CN117917438A

CN117917438A - 抗体融合蛋白及其制备和应用

Info

Publication number: CN117917438A
Application number: CN202211293426.1A
Authority: CN
Inventors: 欧阳雪松; 王晓燕; 张红娟
Original assignee: Beijing Innocare Pharma Tech Co Ltd
Current assignee: Beijing Innocare Pharma Tech Co Ltd
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2024-04-23
Also published as: WO2024083226A1

Abstract

本发明涉及一种可激活抗体融合蛋白，该融合蛋白包括：其包含特异性结合靶标的抗体部分，免疫球蛋白Fc部分，遮蔽部分和细胞因子部分。本发明还涉及所述融合蛋白的制备方法及其在治疗和/或预防肿瘤上的应用。

Description

抗体融合蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种靶向肿瘤特异性抗原，同时具有细胞因子的生物学效应的可激活的多功能抗体融合蛋白。本发明还涉及所述抗体融合蛋白的制备和应用。

背景技术

Claudin是紧密连接蛋白家族中重要的成员，在细胞与细胞的连接及细胞与基质的连接中起着重要作用。Claudin18由基因CLDN18编码，是一个四次跨膜蛋白，具有两个胞外区，在胃、胰腺和肺等组织均有表达。Claudin18被认为可作为诊断标志物及治疗靶点(Krause et al., 2008)。

Claudin18家族中包含Claudin18.1 (CLDN18.1)与Claudin18.2 (CLDN18.2)两个变体，其中CLDN18.2广泛存在于胃部肿瘤组织中；最新发现其在胰腺癌、食管癌和肺癌中也有表达(Jovov et al., 2007；Karanjawala et al., 2008)。正常细胞由于细胞间紧密的连接，抗体不能接触到细胞表达的Claudin18.2；而在肿瘤细胞中，由于细胞病变导致细胞间的连接变得松散，从而将CLDN18.2暴露在外，抗体可以结合这些暴露在外的CLDN18.2分子。因此，CLDN18.2已经成为一种理想的药物靶点分子(Klamp et al., 2011)。

现有CLDN18.2抗体Zolbetuximab (IMAB362)是一个已进入临床研究的人鼠嵌合的人IgG1抗体，IIb期(NCT01630083，FAST 2015)临床研究结果显示，Zolbetuximab与表柔比星、奥沙利铂和卡培他滨(EOX)联合治疗相比EOX单药，在CLDN18.2高表达(在≥70%肿瘤细胞中强度≥2+)的患者预后良好(PFS，9.0个月vs 5.7个月；HR=0.38；OS，16.5 vs 8.9个月；HR=0.50)(Sahin et al., 2021)。目前有至少三种单抗，一种CLDN18.2-ADC药物，和一种双抗药物进入I期临床。但是单抗的单药作用不明显，且给药剂量很高，ADC和双抗类药物副作用大，因此，还需要探索靶向CLDN18.2的新型治疗产品。

抗体-细胞因子融合蛋白(Immunokine)一方面通过抗体靶向性，降低细胞因子外周免疫毒性，另一方面通过与抗体融合，延长细胞因子的半衰期，增强细胞因子和抗体的免疫调节作用，是一类非常有潜力的肿瘤免疫治疗产品(Xue, Hsu, Fu, & Peng, 2021)。细胞因子白介素2 (Interleukin-2, IL-2)对T细胞，尤其是自然杀伤CD8+T细胞和NK细胞的存活和扩增是必需的。高剂量的重组人IL-2阿地白介素(aldesleukin；商品名Proleukin))早在1992年和1998年分别获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗转移性肾癌和转移性黑色素瘤，但由于其半衰期短，毒性大(毛细血管渗漏和多器官衰竭)，临床应用受到了极大限制。目前有多款肿瘤靶向性抗体融合IL-2细胞因子在临床开发阶段，包括处于二期临床的L19-IL-2 (Darleukin)，GD2-IL-2，CD20-IL-2, EpCAM-IL-2 (Pires, Hammond,& Irvine, 2021)。虽然抗体偶联能一定程度上降低IL-2的外周免疫毒性，但天然或者IL-2Rβγ偏向性IL-2分子，会激活外周淋巴细胞，依然会带来潜在的外周免疫毒性。

可激活型抗体细胞因子融合蛋白保留了抗体细胞因子融合蛋白的优势，同时，通过一段遮蔽肽将IL-2与受体的结合位点封闭，通过肿瘤微环境中特异性表达的金属蛋白酶切割，释放出有活性的IL-2细胞因子，可以同时实现延长IL-2半衰期，肿瘤靶向性释放，降低外周毒性等目的。Hsu等人报道了(Hsu et al., 2021)IL-2前药在肿瘤微环境中特异性激活CD8+T细胞，增强肿瘤杀伤，同时显示出良好的安全性,其他抗体偶联IL-2前药产品包括如Werewolf公司的可切割IL2 (US11352403，WO2019222295)，XILIO公司的遮蔽的IL2细胞因子(WO2021202675)，Askgenen公司的细胞因子前药(WO2019173832)。本发明设计具有图1A所示结构的可激活型抗体融合蛋白。

发明内容

本发明提供了一种可激活抗体融合蛋白，这里以CLDN18.2可激活抗体融合蛋白为例进行说明。主要由抗CLDN18.2抗体及IL-2/IL-2Rα复合物组成，并通过可切割的连接肽偶联IL-2和IL-2Rα，使其成为一种可激活抗体融合蛋白；同时通过基因工程和细胞工程的方法对Fc偶联糖链进行改造，进一步提高了该融合蛋白抗体依赖的细胞活性。本文叙述CLDN18.2可激活抗体融合蛋白以多功能融合蛋白H7E12-2-Pro-IL2 (H7E12-2抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)，432-Pro-IL2 (432抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)，362-Pro-IL2 (362抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)和Hit2.2-Pro-IL2 (Hit2.2抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)作为示例，使用该种架构设计与CLDN18.2靶点抗体组合，公开了通过基因工程技术获得的靶向Claudin18.2，Fc功能优化的，同时具有IL-2/IL-2Rα复合物的生物学效应的多功能融合蛋白，并公开了编码所述多功能融合蛋白的氨基酸序列、架构设计、包含所述重组载体的重组细胞，以及包含所述重组载体的岩藻糖修饰功能缺乏的重组细胞，以及所述多功能融合蛋白的制备方法及其医药用途。具体而言，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种可激活抗体融合蛋白，其特征在于，其包含特异性结合靶标的抗体部分，免疫球蛋白Fc部分，遮蔽部分和细胞因子部分，其中所述遮蔽部分与所述免疫球蛋白Fc部分通过连接肽L1融合，所述细胞因子部分与所述遮蔽部分通过可切割的连接肽L2融合。

可激活抗体融合蛋白通过将细胞因子与抗体靶向部分/Fc部分结合，一方面增加了细胞因子的靶向性，另一方面与Fc部分融合延长了细胞因子的半衰期；同时遮蔽部分通过可切割接头和细胞因子融合并抑制细胞因子活性，一方面降低细胞因子对正常组织不利的活性，另一方面在到达肿瘤时，肿瘤组织中特异表达的蛋白酶才对可切割接头进行切割，并将细胞因子从遮蔽部分释放到肿瘤微环境中，如图1A中的示意图所示。

在一些实施方案中，所述可激活抗体融合蛋白从N端向C段依次包含：特异性结合靶标的抗体部分，免疫球蛋白Fc部分，连接所述Fc片段和所述免疫球蛋白Fc部分的连接肽L1，连接至连接肽L1的遮蔽部分，连接到细胞因子的可切割的连接肽L2，以及所述细胞因子，如图1B中的示意图所示。

在一些实施方案中，所述靶标是肿瘤特异性抗原，其中所述肿瘤特异性抗原选自以下组成的组的一个或多个：Claudin18.2、CA125、AFP、CEA、EGFR、HER2、B7H3、B7H6、MUC1、MUC16、GPC3、CD24、CD20。优选地，所述肿瘤特异性抗原是CLDN18.2、HER2或CD20。更优选地，所述肿瘤特异性抗原是CLDN18.2。

在一些实施方案中，所述细胞因子选自以下组成的组的一个或多个：白介素-2(IL-2)、干扰素α (IFNα)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ (IFNγ)、白介素-7(IL-7)、白介素-12 (IL-12)，和白介素-21 (IL-21)。优选地，所述细胞因子是IL-2。

在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2野生多肽或突变体或截短体，优选的为IL-2野生多肽。在一些实施方案中，所述细胞因子的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

在一些实施方案中，所述遮蔽部分是所述细胞因子的受体或其结合片段，或特异性结合所述细胞因子的抗体或其结合片段，其可以通过与所述细胞因子结合而抑制所述细胞因子的活性。

在一些实施方案中，所述遮蔽部分抑制IL-2细胞因子与免疫细胞上的IL-2Rαβγ和/或IL-2Rβγ结合而抑制所述细胞因子的活性。

在一些实施方案中，所述遮蔽部分选自：IL-2Rα，IL-2Rβ、IL-2Rγ或其突变体。优选地，所述遮蔽部分是IL-2Rα。在一些实施方案中，所述遮蔽部分的氨基酸序列如SEQ IDNO: 29所示。

