を、１５ウェルＡｎｙ－ｋＤａ染色フリーゲル（ＢｉｏＲａｄ）に装填し、２００Ｖで３０分間試験した。タンパク質を、ＢｉｏＲａｄ撮像装置を使用して撮像し、移動サイズの変化による完全な活性化を確認した。
マスクされた抗体の完全な活性化は、切断された抗体の移動サイズの変化によって示された。
実施例７：ヒトＣＴＬＡ４への抗ＣＴＬＡ４抗体結合のインビトロ特徴付け：低密度抗原結合ＥＬＩＳＡ
方法
ポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（フィッシャー、＃０７－２００－５９１）を、ウェルあたり１μｇ／ｍＬのヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ＃７２６８－ＣＴ）でコーティングし、４℃で一晩保存した。プレートを、ＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｂ４２８７－２５Ｇ）でブロッキングし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。抗ＣＴＬＡ４抗体を含む試料の連続希釈を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ＋１％ＢＳＡ）中で作製し、プレートに添加し、室温で１時間、１００ＲＰＭで軌道振盪した。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、アッセイ緩衝液中で１：８０００に希釈された抗ヒトカッパ軽鎖［クローン：ＳＢ８１ａ］－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ ＃ａｂ７９１１５）を、ウェルに塗布し、室温で１時間振盪した。プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ＨＲＰ基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ ＃３７０６９）をプレートに塗布し、発光を分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析した。
試験された抗体は、抗体１および抗体２と称されるヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体、ならびにそのバリアント／形態／バージョンを含む。特定の番号付けスキームに従って、抗体１は、配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。抗体１は、配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。Ｋａｂａｔの番号付けスキームに従って、抗体１は、配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。特定の番号付けスキームに従って、抗体２は、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。Ｋａｂａｔの番号付けスキームに従って、抗体２は、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む。各々が「抗体１－＃」の命名法を有する、抗体１の様々な形態を生成し、各々が「抗体２－＃」の命名を有する、抗体２の様々な形態を生成した。
結果
図９Ａおよび図９Ｂは、抗体１および抗体２と称されるヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体またはそのバリアントとの結合研究を示す。図９Ａは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体１のバージョン（抗体１－１）と、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃに対するＦｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体１のバージョン（抗体１－２）との結合の間の検出可能な差異がないことを示す。抗体１－２は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、および配列番号４７８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。図９Ｂは、野生型Ｆｃ領域を有する抗体２のバージョン（抗体２－１）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－２）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ変異、Ｉ３３２Ｅ変異、および２つのヒンジ領域変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－３）、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、およびＡ３３０Ｌ変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－４）と、Ｆｃ領域におけるＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ変異、および２つのヒンジ領域変異を有する抗体２のバージョン（抗体２－５）とを含む、抗体２の様々な形態のＣＴＬＡ４結合を比較する。図９Ｂに示されるように、全形態の抗体は、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃに同様に結合した。試験された抗体の平均ＥＣ５０値を、以下の表５に提供する。
（表５）
Figure 2022516503000017
実施例８：ヒトＣＴＬＡ４結合に対するプロテアーゼ活性化の影響
方法
ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体を、実施例７に記載される低密度抗原結合ＥＬＩＳＡで使用した。マスクされた活性化可能な形態のヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の活性化を評価するために、実施例６に概説されるように組換えプロテアーゼを使用した。
Ｆｃ領域中にＳ２３９Ｄ変異およびＩ３３２Ｅ変異を有する抗体２のマスクされていないバージョン（抗体２－６）を、同じ２つの変異を有するが、配列番号１９または５のアミノ酸配列を含むマスキングペプチド、ならびにスペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドも含む抗体のバージョンと比較するためのマスクされていない対照として使用した。親非マスク抗体２－６は、配列番号３２４のアミノ酸配列を有する可変重鎖、配列番号３２２のアミノ酸配列を有する可変軽鎖、配列番号４２１のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号３３４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。抗体２－７～抗体２－２１のマスクされた抗体は、表６および表９に記載されるように、親非マスク抗体２－６の可変重鎖、可変軽鎖、重鎖、および軽鎖配列を含み、マスキングペプチド、スペーサーリンカー１、切断可能な（または非切断性の）ペプチド、およびスペーサーリンカー２をさらに含む。したがって、抗体２－６、抗体２－７、抗体２－８、抗体２－９、抗体２－１０、抗体２－１１、抗体２－１２、抗体２－１３、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１６、抗体２－１７、抗体２－１８、抗体２－１９、抗体２－２０、および抗体２－２１の各々は、配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、配列番号４２１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別段の指示がない限り、抗体２－７～抗体２－２１と称されるマスクされた抗体は、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の構成要素：１）マスキングペプチド、２）スペーサーリンカー１、３）切断可能なペプチド、４）スペーサーリンカー２、軽鎖のＮ末端を親非マスク抗体２－６の軽鎖に連結することによってマスクされる。抗体２－１０は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。抗体２－７～抗体２－１３におけるスペーサーリンカーおよび切断可能なペプチドの配列を含む、試験された例示的な抗体の例を、表６に提供する。
（表６）
Figure 2022516503000018
抗体の連続希釈をアッセイ緩衝液中で行い、ヒトＣＴＬＡ４－Ｆｃでコーティングされた９６ウェルマイクロプレートに添加し、室温で１時間振盪した。プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ＢＳＡでブロッキングし、ＴＢＳ－Ｔで再度洗浄した。抗体をプレートに添加し、振盪した。洗浄後、アッセイ緩衝液中の抗ヒトカッパ軽鎖（ＨＲＰに複合体化された）をウェルに塗布し、室温で振盪した。プレートを、ＨＲＰ基質を添加する前に再度洗浄した。発光を、分光光度計を使用して記録し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析した。
結果
図１０Ａおよび図１０Ｂは、プロテアーゼの不在下（図１０Ａ）または存在下（図１０Ｂ）での抗体２のマスクされたバージョンおよびマスクされていないバージョンを用いた結合研究を示す。図１０Ａは、プロテアーゼの不在下での、抗体２の様々なバージョンおよびＩｇＧ１アイソタイプの結合を示す。マスクされていない抗体２－６およびＩｇＧ１アイソタイプの右側への移動により証明されるように、抗体のより高い濃度が結合を示すために必要である（図１０Ａ）。マスクされた抗体は、マスキングペプチドによって閉塞されるとみなされる。各マスクされた抗体の閉塞を以下の表７に示し、マスクされた抗体のＥＣ５０を、マスクされていない親抗体である抗体２－６のＥＣ５０で割ることによって計算する。閉塞の量のばらつきは、スペーサーリンカーおよび／または切断可能なペプチドの配列が、マスキングペプチドの抗原結合をブロックする能力に影響することを示す。抗体のＥＣ５０および計算された閉塞を、以下の表７に示す。
（表７）
Figure 2022516503000019
図１０Ｂは、プロテアーゼの存在下（すなわち、活性化）での、非切断性のリンカーを有する抗体２－１０を除く、抗体２の様々なバージョンの結合を示す。マスクされていない親抗体２－６を対照として含み、プロテアーゼに曝露しなかった。プロテアーゼ消化を、実施例６に提供されるプロトコルに従って行った。図１０Ｂに示されるデータは、切断可能なペプチドのタンパク質分解切断が、マスクされていない親抗体である抗体２－６と同等のレベルに抗体の結合を回復させることによって、ヒトＣＴＬＡ４への抗体の結合を完全にレスキューすることを示す。プロテアーゼの存在によって「活性化された」試験された抗体の結合データおよび活性化データを、以下の表８に提供する。活性化を、以下の式によって計算する：活性化＝１－（活性化マスク抗体のＥＣ５０－マスクされていない親抗体である抗体２－６のＥＣ５０）／（非活性化マスク抗体のＥＣ５０－親抗体である抗体２－６のＥＣ５０）。
（表８）
Figure 2022516503000020
実施例９：マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のプロテアーゼ切断のインビトロ特徴付け：酵素動態、タンパク質切断、およびレーダープロット
例示的なプロテアーゼの存在下で、各々が配列番号５または１９のアミノ酸配列、ならびに第１および第２のスペーサーリンカーと切断可能なペプチドを含むマスキングペプチドを含む、抗体２のマスクされた形態を使用して結合研究を行った。抗体２－１５は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。いくつかの研究では、マスクされていない親抗体である抗体２－６も比較のために試験した。マスキングペプチド、スペーサーリンカー、および切断可能ペプチドの配列を含む、試験された抗体の例を表９に提供する。
（表９）
Figure 2022516503000021
切断可能なペプチド配列のプロテアーゼ選択に対するインビトロ感受性の比較を、図１１Ａ～Ｈにレーダープロットとして示す。レーダープロット上の各プロテアーゼによる各抗体の活性化を、活性化が０（活性化なし）～１．０（完全活性化）の範囲で示されるレーダープロットを使用して示す。活性化を、以下の式によって計算する：活性化＝１－（活性化マスク抗体のＥＣ５０－マスクされていない親抗体である抗体２－６のＥＣ５０）／（非活性化マスク抗体のＥＣ５０－親抗体である抗体２－６のＥＣ５０）。各マスクされた抗体の閉塞を以下の表１２に示し、マスクされた抗体のＥＣ５０を、マスクされていない親抗体である抗体２－６のＥＣ５０で割ることによって計算する。結合を、実施例７および実施例８に提供されるプロトコルに従って実施し、抗体のタンパク質分解処理を、実施例６および実施例８に提供されるプロトコルに従って行った。マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体（１０００ｎＭ）の溶液を、適切な切断緩衝液中で作製した。２つの抗体試料を、２本の０．５ｍＬのエッペンドルフチューブに等分した。切断緩衝液の作業溶液（表１１を参照されたい）を対応する抗体試料に添加し、切断緩衝液を対照（プロテアーゼなし）試料に添加した。
