JP2023520518A - マスクされたｉｌ－１２サイトカイン及びその切断産物 - Google Patents

マスクされたｉｌ－１２サイトカイン及びその切断産物 Download PDF

Info

Publication number
JP2023520518A
JP2023520518A JP2022560206A JP2022560206A JP2023520518A JP 2023520518 A JP2023520518 A JP 2023520518A JP 2022560206 A JP2022560206 A JP 2022560206A JP 2022560206 A JP2022560206 A JP 2022560206A JP 2023520518 A JP2023520518 A JP 2023520518A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cytokine
masked
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022560206A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021202678A5 (ja
Inventor
ラファエル ローゼンフェルド，
ウグル エスキオチャク，
ファーウェイ チウ，
パーカー ジョンソン，
カート アレン ジェンキンス，
マガリ ペデルゾリ－リベイル，
ディラージ スィング トマル，
レベカ カイ オドンネル，
Original Assignee
エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド filed Critical エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド
Publication of JP2023520518A publication Critical patent/JP2023520518A/ja
Publication of JPWO2021202678A5 publication Critical patent/JPWO2021202678A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

【要約書】本発明は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片と、マスキング部分と、タンパク質分解的に切断可能なリンカーとを含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカインに関する。マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片をマスクし、それによって、ＩＬ－サイトカイン又はその機能的断片のその同族受容体への結合を低減又は防止するが、標的部位における切断可能なリンカーのタンパク質分解切断時に、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、活性化され、その同族受容体への結合が可能又はより可能なものになる。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれが参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１日に出願された米国仮出願第６３／００３，８４２号、２０２０年１１月２５日に出願された第６３／１１８，５７９号、及び２０２０年１２月１８日に出願された第６３／１２７，８９３号の優先権の利益を主張する。
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出の内容は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７７６２００２８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年３月２６日、サイズ：１，０００ＫＢ）。
本発明は、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン、並びにその使用及び製造に関連する方法に関する。本発明はまた、該マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物、及びその使用に関連する方法に関する。
がんは、米国で第２の主要な死因であり、次の５つの主要な原因（慢性呼吸器疾患、脳卒中、事故、アルツハイマー病、及び糖尿病）よりも多くの死亡を占めている。特に標的療法では大きな進歩が遂げられているが、この分野ではまだ多くの研究が残されている。免疫療法及びこの分野の分科である免疫腫瘍学は、悪性腫瘍を治療するための実行可能で刺激的な治療選択肢を生み出している。特に、がんの１つの特徴は免疫回避であり、顕著な努力が、がんを認識及び治療するために免疫系を再活性化するための標的を識別し、これらの標的に対する療法を開発してきたことが現在では認識されている。
サイトカインは、その三次元構造に基づいてなど、様々な方法で分類されることができる。いくつかのサイトカインは、ヘテロ二量体であるとして分類される。ヘテロ二量体サイトカインの例としては、ＩＬ－１２及びＩＬ－２３が挙げられる。ＩＬ－１２サイトカインは、ｐ３５及びｐ４０サブユニットを含むヘテロ二量体である。
サイトカイン療法は、免疫系を刺激して抗腫瘍細胞傷害を誘発するための有効な方略である。特に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の組換え形態であるアルデスロイキンは、転移性腎細胞がん及び黒色腫の治療のためにＦＤＡによって承認されている。残念ながら、患者に投与されるサイトカインは、一般的に非常に短い半減期を有し、それによって、頻繁な投与を必要とする。例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎというブランド名で市販されているアルデスロイキンの製品ラベルは、５分間の静脈内（ＩＶ）注入を受けた患者では薬物が８５分の半減期を有することが示されたと記載している。加えて、高用量のサイトカインの投与は、全身免疫活性化を通して血管漏出などの有害な健康転帰を引き起こし得る。これらの所見は、全身免疫活性化に関連する副作用を伴わずに腫瘍を効果的に標的化するＩＬ－２サイトカイン治療薬を開発する必要性を例証している。
本明細書で提供されるものは、この必要性に対処するために、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン、該マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物、及びその組成物、並びにその使用方法である。
開示される発明は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片の１つ以上の受容体結合部位においてマスキング部分によってマスクされるように操作される、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片に関する。ＩＬ－１２サイトカインは、タンパク質分解的に切断可能なリンカーを含むことによって、腫瘍微小環境内などの標的部位においてプロテアーゼによって活性化可能であるように操作される。マスクされたサイトカイン構築物では、マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片のその同族受容体への結合を低減又は防止する。標的部位における切断可能なリンカーのタンパク質分解切断時に、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、活性化され、その同族受容体への結合が可能又はより可能なものになる。
本明細書で提供されるものは、ヘテロ二量体を含むマスクされたＩＬ－１２サイトカインであって、
以下を含む第１のポリペプチド鎖と、
Figure 2023520518000002
以下を含む第２のポリペプチド鎖と、を含み、
Figure 2023520518000003
ＨＬ１が、第１の半減期延長ドメインであり、Ｌ１が、第１のリンカーであり、ＭＭが、マスキング部分であり、ＨＬ２が、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２が、第２のリンカーであり、Ｃが、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片であり、
第１の半減期延長ドメインが、第２の半減期延長ドメインと会合しており、
第１のリンカー又は第２のリンカーのうちの１つが、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカインである。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド又はその機能的断片は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片に共有結合されたＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、長さで５～２０個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、配列番号３を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、ＧＡＧ－結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５７を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５８を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して１つ以上のサイトカイン置換変異を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５９を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号６０を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、配列番号２を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６１を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６２を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６３を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン受容体、又はそのサブユニット若しくは機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１、又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、配列番号５を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、配列番号６を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２、又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち、配列番号７を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号８を有する配列を含むか、又はマスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち、配列番号１１を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号９を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号９の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、任意選択的に、該修飾は、システイン置換変異である。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６５を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち、配列番号１０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、長さで６～１０個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000004
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000005
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、長さで３～１８個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、長さで３～１５個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、［（Ｇ）ｎＳ］を含み、ｎ＝４又は５である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５４（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５５（ＰＧＧＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５６（ＧＧＳＰＧ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、スペーサードメイン（ＳＤ）が両側に配置されたタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含み、
ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２
ＳＤ１及びＳＤ２は、第１のポリペプチド鎖が以下を含み、
Figure 2023520518000006
第２のポリペプチド鎖が以下を含むように、異なる。
Figure 2023520518000007
いくつかの実施形態では、第１のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、長さで３～１０個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、配列番号１６を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、配列番号１７を含む。
いくつかの実施形態では、第２のスペーサードメイン（ＳＤ２）は、長さで３～６個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＳＤ２は、配列番号１８を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号１９を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号２０を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４６（ＧＧＳＧＧＳＭＰＹＤＬＹＨＰＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４７（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＭＰＹＤＬＹＨＰＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４８（ＧＧＳＧＧＳＤＳＧＧＦＭＬＴＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４９（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＤＳＧＧＦＭＬＴＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５０（ＧＧＳＧＧＳＲＡＡＡＶＫＳＰＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５１（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＲＡＡＡＶＫＳＰＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５２（ＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５３（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＧＰ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、第１のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含み、第２の半減期延長ドメインは、第２のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃドメインは各々、第１及び第２の半減期延長ドメインの非共有結合性会合を促進する１つ以上の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、前記第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、第１のペプチド鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、第２のペプチド鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
本明細書で提供されるものは、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能な切断産物であって、本明細書に記載される記述又は実施形態のうちのいずれか１つで定義されるマスクされたＩＬ－１２サイトカイン中の切断可能なペプチドのタンパク質分解切断によって調製可能である、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む、切断産物である。
本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であって、切断産物は、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、切断産物は、以下を含むポリペプチドを含み、
ＰＣＰ－ＳＤ２－Ｃ
ＰＣＰは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部であり、ＳＤ２は、スペーサードメインであり、Ｃは、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である。
いくつかの実施形態では、ＰＣＰは、本明細書に記載されるタンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部分である。
いくつかの実施形態では、ＳＤ２は、本明細書に記載されるスペーサードメインである。
いくつかの実施形態では、Ｃは、本明細書に記載されるＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれか１つをコードする核酸である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれか１つの鎖のうちの１つをコードする核酸である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される核酸を含む、ベクターである。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインをコードする核酸を含む、ベクターである。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの鎖のうちの１つをコードする核酸を含む、ベクターである。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞である。
一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれか１つを含む、組成物である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれか１つと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単一単位剤形である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化され、単一単位剤形である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、注射のために製剤化され、単一単位剤形である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体であり、単一単位剤形である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカイン、又は本明細書に記載される組成物、若しくは本明細書に記載される医薬組成物を含む、キットである。
本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインを産生する条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを産生する方法である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される切断産物をコードする核酸である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される切断産物を含む組成物である。
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される切断産物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
本明細書で提供されるものは、薬物で使用するための本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインである。
本明細書で提供されるものは、薬物で使用するための本明細書に記載される切断産物である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法であって、有効量の本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを対象に投与することを含む、方法である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法であって、有効量の本明細書に記載される組成物を対象に投与することを含む、方法である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法であって、有効量の本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む、方法である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法であって、有効量の本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを対象に投与することを含み、それによって、マスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断され、本明細書に記載される切断産物を産生する、方法である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法であって、同族受容体に結合することが可能である切断産物をインビボで産生するステップを含み、切断産物が、本明細書に記載される、方法である。
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
本明細書で提供されるものは、がんの治療又は予防に使用するための本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインである。
本明細書で提供されるものは、がんを治療又は予防する方法で使用するための本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインであって、方法が、有効量のマスクされたＩＬ－１２サイトカインを対象に投与することを含み、それによって、マスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断され、本明細書に記載される切断産物を産生する、マスクされたＩＬ－１２サイトカインである。
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
本明細書で提供されるものは、がんの治療又は予防に使用するための本明細書に記載される切断産物である。
本明細書で提供されるものは、がんを治療又は予防する方法で使用するための本明細書に記載される切断産物であって、方法が、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインを患者に投与し、それによって、インビボでマスクされたサイトカインのタンパク質分解切断によって切断産物を産生するステップを含む、切断産物である。
本明細書で提供されるものは、対象においてがんを治療又は予防する方法で使用するための本明細書に記載される切断産物であって、方法が、対象に投与された本明細書に記載されるマスクされたサイトカインからインビボのタンパク質分解切断によって切断産物を産生するステップを含む、切断産物である。
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
本明細書で提供されるものは、がんの治療又は予防に使用するための本明細書に記載される医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
マスキング部分と、サイトカイン又はその機能的断片（「サイトカイン」）と、半減期延長ドメインと、第１の切断可能なペプチド（「１ＣＰ」）、第１のＮ末端スペーサードメイン（「１ＮＳＤ」）、及び第１のＣ末端スペーサードメイン（「１ＣＳＤ」）を含む、第１のリンカーとを含む、マスクされたサイトカインの例示的実施形態の構造を示す。これらの例示的実施形態はまた、第２の切断可能なペプチド（「２ＣＰ」）、第２のＮ末端スペーサードメイン（「２ＮＳＤ」）、及び第２のＣ末端スペーサードメイン（「２ＣＳＤ」）を含む、第２のリンカーも含む。矢印によって示されるように、例示的実施形態は、第１のリンカーに連結されたマスキング部分を示し、サイトカイン又はその機能的断片は、第１のリンカー及び第２のリンカーに連結されるが、マスキング部分及びサイトカイン又はその機能的断片は、サイトカイン又はその機能的断片が第１のリンカーに連結され、マスキング部分が第１のリンカー及び第２のリンカーに連結されるように、交換され得る。図１は、単量体としてのマスクされたサイトカインの例示的実施形態の構造を示す。 マスキング部分と、サイトカイン又はその機能的断片（「サイトカイン」）と、第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む、マスクされたサイトカインの例示的実施形態の構造を示す。図２に示される例示的実施形態はまた、第１の切断可能なペプチド（「１ＣＰ」）、第１のＮ末端スペーサードメイン（「１ＮＳＤ」）、及び第１のＣ末端スペーサードメイン（「１ＣＳＤ」）を含む、第１のリンカーと、第２の切断可能なペプチド（「２ＣＰ」）、第２のＮ末端スペーサードメイン（「２ＮＳＤ」）、及び第２のＣ末端スペーサードメイン（「２ＣＳＤ」）を含む、第２のリンカーとを含む。例示的な第１及び第２の半減期延長ドメインは、第１の半減期延長ドメイン内の「ホール」及び第２の半減期延長ドメイン内の「ノブ」によって示されるように、第２の半減期延長ドメインとの第１の半減期延長ドメインの会合を促進する「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）」修飾を含む。第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインはまた、ジスルフィド結合の形成により、少なくとも部分的に会合するものとして示される。「ホール」は、（マスキング部分に連結された）第１の半減期延長ドメインの一部として描写され、「ノブ」は、（サイトカインに連結された）第２の半減期延長ドメインの一部として描写され、「ホール」及び「ノブ」は、代替的に、「ホール」が（サイトカインに連結された）第２の半減期延長ドメインの一部であり、「ノブ」が（マスキング部分に連結された）第１の半減期延長ドメインの一部であるように、それぞれ、第２の半減期延長ドメイン及び第１の半減期延長ドメインに含まれ得ることを理解されたい。 腫瘍微小環境などにおけるプロテアーゼによる切断の前（左）及び後（右）のマスクされたサイトカインの例示的実施形態を示す。図３Ａ～３Ｂは、マスクされたＩＬ－２サイトカインの例示的実施形態を示す。プロテアーゼによる切断は、マスキング部分（例えば、図３Ｂに示されるようなＩＬ－２Ｒβ）を放出するか、又はＩＬ－２（図３Ａ）を放出する。 ＩＬ－２構築物（ＡＫ３０４、ＡＫ３０５、ＡＫ３０７、ＡＫ３０８、ＡＫ３０９、ＡＫ３１０、ＡＫ３１１、ＡＫ３１２、ＡＫ３１３、ＡＫ３１４、及びＡＫ３１５）の産生及び精製後の、フロースルー（ＦＴ）サンプル（すなわち、プロテインＡカラムに結合しなかったタンパク質）及び溶出（Ｅ）サンプル（すなわち、プロテインＡカラムに結合し、そこから溶出されたタンパク質）についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 ＣＤ２５－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）又はｒｈＩＬ２対照の結合を試験したＳＰＲ分析からの結果を示す。図５Ａは、ＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図５Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図５Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。 ＣＤ１２２－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）又はｒｈＩＬ－２対照の結合を試験したＳＰＲ分析からの結果を示す。図６Ａは、ＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｂは、プロテアーゼで活性化されたＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示し、図６Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を示す。図６Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。 腫瘍微小環境などにおけるプロテアーゼによる切断の前（左）及び後（右）のマスクされたサイトカインの例示的実施形態を示す。 Ｆｃ部分からのＩＬ－２の放出を実証する、ＭＭＰ１０プロテアーゼの非存在下（左レーン）又は存在下（右レーン）でインキュベートされた例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 対照として構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０３５、ＡＫ０４１、又はｒｈＩＬ－２で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ｒｈＩＬ－２（図８Ａ）、ＡＫ０３２（図８Ｂ）、ＡＫ０３５（図８Ｃ）、又はＡＫ０４１（図８Ｄ）を用いたインキュベーション後に決定される、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について示される。 対照として構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０３５、ＡＫ０４１、又はｒｈＩＬ－２で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ｒｈＩＬ－２（図８Ａ）、ＡＫ０３２（図８Ｂ）、ＡＫ０３５（図８Ｃ）、又はＡＫ０４１（図８Ｄ）を用いたインキュベーション後に決定される、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について示される。 構築物ＡＫ０８１又はＡＫ０３２で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。ＭＭＰ１０への事前曝露の有無別のＡＫ０８１構築が試験された。アイソタイプ対照並びに無ＩＬ－２陰性対照も試験された。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ＮＫ細胞（図９Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）、及びＣＤ４＋Ｔ細胞（図９Ｂ）について示される。 構築物ＡＫ０８１及びＡＫ１１１、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を示す。無治療対照も試験された。ＥＣ５０（ｐＭ）もまた、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ０８１、及びＡＫ１１１治療について示される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１０Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１０Ｂ）、及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１０Ｃ）について示される。図１０Ｄは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１構築物、並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。 構築物ＡＫ０８１及びＡＫ１１１、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を示す。無治療対照も試験された。ＥＣ５０（ｐＭ）もまた、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ０８１、及びＡＫ１１１治療について示される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１０Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１０Ｂ）、及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１０Ｃ）について示される。図１０Ｄは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１構築物、並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。 構築物ＡＫ１６７及びＡＫ１６８、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。無治療対照も試験された。ＥＣ５０（ｐＭ）もまた、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８治療について示される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１１Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１１Ｂ）、及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１１Ｃ）について示される。図１１Ｄは、ＡＫ１６７及びＡＫ１６８構築物、並びにｒｈＩＬ－２対照についてＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。 構築物ＡＫ１６７及びＡＫ１６８、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化研究の結果を示す。無治療対照も試験された。ＥＣ５０（ｐＭ）もまた、ｒｈＩＬ－２、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８治療について示される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞（図１１Ａ）、ＣＤ８＋細胞（図１１Ｂ）、及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１１Ｃ）について示される。図１１Ｄは、ＡＫ１６７及びＡＫ１６８構築物、並びにｒｈＩＬ－２対照についてＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。 （＋ＭＭＰ１０）であったか、又は以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、構築物ＡＫ１６５若しくはＡＫ１６６、又はアイソタイプ対照若しくはＩＬ－２－Ｆｃ対照で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１２Ａに示されるような凡例は、図１２Ｂにも適用され、図１２Ｃに示されるような凡例は、図１２Ｄにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ調節性細胞（図１２Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔヘルパー細胞（図１２Ｂ）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（図１２Ｃ）、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図１２Ｄ）について示される。 （＋ＭＭＰ１０）であったか、又は以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、構築物ＡＫ１６５若しくはＡＫ１６６、又はアイソタイプ対照若しくはＩＬ－２－Ｆｃ対照で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１２Ａに示されるような凡例は、図１２Ｂにも適用され、図１２Ｃに示されるような凡例は、図１２Ｄにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ調節性細胞（図１２Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔヘルパー細胞（図１２Ｂ）、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（図１２Ｃ）、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞（図１２Ｄ）について示される。 （＋ＭＭＰ１０）であったか、又は以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、構築物ＡＫ１０９若しくはＡＫ１１０、又はアイソタイプ対照若しくはＩＬ－２－Ｆｃ対照で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１２Ｂに示されるような凡例は、図１３Ａにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＮＫ細胞（図１３Ａ）、ＣＤ８細胞（図１３Ｂ）、及びＣＤ４細胞（図１３Ｃ）について示される。 構築物ＡＫ２１１、ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４、及びＡＫ３１６、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞（図１４Ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－細胞（図１４Ｂ）、及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（図１４Ｃ）について示される。図１４Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。 構築物ＡＫ２１１、ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４、及びＡＫ３１６、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞（図１４Ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－細胞（図１４Ｂ）、及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（図１４Ｃ）について示される。図１４Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。 プロテアーゼによって活性化された構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１６７、ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、及びＡＫ２２３、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（図１５Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１５Ｂ）、及びＣＤ８＋細胞（図１５Ｃ）について示される。図１５Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。 プロテアーゼによって活性化された構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１６７、ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、及びＡＫ２２３、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、ＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を示す。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞（図１５Ａ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ２５－細胞（図１５Ｂ）、及びＣＤ８＋細胞（図１５Ｃ）について示される。図１５Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。 構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、若しくはＡＫ２１０、又は抗ＲＳＶ対照で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化（％）を示す。図１６Ａに示されるような凡例は、図１６Ｂ及び１６Ｃにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）が、調節性Ｔ細胞（図１６Ａ）、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（図１６Ｂ）、及びＣＤ８細胞（図１６Ｃ）について示される。 構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、若しくはＡＫ１９３、又は抗ＲＳＶ対照で治療されたＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５活性化に（％）を示す。図１７Ａに示されるような凡例は、図１７Ｂ及び１７Ｃにも適用される。ＳＴＡＴ５活性化（％）は、調節性Ｔ細胞（図１７Ａ）、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞（図１７Ｂ）、及びＣＤ８細胞（図１７Ｃ）について示される。 構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８、又は抗ＲＳＶ対照を使用して担腫瘍マウスで実行された薬物動態研究からの結果を示す。図１８Ａは、試験された構築物の各々の構造の単純な描写を提供する。図１８Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｃは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｄは、ヒトＩＬ－２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。検出ステップの前に、抗ヒトＩＧが、捕捉抗体として使用された。 構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、若しくはＡＫ２１１、又は抗ＲＳＶ対照を使用して担腫瘍マウスで実行された薬物動態研究からの結果を示す。図１９Ａは、試験された構築物の各々の構造の単純な描写を提供する。図１９Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｃは、ヒトＩＬ－２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｄは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。検出ステップの前に、抗ヒトＩＧが、捕捉抗体として使用された。 構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、若しくはＡＫ２１１、又は抗ＲＳＶ対照を使用して担腫瘍マウスで実行された薬物動態研究からの結果を示す。図１９Ａは、試験された構築物の各々の構造の単純な描写を提供する。図１９Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｃは、ヒトＩＬ－２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｄは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。検出ステップの前に、抗ヒトＩＧが、捕捉抗体として使用された。 ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｌ）が示される。 ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｌ）が示される。 ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２０Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２０Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２０Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２０Ｌ）が示される。 ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｌ）が示される。 ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｌ）が示される。 ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｈ）が示される。腫瘍組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２１Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２１Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２１Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２１Ｌ）が示される。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｈ）が示される。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｌ）が示される。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｈ）が示される。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｌ）が示される。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、若しくはＡＫ２１１構築物、又は抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果を示す。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ａ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｂ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｃ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｄ）が示される。血液については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｅ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｆ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｇ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｈ）が示される。脾臓組織については、ＣＤ３細胞のＣＤ８細胞％（図２２Ｉ）、ＣＤ３細胞のＣＤ４％（図２２Ｊ）、ＣＤ３－細胞のＮＫ細胞％（図２２Ｋ）、及びＣＤ４細胞のＦｏｘＰ３％（図２２Ｌ）が示される。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、又はＡＫ２１１構築物を使用した、脾臓、血液、及び腫瘍におけるインビボＴ細胞活性化からの結果を示す。Ｔ細胞活性化が、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２３Ａ、図２３Ｄ、図２３Ｇ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２３Ｂ、図２３Ｅ、図２３Ｈ）、又はＦｏｘｐ３＋細胞（図２３Ｃ、図２３Ｆ、図２３Ｉ）におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、又はＡＫ２１１構築物を使用した、脾臓、血液、及び腫瘍におけるインビボＴ細胞活性化からの結果を示す。Ｔ細胞活性化が、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２３Ａ、図２３Ｄ、図２３Ｇ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２３Ｂ、図２３Ｅ、図２３Ｈ）、又はＦｏｘｐ３＋細胞（図２３Ｃ、図２３Ｆ、図２３Ｉ）におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。 ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、又はＡＫ２１１構築物を使用した、脾臓、血液、及び腫瘍におけるインビボＴ細胞活性化からの結果を示す。Ｔ細胞活性化が、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２３Ａ、図２３Ｄ、図２３Ｇ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２３Ｂ、図２３Ｅ、図２３Ｈ）、又はＦｏｘｐ３＋細胞（図２３Ｃ、図２３Ｆ、図２３Ｉ）におけるＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。 例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８（切断可能なペプチド配列：ＭＰＹＤＬＹＨＰ）及びＡＫ２０９（切断可能なペプチド配列：ＶＰＬＳＬＹ、配列番号１５）のインビボ切断を試験した研究からの結果を示す。図２４Ｅは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、及びＡＫ２０９構築物の合計レベル、並びに各構築物の非切断形態のレベルについて、総血漿中ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）の薬物動態研究からの結果を示す。 例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８（切断可能なペプチド配列：ＭＰＹＤＬＹＨＰ）及びＡＫ２０９（切断可能なペプチド配列：ＶＰＬＳＬＹ、配列番号１５）のインビボ切断を試験した研究からの結果を示す。図２４Ｅは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、及びＡＫ２０９構築物の合計レベル、並びに各構築物の非切断形態のレベルについて、総血漿中ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）の薬物動態研究からの結果を示す。 例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１若しくはＡＫ１６８、又はマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１若しくはＡＫ１６７、又は抗ＲＳＶ対照を使用して血管漏出を評価したインビボ研究からの結果を示す。図２５Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、それぞれ、各々について肝臓、肺、及び脾臓の重量をグラムで示す。 ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ対照の投与後の肝臓及び肺組織内への染料漏出の程度を測定することによって示される血管漏出を評価したインビボ研究からの結果を示す。肝臓（図２６Ａ）及び肺（図２６Ｂ）内への染料漏出の程度が、６５０ｎｍにおける吸光度に基づいて測定された。 ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ対照の投与後の肝臓及び肺組織内への単核細胞血管周囲浸潤の程度を測定することによって示される血管漏出を評価したインビボ研究からの結果を示す。肝臓内の単核細胞の平均数（図２７Ａ）及び肺内の単核細胞の平均数（図２７Ｂ）が、各々について描写される。 ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ対照を用いた治療過程にわたって腫瘍体積及び体重を評価した同系腫瘍モデル研究からの結果を示す。図２８Ａは、治療過程にわたる腫瘍体積についてのデータを示し、図２８Ｂは、治療過程にわたる体重の変化率（％）についてのデータを示す。 ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８構築物、又は抗ＲＳＶ対照を用いた治療過程にわたって腫瘍体積及び体重を評価した同系腫瘍モデル研究からの結果を示す。図２８Ａは、治療過程にわたる腫瘍体積についてのデータを示し、図２８Ｂは、治療過程にわたる体重の変化率（％）についてのデータを示す。 Ｉ２５３Ａ ＦｃＲｎ変異を伴うＡＫ４７１が、ＴＭＥにおいて堅調なＣＤ８ Ｔ細胞の拡張を誘発した一方で、周辺では不活性のままであったことを示す。 ＡＫ４７１が、アグリコ－ｈＩｇＧ１と比較して、わずかに短い半減期を有することを示す。 血漿中のＡＫ４７１で切断又は切除の証拠がないことを示す。 例示的ＩＬ－１２構築物形式を示す。 例示的分子ＡＫ３８０、ＡＫ３８１、及びＡＫ３８４（図３４Ａ）、並びにＡＫ３８３、ＡＫ３８６、ＡＫ４３４、ＡＫ４４７、ＡＫ４４８、ＡＫ４４６、ＡＫ５２８、及びＡＫ５２９（図３４Ｂ）の例示的切断プロセスを示す。 ｒｈＩＬ－１２ＲＢ１－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－１２ポリペプチド構築物（ＡＫ３８４及びＡＫ３８６）の結合を試験したＳＰＲ分析を使用した、ＩＬ－１２ＲＢ１に向けたＩＬ－１２のマスキングを描写する。図３４Ａは、ＡＫ３８４とＩＬ－１２ＲＢ１－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図３４Ｂは、ＡＫ３８６とＩＬ－１２ＲＢ１－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図３４Ｃは、組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）対照と１２ＲＢ１－Ｆｃとの間の相互作用を描写する。図３４Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。曲線の形状により、正確な速度を決定することができず、したがって、ＫＤは、オンレートに基づいて推定される。これらの結果は、これらの例示的なマスクされたＩＬ－１２ポリペプチド構築物（ＡＫ３８４及びＡＫ３８６）が、ＩＬ－１２ＲＢ１－Ｆｃへの検出可能な結合を実証しなかった一方で、野生型ｒｈＩＬ－１２対照が、検出可能な結合を実証したことを実証する。 ｒｈＩＬ－１２ＲＢ２－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－１２ポリペプチド構築物（ＡＫ３８４及びＡＫ３８６）の結合を試験したＳＰＲ分析を使用した、ＩＬ－１２ＲＢ２に向けたＩＬ－１２のマスキングを描写する。図３５Ａは、ＡＫ３８４とＩＬ－１２ＲＢ２－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図３５Ｂは、ＡＫ３８６とＩＬ－１２ＲＢ２－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図３５Ｃは、組換えヒトＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）対照とＩＬ－１２ＲＢ２－Ｆｃとの間の相互作用を描写する。図３５Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。曲線の形状により、正確な速度を決定することができず、したがって、ＫＤは、オンレートに基づいて推定される。これらの結果は、例示的なマスクされたＩＬ－１２ポリペプチド構築物（ＡＫ３８６）が、ＩＬ－１２ＲＢ１－Ｆｃへの弱いが検出可能な結合を実証した一方で、野生型ｒｈＩＬ－１２対照及び例示的ＩＬ－１２ポリペプチド構築物（ＡＫ３８４）が、検出可能な結合を実証したことを実証する。 実施例６からの結果を示す。 実施例６からの結果を示す。 実施例６からの結果を示す。 実施例６からの結果を示す。 実施例６からの結果を示す。 実施例７からの結果を示す。 実施例７からの結果を示す。 実施例７からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 実施例８からの結果を示す。 ペプチド基質を含まない例示的ＩＬ－１５構築物ＡＫ９０４及びＡＫ９１０、並びにペプチド基質を含む構築物ＡＫ９３２、ＡＫ９３８、ＡＫ９３０、及びＡＫ９３６を使用した、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果を示す。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。 ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果を示す。 ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果を示す。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１１の結果を示す。例示的なマウス化分子ＡＫ９４４、ＡＫ９４５、ＡＫ９４７、及び対照ＡＫ９４８のＰＫ／ＰＤが、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０においてインビボで分析された。 実施例１２の結果を示す。例示的分子ＡＫ６６７、ＡＫ９２１、ＡＫ９２３、及び対照ＡＫ６７１のＰＫ、ＰＤ、血液、及び血清化学が、カニクイザルで分析された。 実施例１２の結果を示す。例示的分子ＡＫ６６７、ＡＫ９２１、ＡＫ９２３、及び対照ＡＫ６７１のＰＫ、ＰＤ、血液、及び血清化学が、カニクイザルで分析された。 実施例１２の結果を示す。例示的分子ＡＫ６６７、ＡＫ９２１、ＡＫ９２３、及び対照ＡＫ６７１のＰＫ、ＰＤ、血液、及び血清化学が、カニクイザルで分析された。 実施例１２の結果を示す。例示的分子ＡＫ６６７、ＡＫ９２１、ＡＫ９２３、及び対照ＡＫ６７１のＰＫ、ＰＤ、血液、及び血清化学が、カニクイザルで分析された。
