TW202221016A - Ｆｌｔ３配位體融合蛋白及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供無效應物免疫球蛋白 Fc 蛋白、無效應物 Fc 蛋白與 Flt3 配位體之融合及其使用方法。

Description

FLT3　配位體融合蛋白及使用方法
本發明涉及 Flt3 配位體融合蛋白及其使用方法。
許多研究佐證了免疫系統組分之差異性存在在癌症進展中的重要性 (Jochems 及 Schlom, Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011))。臨床資料表明，腫瘤浸潤性淋巴球之高密度與臨床結果的改善有關 (Mlecnik 等人，Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011))。腫瘤免疫浸潤物包括巨噬球、樹突細胞 (DC)、肥大細胞、自然殺手 (NK) 細胞、初始及記憶性淋巴球、B 細胞及效應 T 細胞 (T 淋巴球)，其主要負責識別由腫瘤細胞表現之抗原且隨後藉由 T 細胞破壞腫瘤細胞。
儘管抗原由癌細胞呈現且存在可潛在地與腫瘤細胞發生反應之免疫細胞，但在許多情形下，免疫系統未經活化或經肯定地阻抑。腫瘤產生諸多免疫調節機制來逃避抗腫瘤免疫反應。總體結果係損害 T 細胞反應且誘導 CD8 +細胞毒性 T 細胞之細胞凋亡或減低其抗腫瘤免疫能力。抗原呈現功能及樹突細胞 (DC) 之抑制另外有助於逃避抗腫瘤免疫性 (Gerlini 等人，Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004)。
另外，腫瘤微環境之局部免疫阻抑性質可導致不表現標靶抗原的癌細胞亞群體得以逃逸。因此，找到促進免疫系統之抗腫瘤活性之保留及/或恢復的方式將具有重大治療益處。
免疫查核點參與抗腫瘤免疫性之腫瘤介導的下調。已證實，T 細胞功能障礙與抑制性受體 CTLA-4 及程式性死亡 1 多肽 (PD-1) (CD28 家族受體之成員) 之誘導表現同時發生。然而，儘管近年來已進行廣泛研究，但免疫療法在臨床環境中之成功受到限制。很少治療劑受到管理機構之核準，且其中大部分患者未體驗到益處。近年來發現，免疫查核點參與抗腫瘤免疫性之下調且被用作治療標靶。該等觀察突出顯示，需要研發用於利用免疫系統來抵抗癌症之新穎治療方式。
人類 Flt3L (Fms 樣酪胺酸激酶 3 配位體) 係刺激骨髓細胞增殖之第 I 型跨膜蛋白，其在 1994 年被選殖 (Lyman 等人，1994)。已在各種臨床前及臨床環境中探索可溶性 hFlt3L 之應用，包括備用於骨髓移植之幹細胞動員、癌症免疫療法 (例如樹突細胞擴增) 以及疫苗佐劑。尚無基於 Flt3L 之醫藥組成物在臨床中進展至超過 2 期。
一個挑戰在於最佳化 Flt3L 配位體暴露且鑑別最佳投藥方案，而最小化不良副效應或潛在不利免疫學效應。可例如藉由改變投藥方案、改變投藥量或改變治療分子之藥物動力學及/或藥效動力學性質來調節暴露。本文提供具有有益於增強用於癌症患者之免疫療法之有益 PK/PD 性質的 Flt3L-Fc 融合蛋白。
本發明提供無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白 (包括含有融合至無效應免疫球蛋白 Fc 蛋白之活性 Flt3 配位體 (Flt3L) 的 Flt3 配位體融合蛋白) 及其使用方法。無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白及 Flt3L-Fc 融合蛋白之使用方法包括治療癌症，尤其係治療接受查核點免疫療法之患者的癌症。本發明進一步提供無效應 IgG Fc 蛋白。
在一方面，提供一種無效應 Fc 蛋白，其包含與殘基 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 或 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在再其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 相同之胺基酸序列。為清楚起見，在一些實施例中，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含 PVAGP (SEQ ID NO:20)，此可在本文中稱為涵蓋 PVA# 變異體；且其中 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸，此可在本文中稱為 N297G 突變，其中 297 係指抗體之 EU 編號。
在一些實施例中，無效應 Fc 蛋白包含 SEQ ID NO: 2、4、5、6、13 或 15 之蛋白質序列。
在再其他實施例中，相對於包含 SEQ ID NO:12 之野生型 IgG1 Fc 區，無效應 IgG1 Fc 蛋白被減弱。
在一些方面，提供包含無效應 Fc 蛋白之抗體，該無效應 Fc 蛋白包含與殘基 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 或 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。
在一些實施例中，抗體結合至 Flt3L 受體。
在一些實施例中，抗體結合至查核點抑制蛋白。在其他實施例中，查核點抑制蛋白為 PD-L1、PD-1 及/或 CTLA-4。在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。
在一些方面，提供包含本發明之無效應 Fc 蛋白及第二蛋白質之異源二聚體蛋白。在一些實施例中，無效應 Fc 蛋白及第二蛋白質彼此共價連接。在其他實施例中，無效應 Fc 蛋白及第二蛋白質藉由雙硫鍵連接。
在一些方面，提供編碼本發明之無效應 Fc 蛋白之經分離核酸、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含如本文及上文所闡述之無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。在一些實施例中，經分離核酸編碼 SEQ ID NO: 2、4、5、6、13 或 15之蛋白質序列。在其他實施例中，經分離核酸進一步編碼無效應 Fc 蛋白之 N-末端處的訊息序列。在一較佳實例中，經分離核酸編碼 SEQ ID NO:13 之蛋白質序列。
在一些方面，提供一種宿主細胞，其包含編碼本發明之無效應 Fc 蛋白之核酸、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含如本文及上文所闡述之無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。
在一些方面，提供產生本發明之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白的方法，其包含培養包含編碼本發明之無效應 Fc 蛋白之核酸、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白的宿主細胞，從而產生每一蛋白質。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收本發明之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞或原核細胞。在其他實施例中，真核細胞為 CHO 細胞。
在一些方面，提供一種宿主細胞，其包含編碼本發明之無效應 Fc 蛋白之核酸、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。
在一些方面，提供產生本發明之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白的方法，其包含培養包含編碼本發明之無效應 Fc 蛋白之核酸、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白的宿主細胞，從而產生本發明之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收本發明之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體及/或包含無效應 Fc 蛋白之異源二聚體蛋白。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞或原核細胞。在其他實施例中，真核細胞為 CHO 細胞。
在一方面，提供包含無效應 Fc 蛋白之融合蛋白，其包含無效應 Fc 蛋白 (SEQ ID NO:13 或其變異體) 及第二蛋白質，其中第二蛋白質係標靶蛋白之配位體。在一些實施例中，在配位體結合至標靶蛋白時，配位體調節標靶蛋白。在一些實施例中，第二蛋白質為 Flt3L。在其他實施例中，標靶蛋白為 Flt3L 受體。在較佳實施例中，第二蛋白質位於無效應 Fc 蛋白之 N-末端。
在一些實施例中，融合蛋白包含與 SEQ ID NO:13 至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之 Fc 蛋白，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 或 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在再其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 相同之胺基酸序列。為清楚起見，在一些實施例中，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含 PVAGP (SEQ ID NO:20)，此可在本文中稱為涵蓋 PVA# 變異體；且其中 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸，此可在本文中稱為 N297G 突變，其中 297 係指抗體之 EU 編號。
在一方面，融合蛋白包含 Flt3 配位體 (Flt3L) 及無效應 IgG1 Fc 區，其中相對於包含 SEQ ID NO:12 的野生型 IgG1 Fc 區，Flt3L-Fc 融合蛋白之效應功能被減弱。
在 Flt3L-Fc 融合蛋白之一些實施例中，Flt3L 包含含有與 SEQ ID NO:21 之殘基 27-167 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列的蛋白質。在其他實施例中，Flt3L 包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，其中該胺基酸序列具有 1、2 或 3 個胺基酸取代。在其他實施例中，1、2 或 3 個胺基酸取代並不存在於結合至 FcRn 蛋白之 Flt3L 區域中。在其他實施例中，Flt3L 蛋白包含 SEQ ID NO:22 之序列。
在 Flt3L-Fc 融合蛋白之一些實施例中，Flt3L 包含含有 SEQ ID NO:21 之胺基酸 27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184 或 27-185 的蛋白質。在 Flt3L-Fc 融合蛋白之較佳實施例中，Flt3L 包含由 SEQ ID NO:21 之胺基酸 27-167 或 SEQ ID NO:21 之胺基酸 27-168 組成的胺基酸序列。在其他實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白之 Flt3L 不包含 SEQ ID NO:21 之168-235、169-235、170-235、171-235、172-235、173-235。在再其他實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白之 Flt3L 不包含胺基酸序列 PWSPRPLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:48)、WSPRPLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:49)、SPRPLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:50)、PRPLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:51)、RPLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:52) 或 PLEATAPTAPQPP (SEQ ID NO:53)。
在 Flt3L-Fc 融合蛋白之一些實施例中，Flt3L 包含與包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸 27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184 或 27-185 之蛋白質至少約 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的蛋白質。