在一些实施方案中，所述特异性结合靶标的抗体部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。

在一些实施方案中，所述特异性结合靶标的抗体部分与所述免疫球蛋白Fc部分形成包含重链和轻链的抗体结构，其中：所述轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 3、7、11和15所示的氨基酸序列；和/或所述重链的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 5、9、13、17、19、21、31、35和所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 21所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO: 11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 35所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；或所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 33所示。

在一些实施方案中，其中所述免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区氨基酸序列。优选地，所述所述免疫球蛋白Fc部分选自IgG1的恒定区氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示。

在一些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc部分包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸替换：S239D、S298A、I332E和A330L，优选S239D和I332E或S239D、I332E和A330L，所述氨基酸编号根据EU系统编号。

在一些实施方案中，本发明的可激活抗体融合蛋白是去岩藻糖基化的。在一些实施方式中，本发明的可激活抗体融合蛋白缺少在所述免疫球蛋白Fc部分的第297位Asn的岩藻糖基化，如缺少G0F、G1F、G2F、G0F-GN等。

在一些实施方案中，所述连接肽L1选自包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基的柔性连接肽，优选包含(GGGGS)n重复，其中n选自1-6的整数，更优选地如氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

在一些实施方案中，所述可切割的连接肽L2被肿瘤相关蛋白酶切割，从而释放具有活性的所述细胞因子。

在一些实施方案中，所述蛋白酶选自基质金属肽酶-1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP19、MMP20、MMP21、uPA、FAPa或组织蛋白酶B。

例如，已知MMP14特异性切割的序列包括，例如IFARS-L、LARA-LK、LGPSH-Y、LPPLG-F、LQIGH-L、NSPMS-L、PKLAA-I、PTPRS-Y、RKLAF-L、RPLN-LS、RRPVA-Y、SSPLN-Y、SVPSA-I、SYPRA-Y、TMLLA-L、VGPAF-L、RPRS-LL、KIPSA-L、AHPSA-L、SPRN-LR、YGPRA-I、YPAG-LR、KAPAH-L、SQPMA-Y、HTVRG-L、LKVMN-Y、NPLG-IR、PRS-LKS、SSPLA-L、RLPYP-L、FIPFP-F、TPYG-LV、IGALA-L、RPRG-LT、IGPQF-L、VVPNN-L、SAVG-LR、VRH-LIN、PAA-LLG、PLG-IRY、HRLLS-L、YPFGS-L、PTFAH-L、ARLGY-L、FVVRA-L、GFPLM-L、PRP-LLA、VIRF-LR、PYPVP-F、HVRH-LL、RTAHN-L、AHG-ILS、DLPAG-L、SPYG-LL、VFPMS-L、RLPWS-L、RIPRF-L、PRVHH-L、PRA-LKG、SPAS-LR、SFPNP-L、SLVRF-L、VRPRP-F、RTPIG-I、AAHG-IF、YYPRA-L、TRIAY-L、VIPRP-L、RVPYG-L、PHG-FFQ、AHG-LLL、PRVEA-L、TSPVA-L、PLG-LSG、RFPRP-I、SEPFG-L、RIPAS-L、TALP-LR、GLPMH-L、VKAYN-L、QRMAS-L、KSPLG-L、RFALN-L、SIAFA-L、LPYA-LY、PRP-LYH、IPAFN-L、EVRG-LR、RYAQP-L、TPSA-LT、RGPYH-L、IPLLN-L、YPLH-LQ、VRVLH-L、PLG-ITL、LLYAS-L、RTPVG-L、TMAHP-L，和SMPRM-L。

在一些实施方案中，所述蛋白酶选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶的半胱天冬酶切割11和半胱天冬酶12。

在一些实施方案中，所述可切割的连接肽L2被基质金属肽酶14切割。在一些实施方案中，连接肽L2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。

在第二方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码根据本发明第一方面所述的可激活抗体融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自SEQ IDNO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、32、34、36或38所示的多核苷酸序列。

在第三方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明第二方面所述的的核酸分子。

在一些实施方案中，所述宿主细胞具有改变的糖基化机制以使岩藻糖残基不与N-寡聚糖链连接或者这种连接最小化。优选地，所述宿主细胞缺乏相关的岩藻糖基转移酶活性或者岩藻糖转运活性。在一些实施方案中，所述岩藻糖基转移酶是α1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)。在一些实施方案中，所述岩藻糖转运蛋白为GDP-岩藻糖转运蛋白(FUCT1)。

在一些实施方案中，所述宿主细胞选自CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞，例如HEK 293细胞。

在第四方面，本发明提供了用于生产本发明第一方面所述的可激活抗体融合蛋白的方法，其包括培养根据本发明第三方面所述的宿主细胞以表达所述融合蛋白，和分离所表达的融合蛋白。

进一步地，本发明提供了根据本发明第四方面所述的方法生产的可激活抗体融合蛋白产品，其特征在于在免疫球蛋白Fc区域的第297位Asn的岩藻糖基化水平降低，优选地，在免疫球蛋白Fc区域的第297位Asn具有岩藻糖基化修饰的可激活抗体融合蛋白占全部可激活抗体融合蛋白的总量的10%或更少，所述氨基酸编号根据EU系统编号。

在一些实施方案中，所述可激活抗体融合蛋白产品中，与岩藻糖基化的对照融合蛋白相比，无岩藻糖基化的可激活抗体融合蛋白具有增强的抗体依赖性细胞毒性。

进一步地，本发明提供了本发明的可激活抗体融合蛋白、核酸分子、可激活抗体融合蛋白产品在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物或试剂中的应用。在一些实施方案中，所述肿瘤是与CLDN18.2相关的肿瘤。在进一步的实施方案中，所述肿瘤是胃癌、胃食管交界处腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌或乳腺癌。

本发明的可激活抗体融合蛋白靶向肿瘤特异性抗原，从而将细胞因子携带至靶标肿瘤位置，并且通过肿瘤特异性表达的酶而在肿瘤微环境中激活细胞因子的活性，实现了有效的靶向性，同时Fc和细胞因子的偶联增加了细胞因子的半衰期。进一步地，本发明采用包含免疫球蛋白Fc的可激活抗体融合蛋白，不仅具有抗体的抗原靶向性作用，而且还保留了Fc部分的效应功能，包括抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。通过抗体靶向性、效应功能与细胞因子作用的协同，实现了更好的治疗效果。因此，本发明的可激活抗体融合蛋白代表了有前景的活性药物成分。

在下文中，将以CLDN18.2可激活抗体融合蛋白为例进行说明。所列举的实例仅出于说明的目的，而并非限制本发明的范围。本领域技术人员可以了解，本发明的构思也适用于各种肿瘤特异性抗原以及细胞因子，而不受其具体序列的限制。

在一个具体实施方案中，本发明的可激活抗体融合蛋白主要由抗CLDN18.2抗体及IL-2/IL-2Rα复合物组成，并通过可切割的连接肽偶联IL-2和IL-2Rα，使其成为一种可激活抗体融合蛋白；同时通过基因工程和细胞工程的方法对Fc偶联糖链进行改造，进一步提高了该融合蛋白抗体依赖的细胞活性。

在一个实施方案中，通过连接序列1将可激活的IL-2与CLDN18.2抗体的Fc融合，得到靶向CLDN18.2的可激活的抗体融合蛋白CLDN18.2-Pro-IL2。总的来说，靶向CLDN18.2的可激活的抗体融合蛋白从N端开始依次包含：靶向CLDN18.2的抗体的结合区，抗体的Fc片段，连接Fc片段和IL-2受体的连接序列1，连接至第一接头的白介素-2受体亚基α(IL-2Rα)，连接到IL-2的可切割接头序列2，白介素-2 (IL-2)野生型或IL-2突变蛋白。

本文叙述CLDN18.2可激活抗体融合蛋白以多功能融合蛋白H7E12-2-Pro-IL2(H7E12-2抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)，432-Pro-IL2(432抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)，362-Pro-IL2(362抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)和Hit2.2-Pro-IL2(Hit2.2抗体，IL-12/IL-2Rα缀合物外加MMP14可切割肽链的多功能融合蛋白)作为示例，使用该种架构设计与CLDN18.2靶点抗体组合，公开了通过基因工程技术获得的靶向Claudin18.2，Fc功能优化的，同时具有IL-2/IL-2Rα复合物的生物学效应的多功能融合蛋白，并公开了编码所述多功能融合蛋白的氨基酸序列、架构设计、包含所述重组载体的重组细胞，以及包含所述重组载体的岩藻糖修饰功能缺乏的重组细胞，以及所述多功能融合蛋白的制备方法及其医药用途。

