CN115734806A - 掩蔽的il-12细胞因子和其切割产物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及掩蔽的IL‑12细胞因子,所述掩蔽的IL‑12细胞因子包括IL‑12细胞因子或其功能片段、掩蔽部分和蛋白水解可切割接头。所述掩蔽部分掩蔽所述IL‑12细胞因子或其功能片段,由此减少或预防所述IL‑细胞因子或其功能片段与其同源受体结合,但在所述可切割接头在靶位点处进行蛋白水解切割后,所述IL‑12细胞因子或其功能片段被激活,这使其能够或更能够与其同源受体结合。
Description
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年4月1日提交的美国临时申请序列号63/003,842、于2020年11月25日提交的美国临时申请序列号63/118,579和于2020年12月18日提交的美国临时申请序列号63/127,893的优先权权益;所述美国临时申请中的每一个均通过引用整体并入本文。
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技术领域
本发明涉及掩蔽的IL-12细胞因子和与使用并制造所述细胞因子相关的方法。本发明还涉及所述经掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,以及关于其使用的方法。
背景技术
在美国,癌症是排名第二的主要死亡原因,引起比随后的五种主要原因(慢性呼吸道疾病、中风、事故、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)和糖尿病)更多的死亡。尽管已经取得长足进步,尤其在靶向疗法方面,但这一领域中仍有大量工作要做。免疫疗法和这一领域的分支,免疫肿瘤学,正在产生用于治疗恶性病的可行且令人振奋的治疗选项。具体地说,现认识到癌症的一个特点是免疫逃避,且已进行大量工作以发现目标且研发出针对这些目标的疗法,以便重新激活免疫系统从而识别和治疗癌症。
细胞因子可以以多种方式分类,如基于其三维结构。一些细胞因子被归类为异二聚体。异二聚体细胞因子的实例包含IL-12和IL-23。IL-12细胞因子是包括p35和p40亚基的异二聚体。
细胞因子疗法是用于刺激免疫系统以诱导抗肿瘤细胞毒性的有效策略。具体地,阿地白介素(aldesleukin),即,白介素-2(IL-2)的重组形式已经被FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌和黑色素瘤。不幸的是,向患者施用的细胞因子通常具有非常短的半衰期,由此需要频繁给药。例如,以商品名Proleukin销售的阿地白介素的产品标签表明,在接受5分钟静脉内(IV)输注的患者中,示出的药物的半衰期为85分钟。另外,高剂量细胞因子的施用可以通过全身性免疫激活引起不良健康结果,如血管渗漏。这些调查结果说明需要研发有效靶向肿瘤而不引起与全身性免疫激活相关联的副作用的IL-2细胞因子治疗剂。
本文提供了掩蔽的IL-12细胞因子、所述掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物和其组合物以及其用于解决此需求的方法。
发明内容
所公开的发明涉及被工程化为在IL-12细胞因子的一个或多个受体结合位点或其功能片段处被掩蔽部分掩蔽的IL-12细胞因子或其功能片段。IL-12细胞因子被工程化为可通过包含蛋白水解可切割接头在靶位点处如在肿瘤微环境中被蛋白酶激活。在掩蔽的细胞因子构建体中,掩蔽部分减少或防止IL-12细胞因子或其功能片段与其同源受体的结合。在可切割接头在靶位点处进行蛋白水解切割后,IL-12细胞因子或其功能片段被激活,这使其能够或更能够与其同源受体结合。
本文提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子,其包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
第一多肽链,所述第一多肽链包括:
N'HL1-L1-MM C'
以及第二多肽链,所述第二多肽链包括:
N'HL2-L2-C C'
其中HL1是第一半衰期延长结构域,L1是第一接头,MM是掩蔽部分,HL2是第二半衰期延长结构域,L2是第二接头,并且C是IL-12细胞因子或其功能片段,
其中所述第一半衰期延长结构域与所述第二半衰期延长结构域缔合,并且
其中所述第一接头或所述第二接头中的一个包括蛋白水解可切割肽。
在一些实施例中,IL-12多肽或其功能片段包括与IL-12p35多肽或其功能片段共价连接的IL-12p40多肽或其功能片段。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头的长度介于5个氨基酸与20个氨基酸之间。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头富含氨基酸残基G和S。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头包括SEQ ID NO:3。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:1。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括对GAG结合结构域(KSKREKKDRV)的至少一个氨基酸修饰。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:57。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:58。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括具有一个或多个半胱氨酸取代突变的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:59。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:60。
在一些实施例中,IL-12p35多肽包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12p35多肽包括SEQ ID NO:2。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:61。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:62。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:63。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64。
在一些实施例中,掩蔽部分包括IL-12细胞因子受体或其亚基或功能片段。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至237,即具有SEQ ID NO:5的序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至545,即具有SEQ ID NO:6的序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至212,即具有SEQ ID NO:7的序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至222,即具有SEQ ID NO:8的序列,或者所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至227,即具有SEQ ID NO:11的序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:9的序列。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:9的序列相比,所述掩蔽部分包括至少一个氨基酸修饰,任选地其中所述修饰是半胱氨酸取代突变。
在一些实施例中,掩蔽部分包括SEQ ID NO:65。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至622,即具有SEQ ID NO:10的序列。
在一些实施例中,可切割肽的长度为6个至10个氨基酸。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施例中,所述第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括
N'HL2-可切割的L2-C C'
在一些实施例中,不可切割接头的长度介于3个氨基酸与18个氨基酸之间。
在一些实施例中,不可切割接头的长度介于3个氨基酸与15个氨基酸之间。
在一些实施例中,不可切割接头富含氨基酸残基G和S。
在一些实施例中,不可切割接头包含[(G)nS],其中n=4或5。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列(GGSGGSGGSGGSGGSSGP)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列(PGGSGP)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列(GGSPG)。
在一些实施例中,可切割接头包括在两侧上侧接有间隔子结构域(SD)的蛋白水解可切割肽(CP):
SD1-CP-SD2
其中SD1和SD2不同,使得所述第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-SD1-CP-SD2-C C'
在一些实施例中,第一间隔子结构域(SD1)的长度介于3个氨基酸与10个氨基酸之间。
在一些实施例中,SD1包括SEQ ID NO:16。
在一些实施例中,SD1包括SEQ ID NO:17。
在一些实施例中,第二间隔子结构域(SD2)的长度介于3个氨基酸与6个氨基酸之间。
在一些实施例中,SD2包括SEQ ID NO:18。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:19。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:20。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:46(GGSGGSMPYDLYHPSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:47(GGSGGSGGSMPYDLYHPSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:48(GGSGGSDSGGFMLTSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:49(GGSGGSGGSDSGGFMLTSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:50(GGSGGSRAAAVKSPSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:51(GGSGGSGGSRAAAVKSPSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:52(GGSGGSISSGLLSGRSSGP)。
在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:53(GGSGGSGGSISSGLLSGRSSGP)。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括第一IgG1 Fc结构域或其片段,并且第二半衰期延长结构域包括第二IgG1 Fc结构域或其片段。
在一些实施例中,第一Fc结构域和/或第二Fc结构域各自含有促进第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的非共价缔合的一个或多个修饰。
在一些实施例中,所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,第一多肽链包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列,并且第二多肽链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
本文提供了一种能够与IL-12R结合的切割产物,所述切割产物包括IL-12细胞因子或其功能片段,所述切割产物可通过本文所描述的陈述或实施例中任一项所定义的掩蔽的IL-12细胞因子中的可切割肽的蛋白水解切割来制备。
本文提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括包含以下的多肽:
PCP-SD2-C
其中PCP是蛋白水解可切割肽的一部分;SD2是间隔子结构域;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段。
在一些实施例中,PCP是如本文所描述的蛋白水解可切割肽的一部分。
在一些实施例中,SD2是如本文所描述的间隔子结构域。
在一些实施例中,C是如本文所描述的IL-12细胞因子或其功能片段。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
本文提供了一种核酸,其编码本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一种。
本文提供了一种核酸,其编码本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一种的链之一。
本文提供了一种载体,其包括本文所描述的核酸。
本文提供了一种载体,其包括编码本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的核酸。
本文提供了一种载体,其包括编码本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的链之一的核酸。
本文提供了一种宿主细胞,其包括本文所描述的核酸。
在一个实施例中,宿主细胞是HEK细胞。在另一个实施例中,宿主细胞是CHO细胞。
本文提供了一种组合物,其包括本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一项。
本文提供了一种药物组合物,其包括本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一项以及药学上可接受的载体。
在一些实施例中,药物组合物呈单单位剂型。
在一些实施例中,药物组合物被调配用于静脉内施用并且呈单单位剂型。
在一些实施例中,药物组合物被调配用于注射并且呈单单位剂型。
在一些实施例中,药物组合物是液体并且呈单单位剂型。
本文提供了一种试剂盒,其包括如本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子、或本文所描述的组合物、或本文所描述的药物组合物。
本文提供了一种产生如本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的方法,所述方法包括在产生所述掩蔽的IL-12细胞因子的条件下培养本文所描述的宿主细胞。
本文提供了一种核酸,其编码本文所描述的切割产物。
本文提供了一种组合物,其包括本文所描述的切割产物。
本文提供了一种药物组合物,其包括本文所描述的切割产物以及药学上可接受的载体。
本文提供了一种本文所描述的用于医学中的掩蔽的IL-12细胞因子。
本文提供了一种本文所描述的用于医学中的切割产物。
本文提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子。
本文提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的组合物。
本文提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的药物组合物。
本文提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子,其中所述掩蔽的细胞因子在体内被蛋白水解切割以产生本文所描述的切割产物。
本文提供了一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括在体内产生能够与其同源受体结合的切割产物的步骤,其中所述切割产物在本文中描述。
在一些实施例中,癌症是实体瘤。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防癌症的掩蔽的IL-12细胞因子。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防癌症的方法中的掩蔽的IL-12细胞因子,所述方法包括向受试者施用有效量的掩蔽的IL-12细胞因子,由此掩蔽的细胞因子在体内被蛋白水解切割以产生如本文所描述的切割产物。
在一些实施例中,癌症是实体瘤。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防癌症的切割产物。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防癌症的方法中的切割产物,所述方法包括向患者施用本文所描述的掩蔽的细胞因子的步骤,由此通过在体内对掩蔽的细胞因子进行蛋白水解切割来产生切割产物。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防受试者的癌症的方法中的切割产物,所述方法包括通过对已经施用于受试者的本文所描述的掩蔽的细胞因子进行体内蛋白水解切割来产生切割产物的步骤。
在一些实施例中,癌症是实体瘤。
本文提供了一种本文所描述的用于治疗或预防癌症的药物组合物。
在一些实施例中,癌症是实体瘤。
附图说明
图1示出了掩蔽的细胞因子的示例性实施例的结构,所述掩蔽的细胞因子包含掩蔽部分、细胞因子或其功能片段(“细胞因子”)、半衰期延长结构域和包含第一可切割肽(“1CP”)、第一N末端间隔子结构域(“1NSD”)和第一C末端间隔子结构域(“1CSD”)的第一接头。这些示例性实施例还包含第二接头,所述第二接头包含第二可切割肽(“2CP”)、第二N末端间隔子结构域(“2NSD”)和第二C末端间隔子结构域(“2CSD”)。如通过箭头所示出的,虽然示例性实施例示出了与第一接头连接的掩蔽部分,并且细胞因子或其功能片段与第一接头和第二接头连接,但是掩蔽部分和细胞因子及其功能片段可以互换,使得细胞因子或其功能片段与第一接头连接,并且掩蔽部分与第一接头和第二接头连接。图1示出了作为单体的掩蔽的细胞因子的示例性实施例的结构。
图2示出了包含掩蔽部分、细胞因子或其功能片段(“细胞因子”)、第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的掩蔽的细胞因子的示例性实施例的结构。图2中所示的示例性实施例还包含第一接头,所述第一接头包含第一可切割肽(“1CP”)、第一N末端间隔子结构域(“1NSD”)和第一C末端间隔子结构域(“1CSD”),以及第二接头,所述第二接头包含第二可切割肽(“2CP”)、第二N末端间隔子结构域(“2NSD”)和第二C末端间隔子结构域(“2CSD”)。示例性第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域包含促进第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域的缔合的“杵臼结构(knobs into holes)”修饰,如通过第一半衰期延长结构域中的“臼”和第二半衰期延长结构域中的“杵”所示出的。第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域也示出为至少部分地由于二硫键的形成而缔合。应当理解,尽管“臼”描绘为第一半衰期延长结构域的一部分(与掩蔽部分连接),并且“杵”描绘为第二半衰期延长结构域的一部分(与细胞因子连接),但是“臼”和“杵”可以可替代地分别包含在第二半衰期延长结构域和第一半衰期延长结构域中,使得“臼”是第二半衰期延长结构域的一部分(与细胞因子连接),并且“杵”是第一半衰期延长结构域的一部分(与掩蔽部分连接)。
图3A-3B示出了在被蛋白酶切割之前(左)和之后(右),如在肿瘤微环境处的掩蔽的细胞因子的示例性实施例。图3A-3B示出了掩蔽的IL-2细胞因子的示例性实施例。通过蛋白酶切割释放掩蔽部分(例如,IL-2Rβ,如图3B中所示的)或释放IL-2(图3A)。
图4示出了在产生和纯化IL-2构建体(AK304、AK305、AK307、AK308、AK309、AK310、AK311、AK312、AK313、AK314和AK315)后,对流通(FT)样品(即,未与蛋白A柱结合的蛋白质)和洗脱(E)样品(即,与蛋白A柱结合并从中洗脱的蛋白质)进行的SDS-PAGE分析。
图5A-5D示出了来自测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK168)或rhIL2对照与CD25-Fc的结合的SPR分析的结果。图5A示出了AK168与CD25-Fc之间的相互作用,图5B示出了用MMP激活的AK168与CD25-Fc之间的相互作用,并且图5C示出了重组人IL-2(rhIL-2)对照与CD25-Fc之间的相互作用。图5D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。
图6A-6D示出了来自测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK111)或rhIL-2对照与CD122-Fc的结合的SPR分析的结果。图6A示出了AK111与CD122-Fc之间的相互作用,图6B示出了用蛋白酶激活的AK111与CD122-Fc之间的相互作用,并且图6C示出了重组人IL-2(rhIL-2)对照与CD122-Fc之间的相互作用。图6D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。
图7A示出了在被蛋白酶切割之前(左)和之后(右),如在肿瘤微环境处的掩蔽的细胞因子的示例性实施例。图7B示出了在MMP10蛋白酶不存在(左泳道)或存在(右泳道)的情况下温育的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体的SDS-PAGE分析,其证明了IL-2从Fc部分的释放。
图8A-8D示出了用构建体AK032、AK035、AK041或rhIL-2作为对照处理的PBMC中的STAT5激活(%)。示出了NK细胞、CD8+T细胞、效应T细胞(Teff)和调节性T细胞(Treg)的STAT5激活的水平(%),如在与rhIL-2(图8A)、AK032(图8B)、AK035(图8C)或AK041(图8D)温育后测定的。
图9A-9C示出了用构建体AK081或AK032处理的PBMC中的STAT5激活(%)。测试了具有和不具有先前暴露于MMP10的AK081构建体。还测试了同种型对照以及无IL-2阴性对照。示出了NK细胞(图9A)、CD8+T细胞(图9C)和CD4+T细胞(图9B)的STAT5激活的水平(%)。
图10A-10D示出了来自使用构建体AK081和AK111以及包含rhIL-2和抗RSV抗体的对照的PBMC中的STAT5激活研究的结果。还测试了无处理对照。rhIL-2、AK081和AK111处理也示出了EC50(pM)。显示了CD4+FoxP3+CD25+细胞(图10A)、CD8+细胞(图10B)和CD4+FoxP3-CD25-细胞(图10C)的STAT5激活(%)。图10D提供了AK081、AK111构建体以及rhIL-2对照的EC50(pM)和倍数变化数据。
图11A-11D示出了来自使用构建体AK167和AK168以及包含rhIL-2和抗RSV抗体的对照的PBMC中的STAT5激活研究的结果。还测试了无处理对照。还示出了rhIL-2、AK167和AK168处理的EC50(pM)。示出了CD4+FoxP3+CD25+细胞(图11A)、CD8+细胞(图11B)和CD4+FoxP3-CD25-细胞(图11C)的STAT5激活(%)。图11D提供了AK167和AK168构建体以及rhIL-2对照的EC50(pM)和倍数变化数据。
图12A-12D示出了用构建体AK165或AK166、或同种型对照或IL-2-Fc对照处理的为(+MMP10)或先前未暴露于MMP10蛋白酶的PBMC中的STAT5激活(%)。如在图12A中所示的键也适用于图12B,并且如在图12C中所示的键也应用于图12D。示出了CD4+FoxP3+T调节细胞(图12A)、CD4+FoxP3-T辅助细胞(图12B)、CD8+细胞毒性T细胞(图12C)和CD56+NK细胞(图12D)的STAT5激活(%)。
图13A-13C示出了用构建体AK109或AK110、或同种型对照或IL-2-Fc对照处理的为(+MMP10)或先前未暴露于MMP10蛋白酶的PBMC中的STAT5激活(%)。如在图12B中所示的键也适用于图13A。示出了NK细胞(图13A)、CD8细胞(图13B)和CD4细胞(图13C)的STAT5激活(%)。
图14A-14D示出了来自使用构建体AK211、AK235、AK253、AK306、AK310、AK314和AK316以及rhIL-2对照的PBMC中的STAT5激活研究的结果。示出了CD3+CD4+FoxP3+细胞(图14A)、CD3+CD4+FoxP3-细胞(图14B)和CD3+CD8+细胞(图14C)的STAT5激活(%)。图14D为每个测试的构建体以及rhIL-2对照提供EC50数据。
图15A-15D示出了来自使用已被蛋白酶激活的构建体AK081、AK167、AK216、AK218、AK219、AK220和AK223以及rhIL-2对照的PBMC中的STAT5激活研究的结果。示出了CD4+FoxP3+CD25+调节性T细胞(图15A)、CD4+FoxP3-CD25-细胞(图15B)和CD8+细胞(图15C)的STAT5激活(%)。图15D为每个测试的构建体以及rhIL-2对照提供EC50数据。
图16A-16C示出了用构建体AK081、AK189、AK190或AK210或抗RSV对照处理的PBMC中的STAT5激活(%)。如在图16A中所示的键也适用于图16B和16C。示出了调节性T细胞(图16A)、CD4辅助T细胞(图16B)和CD8细胞(图16C)的STAT5激活(%)。
图17A-17C示出了用构建体AK167、AK191、AK192或AK193或抗RSV对照处理的PBMC中的STAT5激活(%)。如在图17A中所示的键也适用于图17B和17C。示出了调节性T细胞(图17A)、CD4辅助T细胞(图17B)和CD8细胞(图17C)的STAT5激活(%)。
图18A-18D示出了来自使用构建体AK032、AK081、AK111、AK167或AK168或抗RSV对照在荷瘤小鼠中进行的药代动力学研究的结果。图18A提供了测试的每个构建体的结构的简化描绘。图18B示出了通过检测人IgG的血浆(μg/mL)中的Fc水平,图18C示出了通过检测人CD 122的血浆(μg/mL)中的Fc-CD122水平,并且图18D示出了通过检测人IL-2的血浆(μg/mL)中的Fc-IL2水平。在检测步骤之前,使用抗人IG作为捕获抗体。
图19A-19D示出了来自使用构建体AK167、AK191、AK197、AK203、AK209或AK211或抗RSV对照在荷瘤小鼠中进行的药代动力学研究的结果。图19A提供了测试的每个构建体的结构的简化描绘。图19B示出了通过检测人IgG的血浆(μg/mL)中的Fc水平,图19C示出了通过检测人IL-2的血浆(μg/mL)中的Fc-IL2水平,并且图19D示出了通过检测人CD 122的血浆(μg/mL)中的Fc-CD122水平。在检测步骤之前,使用抗人IG作为捕获抗体。
图20A-20L示出了来自使用AK032、AK081、AK111、AK167或AK168构建体或抗RSVIgG对照测试CD4、CD8、NK和Treg百分比在脾脏、血液和肿瘤中的体内应答的研究的结果。对于脾脏组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图20A)、CD3细胞的CD4%(图20B)、CD3-细胞的NK细胞%(图20C)、CD4细胞的FoxP3%(图20D)。对于血液,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图20E)、CD3细胞的CD4%(图20F)、CD3-细胞的NK细胞%(图20G)、CD4细胞的FoxP3%(图20H)。对于肿瘤组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图20I)、CD3细胞的CD4%(图20J)、CD3-细胞的NK细胞%(图20K)、CD4细胞的FoxP3%(图20L)。
图21A-21L示出了来自使用AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209或AK211构建体或抗RSV IgG对照测试CD4、CD8、NK和Treg百分比在脾脏、血液和肿瘤中的体内应答的研究的结果。对于脾脏组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图21A)、CD3细胞的CD4%(图21B)、CD3-细胞的NK细胞%(图21C)、CD4细胞的FoxP3%(图21D)。对于血液,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图21E)、CD3细胞的CD4%(图21F)、CD3-细胞的NK细胞%(图21G)、CD4细胞的FoxP3%(图21H)。对于肿瘤组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图21I)、CD3细胞的CD4%(图21J)、CD3-细胞的NK细胞%(图21K)、CD4细胞的FoxP3%(图21L)。
图22A-22L示出了来自使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190或AK211构建体或抗RSV IgG对照测试CD4、CD8、NK和Treg百分比在脾脏、血液和肿瘤中的体内应答的研究的结果。对于脾脏组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图22A)、CD3细胞的CD4%(图22B)、CD3-细胞的NK细胞%(图22C)、CD4细胞的FoxP3%(图22D)。对于血液,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图22E)、CD3细胞的CD4%(图22F)、CD3-细胞的NK细胞%(图22G)、CD4细胞的FoxP3%(图22H)。对于肿瘤组织,示出了CD3细胞的CD8细胞%(图22I)、CD3细胞的CD4%(图22J)、CD3-细胞的NK细胞%(图22K)、CD4细胞的FoxP3%(图22L)。
图23A-23I示出了来自使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190或AK211构建体在脾脏、血液和肿瘤中的体内T细胞激活的结果。T细胞激活作为脾脏、血液和肿瘤中的在CD8+T细胞(图23A;图23D;图23G)、CD4+T细胞(图23B;图23E;图23H)或Foxp3+细胞(图23C;图23F;图23I)中的CD25的平均荧光强度(MFI)进行测量。与不可切割的AK211构建体相比,使用单因素ANOVA进行统计分析。
图24A-24D示出了来自测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体AK168(可切割肽序列:MPYDLYHP)和AK209(可切割肽序列:VPLSLY;SEQ ID NO:15)的体内切割的研究的结果。图24E示出了来自针对AK167、AK168和AK209构建体的总水平以及每种构建体的未切割形式的水平的总血浆IgG浓度(μg/mL)的药代动力学研究的结果。
图25A-25D示出了来自使用示例性掩蔽的IL-2多肽构建体AK111或AK168,或非掩蔽的IL-2多肽构建体AK081或AK167或抗RSV对照来评估血管渗漏的体内研究的结果。图25A示出了体重减轻的百分比(%),并且图25B、25C和25D分别各自示出了肝脏、肺和脾脏的重量,以克为单位。
图26A和26B示出了来自如通过测量在施用AK081、AK111、AK167或AK168构建体或抗RSV对照之后染料渗漏到肝脏和肺组织中的程度所指示的来评估血管渗漏的体内研究的结果。基于650nm处的吸光度测量染料渗流到肝脏(图26A)和肺(图26B)的程度。
图27A和27B示出了来自如通过测量在施用AK081、AK111、AK167或AK168构建体或抗RSV对照之后进入肝脏组织和肺组织中的单核细胞血管周侵入的程度所指示的来评估血管渗漏的体内研究的结果。各自描绘了肝脏中单核细胞的平均数量(图27A)和肺中单核细胞的平均数量(图27B)。
图28A和28B示出了来自在用AK032、AK081、AK111、AK167或AK168构建体或抗RSV对照处理的过程中评估肿瘤体积和体重的同基因肿瘤模型研究的结果。图28A示出了处理过程中的肿瘤体积数据,并且图28B示出了处理过程中的体重百分比(%)变化的数据。
图29A和29B示出了具有I253A FcRn突变的AK471在TME中诱导了稳健的CD8 T细胞扩增,同时在外周中保持无活性。
图30A-30C示出了AK471的半衰期与aglyco-hIgG1相比稍短。
图31A-31C示出了不存在用血浆中的AK471切割或断头的证据。
图32示出了示例性IL-12构建体格式。
图33A和33B示出了示例性分子AK380、AK381和AK384(FIG34A),以及AK383、AK386、AK434、AK447、AK448、AK446、AK528和AK529(FIG34B)的示例性切割过程。
图34A-34D描绘了IL-12对IL-12RB1的掩蔽,使用SPR分析测试示例性掩蔽的IL-12多肽构建体(AK384和AK386)与rhIL-12RB1-Fc的结合。图34A描绘了AK384与IL-12RB1-Fc之间的相互作用,图34B描绘了AK386与IL-12RB1-Fc之间的相互作用,并且图34C描绘了重组人IL-12(rhIL-12)对照与IL-12RB1-Fc之间的相互作用。图34D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。由于曲线的形状,无法确定准确的动力学,并且因此基于缔合速率估计KD。这些结果证明,这些示例性掩蔽的IL-12多肽构建体(AK384和AK386)未证明与IL-12RB1-Fc的可检测的结合,而野生型rhIL-12对照证明了可检测的结合。
图35A-35D描绘了IL-12对IL-12RB2的掩蔽,使用SPR分析测试示例性掩蔽的IL-12多肽构建体(AK384和AK386)与rhIL-12RB2-Fc的结合。图35A描绘了AK384与IL-12RB2-Fc之间的相互作用,图35B描绘了AK386与IL-12RB2-Fc之间的相互作用,并且图35C描绘了重组人IL-12(rhIL-12)对照与IL-12RB2-Fc之间的相互作用。图35D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。由于曲线的形状,无法确定准确的动力学,并且因此基于缔合速率估计KD。这些结果证明,示例性掩蔽的IL-12多肽构建体(AK386)证明与IL-12RB1-Fc的弱但可检测的结合,而野生型rhIL-12对照和示例性IL-12多肽构建体(AK384)证明了可检测的结合。
图36-40示出了来自实例6的结果。图41-43示出了来自实例7的结果。图44-52E示出了来自实例8的结果。
图53A-53D和图54A-54F示出了使用不包含肽底物的示例性IL-15构建体AK904和AK910和包含肽底物的构建体AK932、AK938、AK930和AK936的SDS-PAGE和HEK-Blue IL-2生物测定的结果。图53A-53D示出了SDS-PAGE凝胶结果。图54A-54F示出了HEK-Blue IL-2生物测定结果。
图55-68示出了实例11的结果。在两种肿瘤模型MB49和B16F10中在体内分析了示例性鼠化分子AK944、AK945、AK947和对照AK948的PK/PD。
图69-71B示出了实例12的结果。在食蟹猴中分析示例性分子AK667、AK921、AK923和对照AK671的PK、PD、血液学和血清化学。
具体实施方式
通过使用掩蔽部分,可以通过干扰IL-12细胞因子或其功能片段与其同源受体的结合能力来减少所施用的IL-12细胞因子或其功能片段的全身性副作用。
白介素12受体是I型细胞因子受体,结合白介素12。其由β1和β2亚基组成。
通过使用包含蛋白水解可切割肽的接头来掩蔽IL-12细胞因子或其功能片段,可以通过在肿瘤微环境中切割可切割肽来恢复通过使用掩蔽部分干扰的结合能力。因此,本文所提供的掩蔽的IL-12细胞因子被工程化成通过利用癌症的印记之一,即高局部浓度的活性蛋白酶,将药理活性精确地靶向到肿瘤微环境。肿瘤微环境的此特征用于将全身惰性分子转换成呈IL-12切割产物形式的局部活性的IL-12细胞因子或其功能片段。IL-12细胞因子或其功能片段在肿瘤微环境处的激活显著降低了可能与以活性形式施用于受试者的药物相关联的全身性毒性。因此,本发明的掩蔽的IL-2细胞因子可以被视为前药。
已经发现本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子示出了各种有利性质。已经发现本文任何地方所描述的掩蔽的IL-12细胞因子能够在蛋白水解切割后优选地在肿瘤微环境中并且在外周较低水平下激活免疫细胞(增殖和扩增)。已经发现本文任何地方所描述的掩蔽的IL-12细胞因子能够促进肿瘤根除(即,示出抗肿瘤活性)并且在蛋白水解切割后抑制转移。已经发现本文任何地方所描述的掩蔽的IL-12细胞因子显示出有利的延长的药物暴露。已经发现本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子显示出有利的稳定性。已经发现本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子显示出有利的耐受性。进一步地,已经发现本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子显示出有利的效力。
1.‘异二聚体’掩蔽的细胞因子
在一些实施例中,本文提供了包括第一多肽链中的掩蔽部分和第二多肽链中的IL-12细胞因子或其功能片段的掩蔽的细胞因子。此类掩蔽的细胞因子可以被称为‘异二聚体’掩蔽的细胞因子。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
a)第一多肽链,所述第一多肽链包括通过第一接头与第一半衰期延长结构域连接的掩蔽部分;以及
b)第二多肽链,所述第二多肽链包括通过第二接头与第二半衰期延长结构域连接的IL-12细胞因子或其功能片段,
其中所述第一半衰期延长结构域与所述第二半衰期延长结构域缔合,并且
其中所述第一接头或所述第二接头中的一个包括蛋白水解可切割肽。
掩蔽部分、半衰期延长结构域、IL-12细胞因子或其功能片段、接头和第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域之间的缔合类型可以是本文所描述的那些中的任一个,以及本文所描述的那些的任何组合。
在一些实施例中,在第一多肽链中,第一半衰期延长结构域与第一接头的氨基末端连接,并且第一接头的羧基末端与掩蔽部分的氨基末端连接,并且在第二多肽链中,第二半衰期延长结构域与第二接头的氨基末端连接,并且第二接头的羧基末端与IL-12细胞因子或其功能片段的氨基末端连接。这在下文示意性地示出,其中:
所述第一多肽链包括:
N'HL1-L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-L2-C C'
其中HL1是第一半衰期延长结构域,L1是第一接头,MM是掩蔽部分,HL2是第二半衰期延长结构域,L2是第二接头,并且C是IL-12细胞因子或其功能片段。
1.1 IL-12细胞因子
本文提供了用于掩蔽的细胞因子或其切割产物中的IL-12细胞因子或其功能片段。细胞因子在细胞信号传导中起作用,特别是在免疫系统的细胞中。IL-12是白介素,其是在免疫系统中调节白血细胞活性的细胞因子信号传导分子的类型。
内源性IL-12作为在生物合成期间在细胞内二聚化的两种不同的分子IL-12 p40和IL-12 p35存在。