マスキング部分を使用することにより、投与されたＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片の全身的副作用は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片のその同族受容体への結合能力を妨害することによって低減され得る。
インターロイキン１２受容体は、インターロイキン１２に結合する、Ｉ型サイトカイン受容体である。これは、ベータ１及びベータ２サブユニットからなる。
タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含むリンカーを使用して、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片をマスクすることにより、マスキング部分を使用することによって妨害される結合能力は、腫瘍微小環境における切断可能なペプチドの切断によって復元され得る。したがって、本明細書で提供されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、がんの特徴のうちの１つである、高局所濃度の活性プロテアーゼを活用することによって、腫瘍微小環境に薬理学的活性を正確に標的化するように操作される。腫瘍微小環境のこの特徴は、全身的に不活性な分子を、ＩＬ－１２切断産物の形態の局所的に活性なＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片に形質転換するために使用される。腫瘍微小環境におけるＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片の活性化は、活性形態で対象に投与される薬物と関連付けられ得る全身毒性を有意に低減する。したがって、本発明のマスクされたＩＬ－２サイトカインは、プロドラッグとみなされ得る。
本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、様々な有利な特性を示すことが見出されている。本明細書のいずれかの場所に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、タンパク質分解切断時に、優先的に腫瘍微小環境内で、かつ周辺ではより低いレベルにおいて、免疫細胞を活性化すること（増殖及び拡張）が可能であることが見出されている。本明細書のいずれかの場所に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、腫瘍の根絶の促進（すなわち、抗腫瘍活性を示す）及びタンパク質分解切断時の転移の阻害が可能であることが見出されている。本明細書のいずれかの場所に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、有利な長期薬物曝露を実証することが見出されている。本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、有利な安定性を実証することが見出されている。本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、有利な忍容性を実証することが見出されている。さらに、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、有利な効力を実証することが見出されている。
１．「ヘテロ二量体の」マスクされたサイトカイン
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、第１のポリペプチド鎖内のマスキング部分と、第２のポリペプチド鎖内のＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片とを含む、マスクされたサイトカインである。そのようなマスクされたサイトカインは、「ヘテロ二量体の」マスクされたサイトカインと称され得る。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、
ａ）第１のリンカーを介して第１の半減期延長ドメインに連結されたマスキング部分を含む、第１のポリペプチド鎖と、
ｂ）第２のリンカーを介して第２の半減期延長ドメインに連結されたＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む、第２のポリペプチド鎖と、を含む、タンパク質ヘテロ二量体であり、
第１の半減期延長ドメインは、第２の半減期延長ドメインと会合しており、
第１のリンカー又は第２のリンカーのうちの１つは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む。
マスキング部分、半減期延長ドメイン、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片、リンカー、及び第１の半減期延長ドメインと第２の半減期延長ドメインとの間の会合のタイプは、本明細書に記載されるもののうちのいずれか１つ、及び本明細書に記載されるものの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖において、第１の半減期延長ドメインは、第１のリンカーのアミノ末端に連結され、第１のリンカーのカルボキシ末端は、マスキング部分のアミノ末端に連結され、第２のポリペプチド鎖では、第２の半減期延長ドメインは、第２のリンカーのアミノ末端に連結され、第２のリンカーのカルボキシ末端は、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片のアミノ末端に連結される。これは、以下に概略的に示される：
第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000008
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000009
ＨＬ１は、第１の半減期延長ドメインであり、Ｌ１は、第１のリンカーであり、ＭＭは、マスキング部分であり、ＨＬ２は、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は、第２のリンカーであり、Ｃは、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である。
１．１ ＩＬ－１２サイトカイン
本明細書で提供されるものは、マスクされたサイトカイン又はその切断産物で使用するためのＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である。サイトカインは、特に免疫系の細胞内で、細胞シグナル伝達において役割を果たす。ＩＬ－１２は、白血球の活性を調節する免疫系内のサイトカインシグナル伝達分子の一種である、インターロイキンである。
内因性ＩＬ－１２は、生合成中に細胞内で二量体化する、２つの明確に異なる分子ＩＬ－１２ ｐ４０及びＩＬ－１２ ｐ３５として存在する。
ＩＬ－１２ ｐ４０及びＩＬ－１２ ｐ３５の全配列は、以下である（生合成中に切断されたプロペプチドは太字で示される）。
Figure 2023520518000010
Figure 2023520518000011
成熟形態は、以下のとおりである。
ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット：
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ
ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット：
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ
それらは、２つのサブユニット間のジスルフィド結合を通して生合成中に共有結合的に二量体化する、２つの鎖として発現される。ｐ４０サブユニットのシステインＣ１９９は、ｐ３５サブユニットのシステインＣ９６と会合する。
ＩＬ－１２サイトカインの「機能的断片」は、（例えば、完全長サイトカインタンパク質と比較して、少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％活性以内で）サイトカイン受容体結合能を保持するか、又は修飾している、完全長サイトカインタンパク質の一部を含む。サイトカイン受容体結合能は、例えば、サイトカインの同族受容体又はその成分に結合するサイトカインの能力によって示されることができる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、インターロイキン－１２受容体に結合することが可能な任意の天然に存在するインターロイキン－２（ＩＬ－１２）タンパク質又はその修飾バリアントである。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ポリペプチド又はその機能的断片は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片に共有結合されたＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片を含む。
ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片は、第１の半減期延長ドメインに付着し得るため、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000012
第２のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000013
「ＩＬ－１２ｐ４０」は、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片であり、「ＩＬ－１２ｐ３５」は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも１つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、又は欠失などの任意のアミノ酸修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインを含む。ヘパリン及びヘパラン硫酸などのＧＡＧは、ＩＬ－１２を含む多数の成長因子及びサイトカインに結合することが示されている。この結合の生理学的有意性は、２倍である。第一に、ＧＡＧは、細胞表面上の共受容体としての役割を果たし、サイトカインの高い局所濃度を維持することができる。第二に、ＧＡＧは、二量体化及びタンパク質分解からの防御を含む複数の機序を通して、成長因子及びサイトカインの生体活性を調節することができる。
ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットの成熟形態のＧＡＧ結合ドメインが、太字で以下に示される。
Figure 2023520518000014
ＧＡＧ結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）への修飾は、サイトカイン活性のいずれの減少も伴わずに、変異ＧＡＧ結合ドメインを伴うＩＬ－１２サイトカインを含む構築物のＰＫプロファイルを増加させることが本明細書で示されている。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、ＧＡＧ結合ドメインへの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインへの修飾は、欠失変異である。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインへの修飾は、欠失変異及び少なくとも１つの置換変異である。
いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶからなる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号５７を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶからなる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号５８を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｃ２５２におけるアミノ酸置換は、Ｃ２５２Ｓである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号５９のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン置換を有するアミノ酸配列と、ＧＡＧ結合ドメインへの少なくとも１つのアミノ酸修飾とを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２Ｓにアミノ酸置換を含み、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＲＶを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、位置Ｃ２５２Ｓにアミノ酸置換を含み、ＧＡＧ結合ドメインは、アミノ酸配列ＫＤＮＴＥＧＲＶを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも１つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、又は欠失などの任意のアミノ酸修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、長さで５～２０個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、Ｇ及びＳからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、［（Ｇ）ｎＳ］を含み、ｎ＝４又は５である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）反復を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーは、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号１及び２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む。少なくとも１つのアミノ酸修飾の各々は、置換、挿入、又は欠失などの任意のアミノ酸修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号１及び２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号１及び２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも５つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６２のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６３のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
１．２ マスキング部分
本明細書で提供されるものは、マスクされたサイトカインで使用するためのマスキング部分である。マスキング部分は、マスクされたサイトカインから切断されて、その切断産物を形成することを理解されたい。マスキング部分は、マスクされたサイトカイン中のＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片をマスクし、それによって、ＩＬ－サイトカイン又はその機能的断片のその同族受容体への結合を低減又は防止する。
ＩＬ－１２受容体ベータ１、又はＩＬ－１２Ｒβ１は、ＩＬ－１２受容体複合体のサブユニットである。ＩＬ－１２Ｒβ１は、ＣＤ２１２としても知られている。このタンパク質は、低親和性でインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）に結合する。このタンパク質は、そのＩＬ－１２結合活性に必要とされる、ジスルフィド結合オリゴマーを形成する。ＩＬ－１２受容体ベータ２、又はＩＬ－１２Ｒβ２は、ＩＬ－１２受容体複合体のサブユニットである。ＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－１２Ｒβ２タンパク質の共発現は、高親和性ＩＬ－１２結合部位の形成につながることが示されている。
タンパク質（例えば、サイトカイン）の同族タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）への結合の程度を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２サイトカイン受容体、又はそのサブユニット若しくは機能的断片を含む。
ＣＤ２１２とも呼ばれる、インターロイキン１２受容体サブユニットベータ－１は、以下の配列を有する。
Figure 2023520518000015
インターロイキン１２受容体サブユニットベータ－２は、以下の配列を有する。
Figure 2023520518000016
太字は、プロペプチドを示し、下線付きの斜体は、細胞外ドメインを示し、斜体は、膜貫通ドメインを示し、下線付きの太字は、細胞質ドメインを示す。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１、又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴うヒトＩＬ－１２Ｒβ１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴うヒトＩＬ－１２Ｒβ１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号５を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号５を有するＩＬ－１２Ｒβ１を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号５のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号６を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６を有するＩＬ－１２Ｒβ１を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２、又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴うヒトＩＬ－１２Ｒβ２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴うヒトＩＬ－１２Ｒβ２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち、配列番号７を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号８を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号８のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号９を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号９のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、１つ以上のシステイン置換を伴う配列番号９を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、位置Ｃ２４２にアミノ酸置換を伴う配列番号９を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｃ２４２におけるアミノ酸置換は、Ｃ２４２Ｓである。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６５のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号６５のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち、配列番号１０を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号１０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号１０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号１０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち、配列番号１１を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、配列番号１１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１～４個のアミノ酸置換を伴う配列番号１１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、１つ又は２つのアミノ酸置換を伴う配列番号１１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
１．３ リンカー
本明細書で提供されるものは、マスクされたサイトカイン又はその切断産物で使用するためのリンカーである。本明細書で提供されるリンカーは、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインにおいて２つの機能的成分をともに連結するために使用される、さらに２つのアミノ酸のペプチドを指す。
マスクされたサイトカインは、第１のリンカー及び第２のリンカーを含み、第１のリンカー又は第２のリンカーのうちの１つは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含み（本明細書では「タンパク質分解的に切断可能なリンカー」と称されるリンカー）、第１のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含まない（本明細書では「非タンパク質分解的に切断可能なリンカー」と称されるリンカー）ため、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000017
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000018
いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含み（本明細書では「タンパク質分解的に切断可能なリンカー」又は「切断可能なリンカー」と称されるリンカー）、第２のリンカーは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含まない（本明細書では「非タンパク質分解的に切断可能なリンカー」又は「非切断可能なリンカー」と称されるリンカー）ため、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000019
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000020
いくつかの実施形態の非切断可能なリンカー及び切断可能なリンカーは、以下でより詳細に記載される。
１．３．１ 非タンパク質分解的に切断可能なリンカー
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、長さで３～１８個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、長さで３～１５個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、Ｇ及びＳからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、［（Ｇ）ｎＳ］を含み、ｎ＝４又は５である。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１２（ＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１４（ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５４（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５５（ＰＧＧＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５６（ＧＧＳＰＧ）に示されるアミノ酸配列を含む。
第２のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なリンカーであるように、第２のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なペプチドを含み、第１のリンカーが非タンパク質分解的に切断可能なリンカーであるように、第１のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なペプチドを含まない、いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、長さで３～１８個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１２（ＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１４（ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５４（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５５（ＰＧＧＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号５６（ＧＧＳＰＧ）に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖は、第１の半減期延長ドメインが第２の半減期延長ドメインと会合すること、及びマスキング部分が集合構築物中のＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片をマスクすることを促進するために、同じ又は類似の長さであることが望ましい。したがって、マスキング部分が、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片よりも短いアミノ酸配列である場合、長さの差は、より長いリンカーＬ１を使用することによって完全又は部分的に補償され得る。
１．３．２ タンパク質分解的に切断可能なリンカー
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、長さで１０～２５個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、以下に示されるスペーサードメイン（ＳＤ）が両側に配置されたタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含む。
ＳＤ－ＣＰ－ＳＤ
切断可能なペプチド
切断可能なリンカーは、切断可能なペプチドを含む。
切断可能なペプチドは、切断可能なペプチドがタンパク質分解的に切断可能であるようにプロテアーゼ切断部位を含む、ポリペプチドである。プロテアーゼは、標的基質タンパク質の２つの特異的アミノ酸残基間のペプチド結合を切断及び加水分解する酵素である。本明細書で使用される場合の「切断部位」は、本明細書に記載される切断可能なペプチドを含むリンカーのいずれかで見出される、切断可能なペプチドの一部の切断のための認識可能な部位を指す。したがって、切断部位は、本明細書に記載される切断可能なペプチドの配列で見出され得る。いくつかの実施形態では、切断部位は、切断剤によって認識及び切断されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、腫瘍関連プロテアーゼ切断部位である。本明細書で提供される「腫瘍関連プロテアーゼ切断部位」は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列であり、その発現は、腫瘍細胞若しくはその腫瘍細胞環境に特異的であるか、又は上方調節される。
腫瘍細胞環境は、複雑であり、複数の異なるプロテアーゼを含むことができる。したがって、所与の切断可能なペプチドが腫瘍細胞環境内で切断される正確な部位は、腫瘍型の間、同じ腫瘍型を有する患者の間、及び特定の腫瘍細胞環境に依存する同じ腫瘍に形成された切断産物の間でさえも変化し得る。さらに、切断後でさえも、例えば、１つ又は２つの末端アミノ酸の除去による、初期切断産物のさらなる修飾は、腫瘍細胞環境内のプロテアーゼのさらなる作用によって生じ得る。したがって、切断産物の分布は、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインの単一構造の投与後に、患者の腫瘍細胞環境内に形成されることが予期され得る。
本明細書で参照される切断部位は、腫瘍細胞環境と関連することが知られているプロテアーゼの標的である切断可能なペプチド内の２つの特異的アミノ酸残基の間の部位を指すことを理解されたい。この意味で、異なるプロテアーゼが、異なる切断部位において切断可能なペプチドを切断する、本明細書に記載される切断可能なペプチド内に１つを超える切断部位が存在し得る。また、１つを超えるプロテアーゼが、切断可能なペプチド内の同じ切断部位に作用し得る可能性もある。プロテアーゼ切断部位についての考察は、当該技術分野で見出され得る。
したがって、本明細書に開示される切断可能なペプチドは、１つ以上のプロテアーゼによって切断され得る。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、ＩＬ－１２サイトカイン受容体を発現する領域又は組織内で共局在化されるプロテアーゼのための基質である。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、５ｍｅｒ（すなわち、長さで５個のアミノ酸のペプチド）、６ｍｅｒ（すなわち、長さで６個のアミノ酸のペプチド）、７－ｍｅｒ（すなわち、長さで７個のアミノ酸のペプチド）、８ｍｅｒ（すなわち、長さで８個のアミノ酸のペプチド）、９ｍｅｒ（すなわち、長さで９個のアミノ酸のペプチド）、１０ｍｅｒ（すなわち、長さで１０個のアミノ酸のペプチド）、１１ｍｅｒ（すなわち、長さで１１個のアミノ酸のペプチド）、１２ｍｅｒ（すなわち、長さで１２個のアミノ酸のペプチド）、１３ｍｅｒ（すなわち、長さで１３個のアミノ酸のペプチド）、１４ｍｅｒ（すなわち、長さで１４個のアミノ酸のペプチド）、１５ｍｅｒ（すなわち、長さで１５個のアミノ酸のペプチド）、１６ｍｅｒ（すなわち、長さで１６個のアミノ酸のペプチド）、１７－ｍｅｒ（すなわち、長さで１７個のアミノ酸のペプチド）、又は１８ｍｅｒ（すなわち、長さで１８個のアミノ酸のペプチド）である。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、長さで５～１８個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、長さで６～１０個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカー内の切断可能なペプチドは、以下からなる群から選択されるアミノ酸を含む。
Figure 2023520518000021
純粋に一例として、上記の表では、＊は、切断可能なペプチド内の既知の又は観察されたプロテアーゼ切断部位を示す。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号１５（ＶＰＬＳ＊ＬＹ）のアミノ酸配列を含み、例えば、切断可能なペプチドは、配列番号２１０（ＶＰＬＳＬＹＳＧ）のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４１（ＭＰＹＤ＊ＬＹＨＰ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４２（ＤＳＧＧ＊ＦＭＬＴ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４３ ４３（ＲＡＡＡ＊ＶＫＳＰ）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４４（ＩＳＳＧＬＬ＊ＳＧＲＳ）のアミノ酸配列を含み、例えば、切断可能なペプチドは、配列番号２１１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＰ）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４５（ＤＬＬＡ＊ＶＶＡＡＳ）のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号１５（ＶＰＬＳ＊ＬＹ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号２１０（ＶＰＬＳＬＹＳＧ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４１（ＭＰＹＤ＊ＬＹＨＰ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４２（ＤＳＧＧ＊ＦＭＬＴ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４３（ＲＡＡＡ＊ＶＫＳＰ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４４（ＩＳＳＧＬＬ＊ＳＧＲＳ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号２１１（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＤＱＰ）のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドは、配列番号４５（ＤＬＬＡ＊ＶＶＡＡＳ）のアミノ酸配列からなる。
配列番号４４又は４５に示されるアミノ酸配列を有する切断可能なペプチドは、非腫瘍細胞環境と比較して、腫瘍細胞環境内で非常に特異的な切断を実証することが見出されている。したがって、これらの切断可能なペプチドが、本明細書のいずれかの場所で開示されるようにマスクされたＩＬ－１２サイトカインに組み込まれるとき、投与されたＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片の任意の全身性副作用は、さらに低減され得る。
スペーサードメイン
スペーサードメインは、１つ以上のアミノ酸からなり得る。スペーサードメインの機能は、存在する場合、タンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を本明細書に記載される構築物中の他の機能的成分に連結することである。
スペーサードメインは、腫瘍細胞環境又は非腫瘍細胞環境内のプロテアーゼとのタンパク質分解的に切断可能なペプチドの生物学的相互作用を改変しないことを理解されたい。言い換えれば、スペーサードメインの存在下でさえも、本明細書に開示される本発明のタンパク質分解的に切断可能なペプチドは、その有利な腫瘍特異性を保持する。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドに隣接するスペーサードメインは、異なる。
いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、及びＰが豊富である。
いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、以下を含み、
Figure 2023520518000022
ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインである。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、以下を含む。
Figure 2023520518000023
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000024
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000025
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000026
第２のポリペプチド鎖は、以下を含む。
Figure 2023520518000027
いくつかの実施形態では、ＳＤ１のＮ末端は、グリシン（Ｇ）である。
いくつかの実施形態では、第１のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、長さで３～１０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、第１のスペーサードメイン（ＳＤ１）は、長さで５～９個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、配列番号１６（ＧＧＳＧＧＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、配列番号１７（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＤ２のＣ末端配列は、
Figure 2023520518000028
である。
いくつかの実施形態では、第２のスペーサードメイン（ＳＤ２）は、長さで３～６個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＳＤ２は、配列番号１８（ＳＧＰ）を含む。
切断可能なリンカーにおけるＳＤ１及びＳＤ２の例示的な組み合わせが、以下に示される。
Figure 2023520518000029
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、及びＰが豊富である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、及びＰが豊富である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、長さで３～６個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、及びＰが豊富である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１は、第１のスペーサードメインであり、ＣＰは、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２は、第２のスペーサードメインであり、ＣＰは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＳＤ１は、長さで３～６個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、及びＰが豊富である。いくつかの実施形態では、スペーサードメインは、Ｇ、Ｓ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸残基タイプのみを含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000030
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000031
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000032
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000033
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000034
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000035
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000036
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000037
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000038
を含む。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000039
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１２（ＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000040
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000041
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１４（ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000042
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１２（ＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000043
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000044
を含む。
いくつかの実施形態では、非切断可能なリンカーは、配列番号１４（ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、
Figure 2023520518000045
を含む。
第２のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なリンカーであるように、第２のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なペプチドを含み、第１のリンカーが非タンパク質分解的に切断可能なリンカーであるように、第１のリンカーがタンパク質分解的に切断可能なペプチドを含まない、いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４６を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４７を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４８を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号４９を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５６を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５０を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５０を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５１を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５６を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５１を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５２を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５２を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５３を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５６を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、配列番号５３を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４を含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、配列番号４４（ＩＳＳＧＬＬ＊ＳＧＲＳ）のアミノ酸配列からなる切断可能なペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なリンカーは、配列番号４５（ＤＬＬＡ＊ＶＶＡＡＳ）のアミノ酸配列からなる切断可能なペプチドを含む。
本明細書で開示され、かつ例示的ＡＫ分子で開示されるリンカーの組み合わせは、本明細書で開示される任意のＩＬ－１２サイトカイン又はその断片とともに使用され得る。本明細書で開示され、かつ例示的ＡＫ分子で開示されるリンカーの組み合わせは、本明細書で開示される任意のマスキング部分とともに使用され得る。本明細書で開示され、かつ例示的ＡＫ分子で開示されるリンカーの組み合わせは、任意の半減期延長ドメインとともに使用され得る。言い換えれば、例示的ＡＫ分子で開示されるリンカーは、本明細書に開示されるＩＬ－１２サイトカイン若しくはその断片、本明細書に開示されるマスキング部分、及び／又は本明細書に開示される半減期延長ドメインとの組み合わせで使用され得る。
１．４ 半減期延長ドメイン
本明細書で提供されるものは、マスクされたサイトカイン又はその切断産物で使用するための半減期延長ドメインである。インビボでの長い半減期は、治療用タンパク質にとって重要である。残念ながら、対象に投与されるサイトカインは、通常、腎臓によるクリアランス及びエンドサイトーシス分解を含む機序によって対象から急速に取り除かれるため、一般的に短い半減期を有する。したがって、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインでは、半減期延長ドメインは、インビボでのサイトカインの半減期を延長する目的で、マスクされたサイトカインに連結される。
「半減期延長ドメイン」という用語は、血清中の標的成分の半減期を延長するドメインを指す。「半減期延長ドメイン」という用語は、例えば、抗体及び抗体断片を包含する。
本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、第２の半減期延長ドメインと会合している第１の半減期延長ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインは、非共有結合的に会合している。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインは、共有結合される。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、１つ以上のジスルフィド結合を介して第２の半減期延長ドメインに連結される。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインリンカー（ＨＬＤＬ）を介して第２の半減期延長ドメインに連結される。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインは、非共有結合的に会合しており、さらに、第１の半減期延長ドメインは、ジスルフィド結合を介して第２の半減期延長ドメインに連結されている。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、第１の抗体又はその断片を含み、第２の半減期延長ドメインは、第２の抗体又はその断片を含む。
ＦｃＲｎ介在性再循環が可能である抗体又はその断片は、対象からのマスクされたサイトカインのクリアランスを低減するか、又は別様に遅延させ、それによって、投与されたマスクされたサイトカインの半減期を延長し得る。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、ＦｃＲｎ介在性再循環が可能である任意の重鎖ポリペプチド又はその一部（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）などのＦｃＲｎ介在性再循環が可能である任意の抗体又はその断片である。
抗体又はその断片は、任意の抗体又はその断片であり得る。しかしながら、第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む、マスクされたサイトカインのいくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメイン又は第２の半減期延長ドメインのいずれかは、軽鎖ポリペプチドなどのＦｃＲｎ受容体に結合しない抗体又はその断片を含み得る。例えば、マスクされたサイトカインのいくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、ＦｃＲｎ受容体と直接相互作用しない軽鎖ポリペプチド又はその一部を含む、抗体又はその断片を含むが、それにもかかわらず、マスキング型サイトカインは、重鎖ポリペプチドを含むことなどによって、ＦｃＲｎ受容体と相互作用することが可能である第２の半減期延長ドメインを含むことにより、延長した半減期を有する。ＦｃＲｎ介在性再循環は、抗体又はその断片のＦｃ領域へのＦｃＲｎ受容体の結合を必要とすることが、当該技術分野で認識されている。例えば、研究は、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされる）が、ヒトＦｃ領域とヒトＦｃＲｎ複合体との間の相互作用のために重要であることを示している。例えば、Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３－１００２、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）を参照されたい。残基２４８～２５９、３０１～３１７、３７６～３８２、及び４２４～４３７（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされる）の様々な変異体も調査及び報告されている。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）。
いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、重鎖ポリペプチド又は軽鎖ポリペプチドのいずれかの一部を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、Ｆｃドメイン又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、重鎖ポリペプチドの定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、軽鎖ポリペプチドの定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、重鎖ポリペプチド又はその断片（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）を含む。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、軽鎖ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、第１のＦｃドメイン又はその断片を含み、第２の半減期延長ドメインは、第２のＦｃドメイン又はその断片を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃドメインは各々、第１及び第２の半減期延長ドメインの非共有結合性会合を促進する１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、第１の半減期延長ドメインに「ホール」を形成する変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含み、第２の半減期延長ドメインは、第２の半減期延長ドメインに「ノブ」を形成する変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含む、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片である。ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１は、以下の配列を有する。
Figure 2023520518000046