定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

本文提供的是特异性结合CLDN18.2的抗体(例如，单克隆抗体)及其抗原结合片段。在具体的方面，本文提供的是特异性结合CLDN18.2的单克隆抗CLDN18.2抗体，其中所述抗CLDN18.2抗体包括亲本抗体的变体。在具体的方面，本文提供的是特异性结合CLDN18.2(例如，人CLDN18.2)的抗体。术语“CLDN18.2”是指本领域技术人员已知的任何CLDN18.2受体。例如所述CLDN18.2可以来自哺乳动物，例如CLDN18.2可以来自人或食蟹猴。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

序列“相同性”或“同一性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性((Gribskov & Devereux, 1991; Griffin &Griffin, 1994; Heijne, 1987; Smith, 1994)。

如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段以及其他片段，包括修饰的片段(Welschof &Krauss, 2003)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约10⁷-10⁸M^-1的Ka)抗原的抗体。“功能片段”或“抗CLDN18.2抗体的类似物”是可防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段或类似物。正如本文所使用，功能片段一般与“抗体片段″含义相同，且就抗体而论，可指能防止或实质降低所述受体结合配体或启动信号转导的能力的片段，例如Fv、Fab、F(ab')2等等。“Fv”片段由一条重链的可变结构域和一条轻链的可变结构域籍非共价结合方式而形成的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDRs相互作用，以确定VH-VL二聚体表面上的靶结合位点，与完整抗体的情况一样。所述六个CDRs共同赋予完整抗体的靶结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包括3个靶特异的CDRs的Fv的一半)，仍可具有识别和结合靶的能力。

如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。

如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。

如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于肿瘤细胞。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约1×10⁷M^-1或1x10⁸M^-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10^-7M或1×10^-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购。

如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如本文所使用，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。

如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。

如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。

如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。

如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。

如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。

如本文所用“可激活抗体融合蛋白”是指这样的蛋白，其中完整抗体和细胞因子融合通过连接肽形成融合蛋白，细胞因子与其受体通过可切割接头融合，一方面细胞因子受体与细胞因子结合降低可激活的细胞因子对正常组织的结合活性，另一方面在肿瘤组织中金属蛋白酶对可切割接头的切割将细胞因子从细胞因子受体中释放。

细胞因子白介素2 (Interleukin-2, IL-2)对T细胞，尤其是自然杀伤CD8+T细胞和NK细胞的存活和扩增是必需的。如本文所用，IL-2“野生”多肽是指在其他方面与IL-2“突变体”相同，但在IL-2突变体的每个氨基酸位置处具有野生型IL-2氨基酸的IL-2的形式。类似地，如本文所用的，IL-2截短体是指从野生型或突变型IL-2的C-和/或N-末端截短一个或多个氨基酸而获得的IL-2的形式。

IL-2主要是由激活的CD4+辅助T细胞分泌，通过结合CD8+T细胞或者NK细胞上的IL-2Rβγ二聚体受体，促进下游JAK1/JAK3-STAT5信号通路，促进T细胞和NK细胞的存活；另外，IL-2对调节性T细胞(Treg)的维持也是必须的，Treg上表达高亲和力IL-2Rαβγ三聚体受体，其与IL-2的亲和力Kd~10^-11M，IL-2Rβγ二聚体受体与IL-2的亲和力Kd~10^-9M，IL-2Rα单体与IL-2的亲和力Kd~10^-8M (Hernandez et al., 2022)。

本文所用的“免疫细胞”指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。例如，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。

本文所用的“去岩藻糖基化”是指宿主细胞天然缺失藻糖转运体或者岩藻糖转移酶，或基因编辑的方法敲除或降低岩藻糖转运体或岩藻糖转移酶，使得该宿主细胞表达的人IgG抗体，或者含有的IgG Fc段的Asn-297位点的N糖链失去或显著降低核心岩藻糖化的能力，从而增强其与Fcγ受体亲和力及ADCC活性。

如本文所用“药物组合物”是指药学上可接受的组合物，其包括例如本文所述的治疗剂中的一种或多种，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、或更多种，连同药学上可接受的载剂一起配制。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。载剂可适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。

如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。

如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。

附图说明

图1表示了可激活抗体融合蛋白结构，其中：

A) 表示了可激活抗体融合蛋白结构和作用的示意图；

B) 表示了可激活抗体-细胞因子融合蛋白的结构示意图。

图2表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白SDS-PAGE图，其中：

A) 可激活IL2融合蛋白和CLDN18.2抗体SDS-PAGE图；

B) 表示了CLDN8.2-Pro-IL2可激活抗体融合蛋白SDS-PAGE图；

C) 表示了ADCC增强的CLDN8.2-Pro-IL2的SDS-PAGE；

D) 表示了CLDN8.2-Pro-IL2用蛋白酶MMP14酶切验证SDS-PAGE图。

图3表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白SEC-HPLC图，其中：

A) 表示了可激活IL2融合蛋白和CLDN18.2抗体SEC-HPLC图；

B) 表示了可激活的IL2和抗体SEC-HPLC图；

C) 表示了ADCC增强的可激活的IL2抗体融合蛋白SEC-HPLC图。

图4表示了岩藻糖敲除宿主细胞中CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白的糖型，其中：

A) 表示了H7E12-Pro-IL2在敲除α1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)CHO-K1 -宿主细胞中表达融合蛋白ICP-130 的糖型分析；

B) 表示了H7E12-Pro-IL2在敲除SLC35C1基因(FUCT1缺失)CHO-K1-GFT^-(CHOK1-AF)宿主细胞中表达融合蛋白ICP-155 的糖型分析。

图5表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白对IL-2受体的结合能力检测。

图6表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白体外MMP14酶切的还原性SDS-PAGE图。

图7表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白活性和非活性形式对PBMC来源的T细胞释放IFN-γ的影响，其中：

A) 表示了ICP-070活性形式和非活性形式对PBMC来源的T细胞释放IFN-γ的影响；

B) 表示了ICP-087活性形式和非活性形式对PBMC来源的T细胞释放IFN-γ的影响；

C) 表示了ICP-068活性形式和非活性形式对PBMC来源的T细胞释放IFN-γ的影响；

D) 表示了ICP-106活性形式和非活性形式对PBMC来源的T细胞释放IFN-γ的影响。

图8表示了去岩藻糖的CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白活性和非活性形式介导的原代NK细胞ADCC活性检测，其中：

A) 表示了ICP-087和其单抗ICP-038的ADCC活性比较；

B) 表示了ICP-106和其单抗ICP-063的ADCC活性比较。

图9表示了ADCC增强型CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导的ADCC报告细胞系活性检测，其中：

A) 表示了ICP-070 (野生型Fc)和其对应的ADCC增强型ICP-087(去岩藻糖)，ICP-155(去岩藻糖)和ICP-154(S239D,I332E)融合蛋白的ADCC活性比较；

B) 表示了ICP-068 (野生型Fc)和其对应的ADCC增强型ICP-106(去岩藻糖)，ICP-153 (S239D, I332E)融合蛋白的ADCC活性比较。

图10表示了CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白活性和非活性形式对NK-92细胞STAT5磷酸化信号影响的检测，其中：

A) 表示了ICP-070活性形式和非活性形式对NK-92细胞STAT5磷酸化信号的影响；

B) 表示了ICP-087活性形式和非活性形式对NK-92细胞STAT5磷酸化信号的影响；

C) 表示了ICP-068活性形式和非活性形式对NK-92细胞STAT5磷酸化信号的影响；

D) 表示了ICP-106活性形式和非活性形式对NK-92细胞STAT5磷酸化信号的影响。

图11表示了ICP-024和对照药ICP-015在小鼠结肠癌模型MC-38-hCLDN18.2-A11细胞中的肿瘤抑制药效活性检测。

图12表示了图11所述药效实验中各给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图，其中：

A) 表示了对照组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

B) 表示了ICP-024给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

C) 表示了ICP-025给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

D) 表示了ICP-015给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图。

图13表示了ICP-024和对照药ICP-015在小鼠结肠癌模型CT-26-hCLDN18.2细胞中的肿瘤抑制药效活性检测。

图14表示了图13所述药效实验中各给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图，其中：

A) 表示了对照组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

B) 表示了ICP-024给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

C) 表示了ICP-025给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

D) 表示了ICP-015给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图。

图15表示了图13所述药效实验终点小鼠外周血淋巴细胞绝对计数的流式测定，其中：

A) 表示了外周血CD45+细胞在各给药组中的绝对数值变化；

B) 表示了外周血CD3+细胞在各给药组中的绝对数值变化；

C) 表示了外周血CD8+细胞在各给药组中的绝对数值变化；

D) 表示了外周血CD4+细胞在各给药组中的绝对数值变化。

图16表示了不同CLDN18.2抗体融合蛋白和对照药ICP-069在小鼠结肠癌模型MC-38-hCLDN18.2-A11细胞中的肿瘤抑制药效活性检测。

图17表示了上述图16所述的药效实验各给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图，其中：

A) 表示了对照组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

B) 表示了ICP-070给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

C) 表示了ICP-068给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

D) 表示了ICP-069给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

E) 表示了ICP-024给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图；

F) 表示了ICP-087给药组的小鼠个体肿瘤生长曲线图。

图18表述了图17所述药效实验中ICP-024和ICP-087肿瘤消退小鼠的肿瘤再刺激和免疫记忆形成实验。

图19表示了图18所述ICP-024和ICP-087肿瘤消退小鼠的肿瘤再刺激实验中各给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图，其中：