在 Flt3L-Fc 融合蛋白之一些實施例中，Flt3L 包含與包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸 24-167、25-167、26-167、24-168、25-168、26-168、24-169、25-169 或 26-169 之蛋白質至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的蛋白質。
在 Flt3L-Fc 融合蛋白之一些實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 或 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。在再其他實施例中，無效應 IgG1 Fc 區包含與 SEQ ID NO:13 相同之胺基酸序列。為清楚起見，在一些實施例中，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含 PVAGP (SEQ ID NO:20)，此可在本文中稱為涵蓋 PVA# 變異體；且其中 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸，此可在本文中稱為 N297G 突變，其中 297 係指抗體之 EU 編號。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO: 26 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的胺基酸序列。在其他實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO:26 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:26 之殘基 154-158 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:26 之殘基 217 為甘胺酸。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO:25 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:25 之殘基 155-159 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:25 之殘基 218 為甘胺酸。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO:32 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:32 之殘基 153-157 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:32 之殘基 216 為甘胺酸。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO:33 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:33 之殘基 152-156 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:33 之殘基 215 為甘胺酸。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與 SEQ ID NO:34 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:34 之殘基 151-154 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:34 之殘基 214 為甘胺酸。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白包含與選自由 SEQ ID NO:27 至 SEQ ID NO:31 及 SEQ ID NO: 35 至 SEQ ID NO: 44 組成之群組之蛋白質至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白在活體外分析在活化抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)，其活性程度小於包含融合至野生型 IgG1 Fc (SEQ ID NO:12) 之野生型 Flt3L 之 Flt3L-Fc 融合蛋白在活體外分析中之活性程度的約 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99%。在其他實施例中，ADCP 活體外分析包含使用原代巨噬球作為效應細胞且使用表現 Flt3L 受體之細胞系作為標靶細胞。在再其他實施例中，原代巨噬球係來自健康人類供體之單核球源巨噬球。在其他實施例中，標靶細胞為人類急性淋巴母細胞性白血病細胞，視情況為 SEM 細胞系細胞。在一些實施例中，將活性測量為吞噬作用百分比 (ADCP %)，其中藉由測量來自標靶細胞之視覺標記物的攝取來確定吞噬作用。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白活化已投予該融合蛋白之受試者中的 DC 擴增。在其他實施例中，在受試者之全血中測量 DC 擴增。在再其他實施例中，藉由流式細胞分析技術或 FACS 測量 DC 擴增。在一些實施例中，DC 擴增係源自投予未融合至異源蛋白之 Flt3L 蛋白之 DC 擴增的至少 5 倍、10 倍、15 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍、5000 倍或 10,000 倍。在其他實施例中，異源蛋白為野生型人類 IgG Fc 蛋白。在其他實施例中，野生型人類 IgG Fc 蛋白為野生型 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 蛋白。在一些實施例中，Flt3L 蛋白未融合至野生型 IgG1 Fc 蛋白或人類血清白蛋白。在一些實施例中，受試者為齧齒類動物、兔、食蟹猴或人類。在其他實施例中，齧齒類動物為小鼠或大鼠。
在一些實施例中，該 Flt3L-Fc 融合蛋白之熱穩定性高於具有 SEQ ID NO:14 之 Flt3L-Fc 融合蛋白的熱穩定性。在其他實施例中，使用差示掃描螢光法來測量熱穩定性。在再其他實施例中，該 Flt3L-Fc 融合蛋白之熔融溫度 (Tm) 大於具有 SEQ ID NO:14 之 Flt3L-Fc 融合蛋白的 Tm 至少 1.5℃、2℃、3℃、4℃ 或 5℃。
在一些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白在 Flt3L 域中含有單一胺基酸取代。在其他實施例中，取代會將活體內免疫原性減低 10%、20% 或 30% 以上，但並不減低功能活性。在其他實施例中，功能活性分析係動物中之樹突細胞的擴增。
在一些方面，提供編碼如本文及上文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白的經分離核酸。在一些實施例中，經分離核酸編碼 SEQ ID NO: 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 或 44 之蛋白質序列。在其他實施例中，經分離核酸進一步編碼 Flt3L-Fc 融合蛋白之 N-末端處的訊息序列。在一較佳實例中，經分離核酸編碼 SEQ ID NO:45 之蛋白質序列。
在一些方面，提供一種宿主細胞，其包含編碼如本文及上文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白的核酸。
在一些方面，提供產生 Flt3L-Fc 融合蛋白之方法，其包含培養包含編碼無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白之核酸的宿主細胞，從而產生 Flt3L-Fc 融合蛋白。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收 Flt3L-Fc 融合蛋白。在一些實施例中，宿主細胞為真核細胞或原核細胞。在其他實施例中，真核細胞為 CHO 細胞。
在一些方面，提供一種醫藥調配物，其包含如本文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含其他治療劑。在再其他實施例中，其他醫藥藥劑係佐劑、樹突細胞成熟因子及/或查核點抑制劑。
在一些方面，提供擴增投予 Flt3L-Fc 融合蛋白之受試者中之樹突細胞 (DC) 之數量的方法。在一些實施例中，DC為 cDC1 及/或 cDC2 細胞。在其他實施例中，該方法包含向受試者投予本發明之 Flt3L-Fc 融合蛋白。
在一些實施例中，該方法包含向受試者投予約 0.1 mg/kg 至 50 mg/kg、0.1 mg/kg 至 40 mg/kg、0.1 mg/kg 至 25 mg/kg、0.1 mg/kg 至 20 mg/kg、0.1 mg/kg 至 15 mg/kg、0.1 mg/kg 至 10 mg/kg、1 mg/kg 至 50 mg/kg、1 mg/kg 至 40 mg/kg、1 mg/kg 至 25 mg/kg、1 mg/kg 至 20 mg/kg、1 mg/kg 至 15 mg/kg 或 1 mg/kg 至 10 mg/kg Flt3L-Fc 融合蛋白 之劑量。
在一些實施例中，該方法包含以約以下頻率向受試者投予 Flt3L 融合蛋白：每天一次、每週一次、每週兩次、每 2 週一次、每 3 週一次、每月一次或每隔一月一次。
在一些實施例中，該方法包含藉由靜脈內投予、非經腸投予、肌內注射或皮下注射向受試者投予 Flt3L 融合蛋白。
在一些方面，提供治療癌症之方法，其中該方法包含向有需要之受試者投予如本文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白。在一些實施例中，該方法包含投予治療有效量之 Flt3L-Fc 融合蛋白且投予治療有效量之免疫查核點抑制劑。在其他實施例中，免疫查核點抑制劑阻抑或抑制 PD-1 或 PD-L1 之效應。在再其他實施例中，免疫查核點抑制劑為帕博利珠單抗 (pembrolizumab)、納武利尤單抗 (nivolumab)、匹定利珠單抗 (pidilizumab)、BMS 936559、阿替利珠單抗 (atezolizumab) 或阿維魯單抗 (avelumab)。在其他實施例中，在投予 Flt3L-Fc 融合蛋白之前、同時或之後投予查核點抑制劑。
在一些實施例中，該方法進一步包含投予樹突細胞 (DC) 成熟因子。在其他實施例中，DC 成熟因子係選自聚 IC、聚-ICLC、CD40 促效劑、輻射療法及化學療法。在其他實施例中，在投予 Flt3L-Fc 融合蛋白之前、同時及/或之後將DC 成熟因子投予個體。在特定實施例中，DC 成熟因子為輻射療法。在一些實施例中，該方法包含在受試者已接受 DC 成熟因子之後將Flt3L-Fc 融合蛋白投予受試者。在其他實施例中，該方法包含在受試者已接受 DC 成熟因子之前將 Flt3L-Fc 融合蛋白投予受試者。在再其他實施例中，方法包含與受試者接受 DC 成熟因子大約同時將Flt3L-Fc 融合蛋白投予受試者。
在一些實施例中，癌症係選自由以下項組成之群組：非小細胞肺癌 (NSCLC)、小細胞肺癌 (SCLC)、黑色素瘤、胰管腺癌 (PDAC)、三陰性乳癌 (TNBC)、非何杰金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma，NHL)、結直腸癌 (CRC)、乳癌、膀胱癌、腎癌或其組合。
在一些實施例中，使用查核點抑制劑預先治療受試者。在其他實施例中，受試者對查核點抑制劑療法並不具有反應，其中經至少或約 3 個月、4 個月、5 個月、6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、1 年、1.5 年或 2 年之時段投予查核點抑制劑療法。
在一些實施例中，使用輻射療法治療受試者，其中經至少或約 3 個月、4個月、5 個月、6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、1 年、1.5 年或 2 年之時段投予輻射療法。
在一些實施例中，使用化學療法治療受試者，其中經至少或約 3 個月、4個月、5 個月、6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、1 年、1.5 年或 2 年之時段投予化學療法。
在一些實施例中，受試者之癌症之特徵在於包含免疫沙漠型腫瘤。在其他實施例中，癌症之特徵在於包含發炎相對於反應性、發炎腫瘤 (「熱腫瘤」) 減弱的腫瘤 (「冷腫瘤」)。