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは、第１及び第２の半減期延長ドメインが各々、１つ以上のアミノ酸修飾を伴う配列番号２１又はその断片を含むように、配列番号２１を有するヒトＩｇＧ１免疫グロブリン重鎖定常ガンマ１の配列（「親配列」）に由来する。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、任意選択的に１つ以上のアミノ酸修飾を伴って、上記に太字で示される配列番号２１の部分を含み、すなわち、以下である。
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
（配列番号２２）
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）」アプローチに従って第１及び第２の半減期延長ドメインの会合を促進するために、アミノ置換を伴う配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、配列配列番号２２は、第１の半減期延長ドメインに「ホール」を形成する変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる）と、第２の半減期延長ドメインに「ノブ」を形成する変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付される）とを含む。これらの修飾配列は、以下に示される配列番号２３及び２４を有する。
第１の半減期延長ドメイン（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）配列番号２３：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ
ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱ
ＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬ
ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
第２の半減期延長ドメイン（Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ）配列番号２４：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨ
ＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ
ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫ
ＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
ＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたアミノ置換Ｎ２９７Ａをさらに含む。
第１の半減期延長ドメイン（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）配列番号２５：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥ
ＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬ
ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱ
ＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬ
ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
第２の半減期延長ドメイン（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＮ２９７Ａ）配列番号２６：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨ
ＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ
ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫ
ＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
ＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたアミノ置換Ｉ２５３Ａをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１及び第２の半減期延長ドメインは各々、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた両方のアミノ置換Ｎ２９７Ａ及びＩ２５３Ａをさらに含む。
第１の半減期延長ドメイン（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）配列番号２７：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ
ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ
ＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡ
ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
第２の半減期延長ドメイン（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）配列番号２８：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ
ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹ
ＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫ
ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２２、２３、２５、及び２７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２２、２４、２６、及び２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列のうちのいずれか１つに対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２２、２３、２５、及び２７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失などの１つ以上の修飾を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２２、２４、２６、及び２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失などの１つ以上の修飾を有するアミノ酸配列を含む。１つ以上の修飾は、いくつかの実施形態では、ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進し、及び／又はポリペプチド鎖のホモ二量体化を抑制するか、エフェクター機能を改変するか、若しくはエフェクター機能を強化する、任意の修飾又は改変を含む、本明細書に記載される任意の修飾又は改変であり得る。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン又はその断片は、エフェクター機能を改変する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｄ２６５Ａ、及びＰ３２９Ｇからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン又はその断片であり、アミノ置換：Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｖ２３４Ａ及びＧ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＡ３３１Ｓ、並びに／又はＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、及びＡ３３０Ｓを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン又はその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、及びＶ３０９Ｌからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン又はその断片であり、アミノ置換：Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、及びＥ３１８Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓ、並びに／又はＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン又はその断片であり、Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、エフェクター機能を強化する１つ以上のアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり、アミノ置換：Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａ；Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ；Ｐ２４７Ｉ及びＡ３３９Ｄ又はＡ３３９Ｑ；Ｄ２８０Ｈ及びＫ２９０Ｓ；Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、及びＳ２９８Ｄ又はＳ２９８Ｖのいずれか；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ；Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、及びＩ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ａ及びＥ３３３Ａ；Ｋ３２６Ｗ及びＥ３３３Ｓ；Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、及びＴ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、及びＫ３２６Ｅ；Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、及びＴ２９９Ａ；Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａ、及びＫ３２６Ｅ；Ｋ３３４Ｖ；Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、及びＫ３３４Ｖ；Ｋ３３４Ｖ及びＱ３３１Ｍ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、又はＳ２９８Ｔ；Ｅ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、及びＫ３３４Ｖ；Ｌ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、及びＫ３３４Ｖ；Ｋ３３４Ｖ及びＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ又はＡ３３０Ｆ；Ｋ３３４Ｖ、Ｑ３１１Ｍ、及びＡ３３０Ｍ又はＡ３３０Ｆのいずれか；Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、及びＡ３３０Ｍ又はＡ３３０Ｆのいずれか；Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２３９Ｄ、及びＡ３３０Ｍ又はＳ２９８Ｔのいずれか；Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、及びＫ２９０Ｙ、Ｆ２４３Ｖ又はＥ２９４Ｌ；Ｙ２９６Ｗ及びＬ２３４Ｙ又はＫ２９０Ｙのいずれか；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｓ、及びＩ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ；Ｆ２４３Ｌ及びＶ２６４Ｉ；Ｌ３２８Ｍ；Ｉ３３２Ｅ；Ｌ３２８Ｍ及びＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｉ及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｅ及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｑ及びＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９Ｅ；Ａ３３０Ｙ；Ｉ３３２Ｄ；Ｌ３２８Ｉ及びＩ３３２Ｅ；Ｌ３２８Ｑ及びＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｔ；Ｖ２４０Ｉ；Ｖ２６６Ｉ；Ｓ２３９Ｄ；Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｎ；Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｑ；Ｓ２３９Ｅ及びＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９Ｅ及びＩ３３２Ｎ；Ｓ２３９Ｅ及びＩ３３２Ｑ；Ｓ２３９Ｎ及びＩ３３２Ｄ；Ｓ２３９Ｎ及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｑ及びＩ３３２Ｄ；Ａ３３０Ｙ及びＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｙ及びＩ３３２Ｅ；Ａ３３０Ｌ及びＩ３３２Ｅ；Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ；Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、又はＬ２３４Ｉ；Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、又はＬ２３５Ｉ；Ｓ２３９Ｔ；Ｖ２４０Ｍ；Ｖ２６４Ｙ；Ａ３３０Ｉ；Ｎ３２５Ｔ；Ｉ３３２Ｅ及びＬ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、又はＬ３２８Ｉ；Ｖ２６４Ｉ、Ｉ３３２Ｅ、及びＳ２３９Ｅ又はＳ２３９Ｑのいずれか；Ｓ２３９Ｅ、Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｙ、及びＩ３３２Ｅ；Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ又はＳ２３９Ｎのいずれか；Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ又はＳ２３９Ｎのいずれか；Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２９８Ａ、及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａ、Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ又はＳ２３９Ｎのいずれか；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、Ｓ２９８Ａ、及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｉ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＡ３３０Ｉ；Ｐ２３０Ａ、Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、及びＩ３３２Ｅ；Ｅ２７２Ｙ；Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、又はＫ２７４Ｙ；Ｆ２７５Ｗ；Ｎ２７６Ｌ；Ｙ２７８Ｔ；Ｖ３０２Ｉ；Ｅ３１８Ｒ；Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ又はＳ３２４Ｖ；Ｋ３２６Ｉ又はＫ３２６Ｔ；Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、又はＴ３３５Ｙ；Ｖ２４０Ｉ及びＶ２６６Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、及びＬ２３４Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、及びＬ２３５Ｄ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、及びＶ２４０Ｉ；Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、及びＶ２６４Ｔ；並びに／若しくはＳ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｅ、及びＫ３２６Ｅ又はＫ３２６Ｔのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片であり、Ｐ２３０Ａ、Ｅ２３３Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｅ２７２Ｙ、Ｋ２７４Ｔ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ２７４Ｒ、Ｋ２７４Ｌ、Ｋ２７４Ｙ、Ｆ２７５Ｗ、Ｎ２７６Ｌ、Ｙ２７８Ｔ、Ｖ３０２Ｉ、Ｅ３１８Ｒ、Ｓ３２４Ｄ、Ｓ３２４Ｉ、Ｓ３２４Ｖ、Ｎ３２５Ｔ、Ｋ３２６Ｉ、Ｋ３２６Ｔ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｔ３３５Ｄ、Ｔ３３５Ｒ、及びＴ３３５Ｙからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＦｃＲｎへの半減期延長ドメインの結合を強化する１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、酸性ｐＨにおけるＦｃＲｎへのＦｃ含有ポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド又はＦｃドメイン若しくはその断片）の結合親和性を増加させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、Ｍ４２８Ｆ、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｆ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ；Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ；Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ；Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１１；Ｎ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｗ；Ｍ４２８Ｆ及びＮ４３４Ｓ；Ｖ２５９Ｉ及びＶ３０８Ｆ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅ；Ｖ２５９Ｉ、Ｖ３０８Ｆ、及びＭ４２８Ｆ；Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ｓ；Ｔ３０７Ｑ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ；Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；Ｎ４３４Ｈ；並びにＶ３０８Ｐからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
製造目的で、シグナルペプチドは、タンパク質の分泌を改善するように半減期ドメインの上流で操作され得る。シグナルペプチドは、当該技術分野で公知であるような細胞株の要件に従って選択される。シグナルペプチドは、精製され、医薬品として製剤化されるタンパク質の一部として発現されないことを理解されたい。
１．４．１ ヘテロ二量体化修飾
本明細書に記載される半減期延長ドメインは、２つの異なる半減期延長ドメインのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、その正しいヘテロ二量体形態でのマスクされたサイトカインの産生が効率的に産生されるように、第１及び第２の半減期延長ドメインのヘテロ二量体化を促進することが望ましい。したがって、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６）：６５３－６６３に記載されているような任意の方略を含む、当該技術分野で利用可能な任意の方略を使用して、１つ以上のアミノ酸修飾が、第１の半減期延長ドメインに行われることができ、１つ以上のアミノ酸修飾が、第２の半減期延長ドメインに行われることができる。例示的方略及び修飾が、以下で詳細に記載される。
ノブ・イントゥ・ホールアプローチ
２つの異なる半減期延長ドメインのヘテロ二量体化を促進するための１つの方略は、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」と呼ばれるアプローチである。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、各々がＣＨ３ドメインを含む、第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインを含む半減期延長ドメインは、重鎖ポリペプチド又はその断片（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）である。２つの半減期延長ドメインのＣＨ３ドメインは、例えば、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によって改変されることができ、これは、例えば、ＷＯ １９９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９６）９（７）：６１７－６２１、Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６（７）：６７７－６８１に、いくつかの例とともに詳細に記載されている。また、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６）：６５３－６６３も参照されたい。ノブ・イントゥ・ホール法を使用して、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面は、改変され、２つの改変されたＣＨ３ドメインを含有する２つの半減期延長ドメインのヘテロ二量体化を増加させる。これは、「ノブ」として作用する、半減期延長ドメインのうちの１つのＣＨ３ドメインにかさばる残基を導入することによって生じる。次いで、かさばる残基を収容するために、ノブを収容することができる「ホール」が、他の半減期延長ドメインに形成される。改変されたＣＨ３ドメインのいずれかが、「ノブ」であり得る一方で、他方は、「ホール」であり得る。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化する（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６（７）、Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７０（１）：２６－３５）とともに、収率を増加させる。
９７％を超えるヘテロ二量体化収率は、重鎖にＳ３５４Ｃ変異及びＴ３６６Ｗ変異を導入して「ノブ」を作成することによって、かつ重鎖にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を導入して「ホール」を作成することによって（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムによる残基の番号付け）、達成され得ることが報告されている。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８：７－１５、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６）：６５３－６６３。
第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む、いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、アミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる）を含む重鎖ポリペプチド又はその一部（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）を含み、第２の半減期延長ドメインは、アミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる）重鎖ポリペプチド又はその一部（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）を含む。第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む、いくつかの実施形態では、第１の半減期延長ドメインは、アミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる）を含む重鎖ポリペプチド又はその一部（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）を含み、第２の半減期延長ドメインは、アミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる）重鎖ポリペプチド又はその一部（例えば、Ｆｃドメイン又はその断片）を含む。
ノブ及びホールを形成するために作製され得る置換の追加的な例には、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１４０３０２０３７Ａ１に記載されるものが含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、以下のアミノ酸置換のうちのいずれかが、各々、Ｆｃドメインを含有する、第１の半減期延長ドメイン（「第１のドメイン」）及び対になった第２の半減期延長ドメイン（「第２のドメイン」）に行われることができる：Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、（ａ）第１のドメイン内のＹ４０７Ｔ及び第２のドメイン内のＴ３６６Ｙ、（ｂ）第１のドメイン内のＹ４０７Ａ及び第２のドメイン内のＴ３６６Ｗ、（ｃ）第１のドメイン内のＦ４０５Ａ及び第２のドメイン内のＴ３９４Ｗ、（ｄ）第１のドメイン内のＦ４０５Ｗ及び第２のドメイン内のＴ３９４Ｓ、（ｅ）第１のドメイン内のＹ４０７Ｔ及び第２のドメイン内のＴ３６６Ｙ、（ｆ）第１のドメイン内のＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａ、並びに第２のドメイン内のＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ、（ｇ）第１のドメイン内のＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗ、並びに第２のドメイン内のＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ、（ｈ）第１のドメイン内のＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａ、並びに第２のドメイン内のＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ、又は（ｉ）第１のドメイン内のＴ３６６Ｗ、並びに第２のドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ。
いくつかの実施形態では、以下のアミノ酸置換のうちのいずれかが、各々、Ｆｃドメインを含有する、第１の半減期延長ドメイン（「第１のドメイン」）及び対になった第２の半減期延長ドメイン（「第２のドメイン」）に行われることができる：Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた、（ａ）第２のドメイン内のＹ４０７Ｔ及び第１のドメイン内のＴ３６６Ｙ、（ｂ）第２のドメイン内のＹ４０７Ａ及び第１のドメイン内のＴ３６６Ｗ、（ｃ）第２のドメイン内のＦ４０５Ａ及び第２のドメイン内のＴ３９４Ｗ、（ｄ）第２のドメイン内のＦ４０５Ｗ及び第１のドメイン内のＴ３９４Ｓ、（ｅ）第２のドメイン内のＹ４０７Ｔ及び第１のドメイン内のＴ３６６Ｙ、（ｆ）第２のドメイン内のＴ３６６Ｙ及びＦ４０５Ａ、並びに第１のドメイン内のＴ３９４Ｗ及びＹ４０７Ｔ、（ｇ）第２のドメイン内のＴ３６６Ｗ及びＦ４０５Ｗ、並びに第１のドメイン内のＴ３９４Ｓ及びＹ４０７Ａ、（ｈ）第２のドメイン内のＦ４０５Ｗ及びＹ４０７Ａ、及び第１のドメイン内のＴ３６６Ｗ及びＴ３９４Ｓ、又は（ｉ）第２のドメインのＴ３６６Ｗ、並びに第１のドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ。
各々、Ｆｃドメインを含む、第１の半減期延長ドメインと、第２の半減期延長ドメインとを含む、実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体化改変のうちのいずれかが、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインのうちのいずれかのヘテロ二量体形成を促進するためにＦｃドメインで使用されることができる。
１．５ 例示的なマスクされたサイトカイン
本開示によるマスクされたサイトカインは、本明細書のいずれかの場所に記載されるＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片、本明細書のいずれかの場所に記載されるマスキング部分、本明細書のいずれかの場所に記載される第１及び第２の半減期ドメイン、並びに本明細書のいずれかの場所に記載される切断可能及び非切断可能なリンカーを組み合わせることができる。
さらに、ある実施形態では、本明細書に開示される任意の特定の配列は、任意選択的に、１つ、２つ、又は３つの置換などのさらなるアミノ酸置換を含み得る。別の実施形態では、マスクされたサイトカインのドメインについて本明細書に開示される任意の特定の配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％の相同性を有する配列も、本発明によって包含される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号５を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号６を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち、配列番号７を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号８を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号９を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６３のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち、配列番号１０を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち、配列番号１１を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号５を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、配列番号６を有する配列、又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントを含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち、配列番号７を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号８を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号９を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち、配列番号１０を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち、配列番号１１を有する配列を含み、第１の半減期伸長ドメインは、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号４１のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、マスキング部分は、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号６５を有する配列を含み、非切断可能なリンカーは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、切断可能なリンカーは、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、第１の半減期延長ドメインは、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、第２の半減期延長ドメインは、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＮ２９７Ａ）を含む。
マスクされたサイトカインのいくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000047
第２のポリペプチド鎖は、以下を含み、
Figure 2023520518000048
「ＩＬ－１２ｐ４０」は、ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片であり、「ＩＬ－１２ｐ３５」は、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片である。第１の半減期伸長ドメイン（ＨＬ１）、第１のリンカー（Ｌ１）、マスキング部分（ＭＭ）、第２の半減期伸長ドメイン（ＨＬ２）、第２のリンカー（Ｌ２）、及びＩＬ－１２サイトカイン又はその断片（［ＩＬ－１２ｐ３５－リンカー－ＩＬ－１２ｐ４０］）は、本明細書のいずれかの場所で定義されるとおりであり得る。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号８８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、配列番号８４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
２．切断産物
本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される「二量体の」マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物である。
本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインは、切断可能なリンカーを含む。切断部位における切断可能なリンカーのタンパク質分解切断時に、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む切断産物が形成される。切断産物中のＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、もはやマスキング部分によってマスクされなくなるため、活性化される。したがって、切断産物中のＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片は、標的タンパク質に結合することが可能である。
腫瘍細胞環境は、複雑であり、複数の異なるプロテアーゼを含むことができる。したがって、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン内の所与の切断可能なペプチドが腫瘍細胞環境内で切断される正確な部位は、腫瘍型の間、同じ腫瘍型を有する患者の間、及び同じ腫瘍に形成された切断産物の間でさえも変化し得る。さらに、切断後でさえも、例えば、１つ又は２つの末端アミノ酸の除去による、初期切断産物のさらなる修飾は、腫瘍細胞環境内のプロテアーゼのさらなる作用によって生じ得る。したがって、切断産物の分布は、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインの投与後に、患者の腫瘍細胞環境内に形成されることが予期され得る。
本明細書で提供されるものは、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能な切断産物であって、本明細書のいずれかの場所に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカイン中の切断可能なペプチドのタンパク質分解切断によって調製可能である、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む、切断産物である。
また、本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であり、切断産物は、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、切断産物は、本明細書のいずれかの場所に定義されるＩＬ－２サイトカイン又はその機能的断片を含む。また、本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの単一構造から取得されるか、又は取得可能である切断産物の分布であり、切断産物の分布内の各切断産物は、（ｉ）ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、（ｉｉ）本明細書のいずれかの場所に定義されるＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む。
本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であり、切断産物は、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、切断産物は、
Figure 2023520518000049
ＰＣＰは、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部であり、ＳＤは、スペーサードメインであり、Ｃは、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である。
さらに、本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であり、切断産物は、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、切断産物は、
ａ）第１の半減期延長ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式５を含むポリペプチドを含む、第２のポリペプチド鎖と、
Figure 2023520518000050
を含む、タンパク質ヘテロ二量体を含み、ＨＬ２は、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は、非切断可能なリンカーであり、Ｃは、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片であり、第１の半減期延長ドメインは、第２の半減期延長ドメインと会合している。また、本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの単一構造から取得されるか、又は取得可能である切断産物の分布であり、切断産物の分布内の各切断産物は、（ｉ）ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、（ｉｉ）
ａ）第１の半減期延長ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式５を含むポリペプチドを含む、第２のポリペプチド鎖と、
Figure 2023520518000051
を含む、タンパク質ヘテロ二量体を含み、ＨＬ２は、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２は、非切断可能なリンカーであり、Ｃは、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片であり、第１の半減期延長ドメインは、第２の半減期延長ドメインと会合している。
さらに、本明細書で提供されるものは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であり、切断産物は、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、切断産物は、
ａ）第１のポリペプチド鎖であって、
Figure 2023520518000052
ＨＬ１が、第１の半減期延長ドメインであり、ＳＤが、スペーサードメインであり、ＰＣＰが、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部である、第１のポリペプチド鎖と、
ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、
Figure 2023520518000053
ＨＬ２が、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２が、リンカーであり、Ｃが、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である、第２のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質ヘテロ二量体を含み、
第１の半減期延長ドメインは、第２の半減期延長ドメインと会合している。
切断産物内で、マスキング部分、半減期延長ドメイン、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片、リンカー、スペーサードメイン、及び第１の半減期延長ドメインと第２の半減期延長ドメインとの間の会合のタイプは、本明細書に記載されるもののうちのいずれか１つ、及び本明細書に記載されるものの任意の組み合わせであり得る。
切断可能なペプチドの位置は、ＩＬ－１２サイトカインを含む、結果として生じる切断産物の構造を決定する。
「タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部」は、切断部位における切断が生じた後の元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の一部を指す。切断後に、例えば、１つ又は２つの末端アミノ酸の除去による、初期切断産物のさらなる修飾もまた、腫瘍細胞環境内のプロテアーゼのさらなる作用によって生じ得る。したがって、マスクされたサイトカインの投与後に患者の腫瘍細胞環境に形成され得る切断産物の分布内の切断産物は、タンパク質分解的に切断可能なペプチドのいかなる部分も含有しない場合がある。
いくつかの実施形態では、「一部」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸、又は６つのアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、「一部」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の２つのアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、「一部」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の３つのアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、「一部」は、元のタンパク質分解的に切断可能なペプチド配列の４つのアミノ酸を指す。
いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの「一部」は、長さで３～６個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの「一部」は、長さで３又は４個のアミノ酸である。
本明細書に開示される切断可能なリンカーのための切断部位が、以下に開示される。
Figure 2023520518000054
純粋に一例として、上記の表では、＊は、切断可能なペプチド内の既知の又は観察されたプロテアーゼ切断部位を示す。
したがって、本明細書に開示されるものは、本明細書に開示されるマスクされたサイトカインのうちのいずれか１つの切断産物である。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号２９を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６６を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６７を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６８を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号６９を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７０を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７１を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７２を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７３を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７４を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７５を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。７６を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７６を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７７を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７８のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７８を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７９のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号７９を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号８０のアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、切断産物は、配列番号８０を含むアミノ酸配列を有する、アミノ酸配列を含む。
３．結合アッセイ
サイトカイン又はその機能的断片が特異的である、サイトカイン又はその機能的断片と結合パートナー（例えば、サイトカイン受容体などの標的タンパク質）との間のものなどの免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表されることができ、より小さいＫｄは、より大きい親和性を表す。ＩＬ－１２サイトカイン受容体へのＩＬ－１２サイトカインの結合は、Ｋｄの観点から表されることができる。いくつかの実施形態では、免疫学的結合相互作用は、マスクされたサイトカイン（プロテアーゼの存在下又は非存在下）と、サイトカイン受容体などの標的タンパク質との間のものである。タンパク質の免疫学的結合特性は、当該技術分野で周知の方法を使用して定量化されることができる。例えば、１つの方法は、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ－１２Ｒ）／サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）複合体形成及び解離の速度を測定することを含み、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。「オンレート定数」（Ｋｏｎ）及び「オフレート定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度並びに会合及び解離の実際の速度の計算によって決定されることができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの削除を可能にし、解離定数Ｋｄと等しい。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９－４７３，（１９９０）を参照されたい。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインは、マスキング部分を含むが切断可能なペプチドを含まない親サイトカインと比較して、プロテアーゼによる切断時に、ほぼ同じ又はより高い親和性で標的タンパク質に結合する。標的タンパク質は、任意のサイトカイン受容体であり得る。
いくつかの実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含まない、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、標的タンパク質と≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含む、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、プロテアーゼによって切断可能である前の標的タンパク質と≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、リンカー中に切断可能なペプチドを含む、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、プロテアーゼによる切断時の標的タンパク質と≦１Ｍ、≦１５０ｎＭ、１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインのサイトカイン又はその機能的断片は、マスクされたサイトカインのマスキング部分と≧５００Ｍ、≧２５０Ｍ、≧２００Ｍ、≧１５０Ｍ、≧１００Ｍ、≧５０Ｍ、≧１０Ｍ、≧１Ｍ、≧５００ｎＭ、≧２５０ｎＭ、≧１５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、≧５０ｎＭ、≧１０ｎＭ、≧１ｎＭ、≧０．１ｎＭ、≧０．０１ｎＭ、又は≧０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインのサイトカイン又はその機能的断片は、約若しくは少なくとも約１７５Ｍ、約若しくは少なくとも約１５０Ｍ、約若しくは少なくとも約１２５Ｍ、約若しくは少なくとも約１００Ｍ、約若しくは少なくとも約７５Ｍ、約若しくは少なくとも約５０Ｍ、約若しくは少なくとも約２５Ｍ、約若しくは少なくとも約５Ｍ、約若しくは少なくとも約１Ｍ、約若しくは少なくとも約７５０ｎＭ、約若しくは少なくとも約５００ｎＭ、約若しくは少なくとも約２５０ｎＭ、約若しくは少なくとも約１５０ｎＭ、約若しくは少なくとも約１００ｎＭ、約若しくは少なくとも約７５ｎＭ、又は約若しくは少なくとも約５０ｎＭなどの約２００Ｍ～約５０ｎＭである解離定数（Ｋｄ）を有する。結合親和性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知である。
いくつかの態様では、所望の閉塞比を示すマスクされたサイトカインが提供される。本明細書で使用される場合の「閉塞比」という用語は、（ａ）第１の条件セットの下でのパラメータの最大検出レベルと、（ｂ）第２の条件セットの下でのそのパラメータの最小検出値との比を指す。マスクされたＩＬ－１２ポリペプチドの文脈では、（ａ）マスクされたＩＬ－１２ポリペプチドの切断可能なペプチドを切断することが可能な少なくとも１つのプロテアーゼの存在下でマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドに結合する標的タンパク質（例えば、ＩＬ－１２Ｒタンパク質）の最大検出レベルと、（ｂ）プロテアーゼの非存在下でマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドに結合する標的タンパク質（例えば、ＩＬ－１２Ｒタンパク質）の最小検出値との比を指す。したがって、マスクされたサイトカインの閉塞比は、切断前のマスクされたサイトカインのＥＣ５０を切断後のマスクされたサイトカインのＥＣ５０で割ることによって、計算されることができる。マスクされたサイトカインの閉塞比はまた、プロテアーゼによる切断前のマスクされたサイトカインの解離定数と、プロテアーゼによる切断後のマスクされたサイトカインの解離定数との比として計算されることもできる。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインのより大きい閉塞比は、マスクされたサイトカインによって結合された標的タンパク質が、マスクされたサイトカインの切断可能なペプチドを切断することが可能なプロテアーゼの存在下で、プロテアーゼの非存在下よりも大きい程度に生じる（例えば、大部分が生じる）ことを示す。
いくつかの実施形態では、最適な閉塞比を伴うマスクされたサイトカインが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインの最適な閉塞比は、マスクされたサイトカインが、本明細書に企図される方法又は組成物に有用な望ましい特性を有することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、約２対約１０，０００、例えば、約８０対約１００の最適な閉塞比を示す。本明細書で提供されるマスクされたサイトカインのうちのいずれかのさらなる実施形態では、閉塞比は、約２対約７，５００、約２対約５，０００、約２対約２，５００、約２対約２，０００、約２対約１，０００、約２対約９００、約２対約８００、約２対約７００、約２対約６００、約２対約５００、約２対約４００、約２対約３００、約２対約２００、約２対約１００、約２対約５０、約２対約２５、約２対約１５、約２対約１０、約５対約１０、約５対約１５、約５対約２０、約１０対約１００、約２０対約１００、約３０対約１００、約４０対約１００、約５０対約１００、約６０対約１００、約７０対約１００、約８０対約１００、又は約１００対約１，０００である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、約２対約１，０００の最適な閉塞比を示す。プロテアーゼによる切断前及び／又は切断後の標的タンパク質へのマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドの結合は、ＥＬＩＳＡによるものなどの当該技術分野で周知の技術を使用して決定されることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスキング部分は、サイトカイン又はその機能的断片と標的タンパク質（例えば、サイトカイン受容体）との間の親和性よりも低い親和性で、本明細書に記載されるサイトカイン又はその機能的断片に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるマスキング部分は、
≧５００Ｍ、≧２５０Ｍ、≧２００Ｍ、≧１５０Ｍ、≧１００Ｍ、≧５０Ｍ、≧１０Ｍ、≧１Ｍ、≧５００ｎＭ、≧２５０ｎＭ、≧１５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、≧５０ｎＭ、≧１０ｎＭ、≧１ｎＭ、≧０．１ｎＭ、≧０．０１ｎＭ、又は≧０．００１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）で、本明細書に記載されるサイトカイン又はその機能的断片に結合する。