A) 表示了对照组小鼠个体肿瘤生长曲线图；

B) 表示了ICP-024给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图；

C) 表示了ICP-087给药组小鼠个体肿瘤生长曲线图。

图20表示了与Fc-IL-2相比，CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白没有引起毛细血管渗漏，具有良好的外周安全性。

具体实施方案

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂、原料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。Zolbetuximab (IMAB362)：GanymedPharmaceuticals，参见NW_004504382.1。

实施例1：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白的蛋白制备

可激活抗体融合蛋白通过将细胞因子白介素-2(IL-2)与抗体结合，一方面增加了细胞因子的靶向性，另一方面与抗体Fc融合延长了细胞因子的半衰期；同时白介素-2受体亚基α(IL-2Rα)通过可切割接头和IL2融合并抑制IL-2活性，一方面降低白介素-2 (IL-2)对正常组织的结合活性，另一方面在到达肿瘤时，肿瘤组织中金属蛋白酶才对可切割接头进行切割，并将IL-2从IL-2受体释放给有需要的受试者。

在另一个实施方案中，本发明包括降低可激活的白介素-2 (IL-2)对正常组织的结合活性和靶向癌细胞的方法，包括施用有效量的可激活的白介素-2 (IL-2)融合蛋白包括：白介素-2 (IL-2)野生型或突变蛋白；连接到IL-2的第一个可切割接头；白介素-2受体结合区(IL-2α或IL-2β受体)与第一可切割接头相连；和与IL-2或IL-2受体连接的半衰期延长剂，其中可切割接头的切割将IL-2从IL-2受体释放给有需要的受试者。

在这里，通过连接序列1将可激活的IL2与CLDN18.2抗体的Fc融合，得到靶向CLDN18.2的可激活的抗体融合蛋白CLDN18.2-Pro-IL2。总的来说靶向CLDN18.2的可激活的抗体融合蛋白从N端开始依次包含：靶向CLDN18.2的抗体的结合区，抗体的Fc片段，连接Fc片段和IL-2受体的连接序列1，连接至第一接头的白介素-2受体亚基α(IL-2Rα)，连接到IL-2的可切割接头序列2，白介素-2 (IL-2)野生型或IL-2突变蛋白。

优选的，将抗CLDN18.2的人源化单克隆抗体H7E12-2的重链HC依次与连接序列1、白介素-2受体亚基α、可切割序列2、白介素-2 (IL-2)依次融合，对应氨基酸序列SEQ IDNO:17，和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:15共同表达，获得抗体融合蛋白H7E12-2-Pro-IL2，蛋白编号ICP-070。

优选的，将Zolbetuximab(362)(基因NW_004504382.1)重链HC依次与连接序列1、白介素-2受体亚基α、可切割序列2、白介素-2 (IL-2)依次融合，对应氨基酸序列SEQ IDNO:13和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:11共同表达，获得抗体融合蛋白362-Pro-IL2，蛋白编号ICP-069。

优选的，将人CLDN18.2抗体432重链HC依次与连接序列1、白介素-2受体亚基α、可切割序列2、白介素-2 (IL-2)依次融合，对应氨基酸序列SEQ ID NO:9和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:7共同表达，获得抗体融合蛋白432-Pro-IL2，蛋白编号ICP-068。

优选的，将人CLDN18.2抗体Hit2.2重链HC依次与连接序列1、白介素-2受体亚基α、可切割序列2、白介素-2 (IL-2)依次融合，对应氨基酸序列SEQ ID NO:5和轻链氨基酸序列SEQ ID NO:3共同表达，获得抗体融合蛋白Hit2.2-Pro-IL2，蛋白编号ICP-024。

将白介素-2受体亚基α(IL-2Rα)基因(SEQ ID NO:27)通过到第一个接头序列上(SEQ ID NO:23)连接到抗体的Fc区，然后通过第二个可切割接头(SEQ ID NO: 25)将白介素-2(IL-2)连接到白介素-2受体结合区，制备成融合蛋白ICP-015 (SEQ ID NO: 1)。这些连接都是通过DNA同源重组的方式实现的。

IL-2Rα和IL-2连接后，IL2和IL-2Rα结合，在心脏、肺、肾脏或中枢神经系统中的毒性降低；另一方面，连接IL2的可切割接头被肿瘤微环境中上调表达的蛋白酶MMP14切割，并从其白介素-2受体结合区上释放，从而集中于肿瘤部位；同时抗体 Fc 区可以延长IL-2的半衰期。总的来说，融合蛋白包含：(1)靶蛋白结合序列；(2)人IgG1 Fc段; (3) 接头1；(4)人IL-2Rα; (5) 可切割接头2； (6) 人IL-2；或者(1)人IgG1 Fc段; (2) 接头1；(3) 人IL-2Rα; (4) 可切割接头2； (5) 人IL-2。通过与不同的靶蛋白结合区连接，获得以下1种IL2融合蛋白ICP015，和4种可激活抗体融合蛋白ICP024、ICP068、ICP069、ICP070。其序列如表1所示。

表1：抗体和融合蛋白序列及宿主细胞总结

抗体融合蛋白编号

抗体融合蛋白名称

轻链氨基酸序列

轻链核苷酸序列

重链氨基酸序列

重链核苷酸序列

宿主细胞

ICP-015

Fc融合蛋白前药IL2

NA

SEQ ID No 1

SEQ ID No 2

HEK293

ICP-025

CLDN18.2单克隆抗体Hit2.2

SEQ ID No 3

SEQ ID No 4

SEQ ID No 31

SEQ ID No 32

HEK293

ICP-038

CLDN18.2单克隆抗体H7E12-2

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 33

SEQ ID No 34

HEK293

ICP-041

CLDN18.2单克隆抗体362 (Zolbetuximab)

SEQ ID No 11

SEQ ID No 12

SEQ ID No 35

SEQ ID No 36

HEK293

ICP-063

CLDN18.2单克隆抗体432

SEQ ID No 7

SEQ ID No 8

SEQ ID No 37

SEQ ID No 38

HEK293

ICP-024

Hit2.2-Pro-IL2

SEQ ID No 3

SEQ ID No 4

SEQ ID No 5

SEQ ID No 6

HEK293

ICP-068

432-Pro-IL2

SEQ ID No 7

SEQ ID No 8

SEQ ID No 9

SEQ ID No 10

HEK293

ICP-069

362-Pro-IL2

SEQ ID No 11

SEQ ID No 12

SEQ ID No 13

SEQ ID No 14

HEK293

ICP-070

H7E12-2-Pro-IL2

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 17

SEQ ID No 18

HEK293

ICP-087

H7E12-2-Pro-IL2 HEK Afu

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 17

SEQ ID No 18

HEK293/FUT8^-

ICP-106

432-Pro-IL2 HEK Afu

SEQ ID No 7

SEQ ID No 8

SEQ ID No 9

SEQ ID No 10

HEK293/FUT8^-

ICP-130

H7E12-2-Pro-IL2 CHO-K1 Afu (FUT8)

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 17

SEQ ID No 18

CHO-K1/FUT8-

ICP-155

H7E12-2-Pro-IL2 CHO-K1 Afu (FUCT1)

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 17

SEQ ID No 18

CHO-K1-AF

ICP-153

H7E12-2-Pro-IL2 DE mut

SEQ ID No 15

SEQ ID No 16

SEQ ID No 19

SEQ ID No 20

CHO-S

ICP-154

432-Pro-IL2 DE mut

SEQ ID No 7

SEQ ID No 8

SEQ ID No 21

SEQ ID No 22

CHO-S

实施例2：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白表征

在37℃、8％CO₂、100 rpm下培养CHO-S细胞至细胞密度6×10⁶个/mL。使用脂质体分别将构建的载体转染到上述细胞中，转染质粒浓度为1 mg/ml，脂质体浓度参照ExpiCHOTMExpression System试剂盒确定，在32℃、5％CO₂，100 rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料一次。离心上述培养产物，0.22μm滤膜过滤并收集培养基上清液，采用ProteinA、离子柱纯化抗体或融合蛋白。

ProteinA、离子柱纯化的具体操作步骤为：细胞培养液经过高速离心后取上清，利用Cytiva的ProteinA层析柱进行亲和层析。层析使用平衡缓冲液为1×PBS (pH7.4)，细胞上清上样结合后利用PBS洗涤至紫外线回到基线，然后利用洗脱缓冲液0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱目的蛋白，利用Tris调节pH至中性保存。将亲和层析所得产物调节pH至低于或者高于pI1-2个pH单位，适当稀释以控制样本电导在5ms/cm以下。利用合适的对应pH缓冲液如磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等条件，利用本领域内常规的离子交换层析方法如阴离子交换或者阳离子交换进行对应pH条件下NaCl梯度洗脱，根据UV280吸收选择目的蛋白所在的收集管合并保存。