（表１０）
Figure 2022516503000022
１切断緩衝液については、表１１を参照されたい。
（表１１）
Figure 2022516503000023
様々な切断可能なペプチドの配列を有する抗体のレーダープロットを図１１Ａ～Ｇに示す。図１１Ｈは、陰性対照として使用するための非切断性の、切断可能なペプチドを含む抗体２－１５が、様々な例示的なプロテアーゼの添加によるその結合において影響を受けなかったことを示す。図１１Ａは、抗体２－１４のレーダープロットを示す。
２日目（ｄ２）、４日目（ｄ４）、または７日目（ｄ７）のプロテアーゼ切断のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を、前述のように、健康なマウスおよびＭＣ３８腫瘍担持マウスで評価し、図１１Ｉ～１１Ｍに示す。図１１Ｉに示されるように、抗体２－１４における切断可能なペプチドの切断を、健康なマウスの血漿で評価した。１５０μｇの抗体２－１４を投与したマウス１＊（上のパネル）を除いて、各群の健康なマウス５匹の群に２００μｇの抗体２－１４を投与した。標準をプロテアーゼあり（右のレーン）またはプロテアーゼなし（左のレーン）で処理した。図１１Ｊに示されるように、抗体２－１６における切断可能なペプチドの切断を、健康なマウスの血漿で評価した。図１１Ｊで使用された標準は、抗体２－１８であった。１５０μｇの抗体２－１４を投与したマウス４＊を除いて、健康なマウスに２００μｇの抗体２－１６を投与した。
図１１Ｋ～１１Ｍに示されるように、抗体２－１４の切断可能なペプチドの切断、抗体２－１５の非切断性のペプチド、および抗体２－１６の切断可能なペプチドを、ＭＣ３８腫瘍担持マウスの血漿で評価した。ＭＣ３８腫瘍担持マウスに２００μｇの各抗体を投与した。図１１Ｍにおいて、マウス２の２日目（ｄ２）の試料はエラーであるようであり、無視すべきである。
プロテアーゼの存在下または不在下での、抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５のＣＴＬＡ４への結合を、図１２Ａに示し、ＥＣ５０、閉塞、および活性化を表１２に提供する。マスクされていない抗体２－６は、プロテアーゼの存在によって影響を受けない結合を示す（図１２Ａ）。マスクされているが非切断性である切断可能なペプチド配列を含む抗体２－１５は、プロテアーゼの添加によってレスキューされないプロテアーゼの不在下で、マスクされていない親抗体２－６と比較して、低減された結合親和性を示す（図１２Ａ）。マスクされ、かつ切断可能なペプチドを含む抗体２－１４は、プロテアーゼの不在下で、１０１の閉塞値を有する低減された結合親和性を示すが、この低減された結合親和性は、１．０の活性化値で（表１２）、プロテアーゼの添加により活性化されたときにレスキューされる（図１２Ａ）。プロテアーゼの存在下または不在下での抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５のＥＣ５０を、以下の表１２に提供する。
（表１２）
Figure 2022516503000024
プロテアーゼの存在下または不在下での、抗体２－６、抗体２－７、および抗体２－１０のＣＴＬＡ４への結合を、図１２Ｂに示し、ＥＣ５０、閉塞、および活性化を表１３に提供する。抗体２－１０は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。マスクされ、かつ切断可能なペプチドを含む抗体２－７は、プロテアーゼの不在下での閉塞値４９、およびプロテアーゼを使用した活性化時に１．０の活性化値を示す（図１２Ｂ、表１３）。プロテアーゼの不在下で、マスクされた抗体２－７は、マスクされた抗体２－１０と類似の結合を示し、プロテアーゼの添加による活性化時に、抗体２－７は、マスクされていない親抗体２－６と類似の結合を示す。抗体２－６、抗体２－７、および抗体２－１０のＥＣ５０を、以下の表１３に提供する。
（表１３）
Figure 2022516503000025
図１２Ａ、図１２Ｂ、表１２、および表１３に示されるデータは、抗体２－７（配列番号１９）および抗体２－１４（配列番号５）に含まれる例示的なマスキングペプチドが各々、可逆的な様式で結合活性をマスキングすることができることを示す。
実施例１０：エンテロトキシン分析
方法
ＳＥＢアッセイ
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）アッセイを使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ－２生成を促進する様々な抗体の能力を調べた。ＳＥＢアッセイについては、選択された抗体の希釈物を、予め加温された培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ＦＢＳ＋１％ＨＥＰＥＳ＋１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ＋１％Ｎａ－ピルビン酸塩）中で調製した。抗体溶液を三重に播種し、培地のみを「ＰＢＭＣ＋ＳＥＢ」ウェル、「ＰＢＭＣのみ」のウェル、および外縁壁に添加した。ＳＥＢ溶液を予め加温した培地中で調製し、「ＰＢＭＣのみ」を除くすべての実験ウェルに添加した。ＰＢＭＣ（ＢｉｏＩＶＴ）を、３７℃の水浴中で解凍した。細胞をコニカルチューブに滴加で移し、２０倍の予め加温した培地を添加して細胞を洗浄した。細胞を遠心分離し、培地を吸引した。細胞を、２０ｍＬの予め加温した培地中に再懸濁し、アリコートを計数のために採取した。残りの細胞を遠心分離し、大量に再懸濁して、細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬにした。細胞をウェルあたり１００μＬで播種し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。５日目に、プレートを１０００ＲＰＭで５分間スピンした。各ウェルから、２５０μＬの細胞を新しい９６ウェルプレートに移した。プレートを再びスピンし、２２５μＬの細胞をＰＣＲストリップに移した。試料を、ＥＬＩＳＡにより分析されるまで－８０℃で保存した。
ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ
上述のプロトコルを使用して生成された細胞上清のＩＬ－２レベルを、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ Ｄｅｌｕｘｅセット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号＃４３１８０６）を用いた分析によって決定した。細胞上清試料をアッセイ緩衝液で希釈して、標準曲線内に収まった。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、およびテューキーの多重比較検定（一元配置分散分析）を用いて試料を分析して、治療群間の統計的有意性を決定した。
結果
抗体１および抗体２の様々な形態を、ＳＥＢアッセイで試験した。実施例７に記載される、抗体１－１もしくは抗体１－２の存在下で生成された、または抗体なしのＩＬ－２のレベルを示すデータを、図１３Ａに示す。実施例７に記載される、抗体２－１、抗体２－２、抗体２－３、抗体２－４、および抗体２－５の存在下で生成された、または抗体なしのＩＬ－２のレベルを示すデータを、図１３Ｃに示す。すべての試験された抗体は、非抗体対照と比較してＩＬ－２レベルを増加させる能力を示した。各抗体に対する抗体なし対照を上回るＩＬ－２レベルの倍増を、アイソタイプ対照との比較とともに、図１３Ｂおよび図１３に示す。
実施例１１：マスクされたおよび活性化された抗ＣＴＬＡ４抗体の免疫機能
実施例１０のプロトコルに従ったＳＥＢアッセイを実施して、抗体２の様々な形態を用いた処理に応答してＩＬ－２生成を試験した。アッセイを、対照として抗体の不在下（すなわち、抗体なし）、またはアイソタイプ対照抗体の不在下で実行した。マスクされていない親抗体である抗体２－６も比較のために試験した。
図１４Ａおよび１４Ｂに示されるように、強力なＩＬ－２生成を促進するマスクされていない抗体２－６とは対照的に、抗体２のマスクされた形態は、ＩＬ－２生成を促進するのに概して効果的ではなかった。図１４Ｂに示されるように、抗体２－１２は、アイソタイプ対照と比較してＩＬ－２生成の有意な増加をもたらした唯一のマスクされた抗体であったが、この増加は、マスクされていない抗体２－６の親抗体を使用した場合に観察された増加よりもはるかに少ないものであった。対照的に、抗体２－７、抗体２－８、抗体２－９、抗体２－１０、抗体２－１１、および抗体２－１３は各々、アイソタイプ対照と比較して、ＩＬ－２生成の有意な増加を促進しなかった（図１４Ｂ）。一元配置分散分析比較を使用して統計分析を行った。
図１４Ｃおよび１４Ｄは、ＩＬ－２生成を促進する抗体２－７、抗体２－８、抗体２－９、および抗体２－１０の能力に対する、実施例６のプロトコルに従って実施されたプロテアーゼ処理の影響を示す。抗体２－１０は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。マスクされていない親抗体２－６を陽性対照として試験し、アイソタイプ対照抗体および抗体なし対照を陰性対照として試験した。抗体２－６に対する一元配置分散分析比較を使用して、図１４Ｄに示される統計分析を行った。
図１４Ｃに示される結果は、プロテアーゼによる処理が、マスクされていない親抗体２－６と類似のレベルでＩＬ－２の生成を促進する抗体２－７、抗体２－８、および抗体２－９の能力をレスキューすることを示す。図１４Ｂに示されるグラフは、抗体なし対照を上回るＩＬ－２生成の倍増を比較する。マスクされているがプロテアーゼにより活性化可能ではない抗体２－１０による処置は、アイソタイプ対照と、類似のレベルのＩＬ－２生成、および抗体なし対照を上回る類似の変化倍率をもたらした（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。
実施例１２：マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ切断
方法
健康なマウスの血漿中のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ切断
健康な７～８週齢の雌の非腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２００μｇのマスクされた形態の抗体２を０日目に腹腔内注射した。２日目および４日目に、ＲＯ洞を介して血液を採取し、血漿単離のためにＬｉＨｅｐで処理した。７日目に、心臓穿刺を介して血液を採取し、血漿単離のためにＬｉＨｅｐで処理した。血漿を等分し、ウェスタンブロット分析まで－８０℃で保存した。インビトロでプロテアーゼの存在下または不在下でマスクされた抗体を処置した標準試料を、陽性対照として含めた。ウェスタンブロット分析については、血漿試料をＰＢＳ中で希釈し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ＢｕｆｆｅｒおよびβＭＥ中で希釈した。試料を９５℃で加熱し、次いで、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｅｃａｓｔゲルに装填した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、２００Ｖで４２分間行った。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、１％Ｃａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒを用いて１倍ＴＢＳ中で、室温で１時間振盪しながらブロッキングした。膜を、ヒトカッパ軽鎖［クローン ＥＰＲ５３６７－８］に対してＨＲＰ複合体化Ｒｂ ｍＡｂでプローブし、４℃で一晩振盪しながらＣａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒ中に１：１０，０００で希釈した。膜をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで現像した。生データをＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアで分析した。活性化割合を以下のように計算した：活性化バンドの強度／（活性化バンドの強度＋マスクされた非活性化バンドの強度）×１００％。
インビボ実験を２週間にわたって２つのコホートで行い、抗体２－１４を両コホートに含めた。試験された抗体には、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１６、抗体２－１７、抗体２－１８、抗体２－１９、抗体２－２０、および抗体２－２１が含まれる。抗体２－１５は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。
結果
抗体２－１４（図１５Ａ）および抗体２－２０（図１５Ｃ）の両方をインビボで活性化した。抗体２－１９の活性化は、インビボで検出されなかった（図１５Ｂ）。インビボでの活性化は、抗体２－１６、抗体２－１７、抗体２－１８、および抗体２－２１（データには示さず）についても検出されず、陰性対照抗体２－１５についても検出されなかった。２日目から７日目までの活性化の割合の増加を、抗体２－１４および抗体２－２０について図１５Ｄに示す。