IL-12 p40和IL-12 p35的全序列以粗体示出(在生物合成期间切割的前肽):
IL-12 p40亚基:
IL-12 p35亚基:
成熟形式如下:
IL-12 p40亚基:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
IL-12 p35亚基:
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
其表达为两条链,在生物合成期间通过两个亚基之间的二硫键进行共价二聚化:p40亚基的半胱氨酸C199与p35亚基的半胱氨酸C96缔合。
IL-12细胞因子的“功能片段”包括保留或具有经修饰的细胞因子受体结合能力的全长细胞因子蛋白的一部分(例如,与全长细胞因子蛋白相比,在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的活性内)。细胞因子受体结合能力可以例如通过细胞因子与细胞因子的同源受体或其组分结合的能力来示出。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段是能够与白介素-12受体结合的任何天然存在的白介素-2(IL-12)蛋白或其经修饰的变体。
在一些实施例中,IL-12多肽或其功能片段包括与IL-12p35多肽或其功能片段共价连接的IL-12p40多肽或其功能片段。
IL-12p40多肽或其功能片段可以与第一半衰期延长结构域连接,使得第一多肽链包括:
N'HL1-L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-L2-[IL-12p40-接头-IL-12p35]C'
其中‘IL-12p40’是IL-12p40多肽或其功能片段,并且‘IL-12p35’是IL-12p35多肽或其功能片段。
在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:1。在一些实施例中,与SEQ IDNO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。至少一个氨基酸修饰中的每个氨基酸修饰可以是任何氨基酸修饰,如取代、插入或缺失。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
IL-12p40多肽包括糖胺聚糖(GAG)结合结构域。GAG,如肝素和硫酸乙酰肝素,已被证明能够结合多种生长因子和细胞因子,包含IL-12。这种结合的生理意义是双重的。首先,GAG可以作为细胞表面的共受体,用于维持细胞因子的高浓度和局部浓度。其次,GAG可以通过多种机制调节生长因子和细胞因子的生物活性,所述机制包含二聚化和防止蛋白水解降解。
IL-12 p40亚基的成熟形式的GAG结合结构域以粗体示出如下:
本文已示出对GAG结合结构域(KSKREKKDRV)的修饰可增加包括具有突变的GAG结合结构域的IL-12细胞因子的构建体的PK曲线,而不会降低细胞因子活性。因此,在一些实施例中,IL-12p40多肽包括对GAG结合结构域的至少一种氨基酸修饰。在一些实施例中,对GAG结合结构域的修饰是缺失突变。在一些实施例中,对GAG结合结构域的修饰是缺失突变和至少一种取代突变。
在一些实施例中,GAG结合结构域包括氨基酸序列KDNTERV。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施例中,GAG结合结构域包括氨基酸序列KDNTEGRV。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施例中,GAG结合结构域由氨基酸序列KDNTERV组成。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:57。在一些实施例中,GAG结合结构域由氨基酸序列KDNTEGRV组成。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:58。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括具有一个或多个半胱氨酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括在位置C252处具有氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中,位置C252处的氨基酸取代是C252S。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:59的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12p40多肽由SEQ ID NO:59的氨基酸序列组成。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括具有一个或多个半胱氨酸取代的氨基酸序列,以及对GAG结合结构域的至少一个氨基酸修饰。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括在位置C252S处的氨基酸取代,并且GAG结合结构域包括氨基酸序列KDNTERV。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括在位置C252S处的氨基酸取代,并且GAG结合结构域包括氨基酸序列KDNTEGRV。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:60的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12p40多肽包括与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12p40多肽由SEQ ID NO:60的氨基酸序列组成。
在一些实施例中,IL-12p35多肽包括SEQ ID NO:2。在一些实施例中,与SEQ IDNO:2的氨基酸序列相比,IL-12p35多肽包括具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。至少一个氨基酸修饰中的每个氨基酸修饰可以是任何氨基酸修饰,如取代、插入或缺失。在一些实施例中,与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中,与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头的长度介于5个氨基酸与20个氨基酸之间。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头富含氨基酸残基G和S。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头仅包含选自由G和S组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头包含[(G)nS],其中n=4或5。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头包含(GGGGS)重复序列。
在一些实施例中,IL-12p40-IL-12p35接头包括SEQ ID NO:3(GGGGSGGGGSGGGGS)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。至少一个氨基酸修饰中的每个氨基酸修饰可以是任何氨基酸修饰,如取代、插入或缺失。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中,与SEQ IDNO:1和2的氨基酸序列相比,IL-12细胞因子或其功能片段包括具有至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
1.2掩蔽部分
本文提供了用于掩蔽的细胞因子中的掩蔽部分。应当理解,掩蔽部分从掩蔽的细胞因子切割以形成其切割产物。掩蔽部分掩蔽掩蔽的细胞因子中的IL-12细胞因子或其功能片段,由此减少或预防IL-细胞因子或其功能片段与其同源受体的结合。
IL-12受体、β1或IL-12Rβ1是IL-12受体复合物的亚基。IL-12Rβ1还被称为CD212。此蛋白质以低亲和力与白介素-12(IL-12)结合。此蛋白质形成二硫键连接的寡聚体,这是其IL-12结合活性所必需的。IL-12受体、β2或IL-12Rβ2是IL-12受体复合物的亚基。已示出IL-12Rβ1和IL-12Rβ2蛋白的共表达导致高亲和力IL-12结合位点的形成。
用于确定蛋白质(例如,细胞因子)与同源蛋白(例如,细胞因子受体)的结合程度的方法是本领域众所周知的。
在一些实施例中,掩蔽部分包括IL-12细胞因子受体的胞外结构域或其亚基或功能片段。
白介素-12受体亚基β-1还称为CD212,具有以下序列:
白介素-12受体亚基β-2具有以下序列:
粗体指示前肽,带下划线的斜体指示胞外结构域,斜体指示跨膜结构域,并且带下划线的粗体指示细胞质结构域。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。
在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的人IL-12Rβ1的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的人IL-12Rβ1的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至237,即具有SEQ ID NO:5的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有SEQ ID NO:5的IL-12R[g2]β[/g2]1。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:5的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ IDNO:5的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至545,即具有SEQ ID NO:6的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有SEQ ID NO:6的IL-12R[g2]β[/g2]1。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:6的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ IDNO:6的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的人IL-12Rβ2的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的人IL-12Rβ2的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至212,即具有SEQ ID NO:7的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:7的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至222,即具有SEQ ID NO:8的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:8的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:9的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:9的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有带有一个或多个半胱氨酸取代的SEQ ID NO:9的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有在位置C242处带有氨基酸取代的SEQ ID NO:9的序列。在一些实施例中,位置C242处的氨基酸取代是C242S。在一些实施例中,掩蔽部分包括SEQ ID NO:65的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分由SEQ ID NO:65的氨基酸序列组成。在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至622,即具有SEQ ID NO:10的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQID NO:10的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至227,即具有SEQ ID NO:11的序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括与SEQ ID NO:11的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个至四个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中,掩蔽部分包括具有带有一个或两个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的氨基酸序列的氨基酸序列。
1.3接头
本文提供了用于掩蔽的细胞因子或其切割产物中的接头。本文所提供的接头是指用于将本文所描述的掩蔽的细胞因子中的两个功能组分连接在一起的两个以上的氨基酸的肽。
掩蔽的细胞因子包括第一接头和第二接头,其中第一接头或第二接头中的一个包括蛋白水解可切割肽。
在一些实施例中,第二接头包括蛋白水解可切割肽(接头在本文中称为‘蛋白水解可切割接头’),并且第一接头不包括蛋白水解可切割肽(接头在本文中称为‘非蛋白水解可切割接头’),使得第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括
N'HL2-可切割的L2-C C'
在一些实施例中,第一接头包括蛋白水解可切割肽(接头在本文中称为‘蛋白水解可切割接头’或‘可切割接头’),并且第二接头不包括蛋白水解可切割肽(接头在本文中称为‘非蛋白水解可切割接头’或‘不可切割接头’),使得第一多肽链包括:
N'HL1-可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括
N'HL2-不可切割的L2-C C'
下文更详细地描述了一些实施例的不可切割接头和可切割接头。
1.3.1非蛋白水解可切割接头
在一些实施例中,不可切割接头的长度介于3个氨基酸与18个氨基酸之间。
在一些实施例中,不可切割接头的长度介于3个氨基酸与15个氨基酸之间。
在一些实施例中,不可切割接头富含氨基酸残基G和S。
在一些实施例中,不可切割接头仅包含选自由G和S组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,不可切割接头包含[(G)nS],其中n=4或5。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列(GGGGS)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGS)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列(GGSGGGSGGGGGS)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列(GGSGGSGGSGGSGGSSGP)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列(PGGSGP)。
在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列(GGSPG)。
在一些实施例中,其中第二接头包括蛋白水解可切割肽,使得所述第二接头是蛋白水解可切割接头,并且第一接头不包括蛋白水解可切割肽,使得所述第一接头是非蛋白水解可切割接头,不可切割接头的长度介于3个氨基酸与18个氨基酸之间。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列(GGGGS)。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGS)。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列(GGSGGGSGGGGGS)。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列(GGSGGSGGSGGSGGSSGP)。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列(PGGSGP)。在一些实施例中,不可切割接头包括如SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列(GGSPG)。
在一些实施例中,期望第一多肽链和第二多肽链具有相同的或相似的长度,以促进第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域缔合并且掩蔽部分掩蔽在组装的构建体中的IL-12细胞因子或其功能片段。因此,当掩蔽部分是比IL-12细胞因子或其功能片段更短的氨基酸序列时,长度差异可以通过使用更长的接头L1来完全或部分地补偿。
1.3.2蛋白水解可切割接头
在一些实施例中,可切割接头的长度为10个至25个氨基酸。
在一些实施例中,可切割接头包括在两侧上侧接有间隔子结构域(SD)的蛋白水解可切割肽(CP),如下所示:
SD-CP-SD
可切割肽
可切割接头包括可切割肽。
可切割肽是包含蛋白酶切割位点的多肽,使得可切割肽是蛋白水解可切割的。蛋白酶是切割和水解靶底物蛋白的两个特异性氨基酸残基之间的肽键的酶。如本文所使用的,“切割位点”是指用于切割在包括本文所描述的可切割肽的任何接头中发现的可切割肽的一部分的可识别位点。因此,可以在如本文所描述的可切割肽的序列中发现切割位点。在一些实施例中,切割位点是由切割剂识别和切割的氨基酸序列。
在一些实施例中,蛋白酶切割位点是肿瘤相关蛋白酶切割位点。如本文所提供的“肿瘤相关蛋白酶切割位点”是被蛋白酶识别的氨基酸序列,所述蛋白酶表达对于肿瘤细胞或其肿瘤细胞环境是特异性的或上调的。
肿瘤细胞环境是复杂的,并且可以包括多种不同的蛋白酶。因此,给定可切割肽将在肿瘤细胞环境中切割的精确位点可以在肿瘤类型之间、在具有相同肿瘤类型的患者之间、并且甚至在取决于特定肿瘤细胞环境的相同肿瘤中形成的切割产物之间变化。此外,即使在切割之后,初始切割产物的另外的修饰,例如通过去除一个或两个末端氨基酸,可以通过蛋白酶在肿瘤细胞环境中的进一步作用而发生。因此,在施用如本文所描述的掩蔽的细胞因子的单个结构之后,可以预期在患者的肿瘤细胞环境中形成切割产物的分布。
应当理解,本文所提及的切割位点是指在可切割肽内的两个特异性氨基酸残基之间的位点,所述位点是已知与肿瘤细胞环境缔合的蛋白酶的靶标。在这个意义上,如本文所描述的可切割肽中可能存在多于一个的切割位点,其中不同的蛋白酶在不同切割位点处切割可切割肽。还可能有多于一种的蛋白酶可以作用于可切割肽内的相同切割位点上。蛋白酶切割位点的讨论可以在本领域中找到。
因此,本文所公开的可切割肽可以被一种或多种蛋白酶切割。
在一些实施例中,可切割肽是共定位于表达IL-12细胞因子受体的区或组织中的蛋白酶的底物。
在一些实施例中,可切割肽是5聚体(即,长度为5个氨基酸的肽)、6聚体(即,长度为6个氨基酸的肽)、7聚体(即,长度为7个氨基酸的肽)、8聚体(即,长度为8个氨基酸的肽)、9聚体(即,长度为9个氨基酸的肽)、10聚体(即,长度为10个氨基酸的肽)、11聚体(即,长度为11个氨基酸的肽)、12聚体(即,长度为12个氨基酸的肽)、13聚体(即,长度为13个氨基酸的肽)、14聚体(即,长度为14个氨基酸的肽)、15聚体(即,长度为15个氨基酸的肽)、16聚体(即,长度为16个氨基酸的肽)、17聚体(即,长度为17个氨基酸的肽)或18聚体(即,长度为18个氨基酸的肽)。
在一些实施例中,可切割肽的长度为5个至18个氨基酸。在一些实施例中,可切割肽的长度为6个至10个氨基酸。
在一些实施例中,可切割接头内的可切割肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列:
仅通过举例来说,在上表中,*指示可切割肽内的已知或观察到的蛋白酶切割位点。
在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列(VPLS*LY),例如可切割肽可以包括SEQ ID NO:210的氨基酸序列(VPLSLYSG)。在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列(MPYD*LYHP)。在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列(DSGG*FMLT)。在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:43的氨基酸序列(RAAA*VKSP)。在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列(ISSGLL*SGRS),例如可切割肽可以包括SEQ ID NO:211的氨基酸序列(ISSGLLSGRSDQP)。在一些实施例中,可切割肽包括SEQ ID NO:45的氨基酸序列(DLLA*VVAAS)。
在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:15的氨基酸序列(VPLS*LY)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:210的氨基酸序列(VPLSLYSG)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:41的氨基酸序列(MPYD*LYHP)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQID NO:42的氨基酸序列(DSGG*FMLT)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:43的氨基酸序列(RAAA*VKSP)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:44的氨基酸序列(ISSGLL*SGRS)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:211的氨基酸序列(ISSGLLSGRSDQP)组成。在一些实施例中,可切割肽由SEQ ID NO:45的氨基酸序列(DLLA*VVAAS)组成。
已发现与非肿瘤细胞环境相比,具有如SEQ ID NO:44或45中所示的氨基酸序列的可切割肽在肿瘤细胞环境中表现出非常特异性的切割。因此,当这些可切割肽掺入到如在本文任何地方所公开的掩蔽的IL-12细胞因子中时,可以进一步减少所施用的IL-12细胞因子或其功能片段的任何全身副作用。
间隔子结构域
间隔子结构域可以由一个或多个氨基酸组成。如果存在,间隔子结构域的功能是将蛋白水解可切割肽(CP)与本文所描述的构建体中的其它功能组分连接。
应当理解,间隔子结构域不改变蛋白酶在肿瘤细胞环境或非肿瘤细胞环境中的蛋白水解可切割肽的生物相互作用。换言之,即使在间隔子结构域的存在的情况下,本文所公开的本发明的蛋白水解可切割肽保留其有利的肿瘤特异性。
在一些实施例中,侧接蛋白水解可切割肽的间隔子结构域是不同的。
在一些实施例中,间隔子结构域富含氨基酸残基G、S和P。
在一些实施例中,间隔子结构域仅包含选自由G、S和P组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,可切割接头包括:
N'SD1-CP-SD2 C'
其中SD1是第一间隔子结构域并且SD2是第二间隔子结构域。
在一些实施例中,可切割接头包括:
N'SD1-CP-SD2 C'
在一些实施例中,所述第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-SD1-CP-SD2-C C'
在一些实施例中,所述第一多肽链包括:
N'HL1-SD1-CP-SD2-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-不可切割的L2-C C'
在一些实施例中,SD1的N末端是甘氨酸(G)。
在一些实施例中,第一间隔子结构域(SD1)的长度介于3个氨基酸与10个氨基酸之间。在一些实施例中,第一间隔子结构域(SD1)的长度介于5个氨基酸与9个氨基酸之间。
在一些实施例中,SD1包括SEQ ID NO:16(GGSGGS)。
在一些实施例中,SD1包括SEQ ID NO:17(GGSGGSGGS)。
在一些实施例中,SD2的C末端序列是–GP C'。
在一些实施例中,第二间隔子结构域(SD2)的长度介于3个氨基酸与6个氨基酸之间。
在一些实施例中,SD2包括SEQ ID NO:18(SGP)。
可切割接头中SD1和SD2的示例性组合如下所示:
接头结构 | SD1序列 | SD2序列 |
SD1-CP-SD2 | GGSGGS | SGP |
SD1-CP-SD2 | GGSGGSGGS | SGP |
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一些实施例中,间隔子结构域富含氨基酸残基G、S和P。在一些实施例中,间隔子结构域仅包含选自由G、S和P组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在一些实施例中,间隔子结构域富含氨基酸残基G、S和P。在一些实施例中,间隔子结构域仅包含选自由G、S和P组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些实施例中,SD1的长度为3个至6个氨基酸。在一些实施例中,间隔子结构域富含氨基酸残基G、S和P。在一些实施例中,间隔子结构域仅包含选自由G、S和P组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。在一些实施例中,SD1的长度为3个至6个氨基酸。在一些实施例中,其中间隔子结构域富含氨基酸残基G、S和P。在一些实施例中,间隔子结构域仅包含选自由G、S和P组成的组的氨基酸残基类型。
在一些实施例中,其中第二接头包括蛋白水解可切割肽,使得所述第二接头是蛋白水解可切割接头,并且第一接头不包括蛋白水解可切割肽,使得所述第一接头是非蛋白水解可切割接头,可切割接头包括SEQ ID NO:46,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:55。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:47,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:55。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:48,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:55。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:49,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:56。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:50,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:55。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:50,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:14。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:51,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:56。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:51,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:14。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:52,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:55。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:52,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:14。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:53,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:56。在一些实施例中,可切割接头包括SEQ ID NO:53,并且不可切割接头包括SEQ ID NO:14。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的可切割肽(ISSGLL*SGRS)。
在一些实施例中,蛋白水解可切割接头包括由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成的可切割肽(DLLA*VVAAS)。
本文所公开的和示例性AK分子中所公开的接头组合可以与本文所公开的任何IL-12细胞因子或其片段一起使用。本文所公开的和示例性AK分子中所公开的接头组合可以与本文所公开的任何掩蔽部分一起使用。本文所公开的和示例性AK分子中所公开的接头组合可以与任何半衰期延长结构域一起使用。换言之,示例性AK分子中所公开的接头可以与本文所公开的任何IL-12细胞因子或其片段、本文所公开的掩蔽部分和/或本文所公开的半衰期延长结构域的组合一起使用。
1.4半衰期延长结构域
本文提供了用于掩蔽的细胞因子或其切割产物的半衰期延长结构域。体内长半衰期对于治疗性蛋白质是重要的。不幸的是,施用于受试者的细胞因子通常具有短的半衰期,因为其通常通过包含肾清除和内吞降解的机制从受试者中快速清除。因此,在本文所提供的掩蔽的细胞因子中,为了在体内延长细胞因子的半衰期,将半衰期延长结构域与掩蔽的细胞因子连接。
术语“半衰期延长结构域”是指延长血清中靶组分的半衰期的结构域。术语“半衰期延长结构域”涵盖例如抗体和抗体片段。
本文所提供的掩蔽的细胞因子包括与第二半衰期延长结构域相关联的第一半衰期延长结构域。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域是非共价缔合的。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域共价结合。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域通过一个或多个二硫键与第二半衰期延长结构域连接。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域通过半衰期延长结构域接头(HLDL)与第二半衰期延长结构域连接。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域是非共价缔合的,并且另外的,第一半衰期延长结构域通过二硫键与第二半衰期延长结构域连接。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括第一抗体或其片段,并且第二半衰期延长结构域包括第二抗体或其片段。
能够进行FcRn介导的再循环的抗体或其片段可以减少或以其它方式延迟掩蔽的细胞因子从受试者中清除,由此延长施用的掩蔽的细胞因子的半衰期。在一些实施例中,抗体或其片段是能够进行FcRn介导的再循环的任何抗体或其片段,如能够进行FcRn介导的再循环的任何重链多肽或其部分(例如,Fc结构域或其片段)。
抗体或其片段可以是任何抗体或其片段。然而,在包括第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的掩蔽的细胞因子的一些实施例中,第一半衰期延长结构域或第二半衰期延长结构域可以包括不与FcRn受体结合的抗体或其片段,如轻链多肽。例如,在掩蔽的细胞因子的一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括抗体或其片段,所述抗体或其片段包括不与FcRn受体直接相互作用的轻链多肽或其部分,但是,由于包括能够与FcRn受体相互作用的第二半衰期延长结构域,例如通过包括重链多肽,所以掩蔽的细胞因子具有延长的半衰期。本领域认识到,FcRn介导的再循环需要FcRn受体与抗体或其片段的Fc区结合。例如,研究表明,残基I253、S254、H435和Y436(根据Kabat EU索引编号系统进行编号)对于人Fc区与人FcRn复合物之间的相互作用是重要的。参见例如,Firan,M等人,《国际免疫学(Int.Immunol.)》13(2001)993-1002;Shields,R.L等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(2001)6591-6604))。还检查和报告了残基248-259、301-317、376-382和424-437的各种突变体(根据Kabat EU索引编号系统进行编号)。Yeung,Y.A.等人,(《免疫学杂志》182(2009)7667-7671。
在一些实施例中,抗体或其片段包括重链多肽或轻链多肽。在一些实施例中,抗体或其片段包括重链多肽或轻链多肽的一部分。在一些实施例中,抗体或其片段包括Fc结构域或其片段。在一些实施例中,抗体或其片段包括CH2和CH3结构域或其片段。在一些实施例中,抗体或其片段包括重链多肽的恒定结构域。在一些实施例中,抗体或其片段包括轻链多肽的恒定结构域。在一些实施例中,抗体或其片段包括重链多肽或其片段(例如,Fc结构域或其片段)。在一些实施例中,抗体或其片段包括轻链多肽。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括第一Fc结构域或其片段,并且第二半衰期延长结构域包括第二Fc结构域或其片段。
在一些实施例中,第一Fc结构域和/或第二Fc结构域各自含有促进第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的非共价缔合的一个或多个修饰。在一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括包含突变Y349C;T366S;L38A;以及Y407V的IgG1 Fc结构域或其片段以在第一半衰期延长结构域中形成‘臼’,并且第二半衰期延长结构域包括包含突变S354C和T366W的IgG1 Fc结构域或其片段以在第二半衰期延长结构域中形成‘杵’。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自是IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域或其片段。在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自是IgG1 Fc结构域或其片段。人IgG1免疫球蛋白重恒定γ1具有以下序列:
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域源自具有SEQID NO:21的人IgG1免疫球蛋白重恒定γ1的序列(“亲本序列”),使得第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自包括具有一个或多个氨基酸修饰的SEQ ID NO:21或其片段。
在一些实施例中,第一半衰期延伸结构域和第二半衰期延伸结构域各自包括以上以粗体示出的SEQ ID NO:21的部分,任选地具有一个或多个氨基酸修饰,即:
DKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:22)
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域包括具有氨基取代的SEQ ID NO:22,以根据‘杵臼结构’方法促进第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的缔合。在一些实施例中,序列SEQ IDNO:22含有突变Y349C;T366S;L38A;以及Y407V(根据Kabat EU编号系统进行编号)以形成第一半衰期延长结构域中的‘臼’,以及突变S354C和T366W(根据Kabat EU编号系统进行编号)以形成第二半衰期延长结构域中的‘杵’。这些经修饰的序列具有以下所示的SEQ ID NO:23和24:
第一半衰期延长结构域(Y349C;T366S;L38A;以及Y407V)SEQ ID NO:23:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二半衰期延长结构域(S354C和T366W)SEQ ID NO:24:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自进一步包括根据Kabat EU编号系统进行编号的氨基取代N297A:
第一半衰期延长结构域(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A)SEQ ID NO:25:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二半衰期延长结构域(S354C、T366W和N297A)SEQ ID NO:26:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自进一步包括根据Kabat EU编号系统进行编号的氨基取代I253A。
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域各自进一步包括根据Kabat EU编号系统进行编号的氨基取代N297A和I253A两者:
第一半衰期延长结构域(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A)SEQ IDNO:27:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
第二半衰期延长结构域(S354C、T366W、N297A和I253A)SEQ ID NO:28:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括与SEQ ID NO:22、23、25和27中的任一个的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,第二半衰期延长结构域包括与SEQ ID NO:22、24、26和28中的任一个的氨基酸序列中的任一个具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,与SEQ ID NO:22、23、25和27中的任一个的氨基酸序列相比,第一半衰期延长结构域包括具有一个或多个修饰,如一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。在一些实施例中,与SEQ ID NO:22、24、26和28中的任一个的氨基酸序列相比,第二半衰期延长结构域包括具有一个或多个修饰,如一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。一个或多个修饰可以是本文所描述的任何修饰或改变,包含在一些实施例中,本文所公开的促进多肽链的异二聚化和/或抑制多肽链的均二聚化、改变效应子功能或增强效应子功能的任何修饰或改变。