然后，将纯化后所得的洗脱液超滤换液至缓冲液中。通过SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白质纯度及含量，如图2所示。

进一步用经SEC-HPLC对融合蛋白纯度进行测定，结果表明，目标抗体或融合蛋白经一步纯化，纯度均在90%以上，纯度较高，如图-2A-D和表2所示。

表2：各抗体融合蛋白纯度结果

抗体融合蛋白编号	纯度
		ICP-015	92%
ICP-025	99%
		ICP-038	95%
ICP-041	94%
		ICP-063	95%
ICP-024	98%
		ICP-068	99%
ICP-069	99%
		ICP-070	96%
ICP-087	98%
		ICP-106	97%
ICP-130	95%
		ICP-155	99%
ICP-153	95%
		ICP-154	95%

实施例3：ADCC增强型CLDN18.2-Pro-IL-2可激活抗体融合蛋白的制备和糖型鉴定

H7E12-2-Pro-IL2在FUT8基因敲除的CHO-K1/FUT8-细胞中的表达，由南京蓬勃生物科技有限公司代为完成。细胞株在Expi-CHOS expression medium 中传代用于生产，传代密度0.2~0.3 x 10⁶/mL，传代周期2~3天。转染前一天将细胞稀释至2 x 10⁶/mL，转染当日，检测细胞密度应在6 x 10⁶/mL左右，活率大于95%。转染当日按照并使用转染试剂盒使用说明操作转染，质粒使用7E12-2-pro-IL2重链和轻链,用量100μg，轻链和重链摩尔浓度比为1:1。转染后第一天加入Enhancer与Expichos Feed medium，降温至32℃培养。转染第五天，加入Expichos Feed medium。转染后第10到第14，监测细胞活率，细胞活率小于70%时收获细胞，纯化蛋白，编号ICP-130。蛋白表达情况及纯度如图2、3和表3。

对表达的融合蛋白ICP-130用荧光标记色谱和质谱的方法进行糖型定量分析，结果如图4和表3所示。结果表明Fc段岩藻糖修饰的主要糖型G0F和G1F均低于检出限。

H7E12-2-Pro-IL2在SLC35C1基因敲除(FUCT1缺失)的CHO-K1/GFT^-(CHOK1-AF)细胞中的表达，由北京华放天实生物制药有限责任公司代为完成。细胞株在瞬转培养基Transpro CD01中培养用于传代。瞬转使用化转PEI进行转染，转染总体积200mL。载体使用H7E12-2-pro-IL2重链和轻链,用量200ug，浓度1.6μg/ml，轻链和重链摩尔浓度比为1:1。转染前将细胞密度调整至5x 10⁶/mL，然后制备转染复合物，将上述计算后的质粒和PEI混合后反应10min，加入至准备好的细胞中。37度5% CO₂ 125rpm摇床中培养。转染后第一天添加丁酸钠和0.1g/L的葡聚糖硫酸脂钠盐，并降温至32℃培养。转染后第1、3、5、7、9天进行流加培养，流加3% 403A和0.3% 403B流加液。转染后第10到第14，监测细胞活率和葡萄糖含量，糖含量不足时随时添加。培养14天收获细胞，纯化蛋白。蛋白表达情况及纯度如图3A-C和表3。

对表达的融合蛋白ICP-155用荧光标记色谱和质谱的方法进行糖型定量分析，结果如图4B和表4所示。结果表明Fc段岩藻糖修饰的主要糖型G0F和G1F均低于检出限。

表3：抗体融合蛋白ICP-130糖型分析

样品名称	G0-GN	G0	Man5	G1a	G1b	G2
							ICP-130	20.38%	42.58%	7.87%	0.55%	2.10%	4.66%

表4：抗体融合蛋白ICP-155糖型分析

实施例4：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白对IL-2Rα和IL-2Rβγ的结合能力测定

HEK-Blue™ IL-2细胞(购自Invivogen)过表达了人CD25(IL-2Rα)、CD122 (IL-2Rβ)，和CD132 (IL-2Rγ)基因，因此可以在细胞膜上表达低亲和力IL-2Rα受体，和中亲和力IL-2Rβγ受体，以及高亲和力IL-2Rαβγ受体。用8 x 10⁴细胞分别与不同的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白室温孵育30分钟，起始浓度为20nM，5倍稀释，9个浓度梯度。孵育结束后用流式缓冲液洗一遍，加入PE标记的抗人IgG Fc二抗，室温孵育30分钟，孵育结束用流式缓冲液洗一遍，用用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测平均荧光强度。使用GraphPadPrism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC₅₀值。结果见图5和表5。

ICP-159为人IgG1 Fc与IL-2串联表达的融合蛋白，作为与IL-2受体结合的阳性对照，其在HEK-Blue™ IL-2细胞上的结合强度EC50=0.74nM，而不同的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白由于IL-2倍IL-2Rα遮蔽，完全不与HEK-Blue™ IL-2细胞上表达的IL-2受体结合，证明遮蔽效果良好，达到了抑制IL-2与受体结合的作用。

表5：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白对IL-2受体的结合能力检测

处理组

ICP-024

ICP-068

ICP-070

ICP-087

ICP-106

ICP-159

EC₅₀(nM)

N/A

0.74

N/A:未检测到。

实施例5：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白体外MMP14切割

用1X活化缓冲液(50mM Tris-HCL pH=9.0，1mM CaCl₂，0.5% Brij-35)稀释hrFurin活化酶原MMP-14，在37℃培养箱预激活2小时使MMP14酶活化。将待切割融合蛋白ICP-068, ICP-070, ICP-087和ICP-106在10X酶切缓冲液(500mM Tris-HCL PH=7.5，30mMCaCl₂，10μM ZnCl₂)中以1.2 μmol/L等摩尔浓度切割，在37℃培养箱反应48小时。同时设置不加MMP14酶的不切割对照组，用1X活化缓冲液替代MMP14酶。用SDS-PAGE验证酶切效率，从每个酶切体系中取10uL样品分别与含DTT的3.3uL 4X上样缓冲液混匀，95℃金属浴10分钟。用15孔预制胶上样2μg，恒压100V条件下跑胶100分钟。使用eStain L1蛋白染色仪(GenScript)完成考染及脱色。酶切结果如图6所示，经MMP14切割后的融合蛋白释放出活性IL-2蛋白，大小约15KD，后续对MMP14酶切(+)或未切(-)的融合蛋白的生物学活性进行评估。

实施例6：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白的NK-92和CTLL-2细胞增殖活性检测

人的NK细胞系NK-92 (CRL-2407，ATCC)和小鼠的T淋巴细胞系CTLL-2 (购自中科院生物物理所)细胞系均为IL-2依赖型细胞系，利用体外培养的IL-2饥饿的NK-92和CTLL-2细胞系模型评价MMP14酶切(+)或未切(-)的融合蛋白的促细胞增殖活性，在96孔板的中加入3000个细胞/孔，活性和非活性形式的融合蛋白起始浓度为26nM，5倍梯度稀释9个浓度点，设置PBS阴性对照。培养结束后，取出平底96孔板平衡至室温，加30 μL的CTG-Glo试剂(Promega, Madison, WI)，振荡混匀充分裂解10分钟，室温静置10分钟后将上清液转移50μL至平底384孔板中于Envision多功能微孔板检测仪(Perkin Elmer, Waltham, MA)检测荧光信号。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC₅₀值。NK-92(n=3)和CTLL2 (n=3)细胞的EC₅₀±SEM总结如表6，倍数变化±SEM由未切割(-)的EC₅₀/切割形式(+)EC₅₀计算得出。

表6：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白在NK-92和CTLL-2中的细胞增殖活性总结

N/A，未检测到，数据均显示为平均值±SEM。

融合蛋白ICP-068，ICP-106, ICP-070和ICP-087经MMP切割后分别表示为ICP-068+，ICP-106+,ICP-07+和ICP-087+；未切割的ICP-068，ICP-106, ICP-070和ICP-087分别表示为ICP-068-，ICP-106-，ICP-070-和ICP-087-。结果显示，CLDN18.2单抗H7312-2和432均无促进NK-92和CTLL-2增殖的体外活性，融合蛋白ICP-068+，ICP-106+,ICP-07+和ICP-087+在NK-92细胞中的EC₅₀分别为17.7±5.2 nM，20.7±8.2 nM，7.5±1.7 nM，12.9±3.1 nM，与人的重组IL-2的EC₅₀活性13.5±1.5相当；未切割的ICP-068-，ICP-106-，ICP-070-和ICP-087-在NK-92细胞中的EC₅₀分别为419.0±78.9 nM，157.0±39.7 nM，296.3±57.0 nM，154.7±26.8 nM。融合蛋白ICP-068，ICP-106，ICP-070和ICP-087的非活性形式和活性形式EC₅₀倍数变化分别为26.6±5.0倍，8.5±1.3倍，40.0±2.6倍，12.6±2.2倍, 结果显示遮蔽形式的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白中细胞因子IL-2的活性显著性减低，经MMP14酶切后，可以有效释放IL-2，促进NK细胞的扩增。

