CN113490688A - 可活化的被掩蔽的抗ctla4结合蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗体、双特异性抗体和嵌合受体)以及其在治疗和预防癌症中的用途，以及包含所述可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的组合物和试剂盒。

Description

可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质
相关申请案的交叉参考
本申请案要求2018年12月26日提交的美国临时申请案62/785,111的优先权，其内容以全文引用的形式并入本文中。
以ASCII文本文件形式提交的序列表
以下以ASCII文本文件形式提交的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：737762001640.txt，创建日期：2019年12月23日，大小：518KB)。
技术领域
本发明涉及可活化的被掩蔽的抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体)和其相关使用方法。
背景技术
在美国，癌症是排名第二的主要死亡原因，引起比随后的五种主要原因(慢性呼吸道疾病、中风、事故、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)和糖尿病)更多的死亡。尽管已经取得长足进步，尤其在靶向疗法方面，但这一领域中仍有大量工作要做。免疫疗法和这一领域的分支，免疫肿瘤学，正在产生用于治疗恶性病的可行且令人振奋的治疗选项。具体地说，现认识到癌症的一个特点是免疫逃避，且已进行大量工作以发现目标且研发出针对这些目标的疗法，以便重新激活免疫系统从而识别和治疗癌症。实际上，抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)抗体，即伊派利单抗(ipilimumab)，已实现罹患III/IV期恶性黑素瘤的患者的长期存活。伊派利单抗是免疫检查点拮抗剂，其通过阻断CTLA4来中断T细胞抑制，且可能引起T调节性细胞(Treg)的消耗。[Korman，A.等人，2005.《肿瘤免疫疗法：抗CTLA4抗体的临床前和临床活性(Tumor immunotherapy：preclinical and clinicalactivity of anti-CTLA4 antibodies)》.《对研究药物的当前观点(Current Opinion inInvestigational Drugs)》6：582-591；Quezada等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》，206(8)：1717-1725，2009；Selby等人，《癌症免疫研究(Cancer Immunol Res.)》，1(1)；32-42，2013。]不幸的是，伊派利单抗引起T细胞依赖性免疫反应的全身性(非肿瘤特异性)活化，其引起可危及生命且通常限制剂量和治疗持续时间的免疫相关副作用(Weber，J.S.等人，2008.《转移性黑素瘤患者中的伊派利单抗的I/II期研究(Phase I/II study ofipilimumab for patients with metastatic melanoma)》.《临床肿瘤学杂志(JournalofClinical Oncology)》26：5950-5956)。这些副作用包括小肠结肠炎、皮炎、垂体炎、葡萄膜炎、肝炎、肾炎和死亡。小肠结肠炎是最常见的主要毒性(影响约20％的患者)。与免疫介导的不良反应相关的严重安全性风险促使FDA批准对伊派利单抗实施风险评估和缓解策略(Risk Evaluation and Mitigation Strategy；REMS)。最近，已证实当与单独的伊派利单抗相比时，伊派利单抗和靶向PD1的第二免疫检查点调节剂(例如，尼沃单抗(nivolumab))的共同给药可显著提高黑素瘤的免疫疗法的功效。然而，这一增益与3/4级副作用的发生率增加相关联，所述副作用影响超过50％的接受组合治疗的患者(Wolchok，J.D.等人，2013.《晚期黑素瘤中的尼沃单抗加伊派利单抗(Nivolumabplus Ipilimumab in AdvancedMelanoma)》.《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》)。
这些结果说明需要研发可有效靶向肿瘤而不引起与全身性免疫活化相关联的副作用的抗CTLA4蛋白质治疗剂。本文中提供用于解决这一需求的抗CTLA结合蛋白质、其组合物以及其使用方法。
本文中所引用的所有参考文献，包含专利申请案、专利案公开案和科学文献，都以全文引用的方式并入本文中，就像各个参考文献特别地且单独地被指示为以引用的方式并入一般。
发明内容
本文中提供可活化的被掩蔽的抗细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)结合蛋白质、包含其的组合物和其使用方法。
本文中提供被掩蔽的抗体，其含有结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段含有第一链和第二链，和包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施例中，第一链是轻链；且第二链是重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段含有两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是或包含轻链可变结构域；且第二链是或包含重链可变结构域。在任何这类实施例中的一些中，抗原结合片段是dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。在任何这类实施例中的一些中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。在任何这类实施例中的一些中，包含可裂解肽的连接子含有间隔连接子和可裂解肽。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子含有选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施例中的一些中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
在任何这类实施例中的一些中，按N至C端或C至N端方向，被掩蔽的抗体含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在任何这类实施例中的一些中，被掩蔽的抗体含有掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；且被掩蔽的抗体含有可裂解肽与结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段之间的间隔连接子。
在任何这类实施例中的一些中，抗体是鼠类抗体。在任何这类实施例中的一些中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施例中的一些中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何这类实施例中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和I332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；G236A、S239D和I332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366或380-397的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：366的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQID NO：421的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。
在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。在任何这类实施例中的一些中，抗体或其抗原结合片段与药剂结合。在任何这类实施例中的一些中，药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何这类实施例中的一些中，药剂是类美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吲哚啉并苯并二氮杂卓(indolinobenzodiazepine)二聚体或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
在任何这类实施例中的一些中，本文中所提供的被掩蔽的抗体呈现约20至约10,000的最佳遮挡率。在另一实施例中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施例中，最佳遮挡率是约80至约100。
在任何这类实施例中的一些中，被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
本文中还提供被掩蔽的双特异性抗体，其含有特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链、特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链以及包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至第一对的轻链或重链的氨基端或羧基端。在一些实施例中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。在任何这类实施例中的一些中，包含可裂解肽的连接子含有间隔连接子和可裂解肽。
在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端或C端。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子含有选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施例中的一些中，所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
在任何这类实施例中的一些中，按N至C端或C至N端方向，第一对的轻链或重链含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)轻链或重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；且第一对含有可裂解肽与轻链或重链之间的间隔连接子。
在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体是鼠类抗体。在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在任何这类实施例中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，如S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和I332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；G236A、S239D和I332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区含有(i)包含SEQ ID NO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ IDNO：321的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366或380-397的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：366的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：380的氨基酸序列的重链。在任何这类实施例中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。在任何这类实施例中的一些中，双特异性抗体与药剂结合。在任何这类实施例中的一些中，药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何这类实施例中的一些中，药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
在任何这类实施例中的一些中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体中的第一对和第二对各自呈现最佳遮挡率，所述最佳遮挡率可以彼此相同或不同。在一些实施例中，最佳遮挡率是约20至约10,000。在另一实施例中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施例中，最佳遮挡率是约80至约100。
本文中还提供被掩蔽的嵌合受体，其含有结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列、跨膜结构域；和细胞内信号传导结构域，其包含信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至配体结合结构域的第一链或第二链的氨基端或羧基端。
在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域；且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。在任何这类实施例中的一些中，包含可裂解肽的连接子含有间隔连接子和可裂解肽。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端或C端。在任何这类实施例中的一些中，间隔连接子含有选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施例中的一些中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在任何这类实施例中的一些中，按N至C端或C至N端方向，配体结合结构域的第一链或第二链含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)第一链或第二链。在任何这类实施例中的一些中，配体结合结构域含有掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；且配体结合结构域含有可裂解肽与第一链或第二链之间的间隔连接子。
在任何这类实施例中的一些中配体结合结构域含有第一链和第二链，其中第一链含有(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链含有(i)包含SEQ ID NO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ IDNO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施例中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施例中的一些中，第一链含有SEQ ID NO：232的氨基酸序列；和/或第二链含有SEQ ID NO：233的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，第一链含有选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列；和/或第二链含有选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，第一链包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，第一链包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。
在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。在任何这类实施例中的一些中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在任何这类实施例中的一些中，本文中所提供的被掩蔽的嵌合受体呈现约20至约10,000的最佳遮挡率。在另一实施例中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施例中，最佳遮挡率是约80至约100。
还提供编码根据前述实施例中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的核酸。还提供包含根据前述实施例的核酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体。还提供包含前述核酸实施例的宿主细胞。
还提供用于制备被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的方法，其包含在产生所述被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的条件下培养前述宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。在一些实施例中，其中宿主细胞过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。在一些实施例中，宿主细胞还过表达高尔基体(Golgi)μ-甘露糖苷酶II(ManII)。任何这类实施例中的一些还包括回收由宿主细胞产生的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。在一些实施例中，通过上述方法产生被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。
还提供一种组合物，其含有根据前述实施例中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。一些实施例涵盖包含根据前述实施例的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的组合物。在一些实施例中，组合物是医药组合物。
还提供一种试剂盒，其含有根据前述实施例中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体、被掩蔽的嵌合受体或组合物。
还提供用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据前述实施例中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体、被掩蔽的嵌合受体或组合物。在一个实施例中，赘生性疾病是癌症。在一些实施例中，癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
应理解，本文中所描述的各种实施例的一种、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它实施例。本发明的这些和其它方面将变得对所属领域的技术人员显而易见。通过以下详细说明进一步描述本发明的这些和其它实施例。
附图说明
图1A和1B是展示由掩蔽肽进行的抗CTLA4抗体遮挡的体外分析的一系列图。进行表面等离子共振(SPR)以检验9D9抗体(配体)与掩蔽肽CNLIVEGHC(分析物)之间的A)动力学和B)亲和力。在37℃下，在0.1至50μM的递增浓度的2倍连续稀释物中操作分析物。标绘减去参考物的反应。进行三次SPR且展示来自一个实验的代表性迹线。
图2A-2C是展示被掩蔽的鼠类抗CTLA4抗体的蛋白酶活化的一系列图。图2A)与亲本抗CTLA4抗体(9D9，实心圆)相比，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体与鼠类CTLA4-Fc(被掩蔽的9D9，实心正方形)的结合低90倍。可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的蛋白酶活化完全恢复与鼠类CTLA4-Fc(被活化的蛋白酶，星号)的结合，达到与亲本抗CTLA4抗体类似的水平。x轴指示所测试的抗体量。图2B)与亲本抗CTLA4抗体(9D9，实心圆)相比，可活化被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9，实心倒三角形)和不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体(NC被掩蔽的9D9，空心正方形)与鼠类CTLA4的结合分别低约156倍和约218倍。x轴指示所测试的抗体量。图2C)在不存在或存在重组MMP2的情况下，通过ELISA测定可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)、不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体(NC被掩蔽的9D9)和亲本抗CTLA4抗体(9D9)的EC50。每个组进行至少三次且报告平均EC50+/-SE。
图3A-3D是展示蛋白酶活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)的减小肿瘤体积的功效与亲本抗CTLA4抗体(9D9 IgG2a)的功效相等的一系列图。将MC38同基因肿瘤植入C57BI/6小鼠中。在肿瘤大小达到60-120mm3后，向小鼠腹膜内给予单次200μg剂量的图3A)muIgG2a对照抗体、图3B)具有IgG2a同型的亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a)、图3C)可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)，在MC38鼠类肿瘤模型中，与用3B)亲本抗CTLA4抗体(9D9 IgG2a)或3A)muIgG2a对照抗体处理的小鼠相比，图3D)人类化IgG1抗CTLA4抗体1(抗体1)显示类似的体内减小肿瘤体积的功效。
图4是展示肿瘤浸润中由蛋白酶活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)和亲本抗CTLA4抗体(9D9 IgG2a)进行的等效调节性T淋巴细胞(Treg)消耗的图。对照指示用muIgG2a对照抗体进行的处理。
图5A和5B是展示蛋白酶活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)显著减少被处理的小鼠的脾中的A)CD4+T细胞和B)CD8+T细胞的增殖的一系列图。箭头指向使用亲本抗CTLA4抗体(9D9 IgG2a)和蛋白酶活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)的处理组之间的平均值。
图6A-6D是展示被掩蔽的抗CTLA4抗体的功效和安全性研究的一系列图。在携带MC38肿瘤的C57BL/6小鼠(n＝10)中检验图6A)同型对照抗体(IgG2a对照)、图6B)不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体(NC被掩蔽的9D9)、图6C)亲本抗CTLA4抗体(9D9)和图6D)可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)的肿瘤抑制活性。
图7A和7B是展示在用同型对照抗体(IgG2a对照)、亲本抗CTLA4抗体(9D9)、可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)和不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体(NC被掩蔽的9D9)处理的小鼠(n＝6)的脾中，A)肿瘤中的调节性T淋巴细胞(Treg)的消耗和B)Treg增殖的一系列图。
图8是展示被掩蔽的人类化抗CTLA4抗体1的蛋白酶活化的图。与亲本人类化抗CTLA4抗体1(亲本，空心圆)相比，被掩蔽的人类化抗CTLA4抗体1呈现较低的与人类CTLA4-Fc(被掩蔽的，实心正方形)的结合。被掩蔽的人类化抗CTLA4抗体的蛋白酶活化完全恢复与人类CTLA4-Fc(蛋白酶活化，星号)的结合，达到与亲本人类化抗CTLA4抗体1类似的水平。x轴指示所测试的抗体量。y轴上的分子的RLU/亲本的RLU指示与亲本人类化抗CTLA4抗体1相比，相关光单位的分数。
图9A和9B是展示在某一抗体浓度范围内，未被掩蔽的抗CTLA4抗体与人类CTLA4-Fc的结合的图。图9A展示在某一抗体浓度范围内，抗体1的各形式(抗体1-1和抗体1-2)与人类CTLA4-Fc的结合，其显示所展示的抗体的类似结合。图9B展示在某一抗体浓度范围内，抗体2的各形式(抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5)与人类CTLA4-Fc的结合，其显示所展示的抗体的类似结合。
图10A和10B是展示在某一抗体浓度范围内，被掩蔽的抗CTLA4抗体与人类CTLA4-Fc的结合的图。图10A展示在不存在蛋白酶活化的情况下由被掩蔽的抗体进行的结合。图10B展示在蛋白酶活化后由被掩蔽的抗体进行的结合。抗体2-6是抗体2-7、抗体2-8、抗体2-9、抗体2-10、抗体2-11、抗体2-12和抗体2-13的未被掩蔽的亲本抗体。图10A和10B展示在蛋白酶活化后，被掩蔽的抗体显示与未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6类似的结合特征。
图11A-11H展示含有各种可裂解的肽序列的抗体2的被掩蔽的形式的雷达图。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列。使用雷达图描绘图11A-11H中展示的各种抗体的由雷达图上展示的各种蛋白酶进行的活化，其中在0(未活化)至1.0(完全活化)范围内描绘活化。图11I-11M描绘在健康小鼠的血浆中(图11I和11J)以及在携带MC38肿瘤的小鼠的血浆中(图11K-11M)，用所选择的抗体进行的蛋白酶裂解的SDSP-PAGE蛋白质印迹分析(Westernblot analysis)的结果。
图12A和12B是描绘在存在或不存在蛋白酶活化的情况下，被掩蔽的抗CTLA4抗体与人类CTLA4-Fc的结合的图。在存在蛋白酶的情况下，被掩蔽的抗体是由可裂解肽的蛋白酶裂解″活化″。图12A包括不可活化的同型对照以及由于可裂解肽序列不可裂解而不可活化的被掩蔽的抗体(抗体2-15)作为对照物。图12B包括同型对照以及由于可裂解肽序列不可裂解而不可活化的被掩蔽的抗体(抗体2-10)作为对照物。抗体2-14的活化完全恢复其与人类CTLA4-Fc的结合，达到与未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6类似的水平(图12B)。
图13A-13D是描绘抗体1和抗体2的未被掩蔽的形式的IL-2水平(pg/mL)(图13A和13C)或IL-2水平的倍数变化(图13B和13D)的图，如使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)分析法测定。使用SEB分析法，测试抗体1的未被掩蔽的形式(抗体1-1和1-2)(图13A和13B)和抗体2的未被掩蔽的形式(抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5)(图13C和13D)的促进周边单核细胞的IL-2产生的能力。与不含抗体的对照相比，抗体1和抗体2的所有所测试的形式都显示增加IL-2水平的能力(图13A和13C)。
图14A-14D是描绘抗体2的被掩蔽的形式的IL-2水平(pg/mL)(图14A和14C)或IL-2水平的倍数变化(图14B和14D)的图，如使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)分析法测定。测试抗体2的未被掩蔽的形式(抗体2-6)和抗体2-6的被掩蔽的形式(抗体2-7、抗体2-8、抗体2-9、抗体2-10、抗体2-11、抗体2-12和抗体2-13)。图14A和14B描绘在非活化状态下(即，未暴露于蛋白酶)，抗体对IL-2水平(图14A)和IL-2水平的倍数变化(图14B)的影响。未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6显示显著增加IL-2水平的能力，且仅一种被掩蔽的抗体(抗体2-12)展示IL-2水平的显著增加，但水平明显低于抗体2-6(图14A和14B)。图14C和14D描绘在活化状态下(即，在暴露于蛋白酶后)，抗体对IL-2水平(图14C)和IL-2水平的倍数变化(图14D)的影响。图14C和14D展示对蛋白酶的暴露可以修复抗体2-7、抗体2-8和抗体2-9促进IL-2产生的能力，达到与未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6类似的水平。
图15A-15D描绘健康小鼠的血浆中的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内裂解程度，如由蛋白质印迹分析所展示。在抗体的腹膜内给药后的第2、4和7天展示健康小鼠中的抗体2的被掩蔽的形式(抗体2-14、抗体2-19和抗体2-20)的体内裂解。使用在体外，在存在或不存在蛋白酶的情况下处理被掩蔽的抗体的标准样品作为裂解对照。抗体2-14(图15A)和抗体2-20(图15C)都在体内活化。图15B展示不存在抗体2-19的活化。图15D中展示从第2天至第7天，抗体2-14和抗体2-20的活化百分比的增加。
图16A-16D描绘携带肿瘤的小鼠的血浆中的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内裂解程度，如由蛋白质印迹分析所展示。在抗体的腹膜内给药后的第2、4和7天展示携带MC38肿瘤的小鼠中的抗体2的被掩蔽的形式(抗体2-14、抗体2-19和抗体2-20)的体内裂解。使用在体外，在存在或不存在蛋白酶的情况下处理被掩蔽的抗体的标准样品作为裂解对照。抗体2-14(图16A)和抗体2-20(图16C)都在体内活化。图16B展示不存在抗体2-19的活化。图16D中展示从第2天至第7天，抗体2-14和抗体2-20的活化百分比的增加。与健康的未携带肿瘤的小鼠相比，携带MC38肿瘤的小鼠中抗体2-14的活化百分比明显更大，如通过2因素ANOVA(经调整的P值＝0.0113)测定(图16D)。
图17是展示在被掩蔽的状态下和在作为预先暴露于蛋白酶的结果的″被活化的″状态下，被掩蔽的抗CTLA4抗体促进ADCC活性的能力的图，如使用ADCC报导子生物分析法测定。图17描绘由未被掩蔽的亲本抗体(抗体2-6)和抗体2-6的被掩蔽的版本(抗体2-14和抗体2-15)实现的报导子活化程度。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。还测试同型对照。将预先暴露于蛋白酶的抗体描绘为″被活化的″。当在未预先暴露于蛋白酶的情况下测试时，与未被掩蔽的亲本抗体(抗体2-6)相比，被掩蔽的抗体，即抗体2-14和抗体2-15显示降低的报导子活化(图17)。不可由蛋白酶活化的抗体2-15的降低的报导子活化未因预先暴露于蛋白酶而得到修复(图17)。可由蛋白酶活化的抗体2-14的报导子活化被修复到与由未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6所诱导的活化类似的水平(图17)。
图18A和18B是描绘抗CTLA4抗体阻断CTLA4与其配体，即CD80和CD86的相互作用的能力的图，如使用CTLA4阻断生物分析法测定。图18A描绘抗体2的未被掩蔽的形式(抗体2-2)和抗体2的被掩蔽的形式(抗体2-14)阻断CTLA4与其配体的结合的能力。在被掩蔽的状态(即，未预先暴露于蛋白酶)和由预先暴露于蛋白酶而引起的″被活化的″状态下测试抗体2-14。作为比较，还使用同型对照进行分析法且还在不存在抗体的情况下运行分析法(即，作为无抗体的对照物)。图18A展示当由于不存在蛋白酶而呈被掩蔽的(未被活化的)形式时，抗体2-14未显示有效阻断CTLA4与其配体的结合的能力。对高于无抗体的对照物的倍数变化的分析未显示在阻断CTLA4与其配体的结合方面，呈被掩蔽的(未被活化的)形式的抗体2-14的能力与同型对照的能力之间的显著差异(图18B)。然而，图18A展示当抗体2-14由于预先暴露于蛋白酶而呈″被活化的″形式时，其在一系列浓度下显示有效阻断CTLA4与其配体的结合的能力。″被活化的″抗体2-14的阻断CTLA4与其配体结合的能力与未被掩蔽的抗体2-2的能力类似(图18A和18B)。对高于无抗体的对照物的倍数变化的分析未显示在阻断CTLA4与其配体的结合方面，″被活化的″抗体2-14与未被掩蔽的抗体2-2的能力之间的显著差异(″ns″)(图18B)。
图19A-19D描绘评估表达标记物的CD45+细胞的比例的免疫表型研究的结果，所述细胞包括以下：CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+。图19E和19F提供比较所测试的抗体的统计数据(第1组：IgG，第2组：抗体2-1；第3组：抗体2-10；第4组：伊派利单抗；第5组：伊派利单抗-aFuc)。
图20A和20B描绘展示在20μg、7μg或2μg测试抗体的单次注射给药之后随时间推移的肿瘤体积的图。
图21描绘展示两组实验(实验1和实验2)的结果的图，所述实验通过评估在抗体2-6、抗体2-10、抗体2-14、抗体2-16或同型对照的给药之后，全部CD4+细胞中的Ki67+细胞的百分比来评估在食蟹猕猴中的药效学作用。
图22描绘评估在给予以下测试抗体中的一种之后，在食蟹猕猴中的药物动力学的实验的结果：RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-10、抗体2-14、抗体2-16或被掩蔽的伊派利单抗-m。图22描绘展示在14天时段内，每种所给予的抗体的水平(μg/mL)的图。
图23A描绘具有在给药后第5天，对周边血液中的CD4+Ki67+细胞(左侧)和CD4+ICOS+细胞(右侧)的百分比的功效研究的结果的图。图23B描绘展示肿瘤重量(左侧)和CD8/Treg比率(右侧)的图，如在用10mg/kg(RSV-m对照物)或3mg/kg(伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-14、抗体2-15)处理的小鼠中在第7天评估。图23C描绘展示在小鼠中，在给予RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-14或抗体2-15之后，肿瘤微环境中的调节性T细胞(左侧)和肿瘤微环境中的CD8+T细胞(右侧)的图。图23D描绘展示在给予0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的包括RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15的抗体之后，随时间推移的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。
图24A描绘使用MCA205纤维肉瘤细胞的SDS-PAGE蛋白质印迹分析的结果，所述分析评估血浆、肾脏、肝脏和肿瘤组织中的抗体2-6、抗体2-14、抗体2-16和抗体2-10的裂解。图24B描绘使用MB49细胞的SDS-PAGE蛋白质印迹分析的结果，所述分析评估血浆、肾脏和肝脏组织中的抗体2-6、抗体2-14、抗体2-16和抗体2-10的裂解。图24C描绘使用MC38细胞的SDS-PAGE蛋白质印迹分析的结果，所述分析评估血浆、肾脏、肝脏和肿瘤组织中的抗体2-6、抗体2-14、抗体2-16和抗体2-10的裂解。图24D描绘评估裂解的使用MC38细胞的SDS-PAGE蛋白质印迹分析的结果，且提供所选择的样品的裂解百分比。基于密度强度计算裂解百分比(裂解％＝上部谱带/(下部谱带+上部谱带))。图24E描绘展示每种抗体与CTLA4之间的结合的图，其中每种抗体是在向携带MB49的B-hCTLA4转基因小鼠给药之后从血浆、肾脏、肝脏或脾分离。图24F描绘由一组例示性蛋白酶进行的可裂解肽底物的体外裂解的热图。
图25A-25F描绘使用所标识的小鼠模型(C57/B16-wt、MC38-wt、MC38-hCTLA4、MB49-wt、MCA205-wt、B16-wt)的条件培养基中的裂解的发生率的雷达图。用如所指示的组织，如脾、肝脏、肾脏、血浆或肿瘤调节培养基。
图26A和26B描绘使用抗体2-14进行的健康食蟹猕猴的血浆中的体内裂解研究的结果。如图26A中所示，使用毛细电泳法(CE)和质谱(MS)计算抗体2-14的裂解，如所指示。图26B描绘展示在1小时、24小时和72小时，完整的抗体2-14与其裂解产物的比例的图。图26C描绘使用抗体2-16进行的健康食蟹猕猴的血浆中的体内裂解研究的结果，包括使用毛细电泳法(CE)和质谱(MS)计算的裂解的评估，如所指示。
图27A和27B描绘使用由人类肺或结肠肿瘤样品调节的培养基的离体裂解研究的结果。
图28A-28D描绘使用质谱和结肠肿瘤上清液的对裂解的分子百分比(％)的分析的结果(抗体2-14，图28A；抗体2-15，图28B；抗体2-16，图28C；抗体2-10，图28D)。图28E描绘使用抗体2-6、抗体2-14、抗体2-15、抗体2-10、抗体2-16和被掩蔽的伊派利单抗-m进行的ELISA分析法的结果，其中在结肠肿瘤条件培养基(colon2 4sept结肠肿瘤样品)或作为对照的RPMI中培养每种所测试的抗体。
图29描绘使用LDH释放分析法测量的细胞毒性，所述分析法是在用所指示的细胞系或肿瘤/NAT组织调节的无血清或补充有胎牛血清(FCS)的培养基中完成。
图30以iceLogo图形式描绘MC38和H2228细胞系的底物裂解。
图31A和31B以iceLogo形式描绘NAT和肿瘤(TUM)组织的底物裂解。图31C以热图形式描绘P4-P4’位置处的Z分数的差异，以突出有利于NAT或肿瘤特异性裂解的残基。正亮氨酸(n)是库中Met的代表。图31D以热图形式描绘与NAT或肿瘤样品相比，P4-P4’位置处的Z分数的差异，以突出有利于H2228特异性裂解的残基。正亮氨酸(n)是库中Met的代表。
图32A和32B描绘在MC38条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图32A，左侧)、AK10-02(图32A，右侧)；AK10-04(图32B，左侧)和AK10-05(图32B，右侧)。
图33描绘来自与AK10库肽的MC38AMSP-MS反应的主要裂解产物的相关效率。
图34A和34B描绘在H2228条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图34A，左上部)、AK10-02(图34A，右上部)、AK10-04(图34A，下部)、AK10-09(图34B，左侧)和AK10-10(图34B，右侧)。
图35描绘通过AMSP-MS监测的由H2228条件培养基实现的最高底物裂解以及其相关效率。
图36A-36C描绘在肿瘤条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图36A，左上部)、AK10-02(图36A，中间上部)、AK10-03(图36A，底部)、AK10-04(图36B，左上部)和AK10-05(图36B，右上部)、AK10-09(图36B，底部)、AK10-09氧化的肽(图36C，左侧)和AK10-10(图36C，右侧)。图36D描绘通过AMSP-MS进行的由肿瘤条件培养基实现的最高底物裂解以及其相关效率。
图37A-37D描绘在NAT条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图37A，顶部)、AK10-02(图37A，底部)、AK10-04(图37B，顶部)和AK10-05(图37B，底部)、AK10-09(图37C，顶部)、AK10-09氧化肽(图37C，底部)和AK10-10(图37D)。图37E描绘在肽的AK10库情况下，由NAT条件培养基引起的最高裂解以及相关效率。
图38以火山图形式描绘肿瘤和NAT组织样品中的以差异方式表达的蛋白质。统计显著蛋白质的阈值倍数差≥2倍变化。这些切片中存在肿瘤(右上侧，第2部分)或NAT(左上侧，第1部分)中显著富集的蛋白质。
具体实施方式
如检查点抑制剂等治疗剂在癌症中显示前所未有的反应，但其用途受到免疫相关不良事件(irAE)和其它毒性(例如，垂体炎)限制。本文中提供蛋白质治疗剂，其在目标位点处，例如在肿瘤微环境中，在由蛋白酶活化之后特异性结合CTLA4，以实现增加的持久反应率和显著改良的安全性概况。本文中所提供的蛋白质治疗剂被工程改造成通过利用癌症的一个特点，即高局部活性蛋白酶浓度来使药理学活性精确靶向肿瘤微环境。使用肿瘤微环境的这一特征将全身性惰性分子转化成局部活性药物。药物在肿瘤微环境中活化可以显著降低与以活性形式给予受试者的药物相关联的全身毒性。
I.定义.