４．マスクされたＩＬ－１２サイトカインの産生
本明細書に記載されるマスクされたサイトカインは、その例示的方法が記載される、当該技術分野で利用可能な技術を使用して調製される。
４．１ 抗体産生
マスクされたＩＬ－１２サイトカインのいくつかの実施形態は、抗体又はその断片を含む。以下の節は、本明細書で提供されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのいくつかの実施形態で使用され得る、抗体、並びにその抗体断片、バリアント、及び誘導体の産生についてさらなる詳細を提供する。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、ジスルフィド結合を通して会合しているマスクされたＩＬ－１２サイトカインの２つのコピーによって産生される二量体の形態である。
１．抗体断片
本発明は、いくつかの実施形態では、抗体断片を包含する。抗体断片は、いくつかの断片の中でも、Ｆｃドメイン、重鎖の一部、軽鎖の一部、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖなどの任意の抗体断片であり得る。抗体断片は、酵素消化などの従来の手段によって、又は組換え技術によって生成され得る。ある特定の状況では、抗体断片を全抗体ではなく本明明細書に記載されるマスクされた抗体断片に連結するという利点が存在する。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４を参照されたい。
抗体断片の産生のために様々な技術が開発されてきた。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化を介して導出された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生されることができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、Ｅ．ｃｏｌｉ並びにＨＥＫ２９３及びＣＨＯ細胞などの他の細胞型で発現され、そこから分泌され、したがって、大量のこれらの断片の容易な産生を可能にすることができる。代替的に、Ｆａｂ－ＳＨ断片は、培養培地から直接回収され、Ｆ（ａｂ）２断片を形成するように化学的に結合されることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離されることができる。ＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期の増加を伴うＦａｂ及びＦ（ａｂ）２断片は、米国特許 第５，８６９，０４６号に記載されている。マスクされたサイトカインで使用するための抗体断片の産生のための他の技法が、当業者に明らかであろう。ある特定の実施形態では、マスクされた抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含む。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許 第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照されたい。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合をもたらすように構築され得る。上記のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。また、いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖを含むｂｉ－ｓｃＦｖが、マスクされたサイトカインとともに使用されることができる。
本発明は、いくつかの実施形態では、線形抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような）、又は適切なリンカーを介して連結された抗体の重鎖及び軽鎖配列を含む一本鎖免疫グロブリンを含む。そのような線形抗体又は免疫グロブリンは、単一特異性又は二重特異性であり得る。そのような一本鎖免疫グロブリンは、二量体化され、それによって、元々四量体である抗体のものと類似する構造及び活性を維持することができる。また、いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖の配列を有していない抗体であり得る。そのような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はナノボディと呼ばれる。これらの抗体はまた、本発明による抗体の機能的断片の意味に包含される。抗体断片は、本明細書で提供される指導に従って、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインに連結されることができる。
２．ヒト化抗体
本発明は、いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその抗体断片を包含する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、任意の抗体断片を含む、任意の抗体であり得る。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で既知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである源から導入される１つ以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる、「輸入」残基と称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列に超可変領域の配列を置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）に従って本質的に行われ得る。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的にインタクトとは言えないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基及び場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されている、ヒト抗体である。ヒト化抗体は、本明細書で提供される指導に従って、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインに連結されることができる。
３．ヒト抗体
本発明のいくつかの実施形態のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を、既知のヒト定常ドメイン配列と組み合わせることによって、構築されることができる。代替的に、本発明のいくつかの実施形態のヒトモノクローナル抗体は、例えば、ヒトモノクローナル抗体を産生するために、例えば、マウス、ラット、ウシ（例えば、乳牛）、又はウサギ細胞を使用することによる、ハイブリドーマ法によって作製されることができる。いくつかの実施形態では、ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体は、任意の抗原に結合する抗体であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、標的抗原でヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒト動物を免疫化し、抗体を免疫動物又は免疫動物に由来する細胞から単離することによって、作製されることができる。好適な非ヒト動物の例としては、ＨｕＭＡｂ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）、「ＴＣマウス」、及びＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）などのトランスジェニック又はトランスクロモソミック動物が挙げられる。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－８５１、ＷＯ２００２／４３４７８、米国特許第 ５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号、第６，１６２，９６３号、及びＴｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２－７２７を参照されたい。
ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって記載されている。ヒト抗体は、本明細書で提供される指導に従って、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインに連結されることができる。
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、結合特異性のうちの１つは、第１の抗原に対するものであり、他方の結合特異性は、第２の抗原に対するものであり、これは、同じ標的タンパク質上の２つの異なるエピトープ、又は２つの異なる標的タンパク質上の２つの異なるエピトープのいずれかであり得る。二重特異性抗体はまた、第１の抗原及び／又は第２の抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化するために使用され得る。二重特異性抗体はまた、特定の細胞、例えば、がん細胞を死滅させるために、Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞などの細胞を動員するために使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製されることができる。二重特異性抗体は、本明細書で提供される指導に従って、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインに連結されることができる。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で既知である。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３）、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２０（７）：８３８－８４７を参照されたい。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。二重特異性抗体には、架橋又は「ヘテロ複合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体内の抗体の一方は、アビジンに結合され、他方は、ビオチンに結合され得る。ヘテロ複合体抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに、米国特許 第４，６７６，９８０号に開示されている。
５．単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、本明細書で提供される指導に従ってマスクされたサイトカインに連結される。単一ドメイン抗体は、任意の抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む、単一ポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部からなる。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、標的抗原によるラクダ科の免疫化によって得られたラクダ科由来抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、標的抗原によるサメの免疫化によって得られたサメ由来抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ナノボディである（例えば、ＷＯ２００４０４１８６５Ａ２及びＵＳ２００７０２６９４２２Ａ１を参照されたい）。
６．抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその断片のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体のＦｃＲｎ結合親和性及び／又はｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合親和性を改善することが望ましくあり得る。また、特定のアミノ酸修飾を導入することによって、抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することも望ましくあり得る。ヘテロ二量体化を促進するために行われ得る特定の修飾を含む、抗体鎖のヘテロ二量体化を促進するための方法は、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＭＡｂｓ，４（６）：６５３－６６３に記載されている。
抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はその置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行い、最終構築物に達することができるが、但し、最終構築物が所望の特徴を保有していることを条件とする。アミノ酸改変は、配列が作製されるときに対象の抗体アミノ酸配列に導入され得る。
変異誘発のための好ましい位置である抗体のある特定の残基又は領域の識別のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の群が識別され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換されて、アミノ酸と抗原の相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置は、置換部位に、又は置換部位のために、さらなる又は他のバリアントを導入することによって精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は、予め決められているが、変異自体の性質は、予め決められる必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム変異誘発が標的コドン又は領域において行われ、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
アミノ酸配列挿入には、１つの残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を延長する、酵素又はポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が含まれる。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、ヒンジ領域近くのプロテアーゼ切断を排除、低減、又は別様に妨害するように修飾される。ＩｇＧの「ヒンジ領域」は、一般的に、Ｅ２１６を含み、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従ってヒトＩｇＧｌのＰ２３０で終端するものとして定義されるが、機能的には、鎖の可撓性部分は、Ｅ２１６～Ｇ２３７などの上部及び下部ヒンジ領域と称される追加の残基を含むとみなされ得（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３）、下部ヒンジは、ＦｃｙＲ結合が一般的に起因したＦｃ領域の残基２３３～２３９と称されている。本明細書に記載されるマスクされたサイトカインのうちのいずれかに対する修飾は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ ２０１５０１３９９８４Ａ１に記載される方法に従って、並びに本明細書に記載される修飾のうちのいずれかを組み込むことによって、実施されることができる。
いくつかの実施形態では、薬物動態を改善するＦｃＲｎ変異には、これらに限定されないが、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１１、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｖ２５９Ｉ／Ｖ３０８Ｆ／Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｖ３０８Ｐが含まれる。いくつかの実施形態では、そのような変異は、低いｐＨではＦｃＲｎへの抗体結合を強化するが、中性ｐＨでは抗体親和性を変化させない。
ある特定の実施形態では、抗体又はその断片は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的グリコシル化部位を作成する。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖、すなわち、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つの付着を指すが、５－ヒドロキシプロリン又は５－ヒドロキシリシンも使用され得る。
マスクされたサイトカインへのグリコシル化部位の付加又は欠失は、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上記に記載されるトリペプチド配列のうちの１つ以上が作成又は除去されるように、アミノ酸配列を改変することによって、便宜的に達成される。改変はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリン残基又はスレオニン残基の付加、欠失、又は置換によって行われ得る。
抗体又はその断片がＦｃ領域を含む場合、それに付着した炭水化物は、改変され得る。例えば、抗体のＦｃ領域に付着したフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体は、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に付着した炭水化物中の二等分Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ ２００３／０１１８７８，Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．、及び米国特許 第６，６０２，６８４号，Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．で参照されている。抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ １９９７／３００８７，Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．に報告されている。また、そのＦｃ領域に付着した改変炭水化物を有する抗体に関するＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。修飾グリコシル化を有する抗原結合分子に関するＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）も参照されたい。
ある特定の実施形態では、グリコシル化バリアントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に付着した炭水化物構造は、フコースを欠くか、又は低減されたフコースを有する。そのようなバリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意選択的に、Ｆｃ領域は、その中に、ＡＤＣＣをさらに改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４（残基のＥＵ番号付け）における置換をさらに含む。「脱フコシル化」抗体又は「フコース欠損」抗体に関連する刊行物の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７．６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損したＬｅｅ １３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４））などのノックアウト細胞株、並びに（３１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）及びゴルジｐ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する細胞が挙げられる。
本明細書の実施形態のうちのいずれかでは、マスクされたサイトカインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作され得る。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、アルファ１，６－フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株で産生され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、低減した内因性アルファ１，６－フコシル化活性を有するように修飾されている。哺乳動物宿主細胞内のフコシル化経路を修飾するための方法の例は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ａｎｄ Ｓａｔｏｈ，ＭＡｂｓ，１（３）：２３０－２３６（２００９）で見出され得る。ＦＵＴ８遺伝子の発現を部分的又は完全に不活化するための方法及び組成物の例は、例えば、米国公開 第２０１６０１９４６６５Ａ１号、ＷＯ２００６１３３１４８Ａ２に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、ＣＨＯ細胞のＬｅｃｌ３バリアント（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（３０）：２６７３３－４０（２００２）を参照されたい）、低減したＦＵＴ８活性を有するＹＢ２／０細胞株（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（５）：３４６６－７３（２００３）を参照されたい）で産生される。いくつかの実施形態では、アルファ１，６－フコシル化に関連する遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が導入され得る（例えば、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８８（７）：９０１－９０８（２００４）、Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８４（２００７）、Ｏｍａｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０６（２）：１６８－１７３（２００８）を参照されたい）。いくつかのさらなる実施形態では、マスクされたサイトカインは、｜３１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株で産生され得る。さらなる実施形態では、細胞株は、加えて、ゴルジｐ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する。本明細書の実施形態のうちのいくつかでは、マスクされたサイトカインは、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、その血清半減期を改善するように改変される。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第 第５，７３９，２７７号に記載されるように、連結された抗体（特に抗体断片）にＦｃＲＮ／サルベージ受容体結合エピトープを組み込み得る。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加する要因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，８３４，５９７号）。
バリアントの別のタイプは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、異なる残基により置き換えられた抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発についての目的の部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下で表３に示されている。そのような置換が生物活性に望ましい変化をもたらす場合、表３において「例示的置換」で表示されるか、又はアミノ酸のクラスに関して以下にさらに記載される、より大きな置換変化が導入され得、生成物がスクリーニングされ得る。
Figure 2023520518000055
抗体の生物学的特性における置換修飾は、（ａ）例えば、シート又はヘリカル立体構造としての置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の体積の維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することにより実現される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｉｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
代替的に、天然に存在する残基は、以下の一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分けられ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｈｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴う。そのような置換残基はまた、保存的置換部位、又は残りの（非保存的）部位に導入され得る。
別のタイプの置換バリアントは、天然に存在するアミノ酸残基の天然に存在しないアミノ酸残基への置換を伴う。天然に存在しないアミノ酸残基は、例えば、ｔＲＮＡ再コードを通して、又は例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６１５４６７５Ａ１に記載される方法のうちのいずれかを通して、組み込まれることができる。
置換バリアントの１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。概して、さらなる開発のために選択された結果として生じるバリアントは、それらが生成される親抗体に対して、修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。そのような置換バリアントを生成するための便宜的な方法は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、又は哺乳動物ディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７つの部位）が変異され、各部位ですべての可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物）の少なくとも一部への融合として、繊維状ファージ粒子からディスプレイされる。次いで、ファージディスプレイバリアントが、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための超可変領域部位候補を識別するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を実施し、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を識別することができる。代替的に、又は加えて、抗体と抗原との間の接触点を識別するために、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述されるものを含む、当該技術分野で既知の技術による置換の候補である。そのようなバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の技法を使用したスクリーニングを受け、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。
マスクされたサイトカインのアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法には、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、又は例えば、抗体の以前に調製されたバリアント若しくは非バリアントバージョンのオリゴヌクレオチド媒介性（若しくは部位指向型）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入し、それによって、Ｆｃ領域バリアントを生成することが望ましくあり得る。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプを有する、抗体又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１アイソタイプを有する、抗体又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるマスクされたサイトカインは、エフェクター機能が強化されたＩｇＧ１アイソタイプを有する。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、脱フコシル化される。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、増加したレベルのマンノース部分を有する。いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、増加したレベルの二等分グリカン部分を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるマスクされたサイトカインは、ＩｇＧ１アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を有する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、エフェクター機能を強化する１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、及びＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｐ２４７Ｉ及びＡ３３９Ｄ又はＡ３３９Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｄ２８０Ｈ、Ｓ２９８Ｄの有無別のＫ２９０Ｓ、又はＳ２９８Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、及びＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６Ａ及びＥ３３３Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３２６Ｗ及びＥ３３３Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、Ｋ３２６Ｅの有無を問わず、アミノ酸置換Ｋ２９０Ｅ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、Ｋ３２６Ｅの有無を問わず、アミノ酸置換Ｋ２９０Ｎ、Ｓ２９８Ｇ、Ｔ２９９Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、及びＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ及びＱ３３１Ｍ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｖ、Ｅ２９４Ｌ、又はＳ２９８Ｔを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｌ、Ｑ３１１Ｍ、及びＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、及びＫ３３４Ｖを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ及びＳ２９８Ｔ、Ａ３３０Ｍ、又はＡ３３０Ｆを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｑ３１１Ｍ、及びＡ３３０Ｍ又はＡ３３０Ｆのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、及びＡ３３０Ｍ又はＡ３３０Ｆのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｋ３３４Ｖ、Ｓ２３９Ｄ、及びＡ３３０Ｍ又はＳ２９８Ｔのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、及びＫ２９０Ｙ、Ｆ２４３Ｖ、又はＥ２９４Ｌを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｙ２９６Ｗ及びＬ２３４Ｙ又はＫ２９０Ｙのいずれかを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｓ、及びＩ３３２Ｅを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１は、エフェクター機能を減少させるか、又は阻害する、１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、又はＮ２９７Ｑを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ又はＬ２３５Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、及びＰ２３８Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、及びＬ２３５Ａを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３３１Ｓを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。一実施形態では、ＩｇＧ１は、アミノ酸置換Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを含み、アミノ酸残基は、ＫａｂａｔのようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。
この説明及び当該技術分野の教示によれば、いくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインの抗体又はその断片は、例えば、Ｆｃ領域内に、野生型の対応する抗体と比較して、１つ以上の改変を含み得ることが企図される。例えば、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善されたか、又は減少したかのいずれかである）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすであろう、特定の改変がＦｃ領域に行われ得ることが考えられる。また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許 第５，６４８，２６０号、米国特許 第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）及びＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲへの結合が改善されたか、又は減少した抗体バリアントを説明する。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。また、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）も参照されたい。増加した半減期と、母体のＩｇＧの胎児への移入の要因となる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合とを有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、その中に１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。改変Ｆｃ領域アミノ酸配列を有し、Ｃ１ｑ結合能が増加又は減少したポリペプチドバリアントは、米国特許 第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）も参照されたい。
４．２ マスクされたＩＬ－１２サイトカイン・薬物複合体
本発明はまた、１つ以上の薬剤に複合体化された本明細書に開示される任意のＩＬ－１２マスクされたサイトカインであり得る、本明細書で提供されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン・薬物複合体（ＭＣＤＣ）も提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の薬剤は、化学療法剤若しくは薬、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）、又は放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の薬剤は、免疫刺激剤である。
いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカインに複合体化された１つ以上の薬物には、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照されたい）、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）などのオーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号及び第５，７８０，５８８号、並びに第７，４９８，２９８号を参照されたい）、ドラスタチン、カリチアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、及び第５，８７７，２９６号、Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３）、並びにＬｏｄｅ ｅｔ ａｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２５－２９２８（１９９８）を参照されたい）、ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７－５２３（２００６）、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｋ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８－３６２（２００６）、Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｋ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７－７２１（２００５）、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８２９－８３４（２０００）、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｋ，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９－１５３２（２００２）、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｋ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６－４３４３（２００２）、及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照されたい）、メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、並びにＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカインに複合体化された１つ以上の薬物には、チューブリン重合の阻害剤（例えば、メイタンシノイド及びオーリスタチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、カリチアミシン、デュオカルマイシン、及びインド－リノベンゾジアゼピン二量体）、並びにＤＮＡ合成阻害剤（例えば、エキサテカン誘導体Ｄｘｄ）が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン・薬物複合体は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ジェロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素又はその断片に複合体化された本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含む。
別の実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン・薬物複合体は、放射性原子に複合体化された本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含み、放射性複合体を形成する。様々な放射性同位体が、放射性複合体の産生に利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、１１３１、１１２５、Ｙ９０、Ｒｅｌ８６、Ｒｅｌ８８、Ｓｍｌ５３、Ｂ１２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位元素が挙げられる。放射性複合体が検出に使用されるとき、これは、例えば、ｔｃ９９ｍ若しくは１１２３などのシンチグラフィー研究検査用の放射性原子、又は再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）用のスピン標識を含み得る。
いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン・薬物複合体は、１つ以上の免疫刺激剤に複合体化された本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激剤は、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト又はｔｏｌｌ様受容体（ＴＥＲ）アゴニストの刺激剤である。
ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＳＴＩＮＧの任意のアゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）である。ＣＤＮは、任意のＣＤＮ又はその誘導体若しくはバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃＡＩＭＰ、及びｃ－ｄｉ－ＩＭＰからなる群から選択されるＣＤＮである。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ｃＧＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ、ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ、ｃＡＩＭＰ、及びｃ－ｄｉ－ＩＭＰからなる群から選択されるＣＤＮの誘導体又はバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、４－（２－クロロ－６－フルオロベンジル）－Ｎ－（フラン－２－イルメチル）－３－オキソ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン－６－カルボキサミド、又はその誘導体若しくはバリアントである。例えば、Ｓａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．，１１（１２）：ｅ！００５３２４を参照されたい。
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、又はＴＬＲ１０などの任意のＴＬＲのアゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、又はＴＬＲ５などの細胞表面上で発現されるＴＬＲのアゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、又はＴＬＲ１０などの細胞内で発現されるＴＬＲのアゴニストである。
マスクされたＩＬ－１２サイトカイン及び細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミジン酸塩ＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製されることができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの複合体化のための例示的キレート剤である。Ｗ０９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が、使用され得る。
本明細書のＭＣＤＣは、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、
ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているスクシンイミジル－（４－ビニルスルホン安息香酸））を含むが、これらに限定されない、架橋試薬を用いて調製されるそのような複合体を明示的に企図するが、これらに限定されない。
４．３ ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本発明のＩＬ－１２マスクされたサイトカインの組換え産生については、それをコードする１つ以上の核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、
又は発現のために、単離され、複製可能なベクターに挿入される。その成分を含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカインをコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。概して、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（概して哺乳動物）起源のいずれかである。適用可能であるときに、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む、抗体又はその断片の任意のアイソタイプの定常領域が、この目的で使用され得、そのような定常領域は、任意のヒト又は動物種から取得され得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、１つのベクターが、ＩＬ－１２マスクされたサイトカインをコードするために使用される。いくつかの実施形態では、１つを超えるベクターが、マスクされたＩＬ－１２サイトカインをコードするために使用される。
１．原核宿主細胞を使用したマスクされたＩＬ－１２サイトカインの生成
ａ．ベクター構築
本発明のマスクされたサイトカインのポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を使用して取得されることができる。抗体又はその抗体断片の所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。代替的に、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成器若しくはＰＧＲ技法を使用して合成されるか、又は他の供給源から取得されることができる。取得されると、マスクされたサイトカインの成分をコードする配列は、原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することが可能な組換えベクターに挿入される。当該技術分野で利用可能かつ既知の多くのベクターが、本発明の目的で使用されることができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現、又はその両方）、及びそれが常駐する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分には、一般的に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写ターミネーター配列が含まれるが、これらに限定されない。
一般に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型選択を提供することが可能なマーキング配列を担持する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、遺伝子コードアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性を含有し、したがって、形質転換細胞を識別するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の微生物プラスミド若しくはバクテリオファージもまた、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含有し得るか、又は含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｈ，米国特許 第５，６４８，２３７号に記載されている。
加えて、宿主微生物と適合するレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用されることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に、７ＧＥＭ．ＴＭ．－１１などのバクテリオファージが利用され得る。
本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする、２つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導性及び恒常性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在若しくは非存在又は温度の変化に応答して、その制御下でシストロンの転写のレベルの増加を開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化を介してプロモーターをソースＤＮＡから除去し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、マスクされたサイトカインのいずれかの鎖をコードするシストロンＤＮＡに動作可能に連結されることができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方が、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を指示するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、それらが、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写量及びより高い収率を一般的に許容するため、利用される。
原核宿主とともに使用するために好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、［３－ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃ又はｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能する他のプロモーター（他の既知の細菌又はファージプロモーターなど）も同様に好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それによって、当業者が、任意の必要な制限部位を供給するためのリンカー又はアダプターを使用して、例えば、軽鎖及び重鎖を含むマスクされたサイトカインのための標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを動作可能にライゲーションすることを可能にしている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたって発現ポリペプチドの転座を配向する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、又はベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに対して天然のシグナル配列を認識及び処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態では、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列又はそのバリアントである。
別の態様では、本発明によるポリペプチド成分の産生は、宿主細胞の細胞質内で生じ得るため、各シストロン内の分泌シグナル配列の存在を必要としない。この点に関して、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を含む実施形態については、例えば、軽鎖及び重鎖は、マスキング部分、リンカー配列の有無を問わず発現され、例えば、フォールディング及びアセンブリされて、細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それによって、発現されたタンパク質サブユニットの適切なフォールディング及びアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）を参照されたい。
本発明のマスクされたサイトカインはまた、本発明の分泌及び適切にアセンブリされた抗体の収率を最大化するために、発現ポリペプチド成分の定量的比が調節され得る、発現系を使用することによって産生されることができる。そのような調節は、ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。
本発明のマスクされたサイトカインを発現するために好適な原核宿主細胞には、例えば、グラム陰性又はグラム陽性生物などの古細菌及び真正細菌が含まれる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、又はＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴＡ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）及びその誘導体が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ １７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）などの他の株及びその誘導体も好適である。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体を構築するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内のレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌を選択することが一般的に必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種を宿主として好適に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤は、望ましくは、細胞培養に組み込まれ得る。
ｂ．マスクされたサイトカインの産生
宿主細胞は、上記に記載される発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
形質転換とは、ＤＮＡが、染色体外要素として、又は染色体統合体によってのいずれかで複製可能であるように、原核宿主にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に適切な標準的な技術を使用して行われる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に一般的に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技法は、電気穿孔法である。