実施例１３：腫瘍担持マウスの血漿中のマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ切断
ＭＣ３８細胞（１×１０６個）を、７～８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下注射した。０日目に、腫瘍体積測定値に基づいてマウスを無作為化し、２００μｇの抗体２構築物を腹腔内注射した。２日目および４日目に、ＲＯ洞を介して血液を採取し、血漿単離のためにＬｉＨｅｐで処理した。７日目に、心臓穿刺を介して血液を採取し、血漿単離のためにＬｉＨｅｐで処理した。血漿を等分し、ウェスタンブロット分析まで－８０℃で保存した。インビトロでプロテアーゼの存在下または不在下でマスクされた抗体を処置した標準試料を、陽性対照として含めた。ウェスタンブロット分析については、血漿試料をＰＢＳ中で希釈し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ＢｕｆｆｅｒおよびβＭＥ中で希釈した。試料を９５℃で加熱し、次いで、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｅｃａｓｔゲルに装填した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、２００Ｖで４２分間行った。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、１％Ｃａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒを用いて１倍ＴＢＳ中で、室温で１時間振盪しながらブロッキングした。膜を、ヒトカッパ軽鎖［クローン ＥＰＲ５３６７－８］に対してＨＲＰ複合体化Ｒｂ ｍＡｂでプローブし、４℃で一晩振盪しながらＣａｓｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｅｒ中に１：１０，０００で希釈した。膜をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで現像した。生データをＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアで分析した。
インビボ実験を２週間にわたって２つのコホートで行い、抗体２－１４を両コホートに含めた。試験された抗体には、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１６、抗体２－１７、抗体２－１８、抗体２－１９、抗体２－２０、および抗体２－２１が含まれる。抗体２－１５は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。
別のセットの実験では、ＭＣ３８細胞（１×１０６個）をマウスモデルに皮下注射し、ヒトＣＴＬＡ４でノックインした。ＭＣ３８腫瘍担持マウスに、２００μｇの試験抗体（例えば、ＩｇＧ対照、抗体２－１、抗体２－１０、イピリムマブ、または非フコシル化形態のイピリムマブ（イピリムマブ－ａＦｕｃ））の単回注射を投与し、免疫表現型検査を、注射の５日後にＣＤ４５＋脾臓細胞およびＣＤ４５＋腫瘍内細胞上で行った。いくつかの研究では、２０μｇ、７μｇ、または２μｇの試験抗体の単回注射後に、経時的な腫瘍体積を測定した。特定されたマーカーを有するＣＤ４５＋細胞の相対割合でＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋に対して選択性のものを含む、ＣＤ４５＋細胞をマーカーについて評価した。
結果
抗体２－１４および抗体２－２０は、ＭＣ３８担持マウスにおいてインビボで活性化された（図１６Ａおよび１６Ｃ）。抗体２－１９の活性化は、インビボで検出されなかった（図１６Ｂ）。活性化は、抗体２－１６、抗体２－１７、抗体２－１８、および抗体２－２１（データには示さず）についても検出されず、陰性対照抗体２－１５についても検出されなかった。抗体２－１４の活性化率は、二元配置分散分析（調整されたＰ値＝０．０１１３）によって決定された場合に、健康な非腫瘍担持マウスと比較して、ＭＣ３８担持マウスで有意に大きかった（図１６Ｄ）。
ＭＣ３８腫瘍担持マウスを使用した研究の結果を、図１９Ａ～１９Ｄに示し、ＣＤ４５＋脾臓（図１９Ａおよび１９Ｂ）またはＣＤ４５＋腫瘍内（図１９Ｃおよび１９Ｄ）の相対割合を、ＣＤ３＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ３＋／Ｋｉ６７＋、ＣＤ４＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ＋／ＩＣＯＳ＋、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇ＋／Ｋｉ６７＋に対して選択性のマーカーのために提供する。統計を図１９Ｅ（脾臓細胞）および１９Ｆ（腫瘍内細胞）に提供する。群１：ＩｇＧ、群２：抗体２－１、群３：抗体２－１０、群４：イピリムマブ、群５：イピリムマブ－ａＦｕｃ。
２０μｇ、７μｇ、または２μｇの試験抗体の単回注射を受けたＭＣ３８腫瘍担持マウスを使用した研究の結果を、図２０Ａおよび２０Ｂに示す。図２０Ａは、抗体２－６、抗体２－１０、ならびにＦｃドメインにおけるＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異を有するＲＳＶ抗体（ＲＳＶ－ｍ）の経時的な腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。図２０Ａに示されるように、腫瘍成長は、マスクされているが非切断性の抗体２－１０と比較して、マスクされていない親抗体２－６によって抑制される。図２０Ｂは、経時的な腫瘍体積に対する腫瘍平均を示し、これは、抗体２－１０またはＲＳＶ－ｍ対照と比較して、抗体２－６の投与後の腫瘍成長がより遅いことを示す。
実施例１４：抗ＣＴＬＡ４抗体によるＡＤＣＣ活性およびＣＴＬＡ４遮断
方法
レポーターバイオアッセイ
Ｆｃ ＲＩＩＩａレポーターバイオアッセイを、様々な抗ＣＴＬＡ４抗体を使用して行った。γ抗体を、予め加温した完全培地（ＲＰＭＩ１６４０を有するＦＢＳ）中で希釈した。ＣＴＬＡ４エフェクター細胞（標的細胞：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｊ１５８Ａ）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を混合および計数し、細胞の密度を１×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。標的細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号＃３９１７）の各ウェルに添加した。希釈された抗体を適切なウェルに添加し、二重で試験した。各ウェルの内容物を穏やかに混合し、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞を発現するＦｃγＲＩＩＩａ）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を混合および計数し、細胞の密度を３×１０６個の細胞／ｍＬに調整した。直ちに、エフェクター細胞を各ウェルに分注し、穏やかに混合した。プレートを蓋で覆い、３７℃で６時間維持した。測定の１時間前に、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ基質およびＢｉｏ－Ｇｌｏ緩衝液を４℃から除去した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ緩衝液をＢｉｏ－Ｇｌｏ基質のボトルに移して、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を作製し、反転により穏やかに混合した。ボトルを室温で維持した。インキュベーション後、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１０分間維持した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに添加し、プレートを室温で５～１５分間インキュベートした。次いで、プレートをルミノメーターで読み取った。
試験された抗体は、抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５、ならびにアイソタイプ対照を含む。抗体２－６は、抗体２－１４および抗体２－１５に対するマスクされていない親抗体である。抗体２－１５は、陰性対照として使用するための非切断性である切断可能ペプチド配列を含む。抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５を各々、以前のプロテアーゼへの曝露なしで試験し、また切断可能なペプチドの切断による活性化を可能にするプロテアーゼへの曝露後に試験した。各抗体の閉塞を、抗体のＥＣ５０を、マスクされていない親抗体である抗体２－６のＥＣ５０で割ることによって計算する。
結果
マスクされていない親抗体２－６は、プロテアーゼの存在下および不在下で、レポーター活性化の同様の曲線を示した（図１７）。以前のプロテアーゼへの曝露を有することなく試験した場合、マスクされた抗体である抗体２－１４および抗体２－１５は、マスクされていない親抗体２－６と比較して、低減されたレポーター活性化を示した（図１７）。プロテアーゼによって非活性化可能な抗体２－１５のレポーター活性化は、以前のプロテアーゼの添加によってレスキューされなかった（すなわち、マスクされていない親抗体２－６に関連するものに似ている活性化レベルに戻らなかった）（図１７）。プロテアーゼによって活性化可能な抗体２－１４のレポーター活性化は、マスクされていない親抗体２－６に関連するものに似ているレベルにレスキューされた（図１７）。試験された抗体のＥＣ５０値および閉塞値を、表１４に提供する。
（表１４）
Figure 2022516503000026
ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイ
マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体を含む抗ＣＴＬＡ４抗体の、ＣＴＬＡ４とそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用をブロックする能力を、ＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイを使用して試験した。抗体を、予め加温した完全培地中で希釈した。ＣＴＬＡ４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を混合および計数した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９１７）の各ウェルに添加した。希釈された抗体を適切なウェルに添加し、二重で試験した。プレートを穏やかに混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＡＰＣ細胞（Ｒａｊｉ細胞を発現するＣＤ８０／ＣＤ８６）を解凍し、完全培地を含むコニカルチューブに移した。細胞を穏やかに混合および計数し、直ちに各ウェルに分注し、穏やかに混合した。プレートを覆い、３７℃で６時間維持した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を反転により穏やかに混合し、ボトルを室温で維持した。６時間のインキュベーション後、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１０分間維持した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬をウェルに添加し、プレートを室温で５～１５分間インキュベートした。次いで、プレートをルミノメーターで読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。結合をブロックする能力の変化倍率の統計分析を、一元配置分散分析比較を使用して行った。
試験された抗体には、抗体２－２および抗体２－１４、ならびにアイソタイプ対照が含まれる。抗体２－２は、抗体２のマスクされていない形態である。抗体２－１４を、以前のプロテアーゼへの曝露なし（すなわち、マスクされた非活性化形態で）試験し、またプロテアーゼへの曝露後に（すなわち、活性化形態で）試験した。アッセイをまた、抗体を使わずに（すなわち、抗体なし対照）実行した。
結果
図１８Ａに示されるように、抗体２－１４は、プロテアーゼの不在により非活性化形態にある場合、ＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合を効果的にブロックする能力を示さなかった。抗体なし対照を上回る変化倍率の分析は、非活性化形態にある場合の抗体２－１４の能力と、ＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合をブロックするアイソタイプ対照の能力との間に有意差がないことを明らかにした（図１８Ｂ）。しかしながら、抗体２－１４が以前のプロテアーゼへの曝露のために活性化形態にある場合、それは、ある範囲の濃度にわたってＣＴＬＡ４のそのリガンドへの結合を効果的に遮断する能力を示した（図１８Ａ）。そのリガンドへのＣＴＬＡ４結合を遮断する活性化された抗体２－１４の能力は、マスクされていない抗体２－２のものと類似していた（図１８Ａおよび１８Ｂ）。実際、抗体対照なしを上回る変化倍率の分析は、そのリガンドへのＣＴＬＡ４結合を遮断する活性化された抗体２－１４とマスクされていない抗体２－２の能力の間に有意差を示さなかった（図１８Ｂ）。