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于具体组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例，并且不打算作为限制。除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式″一(a/an)″和″所述″包括多个指示物。因此，举例来说，对″抗体″的参考任选地包括两种或更多种这类抗体的组合等。
如本文中所使用，术语″约″是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到″约″一个值或参数包括(且描述)针对所述值或参数本身的实施例。
应理解，本文中所描述的本发明的各方面和实施例包括″包含″各方面和实施例、″由各方面和实施例组成″和″基本上由各方面和实施例组成″。
术语″抗体″包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。在本文中，术语″免疫球蛋白″(Ig)可以与″抗体″互换地使用。
碱性4链抗体单元是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。IgM抗体由5个碱性异四聚体单元和称为J链的其它多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个碱性4链单元，所述单元可以聚合以与J链组合形成多价集合物。在IgG的情况下，4链单元通常是约150,000道尔顿(dalton)。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，而视H链同型而定，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。各H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。各H链在N端具有可变结构域(VH)，接着是针对α和γ链中的每一个的三个恒定结构域(CH)以及针对μ和ε同型的四个CH结构域。各L链在N端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对准且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。相信具体的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对共同形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如《基础临床免疫学(Basic andClinical Immunology)》，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以指定为不同种类或同型。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为α、δ、ε、γ和的μ重链。基于CH序列和功能中的相对较小差异而将γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本发明。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z标示的变体。
″被分离的″抗体是已从其生产环境的组分鉴别、分离和/或回收(例如，天然地或以重组方式)的抗体。在一些实施例中，被分离的多肽与其生产环境中的所有其它组分无关。其生产环境中的污染物组分(如由重组转染细胞产生)是将通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，多肽被纯化：(1)达到大于抗体的95重量％，如通过例如劳里法(Lowry method)测定，并且在一些实施例中，达到大于99重量％；(1)通过使用旋杯式测序仪，达到足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用考马斯(Coomassie)蓝或银染色，在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE，达到均质。被分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备被分离的多肽。
如本文中所使用，术语″单克隆抗体″是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，组成所述群体的各个抗体是相同的。在一些实施例中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有C端裂解。举例来说，在重链和/或轻链的C端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基裂解。在一些实施例中，C端裂解从重链去除C端赖氨酸。在一些实施例中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有N端裂解。举例来说，在重链和/或轻链的N端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基裂解。在一些实施例中，可以通过重组技术来制备单克隆抗体的截短形式。在一些实施例中，单克隆抗体针对单一抗原位点具有高特异性。在一些实施例中，单克隆抗体针对多个抗原位点具有高特异性(如双特异性抗体或多特异性抗体)。修饰语″单克隆″表明抗体的特性是由基本同源的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括例如融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现技术以及用于在具有一部分或所有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人类或人类样抗体的技术。
术语″裸抗体″是指未与细胞毒性部分或放射性标记结合的抗体。
术语″亲本抗体″是指在修饰之前的抗体，所述修饰是如用掩蔽肽掩蔽抗体。
术语″被掩蔽的抗体″是指被修饰成包含掩蔽肽且在一些实施例中，允许在优选环境中活化或去除掩蔽肽的其它组分的抗体。
″抗体-药物结合物″或″ADC″是指与一种或多种异源分子结合的抗体，所述异源分子包括(但不限于)细胞毒性剂。
术语″全长抗体″、″完整抗体″或″完全抗体″可以互换地用于指相对于抗体片段，呈基本上完整形式的抗体。具体地说，完全抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是原生序列恒定结构域(例如，人类原生序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应功能。
″抗体片段″包含完整抗体的一部分、完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗原结合抗体片段的实例包括结构域抗体(dAb)、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线抗体(参见美国专利案第5,641,870号，实例2；Zapata等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。单重链抗体或单轻链抗体可以被工程改造，或在重链的情况下，可以从被工程改造成产生单重链分子的骆驼、鲨鱼、库或小鼠分离。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为″Fab″片段，以及残余的″Fc″片段，此名称反映易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链和H链的可变区结构域(VH)以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。各Fab片段相对于抗原结合是单价的，即，其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大型F(ab′)2片段，所述片段大致对应于两个二硫键连接的具有不同的抗原结合活性且仍能够与抗原交联的Fab片段。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，CH1结构域的羧基端具有少数额外残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。在本文中，Fab′-SH是关于Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初是以其间具有铰链半胱氨酸的Fab′片段对形式产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应功能是由Fc区中的序列和聚糖决定，所述区域也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
″Fv″是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段是由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠得到六个高变环(H链和L链各3个环)，这些高变环提供用于抗原结合的氨基酸残基且使抗体具有抗原结合特异性。然而，尽管单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原具有特异性的HVR)具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。
″单链Fv″，又简称为″sFv″或″scFv″，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，sFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽连接子，其使得sFv能够形成抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
本发明的抗体的″功能片段″包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体中保留或具有被修饰的FcR结合能力的Fv区域。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的线抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。
本文中的单克隆抗体特定地包括″嵌合″抗体(免疫球蛋白)，其中重和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，以及这类抗体的片段，只要其呈现所需生物活性即可(美国专利案第4,816,567号；Morrison等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，81：6851-6855(1984))。在本文中，相关嵌合抗体包括
Figure BDA0003230734600000321
抗体，其中抗体的抗原结合区是来源于通过例如用相关抗原对猕猴进行免疫接种而产生的抗体。如本文中所使用，″人类化抗体″用作″嵌合抗体″的子集。
非人类(例如，鼠类)抗体的″人类化″形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人类化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基由来自非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人类灵长类动物的HVR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残基由相应的非人类残基置换。此外，人类化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人类化抗体将包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环，且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的FR区，但FR区可以包括一个或多个改良抗体性能(如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的单独FR残基取代。在一些实施例中，FR中的这些氨基酸取代的数目在H链中不超过6个，且在L链中不超过3个。人类化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的至少一部分。关于其它细节，参见例如Jones等人，《自然(Nature)》321：522-525(1986)；Reichmann等人，《自然》332：323-329(1988)；以及Presta，《结构生物学新观点(Curr.Op.Struct.Biol.)》2：593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton，《过敏性哮喘与免疫学年鉴(Ann.Allergy，Asthma&Immunol.)》1：105-115(1998)；Harris，《生物化学学会学报(Biochem.Soc.Transactions)》23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，《生物技术新观点(Curr.Op.Biotech.)》5：428-433(1994)；以及美国专利案第6,982,321号和第7,087,409号。在一些实施例中，人类化抗体是针对单一抗原位点。在一些实施例中，人类化抗体是针对多个抗原位点。替代性人类化方法描述于美国专利案第7,981,843号和美国专利申请公开案第2006/0134098号中。
抗体的″可变区″或″可变结构域″是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。因此，如本文中所使用的术语″可变区″和″可变结构域″可以互换地使用。重链和轻链的可变结构域可以分别称为″VH″和″VL″。这些结构域通常是抗体中可变性最高的部分(相对于相同类别的其它抗体)且含有抗原结合位点。重链和轻链的可变结构域可以使用任何可用的方法或编号方案确定，且可以包括如例如WO 2018/207701中所描述的可变结构域，其内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，重链和/或轻链的可变结构域可能不具有可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而包括于所述可变结构域的描述中。在一些实施例中，重链和/或轻链的可变结构域可以包括可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而不包括于所述可变结构域的描述中。
当在本文中使用时，术语″高变区″、″HVR″或″HV″是指抗体可变结构域中在序列方面具有高可变性和/或形成以结构方式定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。在原生抗体中，H3和L3显示六HVR中最高的多样性，且尤其相信H3在赋予抗体优良的特异性方面起到独特作用。参见例如Xu等人，《免疫学(Immunity)》13：37-45(2000)；Johnson和Wu，《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》248：1-25(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是具有功能性且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人，《自然》363：446-448(1993)和Sheriff等人，《自然结构生物学(NatureStruct.Biol.)》3：733-736(1996)。
正在使用许多HVR描述且涵盖于本文中。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是基于序列可变性且是最常用的(Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》，第5版，公共卫生服务部(Public HealthService)，国立卫生研究院(National Institute ofHealth)，Bethesda，MD(1991))。而Chothia HVR是指结构环的位置(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196：901-917(1987))。″Contact″HVR是基于可用的复杂晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基标注于下文中。
Figure BDA0003230734600000341
除非另有指示，否则可变结构域残基(HVR残基和构架区残基)是根据Kabat等人，见上文编号。
″构架″或″FR″残基是除如本文中所定义的HVR残基以外的可变结构域残基。
表述″根据Kabat编号的可变结构域残基″或″根据Kabat编号的氨基酸位置″以及其变化形式是指Kabat等人，见上文中的用于抗体编译中的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际线形氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域中的FR或HVR的缩短或其中的插入。举例来说，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(残基52a，根据Kabat)和在重链FR残基82之后的被插入的残基(例如，残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。可以通过抗体序列与″标准″Kabat编号序列的同源区域处的比对来确定既定抗体的残基的Kabat编号。
出于本文中的目的，″受体人类构架″是包含来源于人类免疫球蛋白构架或人类共同构架的VL或VH构架的氨基酸序列的构架。″来源于″人类免疫球蛋白架构或人共同架构的受体人类架构可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施例中，预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。
相对于参考多肽序列的″氨基酸序列一致性百分比(％)″被定义为在比对序列且视需要引入空位以实现最大序列一致性百分比且不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分之后，候选序列中的与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以由所属领域的技术内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包含在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。举例来说，如下计算既定氨基酸序列A与、和或针对既定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性百分比(其可以替代地表述为与、和或针对既定氨基酸序列B包含某一氨基酸序列一致性百分比的既定氨基酸序列A)：
100乘以分数X/Y
其中X是以程序中A与B的比对中的序列的一致匹配形式评分的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应了解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列一致性百分比将不等于B与A的氨基酸序列一致性百分比。
″结合于″、″特异性结合于″具体多肽或具体多肽上的表位或对所述多肽或表位″具有特异性″的抗体是与具体多肽或具体多肽上的表位结合且基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的抗体。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与非相关、非CTLA4多肽的结合小于抗体与CTLA4的结合约10％，如通过所属领域中已知的方法(例如，酶联结免疫吸附分析法(ELISA))所测量。在一些实施例中，与CTLA4(例如，小鼠CTLA4和/或人类CTLA4)结合的结合蛋白质(例如，抗体)的平衡解离常数(KD)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤2nM、≤1nM、≤0.7nM、≤0.6nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
如本文中所提供的术语″CTLA4″或″CTLA4蛋白质″包括细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)或其可维持CTLA4蛋白质活性(例如，与CTLA4相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性范围内)的变体或同源物的任何重组或天然存在的形式。在一些方面中，与天然存在的CTLA4多肽相比，变体或同源物在整个序列或一部分序列(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性。在一些实施例中，CTLA4如由NCBI序列参考GI：83700231鉴别的蛋白质，其同源物或功能性片段。在一些实施例中，CTLA4是人类CTLA4。在一些实施例中，CTLA4是小鼠CTLA4。
抗体″效应功能″是指可由抗体的Fc区(原生序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性且随抗体同型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
″抗体依赖性细胞介导的细胞毒性″或″ADCC″是指细胞毒性的一种形式，其中所分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如，自然杀手(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒性效应细胞能够与携带抗原的目标细胞特异性结合且随后利用细胞毒素杀伤目标细胞。抗体将细胞毒性细胞″武装″起来且是通过这种机制杀伤目标细胞所需的。用于介导ADCC的原生细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概述于以下文献中的第464页中的表3中：Ravetch和Kinet，《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》9：457-92(1991)。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)在不具有将Fc聚糖海藻糖基化以具有增强的ADCC的能力的细胞中被工程改造或表达。为了评估相关分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC分析法，如美国专利案第5,500,362号或第5,821,337号中描述的分析法。适用于这类分析法的效应细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，相关分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》，95：652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。改变ADCC活性和其它抗体特性的其它Fc变体包括以下文献中所公开的变体：Ghetie等人，《自然生物技术(Nat Biotech.)》15：637-40，1997；Duncan等人，《自然》332：563-564，1988；Lund等人，《免疫学杂志(J.Immunol)》147：2657-2662，1991；Lund等人，《分子免疫学(Mol Immunol)》29：53-59，1992；Alegre等人，《移植(Transplantation)》57：1537-1543，1994；Hutchins等人，《美国国家科学院院刊》92：11980-11984，1995；Jefferis等人，《免疫学期刊(Immunol Lett.)》44：111-117，1995；Lund等人，《美国实验生物学学会联合会(FASEB)》J9：115-119，1995；Jefferis等人，《免疫学期刊》54：101-104，1996；Lund等人，《免疫学杂志》157：4963-4969，1996；Armour等人，《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》29：2613-2624，1999；Idusogie等人，《免疫学杂志》164：4178-4184，200；Reddy等人，《免疫学杂志》164：1925-1933，2000；Xu等人，《细胞免疫学(CellImmunol)》200：16-26，2000；Idusogie等人，《免疫学杂志》166：2571-2575，2001；Shields等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》276：6591-6604，2001；Jefferis等人，《免疫学期刊》82：57-65.2002；Presta等人，《生物化学学会学报(Biochem Soc Trans)》30：487-490，2002；Lazar等人，《美国国家科学院院刊》103：4005-4010，2006；美国专利案第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；和第7,317,091号。
在本文中，术语″Fc区″用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括原生序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界限可能变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基端。适用于本发明的抗体的原生序列Fc区包括人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文中所使用，″结合亲和力″是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)之间的非共价相互作用的强度。在一些实施例中，结合蛋白质(例如，抗体)对CTLA4的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常用方法，包括本文中所描述的方法来测量。
如本文中所使用，″结合亲合力″是指分子(例如，抗体)的多个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)的结合强度。
在本文中，编码抗体的″被分离的″核酸分子是被鉴别且从至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，其与所述至少一种污染核酸分子通常在其生产环境中相关联。在一些实施例中，被分离的核酸与和生产环境相关联的所有组分都无关。在本文中，编码多肽和抗体的被分离的核酸分子呈与其在自然界中被发现的形式或环境不同的形式。因此，被分离的核酸分子与细胞中天然存在的编码本文中的多肽和抗体的核酸不同。
术语″医药配制物″是指呈允许活性成分的生物活性有效，并且不含对将被施用所述配制物的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。这类配制物是无菌的。
如本文中所使用，″载剂″包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其对暴露于所使用的剂量和浓度的所述载剂的细胞或哺乳动物无毒性。生理学上可接受的载剂通常是水性pH值缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包括缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐相对离子，如钠；和/或非离子性表面活性剂，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文中所使用，术语″治疗″是指被设计成在临床病理学过程期间改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入。合乎需要的治疗作用包括降低疾病进展率、改善或减轻疾病病况以及缓解或改善预后。举例来说，如果与病症(例如，赘生性疾病)相关联的一种或多种症状得到缓解或消除，那么成功地″治疗″个体。举例来说，如果治疗引起罹患疾病的个体的生活质量提高、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、降低疾病的复发频率、减轻疾病的严重程度、延缓疾病的发展或进展和/或延长个体的存活期，那么成功地″治疗″个体。
如本文中所使用，″与......结合″或″与......组合″是指施用除一种治疗方法以外的另一种治疗方法。因此，″与......结合″或″与......组合″是指在向个体施用一种治疗方法之前、期间或之后施用另一种治疗方法。
如本文中所使用，术语″预防″包括提供与个体中的疾病的发生或复发相关的防治。个体可能易患病症、对病症敏感或具有产生病症的风险，但尚未被诊断患有病症。在一些实施例中，使用本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体)延缓病症的发展。
如本文中所使用，″具有产生病症的风险″的个体在本文中所描述的治疗方法之前可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状，且可能显示或可能不显示可检测的疾病或疾病症状。″具有风险″表示个体具有一种或多种风险因素，所述风险因素是与疾病的发展相关的可测量的参数，如所属领域中已知。具有这些风险因素中的一种或多种的个体与不具有这些风险因素中的一种或多种的个体相比具有更高的产生病症的可能性。
″有效量″是指至少在必需的剂量和时段下有效实现所需或所指示的作用，包括治疗性或预防性结果的量。可以按一次或多次给药的方式来提供有效量。″治疗有效量″至少是实现具体病症的可测量的改善所需的最小浓度。在本文中，治疗有效量可以根据如疾病病况、患者的年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也可以是其中治疗有益作用超过抗体的任何毒性或有害作用的量。″预防有效量″是指在必需的剂量和时段下有效实现所需预防性结果的量。通常但未必，因为预防性剂量是在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。
″慢性″给药是指以与急性模式相反的连续模式给予(一种或多种)药剂，以便将初始治疗作用(活性)维持长期时段。″间歇性″给药是在不中断的情况下非连续地进行，但实际性质是循环性的治疗。
如本文中所使用，″个体″或″受试者″是哺乳动物。出于治疗的目的，″哺乳动物″包括人类、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如犬、马、兔、牛、、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施例中，个体或受试者是人类。
II.可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质
在一个方面中，提供可活化的被掩蔽的细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA4)结合蛋白质，其包含(i)CTLA4结合结构域；(ii)CTLA4结合结构域掩蔽肽(在本文中也称为″掩蔽肽″)；和(iii)将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的包含可裂解肽的连接子。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质是被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质是结合于CTLA4的被掩蔽的双特异性抗体。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质是结合于CTLA4的被掩蔽的嵌合受体。
本文中所提供的可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质可以结合于来自各种物种的CTLA4，举例来说，一些结合于人类CTLA4和/或小鼠CTLA4，或食蟹猕猴CTLA4。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质具有以下特征中的一种或多种：(1)结合CTLA4(例如，人类CTLA4)；(2)在将掩蔽肽连接至结合蛋白质的肽连接子的蛋白酶裂解(例如，活化)之后以更高的亲和力结合CTLA4；和(3)在肿瘤位点处体内结合CTLA4。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质，其尤其适用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病。如本文所提供的可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质包括能够与表达于细胞(例如，癌细胞或T细胞)表面上的CTLA4蛋白质相互作用(例如，结合)的结合结构域。在一些实施例中，结合结构域通过包含可裂解肽的连接子连接至掩蔽肽，使得掩蔽肽防止CTLA4结合结构域与CTLA4蛋白质结合。在可裂解肽的裂解之后，掩蔽肽被释放，由此允许结合结构域与CTLA4蛋白质相互作用。
在一些实施例中，本文中还提供被掩蔽的CTLA4结合蛋白质(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)，其包含(a)CTLA4结合蛋白质(例如，包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)；和(b)掩蔽肽。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，且掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施例中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施例中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施例中，以氨基端至羧基端方向，包含可裂解肽的连接子包含：间隔连接子、可裂解肽和间隔连接子。在一些实施例中，掩蔽肽的C端连接至包含可裂解肽的连接子的N端，且包含可裂解肽的连接子的C端连接至第一链(例如，轻链或轻链可变区)的N端。
CTLA4结合蛋白质
如本文中所提供的术语″CTLA4结合蛋白质″是指包含CTLA4结合结构域的多肽，其能够结合于CTLA4蛋白质或以其它方式呈现对CTLA4蛋白质的亲和力。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗原结合片段、单链抗体等。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。因此，在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，CTLA4结合蛋白质是结合CTLA4的嵌合抗原受体的组分。
术语″CTLA4结合结构域″是指以重组方式表达的多肽结构域，其能够结合于在细胞中或细胞上发现的CTLA4蛋白质或以其它方式呈现对所述CTLA4蛋白质的亲和力。用于确定CTLA4结合结构域与CTLA4的结合程度的方法是所属领域中众所周知的。
在一些实施例中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，本文中所描述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是同源二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是异源二聚体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是包含第一链和第二链的异源二聚体，如包含重链和轻链的异源二聚体。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含第一链和第二链。在一些实施例中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施例中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链(例如，轻链和重链)。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链(例如，两条轻链和两条重链)。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ IDNO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且包含有包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且包含有包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区；和包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ IDNO：334的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366或380-397的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1同型，其包含增强如本文中所描述的效应功能的氨基酸取代。
在一些实施例中，CTLA4结合结构域包含双特异性抗体的抗原结合臂的轻链和重链。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链包含(i)包含SEQ IDNO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含有包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且重链包含有包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且重链包含有包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列；和/或重链包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：327-341；和/或重链包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：366-380、421和478。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO：366、380-397、421和478的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含与SEQ ID NO：334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，轻链包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列，且重链包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施例中，CTLA4是人类CTLA4。在双特异性抗体的一些实施例中，CTLA4是鼠类CTLA4。在一些实施例中，双特异性抗体是鼠类抗体。在一些实施例中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1同型，其包含增强如本文中所描述的效应功能的氨基酸取代。
在一些实施例中，CTLA4结合结构域包含结合于CTLA4的第一链和第二链，如用于嵌合受体中的配体结合结构域的一部分。在嵌合受体的一些实施例中，第一链是轻链可变结构域。在一些实施例中，第二链是重链可变结构域。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链包含(i)包含SEQ ID NO：405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含有包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且第二链包含有包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且第二链包含有包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含与SEQ ID NO：321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO：323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含与SEQ ID NO：322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQID NO：324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
掩蔽肽
如本文所提供的CTLA4结合结构域掩蔽肽(也称为″掩蔽肽″)是指能够结合于CTLA4结合结构域或以其它方式呈现对CTLA4结合结构域的亲和力的肽。当结合于CTLA4结合结构域时，掩蔽肽阻断、遮挡、抑制(例如，降低)或以其它方式阻止(例如，掩蔽)CTLA4结合结构域对其同源受体或蛋白质(即，CTLA4)的活性或结合。用于确定CTLA4结合结构域与CTLA4蛋白质的结合程度的方法是所属领域中众所周知的。
在实施例中，掩蔽肽的长度是至少4个氨基酸。在一些实施例中，掩蔽肽是线形肽。在一些实施例中，线形肽是4聚体至24聚体。在实施例中，掩蔽肽是环状肽。在实施例中，环状肽是3聚体至12聚体，如由2个半胱氨酸之间的氨基酸数目定义。在实施例中，环状肽是3聚体至20聚体。当掩蔽肽是环化肽时，环化肽是由连接两个半胱氨酸氨基酸残基的二硫键形成。在一些实施例中，半胱氨酸氨基酸残基是末端半胱氨酸(即，位于掩蔽肽的N端和/或C端处或附近)。在实施例中，二硫键连接N端半胱氨酸与C端半胱氨酸。
在一些实施例中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的N端。在一些实施例中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的N端。在一些实施例中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的C端。在一些实施例中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的C端。
在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的N端。在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链的N端。在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的N端。在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的N端。在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的C端。在一些实施例中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的C端。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。因此，在实施例中，掩蔽肽包含与以下氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：CNLIVEGHC(SEQ ID NO：1)、MQTRCKEYPRWCEHWL(SEQ ID NO：2)、CKHAPYALC(SEQ ID NO：3)、CPFPAKILC(SEQ ID NO：4)、CPGKGLPSC(SEQ ID NO：5)、NWLGEWLPPGKV(SEQ ID NO：6)、QFIECPNFPRQCPGKN(SEQ ID NO：7)、VRQQCSLNPGRCPYLV(SEQID NO：8)、VWQECHTAPQLCPGKI(SEQ ID NO：9)、DSYTCRGPTWMCAGNM(SEQ ID NO：10)、FNHDCSGHWMRCLDQQ(SEQ ID NO：11)、NKSPCRPKMVACYGIL(SEQ ID NO：12)、PTPQCWNQYYECWIPS(SEQ ID NO：13)、SQKCPWTKETCMHYM(SEQ ID NO：14)、WHLSMYPKPPAE(SEQID NO：15)、WHTDGFYTRLPA(SEQ ID NO：16)、CIHAPYAKC(SEQ ID NO：17)、CPAKIGQEC(SEQ IDNO：18)、CPFPALELC(SEQ ID NO：19)、CTKPAKALC(SEQ ID NO：20)、DTATCYTTTGWCEGMV(SEQID NO：21)、NSDNCGPAKSTCMYND(SEQ ID NO：22)、PPGKCTQPHRCPPLN(SEQ ID NO：23)、DDPVCWDSNPTCQTIA(SEQ ID NO：24)、ISDQCSVLFLSCNTRV(SEQ ID NO：25)、ACHFPHPEGC(SEQID NO：26)、CLPPFPTKC(SEQ ID NO：27)、CPDHVFPKC(SEQ ID NO：28)、CWLPKPDMC(SEQ IDNO：29)、CWSWPSKAC(SEQ ID NO：30)、CYPFGKYEC(SEQ ID NO：31)、ALTPAKWLPADD(SEQ IDNO：32)、DDKECDWMHFACTGPQ(SEQ ID NO：33)、DEMKCAWSLEMCVRTS(SEQ ID NO：34)、DPILCPNTRMSCDNQT(SEQ ID NO：35)、GNALYDSPGTML(SEQ ID NO：36)、KNYECREVMPPCEPNT(SEQ ID NO：37)、NSYTSPYWLPDS(SEQ ID NO：38)、SLTPPYWIPREW(SEQ ID NO：39)、SPLTPHDRPSFL(SEQ ID NO：40)、TADVFSSSRYTR(SEQ ID NO：41)、TDLQCPPSSPICQIEH(SEQ IDNO：42)、TKCHCDGNCVMCYQMQ(SEQ ID NO：43)、TLAYETPLLWLP(SEQ ID NO：44)、TNWHCNNDGSSCNVRA(SEQ ID NO：45)或CNLIVQGHC(SEQ ID NO：46)。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列具有约90％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有约90％同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列具有约80％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有约80％同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列具有约70％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有约70％同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，掩蔽肽氨基酸序列是选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽氨基酸序列是SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，掩蔽肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一些实施例中，掩蔽肽包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，掩蔽肽包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过30个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过40个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端，所述掩蔽肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至选自由以下组成的群组的掩蔽肽的N端：SEQ ID NO：1-46。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至选自由以下组成的群组的掩蔽肽的N端：SEQ ID NO：1-46，其中所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至选自由以下组成的群组的掩蔽肽的N端：SEQ IDNO：1-46，其中所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)。
连接子
在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含连接子，例如间隔连接子。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含超过一个连接子，例如第一间隔连接子和第二间隔连接子。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含可裂解肽的连接子。如本文中所使用，″包含可裂解肽的连接子″是指共价键结至CTLA4结合结构域且共价键结至掩蔽肽的可以酶促方式裂解的连接子。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子是以重组方式表达。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子是通过使用例如结合化学反应使连接至连接子的功能性(反应性)基团与掩蔽肽反应而形成的连接子。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子是通过使用例如结合化学反应使连接至连接子的功能性(反应性)基团与CTLA4结合结构域反应而形成的连接子。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的N端(例如，轻链的N端)。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的C端(例如，轻链的C端)。
在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子与掩蔽肽融合，如当核酸编码连接子和掩蔽肽且由细胞以编码连接子和掩蔽肽的氨基酸序列形式表达时。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子与CTLA4结合结构域融合，如当核酸编码连接子和CTLA4结合结构域且由细胞以编码连接子和CTLA4结合结构域的氨基酸序列形式表达时。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的N端(例如，轻链的N端)。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的C端(例如，轻链的C端)。
在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子是包括一个或多个甘氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基、组氨酸残基和/或脯氨酸残基的柔性连接子。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子含有直接连接至可裂解肽的N端和/或C端的间隔连接子。在一些实施例中，间隔连接子包含一个或多个甘氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基、组氨酸残基和/或脯氨酸残基。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含间隔连接子和可裂解肽。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子。因此，在一些实施例中，被掩蔽的CTLA4结合蛋白质(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)包含有包含可裂解肽的连接子，该连接子包含连接至可裂解肽的N端的间隔连接子(例如，第一间隔连接子或间隔连接子1)，和连接至可裂解肽的C端的间隔连接子(例如，第二间隔连接子或间隔连接子2)，其中各间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子的C端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域，且包含可裂解肽的连接子的N端连接至掩蔽肽。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子的C端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变结构域，且包含可裂解肽的连接子的N端连接至掩蔽肽。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子的N端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域，且包含可裂解肽的连接子的C端连接至掩蔽肽。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子的N端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变结构域，且包含可裂解肽的连接子的C端连接至掩蔽肽。
在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端且包含选自SEQ ID NO：89-100的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的C端且包含选自SEQ IDNO：101-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中所描述的掩蔽肽直接连接至间隔连接子的N端。因此，在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)间隔连接子(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列的间隔连接子)，2)可裂解肽，如本文中所描述的可裂解肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ IDNO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列的可裂解肽)，和3)间隔连接子(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列的间隔连接子)。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含选自由SEQID NO：47-88、464-469和479-508组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：420的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：96的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：415的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：416的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：417的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQID NO：57的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：418的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：417的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：418的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的连接子包含：1)包含SEQ IDNO：419的氨基酸序列的间隔连接子；2)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列的间隔连接子。
在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含SEQ ID NO：454的氨基酸序列。在一些实施例中，包含可裂解肽的连接子包含SEQ ID NO：455的氨基酸序列。
可以通过所属领域中众所周知的各种方法使连接子与掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白质结合。术语″结合″和″结合化学反应″是指由已知的反应性基团在相对温和条件下进行的反应。这些反应包括(但不限于)亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯发生的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和对碳-碳和碳-杂原子多重键进行的加成反应(例如，迈克尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿德尔加成反应(Diels-Alder addition))。这些和其它适用的反应论述于例如March，《高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)》，第3版，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，《生物结合技术(BioconjugateTechniques)》，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，《蛋白质修饰(Modification of Proteins)》；《化学进展(Advances in Chemistry Series)》，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
适用于本文中的结合化学反应的反应性官能团包括例如：(a)羧基和其各种衍生物，包括(但不限于)N-羟基丁二酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酸卤化物、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；(c)卤烷基，其中卤离子可随后由如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳阴离子或醇盐离子等亲核性基团置换，由此在卤素原子的位点处产生新基团的共价连接；(d)亲二烯物基团，其能够参与狄尔斯-阿德尔反应，例如顺丁烯二酰亚胺基；(e)醛或酮基团，使得有可能通过形成羰基衍生物(例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟)或通过如格林纳加成(Grignard addition)或烷基锂加成等机制进行后续衍生作用；(f)磺酰基卤化物基团，其用于与胺的后续反应，例如以形成磺酰胺；(g)硫醇基，其可以转化成二硫化物、与酰基卤化物反应或与如金等金属键结；(h)胺或巯基，其可以例如酰化、烷基化或氧化；(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成(Michael addition)等；(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；(k)氨基亚磷酸酯和其它适用于核酸合成的标准官能团；(i)金属氧化硅键结；和(1)与反应性磷基团(例如，膦)键结以形成例如磷酸二酯键的金属。
可以选择反应性官能团使得其不影响或干扰本文中所描述的组合物的化学稳定性。或者，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团不参与交联反应。
在一些实施例中，可以通过所属领域中众所周知的各种方法将连接子工程改造成与掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白质融合。举例来说，核酸可以被工程改造成编码具有掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白质的连接子，以在由宿主细胞以重组方式表达时产生融合蛋白质。
可裂解肽
在一些实施例中，本文中所提供的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)包含可裂解肽。在一些实施例中，可裂解肽包含于包含可裂解肽的连接子内。本文中所提供的包含可裂解肽的连接子可以包括可裂解肽内的蛋白酶裂解位点。如本文中所使用，″裂解位点″是指在本文中所描述的CTLA4结合蛋白质中发现的用于连接子(例如，上文所描述的包含可裂解肽的连接子)的一部分的裂解的可识别位点。因此，裂解位点可以在如本文中所描述的可裂解肽(包括其实施例)的序列中发现。在一些实施例中，裂解位点是由裂解剂识别和裂解的氨基酸序列。例示性裂解剂包括蛋白质、酶、DNA酶、RNA酶、金属、酸和碱基。可裂解肽可以是任何包括蛋白酶裂解位点的肽。例示性可裂解肽展示于表1中。
表1.代表性可裂解肽
Figure BDA0003230734600000611
Figure BDA0003230734600000621
因此，在一些实施例中，可裂解肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQID NO：47-88、464-469和479-508。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列。
在一些实施例中，蛋白酶裂解位点是肿瘤相关蛋白酶裂解位点。如本文所提供的″肿瘤相关蛋白酶裂解位点″是由蛋白酶识别的氨基酸序列，其表达对肿瘤细胞或其肿瘤细胞环境具有特异性。在一些实施例中，蛋白酶裂解位点是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶识别的裂解位点：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAMI5、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。在一些实施例中，蛋白酶裂解位点是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶识别的裂解位点：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在实施例中，蛋白酶裂解位点基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点、含有解整合素和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶裂解位点、前列腺特异性抗原(PSA)蛋白酶裂解位点、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物(uPA)蛋白酶裂解位点、薄膜型丝氨酸蛋白酶1(MT-SP1)蛋白酶裂解位点、蛋白裂解酶蛋白酶裂解位点(ST14)或豆荚蛋白酶裂解位点。在实施例中，基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点是MMP9裂解位点、MMP13裂解位点或MMP2裂解位点。在实施例中，含有解整合素和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶裂解位点是ADAM9金属蛋白酶裂解位点、ADAM10金属蛋白酶裂解位点或ADAM17金属蛋白酶裂解位点。蛋白酶裂解位点可以由特定氨基酸序列标示。
在一些实施例中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。在一些实施例中，可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在实施例中，可裂解肽是5聚体(即，长度是5个氨基酸的肽)、6聚体(即，长度是6个氨基酸的肽)、7聚体(即，长度是7个氨基酸的肽)、8聚体(即，长度是8个氨基酸的肽)、9聚体(即，长度是9个氨基酸的肽)、10聚体(即，长度是10个氨基酸的肽)、11聚体(即，长度是11个氨基酸的肽)、12聚体(即，长度是12个氨基酸的肽)或13聚体(即，长度是13个氨基酸的肽)。
因此，在一些实施例中，按N端至C端方向，掩蔽肽和包含可裂解肽的连接子包含：1)掩蔽肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽)，2)间隔连接子(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列的间隔连接子)，3)可裂解肽，如本文中所描述的可裂解肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列的可裂解肽)，和4)间隔连接子(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列的间隔连接子)。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过30个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过40个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、间隔连接子和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：113-231的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、间隔连接子和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：113-193的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、间隔连接子和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：194-206的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、间隔连接子和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：207-231的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子的肽，其中所述肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：113-231、444、446-448和450-453。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子的肽，其中所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：113-231、444、446-448和450-453。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子的肽，其中所述肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO：444、446-448和450-453。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质包含有包含掩蔽肽、第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子的肽，其中所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：444、446-448和450-453。
例示性被掩蔽的CTLA4结合蛋白质
以下描述含有如上文所描述的某些特征的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质的某些例示性实施例。这些实施例仅是例示性的且不应解释为限制性。
在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
在一些实施例中，本文中还提供被掩蔽的抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体或其抗原结合片段的第一链和第二链的氨基端。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQ IDNO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
在一些实施例中，本文中还提供被掩蔽的抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体或其抗原结合片段的第一链和第二链的羧基端。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施例中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ IDNO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ IDNO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
在一些实施例中，本文中还提供掩蔽抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，和b)包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体的第一链的C端或N端且掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体的第二链的C端或N端。在一些实施例中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，a)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是轻链；b)抗体的第一链是重链且抗体的第二链是重链；或c)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是重链。因此，在一些实施例中，被分离的抗体包含两条轻链中的每一条的C端和/或N端以及两条重链中的每一条的C端和/或N端上的掩蔽肽。在一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
在一些实施例中，本文中还提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含：a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3；b)掩蔽肽，其包含选自由SEQ ID NO：1-46组成的群组的氨基酸序列；和c)可裂解肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。在一些实施例中，可裂解肽包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。在一些实施例中，掩蔽肽连接至可裂解肽，且可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区。在一些实施例中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段进一步包含将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔连接子，所述间隔连接子包含选自由SEQID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且进一步包含将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔连接子，所述间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。在一些实施例中，将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔连接子包含SEQ ID NO：420的氨基酸序列，且将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔连接子包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列。在一些实施例中，将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔连接子包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列，且将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔连接子包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列。在一些实施例中，轻链可变区包含SEQ IDNO：322的氨基酸序列，且重链可变区包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。在一些实施例中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，以及包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列的肽。在一些实施例中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ IDNO：319或320的氨基酸序列的重链。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含选自SEQ IDNO：323或324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO：366或380-397的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链。在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ IDNO：233的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含a)包含有掩蔽肽、包含可裂解肽的连接子和轻链的氨基酸序列；和b)包含重链的氨基酸序列。在一些实施例中，包含有掩蔽肽、包含可裂解肽的连接子和轻链的氨基酸序列是选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：358、422、424-426和428-431。在一些实施例中，包含重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。在一些实施例中，包含有掩蔽肽、包含可裂解肽的连接子和轻链的氨基酸序列是选自由以下组成的群组：SEQ ID NO：358、422、424-426和428-431；且包含重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含与选自由SEQID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列；和/或包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列；且包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：422的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：422的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：358的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：358的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：423的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：423的氨基酸序列，和SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：424的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：424的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：425的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：425的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：426的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：426的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：427的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：427的氨基酸序列，和SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：428的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：428的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：429的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：429的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：430的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：430的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：431的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQID NO：421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：431的氨基酸序列，和SEQ IDNO：421的氨基酸序列。
存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本文中的一些实施例中。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z或其组合标示的变体。在本文中的一些实施例中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一些实施例中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO：235或236的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO：326的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO：463的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段在由蛋白酶(如本文中所描述的蛋白酶)裂解后结合CTLA4。在一些实施例中，可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。
在本发明的一个方面中，提供编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸。在某些实施例中，提供包含编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的聚核苷酸的载体。在某些实施例中，提供包含这类载体的宿主细胞。在本发明的另一方面中，提供一种组合物，其包含本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或本文中所描述的编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的聚核苷酸。在某些实施例中，本发明的组合物是医药配制物，其用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病，如本文中所列举的赘生性疾病。
在一些实施例中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白质是能够结合于CTLA4的双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施例中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和c)包含选自SEQID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至第一对的轻链和/或重链的氨基端。在一些方面中，本文中提供被掩蔽的双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和c)包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至第一对的轻链和/或重链的羧基端。在一些实施例中，抗原是与CTLA4不同的抗原。在一些实施例中，第一对或第二对的轻链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施例中，第一对或第二对的重链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施例中，第一对的轻链包含有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且第一对的重链包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，第二对的轻链包含有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二对的重链包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施例中，抗原是针对CTLA4的不同表位。在一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ IDNO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
本文中所涵盖的用于被掩蔽的双特异性抗体的双特异性抗体包括鼠类双特异性抗体、人类化双特异性抗体、嵌合双特异性抗体和人类双特异性抗体。在本文中的一些实施例中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。在一些实施例中，本文中所提供的双特异性抗体具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一些实施例中，抗体具有包含氨基酸取代的IgG1同型或由不具有或具有降低的将Fc聚糖海藻糖基化的能力以增强如本文中所描述的效应功能的细胞表达。在一些实施例中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ IDNO：235或236的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：326的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施例中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：463的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链和/或包含有包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO：327、334或342-365的氨基酸序列的轻链和/或包含有包含选自SEQ ID NO：366或380-397的氨基酸序列的重链。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：233的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：232的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施例中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施例中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白质是能够结合于CTLA4的嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))。CAR是将针对所需抗原(例如，CTLA4)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以产生呈现特异性抗肿瘤细胞活性的嵌合蛋白质的分子。在一个实施例中，本文中提供嵌合受体，其被工程改造成包含具有本文中所描述的CTLA4结合结构域的细胞外结构域与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的融合物。CTLA4结合结构域被工程改造使得其通过包含可裂解肽的连接子连接至掩蔽肽，如本文中所描述的掩蔽肽。当在T细胞中表达时，本文中所提供的可活化的被掩蔽的嵌合受体在由识别可裂解肽的蛋白酶裂解后能够基于抗原结合特异性来重新引导抗原识别。在一些实施例中，CTLA4结合结构域优选与来自共刺激性分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。在一些实施例中，CTLA4结合结构域与选自以下群组的一个或多个细胞内结构域融合：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列，c)跨膜结构域；和d)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至配体结合结构域的第一链和/或第二链的氨基端。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列。在一些实施例中，第一链包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列，c)跨膜结构域；和d)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至配体结合结构域的第一链和/或第二链的羧基端。在一些实施例中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施例中，第一链包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列。在一些实施例中，第一链包含选自SEQ ID NO：321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO：323或324的氨基酸序列。