本発明のマスクされたサイトカインを産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野で既知の培地中で増殖され、選択された宿主細胞の培養に好適である。好適な培地の例としては、必要な栄養補助剤を加えたルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤を含有し、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に許容する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンが培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸源以外の任意の必要な補助剤もまた、単独で、又は別の補助剤若しくは複合窒素源などの培地との混合物として、適切な濃度で含まれ得る。任意選択的に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖については、増殖温度は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃、又は約３０℃の範囲である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５～約９の範囲の任意のｐＨであり得る。ある特定の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉについては、ｐＨは、約６．８～約７．４、又は約７．０である。
誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターで使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためにリン酸制限培地中で培養される。ある特定の実施形態では、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照されたい）。当該技術分野で既知であるように、用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導剤が使用され得る。
一実施形態では、本発明の発現されたマスクされたサイトカインは、宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、又は溶解などの手段によって微生物を破壊することを伴う。細胞が破壊されると、細胞片又は細胞全体が、遠心分離又は濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。代替的に、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離されることができる。細胞は、培養物から除去され得、培養上清は、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイなどの一般的に既知の方法を使用して、さらに単離及び識別されることができる。
本発明の一態様では、マスクされたサイトカイン産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。組換えタンパク質の産生には、様々な大規模な流加発酵手順が利用可能である。大規模な発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を有し、ある特定の実施形態では、約１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコースを分配するために撹拌器インペラーを使用する。小規模の発酵とは、一般的に、体積容量が約１００リットル以下であり、かつ約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る、発酵槽内の発酵を指す。
発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で、所望の密度、例えば、約１８０～２２０のＯＤ５５０まで増殖させられた後に開始され、その段階で、細胞は初期静止期にある。様々な誘導剤が、当該技術分野で既知であり、上記に記載されるように、用いられるベクター構築物に従って使用され得る。細胞は、誘導の前により短い期間にわたって増殖され得る。細胞は通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長い又はより短い誘導時間が使用されてもよい。
本発明のポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、様々な発酵条件が修正され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリ及びフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（カペロン活性を有するペプチジルプロリルシス，トランス－イソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現する追加のベクターが、宿主原核細胞を共形質転換するために使用されることができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞中で産生される異種タンパク質の適切なフォールディング及び溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１－１９６０５、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ，米国特許 第６，０８３，７１５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ，米国特許 第６，０２７，８８８号、Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５、Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３、Ａｒｉｅ ｅｔ ａｋ（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０．
発現された異種タンパク質（特に、タンパク質分解感受性であるタンパク質）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠損したある特定の宿主株が、本発明に使用されることができる。例えば、宿主細胞株は、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子内の遺伝的変異に影響するように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が、利用可能であり、例えば、上記のＪｏｌｙ ｅｔ ａｋ（１９９８）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ，米国特許 第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｋ，米国特許 第５，５０８，１９２号、Ｋａｒａ ｅｔ ａｋ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素を欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株は、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。
ｃ．マスクされたサイトカインの精製
いくつかの実施形態では、本明細書で産生されるマスクされたサイトカインは、さらなるアッセイ及び使用のために実質的に均質である調製物を取得するためにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順は、好適な精製手順の例である：免疫親和性カラム又はイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過。
いくつかの実施形態では、固相上に固定化されたプロテインＡは、本発明のマスクされたサイトカインの免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤ細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３。プロテインＡが固定化される固相は、ガラス若しくはシリカ表面を含むカラム、又は制御細孔ガラスカラム若しくはケイ酸カラムであり得る。いくつかの用途では、カラムは、グリセロールなどの試薬でコーティングされ、汚染物質の非特異的な付着を防止する可能性がある。
精製の第１のステップとして、上記に記載される細胞培養に由来する調製物が、プロテインＡ固定化固相に適用され、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を可能にすることができる。次いで、固相が洗浄され、固相に非特異的に結合された汚染物質を除去する。最後に、目的のマスクされたサイトカインは、溶出によって固相から回収される。
マスクされたサイトカインの成分への高い親和性結合を提供する精製の他の方法は、当技術分野で既知の標準的なタンパク質精製方法に従って用いられることができる。
２．真核宿主細胞を使用したマスクされたサイトカインの生成
真核宿主細胞で使用するためのベクターには、概して、以下の非限定的な構成要素、すなわち、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が含まれる。
ａ．シグナル配列成分
真核宿主細胞で使用するためのベクターはまた、シグナル配列、又は成熟タンパク質若しくは目的のポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドを含有し得る。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内でマスクされたサイトカインをコードするＤＮＡにライゲーションされる。
ｂ．複製起点
概して、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、典型的には、早期プロモーターを含むためにのみ使用され得る。
ｃ．選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される、選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠損を相補するタンパク質、又は（ｃ）複合培地から利用可能ではない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の増殖を停止するための薬物を利用する。異種遺伝子で正常に形質転換することに成功したそれらの細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを生き延びる。そのような優性選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンという薬物を使用する。
哺乳動物細胞のための好適な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの核酸をコードするマスクされたサイトカインを取り込む能力がある細胞の識別を可能にするものである。
例えば、いくつかの実施形態では、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中ですべての形質転換体を培養することによって識別される。いくつかの実施形態では、野生型ＤＨＦＲが用いられるときの適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）である。
代替的に、マスクされたサイトカイン、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換又は共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またＧ４１８などの選択可能マーカーの選択剤を含有する培地中の細胞増殖によって、選択されることができる。米国特許 第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）を欠損した細胞株を含む、ＮＳ０を含み得る。哺乳動物細胞用の選択可能マーカーとしてのＧＳの使用のための方法は、米国特許 第５，１２２，４６４号及び米国特許 第５，８９１，６９３号に記載されている。
ｄ．プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本明細書に記載される任意のマスクされたサイトカインであり得る、目的のマスクされたサイトカインをコードする核酸に動作可能に連結される、プロモーターを含有する。プロモーター配列は、真核生物について既知である。例えば、ほぼすべての真核遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴ豊富領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得る、ＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある特定の実施形態では、これらの配列のうちのいずれか又はすべては、真核生物発現ベクターに好適に挿入され得る。
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから取得されるプロモーターによって制御されるが、但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの早期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として便宜的に取得される。ヒトサイトメガロウイルスの即時早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として便宜的に取得される。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許 第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許 第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒト［３－インターフェロンｃＤＮＡの発現を記載している、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｈ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。代替的に、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
ｅ．エンハンサー要素成分
高等真核生物による本発明のマスクされたサイトカインをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加される。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ－フェトプロテイン、及びインスリン）から既知である。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、ヒトサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）（真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素について記載している）も参照されたい。エンハンサーは、マスクされたサイトカインコード配列に対する位置５’又は３’においてベクターにスプライスされ得るが、一般的に、プロモーターから５’の部位に位置する。
ｆ．転写終結成分
真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終結のため、及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含有し得る。そのような配列は、真核若しくはウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合により３’の非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、マスクされたサイトカインをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びその中に開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ．宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書のベクター中でＤＮＡをクローニング又は発現するための好適な宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核生物細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＥＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｈ，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
宿主細胞は、マスクされたサイトカインの産生のために上記に記載される発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜に修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
ｈ．宿主細胞の培養
本発明のマスクされたサイトカインを産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するために好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｈ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｈ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許 第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、Ａ，９２１，１６２￥第４，５６０，６５５号、又は第５，１２２，４６９号、ＷＯ ９０／０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５、又は米国特許 再発行第３０，９８５号に記載される培地のうちのいずれかが、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれかは、必要な場合、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲内の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の補助剤も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ、及び同等物などの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
ｉ．マスクされたサイトカインの精製
組換え技法を使用するとき、マスクされたサイトカインは、細胞内で産生されるか、又は培地中に直接分泌されることができる。マスクされたサイトカインが第１のステップとして細胞内で産生される場合、宿主細胞又は溶解断片のいずれかである微粒子状破片が、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去され得る。マスクされたサイトカインが培地中に分泌されるとき、そのような発現系由来の上清は、最初に、市販のタンパク質濃度フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮され得る。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するための前述のステップのうちのいずれかに含まれ得、抗生物質が、外来性汚染物質の増殖を防止するために含まれ得る。
細胞から調製されたマスクされたサイトカイン組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製されることができ、親和性クロマトグラフィーが便宜的な技法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、もしあれば、マスクされたサイトカインに存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡが、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用されることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３（１９８３））。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトｙ３について推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｋ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、アガロースであり得るが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流量及び短い処理時間を可能にする。マスクされたサイトカインがＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。
イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技法もまた、回収されるマスクされたサイトカインに応じて利用可能である。
任意の予備的精製ステップに続いて、目的のマスクされたサイトカイン及び汚染物質を含む混合物は、例えば、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で実施される、約２．５～４．５のｐＨにおける溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、さらなる精製を受け得る。
一般に、研究、試験、及び臨床用途における使用のためのマスクされたサイトカインを調製するための様々な方法論は、上記に記載される方法論と一致し、及び／又は特定の目的のマスクされたサイトカインについて当業者によって適切であるとみなされるように、当該技術分野で定着している。
５．組成物
いくつかの態様では、また、本明細書で供されるものは、本明細書に記載されるＩＬ－１２マスクされたサイトカインのうちのいずれかを含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの例示的実施形態のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれかの二量体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、マスクされたＩＬ－１２サイトカインを含み、以下に詳細に記載される構成要素のうちの１つ以上をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、緩衝剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤若しくは洗剤、又は他の治療剤若しくは活性化合物、又はそれらの組み合わせを含む。組成物の様々な実施形態は、本明細書では製剤と称されることもある。
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することによって、保管のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｋｌｉｎｓ，Ｐｕｂ．，Ｇｅｎｎａｒｏ Ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２０００）。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、緩衝剤、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む酸化防止剤、防腐剤、等張剤、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）、ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／又は非イオン性界面活性剤を含む。
緩衝剤を使用して、特に安定性がｐＨ依存性である場合に、治療有効性を最適化する範囲内でｐＨを調整することができる。緩衝剤は、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。本発明とともに使用するための好適な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方並びにその塩を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。加えて、緩衝剤は、トリスなどのヒスチジン塩及びトリメチルアミン塩からなり得る。
防腐剤は、微生物の増殖を防止するために添加されることができ、典型的には、約０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在する。治療剤とともに一般的に使用される好適な防腐剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム、チメロサール、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾール、ｏ－クレゾール、ｐ－クレゾール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピル、２－フェノキシエタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸ブチル、２－フェニルエタノール、エタノール、クロロブタノール、チオメロサル、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル、及びクロルフェネシン（３ｐ－クロルフェノキシプロパン－１，２－ジオール）が挙げられる。
「安定剤」として知られることもある等張剤は、組成物中の液体の等張性を調整又は維持するために存在し得る。タンパク質及び抗体などの大きな荷電生体分子とともに使用されたとき、それらはアミノ酸側鎖の荷電群と相互作用し、それによって、分子間及び分子内相互作用の可能性を低減することができるため、しばしば「安定剤」と称される。
等張剤は、他の成分の相対量を考慮に入れて、約０．１重量％～約２５重量％又は約１～約５重量％の任意の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、等張剤としては、多価糖アルコール、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどの三価又は高級糖アルコールが挙げられる。
追加の賦形剤には、（１）増量剤、（２）溶解性エンハンサー、（３）安定剤、及び（４）変性又は容器壁への付着を防止する薬剤のうちの１つ以上として作用し得る薬剤が含まれる。そのような賦形剤には、多価糖アルコール（上記に列挙）、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖又は糖アルコール、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、ａ－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース、二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）、ラフィノースなどの三糖類、並びにデキストリン又はデキストランなどの多糖類が含まれる。
非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療剤を可溶化すること、並びに撹拌誘導凝集から治療用タンパク質を保護することを助けるために存在し得、これはまた、活性治療用タンパク質又は抗体の変性を引き起こすことなく、製剤がせん断表面応力に曝露されることを可能にする。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ又は約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在する。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％～約０．１％ｗ／ｖ、又は約０．０１％～約０．１％ｗ／ｖ、又は約０．０１％～約０．０２５％ｗ／ｖの範囲内で存在する。
好適な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオン性洗剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが含まれる。陽イオン性洗剤には、ベンザルコニウム塩化物又はベンゼトニウム塩化物が含まれる。
製剤をインビボでの投与に使用するためには、製剤は滅菌でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を通した濾過によって滅菌され得る。本明細書の治療用組成物は、概して、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静注液バッグ、又は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病変内、若しくは関節内経路、局所投与、吸入による、又は徐放性若しくは持続放出手段による、注射又は注入などの好適な様式で、単回若しくは複数回のボーラス、又は長期間にわたる注入によるものなどの既知の許容された方法に従う。
本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインのうちのいずれかは、単独で、又は本明細書に記載される方法であるような他の治療剤と組み合わせて使用されることができる。「と組み合わせて」という用語は、同一又は別個の製剤に含まれる２つ以上の治療剤（例えば、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン）を包含する。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、「同時」投与を指し、その場合、本発明のマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与に同時に（例えば、同じ時間に、又はマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与と１つ以上の追加の治療剤の投与との間で１時間以内に）生じる。いくつかの実施形態では、「と組み合わせて」とは、逐次的投与を指し、その場合、本発明のマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与は、１つ以上の追加の治療剤の投与の前及び／又は後に（例えば、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与と１つ以上の追加の治療剤の投与との間で１時間を超えて）生じる。本明細書で企図される薬剤には、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤、免疫刺激分子を標的とする薬剤、成長阻害剤、免疫刺激剤、又は抗がん剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書の製剤はまた、治療されている特定の適応症、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する適応症のために必要に応じて、１つを超える活性化合物を含有し得る。代替的に、又は加えて、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、免疫チェックポイント分子若しくは刺激分子を標的とする薬剤、増殖阻害剤、免疫刺激剤、抗炎症剤、又は抗がん剤を含み得る。そのような分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて好適に存在する。
製剤は、液体製剤、固体（凍結乾燥）製剤、又は凍結製剤などの任意の好適な状態で提示され得る。治療使用のためのこれらのタイプの製剤の各々を調製するためのアプローチは、当該技術分野で周知である。
６．治療の方法
本明細書で提供されるものは、有効量の本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン又はその組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患を治療又は予防するための方法である。いくつかの態様では、本明細書に記載される任意の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患を治療するために方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、がんと診断されたか、又はそのような障害を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン又はその組成物を対象に投与することを含む、対象において疾患を治療又は予防するために方法が提供され、マスクされたＩＬ－１２サイトカインは、酵素による切断時に活性化される。いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカインは、腫瘍微小環境で活性化される。マスクされたＩＬ－１２サイトカインは、切断された後に治療的に活性である。したがって、いくつかの実施形態では、活性薬剤は、切断産物である。
疾患の予防又は治療について、活性薬剤の適切な投与量は、上記に定義されるような治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、薬剤が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、対象の臨床歴及び薬剤に対する応答、並びに担当医師の裁量に依存する。薬剤は、一度に、又は一連の治療にわたって、対象に好適に投与される。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与の間の間隔は、約１週間以上である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与間の間隔は、約２日以上、約３日以上、約４日以上、約５日以上、又は約６日以上である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与間の間隔は、約１週間以上、約２週間以上、約３週間以上、又は約４週間以上である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与間の間隔は、約１か月以上、約２か月以上、又は約３か月以上である。本明細書で使用される場合、投与の間の間隔とは、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの１回の投与とマスクされたＩＬ－１２サイトカインの次の投与との間の期間を指す。本明細書で使用される場合、約１か月の間隔は、４週間を含む。いくつかの実施形態では、治療は、マスクされたＩＬ－１２サイトカインの複数の投与を含み、投与の間の間隔は、変化し得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１か月であり、後続の投与の間の間隔は、約２週間である。いくつかの実施形態では、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約２日、３日、４日、又は５日、若しくは６日であり、後続の投与の間の間隔は、約１週間である。
いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカインは、ある期間にわたって複数回投与される。対象に複数回投与される投与量は、いくつかの実施形態では、各投与について同じ投与量であり得るか、又はいくつかの実施形態では、マスクされたサイトカインは、２つ以上の異なる投与量で対象に投与されることができる。例えば、いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２サイトカインは、最初に、１つの投与量で１回以上投与され、後に、以降の時点で開始して第２の投与量で１回以上投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、一律の用量で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、１回用量当たり約２５ｍｇ～約５００ｍｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、マスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、１回用量当たり約２５ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約７５ｍｇ、約７５ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１２５ｍｇ、約１２５ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約１７５ｍｇ、約１７５ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約２２５ｍｇ、約２２５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５０ｍｇ～約２７５ｍｇ、約２７５ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約３２５ｍｇ、約３２５ｍｇ～約３５０ｍｇ、約３５０ｍｇ～約３７５ｍｇ、約３７５ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約４２５ｍｇ、約４２５ｍｇ～約４５０ｍｇ、約４５０ｍｇ～約４７５ｍｇ、又は約４７５ｍｇ～約５００ｍｇの投与量で対象に投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、対象の体重又は体表面積（ＢＳＡ）に基づく投与量で対象に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）のマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、例えば、１つ以上の別個の投与によって、又は連続注入によってにかかわらず、患者への投与のための初期候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、治療は、概して、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持されるであろう。マスクされたＩＬ－１２ポリペプチドの１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（若しくはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６．０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７．０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８．０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９．０ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、又は約１０．０ｍｇ／ｋｇのうちのいずれかの投与量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドは、約若しくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約３．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約４．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約４．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約５．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約５．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約６．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約６．５ｍｇ／ｋｇ、約、又は少なくとも約７．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約７．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約８．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約８．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約９．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約９．５ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約１０．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約１５．０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約６０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約７０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約８０ｍｇ／ｋｇ、約若しくは少なくとも約９０ｍｇ／ｋｇ、又は約若しくは少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇの投与量で対象に投与される。上記に記載される投与頻度のうちのいずれかが、使用され得る。
本明細書で企図される治療の方法は、本明細書に記載されるマスクされたＩＬ－１２サイトカイン又は組成物のうちのいずれかを用いたがんなどの障害又は疾患の治療である。本発明の製剤を用いて治療可能である障害又は疾患には、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん（例えば、メルケル細胞がん）、又は精巣がんが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン又は組成物の投与による、がんの治療又は予防の方法である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、抗がん剤と組み合わせた本明細書に記載される任意のＩＬ－１２マスクされたサイトカイン又は組成物の投与による、がんの治療又は予防の方法である。抗がん剤は、がん増殖を低減すること、がん細胞複製を妨害すること、がん細胞を直接的若しくは間接的に死滅させること、転移を低減すること、腫瘍血液供給を低減すること、又は細胞生存を低減することが可能な任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、抗がん剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＨＥＲ２阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、Ｂ７Ｈ４阻害剤、Ｂ７Ｈ３阻害剤、ＣＳＦＩＲ阻害剤、ＨＶＥＭ阻害剤、ＣＤ２７阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＮＫＧ２Ａ阻害剤、ＮＫＧ２Ｄアゴニスト、ＴＷＥＡＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＣＤ５２標的化抗体、ＣＣＲ４標的化抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＢＡＦＦ阻害剤、ＨＤ ＡＣ阻害剤、ＶＥＧＦリガンド阻害剤、ＣＤ１９標的化分子、ＦＯＦＲ１標的化分子、ＤＦＦ３標的化分子、ＤＫＫ１標的化分子、ＭＵＣ１標的化分子、ＭＵＧ１６標的化分子、ＰＳＭＡ標的化分子、ＭＳＦＮ標的化分子、ＮＹ－ＥＳ０－１標的化分子、Ｂ７Ｈ３標的化分子、Ｂ７Ｈ４標的化分子、ＢＣＭＡ標的化分子、ＣＤ２９標的化分子、ＣＤ１５１標的化分子、ＣＤ１２３標的化分子、ＣＤ３３標的化分子、ＣＤ３７標的化分子、ＣＤＨ１９標的化分子、ＣＥＡ標的化分子、クローディン１８．２標的化分子、ＣＦＥＣ１２Ａ標的化分子、ＥＧＦＲＶＩＩＩ標的化分子、ＥＰＣＡＭ標的化分子、ＥＰＨＡ２標的化分子、ＦＣＲＨ５標的化分子、ＦＬＴ３標的化分子、ＧＤ２標的化分子、グリピカン３標的化分子、ｇｐＡ３３標的化分子、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化分子、ＩＬ－１２３Ｒ標的化分子、ＩＬ－１ＲＡＰ標的化分子、ＭＣＳＰ標的化分子、ＲＯＮ標的化分子、ＲＯＲ１標的化分子、ＳＴＥＡＰ２標的化分子、ＴｆＲ標的化分子、ＣＤ１６６標的化分子、ＴＰＢＧ標的化分子、ＴＲＯＰ２標的化分子、プロテアソーム阻害剤、ＡＢＥ阻害剤、ＣＤ３０阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＭＥＴ阻害剤、ＲＥＴ阻害剤、ＩＬ－１（３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＲＯＳ１阻害剤、ＢＲＡＥ阻害剤、ＣＤ３８阻害剤、ＲＡＮＫＥ阻害剤、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１阻害剤、ＳＬＡＭＦ７阻害剤、ＩＤＨ２阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＣＤ２０標的化抗体、ＢＴＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＲＡＦ阻害剤、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、ＪＡＫ３阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤、平滑化阻害剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤、ＰＴＣＨ阻害剤、ＰＩＧＦ阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、ＣＤ２８アゴニスト、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＧＩＴＲアゴニスト、０Ｘ４０アゴニスト、ＶＩＳＴＡアゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、及びＩＬ－１２Ｒ阻害剤からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、抗炎症剤と組み合わせた本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカインの投与による、がんの治療又は予防の方法である。抗炎症剤は、炎症を予防、対抗、阻害、又は別様に低減することが可能な任意の薬剤であり得る。
いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１及び／又はＣＯＸ－２の活性を阻害する任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１を選択的に阻害する（すなわち、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－２の活性を阻害するよりもＣＯＸ－１の活性を阻害する）。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－２を選択的に阻害する（すなわち、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１の活性を阻害するよりもＣＯＸ－２の活性を阻害する）。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の両方を阻害する。
いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、選択的ＣＯＸ－１阻害剤であり、ＳＣ－５６０、ＦＲ１２２０４７、Ｐ６、モフェゾラク、ＴＦＡＰ、フルルビプロフェン、及びケトプロフェンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、選択的ＣＯＸ－２阻害剤であり、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、ピロキシカム、デラコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、クロメン誘導体、クロマン誘導体、Ｎ－（２－シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、パレコキシブ、ルミラコキシブ、ＲＳ ５７０６７、Ｔ－６１４、ＢＭＳ－３４７０７０、ＪＴＥ－５２２、Ｓ－２４７４、ＳＶＴ－２０１６、ＣＴ－３、ＡＢＴ－９６３、ＳＣ－５８１２５、ニメスリド、フロスリド、ＮＳ－３９８、Ｌ－７４５３３７、ＲＷＪ－６３５５６、Ｌ－７８４５１２、ダルブフェロン、ＣＳ－５０２、ＬＡＳ－３４４７５、ＬＡＳ－３４５５５、Ｓ－３３５１６、ジクロフェナク、メフェナム酸、及びＳＤ－８３８１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトロラク、インドメタシン、アスピリン、ナプロキセン、トルメチン、ピロキシカム、及びメクロフェナマートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＯＸ阻害剤は、ＳＣ－５６０、ＦＲ１２２０４７、Ｐ６、モフェゾラク、ＴＦＡＰ、ルルビプロフェン、ケトプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、ピロキシカム、デラコキシブ、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、クロメン誘導体、クロマン誘導体、Ｎ－（２－シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、パレコキシブ、ルミラコキシブ、ＲＳ ５７０６７、Ｔ－６１４、ＢＭＳ－３４７０７０、ＪＴＥ－５２２、Ｓ－２４７４、ＳＶＴ－２０１６、ＣＴ－３、ＡＢＴ－９６３、ＳＣ－５８１２５、ニメスリド、フロスリド、ＮＳ－３９８、Ｌ－７４５３３７、ＲＷＪ－６３５５６、Ｌ－７８４５１２、ダルブフェロン、ＣＳ－５０２、ＬＡＳ－３４４７５、ＬＡＳ－３４５５５、Ｓ－３３５１６、ジクロフェナク、メフェナム酸、ＳＤ－８３８１、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトロラク、インドメタシン、アスピリン、ナプロキセン、トルメチン、ピロキシカム、及びメクロフェナマートからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、ＮＦ－ｋＢ阻害剤である。ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＮＦ－ｋＢ経路の活性を阻害する任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＩＫＫ複合体阻害剤、ＩｋＢ分解阻害剤、ＮＦ－ｋＢ核転座阻害剤、ｐ６５アセチル化阻害剤、ＮＦ－ｋＢ ＤＮＡ結合阻害剤、ＮＦ－ｋＢトランス活性化阻害剤、及びｐ５３誘導阻害剤からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ＩＫＫ複合体阻害剤は、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ－３４５５４１、アンレキサノクス、ＳＣ－５１４（ＧＫ－０１１４０）、ＩＭＤ－０３５４、及びＩＫＫ－１６からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩｋＢ分解阻害剤は、ＢＡＹ－１１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、ラクタシスチン、エポキソマイシン、パルテノリド、カルフィルゾミブ、及びＭＬＮ－４９２４（ペボネジスタット）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢ核内転座阻害剤は、ＪＳＨ－２３及びロリプラムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｐ６５アセチル化阻害剤は、没食子酸及びアナカルド酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢＤＮＡ結合阻害剤は、ＧＹＹ－４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ－３９８８、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢトランス活性化阻害剤は、ＬＹ－２９４００２、ウォルトマンニン、及びメサラミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｐ５３誘導阻害剤は、キナクリン及びフラボピリドールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＦ－ｋＢ阻害剤は、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－ｋＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ－３４５５４１、アムレキサノクス、ＳＣ－５１４（ＧＫ－０１１４０）、ＩＭＤ－０３５４、ＩＫＫ－１６、ＢＡＹ－１１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、ラクタシスチン、エポキシシン、パルテノリド、カルフィルゾミブ、ＭＬＮ－４９２４（ペボネジスタット）、ＪＳＨ－２３ロリプラム、没食子酸、アナカルド酸、ＧＹＹ－４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ－３９８８、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＬＹ－２９４００２、ウォルトマンニン、メサラミン、キナクリン、及びフラボピリドールからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、抗がん治療用タンパク質と組み合わせた本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン又は組成物の投与による、がんの治療又は予防の方法である。抗がん治療用タンパク質は、がん増殖を低減すること、がん細胞複製を妨害すること、がん細胞を直接的若しくは間接的に死滅させること、転移を低減すること、腫瘍血液供給を低減すること、又は細胞生存を低減することが可能な任意の治療用タンパク質であり得る。例示的抗がん治療用タンパク質は、抗体若しくはその断片、抗体誘導体、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、融合タンパク質、又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の形態で生じ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるものは、ＣＡＲ－ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞と組み合わせた本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－２サイトカイン又は組成物の投与による、がんの治療又は予防の方法である。
７．製造物品又はキット