在一些实施例中,Fc结构域或其片段包括改变效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG1 Fc结构域或其片段,并且包括选自由根据Kabat EU编号系统进行编号的N297A、N297G、N297Q、L234A、L235A、C220S、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、D265A和P329G组成的组的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG2 Fc结构域或其片段,并且包括以下氨基取代:根据Kabat EU编号系统进行编号的V234A和G237A;H268Q、V309L、A330S和A331S;和/或V234A、G237A、P238S、H268A、V309L和A330S。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG2 Fc结构域或其片段,并且包括选自由根据Kabat EU编号系统进行编号的V234A、G237A、H268Q、V309L、A330S、A331S、P238S、H268A和V309L组成的组的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG4 Fc结构域或其片段,并且包括以下氨基取代:根据Kabat EU编号系统编号的L235A、G237A和E318A;S228P、L234A和L235A;H268Q、V309L、A330S和P331S;和/或S228P和L235A。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG2 Fc结构域或其片段,并且包括选自由根据Kabat EU编号系统进行编号的L235A、G237A、E318A、S228P、L234A、H268Q、V309L、A330S和P331S组成的组的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施例中,半衰期延长结构域包括包含一个或多个氨基酸取代的Fc结构域或其片段,从而增强效应子功能。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG1 Fc结构域或其片段,并且包括以下氨基酸取代:根据Kabat EU编号系统进行编号的S298A、E333A和K334A;S239D和I332E;S239D、A330L和I332E;P247I和A339D或A339Q;D280H和K290S;D280H、K290S和S298D或S298V;F243L、R292P和Y300L;F243L、R292P、Y300L和P396L;F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L;G236A、S239D和I332E;K326A和E333A;K326W和E333S;K290E、S298G和T299A;K290E、S298G、T299A和K326E;K290N、S298G和T299A;K290N、S298G、T299A和K326E;K334V;L235S、S239D和K334V;K334V和Q331M、S239D、F243V、E294L或S298T;E233L、Q311M和K334V;L234I、Q311M和K334V;K334V和S298T、A330M,或A330F;K334V、Q311M和A330M或A330F;K334V、S298T和A330M或A330F;K334V、S239D和A330M或S298T;L234Y、Y296W和K290Y、F243V,或E294L;Y296W和L234Y或K290Y;S239D、A330S和I332E、V264I;F243L和V264I;L328M;I332E;L328M和I332E;V264I和I332E;S239E和I332E;S239Q和I332E;S239E;A330Y;I332D;L328I和I332E;L328Q和I332E;V264T;V240I;V266I;S239D;S239D和I332D;S239D和I332N;S239D和I332Q;S239E和I332D;S239E和I332N;S239E和I332Q;S239N和I332D;S239N和I332E;S239Q和I332D;A330Y和I332E;V264I、A330Y和I332E;A330L和I332E;V264I、A330L和I332E;L234E、L234Y,或L234I;L235D、L235S、L235Y,或L235I;S239T;V240M;V264Y;A330I;N325T;I332E和L328D、L328V、L328T,或L328I;V264I、I332E和S239E或S239Q;S239E、V264I、A330Y和I332E;A330Y、I332E和S239D或S239N;A330L、I332E和S239D或S239N;V264I、S298A和I332E;S298A、I332E和S239D或S239N;S239D、V264I和I332E;S239D、V264I、S298A和I332E;S239D、V264I、A330L和I332E;S239D、I332E和A330I;P230A;P230A、E233D和I332E;E272Y;K274T、K274E、K274R、K274L,或K274Y;F275W;N276L;Y278T;V302I;E318R;S324D、S324I或S324V;K326I或K326T;T335D、T335R,或T335Y;V240I和V266I;S239D、A330Y、I332E和L234I;S239D、A330Y、I332E和L235D;S239D、A330Y、I332E和V240I;S239D、A330Y、I332E和V264T;和/或S239D、A330Y、I332E和K326E或K326T。在一些实施例中,半衰期延长结构域是IgG1 Fc结构域或其片段,并且包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代:P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y。
在一些实施例中,半衰期延长结构域包括增强半衰期延长结构域与FcRn的结合的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中,一个或多个氨基酸取代(一个或多个)增加了含有Fc的多肽(例如,重链多肽或Fc结构域或其片段)在酸性pH下与FcRn的结合亲和力。在一些实施例中,半衰期延长结构域包括选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸取代:M428F;T250Q和M428F;M252Y、S254T和T256E;P257I和N434H;D376V和N434H;P257I和Q3111;N434A;N434W;M428F和N434S;V259I和V308F;M252Y、S254T和T256E;V259I、V308F和M428F;T307Q和N434A;T307Q和N434S;T307Q、E380A和N434A;V308P和N434A;N434H以及V308P。
出于制造目的,可以在半衰期结构域的上游工程化信号肽以改善蛋白质的分泌。信号肽根据本领域已知的细胞系的要求进行选择。应当理解,信号肽不作为将被纯化和调配为药物产品的蛋白质的一部分表达。
1.4.1异二聚化修饰
本文所描述的半衰期延长结构域可以包含促进两个不同的半衰期延长结构域的异二聚化的一个或多个修饰。在一些实施例中,期望促进第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的异二聚化,使得有效地产生呈正确异二聚体形式的掩蔽的细胞因子的产生。因此,可以对第一半衰期延长结构域进行一个或多个氨基酸修饰,并且可以使用本领域中可用的任何策略对第二半衰期延长结构域进行一个或多个氨基酸修饰,所述任何策略包含如Klein等人,(2012),MAb,4(6):653-663所描述的任何策略。下文详细描述了示例性策略和修饰。
杵臼结构方法
促进两个不同的半衰期延长结构域的异二聚化的一种策略是称为“杵臼结构”的方法。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域,其各自包括CH3结构域。在一些实施例中,包括CH3结构域的半衰期延长结构域是重链多肽或其片段(例如,Fc结构域或其片段)。两个半衰期延长结构域的CH3结构域可以通过“杵臼结构”技术改变,所述杵臼结构技术在例如WO 1996/027011;Ridgway,J.B.等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》(1996)9(7):617-621;Merchant,A.M.等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》(1998)16(7):677-681的若干实例中详细描述。还参见Klein等人,(2012),MAb,4(6):653-663。使用杵臼结构方法,改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有两个改变的CH3结构域的两个半衰期延长结构域的异二聚化。这通过将大量残基引入到充当“杵”的半衰期延长结构域中的一个的CH3结构域中发生。然后,为了容纳大量残基,在可以容纳杵的另一个半衰期延长结构域中形成“臼”。改变的CH3结构域中的任一个可以是“杵”,而另一个可以是“臼”。二硫键的引入进一步稳定了异二聚体(Merchant,A.M.等人,《自然生物技术》(1998)16(7);Atwell,S.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》(1997)270(1):26-35)以及增加了产率。
据报道,可以通过在重链中引入S354C和T366W突变以产生“杵”,并且在重链中引入Y349C、T366S、L368A和Y407V突变以产生“臼”(根据Kabat EU编号系统对残基进行编号)来实现高于97%的异二聚化产率。Carter等人,(2001),《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,248:7-15;Klein等人,(2012),MAb,4(6):653-663。
在包括第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括包含氨基酸突变S354C和T366W(根据Kabat EU编号系统进行编号)的重链多肽或其部分(例如,Fc结构域或其片段),并且所述第二半衰期延长结构域包括包含氨基酸突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU编号系统进行编号)的重链多肽或其部分(例如,Fc结构域或其片段)。在包括第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的一些实施例中,第一半衰期延长结构域包括包含氨基酸突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU编号系统进行编号)的重链多肽或其部分(例如,Fc结构域或其片段),并且所述第二半衰期延长结构域包括包含氨基酸突变S354C和T366W(根据Kabat EU编号系统进行编号)的重链多肽或其部分(例如,Fc结构域或其片段)。
可以制备用于形成杵和臼的取代的另外的实例包含在US20140302037A1中所描述的实例,所述文献的内容通过引用并入本文。例如,在一些实施例中,可以对各自含有Fc结构域的第一半衰期延长结构域(“第一结构域”)和成对的第二半衰期延长结构域(“第二结构域”)进行以下氨基酸取代中的任一者:根据Kabat EU编号系统进行编号的(a)第一结构域中的Y407T和第二结构域中的T366Y;(b)第一结构域中的Y407A和第二结构域中的T366W;(c)第一结构域中的F405A和第二结构域中的T394W;(d)第一结构域中的F405W和第二结构域中的T394S;(e)第一结构域中的Y407T和第二结构域中的T366Y;(f)第一结构域中的T366Y和F405A以及第二结构域中T394W和Y407T;(g)第一结构域中的T366W和F405W以及第二结构域中的T394S和Y407A;(h)第一结构域中的F405W和Y407A以及第二结构域中的T366W和T394S;或(i)第一结构域中的T366W和第二结构域中的T366S、L368A和Y407V。
在一些实施例中,可以对各自含有Fc结构域的第一半衰期延长结构域(“第一结构域”)和成对的第二半衰期延长结构域(“第二结构域”)进行以下氨基酸取代中的任一者:根据Kabat EU编号系统进行编号的(a)第二结构域中的Y407T和第一结构域中的T366Y;(b)第二结构域中的Y407A和第一结构域中的T366W;(c)第二结构域中的F405A和第一结构域中的T394W;(d)第二结构域中的F405W和第一结构域中的T394S;(e)第二结构域中的Y407T和第一结构域中的T366Y;(f)第二结构域中的T366Y和F405A以及第一结构域中T394W和Y407T;(g)第二结构域中的T366W和F405W以及第一结构域中的T394S和Y407A;(h)第二结构域中的F405W和Y407A以及第一结构域中的T366W和T394S;或(i)第二结构域中的T366W和第一结构域中的T366S、L368A和Y407V。
在包括各自包括Fc结构域的第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域的实施例中,本文所描述的任何异二聚化改变可以用于Fc结构域中以促进本文所描述的任何掩蔽的细胞因子的异二聚化。
1.5示例性掩蔽的细胞因子
根据本公开的掩蔽的细胞因子可以组合如在本文任何地方所描述的IL-12细胞因子或其功能片段;如在本文任何地方所描述的掩蔽部分;如在本文任何地方所描述的第一半衰期结构域和第二半衰期结构域;以及如在本文任何地方所描述的可切割接头和不可切割接头。
此外,在一实施例中,本文所公开的任何特异性序列可以任选地包括另外的氨基酸取代,如一个、两个或三个取代。在另一个实施例中,本发明还涵盖与本文所公开的用于掩蔽的细胞因子的结构域的任何特异性序列具有至少90%同源性、优选地95%、更优选地99%的序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至237,即具有SEQ ID NO:5的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至545,即具有SEQ ID NO:6的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:61的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:62的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至212,即具有SEQ ID NO:7的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至222,即具有SEQ ID NO:8的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:9的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:63的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至622,即具有SEQ ID NO:10的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至227,即具有SEQ ID NO:11的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至237,即具有SEQ ID NO:5的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至545,即具有SEQ ID NO:6的序列,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2,或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至212,即具有SEQ ID NO:7的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至222,即具有SEQ ID NO:8的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:9的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至622,即具有SEQ ID NO:10的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至227,即具有SEQ ID NO:11的序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,并且掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割肽包括SEQID NO:41的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割肽包括SEQID NO:43的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割肽包括SEQID NO:44的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割接头包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割接头包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,可切割接头包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列,可切割接头包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列,可切割接头包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在一些实施例中,IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64的氨基酸序列,掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:65的序列,不可切割接头包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列,可切割接头包括SEQ ID NO:46的氨基酸序列,并且所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
在掩蔽的细胞因子的一些实施例中,第一多肽链包括:
N'HL1-L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-L2-[IL-12p35-接头-IL-12p40]C'
其中‘IL-12p40’是IL-12p40多肽或其功能片段,并且‘IL-12p35’是IL-12p35多肽或其功能片段。第一半衰期延长结构域(HL1)、第一接头(L1)、掩蔽部分(MM)、第二半衰期延长结构域(HL2)、第二接头(L2)和IL-12细胞因子或其片段([IL-12p35-接头-IL-12p40])可以如本文任何地方所定义。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:93的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:94的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:95的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:96的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:97的氨基酸序列的第二多肽链。
在一些实施例中,掩蔽的细胞因子包括包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一多肽链和包括SEQ ID NO:98的氨基酸序列的第二多肽链。
2.切割产物
本文提供了一种本文所描述的‘异二聚体’掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物。
本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子包括可切割接头。在可切割接头在切割位点处进行蛋白水解切割后,形成包括IL-12细胞因子或其功能片段的切割产物。切割产物中的IL-12细胞因子或其功能片段被激活,因为它不再被掩蔽部分掩蔽。因此,切割产物中的IL-12细胞因子或其功能片段能够与靶蛋白结合。
肿瘤细胞环境是复杂的,并且可以包括多种不同的蛋白酶。因此,在肿瘤细胞环境中切割掩蔽的IL-12细胞因子内的给定可切割肽的精确位点可以在肿瘤类型之间、在具有相同肿瘤类型的患者之间、甚至在同一肿瘤中形成的切割产物之间变化。此外,即使在切割之后,初始切割产物的另外的修饰,例如通过去除一个或两个末端氨基酸,可以通过蛋白酶在肿瘤细胞环境中的进一步作用而发生。因此,在施用如本文所描述的掩蔽的细胞因子之后,可以预期在患者的肿瘤细胞环境中形成切割产物的分布。
本文提供了一种切割产物,其能够与IL-12R结合,所述切割产物包括IL-12细胞因子或其功能片段,所述切割产物可通过对如本文任何地方所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的可切割肽进行蛋白水解切割来制备。
本文还提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括如本文任何地方所定义的IL-2细胞因子或其功能片段。本文还提供了一种从掩蔽的IL-12细胞因子的单个结构获得或可获得的切割产物的分布,其中切割产物的分布内的每个切割产物(i)能够与IL-12R结合并且(ii)包括如本文任何地方所定义的IL-12细胞因子或其功能片段。
本文还提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括多肽,所述多肽包括:
PCP-SD-C
其中PCP是蛋白水解可切割肽的一部分;SD是间隔子结构域;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段。
本文进一步提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
a)第一多肽链,所述第一多肽链包括第一半衰期延长结构域;以及
b)第二多肽链,所述第二多肽链包括多肽,所述多肽包括式5:
HL2-L2-C
(5)
其中HL2是第二半衰期延长结构域;L2是不可切割接头;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段;并且其中第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域缔合。本文还提供了一种从掩蔽的IL-12细胞因子的单个结构获得或可获得的切割产物的分布,其中切割产物的分布内的每个切割产物(i)能够与IL-12R结合并且(ii)包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
a)第一多肽链,所述第一多肽链包括第一半衰期延长结构域;以及
b)第二多肽链,所述第二多肽链包括多肽,所述多肽包括式5:
HL2-L2-C
(5)
其中HL2是第二半衰期延长结构域;L2是不可切割接头;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段;并且其中第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域缔合。
本文进一步提供了一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
a)第一多肽链,所述第一多肽链包括多肽,所述多肽包括:
HL1-SD-PCP
其中HL1是第一半衰期延长结构域;SD是间隔子结构域;并且PCP是蛋白水解可切割肽的一部分;以及
b)第二多肽链,所述第二多肽链包括多肽,所述多肽包括:
HL2-L2-C
其中HL2是第二半衰期延长结构域;L2是不可切割接头;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段;并且
其中所述第一半衰期延长结构域与所述第二半衰期延长结构域缔合。
在切割产物内,掩蔽部分、半衰期延长结构域、IL-12细胞因子或其功能片段、接头、间隔结构域和第一半衰期延长结构域与第二半衰期延长结构域之间的缔合类型可以是本文所描述的那些中的任一个以及本文所描述的那些的任何组合。
可切割肽的位置确定了包括IL-12细胞因子的所得切割产物的结构。
“蛋白水解可切割肽的部分”是指在切割位点处发生切割之后的原始蛋白水解可切割肽序列的组成部分。在切割之后,初始切割产物的另外的修饰,例如通过去除一个或两个末端氨基酸,也可以通过蛋白酶在肿瘤细胞环境中的进一步作用而发生。因此,在施用掩蔽的细胞因子之后可能在患者的肿瘤细胞环境中形成的切割产物的分布内的切割产物可能不含有蛋白水解可切割肽的任何部分。
在一些实施例中,“部分”是指原始蛋白水解可切割肽序列的1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸或6个氨基酸。在一些实施例中,“部分”是指原始蛋白水解可切割肽序列的2个氨基酸。在一些实施例中,“部分”是指原始蛋白水解可切割肽序列的3个氨基酸。在一些实施例中,“部分”是指原始蛋白水解可切割肽序列的4个氨基酸。
在一些实施例中,蛋白水解可切割肽的“部分”的长度为3至6个氨基酸。在一些实施例中,蛋白水解可切割肽的“部分”的长度为3或4个氨基酸。
本文所公开的可切割接头的切割位点在下文公开:
仅通过举例来说,在上表中,*指示可切割肽内的已知或观察到的蛋白酶切割位点。
因此,本文公开了本文所公开的掩蔽的细胞因子中的任一种的切割产物。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:66组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:66的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:67组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:67的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:68组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:68的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:69组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:69的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:70组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:70的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:71组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:72组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:72的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:73组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:73的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:74组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:74的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:75组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:75的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:76组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:76的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:77组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:77的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:78组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:78的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:79组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:79的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括与选自由SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中,切割产物包括具有包括SEQ ID NO:80的氨基酸序列的氨基酸序列。
3.结合测定
如在细胞因子或其功能片段与所述细胞因子或其功能片段对其具有特异性的结合配偶体(例如,靶蛋白,如细胞因子受体)之间,免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(Kd)表达,其中较小的Kd表示较大的亲和力。IL-12细胞因子与IL-12细胞因子受体的结合可以用Kd表达。在一些实施例中,免疫结合相互作用在掩蔽的细胞因子(存在或不存在蛋白酶)与如细胞因子受体等靶蛋白之间。可以使用本领域中众所周知的方法对蛋白质的免疫结合性质进行定量。例如,一种方法包括测量细胞因子受体(例如,IL-12R)/细胞因子(例如,IL-12)复合物形成和解离的速率,其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比率使得能够消除所有与亲和力无关的参数,并且等于解离常数Kd。参见Davies等人,《生物化学年鉴(Annual Rev Biochem.)》59:439-473,(1990)。
在一些方面,与包括掩蔽部分但不包括可切割肽的亲本细胞因子相比,本文所描述的掩蔽的细胞因子在用蛋白酶切割时以大约相同或更高的亲和力与靶蛋白结合。靶蛋白可以是任何细胞因子受体。
在一些实施例中,本文所提供的不包括接头中的可切割肽的掩蔽的细胞因子与靶蛋白具有≤1M、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施例中,本文所提供的包括接头中的可切割肽的掩蔽的细胞因子在用蛋白酶切割之前与靶蛋白具有≤1M、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小、例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施例中,本文所提供的包括接头中的可切割肽的掩蔽的细胞因子在用蛋白酶切割时与靶蛋白具有≤1M、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小、例如10-8M至10-13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子的细胞因子或其功能片段与具有掩蔽的细胞因子的掩蔽部分具有≥500M、≥250M、≥200M、≥150M、≥100M、≥50M、≥10M、≥1M、≥500nM、≥250nM、≥150nM、≥100nM、≥50nM、≥10nM、≥1nM、≥0.1nM、≥0.01nM或≥0.001nM的解离常数(Kd)。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子的细胞因子或其功能片段具有介于约200M与约50nM之间的解离常数(Kd),如约或至少约175M、约或至少约150M、约或至少约125M、约或至少约100M、约或至少约75M、约或至少约50M、约或至少约25M、约或至少约5M、约或至少约1M、约或至少约750nM、约或至少约500nM、约或至少约250nM、约或至少约150nM、约或至少约100nM、约或至少约75nM或约或至少约50nM。用于评估结合亲和力的测定是本领域众所周知的。
在一些方面,提供了表现出期望闭塞率的掩蔽的细胞因子。如本文所使用的,术语“闭塞率”是指(a)在第一组条件下参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下该参数的最小检测值的比率。在掩蔽的IL-12多肽的上下文中,闭塞率是指(a)在至少一种能够切割掩蔽的IL-12多肽的可切割肽的蛋白酶存在的情况下与掩蔽的IL-12多肽结合的靶蛋白(例如,IL-12R蛋白)的最大检测水平与(b)在蛋白酶不存在的情况下与掩蔽的IL-12多肽结合的靶蛋白(例如,IL-12R蛋白)的最小检测水平的比率。因此,可以通过将掩蔽的细胞因子切割前的EC50除以掩蔽的细胞因子切割后的EC50来计算掩蔽的细胞因子的闭塞率。掩蔽的细胞因子的闭塞率也可以计算为用蛋白酶切割之前掩蔽的细胞因子的解离常数与用蛋白酶切割之后掩蔽的细胞因子的解离常数的比率。在一些实施例中,相较于不存在蛋白酶的情况,掩蔽的细胞因子的闭塞率较大指示由掩蔽的细胞因子结合的靶蛋白在存在能够切割掩蔽的细胞因子的可切割肽的蛋白酶的情况下出现的程度更大(例如,绝大多数出现)。
在一些实施例中,本文提供了具有最佳闭塞率的掩蔽的细胞因子。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子的最佳闭塞率指示掩蔽的细胞因子具有可用于本文所涵盖的方法或组合物的期望性质。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子表现出约2至约10,000,例如约80至约100的最佳闭塞率。在本文所提供的掩蔽的细胞因子中的任何掩蔽的细胞因子的另外的实施例中,闭塞率为约2至约7,500、约2至约5,000、约2至约2,500、约2至约2,000、约2至约1,000、约2至约900、约2至约800、约2至约700、约2至约600、约2至约500、约2至约400、约2至约300、约2至约200、约2至约100、约2至约50、约2至约25、约2至约15、约2至约10、约5至约10、约5至约15、约5至约20、约10至约100、约20至约100、约30至约100、约40至约100、约50至约100、约60至约100、约70至约100、约80至约100或约100至约1,000。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子表现出约2至约1,000的最佳闭塞率。可以使用本领域众所周知的技术如通过ELISA来确定在用蛋白酶切割之前和/或切割之后掩蔽的IL-12多肽与靶蛋白的结合。
在一些实施例中,本文所描述的掩蔽部分以低于细胞因子或其功能片段与靶蛋白(例如,细胞因子受体)之间的亲和力的亲和力与如本文所描述的细胞因子或其功能片段结合。在某些实施例中,本文所提供的掩蔽部分以≥500M、≥250M、≥200M、≥150M、≥100M、≥50M、≥10M、≥1M、≥500nM、≥250nM、≥150nM、≥100nM、≥50nM、≥10nM、≥1nM、≥0.1nM、≥0.01nM或≥0.001nM的解离常数(Kd)与如本文所描述的细胞因子或其功能片段结合。
4.掩蔽的IL-12细胞因子的产生
本文所描述的掩蔽的细胞因子是使用本领域可用的技术制备的,描述了所述技术的示例性方法。
4.1抗体产生
掩蔽的IL-12细胞因子的一些实施例包括抗体或其片段。以下章节提供了关于抗体及其抗体片段、变体和衍生物的产生的进一步细节,所述细节可以用于本文所提供的掩蔽的IL-12细胞因子的一些实施例中。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子采用由通过二硫键缔合的掩蔽的IL-12细胞因子的两个拷贝产生的二聚体的形式。
1.抗体片段
在一些实施例中,本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以是任何抗体片段,如Fc结构域、重链的一部分、轻链的一部分、Fab、Fv或scFv以及其它片段。抗体片段可以通过传统方法(如酶促消化)或重组技术产生。在某些情况下,将抗体片段而不是整个抗体连接至本文所描述的掩蔽的细胞因子是有优势的。关于某些抗体片段的评述,参见Hudson等人,(2003)《自然医学(Nat.Med.)》9:129-134。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上,这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto等人,《生物化学和生物物理学方法杂志(Journalof Biochemical and Biophysical Methods)》24:107-117(1992);和Brennan等人,《科学(Science)》,229:81(1985))。然而,这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌和其它细胞类型(如HEK293和CHO)中表达和分泌,由此实现大量的这些片段的便捷产生。可替代地,可以从培养基直接回收Fab-SH片段并将其以化学方式偶联以形成F(ab)2片段(Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。根据另一种方法,可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab)2片段。包括FcRN/救助受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab)2片段描述于美国专利第5,869,046号。用于产生抗体片段以用于掩蔽的细胞因子的其它技术对于熟练的技术人员而言是显而易见的。在某些实施例中,掩蔽的细胞因子包括单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。scFv融合蛋白可以被构建为在scFv的氨基或羧基末端处产生效应蛋白的融合。参见《抗体工程改造(Antibody Engineering)》,Borrebaeck编,见上文。此外,在一些实施例中,包括通过多肽接头连接的两个scFv的双scFv可以与掩蔽的细胞因子一起使用。
在一些实施例中,本发明包含线性抗体(例如,如美国专利第5,641,870号中所述)或单链免疫球蛋白,所述单链免疫球蛋白包括通过适当的接头连接的抗体的重链和轻链序列。此类线性抗体或免疫球蛋白可以是单特异性或双特异性的。此类单链免疫球蛋白可以二聚化,从而维持与抗体类似的结构和活性,所述抗体最初是四聚体。此外,在一些实施例中,抗体或其片段可以是具有单一重链可变区且不具有轻链序列的抗体。此类抗体被称为单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体。这些抗体也涵盖于根据本发明的抗体的功能片段的含义中。抗体片段可以根据本文所提供的指导连接至本文所描述的掩蔽的细胞因子。
2.人源化抗体