実施例１５：ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルにおける抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性および薬力学
方法
抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性および薬力学（ＰＤ）を、ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルを使用して評価した。各試験抗体（ＲＳＶ－ｍ対照抗体、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１４、および抗体２－１５）を投与し、次いで、腫瘍体積および体重を評価することによって有効性を評価した。抗ＲＳＶ対照抗体は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異（ＲＳＶ－ｍ対照抗体）を含む。末梢免疫表現型検査も５日目に実施し、投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞の割合およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞の割合を評価した。有効性試験について、表１５に示されるように、ｍｇ／ｋｇ単位での用量を用いて、マウスの１４コホートを評価した。本明細書で使用される場合、ｍｇ／ｋｇ単位での用量はまた、「ｍｐｋ」とも称される。ＭＢ４９細胞を、Ｃ５７／ＢＬ６－ｈｕＣＴＬＡ４マウスに皮下接種した。治療は、腫瘍が約３５０ｍｍ３に達したときに開始した。ダネットの事後検定を用いた一元配置分散分析を行い、処置対対照（ＲＳＶ－ｍ対照）の統計的有意性を決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
（表１５）
Figure 2022516503000027
薬力学は、表１６に示される用量（ｍｇ／ｋｇ）を用いて、マウスの５つのコホートの各々に抗体を投与することによって評価した。腫瘍、肝臓、脾臓、および血液において、他のリードアウトの中でも特に免疫表現型検査を行う。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ４＋細胞のうちの割合として測定することによってＴ細胞を評価し、ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ４５＋細胞のうちの割合として測定する。腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、および血漿における切断および薬物レベルも評価される。
（表１６）
Figure 2022516503000028
結果
図２３Ａは、投与後５日目の末梢血液中のＣＤ４＋Ｋｉ６７＋細胞（左）およびＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞（右）の割合に関する有効性研究の結果を示し、これはＴ細胞活性化のレベルを表す。結果は、マスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体である抗体２－１４が、３ｍｇ／ｋｇの３．３倍低い用量で呈された抗ＣＴＬＡ４抗体イピリムマブよりも１０ｍｇ／ｋｇの用量でより低いＴ細胞活性化を呈したことを示す。これは、マスクされた抗体２－１４が、ＭＢ４９マウスモデルにおいてイピリムマブよりも安全であることを示す。
図２３Ｂに示されるように、腫瘍重量およびＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を、１０ｍｇ／ｋｇ（ＲＳＶ－ｍ対照）または３ｍｇ／ｋｇ（イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１５）で処置されたマウスにおいて、７日目に評価した。抗体２－６または抗体２－１４で処置されたマウスは、７日目に３ｍｇ／ｋｇの腫瘍において、最も低い腫瘍重量および最も高いＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を呈した。いずれの療法においても、体重、脾臓重量、腎臓重量、または肝臓重量の変化は観察されなかった（データには示さず）。
図２３Ｃに示されるように、制御性Ｔ細胞枯渇およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、抗体２－１４では観察されるが、イピリムマブでは観察されない。
図２３Ｄに示されるように、抗ＣＴＬＡ４抗体を用いた処置後に強力な抗腫瘍活性が観察された。０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、抗体２－６は、イピリムマブと比較して優れた抗腫瘍活性を示した。
実施例１６：腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、および血漿における抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ切断検出
方法
Ｂ－ｈＣＴＬＡ－４トランスジェニック雌マウスを、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎから購入し、研究開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８結腸直腸腫瘍細胞（マウスあたり５×１０５個の細胞）、ＭＢ４９膀胱癌細胞（マウスあたり１×１０６個の細胞）、またはＭＣＡ２０５線維肉腫細胞（マウスあたり１×１０６個の細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下投与した。約２５０～５００ｍｍ３のサイズの腫瘍に到達した後（０日目）、マウスは、１０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内用量の示された抗体を受けた。ウェスタンブロットによる切断の分析のために、４日目に腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、および血漿を採取した。
血漿試料については、勾配基準プレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）上で同等の体積の変性血漿（１～２μＬのインプット）を分離することによって、直接的なウェスタンブロットアプローチを利用する。次いで、分離されたタンパク質を、Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｂｌｏｔシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用してニトロセルロース膜に移した。次いで、ＨＲＰ複合体化抗体（ａｂ２０２５４９）との抗ヒトカッパ軽鎖反応性に対する標準的な方法を使用して、膜を現像した。切断された軽鎖が、２ｋＤの質量差を有する切断されていない軽鎖よりも低い位置に移動するため、切断を視覚的に評価する。
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、７８４４２）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、８７７８８）中のＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）ビーズホモジナイザーを使用して、腫瘍、肝臓、脾臓、および腎臓からのタンパク質溶解物を生成した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより決定し、３ｍｇの組織溶解物を、ビオチン複合体化抗ヒトカッパ軽鎖抗体（ＬＳＢｉｏ、ＬＳ－Ｃ３５１４５１－５００）およびストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、８８８１６）を用いて免疫沈降を行った。タンパク質を、５０μｕｍＬの１０ｍＭグリシン（ｐＨ２）で溶出し、１Ｍトリス（ｐＨ８）で中和した後、上述のようにヒトカッパ軽鎖のウェスタンブロット検出を行った。
別の研究では、健康なサル（カニクイザル）組織（Ｎ＝２）および血漿（Ｎ＝３）のエクスビボ切断を、ＣＴＬＡ４ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。試験された組織には、腎臓、脾臓、肝臓、膀胱、皮膚、結腸、および肺が含まれた。
別の研究では、投与の１時間後、１日後、および７日後に、健康なカニクイザルの血漿中でインビボ切断を評価した。切断を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、および質量分析（ＭＳ）によって特定した。抗体２－１４内の予期される切断部位（ＶＰＬＳ＊＊ＬＹ）における切断生成物の存在量を計算した。別の部位（ＶＰＬＳＬＹ＊＊ＳＧＧ）での切断も比較のために計算した。抗体２－１６の切断の存在量も計算した。
別の研究では、マウスの腫瘍、組織、および血漿におけるエクスビボ切断を、ＣＴＬＡ４ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。これには、以下のマウスモデルが含まれた：Ｃ５７／Ｂｌ６（Ｎ＝９）、野生型マウスのＭＣ３８（Ｎ＝９）、ｈＣＴＬＡ４マウスのＭＣ３８（Ｎ＝５）、野生型マウスのＭＢ４９（Ｎ＝６）、野生型マウスのＭＣＡ２０５（Ｎ＝４）、および野生型マウスのＢ１６（Ｎ＝４）。腫瘍、脾臓、肝臓、腎臓、および血漿における切断を評価した。血漿試料をプールした。切断頻度および切断された分子の割合（中央値）を計算した。
別の研究では、ヒトの腫瘍（結腸腫瘍、肺腫瘍）由来のヒト調整培地を使用してエクスビボ切断を行った。プロテインＡ／Ｇビーズを２ラウンドの免疫沈降で使用して、分析前にヒト試料からヒトＩｇＧを除去した。抗ｈｋＬＣ抗体を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行い、試験された抗体の切断および非切断形態を検出した。ＥＬＩＳＡ分析を行い、切断の割合（％）を計算した。
結果
図２４Ａに示されるように、ＭＣＡ２０５線維肉腫細胞を使用した研究について、抗体２－１４で腫瘍および肝臓組織において切断生成物が強く検出されたが、抗体２－１６では検出されなかった。陽性対照（Ｃｔｒｌ＊）は、抗体２－１４からの５０％非切断生成物および５０％の切断生成物を有する試料を含んだ。
図２４Ｂに示されるように、ＭＢ４９膀胱癌細胞を使用した研究について、抗体２－１４で肝臓組織において切断生成物が強く検出されたが、抗体２－１６では検出されなかった。陽性対照（Ｃｔｒｌ＊）は、抗体２－１４からの５０％非切断生成物および５０％の切断生成物を有する試料を含んだ。
図２４Ｃに示されるように、ＭＣ３８結腸直腸癌細胞を使用した研究について、抗体２－１４で肝臓組織において切断生成物が強く検出されたが、抗体２－１６では検出されなかった。陽性対照（Ｃｔｒｌ＊）は、抗体２－１４からの５０％非切断生成物および５０％の切断生成物を有する試料を含んだ。
ＭＢ４９担持マウスに投与された各抗体のＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって定量化し、次いで、各試料を、ＣＴＬＡ４コーティングＭＳＤプレート上で、脾臓に対して１μｇ／ｍＬ、または腎臓および肝臓組織に対して０．０４μｇ／ｍＬで開始する３倍希釈系列でアッセイして、ＣＴＬＡ４結合を評価した研究もまた実施した。これらの研究には、マスクされていない親抗体（抗体２－６）、マスクされた切断可能な抗体（例えば、抗体２－１４および抗体２－１６）、ならびにマスクされているが非切断性の抗体（抗体２－１０）が含まれた。図２４Ｄは、抗体２－１４の切断された生成物の割合（％）を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。切断の割合を、デンシトメトリー強度（切断％＝下側バンド／（下側バンド＋上側バンド））に基づいて計算した。第１のレーン（左）は、血漿における２８％の切断、腎臓における６０％の切断、肝臓における５９％の切断、および脾臓における７３％の切断を示す。第２のレーン（中央）は、血漿における３９％の切断、腎臓における５４％の切断、肝臓における７７％の切断、および脾臓における７２％の切断を示す。第３のレーン（右）は、血漿における３５％の切断、腎臓における６４％の切断、肝臓における７５％の切断、および脾臓における６９％の切断を示す。矢印は、どの試料をＣＴＬＡ４への結合を評価するために利用したかを示し、図２４Ｅに結果を示す。図２４Ｅは、各抗体とＣＴＬＡ４との間の結合を示し、各抗体は、ＭＢ４９担持Ｂ－ｈＣＴＬＡ４トランスジェニックマウスへの投与後に血漿、腎臓、肝臓、または脾臓から単離された。図２４Ｅに示されるように、非切断性のマスクされた抗体２－１０は、マスクされていない親抗体２－６と比較して低減された結合を示したが、一方で切断可能なマスクされた抗体２－１４は、肝臓および脾臓における抗体２－６と同等の結合、ならびに血漿、腎臓、肝臓、および脾臓における抗体２－１０よりも大きな結合を示した。抗体２－１６は、腎臓、肝臓、および脾臓における抗体２－１０と比較してより強い結合を示した。図２４Ｆは、例示的なプロテアーゼのパネルによる切断可能なペプチド基質のインビトロでの切断のヒートマップを示す。