在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施例中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施例中，间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施例中，间隔连接子包含选自SEQ ID NO：89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施例中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施例中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施例中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ IDNO：398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO：400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO：401)。
1.结合亲和力
免疫结合相互作用(如抗体与所述抗体对其具有特异性的抗原之间)的强度或亲和力可以由所述相互作用的平衡解离常数(KD)来表示，其中KD越小表示亲和力越大。蛋白质的免疫结合特性可以使用在所属领域中众所周知的方法定量。举例来说，一种方法包含测量抗原结合蛋白质(例如，抗体)/抗原复合物形成和解离速率，其中这些速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响所述速率的几何参数。可以通过计算浓度以及实际缔合和解离速率来确定″结合速率常数″(Kon)和″解离速率常数″(Koff)。Koff/Kon的比能够消除所有与亲和力无关的参数且等于平衡解离常数KD。参见Davies等人，《生物化学年鉴(Annual Rev Biochem.)》59：439-473，(1990)。
在一些方面中，与不包含可裂解肽的亲本抗CTLA4结合蛋白质相比，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)在由蛋白酶裂解后以大致相同或更高的亲和力结合于CTLA4。在某些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质的平衡解离常数(KD)≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或50.001nM(例如，10-8M或更低，例如，10-8M至10- 13M，例如，10-9M至10-13M)。在一些实施例中，本文中所提供的抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约50pM至约5nM的平衡解离常数(KD)结合于目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)。用于评估结合亲和力的分析法是所属领域中众所周知的，例如在本文中的实例3A和实例3B中描述的分析法中。
在一些方面中，提供呈现所需遮挡率的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。如本文中所使用，术语″遮挡率″是指(a)在第一组条件下的参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下的参数的最小检测值的比率。举例来说，在可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的情形下，遮挡率是指以下两者的比率：(a)在存在至少一种能够裂解可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的可裂解肽的蛋白酶的情况下，结合于可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)的最大检测水平，(b)在不存在蛋白酶的情况下，结合于可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)的最小检测水平。可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的遮挡率可以计算为在由蛋白酶裂解之前的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的解离常数与在由蛋白酶裂解之后的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的解离常数的比率。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的较大遮挡率指示与在不存在蛋白酶的情况下相比，在存在能够裂解可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的可裂解肽的蛋白酶的情况下，目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)与可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的结合以更大的程度进行(例如，显著进行)。在一些实施例中，本文中提供具有最佳遮挡率的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的最佳遮挡率指示可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有适用于本文中所涵盖的方法或组合物的所需特性。在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质呈现约20至约10,000，例如约80至约100的最佳遮挡率。在另一实施例中，遮挡率是约20至约7,500、约20至约5,000、约20至约2,500、约20至约2,000、约20至约1,000、约20至约900、约20至约800、约20至约700、约20至约600、约20至约500、约20至约400、约20至约300、约20至约200、约20至约100、约20至约50、约30至约100、约40至约100、约50至约100、约60至约100、约70至约100、约80至约100或约100至约1,000。在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质呈现约80至约100的最佳遮挡率。在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质呈现约20至约1,000的最佳遮挡率。可以使用所属领域中众所周知的技术，如通过ELISA来确定在由蛋白酶裂解之前和/或裂解之后，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质与目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)的结合。
在一些方面中，与抗CTLA4结合蛋白质与目标蛋白质(例如，CTLA4蛋白质)之间的亲和力相比，本文中所描述的掩蔽肽以较低亲和力结合于抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在某些实施例中，本文中所提供的掩蔽肽以≤1mM、≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-5M或更低，例如，10-5M至10-13M，例如，10-5M至10-7M)的平衡解离常数(KD)结合于抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，本文中所提供的掩蔽肽以约50nM至约50μM的平衡解离常数(KD)结合于抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。用于评估掩蔽肽与抗CTLA4结合蛋白质(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)之间的结合亲和力的例示性分析法可见于本文中的实例2中。
2.生物活性分析法
在一些方面中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质在体内小鼠肿瘤模型中减小肿瘤体积。用于评估肿瘤体积的减小的分析法是所属领域中众所周知的，例如在本文中的实例4A和实例4B中所描述的分析法中。
III.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质制备
使用所属领域中可用的技术制备本文中所描述的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质，其例示性方法更详细地描述于以下章节中。
1.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：抗体片段
本发明涵盖作为被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的抗体片段。被掩蔽的抗体片段可以由传统方法(如酶促消化)或重组技术产生。在某些情形下，使用被掩蔽的抗体片段而非完全抗体可能具有优点。关于某些抗体片段的评述，参见Hudson et al.(2003)《自然医学(Nat.Med.)》9：129-134。
已经研发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生(参见例如Morimoto等人，《生物化学和生物物理学方法杂志(Journalof Biochemical and BiophysicalMethods)》24：107-117(1992)；和Brennan等人，《科学(Science)》，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌和其它细胞类型中表达和分泌，由此实现大量的这些被掩蔽的片段的便捷产生。或者，可以从培养基直接回收被掩蔽的Fab′-SH片段且以化学方式偶合以形成F(ab′)2片段(Carter等人，《生物技术(Bio/Technology)》10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离被掩蔽的F(ab′)2片段。包含FcRN/救助受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的被掩蔽的Fab和F(ab′)2片段描述于美国专利案第5,869,046号中。用于产生被掩蔽的抗体片段的其它技术对于熟练技术人员是显而易见的。在某些实施例中，被掩蔽的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利案第5,571,894号；和第5,587,458号。Fv和scFv是仅有的具有不含恒定区的完整组合位点的物质；因此，其可以适用于在体内使用期间的降低的非特异性结合。scFv融合蛋白质可以被构造成引起scFv的氨基或羧基端处的效应蛋白质的融合。参见《抗体工程改造(Antibody Engineering)》，Borrebaeck编，见上文。此外，包含通过多肽连接子连接的两个scFv的双重scFv可以用作双特异性抗体。或者，包含三个或更多个scFv的多重scFv可以用作多特异性抗体。
本发明包括线抗体(例如，美国专利案第5,641,870号中所描述)或单链免疫球蛋白，其包含通过适当的连接子连接的抗体的重链和轻链序列。这类线抗体或免疫球蛋白可以是单特异性或双特异性的。这类单链免疫球蛋白可以二聚化，从而维持与抗体类似的结构和活性，所述抗体最初是四聚体。此外，本发明的抗体可以是具有单一重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这类抗体称为单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体。这些抗体也涵盖于本发明的抗体的功能性片段的含义中。
2.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：人类化抗体
本发明涵盖被掩蔽的人类化抗体。根据本文中所提供的指南来掩蔽人类化抗体。用于将非人类抗体人类化的各种方法是所属领域中已知的。举例来说，人类化抗体可以具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为″输入(import)″残基，其通常从″输入″可变结构域获得。基本上可以根据Winter的方法(Jones等人(1986)《自然》321：522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332：323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学》239：1534-1536)，通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行人类化。因此，这类″人类化″抗体是嵌合抗体(美国专利案第4,816,567号)，其中实质上少于完整的人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人类化抗体通常是其中一些高变区残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
3.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：人类抗体
可以通过组合选自人类衍生的噬菌体呈现库的Fv纯系可变结构域序列与已知的人类恒定结构域序列来构建本发明的人类抗CTLA4抗体。或者，本发明的人类单克隆抗CTLA4抗体可以由融合瘤方法制备。用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系已由例如Kozbor《免疫学杂志(J.Immunol.)》，133：3001(1984)；Brodeur等人，《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications)》，第51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，《免疫学杂志》，147：86(1991)描述。根据本文中所提供的指南来掩蔽人类抗体。
4.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，双特异性抗体是人类或人类化抗体。在某些实施例中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达CTLA4的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。根据本文中所提供的指南来掩蔽双特异性抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是所属领域中已知的。参见Milstein和Cuello，《自然》，305：537(1983)；1993年5月13日公开的WO 93/08829；Traunecker等人，《欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)》，10：3655(1991)；Kontermann和Brinkmann，《当今药物探索(DrugDiscovery Today)》，20(7)：838-847。关于产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》，121：210(1986)。双特异性抗体包括交联或″异结合″抗体。举例来说，异结合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶合，另一种与生物素偶合。异结合抗体可以使用任何便利的交联方法制备。合适的交联剂以及许多交联技术是所属领域中众所周知的且公开于美国专利案第4,676,980号中。
5.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：单结构域抗体
在一些实施例中，根据本文中所提供的指南来掩蔽单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的单一多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，Mass.；参见例如美国专利案第6,248,516 B1号)。在一个实施例中，单结构域抗体由抗体的全部或一部分重链可变结构域组成。
6.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质：抗体变体
在一些实施例中，涵盖本文中所描述的被掩蔽的抗体的氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要改善被掩蔽的抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。可以在制备序列时将氨基酸变化引入标的抗体氨基酸序列。
适用于鉴别抗体中可以作为用于突变诱发的优选位置的某些残基或区域的方法称为″丙氨酸扫描突变诱发″，如由Cunningham和Wells(1989)《科学》，244：1081-1085所描述。在本文中，鉴别残基或目标残基的群组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)且由中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。接着，通过在取代位点处引入或引入针对取代位点的另外或其它变体来优化这些显示对取代的功能敏感性的氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的，但突变本身的性质无需是预定的。举例来说，为了分析既定位点处的突变的性能，在目标密码子或区域处进行Ala扫描或随机突变诱发且针对所需活性来筛选被表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多的残基的多肽范围内的氨基和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变体包括延长抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗体的N端或C端的融合。
在一些实施例中，改善药物动力学的FcRn突变包括(但不限于)M428L、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、P257I/N434H、D376V/N434H、P257I/Q3111、N434A、N434W、M428L/N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A、V308P/N434A、N434H、V308P。在一些实施例中，这类突变增强在低pH值下抗体与FcRn的结合，但不改变在中性pH值下的抗体亲和力。
在某些实施例中，改变本发明的抗体以提高或降低抗体的糖基化程度。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，多肽中的这些三肽序列中任一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最通常丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列来便利地实现抗体中糖基化位点的添加或缺失，使得产生或去除上述三肽序列中的一个或多个(对于N-连接的糖基化位点)。所述变化也可以通过原始抗体的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代来实现(对于O-连接的糖基化位点)。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。举例来说，具有成熟的碳水化合物结构的抗体描述于美国专利申请案第US 2003/0157108号(Presta，L.)中，所述成熟的碳水化合物结构不具有连接至抗体的Fc区的海藻糖。还参见US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd)。在连接至抗体的Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体论述于Jean-Mairet等人，WO 2003/011878和Umana等人，美国专利案第6,602,684号中。在连接至抗体的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体报道于Patel等人，WO 1997/30087中。关于具有与Fc区连接的改变的碳水化合物的抗体，还参见WO1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)。关于具有被修饰的糖基化的抗原结合分子，还参见US 2005/0123546(Umana等人)。
在某些实施例中，糖基化变体包含Fc区，其中连接至Fc区的碳水化合物结构不具有海藻糖或具有减少的海藻糖。这类变体具有改善的ADCC功能。任选地，Fc区还包含进一步改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如，Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。与″去海藻糖基化″、″去海藻糖化″或″海藻糖缺失型″抗体相关的公开案的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等人《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87：614(2004)。产生去海藻糖化抗体的细胞系的实例包括蛋白质海藻糖基化中的Lec13 CHO细胞缺失(Ripka等人，《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249：533-545(1986)；美国专利申请案第US 2003/0157108 A1号，Presta，L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其实例11)，和基因敲除细胞系，如α-1，6-海藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人，《生物技术与生物工程》87：614(2004))，以及过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)和高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞。
在本文中的任何实施例中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质可以被工程改造以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施例中，可以在具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除的细胞系中产生被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质。在一些其它实施例中，可以在过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)的细胞系中产生被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质。在其它实施例中，细胞系还过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的一些实施例中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质可以在Fc区中包含至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。
在一个实施例中，改变被掩蔽的抗体以改善其血清半衰期。为了延长抗体的血清半衰期，可以将FcRN/救助受体结合表位并入抗体(尤其抗体片段)中，如例如美国专利案第5,739,277号中所描述。如本文中所使用，术语″救助受体结合表位″是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子的体内血清半衰期的表位(US 2003/0190311、美国专利案第6,821,505号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,624,821号；美国专利案第5,648,260号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,834,597号)。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体的抗体分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基置换。用于取代型突变诱发的相关位点包括高变区，但也涵盖FR变化。保守性取代展示于表2中的标题″优选取代″下。如果这类取代引起生物活性的所需变化，那么可以引入表2中命名为″例示性取代″或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化且筛选产物。
表2.
原始残基 例示性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
通过选择在保持以下各者的作用方面显著不同的取代来实现抗体的生物学特性中实质性修饰：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如呈片状或螺旋状构形，(b)目标位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体。可以根据氨基酸的侧链的特性的类似性来将其分组(A.L.Lehninger，《生物化学(Biochemistry)》，第二版，第73-75页，WorthPublishers，New York(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可以基于共有的侧链特性将天然存在的残基分成各组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要将这些类别中的一种的成员与另一种类别交换。也可以将这类被取代的残基引入保守性取代位点或其余(非保守性)位点。
一种取代型变体涉及取代亲本抗体(例如，人类化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得变体相对于产生其的亲本抗体将具有被修饰的(例如，改善的)生物学特性。产生这类取代型变体的便利方式涉及使用噬菌体呈现的亲和力成熟。简单来说，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体由丝状噬菌体粒子显示为与包装于各粒子内的噬菌体鞘蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。接着，针对生物活性(例如，结合亲和力)来筛选噬菌体呈现的变体。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可以进行扫描突变诱发(例如，丙氨酸扫描)以鉴别显著促进抗原结合的高变区残基。或者或另外，可能有利的是，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点。根据所属领域中已知的技术，包括本文中详细描述的技术，这类接触残基和相邻残基是用于取代的候选物。在产生这类变体后，变体集合经历使用所属领域中已知的技术(包括本文中所描述的技术)进行的筛选，且可以选择在一种或多种相关分析法中具有优良特性的抗体以用于进一步研究。
通过所属领域中已知的各种方法制备编码被掩蔽的抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括(但不限于)从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变异体的情况下)分离，或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变诱发、PCR突变诱发以及抗体的早期制备的变体或非变体型式的盒式突变诱发来制备。
可能需要在本发明的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)，包括铰链半胱氨酸的氨基酸修饰。
在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，或可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体)具有IgG1同型，其具有增强的效应功能。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化的。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体是去海藻糖基化的。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的等分聚糖部分水平。在一些实施例中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施例中，IgG1包含氨基酸突变。
在一些实施例中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体具有IgG1同型(例如，人类IgG1同型)。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S298A、E333A和K334A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S239D和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代S239D、A330L和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代P247I和A339D或A339Q，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P和Y300L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P、Y300L和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代G236A、S239D和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K326A和E333A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K326W和E333S，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施例中，IgG1包含氨基酸取代K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
根据本说明书和所属领域的教示，经考虑，在一些实施例中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可以包含一个或多个变化，例如在Fc区中。这些抗体与其野生型对应物相比将仍保留治疗效用所需的实质上相同的特征。举例来说，认为可以在Fc区中进行某些变化，其将引起改变(即，改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如WO99/51642中所描述。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan和Winter《自然》322：738-40(1988)；美国专利案第5,648,260号；美国专利案第5,624,821号；和WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些专利公开案的内容以引用的方式具体地并入本文中。还参见Shields等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》9(2)：6591-6604(2001)。具有延长的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合(其负责母体IgG转移至胎儿，Guyer等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》117：587(1976)和Kim等人，《免疫学杂志》24：249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。这些抗体包含具有一或多个取代的Fc区，其中所述取代改善Fc区与FcRn的结合。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利案第6,194,551B1号、WO99/51642中。这些专利公开案的内容以引用的方式具体地并入本文中。还参见Idusogie等人《免疫学杂志》164：4178-4184(2000)。
7.被掩蔽的抗体-药物结合物
本发明还提供被掩蔽的抗体-药物结合物(ADC)，其包含与一种或多种细胞毒性剂结合的本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质，所述细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施例中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)类美登素(参见美国专利案第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利案EP 0 425 235 B1)；阿瑞他汀，如单甲基奥利斯坦(monomethylauristatin)药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利案第5,635,483号和第5,780,588号以及第7,498,298号)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利案第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号；Hinman等人，《癌症研究(Cancer Res.)》53：3336-3342(1993)；和Lode等人，《癌症研究》58：2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)，如柔红霉素(daunomycin)或小红莓(doxorubicin)(参见Kratz等人，《当前医学化学(Current Med.Chem.)》13：477-523(2006)；Jeffrey等人，《生物有机和医学化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)》16：358-362(2006)；Torgov等人，《生物结合物化学(Bioconj.Chem.)》16：717-721(2005)；Nagy等人，《美国国家科学院院刊》97：829-834(2000)；Dubowchik等人，《生物有机和医学化学通讯》12：1529-1532(2002)；King等人，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》45：4336-4343(2002)；和美国专利案第6,630,579号)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、特西他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一实施例中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)微管蛋白聚合抑制剂(例如，类美登素和奥瑞他汀)、DNA损伤剂(例如，吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素和吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体)和DNA合成抑制剂(例如，依昔替康衍生物Dxd)。
在另一实施例中，抗体-药物结合物包含与酶活性毒素或其片段结合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、康乃馨蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素。
在另一实施例中，抗体-药物结合物包含与放射性原子结合以形成放射性结合物的如本文中所描述的抗体。各种放射性同位素可以用于产生放射性结合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，其可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的旋转标记，如同样的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与细胞毒性剂的结合物可以使用各种双功能蛋白质偶合剂制备，如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(如二丁二酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人，《科学》238：1098(1987)中所描述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体的结合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。连接子可以是促进细胞中细胞毒性药物的释放的″可裂解连接子″。举例来说，可以使用酸不稳定连接子、肽酶敏感性连接子、光不稳定连接子、二甲基连接子或含有二硫键的连接子(Chari等人，《癌症研究》52：127-131(1992)；美国专利案第5,208,020号)。
在本文中，ADC明确地涵盖(但不限于)用交联剂制备的这类结合物，所述交联剂包括(但不限于)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC和磺酸基-SMPB，以及可商购(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)的SVSB(丁二酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
8.载体、宿主细胞和重组方法
关于本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的重组产生，将编码其的核酸分离且插入可复制的载体中以用于进一步选殖(DNA的扩增)或用于表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)将编码抗体的DNA容易地分离和测序。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于所使用的宿主细胞。通常，宿主细胞是原核或真核(通常哺乳动物)来源的。应了解，任何同型的恒定区都可以用于这一目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，且这类恒定区可以从任何人类或动物物种获得。
9.使用原核宿主细胞产生结合蛋白质
a)载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的多肽组分的聚核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞(如融合瘤细胞)分离所需聚核苷酸序列且测序。或者，可以使用核苷酸合成器或PCR技术来合成聚核苷酸。在获得后，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源聚核苷酸的重组载体中。所属领域中可用和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于插入载体中的核酸的大小以及用载体转化的具体宿主细胞。各载体视其功能(异源聚核苷酸的扩增或表达或其两者)以及其与其所驻存的具体宿主细胞的相容性而含有各种组分。载体组分通常包括(但不限于)：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
通常，将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质体载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在被转化的细胞中提供表型选择的标记序列。举例来说，通常使用pBR322，一种来源于大肠杆菌物种的质体，将大肠杆菌转化。pBR322含有编码安比西林(ampicillin；Amp)和四环素(Tet)抗性的基因且因此提供用于鉴别被转化的细胞的简单方法。pBR322、其衍生物或其它微生物质体或细菌噬菌体也可以含有或被修饰成含有可以由微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。用于具体抗体的表达的pBR322衍生物的实例详细地描述于Carter等人，美国专利案第5,648,237号中。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。举例来说，细菌噬菌体(如λGEM.TM.-11)可以用于制备重组载体，所述重组载体可以用于将敏感宿主细胞(如大肠杆菌LE392)转化。
本发明的表达载体可以包含编码各多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5′)的未被翻译的调节序列，其调节顺反子的表达。原核启动子通常分成两个类别，即诱导性和组成性。诱导性启动子是响应于培养条件的变化(例如，存在或不存在营养物，或温度的变化)而起始在其控制下的顺反子的增加的转录水平的启动子。
由各种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。借助于通过限制酶消化从源DNA移出启动子且将被分离的启动子序列插入本发明的载体，所选择的启动子可以可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。原生启动子序列和许多异源启动子都可以用于引导目标基因的扩增和/或表达。在一些实施例中，利用异源启动子，因为其与原生目标多肽启动子相比通常允许被表达的目标基因的更大的转录和更高的产率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统和杂交启动子，如tac或trc启动子。然而，在细菌中具有功能性的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适用的。其核苷酸序列已被公开，由此使得熟练的工作人员能够使用连接子或衔接子将其以可操作地方式接合至编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人，(1980)《细胞(Cell)》20：269)，以提供任何所需的限制位点。
在本发明的一个方面中，重组载体内的各顺反子包含分泌信号序列组分，其引导被表达的多肽跨越膜的易位。通常，信号序列可以是载体的组分，或其可以是插入载体中的目标多肽DNA的一部分。被选择用于本发明的目的的信号序列应是可以由宿主细胞识别和处理(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和处理异源多肽的原生信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用例如选自由以下组成的群组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)引导物、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施例中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面中，本发明的免疫球蛋白的产生可以在宿主细胞的细胞质中进行，且因此不需要在各顺反子内存在分泌信号序列。在此方面，免疫球蛋白轻链和重链是在存在或不存在掩蔽肽的序列、连接子序列等的情况下表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主品系(例如，大肠杆菌trxB品系)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此允许被表达的蛋白质子单元的适当折叠和组装。Proba和Pluckthun《基因(Gene)》，159：203(1995)。
本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质也可以使用其中可以调节被表达的多肽组分的定量比率，以最大化本发明的被分泌和适当组装的抗体的产率的表达系统来产生。这类调节是至少部分通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。
适用于表达本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物。适用的细菌的实例包括埃希氏杆菌(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、杆菌(例如，枯草杆菌(B.subtilis))、肠内细菌(Enterobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)物种(例如，绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏杆菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一个实施例中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施例中，使用大肠杆菌细胞作为用于本发明的宿主。大肠杆菌品系的实例包括品系W3110(Bachmann，《细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology)》，第2卷(Washington，D.C.：美国微生物学学会(American Society for Microbiology)，1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)和其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的品系33D3(美国专利案第5,639,635号)。其它品系和其衍生物也是合适的，如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)。这些实例是说明性而非限制性的。用于构建上文提及的任何具有既定基因型的细菌的衍生物的方法是所属领域中已知的且描述于例如Bass等人，《蛋白质(Proteins)》，8：309-314(1990)中。考虑到细菌的细胞中的复制子的复制能力，通常需要选择适当的细菌。举例来说，当使用众所周知的质体(如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供应复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以适合地用作宿主。通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，且可能需要将其它蛋白酶抑制剂并入细胞培养物中。
b)结合蛋白质产生
用上述表达载体将宿主细胞转化且在视需要被改良的常规营养培养基中培养以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得DNA是可复制的(以染色体外元件形式或通过染色体整合体)。取决于所使用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙进行的钙处理用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种用于转化的方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的原核细胞是在所属领域中已知且适用于培养所选择的宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括卢里亚培养液(luria broth；LB)加必要的营养补充剂。在一些实施例中，培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。举例来说，向培养基中添加安比西林以用于表达安比西林抗性基因的细胞的生长。
除碳、氮和无机磷酸盐来源以外，也可以包括适当浓度的以单独或与另一种补充剂或培养基(如复合氮来源)的混合物形式引入的任何必要的补充剂。任选地，培养基可以含有一种或多种选自由以下组成的群组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度下培养原核宿主细胞。在某些实施例中，对于大肠杆菌生长，生长温度在约20℃至约39℃、约25℃至约37℃范围内，或是约30℃。主要视宿主生物而定，培养基的pH值可以是在约5至约9范围内的任何pH值。在某些实施例中，对于大肠杆菌，pH值是约6.8至约7.4，或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导性启动子，那么在适合启动子活化的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面中，使用PhoA启动子控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养被转化的宿主细胞以进行诱导。在某些实施例中，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P.培养基(参见例如Simmons等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》(2002)，263：133-147)。如所属领域中已知，根据所使用的载体构建体，可以使用各种其它诱导剂。
在一个实施例中，被表达的本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质被分泌至宿主细胞的周质中且从其中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过如渗透休克、声波处理或溶解等手段。在破坏细胞后，通过离心或过滤来移出细胞碎片或完整细胞。可以例如通过亲和树脂色谱来进一步纯化蛋白质。或者，可以将蛋白质运送至培养基中且在其中分离。可以从培养物移出细胞，并且过滤且浓缩培养物上清液以进行所产生的蛋白质的进一步纯化。可以使用通常已知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析法(Western blot assay))进一步分离和鉴别被表达的多肽。
在本发明的一个方面中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质产生是通过发酵方法来大量进行。各种大规模分批进料发酵程序可以用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升容量且在某些实施例中，约1,000至100,000升容量。这些发酵器使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物，尤其葡萄糖。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约100升且可以在约1升至约100升范围内的发酵器中发酵。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常是在细胞在合适的条件下生长至所需密度(例如，OD550是约180-220)之后起始，在此阶段细胞处于早期固定相。根据所使用的载体构建体，可以使用各种诱导剂，如所属领域中已知和上文所描述。细胞可以在诱导之前生长较短的周期。通常将细胞诱导约12-50小时，但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以改良各种发酵条件。举例来说，为了改善所分泌的抗体多肽的适当组装和折叠，可以使用过表达伴随蛋白质(如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴随蛋白质活性的肽基脯氨酰顺，反-异构酶))的其它载体共同转化宿主原核细胞。已经证明伴随蛋白质可以促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等人，(1999)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》274：19601-19605；Georgiou等人，美国专利案第6,083,715号；Georgiou等人，美国专利案第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275：17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275：17106-17113；Arie等人，(2001)《分子微生物学(Mol.Microbiol.)》39：199-210。
为了最小化被表达的异源蛋白质(尤其对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解，可以将某些缺失蛋白水解酶的宿主品系用于本发明。举例来说，宿主细胞品系可以被修饰成实现编码已知细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI和其组合)的基因中的基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺失型品系是可用的且描述于例如Joly等人，(1998)，见上文；Georgiou等人，美国专利案第5,264,365号；Georgiou等人，美国专利案第5,508,192号；Hara等人，《微生物耐药性(Microbial DrugResistance)》，2：63-72(1996)中。
在一个实施例中，使用缺失蛋白水解酶且用过表达一种或多种伴随蛋白质的质体转化的大肠杆菌品系作为本发明的表达系统中的宿主细胞。
c)结合蛋白质纯化
在一个实施例中，进一步纯化本文中产生的被掩蔽的抗体蛋白质以获得基本上均质的制剂，以用于其它分析法和用途。可以使用所属领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序示例：在免疫亲和力或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上进行的色谱、色谱焦聚、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如葡聚糖凝胶G-75的凝胶过滤。
在一个方面中，使用固定在固相上的蛋白质A进行本发明的抗体产物的免疫亲和力纯化。蛋白质A是来自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白质，其以高亲和力结合于抗体的Fc区。Lindmark等人，(1983)《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62：1-13。固定蛋白质A的固相可以是包含玻璃或二氧化硅表面的柱，或受控微孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱涂有试剂，如甘油，以可能防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步骤，可以将来源于如上文所描述的细胞培养物的制剂施用于蛋白质A固定的固相上以实现相关抗体与蛋白质A的特异性结合。接着，洗涤固相以去除非特异性结合于固相的污染物。最终，通过洗脱从固相回收相关抗体。
10.使用真核宿主细胞产生结合蛋白质
用于真核宿主细胞中的载体通常包括以下非限制性组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主细胞中的载体还可以含有信号序列或其它在相关成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性裂解位点的多肽。所选择的异源信号序列可以是由宿主细胞识别且处理(即，由信号肽酶裂解)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌引导物(例如，单纯疱疹病毒gD信号)是可用的。用于这类前体区域的DNA在阅读框架中接合至编码抗体的DNA。
b)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。举例来说，SV40起点通常可仅因为其含有早期启动子而被使用。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为可选标记物。典型选择基因编码满足以下条件的蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如，安比西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)在相关情况下，补体营养缺陷，或(c)提供不可从复合培养基获得的重要营养物。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且由此经受住选择方案。这类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选标记物的另一实例是使得能够鉴别能够吸收编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的核酸的细胞的标记物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II、灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例来说，在一些实施例中，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养全部转化体来首先鉴别用DHFR选择基因转化的细胞。在一些实施例中，当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺失DHFR活性的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary；CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，用编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质、野生型DHFR蛋白质和另一种可选标记物(如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共同转化的宿主细胞(具体地说，含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有针对可选标记物(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中的细胞生长来选择。参见美国专利案第4,965,199号。宿主细胞可以包括NS0，包括缺失谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系。使用GS作为哺乳动物细胞的可选标记物的方法描述于美国专利案第5,122,464号和美国专利案第5,891,693号中。
d)启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子由宿主生物识别且可操作地连接至编码相关可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的核酸。已知真核生物的启动子序列。举例来说，几乎所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3′端处是AATAAA序列，其可以是用于将聚A尾区添加至编码序列的3′端的信号。在某些实施例中，可以将任何或所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
从哺乳动物宿主细胞中的载体进行的转录是例如通过从以下获得的启动子控制：病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、B型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；热休克启动子，限制条件是这类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以HindIII E限制性片段形式获得。用于使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利案第4,419,446号中。此系统的改进形式描述于美国专利案第4,601,978号中。还参见Reyes等人，《自然》297：598-601(1982)，其描述在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在鼠类细胞中表达人类β-干扰素cDNA。或者，劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可以用作启动子。
e)增强子元件组分
通常通过将增强子序列插入载体中来增加由高级真核生物进行的编码本发明的抗体的DNA的转录。现已从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)知晓许多增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点的晚期的SV40增强子(bp 100-270)、人类巨细胞病毒早期启动子增强子、小鼠巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的晚期的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv，《自然》297：17-18(1982)，其描述用于真核启动子的活化的增强子元件。可以在抗体多肽编码序列的5′或3′位置处将增强子剪接至载体中，但通常位于启动子的5′位点。
f)转录终止组分
真核宿主细胞中使用的表达载体还可以含有转录终止和使mRNA稳定所必需的序列。这类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5′且偶尔3′非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适用于在本文中的载体中克隆或表达DNA的宿主细胞包括本文中所描述的高级真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已变成常规程序。适用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚肾系(亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞；Graham等人，《普通病毒学杂志(J.GenVirol.)》36：59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，《美国国家科学院院刊》77：4216(1980))；鼠类支持细胞(murine sertoli cells)(TM4，Mather，《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝瘤系(Hep G2)。
用上述用于产生可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，且在视需要改良的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
h)培养宿主细胞
可以在各种培养基中培养用于产生本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的宿主细胞。可商购的培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium)((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，以下文献中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人，《酶学方法(Meth.Enz.)》58：44(1979)；Barnes等人，《生物化学期刊(Anal.Biochem.)》102：255(1980)；美国专利案第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利案Re.30,985。这些培养基中的任一种可以视需要补充有激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。所属领域的技术人员将已知，还可以包括适当浓度的任何其它补充剂。培养条件，如温度、pH值等，是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对所属领域的一般技术人员来说将是显而易见的。
i)结合蛋白质的纯化
当使用重组技术时，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质可以在细胞内产生，或直接分泌至培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除微粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。当将可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质分泌至培养基中时，可以首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在任一前述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是便利的技术。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同型。蛋白质A可以用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，《免疫学方法杂志》62：1-13(1983))。建议将蛋白质G用于所有小鼠同型和人类γ3(Guss等人，《欧洲分子生物学会杂志》5：15671575(1986))。与亲和配体连接的基质可以是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质，如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与琼脂糖相比可以实现更快的流动速率和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)适用于纯化。取决于待回收的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，如在离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，包含相关被掩蔽的结合蛋白质和污染物的混合物可以经历进一步纯化，例如通过在约2.5-4.5之间的pH值下使用洗脱缓冲液，在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行的低pH值疏水性相互作用色谱。
通常，用于制备用于研究、测试和临床用途的抗体的各种方法是所属领域中公认的、与上述方法一致和/或被所属领域的技术人员视为适用于相关具体抗体。
IV.组合物
在一些方面中，本文中还提供包含本文中所描述的任何可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的组合物(例如，医药组合物)。
通过将具有所需纯度的活性成分与任选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存的治疗配制物(《雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)》，第20版，Lippincott Williams&Wiklins，Pub.，Gennaro编，Philadelphia，Pa.2000)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的，且包括缓冲剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸、甲硫胺酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)、螯合剂(如EDTA和/或非离子性表面活性剂)。
可以使用缓冲剂将pH值控制在使治疗有效性最佳化的范围内，尤其在稳定性是pH值依赖性的情况下。缓冲剂可以按约20mM至约250mM范围内的浓度存在。适合与本发明一起使用的缓冲剂包括有机和无机酸以及其盐。举例来说，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。此外，缓冲剂可以包含组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
可以添加防腐剂以防止微生物成长，且通常以约0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。适合与本发明一起使用的防腐剂包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯甲烃铵卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可以存在张力剂，有时被称为″稳定剂″，以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型、带电生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，其通常被称为″稳定剂″，因为其可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张力剂可以按约0.1％至约25重量％之间或约1至约5重量％之间的任何量存在。在一些实施例中，张力剂包括多羟基糖醇、三羟基或更高级糖醇，如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其它赋形剂包括可以充当以下中的一种或多种的试剂：(1)膨胀剂，(2)溶解性增强剂，(3)稳定剂，和(4)防止变性或粘附至容器壁的试剂。这类赋形剂包括：多羟基糖醇(上文列举)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含有硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫基硫酸钠；低分子量蛋白质，如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉籽糖；和多糖，如糊精或聚葡萄糖。
可以存在非离子性表面活性剂或洗涤剂(也称为″湿润剂″)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质避免搅拌诱导的聚集，其亦允许配制物暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子性表面活性剂是以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。在一些实施例中，非离子性表面活性剂是以约0.001％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.025％w/v的范围存在。
合适的非离子性表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)；聚氧化物(184、188等)；
Figure BDA0003230734600001121
多元醇；
Figure BDA0003230734600001122
；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0003230734600001123
-20、
Figure BDA0003230734600001124
-80等)；聚桂醇400；硬脂酸聚烃氧40；聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60；丙三醇单硬脂酸酯；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子性洗涤剂包括月桂基硫酸钠、二辛基磺基丁二酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将配制物用于体内给药，其必须是无菌的。可以借助于通过无菌过滤膜过滤来是配制物变得无菌。本文中的治疗性组合物通常置放于具有无菌接入端口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
给药途径是根据已知的和可接受的方法，如通过在长时段内以合适的方式进行单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径进行注射或输注、局部给药、吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)可以单独或与其它治疗剂组合使用，如在本文中所描述的方法中。术语″组合″涵盖相同或单独的配制物中所包括的两种或更多种治疗剂(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质和治疗剂)。在一些实施例中，″组合″是指″同时″给药，在此情况下，本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的给药是与一种或多种其它治疗剂的给药同时进行(例如，在相同时间或可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的给药与一种或多种其它治疗剂的给药之间的间隔小于一小时)。在一些实施例中，″组合″是指依序给药，在此情况下，本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的给药是在一种或多种其它治疗剂的给药之前和/或之后进行(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质的给药与一种或多种其它治疗剂的给药之间的间隔大于一小时)。本文中所涵盖的药剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子的药剂、靶向免疫刺激性分子的药剂或生长抑制剂。
本文中的配制物还可以含有超过一种视需要用于所治疗的具体适应症的活性化合物，优选具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性化合物。或者或另外，组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子或刺激性分子的药剂或生长抑制剂。这类分子宜以有效用于预期目的的量以组合方式存在。
V.治疗方法
本文中提供用于治疗或预防受试者中的疾病的方法，其包含向受试者给予有效量的本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)或其组合物。在一些实施例中，受试者(例如，人类患者)被诊断患有赘生性病症(例如，癌症)或具有产生这类病症的风险。
对于疾病的预防或治疗，活性剂的适当剂量将取决于如上文所定义的所治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和过程、所给予的药剂是否是用于预防性或治疗剂目的、先前疗法、个体的临床病史和对药剂的反应以及主治医生的判断。适当地一次性或在一系列治疗中向受试者给予药剂。在本文中所描述的方法的一些实施例中，所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)的给药之间的间隔是约一个月或更长。在一些实施例中，给药之间的间隔是约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月或更长。如本文中所使用，给药之间的间隔是指抗体的一次给药与抗体的下一次给药之间的时段。如本文中所使用，约一个月的间隔包括四周。在一些实施例中，给药之间的间隔是约两周、约三周、约四周、约八周、约十二周、约十六周、约二十周、约二十四周或更长。在一些实施例中，治疗包括抗体的多次给药，其中给药之间的间隔可以变化。举例来说，第一次给药与第二次给药之间的间隔是约一个月，且后续给药之间的间隔是约三个月。在一些实施例中，第一次给药与第二次给药之间的间隔是约一个月，第二次给药与第三次给药之间的间隔是约两个月且后续给药之间的间隔是约三个月。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以均一剂量给予。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是用于向患者给药的初始候选剂量，不管是例如通过一次或多次单独给药还是通过连续输注。取决于上文所提及的因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于在数天或更长时间内重复给药，取决于病状，治疗通常将是持续的，直至出现疾病症状的所需抑制。抗体的一个例示性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg范围内。因此，可以向患者给予约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以每次给药约25mg至约500mg的剂量给予受试者。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约10mg/kg的剂量给予受试者。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg或10.0mg/kg中的任一种的剂量给予受试者。在一些实施例中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是以0.1mg/kg与10mg/kg之间或约0.1mg/kg与10mg/kg之间、10mg/kg与20mg/kg之间或约10mg/kg与20mg/kg之间、20mg/kg与30mg/kg之间或约20mg/kg与30mg/kg之间、30mg/kg与40mg/kg之间或约30mg/kg与40mg/kg之间、40mg/kg与50mg/kg之间或约40mg/kg与50mg/kg之间、50mg/kg与60mg/kg之间或约50mg/kg与60mg/kg之间、60mg/kg与70mg/kg之间或约60mg/kg与70mg/kg之间或70mg/kg与80mg/kg之间或约70mg/kg与80mg/kg之间的剂量给予受试者。可以使用上文所描述的任何给药频率。
本文中所涵盖的治疗方法是用本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)治疗病症或疾病。可以用本发明的配制物治疗的病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma))或睾丸癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防癌症的方法。如本文中所使用，术语″癌症″是指发现于哺乳动物中的所有癌症、赘瘤或恶性肿瘤类型，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌瘤和肉瘤。可以用本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)、医药组合物或方法治疗的例示性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳癌(例如，三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法抗性、赫赛汀抗性(Herceptin resistant)、HER2阳性、小红莓抗性、他莫昔芬(tamoxifen)抗性、乳腺管癌瘤、小叶癌瘤、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。其它实例包含甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或神经管胚细胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin′s Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性神经胶母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺赘瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质癌瘤、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌瘤、乳头佩吉特氏病(Paget′s Disease ofthe Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、乳腺管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防白血病的方法。术语″白血病″大体上是指血液形成器官的进行性恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中白细胞和其前体的畸变增殖和发育为特征。通常基于以下对白血病进行临床上分类：(1)疾病的持续时间和特征-急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型；骨髓(骨髓性)、淋巴(淋巴性)或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞数量的增加或不增加-白血病或白细胞缺乏症(亚白血性)。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的例示性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、白细胞缺乏性白血病、白细胞性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎白血病、嗜伊红白血病、鼠白血病、毛细胞白血病、血母细胞性白血病、血胚细胞白血病、组织细胞白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、骨髓细胞性白血病、骨髓粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、里德尔(Rieder)细胞白血病、希林氏白血病(Schilling′s leukemia)、干细胞白血病、亚白血性白血病或未分化型细胞白血病。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防肉瘤的方法。术语″肉瘤″通常是指由如胚胎结缔组织的物质组成且通常由包埋于纤维状或均质物质中的紧密包装细胞构成的肿瘤。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝西肉瘤(Abemethy′s sarcoma)、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软部分肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄样肉瘤、绿色癌肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、威尔姆斯氏瘤肉瘤(Wilms′tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金氏肉瘤(Hodgkin′s sarcoma)、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen′ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、库普弗细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤(leukosarcoma)、恶性间皮瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯氏肉瘤(Rous sarcoma)、浆液性囊肿肉瘤(serocystic sarcoma)、滑膜肉瘤或毛细血管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防黑素瘤的方法。术语″黑素瘤″是指由皮肤和其它器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无色素性黑素瘤、良性青少年黑素瘤、克劳德曼黑素瘤(Cloudman′s melanoma)、S91黑素瘤、哈丁-帕西黑素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年黑素瘤、雀斑样痣性黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲下黑素瘤或浅表扩散性黑素瘤。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防癌瘤的方法。术语″癌瘤″是指由上皮细胞组成的恶性新生长，倾向于浸润周围组织且引起转移。可以用本文中所提供的化合物、医药组合物或方法治疗的例示性癌瘤包括例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌、腺样囊性癌症、腺癌、肾上腺皮质癌瘤、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞瘤、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑状癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、管癌、乳腺管癌瘤、硬癌、胚胎癌瘤、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶质癌、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌瘤、许特莱氏细胞腺癌(Hurthle cell carcinoma)、透明质癌、肾上腺样癌瘤、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔氏癌(Krompecher′s carcinoma)、库尔契茨基氏细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌、豆状癌瘤、脂瘤样癌、小叶癌瘤、淋巴上皮癌、髓质癌、髓质癌瘤、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液性癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液质癌、粘液样癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门脉周癌、浸润前期癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬性癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭细胞癌、髓样癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌、血管扩张癌、移行细胞癌、结节性皮癌、管状癌、结节状皮癌、疣状癌或绒毛状癌。