在一些实施例中,本发明涵盖人源化抗体或其抗体片段。在一些实施例中,人源化抗体可以是任何抗体,包含任何抗体片段。用于将非人类抗体人源化的各种方法是本领域中已知的。例如,人源化抗体可以具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入(import)”残基,其通常从“输入”可变结构域获得。基本上可以根据Winter的方法(Jones等人(1986)《自然(Nature)》321:522-525;Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327;Verhoeyen等人(1988)《科学》239:1534-1536),通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行人源化。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号),其中实质上少于完整的人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列取代。在实践中,人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。人源化抗体可以根据本文所提供的指导连接至本文所描述的掩蔽的细胞因子。
3.人类抗体
可以通过组合选自人类衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人类恒定结构域序列来构建本发明的一些实施例的人类抗体。可替代地,本发明的一些实施例的人类单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备,例如通过使用小鼠、大鼠、牛(例如,母牛)或兔细胞来例如产生人类单克隆抗体。在一些实施例中,人类抗体和人类单克隆抗体可以是与任何抗原结合的抗体。在一些实施例中,本发明的人类单克隆抗体可以通过用靶抗原对包括人免疫球蛋白基因座的非人动物进行免疫处理以及从免疫动物或来源于免疫动物的细胞分离抗体来制备。合适的非人动物的实例包含转基因或转染色体动物,如HuMAb(Medarex公司)、KM“TC小鼠”和XenomouseTM。参见例如Lonberg等人,(1994)《自然》368:856-859;Fishwild,D.等人,(1996)《自然生物技术》14:845-851;WO2002/43478;美国专利第5,939,598号;第6,075,181号;第6,114,598号;第6,150,584号;第6,162,963号;以及Tomizuka等人,(2000)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》97:722-727。
用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系已由例如Kozbor《免疫学杂志》,133:3001(1984);Brodeur等人,《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);和Boerner等人,《免疫学杂志》,147:86(1991)描述。人类抗体可以根据本文所提供的指导连接至本文所描述的掩蔽的细胞因子。
4.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中,双特异性抗体是人类或人源化抗体。在一些实施例中,结合特异性中的一种针对第一抗原,并且另一种结合特异性针对第二抗原,所述第二抗原可以是同一靶蛋白上的两个不同表位或两个不同靶蛋白上的两个不同表位。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到表达第一抗原和/或第二抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于募集细胞,如T细胞或天然杀伤细胞,以杀死某些细胞,例如癌细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段(例如,F(ab')2双特异性抗体)。双特异性抗体可以根据本文所提供的指导连接至本文所描述的掩蔽的细胞因子。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。参见Milstein和Cuello,《自然》,305:537(1983);1993年5月13日公开的WO 93/08829;Traunecker等人,《欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)》,10:3655(1991);Kontermann和Brinkmann,《当今药物探索(DrugDiscovery Today)》,20(7):838-847。关于产生双特异性抗体的其它详情,参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986)。双特异性抗体包含交联或“异结合”抗体。例如,异结合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶合,另一种与生物素偶合。异结合抗体可以使用任何便利的交联方法制备。合适的交联剂以及许多交联技术是本领域中众所周知的且公开于美国专利第4,676,980号中。
5.单结构域抗体
在一些实施例中,单结构域抗体根据本文所提供的指导连接至掩蔽的细胞因子。单结构域抗体可以是任何抗体。单结构域抗体是包括抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的单一多肽链。在某些实施例中,单结构域抗体是人类单结构域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆多曼蒂斯公司(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.);参见例如美国专利第6,248,516B1号)。在一些实施例中,单结构域抗体由抗体的全部或一部分重链可变结构域组成。在一些实施例中,单结构域抗体是通过用靶抗原对骆驼进行免疫处理而获得的骆驼源性抗体。在一些实施例中,单结构域抗体是通过用靶抗原对鲨鱼进行免疫处理而获得的鲨鱼源性抗体。在一些实施例中,单结构域抗体是纳米抗体(参见例如WO2004041865A2和US20070269422A1)。
6.抗体变体
在一些实施例中,涵盖了本文所描述的抗体或其片段的氨基酸序列修饰。例如,可能期望改善抗体的FcRn结合亲和力和/或pH依赖性FcRn结合亲和力。还期望通过引入某些氨基酸修饰来促进抗体重链的异源二聚化。用于促进抗体链的异源二聚化的方法,包含可以进行以促进异源二聚化的某些修饰,由Klein等人,(2012),MAb,4(6):653-663描述。
可以通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体,其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。可以在制备序列时将氨基酸变化引入标的抗体氨基酸序列。
适用于鉴别抗体中可以作为用于诱变的优选位置的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085所描述。此处,对残基或靶残基的群组(例如,带电残基,如arg、asp、his、lys和glu)进行鉴别并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如,丙氨酸或聚丙氨酸)替代以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后,通过在取代位点处或针对取代位点引入另外的或其它变体来优化这些对取代显示出功能敏感性的氨基酸位置。因此,尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的,但突变本身的性质无需是预定的。例如,为了分析给定位点处的突变的性能,在靶密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变并且针对期望活性来筛选被表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包含长度在一个残基至含有一百个或更多的残基的多肽范围内的氨基和/或羧基末端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入型变体包含延长抗体的血清半衰期的酶或多肽与抗体的N末端或C末端的融合。
在一些实施例中,修饰掩蔽的细胞因子以消除、减少或以其它方式阻碍铰链区附近的蛋白酶切割。根据如Kabat中的EU指数,IgG的“铰链区”通常定义为包含E216并且在人IgG1的P230处终止,但是在功能上,链的柔性部分可以被视为包含称为上铰链区和下铰链区的另外的残基,如E216至G237(Roux等人,1998《免疫学杂志》161:4083),并且下铰链被称为Fc区的233至239残基,其中FcyR结合通常归因于所述残基。本文所描述的对任何掩蔽的细胞因子的修饰可以例如根据通过引用并入本文的US20150139984A1中描述的方法以及通过并入其中所描述的任何修饰来执行。
在一些实施例中,改善药物动力学的FcRn突变包括(但不限于)M428L、T250Q/M428L、M252Y/S254T/T256E、P257I/N434H、D376V/N434H、P257I/Q3111、N434A、N434W、M428L/N434S、V259I/V308F、M252Y/S254T/T256E、V259I/V308F/M428L、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A、V308P/N434A、N434H、V308P。在一些实施例中,此类突变增强在低pH值下抗体与FcRn的结合,但不改变在中性pH值下的抗体亲和力。
在某些实施例中,改变抗体或其片段以提高或降低抗体的糖基化程度。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此,多肽中的这些三肽序列中任一种的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸,最通常的是丝氨酸或苏氨酸,但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
针对掩蔽的细胞因子的糖基化位点的添加或缺失通过改变氨基酸序列使得产生或去除上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)中的一个或多个来便利地实现。所述变化也可以通过针对原始抗体的序列(对于O-连接的糖基化位点)的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代来实现。
当抗体或其片段包括Fc区时,可以改变与其连接的碳水化合物。例如,具有成熟的碳水化合物结构的抗体描述于美国专利申请案第US 2003/0157108号(Presta,L.)中,所述成熟的碳水化合物结构不具有连接至抗体的Fc区的海藻糖。还参见US 2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。在连接至抗体的Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体论述于Jean-Mairet等人,WO 2003/011878和Umana等人,美国专利第6,602,684号中。在连接至抗体的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体报道于Patel等人,WO 1997/30087中。关于具有与Fc区连接的改变的碳水化合物的抗体,还参见WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)。关于具有被修饰的糖基化的抗原结合分子,还参见US 2005/0123546(Umana等人)。
在某些实施例中,糖基化变体包括Fc区,其中连接至Fc区的碳水化合物结构不具有海藻糖或具有减少的海藻糖。此类变体具有改善的ADCC功能。任选地,Fc区进一步包括进一步改善ADCC的一个或多个氨基酸取代,例如,Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的Eu编号)。与“去海藻糖基化”或“海藻糖缺失型”抗体相关的公开案的实例包含:US2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO 2005/035586;WO 2005/035778;W02005/053742;Okazaki等人,《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。产生去海藻糖基化抗体的细胞系的实例包含蛋白质海藻糖基化中缺失的Lee 13 CHO细胞(Ripka等人《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249:533-545(1986);美国专利申请第US 2003/0157108 A1号,Presta,L;以及WO 2004/056312 A1,Adams等人,尤其在实例11处)和基因敲除细胞系,如α-1,6-海藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程》87:614(2004)),以及过表达31,4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)和高尔基体p-甘露糖苷酶II(Manll)的细胞。
在本文中的任何实施例中,掩蔽的细胞因子可以被工程化为改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施例中,可以在具有α,6-海藻糖基转移酶(Fut8)基因敲除的细胞系中产生掩蔽的细胞因子。在一些实施例中,宿主细胞已被修饰以具有降低的内在α,6-海藻糖基化活性。用于修饰哺乳动物宿主细胞中的岩藻糖基化通路的方法的实例可见于例如Yamane-Ohnuki和Satoh,MAbs,1(3):230-236(2009),所述文献的内容通过引用并入本文。用于部分或完全灭活FUT8基因的表达的方法和组合物的实例可见于例如美国公开第20160194665A 1号;第WO 2006133148A2号,所述文献的内容通过引用并入本文。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子在CHO细胞的Lecl3变体(参见例如Shields等人,《生物化学杂志》,277(30):26733-40(2002))或具有降低的FUT8活性的YB2/0细胞系(参见例如Shinkawa等人,《生物化学杂志》,278(5):3466-73(2003))中产生。在一些实施例中,可以引入针对与α,6-岩藻糖基化相关的基因的小干扰RNA(siRNA)(参见例如Mori等人,《生物技术与生物工程》88(7):901-908(2004);Imai-Nishiya等人,《BMC生物技术(BMCBiotechnol.)》7:84(2007);Omasa等人,《生物科学与生物工程杂志(J.Biosci.Bioeng.)》,106(2):)。在一些另外的实施例中,可以在过表达31,4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)的细胞系中产生掩蔽的细胞因子。在另外的实施例中,细胞系还过表达高尔基体p-甘露糖苷酶II(Manll)。在本文中的一些实施例中,掩蔽的细胞因子可以在Fc区中包括至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。
在一些实施例中,改变掩蔽的细胞因子以改善其血清半衰期。为了增加细胞因子的血清半衰期,可以将FcRN/救助受体结合表位并入连接的抗体(尤其抗体片段)中,如例如美国专利第5,739,277号中所描述的。如本文所使用的,术语“救助受体结合表位”是指IgG分子(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责增加IgG分子的体内血清半衰期的表位(US2003/0190311、美国专利第6,821,505号;美国专利第6,165,745号;美国专利第5,624,821号;美国专利第5,648,260号;美国专利第6,165,745号;美国专利第5,834,597号)。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体的抗体分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基置换。用于取代型诱变的所关注位点包含高变区,但也涵盖FR变化。保守性取代展示于表3中的标题“优选取代”下。如果此类取代引起生物活性的期望变化,那么可以引入表3中命名为“例示性取代”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更多实质性变化且筛选产物。
通过选择在保持以下各者的作用方面显著不同的取代来实现抗体的生物学性质中实质性修饰:(a)取代区域中多肽主链的结构,例如呈片状或螺旋状构形,(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的主体。可以根据氨基酸的侧链的性质的类似性来将其分组(A.L.Lehninger,《生物化学(Biochemistry)》,第二版,第73-75页,Worth Publishers,New York(1975)):
(1)非极性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、lie(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的极性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gin(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
可替代地,可以基于共有的侧链性质将天然存在的残基分成各组:
(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、he;
(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)碱性:His、Lys、Arg;
(5)影响链定向的残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要将这些类别中的一种的成员与另一种类别交换。也可以将此类被取代的残基引入保守性取代位点或其余(非保守性)位点。
另一种类型的取代变体涉及天然存在的氨基酸残基对非天然存在的氨基酸残基的取代。非天然存在的氨基酸残基可以例如通过tRNA重编码或通过如例如在WO2016154675A1中描述的任何方法并入,所述文献通过引用并入本文。
一种取代变体涉及取代亲本抗体(例如,人源化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常,被选择用于进一步研究的所得变体相对于产生其的亲本抗体将具有被修饰的(例如,改善的)生物学性质。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示、酵母展示或哺乳动物展示的亲和力成熟。简单来说,使若干高变区位点(例如,6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体由丝状噬菌体粒子显示为与包装于各粒子内的噬菌体鞘蛋白(例如,M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。接着,针对生物活性(例如,结合亲和力)来筛选噬菌体展示的变体。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点,可以进行扫描诱变(例如,丙氨酸扫描)以鉴别显著促进抗原结合的高变区残基。可替代地或另外地,可能有利的是,分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点。根据本领域中已知的技术,包含本文中详细描述的技术,此类接触残基和相邻残基是用于取代的候选物。在产生此类变体后,变体集合经历使用本领域中已知的技术(包含本文中所描述的技术)进行的筛选,且可以选择在一种或多种相关分析法中具有优良性质的抗体以用于进一步研究。
通过本领域中已知的各种方法制备编码掩蔽的细胞因子的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包含但不限于从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)分离或通过例如寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变以及抗体的早期制备的变体或非变体型式的盒式诱变来制备。
可能需要在本发明的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰,由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包括人类Fc区序列(例如,人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区),其在一个或多个氨基酸位置处包括氨基酸修饰(例如,取代),包含铰链半胱氨酸的氨基酸修饰。
在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子包含具有带增强效应子功能的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的抗体或其片段。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子包含具有带增强效应子功能的IgG1同种型的抗体或其片段。在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子具有带增强效应子功能的IgG1同种型。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子是非海藻糖基化的。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子具有增加水平的甘露糖部分。在一些实施例中,掩蔽的细胞因子具有增加水平的二分聚糖部分。在一些实施例中,IgG1包括氨基酸突变。
在一些实施例中,本文所提供的掩蔽的细胞因子包含具有IgG1同种型(例如,人类IgG1同种型)的抗体。在一些实施例中,IgG1包括增强效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代S298A、E333A和K334A,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代S239D和I332E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代S239D、A330L和I332E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代P247I和A339D或A339Q,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下),其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P和Y300L,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P、Y300L和P396L,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代G236A、S239D和I332E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K326A和E333A,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K326W和E333S,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K290E、S298G、T299A,具有或不具有K326E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K290N、S298G、T299A,具有或不具有K326E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代L235S、S239D和K334V,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V和Q331M、S239D、F243V、E294L或S298T,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代E233L、Q311M和K334V,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代L234I、Q311M和K334V,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V和S298T、A330M或A330F,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V、Q311M以及A330M或A330F,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V、S298T以及A330M或A330F,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代K334V、S239D以及A330M或S298T,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代L234Y、Y296W和K290Y、F243V或E294L,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代Y296W以及L234Y或K290Y,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代S239D、A330S和I332E,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。
在一些实施例中,IgG1包括降低或抑制效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代N297A、N297G或N297Q,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代L234A或L235A,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代C220S、C226S、C229S和P238S,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代C226S、C229S、E233P、L234V和L235A,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代L234F、L235E和P331S,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施例中,IgG1包括氨基酸取代S267E和L328F,其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。
根据本说明书和本领域的教示,经考虑在一些实施例中与野生型对应抗体相比,掩蔽的细胞因子的抗体或其片段例如在Fc区中可以包括一个或多个变化。例如,认为可以在Fc区中进行某些变化,其将引起改变(即,改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC),例如WO99/51642中所描述。关于Fc区变体的其它实例,还参见Duncan和Winter《自然》322:738-40(1988);美国专利第5,648,260号;美国专利第5,624,821号;以及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些专利公开的内容通过引用具体地并入本文。还参见Shields等人,《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001)。具有增加的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的改善的结合(其负责母体IgG向胎儿的转移,Guyer等人,《免疫学杂志》117:587(1976)以及Kim等人,《免疫学杂志》24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。这些抗体包括具有一或多个取代的Fc区,其中所述取代改善Fc区与FcRn的结合。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利第6,194,551B1号、WO99/51642中。这些专利公开的内容通过引用具体地并入本文。还参见Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)。
4.2掩蔽的IL-12细胞因子-药物缀合物
本发明还提供了包括本文所提供的掩蔽的IL-12细胞因子的掩蔽的IL-12细胞因子-药物缀合物(MCDC),其可以是本文所公开的与一种或多种药剂缀合的任何IL-12掩蔽的细胞因子。在一些实施例中,一种或多种药剂是细胞毒性剂,如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如,蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段),或放射性同位素。在一些实施例中,一种或多种药剂是免疫刺激剂。
在一些实施例中,与掩蔽的IL-12细胞因子缀合的一种或多种药物包含但不限于:类美登素(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235 B1);阿瑞他汀,如单甲基奥利斯坦(monomethylauristatin)药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利第5,635,483号和第5,780,588号以及第7,498,298号);海兔毒素(dolastatin);卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号;Hinman等人,《癌症研究(Cancer Res.)》53:3336-3342(1993);和Lode等人,《癌症研究》58:2925-2928(1998));蒽环霉素(anthracycline),如柔红霉素(daunomycin)或阿霉素(doxorubicin)(参见Kratz等人,《当前医学化学(Current Med.Chem.)》13:477-523(2006);Jeffrey等人,《生物有机和医学化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)》16:358-362(2006);Torgov等人,《生物缀合物化学(Bioconj.Chem.)》16:717-721(2005);Nagy等人,《美国国家科学科学院院刊》97:829-834(2000);Dubowchik等人,《生物有机和医学化学通讯》12:1529-1532(2002);King等人,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》45:4336-4343(2002);和美国专利第6,630,579号);甲氨蝶呤(methotrexate);长春地辛(vindesine);紫杉烷(taxane),如多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、特西他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel);新月毒素(trichothecene);和CC1065。
在另一个实施例中,与掩蔽的IL-12细胞因子缀合的一种或多种药物包含但不限于微管蛋白聚合抑制剂(例如,类美登素和奥瑞他汀)、DNA损伤剂(例如,吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素和吲哚啉并苯并二氮杂卓二聚体)和DNA合成抑制剂(例如,依昔替康衍生物Dxd)。
在另一个实施例中,掩蔽的IL-12细胞因子-药物缀合物包括如本文所描述的与酶活性毒素或其片段缀合的掩蔽的IL-12细胞因子,所述酶活性毒素或其片段包含但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素。
在另一个实施例中,掩蔽的IL-12细胞因子-药物缀合物包括如本文所描述的与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的掩蔽的IL-12细胞因子。各种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。实例包含At211,1131,1125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、B1212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时,其可以包括用于闪烁研究的放射性原子,例如tc99m或1123,或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像,mri)的旋转标记,如同样的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
在一些实施例中,掩蔽的IL-12细胞因子-药物缀合物包括如本文所描述的与一种或多种免疫刺激剂缀合的掩蔽的IL-12细胞因子。在一些实施例中,免疫刺激剂是干扰素基因(STING)激动剂或toll样受体(TER)激动剂的刺激剂。
STING激动剂可以是任何STING激动剂。在一些实施例中,STING激动剂是环状二核苷酸(CDN)。CDN可以是任何CDN或其衍生物或变体。在一些实施例中,STING激动剂是选自由以下组成的组的CDN:cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、cAIMP和c-di-IMP。在一些实施例中,STING激动剂是选自由以下组成的组的CDN的衍生物或变体:cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、cAIMP和c-di-IMP。在一些实施例中,STING激动剂是4-(2-氯-6-氟苄基)-N-(呋喃-2-基甲基)-3-氧代-3,4-二氢-2H-苯并[b][1,4]噻嗪-6-甲酰胺或其衍生物或变体。参见例如Sali等人(2015)《公共科学图书馆·病原学(PloS Pathog.)》,11(12):e!005324。
TLR激动剂可以是任何TLR的激动剂,如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10。在一些实施例中,TLR激动剂是在细胞表面上表达的TLR的激动剂,如TLR1、TLR2、TLR4或TLR5。在一些实施例中,TLR激动剂是在细胞内表达的TLR的激动剂,如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9或TLR10。
可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备掩蔽的IL-12细胞因子和细胞毒性剂的缀合物,所述各种双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(如己二酰亚胺酸二甲酯HC1)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,《科学》238:1098(1987)中所描述来制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见W094/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物的释放的“可切割接头”。例如,可以使用酸不稳定性接头、肽酶敏感性接头、光不稳定性接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,《癌症研究》52:127-131(1992);美国专利第5,208,020号)。
本文的MCDC明确考虑但不限于用交联剂试剂制备的此类缀合物,所述交联剂试剂包含但不限于可商购获得(例如,来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物科技公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A))的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SMBC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基磺酰基苯甲酸酯)。
4.3载体、宿主细胞和重组方法
关于本发明的IL-12掩蔽的细胞因子的重组产生,将对其进行编码的一种或多种核酸分离并插入可复制的载体中以用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。使用常规程序容易地分离和测序编码掩蔽的IL-12细胞因子的DNA,包含其组分。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于所使用的宿主细胞。通常,宿主细胞是原核或真核(通常哺乳动物)来源的。应当理解,当适用时,任何同种型抗体或其片段的恒定区都可以用于这一目的,包含IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区,并且此类恒定区可以从任何人类或动物物种获得。在一些实施例中,一个载体用于编码IL-12掩蔽的细胞因子。在一些实施例中,使用多于一个载体编码掩蔽的IL-12细胞因子。
1.使用原核宿主细胞产生掩蔽的IL-12细胞因子
a.载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本发明的掩蔽的细胞因子的多肽组分的多核苷酸序列。可以从产生抗体的细胞(如融合瘤细胞)分离抗体或其抗体片段的期望多核苷酸序列并对其进行测序。可替代地,可以使用核苷酸合成器或PGR技术合成多核苷酸,或者从其它来源获得多核苷酸。一旦获得,编码掩蔽的细胞因子组分的序列就被插入到能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域中可用和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于插入载体中的核酸的大小以及用载体转化的具体宿主细胞。各载体视其功能(异源多核苷酸的扩增或表达或其两者)以及其与其所驻存的具体宿主细胞的相容性而含有各种组分。载体组分通常包含但不限于:复制起点、选择标志物基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
通常,将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质体载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点,以及能够在被转化的细胞中提供表型选择的标记序列。例如,通常使用pBR322,一种来源于大肠杆菌物种的质体,将大肠杆菌转化。pBR322含有编码安比西林(ampicillin;Amp)和四环素(Tet)抗性的基因且因此提供用于鉴别被转化的细胞的简单方法。pBR322、其衍生物或其它微生物质体或细菌噬菌体也可以含有或被修饰成含有可以由微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。用于特定抗体的表达的pBR322衍生物的实例详细地描述于Carter等人,美国专利第5,648,237号中。
另外,含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。例如,细菌噬菌体(如7GEM.TM.-11)可以用于制备重组载体,所述重组载体可以用于转化敏感宿主细胞(如大肠杆菌LE392)。
本发明的表达载体可以包括编码各多肽组分的两个或更多个启动子-顺反子对。启动子是位于顺反子上游(5')的非翻译调节序列,其调节顺反子的表达。原核启动子通常分成两个类别,即诱导性和组成性。诱导型启动子是响应于培养条件的变化(例如,存在或不存在营养物,或温度的变化)而起始在其控制下的顺反子的增加的转录水平的启动子。