相關申請之交叉引用
本申請案主張 2020 年 8 月 7 日提出申請之美國臨時專利申請號 63/062,713 的優先權及權益，其內容以全文引用方式併入本文中。
Ⅰ 界定
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 與其配偶體 Y 的親和力通常可以用解離常數 (Kd) 表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
術語「Flt3 配位體」亦稱為「Flt3L」，其係指能夠以足夠親和力結合 Flt3 受體之蛋白質，從而該蛋白質可用作靶向 Flt3 受體 (Flt3R) 之診斷劑及/或治療劑。在一實施例中，如例如藉由放射免疫分析 (RIA) 所測量，Flt3 配位體與無關、非 Flt3R 蛋白結合之程度低於該蛋白質與 Flt3L 的結合的約 10%。在某些實施例中，結合至 Flt3R 之蛋白質的解離常數 (Kd) 為 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更小，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9M 至 10 -13M)。在某些實施例中，Flt3L 結合至在不同物種的 Flt3R 之間保守的 Flt3R。
除非另外指示，否則本文所用之術語「Flt3L」係指經裂解、可溶性 Flt3L (例如 SEQ ID NO:21之大約殘基 27-185)，但亦可係指來自任何脊椎動物來源 (包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類) 及齧齒類動物 (例如小鼠及大鼠)) 之任何天然 Flt3L。該術語可涵蓋「全長」、未處理 Flt3L 以及源自細胞中處理之任何 Flt3L形式，該處理係例如去除訊息肽 (前導序列) 或自 TM 域裂解。該術語亦涵蓋天然 Flt3L 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。具有內源性訊息序列之實例性人類 Flt3L 的胺基酸序列展示於 SEQ ID NO:21 中且亦提供於基因庫登錄記錄 P49771 中，而在其他實施例中，不含外源性前導序列之成熟 Flt3L 蛋白的胺基酸序列提供為 SEQ ID NO:21 之殘基 27-167。本發明亦考慮極小序列變化，尤其係不影響 Flt3L 的功能及/或活性 (例如與 Flt3 受體結合 (基因庫登錄號：NP_004110)) 的 Flt3L 的保守胺基酸取代。
本文所用之術語「Flt3L-Fc 融合蛋白」或替代地「Fc-無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白」係指 Flt3L 多肽直接或間接連接至變異 IgG Fc 區的融合蛋白，其中變異 Fc 區之效應功能弱於其對應野生型 Fc 區。應注意，對於術語「無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白」之任何使用，術語「無效應」適用於融合蛋白之 Fc 部分。在某些較佳實施例中，本發明之 Flt3L-Fc 融合蛋白包含與人類 IgG Fc 區連接的人類 Flt3L 蛋白或多肽。在某些實施例中，該人 Flt3L 多肽包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列。然而，應理解，不顯著影響 Flt3L 或本發明之無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白 (例如 SEQ ID NO:26) 的功能及/或活性的極小序列變化 (例如插入、缺失、取代，尤其係 Flt3L 或 Fc 的保守胺基酸取代) 亦在本發明的考慮範圍內。本發明之無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白可與 Flt3 受體蛋白 (Flt3) 結合，此可以產生 Flt3 受體下游傳訊。如本文中所使用，CDX-301 係指具有 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列的 Flt3L。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出所欲抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’) 2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv) 及抗原片段形成的多特異性抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干種可進一步分為亞類 (同型)，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ 及 μ。
「效應功能」係指彼等可歸屬於抗體 Fc 區、經分離 Fc 區或融合至另一蛋白質之 Fc 區的生物活性，其中 Fc 區隨源抗體之同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)；下調細胞表面受體 (例如B 細胞受體)；及 B 細胞活化。在某些實施例中，Flt3L-Fc 融合蛋白未展現任何效應功能或任何可檢測效應功能。在某些其他實施例中，相對於包含融合至具有 SEQ ID NO:12 之野生型 Fc 蛋白之本發明 Flt3L 蛋白的融合蛋白，Flt3L-Fc 融合蛋白展現實質上減低之效應功能，例如效應功能減低約 50%、60%、70%、80% 或 90%。
本文所用之「樹突細胞擴增」、「樹突細胞之擴增」或「樹突細胞之數量增加」係指，在活體外分析中或如在活體內實驗中所測量樹突細胞之數量有所增加。
藥劑例如醫藥調配物之「治療有效量」指代在必要之給藥劑量及時間段內有效實現所欲之治療或預防效果的量。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。在一個實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。
本文所用之「T 細胞活化」係指 T 淋巴球 (尤其細胞毒性 T 淋巴球) 之一種或多種細胞反應，其選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物之表現。本發明的 T 細胞活化雙特異性抗原結合分子能夠誘導 T 細胞活化。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用，指代已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括與自原始轉變細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性的突變子代細胞。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者為人類。
「經分離」蛋白質或多肽係自其自然環境的組分中分離出來的蛋白質或多肽。在一些實施例中，將蛋白質純化至大於 95% 或 99% 的純度，如藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如離子交換或反相 HPLC) 所測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人， J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
「分離」核酸指代已經與其天然環境之成分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「經分離之編碼抗 Flt3L-Fc 融合蛋白的核酸」係指編碼 Flt3L-Fc 融合蛋白之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨抗體中之該(等)核酸分子，且該(等)核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置處。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，定義為候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 是序列比對程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式比對中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 是 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 ％ 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 ％ 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 ％ 胺基酸序列同一值。
術語「醫藥調配物」指代以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不包含對調配物將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他成分。
「醫藥上可接受之載劑」指代醫藥調配物中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、安定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療 (treatment)」（及其語法變體，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」），係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，使用本發明之融合蛋白來延遲疾病之發生或減慢疾病之進展。
片語「治療有效量」係指本發明蛋白質用於以下用途的量：(i) 治療或預防特定疾病、病狀或病症，(ii) 減輕、改善或消除特定疾病、病狀或病症的一種或多種症狀，或 (iii) 預防或延遲如本文所闡述之該特定疾病、病狀或病症的一種或多種症狀的發作。就癌症而言，治療有效量之如本文所闡述之治療劑或藥劑組合可減少癌細胞數；減低腫瘤尺寸；抑制 (亦即在一定程度上減緩或較佳的是停止) 癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制 (亦即在一定程度上減緩或較佳的是停止) 腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上減輕與該癌症有關之症狀中的一者或多者。在如本文所闡述之治療劑或藥劑組合可預防生長及/或殺死現有癌細胞之程度上，其可為細胞抑制性的及/或細胞毒性的。對於癌症療法，可例如藉由評估疾病惡化時間 (TTP) 和/或確定緩解率 (RR) 來測量療效。
本文所用之術語「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長為特徵的生理病狀。「腫瘤」包含一種或多種癌性細胞。腫瘤包括實體腫瘤及液體腫瘤。癌症的實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、骨髓瘤及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌 (例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌 (包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌 (「NSCLC」)、肺腺癌及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃 (gastric or stomach) 癌 (包括胃腸道癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、大腸癌、直腸癌、結直腸癌、惡性腦腫瘤、黑色素瘤、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎 (kidney or renal) 癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、頭頸癌以及急性骨髓性白血病 (AML)。
本文所用之術語「冷腫瘤」或「免疫沙漠」係指具有低免疫原性或特徵在於不能充分誘發腫瘤特異性免疫性且抵抗免疫原性細胞毒性的癌性腫瘤。
如本文所用，術語「載體」指代能夠傳遞與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠引導與其操作性連接之核酸的表現。此等載體於本文中稱為「表現載體」。
Ⅱ 組成物及方法
A. 無效應 Fc 蛋白