在CTLL-2细胞中，融合蛋白ICP-068+，ICP-106+,ICP-07+和ICP-087+的EC₅₀分别为12.0±2.1 nM，8.1±1.9 nM，6.1±2.0 nM，6.2±1.9 nM,与人的重组IL-2的EC₅₀活性10.3±4.7相当；未切割的ICP-068-，ICP-106-，ICP-070-和ICP-087-在CTLL-2细胞中的EC₅₀分别为201.3±66.3 nM，59.0±17.0 nM，77.7±1.5 nM，68.5±26.5 nM。融合蛋白ICP-068，ICP-106，ICP-070和ICP-087的非活性形式和活性形式在CTLL-2细胞中的EC₅₀倍数变化分别为17.4±4.8倍，7.2±0.4倍，15.7±4.6倍，9.0±0.6倍，跟NK-92细胞的结果类似，遮蔽形式的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白中细胞因子IL-2的活性在CTLL-2鼠源T细胞中显著性减低，经MMP14酶切后，可以有效释放IL-2，促进T细胞的扩增。

两种细胞的活性检测均证明未切割的前药形式具有封闭IL-2活性的功能，当遮蔽肽被切割，有效释放出活性的IL-2时，才能发挥IL-2促T细和NK细胞增殖的作用。前药和活性药的活性差异在7.2~40倍之间。

实施例7：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白的原代T细胞IFN-γ释放检测

IL-2对于维持原代T细胞的存活是必须的，因此检测CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白对原代T细胞的稳态维持和IFN-γ释放。将PBMC细胞按照2 x10⁵细胞/孔铺板，加入不同浓度的融合蛋白，以36nM浓度起始，4倍梯度稀释8个浓度点，37℃细胞培养箱孵育5天后，收取上清用于人的IFN-γELISA试剂盒检测IFN-γ含量，结果见图7和表7。

表7：CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白促进原代T细胞释放IFN-γ细胞因子的总结

实验结果显示，ICP-068+，ICP-106+, ICP-07+和ICP-087+均促进浓度梯度依赖的IFN-γ细胞因子释放，且刺激PBMC来源的原代T细胞释放IFN-γ的能力比人重组IL-2显著增强。ICP-087-和ICP-106-与ICP-070-和ICP-106-相比，未切割情况下的本底活性略有增强。

IFN-γ通过多种途径介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤，结果显示未激活形式的CLDN18.2融合蛋白在没有经肿瘤微环境的MMP14酶切割时，能有效的减少T细胞的增殖，激活和细胞因子释放，具有降低外周毒性的作用；同时，MMP14酶切后活性形式的CLDN18.2融合蛋白能维持T细胞的稳态扩增，促进T细胞激活以及细胞因子如IFN-γ释放，其释放IFN-γ的能力较重组IL-2更强，显示其强效的肿瘤杀伤作用。

实施例8：去岩藻糖型CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导的原代NK细胞ADCC活性检测

在体内，ADCC是由抗体的Fab端结合肿瘤细胞的抗原表位，其Fc端与自然杀伤细胞(NK细胞)表面的FCγR结合，NK细胞活化释放穿孔素、颗粒酶等细胞毒物质，介导NK细胞杀伤靶细胞致使靶细胞凋亡。本实验中，我们利用外周血单核细胞PBMC来源的原代NK细胞作为效应细胞，用293T-hCLDN18.2 (细胞编号KC-0986，购自康源博创)作为靶细胞建立共培养系统，在体外模拟抗体的ADCC作用。

首先用1.6 μM的CFSE (Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，565082，BD)标记靶细胞293T-hCLDN18.2，室温避光标记10分钟，用5倍体积预冷的无血清培养基洗2遍，将标记好的细胞重悬在ADCC培养液中并计数，向96孔U型板中加入每孔5 x 10⁴细胞，之后加入ICP-068，ICP-106, ICP-070和ICP-087活性和非活性形式融合蛋白进行梯度稀释，500转离心30秒后加入1.5 x 10⁵ PBMC细胞/孔，效靶比为30：1。将靶细胞效应细胞抗体融合蛋白复合物在在37℃共孵育4h。孵育结束后，用PBS+2%FBS清洗细胞两遍，每孔加入100 μL含1 μL 7-AAD (559925，BD)的PBS溶液染色，室温避光孵育10分钟，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测靶细胞的活性。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC₅₀值。结果见图8A, B和表8。

表8：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导的原代NK细胞ADCC活性EC₅₀总结

结果显示与H7E12-2单抗相比，ICP-087由于Fc端去岩藻糖修饰，在酶切和未切割的情况下，ADCC活性分别提高了1.69倍和4.33倍(图8A)。与432单抗相比，ICP-106+和ICP-106-的ADCC活性分别提高了2.76倍和1.65倍(图8B)。

ADCC活性是CLDN18.2抗体发挥肿瘤杀伤作用的重要免疫调节机制，岩藻糖去除的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白较Fc野生型单抗相比，ADCC有明显提高，表明融合蛋白结构不影响CLDN18.2抗体Fc端的功能；同时，本发明中利用FUT8或者FUCT1敲除的宿主细胞产生的融合蛋白有效提高了CLDN18.2-Pro-IL-2的ADCC活性，靶向性杀伤CLDN18.2高表达的肿瘤细胞，为其临床应用提供理论基础。

另外，本发明中的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白，经酶切释放IL-2，可以有效激活肿瘤微环境中的NK细胞的功能，进一步提升CLDN18.2抗体ADCC的功能，因此，本发明的融合蛋白设计，通过两种途径，提高CLDN18.2抗体的ADCC活性，具有比目前在临床开发阶段的单抗药物更显著的肿瘤杀伤活性。

实施例9：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导的Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158 ADCC报告细胞系活性检测

抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是许多抗体药物杀伤肿瘤细胞的主要作用机制。FcγRⅢA(CD16a)可以介导NK细胞对肿瘤细胞的ADCC作用，在此利用Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158(由康源博创公司构建)作为替代的效应细胞分别与过表达人的CLDN18.2的靶细胞293T-hCLDN18.2 (细胞购自康源博创，细胞编号KC-0986)作为靶细胞，以为1：1的效靶比共同孵育，此效应细胞的胞外区过表达高亲和力FcγRⅢA CD16a-V158，与靶细胞和不同浓度的CLDN18.2-Pro-IL-2 融合蛋白(86.9 nM起始，4倍稀释，9个浓度点)共孵育，融合蛋白Fc端结合胞外区高亲和力CD16a-V158激活NFAT-luc2荧光素酶报告系统，通过CLARIOstar® Plus多功能酶标仪(BMG LABTECH)检测荧光素酶的含量可以检测ADCC增强型CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白的ADCC活性的情况。使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算EC50值。实验结果见图9和表9A，9B。

表9：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导的Jurkat-NFAT-Luc2-CD16a-V158ADCC报告细胞系EC₅₀总结

处理组	EC₅₀(nM)	E_max(fold change)
			hIgG1	N/A	4.90
ICP-070-	0.98	63.80
			ICP-153-	0.02	49.85
ICP-087-	0.04	55.77
			ICP-155-	0.04	49.18
ICP-068-	0.54	60.48
			ICP-154-	0.02	49.20
ICP-106-	0.04	64.84

结果显示，以H7E12-2为骨架的CLDN18.2-Pro-IL-2 融合蛋白中，ICP-070(Fc野生型)、ICP-153 (氨基酸突变的ADCC增强型)、ICP-087 (N297去岩藻糖型，292T-FUT8-)和ICP-155 (N297去岩藻糖型，CHO-K1-AF)的ADCC活性EC₅₀分别为0.98 nM、0.02 nM、0.04 nM和0.04 nM(图9A)；以432为骨架的CLDN18.2-Pro-IL-2 融合蛋白中, ICP-068 (Fc野生型)和ICP-154 (S239D和I332E突变的ADCC增强型)以及ICP-106 (N297去岩藻糖型)的ADCC活性EC₅₀分别为0.54 nM、0.02 nM和0.04 nM (图9B)。

两种不同抗体骨架组成的融合蛋白均表明，ADCC增强型突变和N297位岩藻糖去除都有效地提高了CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白的ADCC活性，升高倍数为13.5~27倍，进而提升对CLDN18.2高表达肿瘤细胞的杀伤活性，为其临床应用提供理论基础。

实施例10：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白介导NK-92细胞STAT5磷酸化检测

有活性的IL-2通过结合NK细胞或CD8+T细胞表面的IL-2Rβγ二聚体，或者Treg细胞表面的IL-2Rαβγ三聚体，激活下游JAK1/JAK3-STAT5信号通路，促进STAT5磷酸化(p-STAT5)。因此，比较了酶切和未切的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白促进NK-92细胞STAT5磷酸化的能力。将2.22 x 10⁵/mL NK-92细胞用MEM基础培养基重悬后，转移至96孔细胞培养板，每孔90 μL。抗体起始浓度为3 nM，用MEM基础培养基梯度系列稀释3倍，共10个浓度点，向96孔板转移10 μL抗体溶液，在37℃培养箱孵育15分钟后。将NK-92细胞用PBS缓冲液清洗两次，然后加100 μL 90%的冷甲醇，4℃固定30分钟，用PBS缓冲液清洗两次，然后加入按pSTAT5抗体说明书稀释的Alexa Fluor 647标记的抗体，在室温孵育半小时，用PBS缓冲液清洗两次后，用NovoCyte Quanteon流式细胞仪(安捷伦)检测STAT5的磷酸化水平。实验结果见图10A-D和表10。