由各种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。借助于通过限制酶消化从源DNA去除启动子以及将分离的启动子序列插入本发明的载体中,所选择的启动子可以可操作地连接至编码掩蔽的细胞因子的任一个链的顺反子DNA。原生启动子序列和许多异源启动子都可以用于引导靶基因的扩增和/或表达。
在一些实施例中,利用异源启动子,因为其与原生目标多肽启动子相比通常允许被表达的靶基因的更大的转录和更高的产率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包含PhoA启动子、[3-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂交启动子,如tac或trc启动子。然而,在细菌中具有功能性的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适用的。其核苷酸序列已被公开,由此使得熟练的工作人员能够使用接头或衔接子将其可操作地连接至顺反子,所述顺反子编码例如包括轻链和重链的掩蔽的细胞因子的靶轻链和靶重链(Siebenlist等人(1980)《细胞(Cell)》20:269),以提供任何所需的限制性位点。
在本发明的一个方面中,重组载体内的各顺反子包括分泌信号序列组分,其引导被表达的多肽跨越膜的易位。通常,信号序列可以是载体的组分,或其可以是插入载体中的目标多肽DNA的一部分。被选择用于本发明的目的的信号序列应是可以由宿主细胞识别和处理(即,由信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和处理异源多肽的原生信号序列的原核宿主细胞,将信号序列用例如选自由以下组成的群组的原核信号序列取代:碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)引导物、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施例中,表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面,根据本发明的多肽组分的产生可以在宿主细胞的细胞质中进行,并且因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在此方面,对于包括免疫球蛋白轻链和重链的实施例,例如,轻链和重链在存在或不存在掩蔽部分的序列、接头序列等的情况下表达、折叠和组装,以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如,大肠杆菌trxB菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件,由此允许被表达的蛋白质亚基的适当折叠和组装。Proba和Pluckthun《基因(Gene)》,159:203(1995)。
本发明的掩蔽的细胞因子也可以使用其中可以调节被表达的多肽组分的定量比率以最大化本发明的分泌的和适当组装的抗体的产率的表达系统来产生。此类调节是至少部分通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。
适用于表达本发明的掩蔽的细胞因子的原核宿主细胞包含古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria),如革兰氏阴性(Gram-negative)或革兰氏阳性(Gram-positive)生物。适用的细菌的实例包含埃希氏杆菌(Escherichia)(例如,大肠杆菌)、杆菌(例如,枯草杆菌(B.subtilis))、肠内细菌(Enterobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)物种(例如,绿脓杆菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏杆菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一个实施例中,使用革兰氏阴性细胞。在一个实施例中,使用大肠杆菌细胞作为用于本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包含菌株W3110(Bachmann,《细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology)》,第2卷(华盛顿特区:美国微生物学会(Washington,D.C.:American Society for Microbiology),1987),第1190-1219页;ATCC保藏号27,325)和其衍生物,包含具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac IqlacL8AompTA(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利第5,639,635号)。其它菌株和其衍生物也是合适的,如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌k 1776(ATCC31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)。这些实例是说明性而非限制性的。用于构建上文提及的任何具有既定基因型的细菌的衍生物的方法是本领域中已知的且描述于例如Bass等人,《蛋白质(Proteins)》,8:309-314(1990)中。考虑到细菌的细胞中的复制子的复制能力,通常需要选择适当的细菌。例如,当使用众所周知的质体(如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供应复制子时,大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以适合地用作宿主。通常,宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶,且可能需要将其它蛋白酶抑制剂并入细胞培养物中。
b.掩蔽的细胞因子的产生
用上述表达载体转化宿主细胞,并将所述宿主细胞在适当地修改的常规营养培养基中培养,以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主,使得DNA是可复制的(以染色体外元件形式或通过染色体整合体)。取决于所使用的宿主细胞,使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。通常将采用氯化钙进行的钙处理用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种用于转化的方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本发明的掩蔽的细胞因子的原核细胞在本领域中已知且适用于培养所选择的宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包含卢里亚培养液(luria broth;LB)加必要的营养补充剂。在一些实施例中,培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂,以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。例如,向培养基中添加安比西林以用于表达安比西林抗性基因的细胞的生长。
除碳、氮和无机磷酸盐来源以外,也可以包含适当浓度的以单独或与另一种补充剂或培养基(如复合氮来源)的混合物形式引入的任何必要的补充剂。任选地,培养基可以含有选自由以下组成的组的一种或多种还原剂:谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度下培养原核宿主细胞。在某些实施例中,对于大肠杆菌生长,生长温度在约20℃至约39℃、约25℃至约37℃范围内,或者为约30℃。主要取决于宿主生物,培养基的pH可以是在约5至约9范围内的任何pH。在某些实施例中,对于大肠杆菌,pH值是约6.8至约7.4,或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子,那么在适合启动子激活的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面中,使用PhoA启动子控制多肽的转录。因此,在磷酸盐限制性培养基中培养被转化的宿主细胞以进行诱导。在某些实施例中,磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P.培养基(参见例如Simmons等人,《免疫学方法杂志》(2002),263:133-147)。如本领域中已知的,根据所采用的载体构建体,可以使用各种其它诱导剂。
在一个实施例中,被表达的本发明的掩蔽的细胞因子被分泌至宿主细胞的周质中并从其中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物,通常通过如渗透休克、声波处理或溶解等手段。在破坏细胞后,通过离心或过滤来移出细胞碎片或完整细胞。蛋白质可以例如通过亲和树脂色谱法来进一步纯化。可替代地,可以将蛋白质运送到培养基中且在其中分离。可以从培养物中去除细胞,并且过滤并浓缩培养物上清液以进行所产生的蛋白质的进一步纯化。可以使用通常已知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析法(Western blot assay))进一步分离和鉴别被表达的多肽。
在本发明的一个方面中,掩蔽的细胞因子的产生通过发酵工艺大量进行。各种大规模分批进料发酵程序可以用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升容量且在某些实施例中,约1,000至100,000升容量。这些发酵器使用搅拌器叶轮来分配氧和营养物,尤其葡萄糖。小规模发酵通常是指在体积容量不超过大约100升且可以在约1升至约100升范围内的发酵器中发酵。
在发酵工艺中,蛋白质表达的诱导通常是在细胞在合适的条件下生长至期望密度(例如,OD550是约180-220)之后起始,在此阶段细胞处于早期固定相。根据所使用的载体构建体,可以使用各种诱导剂,如所属领域中已知和上文所描述。细胞可以在诱导之前生长较短的周期。通常将细胞诱导约12-50小时,但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量,可以改良各种发酵条件。例如,为了改善例如所分泌的抗体多肽的适当组装和折叠,可以使用过表达伴侣蛋白(如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴随活性的肽基脯氨酰顺,反-异构酶))的另外的载体来共同转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白可以促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等人(1999)《生物化学杂志》274:19601-19605;Georgiou等人,美国专利第6,083,715号;Georgiou等人,美国专利第6,027,888号;Bothmann和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275:17100-17105;Ramm和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275:17106-17113;Arie等人(2001)《分子微生物学(Mol.Microbiol.)》39:199-210。
为了最小化被表达的异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解,可以将某些缺失蛋白水解酶的宿主菌株用于本发明。例如,宿主细胞菌株可以被修饰成实现编码已知细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI和其组合)的基因中的基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺失型菌株是可用的且描述于例如Joly等人,(1998),见上文;Georgiou等人,美国专利第
5,264,365号;Georgiou等人,美国专利第5,508,192号;Kara等人,《微生物耐药性(Microbial Drug Resistance)》,2:63-72(1996)。
在一些实施例中,缺失蛋白水解酶且用过表达一种或多种伴侣蛋白的质体转化的大肠杆菌菌株被用作本发明的表达系统中的宿主细胞。
c.掩蔽的细胞因子纯化
在一些实施例中,进一步纯化本文中产生的掩蔽的细胞因子以获得基本上均质的制剂,以用于进一步的测定和用途。可以使用本领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序示例:在免疫亲和力或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上进行的色谱、色谱焦聚、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如葡聚糖凝胶G-75的凝胶过滤。
在一些实施例中,使用固定在固相上的蛋白质A进行本发明的掩蔽的细胞因子的免疫亲和力纯化。蛋白质A是来自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白质,其以高亲和力与抗体的Fc区结合。Lindmark等人,(1983)《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62:1-13。固定蛋白质A的固相可以是包括玻璃或二氧化硅表面的柱,或受控微孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中,柱涂有试剂,如甘油,以可能防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步骤,可以将来源于如上文所描述的细胞培养物的制剂应用于蛋白质A固定的固相上以允许所关注的掩蔽的细胞因子与蛋白质A的特异性结合。接着,洗涤固相以去除与固相非特异性结合的污染物。最终,通过洗脱从固相回收所关注的掩蔽的细胞因子。
根据本领域已知的标准蛋白质纯化方法,可以采用提供与掩蔽的细胞因子的组分的高亲和力结合的其它纯化方法。
2.使用真核宿主细胞产生掩蔽的细胞因子
用于真核宿主细胞中的载体通常包含以下非限制性组分中的一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
a.信号序列组分
用于真核宿主细胞中的载体还可以含有信号序列或其它在相关成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的多肽。所选择的异源信号序列可以是由宿主细胞识别且处理(即,由信号肽酶切割)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中,哺乳动物信号序列以及病毒分泌引导物(例如,单纯疱疹病毒gD信号)是可用的。
用于此类前体区的DNA在阅读框中接合至编码掩蔽的细胞因子的DNA。
b.复制起点
通常,哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。例如,SV40起点通常可仅因为其含有早期启动子而被使用。
c.选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因,也称为可选标志物。典型选择基因编码满足以下条件的蛋白质:(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如,安比西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性,(b)在相关情况下,补体营养缺陷,或(c)提供不可从复合培养基获得的重要营养物。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且由此经受住选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选标志物的另一个实例是使得能够鉴别有能力吸收编码核酸的掩蔽的细胞因子的细胞的标志物,如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II、灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如,在一些实施例中,通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养全部转化体来首先鉴别用DHFR选择基因转化的细胞。在一些实施例中,当采用野生型DHFR时,适当的宿主细胞是缺失DHFR活性的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary;CHO)细胞系(例如,ATCC CRL-9096)。
可替代地,用编码掩蔽的细胞因子、野生型DHFR蛋白质和另一种可选标志物(如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共同转化的宿主细胞(特别是含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有针对可选标志物(如氨基糖苷抗生素,例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中的细胞生长来选择。参见美国专利第4,965,199号。宿主细胞可以包含NS0,包含缺失谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系。使用GS作为哺乳动物细胞的可选标志物的方法描述于美国专利第5,122,464号和美国专利第5,891,693号。
d.启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子,所述启动子由宿主生物识别且可操作地连接至编码所关注的掩蔽的细胞因子(其可以是本文中任何掩蔽的细胞因子)的核酸。已知真核生物的启动子序列。例如,几乎所有真核基因都具有富含AT的区域,其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区,其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3'端处是AATAAA序列,其可以是用于将聚A尾区添加至编码序列的3'端的信号。在某些实施例中,可以将任何或所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
从哺乳动物宿主细胞中的载体进行的转录例如通过从以下获得的启动子控制:病毒基因组,所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40);异源哺乳动物启动子,例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子;热休克启动子,限制条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段的形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以Hindlll E限制性片段的形式获得。用于使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利第4,419,446号。此系统的修饰描述于美国专利第4,601,978号。还参见Reyes等人,《自然》297:598-601(1982),其描述了在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下人类[3-干扰素cDNA在鼠类细胞中的表达。可替代地,劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可以用作启动子。
e.增强子元件组分
通常通过将增强子序列插入载体中来增加由高等真核生物进行的编码本发明的掩蔽的细胞因子的DNA的转录。现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、a-胎蛋白和胰岛素)知晓许多增强子序列。然而,通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包含复制起点的后侧的SV40增强子(bp 100-270)、人类巨细胞病毒早期启动子增强子、小鼠巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点的后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见Yaniv,《自然》297:17-18(1982)(描述了用于激活真核启动子的增强子元件)。增强子可以在掩蔽的细胞因子编码序列的5'或3'位置处剪接到载体中,但通常位于距启动子5'的位点处。
f.转录终止组分
真核宿主细胞中使用的表达载体还可以含有转录终止和使mRNA稳定所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔地3'非翻译区获得。这些区含有在编码掩蔽的细胞因子的mRNA的非翻译部分中以聚腺苷酸化片段的形式转录的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见W094/11026和其中公开的表达载体。
g.宿主细胞的选择和转化
适用于在本文中的载体中克隆或表达DNA的宿主细胞包含本文中所描述的高级真核细胞,包含脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已变成常规程序。有用哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系;人胚胎肾细胞系(亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞,Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59(1977));小仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980));鼠类支持细胞(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);人宫颈肿瘤细胞(HELA、ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34);布法罗大鼠肝细胞(BEL 3A、ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138、ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2、HB 8065);鼠类乳腺肿瘤(MMT 060562、ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞;以及人肝瘤细胞系(Hep G2)。
用上述用于掩蔽的细胞因子产生的表达或克隆载体转化宿主细胞,并将所述宿主细胞在适当地修改的常规营养培养基中培养,以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。
h.培养宿主细胞
可以在各种培养基中培养用于产生本发明的掩蔽的细胞因子的宿主细胞。可商购获得的培养基如Ham's F10(西格马公司(Sigma))、最低必需培养基((Minimal EssentialMedium,MEM),西格马公司)、RPMI-1640(西格马公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium,DMEM),西格马)适用于培养宿主细胞。另外,在以下文献中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基:Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979);Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980);美国专利第4,767,704号;第4,657,866号;
第A,921,162\4,560,655号或第5,122,469号;第WO 90/03430号;第WO 87/00195号或美国专利Re.30,985。这些培养基中的任一种可以视需要补充有激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。本领域的技术人员将已知,还可以包含适当浓度的任何其它补充剂。培养条件,如温度、pH等,是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件,并且对所属领域的一般技术人员来说将是显而易见的。
i.掩蔽的细胞因子的纯化
当使用重组技术时,掩蔽的细胞因子可以在细胞内产生,或直接分泌至培养基中。如果在细胞内产生掩蔽的细胞因子,那么作为第一步骤,可以例如通过离心或超滤来去除微粒碎片,即宿主细胞或切割片段。当将掩蔽的细胞因子分泌至培养基中时,可以首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如,Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可以在任一前述步骤中包含蛋白酶抑制剂,如PMSF,以抑制蛋白水解,且可以包含抗生素以防止外来污染物的生长。
用细胞制备的掩蔽的细胞因子组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法来纯化,其中亲和色谱是一种便利的技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于掩蔽的细胞因子中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域(如果有的话)的物种和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人类IgGl、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有鼠类同种型和人y3(Guss等人,《欧洲分子生物学会杂志》5:15671575(1986))。与亲和配体连接的基质可以是琼脂糖,但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质,如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯,与琼脂糖相比可以实现更快的流动速率和更短的处理时间。当掩蔽的细胞因子包括CH3结构域时,Bakerbond ABXTM树脂(新泽西州菲利普斯堡马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.))可用于纯化。
取决于待回收的掩蔽的细胞因子,也可以使用其它蛋白质纯化技术,如在离子交换柱上进行的分级、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后,包括所关注的掩蔽的细胞因子和污染物的混合物可以经历进一步纯化,例如通过使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液在低盐浓度(例如,约0-0.25M盐)下执行的低pH疏水性相互作用色谱法。
通常,用于制备用于研究、测试和临床用途的掩蔽的细胞因子的各种方法是本领域中公认的、与上述方法一致和/或被本领域技术人员视为适用于特定关注的掩蔽的细胞因子。
5.组合物
在一些方面,本文还提供了包括本文所描述的IL-12掩蔽的细胞因子中的任一种的组合物。在一些实施例中,组合物包括本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的示例性实施例中的任一种。在一些实施例中,组合物包括本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一种的二聚体。在一些实施例中,组合物是药物组合物。在一些实施例中,组合物包括掩蔽的IL-12细胞因子,并且进一步包括如下文详细描述的组分中的一种或多种组分。例如,在一些实施例中,组合物包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂、张度剂、非离子表面活性剂或洗涤剂、或其它治疗剂或活性化合物或其组合。组合物的各种实施例在本文中有时称为调配物。
通过将具有期望纯度的活性成分与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存的治疗调配物(《雷明顿:药剂学科学与实践(Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy)》,第20版,宾夕法尼亚州费城利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.),Gennaro编,2000)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对受体是无毒的,且包含缓冲剂、抗氧化剂(包含抗坏血酸、甲硫胺酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如,Zn-蛋白质络合物)、螯合剂(如EDTA和/或非离子性表面活性剂)。
可以使用缓冲剂将pH值控制在使治疗有效性最佳化的范围内,尤其在稳定性是pH值依赖性的情况下。缓冲剂可以按约50mM至约250mM范围内的浓度存在。适合与本发明一起使用的缓冲剂包含有机和无机酸以及其盐。例如,柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外,缓冲剂可以包括组氨酸和三甲胺盐,如Tris。
可以添加防腐剂以防止微生物成长,且通常以约0.2%-1.0%(w/v)的范围存在。通常与治疗剂一起使用的合适的防腐剂的实例包含十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲铵;苯扎氯铵卤化物(例如,氯化物、溴化物、碘化物);苄索氯铵;硫柳汞、苯酚、丁基或苄醇;对羟基苯甲酸烷基酯,如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇、3-戊醇、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、乙醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝醇、苯甲酸、咪脲、氯己定、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯以及氯苯甘醚(3对氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)。
可以存在张力剂,有时被称为“稳定剂”,以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型、带电生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时,其通常被称为“稳定剂”,因为其可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用,由此减少分子间和分子内相互作用的可能性。
考虑到其它成分的相对量,张力剂可以按约0.1%至约25重量%之间或约1至约5重量%之间的任何量存在。在一些实施例中,张力剂包含多羟基糖醇、三羟基或更高级糖醇,如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其它赋形剂包含可以充当以下中的一种或多种的药剂:(1)膨胀剂,(2)溶解性增强剂,(3)稳定剂,以及(4)防止变性或粘附至容器壁的药剂。此类赋形剂包含:多羟基糖醇(上文列举);氨基酸,如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等;有机糖或糖醇,如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如,纤维醇)、聚乙二醇;含有硫的还原剂,如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油和硫基硫酸钠;低分子量蛋白质,如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;单糖(例如,木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖);双糖(例如,乳糖、麦芽糖、蔗糖);三糖,如棉籽糖;以及多糖,如糊精或葡聚糖。
可以存在非离子性表面活性剂或洗涤剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质避免搅拌诱导的聚集,其亦允许调配物暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子性表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。在一些实施例中,非离子性表面活性剂以约0.001%至约0.1%w/v,或约0.01%至约0.1%w/v,或约0.01%至约0.025%w/v的范围存在。
适合的非离子表面活性剂包含聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(等)、聚桂醇400,聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包含月桂基硫酸钠、十六烷磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将调配物用于体内施用,其必须是无菌的。可以借助于通过无菌过滤膜过滤来是调配物变得无菌。本文中的治疗性组合物通常置放于具有无菌接入端口的容器中,例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知的和可接受的方法,如通过在长时段内以合适的方式进行单次或多次团注或输注,例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径进行注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子中的任一种如在本文所描述的方法中可以单独使用或与其它治疗剂组合使用。术语“与…组合”涵盖相同或单独的调配物中所包含的两种或更多种治疗剂(例如,掩蔽的IL-12细胞因子和治疗剂)。在一些实施例中,“与…组合”是指“同时”施用,在这种情况下,本发明的掩蔽的IL-12细胞因子的施用与一种或多种另外的治疗剂的施用同时进行(例如,在相同时间或在掩蔽的IL-12细胞因子的施用与一种或多种另外的治疗剂的施用之间的一小时内)。在一些实施例中,“与…组合”是指按顺序施用,在这种情况下,本发明的掩蔽的IL-12细胞因子的施用在一种或多种另外的治疗剂的施用之前和/或之后进行(例如,掩蔽的IL-12细胞因子的施用与一种或多种另外的治疗剂的施用之间大于一小时)。本文中所涵盖的药剂包含但不限于细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子的药剂、靶向免疫刺激性分子的药剂、生长抑制剂、免疫刺激剂、抗炎剂或抗癌剂。
本文中的调配物还可以含有超过一种视需要用于所治疗的具体适应症的活性化合物,优选地具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性化合物。可替代地或另外,组合物可以包括细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子或刺激性分子的药剂、生长抑制剂、免疫刺激剂、抗炎剂或抗癌剂。此类分子宜以有效用于预期目的的量以组合方式存在。
调配物可以以任何合适的状态呈现,如液体调配物、固态(冻干)调配物或冷冻调配物。用于制备这些类型的调配物中的每一种以用于治疗用途的方法是本领域众所周知的。
6.治疗方法
本文提供了用于治疗或预防受试者的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子或其组合物。在一些实施例中,提供了用于治疗或预防受试者的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用本文所描述的任何组合物。在一些实施例中,受试者(例如,人类患者)已被诊断患有癌症或处于患上此类病症的风险中。在一些实施例中,提供了用于治疗或预防受试者的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子或其组合物,其中掩蔽的IL-12细胞因子在用酶切割后被激活。在一些实施例中,在肿瘤微环境下激活掩蔽的IL-12细胞因子。掩蔽的IL-12细胞因子在切割后具有治疗活性。因此,在一些实施例中,活性剂是切割产物。
对于疾病的预防或治疗,活性剂的适当剂量将取决于如本文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、药剂是出于预防还是治疗目的施用、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂的应答以及主治医生的考量。适当地一次性或在一系列治疗中向受试者施用药剂。
在本文所描述的方法的一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的施用之间的时间间隔为约一周或更长时间。在本文所描述的方法的一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的施用之间的时间间隔为约两天或更长时间、约三天或更长时间、约四天或更长时间、约五天或更长时间或约六天或更长时间。在本文所描述的方法的一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的施用之间的时间间隔为约一周或更长时间、约两周或更长时间、约三周或更长时间或约四周或更长时间。在本文所描述的方法的一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子的施用之间的时间间隔为约一个月或更长时间、约两个月或更长时间或约三个月或更长时间。如本文所使用的,施用之间的时间间隔是指掩蔽的IL-12细胞因子的一次施用与掩蔽的IL-12细胞因子的下一次施用之间的时间段。如本文所使用的,约一个月的时间间隔包含四周。在一些实施例中,治疗包含掩蔽的IL-12细胞因子的多次施用,其中施用之间的时间间隔可以变化。例如,在一些实施例中,第一次施用与第二次施用之间的时间间隔为约一周,并且后续施用之间的时间间隔为约两周。在一些实施例中,第一次施用与第二次施用之间的时间间隔为约两天、三天、四天或五天或六天,并且后续施用之间的时间间隔为约一周。
在一些实施例中,在一段时间内在多种情况下施用掩蔽的IL-12细胞因子。在一些实施例中,在多种情况下施用于受试者的剂量可以为每次施用的相同剂量,或在一些实施例中,掩蔽的细胞因子可以以两种或更多种不同剂量施用于受试者。例如,在一些实施例中,掩蔽的IL-12细胞因子最初在一种或多种情况下以一个剂量施用,并且随后在稍后的时间点开始的一种或多种情况下以第二剂量施用。
在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽以均匀剂量施用。在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽以每剂约25mg至约500mg的剂量施用于受试者。在一些实施例中,掩蔽的IL-12多肽按以下剂量施用于受试者:每剂约25mg至约50mg、约50mg至约75mg、约75mg至约100mg、约100mg至约125mg、约125mg至约150mg、约150mg至约175mg、约175mg至约200mg、约200mg至约225mg、约225mg至约250mg、约250mg至约275mg、约275mg至约300mg、约300mg至约325mg、约325mg至约350mg、约350mg至约375mg、约375mg至约400mg、约400mg至约425mg、约425mt至约450mg、约450mg至约475mg或约475mg至约500mg。