別の態様では、本明細書に記載される任意のマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含む、製造品又はキットが提供される。製造物品又はキットは、本発明の方法におけるサイトカインの使用のための説明書をさらに含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、製造品又はキットは、有効量のマスクされたサイトカインを個体に投与することを含む、個体において障害（例えば、がん）を治療又は予防するための方法におけるマスクされたサイトカインの使用のための説明書を含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、製造品又はキットは、有効量のマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体において障害（例えば、がん）を治療又は予防する方法におけるマスクされたＩＬ－１２ポリペプチドの使用のための説明書を含む。ある特定の実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん、又は精巣がんからなる群から選択される疾患を有する。
製造物品又はキットは、容器をさらに含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングル又はデュアルチャンバーシリンジなど）、試験管、及び静注（ＩＶ）バッグが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、製剤を保持する。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、凍結製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、液体製剤である。
製造物品又はキットは、容器上にあるか、又は容器と関連付けられる、ラベル又は添付文書をさらに含み得、製剤の再構成及び／又は使用のための指示を示し得る。ラベル又は添付文書は、製剤が、個体における障害（例えば、がん）を治療又は予防するための皮下、静脈内、若しくは他の投与様式に有用であるか、又は意図されていることをさらに示し得る。製剤を保持する容器は、単回使用バイアル又は複数回使用バイアルであってもよく、これは再構成された製剤の反復投与を可能にする。製造物品又はキットは、好適な希釈剤を含む第２の容器をさらに含み得る。製造物品又はキットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的、治療的、及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
具体的な実施形態では、本発明は、単回用量投与ユニット用のキットを提供する。そのようなキットは、治療用サイトカインの水性製剤の容器を含み、
シングル又はマルチチャンバープレフィルドシリンジの両方を含む。例示的事前充填シリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ（Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能である。
本明細書の製造物品又はキットは、任意選択に、第２の薬剤を含む容器をさらに含み、マスクされたサイトカインは、第１の薬剤であり、その物品又はキットは、有効量における第２の薬剤で対象を治療するためのラベル又は添付文書上の説明書をさらに含む。
別の実施形態では、本明細書で提供されるものは、自動注射器装置での投与のための本明細書に記載される製剤を含む、製造物品又はキットである。自動注射器は、起動時に、患者又は投与者からの追加の必要な措置なしにその内容物を送達する、注射装置として説明され得る。これらは、送達速度が一定でなければならず、かつ送達時間が数瞬よりも長い場合、治療用製剤のセルフメディケーションに特に適している。
８．定義
別段に定義のない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語、表記、並びに他の技術用語及び科学用語は、請求される主題が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することを意図している。場合によっては、一般的に理解される意味を伴う用語は、明確性及び／又は容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書のそのような定義の包含は、当該技術分野で一般的に理解されるものに対する実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。
本発明は、当然のことながら変化し得る特定の組成物又は生物学系に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものであるに過ぎず、制限を意図するものではないことを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が他に別様に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａｎ ＩＬ－１２ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＩＬ－１２ポリペプチド）」の言及は、任意選択的に、２つ以上のそのようなポリペプチド及び同等物の組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合の「約」という用語は、この技術分野の当業者に容易に知られているそれぞれの値に対する通常の誤差範囲を指す。本明細書の「約」の値又はパラメータの言及は、その値又はパラメータを本質的に対象とする実施形態を含む（及び記載する）。
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形を「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、用語が関連する項目のうちのいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、又は項目のすべてを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という語句は、以下の実施形態の各々を包含することを意図している：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、又はＣ、Ａ又はＢ、Ａ又はＣ、Ｂ又はＣ、Ａ及びＢ、Ａ及びＣ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＢ又はＣ、Ｂ及びＡ又はＣ、Ｃ及びＡ又はＢ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、並びにＣ（単独）。
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（イムノグロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含む。「イムノグロブリン（Ｉｇ）」という用語は、本明細書では「抗体」と同義的に使用される。
「抗体」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインに接続された重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体断片を指す。
塩基性４本鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体が、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに、５個の塩基性ヘテロ四量体ユニットからなり、１０個の抗原結合部位を含有する一方で、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を形成するように重合することができる、２～５個の塩基性４本鎖ユニットを含む。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは、概して、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖が、１つの共有結合ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結される一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、規則的な間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いてａ鎖及びｙ鎖の各々に対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）、並びにｐ及びｓアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその他方の末端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨと整列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨＩ）と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は、ともに単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ ７１ ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる、２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てられることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、それぞれ、ａ、８、ｅ、ｙ、及びｐと指定された重鎖を有する。ｙ及びａクラスは、ＣＨ配列及び機能における比較的軽微な差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと称される複数の多型バリアント（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７で論評される）で存在することができ、そのうちのいずれかが、本発明で使用するために好適である。ヒト集団における一般的なアロタイプバリアントは、ａ、ｆ、ｎ、ｚという文字で指定されるものである。
「単離された」抗体は、その産生環境（例えば、天然又は組換え）の成分から識別、分離、及び／又は回収された抗体である。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その産生環境からの他のすべての成分と無関連である。組換えトランスフェクト細胞から生じるものなどのその産生環境の汚染成分は、典型的には、抗体の研究、診断、又は治療用途に干渉する材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性若しくは非タンパク質性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％超まで、及びいくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（１）回転カップシークエンサーの使用によってＮ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー若しくはシルバー染色を使用した非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均質性まで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内でインサイチュに抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチド又は抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
本明細書で使用される場合の「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖にＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸残基は、重鎖及び／又は軽鎖のＣ末端で切断される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リジンを除去する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖にＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸残基は、重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端で切断される。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の短縮型形態は、組換え技術によって作製され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に配向されている。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、複数の抗原部位（例えば、二重特異性抗体又は多重特異性抗体など）に配向されている。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体群から取得されるものとして抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするとはみなされないものとする。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ技術、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部若しくはすべて又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術を含む、様々な技法によって作製され得る。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、又は「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために同義的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。場合によっては、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域、並びに／若しくはインタクトな抗体の定常領域などのインタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、抗体のＦｃ領域、Ｆｃ領域の一部、又はＦｃ領域を含む抗体の一部が挙げられる。抗原結合抗体断片の例としては、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、抗体、線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２ ［１９９５］を参照されたい）、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。単一重鎖抗体若しくは単一軽鎖抗体は、操作されることができるか、又は重鎖の場合には、単一重鎖分子を産生するように操作されたラクダ科、サメ、ライブラリ、若しくはマウスから単離されることができる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」断片とを産生した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨＩ）とともに、Ｌ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結Ｆａｂ断片にほぼ対応し、依然として抗原を架橋することが可能である、単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を産出する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨＩドメインのカルボキシ末端に数個の追加の残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ、Ｆａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学結合も既知である。Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列及びグリカンによって決定され、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される領域は、ある特定の細胞型上に見られる。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要であればギャップを導入して配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮していない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対した、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対した、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、又は含む、所与のアミノ酸配列Ａと代替的に称され得る）は、以下のように計算される。
１００×画分Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢの整列における配列によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列同一性％と等しくないことを理解されたい。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書で使用される場合の「結合親和性」は、分子（例えば、サイトカイン）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、サイトカイン受容体）との間の非共有相互作用の強度を指す。いくつかの実施形態では、結合タンパク質（例えば、サイトカイン）の親和性は、概して、平衡解離定数（Ｋｄ）によって表されることができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定されることができる。
本明細書に記載されるサイトカインポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、それが産生された環境で通常関連する、少なくとも１つの汚染核酸分子から識別及び分離される核酸分子である。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、産生環境と関連付けられたすべての成分と無関連である。本明細書のポリペプチド及びサイトカインポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態又は環境以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチド及びサイトカインポリペプチドをコードする核酸と区別される。
「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含有しない、調製物を指す。
そのような製剤は、滅菌されている。
本明細書で使用される場合の「担体」は、用いられる投与量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動物に非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、臨床病理の経過中に治療されている個体又は細胞の自然経過を改変するように設計された臨床介入を指す。治療の望ましい効果には、疾患進行の速度の低下、疾患状態の改善若しくは緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。個体は、例えば、障害（例えば、新生物性疾患）に関連する１つ以上の症状が軽減又は除去される場合、首尾よく「治療される」。例えば、治療が、疾患を患う個体の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、疾患の再発頻度の低減、疾患の重症度の低減、疾患の発症若しくは進行の遅延、及び／又は個体の生存の延長をもたらす場合、個体は、首尾よく「治療される」。
本明細書で使用される場合、「と併用して」又は「と組み合わせて」は、別の治療モダリティに加えて、１つの治療モダリティの投与を指す。したがって、「と併用して」又は「と組み合わせて」は、個体への他の治療モダリティの投与の前、その間、又はその後の、１つの治療モダリティの投与を指す。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、個体における疾患の発生又は再発に関して予防を提供することを含む。個体は、障害の素因があるか、障害にかかりやすいか、又は障害を発症するリスクがあり得るが、障害と診断されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスクされたサイトカインは、障害の発症を遅延させるために使用される。
本明細書で使用される場合、障害を発症する「リスクがある」個体は、検出可能な疾患若しくは疾患の症状を有し得るか、又は有しない場合があり、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患若しくは疾患の症状を示している場合があるか、又は示していない場合がある。「リスクがある」とは、当該技術分野で既知であるように、個体が、疾患の発症と相関する測定可能なパラメータである１つ以上のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子のうちの１つ以上を有する個体は、これらのリスク因子のうちの１つ以上がない個体よりも、障害を発症する確率が高い。
「有効量」は、少なくとも、治療結果又は予防的結果を含む、所望の又は指示された効果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。
有効量は、１回以上の投与で提供されることができる。「治療的有効量」は、少なくとも、特定の障害の測定可能な改善に影響を与えるために必要な最小濃度である。本明細書における治療的有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子、並びに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力に応じて変化し得る。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果がマスクされたサイトカインの任意の毒性又は有害な効果を上回る量であり得る。「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。典型的には、必ずしもではないが、予防用量が、疾患の前に、又は疾患の早期の段階で対象で使用されるため、予防的有効量は、治療的有効量よりも少なくあり得る。
「慢性」投与は、長期間にわたる初期治療効果（活性）を主流にするように、急性モードとは対照的な連続モードでの薬剤の投与を指す。「断続的」投与は、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
本明細書で使用される場合、「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。治療の目的のための「哺乳動物」には、ヒト、家畜及び農場動物、並びにイヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどの動物園、スポーツ、又はペット動物が含まれる。いくつかの実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
９．実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示目的のためのみであり、それを考量したその様々な修飾又は変更が当業者に提案され、本出願の趣旨及び目的、並びに添付の特許請求の範囲に含まれるべきであることを理解されたい。
いくつかの実施例は、ＩＬ－２ポリペプチド構築物の「マスクされた」バージョンの操作、産生、及び／又は試験を説明するが、いくつかの実施例はまた、比較のためなどのＩＬ－２ポリペプチド構築物の親「マスクされていない」バージョン、又は比較のための対照として試験される本明細書に記載される成分のうちの１つ以上を含む他の構築物も用いる。したがって、例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物に行われた試験の説明は、構築物のマスクされていないバージョンも試験されなかったことを必ずしも意味するわけではない。
実施例１：マスクされたＩＬ－２ポリペプチドの操作
マスクされたＩＬ－２ポリペプチドが、本明細書の教示に従って生成される。後続の実施例では、いくつかの実験は、単量体形態のマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の使用を伴い、いくつかの実験は、同じマスクされたポリペプチド構築物の２つのコピーを連結するジスルフィド結合を通して形成された二量体（ホモ二量体）、又は２つの異なるポリペプチドによって形成されたヘテロ二量体などの二量体形態のマスクされたＩＬ－２構築物の使用を伴う（例えば、表５を参照されたい）。
ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片、マスキング部分、及び抗体又はその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、及び／又は軽鎖）などの半減期延長ドメインを含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が生成される。マスキング部分も含むことなく、半減期延長ドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片を含む、いくつかのＩＬ－２ポリペプチド構築物も生成される。構築物のうちのいくつかはまた、切断可能なペプチドを含み、マスキング部分をＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片に連結し、それによって、活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらす、リンカーも含む。構築物のうちのいくつかはまた、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片を半減期延長ドメインに連結するリンカーも含む。構築物のうちのいくつかはまた、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片をマスキング部分に連結するリンカーも含む。ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片をマスキング部分に連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、非活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物又は非活性化可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも称される。例示的ＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造及び組成物が、表３に提供される。
Figure 2023520518000056
また、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片、第１のマスキング部分、第２のマスキング部分、及びアルブミン、抗体若しくはその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、及び／又は軽鎖）、アルブミン結合ペプチド、ＩｇＧ結合ペプチド、又はポリアミノ酸配列などの半減期延長ドメインを含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物も生成される。構築物のうちのいくつかはまた、第１のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片に連結するリンカーも含む。構築物のうちのいくつかはまた、第２のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片に連結するリンカーも含む。構築物のうちのいくつかは、第１のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチド若しくはその機能的断片に連結するリンカー、及び／又は第２のマスキング部分をＩＬ－２ポリペプチド若しくはその機能的断片に連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含み、それによって、活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらす。 構築物のうちのいくつかはまた、第２のマスキング部分を半減期延長ドメインに連結するリンカーも含む。ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片を第１のマスキング部分又は第２のマスキング部分に連結するリンカーのいずれかに切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、非活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物又は非活性化可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも称される。例示的ＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造及び組成物が、表４に提供される。
Figure 2023520518000057
また、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片、マスキング部分、第１の半減期延長ドメイン、及び第２の半減期延長ドメイン、抗体又はその断片（例えば、Ｆｃ領域、重鎖、及び／又は軽鎖）を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物も生成される。マスキング部分は、第１の半減期延長ドメインに連結され、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片は、第２の半減期延長ドメインに連結され、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインは、第１及び第２の半減期延長ドメインの会合を促進する修飾を含む。１つの例示的実施形態では、マスキング部分は、第１の半減期延長ドメインに連結され、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片は、第２の半減期延長ドメインに連結され、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインは、第１及び第２の半減期延長ドメインの関連付けを促進する修飾を含む。マスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物の１つの例示的実施形態では、実施形態は、第１の半減期延長ドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片を含み、第２の半減期延長ドメインを含み、ＩＬ－２ポリペプチド又はその機能的断片は、第１の半減期延長ドメイン及び第２の半減期延長ドメインに連結される。構築物のうちのいくつかはまた、マスキング部分を第１の半減期延長ドメインに連結するリンカー、及び／又はＩＬ－２ポリペプチド若しくはその機能的断片を第２の半減期延長ドメインに連結するリンカーを含む。構築物のうちのいくつかの第１及び第２の半減期延長ドメインもまた、連結される。いくつかの構築物では、構築物のうちのいくつかの第１及び第２の半減期延長ドメインは、リンカーによって連結される。構築物のうちのいくつかは、マスキング部分を第１の半減期延長ドメインに連結するリンカー、及び／又はＩＬ－２ポリペプチド若しくはその機能的断片を第２の半減期延長ドメインに連結するリンカー内に切断可能なペプチドを含み、それによって、活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物をもたらす。ＩＬ－２ポリペプチド若しくはその機能的断片を第２の半減期延長ドメインに連結するリンカー、又はマスキング部分を第１の半減期延長ドメインに連結するリンカーのいずれかに切断可能なペプチドを含まないマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、切断可能なペプチドを含まないため、非活性化可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物又は非活性化可能なＩＬ－２ポリペプチド構築物とも称される。例示的ＩＬ－２ポリペプチド構築物の構造及び組成物が、表５に提供される。
Figure 2023520518000058
Figure 2023520518000059
実施例２：マスクされたＩＬ－２のインビトロ特性評価
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、インビトロでいくつかの細胞アッセイ及び機能的アッセイを使用して特性評価される。
産生
構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）をコードするプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）又はＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ；ＮＲＣ）のいずれかにトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、１１５－１００）を使用した１ｍｇの総ＤＮＡを使用して、総ＤＮＡと１：１の比率で実施された。ＤＮＡ及びＰＥＩを各々、５０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３１９８５０８８）培地に添加し、滅菌濾過した。ＤＮＡ及びＰＥＩを１０分間組み合わせ、それぞれ、ｅｘｐｉ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞について、１．８～２．８×１０６細胞／ｍＬ又は０．８５～１．２０×１０６細胞／ｍの細胞密度、及び少なくとも９５％の生存率でＥｘｐｉ２９３細胞に添加した。ＨＥＫ２９３－６Ｅトランスフェクションは、Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクションに使用されたものと同じプロトコルに従って、少なくとも９５％の細胞密度及び生存率で実施された。５～７日後、細胞を３０００×ｇで遠心分離することによってペレット化し、上清を０．２μｍの膜を通して濾過した。プロテインＡ樹脂（ＣａｐｔｉｖＡ、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ ＣＡ－ＰＲＩ－０００５）を、濾過された上清に添加し、振とうしながら４℃で少なくとも２時間インキュベートした。樹脂をカラムの中に充填し、１５カラム体積の２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）で洗浄し、次いで、１５カラム体積の２０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）で洗浄した。結合タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．９）でカラムから溶出した。
親（例えば、マスクされていない）及びマスクされた構築物を含む、産生された例示的構築物の力価（ｍｇ／Ｌ）が、以下の表６に提供される。
Figure 2023520518000060
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析については、タンパク質サンプルを４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６１０７４７）を用いて作製した。還元サンプルについては、０．１ＭのＢｏｎｄ Ｂｒｅａｋｅｒ ＴＣＥＰ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ７７７２０）を添加し、サンプルを６５℃で５分間加熱した。タンパク質を１２ウェル ＮｕＰａｇｅ ４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に装填し、ウェル当たり４μｇのタンパク質を装填した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＣ６０６５）を使用して、ゲルを染色した。
図４に描写されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、例示的構築物（ＡＫ３０４、ＡＫ３０５、ＡＫ３０７、ＡＫ３０８、ＡＫ３０９、ＡＫ３１０、ＡＫ３１１、ＡＫ３１２、ＡＫ３１３、ＡＫ３１４、及びＡＫ３１５）の産生及び精製後に、フロースルー（ＦＴ）サンプル（すなわち、プロテインＡカラムに結合しなかったタンパク質）及び溶出（Ｅ）サンプル（すなわち、プロテインＡカラムに結合し、そこから溶出されたタンパク質）に実施された。この例示的データは、本明細書に記載される構築物が、正常に産生及び精製され得ることを示す。
レポーターバイオアッセイ
レポーターバイオアッセイは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路などの下流経路の活性化を監視するために、マスクされていない親構築物又は他の対照とともに、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物に実施される。
いくつかの研究では、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が、以下の方法に従ってＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を試験するために使用された。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２細胞６代継代（ｐ６）（９７％生細胞）を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活化ＦＢＳ）で２回洗浄し、１５０ｕＬ中のアッセイ培地中に５ｅ４細胞／ウェルにおいて３つのプレート内で播種し、約２時間アッセイ培地中で静置して、プレートへの接着を可能にした。試験された各構築物をアッセイ培地中で３００ｐＭに希釈し、次いで、プレートを１：２まで希釈した。７５ｐＭの最終開始濃度のために、５０ｕＬの各希釈を添加した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２細胞上清を２４時間後に採取し、３ウェル／プレートのアッセイ培地を加えたＱｕａｎｔｉｂｌｕｅ（１８０ｕＬ＋２０ｕＬ上清）と３７℃で１時間インキュベートした。６２５ｎｍにおいてＢｉｏｔｅｋ Ｎｅｏ２を使用して、吸光度を読み取った。
いくつかの研究では、ＣＴＬＬ２細胞が、以下の方法に従ってＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を試験するために使用された。ＣＴＬＬ２細胞を、１０％のＦＢＳを伴うＲＰＭＩ中にウェル当たり４０，０００個の細胞で播種した。目的の構築物の希釈物を添加し、３７度でインキュベートした。６時間後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を添加し、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダーを用いて発光を測定した。
受容体結合
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物については、いくつかの実験では、ＥＬＩＳＡプレートは、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５とも呼ばれる）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２とも呼ばれる）、若しくはＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２とも呼ばれる）、又はそれらの組み合わせなどの受容体サブユニットでコーティングされる。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の希釈物は、受容体サブユニットに結合させられ、抗ｈｕＦｃ－ＨＲＰ検出抗体を使用して検出される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合は、プロテアーゼ切断の有無別の条件で決定される。
細胞上受容体結合
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の細胞上受容体結合が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の希釈物は、ＣＴＬＬ２細胞などの末梢血リンパ球又は組織培養細胞に結合させられ、抗ｈｕＦｃ－ＦＩＴＣ又は抗アルブミン－ＦＩＴＣ検出抗体を使用して蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって検出される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合は、プロテアーゼ切断の有無別の条件で決定される。
受容体結合親和性
マスクされた及びマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物の結合を試験するＳＰＲ研究については、Ｒｅｉｃｈｅｒｔカルボキシメチルデキストランヒドロゲル表面センサチップが、ＥＤＣ及びＮＨＳとのアミン結合を介して、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の３０ｕｇ／ｍｌにおいて目的の構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物又はマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物）でコーティング及び固定化された。ＰＢＳＴ中のＣＤ２５－Ｆｃ又はＦｃ－ＣＤ１２２の希釈物（ＣＤ２５：１６ｎＭ、８ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ及びＣＤ１２２：５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ）を調製した。Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４Ｃｈａｎｎｅｌ ＳＰＲを使用して、ＣＤ２５又はＣＤ１２２の希釈物を、固定化構築物を伴うクリップ上に流し、２５℃でのオンレートを決定した。平衡時（約３～４分）、流動緩衝液をＰＢＳＴに変更し、６分間にわたってオフレートを決定した。各実行の合間に、チップを１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．０）で再生した。
図５Ａ～５Ｄは、ＣＤ２５－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）の結合を試験したＳＰＲ分析を使用して、そのアルファ受容体への結合を防止するＩＬ－２上の変異の有効性を描写する。図５Ａは、ＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図５Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１６８とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図５Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ２５－Ｆｃとの間の相互作用を描写する。図５Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。これらの結果は、この例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１６８）が、ＣＤ２５－Ｆｃへの検出可能な結合を実証しなかった一方で、野生型ｒｈＩＬ－２対照が、検出可能な結合を実証したことを実証する。
図６Ａ～６Ｄは、ＣＤ１２２－Ｆｃへの例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）の結合を試験したＳＰＲ分析を使用して、そのベータ受容体に向けたＩＬ－２のマスキング、並びにプロテアーゼを用いた活性化後の結合の復元を描写する。図６Ａは、ＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図６Ｂは、ＭＭＰで活性化されたＡＫ１１１とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を描写し、図６Ｃは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）対照とＣＤ１２２－Ｆｃとの間の相互作用を描写する。図６Ｄは、会合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）、並びに各相互作用のＣｈｉ２値及びＵ値について取得されたデータを要約する表を提供する。これらの結果は、この例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１１１）が、プロテアーゼで活性化されていない限り、ＣＤ１２２－Ｆｃへの検出可能な結合を実証しなかった一方で、ｒｈＩＬ－２対照が、検出可能な結合を実証したことを実証する。追加の例示的ＳＰＲデータが、マスクされた及びマスクされていない構築物を含む、試験された様々な構築物について、以下の表７に提供される。いくつかの構造については、適用可能である場合、ＫＤは、プロテアーゼによって以前に切断されていることの有無別に構築物について決定された。
Figure 2023520518000061
切断
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の切断速度は、上記に記載されるように、プロテアーゼの存在下又は非存在下で、マスクされたＩＬ－２ペプチド構築物のインキュベーション後に、受容体結合アッセイを行うことによって評価され、プロテアーゼが存在する場合、ＥＤＴＡの添加などによって、様々な時点で不活化される。切断速度はまた、還元及び非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して、並びに質量分析全質量及びペプチドマップ分析によって評価される。切断速度はまた、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物が、ヒト、マウス、若しくはカニクイザル末梢血リンパ球、又は正常なヒト組織若しくはヒト腫瘍組織に曝露される、エクスビボアッセイを使用して評価される。
いくつかのプロテアーゼ活性化研究については、ＭＭＰ１０をＭＭＰ切断緩衝液中で５０ｎｇ／ｕＬに希釈し、１ｍＭのＡＰＭＡで３７℃において２時間活性化した。活性化プロテアーゼのうちの５μＬのプロテアーゼ（合計２５０ｎｇ）を、１ｕＭのマスクされたサイトカイン構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）とインキュベートし、３７度で２時間インキュベートした。切断は、ＡｎｙｋＤ（商標）Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）タンパク質ゲルを使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価された。類似アプローチが、他のプロテアーゼによる切断を試験するためにとられた。
図７Ａは、腫瘍環境に関連するプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断の前（左）及び後（右）のマスクされたＩＬ－２ポリペプチドの例示的構造を描写する。図７Ｂは、ＭＭＰ１０プロテアーゼの非存在下（左レーン）又は存在下（右レーン）でインキュベートされた例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を描写する。
増殖
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた治療後のＣＴＬＬ２、ＹＴ、ＴＦ１Ｂ、ＬＧＬ、ＨＨ、及びＣＴ６などのＩＬ－２応答性組織培養細胞株の増殖が評価される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を伴う実験については、細胞が、ＩＬ－２を欠いた培地中で９６ウェル組織培養プレートに２～４時間播種され、次いで、様々な濃度においてマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物で治療される。３７度における２４～４８時間のインキュベーション後、細胞数は、ＭＴＳ、アラマーブルー、ルシフェラーゼ、又は類似の代謝検出試薬の添加、及びプレート分光光度計リーダーによって検出される比色、蛍光、又はルシフェラーゼの読み出しによって決定される。
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた治療後の免疫細胞の増殖も評価される。ヒト、マウス、又はカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、様々な濃度における構築物で治療され、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／又はＴｒｅｇ細胞などの細胞型の増殖は、特定の細胞型の染色及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を通した分析によって決定される。いくつかの実験では、いくつかのＰＢＭＣは、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、いくつかのＰＢＭＣは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、プロテアーゼ切断（例えば、活性化）の有無別の条件で試験される。いくつかの実験では、ＮＫ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋として染色され、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋として染色され、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－として染色され、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋として染色される。いくつかの実験では、ＰＢＭＣは、５日の期間にわたって治療される。いくつかの実験では、ＰＢＭＣはまた、細胞増殖のマーカーであるＫｉ６７で染色される。いくつかの実験では、ＰＢＭＣは、治療前にＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識され、増殖は、ＣＦＳＥ希釈の程度を決定することによって測定される。いくつかの実験では、各構築物、並びにアルデスロイキン及び／又は他の対照は、０．０００１ｎＭ～５００ｎＭの範囲の１つ以上の濃度などの１つ以上の濃度で投与される。
ＳＴＡＴ５活性化
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた治療後のシグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）の活性化も評価される。ＰＢＭＣは、指定された期間にわたって構築物で治療され、次いで、ＳＴＡＴ５などのタンパク質のリン酸化状態を維持するために即時に固定される。いくつかの実験では、いくつかのＰＢＭＣは、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、いくつかのＰＢＭＣは、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、プロテアーゼ切断（例えば、活性化）の有無別の条件で試験される。いくつかの実験では、ＰＢＭＣは、１０分、１５分、２０分、又は２５分間治療される。いくつかの実験では、各構築物、並びにアルデスロイキン及び／又は他の対照は、０．０００１ｎＭ～５００ｎＭの範囲の１つ以上の濃度などの１つ以上の濃度で投与される。いくつかの実験では、固定及び透過化ＰＢＭＣは、次いで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ホスホ－ＳＴＡＴ５）に特異的な抗体で染色され、フローサイトメトリーによって分析される。いくつかの実験では、ＳＴＡＴ５の合計レベル及びリン酸化レベルが測定される。ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／又はＴｒｅｇ細胞などの特定の細胞型のホスホ－ＳＴＡＴ５状態は、特定の細胞型の染色によって決定される。いくつかの実験では、ＮＫ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ５６＋として染色され、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋として染色され、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５－として染色され、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋として染色される。
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物を用いた治療後のＣＴＬＬ－２細胞などのマウス細胞株内のＳＴＡＴ５の活性化も評価される。いくつかの実験では、いくつかのＣＴＬＬ－２細胞は、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、いくつかのＣＴＬＬ－２細胞は、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、プロテアーゼ切断（例えば、活性化）の有無別の条件で試験される。いくつかの実験では、ＣＴＬＬ－２細胞は、１０分、１５分、２０分、又は２５分間治療され、次いで、ＳＴＡＴ５などのタンパク質のリン酸化状態を維持するために固定される。いくつかの実験では、各構築物、並びにアルデスロイキン及び／又は他の対照は、１つ以上の濃度で投与される。いくつかの実験では、ＳＴＡＴ５の合計レベル及びリン酸化レベルが測定される。
いくつかの研究では、ＩＬ－２によって誘導された細胞内ＳＴＡＴ５活性化（ｐＳＴＡＴ５シグナル）のレベルは、以下の方法によって決定された。凍結されたヒトＰＢＭＣを、水浴中で解凍し、３９ｍＬの事前加温培地（１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、１％ＮＥＡを加えたＲＰＭＩ１６４０培地）に添加し、１０Ｅ６細胞／ｍＬにおいて培地中で回転及び再構成した。細胞を、９６ウェルプレート中にウェル当たり５Ｅ５細胞で播種した。培地中で希釈されたＩＬ－２（例えば、ｒｈＩＬ－２又は例示的ＩＬ－２含有ポリペプチド構築物）を各ウェルに添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を、２００ｕｌ／ウェルの固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で一晩固定した。遠心分離後、固定細胞を、２００ｕｌの冷たいＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄した後、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（染色緩衝液中のサンプル当たり合計５０ｕＬで２．５ｕＬ）を用いて氷上で５分間治療した。染色抗体、すなわち、５ｕｌのｐＳＴＡＴ５－ＡＰＣ（ｐＹ６９４、ＢＤ）、１０ｕｌのＣＤ５６－ＢＶ４２１（５．１Ｈ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１０ｕｌのＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ａ１６１Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び１０ｕｌのＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加し、氷上で３０分間、光から保護してインキュベートした。細胞を２回洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