在一些实施例中，本文中提供通过给予本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)来治疗或预防转移性癌症的方法。如本文中所使用，术语″转移″、″转移性″和″转移性癌症″可以互换使用，并且是指赘生性疾病或病症(例如，癌症)从一个器官或另一个不相邻的器官或身体部分的扩散。癌症发生在起始位点处，例如乳房，所述位点被称为原发性肿瘤，例如原发性乳癌。原发性肿瘤或起始部位中的一些癌细胞获得了穿透和浸润局部区域中的周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁，通过系统循环到身体内的其它部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床上可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的细胞相似。因此，如果肺癌转移至乳房，那么乳房部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳房细胞组成。乳房中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤且患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的受试者是指其中受试者患有原发性肿瘤但不患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。举例来说，转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤的病史且在例如乳房中第二位置或多个位置处具有一个或多个继发性肿瘤的受试者的疾病。
在一些实施例中，可以由本文中所描述的被掩蔽的CTLA4结合蛋白质获益的疾病或病症包括由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)的疾病(例如，糖尿病)、癌症(例如，前列腺癌、肾癌、转移性癌症、黑素瘤、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、神经胶母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性骨髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤)，或由CTLA4或CTLA4活性或功能引起(完全或部分)的疾病的症状。
VI.制品或试剂盒
在另一方面中，提供制品或试剂盒，其包含本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。制品或试剂盒可以进一步包含结合蛋白质在本发明的方法中的使用说明书。因此，在某些实施例中，制品或试剂盒包含在用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)的方法中使用可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)的说明，其包含向个体给予有效量的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在某些实施例中，个体是人类。在一些实施例中，个体患有选自由以下组成的群组的疾病：白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
制品或试剂盒可以进一步包含容器。合适的容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(如单室或双室注射器)和试管。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。容器收纳配制物。在一些实施例中，配制物是冻干配制物。
制品或试剂盒可以进一步包含容器上或与容器相关联的标签或包装插页，其可以指示重组和/或使用配制物的说明。标签或包装插页可以进一步指示配制物适用于或意图用于皮下、静脉内或其它给药模式，以用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)。收纳配制物的容器可以是单次使用式小瓶或多次使用式小瓶，其允许被复原的配制物的重复给药。制品或试剂盒可以进一步包含第二容器，其包含合适的稀释剂。制品或试剂盒可以进一步包括由市售、治疗和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在特定实施例中，本发明提供用于单一剂量给药单元的试剂盒。这类试剂盒包含治疗性抗体的水性配制物的容器，包括单腔室或多腔室预填充注射器。例示性预填充注射器可以从Vetter GmbH，Ravensburg，Germany获得。
本文中的制品或试剂盒任选地进一步包含有包含第二药剂的容器，其中可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是第一药剂，且所述制品或试剂盒进一步包含标签或包装插页上的关于用有效量的第二药剂治疗受试者的说明。
在另一实施例中，本文中提供制品或试剂盒，其包含用于在自动注射器装置中给药的本文中所描述的配制物。自动注射器可以被描述为在启动后将递送其内含物，而无需患者或管理员采取其它必要措施的注射装置。其在递送速率必须是恒定的且递送时间超过数分钟时尤其适于治疗性配制物的自行给药。
例示性实施例
所提供的例示性实施例包括：
1.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和
b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列，
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。
2.根据实施例1所述的被掩蔽的抗体，其中
a)第一链是轻链；和
b)第二链是重链。
3.根据实施例1或2所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。
4.根据实施例1所述的被掩蔽的抗体，其中
a)第一链是轻链可变结构域；和
b)第二链是重链可变结构域。
5.根据实施例1-4中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗原结合片段是dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。
6.根据实施例1-5中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。
7.根据实施例1-6中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含：
a)第一间隔连接子和可裂解肽；或
b)第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子。
8.根据实施例1-7中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中可裂解肽包含选自SEQ IDNO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。
9.根据实施例1-8中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中：
a)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端和/或C端；或
b)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端，且第二间隔连接子直接连接至可裂解肽的C端。
10.根据实施例7-9中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中第一间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列；和/或第二间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
11.根据实施例1-10中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
12.根据实施例1-10中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。
13.根据实施例12所述的被掩蔽的抗体，其中所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
14.根据实施例1-13中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中按N至C端或C至N端方向，所述被掩蔽的抗体包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链。
15.根据实施例14所述的被掩蔽的抗体，其中
a)被掩蔽的抗体包含掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；和
b)被掩蔽的抗体包含可裂解肽与结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段之间的间隔连接子。
16.根据实施例1-15中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
17.根据实施例1-16中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段是鼠类抗体。
18.根据实施例1-16中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。
19.根据实施例1-18中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
20.根据实施例19所述的被掩蔽的抗体，其中IgG1包含以下氨基酸取代：
a)S298A、E333A和K334A；
b)S239D和I332E；
c)S239D、A330L和I332E；
d)P247I和A339D或A339Q；
e)D280H、K290S(存在或不存在S298D或S298V)；
f)F243L、R292P和Y300L；
g)F243L、R292P、Y300L和P396L；
h)F243L、R292P、Y300L、V305Ｉ和P396L；
i)G236A、S239D和Ｉ332E；
j)K326A和E333A；
k)K326W和E333S；或
1)K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；
其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
21.根据实施例1-20中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中：
a)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
22.根据实施例1-21中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。
23.根据实施例22所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO：237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。
24.根据实施例1-21中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的重链可变区；或
b)包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。
25.根据实施例24所述的被掩蔽的抗体，其中抗体包含有包含选自SEQ ID NO：327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。
26.根据实施例24或实施例25所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链；或抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链和包含SEQID NO：478的氨基酸序列的重链。
27.根据实施例1-26中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。
28.根据实施例1-27中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。
29.根据实施例28所述的被掩蔽的抗体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
30.根据实施例1-29中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含SEQID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
31.根据实施例1-30中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
32.根据实施例31所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
33.根据实施例32所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
34.一种被掩蔽的双特异性抗体，其包含：
a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和
c)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列，
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至第一对的轻链或重链的氨基端或羧基端。
35.根据实施例34所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。
36.根据实施例34或35所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含：
a)第一间隔连接子和可裂解肽；或
b)第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子。
37.根据实施例34-36中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。
38.根据实施例36或实施例37所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中：
a)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端或C端；或
b)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端，且第二间隔连接子直接连接至可裂解肽的C端。
39.根据实施例36-38中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列；和/或第二间隔连接子包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
40.根据实施例34-39中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
41.根据实施例34-40中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。
42.根据实施例41所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
43.根据实施例34-42中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中按N至C端或C至N端方向，第一对的轻链或重链包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)轻链或重链。
44.根据实施例43所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中
a)第一对包含掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；和
b)第一对包含可裂解肽与轻链或重链之间的间隔连接子。
45.根据实施例34-44中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中被掩蔽的双特异性抗体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
46.根据实施例34-45中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中双特异性抗体是鼠类抗体。
47.根据实施例34-45中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。
48.根据实施例34-47中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
49.根据实施例48所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中IgG1包含以下氨基酸取代：
a)S298A、E333A和K334A；
b)S239D和I332E；
c)S239D、A330L和I332E；
d)P247I和A339D或A339Q；
e)D280H、K290S(存在或不存在S298D或S298V)；
f)F243L、R292P和Y300L；
g)F243L、R292P、Y300L和P396L；
h)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；
i)G236A、S239D和I332E；
j)K326A和E333A；
k)K326W和E333S；或
l)K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E，
其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
50.根据实施例34-49中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中：
a)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
51.根据实施例34-50中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含有包含SEQ ID NO：232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列的重链可变区。
52.根据实施例51所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含有包含选自SEQID NO：237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：319或320的氨基酸序列的重链。
53.根据实施例34-50中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含：
a)包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列的重链可变区；或
b)包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的重链可变区。
54.根据实施例53所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含有包含选自SEQID NO：327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO：366-380、421和478的氨基酸序列的重链。
55.根据实施例53或实施例54所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对包含有包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链；或第一对包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的重链。
56.根据实施例34-55中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。
57.根据实施例34-56中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。
58.根据实施例57所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
59.根据实施例34-58中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中被掩蔽的双特异性抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
60.根据实施例34-59中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中被掩蔽的双特异性抗体与药剂结合。
61.根据实施例60所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
62.根据实施例60所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
63.一种被掩蔽的嵌合受体，其包含：
a)结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；
b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO：1-46的氨基酸序列，
c)跨膜结构域；和
d)细胞内信号传导结构域，其包含信号传导结构域，
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至配体结合结构域的第一链或第二链的氨基端或羧基端。
64.根据实施例63所述的被掩蔽的嵌合受体，其中
a)第一链是轻链可变结构域；和
b)第二链是重链可变结构域。
65.根据实施例63或64所述的被掩蔽的嵌合受体，其中掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的连接子。
66.根据实施例63-65中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中包含可裂解肽的连接子包含：
a)第一间隔连接子和可裂解肽；或
b)第一间隔连接子、可裂解肽和第二间隔连接子。
67.根据实施例63-66中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中可裂解肽包含选自SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。
68.根据实施例66或实施例67所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端或C端；或
b)第一间隔连接子直接连接至可裂解肽的N端，且第二间隔连接子直接连接至可裂解肽的C端。
69.根据实施例68所述的被掩蔽的嵌合受体，其中第一间隔连接子包含选自由SEQID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列；和/或第二间隔连接子包含选自由SEQID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
70.根据实施例63-69中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
71.根据实施例63-70中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。
72.根据实施例71所述的被掩蔽的嵌合受体，其中所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
73.根据实施例63-72中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中按N至C端或C至N端方向，配体结合结构域的第一链或第二链包含：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)第一链或第二链。
74.根据实施例73所述的被掩蔽的嵌合受体，其中
a)配体结合结构域包含掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔连接子；和
b)配体结合结构域包含可裂解肽与第一链或第二链之间的间隔连接子。
75.根据实施例63-74中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中被掩蔽的嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
76.根据实施例63-75中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)第一链包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)第一链包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)第一链包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)第一链包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
77.根据实施例63-76中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中第一链包含SEQ IDNO：232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：233的氨基酸序列。
78.根据实施例63-76中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)第一链包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)第一链包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
79.根据实施例63-78中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中可裂解肽是与表达CTLA4的细胞或组织共同位于一个区域中的蛋白酶的底物。
80.根据实施例63-79中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABHD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTR1、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。
81.根据实施例80所述的被掩蔽的嵌合受体，其中可裂解肽是由一种或多种选自由以下组成的群组的酶裂解：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
82.一种核酸，其编码根据实施例1-33、100-112和139-148中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例34-62和113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例63-82和122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
83.一种载体，其包含根据实施例82所述的核酸。
84.根据实施例83所述的载体，其是表达载体。
85.一种宿主细胞，其包含根据实施例82所述的核酸。
86.一种用于制备被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的方法，其包含在产生所述被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的条件下培养根据实施例85所述的宿主细胞。
87.根据实施例86所述的方法，其中所述宿主细胞具有α1，6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除。
88.根据实施例86或87所述的方法，其中所述宿主细胞过表达β1，4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)。
89.根据实施例88所述的方法，其中所述宿主细胞还过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)。
90.根据实施例86-89中任一项所述的方法，其进一步包含回收由宿主细胞产生的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。
91.一种被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体，其是由根据实施例86-90中任一项所述的方法产生。
92.一种组合物，其包含根据实施例1-33、100-112和139-148中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例34-62和113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例63-82和122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
93.一种组合物，其包含根据实施例91所述的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。
94.一种医药组合物，其包含根据实施例1-33、100-112和139-148中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例34-62和113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例63-82和122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体和医药学上可接受的载剂。
95.一种医药组合物，其包含根据实施例91所述的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体和医药学上可接受的载剂。
96.一种试剂盒，其包含根据实施例1-33、100-112和139-148中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例34-62和113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体、根据实施例63-82和122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体或根据实施例92-95中任一项所述的组合物。
97.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据实施例1-33、100-112和139-148中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例34-62和113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体、根据实施例63-82和122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体或根据实施例92-95中任一项所述的组合物。
98.根据实施例97所述的方法，其中所述赘生性疾病是癌症。
99.根据实施例98所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
100.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46；
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至VL结构域或VH结构域的氨基端或羧基端。
101.根据实施例100所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
102.根据实施例100或101所述的被掩蔽的抗体，其中可裂解肽包含氨基端和羧基端，且包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中第一间隔连接子连接至可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且第二间隔连接子连接至可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
103.根据实施例100-102中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
104.根据实施例100-103中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
105.根据实施例100-104中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。
106.根据实施例100-105中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中：
a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
107.根据实施例100-106中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
108.根据实施例100-107中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中VL结构域包含于轻链内，所述轻链包含选自由SEQ ID NO：327-341组成的群组的氨基酸序列，且VH结构域包含于重链内，所述重链包含选自由SEQ ID NO：366-380、421和478组成的群组的氨基酸序列。
109.根据实施例100-108中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
110.根据实施例100-109中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
111.根据实施例110所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
112.根据实施例110所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是类美登素、阿瑞他汀、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康衍生物Dxd。
113.一种被掩蔽的双特异性抗体，其包含：
a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和
c)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46，
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至第一对的轻链或重链的氨基端或羧基端。
114.根据实施例113所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
115.根据实施例113或114所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中可裂解肽包含氨基端和羧基端，且包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中第一间隔连接子连接至可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且第二间隔连接子连接至可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
116.根据实施例113-115中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
117.根据实施例113-116中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中被掩蔽的双特异性抗体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
118.根据实施例113-117中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对的轻链包含VL结构域，且第一对的重链包含VH结构域，其中：
a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
119.根据实施例113-118中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
120.根据实施例113-119中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中第一对的轻链包含选自由SEQ ID NO：327-341组成的群组的氨基酸序列，且第一对的重链包含选自由SEQ ID NO：366-380、421和478组成的群组的氨基酸序列。
121.根据实施例113-120中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中被掩蔽的双特异性抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
122.一种被掩蔽的嵌合受体，其包含：
a)结合于CTLA4的包含VL结构域和VH结构域的配体结合结构域；
b)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46；
c)跨膜结构域；和
d)细胞内信号传导结构域，其包含信号传导结构域，
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至VL结构域或VH结构域的氨基端或羧基端。
123.根据实施例122所述的被掩蔽的嵌合受体，其中包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
124.根据实施例122或123所述的被掩蔽的嵌合受体，其中可裂解肽包含氨基端和羧基端，且包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中第一间隔连接子连接至可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且第二间隔连接子连接至可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
125.根据实施例122-124中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
126.根据实施例122-125中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中被掩蔽的嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
127.根据实施例122-126中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
128.根据实施例122-127中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
129.一种核酸，其编码根据实施例100-112中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
130.一种载体，其包含根据实施例129所述的核酸。
131.一种宿主细胞，其包含根据实施例129所述的核酸。
132.一种用于制备被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的方法，其包含在产生所述被掩蔽的抗体的条件下培养根据实施例131所述的宿主细胞。
133.一种被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体，其是由根据实施例132所述的方法产生。
134.一种组合物，其包含根据实施例100-112中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
135.一种医药组合物，其包含根据实施例100-112中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体和医药学上可接受的载剂。
136.一种试剂盒，其包含根据实施例100-112中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
137.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据实施例100-112中任一项所述的被掩蔽的抗体、根据实施例113-121中任一项所述的被掩蔽的双特异性抗体或根据实施例122-128中任一项所述的被掩蔽的嵌合受体。
138.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据实施例135所述的医药组合物。
139.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至VL结构域的氨基端；
其中包含可裂解肽的连接子包含有包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的可裂解肽；
其中(a)VL结构域包含有包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且VH结构域包含有包含SEQ IDNO：411的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或(b)VL结构域包含有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且VH结构域包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
140.根据实施例139所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含SEQID NO：454的氨基酸序列。
141.根据实施例139或140所述的被掩蔽的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
142.根据实施例139-141中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中VL结构域包含于轻链中，所述轻链包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列，且VH结构域包含于重链中，所述重链包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
143.根据实施例139-142中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO：358的氨基酸序列和SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
144.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列；
其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至VL结构域的氨基端；
其中包含可裂解肽的连接子包含有包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的可裂解肽；
其中(a)VL结构域包含有包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且VH结构域包含有包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或(b)VL结构域包含有包含SEQ IDNO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且VH结构域包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
145.根据实施例144所述的被掩蔽的抗体，其中包含可裂解肽的连接子包含SEQID NO：455的氨基酸序列。
146.根据实施例144或145所述的被掩蔽的抗体，其中VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
147.根据实施例144-146中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中VL结构域包含于轻链中，所述轻链包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列，且VH结构域包含于重链中，所述重链包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
148.根据实施例144-147中任一项所述的被掩蔽的抗体，其中被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO：422的氨基酸序列和SEQ ID NO：421的氨基酸序列。
实例
通过参考以下实例将更充分地理解本发明。然而，其不应被解释为限制本发明的范围。应理解，本文中所描述的实例和实施例是仅出于说明性目的，并且根据其进行的各种修改或改变将由所属领域的技术人员想到并且包括在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。
实例1：产生可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体
从BioXcell购得抗CTLA4抗体，即9D9 muIgG2b mAb(9D9 mAb)，以用于生物淘选实验。对于所有其它实验，产生对小鼠CTLA4具有反应性的亲本抗CTLA4抗体(9D9)、可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)和不可裂解被掩蔽的抗CTLA4抗体(不可裂解被掩蔽的9D9)且在ATUM纯化。
可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体、亲本抗CTLA4抗体和不可裂解被掩蔽的抗CTLA4抗体是使用由表达质粒pD2610-v5(ATUM，Newark CA)进行的HEK293瞬时表达来制备且使用小鼠IgG2a同型通过基因合成(ATUM，Newark CA)来产生。在转染之后七天，收集来自被转染的细胞的上清液，且用KanCapA树脂(Kaneka)纯化被掩蔽的抗CTLA4抗体和亲本抗CTLA4抗体且缓冲液交换至磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中。接着，使用Source S或Capto S ImpAct(GE)通过离子交换来进一步纯化抗体。通过分光光度计在OD280的光学密度下确定抗体浓度。
通过从噬菌体呈现肽库生物淘选空间遮挡肽来获得上文所描述的被掩蔽的9D9抗体和不可裂解被掩蔽的9D抗体中所含的掩蔽肽。首先在室温下历时30分钟在ProteinG磁珠(MB)(Thermo Fisher Scientific)上捕获9D9 muIgG2b mAb(BioXcell)。在用脱脂乳阻断9D9muIgG2b mAb固定的MB之后，添加Ph.D.TM-C7C噬菌体肽库(New England BioLabs)以筛选空间遮挡肽。在室温下培育30分钟，接着剧烈地洗涤未结合的噬菌体之后，用0.2M甘氨酸(pH 2.2)将结合的噬菌体洗脱至pH值中和溶液中。通过感染至大肠杆菌K12 ER2738(NewEngland BioLabs)来扩增被洗脱的噬菌体，以用于下一轮生物淘选。进行后续三轮生物淘选以及使用同型对照(BioXcell)的额外一轮阴性分选，以消除在9D9 mAb CDR的外部结合的肽。实现在9D9 mAb与小鼠CTLA4之间的界面处特异性结合的肽的鉴别和富集。
在最后一轮生物淘选之后，通过ELISA来评估来自被富集的群体的各个纯系与9D9mAb的特异性结合。在存在或不存在等摩尔的muCTLA4-hsIgG(R&D Systems)的情况下，在4℃下将9D9 mAb涂布于96孔MaxiSorp板(Thermo Fisher Scientific)上过夜。向用脱脂乳阻断的板中一式三份地添加显示独特肽的各个噬菌体且在室温下培育1小时。在剧烈地洗涤未结合的噬菌体之后，使用HRP结合的抗M13抗体(GE Healthcare)和HRP底物(Sigma-Aldrich)检测结合的噬菌体。在微板读取器(Synergy HT，BioTek)中测量在405nm下的吸光度。
选择产生高9D9结合信号且抑制小鼠CTLA4与9D9 mAb的结合的纯系且提取DNA以用于测序。选择来自编码肽CNLIVEGHC的噬菌体的序列以用于后续代表性实验。
对于可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(被掩蔽的9D9)的设计，在高分辨率(
Figure BDA0003230734600001471
，表3)下确定9D9 Fab与肽CNLIVEGHC的复合物的结构特征。在37℃下用木瓜蛋白酶树脂(Sigma)裂解9D9过夜。通过蛋白质-A、阳离子交换(HiTrap SP-FF，GE Healthcare)和尺寸排阻(Superdex S75，GE Healthcare)柱色谱来纯化Fab。用0.2M甲酸钠和23％(w/v)PEG3350作为母液，使用悬滴汽相扩散法获得10mM Tris-HCl pH 8.0、25mM NaCl、1mM EDTA中的被纯化的Fab的晶体。在低温保护剂(35％(w/v)内消旋赤藻糖醇和储集溶液的1∶1混合物)中收集晶体且用具有Rigaku RAXIS IV++检测器的Rigaku MicroMax007-HF旋转阳极衍射仪收集数据。在100K下，在
Figure BDA0003230734600001472
下收集原生数据且使用XDS处理，产生针对
Figure BDA0003230734600001482
的98.5％完整数据集。使用由CCP4套件中的移相器和曲妥珠单抗Fab(PDB ID：4IOI)进行的作为搜索模型的分子置换来产生初始相。参见Donaldson J.M.等人，《国家科学院院刊(PNAS.)》，110：17456-61，(2013)。在Coot中进行若干轮人工构建，接着使用由Phenix进行的优化以产生最终模型。数据收集和优化统计数据列举于表3中。使用软件PDBePISA来表征表4中的抗体-肽界面。确定的是，CNLIVEGHC肽结合于9D9抗体的重链与轻链之间的界面处的CDR环。肽：9D9 Fab界面由5个氢键组成(表4)，产生375
Figure BDA0003230734600001483
的相互作用表面积。9D9 Fab的静电表面表示法展示重链与轻链的抗原结合位点界面处的大型疏水性区域。CNLIVEGHC肽的中心Leu-Ile-Val模体包埋在此界面处。模型指示CNLIVEGHC肽的C端指向轻链的N端。肽的羧基碳与轻链(残基Asp1)的酰胺氮之间的距离是
Figure BDA0003230734600001484
。选择含有MMP2/7/9裂解位点的肽将9D9抗体连接至肽。参见Turk B.E.等人，《自然生物技术(Nat Biotech)》，19：661-667，(2001)。使用甘氨酸和丝氨酸氨基酸来桥联N与C端间隙。此外，使MMP2/7/9底物序列突变以产生被掩蔽的抗CTLA4抗体的‘不可裂解’版本(不可裂解的被掩蔽的9D9)。
表3.X射线衍射数据和优化统计数据
Figure BDA0003230734600001481
Figure BDA0003230734600001491
表4.空间上被遮挡的肽与9D9-Fab之间的氢键
Figure BDA0003230734600001492
实例2：确定掩蔽肽与抗CTLA4抗体之间的结合亲和力
确定合成CNLIVEGHC肽对9D9抗体的结合亲和力。
方法
在37℃下用GE Biacore T200仪器进行表面等离子共振。在100RU固定水平下将9D9抗体和同型对照(参考通道)与CM5芯片(GE Healthcare)偶合。合成肽且在HBS-EP+操作缓冲液(GE Healthcare)中稀释。使用Biacore评估软件，3.0版分析结合数据。
结果
使用稳态模型，如由SPR确定的合成CNLIVEGHC肽与9D9抗体的结合亲和力是11E-6±2.3E-6M(图1)。阴性对照肽不与9D9抗体结合且CNLIVEGHC肽不与同型对照抗体结合。这些结果表明从噬菌体库选择的肽对9D9抗体具有特异性。
实例3A：结合于小鼠CTLA4的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体外表征
方法
被掩蔽的抗原结合位点的评估
在TBS中用小鼠CTLA4-Fc(R&D Systems)将ELISA板涂布过夜且接着用具有0.05％Tween 20的TBS洗涤，且用含1％BSA的PBS阻断，接着用具有Tween 20的TBS洗涤。使亲本抗CTLA4抗体和被掩蔽的抗CTLA4抗体于PBS中的稀释物与CTLA4结合60分钟，接着用TBSTween 20洗涤。用抗muKappa-HRP(Abcam)和Super Signal Pico化学发光底物检测结合。由裂解前的被掩蔽的抗CTLA4抗体的EC50与亲本抗CTLA4抗体的EC50确定掩蔽率。
蛋白酶裂解的测试
将亲本抗CTLA4抗体和被掩蔽的抗CTLA4抗体与含6nM MMP2(R&D Systems)的150mM NaCl、50mM Tris(pH 7.5)、10mM CaCl2、0.02％NP-40一起在37℃下培育过夜。使用″任何无Kd染色的预制聚丙烯酰胺凝胶″(Bio-Rad)，通过上文所描述的ELISA和还原的SDS-PAGE分析来测试抗体稀释物与小鼠CTLA4-Fc的结合。
结果
可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体呈现低90倍的与小鼠CTLA4的结合(图2A)。被掩蔽的抗CTLA4抗体的蛋白酶活化完全恢复抗体与小鼠CTLA4的结合，达到与亲本抗CTLA4抗体类似的水平(图2A)。
实例3B：结合于小鼠CTLA4的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体和不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体外表征
方法
低密度抗原结合ELISA
以与以下描述基本上类似且通常符合所属领域中已知的方法的方式进行所有ELISA。用每孔3ng muCTLA4hsIgG蛋白质(Abcam)涂布Polysterene 96孔微板(ThermoFisher Scientific)且在4℃下储存过夜。板用含0.1％Tween的TBS(TBS-T)洗涤，在4℃下用含1％BSA(Fisher)的PBS阻断2小时且用TBS-T洗涤。向板中添加测试抗体于含0.05％Tween+1％BSA的PBS(PBS-TB)中的连续稀释物且在室温下培育1小时。在用TBS-T洗涤之后，将在PBS-TB中以1：4000稀释的HRP结合的山羊抗小鼠κ轻链抗体(Abcam)施用于各孔且在室温下培育1小时。用TBS-T洗涤板，将化学发光HRP底物施用于板且使用分光光度计(SynergyHT，BioTek)记录发光。用GraphPad Prism，7.02版分析数据。
被掩蔽的抗体的酶活化
在裂解缓冲液(150mMNaCl；50mM Tris，pH 7.5；10mM CaCl2；0.02％NP-40)中将亲本抗CTLA4抗体、被掩蔽的抗CTLA4抗体和不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体各自稀释至1μM溶液。将在37℃下用1mM对氨基苯汞乙酸盐(AMPA)活化1小时的重组MMP2(R&D Systems)添加至各抗体溶液中达到4nM的最终浓度且在37℃下培育过夜。通过如上文所描述的低密度抗原结合ELISA方案来测试抗体稀释物与小鼠CTLA4(muCTLA4hsIgG蛋白质；Abcam)的结合。
结果
与亲本抗CTLA4抗体相比，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体和不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体与小鼠CTLA4的结合分别低约156倍和218倍(图2B)。亲本抗CTLA4抗体的平均EC50是0.31±0.08nM，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体是48.4±7.2nM且不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体是67.7±16.3nM，如在三个实验中测量(图2C)。当用重组MMP2处理时，将可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体恢复成与亲本抗CTLA4抗体类似的结合(平均EC50＝0.29±0.03nM，图2C)，而不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体的结合未改变(平均EC50＝64.3±18.5nM，图2C)。
实例4A：可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内表征
方法
产生用于体内研究的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体
使用由表达质粒pD2610-v5(ATUM，Newark CA)进行的HEK293瞬时表达来制备被掩蔽的抗CTLA4抗体。在转染之后七天，收集来自被转染的细胞的上清液且用KanCapA树脂(Kaneka)纯化被掩蔽的抗CTLA4抗体，接着通过使用Source S柱(GE Healthcare)且在pH 5下用0-1M NaCl梯度洗脱的阳离子交换进行纯化。接着，将抗体缓冲液交换至PBS中。通过分光光度计在OD280的光学密度下确定抗体浓度且使用Charles River Endotoxin试剂盒确定内毒素水平。
由可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体进行的肿瘤根除
向携带50-100mm3 MC38肿瘤的C57BL/6小鼠腹膜内给予单次剂量的200μg IgG2a对照物(BioXcel)、对小鼠CTLA4具有反应性的亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a，包含SEQ IDNO：237的轻链、包含SEQ ID NO：319的重链)、对小鼠CTLA4具有反应性的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(包含SEQ ID NO：238的轻链、包含SEQ ID NO：319的重链)、对小鼠CTLA4具有反应性的被掩蔽的抗CTLA4抗体1005(包含SEQ ID NO：240的轻链、包含SEQ ID NO：319的重链)或与人类CTLA4和小鼠CTLA4具有交叉反应性的抗CTLA4抗体1(包含SEQ ID NO：327的轻链、包含SEQ ID NO：366的重链)。两周一次测量体重和肿瘤尺寸。
T细胞群体分析
在第1、4和8天向携带50-100mm3 MC38肿瘤的C57BL/6小鼠给予三次200μg剂量的IgG2a对照物(BioXcel)、亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a，包含SEQ ID NO：237的轻链、包含SEQ ID NO：319的重链)、被掩蔽的抗CTLA4抗体2(包含SEQ ID NO：238的轻链、包含SEQ IDNO：319的重链)、被掩蔽的抗CTLA4抗体1005(包含SEQ ID NO：240的轻链、包含SEQ ID NO：319的重链)或与人类CTLA4和小鼠CTLA4具有交叉反应性的抗CTLA4抗体1(包含SEQ ID NO：327的轻链、包含SEQ ID NO：366的重链)。在第9天，将小鼠处死且使用gentleMACSTM方案″肿瘤解离试剂盒″(Milteni)将肿瘤解离，且通过70微米细胞过滤器过滤且在PBS/2.5％FBS缓冲液中冲洗两次以去除酶缓冲液。脾细胞被肿瘤浸润且通过跨越筛网温和地研磨组织来将脾细胞解离。用ACK缓冲液(Thermo Fisher)溶解红血球，接着将细胞染色。用荧光标记的抗CD45(Biolegend)、抗CD3(Biolegend)、抗CD4(Biolegend)、抗CD8(BD Biosciences)、抗CD25(Biolegend)将细胞染色。在用抗FoxP3(eBioscience)和抗Ki67(eBioscience)染色之前，将细胞透性化。针对活(从Life购得的Live/Dead Aqua)CD45阳性细胞中的CD4+、CD8+和CD25 Foxp3+(Treg)细胞的百分比以及这三个细胞群体中呈Ki67阳性(细胞增殖的标记物)的百分比，通过荧光活化细胞分选(FACS)来分析被染色的细胞。
结果
与用IgG2a对照抗体处理的小鼠中的肿瘤体积相比，亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a)使小鼠中的肿瘤体积减小(图3A和3B)。与亲本抗CTLA4抗体(图3B)相比，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体在减小肿瘤体积方面展示等效功效(图3C)。TME中的调节性T淋巴细胞(Treg)对于免疫抑制是重要的。亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a)和可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体2(被掩蔽的9D9)通过效应功能优先消耗肿瘤中的调节性T淋巴细胞(Treg)群体(图4)。体内T细胞上的CTLA4的阻断引起CD4+和CD8+T细胞的增殖。在亲本抗CTLA4抗体(9D9.IgG2a)或可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体2(被掩蔽的9D9)的多剂量给药之后，通过％Ki67+来评估脾中的T细胞的增殖。与亲本抗体(9D9.IgG2a)相比，被掩蔽的抗CTLA4抗体展示降低的周边中的CD4+细胞(图5A)和CD8+T细胞(图5B)的增殖。
人类化被掩蔽的抗CTLA4抗体1对人类CTLA4的亲和力高于伊派利单抗(分别是7倍和38倍)且与食蟹猕猴CTLA4和小鼠CTLA4具有交叉反应性。与亲本抗CTLA4抗体(图3B)相比，人类化被掩蔽的抗CTLA4抗体1在减小肿瘤体积方面展示等效功效(图3D)。
实例4B：可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内表征
使用预先证实对用9D9抗体进行的治疗起反应的MC38小鼠结肠直肠癌模型，研究可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体对肿瘤生长的作用以及肿瘤和周边中的免疫参数。参见Peggs K.S.等人，《实验医学杂志(J Exp Med.)》，206：1717-1725，(2009)和Selby M.J.等人，《癌症免疫研究》，1：32-42，(2013)。
方法
由可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体进行的肿瘤根除
向年龄为8至12周的雌性C57BL/6皮下注射0.5×106个MC38肿瘤细胞。当平均肿瘤体积达到50-100mm3时，将小鼠随机分入具有类似的平均肿瘤体积的处理组中。为了评估抗肿瘤功效，在随机分组后第1天，以＜250μL的体积在每剂量200μg下腹膜内(i.p.)给予在PBS中配制的抗体。每周两次确定肿瘤体积。单独地监测所有小鼠且在肿瘤体积达到1500mm3时或在随机分组后第45天将其处死。为了通过如下文所描述的FACS分析来评估抗体对调节性T细胞(Treg)的生物功能，在随机分组后第1、4和8天，以＜250μL的体积在每剂量200μg下向携带肿瘤的小鼠腹膜内给予抗体。对照抗体是muIgG2a(BioXcell)。在第9天处死所有小鼠；收集肿瘤和脾以用于FACS分析。
T细胞群体分析
借助于肿瘤解离试剂盒(gentleMACS)根据标准方案来解离小鼠肿瘤样品且通过70μm细胞过滤器。在70μm细胞过滤器中用注射器的背面解离脾样品。用ACK缓冲液(Lonza)溶解红血球。将最终细胞悬浮液洗涤且以2×107个细胞/毫升再悬浮于染色缓冲液(PBS pH7.4、2.5％FBS、0.09％NaN3)中。用Mu Trustain fcX(Biolegend)处理细胞以阻断Fc受体，接着用针对CD45(Biolegend)、CD3(Biolegend)、CD4(Biolegend)、CD8(BD Biosciences)、CD25(Biolegend)和Live/Dead Aqua(ThermoFisher)的抗体染色。对于细胞内染色，将细胞固定，透性化且用针对FoxP3(eBioscience)和Ki-67(eBioscience)的抗体染色。运行单色染色和FMO以用于圈选目的。
结果
亲本抗CTLA4抗体(图6C)和可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体(图6D)的给药诱导皮下植入的MC38肿瘤的肿瘤消退，而用同型对照抗体(图6A)或不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体(图6B)处理的小鼠中的肿瘤快速生长。这些结果表明，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体保留与肿瘤微环境中的掩蔽肽的有效裂解和解离一致的抗肿瘤活性。此外，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的完全活性依赖于蛋白酶裂解，因为不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体未能抑制肿瘤生长。这些结果与表明抗CTLA4抗体的局部给药可有效诱导小鼠中的肿瘤消退的早先观察结果一致。参见Marabelle，A.等人，JCI，123：2447-2463，(2013)。
分析由可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体给药进行的瘤内和全身免疫活化。先前工作表明，muIgG2a抗CTLA4抗体以FcγR依赖性方式消耗瘤内Treg细胞，然而，其引起被处理的小鼠的脾中的Treg的活化和扩增。参见Selby M.J.等人，《癌症免疫研究》，1：32-42，(2013)。因此，为了评估被掩蔽的抗CTLA4抗体的局部和全身活性，分别评估瘤内(图7A)和脾中(图7B)的Treg的丰度和增殖状态。在抗体的三次给药中的最后一次给药之后24小时收集肿瘤和脾样品。流式细胞分析表明，用亲本抗CTLA4抗体处理的小鼠的肿瘤中的Treg显著减少(图7A)。在减少Treg方面，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体与亲本抗CTLA4抗体同样有效(图7A)。相比之下，不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体对瘤内Treg丰度无显著影响(图7A)。这些结果表明，以取决于肿瘤相关蛋白酶的活性的方式，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体在肿瘤环境中的活性与亲本抗CTLA4抗体类似。
与对肿瘤组织中的Treg细胞的作用不同，亲本抗CTLA4抗体引起被处理的小鼠的脾中的增殖(Ki67+FOXP3+)Treg的显著增加(图7B)。当与亲本抗CTLA4抗体相比时，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体引起增殖脾Treg的轻微增加，而当与同型对照抗体相比时，不可裂解的被掩蔽的抗CTLA4抗体对Treg增殖无影响(图7B)。总而言之，这些结果支持以下结论：可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的肿瘤活化主要限于肿瘤环境且在正常组织中具有降低的活性。
实例5：结合于人类CTLA4的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体外表征
方法
被掩蔽的抗原结合位点的评估
在TBS中用人类CTLA4-Fc(R&D Systems)将ELISA板涂布过夜且接着用具有0.05％Tween 20的TBS洗涤，且用含1％BSA的PBS阻断，接着用具有Tween 20的TBS洗涤。使亲本抗CTLA4抗体和被掩蔽的抗CTLA4抗体于PBS中的稀释物与CTLA4结合60分钟，接着用TBSTween 20洗涤。用抗huKappa-HRP(Abcam)和Super Signa１ Pico化学发光底物检测结合。由裂解前的被掩蔽的抗CTLA4抗体的EC50与亲本抗CTLA4抗体的EC50确定掩蔽率。
蛋白酶裂解的测试
将亲本抗CTLA4抗体和被掩蔽的抗CTLA4抗体与含6nM 1)蛋白裂解酶的50mM Tris(pH 9)、50mMNaCl、0.01％Tween-20一起在37℃下培育过夜。使用″任何无Kd染色的预制聚丙烯酰胺凝胶″(Bio-Rad)，通过上文所描述的ELISA和还原的SDS-PAGE分析来测试抗体稀释物与人类CTLA4的结合。
结果
人类化被掩蔽的抗CTLA4抗体1呈现低50倍的与人类CTLA4的结合(图8)。人类化被掩蔽的抗CTLA4抗体1的蛋白酶活化完全恢复抗体与人类CTLA4的结合，达到与亲本抗CTLA4抗体类似的水平(图8)。
实例6：被掩蔽的抗体的酶活化
根据下文所描述的方案，使用重组蛋白酶活化被掩蔽的抗体。
将被掩蔽的抗体缓冲液交换至MMP裂解缓冲液中，接着与蛋白酶一起培育。对于活化，将蛋白酶(Anaspec、ProsecBio和R&D Systems)在MMP裂解缓冲液(50mM Tris pH 8.0、150mMNaCl、10mM CaCl2)中稀释至100ng/μL。添加APMA(10mM于DMSO中)达到1mM的最终浓度。将酶在37℃下培育1小时。以1∶1000的抗体∶蛋白酶比率(例如，1μg MMP：1mg抗体)向被掩蔽的抗体中添加被活化的蛋白酶，或向阴性对照样品中添加等量的缓冲液。将样品在37℃下培育过夜。
在培育之后，使用蛋白质A树脂纯化被处理的抗体。简单来说，向1.7mL试管中添加150μL MabSure ProA浆料(GE Healthcare)。用1mL PBS通过在mySpin 6离心机中旋转两分钟来将浆料洗涤两次。将被活化的抗体(500μL)添加至浆料中且在摇荡下，在室温下培育三十分钟或在4℃下培育三小时。在mySpin 6离心机中将抗体-浆料混合物旋转两分钟且收集通过的物料流。用1mL 1x PBS将树脂洗涤两次且收集洗液。使用100μL 25mM乙酸钠pH 3.5将抗体洗脱至少六次(进入具有6μL 1M Tris pH 8.0的新的1.7mL试管)。测量洗脱液的浓度。
将所有洗脱液和被缓冲液交换的样品合并至PBS中。向被合并的样品中添加500μLPBS。将样品添加至过滤器中且旋转三次。通过向过滤器的顶部添加100μL PBS且混合以去除被交换的蛋白质来收集被合并的样品。测量纯化的抗体的浓度。在PBS中将样品稀释至1mg/mL。
使用SDS-PAGE分析样品的活化。简单来说，将10μL样品(1mg/mL)与10μL上样缓冲液混合且在90℃下沸腾十分钟。将10μL样品装载至15孔无任何kDa染色的凝胶(BioRad)上且在200V下运行三十分钟。使用BioRad成像器将蛋白质成像以通过迁移大小的变化来确保完全活化。
通过被裂解的抗体的迁移大小的变化来证实被掩蔽的抗体的完全活化。
实例7：结合于人类CTLA4的抗CTLA4抗体的体外表征：低密度抗原结合ELISA
方法
用每孔1μg/mL的人类CTLA4-Fc(R&D#7268-CT)涂布聚苯乙烯96孔微板(Fisher#07-200-591)且在4℃下储存过夜。板用含0.05％Tween的TBS(TBS-T)洗涤，用1％BSA(SigmaAldrich#B4287-25G)阻断且用TBS-T洗涤。在分析法缓冲液(PBS+0.05％Tween+1％BSA)中制备含有抗CTLA4抗体的样品的连续稀释物，添加至板中且在室温下，在100RPM下振荡一小时。在用TBS-T洗涤之后，向孔施用在分析法缓冲液中以1∶8000稀释的抗人类κ轻链[纯系：SB81a]-HRP(Abcam#ab79115)且在室温下振荡一小时。用TBS-T洗涤板，向板施用HRP底物(Super Signal Pico Chemiluminescent Substrate，Thermo#37069)且使用分光光度计(BioTek)记录发光。用GraphPad Prism分析数据。
所测试的抗体包括称为抗体1和抗体2的人类化抗CTLA4抗体以及其变体/形式/版本。根据具体编号方案，抗体1包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：403的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3。抗体1包含有包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列的VL结构域，和包含SEQID NO：323的氨基酸序列的VH结构域。根据Kabat编号方案，抗体1包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：433的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3。根据具体编号方案，抗体2包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO：412的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3。根据Kabat编号方案，抗体2包含轻链可变区，所述轻链可变区具有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3，且包含重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。产生抗体1的各种形式，各自具有名称″抗体1-编号″，且产生抗体2的各种形式，各自具有名称″抗体2-编号″。
结果
图9A和图9B展示用称为抗体1和抗体2的人类化抗CTLA4抗体或其变体进行的结合研究。图9A展示抗体1的具有野生型Fc区的版本(抗体1-1)和抗体1的具有Fc区中S239D突变和I332E突变的版本(抗体1-2)与人类CTLA4-Fc的结合之间的不存在可检测的差异。抗体1-2包含有包含SEQ ID NO：327的氨基酸序列的VL结构域，和包含SEQ ID NO：478的氨基酸序列的VH结构域。图9B比较抗体2的各种形式的CTLA4结合，所述形式包括抗体2的具有野生型Fc区的版本(抗体2-1)、抗体2的具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的版本(抗体2-2)、抗体2的具有Fc区中的S239D突变、I332E突变和两个铰链区突变的版本(抗体2-3)、抗体2的具有Fc区中的S239D、I332E和A330L突变的版本(抗体2-4)以及抗体2的具有Fc区中的S239D、I332E、A330L突变和两个铰链区突变的版本(抗体2-5)。如图9B中所示，抗体的所有形式都以类似方式结合于人类CTLA4-Fc。所测试的抗体的平均EC50值提供于以下表5中。
表5
Figure BDA0003230734600001591
实例8：蛋白酶活化对人类CTLA4结合的影响
方法
在实例7中所描述的低密度抗原结合ELISA中使用人类化抗CTLA4抗体。对于评估人类化抗CTLA4抗体的被掩蔽的可活化形式的活化，如实例6中所概述来使用重组蛋白酶。
使用抗体2的具有Fc区中的S239D突变和I332E突变的未被掩蔽的版本(抗体2-6)作为未被掩蔽的对照物，以用于与抗体的具有相同的两个突变，但还包括有包括SEQ IDNO：19或5的氨基序列的掩蔽肽以及间隔连接子和可裂解肽的版本进行比较。亲本未被掩蔽的抗体2-6包括具有SEQ ID NO：324的氨基酸序列的可变重链、具有SEQ ID NO：322的氨基酸序列的可变轻链、具有SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链。抗体2-7至抗体2-21的被掩蔽的抗体包括亲本未被掩蔽的抗体2-6的可变重链、可变轻链、重链和轻链序列且进一步包括掩蔽肽、间隔连接子1、可裂解(或不可裂解)肽和间隔连接子2，如表6和表9中所描述。Thus，each of Antibody 2-6，Antibody 2-7，抗体2-8、抗体2-9、抗体2-10、抗体2-11、抗体2-12、抗体2-13、抗体2-14、抗体2-15、抗体2-16、抗体2-17、抗体2-18、抗体2-19、抗体2-20和抗体2-21包含有包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列的VH结构域、包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列的VL结构域、包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO：334的氨基酸序列的轻链。除非另有指示，否则称为抗体2-7至抗体2-21的被掩蔽的抗体是通过按N端至C端方向，如下将以下组分连接至亲本未被掩蔽的抗体2-6的轻链而被掩蔽：1)掩蔽肽；2)间隔连接子1；3)可裂解肽；4)间隔连接子2；轻链的N端。抗体2-10包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。所测试的例示性抗体的实例(包括抗体2-7至抗体2-13中的间隔连接子和可裂解肽的序列)提供于表6中。
表6
Figure BDA0003230734600001601
Figure BDA0003230734600001611
在分析法缓冲液中制备抗体的连续稀释物，添加至涂有人类CTLA4-Fc的96孔微板中且在室温下振荡一小时。板用TBS-T洗涤，用BSA阻断且再用TBS-T洗涤。将抗体添加至板中且振荡。在洗涤之后，将含抗人类κ轻链(与HRP结合)的分析法缓冲液施用于各孔且在室温下振荡。再次洗涤板，接着添加HRP底物。使用分光光度计记录发光且使用GraphPadPrism分析数据。
结果
图10A和图10B展示在不存在(图10A)或存在(图10B)蛋白酶的情况下，用抗体2的被掩蔽的和未被掩蔽的版本进行的结合研究。图10A展示在不存在蛋白酶的情况下，抗体2的各种版本与IgG1同型的结合。需要较高浓度的抗体以展示结合，如由向未被掩蔽的抗体2-6和IgG1同型的右侧的偏移所证明(图10A)。被掩蔽的抗体视为被掩蔽肽遮挡。各被掩蔽的抗体的遮挡展示于以下表7中，且是通过将被掩蔽的抗体的EC50除以未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6的EC50来计算。遮挡量的可变性表明，间隔连接子和/或可裂解肽的序列影响掩蔽肽阻断抗原结合的能力。抗体的EC50和所计算的遮挡展示于以下表7中。
表7
Figure BDA0003230734600001612
Figure BDA0003230734600001621
图10B展示在存在蛋白酶(即，被活化)的情况下，抗体2的各种版本(不包括具有不可裂解连接子的抗体2-10)的结合。包括未被掩蔽的亲本抗体2-6作为对照且未暴露于蛋白酶。根据实例6中提供的方案进行蛋白酶消化。图10B中展示的数据表明，可裂解肽的蛋白水解裂解通过使抗体的结合恢复至与未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6类似的水平来完全修复抗体与人类CTLA4的结合。由存在蛋白酶而″被活化的″测试抗体的结合数据和活化数据提供于以下表8中。通过下式计算活化：活化＝1-(被活化的被掩蔽的抗体的EC50-未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6的EC50)/(未被活化的被掩蔽的抗体的EC50-亲本抗体，即抗体2-6的EC50)。
表8
Figure BDA0003230734600001622
实例9：被掩蔽的抗CTLA4抗体的蛋白酶裂解的体外表征：酶动力学、蛋白质裂解和雷达图(Radar Plot)
在存在例示性蛋白酶的情况下，使用抗体2的被掩蔽的形式进行结合研究，所述形式各自包括有包括SEQ ID NO：5或19的氨基序列的掩蔽肽，以及第一和第二间隔连接子和可裂解肽。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。在一些研究中，也测试未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6以进行比较。所测试的抗体的实例(包括掩蔽肽、间隔连接子和可裂解肽的序列)提供于表9中。
表9
Figure BDA0003230734600001631
在图11A-H中以雷达图形式展示可裂解肽序列对所选择的蛋白酶的体外敏感性的比较。各抗体由雷达图上的各蛋白酶进行的活化是使用雷达图描绘，其中将活化描绘为0(未活化)至1.0(完全活化)的范围。通过下式计算活化：活化＝1-(被活化的被掩蔽的抗体的EC50-未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6的EC50)/(未被活化的被掩蔽的抗体的EC50-亲本抗体，即抗体2-6的EC50)。各被掩蔽的抗体的遮挡展示于以下表12中，且是通过将被掩蔽的抗体的EC50除以未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6的EC50来计算。根据实例7和实例8中提供的方案进行结合且根据实例6和实例8中提供的方案进行抗体的蛋白水解处理。在适当的裂解缓冲液中制备被掩蔽的抗CTLA4抗体的溶液(1000nM)。将两个抗体样品等分至两个0.5mL埃彭道夫管(Eppendorftube)中。向相应的抗体样品中添加裂解缓冲液的工作溶液(参见表11)且向对照(无蛋白酶)样品中添加裂解缓冲液。
表10
Figure BDA0003230734600001641
1关于裂解缓冲液，参见表11。
表11
Figure BDA0003230734600001642
具有各种可裂解肽序列的抗体的雷达图展示于图11A-G中。图11H展示用作阴性对照的含有不可裂解的可裂解肽的抗体2-15的结合未受添加各种例示性蛋白酶的影响。图11A展示抗体2-14的雷达图。
如先前描述在健康和携带MC38肿瘤的小鼠中评估第2天(d2)、第4天(d4)或第7天(d7)的蛋白酶裂解的SDS-PAGE分析，且展示于图11I-11M中。如图11I中所示，在健康小鼠的血浆中评估抗体2-14中的可裂解肽的裂解。除被给予150μg抗体2-14的小鼠1*(上部小图)以外，向各组中具有5只健康小鼠的组给予200μg抗体2-14。用(右泳道)或不用(左泳道)蛋白酶处理标准物。如图11J中所示，在健康小鼠的血浆中评估抗体2-16中的可裂解肽的裂解。图11J中使用的标准物是抗体2-18。除被给予150μg抗体2-14的小鼠4*以外，向健康小鼠给予200μg抗体2-16。
如图11K-11M中所示，在携带MC38肿瘤的小鼠的血浆中评估抗体2-14中的可裂解肽、抗体2-15中的不可裂解肽和抗体2-16中的可裂解肽的裂解。向携带MC38肿瘤的小鼠给予200μg各抗体。在图11M中，小鼠2的第2天(d2)样品似乎发生错误且应被忽略。
抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15与CTLA4在存在或不存在蛋白酶的情况下的结合展示于图12A中，且EC50、遮挡和活化提供于表12中。未被掩蔽的抗体2-6显示不受蛋白酶的存在影响的结合(图12A)。在不存在蛋白酶的情况下，与未被掩蔽的亲本抗体2-6相比，被掩蔽但包括不可裂解的可裂解肽序列的抗体2-15显示降低的结合亲和力，所述降低的结合亲和力未由添加蛋白酶而被修复(图12A)。在不存在蛋白酶的情况下，被掩蔽且包括可裂解肽的抗体2-14显示降低的结合亲和力且遮挡值是101，但此降低的结合亲和力在通过添加蛋白酶来活化时被修复(图12A)且活化值是1.0(表12)。抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15在存在或不存在蛋白酶的情况下的EC50提供于以下表12中。
表12
Figure BDA0003230734600001651
抗体2-6、抗体2-7和抗体2-10与CTLA4在存在或不存在蛋白酶的情况下的结合展示于图12B中，且EC50、遮挡和活化提供于表13中。抗体2-10包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。被掩蔽且包括可裂解肽的抗体2-7在不存在蛋白酶的情况下显示遮挡值为49，且在使用蛋白酶活化时的活化值是1.0(图12B；表13)。在不存在蛋白酶的情况下，被掩蔽的抗体2-7显示与被掩蔽的抗体2-10类似的结合，且在通过添加蛋白酶来活化时，抗体2-7显示与未被掩蔽的亲本抗体2-6类似的结合。抗体2-6、抗体2-7和抗体2-10的EC50提供于以下表13中。
表13
Figure BDA0003230734600001661
图12A、图12B、表12和表13中展示的数据表明，抗体2-7(SEQ ID NO：19)和抗体2-14(SEQ ID NO：5)中所包括的例示性掩蔽肽各自能够以可逆方式掩蔽结合活性。
实例10：肠毒素分析
方法
SEB分析法
使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)分析法检验各种抗体促进周边血液单核细胞(PBMC)的IL-2产生的能力。对于SEB分析法，在预先升温的培养基(RPMI+10％热灭活FBS+1％HEPES+1％MEM NEAA+1％丙酮酸钠)中制备所选择的抗体的稀释物。一式三份地涂布抗体溶液且仅向″PBMC+SEB″孔、″仅PBMC″孔和外边界壁中添加培养基。在预先升温的培养基中制备SEB溶液且添加至除″仅PBMC″以外的所有实验孔中。将PBMC(BioIVT)在37℃下，在水浴中解冻。将细胞逐滴转移至锥形管中且添加20x预先升温的培养基以洗涤细胞。将细胞离心且抽吸培养基。将细胞再悬浮于20mL预先升温的培养基中且获取等分试样以用于计数。将剩余细胞离心且以1×106个细胞/毫升的体积将细胞再悬浮。以100微升/孔涂布细胞且板在37℃，5％CO2培育箱中培育五天。在第五天，将板在1000RPM下旋转五分钟。从各孔将250μL细胞转移至新的96孔板中。再次将板旋转且将225μL细胞转移至PCR条带中。样品在-80℃下储存直到由ELISA进行分析。
IL-2 ELISA