在一方面，本發明提供具有令人吃驚地減低之效應活性的新穎無效應 IgG1 Fc 蛋白。本文所設計及闡述之 Fc 蛋白包含 SEQ ID NO:2 的胺基酸序列且亦在本文中稱為「FcNG2LH」或「Fc NG PVA#」。如本文所展示，與具有野生型 IgG1 Fc 域之蛋白質，FcNG2LH Fc 蛋白具有顯著減低之 ADCP 活性 (例如參見至少實例 1 及 10) 以及減低之巨噬球對細胞激素釋放的活化 (例如參見實例 1) 及減低之 ADCC 活性。亦應注意，相對於僅含 N297G 突變之 IgG1 Fc 域的熱穩定性，FcNG2LH 蛋白之熱穩定性會令人吃驚地增加。
除用於如本文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白中外，無效應 IgG1 Fc 域蛋白之設計可用於許多治療分子的背景中。例如，經設計以藉由將兩個或更多個分子 (例如細胞表面受體) 橋接至一起來結合及活化分子的抗體，靶向查核點抑制劑之抗體，具有至少一個結合至標靶分子且誘導 ADCC 及/或 ADCP 活性之臂的雙-或多特異性抗體。熟習此項技術者應瞭解使用本文所闡述之無效應 Fc 蛋白來生成融合蛋白，其中無效應 Fc 蛋白連接 (例如經由胺基酸鍵) 至第二蛋白質之 N-末端及/或 C-末端 (分別連接至無效應 Fc 蛋白之 C-末端及/或 N-末端)。第二蛋白質較佳係具有期望治療功能者。無效應 Fc 域可防止不良反應，例如由 IgG Fc 受體結合引起之嗜中性球增多症。治療蛋白領域需要繼續研發用以改善 Fc 效應功能之控制的方式。
在一方面，本發明提供其中重鏈恆定域包含SEQ ID NO:2 之 FcNG2LH 蛋白的抗體。在一些實施例中，本文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白包括免疫球蛋白及抗體。熟習此項技術者可易於構想各種可適應存在 NG2LH 突變及由此缺乏或降低效應功能且自其受益之抗原特異性抗體的形式。舉例而言，本發明之人類 IgG1 FcNG2LH 可為單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體的一部分。換言之，其可為包括或可包括 IgG1 Fc 域之任何免疫球蛋白結構。
B. 實例性 Flt3L-Fc 融合蛋白
在一方面，本發明提供結合至 Flt3 受體 (Flt3R) 之 Flt3L-Fc 融合蛋白，且其中 Fc 蛋白幾乎沒有效應功能或其效應功能遠小於野生型 Fc 蛋白。該等融合蛋白可用於經由各種癌症免疫療法治療方案來治療癌症，尤其在患者查核點抑制劑免疫療法並無反應或對查核點抑制劑免疫療法之反應有限的情形下。據信，在「冷腫瘤」或「免疫沙漠」中缺乏抗腫瘤免疫反應至少部分地係由於抗腫瘤 T 細胞反應之不足或缺乏。有效抗腫瘤 T 細胞反應需要藉由樹突細胞 (DC) 交叉呈現腫瘤抗原。
因此，增加癌症免疫療法之效能之一種方式係增加腫瘤內抗原呈現 DC 的數量。眾所周知，Flt3L 之部分功能在於經由前驅細胞之增殖、分化、發育及動員來增加受試者中的 DC。儘管已證實投予健康受試者之 Flt3L 蛋白可真正地擴增 DC 及造血幹細胞 (例如 Anandasabapathy 等人，2015, Bone Marrow Transplant., 50:924-930)，但一個問題係重組 Flt3L 在血液中之半衰期相對較短，此可導致治療效能較低及/或需要過頻繁地投藥。
用以延長治療蛋白之血清半衰期的成熟策略係使其連結或融合至免疫球蛋白 Fc 域 (例如經由肽鍵，較佳地在 Fc 蛋白之 N-末端處) (例如 Czajkowsky 等人，2012, EMBO, 4:1015-1028；Ha 等人，2016, Front Immunol, 7:394)。然而，在 Flt3L-Fc 融合蛋白用於例如癌症免疫療法之情形下，具有可原位活化許多及不可預測之免疫學或發炎性過程的功能性 Fc 域可能較為不利。實際上，重要的是最小化可產生細胞激素風暴或細胞激素釋放症候群 (CRS) 之投予的風險。另外，Flt3L-Fc 融合蛋白域之野生型 Fc 與免疫效應細胞上之 Fc 受體之間之相互作用可導致結合 Flt3L-Fc 融合蛋白的 DC 發生吞噬性破壞。可能重要的是，應最小化且由此控制 Flt3L-Fc 融合蛋白之 Fc 區之效應且同時維持由 Fc 區賦予的優點。本文闡述一種新無效應 IgG Fc 區且在本文中稱為「Fc-NG2LH」或「Fc-PVA# N297G」，其展示為具有令人吃驚地低之效應功能 (例如參見實例 7)，尤其在與例如野生型 IgG1 Fc、IgG1 Fc-N297G 及 IgG4 Fc 區比較時。此外，如實例 8 中所展示，引入 NG2LH 變異體可不可預測地增加 Fc 域之熱穩定性以及對動物血清中之半衰期的效應。
Flt3L-Fc 融合蛋白變異體之額外表徵展示，取代 Flt3L W144 會顯著增加免疫原性，如在活體外 T 細胞增殖分析中所測定，從而表明去除 Flt3L (SEQ ID NO:21) 之位置 149 處的潛在氧化傾向可有害於治療性無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白產物。然而，與之相比，實例 9 展示，位置 149 及 151 處之潛在醣基化位點的取代並不增加免疫原性，如藉由活體外 T 細胞增殖分析所測定，從而表明該等及其他位置處之該等突變可適於製造 Flt3L-Fc 融合蛋白。
重要的是，活體內投予不同劑量之如本文所揭示的無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白會大大擴增樹突細胞 (例如參見實例 5)。此外，可證實，DC 擴增程度遠大於使用等效劑量之 CDX-301 所觀察者。
Flt3L-Fc 融合蛋白包含連接至 IgG1 Fc 區之 Flt3 配位體 (Flt3L) 蛋白，其中相對於融合至野生型 IgG1 Fc 的相同 Flt3L，該 IgG1Fc 之效應功能減低或無效應功能。Flt3L-Fc 融合蛋白之 Flt3L 部分可結合至細胞表面 Flt3 受體 (Flt3R)。Flt3L 蛋白之序列在基因庫登錄號 P49771 中 (在本文中提供為 SEQ ID NO:21) 闡述為長度為 235 個胺基酸之蛋白質形式，且具有在大約殘基 1-26 內延伸之訊息肽及在大約殘基 185-205 內延伸的跨膜域。殘基 29-159 在基因庫記錄中闡述為 Flt3 配位體，而 Savvides 等人 (Nat Struct Bio, 7:486-491) 陳述，僅殘基 27-160 已展示足以達成生物活性。在一些實施例中，本發明構想包含 SEQ ID NO:21 之殘基的 Flt3 配位體域，其中 N-末端為 SEQ ID NO:21 之位置 24 至 30 處之任何胺基酸殘基且 C-末端為 SEQ ID NO:21 之位置 167-190 處的任何胺基酸殘基。儘管 Savvides 等人 (同上) 展示包含僅殘基 27-160 (且組態為二聚體) 之多肽足以達成配位體之功能活性，但下文實例 2 中所闡述之研究展示，在 N-末端止於 SEQ ID NO:21 之殘基 167 的所用 Flt3L 蛋白例如共價連接至 Fc N-末端殘基 (關於 SEQ ID NO:13)。應理解，亦在本發明中構想 Flt3L 變異體，例如包含與 SEQ ID NO:21殘基 27-167 具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性之蛋白質序列的成熟 Flt3L 蛋白。本文 (例如下文之實例 3) 展示，融合至 Fc 蛋白之 Flt3 之片段大小可對融合蛋白的聚集具有顯著影響。
在一方面，本發明提供一種 Flt3L-Fc 融合蛋白，其包含含有與 SEQ ID NO:21 之殘基 27-167 至少 95% 相同之胺基酸序列之 Flt3L 蛋白及與 SEQ ID NO:13 至少 95% 相同的 IgG Fc 分子。IgG Fc 分子之 Fc 效應功能弱於野生型 IgG1 Fc 多肽 (SEQ ID NO:12)，其中 Fc 效應功能係選自 CDC、ADC、ADCC 及/或 ADCP。在一些實施例中，IgG Fc 分子之 ADCP 活性弱於野生型 IgG1 Fc 多肽。不受限於理論，據信，Fc(NG2LH) 蛋白之效應功能極低係因為在 Fc(NG2LH) 蛋白之下鉸鏈中存在 N297G 突變 (在 SEQ ID NO:13 之位置 76 處) 及胺基酸 PVAGP (SEQ ID NO:13 之殘基 13-17) 的獨特組合。
a) 取代、插入和刪除變異體
在某些實施例中，提供具有一個或多個胺基酸取代的蛋白質變異體。保守取代列於表 1 之「較佳取代」標題下。表 1 中之「示例性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入所關注融合蛋白中，並篩選具有期望活性 (例如降低的免疫原性或降低的 ADCP) 之產物。
表 1
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N-末端甲硫胺醯基殘基的 Flt3L-Fc 融合蛋白。Flt3L-Fc 融合蛋白分子之其他插入變異體包括與 Flt3L-Fc 融合蛋白的 N-末端或 C-末端融合的酶 (例如對於 ADEPT) 或增加 Flt3L-Fc 融合蛋白之血清半衰期的多肽。
b) 醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文所提供之 Flt3L-Fc 融合蛋白以增加或降低Flt3L-Fc 融合蛋白之Fc 部分的醣基化程度。可藉由改變胺基酸序列以便產生或去除一個或多個醣基化位點來方便地向 Fc 域中添加或刪除醣基化位點。
對於 Fc 區而言，可改變與其附接的碳水化合物。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人， TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露醣、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳醣及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明之 Flt3L-Fc 融合蛋白中的寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質的無效應 Fc 變異體。
在一實施例中，提供具有缺乏附接 (直接或間接) 至 Fc 區之岩藻醣之碳水化合物結構的 Fc 融合變異體。例如，岩藻醣之量可為 1% 至 80%、1% 至 65%、5% 至 65% 或 20% 至 40%。 藉由計算 Asn297 醣鏈中岩藻醣的平均含量來測定岩藻醣相對於藉由 MALDI-TOF 質譜術測得的連接至 Asn 297 的所有醣結構（例如，複合物、雜合和高甘露醣結構）的總和之含量，例如，WO 2008/077546 中所述。Asn297 是指位於 Fc 區位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區殘基的 Eu 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此類岩藻醣基化變異體可具有改善的 ADCC 功能。參見例如美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.)；US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺乏」抗體變異體相關的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki 等人 ， J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等人 ， Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；美國專利申請號 US 2003/0157108 A1，Presta, L；及 WO 2004/056312 A1，Adams 等人，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人， Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)；Kanda, Y. 等人， Biotechnol. Bioeng，94(4):680-688 (2006)；及 WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分之寡醣的 Fc 變異體，例如，其中附接至融合蛋白之 Fc 區的雙觸角寡醣被 GlcNAc 平分。該等 Fc 變異體可具有減少的岩藻醣基化及/或改良的 ADCC 功能。此等抗體變異體的實例描述於例如：WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國第 6,602,684 號專利 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana 等人)。亦提供在寡醣中具有至少一個附接至 Fc 區之半乳醣殘基的 Flt3L-Fc融合蛋白變異體。該等 Flt3L-Fc 融合蛋白 (及由此 Fc) 變異體可具有改良之 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087 (Patel 等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.) 及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。