在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽以基于受试者的重量或体表面积(BSA)的剂量施用于受试者。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的掩蔽的IL-12多肽可以是施用于患者的初始候选剂量,无论是通过例如一次或多次单独施用,还是通过连续输注。取决于上文所提及的因素,一种典型的每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于数天或更长时间内的重复施用,取决于病状,治疗通常会持续到出现疾病症状的期望抑制。掩蔽的IL-12多肽的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此,可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽以每剂约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约10mg/kg的剂量施用于受试者。在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽按以下中的任一者的剂量施用于受试者:约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg或10.0mg/kg。在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的IL-12多肽按以下剂量施用于受试者:约或至少约0.1mg/kg、约或至少约0.5mg/kg、约或至少约1.0mg/kg、约或至少约1.5mg/kg、约或至少约2.0mg/kg、约或至少约2.5mg/kg、约或至少约3.0mg/kg、约或至少约3.5mg/kg、约或至少约4.0mg/kg、约或至少约4.5mg/kg、约或至少约5.0mg/kg、约或至少约5.5mg/kg、约或至少约6.0mg/kg、约或至少约6.5mg/kg、约或至少约7.0mg/kg、约或至少约7.5mg/kg、约或至少约8.0mg/kg、约或至少约8.5mg/kg、约或至少约9.0mg/kg、约或至少约9.5mg/kg、约或至少约10.0mg/kg、约或至少约15.0mg/kg、约或至少约20mg/kg、约或至少约30mg/kg、约或至少约40mg/kg、约或至少约50mg/kg、约或至少约60mg/kg、约或至少约70mg/kg、约或至少约80mg/kg、约或至少约90mg/kg或约或至少约100mg/kg。可以使用上述给药频率中的任一种。
本文所考虑的治疗方法是用本文所描述的掩蔽的IL-12细胞因子或组合物中的任一种治疗病症或疾病,如癌症。可以用本发明的调配物治疗的病症或疾病包含白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如,梅克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma))或睾丸癌。
在一些实施例中,本文提供了通过施用本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子或组合物来治疗或预防癌症的方法。在一些实施例中,本文提供了通过施用本文所描述的任何IL-12掩蔽的细胞因子或组合物与抗癌剂组合来治疗或预防癌症的方法。抗癌剂可以是能够减少癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀死癌细胞、减少转移、减少肿瘤血液供应或减少细胞存活的任何药剂。在一些实施例中,抗癌剂选自由以下组成的组:PD-1抑制剂、EGFR抑制剂、HER2抑制剂、VEGFR抑制剂、CTLA-4抑制剂、BTLA抑制剂、B7H4抑制剂、B7H3抑制剂、CSFIR抑制剂、HVEM抑制剂、CD27抑制剂、KIR抑制剂、NKG2A抑制剂、NKG2D激动剂、TWEAK抑制剂、ALK抑制剂、CD52靶向抗体、CCR4靶向抗体、PD-L1抑制剂、KIT抑制剂、PDGFR抑制剂、BAFF抑制剂、HD AC抑制剂、VEGF配体抑制剂、CD19靶向分子、FOFR1靶向分子、DFF3靶向分子、DKK1靶向分子、MUC1靶向分子、MUG 16靶向分子、PSMA靶向分子、MSFN靶向分子、NY-ES0-1靶向分子、B7H3靶向分子、B7H4靶向分子、BCMA靶向分子、CD29靶向分子、CD151靶向分子、CD 123靶向分子、CD33靶向分子、CD37靶向分子、CDH19靶向分子、CEA靶向分子、Claudin18.2靶向分子、CFEC12A靶向分子、EGFRVIII靶向分子、EPCAM靶向分子、EPHA2靶向分子、FCRH5靶向分子、FLT3靶向分子、GD2靶向分子、磷脂酰肌醇聚糖3靶向分子、gpA33靶向分子、GPRC5D靶向分子、IL-123R靶向分子、IL-1RAP靶向分子、MCSP靶向分子、RON靶向分子、ROR1靶向分子、STEAP2靶向分子、TfR靶向分子、CD166靶向分子、TPBG靶向分子、TROP2靶向分子、蛋白酶体抑制剂、ABE抑制剂、CD30抑制剂、FLT3抑制剂、MET抑制剂、RET抑制剂、IL-13抑制剂、MEK抑制剂、ROS1抑制剂、BRAE抑制剂、CD38抑制剂、RANKE抑制剂、B4GALNT1抑制剂、SLAMF7抑制剂、IDH2抑制剂、mTOR抑制剂、CD20靶向抗体、BTK抑制剂、PI3K抑制剂、FLT3抑制剂、PARP抑制剂、CDK4抑制剂、CDK6抑制剂、EGFR抑制剂、RAF抑制剂、JAK1抑制剂、JAK2抑制剂、JAK3抑制剂、IL-6抑制剂、IL-17抑制剂、平滑化抑制剂、IL-6R抑制剂、BCL2抑制剂、PTCH抑制剂、PIGF抑制剂、TGFB抑制剂、CD28激动剂、CD3激动剂、CD40激动剂、GITR激动剂、0X40激动剂、VISTA激动剂、CD137激动剂、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂、TIGIT抑制剂和IL-12R抑制剂。
在一些实施例中,本文提供了通过施用本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子与抗炎剂组合来治疗或预防癌症的方法。抗炎剂可以是能够预防、抵消、抑制或以其它方式减少炎症的任何药剂。
在一些实施例中,抗炎剂是环氧化酶(COX)抑制剂。COX抑制剂可以是抑制COX-1和/或COX-2的活性的任何药剂。在一些实施例中,COX抑制剂选择性抑制COX-1(即,COX抑制剂抑制COX-1的活性多于其抑制COX-2的活性)。在一些实施例中,COX抑制剂选择性抑制COX-2(即,COX抑制剂抑制COX-2的活性多于其抑制COX-1的活性)。在一些实施例中,COX抑制剂抑制COX-1和COX-2两者。
在一些实施例中,COX抑制剂是选择性COX-1抑制剂并且选自由以下组成的组:SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸、TFAP、氟比洛芬和酮洛芬。在一些实施例中,COX抑制剂是选择性COX-2抑制剂并且选自由以下组成的组:塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、德拉昔布(deracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、依托昔布(etoricoxib)、色烯衍生物、色满衍生物、N-(2-环己氧基硝基苯基)甲烷磺酰胺、帕瑞昔布、罗美昔布(lumiracoxib)、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利(nimesulide)、弗洛舒利(flosulide)、NS-398、L-745337、RWJ-63556、L-784512、达布飞龙(darbufelone)、CS-502、LAS-34475、LAS-34555、S-33516、双氯芬酸、甲灭酸和SD-8381。在一些实施例中,COX抑制剂选自由以下组成的组:布洛芬、萘普生、酮咯酸、吲哚美辛、阿司匹林、萘普生、托美汀、吡罗昔康和甲氯芬酸。在一些实施例中,COX抑制剂选自由以下组成的组:SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸、TFAP、氟比洛芬、酮洛芬、塞来昔布、罗非昔布、美洛昔康、吡罗昔康、德拉昔布、帕瑞昔布、伐地昔布、依托昔布、色烯衍生物、色满衍生物、N-(2-环己氧基硝基苯基)甲烷磺酰胺、帕瑞昔布、罗美昔布、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利、弗洛舒利、NS-398、L-745337、RWJ-63556、L-784512、达布飞龙、CS-502、LAS-34475、LAS-34555、S-33516、双氯芬酸、甲灭酸、SD-8381、布洛芬、萘普生、酮咯酸、吲哚美辛、阿司匹林、萘普生、托美汀、吡罗昔康和甲氯芬酸。
在一些实施例中,抗炎剂是NF-KB抑制剂。NF-KB抑制剂可以是抑制NF-KB途径的活性的任何药剂。在一些实施例中,NF-KB抑制剂选自由以下组成的组:IKK复合物抑制剂、IKB降解抑制剂、NF-KB核转位抑制剂、p65乙酰化抑制剂、NF-KB DNA结合抑制剂、NF-KB反式激活抑制剂和p53诱导抑制剂。
在一些实施例中,IKK复合物抑制剂选自由以下组成的组:TPCA-1、NF-KB激活抑制剂VI(BOT-64)、BMS-345541、氨来呫诺(amlexanox)、SC-514(GK-01140)、IMD-0354和IKK-16。在一些实施例中,IKB降解抑制剂选自由以下组成的组:BAY-11-7082、MG-115、MG-132、乳胞素、环氧霉素、小白菊内酯、卡非佐米(carfilzomib)和MLN-4924(pevonedistat)。在一些实施例中,NF-KB核转位抑制剂选自由以下组成的组:JSH-23和咯利普兰(rolipram)。在一些实施例中,p65乙酰化抑制剂选自由以下组成的组:没食子酸和漆树酸。在一些实施例中,NF-KBDNA结合抑制剂选自由以下组成的组:GYY-4137、p-XSC、CV-3988和前列腺素E2(PGE2)。在一些实施例中,NF-KB反式激活抑制剂选自由以下组成的组:LY-294002、渥曼青霉素(wortmannin)和美沙拉明(mesalamine)。在一些实施例中,p53诱导抑制剂选自由以下组成的组:奎纳克林(quinacrine)和夫拉平度(flavopiridol)。在一些实施例中,NF-KB抑制剂选自由以下组成的组:TPCA-1、NF-KB激活抑制剂VI(BOT-64)、BMS-345541、氨来呫诺、SC-514(GK-01140)、IMD-0354、IKK-16、BAY-11-7082、MG-115、MG-132、乳胞素、环氧霉素、小白菊内酯、卡非佐米、MLN-4924(pevonedistat)、JSH-23、咯利普兰、没食子酸、漆树酸、GYY-4137、p-XSC、CV-3988、前列腺素E2(PGE2)、LY-294002、渥曼青霉素、美沙拉明、奎纳克林和夫拉平度。
在一些实施例中,本文提供了通过施用本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子或组合物与抗癌治疗性蛋白质组合来治疗或预防癌症的方法。抗癌治疗性蛋白质可以是能够减少癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀死癌细胞、减少转移、减少肿瘤血液供应或减少细胞存活的任何治疗性蛋白质。示例性抗癌治疗性蛋白质可以呈抗体或其片段、抗体衍生物、双特异性抗体、嵌合抗原受体(CAR)T细胞、融合蛋白或双特异性T细胞接合子(BiTE)的形式。在一些实施例中,本文提供了通过施用本文所描述的任何掩蔽的IL-2细胞因子或组合物与CAR-NK(自然杀伤)细胞组合来治疗或预防癌症的方法。
7.制品或试剂盒
另一方面,提供了一种包括本文所描述的任何掩蔽的IL-12细胞因子的制品或试剂盒。制品或试剂盒可以进一步包括在本发明的方法中使用细胞因子的说明。因此,在某些实施例中,制品或试剂盒包括用于治疗或预防个体的病症(例如,癌症)的方法中使用掩蔽的细胞因子的说明,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的细胞因子。例如,在某些实施例中,制品或试剂盒包括用于治疗或预防个体的病症(例如,癌症)的方法中使用掩蔽的IL-12多肽的说明,所述方法包括向个体施用有效量的掩蔽的IL-12多肽。在某些实施例中,个体是人。在一些实施例中,个体患有选自由以下组成的群组的疾病:白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
制品或试剂盒可以进一步包括容器。合适的容器包含例如瓶子、小瓶(例如,双室小瓶)、注射器(如单室注射器或双室注射器)、试管和静脉内(IV)袋。容器可以由多种材料形成,如玻璃或塑料。容器收纳调配物。在一些实施例中,调配物是冻干调配物。在一些实施例中,调配物是冷冻调配物。在一些实施例中,调配物是液体调配物。
制品或试剂盒可以进一步包括容器上或与容器相关联的标签或包装插页,其可以指示重组和/或使用调配物的说明。标签或包装插页可以进一步指示调配物适用于或意图用于皮下、静脉内或其它施用模式,以用于治疗或预防个体中的病症(例如,癌症)。收纳调配物的容器可以是单次使用式小瓶或多次使用式小瓶,其允许被复原的调配物的重复施用。制品或试剂盒可以进一步包括第二容器,其包含合适的稀释剂。制品或试剂盒可以进一步包含由市售、治疗和使用者观点看来合乎需要的其它材料,包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在特定实施例中,本发明提供用于单剂量施用单元的试剂盒。此类试剂盒包括治疗性细胞因子的水性调配物的容器,包含单室预填充注射器或多室预填充注射器两者。示例性预填充注射器可以从德国拉芬斯堡Vetter GmbH公司(Vetter GmbH,Ravensburg,Germany)获得。
本文的制品或试剂盒任选地进一步包括包含第二药物的容器,其中掩蔽的细胞因子是第一药物,并且所述制品或试剂盒进一步包括用于以有效量用第二药物治疗受试者在标签或包装说明书上的说明。
在另一实施例中,本文中提供制品或试剂盒,其包括用于在自动注射器装置中施用的本文中所描述的调配物。自动注射器可以被描述为在启动后将递送其内含物,而无需患者或管理员采取其它必要措施的注射装置。其在递送速率必须是恒定的且递送时间超过数分钟时尤其适于治疗性调配物的自行给药。
8.定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语、符号以及其它技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常所理解含义的相同的含义。在一些情况下,为了清楚和/或便于参考起见,本文对具有通常理解的含义的术语进行了定义,并且本文中包含这些定义不应被必然解释为代表与本领域通常理解的含义有实质性差异。
应当理解,本发明不限于当然可能发生变化的特定组合物或生物系统。还应理解,本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例,并且不打算作为限制。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的,除非内容另外明确指明,否则单数形式的“一个/种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指示物。因此,例如,提及“IL-12多肽”任选地包含两种或更多种此类多肽的组合等。
如本文中所使用的,术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包含(且描述)针对所述值或参数本身的实施例。
应当理解,本文所描述的本发明的方面和实施例包含“包括方面和实施例”、“由方面和实施例组成”以及“基本上由方面和实施例组成”。
如本文所使用的,术语“和/或”是指与所述术语相关联的项中的任何一个项、所述项的任何组合或所有的项。例如,短语“A、B和/或C”旨在涵盖以下实施例中的每个实施例:A、B和C;A、B或C;A或B;A或C;B或C;A和B;A和C;B和C;A和B或C;B和A或C;C和A或B;A(单独);B(单独);和C(单独)。
术语“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体(包含具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如,双特异性抗体、双体和单链分子)以及抗体片段(例如,Fab、F(ab')2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”与互换使用。
术语“双体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,所述抗原结合位点包括与相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变(VL)结构域连接的重链可变(VH)结构域。
碱性4链抗体单元是由两个相同轻(L)链和两个相同重(H)链构成的杂四聚糖蛋白。IgM抗体由5个碱性异四聚体单元和称为J链的其它多肽组成,且含有10个抗原结合位点,而IgA抗体包括2-5个碱性4链单元,所述单元可以聚合以与J链组合形成多价集合物。在IgG的情况下,4链单元通常是约150,000道尔顿(dalton)。各L链通过一个共价二硫键连接至H链,而视H链同种型而定,两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。各H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。各H链在N末端具有可变结构域(VH),随后是a链和y链中每条链的三个恒定结构域(CH),以及p同种型和s同种型的四个CH结构域。各L链在N末端具有可变结构域(VL),接着在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐,并且CL与重链的第一恒定结构域(CHI)对齐。相信具体的氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对共同形成单一抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和性质,参见例如《基础临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和TristramG.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列,免疫球蛋白可以指定为不同种类或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,具有分别命名为a、8、e、y和p的重链。根据CH序列和功能的相对较小的差异,y类和a类被进一步分成子类,例如,人表达以下子类:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以存在于称为同种异型的多种多态性变体中(在Jefferis和Lefranc 2009.mAb第1卷第4期1-7中综述),所述多态性变体中的任一种多态性变体均适用于本发明。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z标示的变体。
“被分离的”抗体是已从其生产环境的组分鉴别、分离和/或回收(例如,天然地或以重组方式)的抗体。在一些实施例中,被分离的多肽与其生产环境中的所有其它组分无关。其生产环境中的污染物组分(如由重组转染细胞产生)是将通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料,且可以包含酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中,多肽被纯化:(1)达到大于抗体的95重量%,如通过例如劳里法(Lowry method)测定,并且在一些实施例中,达到大于99重量%;(1)通过使用旋杯式测序仪,达到足以获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列的程度,或(3)使用考马斯(Coomassie)蓝或银染色,在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE,达到均质。被分离的抗体包含在重组细胞内的原位抗体,因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而,通常通过至少一个纯化步骤制备被分离的多肽。
如本文中所使用的,术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体,即,除可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如,异构化、酰胺化)以外,包括所述群体的各个抗体是相同的。在一些实施例中,单克隆抗体在重链和/或轻链处具有C末端切割。例如,在重链和/或轻链的C末端处,1、2、3、4或5个氨基酸残基切割。在一些实施例中,C末端切割从重链去除C末端赖氨酸。在一些实施例中,单克隆抗体在重链和/或轻链处具有N末端切割。例如,在重链和/或轻链的N末端处,1、2、3、4或5个氨基酸残基切割。在一些实施例中,可以通过重组技术来制备单克隆抗体的截短形式。在一些实施例中,单克隆抗体针对单一抗原位点具有高特异性。在一些实施例中,单克隆抗体针对多个抗原位点具有高特异性(如双特异性抗体或多特异性抗体)。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本同源的抗体群体获得,并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备,包含例如融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示技术以及用于在具有一部分或所有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人类或人类样抗体的技术。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可以互换地用于指相对于抗体片段,呈基本上完整形式的抗体。具体地说,完全抗体包含具有包含Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是原生序列恒定结构域(例如,人类原生序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下,完整抗体可以具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分,如完整抗体的抗原结合区和/或可变区,和/或完整抗体的恒定区。抗体片段的实例包含抗体的Fc区、Fc区的一部分或包括Fc区的抗体的一部分。抗原结合抗体片段的实例包含结构域抗体(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段;双体;线性抗体(参见美国专利第5,641,870号,实例2;Zapata等人,《蛋白质工程(ProteinEng.)》8(10):1057-1062[1995]);单链抗体分子,以及由抗体片段形成的多特异性抗体。单重链抗体或单轻链抗体可以被工程改造,或在重链的情况下,可以从被工程改造成产生单重链分子的骆驼、鲨鱼、库或小鼠分离。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,以及残余的“Fc”片段,此名称反映易于结晶的能力。Fab片段由整个L链以及H链可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CHI)组成。各Fab片段相对于抗原结合是单价的,即,其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段,其大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段,并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的CHI结构域的羧基末端处具有几个另外的残基。Fab'-SH是本文对于Fab'的命名,其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初是作为成对的Fab'片段产生的,其之间具有铰链半胱氨酸。还已知抗体片段的其它化学偶合。Fc片段包括通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列和聚糖决定,所述区域也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(%)”被定义为在比对序列且视需要引入空位以实现最大序列一致性百分比且不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分之后,候选序列中的与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以由所属领域的技术内的各种方式实现,例如使用可公开获得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数,包含在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如,给定氨基酸序列A与(to/with)或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性%(所述氨基酸序列同一性%可以可替代地表述为给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B具有或包括一定的氨基酸序列同一性%)计算如下:
100乘以分数X/Y
其中X是由所述程序的A和B的比对中的序列评分为相同匹配的氨基酸残基的数量,并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解,当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A到B的氨基酸序列同一性%将不等于B到A的氨基酸序列同一性%。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性,并随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包含:Clq结合和补体依赖性细胞毒性;Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如,B细胞受体)的下调和B细胞激活。
如本文所使用的,“结合亲和力”是指分子(例如,细胞因子)的单个结合位点与其结合配偶体(例如,细胞因子受体)之间的非共价相互作用的强度。在一些实施例中,结合蛋白(例如,细胞因子)的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常用方法,包含本文中所描述的方法来测量。
编码本文所描述的细胞因子多肽的“分离的”核酸分子是经鉴定并与至少一种在其产生的环境中通常与之相关联的污染物核酸分子分离的核酸分子。在一些实施例中,被分离的核酸与和生产环境相关联的所有组分都无关。编码本文中的多肽和细胞因子多肽的分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中发现的形式或环境。因此,分离的核酸分子区别于编码本文中天然存在于细胞中的多肽和细胞因子多肽的核酸。
术语“医药调配物”是指呈允许活性成分的生物活性有效,并且不含对将被施用所述调配物的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。
此类调配物是无菌的。
如本文所使用的“载体”包含在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载体通常是水性pH值缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包含缓冲液,如磷酸、柠檬酸和其它有机酸;包含抗坏血酸的抗氧化剂;低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖和其它碳水化合物,包含葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如EDTA;糖醇,如甘露糖醇或山梨糖醇;成盐相对离子,如钠;和/或非离子性表面活性剂,如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文中所使用的,术语“治疗”是指被设计成在临床病理学过程期间改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入。合乎需要的治疗作用包含降低疾病进展率、改善或减轻疾病病况以及缓解或改善预后。例如,如果与病症(例如,赘生性疾病)相关联的一种或多种症状得到缓解或消除,那么成功地“治疗”个体。例如,如果治疗引起罹患疾病的个体的生活质量提高、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、降低疾病的复发频率、减轻疾病的严重程度、延缓疾病的发展或进展和/或延长个体的存活期,那么成功地“治疗”个体。
如本文中所使用的,“与…结合”或“与…组合”是指施用除一种治疗方法以外的另一种治疗方法。因此,“与…结合”或“与…组合”是指在向个体施用一种治疗方法之前、期间或之后施用另一种治疗方法。
如本文中所使用的,术语“预防”包含提供与个体中的疾病的发生或复发相关的防治。个体可能易患病症、对病症敏感或具有产生病症的风险,但尚未被诊断患有病症。在一些实施例中,本文所描述的掩蔽的细胞因子用于延迟病症的发展。
如本文中所使用的,“具有产生病症的风险”的个体在本文中所描述的治疗方法之前可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状,且可能显示或可能不显示可检测的疾病或疾病症状。“具有风险”表示个体具有一种或多种风险因素,所述风险因素是与疾病的发展相关的可测量的参数,如所属领域中已知。具有这些风险因素中的一种或多种的个体与不具有这些风险因素中的一种或多种的个体相比具有更高的产生病症的可能性。
“有效量”是指至少在必需的剂量和时段下有效实现所需或所指示的作用,包含治疗性或预防性结果的量。
可以按一次或多次施用的方式来提供有效量。“治疗有效量”至少是实现特定病症的可测量的改善所需的最小浓度。在本文中,治疗有效量可以根据如疾病病况、患者的年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望反应的能力等因素而变化。治疗有效量也可以是其中掩蔽的细胞因子的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所抵消的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时段下有效实现期望预防性结果的量。通常但未必,因为预防性剂量是在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者,所以预防有效量小于治疗有效量。
“慢性”施用是指以与急性模式相反的连续的药物施用,以便在延长的时间段内维持初始治疗效果(活性)。“间歇性”施用是在不中断的情况下非连续地进行,但实际性质是循环性的治疗。
如本文中所使用的,“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗的目的,“哺乳动物”包含人类、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物,如犬、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施例中,个体或受试者是人。
9.实例
通过参考以下实例将更充分地理解本发明。然而,其不应被解释为限制本发明的范围。应理解,本文中所描述的实例和实施例是仅出于说明性目的,并且根据其进行的各种修改或改变将由所属领域的技术人员想到并且包含在本申请案的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。
尽管一些实例描述了IL-2多肽构建体的“掩蔽的”版本的工程化、产生和/或测试,但一些实例还采用IL-2多肽构建体的亲本“非掩蔽的”版本,如用于比较,或包含作为对照测试的本文所描述的组分中的一种或多种组分的其它构建体以进行比较。因此,对例如对掩蔽的IL-2多肽构建体进行的测试的描述不一定意指也未测试构建体的非掩蔽的版本。
实例1:掩蔽的IL-2多肽的工程化
根据本文的教导生成掩蔽的IL-2多肽。在随后的实例中,一些实验涉及单体形式的掩蔽的IL-2多肽构建体的用途,并且一些实验涉及二聚体形式的掩蔽的IL-2构建体的用途,如通过连接相同掩蔽的多肽构建体(同二聚体)的两个拷贝的二硫键形成的二聚体,或由两种不同多肽形成的异二聚体(参见例如,表5)。
产生包含IL-2多肽或其功能片段、掩蔽部分和半衰期延长结构域,如抗体或其片段(例如,Fc区、重链和/或轻链)的掩蔽的IL-2多肽构建体。还产生了一些包含与半衰期延长结构域连接的IL-2多肽或其功能片段,而不包含掩蔽部分的IL-2多肽构建体。构建体中的一些构建体还包含接头,所述接头包括可切割肽并将掩蔽部分与IL-2多肽或其功能片段连接,由此产生可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体。构建体中的一些构建体还包含将IL-2多肽或其功能片段与半衰期延长结构域连接的接头。构建体中的一些构建体还包含将IL-2多肽或其功能片段与掩蔽部分连接的接头。在将IL-2多肽或其功能片段与掩蔽部分连接的接头中不包含可切割肽的掩蔽的IL-2多肽构建体还被称为不可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体或不可激活的IL-2多肽构建体,因为其不包含可切割肽。表3中提供了示例性IL-2多肽构建体的结构和组合物。
表3:
构建体编号 | 构建体(N末端方向至C末端方向) |
AK032 | H-C |
AK035 | H-C |
还生成了掩蔽的IL-2多肽构建体,其包含IL-2多肽或其功能片段、第一掩蔽部分、第二掩蔽部分和半衰期延长结构域,如白蛋白、抗体或其片段(例如,Fc区、重链和/或轻链)、白蛋白结合肽、IgG结合肽或聚氨基酸序列。构建体中的一些构建体还包含接头,所述接头将第一掩蔽部分与IL-2多肽或其功能片段连接。构建体中的一些构建体还包含接头,所述接头将第二掩蔽部分与IL-2多肽或其功能片段连接。构建体中的一些构建体包含将第一掩蔽部分与IL-2多肽或其功能片段连接的接头和/或将第二掩蔽部分与IL-2多肽或其功能片段连接的接头中的可切割肽,由此产生可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体。构建体中的一些构建体还包含将第二掩蔽部分与半衰期延长结构域连接的接头。将IL-2多肽或其功能片段与第一掩蔽部分或第二掩蔽部分连接的接头中任一个不包含可切割肽的掩蔽的IL-2多肽构建体还被称为不可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体或不可激活的IL-2多肽构建体,因为其不包含可切割肽。表4中提供了示例性IL-2多肽构建体的结构和组合物。
表4:
还生成了包含IL-2多肽或其功能片段、掩蔽部分、第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域、抗体或其片段(例如,Fc区、重链和/或轻链)的掩蔽的IL-2多肽构建体。掩蔽部分与第一半衰期延长结构域连接,IL-2多肽或其功能片段与第二半衰期延长结构域连接,并且第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域含有促进第一延长结构域和第二半衰期延长结构域的缔合的修饰。在一个示例性实施例中,掩蔽部分与第一半衰期延长结构域连接,并且IL-2多肽或其功能片段与第二半衰期延长结构域连接,并且第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域含有促进第一延长结构域和第二半衰期延长结构域的缔合的修饰。在非掩蔽的IL-2多肽构建体的一个示例性实施例中,所述实施例包括与第一半衰期延长结构域连接的IL-2多肽或其功能片段,并且包括第二半衰期延长结构域,其中IL-2多肽或其功能片段与第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域连接。构建体中的一些构建体还包含将掩蔽部分与第一半衰期延长结构域连接的接头,和/或将IL-2多肽或其功能片段与第二半衰期延长结构域连接的接头。构建体中的一些构建体的第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域也连接在一起。在一些构建体中,构建体中的一些构建体的第一半衰期延长结构域和第二半衰期延长结构域通过接头连接。构建体中的一些构建健体包含将掩蔽部分与第一半衰期延长结构域连接的接头和/或将IL-2多肽或其功能片段与第二半衰期延长结构域连接的接头中的可切割肽,由此产生可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体。在将IL-2多肽或其功能片段与第二半衰期延长结构域连接的接头中或在将掩蔽部分与第一半衰期延长结构域连接的接头中不包含可切割肽的掩蔽的IL-2多肽构建体还被称为不可激活的掩蔽的IL-2多肽构建体或不可激活的IL-2多肽构建体,因为其不包含可切割肽。表5中提供了示例性IL-2多肽构建体的结构和组合物。
表5
实例2:掩蔽的IL-2的体外表征
在体外使用若干细胞和功能测定法表征实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体。
产生
将编码构建体(例如,掩蔽的IL-2多肽构建体)的质粒转染到Expi293细胞(生命技术公司(Life Technologies)A14527)或HEK293-6E细胞(国家研究委员会(NationalResearch Council;NRC)中。使用PEIpro(经纪公司(Polyplus)转染,115-100)使用1mg的总DNA以1:1的比率与总DNA进行转染。将DNA和PEI各自添加到50mL的OptiMem(生命技术公司31985088)培养基中并且无菌过滤。将DNA和PEI组合持续10分钟,并添加到分别对于expi293细胞或HEK293细胞的细胞密度为1.8-2.8x106个细胞/mL或0.85-1.20x106个细胞/m的Expi293细胞中,并且活力为至少95%。按照用于Expi293转染的相同方案,以为至少95%的细胞密度和活力进行HEK293-6E转染。在5-7天之后,通过以3000x g离心使细胞沉淀,并将上清液通过0.2μm膜进行过滤。将蛋白A树脂(科帕奇公司(CaptivA),Repligen CA-PRI-0005)添加到经过滤的上清液中,并在4℃下摇晃温育持续至少2小时。将树脂包装到柱中,用15柱体积的20mM柠檬酸盐、pH 6.5洗涤,并且然后用15柱体积的20mM柠檬酸盐、500mM氯化钠、pH 6.5洗涤。用20mM柠檬酸盐、100mM NaCl、pH 2.9从柱中洗脱结合的蛋白质。
下表6中提供了包含亲本(例如,非掩蔽的)和掩蔽的构建体的所产生的示例性构建体的滴度(mg/L)。
表6
SDS-PAGE分析
对于SDS-PAGE分析,将蛋白质样品用4x Laemmli样品缓冲液(伯乐公司(BioRad)目录号1610747)制备。对于经还原的样品,添加0.1M Bond Breaker TCEP溶液(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)77720),并将样品在65℃下加热持续5分钟。将蛋白质加载到12孔NuPage 4-12%Bis-Tris蛋白凝胶(英杰公司(Invitrogen)NP0322BOX)中,其中每孔加载4μg的蛋白质。使用SimplyBlue SafeStain(英杰公司LC6065)染色凝胶。
如在图4中所描绘的,在产生和纯化示例性构建体(AK304、AK305、AK307、AK308、AK309、AK310、AK311、AK312、AK313、AK314和AK315)之后,对流通(FT)样品(即,不与蛋白质A柱结合的蛋白质)和洗脱的(E)样品(即,与蛋白质A柱结合并从其洗脱的蛋白质)执行SDS-PAGE分析。此示例性数据证明,可以成功产生并纯化如本文所描述的构建体。