通过用Human IL-2 ELISA MAX Deluxe集合(BioLegend，目录号431806)进行分析来确定使用上文所描述的方案制备的细胞上清液的IL-2水平。用分析法缓冲液稀释细胞上清液样品以处于标准曲线内。使用GraphPad Prism分析样品且进行杜凯氏多重比较测试(Tukey’s multiple comparisons test)(单因素ANOVA)以确定各处理组之间的统计显著性。
结果
在SEB分析法中测试抗体1和抗体2的各种形式。展示在存在抗体1-1或抗体1-2的情况下(如实例7中所描述)或在不存在抗体的情况下产生的IL-2的水平的数据展示于图13A中。展示在存在抗体2-1、抗体2-2、抗体2-3、抗体2-4和抗体2-5的情况下(如实例7中所描述)或在不存在抗体的情况下产生的IL-2的水平的数据展示于图13C中。与无抗体的对照物相比，所有测试抗体都显示提高IL-2水平的能力。各抗体的高于无抗体的对照物的IL-2水平的倍数增加以及与同型对照的比较展示于图13B和图13中。
实例11：被掩蔽的和被活化的抗CTLA4抗体的免疫功能
进行根据实例10的方案的SEB分析法以测试响应于用抗体2的各种形式进行的处理的IL-2产生。也在不存在抗体(即，无抗体)或存在同型对照抗体的情况下进行分析法以作为对照。也测试未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6以进行比较。
如图14A和14B中所示，与促进大量IL-2产生的未被掩蔽的抗体2-6不同，抗体2的被掩蔽的形式通常在促进IL-2产生方面无效。如图14B中所示，抗体2-12是唯一的与同型对照相比引起IL-2产生的显著增加的被掩蔽的抗体，但此增加比使用未被掩蔽的抗体2-6亲本抗体时所观察到的增加小得多。相比之下，抗体2-7、抗体2-8、抗体2-9、抗体2-10、抗体2-11和抗体2-13与同型对照相比都不促进IL-2产生的显著增加(图14B)。使用单因素ANOVA比较进行统计分析。
图14C和14D展示根据实例6的方案进行的蛋白酶处理对抗体2-7、抗体2-8、抗体2-9和抗体2-10促进IL-2产生的能力的影响。抗体2-10包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。测试未被掩蔽的亲本抗体2-6作为阳性对照，且测试同型对照抗体和无抗体的对照物作为阴性对照。使用与抗体2-6的单因素ANOVA比较来进行图14D中展示的统计分析。
图14C中展示的结果表明，用蛋白酶进行的处理可修复抗体2-7、抗体2-8和抗体2-9促进IL-2产生的能力，达到与未被掩蔽的亲本抗体2-6类似的水平。图14B中展示的图比较高于无抗体的对照物的IL-2产生的倍数增加。用被掩蔽但不可由蛋白酶活化的抗体2-10进行的处理引起类似的IL-2产生水平，和与同型对照类似的高于无抗体的对照物的倍数变化(图14C和图14D)。
实例12：被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内裂解
方法
健康小鼠的血浆中的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内裂解
在第0天向健康、未携带肿瘤的七至八周龄雌性C57BL/6J小鼠腹膜内注射200μg抗体2的被掩蔽的形式。在第二和四天，通过RO窦收集血液且用LiHep处理以用于血浆分离。在第七天，通过心脏穿刺来收集血液且用LiHep处理以用于血浆分离。将血浆等分且在-80℃下储存直到进行蛋白质印迹分析。包括其中在存在或不存在蛋白酶的情况下体外处理被掩蔽的抗体的标准样品作为阳性对照。对于蛋白质印迹分析，在PBS中稀释血浆样品，接着在Laemmli样品缓冲液和βME中稀释。在95℃下加热样品，接着装载至Criterion TGX无染色的预制凝胶上。在200V下进行SDS-PAGE历时四十二分钟。将蛋白质转移至硝化纤维膜且在具有1％酪蛋白阻断剂的1x TBS中，在室温振荡下阻断一小时。膜用针对人类κ轻链[纯系EPR5367-8]的HRP结合的Rb mAb(在酪蛋白阻断剂中以1∶10,000稀释)在4℃振荡下探测过夜。膜用PBS-Tween洗涤三次且用SuperSignal ELISA Pico化学发光底物进行研究。用ImageLab软件分析原始数据。活化百分比计算如下：被活化的谱带的强度/(被活化的谱带的强度+被掩蔽的未被活化的谱带的强度)×100％。
在两个群组中跨越两周进行体内实验，两个群组中都包括抗体2-14。所测试的抗体包括抗体2-14、抗体2-15、抗体2-16、抗体2-17、抗体2-18、抗体2-19、抗体2-20和抗体2-21。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。
结果
抗体2-14(图15A)和抗体2-20(图15C)都是体内活化。在体内未检测到抗体2-19的活化(图15B)。也未检测到抗体2-16、抗体2-17、抗体2-18和抗体2-21(数据未展示)的体内活化，同样未检测到阴性对照抗体2-15的体内活化。图15D中展示从第2天至第7天，抗体2-14和抗体2-20的活化百分比的增加。
实例13：携带肿瘤的小鼠的血浆中的被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内裂解
将MC38细胞(1×106个)皮下注射至七-八周龄雌性C57BL/6J小鼠的皮下。在第0天，基于肿瘤体积测量结果将小鼠随机分配且腹膜内注射200μg抗体2构建体。在第二和四天，通过RO窦收集血液且用LiHep处理以用于血浆分离。在第七天，通过心脏穿刺来收集血液且用LiHep处理以用于血浆分离。将血浆等分且在-80℃下储存直到进行蛋白质印迹分析。包括其中在存在或不存在蛋白酶的情况下体外处理被掩蔽的抗体的标准样品作为阳性对照。对于蛋白质印迹分析，在PBS中稀释血浆样品，接着在Laemmli样品缓冲液和βME中稀释。在95℃下加热样品，接着装载至Criterion TGX无染色的预制凝胶上。在200V下进行SDS-PAGE历时四十二分钟。将蛋白质转移至硝化纤维膜且在具有1％酪蛋白阻断剂的1xTBS中，在室温振荡下阻断一小时。膜用针对人类κ轻链[纯系EPR5367-8]的HRP结合的RbmAb(在酪蛋白阻断剂中以1∶10,000稀释)在4℃振荡下探测过夜。膜用PBS-Tween洗涤三次且用SuperSignal ELISA Pico化学发光底物进行研究。用ImageLab软件分析原始数据。
在两个群组中跨越两周进行体内实验，两个群组中都包括抗体2-14。所测试的抗体包括抗体2-14、抗体2-15、抗体2-16、抗体2-17、抗体2-18、抗体2-19、抗体2-20和抗体2-21。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。
在另一组实验中，将MC38细胞(1×106个)皮下注射至用人类CTLA4进行敲入的小鼠模型中。向携带MC38肿瘤的小鼠给予200μg测试抗体(例如，IgG对照物、抗体2-1、抗体2-10、伊派利单抗或伊派利单抗的去海藻糖基化形式(伊派利单抗-aFuc))的单次注射且在注射之后第五天对CD45+脾细胞和CD45+瘤内细胞进行免疫表型分析。在一些研究中，在20μg、7μg或2μg测试抗体的单次注射后测量随时间推移的肿瘤体积。评估CD45+细胞的标记物，包括对CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+具有选择性的标记物，且鉴别具有这些标记物的CD45+细胞的相对比例。
结果
在携带MC38的小鼠中体内活化抗体2-14和抗体2-20(图16A和16C)。在体内未检测到抗体2-19的活化(图16B)。也未检测到抗体2-16、抗体2-17、抗体2-18和抗体2-21(数据未展示)的活化，同样未检测到阴性对照抗体2-15的活化。与健康的未携带肿瘤的小鼠相比，携带MC38的小鼠中的抗体2-14的活化百分比明显更高，如通过2因素ANOVA确定(调节的P值＝0.0113)(图16D)。
使用携带MC38肿瘤的小鼠的研究结果描绘于图19A-19D中，其中关于对CD3+/ICOS+、CD3+T细胞、CD4+/Ki67+、CD3+/Ki67+、CD4+/ICOS+、CD4+T细胞、CD8+/ICOS+、CD8+T细胞、Treg+/ICOS+、CD8+/Ki67+、Treg、Treg+/Ki67+具有选择性的标记物提供CD45+脾(图19A和19B)或CD45+瘤内(图19C和19D)的相对比例。统计数据提供于图19E(脾细胞)和19F(瘤内细胞)中。第1组：IgG，第2组：抗体2-1；第3组：抗体2-10；第4组：伊派利单抗；第5组：伊派利单抗-aFuc。
使用接受20μg、7μg或2μg测试抗体的单次注射的携带MC38肿瘤的小鼠的研究结果描绘于图20A和20B中。图20A展示抗体2-6、抗体2-10和具有Fc结构域中的S239D和Ｉ332E突变的RSV抗体(RSV-m)的随时间推移的肿瘤体积(mm3)。如图20A中所示，与被掩蔽但不可裂解的抗体2-10相比，未被掩蔽的亲本抗体2-6抑制肿瘤生长。图20B描绘随时间推移的肿瘤体积的肿瘤平均值，其证实与抗体2-10或RSV-m对照物相比，在给予抗体2-6之后的较慢的肿瘤生长。
实例14：抗CTLA4抗体的ADCC活性和CTLA4阻断
方法
报导子生物分析法
使用各种抗CTLA4抗体进行FcγRIIIa报导子生物分析法。在预先升温的完全培养基(具有RPMI1640的FBS)中稀释抗体。将CTLA4效应细胞(目标细胞：Promega J158A)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞混合且计数，且将细胞密度调节至1×106个细胞/毫升。向96孔板(Coming，目录号：3917)的各孔中添加目标细胞。向适当的孔中添加被稀释的抗体且一式两份地测试。温和地混合各孔的内含物且在37℃下培育板十五分钟。将效应细胞(表达FcγRIIIa的Jurkat细胞)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞混合且计数，且将细胞密度调节至3×106个细胞/毫升。立即将效应细胞分配至各孔中且温和地混合。用盖子将板覆盖且在37℃下保持六小时。在测量前一小时，在4℃下移出Bio-Glo底物和Bio-Glo缓冲液。将Bio-Glo缓冲液转移至Bio-Glo底物的瓶中以制备Bio-Glo试剂且通过翻转来温和地混合。将瓶保持在室温下。在培育之后，从培育箱移出分析板且在室温下保持十分钟。向各孔中添加Bio-Glo试剂且在室温下培育板五-十五分钟。接着，用光度计读取板。
所测试的抗体包括抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15以及同型对照。抗体2-6是针对抗体2-14和抗体2-15的未被掩蔽的亲本抗体。抗体2-15包括不可裂解的可裂解肽序列以用作阴性对照。抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15各自在未预先暴露于蛋白酶的情况下测试且也在暴露于蛋白酶之后测试，暴露于蛋白酶通过可裂解肽的裂解实现活化。通过将抗体的EC50除以未被掩蔽的亲本抗体，即抗体2-6的EC50来计算各抗体的遮挡。
结果
未被掩蔽的亲本抗体2-6在存在和不存在蛋白酶的情况下显示类似的报导子活化曲线(图17)。当在未预先暴露于蛋白酶的情况下测试时，与未被掩蔽的亲本抗体2-6相比，被掩蔽的抗体，即抗体2-14和抗体2-15显示降低的报导子活化(图17)。不可由蛋白酶活化的抗体2-15的报导子活化未因预先添加蛋白酶而得到修复(即，未恢复至与未被掩蔽的亲本抗体2-6相关的水平类似的活化水平)(图17)。可由蛋白酶活化的抗体2-14的报导子活化被修复至与未被掩蔽的亲本抗体2-6相关的水平类似的水平(图17)。所测试的抗体的EC50值和遮挡值提供于表14中。
表14
抗体 蛋白酶 EC<sub>50</sub>(ng/mL)士SE R<sup>2</sup> 遮挡
抗体2-6 - 8.0×10<sup>-3</sup>±1.8×10<sup>-3</sup> 0.927
抗体2-6 + 4.9×10<sup>-3</sup>±1.3×10<sup>-3</sup> 0.8759 0.6
抗体2-14 - 33±6 0.9906 4,125
抗体2-14 + 2.8×10<sup>-3</sup>±0.5×10<sup>-3</sup> 0.8953 0.4
抗体2-15 - 19±2 0.9942 2,375
抗体2-15 + 10±2 0.9722 1,250
CTLA4阻断生物分析法
使用CTLA4阻断生物分析法测试抗CTLA4抗体(包括被掩蔽的抗CTLA4抗体)阻断CTLA4与其配体CD80和CD86的相互作用的能力。在预先升温的完全培养基中稀释抗体。将表达CTLA4的Jurkat细胞(效应细胞)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞混合且计数。将细胞添加至96孔板(Corning，#3917)的各孔中。向适当的孔中添加被稀释的抗体且一式两份地测试。温和地混合板且在37℃下培育15分钟。将APC细胞(表达CD80/CD86的Raji细胞)解冻且转移至含有完全培养基的锥形管中。将细胞温和地混合、计数且立即分配至各孔中且温和地混合。将板覆盖且在37℃下保持6小时。通过翻转来温和地混合Bio-Glo试剂且将瓶子保持在室温下。在培育六小时之后，从培育箱移出分析板且在室温下保持十分钟。向孔中添加Bio-Glo试剂且在室温下培育板五-十五分钟。接着，用光度计读取板且使用GraphPad Prism分析。使用单因素ANOVA比较来进行阻断结合的能力的倍数变化的统计分析。
所测试的抗体包括抗体2-2和抗体2-14以及同型对照。抗体2-2是抗体2的未被掩蔽的形式。在未预先暴露于蛋白酶(即，以被掩蔽的、未被活化的形式)的情况下测试抗体2-14，且也在暴露于蛋白酶之后(即，以被活化的形式)测试。也在不使用抗体(即，以无抗体的对照物形式)的情况下进行分析法。
结果
如图18A中所示，当由于不存在蛋白酶而呈未被活化的形式时，抗体2-14未显示有效阻断CTLA4与其配体的结合的能力。对高于无抗体的对照物的倍数变化的分析未显示在阻断CTLA4与其配体的结合方面，呈未被活化的形式的抗体2-14的能力与同型对照的能力之间的显著差异(图18B)。然而，当抗体2-14由于预先暴露于蛋白酶而呈被活化的形式时，其在一系列浓度下显示有效阻断CTLA4与其配体的结合的能力(图18A)。被活化的抗体2-14阻断CTLA4与其配体的结合的能力与未被掩蔽的抗体2-2的能力类似(图18A和18B)。实际上，对高于无抗体的对照物的倍数变化的分析未显示在阻断CTLA4与其配体的结合方面，被活化的抗体2-14与未被掩蔽的抗体2-2的能力之间的显著差异(图18B)。
实例15：抗CTLA4抗体在MB49小鼠膀胱肿瘤模型中的功效和药效学。
方法
使用MB49小鼠膀胱肿瘤模型评估抗CTLA4抗体的功效和药效学(PD)。通过给予各测试抗体(RSV-m对照抗体、伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-14和抗体2-15)且接着评估肿瘤体积和体重来评估功效。抗RSV对照抗体含有S239D和I332E突变(RSV-m对照抗体)。还在第5天进行周边免疫表型分析，其评估在给药后第5天周边血液中的CD4+Ki67+细胞的百分比和CD4+ICOS+细胞的百分比。评估十四组小鼠以用于功效研究，其中剂量以mg/kg计，如表15中所示。如本文中所使用，以mg/kg计的剂量也称为″mpk″。将MB49细胞皮下接种至C57/BL6-huCTLA4小鼠中。当肿瘤达到约350mm3时开始处理。进行单因素ANOVA和邓尼特事后检验(Dunnett’s post-test)以确定处理对比对照(RSV-m对照物)的统计显著性。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
表15
群组 抗体 剂量(mg/kg)
1 RSV-m对照物 10
2 伊派利单抗 0.3
3 伊派利单抗 1
4 伊派利单抗 3
5 抗体2-6 0.3
6 抗体2-6 1
7 抗体2-6 3
8 抗体2-6 10
9 抗体2-14 1
10 抗体2-14 3
11 抗体2-14 10
12 抗体2-15 1
13 抗体2-15 3
14 抗体2-15 10
通过向五个小鼠群组中的每一个给予抗体来评估药效学，其中剂量(mg/kg)如表16中所示。在肿瘤、肝脏、脾和血液中进行免疫表型分析和其它读取。通过以CD4+细胞的百分比形式测量Foxp3+CD25+细胞来评估T细胞，且以CD45+细胞的百分比形式测量CD8+细胞。还评估肿瘤、肝脏、肾脏、脾和血浆中的裂解和药物水平。
表16
群组 抗体 剂量(mg/kg)
1 RSV-m对照物 10
2 伊派利单抗 3
3 抗体2-6 3
4 抗体2-14 3
5 抗体2-15 3
结果
图23A展示在给药后第5天，对周边血液中的CD4+Ki67+细胞(左侧)和CD4+ICOS+细胞(右侧)的百分比的功效研究的结果，其表示T细胞活化水平。结果表明被掩蔽的抗CTLA4抗体，即抗体2-14在10mg/kg的剂量下呈现比抗CTLA4抗体，即伊派利单抗在低3.3倍的3mg/kg的剂量下所呈现的更低的T细胞活化。这表明在MB49小鼠模型中，被掩蔽的抗体2-14比伊派利单抗更安全。
如图23B中所示，在用10mg/kg(RSV-m对照物)或3mg/kg(伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-14、抗体2-15)处理的小鼠中，在第7天评估肿瘤重量和CD8/Treg比率。在第7天，在3mg/kg下，用抗体2-6或抗体2-14处理的小鼠呈现最低的肿瘤重量和肿瘤中最高的CD8/Treg比率。在任一种疗法下都未观察到体重、脾重量、肾脏重量或肝脏重量的变化(数据未展示)。
如图23C中所示，在抗体2-14，但未在伊派利单抗的情况下观察到调节性T细胞消耗和CD8+T细胞活化。
如图23D中所示，在用抗CTLA4抗体处理后观察到强抗肿瘤活性。在0.3mg/kg剂量下，抗体2-6与伊派利单抗相比显示优良的抗肿瘤活性。
实例16：肿瘤、肝脏、肾脏、脾和血浆中抗CTLA4抗体的体内裂解检测
方法
从Biocytogen购得B-hCTLA-4转基因雌性小鼠且在研究开始时是8-10周龄。将MC38结肠直肠肿瘤细胞(5×105个细胞/小鼠)、MB49膀胱癌细胞(1×106个细胞/小鼠)或MCA205纤维肉瘤细胞(1×106个细胞/小鼠)皮下接种至各小鼠的右侧腹中。当肿瘤尺寸达到约250-500mm3时(第0天)，小鼠接受所指示的抗体的单次10mg/kg腹膜内给药。在第4天收集肿瘤、肝脏、肾脏、脾和血浆以用于通过蛋白质印迹进行裂解分析。
对于血浆样品，通过在梯度准则预制凝胶(BioRad)上分离相同体积的变性血浆(1-2μL输入)来使用直接蛋白质印迹方法。接着，使用Turbo Transblot系统(BioRad)将被分离的蛋白质转移至硝化纤维膜中。接着，用HRP结合的抗体(ab202549)，使用用于抗人类κ轻链反应性的标准方法研究膜。当裂解的轻链迁移至低于未裂解的轻链且质量差为2kD时目视评估裂解。
使用Tissue Lyser II(Qiagen)珠粒均质器，在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher，78442)的RIPA缓冲液(Pierce，87788)中产生来自肿瘤、肝脏、脾和肾脏的蛋白质溶解物。通过BCA分析法确定蛋白质浓度且使3mg组织溶解物与生物素结合的抗人类κ轻链抗体(LSBio，LS-C351451-500)和抗生蛋白链菌素磁珠(Pierce，88816)一起经历免疫沉淀。在50μL 10mM甘氨酸(pH 2)中洗脱蛋白质且用1M Tris(pH 8)中和，接着如上文所描述进行人类κ轻链的蛋白质印迹检测。
在另一研究中，使用CTLA4 ELISA分析法评估健康猴(食蟹猕猴)组织(N＝2)和血浆(N＝3)的离体裂解。所测试的组织包括肾脏、脾、肝脏、膀胱、皮肤、结肠和肺。
在另一研究中，在给药之后第1小时、第1天和第7天评估健康食蟹猕猴的血浆中的体内裂解。通过毛细电泳法(CE)和质谱(MS)鉴别裂解。计算抗体2-14内的预期裂解位点(VPLS**LY)处的裂解产物的丰度。还计算另一位点(VPLSLY**SGG)处的裂解以进行比较。还计算抗体2-16的裂解的丰度。
在另一研究中，使用CTLA4 ELISA分析法评估小鼠肿瘤、组织和血浆中的离体裂解。这包括以下鼠类模型：C57/B16(N＝9)、野生型小鼠中的MC38(N＝9)、hCTLA4小鼠中的MC38(N＝5)、野生型小鼠中的MB49(N＝6)、野生型小鼠中的MCA205(N＝4)和野生型小鼠中的B16(N＝4)。评估肿瘤、脾、肝脏、肾脏和血浆中的裂解。将血浆样品合并。计算裂解频率和裂解分子百分比(中值)。
在另一研究中，使用来自人类肿瘤(结肠肿瘤、肺肿瘤)的人类调节之培养基进行离体裂解。在分析之前，在两轮免疫沉淀中使用蛋白质A/G珠粒以从人类样品去除人类IgG。使用抗hkLC抗体进行SDS-PAGE分析以检测所测试的抗体的裂解和未裂解形式。进行ELISA分析以计算裂解百分比(％)。
结果
如图24A中所示，对于使用MCA205纤维肉瘤细胞的研究，在抗体2-14而非抗体2-16的情况下，在肿瘤和肝脏组织中明显地检测到裂解产物。阳性对照(对照*)包括具有50％未裂解和来自抗体2-14的50％裂解产物的样品。
如图24B中所示，对于使用MB49膀胱癌细胞的研究，在抗体2-14而非抗体2-16的情况下，在肝脏组织中明显地检测到裂解产物。阳性对照(对照*)包括具有50％未裂解和来自抗体2-14的50％裂解产物的样品。
如图24C中所示，对于使用MC38结肠直肠癌细胞的研究，在抗体2-14而非抗体2-16的情况下，在肝脏组织中明显地检测到裂解产物。阳性对照(对照*)包括具有50％未裂解和来自抗体2-14的50％裂解产物的样品。
还进行以下研究：通过ELISA分析法定量向携带MB49的小鼠给予的各抗体的IgG水平，且接着在涂有CTLA4的MSD板上，在3倍连续稀释物(对于脾，以1μg/mL开始或对于肾脏和肝脏组织，以0.04μg/mL开始)中分析各样品，以评估CTLA4结合。这些研究包括未被掩蔽的亲本抗体(抗体2-6)、被掩蔽且可裂解的抗体(例如，抗体2-14和抗体2-16)以及被掩蔽但不可裂解的抗体(抗体2-10)。图24D是展示抗体2-14的裂解产物百分比(％)的SDS-PAGE分析。基于密度强度计算裂解百分比(裂解百分比＝下部谱带/(下部谱带+上部谱带)。第一泳道(左侧)展示血浆中的28％裂解、肾脏中的60％裂解、肝脏中的59％裂解和脾中的73％裂解。第二泳道(中间)展示血浆中的39％裂解、肾脏中的54％裂解、肝脏中的77％裂解和脾中的72％裂解。第三泳道(右侧)展示血浆中的35％裂解、肾脏中的64％裂解、肝脏中的75％裂解和脾中的69％裂解。箭头指示哪些样品用于评估与CTLA4的结合且结果展示于图24E中。图24E展示每种抗体与CTLA4之间的结合，其中每种抗体是在向携带MB49的B-hCTLA4转基因小鼠给药之后从血浆、肾脏、肝脏或脾分离。如图24E中所示，不可裂解的被掩蔽的抗体2-10与未被掩蔽的亲本抗体2-6相比显示降低的结合，而可裂解的被掩蔽的抗体2-14在肝脏和脾中显示与抗体2-6类似的结合且在血浆、肾脏、肝脏和脾中显示比抗体2-10更大的结合。与抗体2-10相比，抗体2-16在肾脏、肝脏和脾中显示更强的结合。图24F描绘由一组例示性蛋白酶进行的可裂解肽底物的体外裂解的热图。
使用CTLA4 ELISA分析法测试食蟹猕猴器官和血浆中的抗体2-14、抗体2-15、抗体2-10、抗体2-16和抗体1334的离体裂解的研究概述如下。抗体2-14在肺(88％)、膀胱(37％)和结肠(36％)中显示高裂解百分比。抗体2-16在肺(30％)和脾(15％)中显示中等裂解百分比。抗体1334在肺(22％)中显示中等裂解百分比。抗体2-14在血浆(4％)中显示低裂解百分比。未检测到抗体2-16在血浆中的裂解。抗体1334在血浆(5％)中显示低裂解百分比。
图25A-25F中展示在C57/B16-wt、MC38-wt、MC38-hCTLA4、M49-wt、MCA205-wt和B16小鼠中，使用CTLA4 ELISA分析法评估用于测试某些抗体(例如，抗体2-14、抗体2-15、抗体2-10、抗体2-16和抗体1334)在小鼠肿瘤、组织和血浆中的离体裂解的研究的结果。如通过ELISA分析法计算的裂解分子百分比概述于表17中。
表17.裂解分子百分比(％)
Figure BDA0003230734600001781
Figure BDA0003230734600001791
Figure BDA0003230734600001801
以雷达图形式展示裂解频率，如图25A-25F中所示。关于肿瘤条件培养基中的裂解频率，抗体2-14在MC38-wt的肿瘤条件培养基中的频率是33％，在MB49-wt的肿瘤条件培养基中的频率是17％且在MCA205-wt的肿瘤条件培养基中的频率是25％；且抗体2-16在MC38-wt的肿瘤条件培养基中的频率是100％，在MC38-hCTLA4的肿瘤条件培养基中的频率是40％且在MB49-wt的肿瘤条件培养基中的频率是17％。关于肾脏条件培养基中的裂解频率，抗体2-14在MC38-wt、MC38-hCTLA4、MB49-wt、MCA205-wt和B16-wt的肾脏条件培养基中的频率是100％；且抗体2-16在MC38-wt的肾脏条件培养基中的频率是67％，在MC38-hCTLA4的肾脏条件培养基中的频率是80％，在MB49-wt的肾脏条件培养基中的频率是17％且在B16-wt的肾脏条件培养基中的频率是100％。
图26A和26B描绘使用抗体2-14进行的健康食蟹猕猴的血浆中的体内裂解研究的结果。如图26A中所示，使用毛细电泳法(CE)的抗体2-14的裂解计算为在第1小时在所有三名受试者中是0％，在第1天在1号受试者中是8％，在第1天在3号受试者中是6％且在第1天在5号受试者中是4％；且在第7天在1号受试者中是35％，在第7天在3号受试者中是32％且在第7天在5号受试者中是31％。还使用质谱(MS)计算3号受试者中的抗体2-14的裂解，其计算为在第1小时是0％，在第1天是18％且在第7天是32.3％。将所预期的裂解位点(VPLS**LY)或另一位点(VPLSLY**SGG)处的完整(即，未裂解)的抗体2-14以及裂解产物的丰度定量。完整抗体2-14计算为在第1小时是100％丰度，在第24小时是82.1％且在第72小时是67.7％；裂解产物VPLS**LY计算为在第1小时是0％丰度，在第24小时是17％且在第72小时是32.3％丰度；且裂解产物VPLSLY**SGG计算为在第1小时和第72小时是0％丰度且在第24小时是1％。
图26C描绘使用抗体2-16进行的健康食蟹猕猴的血浆中的体内裂解研究的结果。如图26C中所示，在所测试的条件下，使用CE或MS未发现抗体2-16的裂解。完整(即，未裂解)的抗体2-16的丰度计算为在第1小时、第24小时和第72小时是100％丰度。
图27A和27B描绘使用由人类肺或结肠肿瘤样品调节的培养基的离体裂解研究的结果。图27A描绘SDS-PAGE分析，其展示通过进行两轮免疫沉淀(IP)来去除人类IgG，由此实现裂解分析。图27B描绘展示在存在裂解状态、未裂解状态或这两种状态的测试抗体的情况下，在由人类肿瘤样品调节的培养基中培育之后的SDS-PAGE分析的结果。还计算使用ELISA分析法的结果(参见图28E)，且展示描绘裂解的所选择的样品的裂解百分比(％)。如图27B中所示，证实抗体2-14在肿瘤样品中呈现裂解且计算为在肺肿瘤样品中呈现2.7％裂解，在colon2 8aug结肠肿瘤样品中呈现100％裂解，在结肠28aug结肠肿瘤样品中呈现75％裂解且在colon2 4sept结肠肿瘤样品中呈现100％裂解。如图27B中所示，证实抗体2-16在肿瘤样品中呈现裂解且计算为在肺肿瘤样品中呈现21％裂解，在colon2 8aug结肠肿瘤样品中呈现98％裂解，在结肠28aug结肠肿瘤样品中呈现45％裂解且在colon2 4sept结肠肿瘤样品中呈现100％裂解。这表明ELISA结合分析法的结果与裂解相关，如抗体2-14和抗体2-16的SDS-PAGE分析中所示。
还用结肠肿瘤上清液(colon2 4sept结肠肿瘤样品)，使用质谱来分析裂解分子百分比(％)且与ELISA分析法结果进行比较。计算可裂解肽内的各位点处的完整(即，未裂解)抗体以及由裂解产生的裂解产物的丰度。结果展示于图28A-28D中。如图28A中所示，当在结肠肿瘤条件培养基中培养时，完整抗体2-14的丰度是4.8％，相比之下，当在作为对照的RPMI中培养时，丰度是99.6％。当在结肠肿瘤条件培养基中培养抗体2-14时，L*SLY裂解产物的丰度是69％，S*LY裂解产物的丰度是5.9％，L*YSGG裂解产物的丰度是2.7％，Y*SGG裂解产物的丰度是11.3％且S*GG裂解产物的丰度是6.3％。如图28B中所示，当在结肠肿瘤条件培养基或作为对照的RMPI中培养时，完整抗体2-15的丰度是98.8％。如图28C中所示，当在结肠肿瘤条件培养基中培养时，完整抗体2-16的丰度是0.2％，相比之下，当在作为对照的RMPI中培养时，丰度是99.8％。当在结肠肿瘤条件培养基中培养抗体2-16时，T*SGG裂解产物的丰度是96.8％。如图28D中所示，当在结肠肿瘤条件培养基中培养时，完整抗体2-10的丰度是94.3％，相比之下，当在作为对照的RMPI中培养时，丰度是97.5％。
使用抗体2-6、抗体2-14、抗体2-15、抗体2-10、抗体2-16和含有Fc结构域中的S239D和I332E突变的伊派利单抗的被掩蔽的版本(被掩蔽的伊派利单抗-m)进行ELISA分析法，其中在结肠肿瘤条件培养基(colon2 4sept结肠肿瘤样品)或作为对照的RPMI中培养各测试抗体。结果展示于图28E中。抗体2-14计算为呈现100％的分子裂解，抗体2-15计算为呈现0％的分子裂解，抗体2-10计算为呈现4％的分子裂解且抗体2-16计算为呈现100％的分子裂解。
对于裂解分子百分比(％)，图28A-28D中展示的MS数据与ELISA数据相关。对于抗体2-14，在此结肠肿瘤样品情况下，ELISA分析展示100％的裂解，相比之下，基于MS数据为95.2％。对于抗体2-15，在此结肠肿瘤样品情况下，ELISA分析展示0％的裂解，相比之下，基于MS数据为1.2％。对于抗体2-10，在此结肠肿瘤样品情况下，ELISA分析展示4％的裂解，相比之下，基于MS数据为5.7％。对于抗体2-16，在此结肠肿瘤样品情况下，ELISA分析展示100％的裂解，相比之下，基于MS数据为99.8％。
使用从人体组织合作网(Cooperative Human Tissue Network；CHTN)获得的人类肿瘤组织和与肿瘤组织相邻的正常组织(NAT)进行抗CTLA4 ELISA分析。所测试的抗体包括抗体2-14、抗体2-16和抗体1334。表18概述结果。如表18中所示，抗体2-14(65％)的人类肿瘤组织的总裂解频率高于抗体2-16(22％)。抗体2-16(26％)的肿瘤裂解分子百分比略微高于抗体2-14(22％)。抗体2-14(24％)的总NAT裂解分子百分比高于抗体2-16(7％)。
表18
Figure BDA0003230734600001831
Figure BDA0003230734600001841
实例17：用患者肿瘤和正常邻近组织(NAT)进行的MC38和H228细胞系的酶和蛋白质组分析
根据标准方案(Thermo Scientific#23225)通过二喹啉甲酸(BCA)分析法评估样品中的总蛋白质浓度。肿瘤/NAT对样品的浓度是约1mg/mL，而细胞系样品的浓度通常低10倍。因此，使用10kDa截止膜将两个重复细胞系样品(MC38-1和H2228-1)浓缩10倍。将样品与AMSP-MS库一起在50μg/mL蛋白质的最终反应浓度下培育。
A.细胞毒性
使用LDH分析法(Thermo Scientific#88953)根据制造商方案在条件培养基样品中测量乳酸脱氢酶(LDH)的活性，以测量细胞毒性。还在作为MC38的对照的无血清DMEM培养基和作为H2228的对照的具有或不具有血清的RPMI以及NAT/肿瘤样品中测量背景LDH活性。相对于相应的背景培养基对照物的细胞毒性来表示细胞毒性。
使用条件培养基样品中的LDH的活性作为坏死的代表，如图29中所示。图29展示使用LDH释放分析法测量的细胞毒性，所述分析法是在用所指示的细胞系或肿瘤/NAT组织调节的无血清或补充有胎牛血清(FCS)的培养基中完成。吸光度值表示为在各样品的相应培养基中测量的基线活性的百分比。尽管MC38细胞具有与先前细胞活力数据类似的LDH细胞毒性，但H2228细胞具有高于预期的细胞毒性(比MC38高约2.6倍)。
当在无血清培养基中培养时，肿瘤和NAT组织展示增加的细胞死亡。与NAT样品相比，肿瘤样品对不存在血清更敏感，潜在地反映肿瘤样品中的较高生长速率。如图29中所示，与无血清培养基中的组织或被培养的细胞系相比，在完全培养基中培养的组织样品具有最低的细胞毒性水平。
B.蛋白酶特异性分析
通过质谱(AMSP-MS)方法用Alaunus Multiplex底物分析来进行蛋白酶特异性筛选。此方法使用物理-化学多样性肽库作为蛋白酶的底物，且随时间推移而监测反应且进行裂解产物的质谱检测。通过与不含酶的对照性培育的结果进行比较，针对用酶处理的样品中的特异性裂解来评估所引起的裂解。
对于特异性概况的差异性分析，用iceLogo软件(v.1.2)产生各位置处的各氨基酸的Z分数的矩阵。这些Z分数计算具体氨基酸的出现率与平均值的偏差倍数(即，阴性参考集合中所述特定位置处的所述特定氨基酸的出现率)。接着，使用gplot和RColorBrewer程序包，用样品之间的差异性Z分数产生R环境中的热图。
通过LC-MS/MS鉴别来自AMSP-MS库的时间依赖性肽裂解产物。两个细胞系样品MC38和H228各自展示针对库的良好活性水平。在时程期间观察到的裂解总数是40(15分钟)、107(60分钟)和306(240分钟)(对于MC38)；149(15分钟)、170(60分钟)和371(240分钟)(对于H2228)。由跨越整个时程观察到的453(对于MC38)和690(对于H2228)个裂解的累计清单来外推底物特异性的概况，且使用图30中的iceLogo表示法报告。IceLogo考虑肽库中的裂解和未裂解的位置，且用于观察侧接(P1-P1’)处的裂解位点的氨基酸的富集和去富集倍数。图30以iceLogo图形式展示MC38和H2228细胞系的底物裂解。字母高度测量裂解的肽中的氨基酸出现率相对于库中的所有可能的肽裂解的百分比差异，在各位置P4至P4’处标绘。中心线上方的残基是有利的；线下方的残基是不利的。由物理化学特性将统计显著残基(p≤0.05)染色(黑色：疏水性，红色：酸性，蓝色：碱性，紫色：酰胺性，绿色：小型)。在p＞0.05下观察到灰色的残基。
本文中由AMSP-MS鉴别的特异性概况展示内肽酶活性，对P1中的疏水性和碱性氨基酸具有强烈偏好，其是两种细胞系共有的。MC38细胞展示对P1’中的R和Y的偏好，以及在P3、P2和P4’处的其它疏水性特异性。H2228细胞展示对P1’处的H、S和Y的偏好，以及P2’和P4’处的其它疏水性特异性。
C.NAT和肿瘤差异性分析
如上文在实例17.B中所描述来鉴别来自MSP-MS库的时间依赖性肽裂解产物。两个患者组织样品展示针对库的高活性水平。在时程期间观察到的总裂解数是134(15分钟)、270(60分钟)和475(240分钟)(对于NAT)；63(15分钟)、184(60分钟)和447(240分钟)(对于肿瘤组织)。由跨越整个时程观察到的879(对于NAT)和694(对于肿瘤)个裂解的累计清单外推底物特异性的概况，且使用图31A中展示的iceLogo表示法报告。与图2相同，图31A和31B以iceLogo形式展示NAT和肿瘤(TUM)组织的底物裂解。
此外，在更长的24小时时间点时监测两个患者样品针对库的活性，以揭露底物特异性中的其它差异。在此额外时间点时观察到的裂解是719(对于NAT)和636(对于肿瘤)。整个时程(包括24小时时间点)的概况展示于图31B中。正亮氨酸(n)是库中Met的代表。NAT样品展示对P1中的碱性氨基酸(主要是R和K)以及P1’中的R、H和S的强烈偏好。肿瘤样品展示对P1中的碱性(R和K)和疏水性氨基酸的偏好以及对P1’中的H的强烈偏好。肿瘤样品还展示对P2’处的疏水性氨基酸的偏好，而两个患者样品共有对P4’处的疏水性氨基酸的偏好。
为了将NAT与肿瘤样品之间的整体底物特异性的差异定量，还使用来自各样品中的裂解的Z分数产生来源于各子位点处的残基偏好的差异图，如图31C中所示。图31C以热图形式展示P4-P4’位置处的Z分数的差异，以突出有利于NAT或肿瘤特异性裂解的残基。正亮氨酸(n)是库中Met的代表。此证实了NAT样品中P1处的赖氨酸和精氨酸的主要特异性，以及突出显示其它位置处的其它次要偏好，尤其在肿瘤样品中(如P1中的G和F)。
纳入细胞系H2228提供了在特异性概况方面比较永生化细胞系与类似来源的初生组织的机会，本文中选择非小细胞肺癌(NSCLC)。与肿瘤样品相比，H2228细胞在对NAT的特异性方面展示更显著的差异。此外，此差异性分析证实H2228细胞在与NAT相比时的一些偏好(左侧小图)，其与以类似方式与NAT进行比较的肿瘤组织的概况类似，包括P1处的G、H和F。然而，还检测到图31D中展示的H2228细胞与肿瘤组织之间的特异性差异(尽管不太显著)，提供对肿瘤微环境中的蛋白酶活性方面的患者异质性的支持。图31D以热图形式展示与NAT或肿瘤样品相比，P4-P4’位置处的Z分数的差异，以突出有利于H2228特异性裂解的残基。正亮氨酸(n)是库中Met的代表。
D.肽序列的动力学分析
通过AMSP-MS分析表19中展示的十个序列(AK10)。这些序列是从原始序列被略微修饰以产生与质谱相容的肽(在一些情况下，添加碱性残基以增加正电荷)和间隔残基(GG)，以产生更长的约14聚体肽。在AMSP-MS反应中在500nM最终浓度下制备肽。还通过LC-MS/MS单独地分析AK10库以用于肽物质的化学验证。
表19
Figure BDA0003230734600001871
在标准底物特异性分析条件下进行AMSP-MS分析，在反应物培育期间的取样时间点是第0、15、60、240和1200分钟。由各肽物质的MS1前体离子峰面积，通过质谱无标记定量来对肽进行定量。在GraphPad Prism软件，8.0版中将酶进展曲线模型化且使用非线性最小二乘拟合针对一级动力学方程来拟合数据：
Figure BDA0003230734600001881
其中Y＝产物形成百分比，Kobs是所观察到的速率且t＝时间。在米-蒙动力学(Michaelis-Menten kinetics)中，所观察到的速率Kobs是酶浓度和催化效率的函数(kcat/KM)。在酶混合物的此分析中，使用Kobs将产物裂解分级。
为了表示AMSP-MS反应中AK10肽的整体图，随时间推移而标绘各底物肽的标准化相对丰度。用MC38无血清条件培养基通过AMSP-MS监测AK10库中底物肽的相对丰度。观察到的对于MC38无血清条件培养基反应，归因于酶促和非酶促过程(如Met氧化)的组合，各底物的丰度以不同速率降低。为了评估酶裂解，还需要产物形成分析。
为了评估酶处理是否消耗底物，针对理想地达到饱和的单相衰减模型的拟合质量来评估产物形成速率。图32A和32B展示在MC38细胞系情况下具有明显降解的所选择的肽的单独进展曲线。图32A和32B展示在MC38条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图32A，左侧)、AK10-02(图32A，右侧)；AK10-04(图32B，左侧)和AK10-05(图32B，右侧)。在AK10-02情况下，清楚的产物形成是显而易见的且具有极轻微弯曲的曲线，而由AK10-01、AK10-4和AK10-05形成的″产物″是非特异性降解的实例。AK10-01基本上是线性的，AK10-04在时间零点中存在且AK10-05的产物由于化学过程而继续降解(通过LC-MS/MS观察到的一些)。
MC38的最佳底物是AK-09和AK-10，其中观察到这些肽的多种裂解产物。针对一级动力学速率拟合其进展曲线且接着根据其相关效率将裂解分级，如图33中所示。图33展示来自与AK10库肽的MC38 AMSP-MS反应的主要裂解产物的相关效率。最快速的裂解在肽AK-10中的PRQA|RVVG处发生，其中″|″指示易断裂的键。在肽AK-09中，在最高的最有效底物的窄倍数范围内观察到多个裂解，其中裂解位于：LS|GRSNAM、LSG|RSNAM和LSGR|SNAM。还展示AK-02的低效率裂解。
H2228细胞系在肽AK10-01、-02、-04、-09和-10中产生裂解。各个底物的产物形成展示于图34A和34B中。图34A和34B展示在H2228条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图34A，左上方)、AK10-02(图34A，右上方)、AK10-04(图34A，下部)、AK10-09(图34B，左侧)和AK10-10(图34B，右侧)。由H2228条件培养基实现的最高底物裂解和所计算的相关效率展示于图35中。
针对一级动力学速率拟合AK10库中的最高裂解底物且最有效裂解模体是：YDLY|HP和LSGR|S。模体LSGR|S按以下排序在三个肽中裂解：AK-01＞AK-09＞AK-02。YDLY|HP模体按以下排序在两个肽的情形下裂解：AK-04＞AK-09。在肽AK-10中，易断裂的键偏移至HPRQ|AR，但此肽仍在最高底物的5倍效率内裂解。
患者肿瘤样品产生比AK10库肽的AMSP-MS分析中的任一种细胞系样品更广泛的裂解集合。单独的产物形成迹线展示于图36A-36C中。这些图描绘在肿瘤条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图36A，左上方)、AK10-02(图36A，顶部中间)、AK10-03(图36A，底部)、AK10-04(图36B，左上方)和AK10-05(图36B，右上方)、AK10-09(图36B，底部)、AK10-09氧化肽(图36C，左侧)和AK10-10(图36C，右侧)与先前相同，在非氧化和氧化肽物质中观察到肽AK-09的若干降解产物。然而，肽AK-10的唯一显著裂解位于PRQA|RVV，且图36C，右侧小图中的产物进展曲线表明次级反应正在减少产物信号。
肿瘤条件培养基中AK10库的最高底物展示于图36D中。最高裂解发生于AK-03的LSLY|SG模体和AK-04的YDLY|HP中。来自H2228和肿瘤组织的NSCLC样品共有肽AK-04(YDLY|HP处)和多个位点(LSG|R|SNAMPYDLY|HP)处的AK-09的显著裂解。
NAT条件培养基还产生特异性裂解。底物丰度监测揭露了实验环境内显著的AK10库降解的整体趋势。各个产物展示图37A-37D中所描绘的特性范围。图37A-37D描绘在NAT条件培养基情况下所选择的底物的产物形成曲线；AK10-01(图37A，顶部)、AK10-02(图37A，底部)、AK10-04(图37B，顶部)和AK10-05(图37B，底部)、AK10-09(图37C，顶部)、AK10-09氧化肽(图37C，底部)和AK10-10(图37D)。表现较好的底物是AK-01、-04、-09和-10，且较差的底物是AK-02和AK-05。
最有效的NAT催化的底物的动力学分析展示于图37E中。最有效的NAT底物是AK-10(LSGR|SDNH)，与H2228但非肿瘤样品共有裂解。其它有效底物是多个位点(LS|GR|SNAMPYDLY|HP)处的AK-09，其中一些与H2228和肿瘤共有，和AK-04(YDLY|HP处)。
此分析表明正常邻近组织含有与其相匹配的肿瘤组织共有的位点特异性酶活性。具体地说，对于图31A，右侧小图中展示的肿瘤条件培养基，YDLY|HP裂解在iceLogo模体中是显而易见的。在图31A，右侧小图中，针对LSGR|S模体的特异性在4小时反应之后产生的肿瘤条件培养基iceLogo中也是显而易见的，并且在图31B，左侧小图中也在24小时培育时间下的NAT样品中甚至更明显地检测到。
MC38与NSCLC样品仅共有在肽AK-09和AK-02中发现的LSGRS模体内的裂解。HPRQ|AR模体处由MC38引起的AK-10的裂解是与H2228但非肿瘤样品共有的，或在HPRQA|R位处与NAT共有。GLSG|RS处的AK-02的MC38裂解符合其对Arg的强P1’偏好，如在图30，左侧小图中所描绘的其iceLogo模体中所见。
总而言之，表20支持AK10库肽具有与酶裂解一致的一级动力学特性的结论。表20指示(是/否/N.D.)肽底物是否由条件培养基样品裂解。N.D.指示在用条件培养基处理的样品中未以完整或裂解物质形式检测到。
表20
Figure BDA0003230734600001901
Figure BDA0003230734600001911
E.蛋白质组分析
通过BCA分析法将样品中的蛋白质浓度定量，且每次消化反应使用5μg总蛋白质。用4M尿素将样品变性，用5mM二硫苏糖醇(DTT)通过在56℃下反应30分钟来还原。在10mM下用碘乙酰胺(IAM)通过在黑暗中，在室温下反应1小时来将样品烷基化。用5mM DTT淬灭过量的IAM且接着将反应物稀释至1M最终尿素。在37℃下，用测序级猪胰蛋白酶(Promega，V5111)以1：50质量比的胰蛋白酶：样品将样品消化过夜。第二天，用C18吸管尖(Millipore-Sigma)将所得肽消化样品脱盐且接着冷冻干燥。将样品再悬浮于含0.1％甲酸的HPLC级水中以用于LC-MS/MS分析。
用配备有nanoACQUITY(Waters)超高效LC(UPLC)系统和EASY-Spray离子源(Thermo)的QExactive Plus质谱仪(Thermo)进行由LC-MS/MS进行的肽测序。用EASY-SprayPepMap C18柱(Thermo，ES800；3μm珠粒尺寸，75μm×150mm)进行逆相色谱。在样品装载期间，色谱在600-nl/min流动速率下进行14分钟，且接着在用于肽分离的400-nl/min流动速率下进行90分钟，线性梯度为含2至35％(体积/体积)乙腈的0.1％甲酸。在最少2,000次计数，分离宽度为2.0m/z且最小标准化碰撞能量为25的情况下，在六个最强的前体离子上通过高能碰撞解离(higher-energy collisional dissociation；HCD)来进行肽片段化。
用MSConvert6产生MS峰值清单且使用Protein Prospector软件，v.5.22.1(UCSF)分析数据。分别针对SwissProt人类或小鼠库(2017年11月1日下载)检索数据，总计20,240或16,942个项目。与人类NSCLC样品分开地分析MC38，一种小鼠细胞系。还检索SwissProt牛库以鉴别FCS蛋白质。使用反相数据库(decoy database)检索方法评估错误发现率(FDR)，且选择用于报告蛋白质鉴别的分数阈值以获得＜1％FDR。将质量公差设定为20ppm(对于母离子)和30ppm(对于片段离子)，且在允许一个非特异性裂解和一个遗漏裂解的情况下选择胰蛋白酶特异性。使用对Cys的脲基甲基化作为固定修饰。使用以下标准可变修饰：蛋白质N端乙酰化、蛋白质N端乙酰化+氧化、来自谷氨酰胺的N端焦谷氨酸盐形成、Met损失和Met氧化。此外，在跨越重复样品的既定实验中，每次蛋白质鉴别需要在单次LC-MS/MS运行中最少需要至少两个独特肽。
输出数据，其中频谱计数(肽计数)作为相关蛋白质丰度的近似值。为了校正每次运行之间的蛋白质装载中的潜在差异，通过所述运行中的总计数的总和来标准化肽计数。接着在Perseus中处理检索结果，对数据进行log2标准化，接着如果蛋白质在3个复本中的至少2个中不具有肽计数＞1，那么将所述蛋白质排除。接着，用由正态分布估算的随机数置换遗漏值。在两个重复集合之间进行魏尔希氏t测试(Welch’s t-test)且在R中产生火山图。
蛋白质鉴别包括47种蛋白酶或蛋白酶抑制剂，包括基质金属蛋白酶(Mmp2、7和12)、MMP抑制剂(Timp2)、蛋白酶体子单元(Psma)、丝氨酸蛋白酶抑制剂和胱抑素、羧基肽酶(Cpe和Cpd)、组织蛋白酶(Ctsd、b、h、z和1)、氨基肽酶(Rnpep、Lap3)、钙激活中性蛋白酶(Cpns)、脯氨酰基引导的肽酶(Dpp3、Xpnpep1和Pepd)、丝氨酸蛋白酶(Prss23)、三肽基肽酶(Tpp1)、Adam10和Casp3。
蛋白酶和抑制剂的丰度未必合计为所观察到的活性，但蛋白质鉴别提供对活性数据中鉴别的模体的洞察。举例来说，组织蛋白酶的存在可能是P1 nLeu偏好(Ctsd)或P1Arg、Gly(Ctsb、Ctsl)的原因。P1处的底物特异性概况中对碱性残基的强烈偏好还可能与来自凝血级联的背景血清蛋白质相关，因为在蛋白质组数据中检测到牛凝血酶和纤维蛋白溶酶。
将人类NSCLC相关样品的分析组合以进行样品之间的比较；这包括H2228细胞系、患者肿瘤和正常邻近组织。本文中，蛋白质组分析引起跨越所有三个样品的2243独特蛋白质的可靠鉴别。
鉴别包括类似的蛋白酶和其抑制剂的清单：蛋白酶体子单元氨基肽酶B和N、钙蛋白酶子单元、羧基肽酶E和A、胱天蛋白酶1、3、6、8、组织蛋白酶B、D、E、L1、L2、S和Z、DPP1、2和3；ADAM10、MMP14和9、MMP抑制剂1和2；丝氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶HTRA1、脯氨酰基肽链内切酶(包括FAP)、脯氨酰基氨基肽酶、三肽基肽酶TPP1和TPP2以及凝血因子和补体蛋白质。
使用Perseus软件对在来自NAT和肿瘤样品的条件培养基中检测到的蛋白质清单进行例示性差异性分析，实现两组重复样品之间的差异性表达的双侧魏尔希氏t测试(基于肽计数)。在图38中的火山图中显示结果，其中这些部分中存在肿瘤(右上侧，部分2)或NAT(左上侧，部分1)中显著富集的蛋白质。在此清单中鉴别三种相关蛋白质：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白H1、α-1-抗胰凝乳蛋白酶(SERPINA3)和巨噬细胞甘露糖受体1(MRC1)。
总之，使用AMSP-MS的无偏活性分析揭露了各样品的裂解概况和对碱性残基的整体强烈偏好。MC38和H2228细胞系具有不同的蛋白酶特异性概况，而来自相同患者的肿瘤和NAT组织共有类似的蛋白酶特异性，但差异性分析揭露了与肿瘤中的P1 Leu、Phe或Gly相比，NAT样品中对P1 Arg/Lys的更强烈偏好。比较性动力学分析证实在多个样品和各个底物内，两种特异性模体可靠地裂解，包括YDLY|HP和LSGR|S。小鼠MC38细胞系具有与其它人类NSCLC相关样品不同的生物来源，但在MC38条件培养基中鉴别的蛋白酶和抑制剂的集合与NSCLC集合明显类似。由蛋白质组分析鉴别的蛋白酶包括具有与所观察到的AMSP-MS裂解一致的特异性的候选物，包括组织蛋白酶。
实例18：食蟹猕猴中被掩蔽的抗CTLA4抗体的体内评估
在第一组实验中，向食蟹猕猴给予伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-10或同型对照，且通过测量CD4+细胞中的Ki67+细胞百分比(％)来评估药效学(PD)作用。在第二组实验中，向食蟹猕猴给予抗体2-6、抗体2-10、抗体2-14、抗体2-16或同型对照，且通过测量CD4+细胞中的Ki67+细胞百分比(％)来评估药效学作用。
第一组和第二组PD实验的结果展示于图21中。在诱导周边PD作用方面，亲本未被掩蔽的抗体2-6比伊派利单抗更有效，如由与伊派利单抗相比CD4+细胞中的升高的Ki67+细胞百分比证实。抗体2-10，其是抗体2-6的被掩蔽但不可裂解的版本，阻断与抗体2-6相关的PD作用。如第二组实验(实验2)中所示，被掩蔽且可裂解的抗体，即抗体2-14和抗体2-16与未被掩蔽的亲本抗体2-6相比呈现降低的PD作用。
还使用食蟹猕猴在测试抗体(RSV-m对照物、伊派利单抗、抗体2-6、抗体2-10、抗体2-14、抗体2-16或含有Fc结构域中的S239D和I332D突变的伊派利单抗的被掩蔽的版本(被掩蔽的伊派利单抗-m)的10mg/kg静脉内给药后评估药物动力学。测量血浆中各抗体的水平，且在两个研究中测量半衰期(天)、Cmax(μg/mL)和曲线下面积(AUC)(天×微克/毫升)。
药物动力学研究的结果展示于图22中。图22展示在14天时段内所给予的各抗体的水平。此数据表明在10mg/kg静脉内给药后，抗体2-14和抗体2-16在食蟹猕猴中显示有利的药物动力学。
序列表
<110> 希望之城公司
西利欧发展公司
<120> 可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白质
<130> AJ20628PT2101
<140> 未指定
<141> 一同提交
<150> US 62/785,111
<151> 2018-12-26
<160> 508
<170> 用于Windows的FastSEQ，4.0版
<210> 1
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<223> 合成构筑体
<400> 52
Thr Ser Glu Phe Val Phe Ala Pro Asp Gln
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 53
Lys Leu Val Leu Pro Val Leu Pro
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 54
Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu
1 5
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 55
Ala Asn Gln Leu Lys Gly
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 56
Gln Ser Gln Leu Lys Glu
1 5
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 57
His Glu Gln Leu Thr Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 58
Pro Ala Asn Leu Val Ala Pro Asp Pro
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 59
Pro Ala Pro Gly Val Tyr Pro Gly Pro
1 5
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 60
Ala Pro Ala Gly Leu Ile Val Pro Tyr Asn
1 5 10
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 61
Pro Gln Ala Leu Val Ala
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 62
Val Gly Asn Leu Asn Phe
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 63
Val Ala Asn Leu Leu Tyr Glu
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 64
Val Tyr Asn Leu Met Asp
1 5
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 65
Thr Phe Asn Ile Lys Gln
1 5
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 66
Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 67
Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 68
Gln Gln Tyr Arg Ala Leu Lys Ser
1 5
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 69
Tyr Val Pro Arg Ala Val Leu
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 70
Gly Val Asn Lys Trp Pro Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 71
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 72
Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 73
Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Ala Ser
1 5
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 74
Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 75
Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 76
Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 77
Val His His Gln Lys Leu Val Phe
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 78
Ile Arg Arg Val Ser Tyr Ser Phe
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 79
Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 80
Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 81
Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr Leu Val Leu Pro Val Leu Pro
1 5 10 15
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 82
Thr Ser Glu Phe Val Phe Ala Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe
1 5 10 15
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 83
Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 84
Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 85
Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 86
Val Pro Leu Ser Leu Tyr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 87
Thr Ser Ala Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ala
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 88
Pro Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Ser Pro
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 89
Gly Gly Ser
1
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 90
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 91
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 92
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 92
Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 93
Gly Ser
1
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 94
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 95
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 95
Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 96
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 97
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 98
Gly His Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 99
Gly Pro Ser
1
<210> 100
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 100
Gly Ala Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 101
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 102
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 102
Ser Gly Gly
1
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 103
Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 104
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 104
Ser Ser Gly
1
<210> 105
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 105
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
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<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 106
Gly Gly
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 107
Gly Gly Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 108
Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 109
Ser His Gly Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 110
His Gly Gly Gly
1
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 111
Ser Gly Ala Ala
1
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 112
Ser Gly Pro Ala
1
<210> 113
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 113
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
20
<210> 114
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 114
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Gly Gly Gly
20 25
<210> 115
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 115
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Ser
20 25
<210> 116
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 116
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ala Gly Gly Ser
20 25
<210> 117
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 117
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ser Ser
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Pro
20
<210> 118
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 118
Asp Asp Pro Val Cys Trp Asp Ser Asn Pro Thr Cys Gln Thr Ile Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 119
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 119
Ile Ser Asp Gln Cys Ser Val Leu Phe Leu Ser Cys Asn Thr Arg Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 120
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 120
Ala Cys His Phe Pro His Pro Glu Gly Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 121
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 121
Ala Cys Leu Pro Pro Phe Pro Thr Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 122
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 122
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 123
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 123
Ala Cys Pro Asp His Val Phe Pro Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 124
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 124
Ala Cys Trp Leu Pro Lys Pro Asp Met Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 125
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 125
Ala Cys Trp Ser Trp Pro Ser Lys Ala Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 126
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 126
Ala Cys Tyr Pro Phe Gly Lys Tyr Glu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser
<210> 127
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 127
Ala Leu Thr Pro Ala Lys Trp Leu Pro Ala Asp Asp Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 128
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 128
Asp Asp Lys Glu Cys Asp Trp Met His Phe Ala Cys Thr Gly Pro Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 129
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 129
Asp Glu Met Lys Cys Ala Trp Ser Leu Glu Met Cys Val Arg Thr Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 130
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 130
Asp Pro Ile Leu Cys Pro Asn Thr Arg Met Ser Cys Asp Asn Gln Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 131
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 131
Gly Asn Ala Leu Tyr Asp Ser Pro Gly Thr Met Leu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 132
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 132
Lys Asn Tyr Glu Cys Arg Glu Val Met Pro Pro Cys Glu Pro Asn Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 133
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 133
Asn Ser Tyr Thr Ser Pro Tyr Trp Leu Pro Asp Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 134
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 134
Ser Leu Thr Pro Pro Tyr Trp Ile Pro Arg Glu Trp Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 135
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 135
Ser Pro Leu Thr Pro His Asp Arg Pro Ser Phe Leu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 136
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 136
Thr Ala Asp Val Phe Ser Ser Ser Arg Tyr Thr Arg Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 137
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 137
Thr Asp Leu Gln Cys Pro Pro Ser Ser Pro Ile Cys Gln Ile Glu His
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 138
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 138
Thr Lys Cys His Cys Asp Gly Asn Cys Val Met Cys Tyr Gln Met Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 139
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 139
Thr Leu Ala Tyr Glu Thr Pro Leu Leu Trp Leu Pro Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 140
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 140
Thr Asn Trp His Cys Asn Asn Asp Gly Ser Ser Cys Asn Val Arg Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser
35
<210> 141
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 141
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val
1 5 10 15
Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
20 25 30
Gly
<210> 142
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 142
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu
1 5 10 15
Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 143
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 143
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala Cys Asn Leu Ile
1 5 10 15
Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly
20 25 30
Gly Gly
<210> 144
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 144
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
35
<210> 145
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 145
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val
1 5 10 15
Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro
20 25 30
Arg Gly Gly Ser
35
<210> 146
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 146
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu
1 5 10 15
Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 147
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 147
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala Cys Asn Leu Ile
1 5 10 15
Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Gly Gly Ser
35
<210> 148
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 148
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Ser
35 40
<210> 149
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 149
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Met Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Leu Tyr His Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 150
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 150
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gln Leu Thr Ala Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 151
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 151
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Gly
1 5 10 15
Arg Phe Gln Thr Phe Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 152
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 152
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Ser Gly
1 5 10 15
Gly Phe Met Leu Thr Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 153
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 153
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 154
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 154
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Glu
1 5 10 15
Phe Val Phe Ala Pro Asp Gln Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 155
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 155
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Lys Leu Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Leu Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 156
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 156
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Lys Pro Ile
1 5 10 15
Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 157
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 157
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Asn Gln
1 5 10 15
Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly
20
<210> 158
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 158
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gln Ser Gln
1 5 10 15
Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly
20
<210> 159
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 159
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser His Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly
20
<210> 160
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 160
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ala Asn
1 5 10 15
Leu Val Ala Pro Asp Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 161
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 161
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ala Pro
1 5 10 15
Gly Val Tyr Pro Gly Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 162
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 162
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ile Val Pro Tyr Asn Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 163
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 163
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Gln Ala
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly
20
<210> 164
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 164
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Gly Asn
1 5 10 15
Leu Asn Phe Ser Gly Gly Gly
20
<210> 165
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 165
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Ala Asn
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Glu Ser Gly Gly Gly
20
<210> 166
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 166
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Tyr Asn
1 5 10 15
Leu Met Asp Ser Gly Gly Gly
20
<210> 167
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 167
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Phe Asn
1 5 10 15
Ile Lys Gln Ser Gly Gly Gly
20
<210> 168
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 168
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Trp
1 5 10 15
Lys Leu Leu Pro Ser Gly Gly Gly
20
<210> 169
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 169
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Arg Ala Ser Gly Gly Gly
20
<210> 170
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 170
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gln Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Ala Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 171
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 171
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Tyr Val Pro
1 5 10 15
Arg Ala Val Leu Ser Gly Gly Gly
20
<210> 172
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 172
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Val Asn
1 5 10 15
Lys Trp Pro Thr Ser Gly Gly Gly
20
<210> 173
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 173
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ala Val Arg Ser Ser Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 174
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 174
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Arg Ala Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Ser Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 175
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 175
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 176
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 176
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Gln Thr
1 5 10 15
Val Thr Trp Pro Asp Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 177
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 177
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Ile Pro