c) 蛋白質衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供之無效應 Fc 蛋白、包含無效應 Fc 蛋白之抗體或融合蛋白或 Flt3L-Fc 融合蛋白以含有業內已知且易於獲得的其他非蛋白質性部分。適用於 Flt3L-Fc 融合蛋白之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。附接至 Fc-融合蛋白的聚合物之數量可有所變化，且若附接之聚合物超過一種，則其可為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，該等考慮因素包括但不限於擬改良之 Flt3L-Fc 融合蛋白的特定性質或功能、Flt3L-Fc 融合蛋白衍生物是否將用於指定條件下的療法中等。
在另一實施例中，提供可藉由暴露於輻射而選擇性加熱之 Flt3L-Fc 融合蛋白及非蛋白質性部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為奈米碳管 (Kam 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA102: 11600-11605，2005)。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質性部分加熱至接近融合蛋白-非蛋白質性部分的細胞被殺死之溫度的波長。
C. 重組方法和組成物
可使用熟習此項技術者易於已知之重組方法及組成物來產生 Flt3L 融合蛋白。在一實施例中，提供編碼本文所闡述之 Flt3L-Fc 融合蛋白的經分離核酸。該核酸可編碼包含 Flt3L-Fc 融合蛋白之 Flt3L 及 Fc 部分的胺基酸序列。在一進一步實施例中，提供一個或多個包含此核酸之載體 (例如，表現載體)。在一進一步實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在此實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 包含核酸之載體，該核酸編碼本發明之 Flt3L 多肽及 Fc 多肽。在較佳實施例中，編碼 Flt3L 多肽之核酸位於編碼 Fc 多肽的核酸上游。此外，2 種核酸位於單一操縱子中。 在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一實施例中，提供製備 Flt3L-Fc 融合蛋白之方法，其中該方法包含在適於表現 Flt3L-Fc 融合蛋白的條件下培養包含如上文所提供編碼 Flt3L-Fc 融合蛋白的核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收該 Flt3L-Fc 融合蛋白。
在重組生產 Flt3L-Fc 融合蛋白時，將例如如上文所闡述編碼 Flt3L-Fc 融合蛋白之核酸分離並插入一個或多個載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可易於使用習用程序 (例如藉由使用能夠與編碼融合蛋白的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 分離並定序。
用於選殖或表現無效應 Fc 蛋白、含有 Fc 蛋白之抗體或融合蛋白或例如 Flt3L-Fc 融合蛋白編碼載體之適宜宿主細胞包括本文所闡述的原核細胞或真核細胞。例如，Flt3L-Fc 融合蛋白可在細菌中產生，尤其在無需醣基化及 Fc 效應功能時。關於多肽在細菌中之表現，例如參見美國專利第 5,648,237 號、第5,789,199 號及第 5,840,523 號。(另見 Charlton， Methods in Molecular Biology ，第 248 卷(B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在 大腸桿菌中之表現。)在表現之後，Flt3L-Fc 融合蛋白可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可進一步純化。
除原核生物外，真核微生物 (例如絲狀真菌或酵母) 亦係用於 Flt3L-Fc 融合蛋白編碼載體的適宜選殖或表現宿主，包括其醣基化路徑已被「人源化」以產生具有部分或完全人類醣基化模式的 Flt3L-Fc 融合蛋白的真菌及酵母菌株。參見：Gerngross， Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004)；及 Li 等人， Nat. Biotech.24:210-215 (2006)。
用於表現醣基化 Flt3L-Fc 融合蛋白的適宜宿主細胞亦衍生自多細胞生物 (無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多桿狀病毒毒株，其可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾 ( Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。 參見例如美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述了在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIES TM技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham 等人， J. Gen Virol.36:59 (1977) 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather， Biol. Reprod.23: 243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人， Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR -CHO 細胞 (Urlaub 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu， Methods in Molecular Biology ，第 248 卷(B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，第 255-268 頁 (2003)。
D. 分析
可藉由業內已知的各種分析對本文所提供可有利於擴增 DC 之 Flt3L-Fc 融合蛋白的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
E. 免疫結合物
本發明亦提供包含本文之 Flt3L-Fc 蛋白的免疫結合物，該蛋白結合至一種或多種細胞毒性劑，例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素 (例如蛋白毒素、來源於細菌、真菌、植物或動物之酶活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一個實施例中，Flt3L-Fc 蛋白之免疫結合物係以類似於生成抗體-藥物結合物 (ADC) 的方式來生成，其中抗體與一種或多種藥物結合，該等藥物包括但不限於美登木素生物鹼 (參見美國專利第 5,208,020 號、第 5,416,064 號及歐洲專利 EP0425235B1)；澳瑞他汀，諸如單甲基澳瑞他汀藥物部分 DE 及 DF (MMAE 及 MMAF) (參見美國專利第 5,635,483 號及第 5,780,588 號及第 7,498,298 號)；尾海兔素；加利車黴素(calicheamicin) 或其衍生物 (參見美國專利第 5,712,374 號、第 5,714,586 號、第 5,739,116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號及第 5,877,296 號；Hinman 等人， Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993)；及 Lode 等人， Cancer Res. 58: 2925-2928 (1998))；蒽環類藥物，諸如 道諾黴素或多柔比星 (參見 Kratz 等人， Current Med. Chem. 13: 477-523 (2006)；Jeffrey 等人， Bioorganic & Med. Chem. Letters16: 358-362 (2006)；Torgov 等人， Bioconj. Chem. 16: 717-721 (2005)；Nagy 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA97: 829-834 (2000)；Dubowchik 等人， Bioorg. & Med. Chem. Letters12: 1529-1532 (2002)；King 等人， J. Med. Chem.45: 4336-4343 (2002)；及美國專利第 6,630,579 號)；胺甲蝶呤；長春地辛；紫杉烷類，諸如多西他賽、紫杉醇、拉洛紫杉醇、特賽紫杉醇及奧他紫杉醇；單端孢黴烯；及 CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含結合至酶活性毒素或其片段的如本文所闡述之 Flt3L-Fc 蛋白，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜抑制劑、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、米托菌素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴烯族毒素。
在另一實施例中，免疫結合物包含結合至放射性原子以形成放射性結合物的如本文所闡述之 Flt3L-Fc 蛋白。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括 At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32、Pb 212及 Lu 之放射性同位素。當放射性共軛體用於檢測時，它可能包含用於閃爍掃描研究之放射性原子，例如，tc99m 或 I123，或用於核磁共振 (NMR) 成像 (亦稱為磁共振成像，mri) 之自旋標記物，例如，碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
Flt3L-Fc 蛋白及細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑進行製備，該等雙功能蛋白偶合劑為例如 N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (例如己二酸二甲酯HCl)、活性酯 (例如雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛 (例如戊二醛)、雙疊氮化合物 (例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物 (例如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (例如甲苯 2,6-二異氰酸酯) 及雙活性氟化合物 (例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如 Vitetta 等人， Science238:1098 (1987) 中所闡述進行製備。用於將放射性核苷酸結合至抗體的一種例示性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接子、二甲基連接子或含雙硫鍵之連接子 (Chari 等人， Cancer Res.52:127-131 (1992)；美國專利第 5,208,020 號)。
本文之免疫結合物明確考慮但不限於該等使用交聯試劑製得的結合物，該等交聯試劑包括但不限於可商購獲得 (例如自 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 及磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。
F. 醫藥調配物