表10：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白促进NK-92细胞STAT5磷酸化的EC₅₀总结

%p-STAT5	EC₅₀(nM)	MFI Emax
			rhIL-2	0.11	17151
H7E12-2	>3	N/A
			432	>3	N/A
ICP-068+	0.15	17211
			ICP-068-	>3	N/A
ICP-106+	0.08	14182
			ICP-106-	>3	N/A
ICP-070+	0.07	14850
			ICP-070-	>3	N/A
ICP-087+	0.07	14718
			ICP-087-	>3	N/A

结果显示，H7E12-2和432单抗无法促进STAT5磷酸化，酶切后的ICP-068+，ICP-106+，ICP-70+和ICP-087+促进NK-92细胞STAT5磷酸化的EC₅₀分别为0.15 nM，0.08 nM，0.07 nM和0.07nM，与重组IL-2的活性(EC₅₀为0.11 nM)相当；未酶切的非活性形式ICP-068-，ICP-070-，ICP-087-和ICP-106-均无促进STAT5磷酸化的能力(图10A-10D)。

实施例11：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白在MC-38-hCLDN18.2和CT-26-hCLDN18.2小鼠结肠癌细胞模型的药效测定

发明者用可激活抗体融合蛋白Hit2.2-Pro-IL2 (蛋白编号ICP-024)，融合蛋白Fc-Pro-IL2，(蛋白编号ICP-015)，以及Hit2.2-Pro-IL2的抗体形式Hit2.1 (蛋白编号ICP-025)三组同时入组，以等摩尔的给药剂量在MC-38-hCLDN18.2-A11和CT-26-hCLDN18.2小鼠结肠癌细胞模型进行药效检测。

将处于对数生长期的MC-38-hCLDN18.2-A11 (购自南京博望)小鼠结肠癌细胞接种到6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(维通利华)，接种量为5×10⁵/只，接种体积为0.1mL。当肿瘤体积达到60-80mm³时，开始腹腔给药，给药周期为BIW(每周两次)x 5次，给药剂量为0.26nmol/只。肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。实验过程中观察到的临床症状均记录在原始数据中。对照组平均肿瘤体积超过2000 mm³设置为实验终点，实验终点收集脾脏，引流淋巴结和肿瘤组织进行免疫细胞浸润分析。

肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm³)= 1/2 ×(a × b2)(其中a表示长径，b表示短径)。

相对肿瘤抑制率TGI(%)的计算公式如下：TGI% =(1-T/C)× 100%。(T和C分别为治疗组和PBS对照组在某一特定时间点的瘤重(TW))，肿瘤生长曲线如图11所示。

在MC-38-hCLDN18.2-A11模型中，第23天，ICP-024的肿瘤抑制率TGI=81.64% (p<0.01, Oneway ANOVA),而对照药ICP-015和对照单抗ICP-025的TGI分别为-35.06%和32.21%，与PBS对照组相比均未达到显著。个体小鼠的肿瘤生长曲线如图12A-D所示，其中ICP-024给药组有4/8 (50%)小鼠达到完全响应(CR, complete response)(图12B)，显示出ICP-024单药在MC-3-8hCLDN18.2小鼠结肠癌模型中优异的抗肿瘤能力。

同时利用小鼠结肠癌模型CT-26-hCLDN18.2比较ICP-024与对照测试药ICP-015和ICP-025的肿瘤抑制率。将处于对数生长期的CT-26-hCLDN18.2(购自南京博望)小鼠结肠癌细胞接种到6-8周龄BALb/c雌性小鼠(维通利华)，接种量为5×10⁵/只，接种体积为 0.1mL。当肿瘤达到60-80 mm³时开始腹腔给药，给药周期为BIW (每周两次)x 5次，给药剂量为0.26 nmol/只。实验分组给药和肿瘤测量和TGI计算与上述MC-38-hCLDN18.2-A11相同，对照组平均肿瘤体积超过2000 mm³设置为实验终点，实验终点收集外周血进行免疫细胞绝对计数分析，以检测其潜在的外周毒性。肿瘤生长曲线如图13所示，在CT-26-hCLDN18.2模型中，第16天，ICP-024的肿瘤抑制率TGI=97.99% (p<0.05, Oneway ANOVA)，而对照药ICP-015和对照单抗ICP-025的TGI分别为56.12%和-33.81%，与PBS对照组相比均未达到显著；个体小鼠的肿瘤生长曲线如图14 A-D所示，ICP-024给药组有5/8 (62.5%)小鼠达到肿瘤完全清除(CR, complete response), 2/8 (25%)小鼠肿瘤小于70mm³，仅1只(12.5%)小鼠发生肿瘤进展(PD, progressed disease)，显示出ICP-024单药在CT-26-hCLDN18.2小鼠结肠癌模型中优异的抗肿瘤能力。

外周血免疫细胞计数分析如图15A-D所示，检测了重复给药后药效终点各给药组潜在的外周免疫毒性，外周血免疫细胞绝对计数结果显示，与对照组相比，ICP-015促进外周CD45+免疫细胞,CD3+T细胞和CD8+T细胞的扩增，而ICP-024显示出良好的外周安全性，没有引起外周血免疫细胞的过度激活和扩增。

这些结果提示抗体靶向性CLDN18.2-Pro-IL-2能够特异性靶向到肿瘤部位，减少外周非特异性T，NK细胞激活，当融合蛋白靶向到肿瘤部位时，可以有效的激活肿瘤微环境中的T细胞和NK细胞，促进肿瘤杀伤，可以同时发挥减毒增效的抗肿瘤作用。

实施例12：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白在MC-38-hCLDN18.2小鼠结肠癌细胞模型中诱导免疫记忆形成

进一步，比较以参照抗体Zolbetuximab为骨架的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白(ICP-069)，在MC-38-hCLDN18.2-A11 (购自南京博望)小鼠结肠癌肿瘤模型中与其他几个CLDN18.2抗体组成的融合蛋白，即ICP-024、ICP-068、ICP-069、ICP-070和ICP-087的肿瘤抑制能力以及促进免疫记忆形成的能力。MC-38-hCLDN18.2-A11肿瘤建模和分组、肿瘤大小检测与上述实施例11相同，当肿瘤大小到达60-80 mm³时开始腹腔给药，给药周期为BIW(每周两次)x 5次，给药剂量均为260nmol/只。如图16所示，在肿瘤生长第14天，与对照组相比，ICP-024的肿瘤抑制率TGI为93.75% (p<0.0001，Oneway ANOVA), ICP-068的肿瘤抑制率TGI为100.94%% (p<0.0001, Oneway ANOVA), ICP-069的肿瘤抑制率TGI为67.38% (p<0.001, Oneway ANOVA)，ICP-070的肿瘤抑制率TGI为59.58% ( p<0.01, Oneway ANOVA)，ICP-087肿瘤抑制率TGI为108.84% (p<0.0001, Oneway ANOVA)。个体小鼠的肿瘤生长曲线如图17A-F所示，在实验终点时，ICP-024有7/8 (87.5%)只小鼠达到肿瘤完全消退，ICP-068组有3/8(37.5%)只小鼠达到肿瘤完全消退，ICP-069组2/8 (25%)只小鼠达到肿瘤完全消退，ICP-070组无小鼠达到肿瘤完全消退，ICP-087组8/8(100%)只小鼠达到完全肿瘤消退。

对肿瘤完全消退的小鼠(来自ICP-024和ICP-087组)继续进行6周常规饲养和肿瘤监测，之后在对侧重新接种5 x 10⁵ MC-38-hCLDN18.2-A11 (购自南京博望)细胞/只小鼠，同时接种8只野生型小鼠(维通利华)作为肿瘤发生对照，每周测量肿瘤生长情况，对照组小鼠肿瘤平均值约1200mm³时结束观察，如图18所示，与对照组相比，ICP-024组无对侧肿瘤进展，ICP-087组有1只小鼠发生肿瘤进展。个体小鼠对侧肿瘤生长曲线如图19 A-C所示，ICP-024对侧接种的肿瘤发生率为0% (0/70；ICP-087对侧肿瘤发生率为12.5% (1/8)，仅1只小鼠发生了对侧肿瘤生长。这些结果显示，ICP-024和ICP-087在促进肿瘤杀伤的过程中产生了抗肿瘤特异性免疫记忆，当再次遇到相同的肿瘤抗原刺激的时候，可以有效的激活免疫记忆应答并促进肿瘤杀伤。

实施例13：CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白在MC-38-hCLDN18.2小鼠结肠癌细胞模型中的毒性研究