1 5 10 15
Met Ser Ile Pro Pro Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 178
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 178
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Val His His Gln Lys Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 179
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 179
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val His His
1 5 10 15
Gln Lys Leu Val Phe Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 180
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 180
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ile Arg Arg
1 5 10 15
Val Ser Tyr Ser Phe Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 181
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 181
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Met Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Leu Tyr His Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 182
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 182
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gln Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 183
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 183
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Ser Gly
1 5 10 15
Gly Phe Met Leu Thr Leu Val Leu Pro Val Leu Pro Ser Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 184
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 184
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Glu
1 5 10 15
Phe Val Phe Ala Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Gly
<210> 185
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 185
Ala Cys Asn Leu Ile Val Gln Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
20
<210> 186
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 186
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser His Gly Gly
20
<210> 187
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 187
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser His Gly Gly
20
<210> 188
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 188
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
20
<210> 189
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 189
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr His Gly Gly Gly
20
<210> 190
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 190
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr His Gly Gly Gly
20
<210> 191
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 191
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Pro Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Ala
20
<210> 192
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 192
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ala Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Pro Ala
20
<210> 193
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 193
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Pro Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Pro Ala
20
<210> 194
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 194
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 195
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 195
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
20 25 30
Ser Gly Gly
35
<210> 196
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 196
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 197
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 197
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly
20 25 30
Gly
<210> 198
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 198
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 199
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 199
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly
35
<210> 200
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 200
Ala Cys Lys His Ala Pro Tyr Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 201
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 201
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Lys Ile Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 202
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 202
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 203
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 203
Asn Trp Leu Gly Glu Trp Leu Pro Pro Gly Lys Val Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 204
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 204
Gln Phe Ile Glu Cys Pro Asn Phe Pro Arg Gln Cys Pro Gly Lys Asn
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 205
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 205
Val Arg Gln Gln Cys Ser Leu Asn Pro Gly Arg Cys Pro Tyr Leu Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 206
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 206
Val Trp Gln Glu Cys His Thr Ala Pro Gln Leu Cys Pro Gly Lys Ile
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 207
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 207
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Gly Ser Ser Gly
20 25 30
<210> 208
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 208
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 209
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 209
Asp Ser Tyr Thr Cys Arg Gly Pro Thr Trp Met Cys Ala Gly Asn Met
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 210
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 210
Phe Asn His Asp Cys Ser Gly His Trp Met Arg Cys Leu Asp Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 211
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 211
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 212
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 212
Asn Lys Ser Pro Cys Arg Pro Lys Met Val Ala Cys Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 213
Pro Thr Pro Gln Cys Trp Asn Gln Tyr Tyr Glu Cys Trp Ile Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 214
Ser Gln Lys Cys Pro Trp Thr Lys Glu Thr Cys Met His Tyr Met Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Ser Gly Gly
35
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 215
Trp His Leu Ser Met Tyr Pro Lys Pro Pro Ala Glu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 216
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 216
Trp His Thr Asp Gly Phe Tyr Thr Arg Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 217
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 217
Ala Cys Ile His Ala Pro Tyr Ala Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 218
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 218
Ala Cys Pro Ala Lys Ile Gly Gln Glu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 219
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 219
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 220
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 220
Ala Cys Thr Lys Pro Ala Lys Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 221
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 221
Asp Thr Ala Thr Cys Tyr Thr Thr Thr Gly Trp Cys Glu Gly Met Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 222
Asn Ser Asp Asn Cys Gly Pro Ala Lys Ser Thr Cys Met Tyr Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly
35
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 223
Pro Pro Gly Lys Cys Thr Gln Pro His Arg Cys Pro Pro Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Ser Gly Gly
35
<210> 224
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 224
Ala Cys Ile His Ala Pro Tyr Ala Lys Cys Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly
<210> 225
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 225
Ala Cys Pro Ala Lys Ile Gly Gln Glu Cys Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
<210> 226
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 226
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly
35
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 227
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25
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<211> 28
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 228
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 229
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 230
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 231
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly
20 25
<210> 232
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 232
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro
100
<210> 233
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 233
Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Ile Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 234
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 234
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
20 25 30
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
35 40 45
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
50 55 60
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
65 70 75 80
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
85 90 95
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
100 105 110
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
115
<210> 235
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 235
Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp
1 5 10 15
Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
50 55 60
Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr
65 70 75 80
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
85 90 95
Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
145 150 155 160
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
165 170 175
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
180 185 190
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
195 200 205
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
210 215 220
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
245 250 255
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
260 265 270
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
290 295 300
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
305 310 315 320
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325
<210> 236
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 236
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp
1 5 10 15
Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser
50 55 60
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr
65 70 75 80
Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu
85 90 95
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys
100 105 110
Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr
130 135 140
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
145 150 155 160
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
165 170 175
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser
180 185 190
Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
195 200 205
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro
225 230 235 240
Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn
260 265 270
Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys
290 295 300
Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu
305 310 315 320
Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 237
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 237
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 238
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 238
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 239
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 239
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 240
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 240
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 241
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 241
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ala Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 242
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 242
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ser Ser
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Ser Ser Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
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Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
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<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 243
Asp Asp Pro Val Cys Trp Asp Ser Asn Pro Thr Cys Gln Thr Ile Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
50 55 60
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
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Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
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210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 244
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 244
Ile Ser Asp Gln Cys Ser Val Leu Phe Leu Ser Cys Asn Thr Arg Val
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Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
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Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
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Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
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Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
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Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
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Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
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Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 245
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 245
Ala Cys His Phe Pro His Pro Glu Gly Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
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Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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<210> 246
<211> 252
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 246
Ala Cys Leu Pro Pro Phe Pro Thr Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
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Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
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<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 247
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Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
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Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 248
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
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Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
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Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 249
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 249
Ala Cys Trp Leu Pro Lys Pro Asp Met Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
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Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
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245 250
<210> 250
<211> 252
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 250
Ala Cys Trp Ser Trp Pro Ser Lys Ala Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
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Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
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Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
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Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His
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Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
65 70 75 80
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
115 120 125
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
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<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 251
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 252
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Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
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<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 253
Asp Asp Lys Glu Cys Asp Trp Met His Phe Ala Cys Thr Gly Pro Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
50 55 60
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
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Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
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Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 254
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 254
Asp Glu Met Lys Cys Ala Trp Ser Leu Glu Met Cys Val Arg Thr Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
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Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
115 120 125
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
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Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
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Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 255
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 255
Asp Pro Ile Leu Cys Pro Asn Thr Arg Met Ser Cys Asp Asn Gln Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
50 55 60
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
85 90 95
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
115 120 125
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 256
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 256
Gly Asn Ala Leu Tyr Asp Ser Pro Gly Thr Met Leu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val
35 40 45
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
50 55 60
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
180 185 190
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
210 215 220
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
225 230 235 240
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
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<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 257
Lys Asn Tyr Glu Cys Arg Glu Val Met Pro Pro Cys Glu Pro Asn Thr
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
50 55 60
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 258
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 258
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1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
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50 55 60
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Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
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Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
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225 230 235 240
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
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<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 259
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
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Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
85 90 95
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100 105 110
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Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
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<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 261
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1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
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Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
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Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
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Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 262
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Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 263
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 263
Thr Lys Cys His Cys Asp Gly Asn Cys Val Met Cys Tyr Gln Met Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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100 105 110
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Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
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Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 264
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 264
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Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val
35 40 45
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
50 55 60
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
180 185 190
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
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225 230 235 240
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 265
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 265
Thr Asn Trp His Cys Asn Asn Asp Gly Ser Ser Cys Asn Val Arg Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Asn Pro Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
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Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
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Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
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210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 266
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 266
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Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
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Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
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Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
165 170 175
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
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195 200 205
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 267
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 267
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu
1 5 10 15
Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
35 40 45
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
100 105 110
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
115 120 125
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
145 150 155 160
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
180 185 190
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 268
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 268
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala Cys Asn Leu Ile
1 5 10 15
Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
85 90 95
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
100 105 110
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
115 120 125
Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
130 135 140
Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser
145 150 155 160
Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn
165 170 175
Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser
180 185 190
Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys
195 200 205
Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 269
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 269
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
20 25 30
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
35 40 45
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
50 55 60
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
85 90 95
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
115 120 125
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
130 135 140
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
145 150 155 160
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
165 170 175
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
180 185 190
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
195 200 205
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
225 230 235 240
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
245 250 255
Glu Cys
<210> 270
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 270
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val
1 5 10 15
Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro
20 25 30
Arg Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro
35 40 45
Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
50 55 60
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys
65 70 75 80
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
100 105 110
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
115 120 125
Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
130 135 140
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
145 150 155 160
Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe
165 170 175
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp
180 185 190
Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp
195 200 205
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys
210 215 220
Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys
225 230 235 240
Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250 255
<210> 271
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 271
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu
1 5 10 15
Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
20 25 30
Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val
35 40 45
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
50 55 60
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
180 185 190
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
210 215 220
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
225 230 235 240
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 272
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 272
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Ala Cys Asn Leu Ile
1 5 10 15
Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu
35 40 45
Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
50 55 60
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
85 90 95
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr
115 120 125
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
130 135 140
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe
145 150 155 160
Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys
165 170 175
Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile
180 185 190
Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln
195 200 205
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
210 215 220
Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His
225 230 235 240
Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250 255
<210> 273
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 273
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly
1 5 10 15
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
35 40 45
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
50 55 60
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
65 70 75 80
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
85 90 95
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
115 120 125
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
130 135 140
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
145 150 155 160
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
165 170 175
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
180 185 190
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
195 200 205
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
210 215 220
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
225 230 235 240
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
245 250 255
Asn Arg Asn Glu Cys
260
<210> 274
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 274
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Met Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Leu Tyr His Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 275
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 275
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gln Leu Thr Ala Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 276
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 276
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Gly
1 5 10 15
Arg Phe Gln Thr Phe Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 277
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 277
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Ser Gly
1 5 10 15
Gly Phe Met Leu Thr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 278
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 278
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 279
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 279
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Glu
1 5 10 15
Phe Val Phe Ala Pro Asp Gln Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr
20 25 30
Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
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Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
50 55 60
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
100 105 110
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
115 120 125
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
130 135 140
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
165 170 175
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
180 185 190
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
195 200 205
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
210 215 220
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
225 230 235 240
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 280
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 280
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Lys Leu Val
1 5 10 15
Leu Pro Val Leu Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
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Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
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Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
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195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
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225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 281
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 281
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Lys Pro Ile
1 5 10 15
Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
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Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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65 70 75 80
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Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 282
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 282
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Asn Gln
1 5 10 15
Leu Lys Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 283
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 283
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gln Ser Gln
1 5 10 15
Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
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50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
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130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
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Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 284
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 284
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser His Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 285
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 285
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ala Asn
1 5 10 15
Leu Val Ala Pro Asp Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 286
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 286
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Ala Pro
1 5 10 15
Gly Val Tyr Pro Gly Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 287
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 287
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Pro Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ile Val Pro Tyr Asn Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr
20 25 30
Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
35 40 45
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
50 55 60
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
100 105 110
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr
115 120 125
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
130 135 140
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
165 170 175
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
180 185 190
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
195 200 205
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
210 215 220
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
225 230 235 240
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 288
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 288
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Gln Ala
1 5 10 15
Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 289
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 289
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Gly Asn
1 5 10 15
Leu Asn Phe Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 290
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 290
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Ala Asn
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Glu Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
130 135 140
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
165 170 175
Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp
180 185 190
Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu
195 200 205
Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu
210 215 220
Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys
<210> 291
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 291
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Tyr Asn
1 5 10 15
Leu Met Asp Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 292
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 292
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Phe Asn
1 5 10 15
Ile Lys Gln Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 293
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 293
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Trp
1 5 10 15
Lys Leu Leu Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
130 135 140
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
165 170 175
Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp
180 185 190
Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu
195 200 205
Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu
210 215 220
Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys
<210> 294
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 294
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Lys Arg Ala Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
130 135 140
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
165 170 175
Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp
180 185 190
Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu
195 200 205
Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu
210 215 220
Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys
<210> 295
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 295
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gln Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Ala Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
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50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 296
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 296
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Tyr Val Pro
1 5 10 15
Arg Ala Val Leu Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
130 135 140
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
165 170 175
Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp
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195 200 205
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Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys
<210> 297
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 297
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Val Asn
1 5 10 15
Lys Trp Pro Thr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
130 135 140
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys
165 170 175
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195 200 205
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Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Asn Glu Cys
<210> 298
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 298
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ala Val Arg Ser Ser Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
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65 70 75 80
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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 299
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 299
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Arg Ala Ala
1 5 10 15
Ala Val Lys Ser Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 300
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 300
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Leu Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
50 55 60
Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
180 185 190
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
210 215 220
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Asn Glu Cys
245
<210> 301
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 301
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Gln Thr
1 5 10 15
Val Thr Trp Pro Asp Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
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100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
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Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 302
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 302
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ala Ile Pro
1 5 10 15
Met Ser Ile Pro Pro Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
100 105 110
Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe
115 120 125
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
165 170 175
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
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Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
195 200 205
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
210 215 220
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225 230 235 240
Arg Asn Glu Cys
<210> 303
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 303
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Val His His Gln Lys Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
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Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 304
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val His His
1 5 10 15
Gln Lys Leu Val Phe Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
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Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
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Arg Asn Glu Cys
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<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 305