藉由混合具有期望純度的蛋白質與一種或多種可選之醫藥上可接受之載劑來製備如本文所闡述 Flt3L-Fc 融合蛋白的呈凍乾調配物或水溶液形式的醫藥調配物 ( Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol, A. 編輯 (1980))。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露醣或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；醣，例如蔗醣、甘露醇、海藻醣或山梨醣醇；成鹽相對離子， 例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，例如，可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX ®，Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一方面，sHASEGP 與一種或多種附加的醣胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
本文所述之調配物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。舉例而言，可期望 進一步提供樹突細胞成熟因子及/或佐劑。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜實例包括含有 Fc 融合蛋白的固體疏水聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品的形式，例如膜或微膠囊。
用於 體內投予的調配物通常是無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。
G. 治療方法和組成物
本文所提供之任何 Flt3L-Fc 蛋白皆可用於治療方法中。
在一方面，提供用作藥物的 Flt3L-Fc 蛋白。在其他方面，提供用於癌症中之 Flt3L-Fc 蛋白。在某些實施例中，提供用於治療方法中的 Flt3L-Fc 蛋白。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有癌症之個體的方法中的Flt3L-Fc 蛋白，該方法包含向該個體投予有效量之 Flt3L-Fc 蛋白。在一個此類實施例中，該方法復包括將有效量之至少一種另外治療劑 (例如下文所述) 投予至個體。在其他實施例中，本發明提供用於擴增樹突細胞之 Flt3L-Fc 蛋白。在某些實施例中，本發明提供用於擴增個體中之樹突細胞之方法中的 Flt3L-Fc 蛋白，該方法包含向個體投予有效的 Flt3L-Fc 蛋白以擴增樹突細胞。根據上述任一實施例的「個體」較佳地為人。
在又一方面，本發明提供 Flt3L-Fc 蛋白在藥物的製造或製備中的用途。在一實施例中，該藥物用於治療癌症。在又一實施例中，該藥物用於治療癌症的方法中，該方法包含向患有癌症的個體投予有效量之藥物。在一個此類實施例中，該方法復包括將有效量之至少一種另外治療劑 (例如下文所述) 投予至個體。在另一實施例中，該藥物係用於擴增樹突細胞。在又一實施例中，該藥物係用於擴增個體中的樹突細胞的方法中，該方法包括向該個體投予有效量的藥物以擴增樹突細胞。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在又一方面，本發明提供治療癌症的方法。在一實施例中，該方法包含向患有該癌症的個體治療有效量之 Flt3L-Fc 蛋白。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在又一方面，本發明提供擴增個體中之樹突細胞的方法。在一實施例中，該方法包含向個體投予有效量之 Flt3L-Fc 蛋白以擴增樹突細胞。在一個實施例中，「個體」為人。
在又一方面，本發明提供包含本文所提供之任一 Flt3L-Fc 蛋白的醫藥調配物，其例如用於上述治療方法中之任一者。在一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任一 Flt3L-Fc 蛋白及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之任一 Flt3L-Fc 蛋白及至少一種其他治療劑 (例如如下文所闡述)。
本發明之 Flt3L-Fc 蛋白可單獨或與其他藥劑組合用於治療中。例如，本發明之 Flt3L-Fc 蛋白可與至少一種其他治療劑共投予。
上文述及之該等組合療法涵蓋組合投予 (其中兩種或更多種治療劑包括在同一或單獨的調配物中)；以及單獨投予，在該情形下，本發明之 Flt3L-Fc 蛋白的投予可在投予一種或多種其他治療劑之前、同時及/或之後發生。在一實施例中，投予 Flt3L-Fc 蛋白及投予其他治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。本發明之 Flt3L-Fc 蛋白亦可與放射療法組合使用。
本發明之 Flt3L-Fc 融合蛋白 (及任何其他治療劑) 可藉由任何適宜方式投予，包括非經腸、肺內及鼻內投予，並且若期望局部治療，則可採用病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。投藥可藉由任何適宜途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，此部分地取決於短暫投予抑或長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本發明之 Flt3L 融合蛋白將按照與良好醫學實踐一致的方式進行調配、投用及投予。在此背景中，考慮因素包括所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、個別患者的臨床狀況、病症的病因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予排程及醫療從業者已知的其他因素。Flt3L-Fc 融合蛋白並非必須、但可視情況與一種或多種目前用於預防或治療所論述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑的有效量取決於存在於調配物中的 Flt3L-Fc 融合蛋白量、病症或治療的類型以及上文所論述的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明的 Flt3L-Fc 融合蛋白的適當劑量 (在單獨使用或與一種或多種其他額外治療劑組合使用時) 將取決於擬治療疾病的類型、Flt3L-Fc 融合蛋白的類型、疾病的嚴重程度及病程、為了預防抑或治療目的投予 Flt3L-Fc 融合蛋白、先前療法、患者的臨床病史及對該 Flt3L-Fc 融合蛋白的反應以及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予 Flt3L-Fc 融合蛋白。端視疾病的類型和嚴重程度，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1 mg/kg – -10 mg/kg) 的 Flt3L-Fc 融合蛋白可為例如藉由一次或多次分開的投予或藉由連續輸注來投予患者的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病狀而定，治療通常將持續至出現期望的疾病症狀阻抑。Flt3L-Fc 融合蛋白之一實例性劑量將在約 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可向患者投予約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任何組合)。該等劑量可間歇投予，例如每週或每三週投予 ( 例如，使患者接受約 2 個至約 20 個或 例如約 6 個劑量的融合蛋白)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。然而，可以使用其他劑量方案。
應理解，上述任一調配物或治療方法皆可使用本發明之免疫結合物來代替或補充 Flt3L-Fc 融合蛋白來進行。
H. 製品
在本發明之另一方面，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之 Fc 融合蛋白。標籤或包裝插頁指示，該組成物可用於治療所選病狀。此外，該製品可包含 (a) 其中含有組成物的第一容器，其中組成物包含本發明之 Fc 融合蛋白；及 (b) 其中含有組成物的第二容器，其中組成物包含另一細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
應理解，上述任一製品皆可包括本發明之免疫結合物以代替或補充Flt3L-Fc 融合蛋白。
III. 實例
下文為本發明之方法及組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。
實例 1. 無效應 Fc 蛋白之設計
術語「NG2LH」係指包含 IgG1 N297G 取代且使用人類 IgG2 之殘基 233-236 (PVA；在位置 236 處無胺基酸，亦在本文中稱為「PVA#」) 「交換」 IgG1 之下鉸鏈殘基 233-236 (ELLG, SEQ ID NO:19) 的人類 IgG1 Fc 域，其中位置係根據如由 Kabat 所闡述之 EU 索引進行編號。首先在全長抗體之背景中展示 NG2LH Fc 變異蛋白 (亦在本文中稱為「PVA# NG」) 的無效應性質，且與野生型、N297G 及其他 Fc 變異 IgG1’以及 IgG2 及 IgG4 抗體 (如下文之 表 2中所定義) 進行比較。
表 2
SEQ ID NO: 重鏈恆定區 (CH1 – CH3) 之說明 取代 (EU 編號)
2 IgG1 NG2LH，亦稱為 IgG1 NG PVA# N297G/E233P/L234V/L235A/G236#
3 IgG1 NG N297G
4 IgG1 PVA# E233P/L234V/L235A/G236#
5 IgG1 NG PVA# G N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G
6 IgG1 NG PVA# GSS N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G/A330S/P331S
7 IgG1 PG P329G
8 IgG1 LALA L234A/L235A
9 IgG1 LALAPG L234A/L235A/P329G
構築包含表 2 中所列示重鏈恆定區 (CH1-CH3) 之全長抗體，其編碼抗 Her2 抗體 (曲妥珠單抗 (trastuzumab) (HERCEPTIN®，建南德克公司，South San Francisco, Calif., USA) (亦參照美國專利第 6,407,213 號及 Lee 等人，J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93；在本文中為 SEQ ID NO:47) 之輕鏈及重鏈可變區及域。該等抗 Her2 抗體之輕鏈包含天然人類 Cκ 恆定區。將編碼全長輕鏈及各個全長重鏈之核酸選殖至 pRK 哺乳動物表現載體中 (Eaton 等人，1986, Biochemistry 25:8343-47)。在 CHO 細胞中共表現輕鏈及重鏈核酸載體，且經由蛋白質 A 親和層析純化抗體，隨後實施粒徑篩析層析。