ＣＴＬＡ４ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、カニクイザルの器官および血漿中の抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１０、抗体２－１６、および抗体１３３４のエクスビボ切断を試験する研究を、以下の通りに要約する。抗体２－１４は、肺（８８％）、膀胱（３７％）、および結腸（３６％）において高い切断の割合を示した。抗体２－１６は、肺（３０％）および脾臓（１５％）において中程度の切断の割合を示した。抗体１３３４は、肺（２２％）における中程度の切断の割合を示した。抗体２－１４は、血漿（４％）における低い切断の割合を示した。抗体２－１６について、血漿における検出された切断はなかった。抗体１３３４は、血漿（５％）における低い切断の割合を示した。
ＣＴＬＡ４ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価された、マウスの腫瘍、組織、および血漿におけるある特定の抗体（例えば、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１０、抗体２－１６、および抗体１３３４）のエクスビボ切断を試験する研究の結果を、Ｃ５７／Ｂｌ６－ｗｔ、ＭＣ３８－ｗｔ、ＭＣ３８－ｈＣＴＬＡ４、Ｍ４９－ｗｔ、ＭＣＡ２０５－ｗｔ、およびＢ１６マウスについて図２５Ａ～２５Ｆに示す。ＥＬＩＳＡアッセイによって計算された切断分子の割合を表１７に要約する。
（表１７）切断分子の割合（％）
Figure 2022516503000029
切断頻度を、図２５Ａ～２５Ｆに示されるように、レーダープロットに示す。腫瘍調整培地における切断頻度に関して、抗体２－１４は、ＭＣ３８－ｗｔの腫瘍調整培地において３３％の頻度、ＭＢ４９－ｗｔの腫瘍調整培地において１７％の頻度、およびＭＣＡ２０５－ｗｔの腫瘍調整培地において２５％の頻度を呈し、抗体２－１６は、ＭＣ３８－ｗｔの腫瘍調整培地において１００％の頻度、ＭＣ３８－ｈＣＴＬＡ４の腫瘍調整培地において４０％の頻度、およびＭＢ４９－ｗｔの腫瘍調整培地において１７％の頻度を呈した。腎臓調整培地における切断頻度に関して、抗体２－１４は、ＭＣ３８－ｗｔ、ＭＣ３８－ｈＣＴＬＡ４、ＭＢ４９－ｗｔ、ＭＣＡ２０５－ｗｔ、およびＢ１６－ｗｔの腎臓調整培地において１００％の頻度を呈し、抗体２－１６は、ＭＣ３８－ｗｔの腎臓調整培地において６７％の頻度、ＭＣ３８－ｈＣＴＬＡ４の腎臓調整培地において８０％の頻度、ＭＢ４９－ｗｔの腎臓調整培地において１７％の頻度、およびＢ１６－ｗｔの腎臓調整培地において１００％の頻度を呈した。
図２６Ａおよび２６Ｂは、抗体２－１４を使用した健康なカニクイザルの血漿におけるインビボでの切断研究の結果を示す。図２６Ａに示されるように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用した抗体２－１４の切断は、３名すべての対象について１時間で０％、対象＃１について１日目で８％、対象＃３において１日目で６％、および対象＃５について１日目で４％、ならびに対象＃１について７日目で３５％、対象＃３について７日目で３２％、および対象＃５について７日目で３１％であると計算された。抗体２－１４の切断もまた、対象＃３の質量分析法（ＭＳ）を使用して計算し、これは１時間で０％、１日目に１８％、および７日目に３２．３％であると計算された。予期される切断部位（ＶＰＬＳ＊＊ＬＹ）または別の部位（ＶＰＬＳＬＹ＊＊ＳＧＧ）でのインタクトな（すなわち、切断されていない）抗体２－１４ならびに切断生成物の存在量を定量化した。インタクトな抗体２－１４は、１時間で１００％の存在量、２４時間で８２．１％、および７２時間で６７．７％であると計算され、切断生成物ＶＰＬＳ＊＊ＬＹは、１時間で０％の存在量、２４時間で１７％、および７２時間で３２．３％の存在量であると計算され、切断生成物ＶＰＬＳＬＹ＊＊ＳＧＧは、１時間および７２時間で０％の存在量、ならびに２４時間で１％であると計算された。
図２６Ｃは、抗体２－１６を使用した健康なカニクイザルの血漿におけるインビボでの切断研究の結果を示す。図２６Ｃに示されるように、試験した条件下では、ＣＥまたはＭＳを使用して、抗体２－１６に対する切断は特定されなかった。インタクトな（すなわち、切断されていない）抗体２－１６の存在量は、１時間、２４時間、および７２時間で１００％の存在量であると計算された。
図２７Ａおよび２７Ｂは、ヒトの肺または結腸腫瘍試料で調整された培地を使用したエクスビボでの切断研究の結果を示す。図２７Ａは、ヒトＩｇＧの除去を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示し、それによって２ラウンドの免疫沈降（ＩＰ）を行うことによって切断分析を可能にする。図２７Ｂは、ヒト腫瘍試料を含む調整培地中でのインキュベーション後の、切断状態、切断されていない状態、または両方の状態の試験された抗体の存在を示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。ＥＬＩＳＡアッセイを使用した結果（図２８Ｅを参照されたい）も、切断を示す選択試料に対して示された切断の割合（％）を用いて計算した。図２７Ｂに示されるように、抗体２－１４は、腫瘍試料において切断を呈することが示され、肺腫瘍試料では２．７％の切断、結腸２の８ａｕｇ結腸腫瘍試料では１００％の切断、結腸２８ａｕｇ結腸腫瘍試料では７５％の切断、および結腸２の４ｓｅｐｔ結腸腫瘍試料では１００％の切断を呈すると計算された。図２７Ｂに示されるように、抗体２－１６は、腫瘍試料において切断を呈することが示され、肺腫瘍試料では２１％の切断、結腸２の８ａｕｇ結腸腫瘍試料では９８％の切断、結腸２８ａｕｇ結腸腫瘍試料では４５％の切断、および結腸２の４ｓｅｐｔ結腸腫瘍試料では１００％の切断を呈すると計算された。これは、抗体２－１４および抗体２－１６のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に示されるように、切断と相関するＥＬＩＳＡ結合アッセイからの結果を示す。
切断された分子の割合（％）もまた、結腸腫瘍上清（結腸２ ４ｓｅｐｔ結腸腫瘍試料）で質量分析を使用して分析し、ＥＬＩＳＡアッセイ結果と比較した。切断可能なペプチド内の様々な部位での切断から生じる、インタクトな（すなわち、切断されていない）抗体ならびに切断生成物の存在量を計算した。結果を図２８Ａ～２８Ｄに示す。図２８Ａに示されるように、対照としてＲＰＭＩ中で培養した場合の９９．６％の存在量と比較して、インタクトな抗体２－１４の存在量は、結腸腫瘍調整培地中で培養した場合に４．８％であった。抗体２－１４を結腸腫瘍調整培地中で培養した場合、Ｌ＊ＳＬＹ切断生成物の存在量は６９％であり、Ｓ＊ＬＹ切断生成物の存在量は５．９％であり、Ｌ＊ＹＳＧＧ切断生成物の存在量は２．７％であり、Ｙ＊ＳＧＧ切断生成物の存在量は１１．３％であり、Ｓ＊ＧＧ切断生成物の存在量は６．３％であった。図２８Ｂに示されるように、インタクトな抗体２－１５の存在量は、結腸腫瘍調整培地中または対照としてＲＭＰＩのいずれかで培養した場合に９８．８％であった。図２８Ｃに示されるように、対照としてＲＭＰＩ中で培養した場合の９９．８％と比較して、インタクトな抗体２－１６の存在量は、結腸腫瘍調整培地中で培養した場合に０．２％であった。抗体２－１６を結腸腫瘍調整培地中で培養した場合、Ｔ＊ＳＧＧ切断生成物の存在量は９６．８％であった。図２８Ｄに示されるように、対照としてＲＭＰＩ中で培養した場合の９７．５％と比較して、インタクトな抗体２－１０の存在量は、結腸腫瘍調整培地中で培養した場合に９４．３％であった。
ＥＬＩＳＡアッセイを、抗体２－６、抗体２－１４、抗体２－１５、抗体２－１０、抗体２－１６、ならびにＦｃドメインにおいてＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ変異を含むイピリムマブのマスクされたバージョン（マスクされたイピリムマブ－ｍ）を使用して行い、各試験された抗体は、結腸腫瘍調整培地（結腸２ ４ｓｅｐｔ結腸腫瘍試料）または対照としてのＲＰＭＩのいずれかで培養された。結果を図２８Ｅに示す。抗体２－１４は、１００％の切断された分子を呈すると計算され、抗体２－１５は、０％の切断された分子を呈すると計算され、抗体２－１０は、４％の切断された分子を呈すると計算され、抗体２－１６は、１００％の切断された分子を呈すると計算された。
図２８Ａ～２８Ｄに示されるＭＳデータは、切断された分子の割合（％）のＥＬＩＳＡデータと相関する。抗体２－１４については、ＥＬＩＳＡ分析は、ＭＳデータに基づく９５．２％と比較して、この結腸腫瘍試料で１００％の切断を示した。抗体２－１５については、ＥＬＩＳＡ分析は、ＭＳデータに基づく１．２％と比較して、この結腸腫瘍試料で０％の切断を示した。抗体２－１０については、ＥＬＩＳＡ分析は、ＭＳデータに基づく５．７％と比較して、この結腸腫瘍試料で４％の切断を示した。抗体２－１６については、ＥＬＩＳＡ分析は、ＭＳデータに基づく９９．８％と比較して、この結腸腫瘍試料で１００％の切断を示した。
抗ＣＴＬＡ４ ＥＬＩＳＡ分析を、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から得られた腫瘍組織（ＮＡＴ）に隣接するヒト腫瘍組織および正常組織を使用して行った。試験された抗体は、抗体２－１４、抗体２－１６、および抗体１３３４を含む。表１８に結果を要約する。表１８に示されるように、ヒト腫瘍組織による切断の全体的な頻度は、抗体２－１４（６５％）について、抗体２－１６（２２％）よりも高い。腫瘍によって切断される分子の割合は、抗体２－１６（２６％）について、抗体２－１４（２２％）よりもわずかに高い．ＮＡＴによって切断される分子の全体的な割合は、抗体２－１４（２４％）について、抗体２－１６（７％）よりも高い。
（表１８）
Figure 2022516503000030
実施例１７：患者の腫瘍および正常隣接組織（ＮＡＴ）を用いたＭＣ３８およびＨ２２８細胞株の酵素およびプロテオミクスプロファイリング
試料中の総タンパク質濃度を、標準プロトコルに従ってビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２３２２５）により評価した。腫瘍／ＮＡＴ対試料の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬであったが、一方で細胞株試料の濃度は概して１０倍低かった。したがって、複製細胞株試料（ＭＣ３８－１およびＨ２２２８－１）のうちの２つを、１０ｋＤａカットオフ膜を使用して１０倍濃縮した。試料を、５０μｇ／ｍＬのタンパク質の最終反応濃度で、ＡＭＳＰ－ＭＳライブラリとともにインキュベートした。
Ａ．細胞の細胞傷害性
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を、製造業者のプロトコルに従って、ＬＤＨアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃８８９５３）を使用して細胞傷害性を測定するために調整培地試料で測定した。バックグラウンドＬＤＨ活性もまた、ＭＣ３８の対照として無血清ＤＭＥＭ培地中で、およびＨ２２２８の対照として血清ありまたはなしのＲＰＭＩで、ならびにＮＡＴ／腫瘍試料で測定した。細胞の細胞傷害性は、対応するバックグラウンド培地対照の細胞傷害性と比較して表される。
図２９に示されるように、調整培地試料中のＬＤＨの活性を、壊死のプロキシとして使用した。図２９は、示される細胞株または腫瘍／ＮＡＴ組織から調整された無血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）補充培地において完了したＬＤＨ放出アッセイを使用して測定された細胞の細胞傷害性を示す。吸光度値は、各試料について対応する培地で測定されたベースライン活性の割合として表される。ＭＣ３８細胞は、以前の細胞生存率データと同程度のＬＤＨ細胞傷害性を有していたが、Ｈ２２２８細胞は、予想よりも高い細胞傷害性を有していた（ＭＣ３８よりも約２．６倍）。
腫瘍およびＮＡＴ組織は、無血清培地中で培養された場合に、増加された細胞死を示した。腫瘍試料は、ＮＡＴ試料よりも血清の欠乏に対してより感受性であり、腫瘍試料中の高い成長率を反映している可能性がある。図２９に示されるように、完全培地中で培養された組織試料は、無血清培地中の組織または培養細胞株のいずれかと比較して、最も低い細胞傷害性レベルを有していた。
Ｂ．プロテアーゼ特異性プロファイリング
プロテアーゼ特異性スクリーニングを、質量分析（ＡＭＳＰ－ＭＳ）法によるＡｌａｕｎｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇで行った。この方法は、物理化学的に多様なペプチドライブラリをプロテアーゼの基質として使用し、反応は、切断生成物の質量分析検出により経時的に監視される。得られた切断を、酵素なし対照インキュベーションの結果と比較して、酵素処理した試料における特定の切断について評価する。
特異性プロファイルの差異分析については、各位置での各アミノ酸について、ｉｃｅＬｏｇｏソフトウェア（ｖ．１．２）を用いてＺスコアのマトリックスを生成した。これらのＺスコアは、特定のアミノ酸の頻度が平均から逸脱する回数（すなわち、陰性参照セット内の特定の位置でのその特定のアミノ酸の頻度）を計算する。次いで、試料対間の差分Ｚスコアを使用して、ｇｐｌｏｔおよびＲＣｏｌｏｒＢｒｅｗｅｒパッケージを使用して、Ｒ環境でヒートマップを生成した。