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Ile Arg Arg
1 5 10 15
Val Ser Tyr Ser Phe Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr
20 25 30
Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys
35 40 45
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65 70 75 80
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Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 306
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Met Pro Tyr
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Asp Leu Tyr His Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly Gly Asp
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Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn
50 55 60
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Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
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Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
165 170 175
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
180 185 190
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195 200 205
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
210 215 220
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225 230 235 240
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 307
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 307
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gln Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly Gly Asp
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Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp
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Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn
50 55 60
Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
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115 120 125
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Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
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245 250
<210> 308
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 308
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Asp Ser Gly
1 5 10 15
Gly Phe Met Leu Thr Leu Val Leu Pro Val Leu Pro Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
35 40 45
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
50 55 60
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
65 70 75 80
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
100 105 110
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
115 120 125
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
145 150 155 160
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
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Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
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Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 309
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 309
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Thr Ser Glu
1 5 10 15
Phe Val Phe Ala Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu
35 40 45
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His
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Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
65 70 75 80
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
115 120 125
Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
130 135 140
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
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Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
245 250
<210> 310
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 310
Ala Cys Asn Leu Ile Val Gln Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Cys
<210> 311
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 311
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser His Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Glu Cys
<210> 312
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 312
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser His Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
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50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Cys
<210> 313
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 313
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
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Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 314
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 314
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Gly Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr His Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 315
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 315
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly His Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr His Gly Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 316
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 316
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Pro Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
165 170 175
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr
180 185 190
Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala
210 215 220
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 317
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 317
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Ala Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Pro Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val
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195 200 205
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225 230 235 240
Glu Cys
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 318
Ala Cys Asn Leu Ile Val Glu Gly His Cys Gly Pro Ser Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ser Gly Pro Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu
20 25 30
Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr
50 55 60
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly
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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
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Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp
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Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn
225 230 235 240
Glu Cys
<210> 319
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 319
Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser
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Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp
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195 200 205
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Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
245 250 255
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
260 265 270
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
275 280 285
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
290 295 300
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
340 345 350
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
355 360 365
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
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Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
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His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 320
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 320
Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Ile Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
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Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
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Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
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Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn
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Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val
245 250 255
Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
275 280 285
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
305 310 315 320
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser
325 330 335
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser
370 375 380
Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr
385 390 395 400
Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn
420 425 430
Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser
435 440 445
Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 321
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 321
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 322
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 322
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 323
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 323
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 324
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 324
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 325
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 325
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 326
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 326
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 327
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 327
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
85 90 95
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 328
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 328
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
100 105 110
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
130 135 140
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
145 150 155 160
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
165 170 175
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
180 185 190
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
195 200 205
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
225 230 235 240
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
245 250 255
Cys
<210> 329
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 329
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
20 25 30
Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val
35 40 45
Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
50 55 60
Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser
85 90 95
Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
180 185 190
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
210 215 220
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
225 230 235 240
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 330
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 330
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
35 40 45
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu
50 55 60
Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly
85 90 95
Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
100 105 110
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val
115 120 125
Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
130 135 140
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
145 150 155 160
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
165 170 175
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
195 200 205
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
210 215 220
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 331
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 331
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly
20 25 30
Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro
35 40 45
Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val
85 90 95
Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
100 105 110
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln
115 120 125
Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
130 135 140
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
180 185 190
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
195 200 205
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
210 215 220
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
225 230 235 240
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 332
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 332
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
35 40 45
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
50 55 60
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
65 70 75 80
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
115 120 125
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 333
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 333
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val
35 40 45
Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser
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Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
145 150 155 160
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
165 170 175
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
180 185 190
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
195 200 205
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
210 215 220
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
225 230 235 240
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 334
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 334
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 335
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 335
Ala Cys Lys His Ala Pro Tyr Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
35 40 45
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 336
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 336
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Lys Ile Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
210 215 220
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 337
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 337
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
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Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
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180 185 190
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 338
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 338
Asn Trp Leu Gly Glu Trp Leu Pro Pro Gly Lys Val Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr
35 40 45
Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser
50 55 60
Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp
65 70 75 80
Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
165 170 175
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
180 185 190
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
210 215 220
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
225 230 235 240
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 339
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 339
Gln Phe Ile Glu Cys Pro Asn Phe Pro Arg Gln Cys Pro Gly Lys Asn
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe
35 40 45
Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser
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Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
100 105 110
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp
115 120 125
Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 340
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 340
Val Arg Gln Gln Cys Ser Leu Asn Pro Gly Arg Cys Pro Tyr Leu Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe
35 40 45
Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser
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Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
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Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp
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Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 341
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 341
Val Trp Gln Glu Cys His Thr Ala Pro Gln Leu Cys Pro Gly Lys Ile
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe
35 40 45
Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser
65 70 75 80
Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
100 105 110
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp
115 120 125
Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
145 150 155 160
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 342
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 342
Asp Ser Tyr Thr Cys Arg Gly Pro Thr Trp Met Cys Ala Gly Asn Met
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
100 105 110
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
130 135 140
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165 170 175
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
180 185 190
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195 200 205
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
225 230 235 240
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
245 250 255
Cys
<210> 343
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 343
Phe Asn His Asp Cys Ser Gly His Trp Met Arg Cys Leu Asp Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
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35 40 45
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
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65 70 75 80
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
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Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
100 105 110
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
130 135 140
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
145 150 155 160
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
165 170 175
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
180 185 190
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
195 200 205
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
225 230 235 240
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
245 250 255
Cys
<210> 344
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 344
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
35 40 45
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
50 55 60
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
65 70 75 80
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly Val Pro
85 90 95
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
100 105 110
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
115 120 125
Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
145 150 155 160
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 345
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 345
Asn Lys Ser Pro Cys Arg Pro Lys Met Val Ala Cys Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
100 105 110
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
130 135 140
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
145 150 155 160
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
165 170 175
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
180 185 190
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
195 200 205
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
225 230 235 240
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
245 250 255
Cys
<210> 346
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 346
Pro Thr Pro Gln Cys Trp Asn Gln Tyr Tyr Glu Cys Trp Ile Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys
85 90 95
Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
100 105 110
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
130 135 140
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
145 150 155 160
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
165 170 175
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
180 185 190
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
195 200 205
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
210 215 220
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
225 230 235 240
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
245 250 255
Cys
<210> 347
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 347
Ser Gln Lys Cys Pro Trp Thr Lys Glu Thr Cys Met His Tyr Met Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Ser Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
35 40 45
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
50 55 60
Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu
85 90 95
Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
100 105 110
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
115 120 125
Tyr Cys Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
130 135 140
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
145 150 155 160
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
165 170 175
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
180 185 190
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
195 200 205
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
210 215 220
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
225 230 235 240
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250 255
<210> 348
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 348
Trp His Leu Ser Met Tyr Pro Lys Pro Pro Ala Glu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
35 40 45
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu
50 55 60
Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly
85 90 95
Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
100 105 110
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val
115 120 125
Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
130 135 140
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
145 150 155 160
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
165 170 175
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
195 200 205
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
210 215 220
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 349
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 349
Trp His Thr Asp Gly Phe Tyr Thr Arg Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
35 40 45
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu
50 55 60
Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
65 70 75 80
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser Gly
85 90 95
Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
100 105 110
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val
115 120 125
Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
130 135 140
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
145 150 155 160
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
165 170 175
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
195 200 205
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
210 215 220
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
225 230 235 240
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 350
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 350
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
35 40 45
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 351
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 351
Ala Cys Ile His Ala Pro Tyr Ala Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
35 40 45
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
180 185 190
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
210 215 220
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 352
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 352
Ala Cys Ile His Ala Pro Tyr Ala Lys Cys Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr
35 40 45
Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser
50 55 60
Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp
65 70 75 80
Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
100 105 110
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln
115 120 125
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
130 135 140
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
165 170 175
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
180 185 190
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
210 215 220
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
225 230 235 240
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 353
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 353
Ala Cys Pro Ala Lys Ile Gly Gln Glu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
35 40 45
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
180 185 190
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
210 215 220
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 354
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 354
Ala Cys Pro Ala Lys Ile Gly Gln Glu Cys Gly Ser Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile
20 25 30
Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys
35 40 45
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp
50 55 60
Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr
65 70 75 80
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala
100 105 110
Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
130 135 140
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
145 150 155 160
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
165 170 175
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
180 185 190
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
195 200 205
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
210 215 220
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
225 230 235 240
Gly Glu Cys
<210> 355
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 355
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
35 40 45
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
180 185 190
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
210 215 220
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 356
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 356
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val
35 40 45
Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu
50 55 60
Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu
65 70 75 80
Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
100 105 110
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr
115 120 125
Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
130 135 140
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
145 150 155 160
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
165 170 175
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
180 185 190
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
210 215 220
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
225 230 235 240
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 357
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 357
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 358
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 358
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 359
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 359
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln
20 25 30
Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr
35 40 45
Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
100 105 110
Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 360
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 360
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
20 25 30
Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile
35 40 45
Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 361
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 361
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Thr Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
20 25 30
Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile
35 40 45
Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 362
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 362
Ala Cys Thr Lys Pro Ala Lys Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
35 40 45
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met
50 55 60
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His
65 70 75 80
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
165 170 175
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
180 185 190
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
210 215 220
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Arg Gly Glu Cys
245
<210> 363
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 363
Asp Thr Ala Thr Cys Tyr Thr Thr Thr Gly Trp Cys Glu Gly Met Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe
35 40 45
Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser
65 70 75 80
Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
100 105 110
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp
115 120 125
Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
145 150 155 160
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 364
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 364
Asn Ser Asp Asn Cys Gly Pro Ala Lys Ser Thr Cys Met Tyr Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe
35 40 45
Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn
50 55 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser
65 70 75 80
Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
85 90 95
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
100 105 110
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp
115 120 125
Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
145 150 155 160
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
165 170 175
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
195 200 205
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
210 215 220
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
225 230 235 240
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 365
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 365
Pro Pro Gly Lys Cys Thr Gln Pro His Arg Cys Pro Pro Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln
35 40 45
Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser
50 55 60
Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro
65 70 75 80
Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
100 105 110
Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser
115 120 125
Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
130 135 140
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
145 150 155 160
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
165 170 175
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
195 200 205
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
210 215 220
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
225 230 235 240
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
245 250
<210> 366
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 366
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 367
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 367
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr
50 55 60
His Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Lys Gly Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr
85 90 95
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
100 105 110
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val
130 135 140
Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
145 150 155 160
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
165 170 175
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
180 185 190
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
195 200 205
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
210 215 220
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
225 230 235 240
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 368
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 368
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg
20 25 30
Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
35 40 45
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly
65 70 75 80
Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
85 90 95
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
100 105 110
Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
130 135 140
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
165 170 175
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
180 185 190
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
195 200 205
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
210 215 220
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
225 230 235 240
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
245 250 255
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
275 280 285
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
290 295 300
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
305 310 315 320
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
325 330 335
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
340 345 350
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
355 360 365
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
370 375 380
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
385 390 395 400
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
405 410 415
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
420 425 430
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
435 440 445
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
450 455 460
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 369
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 369
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
35 40 45
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr
50 55 60
Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met
65 70 75 80
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro
85 90 95
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
100 105 110
Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
115 120 125
Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
165 170 175
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
180 185 190
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
195 200 205
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
210 215 220
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
225 230 235 240
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Lys
<210> 370
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 370
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly
20 25 30
Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
35 40 45
Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser
50 55 60
Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu
65 70 75 80
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
85 90 95
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
100 105 110
Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
115 120 125
Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly
130 135 140
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
165 170 175
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
180 185 190
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
195 200 205
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
210 215 220
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
225 230 235 240
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys
<210> 371
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 371
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
35 40 45
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
50 55 60
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
85 90 95
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
100 105 110
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
195 200 205
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
210 215 220
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
225 230 235 240
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
245 250 255
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
290 295 300
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
305 310 315 320
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
370 375 380
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
385 390 395 400
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
405 410 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
<210> 372
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 372
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
35 40 45
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile
50 55 60
Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly
65 70 75 80
Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
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Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
100 105 110
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Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
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145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
165 170 175
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
180 185 190
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
195 200 205
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
210 215 220
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
245 250 255
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
260 265 270
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
275 280 285
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
290 295 300
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
305 310 315 320
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
325 330 335
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
340 345 350
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
355 360 365
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
370 375 380
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
385 390 395 400
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
405 410 415
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
420 425 430
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
435 440 445
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
450 455 460
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 373
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 373
Ala Cys Lys His Ala Pro Tyr Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 374
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 374
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Lys Ile Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 375
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 375
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 376
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 376
Asn Trp Leu Gly Glu Trp Leu Pro Pro Gly Lys Val Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
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Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
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115 120 125
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130 135 140
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
165 170 175
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
180 185 190
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
195 200 205
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
210 215 220
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
225 230 235 240
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys
<210> 377
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 377
Gln Phe Ile Glu Cys Pro Asn Phe Pro Arg Gln Cys Pro Gly Lys Asn
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
35 40 45
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
50 55 60
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
100 105 110
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe
130 135 140