然後使用原代巨噬球及過度表現 Her2 之 SK-BR-3 人類乳癌細胞系(ATCC® HTB-30) 測試抗體對抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 及抗體依賴性細胞激素釋放 (ADCR) 的效應。使用抗 gD 抗體作為陰性對照抗體。自供體 PBMC 分離單核球並使用 25 ng/ml 人類 MCSF-1 進行刺激，且在 T-175 組織培養燒瓶中經 5-7天 使其分化成巨噬球。在 ADCP 及細胞激素釋放實驗前一天，使用 50 ng/ml IFNγ (R&D Systems 285-IF-100/CF) 刺激所有巨噬球以分成成 M1 巨噬球。藉由 accutase (Millipore SCR005) 處理來收穫巨噬球及 SK-BR-3 GFP 細胞。將所取出巨噬球及 SK-BR-3 細胞分別以 2×10 6及 0.5×10 6個細胞/ml 之濃度再懸浮於培養基 (X-Vivo 10； Lonza 04-743Q, 10% HI FBS; Gibco 10438-026) 中。設計 96-孔板圖以確定測試條件 (抗體變異體及處理濃度)。在培養基中製備每一抗體變異體之 2X 連續稀釋液 (6 點 10 倍稀釋系列：2000、200、20、2、0.2、0.02 ng/ml)。遵循板圖，將 50 ul 巨噬球及 50 ul SK-BR-3 添加至每一孔中，從而在每一孔中產生 100k 巨噬球及 25k SK-BR-3 細胞。根據板圖將 100 uL 2X 抗體連續稀釋溶液合併至 96-孔板之孔中。最終抗體處理濃度為 1000、100、10、1、0.1、0.01 ng/ml。將 100 uL 培養基添加至 3 個含有巨噬球及 SK-BR-3 細胞之孔中作為「僅培養基」對照處理。使 96-孔板在 20 × g 下離心 2 min，然後在 37℃ 下培育約 24 h。將細胞在 400 × g 下離心 4 min 且收集上澄液以藉由 Luminex Reader Millipore Multiplex 分析 ADCR。藉由 accutase 處理自孔取出細胞。使用 200 ul FACS 緩衝液 (BD, 554657) 將每一孔中之細胞洗滌一次。使用與 Alexa 647 (Invitrogen, Alexa Fluor 647 抗體標記套組，A20186) 結合之抗 CD11b (BD, 555385) 及抗 CD14 (BD, 555396) (於 FACS 緩衝液中之 1:100 抗體結合物) 製備染色溶液。將 50 uL 染色溶液添加至所有孔中並在 4℃ 下培育 30 - 60 min。使用 FACS 緩衝液 (200 ul/孔) 將細胞洗滌兩次。將每一孔中之細胞再懸浮於 50 ul FACS 緩衝液中。藉由 FACS 分析一個細胞板之 ADCP 效率。使用軟體 FlowJo 分析 FACS 資料。根據正向及側向散射繪圖來圈選細胞，然後對 GFP-表現 (Y 軸) 及 Alexa 647 (X 軸) 進行繪圖。計算每一象限中之細胞百分比。SK-BR-3 細胞主要位於象限 1 中 (Q1, GFP 陽性) 且巨噬球主要位於象限 3 中 (Q3, Alexa 647 陽性)。每一孔之吞噬作用 % 計算如下： 吞噬作用 % = 100% - (每一孔之 Q1)/( 3 個僅培養基對照孔之平均 Q1) 將抗體變異體之吞噬作用 % 針對抗體處理濃度繪圖。
藉由 Luminex (Luminex Corp) 分析兩個板。如 圖 1中所展示，在遞增濃度之 LALAPG 或 NGLH2 Fc 抗 Her2 抗體存在下，幾乎觀察不到吞噬作用。使用 IgG1 野生型及 IgG4 抗體變異體觀察到最高程度之 ADCP。針對 IgG2 野生型 Fc 及 IgG1 PVA# Fc 觀察到中間程度之吞噬作用。因此， 圖 1展示，IgG1 NG2LH 及 IgG1 LALAPG Fc 域在活體外分析中缺乏 ADCP 活性。該實驗展示，在 IgG1 NG PVAG 及 IgG1 NG PVA# GSS 存在下以類似方式缺乏 ADCP 活性(資料未展示)。
ADCP 分析之細胞激素釋放型態的結果提供於 圖 2A-2J中。與吞噬作用資料一致，該等結果證實，與天然 IgG1、IgG4 及 (在較小程度上) N297G 不同，NG2LH 變異體在標靶細胞存在下並不介導巨噬球之 ADCR。
該等資料與變異體同野生型 IgG1 Fc 相比之 ADCC 報告基因分析的資料形成對比。使奧克利珠單抗 (ocrelizumab) (抗 CD20) 或曲妥珠單抗 (抗 Her2) 之可變域融合至上述野生型及變異域並在 ADCC 分析中進行測試。在此分析中，將 NK 細胞改造為 NFAT-RE-螢光素酶報告基因細胞，讀出 RcγRIIIa 結合，然後在 WIL2S CD20+ 細胞或 SkBr3 Her2+ 細胞存在下進行分析。對於具有野生型或變異域之抗 CD20 及抗 Her2 構築體而言，與野生型 IgG1 Fc 相比，所有非野生型 Fc 分子皆具有最小活性 (參見 圖 2K 及 2L)。
實例 2.Flt3L Fc 融合蛋白之設計
使用常規核酸選殖、蛋白質表現及蛋白質純化技術來生成 Flt3L-Fc 融合蛋白。
使用 PCR 擴增含有編碼期望嵌合 Flt3L-Fc 蛋白 (參見表 3，SEQ ID NOS:10-31) 之 Flt3L 及 Fc 部分之核苷酸序列的 cDNA。為表現及產生表 3 中所闡述之 Flt3L-Fc 蛋白 (序列提供於表 10 中)，生成包括人類 Flt3L 之天然訊息序列 (基因庫登錄號 P49771 之殘基 1-27；SEQ ID NO:21) 的cDNA。作為一實例，用於表現 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 蛋白之所生成 cDNA 包含編碼具有 Flt3L 訊息序列(如在表 10 中提供為 SEQ ID NO:45) 之融合蛋白的 cDNA 序列。
表 3
SEQ ID NO: 構築體名稱
25 hFLT3L.P168.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
26 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
27 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1
28 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG
29    hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.PVA#
30 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.LALAPG
31 hFLT3L.P167.7aa.hinge.hIgG4
32 hFLT3L.P166.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
33 hFLT3L.L165.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
34 hFLT3L.L164.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
35 hFLT3L.C158.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
36 hFLT3L.P179.hIgG1.N297G
37 hFLT3L.Q159.hIgG1.N297G
38 hFTL3L.C158.3aa.hinge.hIgG1.NG.PVA#
39 hFTL3L.C158.no.hinge.hIgG1.NG.PVA#
40 hFTL3L.D161.no.hinge.hIgG1.NG.PVA#
41 hFTL3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA#
42 Hs_FLT3LG.M1-L165.W144D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
43 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
44 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151E.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH
46 Flt3L-Fc(IgG4)
將編碼 Flt3L-Fc 融合體之 cDNA 亞選殖至哺乳動物表現載體 pRK5 中(Gorman 等人，DNA and Protein Engineering Techniques 2:1 (1990)；美國專利第 6,232,117 號) 並在 CMV 啟動子之控制下加以表現。
使用期望表現構築體瞬時轉染 CHO 或 HEK293 細胞，在適當培養基中分別生長 10 天或 6 天，並收穫以供純化。
使用 HiTrap MabSelect SuRe 親和捕獲層析 (GE) 純化 Flt3L-Fc 融合構築體，隨後實施 Superdex 200 SEC，且最後濃縮並經由透析進行緩衝液交換。
實例 3.Flt3L-Fc 融合蛋白之表徵
針對溶液中之聚集易感性以及雙硫鍵之減少及損失來表徵如實例 2 中所闡述生成的融合蛋白，其中之每一者係藉由 SDS-PAGE (3-5 ug/孔) 及 HPLC SEC (SuperDex 200；平衡緩衝液：200 mM 精胺酸、137 mM 琥珀酸，pH 5.0) 來分析。使用自 CHO 細胞培養物純化之 Flt3L-Fc 融合蛋白執行之實驗的資料匯總於下文之表 4 中，其中表現於 CHO 細胞及 HEK293 細胞中並自其純化之 Flt3L-Fc 融合構築體 hFLT3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# (SEQ ID NO:41) 的實例性資料展示於 圖 3A-3C中，且表現於 CHO 細胞及 HEK293 細胞中並自其純化之 Flt3L-Fc 融合構築體 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# (SEQ ID NO:26) 的資料展示於 圖 3D-3F中。
表 4
SEQ ID NO: 構築體 聚集 % 不完整鉸鏈二硫化物
25 hFLT3L.P168.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 24 ND*
26 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 26 ND
32 hFLT3L.P166.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 26 +
33 hFLT3L.L165.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 33 ++
34 hFLT3L.L164.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 35 +++
35 hFLT3L.C158.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 86 ++++
38 hFTL3L.C158.3aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 90 +++
39 hFTL3L.C158.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# 77 ++
41 hFTL3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# 85 ++++
* ND =未檢測
上文表 4 中所匯總之變異體的資料分析展示，存在於 Flt3L 分子之最後半胱胺酸與 Fc(NG2LH) 分子之第一半胱胺酸之間之胺基酸殘基的數量 (接點長度) 可影響聚集程度及/或雙硫鍵形成。在接點長度小於 14 個殘基時，每一構築體之高達 30% 表現為缺乏分子間鉸鏈二硫化物。5 個胺基酸殘基或更小之接點長度會產生極高聚集。 針對 SEQ ID NO. 24、26、32、33 及 34 之融合蛋白觀察到最低聚集程度。針對 SEQ ID NO. 25、26 及 32 之融合蛋白觀察到不完整鉸鏈二硫化物鍵結的最低程度，且 SEQ ID NO. 33 及 39 亦具有相對較低含量之不完整鉸鏈二硫化物。考慮到 Flt3L 蛋白及 Fc 蛋白之結構已充分表徵且顯示能夠作為獨立域進行折疊，故本文所觀察之資料略顯意外。然而，應注意，每一蛋白質域含有對於二硫化物鍵結及結構完整性較為重要之半胱胺酸殘基。因此，資料展示，Flt3L-Fc(NG2LH) 融合分子之設計需要仔細評價蛋白質產物以確保充分共價 Fc-二聚合及最小或缺乏聚集。
實例 4.Flt3L 活性之活體外功能分析
進行活體外分析以評價 Flt3L-Fc 融合蛋白之功能性質且與 Flt3L 蛋白 (無 Fc 融合；SEQ ID NO:23) 的功能進行比較。可使用如本文所闡述執行之活體外分析來測量 Flt3L 蛋白誘導表現 Flt3 受體之人類細胞系發生增殖的功效。
使用 100 uL 聚-L-鳥胺酸 (Cat#A-004-C EMD Millipore) 將 Costar 96-孔平底板 (Cat#3610 Thermo Fisher) 在室溫下塗覆過夜，使用 PBS 洗滌 3 次並進行乾燥。將人類 OCI-AML5 細胞 (No. ACC 247, DSMZ) 以 3000 個細胞/孔接種於 100 uL分析培養基 (RPMI 1640，含有 5% 熱滅活 FBS、1X Glutamax) 中。將 Flt3L 測試物品在分析培養基中稀釋至 20 ug/mL 並以 1:10 連續稀釋。將 100 uL 經稀釋測試物品添加至每一孔 (三重複) 中以達成 10 ug/mL 之最終起始濃度。最大及最小對照孔包括 10 ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH (SEQ ID NO:26) 或僅分析培養基。將分析板在 37℃、5% CO 2下培育 7 天。自每一孔去除 100 uL 上澄液且然後將 100 uL Cell Titer Glo (Cat#PR-G7572 Thermo Fisher) 添加至每一孔中且將板於暗處培育 8-10 min。使用 SpectraMax i3 讀板儀 (Molecular Devices) 測量發光。將原始值標準化至最大及最小對照孔。使用 XLfit (IDBS) 將每一測試物品之劑量反應繪圖並使用 4 參數邏輯曲線測定 EC 50值。使用 GraphPad Prism 7 生成 圖 4A-4B中所展示之圖形。