ＡＭＳＰ－ＭＳライブラリからの時間依存性ペプチド切断生成物を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより特定した。２つの細胞株試料であるＭＣ３８およびＨ２２８は各々、ライブラリに対して良好なレベルの活性を示した。時間経過中に観察された切断の総数は、ＭＣ３８については４０（１５分）、１０７（６０分）、および３０６（２４０分）であり、Ｈ２２２８については１４９（１５分）、１７０（６０分）、および３７１（２４０分）であった。基質特異性のプロファイルを、全時間経過にわたって観察された４５３（ＭＣ３８について）および６９０（Ｈ２２２８について）の切断の累積リストから外挿し、図３０のｉｃｅＬｏｇｏ表現を使用して報告する。ＩｃｅＬｏｇｏは、ペプチドライブラリ内の切断位置と切断されていない位置の両方を考慮し、（Ｐ１－Ｐ１’）で切断部位に隣接するアミノ酸のフォールド濃縮（ｆｏｌｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および非濃縮（ｄｅ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を可視化するために用いられる。図３０は、ＭＣ３８およびＨ２２２８細胞株の基質切断を、ｉｃｅＬｏｇｏグラフィックとして示す。文字の高さは、ライブラリ中のすべての可能なペプチド切断に対する切断ペプチド間のアミノ酸頻度の差異パーセントであり、各位置Ｐ４～Ｐ４’でプロットされる。中心線より上の残基は好ましく、線より下の残基は好ましくない。統計的に有意な残基（ｐ≦０．０５）は、物理化学特性によって色付けされる（黒色：疎水性、赤色：酸性、青色：塩基性、紫色：アミド、緑色：小さい）。灰色の残基は、ｐ＞０．０５で観察された。
ここでＡＭＳＰ－ＭＳによって特定される特異性プロファイルは、エンドペプチダーゼ活性を示し、両方の細胞株によって共有されるＰ１中の疎水性および塩基性アミノ酸が強く好ましい。ＭＣ３８細胞は、Ｐ１’中のＲおよびＹに対する選好性、ならびにＰ３、Ｐ２、およびＰ４’で追加の疎水性特異性を示した。Ｈ２２２８細胞は、Ｐ１’でＨ、Ｓ、およびＹに対する選好性、ならびにＰ２’およびＰ４’で追加の疎水性特異性を示した。
Ｃ．ＮＡＴおよび腫瘍の差異解析
ＭＳＰ－ＭＳライブラリからの時間依存性ペプチド切断生成物を、実施例１７．Ｂに上述されるように同定した。２つの患者組織試料は、ライブラリに対して高レベルの活性を示した。時間経過中に観察された切断の総数は、ＮＡＴについては１３４（１５分）、２７０（６０分）、および４７５（２４０分）であり、腫瘍組織については６３（１５分）、１８４（６０分）、および４４７（２４０分）であった。基質特異性のプロファイルを、全時間経過にわたって観察された８７９（ＮＡＴについて）および６９４（腫瘍について）の切断の累積リストから外挿し、図３１Ａに示されるｉｃｅＬｏｇｏ表現を使用して報告する。図２と同様に、図３１Ａおよび３１Ｂは、ＮＡＴおよび腫瘍（ＴＵＭ）組織の基質切断を、ｉｃｅＬｏｇｏとして示す。
さらに、２つの患者試料のライブラリに対する活性を、より長い２４時間の時点で監視し、基質特異性のさらなる差異を明らかにした。この追加の時点で観察された切断は、７１９（ＮＡＴについて）および６３６（腫瘍について）であった。全時間経過（２４時間時点を含む）のプロファイルを図３１Ｂに示す。ノルロイシン（ｎ）は、ライブラリ内のＭｅｔのプロキシである。ＮＡＴ試料は、Ｐ１における塩基性アミノ酸（主にＲおよびＫ）、ならびにＰ１’におけるＲ、Ｈ、およびＳに対する強い選好性を示した。腫瘍試料は、Ｐ１における塩基性（ＲおよびＫ）および疎水性アミノ酸の両方に対する選好性、ならびにＰ１’におけるＨに対する強い選好性を示した。腫瘍試料はまた、Ｐ２’における疎水性アミノ酸に対する選好性を示したが、一方で両方の患者試料は、Ｐ４’における疎水性アミノ酸に対する選好性を共有した。
ＮＡＴ試料と腫瘍試料との間の全体的な基質特異性の差を定量化するために、図３１Ｃに示されるように、各試料における切断からのＺスコアもまた使用して、各亜部位での残基選好性に由来する差のマップを生成した。図３１Ｃは、Ｐ４－Ｐ４’位置でのＺスコアの差をヒートマップとして示し、ＮＡＴまたは腫瘍特異的切断で好ましい残基を強調表示する。ノルロイシン（ｎ）は、ライブラリ内のＭｅｔのプロキシである。これは、ＮＡＴ試料におけるＰ１でのリジンおよびアルギニンに対する優性特異性を確認し、ならびに特に腫瘍試料における他の位置（Ｐ１におけるＧおよびＦなど）での追加のわずかな選好性を強調する。
細胞株Ｈ２２２８の含有は、不死化細胞株を、特異性プロファイルに関して類似の起源の主要組織と比較する機会を提供し、ここでは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を選択した。Ｈ２２２８細胞は、腫瘍試料よりも、ＮＡＴとの特異性においてより顕著な差異を示した。さらに、この差異解析は、Ｐ１におけるＧ、Ｈ、およびＦを含む、ＮＡＴと比較して、同様に腫瘍組織のプロファイルと類似した、ＮＡＴ（左パネル）と比較したＨ２２２８細胞におけるいくつかの選好性を示す。それにもかかわらず、特異性の差異（あまり顕著ではないが）は、図３１Ｄに示されるＨ２２２８細胞と腫瘍組織との間でも検出され、腫瘍微小環境中のプロテアーゼ活性に関して、患者の不均一性に対する支持を提供する。図３１Ｄは、Ｐ４－Ｐ４’位置でのＺスコアの差をヒートマップとして示し、ＮＡＴまたは腫瘍試料のいずれかと比較して、Ｈ２２２８特異的切断で好ましい残基を強調表示する。ノルロイシン（ｎ）は、ライブラリ内のＭｅｔのプロキシである。
Ｄ．ペプチド配列の動態分析
表１９に示される１０個の配列（ＡＫ１０）を、ＡＭＳＰ－ＭＳを介して分析した。これらの配列を、元の配列からわずかに修飾して、質量分析に適合したペプチド（いくつかの場合、塩基性残基を添加して正電荷を添加する）、および間隔残基（ＧＧ）を生成して、より長い約１４ｍｅｒのペプチドを生成した。ペプチドを、ＡＭＳＰ－ＭＳ反応において最終濃度５００ｎＭで調製した。また、ペプチド種の化学的検証のために、ＡＫ１０ライブラリをＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって別々に分析した。
（表１９）
Figure 2022516503000031
ＡＭＳＰ－ＭＳ分析を、標準基質特異性プロファイリング条件の０、１５、６０、２４０、および１２００分の反応インキュベーション中のサンプリング時点で行った。ペプチドを、各ペプチド種のＭＳ１前駆体イオンピーク面積からの質量分析ラベルフリー定量法により定量化した。酵素進行曲線をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ８．０でモデル化し、以下の一次動態方程式に非線形最小二乗法のフィッティングを使用してデータをフィッティングさせた。
Figure 2022516503000032
式中、Ｙ＝生成物形成パーセントであり、Ｋｏｂｓは、観察された速度であり、ｔ＝時間である。ミカエリス・メンテン動力学では、観察された速度Ｋｏｂｓは、酵素濃度および触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）の関数である。酵素混合物のこの分析では、Ｋｏｂｓを使用して生成物の切断をランク付けした。
ＡＭＳＰ－ＭＳ反応におけるＡＫ１０ペプチドの全体像を表すために、各基質ペプチドの正規化された相対的存在量を経時的にプロットした。ＡＫ１０ライブラリ中の基質ペプチドの相対的存在量は、ＭＣ３８無血清調整培地を用いたＡＭＳＰ－ＭＳを介して監視された。ＭＣ３８無血清調整培地反応については、Ｍｅｔ酸化などの酵素的処理および非酵素的処理の組み合わせにより、各基質の存在量が異なる速度で減少したことが観察された。酵素切断を評価するために、生成物形成分析も必要とした。
酵素的処理によって基質が消費されているかどうかを評価するために、生成物形成の速度を、飽和に理想的に到達する一相減衰モデルへの適合の質について評価した。図３２Ａおよび３２Ｂは、ＭＣ３８細胞株を用いて明らかな分解を有する選択されたペプチドの個々の進行曲線を示す。図３２Ａおよび３２Ｂは、ＭＣ３８調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３２Ａ、左）、ＡＫ１０－０２（図３２Ａ、右）、ＡＫ１０－０４（図３２Ｂ、左）、およびＡＫ１０－０５（図３２Ｂ、右）。ＡＫ１０－０２の場合、明確な生成物形成は、非常にわずかな曲線で明らかであるが、ＡＫ１０－０１、ＡＫ１０－４、およびＡＫ１０－０５から形成される「生成物」は、非特異的分解の例である。ＡＫ１０－０１は本質的に線形であり、ＡＫ１０－０４は時間のゼロ点に存在し、ＡＫ１０－０５の生成物は化学的処理により分解し続けた（いくつかはＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより観察される）。
ＭＣ３８の最良の基質は、ＡＫ－０９およびＡＫ－１０であり、これらのペプチドについて複数の切断生成物が観察された。図３３に示されるように、それらの進行曲線は一次動態速度にフィッティングされ、次いで、切断をそれらの相対効率によってランク付けした。図３３は、ＡＫ１０ライブラリペプチドとのＭＣ３８ ＡＭＳＰ－ＭＳ反応からの主要な切断生成物の相対効率を示す。ＰＲＱＡ｜ＲＶＶＧでのペプチドＡＫ－１０において最も急速な切断が生じ、「｜」は、シシル（ｓｃｉｓｓｉｌｅ）結合を示す。ペプチドＡＫ－０９では、複数の切断が、最も効率的な上位の基質の狭い倍率範囲内で観察され、切断は、ＬＳ｜ＧＲＳＮＡＭ、ＬＳＧ｜ＲＳＮＡＭ、およびＬＳＧＲ｜ＳＮＡＭでの切断である。ＡＫ－０２の低効率切断も示されている。
Ｈ２２２８細胞株は、ペプチドＡＫ１０－０１、－０２、－０４、－０９、および－１０において切断を生成した。個々の基質の生成物形成を図３４Ａおよび３４Ｂに示す。図３４Ａおよび３４Ｂは、Ｈ２２２８調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３４Ａ、左上）、ＡＫ１０－０２（図３４Ａ、右上）、ＡＫ１０－０４（図３４Ａ、下）、ＡＫ１０－０９（図３４Ｂ、左）、およびＡＫ１０－１０（図３４Ｂ、右）。Ｈ２２２８調整培地によって切断された上位の基質を、計算された相対効率とともに図３５に示す。
ＡＫ１０ライブラリにおける切断された上位の基質を、一次動態速度にフィッティングさせ、最も効率的に切断されたモチーフは、ＹＤＬＹ｜ＨＰおよびＬＳＧＲ｜Ｓであった。モチーフＬＳＧＲ｜Ｓは、３つのペプチドで以下のランク順に切断された：ＡＫ－０１＞ＡＫ－０９＞ＡＫ－０２。ＹＤＬＹ｜ＨＰモチーフは、２つのペプチドの状況において、以下のランク順で切断された：ＡＫ－０４＞ＡＫ－０９。ペプチドＡＫ－１０では、シシル結合をＨＰＲＱ｜ＡＲに移したが、このペプチドは依然として上位の基質の５倍以内の効率で切断された。
患者腫瘍試料は、ＡＫ１０ライブラリペプチドのＡＭＳＰ－ＭＳ分析における細胞株試料のいずれかよりも広範な切断セットを生成した。個々の生成物形成トレースを図３６Ａ～３６Ｃに示す。これらの図は、腫瘍調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３６Ａ、左上）、ＡＫ１０－０２（図３６Ａ、上中央）、ＡＫ１０－０３（図３６Ａ、下）、ＡＫ１０－０４（図３６Ｂ、左上）、およびＡＫ１０－０５（図３６Ｂ、右上）、ＡＫ１０－０９（図３６Ｂ、下）、ＡＫ１０－０９酸化ペプチド（図３６Ｃ、左）、およびＡＫ１０－１０（図３６Ｃ、右）。以前と同様に、ペプチドＡＫ－０９について、非酸化ペプチド種および酸化ペプチド種の両方において、いくつかの分解生成物が観察された。しかしながら、ペプチドＡＫ－１０の唯一の有意な切断は、ＰＲＱＡ｜ＲＶＶであり、図３６Ｃの右パネルの生成物進行曲線は、二次反応が生成物シグナルを低減させていることを支持した。
腫瘍調整培地中のＡＫ１０ライブラリの上位の基質を図３６Ｄに示す。上位の切断は、ＡＫ－０３のＬＳＬＹ｜ＳＧモチーフ、およびＡＫ－０４のＹＤＬＹ｜ＨＰにあった。Ｈ２２２８からのＮＳＣＬＣ試料および腫瘍組織は、複数の部位（ＬＳＧ｜Ｒ｜ＳＮＡＭＰＹＤＬＹ｜ＨＰ）でペプチドＡＫ－０４（ＹＤＬＹ｜ＨＰ）およびＡＫ－０９の有意な切断を共有した。
ＮＡＴ調整培地はまた、特定の切断も生成した。基質存在量の監視により、実験の状況での著しいＡＫ１０ライブラリ分解に対する全体的な傾向が明らかになった。個々の生成物は、図３７Ａ～３７Ｄに示されるある範囲の挙動を示した。図３７Ａ～３７Ｄは、ＮＡＴ調整培地を用いた選択された基質の生成物形成曲線を示す；ＡＫ１０－０１（図３７Ａ、上）、ＡＫ１０－０２（図３７Ａ、下）、ＡＫ１０－０４（図３７Ｂ、上）、およびＡＫ１０－０５（図３７Ｂ、下）、ＡＫ１０－０９（図３７Ｃ、上）、ＡＫ１０－０９酸化ペプチド（図３７Ｃ、下）、およびＡＫ１０－１０（図３７Ｄ）。より良好な性能の基質は、ＡＫ－０１、－０４、－０９、および－１０であり、より弱い基質は、ＡＫ－０２およびＡＫ－０５であった。
最も効率的なＮＡＴ触媒基質の動態分析を図３７Ｅに示す。最も効率的なＮＡＴ基質は、ＡＫ－１０（ＬＳＧＲ｜ＳＤＮＨ）であり、Ｈ２２２８との共有切断であったが、腫瘍試料とは共有されなかった。他の効率的な基質は、複数の部位（ＬＳ｜ＧＲ｜ＳＮＡＭＰＹＤＬＹ｜ＨＰ）でＡＫ－０９（その一部はＨ２２２８および腫瘍と共有された）、およびＡＫ－０４（ＹＤＬＹ｜ＨＰ）であった。
この分析は、正常な隣接組織が、その適合した腫瘍組織と共有される部位特異的酵素活性を含むことを示した。特に、ＹＤＬＹ｜ＨＰ切断は、図３１Ａの右パネルに示される腫瘍調整培地のｉｃｅＬｏｇｏモチーフで明らかである。ＬＳＧＲ｜Ｓモチーフに対する特異性も、図３１Ａの右パネルにおいて、４時間の反応後に生成された腫瘍調整培地ｉｃｅＬｏｇｏにおいて明らかであり、また図３１Ｂの左パネルにおいて、２４時間のインキュベーション時間の場合、ＮＡＴ試料においてさらにより明らかに検出された。