报告生物测定
在掩蔽的IL-2多肽构建体以及非掩蔽的亲本构建体或其它对照上执行报告生物测定,以监测下游途径,如JAK-STAT途径的激活。
在一些研究中,使用HEK-Blue IL-2报告细胞(Invivogen公司(Invivogen))根据以下方法测试JAK-STAT途径的激活。用测定培养基(DMEM+10%热灭活的FBS)洗涤2x HEK-Blue IL-2细胞传代6(p6)(97%活的),在150uL的测定培养基中以5e4个细胞/孔的速度铺板接种3次,并在测定培养基中静置持续约2小时以允许粘附到板上。将测试的每个构建体在测定培养基中稀释至300pM,然后在板上按1:2稀释。添加50uL的各稀释液,以使最终起始浓度为75pM。在24小时后收获HEK-Blue IL-2细胞上清液,在37℃下与Quantiblue(180uL+20uL上清液)加上3孔/板的测定培养基一起温育持续1小时。使用Biotek Neo2在625nm处读取吸光度。
在一些研究中,根据以下方法使用CTLL2细胞来测试JAK-STAT途径的激活。将CTLL2细胞以40,000个细胞/孔在具有10%FBS的RPMI中铺板接种。添加所关注的构建体的稀释,并在37度下温育。在6小时后,添加Bio-Glo试剂,并用BioTek Synergy Neo2酶标仪测量发光。
受体结合
评估实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体的结合。对于掩蔽的IL-2多肽构建体,在一些实验中,将ELISA板用受体亚基,如IL-2Rα(还称为CD25)、IL-2Rβ(还称为CD122)或IL-2Rγ(还称为CD132)或其组合涂覆。允许掩蔽的IL-2多肽构建体的稀释液与受体亚基结合,并使用抗huFc-HRP检测抗体进行检测。在具有和不具有蛋白酶切割的条件下确定掩蔽的IL-2多肽构建体的结合。
细胞上受体结合
评估实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体的细胞上受体结合。允许掩蔽的IL-2多肽构建体的稀释结合外周血淋巴细胞或组织培养细胞,如CTLL2细胞,并且使用抗huFc-FITC或抗白蛋白-FITC检测抗体通过荧光激活的细胞分选术(FACS)进行检测。在具有和不具有蛋白酶切割的条件下确定掩蔽的IL-2多肽构建体的结合。
受体结合亲和力
对于测试掩蔽的和非掩蔽的IL-2多肽构建体的结合的SPR研究,通过与EDC和NHS的胺偶联,用所关注的构建体(例如,掩蔽的IL-2多肽构建体或非掩蔽的IL-2多肽构建体)在10mM乙酸钠、pH 5.0中以30ug/ml涂覆和固定Reichert羧甲基葡聚糖水凝胶表面传感器芯片。制备CD25-Fc或Fc-CD122在PBST中的稀释液(CD25:16nM、8nM、4nM、2nM、1nM和CD122:500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM)。使用Reichert4Channel SPR,将CD25或CD122的稀释液用固定的构建体在夹子上流动,以确定在25℃下的缔合速率。在平衡(大约3分钟)下,将流动缓冲液更换为PBST,以确定在6分钟内的断开速率。在每次运行之间,用10mM甘氨酸、pH 2.0再生芯片。
图5A-5D描绘了防止与其α受体结合的IL-2突变的功效,使用SPR分析测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK168)与CD25-Fc的结合。图5A描绘了AK168与CD25-Fc之间的相互作用,图5B描绘了用MMP激活的AK168与CD25-Fc之间的相互作用,并且图5C描绘了重组人IL-2(rhIL-2)对照与CD25-Fc之间的相互作用。图5D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。这些结果证明,此示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK168)未证明与CD25-Fc的可检测的结合,而野生型rhIL-2对照证明了可检测的结合。
图6A-6D描绘了IL-2朝向其β受体的掩蔽以及用测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK111)与CD122-Fc的结合的SPR分析恢复与蛋白酶的结合后激活。图6A描绘了AK111与CD122-Fc之间的相互作用,图6B描绘了用MMP激活的AK111与CD122-Fc之间的相互作用,并且图6C描绘了重组人IL-2(rhIL-2)对照与CD122-Fc之间的相互作用。图6D提供一个表格,所述表格概述了针对每个相互作用获得的缔合常数(ka)、解离常数(kd)、平衡解离常数(KD),以及Chi2值和U值的数据。这些结果证明,此示例性掩蔽的IL-2多肽构建体(AK111)未证明与CD122-Fc的可检测的结合,除非其已用蛋白酶激活,而rhIL-2对照证明了可检测的结合。下文表7中针对所测试的包含掩蔽的和非掩蔽的构建体的各种构建体提供了另外的示例性SPR数据。对于一些结构,当适用时,确定具有或不具有先前已被蛋白酶切割的构建体的KD。
表7
切割
如上文所描述的,在存在或不存在蛋白酶的情况下温育掩蔽的IL-2肽构建体之后,并用蛋白酶(如果有的话)在各种时间点失活,如通过添加EDTA,通过进行受体结合测定来评估掩蔽的IL-2多肽构建体的切割速率。还使用还原型和非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和质谱法全质量和肽图分析来评估切割速率。还使用离体测定评估切割速率,其中掩蔽的IL-2多肽构建体暴露于人、小鼠或食蟹猴外周血淋巴细胞或正常人组织或人肿瘤组织。
对于一些蛋白酶激活研究,将MMP10在MMP切割缓冲液中稀释至50ng/uL,并在37℃下用1mM APMA激活持续2小时。将5μL蛋白酶(共计250ng)的经激活的蛋白酶与1uM掩蔽的细胞因子构建体(例如,掩蔽的IL-2多肽构建体)一起温育,并在37℃下温育持续2小时。使用AnykDTMCriterionTM TGX Stain-FreeTM蛋白凝胶,通过SDS-PAGE评估切割。采取类似的方法测试通过其它蛋白酶的切割。
图7A描绘了在被蛋白酶,如与肿瘤环境相关联的蛋白酶切割之前(左)和之后(右),掩蔽的IL-2多肽的示例性结构。图7B描绘了在不存在(左泳道)或不存在(右泳道)MMP10蛋白酶的情况下温育的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体的SDS-PAGE分析。
增殖
在用实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体处理之后,评估IL-2应答的组织培养细胞系,如CTLL2、YT、TF1B、LGL、HH和CT6的增殖。对于涉及掩蔽的IL-2多肽构建体的实验,将细胞在缺乏IL-2的培养基中在96孔组织培养板中铺板接种持续2-4小时,并且然后用不同浓度的掩蔽的IL-2多肽构建体处理。在以37度温育24-48小时后,通过添加MTS、阿尔玛蓝(alamar blue)、荧光素酶或类似的代谢检测试剂,以及通过板分光光度计读取器检测到的比色读数、荧光读数或荧光素酶读数来确定细胞数量。
还评估了在用实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体处理之后的免疫细胞的增殖。用构建体以各种浓度处理人、小鼠或食蟹猴外周血单核细胞(PBMC),并通过对特定细胞类型进行染色和通过荧光激活细胞分选(FACS)来确定细胞类型,如自然杀伤(NK)细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和/或Treg细胞的增殖。在一些实验中,用对照处理一些PBMC以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些PBMC,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,在具有和不具有蛋白酶切割(例如,激活)的条件下测试掩蔽的IL-2多肽构建体。在一些实验中,将NK细胞染色为CD45+CD3-CD56+,将CD8+T细胞染色为CD45+CD3+CD8+,将CD4+T细胞染色为CD45+CD3+CD4+CD25-,并将Treg细胞染色为CD45+CD3+CD4+CD25+FOXP3+。在一些实验中,将PBMC处理持续五天。在一些实验中,PBMC还用细胞增殖标志物Ki67染色。在一些实验中,在处理之前用CFSE(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))标记PBMC,并且通过确定CFSE稀释的程度来测量增殖。在一些实验中,将每种构建体以及阿地白介素和/或其它对照以一种或多种浓度,如在0.0001nM至500nM范围内的一个或多个浓度施用。
STAT5激活
还评估了在用实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体处理之后,信号转导物和转录激活子5(STAT5)的激活。用构建体处理PBMC持续指定的时间段,并且然后立即固定以保持蛋白质,如STAT5的磷酸化状态。在一些实验中,用对照处理一些PBMC以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些PBMC,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,在具有和不具有蛋白酶切割(例如,激活)的条件下测试掩蔽的IL-2多肽构建体。在一些实验中,将PBMC处理持续10分钟、15分钟、20分钟或25分钟。在一些实验中,将每种构建体以及阿地白介素和/或其它对照以一种或多种浓度,如在0.0001nM至500nM范围内的一个或多个浓度施用。在一些实验中,然后用对磷酸化STAT5(磷酸-STAT5)特异的抗体染色固定和透化PBMC,并通过流式细胞术进行分析。在一些实验中,测量STAT5的总水平和磷酸化水平。某些细胞类型,如NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和/或Treg细胞的磷酸-STAT5状态通过对特定细胞类型进行染色来确定。在一些实验中,将NK细胞染色为CD45+CD3-CD56+,将CD8+T细胞染色为CD45+CD3+CD8+,将CD4+T细胞染色为CD45+CD3+CD4+CD25-,并将Treg细胞染色为CD45+CD3+CD4+CD25+FOXP3+。
还评估了在用实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体处理之后,在小鼠细胞系,如CTLL-2细胞中STAT5的激活。在一些实验中,用对照处理一些CTLL-2细胞以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些CTLL-2细胞,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,在具有和不具有蛋白酶切割(例如,激活)的条件下测试掩蔽的IL-2多肽构建体。在一些实验中,将CTLL-2细胞处理持续10分钟、15分钟、20分钟或25分钟,并且然后进行固定以保持蛋白质,如STAT5的磷酸化状态。在一些实验中,将每种构建体以及阿地白介素和/或其它对照以一种或多种浓度施用。在一些实验中,测量STAT5的总水平和磷酸化水平。
在一些研究中,通过以下方法确定由IL-2诱导的细胞内STAT5激活(pSTAT5信号)的水平。将冷冻的人PBMC在水浴中解冻,并添加到39mL预热培养基(RPMI1640培养基加10%FBS、1%P/S、1%NEA)中,在培养基中以10E6个细胞/mL旋转并重组。将细胞以每孔5E5个细胞铺板接种于96孔板中。将稀释在培养基中的IL-2(例如,rhIL-2或示例性的含有IL-2的多肽构建体)添加到每个孔中,并且在37℃下温育持续20分钟。然后将细胞用200ul/孔固定缓冲液(e生物科学公司(eBiosciences))在4℃下固定过夜。离心后,将固定的细胞重新悬浮于200ul冷BD Phosflow缓冲液中,并在4℃下温育持续30分钟。在洗涤细胞两次之后,将其用百进生物公司(Biolegend)人TruStain FcX(在染色缓冲液中,每个样品2.5uL,总共50uL)在冰上处理持续5分钟。添加染色抗体;5ul pSTAT5-APC(pY694,BD)、10ul CD56-BV421(5.1H11,百进生物公司)、10ul CD4-PerCP/Cy5.5(A161A1,百进生物公司)和10ulCD3-FITC(UCHT1,百进生物公司),并在冰上、避光培育持续30分钟。将细胞洗涤2次并重新悬浮,并通过流式细胞术进行分析。
图8A-8D描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK032、AK035、AK041或rhIL-2作为对照的来自STAT5激活研究的结果。示出了NK细胞、CD8+T细胞、效应T细胞(Teff)和调节性T细胞(Treg)的STAT5激活的水平(%)。AK032和AK035构建体包含与Fc结构域连接的IL-2多肽,并且AK041构建体包含与CD25结构域和CD122结构域连接的IL-2多肽。如所示出的,在一些实施例中,工程化的IL-2多肽构建体可以减少Treg细胞的激活,同时保留或增强CD8+T细胞和NK细胞的激活。
图9A-9C描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK081和AK032的来自STAT5激活研究的结果。测试了具有和不具有先前暴露于MMP10的AK081构建体。还测试了同种型对照以及无IL-2阴性对照。示出了NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞的STAT5激活的水平(%)。AK032和AK081构建体包含与Fc结构域连接的IL-2多肽,并且AK081构建体包含连接IL-2多肽与Fc结构域的接头中的可切割肽。如所示出的,非掩蔽的单体AK081IL-2多肽构建体刺激类似于非掩蔽的二聚体AK032 IL-2多肽构建体的具有或不具有蛋白酶激活的PBMC的STAT5激活。
图10A-10D描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK081和AK111以及包含rhIL-2和抗RSV抗体的对照的来自STAT5激活研究的结果。还测试了无处理对照。AK111构建体是包含IL-2多肽的野生型形式(除C125A突变外)的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。如在图10A-10D中所示的,与非掩蔽的IL-2多肽构建体AK081相比,掩蔽的IL-2多肽构建体AK111显示出减少的STAT5激活。图10D提供了AK081、AK111构建体以及rhIL-2对照的EC50(pM)和倍数变化数据。
图11A-11D描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK167和AK168以及包含rhIL-2和抗RSV抗体的对照的来自STAT5激活研究的结果。还测试了无处理对照。AK168构建体是包含消除或减少CD25结合的IL-2多肽的突变形式的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。AK167构建体是包含相同突变体IL-2多肽的AK168构建体的亲本、非掩蔽的形式。如在图11A-11C中所示的,与rhIL-2对照相比,非掩蔽的AK167构建体证明了STAT5激活减少,并且掩蔽的IL-2多肽构建体AK168不诱导可检测的STAT5激活。图11D提供了AK167、AK168构建体以及rhIL-2对照的EC50(pM)和倍数变化数据。AK168构建体的EC50是不可检测的(n.d.)。
图12A-12D描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK165和AK166以及为(+MMP10)或未先前暴露于MMP10蛋白酶的同种型对照和IL-2-Fc对照的来自STAT5激活研究的结果。AK166构建体是包含IL-2多肽的野生型形式(除C125A突变外)的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。AK165构建体是包含相同IL-2多肽的AK166构建体的亲本、非掩蔽的形式。如在图12A中所示的键也适用于图12B,并且如在图12C中所示的键也应用于图12D。如在图12A-12D中所示的,对于掩蔽的AK166构建体(无蛋白酶切割),STAT5激活大大减少,但在暴露于激活蛋白酶MMP10之后恢复到类似于IL2-Fc对照的水平。
图13A-13C描绘了如上文所描述的使用示例性构建体AK109和AK110以及为(+MMP10)或未先前暴露于MMP10蛋白酶的同种型对照和IL-2-Fc对照的来自STAT5激活研究的结果。AK109和AK110构建体是包含具有不同异二聚化突变的半衰期延长结构域的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。如在图13B中所示的键也适用于图13A。如在图13A-13C中所示的,对于掩蔽的AK109和AK110构建体(无蛋白酶切割),STAT5激活大大减少,但在暴露于激活蛋白酶MMP10之后,显著增加至接近IL2-Fc对照的水平。
图14A-14D描绘了如上文所描述的使用构建体AK211、AK235、AK253、AK306、AK310、AK314和AK316以及rhIL-2对照的来自STAT5激活研究的结果。这包含包括调节CD25结合的各种突变的亲本、非掩蔽的构建体(AK235、AK253、AK306、AK310、AK314)的构建体。图14D为每个测试的构建体以及rhIL-2对照提供EC50数据。
图15A-15D描绘了如上文所描述的使用已被蛋白酶激活的构建体AK081、AK167、AK216、AK218、AK219、AK220和AK223以及rhIL-2对照的来自STAT5激活研究的结果。还测试了无处理对照。这包含包括调节CD25结合的各种突变的掩蔽的IL-2多肽构建体(AK216、AK218、AK219、AK220和AK223)。构建体在测试其激活STAT5的能力之前先前暴露于激活蛋白酶。图15D为每个测试的构建体以及rhIL-2对照提供EC50数据。
图16A-16C描绘了如上文所描述的使用构建体AK081、AK189、AK190和AK210以及抗RSV对照的来自STAT5激活研究的结果。这包含掩蔽的IL-2多肽构建体(AK189、AK190、AK210),其包含具有C125A突变的IL-2多肽,并且包含相同的可切割肽序列(RAAAVKSP),但由于蛋白酶切割序列的N末端上的氨基酸残基中的差异而具有不同的接头序列。如在图16A中所示的键也适用于图16B和16C。
图17A-17C描绘了如上文所描述的使用构建体AK167、AK191、AK192和AK193以及抗RSV对照的来自STAT5激活研究的结果。这包含掩蔽的IL-2多肽构建体(AK189、AK190、AK210),其包含具有R38A、F42A、Y45A、E62A和C125A突变的IL-2多肽,并且包含相同的可切割肽序列(RAAAVKSP;SEQ ID NO:27),但由于蛋白酶切割序列的N末端上的氨基酸残基中的差异而具有不同的接头序列。如在图17A中所示的键也适用于图17B和17C。
实例3:掩蔽的IL-2的体内表征
药代动力学
使用小鼠模型在体内评估实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体的药代动力学。
用构建体静脉内或皮下处理小鼠,并且随着时间的推移测量血浆中构建体的浓度。在一些实验中,用对照处理一些小鼠以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些小鼠,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,经处理的小鼠具有肿瘤。在一些实验中,经处理的小鼠是无肿瘤的。在一些实验中,用构建体处理小鼠,并且在处理过程中在不同时间抽血,这可以包含在开始处理之前抽血并对其进行处理以获得血浆。在一些实验中,在两周、三周或四周或更长时间的处理过程中在各种时间点进行抽血。在一些实验中,测量所施用的构建体以及阿地白介素和/或其它对照的平均血浆浓度。在用IL-2特异性ELISA和人Fc特异性ELISA稀释到PBS吐温中后,在血浆样品中检测到掩蔽的IL-2多肽构建体,并且使用针对每种构建体产生的标准曲线进行定量。通过具有抗huFc-HRP和抗huIL-2-HRP的蛋白质印迹并通过全质量和肽质谱法确定全长和切割构建体的百分比。
还使用小鼠模型在体内评估肿瘤中掩蔽的IL-2多肽构建体的药代动力学。用构建体静脉内或皮下处理具有肿瘤的小鼠,并且评估小鼠肿瘤中构建体的浓度。在一些实验中,用对照处理一些小鼠以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些小鼠,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。分析肿瘤的构建体的存在以及特定蛋白酶的存在。在一些实验中,分析肿瘤的全长和切割构建体的存在和百分比。
根据以下方法进行一些药代动力学研究。C57BL/6雌性小鼠购自查尔斯河实验室(Charles River Laboratories),并且在研究开始时为8-10周龄。将MC38肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。在达到~100mm3大小的肿瘤(第0天)时,小鼠在PBS中接受所关注的构建体(例如,非掩蔽的亲本IL-2多肽构建体、掩蔽的IL-2多肽构建体或不可切割的掩蔽的IL-2多肽构建体)的单次2mg/kg静脉内剂量。测试的构建体包含例如AK032、AK081、AK111、AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209和AK211。在给药后5分钟、第1天、第2天和第5天收集血浆。使用利用抗人IgG(克隆M1310G05,百进生物公司)作为捕获抗体和各种检测抗体的ELISA来确定药物水平。针对人IgG(ab97225,艾博抗公司)或CD122(克隆9A2,Ancell公司)和IL-2(Poly5176,百进生物公司)的HRP或生物素缀合的检测抗体分别用于检测总药物水平和未切割的药物水平。
图18A-18D描述了来自如上文所描述的使用构建体AK032、AK081、AK111、AK167和AK168以及抗RSV对照在荷瘤小鼠中进行的药代动力学研究的结果。图18A提供了测试的构建体中的每个构建体的结构的简化描绘。如所指示的,AK111和AK168是示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。AK167和AK168构建体包含消除或减少与CD25结合的突变(R38A、F42A、Y45A和E62A)。图18A示出了通过检测人IgG的血浆(μg/mL)中的Fc水平,图18C示出了通过检测人CD122的血浆(μg/mL)中的Fc-CD122水平,并且图18D示出了通过检测人IL-2的血浆(μg/mL)中的Fc-IL2水平。
图19A-19D描述了来自如上文所描述的使用构建体AK167、AK191、AK197、AK203、AK209和AK211以及抗RSV对照在荷瘤小鼠中进行的药代动力学研究的结果。图19A提供了测试的每个构建体的结构的简化描绘。如所指示的,AK168、AK191、AK197、AK203和AK209是各自在连接IL-2多肽与半衰期延长结构域的接头中包含不同的可切割肽序列的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。图19B示出了通过检测人IgG的血浆(μg/mL)中的Fc水平,图19C示出了通过检测人IL-2的血浆(μg/mL)中的Fc-IL2水平,并且图19D示出了通过检测人CD122的血浆(μg/mL)中的Fc-CD122水平。如在图19B、19C和19D中所示的,血浆中的Fc水平、Fc-IL2水平和Fc-CD122水平在测试的掩蔽的IL-2多肽构建体中是相似的。
小鼠中的生物活性
使用小鼠模型,如C57BL/6小鼠,在体内评估在实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体的体内生物活性。用构建体处理小鼠,并评估体内生物活性。在一些实验中,用对照处理一些小鼠以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些小鼠,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,经处理的小鼠具有肿瘤。在一些实验中,经处理的小鼠是无肿瘤的。在一些实验中,在小鼠中评估免疫细胞的剂量依赖性扩增。在一些实验中,用各种剂量的构建体、阿地白介素或其它对照处理小鼠。在一些实验中,对小鼠进行为期两周的处理。在不同时间点从小鼠中收集血液,并且然后使用抗体对所关注的免疫细胞标志物进行染色。在一些实验中,还确定了某些循环细胞类型,如CD8+T细胞、NK细胞和Treg细胞的增殖和扩增的纵向动力学,以及CD8+T细胞和NK细胞与CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞的比率。在一些实验中,如通过评估如通过器官湿重和组织学确定的肺和肝脏等某些器官中的水肿和淋巴细胞浸润来评估小鼠的血管渗漏。
在一些研究中,评估血管渗漏以便通过执行以下方法来评估由基于IL-2的疗法介导的潜在毒性相关效应。使用购自查尔斯河实验室并且在研究开始时称重为18-22克的8-10周龄的C57BL/6雌性小鼠进行重复剂量毒性研究。每组5只小鼠每天在PBS中接受掩蔽和非掩蔽的IL-2构建体的腹膜内注射,持续4或5天。所测试的构建体包含AK081、AK111、AK167和AK168。对照抗体还作为对照施用。在最后一次剂量后两小时,所有小鼠在PBS中接受0.1ml的1%伊文思蓝(Evans blue)(西格玛公司(Sigma),目录号E2129)的静脉内注射。在伊文思蓝施用后两小时,将小鼠麻醉并用10U/ml肝素在PBS中灌注。在650nm处测量上清液的吸光度之前,用NanoDrop OneC(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))将脾脏、肺和肝脏在4℃下收获并固定在3ml of 4%PFA中2天,作为伊文思蓝的血管渗漏的指示剂。将固定的器官嵌入在石蜡中,切片,并用苏木精和曙红染色。组织病理学研究和定量由NovoVita Histopathy实验室有限责任公司(NovoVita Histopathy Laboratory,LLC.)(马萨诸塞州奥尔斯顿(Allston,MA))根据标准程序进行。图25A-50D描绘了来自如上文所描述的使用示例性掩蔽的IL-2多肽构建体AK111和AK168以及非掩蔽的IL-2多肽构建体AK081和AK167以及抗RSV对照来评估血管渗漏的体内研究的结果。图25A示出了体重减轻的百分比(%),并且图25B、25C和25D分别各自示出了肝脏、肺和脾脏的重量,以克为单位。
还针对AK081、AK111、AK167和AK168构建体连同抗RSV对照评估如通过测量染料渗漏到组织中的程度所指示的血管渗漏,结果分别在针对肝脏和肺的图26A和26B中示出。基于在650nm处的吸光度测量染料渗漏的程度。
还针对AK081、AK111、AK167和AK168构建体连同抗RSV对照评估如通过测量单核细胞血管周侵入到肝脏和肺的程度所指示的血管渗漏,结果分别在针对肝脏和肺的图27A和27B中示出。各自描绘了肝脏中单核细胞的平均数量(图27A)和肺中单核细胞的平均数量(图27B)。如在图27B中所示的,例如,与非掩蔽的构建体AK081和AK167不同,掩蔽的IL-2多肽构建体AK111和AK168没有在肺中产生可检测数量的单核细胞。
浸润免疫细胞表型
评估用实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体处理的小鼠模型中体内免疫细胞浸润肿瘤的表型。用构建体处理小鼠,并评估肿瘤浸润免疫细胞的表型。在一些实验中,用对照处理一些小鼠以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些小鼠,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。将荷瘤小鼠用构建体、阿地白介素或另一对照处理,并且在初始剂量后的各个时间点,如在初始剂量后第五天、第七天或第十天,收集肿瘤、组织如肝脏、肺和脾脏以及血液。在一些实验中,从肿瘤、组织和血液分离免疫细胞,并且使用流式细胞术进行表型评估。在一些实验中,使用所关注的标志物,如CD8+T细胞、记忆CD8+T细胞、激活的NK细胞、CD4+T细胞和CD4+Treg细胞的标志物,评估分离的免疫细胞。
在一些研究中,使用以下方法评估体内免疫细胞浸润肿瘤的表型。C57BL/6雌性小鼠购自查尔斯河实验室,并且在研究开始时为8-10周龄。将MC38肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。在达到~100mm3大小的肿瘤(第0天)时,小鼠在PBS中接受所关注的构建体(例如,非掩蔽的亲本IL-2多肽构建体、掩蔽的IL-2多肽构建体或不可切割的掩蔽的IL-2多肽构建体)的单次2mg/kg静脉内剂量。在第5天时,通过CO2窒息对小鼠实施安乐死,并收获肿瘤、肝脏、脾脏和血液。通过机械破碎从脾脏制备细胞悬浮液,并通过40μm细胞过滤器。使用Miltenyi肿瘤解离试剂盒试剂(美天旎公司(Miltenyi)目录号130-096-730)酶消化肿瘤组织,并使用gentleMACS解离器(美天旎公司)进行机械解离步骤。使用ACK缓冲液(Gibco公司目录号A10492)切割脾脏中的红细胞和肿瘤细胞悬浮液和血液。用以下抗体染色细胞悬浮液:CD45(克隆30-F11,e生物科学公司)、CD3(克隆2C11,百进生物公司)、CD8(克隆53-6.7,BD生物科学公司(BD Biosciences))、CD4(克隆RM-45,BD生物科学公司)、FOXP3(MF-14,百进生物公司)、CD25(3C7,百进生物公司)、CD44(克隆IM7,e生物科学公司)和NKp46(29A1.4,e生物科学公司)。在MACSQuant分析仪流式细胞仪(Milenyi公司(Milenyi))上进行数据采集,并使用FlowJo分析数据。
使用AK032、AK081、AK111、AK167和AK168构建体以及抗RSV IgG对照,如上文所描述进行的来自测试脾脏、血液和肿瘤中的CD4、CD8、NK和Treg百分比的体内应答的研究的结果在图20A-20L中示出。AK111和AK168是示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。
使用AK167、AK168、AK191、AK197、AK203、AK209和AK211构建体以及抗RSV IgG对照,如上文所描述进行的来自测试脾脏、血液和肿瘤中的CD4、CD8、NK和Treg百分比的体内应答的研究的结果在图21A-21L中示出。AK168、AK191、AK197、AK203和AK209是各自在连接IL-2多肽与半衰期延长结构域的接头中包含不同的可切割肽序列的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。与不可切割的AK211构建体相比,使用单因素ANOVA进行统计分析。
使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190和AK211构建体,如上文所描述进行的来自测试脾脏、血液和肿瘤中的CD4、CD8、NK和Treg百分比的体内应答的研究的结果在图22A-22L中示出。AK191、AK192、AK193、AK210、AK189和AK190是各自在连接IL-2多肽与半衰期延长结构域的接头中包含可切割肽序列的示例性掩蔽的IL-2多肽构建体。取决于所利用的接头序列,接头序列在这些构建体之间也不同。AK189、AK190和AK210包含具有C125A突变的IL-2多肽,并且AK191、AK192和AK193包含具有C125A、R38A、F42A、Y45A和E62A突变的IL-2多肽。AK235构建体是非掩蔽的构建体,并且AK211构建体包含不可切割的接头序列。与不可切割的AK211构建体相比,使用单因素ANOVA进行统计分析。
如上文所描述的,使用AK235、AK191、AK192、AK193、AK210、AK189、AK190和AK211构建体测试来自如上文所描述的脾脏、血液和肿瘤中的体内T细胞激活的研究的结果在图23A-23I中示出。T细胞激活测量为脾脏、血液和肿瘤中CD8+T细胞、CD4+T细胞或Foxp3+细胞中CD25的平均荧光强度(MFI)。与不可切割的AK211构建体相比,使用单因素ANOVA进行统计分析。
体内切割
评估掩蔽的IL-2细胞因子构建体(例如,掩蔽的IL-2多肽构建体)的体内切割。在一些研究中,施用对照抗体用于比较。在一些研究中,通过在小鼠中施用所关注的构建体,并且在某一时间段之后捕获人IgG,并且然后测量例如人IgG、CD122和IL-2的水平来评估体内切割。
在一些测试掩蔽的IL-2多肽构建体的体内切割的研究中,使用利用抗人IgG(克隆M1310G05,百进生物公司)作为捕获抗体和各种检测抗体的ELISA来确定药物水平(即,施用的构建体的水平,包含切割副产物)。针对人IgG(ab97225,艾博抗公司)或CD122(克隆9A2,Ancell公司)和IL-2(Poly5176,百进生物公司)的HRP或生物素缀合的检测抗体分别用于检测总药物水平和未切割的药物水平。通过从总药物浓度中减去未切割的(即,完整的)来计算切割和释放的IL-2的浓度。图24A-24D描绘了来自测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体AK168(可切割肽序列:MPYDLYHP)和AK209(可切割肽序列:VPLSLY;SEQ ID NO:15)的体内切割的研究的结果。AK167构建体是包含与掩蔽的AK168构建体相同的IL-2多肽的可切割非掩蔽的IL-2多肽构建体。如在图24A-24D中所示出的,有效切割掩蔽的(AK168和AK209)和非掩蔽的(AK167)构建体两者,并切割两种可切割肽序列。图24E描绘了来自针对AK167、AK168和AK209构建体的总水平以及每种构建体的未非切割形式的水平的总血浆IgG浓度(μg/mL)的药代动力学研究的结果。
肿瘤根除和转移的抑制
使用小鼠模型,如同基因MC38、CT26和B16F10肿瘤模型,在体内评估在实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体以促进肿瘤根除并抑制转移的能力。
将小鼠皮下植入肿瘤细胞,并允许肿瘤生长至可触及的尺寸。用掩蔽的IL-2构建体处理荷瘤小鼠,并且在处理过程中测量肿瘤体积。在一些实验中,用对照处理一些小鼠以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些小鼠,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在处理过程中周期性地测量肿瘤体积。在一些实验中,还在处理过程中周期性地测量体重。在一些实验中,在处理过程中产生血浆样品,并分析如针对CD8+T细胞、记忆CD8+T细胞、激活的NK细胞、CD4+T细胞和CD4+Treg细胞的药代动力学、药效学、切割和血液标志物。
还使用适合于转移研究的小鼠模型,如用于评估肺转移的同基因CT26肿瘤模型,在体内评估掩蔽的IL-2多肽构建体抑制转移的能力。小鼠被皮下植入肿瘤细胞。在一些实验中,允许肿瘤在处理之前生长至可触及的大小。在一些实验中,处理在肿瘤生长到可触及的大小之前开始。评估用掩蔽的IL-2构建体处理荷瘤小鼠的肿瘤细胞转移到组织如肺、肝脏和淋巴结中的情况。
在一些研究中,同基因肿瘤模型用于评估掩蔽的IL-2多肽构建体根据以下方法减少肿瘤体积的能力。C57BL/6雌性小鼠购自查尔斯河实验室,并且在研究开始时为8-10周龄。将MC38肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。在达到~125mm3大小的肿瘤(第0天)时,小鼠随机接受在PBS中的2mg/kg剂量的AK081、AK111、AK167或AK168或作为对照的抗RSV抗体。小鼠腹膜内给药,每周三次,共6个剂量。使用带表卡尺计算肿瘤体积(长度*(宽度^2)/2),并且每周记录体重两次。图28A和28B示出了来自在处理过程中评估肿瘤体积和体重的同基因肿瘤模型研究的结果。如在图28A中所示的,与抗RSV对照相比,使用包含掩蔽的构建体AK111和AK168的示例性IL-2多肽构建体的处理导致随时间推移的肿瘤生长抑制。如在图28B中所示的,当用掩蔽的构建体AK111和AK168处理小鼠时,观察到通常缺乏体重减轻。
食蟹猴中的生物活性
在食蟹猴中在体内评估实例1中产生的掩蔽的IL-2多肽构建体的体内生物活性。用构建体处理食蟹猴,并评估体内生物活性、药代动力学和切割。在一些实验中,用对照处理一些猴以进行比较。在一些实验中,用阿地白介素处理一些猴,作为用于掩蔽的IL-2多肽处理的对照。在一些实验中,用各种剂量的构建体、阿地白介素或其它对照处理猴。在不同时间点收集来自猴的血液,并且然后评估某些细胞类型,如CD8+T细胞、记忆CD8+T细胞、激活的NK细胞、CD4+T细胞和CD4+Treg细胞和/或所关注的标志物,如总淋巴细胞Ki67+和可溶性CD25的剂量应答。在一些实验中,评估某些循环T细胞和NK细胞类型的增殖和扩增的纵向动力学。在一些实验中,通过ELISA、PAGE和质谱法确定掩蔽的IL-2多肽构建体的药代动力学和切割。
为了测试示例性掩蔽的IL-2多肽构建体在非人灵长类动物中的安全性特性,根据以下方法进行剂量范围研究。将每组3只健康的雄性食蟹猴(食蟹猕猴)随机分配以在100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)中以10nmol/kg、30nmol/kg和100nmol/kg接受2mL/kg的可激活的(即可切割的)掩蔽的IL-2多肽蛋白或不可切割掩蔽的IL-2多肽蛋白的单次静脉内团注剂量。第三组以3nmol/kg、10nmol/kg和30nmol/kg接受亲本非掩蔽的可切割蛋白作为阳性对照。第三组以较低的范围给药,以考虑亲本非掩蔽的分子的较高效力。剂量以摩尔为单位计算,以考虑分子量的差异。在给药前和给药后1小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、264小时和336小时收集血液样品。自动血液学分析仪用于监测淋巴细胞子集和血清化学的变化。使用如上文所描述的定制ELISA从血浆测量总药物水平和完整(即,未切割)的药物水平。用ELISA(R&D系统,目录号DR2A00)测量可溶性CD25水平以监测免疫刺激。使用定制多重电化学发光测定法(中尺度发现公司(Meso Scale Discovery))定量炎性细胞因子的血浆水平。监测血压作为血管渗漏综合征的指标。使用捕获IL-2并检测人Fc的ELISA以及通过捕获人Fc并检测人Fc的ELISA分析PK。
实例4:
C57BL/6雌性小鼠购自查尔斯河实验室,并且在研究开始时为8-10周龄。将MC38肿瘤细胞(每只小鼠5x105个细胞)皮下注射到每只小鼠的右胁腹中。在达到~100mm3大小的肿瘤(第0天)时,小鼠在PBS中接受各种Fc-IL-2构建体的单次高剂量腹膜内剂量。在给药后5分钟、第3天、第5天和第7天收集血浆。
所用的构建体是:
使用基于FACS的方法进行免疫分型。在第5天时,通过CO2窒息对小鼠实施安乐死,并收获肿瘤、肝脏、脾脏和血液。通过机械破碎从脾脏制备细胞悬浮液,并通过40μm细胞过滤器。使用Miltenyi肿瘤解离试剂盒试剂(美天旎公司目录号130-096-730)酶消化肿瘤组织,并使用gentleMACS解离器(美天旎公司)进行机械解离步骤。使用ACK缓冲液(Gibco公司(Gibco)目录号A10492)切割脾脏中的红细胞和肿瘤细胞悬浮液和血液。
用以下抗体染色细胞悬浮液:CD45(克隆30-F11,e生物科学公司)、CD3(克隆2C11,百进生物公司)、CD8(克隆53-6.7,BD生物科学公司)、CD4(克隆RM-45,BD生物科学公司)。在MACSQuant分析仪流式细胞仪(Milenyi公司)上进行数据采集,并使用FlowJo分析数据。