IL-2主要的毒性是引起毛细血管渗漏并引发多器官衰竭，我们用MC-38-hCLDN18.2荷瘤小鼠进行了CLDN18.2-Pro-IL-2的毒性研究。小鼠肿瘤细胞接种和肿瘤测量如实施例12所述，当肿瘤发生并达到500-800mm³时，进行单次腹腔给药，给药剂量为0.26nmol/只。给药后96小时，收集小鼠肺并称重，37℃烘干48小时后，再次称重，差值即为净重。

结果如图20所示，等摩尔的Fc-IL-2单次给药后96小时与对照组相比，有显著的肺净重升高，表明引起了毛细血管渗漏，而相同剂量的ICP-106没有与对照相比，没有肺净重升高，说明CLDN18.2-Pro-IL-2抗体融合蛋白具有很好的外周安全性。

实施例14：Trastuzumab-Pro-IL-2抗体融合蛋白的蛋白制备

Trastuzumab-Pro-IL-2与IL2及其遮蔽肽的连接方式如实施例1所述，其序列如SEQ ID NO: 41和SEQ ID NO: 42所示。

其表达如实施例2所述，将CHO-S细胞密度调整至6×10⁶个/mL，使用脂质体进行转染，质粒浓度为1mg/ml，在32℃、5％CO₂，100rpm下培养7-10天。转染18-22h之后和第5天之间分别补料。超滤收集清液，采用ProteinA、离子交换柱或者分子筛纯化蛋白，根据UV280吸收选择目的蛋白所在的收集管合并保存，将纯化后蛋白超滤换液至目标缓冲液中。用SDS-PAGE凝胶电泳和SEC-HPLC高效液相色谱检测蛋白质纯度及含量，并用CTLL-2, NK-92细胞增殖实验进行IL-2端的活性测试。

实施例15：Rituximab-Pro-IL-2抗体融合蛋白的蛋白制备

Rituximab-Pro-IL-2与IL2及其遮蔽肽的连接方式如实施例1所述，其序列如SEQID NO: 43和SEQ ID NO: 44所示。其表达、纯化及表征如实施例13所述，并用CTLL-2, NK-92细胞增殖实验进行IL-2端的活性测试。

综上所述，体外和体内活性实验表明，CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白在未经MMP14切割时，细胞因子IL-2的活性(包括促进T细胞或NK细胞中STAT5的磷酸化，进而促进NK和T细胞扩增，和细胞因子IFN-γ释放)均得到了有效的抑制，说明本发明提供的未激活型抗体融合蛋白通过遮蔽肽IL-2Rα将IL-2与T细胞或NK细胞上的受体IL-2Rβγ的结合阻断，因此不会在外周血中激活免疫细胞，从而达到降低外周系统性免疫毒性的目的。另外，经肿瘤微环境中的MMP14切割后，激活型抗体融合蛋白通过可切割的连接肽，释放出有活性的IL-2，进而在肿瘤微环境中特异性的提高T细胞或NK细胞中STAT5的磷酸化，促进NK和T细胞扩增，和细胞因子IFN-γ释放，达到肿瘤杀伤的作用。

另一方面，本发明提供的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白还通过CLDN18.2抗体本身除了发挥肿瘤靶向性细胞因子递送外，还发挥直接的肿瘤杀伤的作用，本发明提供的ADCC增强型CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白有效的提高了融合蛋白的ADCC活性，证明本发明的融合蛋白分子设计不仅不影响抗体Fc端ADCC的功能，同时通过ADCC增强的设计，还能进一步提高其ADCC活性，进而对CLDN18.2阳性的肿瘤细胞产生抗体介导的细胞杀伤。

第三方面，本发明提供的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白，CLDN18.2抗体端和经酶切释放活性的IL-2细胞因子端，可以发生协同增效的作用，IL-2可以增强肿瘤微环境局部浸润的NK细胞的活性，进一步增加CLDN18.2抗体的功能，达到协同增效的作用。

因此，本发明提供的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白可通过不同的分子机制促进免疫细胞对CLDN18.2阳性肿瘤细胞的杀伤，同时有效降低IL-2细胞因子的外周毒性，本发明提供的CLDN18.2-Pro-IL-2融合蛋白药物，具有良好的肿瘤靶向性和安全性，是一款高效低毒的CLDN18.2抗体靶向性IL-2细胞因子产品。

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Claims

1.一种可激活抗体融合蛋白，其特征在于，其包含特异性结合靶标的抗体部分，免疫球蛋白Fc部分，遮蔽部分和细胞因子部分，其中所述遮蔽部分与所述免疫球蛋白Fc部分通过连接肽L1融合，所述细胞因子部分与所述遮蔽部分通过可切割的连接肽L2融合。

2.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中所述靶标是肿瘤特异性抗原，其中所述肿瘤特异性抗原选自以下组成的组的一个或多个：Claudin18.2、CA125、AFP、CEA、EGFR、HER2、B7H3、B7H6、MUC1、MUC16、GPC3、CD24、CD20；优选地，所述肿瘤特异性抗原是CLDN18.2、HER2或CD20；更优选地，所述所述肿瘤特异性抗原是CLDN18.2。

3.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中：

a) 所述选自以下组成的一个或多个：白介素-2 (IL-2)、干扰素α (IFNα)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ (IFNγ)、白介素-7(IL-7)、白介素-12 (IL-12)，和白介素-21 (IL-21)；优选地，所述细胞因子是IL-2；

b) 所述细胞因子是IL-2野生多肽或突变体或截短变体，优选的为IL-2野生多肽；或

c) 所述细胞因子的氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示。

4.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中：

a) 所述遮蔽部分是所述细胞因子的受体或其结合片段或特异性结合所述细胞因子的抗体或其结合片段，其可以通过与所述细胞因子结合而抑制所述细胞因子的活性；或

b) 所述遮蔽部分抑制IL-2细胞因子与免疫细胞上的IL-2Rαβγ和/或IL-2Rβγ结合而抑制所述细胞因子的活性；或

c) 所述遮蔽部分选自：IL-2Rα，IL-2Rβ、IL-2Rγ或其突变体，优选的为IL-2Rα；或

d) 所述遮蔽部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 29所示。

5.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中：

a) 所述特异性结合靶标的抗体部分选自Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段；或

b) 所述特异性结合靶标的抗体部分与所述免疫球蛋白Fc部分形成包含重链和轻链的抗体结构，其中：

i) 所述轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 3、7、11、15、42和44所示的氨基酸序列；和/或所述重链的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 5、9、13、17、19、21、31、35、41和43所示的氨基酸序列；或者

ii) 所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ IDNO: 5所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；或者

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。

6.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中：

a) 所述免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区氨基酸序列，优选选自IgG1的恒定区氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示；和/或

b) 所述免疫球蛋白Fc部分包含选自由以下组成的组的一个或多个氨基酸替换：S239D、S298A、I332E和A330L，优选S239D和I332E或S239D、I332E和A330L。

7.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中所述连接肽L1选自包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基的柔性连接肽，优选包含(GGGGS)_n重复，其中n选自1-6的整数，更优选地如氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示。

8.如权利要求1所述的可激活抗体融合蛋白，其中所述可切割的连接肽L2被肿瘤相关蛋白酶切割，从而释放具有活性的所述细胞因子，其中：

a) 所述蛋白酶选自基质金属肽酶-1(MMP1)、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP19、MMP20、MMP21、uPA、FAPa或组织蛋白酶B；

b) 所述蛋白酶选自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶的半胱天冬酶切割11和半胱天冬酶12；或者

c) 所述可切割的连接肽L2被基质金属肽酶14切割，优选地连接肽L2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。

9.分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-8任一项所述的可激活抗体融合蛋白的多核苷酸。

10.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其具有改变的糖基化机制以使岩藻糖残基不与糖链连接或者这种连接最小化，优选地所述宿主细胞缺乏有效的岩藻糖基转移酶活性或者岩藻糖转运活性；优选地，所述岩藻糖基转移酶是FUT8和/或所述岩藻糖转运蛋白为FUCT1。

12.用于生产根据权利要求1-8中任一项所述的可激活抗体融合蛋白的方法，其包括培养根据权利要求10或11中任一项所述的宿主细胞以表达所述融合蛋白，和分离所表达的融合蛋白。

13.根据权利要求12所述的方法生产的可激活抗体融合蛋白产品，其特征在于在免疫球蛋白Fc区域的第297位Asn的岩藻糖基化水平降低，优选地，在免疫球蛋白Fc区域的第297位Asn具有岩藻糖基化修饰的可激活抗体融合蛋白占全部可激活抗体融合蛋白的总量的10%或更少；其中与岩藻糖基化的对照融合蛋白相比，无岩藻糖基化的可激活抗体融合蛋白具有增强的抗体依赖性细胞毒性。

14.如权利要求1-8任一项所述的可激活抗体融合蛋白、权利要求9所述的核酸分子、权利要求13所述的可激活抗体融合蛋白产品在制备用于诊断、治疗或预防肿瘤的药物或试剂中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是与CLDN18.2相关的肿瘤；优选地，所述肿瘤是胃癌、胃食管交界处腺癌、胰腺癌、食管癌、支气管癌或乳腺癌。