ＭＣ３８は、ペプチドＡＫ－０９およびＡＫ－０２に見られるＬＳＧＲＳモチーフ内のＮＳＣＬＣ試料とのみ切断を共有した。ＨＰＲＱ｜ＡＲモチーフでのＭＣ３８によるＡＫ－１０の切断は、Ｈ２２２８と共有されたが、腫瘍試料と共有されなかったか、またはＨＰＲＱＡ｜Ｒ部位では、ＮＡＴと共有された。ＧＬＳＧ｜ＲＳでのＡＫ－０２のＭＣ３８切断は、図３０の左パネルに示されるそのｉｃｅＬｏｇｏモチーフに見られるように、Ａｒｇに対するその強いＰ１’選好性と一貫していた。
要約すると、表２０は、ＡＫ１０ライブラリペプチドが、酵素切断と一貫する一次動態挙動を有していたという結論を支持する。表２０は、ペプチド基質が、調整培地試料によって切断されたかどうかを示す（はい／いいえ／Ｎ．Ｄ．）。Ｎ．Ｄ．は、それが、調整培地処理試料において、インタクトまたは切断された種として検出されなかったことを示す。
（表２０）
Figure 2022516503000033
Ｅ．プロテオミクス分析
試料中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイにより定量化し、消化反応ごとに５μｇの総タンパク質を使用した。試料を、４Ｍの尿素で変性させ、５６℃で３０分間の反応によって、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した。試料を、室温で１時間、暗所での反応により１０ｍＭでヨードアセトアミド（ＩＡＭ）でアルキル化した。過剰なＩＡＭを５ｍＭのＤＴＴでクエンチし、次いで、反応物を１Ｍの最終尿素に希釈した。試料を、３７℃で一晩、トリプシン対試料の１：５０の質量比で、シーケンシンググレードのブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）で消化した。翌日、得られたペプチド消化試料を、Ｃ１８ジップチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）で脱塩し、次いで、凍結乾燥させた。試料を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために、ＨＰＬＣグレードの水中の０．１％ギ酸中に再懸濁した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチドシーケンシングを、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ（Ｗａｔｅｒｓ）超高性能ＬＣ（ＵＰＬＣ）システムおよびＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ）を備えた、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）で行った。ＥＡＳＹ－Ｓｐｒａｙ ＰｅｐＭａｐ Ｃ１８カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、ＥＳ８００；３μｍビーズサイズ、７５μｍ×１５０ｍｍ）を用いて、逆相クロマトグラフィーを実施した。試料装填中の６００－ｎｌ／分の流量で１４分間、クロマトグラフィーを行い、次いで、０．１％ギ酸中の２～３５％（体積／体積）のアセトニトリルの線形勾配を用いて、９０分にわたってペプチド分離のために４００－ｎｌ／分の流量で行った。ペプチド断片化を、６つの最も強度の高い前駆体イオン上の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）によって行い、最小２，０００カウント、単離幅２．０ｍ／ｚ、最小正規化衝突エネルギー２５であった。
ＭＳピークリストをＭＳＣｏｎｖｅｒｔ６を用いて生成し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒソフトウェアｖ．５．２２．１（ＵＣＳＦ）を使用してデータを分析した。データは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔのヒトまたはマウスライブラリ（２０１７年１１月１日にダウンロード）に対して検索され、それぞれ、合計２０，２４０または１６，９４２件のエントリーがあった。マウス細胞株であるＭＣ３８を、ヒトＮＳＣＬＣ試料とは別個に分析した。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔウシライブラリも検索され、ＦＣＳタンパク質を同定した。デコイデータベース検索アプローチを使用して、偽発見率（ＦＤＲ）を推定し、タンパク質同定を報告するためのスコア閾値を＜１％のＦＤＲを得るために選択した。質量公差を、親イオンについては２０ｐｐｍ、断片イオンについては３０ｐｐｍに設定し、トリプシン特異性を、１つの非特異的開裂および１つの未切断を許容して選択した。Ｃｙｓ上のカルバミドメチル化を、固定修飾として使用した。以下の標準変数修飾を使用した：タンパク質Ｎ末端アセチル化、タンパク質Ｎ末端アセチル化＋酸化、グルタミンからのＮ末端ピログルタミン酸塩形成、Ｍｅｔ損失、およびＭｅｔ酸化。さらに、１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ試験における少なくとも２つの固有のペプチドの最小要件は、複製試料にわたる所与の実験におけるタンパク質同定ごとに必要であった。
相対タンパク質存在量の近似として、スペクトルカウント（ペプチドカウント）でデータを出力した。試験間のタンパク質負荷の潜在的な差異を補正するために、その試験からの総カウントの合計によってペプチドカウントを正規化した。検索はその後ペルセウスで処理され、データはｌｏｇ２で正規化され、次いで、３つの複製のうち少なくとも２つにおいて＞１のペプチドカウントを有していなかった場合、タンパク質を除外した。次いで、欠損値を、正規分布から帰属される乱数により置き換えた。２つの複製セットの間でウェルチのｔ検定を行い、火山型プロットをＲで生成した。
タンパク質同定のいくつかは、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍｍｐ２、７、および１２）、ＭＭＰ阻害剤（Ｔｉｍｐ２）、プロテアソームサブユニット（Ｐｓｍａ）、セルピンおよびシスタチン、カルボキシペプチダーゼ（ＣｐｅおよびＣｐｄ）、カテプシン（Ｃｔｓｄ、ｂ、ｈ、ｚおよびｌ）、アミノペプチダーゼ（Ｒｎｐｅｐ、Ｌａｐ３）、カルパイン（Ｃｐｎｓ）、プロリル指向性ペプチダーゼ（Ｄｐｐ３、Ｘｐｎｐｅｐ１、およびＰｅｐｄ）、セリンプロテアーゼ（Ｐｒｓｓ２３）、トリペプチジル－ペプチダーゼ（Ｔｐｐ１）、Ａｄａｍ１０、ならびにＣａｓｐ３を含む、４７個のプロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤であった。
プロテアーゼおよび阻害剤の存在量は、必ずしも観察された活性に加算されるものではないが、タンパク質同定は、活性データで同定されたモチーフに対する洞察を提供する。カテプシンの存在は、例えば、Ｐ１ ｎＬｅｕ選好性（Ｃｔｓｄ）、またはＰ１ Ａｒｇ、Ｇｌｙ（Ｃｔｓｂ、Ｃｔｓｌ）を説明することができる。また、Ｐ１の基質特異性プロファイルにおける塩基性残基の強い選好性は、ウシトロンビンおよびプラスミンの両方がプロテオミクスデータで検出されたため、凝固カスケード由来のバックグラウンド血清タンパク質にも関連している可能性がある。
ヒトＮＳＣＬＣ関連資料の分析を組み合わせて、試料間の比較を可能にし、これには、Ｈ２２２８細胞株、患者の腫瘍、および正常な隣接組織が含まれた。ここで、プロテオミクス分析により、３つの試料すべてにわたって２２４３個の固有のタンパク質の確信的な同定がもたらされた。
同定のいくつかは、プロテアーゼおよびその阻害剤の類似のリストであった：プロテアソームサブユニット、アミノペプチダーゼＢおよびＮ、カルパインサブユニット、カルボキシペプチダーゼＥおよびＡ、カスパーゼ１，３，６，８、カテプシンＢ、Ｄ、Ｅ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ、およびＺ、ＤＰＰ１、２、および３、ＡＤＡＭ１０、ＭＭＰ１４および９、ＭＭＰ阻害剤１および２、セルピン、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１、ＦＡＰを含むプロリルエンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＴＰＰ１およびＴＰＰ２、ならびに凝固因子および相補タンパク質。
ＮＡＴ試料および腫瘍試料から調整培地で検出されたタンパク質のリストについて、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェアを使用して差異解析の例を行い、２つのセット（ペプチドカウントに基づく）の複製試料間の差異発現の両側ウェルチのｔ検定を可能にした。結果は、図３８に火山型プロットで視覚化され、腫瘍（右側上、セクション２）またはＮＡＴ（左側上、セクション１）で著しく濃縮されたタンパク質がこれらのセクションに存在する。このリストでは、３つの目的のタンパク質を特定した：セルピンＨ１、アルファ－１－アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）、およびマクロファージマンノース受容体１（ＭＲＣ１）。
結論として、ＡＭＳＰ－ＭＳを使用した偏りのない活性プロファイリングにより、塩基性残基に対する全体的な強い選好性を有する各試料の切断プロファイルが明らかになった。ＭＣ３８およびＨ２２２８細胞株は、異なるプロテアーゼ特異性プロファイルを有していたが、一方で同じ患者の腫瘍およびＮＡＴ組織は、類似のプロテアーゼ特異性を共有していたが、差異解析により、腫瘍におけるＰ１ Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙに対して、ＮＡＴ試料におけるＰ１ Ａｒｇ／Ｌｙｓに対するより強い選好性が明らかになった。比較動態解析により、ＹＤＬＹ｜ＨＰおよびＬＳＧＲ｜Ｓを含む、複数の試料にわたって、かつ個々の基質内で、２つの特定のモチーフが確実に切断されたことが示された。マウスＭＣ３８細胞株は、他のヒトＮＳＣＬＣ関連試料とは異なる生物学的起源のものであるが、ＭＣ３８調整培地で特定されたプロテアーゼおよび阻害剤の収集は、ＮＳＣＬＣセットと顕著に類似していた。プロテオミクス分析から特定されたプロテアーゼには、カテプシンを含む観察されたＡＭＳＰ－ＭＳ切断と一貫する特異性を有する候補が含まれる。
実施例１８：カニクイザルにおけるマスクされた抗ＣＴＬＡ４抗体のインビボ評価
実験の第１のセットでは、カニクイザルに、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１０、またはアイソタイプ対照を投与し、薬力学的（ＰＤ）効果を、ＣＤ４＋細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合（％）を測定することによって評価した。実験の第２のセットでは、カニクイザルに、抗体２－６、抗体２－１０、抗体２－１４、抗体２－１６、またはアイソタイプ対照を投与し、薬力学的効果を、ＣＤ４＋細胞中のＫｉ６７＋細胞の割合（％）を測定することによって評価した。
ＰＤ実験の第１および第２のセットからの結果を図２１に示す。親非マスク抗体２－６は、イピリムマブと比較して、ＣＤ４＋細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合の上昇によって示されるように、イピリムマブよりも末梢ＰＤ効果の誘導においてより強力である。抗体２－６のマスクされているが非切断性のバージョンである抗体２－１０は、抗体２－６に関連するＰＤ効果をブロックする。実験の第２セット（実験２）に示されるように、マスクされた切断可能な抗体である抗体２－１４および抗体２－１６は、マスクされていない親抗体２－６と比較して、低減されたＰＤ効果を呈する。
また、試験抗体（ＲＳＶ－ｍ対照、イピリムマブ、抗体２－６、抗体２－１０、抗体２－１４、抗体２－１６、またはＦｃドメインにおけるＳ２３９ＤおよびＩ３３２Ｄ変異を含むイピリムマブのマスクされたバージョン（イピリムマブ－ｍ－マスク））の１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のカニクイザルを使用して薬物動態を評価した。血漿中の各抗体のレベルを測定し、半減期（日）、Ｃｍａｘ（μｇ／ｍＬ）、および曲線下面積（ＡＵＣ）（日×μｇ／ｍＬ）を２つの研究で測定した。
薬物動態研究からの結果を、図２２に示す。図２２は、１４日間の期間にわたる各投与された抗体のレベルを示す。このデータは、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量後のカニクイザルにおいて、抗体２－１４および抗体２－１６が好ましい薬物動態を示すことを実証する。

Claims (40)

  1. ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
    ｂ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
    を含む、マスクされた抗体であって、
    前記マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、前記ＶＬドメインまたは前記ＶＨドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
    マスクされた抗体。