使用利用抗人IgG(克隆M1310G05,百进生物公司)作为捕获抗体和各种检测抗体的ELISA来确定药物水平。针对人IgG(ab97225,艾博抗公司)或CD122(克隆9A2,Ancell公司)和IL-2(Poly5176,百进生物公司)的HRP或生物素缀合的检测抗体分别用于检测总药物水平和未切割的药物水平。
具有I253A FcRn突变的AK471在TME中诱导了稳健的CD8 T细胞扩增,同时在外周保持无活性,如在图29A和29B中所示的。
如在图30A、B和C中所示的,与aglyco-hIgG1相比,AK471具有稍微较短的半衰期。
血浆中不存在用AK471切割或断头的证据(图31A、B和C)。
实例5:IL-12异构化
SPR对重组IL-12受体、IL-12Rb1和IL-12Rb2的切割和结合:
传感器芯片用IL-12受体涂覆和固定。将IL-12构建体的稀释液用固定的IL-12受体在芯片上流动,以确定在25℃下的缔合速率。在平衡(大约3-4分钟)下,将流动缓冲液更换为PBST,以确定在6分钟内的断开速率。在每次运行之间重新生成芯片。这些表格表示SPR数据(图34和35)。ND表示“未确定”,因为IL-12的掩蔽阻止了与受体的结合;因此,结合数无法确定。
用HEK-Blue IL-12细胞检测IL-12分子:
由Invivogen公司开发的HEK Blue IL-12报告细胞被专门设计用于监测JAK-STAT途径的激活。这些细胞是通过用人IL-12Rβ1和IL-12Rβ2基因以及人JAK2和STAT4基因稳定转染HEK293细胞产生的,以获得功能齐全的IL-12信号传导途径。另外,还引入了STAT4诱导型SEAP报告基因。在刺激后,HEK-BlueTM IL-12细胞触发STAT4的激活和随后的SEAP的分泌。可以使用QUANTI-BlueTM轻松监测STAT4诱导型SEAP的水平。HEK-BlueIL-12细胞可以用于验证人或鼠IL-12的功能、毒性和可变剂量效应。将HEK Blue IL-12细胞在传代培养基中生长,直到~80%汇合。将洗涤的单细胞悬浮液在测定培养基中铺板接种,并将测定培养基中IL-12分子的连续稀释液添加到细胞中。将板在37℃下温育持续24小时。在24小时后,制备Quanti-Blue溶液(Invivogen公司),并将细胞上清液添加到Quanti-Blue溶液中,并在37℃下温育持续1-2小时。测量625nm处的吸光度。在Graphpad Prism,版本8.3中执行数据分析。从原始数据中减去背景,并且数据是非线性拟合的:[激动剂]对应答-可变斜率(四个参数)。报告了每种IL-12构建体的EC50值。
实例6
此实例研究IL-12构建体上GAG结合结构域的突变是否改变PK,在C57BL/6非荷瘤小鼠中将两个GAG结合突变变体(AK600和AK601)与WT IL-12构建体(AK598)进行比较。AK600分别具有具有KDNTEGRV GAG结合结构域突变体的KDNTERV和AK601。
AK598、AK600和AK601均具有以下构建体结构:
这些动物通过i.v注射以1或10mg/kg单次给药。使用人Fc捕获(南方生物技术公司(Southern Biotech)IgG目录号2049-01山羊抗人IgG,Monkey ads-UNLB)人Fc检测(ab97225)和/或人Fc捕获/抗人IL-12(ab83448)检测ELISA测量血浆药物水平。
ELISA发现,与AK598相比,来自AK600和AK601的GAG结合突变可改善Cmax和AUC中的药物暴露。在AK600和AK601之间未观察到PK曲线的差异。AK600和AK601两者的半衰期与AK598相似,约为2天。
结果示出于图36-40中。
实例7
游离半胱氨酸残基可以引起分子间交联和聚集。此实例测试了半胱氨酸到丝氨酸的氨基酸突变是否对聚集和稳定性有影响。
在此实例中使用以下构建体:
AK386、AK604、AK605和AK606的序列在第10节的序列表中。
将蛋白质与所指示的缓冲液在40C下温育持续3天或12天。然后通过HPLC尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和考马斯染色对分子进行分析。
在第3天,仅存在足够的聚集,以在2种缓冲条件下对稳定性进行排名,其中AK606排名最佳。Cys→Ser突变趋向于更稳定。在第12天,AK606在6种另外的缓冲条件中排名最佳。Cys→Ser突变似乎赋予稳定性。SDS-PAGE示出了Cys242比Cys252引起更多共价聚集。示出的第0/12天,AK386和AK605示出比AK604和AK606更多的共价聚集。
结果示出于图41-43中。
实例8
此实例展示了示例性IL-12构建体的掩蔽和切割。
在此实例中使用以下构建体:
AK671是一个非掩蔽的分子,AK663不包括细胞因子,并且AK664是不可切割的。这三种分子充当对照。
每种构建体的切割肽示出在每个柱的顶部。
AK666、AK667、AK918、AK920和AK669是‘版本1’构建体。AK665、AK668、AK919、AK921、AK670是‘版本2’构建体。AK924、AK922、AK925和AK923是‘版本3’构建体。
每个版本的可切割接头(蛋白酶位点接头),即HL2与IL-12结构域之间,以及HL1与掩蔽部分之间的不可切割接头(b2受体接头)如下所示:
在适用的情况下,所有这些构建体均包括KDNTEGRV突变到IL-12p40亚基的GAG结合结构域、Il-12p40亚基的C252S突变以及IL-12RB2结构域的C242S突变。每个构建体的确切序列在第10节中的序列表中示出。
i)离体切割测定(WB/IL-12信号传导)
将1uM的IL-12构建体与90ul的条件培养基温育过夜或与90ul的血浆在37C下温育以下时间(d1-d2-d4-d7-d9-d11)。使用蛋白质印迹抗人IL-12和抗人IL-12Rb将切割速率计算为:切割的构建体/(切割的构建体+完整的构建体)的比率。使用IL-12后受体信号传导测定法评估人组织条件培养基对这些构建体的激活,其中将0.05x106 HEK-Blue细胞与37.5nM构建体一起温育持续24小时。
结果示出于图44中和下表中。
具有以下切割位点的分子在肿瘤上清液中表现出易于检测的切割:
-RAAAVKSP
-ISSGLLSGRS
-MPYDLYHP
按以下顺序观察切割位点敏感性:
RAAAVKSP>ISSGLLSGRS>MPYDLYHP
因此,含有这些切割位点的IL-12构建体代表了RCC和其它类型癌症中肿瘤选择性激活的良好候选者。
ii)体外切割分析:HEK Blue IL-12和SDS-PAGE分析
用HEK-Blue IL-12细胞检测IL-12分子:
由Invivogen公司开发的HEK Blue IL-12报告细胞被专门设计用于监测JAK-STAT途径的激活。这些细胞是通过用人IL-12Rβ1和IL-12Rβ2基因以及人TyK2、JAK2和STAT4基因稳定转染HEK293细胞产生的,以获得功能齐全的IL-12信号传导途径。另外,还引入了STAT4诱导型SEAP报告基因。在刺激后,HEK-BlueTM IL-12细胞触发STAT4的激活和随后的SEAP的分泌。可以使用QUANTI-BlueTM轻松监测STAT4诱导型SEAP的水平。HEK-Blue IL-12细胞可以用于验证人或鼠IL-12的功能、毒性和可变剂量效应。将HEK Blue IL-12细胞在传代培养基中生长,直到~80%汇合。将洗涤的单细胞悬浮液在测定培养基中铺板接种,并将测定培养基中IL-12分子的连续稀释液添加到细胞中。将板在37℃下温育持续24小时。在24小时后,制备Quanti-Blue溶液(Invivogen公司),并将细胞上清液添加到Quanti-Blue溶液中,并在37℃下温育持续1-2小时。测量625nm处的吸光度。在Graphpad Prism,版本8.3中执行数据分析。从原始数据中减去背景,并且数据是非线性拟合的:[激动剂]对应答-可变斜率(四个参数)。报告了每种IL-12构建体的EC50值。
掩蔽:
结果示于下表以及图45,46A和B中。
亲本AK671的效力低于rhIL-12(但不显著,即3倍)。所有掩蔽的构建体均比AK386更隐蔽。AK667和AK918两者均隐蔽>100倍。
与AK386相比,具有GAG结合结构域突变、半胱氨酸到丝氨酸突变、新优化的接头以及不同切割位点的新分子均表现出改进的掩蔽。
切割:
使用示例性蛋白酶MMP7、9和10测试构建体的切割。
批次1
AK ID | 蛋白质批号 | 300ng MMP | 切割的总构建体,ug |
AK663 | AK663-01A | 7 | 8.8 |
AK664 | AK664-01A | 7 | 14.8 |
AK665 | AK665-01A | 7 | 14.8 |
AK666 | AK666-01A | 7 | 14.8 |
AK667 | AK667-01A | 10 | 14.9 |
AK668 | AK668-01A | 10 | 14.9 |
AK669 | AK669-01A | 2 | 14.9 |
AK670 | AK670-01A | 2 | 14.9 |
AK671 | AK671-01A | 7 | 11.3 |
AK386 | AK386-03A | 7 | 14.9 |
AK674 | AK674-01A | 7 | 15.1 |
结果示出于图47A-B和48A-K
批次2
AK ID | 蛋白质批号 | 300ng MMP | 切割的总构建体,ug |
AK667 | AK667-01A | 7,9,10 | 14.86 |
AK671 | AK671-01A | 7,9,10 | 11.31 |
AK918 | AK918-01A | 7 | 14.84 |
AK919 | AK919-01A | 7 | 14.85 |
AK920 | AK920-01A | 9 | 14.83 |
AK921 | AK921-01A | 9 | 14.84 |
AK386 | AK386-03A | 7 | 14.90 |
结果示出于图49A-B和50A-G
批次3
AK ID | 蛋白质批号 | 300ng MMP | 切割的总构建体,ug |
AK386 | AK386-04A | 7,10 | 14.9 |
AK922 | AK922-01A | 7 | 14.9 |
AK923 | AK923-01A | 7 | 14.9 |
AK924 | AK924-01A | 10 | 14.8 |
AK925 | AK925-01A | 10 | 14.9 |
AK671 | AK671-02A | N/A | N/A |
结果示出于图51和52A-E
总体而言,具有不同切割位点的新分子在体外都对MMP切割易感。对于所有分子,切割后活性恢复。这些化合物代表了肿瘤选择性可激活IL-12分子的良好候选者。
实例9
i.通过NAT对RCC培养上清液切割肽
在‘NAT’(正常邻近组织)或‘RCC’(肾细胞癌)培养上清液中温育包括切割肽的序列(下文以粗体示出),以测试每种肽切割的特异性。
为此,通过质谱法进行肽测序来用于鉴定下表中所示的合成肽产生的切割片段,使用已发布的称为通过质谱法进行的多重底物谱分析(MSP-MS)的技术(O'Donoghue A.J.等人,《自然方法(Nat Methods.)》2012年11月;9(11):1095-100。)。随着时间的推移,在这些反应中监测切割,并且发现在最早时间点切割的肽被视为对条件培养基样品中的蛋白水解活性最敏感。
结果如下:
发现切割肽DLLAVVA*AS和ISSGLL*SG*RS是最特异性的。包括这些肽的序列在NAT培养物中不切割,但在RCC培养物中的每次运行中切割。
实例10
在此实例中使用以下构建体:
每个AK分子的结构域特征和序列的细节如下:
重要的是,AK932和AK930和其‘翻转’对应物AK938和AK936包含肽底物(其序列在每种分子上方的方框中描绘,并在序列表中加粗)。AK904是不可切割非掩蔽的构建体,并且AK910是不可切割掩蔽的构建体,两者均充当阴性对照。
上述AK分子包含IL-15结构域,然而,应当理解,无论如何,此数据的结果和结论与IL-2构建体同样相关。
对包含肽底物的掩蔽的构建体进行切割。
将构建体与MMP7、9和10一起温育。通过SDS-PAGE分析每种构建体的切割并通过HEK-Blue IL-2生物测定确认。
HEK-Blue测定如下进行:
条件:细胞板:96孔板:细胞密度:50K cls/孔。测试了HEK Blue检测的时间点:1小时。构建体编号:共测试了14种构建体。
测定流程图:
结果在下表中示出,其中‘X’指示未完全切割,并且‘√’指示切割:
来自HEK-Blue IL-2生物测定的具体EC50读数结果在下表中示出。
SDS-PAGE凝胶结果在图53A-D中示出。HEK-Blue IL-2生物测定结果在图54A-F中示出。
实例11
为了了解示例性靶向肿瘤的杂合鼠源化分子在体内的药代动力学和药效学曲线,测试了由具有不同切割位点的人Fc和小鼠IL-12构建的三种分子。
AK944(MPYDLYHP)、AK945(ISSGLLSGRS)、AK947(RAAAVKSP)用于2个肿瘤模型MB49和B16F10,无掩蔽的亲本AK948用作对照。
此实例中使用的构建体的详细信息如下:
成熟小鼠IL-12 p40和IL-12 p35亚基的序列,以及分子中使用的小鼠IL-12R掩蔽部分如下:
小鼠IL-12 p40亚基:
MWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS
小鼠IL-12p35亚基:
RVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
小鼠IL-12R掩蔽部分:
LYHPSGPMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSGGGGSGGGGSGGGGSRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA
每个分子的全序列信息如下表所示(可切割接头以粗体示出,不可切割接头以下划线示出):
在此研究中,将C57BL/6小鼠皮下接种1x106MB49或0.5x106B16F10肿瘤细胞。当肿瘤大小达到300mm3时开始处理。分子的施用是通过0.5或3mg/kg的单次i.v.注射。在处理开始后第五天对动物实施安乐死。记录体重和器官重量:
分析了以下读数:
-肿瘤生长抑制:在B16模型中,AK945和AK947的肿瘤体积显著减小。
-肿瘤重量:单剂量AK945在MB49中以低剂量显著降低肿瘤重量。
-体重变化的%:所有掩蔽的分子都示出对体重减轻的保护作用。
-脾脏重量:MB49模型的脾脏重量增加,但B16的脾脏重量未增加。模型之间媒剂组的脾脏重量差异可能是肿瘤特异性驱动的。
-肺重量(仅MB49模型):MB49模型中的肺重量不受IL-12变体的影响。
结果示出于图55-59中。
与包含血液和脾脏在内的多个外周器官相比,FACS分析还用于研究肿瘤微环境中的免疫应答。肿瘤微环境中CD8 T细胞的激活和/或扩增、CD8 T细胞/T-reg比率是特别令人关注的。
分析了以下PD读数:
-TME中的CD45
-CD8 T细胞:CD8 T细胞在高剂量AK947的肿瘤微环境中增加。AK947还扩增CD8 T细胞外周。
-CD8/Treg比率:CD8/Treg比率在肿瘤微环境中增加。
-CD8 T细胞增殖:TME中CD8 T细胞增殖没有差异。CD8 T细胞在TME中比在外周中更容易增殖。
-CD8激活标志物:CD8 T细胞在肿瘤微环境中更加活跃。
结果示出于图60-65中
最后,在第5天测量血清小鼠ALT测量结果;使用第3天的血浆进行小鼠IFN-γ和TNF-αELISA,以研究靶向肿瘤的分子激活的下游信号传导。
分析了以下读数:
-毒性-ALT测定:IL-12变体在低剂量下不包含肝脏毒性
-D3血清细胞因子:在掩蔽的IL-12经处理的小鼠中,血清IFNγ表达显著降低。所有IL-12变体的IFN-γ均存在剂量依赖性增加,但显著低于非掩蔽的亲本分子。处理开始后第3天,高剂量IL-12变体诱导的血清TNFα表达与亲本相当。
-PK:Fc捕获、Fc检测:Fc检测PK-ELISA表明B16模型中药物在血浆中的累积没有差异。使用Fc捕获、Fc检测ELISA进行PK分析。
结果示出于图66-68中。
实例12
此研究的目的是确定安全性,并比较示例性靶向肿瘤的分子在食蟹猴中的药代动力学和药效学。
在此研究中分别测试了三种含有GAG结合突变的分子,所述分子构建有具有切割位点RAAAVKSP、ISSGLLSGRS和MPYDLYHP的具有不同切割位点AK921、AK923、AK667的人Fc和人IL-12。AK671,即具有GAG结合突变的亲本非掩蔽的分子用作阳性对照。这些分子的结构在实例8中示出,并且确切序列在第10节的序列表中。
在第0天、第7天、第14天和第21天,将动物以约1.0毫升/分钟的速度静脉注射,剂量为4mL/kg,共4剂。将在不同的时间点(直到第56天)收集血浆,用于进行完整的PK分析。
PK分析将使用Fc捕获、Fc检测ELISA进行。还将进行血液学、血清化学。将在第0天(给药前)、第5天和第12天对以下标志物进行FACS分析:CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD45、CD127、CD278、CD159a、FoxP3和Ki67。
结果示出于图69-71中。
-通过流式细胞仪进行PD:在外周血给药前和给药后的不同时间点对T细胞和NK细胞增殖状态进行流式细胞术分析。在NK细胞和CD8 T细胞中获取增殖标志物Ki-67的MFI,并在第一次施用后在第14天观察到峰值变化。在血液中的NK细胞和CD8 T细胞中,非掩蔽AK671的Ki-67 MFI均显著增加,而掩蔽的分子未示出显著的外周NK或T细胞激活。执行单因素ANOVA Bonferonni的多重比较后测试以确定处理相对于媒剂的统计显著性(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001)。参见图70中的结果
-血液学和血清化学:在第1天和第5天进行血液学和血清化学。(a)在所有组中观察到血液中绝对淋巴细胞计数(第1天)、RBC(第8天)和血细胞比容(HCT)的百分比(第8天)的短暂下降。对于掩蔽的分子和非掩蔽的分子,所有观察结果均在正常范围内。(b)第一次给药后第5天,非掩蔽的AK671增加了血清ALT、AST和TBILI(肝功能测试的生物标志物)(不显著)。AK667、AK921和AK923的掩蔽的分子在血清中示出相对较低的ALT、AST和TBILI水平。参见图71A和71B中的结果(箭头指示给药时间)。
10.序列
可切割接头:
不可切割接头:
细胞因子:
掩蔽部分:
半衰期延长结构域:
切割产物:
全序列:
11.构建体列表
下表示出了通过‘AK’参考编号标记的分子的全序列。还示出了序列的组分部分以及其组装在分子链中的顺序。单独的链用‘DNA’参考编号标记:
Claims (110)
1.一种掩蔽的IL-12细胞因子,其包括蛋白质异二聚体,所述蛋白质异二聚体包括:
第一多肽链,所述第一多肽链包括:
N'HL1-L1-MM C'
以及第二多肽链,所述第二多肽链包括:
N'HL2-L2-C C'
其中HL1是第一半衰期延长结构域,L1是第一接头,MM是掩蔽部分,HL2是第二半衰期延长结构域,L2是第二接头,并且C是IL-12细胞因子或其功能片段,
其中所述第一半衰期延长结构域与所述第二半衰期延长结构域缔合,并且
其中所述第一接头或所述第二接头中的一个包括蛋白水解可切割肽。
2.根据权利要求1所述的掩蔽的细胞因子,其中IL-12多肽或其功能片段包括与IL-12p35多肽或其功能片段共价连接的IL-12p40多肽或其功能片段。
3.根据权利要求2所述的掩蔽的细胞因子,其中IL-12p40-IL-12p35接头的长度介于5个氨基酸与20个氨基酸之间。
4.根据权利要求2或3所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p40-IL-12p35接头富含氨基酸残基G和S。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p40-IL-12p35接头包括SEQ ID NO:3(GGGGSGGGGSGGGGS)。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的掩蔽的细胞因子,其中IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:1。
8.根据权利要求6所述的掩蔽的细胞因子,其中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括对GAG结合结构域([g1]KSKREKKDRV)[/g1]的至少一个氨基酸修饰。
9.根据权利要求8所述的掩蔽的细胞因子,其中IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:57。
10.根据权利要求8所述的掩蔽的细胞因子,其中IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:58。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,IL-12p40多肽包括具有一个或多个半胱氨酸取代突变的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:59。
13.根据权利要求11所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p40多肽包括SEQ ID NO:60。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p35多肽包括SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12p35多肽包括SEQ ID NO:2。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:4。
17.根据权利要求1至10中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:61。
18.根据权利要求1至10中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:62。
19.根据权利要求1至12中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:63。
20.根据权利要求1至13中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述IL-12细胞因子或其功能片段包括SEQ ID NO:64。
21.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括IL-12细胞因子受体或其亚基或功能片段。
22.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。
23.根据权利要求22所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至237,即具有SEQ ID NO:5的序列。
24.根据权利要求22所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ1的残基24至545,即具有SEQ ID NO:6的序列。
25.根据权利要求1至21中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的胞外结构域或其保留或以其它方式展示对IL-12的亲和力的片段、部分或变体。
26.根据权利要求25所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至212,即具有SEQ ID NO:7的序列。
27.根据权利要求25所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至222,即具有SEQ ID NO:8的序列,或者其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至227,即具有SEQ ID NO:11的序列。
28.根据权利要求25所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至319,即具有SEQ ID NO:9的序列。
29.根据权利要求28所述的掩蔽的细胞因子,其中与SEQ ID NO:9的序列相比,所述掩蔽部分包括至少一个氨基酸修饰,任选地其中所述修饰是半胱氨酸取代突变。
30.根据权利要求29所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括SEQ ID NO:65。
31.根据权利要求25所述的掩蔽的细胞因子,其中所述掩蔽部分包括人IL-12Rβ2的残基24至622,即具有SEQ ID NO:10的序列。
32.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽的长度为6个氨基酸至10个氨基酸。
33.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:15的氨基酸序列。
34.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:41的氨基酸序列。
35.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:42的氨基酸序列。
36.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:43的氨基酸序列。
37.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:44的氨基酸序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割肽包括SEQID NO:45的氨基酸序列。
39.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括
N'HL2-可切割的L2-C C'
40.根据权利要求39所述的掩蔽的细胞因子,其中不可切割接头的长度介于3个氨基酸与18个氨基酸之间。
41.根据权利要求39所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头的长度介于3个氨基酸与15个氨基酸之间。
42.根据权利要求30至41中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头富含氨基酸残基G和S。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包含[(G)nS],其中n=4或5。
44.根据权利要求39至43中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列(GGGGS)。
45.根据权利要求39至43中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列(GGGGSGGGGS)。
46.根据权利要求39至43中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列(GGSGGGSGGGGGS)。
47.根据权利要求39至42中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列(GGSGGSGGSGGSGGSSGP)。
48.根据权利要求39至42中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列(PGGSGP)。
49.根据权利要求39至42中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述不可切割接头包括如SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列(GGSPG)。
50.根据权利要求39至49中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中可切割接头包括在两侧上侧接有间隔子结构域(SD)的蛋白水解可切割肽(CP):
SD1-CP-SD2
其中SD1和SD2不同,使得所述第一多肽链包括:
N'HL1-不可切割的L1-MM C'
并且所述第二多肽链包括:
N'HL2-SD1-CP-SD2-C C'。
51.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中第一间隔子结构域(SD1)的长度介于3个氨基酸与10个氨基酸之间。
52.根据权利要求50或51所述的掩蔽的细胞因子,其中SD1包括SEQ ID NO:16(GGSGGS)。
53.根据权利要求50或51所述的掩蔽的细胞因子,其中SD1包括SEQ ID NO:17(GGSGGSGGS)。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中第二间隔子结构域(SD2)的长度介于3个氨基酸与6个氨基酸之间。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中SD2包括SEQ ID NO:18(SGP)。
56.根据权利要求50所述的掩蔽的IL-2细胞因子,其中所述蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
57.根据权利要求50所述的掩蔽的IL-2细胞因子,其中所述蛋白水解可切割接头包括SD1-CP-SD2,其中SD1是第一间隔子结构域,CP是可切割肽并且SD2是第二间隔子结构域,并且其中CP具有如SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列,并且SD2具有如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
58.根据权利要求50至54中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:19(GGSGGSVPLSLYSGP)。
59.根据权利要求50至54中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:20(GGSGGSGGSVPLSLYSGP)。
60.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:46(GGSGGSMPYDLYHPSGP)。
61.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:47(GGSGGSGGSMPYDLYHPSGP)。
62.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:48(GGSGGSDSGGFMLTSGP)。
63.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:49(GGSGGSGGSDSGGFMLTSGP)。
64.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:50(GGSGGSRAAAVKSPSGP)。
65.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:51(GGSGGSGGSRAAAVKSPSGP)。
66.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:52(GGSGGSISSGLLSGRSSGP)。
67.根据权利要求50所述的掩蔽的细胞因子,其中所述可切割接头包括SEQ ID NO:53(GGSGGSGGSISSGLLSGRSSGP)。
68.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一半衰期延长结构域包括第一IgG1 Fc结构域或其片段,并且所述第二半衰期延长结构域包括第二IgG1 Fc结构域或其片段。
69.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一Fc结构域和/或所述第二Fc结构域各自含有促进所述第一半衰期延长结构域和所述第二半衰期延长结构域非共价缔合的一个或多个修饰。
70.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:25(Y349C;T366S;L38A;Y407V;以及N297A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO 26(S354C、T366W和N297A)。
71.根据前述权利要求中任一项所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:27(Y349C;T366S;L38A;Y407V;N297A;以及I253A),并且所述第二半衰期延长结构域包括SEQ ID NO:28(S354C、T366W、N297A和I253A)。
72.根据权利要求1所述的掩蔽的细胞因子,其中所述第一多肽链包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列,并且第二多肽链包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
73.一种切割产物,其能够与IL-12R结合,所述切割产物包括IL-12细胞因子或其功能片段,所述切割产物可通过对根据权利要求1至42中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子中的所述可切割肽进行蛋白水解切割来制备。
74.一种掩蔽的IL-12细胞因子的切割产物,其中所述切割产物能够与IL-12R结合,所述切割产物包括包含以下的多肽:
PCP-SD2-C
其中PCP是蛋白水解可切割肽的一部分;SD2是间隔子结构域;并且C是IL-12细胞因子或其功能片段。
75.根据权利要求74所述的切割产物,其中PCP是如权利要求32至38中任一项所定义的蛋白水解可切割肽的一部分。
76.根据权利要求74或75所述的切割产物,其中SD2是如权利要求54至55中任一项所定义的间隔子结构域。
77.根据权利要求74至76中任一项所述的切割产物,其中C是如权利要求2至20中任一项所定义的IL-12细胞因子或其功能片段。
78.根据权利要求74至77中任一项所述的切割产物,其中所述切割产物包括与选自由SEQ ID NO:29组成的组的氨基酸序列具有约或至少约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。
79.根据权利要求78所述的切割产物,其中所述切割产物包括SEQ IDNO:29的氨基酸序列。
80.一种核酸,其编码根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子或编码根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子的多肽链之一。
81.一种载体,其包括根据权利要求80所述的核酸。
82.一种宿主细胞,其包括编码根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子的核酸。
83.一种组合物,其包括根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子。
84.一种药物组合物,其包括根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子以及药学上可接受的载体。
85.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述药物组合物呈单单位剂型。
86.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述药物组合物被调配用于静脉内施用并且呈单单位剂型。
87.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述药物组合物被调配用于注射并且呈单单位剂型。
88.根据权利要求84所述的药物组合物,其中所述药物组合物是液体并且呈单单位剂型。
89.一种试剂盒,其包括根据权利要求1至41中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子、或根据权利要求83所述的组合物或根据权利要求84至88所述的药物组合物。
90.一种产生根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子的方法,所述方法包括在产生所述掩蔽的IL-12细胞因子的条件下培养根据权利要求82所述的宿主细胞。
91.一种核酸,其编码根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物。
92.一种组合物,其包括根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物。
93.一种药物组合物,其包括根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物以及药学上可接受的载体。
94.根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子,其用于医学中。
95.根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物,其用于医学中。
96.一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子。
97.一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求83或92所述的组合物。
98.一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求84至88和93中任一项所述的药物组合物。
99.一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子,由此所述掩蔽的细胞因子在体内被蛋白水解切割以产生根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物。
100.一种治疗或预防受试者的癌症的方法,所述方法包括在体内产生能够与其同源受体结合的切割产物的步骤,其中所述切割产物如权利要求73至79中任一项所定义。
101.根据权利要求96至100中任一项所述的方法,其中所述癌症是实体瘤。
102.根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子,其用于治疗或预防癌症。
103.根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的IL-12细胞因子,其用于治疗或预防癌症的方法中,所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述掩蔽的IL-12细胞因子,由此所述掩蔽的细胞因子在体内被蛋白水解切割以产生根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物。
104.根据权利要求103所述的供使用的掩蔽的IL-12细胞因子,其中所述癌症是实体瘤。
105.根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物,其用于治疗或预防癌症。
106.根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物,其用于治疗或预防癌症的方法中,所述方法包括向患者施用根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的细胞因子的步骤,由此通过在体内对所述掩蔽的细胞因子进行蛋白水解切割来产生所述切割产物。
107.根据权利要求73至79中任一项所述的切割产物,其用于治疗或预防受试者的癌症的方法中,所述方法包括通过对已经施用于所述受试者的根据权利要求1至72中任一项所述的掩蔽的细胞因子进行体内蛋白水解切割来产生所述切割产物的步骤。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的供使用的切割产物,其中所述癌症是实体瘤。
109.根据权利要求84至88和93中任一项所述的药物组合物,其用于治疗或预防癌症。
110.根据权利要求109所述的供使用的药物组合物,其中所述癌症是实体瘤。
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