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 378
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 378
Val Arg Gln Gln Cys Ser Leu Asn Pro Gly Arg Cys Pro Tyr Leu Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
35 40 45
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
50 55 60
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
100 105 110
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe
130 135 140
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 379
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 379
Val Trp Gln Glu Cys His Thr Ala Pro Gln Leu Cys Pro Gly Lys Ile
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
35 40 45
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
50 55 60
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
100 105 110
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe
130 135 140
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 380
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 380
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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435 440 445
Lys
<210> 381
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 381
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
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Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Gly Ser Ser Gly
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100 105 110
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
180 185 190
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
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290 295 300
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
<210> 382
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 382
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Ser Gly Gly
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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130 135 140
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
180 185 190
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195 200 205
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
370 375 380
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
405 410 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
<210> 383
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 383
Asp Ser Tyr Thr Cys Arg Gly Pro Thr Trp Met Cys Ala Gly Asn Met
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Lys Gly Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val
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Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
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Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 384
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 384
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Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
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Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
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Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
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130 135 140
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165 170 175
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
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Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
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245 250 255
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260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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420 425 430
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435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 385
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 385
Met Gln Thr Arg Cys Lys Glu Tyr Pro Arg Trp Cys Glu His Trp Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
145 150 155 160
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
180 185 190
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
195 200 205
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
210 215 220
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
225 230 235 240
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
245 250 255
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
260 265 270
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
275 280 285
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
290 295 300
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
305 310 315 320
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
325 330 335
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
340 345 350
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
355 360 365
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
370 375 380
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
385 390 395 400
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
405 410 415
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
420 425 430
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
435 440 445
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
450 455 460
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Lys
<210> 386
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 386
Asn Lys Ser Pro Cys Arg Pro Lys Met Val Ala Cys Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr
50 55 60
His Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Lys Gly Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr
85 90 95
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
100 105 110
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val
130 135 140
Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
145 150 155 160
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
165 170 175
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
180 185 190
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
195 200 205
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
210 215 220
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
225 230 235 240
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 387
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 387
Pro Thr Pro Gln Cys Trp Asn Gln Tyr Tyr Glu Cys Trp Ile Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr
50 55 60
His Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Lys Gly Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr
85 90 95
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr
100 105 110
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val
130 135 140
Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
145 150 155 160
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
165 170 175
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
180 185 190
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
195 200 205
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
210 215 220
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
225 230 235 240
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 388
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 388
Ser Gln Lys Cys Pro Trp Thr Lys Glu Thr Cys Met His Tyr Met Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
20 25 30
Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
35 40 45
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His
50 55 60
Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly
65 70 75 80
Lys Gly Met Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn
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Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser
100 105 110
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met
130 135 140
Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 389
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 389
Trp His Leu Ser Met Tyr Pro Lys Pro Pro Ala Glu Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
35 40 45
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr
50 55 60
Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met
65 70 75 80
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro
85 90 95
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
100 105 110
Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
165 170 175
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
180 185 190
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
195 200 205
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
210 215 220
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
225 230 235 240
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
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370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Lys
<210> 390
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 390
Trp His Thr Asp Gly Phe Tyr Thr Arg Leu Pro Ala Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser
20 25 30
Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
35 40 45
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr
50 55 60
Ser Gly Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met
65 70 75 80
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro
85 90 95
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
100 105 110
Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
115 120 125
Tyr Cys Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp
130 135 140
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
165 170 175
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
180 185 190
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
195 200 205
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
210 215 220
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
225 230 235 240
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
245 250 255
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
260 265 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275 280 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290 295 300
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305 310 315 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
325 330 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
340 345 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
355 360 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370 375 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
385 390 395 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405 410 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420 425 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
435 440 445
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450 455 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465 470 475 480
Ser Pro Gly Lys
<210> 391
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 391
Ala Cys Ile His Ala Pro Tyr Ala Lys Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
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195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 392
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 392
Ala Cys Pro Ala Lys Ile Gly Gln Glu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 393
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 393
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 394
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 394
Ala Cys Thr Lys Pro Ala Lys Ala Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Ser Gly Gly
20 25 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
35 40 45
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
50 55 60
Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
65 70 75 80
Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
85 90 95
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
100 105 110
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
145 150 155 160
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
180 185 190
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
195 200 205
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
225 230 235 240
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
260 265 270
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
275 280 285
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
290 295 300
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
305 310 315 320
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
325 330 335
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
340 345 350
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
370 375 380
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
405 410 415
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
420 425 430
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
435 440 445
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
450 455 460
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 395
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 395
Asp Thr Ala Thr Cys Tyr Thr Thr Thr Gly Trp Cys Glu Gly Met Val
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
35 40 45
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
50 55 60
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
100 105 110
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe
130 135 140
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 396
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 396
Asn Ser Asp Asn Cys Gly Pro Ala Lys Ser Thr Cys Met Tyr Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala
20 25 30
Asn Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
35 40 45
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
50 55 60
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
65 70 75 80
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala
85 90 95
Asp Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
100 105 110
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
115 120 125
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe
130 135 140
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
165 170 175
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
180 185 190
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
195 200 205
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
210 215 220
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
245 250 255
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
260 265 270
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
275 280 285
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
290 295 300
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
305 310 315 320
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
325 330 335
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
340 345 350
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
355 360 365
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
370 375 380
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
385 390 395 400
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
405 410 415
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
420 425 430
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
435 440 445
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
450 455 460
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
465 470 475 480
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 397
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 397
Pro Pro Gly Lys Cys Thr Gln Pro His Arg Cys Pro Pro Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn
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Pro Arg Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
35 40 45
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
50 55 60
Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
65 70 75 80
Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp
85 90 95
Tyr Ala Glu Lys Phe Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
100 105 110
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
115 120 125
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala
130 135 140
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
165 170 175
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
180 185 190
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
195 200 205
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
210 215 220
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
225 230 235 240
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
245 250 255
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
260 265 270
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
290 295 300
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
305 310 315 320
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
325 330 335
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
340 345 350
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
355 360 365
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
370 375 380
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
435 440 445
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
450 455 460
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
465 470 475 480
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 398
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 398
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 399
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 400
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 400
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 401
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 401
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 402
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 402
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 403
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 403
Leu Val Ser
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 404
Val Gln Gly Thr His Asp Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
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Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly Tyr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 406
Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 407
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 408
Ser Ala Leu Ser Tyr Met
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 409
Gly Thr Ser
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
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His His Trp Ser Asn Thr Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
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Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 412
Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 413
Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 414
Gly Ser Gly Gly Ser Gly
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 415
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
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Gly Gly Pro Gly Ser Ser Pro
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 417
Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 418
Ser Ser Pro Ser Pro Ser Gly Gly
1 5
<210> 419
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 419
Gly Ser Pro Gly Ser Pro
1 5
<210> 420
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 420
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Pro
1 5
<210> 421
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 421
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Val Asp Pro Glu Gln Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Lys Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 422
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 422
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 423
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 423
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 424
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 424
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
20 25 30
Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys
35 40 45
Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 425
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 425
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
<210> 426
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 426
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
His Glu Gln Leu Thr Val Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
20 25 30
Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys
35 40 45
Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
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<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 427
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu
20 25 30
Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr
35 40 45
Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln
50 55 60
Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
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Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
180 185 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
210 215 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225 230 235 240
Cys
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 428
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Ser Ser Pro Ser Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Ser Gly Gly Glu Ile Val
20 25 30
Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val
35 40 45
Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
145 150 155 160
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
165 170 175
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
180 185 190
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
195 200 205
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
210 215 220
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
225 230 235 240
Glu Cys
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<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 429
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
20 25 30
Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile
35 40 45
Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
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<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 430
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
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Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile
35 40 45
Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
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Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu
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Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
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Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
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Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
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Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
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Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 240
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 431
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr
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Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile
35 40 45
Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Trp Val His Gly Thr Ser Asn Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 432
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<210> 433
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 433
Leu Val Ser Lys Leu Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 434
Val Gln Gly Thr His Asp Pro Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 435
Ser Gly Tyr Asp Trp Thr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 436
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 437
Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala
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<210> 438
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 438
Ser Ala Asn Ser Ala Leu Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 439
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 440
His His Trp Ser Asn Thr Gln Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 441
Asn Tyr Phe Met Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 442
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1 5 10 15
Lys
<210> 443
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 443
Arg Ala Met Asp Asn Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 444
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 444
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Pro Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr Ser Gly Gly
20 25
<210> 445
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 445
Ala Cys Pro Gly Lys Gly Leu Pro Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly
20 25
<210> 446
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 446
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
20 25
<210> 447
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 447
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Ser Gly Gly
20 25
<210> 448
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 448
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
His Glu Gln Leu Thr Val Ser Gly Gly
20 25
<210> 449
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 449
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly
20 25
<210> 450
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 450
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Ser Ser Pro Ser Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Ser Gly Gly
20 25
<210> 451
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 451
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro Ser Gly Gly
20 25
<210> 452
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 452
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Gly Ser Ser Pro Pro
1 5 10 15
Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly Gly
20 25
<210> 453
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 453
Ala Cys Pro Phe Pro Ala Leu Glu Leu Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro
1 5 10 15
Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly Gly
20 25
<210> 454
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 454
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 455
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 455
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Pro Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr Ser
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 456
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 456
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly
1 5 10 15
<210> 457
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 457
Gly Gly Pro Gly Ser Ser Pro Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Ser
1 5 10 15
Gly Gly
<210> 458
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 458
Gly Gly Ser Ser Pro Pro His Glu Gln Leu Thr Val Ser Gly Gly
1 5 10 15
<210> 459
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 459
Ser Ser Pro Ser Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala
1 5 10 15
Ser Gly Gly
<210> 460
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 460
Gly Gly Ser Ser Pro Pro Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro Ser Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 461
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 461
Gly Gly Ser Ser Pro Pro Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Ser Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 462
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 462
Gly Ser Pro Gly Ser Pro Lys Pro Ile Leu Phe Phe Arg Leu Ser Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 463
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 463
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
20 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
35 40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 464
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 464
Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
1 5 10
<210> 465
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 465
Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp
1 5 10 15
Asn His
<210> 466
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 466
Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly
1 5
<210> 467
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 467
Arg Gln Ala Arg Val Val Gly
1 5
<210> 468
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 468
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro
1 5 10 15
<210> 469
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 469
Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Arg Gln Ala Arg Val Val Gly
1 5 10 15
<210> 470
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 470
Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His
1 5 10
<210> 471
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 471
Arg Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser
1 5 10 15
Asp Asn His
<210> 472
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 472
Arg Gly Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 473
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 473
Arg Gly Gly Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 474
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 474
Arg Gly Gly Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 475
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 475
Arg Gly Ser Gly His Glu Gln Leu Thr Val Gly Gly Ser Lys
1 5 10
<210> 476
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 476
Gly Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro Gly Ser Lys
1 5 10
<210> 477
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 477
Gly Ser Gly Arg Gln Ala Arg Val Val Gly Gly Gly Ser Lys
1 5 10
<210> 478
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 478
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Tyr His Thr Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Lys Pro Pro Gly Lys Gly Met Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Met Met Val Pro His Tyr Tyr Val Met Asp Ala Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 479
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 479
Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly
1 5
<210> 480
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 480
Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly
1 5
<210> 481
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 481
Ile Tyr Asp Gln Lys Thr
1 5
<210> 482
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 482
Ala His Asn Tyr Lys Thr
1 5
<210> 483
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 483
Met Met Asp Gln Ala Asn
1 5
<210> 484
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 484
Met Leu Gly Glu Phe Val Ser Glu
1 5
<210> 485
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 485
Gly Leu Val Ala Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 486
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 486
Lys Glu His Lys Tyr Lys Ala Glu
1 5
<210> 487
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 487
Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
1 5
<210> 488
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 488
Leu Gly Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ala Gln Val Arg Leu Glu
1 5 10
<210> 489
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 489
Leu Gly Gly Ser Gly Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu Glu
1 5 10
<210> 490
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 490
Ser Gly Arg Ile Gly Phe Leu Arg Thr Ala
1 5 10
<210> 491
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 491
Ser Gly Ala Ile Gly Phe Leu Arg Thr Ala
1 5 10
<210> 492
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 492
Arg Pro Ala Arg Ser Gly Arg Ser Ala Gly Gly Ser Val Ala
1 5 10
<210> 493
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 493
Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser
1 5 10
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 494
Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly
1 5
<210> 495
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 495
Leu Ser Gly Arg Ile Gly Phe Leu Arg Thr Ala
1 5 10
<210> 496
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 496
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 497
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 497
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Val Pro Leu Ser Leu Tyr
1 5 10
<210> 498
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 498
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr
1 5 10 15
<210> 499
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 499
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala His Glu Gln Leu Thr Ala
1 5 10
<210> 500
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 500
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 501
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 501
Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro
1 5 10 15
<210> 502
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 502
Val Pro Leu Ser Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 503
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 503
Asp Ser Gly Gly Phe Met Leu Thr Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10 15
<210> 504
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 504
Gly Gly Ile Gly Gln Leu Thr Ala Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10 15
<210> 505
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 505
Met Pro Tyr Asp Leu Tyr His Pro Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10 15
<210> 506
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 506
His Glu Gln Leu Thr Val Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10
<210> 507
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 507
Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10 15
<210> 508
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构筑体
<400> 508
Thr Ser Val Leu Met Ala Ala Pro Leu Ser Gly Arg Ser Asn Ala
1 5 10 15

Claims (40)

1.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46；
其中所述掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述VL结构域或所述VH结构域的氨基端或羧基端。
2.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
3.根据权利要求2所述的被掩蔽的抗体，其中所述可裂解肽包含氨基端和羧基端，且所述包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中所述第一间隔连接子连接至所述可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且所述第二间隔连接子连接至所述可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ IDNO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
5.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述被掩蔽的抗体包含选自由SEQ IDNO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。
7.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中：
a)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
8.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述VL结构域包含于轻链内，所述轻链包含选自由SEQ ID NO：327-341组成的群组的氨基酸序列，且所述VH结构域包含于重链内，所述重链包含选自由SEQ ID NO：366-380和421组成的群组的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
12.根据权利要求11所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
13.根据权利要求11所述的被掩蔽的抗体，其中所述药剂是类美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体或依昔替康(exatecan)衍生物Dxd。
14.一种被掩蔽的双特异性抗体，其包含：
a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；
b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和
c)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46，
其中所述掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述第一对的轻链或重链的氨基端或羧基端。
15.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
16.根据权利要求15所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述可裂解肽包含氨基端和羧基端，且所述包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中所述第一间隔连接子连接至所述可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且所述第二间隔连接子连接至所述可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
17.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
18.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述被掩蔽的双特异性抗体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
19.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述第一对的轻链包含VL结构域，且所述第一对的重链包含VH结构域，其中：
a)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
20.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
21.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述第一对的轻链包含选自由SEQ ID NO：327-341组成的群组的氨基酸序列，且所述第一对的重链包含选自由SEQ IDNO：366-380和421组成的群组的氨基酸序列。
22.根据权利要求14所述的被掩蔽的双特异性抗体，其中所述被掩蔽的双特异性抗体包含SEQ ID NO：421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO：358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
23.一种被掩蔽的嵌合受体，其包含：
a)结合于CTLA4的包含VL结构域和VH结构域的配体结合结构域；
b)掩蔽肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1-46；
c)跨膜结构域；和
d)细胞内信号传导结构域，其包含信号传导结构域，
其中所述掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述VL结构域或所述VH结构域的氨基端或羧基端。
24.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含有包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列的可裂解肽：SEQ ID NO：47-88、464-469和479-508。
25.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中所述可裂解肽包含氨基端和羧基端，且所述包含可裂解肽的连接子包含第一间隔连接子和第二间隔连接子，其中所述第一间隔连接子连接至所述可裂解肽的氨基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且所述第二间隔连接子连接至所述可裂解肽的羧基端且包含选自由SEQ ID NO：89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
26.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中所述包含可裂解肽的连接子包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO：454-462。
27.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中所述被掩蔽的嵌合受体包含选自由SEQ ID NO：113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
28.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：407的氨基酸序列的CDR-H3；或
b)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或
c)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：437的氨基酸序列的CDR-H3；或
d)所述VL结构域包含(i)包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO：439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
29.根据权利要求23所述的被掩蔽的嵌合受体，其中：
a)所述VL结构域包含SEQ ID NO：321的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：323的氨基酸序列；或
b)所述VL结构域包含SEQ ID NO：322的氨基酸序列，且所述VH结构域包含SEQ ID NO：324的氨基酸序列。
30.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体。
31.一种载体，其包含根据权利要求30所述的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含根据权利要求30所述的核酸。
33.一种用于制备被掩蔽的抗体的方法，其包含在产生所述被掩蔽的抗体的条件下培养根据权利要求32所述的宿主细胞。
34.一种被掩蔽的抗体，其是由根据权利要求33所述的方法制备。
35.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体。
36.一种医药组合物，其包含根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体和医药学上可接受的载剂。
37.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体。
38.一种用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据权利要求1所述的被掩蔽的抗体。
39.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
其中所述掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述VL结构域的氨基端；
其中所述包含可裂解肽的连接子包含有包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列的可裂解肽；
其中(a)所述VL结构域包含有包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且所述VH结构域包含有包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或(b)所述VL结构域包含有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且所述VH结构域包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
40.一种被掩蔽的抗体，其包含：
a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变(VL)结构域和重链可变(VH)结构域；和
b)掩蔽肽，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列；
其中所述掩蔽肽通过包含可裂解肽的连接子连接至所述VL结构域的氨基端；
其中所述包含可裂解肽的连接子包含有包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的可裂解肽；
其中(a)所述VL结构域包含有包含SEQ ID NO：408的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO：409的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：410的氨基酸序列的CDR-L3；且所述VH结构域包含有包含SEQ ID NO：411的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：412的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：413的氨基酸序列的CDR-H3；或(b)所述VL结构域包含有包含SEQ ID NO：438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO：440的氨基酸序列的CDR-L3；且所述VH结构域包含有包含SEQ ID NO：441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO：443的氨基酸序列的CDR-H3。
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