  2. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  3. 前記切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、前記第１のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記アミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記カルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のマスクされた抗体。
  4. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  5. 配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  6. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  7. ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    請求項１に記載のマスクされた抗体。
  8. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載のマスクされた抗体。
  9. 前記ＶＬドメインが、配列番号３２７～３４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖内に含まれ、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３６６～３８０および４２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖内に含まれる、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  10. 配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  11. 前記抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片が、薬剤と複合体化されている、請求項１に記載のマスクされた抗体。
  12. 前記薬剤が、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはＤＮＡ合成阻害剤である、請求項１１に記載のマスクされた抗体。
  13. 前記薬剤が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアマイシン、デュオカルマイシン、インドリノベンゾジアゼピン二量体、またはエキサテカン誘導体Ｄｘｄである、請求項１１に記載のマスクされた抗体。
  14. ａ）ＣＴＬＡ４に特異的に結合する第１の対の軽鎖および重鎖と、
    ｂ）抗原に特異的に結合する第２の対の軽鎖および重鎖と、
    ｃ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
    を含む、マスクされた二重特異性抗体であって、
    前記マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、前記第１の対の前記重鎖または前記軽鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
    マスクされた二重特異性抗体。
  15. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  16. 前記切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、前記第１のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記アミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記カルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  17. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  18. 配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  19. 前記第１の対の前記軽鎖が、ＶＬドメインを含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、ＶＨドメインを含み、
    ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  20. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
    請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  21. 前記第１の対の前記軽鎖が、配列番号３２７～３４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ前記第１の対の前記重鎖が、配列番号３６６～３８０および４２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  22. 配列番号４２１のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３５８および４２２～４３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のマスクされた二重特異性抗体。
  23. ａ）ＣＴＬＡ４に結合するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むリガンド結合ドメインと、
    ｂ）配列番号１～４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと、
    ｃ）膜貫通ドメインと、
    ｄ）シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインと
    を含む、マスクされたキメラ受容体であって、
    前記マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、前記ＶＬドメインまたは前記ＶＨドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端に連結されている、
    マスクされたキメラ受容体。
  24. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４７～８８、４６４～４６９、および４７９～５０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含む、請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  25. 前記切断可能なペプチドが、アミノ末端およびカルボキシ末端を含み、切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、第１のスペーサーリンカーおよび第２のスペーサーリンカーを含み、前記第１のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記アミノ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のスペーサーリンカーが、前記切断可能なペプチドの前記カルボキシ末端に連結されており、かつ配列番号８９～１１２および４１５～４２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  26. 切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号４５４～４６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  27. 配列番号１１３～２３１および４４４～４５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  28. ａ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｂ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｃ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、あるいは
    ｄ）前記ＶＬドメインが、（ｉ）配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ／または前記ＶＨドメインが、（ｉ）配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  29. ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２１のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む、または
    ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号３２２のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号３２４のアミノ酸配列を含む、
    請求項２３に記載のマスクされたキメラ受容体。
  30. 請求項１に記載のマスクされた抗体をコードする、核酸。
  31. 請求項３０に記載の核酸を含む、ベクター。
  32. 請求項３０に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  33. マスクされた抗体を生成する方法であって、前記マスクされた抗体を生成する条件下で、請求項３２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  34. 請求項３３に記載の方法によって生成される、マスクされた抗体。
  35. 請求項１に記載のマスクされた抗体を含む、組成物。
  36. 請求項１に記載のマスクされた抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  37. 請求項１に記載のマスクされた抗体を含む、キット。
  38. 対象において腫瘍性疾患を治療または予防する方法であって、請求項１に記載のマスクされた抗体の有効量を対象に投与することを含む、方法。
  39. ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
    ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
    を含む、マスクされた抗体であって、
    前記マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、前記ＶＬドメインのアミノ末端に連結されており、
    切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号８６のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含み、
    （ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、または
    （ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    マスクされた抗体。
  40. ａ）軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片と、
    ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むマスキングペプチドと
    を含む、マスクされた抗体であって、
    前記マスキングペプチドが、切断可能なペプチドを含むリンカーを介して、前記ＶＬドメインのアミノ末端に連結されており、
    切断可能なペプチドを含む前記リンカーが、配列番号５０のアミノ酸配列を含む切断可能なペプチドを含み、
    （ａ）前記ＶＬドメインが、配列番号４０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号４１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、または
    （ｂ）前記ＶＬドメインが、配列番号４３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号４３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号４４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、かつ前記ＶＨドメインが、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号４４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む、
    マスクされた抗体。
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