図８Ａ～８Ｄは、例示的構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０３５、ＡＫ０４１、又は対照としてのｒｈＩＬ－２を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）が、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）について示される。ＡＫ０３２及びＡＫ０３５構築物は、Ｆｃドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ０４１構築物は、ＣＤ２５ドメイン及びＣＤ１２２ドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含む。示されるように、操作されたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化を保持又は強化しながら、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を低減することができる。
図９Ａ～９Ｃは、例示的構築物ＡＫ０８１及びＡＫ０３２を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。ＭＭＰ１０への以前の曝露の有無別のＡＫ０８１構築物が試験された。アイソタイプ対照並びに無ＩＬ－２陰性対照も試験された。ＳＴＡＴ５活性化のレベル（％）は、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞について示される。ＡＫ０３２及びＡＫ０８１構築物は、Ｆｃドメインに連結されたＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ０８１構築物は、ＩＬ－２ポリペプチドをＦｃドメインに接続するリンカー内に切断可能なペプチドを含む。示されるように、マスクされていない単量体ＡＫ０８１ ＩＬ－２ポリペプチド構築物は、マスクされていない二量体ＡＫ０３２ ＩＬ－２ポリペプチド構築物と同様に、プロテアーゼ活性化の有無別にＰＢＭＣのＳＴＡＴ５活性化を刺激する。
図１０Ａ～１０Ｄは、例示的構築物ＡＫ０８１及びＡＫ１１１、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。無治療対照も試験された。ＡＫ１１１構築物は、（Ｃ１２５Ａ変異を除く）ＩＬ－２ポリペプチドの野生型を含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。図１０Ａ～１０Ｄに示されるように、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１は、マスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１と比較して、ＳＴＡＴ５活性化の低減を実証した。図１０Ｄは、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１構築物、及びｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。
図１１Ａ～１１Ｄは、例示的構築物ＡＫ１６７及びＡＫ１６８、並びにｒｈＩＬ－２及び抗ＲＳＶ抗体を含んだ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。無治療対照も試験された。ＡＫ１６８構築物は、ＣＤ２５結合を排除又は低減するＩＬ－２ポリペプチドの変異形態を含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。ＡＫ１６７構築物は、同じ変異ＩＬ－２ポリペプチドを含むＡＫ１６８構築物の親のマスクされていない形態である。図１１Ａ～１１Ｃに示されるように、マスクされていないＡＫ１６７構築物は、ｒｈＩＬ－２対照と比較してＳＴＡＴ５活性化の低減を実証し、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８は、検出可能なＳＴＡＴ５活性化を誘導しなかった。図１１Ｄは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８構築物、並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０（ｐＭ）及び倍率変化データを提供する。ＡＫ１６８構築物のＥＣ５０は、検出不能（ｎ．ｄ．）であった。
図１２Ａ～１２Ｄは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、又は以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、例示的構築物ＡＫ１６５及びＡＫ１６６、並びにアイソタイプ対照及びＩＬ－２－Ｆｃ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。ＡＫ１６６構築物は、（Ｃ１２５Ａ変異を除く）ＩＬ－２ポリペプチドの野生型を含む例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。ＡＫ１６５構築物は、同じＩＬ－２ポリペプチドを含むＡＫ１６６構築物の親のマスクされていない形態である。図１２Ａに示されるような凡例は、図１２Ｂにも適用され、図１２Ｃに示されるような凡例は、図１２Ｄにも適用される。図１２Ａ～１２Ｄに示されるように、ＳＴＡＴ５活性化は、マスクされたＡＫ１６６構築物（プロテアーゼ切断なし）について大幅に減少したが、活性化プロテアーゼＭＭＰ１０への曝露後にＩＬ２－Ｆｃ対照に類似するレベルに回復した。
図１３Ａ～１３Ｃは、（＋ＭＭＰ１０）であったか、又は以前にＭＭＰ１０プロテアーゼに曝露されなかった、例示的構築物ＡＫ１０９及びＡＫ１１０、並びにアイソタイプ対照及びＩＬ－２－Ｆｃ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。ＡＫ１０９及びＡＫ１１０構築物は、異なるヘテロ二量体形成変異を有する半減期延長ドメインを含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。図１３Ｂに示されるような凡例は、図１３Ａにも適用される。図１３Ａ～１３Ｃに示されるように、ＳＴＡＴ５活性化は、マスクされたＡＫ１０９及びＡＫ１１０構築物（プロテアーゼ切断なし）について大幅に減少したが、活性化プロテアーゼＭＭＰ１０への曝露後にＩＬ２－Ｆｃ対照に類似するレベルまで大幅に増加した。
図１４Ａ～１４Ｄは、構築物ＡＫ２１１、ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４、及びＡＫ３１６、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を描写する。これは、ＣＤ２５結合を調節する様々な変異を含む、親のマスクされていない構築物（ＡＫ２３５、ＡＫ２５３、ＡＫ３０６、ＡＫ３１０、ＡＫ３１４）である構築物を含む。図１４Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。
図１５Ａ～１５Ｄは、プロテアーゼによって活性化された構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１６７、ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、及びＡＫ２２３、並びにｒｈＩＬ－２対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を描写する。無治療対照も試験された。これは、ＣＤ２５結合を調節する様々な変異を含む、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ２１６、ＡＫ２１８、ＡＫ２１９、ＡＫ２２０、及びＡＫ２２３）を含む。構築物は、ＳＴＡＴ５を活性化する能力を試験する前に、活性化プロテアーゼに前もって曝露された。図１５Ｄは、試験された構築物の各々並びにｒｈＩＬ－２対照のＥＣ５０データを提供する。
図１６Ａ～１６Ｃは、構築物ＡＫ０８１、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、及びＡＫ２１０、並びに抗ＲＳＶ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化研究からの結果を描写する。これは、Ｃ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、同じ切断可能なペプチド配列（ＲＡＡＡＶＫＳＰ）を含むが、プロテアーゼ切断配列のＮ末端上のアミノ酸残基の差異により、異なるリンカー配列を有する、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、ＡＫ２１０）を含む。図１６Ａに示されるような凡例は、図１６Ｂ及び１６Ｃにも適用される。
図１７Ａ～１７Ｃは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、及びＡＫ１９３、並びに抗ＲＳＶ対照を使用した、上記に記載されるＳＴＡＴ５活性化試験からの結果を描写する。これは、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、及びＣ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、同じ切断可能なペプチド配列（ＲＡＡＡＶＫＳＰ、配列番号２７）を含むが、プロテアーゼ切断配列のＮ末端上のアミノ酸残基の差異により、異なるリンカー配列を有する、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物（ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、ＡＫ２１０）を含む。図１７Ａに示されるような凡例は、図１７Ｂ及び１７Ｃにも適用される。
実施例３：マスクされたＩＬ－２のインビボ特性評価
薬物動態
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態が、マウスモデルを使用してインビボで評価される。
マウスが、構築物を用いて静脈内又は皮下で治療され、血漿中の構築物の濃度が、経時的に測定される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、治療されるマウスは、腫瘍を有する。いくつかの実験では、治療されるマウスは、腫瘍を含まない。いくつかの実験では、マウスが、構築物で治療され、血液が、治療過程にわたって様々な時点で採取され、これには、治療の開始前に血液を採血し、血漿を取得するためにそれを処理することが含まれ得る。いくつかの実験では、血液が、２週間、３週間、若しくは４週間又はそれ以上の治療過程にわたって様々な時点で採取される。いくつかの実験では、投与された構築物並びにアルデスロイキン及び／又は他の対照の平均血漿中濃度が測定される。マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物は、ＩＬ－２及びヒトＦｃ特異的ＥＬＩＳＡを用いて、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎへの希釈後に血漿サンプル中で検出され、各構築物について生成された標準曲線を使用して定量化される。完全長及び切断構築物の割合は、抗ｈｕＦｃ－ＨＲＰ及び抗ｈｕＩＬ－２－ＨＲＰを用いたウェスタンブロットによって、並びに全質量及びペプチド質量分析によって決定される。
腫瘍におけるマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態も、マウスモデルを使用してインビボで評価される。腫瘍を有するマウスが、構築物を用いて静脈内又は皮下で治療され、マウスの腫瘍内の構築物の濃度が、評価される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。腫瘍は、構築物の存在、及び特定のプロテアーゼの存在について分析される。いくつかの実験では、腫瘍は、完全長及び切断構築物の存在及び割合について分析される。
いくつかの薬物動態研究は、以下の方法に従って実行された。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５個の細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の目的の構築物（例えば、マスクされていない親ＩＬ－２ポリペプチド構築物、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物、又は非切断可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）の単回の２ｍｇ／ｋｇ静脈内用量を受けた。試験された構築物としては、例えば、ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、及びＡＫ２１１が挙げられる。投与後５分、１日目、２日目、及び５日目に血漿を収集した。薬物レベルは、捕捉抗体及び様々な検出抗体として抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用したＥＬＩＳＡを使用して、決定された。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）又はＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）及びＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰ又はビオチン複合検出抗体が、それぞれ、総薬剤レベル及び非切断薬物レベルを検出するために利用された。
図１８Ａ～１８Ｄは、構築物ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８、並びに抗ＲＳＶ対照を使用して、担腫瘍マウスで上記に記載されるように実行された薬物動態研究からの結果を描写する。図１８Ａは、試験された構築物の各々の構造の単純な描写を提供する。示されるように、ＡＫ１１１及びＡＫ１６８は、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。ＡＫ１６７及びＡＫ１６８構築物は、ＣＤ２５への結合を排除又は低減する変異（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＥ６２Ａ）を含む。図１８Ａは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｃは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１８Ｄは、ヒトＩＬ－２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。
図１９Ａ～１９Ｄは、構築物ＡＫ１６７、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、及びＡＫ２１１、並びに抗ＲＳＶ対照を使用して、担腫瘍マウスで上記に記載されるように実行された薬物動態研究からの結果を記載する。図１９Ａは、試験された構築物の各々の構造の単純な描写を提供する。示されるように、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、及びＡＫ２０９は、各々、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長ドメインに接続するリンカー中に異なる切断可能なペプチド配列を含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。図１９Ｂは、ヒトＩｇＧを検出することによって血漿中のＦｃレベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｃは、ヒトＩＬ－２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＩＬ２レベル（μｇ／ｍＬ）を示し、図１９Ｄは、ヒトＣＤ１２２を検出することによって血漿中のＦｃ－ＣＤ１２２レベル（μｇ／ｍＬ）を示す。図１９Ｂ、１９Ｃ、及び１９Ｄに示されるように、血漿中のＦｃレベル、Ｆｃ－ＩＬ２レベル、及びＦｃ－ＣＤ１２２レベルは、試験されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の間で類似する。
マウスにおける生物活性
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボ生物活性が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスなどのマウスモデルを使用してインビボで評価される。マウスが構築物で治療され、インビボ生物活性が評価される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、治療されるマウスは、腫瘍を有する。いくつかの実験では、治療されるマウスは、腫瘍を含まない。いくつかの実験では、免疫細胞の用量依存性拡張が、マウスにおいて評価される。いくつかの実験では、マウスは、様々な用量の構築物、アルデスロイキン、又は他の対照で治療される。いくつかの実験では、マウスは、２週間にわたって治療される。血液が、様々な時点でマウスから収集され、次いで、目的の免疫細胞マーカーに対する抗体を使用して染色される。いくつかの実験では、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴｒｅｇ細胞などの特定の循環細胞型の増殖及び拡張の長軸方向動態、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞とＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞との比率も決定される。いくつかの実験では、マウスは、器官湿潤重量及び組織学によって決定される肺及び肝臓のような特定の器官における浮腫及びリンパ球浸潤を評価することなどによって、血管漏出について評価される。
いくつかの研究では、以下の方法を実施することによって、ＩＬ－２ベースの療法によって媒介される潜在的な毒性関連効果を評価するために、血管漏出が評価された。反復用量毒性研究が、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、研究開始時に体重１８～２２グラムの８～１０週齢であったＣ５７ＢＬ／６メスマウスを使用して行われた。５匹のマウスの群が、ＰＢＳ中のマスクされた及びマスクされていないＩＬ－２構築物の腹腔内注射を４日又は５日間にわたって毎日受けた。試験された構築物は、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８を含んだ。対照抗体も、対照として投与された。最終用量の２時間後、すべてのマウスは、ＰＢＳ中の０．１ｍｌの１％エバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ２１２９）の静脈内注射を受けた。エバンスブルー投与の２時間後、マウスを麻酔し、ＰＢＳ中１０Ｕ／ｍｌのヘパリンで灌流した。エバンスブルーの血管漏出の指標としてＮａｎｏＤｒｏｐ ＯｎｅＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて６５０ｎｍにおける上清の吸光度を測定する前に、脾臓、肺、及び肝臓を採取し、３ｍｌの４％ＰＦＡ中で４℃において２日間固定した。固定された器官をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。病理組織学的研究及び定量化が、ＮｏｖｏＶｉｔａ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＬＬＣ（Ａｌｌｓｔｏｎ，ＭＡ）によって標準手順に従って実行された。図２５Ａ～５０Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１及びＡＫ１６８、並びにマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ０８１及びＡＫ１６７、並びに抗ＲＳＶ対照を使用して、血管漏出を評価するための上記に記載されるインビボ研究からの結果を描写する。図２５Ａは、体重減少の割合（％）を示し、図２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄは、それぞれ、各々について肝臓、肺、及び脾臓の重量をグラムで示す。
組織への染料漏出の程度を測定することによって示されるような血管漏出も、抗ＲＳＶ対照とともに、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８構築物について評価され、結果が、それぞれ、肝臓及び肺について図２６Ａ及び２６Ｂに示される。染料漏出の程度が、６５０ｎｍにおける吸光度に基づいて測定された。
肝臓及び肺への単核細胞血管周辺浸潤の程度を測定することによって示されるような血管漏出も、抗ＲＳＶ対照とともに、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８構築物について評価され、結果が、それぞれ、肝臓及び肺について図２７Ａ及び２７Ｂに示される。肝臓内の単核細胞の平均数（図２７Ａ）及び肺内の単核細胞の平均数（図２７Ｂ）が、各々ついて描写される。図２７Ｂに示されるように、例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１１１及びＡＫ１６８は、マスクされていない構築物ＡＫ０８１及びＡＫ１６７とは異なり、肺内の検出可能な数の単核細胞をもたらさなかった。
浸潤免疫細胞表現型
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物で治療されたマウスモデルにおいてインビボで腫瘍に浸潤する免疫細胞の表現型が評価される。マウスが構築物で治療され、腫瘍浸潤性免疫細胞の表現型が評価される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。腫瘍を持つマウスが、構築物、アルデスロイキン、又は別の対照で治療され、腫瘍、肝臓、肺、及び脾臓などの組織、並びに血液が、初回投与の５日後、７日後、又は１０日後などの初回投与後の様々な時点で収集される。いくつかの実験では、免疫細胞が、腫瘍、組織、及び血液から単離され、フローサイトメトリーを使用して表現型評価を受ける。いくつかの実験では、単離された免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のマーカーなどの目的のマーカーを使用して評価される。
いくつかの研究では、インビボで腫瘍に浸潤する免疫細胞の表現型が、以下の方法を使用して評価された。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５個の細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の目的の構築物（例えば、マスクされていない親ＩＬ－２ポリペプチド構築物、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物、又は非切断可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）の単回の２ｍｇ／ｋｇ静脈内用量を受けた。５日目に、マウスがＣＯ２窒息によって安楽死させられ、腫瘍、肝臓、脾臓、及び血液が採取された。細胞懸濁液が、機械的破損及び４０μｍ細胞ストレーナーを通した通過によって脾臓から調製された。腫瘍組織が、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉカタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して酵素的に消化され、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）が、機械的解離ステップに使用された。脾臓中の赤血球並びに腫瘍細胞懸濁液及び血液が、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解された。細胞懸濁液は、以下の抗体で染色された：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦＯＸＰ３（ＭＦ－１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５（３Ｃ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＮＫｐ４６（２９Ａ１．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。データ収集がＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）上で実行され、データがＦｌｏｗＪｏを使用して分析された。
ＡＫ０３２、ＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、及びＡＫ１６８構築物、並びに抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して上記に記載されるように実行された、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果が、図２０Ａ～２０Ｌに示される。ＡＫ１１１及びＡＫ１６８は、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。
ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、ＡＫ２０９、及びＡＫ２１１構築物、並びに抗ＲＳＶ ＩｇＧ対照を使用して上記に記載されるように実行された、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果が、図２１Ａ～２１Ｌに示される。ＡＫ１６８、ＡＫ１９１、ＡＫ１９７、ＡＫ２０３、及びＡＫ２０９は、各々、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長ドメインに接続するリンカー中に異なる切断可能なペプチド配列を含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。
ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、及びＡＫ２１１構築物を使用して上記に記載されるように実行された、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、及びＴｒｅｇのインビボ応答率を試験した研究からの結果が、図２２Ａ～２２Ｌに示される。ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、及びＡＫ１９０は、各々、ＩＬ－２ポリペプチドを半減期延長ドメインに接続するリンカー中に異なる切断可能なペプチド配列を含む、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物である。リンカー配列はまた、利用されるリンカー配列に応じて、これらの構築物間で異なる。ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、及びＡＫ２１０は、Ｃ１２５Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含み、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、及びＡＫ１９３は、Ｃ１２５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、及びＥ６２Ａ変異を有するＩＬ－２ポリペプチドを含む。ＡＫ２３５構築物は、マスクされていない構築物であり、ＡＫ２１１構築物は、非切断可能なリンカー配列を含む。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。
ＡＫ２３５、ＡＫ１９１、ＡＫ１９２、ＡＫ１９３、ＡＫ２１０、ＡＫ１８９、ＡＫ１９０、及びＡＫ２１１構築物を使用して上記に記載されるように実行された、脾臓、血液、及び腫瘍中のインビボＴ細胞活性化を試験した研究からの結果が、図２３Ａ～２３Ｉに示される。Ｔ細胞活性化が、脾臓、血液、及び腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＦｏｘｐ３＋細胞のＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。統計分析が、非切断可能なＡＫ２１１構築物と比較して、一元配置分散分析を使用して実施された。
インビボ切断
マスクされたＩＬ－２サイトカイン構築物（例えば、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物）のインビボ切断が評価される。いくつかの研究では、対照抗体が比較のために投与される。いくつかの研究では、インビボ切断は、マウスにおいて目的の構築物を投与し、一定期間後、ヒトＩｇＧを捕捉し、次いで、例えば、ヒトＩｇＧ、ＣＤ１２２、及びＩＬ－２のレベルを測定することによって、評価される。
マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボ切断を試験するいくつかの研究では、薬物レベル（すなわち、切断副産物を含む、投与される構築物のレベル）が、捕捉抗体及び様々な検出抗体として抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用するＥＬＩＳＡを使用して決定された。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）又はＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）及びＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰ又はビオチン複合検出抗体が、それぞれ、総薬物レベル及び非切断薬物レベルを検出するために利用された。切断及び放出されたＩＬ－２の濃度が、総薬物濃度から非切断（すなわち、インタクト）薬物濃度を差し引くことによって計算される。図２４Ａ～２４Ｄは、例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物ＡＫ１６８（切断可能なペプチド配列：ＭＰＹＤＬＹＨＰ）及びＡＫ２０９（切断可能なペプチド配列：ＶＰＬＳＬＹ、配列番号１５）のインビボ切断を試験した研究からの結果を描写する。ＡＫ１６７構築物は、マスクされたＡＫ１６８構築物と同じＩＬ－２ポリペプチドを含む、切断可能なマスクされていないＩＬ－２ポリペプチド構築物である。図２４Ａ～２４Ｄに示されるように、マスクされた（ＡＫ１６８及びＡＫ２０９）構築物並びにマスクされていない（ＡＫ１６７）構築物の両方が効果的に切断され、両方の切断可能なペプチド配列の両方が切断された。図２４Ｅは、ＡＫ１６７、ＡＫ１６８、及びＡＫ２０９構築物の合計レベル、並びに各構築物の非切断形態のレベルについて、総血漿中ＩｇＧ濃度（μｇ／ｍＬ）の薬物動態研究からの結果を描写する。
腫瘍の根絶及び転移の阻害
腫瘍の根絶を促進し、転移を阻害する実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の能力は、同系ＭＣ３８、ＣＴ２６、及びＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルなどのマウスモデルを使用してインビボで評価される。
マウスは、腫瘍細胞を皮下に移植され、腫瘍は、触知可能なサイズまで成長させられる。担腫瘍マウスが、マスクされたＩＬ－２構築物で治療され、腫瘍体積が、治療過程にわたって測定される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のマウスが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。腫瘍体積が、治療過程にわたって定期的に測定される。いくつかの実験では、体重もまた、治療過程にわたって定期的に測定される。いくつかの実験では、血漿サンプルが治療過程にわたって生成され、薬物動態、薬力学、切断、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のマーカーなどの血液マーカーについて分析される。
転移を阻害するマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の能力もまた、肺転移を評価するための同系ＣＴ２６腫瘍モデルなどの転移研究に好適なマウスモデルを使用してインビボで評価される。マウスは、腫瘍細胞を皮下に移植される。いくつかの実験では、腫瘍は、治療の前に触知可能なサイズまで成長させられる。いくつかの実験では、治療は、腫瘍が触知可能なサイズに成長する前に開始する。担腫瘍マウスは、マスクされたＩＬ－２構築物で治療され、肺、肝臓、及びリンパ節などの組織への腫瘍細胞転移について評価される。
いくつかの研究では、同系腫瘍モデルが、以下の方法に従って、腫瘍体積を低減するマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の能力を評価するために使用された。Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５個の細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１２５ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｋｇ用量のＡＫ０８１、ＡＫ１１１、ＡＫ１６７、若しくはＡＫ１６８、又は対照としての抗ＲＳＶ抗体を受けるように無作為化された。マウスは、６回の投与のために週に３回腹腔内投与された。腫瘍体積がダイヤルキャリパーを使用して計算され（長さ＊（幅＾２）／２）、体重が週に２回記録された。図２８Ａ及び２８Ｂは、治療過程にわたって腫瘍体積及び体重を評価した同系腫瘍モデル研究からの結果を示す。図２８Ａに示されるように、マスクされた構築物ＡＫ１１１及びＡＫ１６８を含む例示的ＩＬ－２ポリペプチド構築物を使用した治療は、抗ＲＳＶ対照と比較して、経時的に腫瘍成長阻害をもたらした。図２８Ｂに示されるように、マウスがマスクされた構築物ＡＫ１１１及びＡＫ１６８で治療されたときに観察された、体重減少の一般的な欠如があった。
カニクイザルにおける生物活性
実施例１で生成されたマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物のインビボ生物活性が、カニクイザルにおいてインビボで評価される。カニクイザルが構築物で治療され、インビボ生物活性、薬物動態、及び切断が評価される。いくつかの実験では、数匹のサルが、比較のために対照で治療される。いくつかの実験では、数匹のサルが、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド治療のための対照としてのアルデスロイキンで治療される。いくつかの実験では、サルは、様々な用量の構築物、アルデスロイキン、又は他の対照で治療される。血液が、様々な時点でサルから収集され、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞などの特定の細胞型、並びに／又は総リンパ球の用量反応、Ｋｉ６７＋、及び可溶性ＣＤ２５などの目的のマーカーについて評価される。いくつかの実験では、特定の循環Ｔ及びＮＫ細胞型の増殖及び拡張の長軸方向動態が評価される。いくつかの実験では、マスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の薬物動態及び切断が、ＥＬＩＳＡ、ＰＡＧＥ、及び質量分析によって決定される。
非ヒト霊長類における例示的なマスクされたＩＬ－２ポリペプチド構築物の安全性プロファイルを試験するために、用量範囲試験が以下の方法に従って実施される。３匹の健康なオスカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の群が、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中の１０、３０、及び１００ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて、２ｍＬ／ｋｇの活性化可能な（すなわち、切断可能な）マスクされたＩＬ－２ポリペプチドタンパク質又は非切断可能なマスクされたＩＬ－２ポリペプチドタンパク質の単回静脈内ボーラス用量を受けるように無作為に割り当てられる。第３の群は、陽性対照として、３、１０、及び３０ｎｍｏｌ／ｋｇにおいて親のマスクされていない切断可能タンパク質を受け取る。この第３の群は、親のマスクされていない分子のより高い効力を説明するために、より低い範囲で投与される。用量は、分子量の差を説明するためにモルで計算される。血液サンプルが、投与前、並びに投与後１、２４、４８、７２、９６、１６８、２６４、及び３３６時間で収集される。自動血液分析器が、リンパ球サブセット及び血清化学の変化を監視するために使用される。総薬物レベル及びインタクトな（すなわち、非切断）薬物レベルが、上記に記載されるカスタムＥＬＩＳＡを使用して血漿から測定される。可溶性ＣＤ２５レベルが、免疫刺激を監視するためにＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＲ２Ａ００）で測定される。炎症性サイトカインの血漿中レベルが、カスタム多重化電気化学発光アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して定量化される。血圧が、血管漏出症候群の指標として監視される。ＰＫが、ＩＬ－２を捕捉し、ヒトＦｃを検出するＥＬＩＳＡを使用して、及びヒトＦｃを捕捉し、ヒトＦｃを検出するＥＬＩＳＡによって、分析される。
実施例４：
Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスが、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、試験開始時に８～１０週齢であった。ＭＣ３８腫瘍細胞（マウス当たり５×１０５個の細胞）を、各マウスの右脇腹に皮下注射した。約１００ｍｍ３サイズの腫瘍に到達すると（０日目）、マウスは、ＰＢＳ中の様々なＦｃ－ＩＬ－２構築物の単回高用量腹腔内用量を受けた。血漿が、投与後５分、３日目、５日目、及び７日目に収集された。
使用される構築物は、以下である：
Figure 2023520518000062
免疫表現型検査が、ＦＡＣＳベースの方法を使用して実施された。５日目に、マウスがＣＯ２窒息によって安楽死させられ、腫瘍、肝臓、脾臓、及び血液が採取された。細胞懸濁液が、機械的破損及び４０μｍ細胞ストレーナーを通した通過によって脾臓から調製された。腫瘍組織が、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉカタログ番号１３０－０９６－７３０）を使用して酵素的に消化され、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）が、機械的解離ステップに使用された。脾臓中の赤血球並びに腫瘍細胞懸濁液及び血液が、ＡＣＫ緩衝液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ１０４９２）を使用して溶解された。
細胞懸濁液は、以下の抗体で染色された：ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（クローンＲＭ－４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。データ収集がＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒフローサイトメーター（Ｍｉｌｅｎｙｉ）上で実行され、データがＦｌｏｗＪｏを使用して分析された。
薬物レベルが、捕捉抗体及び様々な検出抗体として抗ヒトＩｇＧ（クローンＭ１３１０Ｇ０５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を利用したＥＬＩＳＡを使用して、決定された。ヒトＩｇＧ（ａｂ９７２２５、Ａｂｃａｍ）又はＣＤ１２２（クローン９Ａ２、Ａｎｃｅｌｌ）及びＩＬ－２（Ｐｏｌｙ５１７６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対するＨＲＰ又はビオチン複合検出抗体が、それぞれ、総薬物レベル及び非切断薬物レベルを検出するために利用された。
Ｉ２５３Ａ ＦｃＲｎ変異を伴うＡＫ４７１は、図２９Ａ及び２９Ｂに示されるように、ＴＭＥにおいて堅調なＣＤ８ Ｔ細胞の拡張を誘発した一方で、周辺では不活性のままであった。
ＡＫ４７１は、図３０Ａ、Ｂ及びＣに示されるように、アグリコ－ｈＩｇＧ１と比較して、わずかに短い半減期を有する。
血漿中のＡＫ４７１で切断又は切除の証拠がない（図３１Ａ、Ｂ、及びＣ）。
実施例５：ＩＬ－１２ヘテロＡＫ化（Ｈｅｔｅｒｏａｋｌｕｓｉｏｎ）
ＳＰＲによるＩＬ－１２受容体であるＩＬ－１２Ｒｂ１及びＩＬ－１２Ｒｂ２への切断及び結合：
センサチップをＩＬ－１２受容体でコーティング及び固定化した。ＩＬ－１２構築物の希釈物を、固定化ＩＬ－１２受容体を伴うチップ上に流し、２５℃でのオンレートを決定した。平衡時（約３分）、流動緩衝液をＰＢＳＴに変更し、６分間にわたってオフレートを決定した。各実行の合間に、チップが再生された。表は、ＳＰＲデータを表す（図３４及び３５）。ＩＬ－１２のマスキングが受容体への結合を妨げたため、ＮＤは「未定」であり、したがって、結合数は決定できなかった。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を用いたＩＬ－１２分子の試験：
Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎによって開発されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーター細胞は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を監視するように特異的に設計されている。これらの細胞は、完全に機能的なＩＬ－１２シグナル伝達経路を得るために、ヒトＪＡＫ２及びＳＴＡＴ４遺伝子とともに、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－１２Ｒβ２遺伝子を用いたＨＥＫ２９３細胞の安定したトランスフェクションによって生成された。加えて、ＳＴＡＴ４誘発性ＳＥＡＰレポーター遺伝子も導入された。刺激時に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞は、ＳＴＡＴ４の活性化及びＳＥＡＰの後続の分泌を誘起する。ＳＴＡＴ４誘発性ＳＥＡＰのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して容易に監視されることができる。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞は、ヒト又はマウスＩＬ－１２の機能性、毒性、及び可変用量投与量効果を検証するために使用されることができる。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を、約８０％の密集まで継代培地中で増殖させた。アッセイ培地中の洗浄された単一細胞懸濁液が播種され、アッセイ培地中のＩＬ－１２分子の連続希釈物が細胞に添加された。プレートが、３７℃で２４時間インキュベートされた。２４時間後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が調製され、細胞上清がＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液に添加され、３７℃で１～２時間インキュベートされた。６２５ｎｍにおける吸光度が測定された。データ分析が、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍのバージョン８．３で実施された。背景が未加工データから差し引かれ、データが非線形に適合された：［アゴニスト］対応答－可変勾配（４つのパラメータ）。各ＩＬ－１２構築物のＥＣ５０値が報告された。
実施例６
本実施例は、ＩＬ－１２構築物上のＧＡＧ結合ドメインの変異がＰＫを変化させるかどうかを調査し、２つのＧＡＧ結合変異バリアント（ＡＫ６００及びＡＫ６０１）が、Ｃ５７ＢＬ／６非担腫瘍マウスにおけるＷＴ ＩＬ－１２構築物（ＡＫ５９８）と比較された。それぞれ、ＡＫ６００は、ＫＤＮＴＥＲＶ ＧＡＧ結合ドメイン変異体を有し、ＡＫ６０１は、ＫＤＮＴＥＧＲＶ ＧＡＧ結合ドメイン変異体を有する。
ＡＫ５９８、ＡＫ６００、及びＡＫ６０１はすべて、以下の構築構造を有する：
Figure 2023520518000063
動物は、静脈内注射を通して、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで単回投与された。血漿中薬物濃度が、ヒトＦｃ捕捉（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＩｇＧカタログ番号２０４９－０１、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、サルａｄｓ－ＵＮＬＢ）ヒトＦｃ検出（ａｂ９７２２５）及び／又はヒトＦｃ捕捉／抗ヒトＩＬ－１２（ａｂ８３４４８）検出ＥＬＩＳＡを使用して、測定された。
Figure 2023520518000064
ＥＬＩＳＡから、ＡＫ６００及びＡＫ６０１の両方からのＧＡＧ結合変異は、ＡＫ５９８と比較して、Ｃｍａｘ及びＡＵＣにおいて薬物曝露を改善することが見出された。ＡＫ６００とＡＫ６０１の間でＰＫプロファイルの差異は観察されなかった。ＡＫ６００及びＡＫ６０１の両方は、約２日である、ＡＫ５９８と類似する半減期を有する。
結果が、図３６～４０に示される。
実施例７
遊離システイン残基は、分子間架橋及び凝集を引き起こし得る。本実施例は、システインからセリンへのアミノ酸変異が、凝集及び安定性に影響を及ぼすかどうかを試験する。
以下の構築物が、この実施例で使用された：
Figure 2023520518000065
ＡＫ３８６、ＡＫ６０４、ＡＫ６０５、及びＡＫ６０６の配列は、第１０節における配列表内にある。
タンパク質を、指定された緩衝液と４０℃で３日間又は１２日間インキュベートした。次いで、分子を、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによって、並びにＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシー染色によって分析した。
３日目に、十分な凝集物のみが、ＡＫ６０６が最良にランク付けされた２つの緩衝条件におで安定性をランク付けするために存在した。Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異では、より安定的になる傾向にある。１２日目に、ＡＫ６０６は、６つの追加の緩衝条件で最良にランク付けされた。Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異は、安定性を付与すると思われる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、Ｃｙｓ２４２がＣｙｓ２５２よりも多くの共有結合性凝縮を引き起こすことを示す。０／１２日目が示され、ＡＫ３８６及びＡＫ６０５は、ＡＫ６０４及びＡＫ６０６よりもはるかに多くの共有結合性凝集を示す。
結果が、図４１～４３に示される。
実施例８
本実施例は、例示的ＩＬ－１２構築物のマスキング及び切断を示す。
以下の構築物が、この実施例で使用された：
Figure 2023520518000066
ＡＫ６７１は、マスクされていない分子であり、ＡＫ６６３は、サイトカインを含まず、ＡＫ６６４は、非切断可能である。これら３つの分子は、対照としての役割を果たす。
各構築物のための切断ペプチドが、各列の最上部に示される。
ＡＫ６６６、ＡＫ６６７、ＡＫ９１８、ＡＫ９２０、及びＡＫ６６９は、「バージョン１」構築物である。ＡＫ６６５、ＡＫ６６８、ＡＫ９１９、ＡＫ９２１、ＡＫ６７０は、「バージョン２」構築物である。ＡＫ９２４、ＡＫ９２２、ＡＫ９２５、及びＡＫ９２３は、「バージョン３」構築物である。
切断可能なリンカー（プロテアーゼ部位リンカー）、すなわち、ＨＬ２とＩＬ－１２ドメインとの間のリンカー、及びＨＬ１と各バージョンのマスキング部分との間の非切断可能なリンカー（ｂ２受容体リンカー）が、以下に示される。
Figure 2023520518000067
適用可能である場合、これらの構築物のすべては、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットのＧＡＧ結合ドメインに対するＫＤＮＴＥＧＲＶ変異、Ｉｌ－１２ｐ４０サブユニットのＣ２５２Ｓ変異、及びＩＬ－１２ＲＢ２ドメインのＣ２４２Ｓ変異を含む。各構築物の正確な配列は、第１０節における配列表に示される。
ｉ）エクスビボ切断アッセイ（ＷＢ／ＩＬ－１２シグナル伝達）
１ｕＭのＩＬ－１２構築物が、３７℃において９０ｕｌの馴化培地と一晩、又は９０ｕｌの血漿と次の時間（ｄ１－ｄ２－ｄ４－ｄ７－ｄ９－ｄ１１）の間インキュベートされた。切断速度は、ウェスタンブロット抗ヒトＩＬ－１２及び抗ヒトＩＬ－１２Ｒｂを使用して、切断された構築物／（切断された構築物＋インタクトな構築物）の比率として計算される。ヒト組織馴化培地によるこれらの構築物の活性化は、０．０５×１０６個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ細胞が３７．５ｎＭの構築物と２４時間インキュベートされる、ＩＬ－１２受容体後シグナル伝達アッセイを使用して評価される。
Figure 2023520518000068
結果が、図４４及び以下の表に示される。
以下の切断部位を伴う分子は、腫瘍上清において容易に検出可能な切断を呈した：
－ＲＡＡＡＶＫＳＰ
－ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ
－ＭＰＹＤＬＹＨＰ
切断部位の感受性は、以下の順序で観察された：
ＲＡＡＡＶＫＳＰ＞ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ＞ＭＰＹＤＬＹＨＰ
したがって、これらの切断部位を持つＩＬ－１２構築物は、ＲＣＣ及び他のタイプのがんにおける腫瘍選択的活性化の良好な候補を表す。
Figure 2023520518000069
ｉｉ）インビトロ切断分析：ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を用いたＩＬ－１２分子の試験：
Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎによって開発されたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２レポーター細胞は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の活性化を監視するように特異的に設計されている。これらの細胞は、完全に機能的なＩＬ－１２シグナル伝達経路を得るために、ヒトＴｙＫ２、ＪＡＫ２、及びＳＴＡＴ４遺伝子とともに、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－１２Ｒβ２遺伝子を用いたＨＥＫ２９３細胞の安定したトランスフェクションによって生成された。加えて、ＳＴＡＴ４誘発性ＳＥＡＰレポーター遺伝子も導入された。刺激時に、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１２細胞は、ＳＴＡＴ４の活性化及びＳＥＡＰの後続の分泌を誘起する。ＳＴＡＴ４誘発性ＳＥＡＰのレベルは、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を使用して容易に監視されることができる。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞は、ヒト又はマウスＩＬ－１２の機能性、毒性、及び可変用量投与量効果を検証するために使用されることができる。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞を、約８０％の密集まで継代培地中で増殖させた。アッセイ培地中の洗浄された単一細胞懸濁液が播種され、アッセイ培地中のＩＬ－１２分子の連続希釈物が細胞に添加された。プレートが、３７℃で２４時間インキュベートされた。２４時間後、Ｑｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）が調製され、細胞上清がＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ溶液に添加され、３７℃で１～２時間インキュベートされた。６２５ｎｍにおける吸光度が測定された。データ分析が、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍのバージョン８．３で実施された。背景が未加工データから差し引かれ、データが非線形に適合された：［アゴニスト］対応答－可変勾配（４つのパラメータ）。各ＩＬ－１２構築物のＥＣ５０値が報告された。
マスキング：
結果が、以下の表、並びに図４５、４６Ａ及びＢに示される。
Figure 2023520518000070
親ＡＫ６７１は、ｒｈＩＬ－１２ほど強力ではない（但し、有意ではない、すなわち、３倍）。すべてのマスクされた構築物は、ＡＫ３８６よりも多くＡＫ化される。ＡＫ６６７及びＡＫ９１８は両方とも、＞１００倍ＡＫ化される。
ＡＫ３８６と比較して、ＧＡＧ結合ドメイン変異、システインからセリンへの変異、新しい最適化されたリンカー、及び異なる切断部位を有する新しい分子はすべて、改善されたマスキングを示す。
切断
構築物の切断は、例示的プロテアーゼＭＭＰ７、９及び１０を使用して試験された。
Figure 2023520518000071
結果が、図４７Ａ－Ｂ及び４８Ａ－Ｋに示される。
Figure 2023520518000072
結果が、図４９Ａ－Ｂ及び５０Ａ－Ｇに示される。
Figure 2023520518000073
結果が、図５１及び５２Ａ－Ｅに示される。
全体的に、異なる切断部位を伴う新しい分子はすべて、インビトロでＭＭＰ切断の影響を受けやすい。すべての分子について、切断後の活性の回復がある。これらの化合物は、腫瘍選択的で活性化可能なＩＬ－１２分子の良好な候補を表す。
実施例９
ｉ．ＮＡＴ対ＲＣＣ培養上清によるペプチドの切断
切断ペプチドを含む配列（以下に太字で示される）が、各ペプチドの切断の特異性を試験するために、「ＮＡＴ」（正常隣接組織）又は「ＲＣＣ」（腎細胞がん）培養上清のいずれかでインキュベートされた。
この目的のために、質量分析法によるペプチド配列決定が、質量分析法（ＭＳＰ－ＭＳ）による多重化基質プロファイリングと呼ばれる公開された技法を使用して、以下の表に示される合成ペプチドについて産生された切断断片を識別するために使用された（Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｎｏｖ；９（１１）：１０９５－１００）。切断は、これらの反応において経時的に監視され、最も早い時点で切断されることが見出されたペプチドは、馴化培地サンプルにおけるタンパク質分解活性に対して最も感受性があるとみなされた。
結果は、以下のとおりである。
Figure 2023520518000074
切断ペプチドＤＬＬＡＶＶＡ＊ＡＳ及びＩＳＳＧＬＬ＊ＳＧ＊ＲＳが、最も特異的であると見出された。これらのペプチドを含む配列は、ＮＡＴ培養では切断されなかったが、ＲＣＣ培養では毎回切断された。
実施例１０
以下の構築物が、この実施例で使用された：
Figure 2023520518000075
各ＡＫ分子のドメイン特徴及び配列の詳細は、以下のとおりである。
Figure 2023520518000076
Figure 2023520518000077
Figure 2023520518000078
重要なことに、ＡＫ９３２及びＡＫ９３０、並びにそれらの「逆転」対応物ＡＫ９３８及びＡＫ９３６は、ペプチド基質を含む（その配列は各分子の上方のボックスに描写され、配列表内で太字である）。ＡＫ９０４は、非切断可能なマスクされていない構築物であり、ＡＫ９１０は、非切断可能なマスク構築物であり、両方とも陰性対照として作用する。
上記のＡＫ分子は、ＩＬ－１５ドメインを含むが、このデータの結果及び結論はＩＬ－２構築物についても同等に関連性があることを理解されたい。
切断がペプチド基質を含むマスクされた構築物について達成された。
構築物が、ＭＭＰ７、９及び１０とインキュベートされた。各構築物の切断が、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイによって確認された。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅアッセイは、以下のように実行された：
条件：細胞プレート：９６ウェルプレート。細胞密度：５０Ｋ細胞／ウェル。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ検出の時点が試験された：１時間。構築物番号：試験された合計１４個の構築物。
アッセイのフローチャート：
Figure 2023520518000079
結果は、「Ｘ」が完全には切断されていないことを示し、「√」が切断を示す、以下の表に示される。
Figure 2023520518000080
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイからの具体的なＥＣ５０読み出し結果が、以下の表に示される。
Figure 2023520518000081
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果が、図５３Ａ～Ｄに示される。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２バイオアッセイの結果が、図５４Ａ～Ｆに示される。
実施例１１
インビボで例示的な腫瘍標的ハイブリッドマウス化分子の薬物動態及び薬力学プロファイルを理解するために、異なる切断部位を伴うヒトＦｃ及びマウスＩＬ－１２で構成された３つの分子が試験された。
ＡＫ９４４（ＭＰＹＤＬＹＨＰ）、ＡＫ９４５（ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ）、ＡＫ９４７（ＲＡＡＡＶＫＳＰ）が、２つの腫瘍モデルＭＢ４９及びＢ１６Ｆ１０で使用され、マスキングを伴わない親ＡＫ９４８が、対照として使用された。
この実施例で使用される構築物の詳細は、以下のとおりである。
Figure 2023520518000082
分子で使用される成熟マウスＩＬ－１２ ｐ４０及びＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット、並びにマウスＩＬ－１２Ｒマスキング部分の配列は、以下のとおりである。
マウスＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット：
ＭＷＥＬＥＫＤＶＹＶＶＥＶＤＷＴＰＤＡＰＧＥＴＶＮＬＴＣＤＴＰＥＥＤＤＩＴＷＴＳＤＱＲＨＧＶＩＧＳＧＫＴＬＴＩＴＶＫＥＦＬＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＴＬＳＨＳＨＬＬＬＨＫＫＥＮＧＩＷＳＴＥＩＬＫＮＦＫＮＫＴＦＬＫＣＥＡＰＮＹＳＧＲＦＴＣＳＷＬＶＱＲＮＭＤＬＫＦＮＩＫＳＳＳＳＳＰＤＳＲＡＶＴＣＧＭＡＳＬＳＡＥＫＶＴＬＤＱＲＤＹＥＫＹＳＶＳＣＱＥＤＶＴＣＰＴＡＥＥＴＬＰＩＥＬＡＬＥＡＲＱＱＮＫＹＥＮＹＳＴＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＭＫＰＬＫＮＳＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＳＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＫＦＦＶＲＩＱＲＫＫＥＫＭＫＥＴＥＥＧＣＮＱＫＧＡＦＬＶＥＫＴＳＴＥＶＱＣＫＧＧＮＶＣＶＱＡＱＤＲＹＹＮＳＳＣＳＫＷＡＣＶＰＣＲＶＲＳ
マウスＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット：
ＲＶＩＰＶＳＧＰＡＲＣＬＳＱＳＲＮＬＬＫＴＴＤＤＭＶＫＴＡＲＥＫＬＫＨＹＳＣＴＡＥＤＩＤＨＥＤＩＴＲＤＱＴＳＴＬＫＴＣＬＰＬＥＬＨＫＮＥＳＣＬＡＴＲＥＴＳＳＴＴＲＧＳＣＬＰＰＱＫＴＳＬＭＭＴＬＣＬＧＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＴＥＦＱＡＩＮＡＡＬＱＮＨＮＨＱＱＩＩＬＤＫＧＭＬＶＡＩＤＥＬＭＱＳＬＮＨＮＧＥＴＬＲＱＫＰＰＶＧＥＡＤＰＹＲＶＫＭＫＬＣＩＬＬＨＡＦＳＴＲＶＶＴＩＮＲＶＭＧＹＬＳＳＡ
マウスＩＬ－１２Ｒマスキング部分：
ＬＹＨＰＳＧＰＭＷＥＬＥＫＤＶＹＶＶＥＶＤＷＴＰＤＡＰＧＥＴＶＮＬＴＣＤＴＰＥＥＤＤＩＴＷＴＳＤＱＲＨＧＶＩＧＳＧＫＴＬＴＩＴＶＫＥＦＬＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＴＬＳＨＳＨＬＬＬＨＫＫＥＮＧＩＷＳＴＥＩＬＫＮＦＫＮＫＴＦＬＫＣＥＡＰＮＹＳＧＲＦＴＣＳＷＬＶＱＲＮＭＤＬＫＦＮＩＫＳＳＳＳＳＰＤＳＲＡＶＴＣＧＭＡＳＬＳＡＥＫＶＴＬＤＱＲＤＹＥＫＹＳＶＳＣＱＥＤＶＴＣＰＴＡＥＥＴＬＰＩＥＬＡＬＥＡＲＱＱＮＫＹＥＮＹＳＴＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＭＫＰＬＫＮＳＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＳＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＫＦＦＶＲＩＱＲＫＫＥＫＭＫＥＴＥＥＧＣＮＱＫＧＡＦＬＶＥＫＴＳＴＥＶＱＣＫＧＧＮＶＣＶＱＡＱＤＲＹＹＮＳＳＣＳＫＷＡＣＶＰＣＲＶＲＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＩＰＶＳＧＰＡＲＣＬＳＱＳＲＮＬＬＫＴＴＤＤＭＶＫＴＡＲＥＫＬＫＨＹＳＣＴＡＥＤＩＤＨＥＤＩＴＲＤＱＴＳＴＬＫＴＣＬＰＬＥＬＨＫＮＥＳＣＬＡＴＲＥＴＳＳＴＴＲＧＳＣＬＰＰＱＫＴＳＬＭＭＴＬＣＬＧＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＴＥＦＱＡＩＮＡＡＬＱＮＨＮＨＱＱＩＩＬＤＫＧＭＬＶＡＩＤＥＬＭＱＳＬＮＨＮＧＥＴＬＲＱＫＰＰＶＧＥＡＤＰＹＲＶＫＭＫＬＣＩＬＬＨＡＦＳＴＲＶＶＴＩＮＲＶＭＧＹＬＳＳＡ
各分子の完全な配列情報が、以下の表に示される（切断可能なリンカーが太字で示され、非切断可能なリンカーが下線で示される）：
Figure 2023520518000083
Figure 2023520518000084
Figure 2023520518000085
この研究では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが、１×１０６個のＭＢ４９又は０．５×１０６個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下に接種された。治療は、腫瘍サイズが３００ｍｍ３に達した時に開始した。分子の投与は、０．５又は３ｍｇ／ｋｇの単回静脈内注射を通した。動物は、治療開始後５日目に安楽死させた。体重及び器官重量が記録された：
Figure 2023520518000086
以下の読み出しが分析された：
－腫瘍成長阻害：腫瘍体積が、Ｂ１６モデルにおけるＡＫ９４５及びＡＫ９４７で有意に減少した。
－腫瘍重量：単回投与ＡＫ９４５は、ＭＢ４９において低用量で腫瘍重量を有意に減少させる。
－体重変化率％：すべてのマスクされた分子は、体重減少に対する保護を示す。
－脾臓重量：脾臓重量は、Ｂ１６ではなくＭＢ４９モデルで増加する。モデル間のビヒクル群からの脾臓重量の差は、腫瘍特異的駆動型であり得る。
－肺重量（ＭＢ４９モデルのみ）：肺重量は、ＭＢ４９モデルではＩＬ－１２バリアントによる影響を受けない。
結果は、図５５～５９に示される。
ＦＡＣＳ分析もまた、血液及び脾臓を含む複数の末梢器官と比較して、腫瘍微小環境における免疫応答を調査するために使用された。腫瘍微小環境におけるＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞／Ｔ－ｒｅｇ比の活性化及び／又は拡張が、特に興味深い。
以下のＰＤ読み出しが分析された：
－ＴＭＥにおけるＣＤ４５
－ＣＤ８ Ｔ細胞：ＣＤ８ Ｔ細胞は、高用量でＡＫ９４７を用いると腫瘍微小環境で増加した。ＡＫ９４７もまた、末梢でＣＤ８ Ｔ細胞を拡張させる。
－ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比：ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は、腫瘍微小環境で増加する。
－ＣＤ８ Ｔ細胞増殖：ＴＭＥにおいてＣＤ８ Ｔ細胞増殖の差異がない。ＣＤ８ Ｔ細胞は、末梢よりもＴＭＥで増殖性である。
－ＣＤ８活性化マーカー：ＣＤ８ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境でより活性化される。
結果は、図６０～６５に示される。
最後に、血清マウスＡＬＴ測定を５日目に測定し、マウスＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡを３日目の血漿を使用して実施し、腫瘍標的分子によって活性化された下流シグナル伝達を調べた。
以下の読み出しが分析された：
－毒性－ＡＬＴアッセイ：ＩＬ－１２バリアントは低用量では肝毒性を誘発しない
－Ｄ３血清サイトカイン：血清ＩＦＮγ発現は、マスクされたＩＬ－１２治療マウスでは有意に低下される。すべてのＩＬ－１２バリアントについてＩＦＮ－γの用量依存的な増加があるが、マスクされていない親分子よりも有意に低い。高用量ＩＬ－１２バリアントは、治療が開始してから３日後の親に匹敵する血清ＴＮＦα発現を誘発する。
－ＰＫ：Ｆｃ捕捉、Ｆｃ検出：Ｆｃ検出ＰＫ ＥＬＩＳＡは、Ｂ１６モデルにおける血漿中の薬物蓄積に差異がないことを示す。ＰＫ分析は、Ｆｃ捕捉、Ｆｃ検出ＥＬＩＳＡを使用して実施された。
結果は、図６６～６８に示される。
実施例１２
本研究の目的は、安全性を決定し、かつカニクイザルにおける例示的腫瘍標的分子の薬物動態及び薬力学を比較することである。
３つのＧＡＧ結合変異含有分子が、異なる切断部位を伴うヒトＦｃ及びヒトＩＬ－１２を用いて構築され、それぞれ、切断部位ＲＡＡＡＶＫＳＰ、ＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳ、及びＭＰＹＤＬＹＨＰを有するＡＫ９２１、ＡＫ９２３、ＡＫ６６７が、本研究で試験された。ＧＡＧ結合変異を伴う親のマスクされていない分子であるＡＫ６７１が、陽性対照として使用される。これらの分子の構造は、実施例８に示され、正確な配列は、第１０節内の配列表に示される。
動物は、合計４回の投与のために約１．０ｍＬ／分において、０、７、１４、及び２１日目に４ｍＬ／ｋｇの静脈内注射によって投与される。血漿が、完全ＰＫ分析のために様々な時点で（５６日目まで）収集される。
ＰＫ分析が、Ｆｃ捕捉、Ｆｃ検出ＥＬＩＳＡを使用して実施される。血液学、血清化学も実施される。ＦＡＣＳ分析が、以下のマーカーについて、０日目（投与前）、５日目、及び１２日目に実施される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ１５９ａ、ＦｏｘＰ３、及びＫｉ６７。
結果は、図６９～７１に示される。
－ＰＫ：血漿中の被験物質の測定が、捕捉試薬として抗ヒトＩｇＧ及び検出試薬として抗ヒトＩｇＧを用いたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））技術を使用して行われた。図６９は、最初の７日からの血漿中の薬物レベルを示した。
－フローサイトメトリーを介したＰＤ：フローサイトメトリー分析が、Ｔ及びＮＫ細胞の増殖状態について投与前及び投与後の様々な時点で実施された。増殖Ｋｉ－６７のＭＦＩが、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞でアクセスされ、ピーク変化が、最初の投与後の１４日目に観察された。マスクされていないＡＫ６７１のＫｉ－６７ ＭＦＩが、血液中のＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の両方で有意に増加した一方で、マスクされた分子は、有意な末梢ＮＫ又はＴ細胞の活性化を示さなかった。一元配置分散分析であるＢｏｎｆｅｒｏｎｎｉの多重比較事後検定が、治療対ビヒクルの統計的有意性を決定するために実施された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。図７０の結果を参照されたい。
－血液学及び血清化学：血液学及び血清化学が、１日目及び５日目に実施された。（ａ）血液中の絶対リンパ球数（１日目）、ＲＢＣ（８日目）、及びヘマトクリット（ＨＣＴ）（８日目）の割合の一時的な減少が、すべての群で観察された。すべての観察結果は、マスクされた分子及びマスクされていない分子の両方について正常範囲内であった。（ｂ）マスクされていないＡＫ６７１は、最初の投与後の５日目に血清ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＴＢＩＬＩ（肝機能検査のバイオマーカー）を増加させた（有意ではない）。ＡＫ６６７、ＡＫ９２１及びＡＫ９２３のマスクされた分子は、血清中の比較的低いレベルのＡＬＴ、ＡＳＴ及びＴＢＩＬＩを示す。図７１Ａ及び７１Ｂの結果を参照されたい（矢印は投薬の時間を示す）。
Figure 2023520518000087
Figure 2023520518000088
Figure 2023520518000089
Figure 2023520518000090
Figure 2023520518000091
Figure 2023520518000092
Figure 2023520518000093
Figure 2023520518000094
Figure 2023520518000095
Figure 2023520518000096
Figure 2023520518000097
Figure 2023520518000098
Figure 2023520518000099
Figure 2023520518000100
Figure 2023520518000101
Figure 2023520518000102
Figure 2023520518000103
Figure 2023520518000104
Figure 2023520518000105
Figure 2023520518000106
Figure 2023520518000107
Figure 2023520518000108
Figure 2023520518000109
Figure 2023520518000110
Figure 2023520518000111
Figure 2023520518000112
Figure 2023520518000113
Figure 2023520518000114
Figure 2023520518000115
Figure 2023520518000116
Figure 2023520518000117
Figure 2023520518000118
Figure 2023520518000119
Figure 2023520518000120
Figure 2023520518000121
Figure 2023520518000122
Figure 2023520518000123
Figure 2023520518000124
Figure 2023520518000125
１１．構築物のリスト
以下の表は、「ＡＫ」参照番号によって標識された分子の完全な配列を示す。配列の構成要素部分、並びにそれらが分子の鎖内で組み立てられる順序も示される。個々の鎖は、「ＤＮＡ」参照番号によって標識される。
Figure 2023520518000126
Figure 2023520518000127
Figure 2023520518000128
Figure 2023520518000129
Figure 2023520518000130
Figure 2023520518000131
Figure 2023520518000132
Figure 2023520518000133
Figure 2023520518000134
Figure 2023520518000135
Figure 2023520518000136
Figure 2023520518000137
Figure 2023520518000138
Figure 2023520518000139
Figure 2023520518000140
Figure 2023520518000141
Figure 2023520518000142
Figure 2023520518000143
Figure 2023520518000144
Figure 2023520518000145
Figure 2023520518000146
Figure 2023520518000147
Figure 2023520518000148
Figure 2023520518000149
Figure 2023520518000150
Figure 2023520518000151
Figure 2023520518000152
Figure 2023520518000153
Figure 2023520518000154
Figure 2023520518000155
Figure 2023520518000156
Figure 2023520518000157
Figure 2023520518000158
Figure 2023520518000159
Figure 2023520518000160
Figure 2023520518000161
Figure 2023520518000162
Figure 2023520518000163
Figure 2023520518000164
Figure 2023520518000165
Figure 2023520518000166
Figure 2023520518000167
Figure 2023520518000168
Figure 2023520518000169
Figure 2023520518000170
Figure 2023520518000171
Figure 2023520518000172
Figure 2023520518000173
Figure 2023520518000174
Figure 2023520518000175
Figure 2023520518000176
Figure 2023520518000177
Figure 2023520518000178
Figure 2023520518000179
Figure 2023520518000180
Figure 2023520518000181
Figure 2023520518000182
Figure 2023520518000183
Figure 2023520518000184
Figure 2023520518000185
Figure 2023520518000186
Figure 2023520518000187
Figure 2023520518000188
Figure 2023520518000189
Figure 2023520518000190
Figure 2023520518000191
Figure 2023520518000192
Figure 2023520518000193
Figure 2023520518000194
Figure 2023520518000195
Figure 2023520518000196
Figure 2023520518000197
Figure 2023520518000198
Figure 2023520518000199
Figure 2023520518000200
Figure 2023520518000201
Figure 2023520518000202
Figure 2023520518000203
Figure 2023520518000204

Claims (110)

  1. タンパク質ヘテロ二量体を含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカインであって、
    以下を含む第１のポリペプチド鎖と、
    Figure 2023520518000205
    以下を含む第２のポリペプチド鎖と、を含み、
    Figure 2023520518000206
    ＨＬ１が、第１の半減期延長ドメインであり、Ｌ１が、第１のリンカーであり、ＭＭが、マスキング部分であり、ＨＬ２が、第２の半減期延長ドメインであり、Ｌ２が、第２のリンカーであり、Ｃが、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片であり、
    前記第１の半減期延長ドメインが、前記第２の半減期延長ドメインと会合しており、
    前記第１のリンカー又は前記第２のリンカーのうちの１つが、タンパク質分解的に切断可能なペプチドを含む、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  2. 前記ＩＬ－１２ポリペプチド又はその機能的断片が、ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチド又はその機能的断片に共有結合されたＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド又はその機能的断片を含む、請求項１に記載のマスクされたサイトカイン。
  3. ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーが、長さで５～２０個のアミノ酸である、請求項２に記載のマスクされたサイトカイン。
  4. 前記ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーが、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である、請求項２又は３に記載のマスクされたサイトカイン。
  5. 前記ＩＬ－１２ｐ４０－ＩＬ－１２ｐ３５リンカーが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  6. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  7. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチド鎖が、配列番号１を含む、請求項６に記載のマスクされたサイトカイン。
  8. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、前記配列番号１のアミノ酸配列と比較して、ＧＡＧ－結合ドメイン（ＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶ）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項６に記載のマスクされたサイトカイン。
  9. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号５７を含む、請求項８に記載のマスクされたサイトカイン。
  10. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号５８を含む、請求項８に記載のマスクされたサイトカイン。
  11. ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、前記配列番号１のアミノ酸配列と比較して１つ以上のサイトカイン置換変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  12. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号５９を含む、請求項１１に記載のマスクされたサイトカイン。
  13. 前記ＩＬ－１２ｐ４０ポリペプチドが、配列番号６０を含む、請求項１１に記載のマスクされたサイトカイン。
  14. 前記ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列を含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  15. 前記ＩＬ－１２ｐ３５ポリペプチドが、配列番号２を含む、請求項１４に記載のマスクされたサイトカイン。
  16. 前記ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片が、配列番号４を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  17. 前記ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片が、配列番号６１を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  18. 前記ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片が、配列番号６２を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  19. 前記ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片が、配列番号６３を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  20. 前記ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片が、配列番号６４を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  21. 前記マスキング部分が、ＩＬ－１２サイトカイン受容体又はそのサブユニット若しくはバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  22. 前記マスキング部分が、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  23. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～２３７、すなわち、配列番号５を有する配列を含む、請求項２２に記載のマスクされたサイトカイン。
  24. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ１の残基２４～５４５、すなわち、配列番号６を有する配列を含む、請求項２２に記載のマスクされたサイトカイン。
  25. 前記マスキング部分が、ＩＬ－１２に対する親和性を保持するか、又は別様に実証する、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２又はその断片、一部、若しくはバリアントの細胞外ドメインを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  26. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２１２、すなわち、配列番号７を有する配列を含む、請求項２５に記載のマスクされたサイトカイン。
  27. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２２、すなわち、配列番号８を有する配列を含むか、又は前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～２２７、すなわち、配列番号１１を有する配列を含む、請求項２５に記載のマスクされたサイトカイン。
  28. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～３１９、すなわち、配列番号９を有する配列を含む、請求項２５に記載のマスクされたサイトカイン。
  29. 前記マスキング部分が、配列番号９の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、任意選択的に、前記修飾が、システイン置換変異である、請求項２８に記載のマスクされたサイトカイン。
  30. 前記マスキング部分が、配列番号６５を含む、請求項２９に記載のマスクされたサイトカイン。
  31. 前記マスキング部分が、ヒトＩＬ－１２Ｒβ２の残基２４～６２２、すなわち、配列番号１０を有する配列を含む、請求項２５に記載のマスクされたサイトカイン。
  32. 前記切断可能なペプチドが、長さで６～１０個のアミノ酸である、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  33. 前記切断可能なペプチドが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  34. 前記切断可能なペプチドが、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  35. 前記切断可能なペプチドが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  36. 前記切断可能なペプチドが、配列番号４３のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  37. 前記切断可能なペプチドが、配列番号４４のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  38. 前記切断可能なペプチドが、配列番号４５のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  39. 前記第１のポリペプチド鎖が、以下を含み、
    Figure 2023520518000207
    前記第２のポリペプチド鎖が、以下を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
    Figure 2023520518000208
  40. 前記非切断可能なリンカーが、長さで３～１８個のアミノ酸である、請求項３９に記載のマスクされたサイトカイン。
  41. 前記非切断可能なリンカーが、長さで３～１５個のアミノ酸である、請求項３９に記載のマスクされたサイトカイン。
  42. 前記非切断可能なリンカーが、アミノ酸残基Ｇ及びＳが豊富である、請求項３０～４１のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  43. 前記非切断可能なリンカーが、［（Ｇ）ｎＳ］を含み、ｎ＝４又は５である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  44. 前記非切断可能なリンカーが、配列番号１２（ＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  45. 前記非切断可能なリンカーが、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  46. 前記非切断可能なリンカーが、１４（ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  47. 前記非切断可能なリンカーが、５４（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  48. 前記非切断可能なリンカーが、５５（ＰＧＧＳＧＰ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  49. 前記非切断可能なリンカーが、５６（ＧＧＳＰＧ）に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３９～４２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  50. 前記切断可能なリンカーが、両側にスペーサードメイン（ＳＤ）が配置されたタンパク質分解的に切断可能なペプチド（ＣＰ）を含み、
    ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２
    ＳＤ１及びＳＤ２は、前記第１のポリペプチド鎖が以下を含み、
    Figure 2023520518000209
    前記第２のポリペプチド鎖が以下を含むように、異なる、請求項３９～４９のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
    Figure 2023520518000210
  51. 前記第１のスペーサードメイン（ＳＤ１）が、長さで３～１０個のアミノ酸である、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  52. ＳＤ１が、配列番号１６（ＧＧＳＧＧＳ）を含む、請求項５０又は５１に記載のマスクされたサイトカイン。
  53. ＳＤ１が、配列番号１７（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ）を含む、請求項５０又は５１に記載のマスクされたサイトカイン。
  54. 前記第２のスペーサードメイン（ＳＤ２）が、長さで３～６個のアミノ酸である、請求項５０～５３のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  55. ＳＤ２が、配列番号１８（ＳＧＰ）を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  56. 前記タンパク質分解的に切断可能なリンカーが、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１が、第１のスペーサードメインであり、ＣＰが、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２が、第２のスペーサードメインであり、ＣＰが、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５０に記載のマスクされたＩＬ－２サイトカイン。
  57. 前記タンパク質分解的に切断可能なリンカーが、ＳＤ１－ＣＰ－ＳＤ２を含み、ＳＤ１が、第１のスペーサードメインであり、ＣＰが、切断可能なペプチドであり、ＳＤ２が、第２のスペーサードメインであり、ＣＰが、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を有し、ＳＤ２が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５０に記載のマスクされたＩＬ－２サイトカイン。
  58. 前記切断可能なリンカーが、
    Figure 2023520518000211
    を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  59. 前記切断可能なリンカーが、
    Figure 2023520518000212
    を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  60. 前記切断可能なリンカーが、配列番号４６（ＧＧＳＧＧＳＭＰＹＤＬＹＨＰＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  61. 前記切断可能なリンカーが、配列番号４７（ＧＧＳＧＧＳＭＰＹＤＬＹＨＰＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  62. 前記切断可能なリンカーが、配列番号４８（ＧＧＳＧＧＳＤＳＧＧＦＭＬＴＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  63. 前記切断可能なリンカーが、配列番号４９（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＤＳＧＧＦＭＬＴＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  64. 前記切断可能なリンカーが、配列番号５０（ＧＧＳＧＧＳＲＡＡＡＶＫＳＰＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  65. 前記切断可能なリンカーが、配列番号５１（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＲＡＡＡＶＫＳＰＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  66. 前記切断可能なリンカーが、配列番号５２（ＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  67. 前記切断可能なリンカーが、配列番号５３（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＩＳＳＧＬＬＳＧＲＳＳＧＰ）を含む、請求項５０に記載のマスクされたサイトカイン。
  68. 前記第１の半減期延長ドメインが、第１のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含み、前記第２の半減期延長ドメインが、第２のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はその断片を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  69. 前記第１及び／又は第２のＦｃドメインが各々、前記第１及び第２の半減期延長ドメインの非共有結合性会合を促進する１つ以上の修飾を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  70. 前記第１の半減期延長ドメインが、配列番号２５（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＮ２９７Ａ）を含み、前記第２の半減期延長ドメインが、配列番号２６（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＮ２９７Ａ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  71. 前記第１の半減期延長ドメインが、配列番号２７（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含み、前記第２の半減期延長ドメインが、配列番号２８（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｎ２９７Ａ、及びＩ２５３Ａ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカイン。
  72. 前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のマスクされたサイトカイン。
  73. ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能な切断産物であって、前記切断産物が、請求項１～４２のいずれかに記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン中の切断可能なペプチドのタンパク質分解切断によって調製可能である、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片を含む、切断産物。
  74. マスクされたＩＬ－１２サイトカインの切断産物であって、前記切断産物が、ＩＬ－１２Ｒに結合することが可能であり、前記切断産物が、以下を含むポリペプチドを含み、
    ＰＣＰ－ＳＤ２－Ｃ
    ＰＣＰが、タンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部であり、ＳＤ２が、スペーサードメインであり、Ｃが、ＩＬ－１２サイトカイン又はその機能的断片である、切断産物。
  75. ＰＣＰが、請求項３２～３８のいずれか一項に記載のタンパク質分解的に切断可能なペプチドの一部である、請求項７４に記載の切断産物。
  76. ＳＤ２が、請求項５４～５５のいずれかに定義されるスペーサードメインである、請求項７４又は７５に記載の切断産物。
  77. Ｃが、請求項２～２０のいずれかに定義されるＩＬ－１２サイトカイン又はその断片である、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の切断産物。
  78. 前記切断産物が、配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して約若しくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の切断産物。
  79. 前記切断産物が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の切断産物。
  80. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインをコードするか、又は請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインのペプチド鎖のうちの１つをコードする、核酸。
  81. 請求項８０に記載の核酸を含む、ベクター。
  82. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインをコードする核酸を含む、宿主細胞。
  83. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインを含む、組成物。
  84. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  85. 前記医薬組成物が、単一単位剤形である、請求項８４に記載の医薬組成物。
  86. 前記医薬組成物が、静脈内投与のために製剤化され、単一単位剤形である、請求項８４に記載の医薬組成物。
  87. 前記医薬組成物が、注射のために製剤化され、単一単位剤形である、請求項８４に記載の医薬組成物。
  88. 前記医薬組成物が、液体であり、単一単位剤形である、請求項８４に記載の医薬組成物。
  89. 請求項１～４１のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン、又は請求項８３に記載の組成物、若しくは請求項８４～８８のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  90. 請求項１～７２のいずれか一項で定義されるマスクされたＩＬ－１２サイトカインを産生する方法であって、前記マスクされたＩＬ－１２サイトカインを産生する条件下で、請求項８２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  91. 請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物をコードする、核酸。
  92. 請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物を含む、組成物。
  93. 請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  94. 薬物で使用するための請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  95. 薬物で使用するための請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物。
  96. 対象においてがんを治療又は予防する方法であって、請求項１～７２のいずれか一項に記載の有効量のマスクされたＩＬ－１２サイトカインを前記対象に投与することを含む、方法。
  97. 対象においてがんを治療又は予防する方法であって、請求項８３又は９２に記載の有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  98. 対象においてがんを治療又は予防する方法であって、請求項８４～８８又は９３のいずれか一項に記載の有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  99. 対象においてがんを治療又は予防する方法であって、請求項１～７２のいずれか一項に記載の有効量のマスクされたＩＬ－１２サイトカインを前記対象に投与することを含み、それによって、前記マスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断され、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物を産生する、方法。
  100. 対象においてがんを治療又は予防する方法であって、同族受容体に結合することが可能である切断産物をインビボで産生するステップを含み、前記切断産物が、請求項７３～７９のいずれか一項で定義されるとおりである、方法。
  101. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項９６～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. がんの治療又は予防に使用するための請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  103. がんを治療又は予防する方法で使用するための請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたＩＬ－１２サイトカインであって、前記方法が、有効量の前記マスクされたＩＬ－１２サイトカインを前記対象に投与することを含み、それによって、前記マスクされたサイトカインが、インビボでタンパク質分解的に切断され、請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物を産生する、マスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  104. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項１０３に記載の使用のためのマスクされたＩＬ－１２サイトカイン。
  105. がんの治療又は予防に使用するための請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物。
  106. がんを治療又は予防に使用する方法で使用するための請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物であって、前記方法が、請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカインを患者に投与し、それによって、インビボで前記マスクされたサイトカインのタンパク質分解切断によって前記切断産物を産生するステップを含む、切断産物。
  107. 対象においてがんを治療又は予防する方法で使用するための請求項７３～７９のいずれか一項に記載の切断産物であって、前記方法が、前記対象に投与された請求項１～７２のいずれか一項に記載のマスクされたサイトカインからインビボのタンパク質分解切断によって前記切断産物を産生するステップを含む、切断産物。
  108. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の使用のための切断産物。
  109. がんの治療又は予防に使用するための請求項８４～８８及び９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  110. 前記がんが、固形腫瘍である、請求項１０９に記載の使用のための医薬組成物。
JP2022560206A 2020-04-01 2021-03-31 マスクされたｉｌ－１２サイトカイン及びその切断産物 Pending JP2023520518A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063003842P 2020-04-01 2020-04-01
US63/003,842 2020-04-01
US202063118579P 2020-11-25 2020-11-25
US63/118,579 2020-11-25
US202063127893P 2020-12-18 2020-12-18
US63/127,893 2020-12-18
PCT/US2021/025107 WO2021202678A1 (en) 2020-04-01 2021-03-31 Masked il-12 cytokines and their cleavage products

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023520518A true JP2023520518A (ja) 2023-05-17
JPWO2021202678A5 JPWO2021202678A5 (ja) 2024-04-10

Family

ID=77929928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022560206A Pending JP2023520518A (ja) 2020-04-01 2021-03-31 マスクされたｉｌ－１２サイトカイン及びその切断産物

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230159603A1 (ja)
EP (1) EP4126249A4 (ja)
JP (1) JP2023520518A (ja)
KR (1) KR20220161405A (ja)
CN (1) CN115734806A (ja)
AU (1) AU2021248919A1 (ja)
BR (1) BR112022019708A2 (ja)
CA (1) CA3172641A1 (ja)
IL (1) IL296913A (ja)
MX (1) MX2022012312A (ja)
TW (1) TW202204386A (ja)
WO (1) WO2021202678A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI3794024T3 (fi) 2018-05-14 2023-08-10 Werewolf Therapeutics Inc Aktivoitavia interleukiini-2-polypeptidejä ja niiden käyttömenetelmiä
MX2020012252A (es) 2018-05-14 2021-04-28 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de interleucina 12 activables y metodos de uso de los mismos.
WO2020069398A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Akrevia Therapeutics Inc. Masked cytokine polypeptides
CA3137512A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Werewolf Therapeutics, Inc. Separation moieties and methods and use thereof
CA3174786A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Sayantan Mitra Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
IL305716A (en) * 2021-03-16 2023-11-01 Cytomx Therapeutics Inc Activated garaged cytokine constructs and related compositions and methods
US20240116997A1 (en) 2022-02-23 2024-04-11 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 polypeptides
US20230365641A1 (en) * 2022-02-28 2023-11-16 Xilio Development, Inc. Targeted cytokines and methods of use thereof
WO2023220501A1 (en) * 2022-05-12 2023-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Activatable therapeutic peptides and uses thereof
WO2024028347A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Heterodimeric fc-clec-1 fusion molecule and uses thereof
CN117917438A (zh) * 2022-10-21 2024-04-23 北京诺诚健华医药科技有限公司 抗体融合蛋白及其制备和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1037927B1 (en) * 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
JP7358047B2 (ja) * 2016-05-16 2023-10-10 チェックマブ エス．アール．エル． 腫瘍浸潤制御性ｔ細胞において選択的に脱制御されたマーカー
EP3733716A4 (en) * 2017-12-26 2021-11-24 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. DIMERAL FUSION PROTEIN USING ANTIBODY FC REGION AS A SKELETON AND ASSOCIATED USE
CN108218993B (zh) * 2018-01-05 2020-11-17 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用
CN113166220A (zh) * 2018-03-09 2021-07-23 奥美药业有限公司 创新细胞因子前药
MX2020012252A (es) * 2018-05-14 2021-04-28 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de interleucina 12 activables y metodos de uso de los mismos.
KR20210038548A (ko) * 2018-06-22 2021-04-07 큐진 인크. 사이토카인-기반 생체활성 약물 및 이의 사용 방법
US20210163562A1 (en) * 2018-07-25 2021-06-03 AskGene Pharma, Inc. Novel IL-21 Prodrugs and Methods of Use Thereof
WO2020069398A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Akrevia Therapeutics Inc. Masked cytokine polypeptides
AU2020353235A1 (en) * 2019-09-28 2022-03-31 AskGene Pharma, Inc. Cytokine prodrugs and dual-prodrugs
EP4126972A4 (en) * 2020-03-23 2024-05-01 Zymeworks BC Inc. MASKED IL12 FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
EP4126249A1 (en) 2023-02-08
CA3172641A1 (en) 2021-10-07
AU2021248919A1 (en) 2022-10-13
MX2022012312A (es) 2023-02-09
CN115734806A (zh) 2023-03-03
IL296913A (en) 2022-12-01
WO2021202678A1 (en) 2021-10-07
EP4126249A4 (en) 2024-04-24
BR112022019708A2 (pt) 2022-12-20
US20230159603A1 (en) 2023-05-25
TW202204386A (zh) 2022-02-01
KR20220161405A (ko) 2022-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7479383B2 (ja) マスクされたサイトカインポリペプチド
US20230159603A1 (en) Masked il-12 cytokines and their cleavage products
US20230151072A1 (en) Masked il-2 cytokines and their cleavage products
US20230331799A1 (en) Masked il-15 cytokines and their cleavage products
US20230072822A1 (en) Tumor-specific cleavable linkers

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240329

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240329