該等資料展示，hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 及 gCDX-301 皆在活體外誘導 OCI-AML5 細胞之劑量依賴性增殖。平均 EC 50功效值係相當的：hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 為 2.5±0.5 pM；gCDX-301 為 2.3±0.5 pM。此外，hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 及 gCDX-301 可在活體外以至少等效功效誘導 OCI-AML5 細胞之增殖。
實例 5. 小鼠中之 PKPD 研究
考慮到免疫系統之複雜性，在可提供此人類 Fc 分子之資訊的哺乳動物受試者中展示藥效動力學可能較為重要。使用如本文所闡述之小鼠來執行 PK/PD 研究。
該研究係由建南德克公司之機構動物護理與使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee) 核準且使用 SCID 小鼠來實施。將動物分成 3 組。分別以 0.1 mg/kg、1.0 mg/kg 及 10 mg/kg 向組 1、2 及 3 中之動物給予 FLT3L-Fc (SEQ ID NO:37--Flt3L.Q159.Fc.NG)。在所選時間點收集全血以用於藉由 FACS 測定細胞群體計數。收集血漿並使用 huFlt3L ELISA 分析以測定每一樣品中之測試物品的量。
組平均 PK 參數匯總於下文之表 5中。
表 5
標稱劑量 Cmax (ug/mL) Cmax/劑量 (ug/mL)/(mg/kg) AUCinf (ug/ml*天) AUCinf/劑量 (ug/mL*天)/(mg/kg) CL (mL/天/kg)
0.1 mg/kg 2.68 26.8 4.42 22.6 22.6
1 mg/kg 27.9 27.9 77.9 77.9 12.8
10 mg/kg 273 27.3 768 76.8 13
表 5 中所報告之 NCA 參數包括 C max(第一劑量後之所觀察最大血清濃度)；C max/劑量 (劑量標準化之 C max)；AUC inf(自第 0 天至無窮時間之血清濃度−時間曲線下面積)；AUC inf/劑量 (劑量標準化之 AUC)；及 CL (使用血清濃度−時間曲線計算之清除率)。
結果以圖解方式呈現於 圖 5中。
在組 1-3 中，C max幾乎隨劑量成比例增加。觀察到超出 AUC 劑量比例性增加之部分，從而表明標靶調介之藥物處置 (TMDD) 會影響所有劑量組中的 PK 型態。另外，據觀察，總清除率 (CL) 具有劑量‑依賴性，從而指示了標靶‑調介之 CL
周邊血樣之平均單核球及 DC 計數展示於 圖 6A(單核球) 及 圖 6B(DC) 中。在所有三個組中，在 0.1-10 mg/kg 下於周邊血中觀察到穩定劑量依賴性細胞擴增。DC 擴增之初始動力學在各劑量之間類似，而擴增持續時間為劑量/暴露依賴性。
實例 6. 食蟹猴中之 PKPD 研究
使用不同劑量之投予食蟹猴的 Flt3L-Fc (NG2LH) 蛋白 (SEQ ID NO:26) 來執行額外 PKPD 研究。在查理士河實驗室 (Charles River Laboratories) (Reno, NV) 處使用初始食蟹猴來實施此研究。將動物分成 4 組 (2 隻雄性及 1 隻雌性/組)。以 10 mg/kg 向組 1 中之動物給予抗 gD (具有 N297G 突變之抗醣蛋白 D 人類 IgG1 抗體)，而分別以 0.1 mg/kg、1.0 mg/kg 及 10 mg/kg 向組 2、3 及 4 中之動物給予 FLT3L-Fc。使組 2 中之動物接受單一劑量，而向其他組中之動物投予兩個劑量 (研究之第 1 及 22 天)。在所選時間點收集全血以用於藉由 FACS 測定細胞群體計數。收集血漿並使用抗 huFlt3L-huFc ELISA 分析以測定每一血清樣品中之測試物品的量。
下文之表 6A 詳述每一動物組的投藥。組平均 PK 參數匯總於表 6B 中。
表 6A
組 標稱劑量 治療
1 10 mg/kg 抗 gD (N297G)
2 0.1 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
3 1 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
4 10 mg/kg FLT3L-Fc(NG2LH)
表 6B
組 Cmax (ug/ml) Cmax/ 劑量 (ug/ml)/(mg/kg) AUC0-21 (ug/ml* 天) AUC0-21/ 劑量 (ug/ml* 天)/(mg/kg) CL0-14* (ml/ 天/kg)
1 286 ± 26.6 28.6 2140 ± 45.9 214 3.65
2 2.63 ± 0.189 26.3 6.4 ± 0.285 64 13.7
3 29.2 ± 0.413 29.2 141 ± 16.7 141 6.83
4 280 ± 33.1 28 1630 ± 386 163 4.92
結果以圖解方式呈現於 圖 7中。
在組 2-3 中，C max幾乎隨劑量成比例增加。在所有投藥動物中於第 14 天或之後檢測抗藥物抗體 (ADA) 且在具有高 ADA 效價的動物中暴露受到影響。在第一劑量之後觀察到超出 AUC 0-21劑量比例性增加之部分，從而表明標靶調介之藥物處置 (TMDD) 會影響 PK 型態，尤其係在 ≤ 1 mg/kg 下。另外，據觀察，總清除率 (CL) 具有劑量依賴性，從而指示了標靶調介之 CL。在 10 mg/kg 下，抗 GD 及 FLT3L-Fc 組具有類似 PK 型態且 FLT3L-Fc 的總 CL 為 4.92 mL/天/kg。
所有 4 個組之平均單核球、cDC1 及 cDC2 計數展示於 圖 8A-8C中。對於經 FLT3L-Fc 治療之動物而言，在 0.1-1 mg/kg 之第 1 劑量之後，於周邊血中觀察到穩定劑量依賴性細胞擴增 (單核球、cDC1 及 cDC2)。在 10 mg/kg 下，觀察到較小擴增。不受限於理論，一種可能之解釋為，高濃度之 Flt3 配位體可防止增殖及分化所需的受體二聚化。在 1-10 mg/kg 下，於第 2 劑量之後觀察到較低但持續的細胞擴增(可能因為 ADA 之影響)。
實例 7.Fc(NG2LH) 之 FcγR 及 FcRn 結合
Fc 域之效應功能可受該域內之某些胺基酸變化影響。因此，藉由 Biacore 測量 Fc(NG2LH) 與 FcγR 及 FcRn 受體之結合。在該等分析中，經由抗 His 抗體在 Biacore 晶片上捕獲FcγR 或將 FcRn 直接固定於晶片上。在注入 (締合期) 結束時收集資料且藉由將樣品值除以標準品值以達成標準化來計算相對結合活性 (%)。
PTD Biocore 資料之匯總提供於下文之表 7 中。該等值展示 10 ug/ml 下之相對結合程度 (%)。
表 7
抗體 FcγRI FcγRI FcγRIIIa V158 FcRn
αCD20 αHer2 αCD20 αHer2 αCD20 αHer2 αCD20 αHer2
IgG1 野生型 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00
IgG1 LALAPG 1.74 1.92 -0.34 -0.62 1.36 1.58 95.93 97.86
IgG1 PVA# 2.69 2.51 25.11 26.77 5.16 5.57 104.45 102.81
IgG1 NG 4.50 6.12 0.06 0.385 2.12 2.95 86.73 86.27
IgG1 NG PVA# (NG2LH) 2.79 2.58 0.09 -0.21 2.09 2.02 94.17 94.72
IgG1 NG PVA# G 2.77 2.17 0.59 -0.40 2.16 1.74 94.65 91.12
IgG1 NG PVA# GSS 4.00 1.99 0.81 -0.47 2.24 1.46 92.92 93.24
IgG2 野生型 2.43 2.10 179.04 157.56 3.85 3.33 99.42 95.35
IgG4 SP 70.59 63.59 14.82 18.22 3.41 3.12 66.49 65.08
實例 8.Fc(NG2LH) 之熱穩定性
FLT3L 配位體融合蛋白之熱穩定性係研發治療性生物劑的一個重要方面。在設計無效應 Fc(NG2LH) 蛋白之後，執行差示掃描螢光法 (DSF) 以理解胺基酸變化對 Fc 蛋白之熱穩定性的效應。DSF 監測蛋白質在螢光染料存在下之熱去摺疊且通常藉由使用即時 PCR 儀器 (例如 Bio-Rad CFX) 來執行。在 PBS 中以 1:20 稀釋 SYPRO 橙色染料 (Invitrogen, cat. no. S6650)。將 1 ul 經稀釋染料添加至孔中之 24 ul Fab 蛋白 (約 100 ug/ml) 中。隨著在即時 PCR 儀器 (Bio-Rad CFX) 中溫度自 20℃ 升至 100℃，繪製螢光強度圖且使用例如玻耳茲曼方程式 (Boltzmann equation) 計算轉變曲線之拐點 (Tm)。參見 Nature Protocols, 2007, 2:2212-2221。
在全長抗體 (具體而言衍生自奧克利珠單抗之抗 CD20 抗體及衍生自曲妥珠單抗之抗 Her 抗體) 之背景中分析變異 Fc 蛋白。該等變異抗體之穩定性資料提供於下文之表 8 中。另外，亦在包含表 2 中所闡述序列但不存在 CH1 域且由此在 N-末端始於鉸鏈序列 DKTHT 之經分離 Fc 區的背景中測試變異 Fc 蛋白。 該等變異 Fc 蛋白之穩定性資料提供於下文之表 9 中。
表 8
構築體 重鏈恆定區 SEQ ID NO a-CD20 IgG (℃) a-Her2 IgG (℃) Ave. (℃) Δ IgG1 (℃)
IgG2 野生型 (wt) 8 57 57 57 -4.3
IgG4 SP 9 59 59 59 -2.3
IgG1 wt 1 61.2 61.4 61.3 0
IgG1 LALAPG 7 59.7 59.7 59.7 -1.6
IgG1 PVA# 4 61.9 61.95 61.9 +0.6
IgG1 NG 3 52.8 53.2 53 -8.3
IgG1 NG PVA# 2 55.2 55.6 55.4 -5.9
IgG1 NG PVA# G 5 54.4 54.2 54.3 -7.0
IgG1 NG PVA# GSS 6 50.4 50 50.2 -11.1
表 9
   構築體    SEQ ID NO Tm (℃)    Δ IgG1 (℃)
Fc N297G 14 59.3 -7.1
Fc NG2LH 13 61.6 -4.8
Fc PG 16 63.4 -3.0
Fc LALAPG 18 65.5 -0.9
Fc wt 12 66.4 0.0
LALA 17 67.0 +0.6
Fc PVA# 15 68.5 +2.1
該資料展示，對於全長 IgG 及經分離 Fc 蛋白而言，出人意料地，相對於僅具有 N297G 突變之 Fc 構築體的熱穩定性，組合 PVA# 變異體與 N297G 取代皆可將熱穩定性增加約 2℃。
實例 9. 無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白之變異體
執行實驗以評價各種 Flt3L-Fc 融合蛋白之免疫原性。具體而言，在 T 細胞增殖分析中測試某些蛋白質的免疫原性。如圖 9A 中所展示，Flt3L.P167.Fc.NG2LH (SEQ ID NO:26) 及 Flt3L.L165.Fc.NG2LH (SEQ ID NO:33) 皆無可檢測免疫原性。出人意料地，在引入 Flt3L W144D 突變 (SEQ ID NO:42) 後檢測到顯著免疫原性。
另一實驗評價了 Flt3L 蛋白之醣基化變異體的免疫原性。如 圖 9A 中所展示，引入 N149E、S151D 或 S151E 突變不會引起 CD4 T 細胞增殖之任何可檢測增加。N149E、S151D 及 S151E 指示相對於 SEQ ID NO:21 之胺基酸變化及位置。
實例 10.ADCP 分析中之無效應 Flt3L-Fc 融合蛋白
執行實驗以比較人類重組蛋白 Flt3L-Fc 構築體之以下 3 種變異體的抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性：1) Flt3L-Fc-野生型 IgG1 (SEQ ID NO:27)；具有 hIgG1.NG2LH 之 Fc 的 Flt3L (SEQ ID NO:26)；及 3) 具有 hIgG1.N297G 之 Flt3L (SEQ ID NO:28)。使用 EB10.hIgG1 (一種抗 Flt3 單株抗體，Piloto 等人，2006, Cancer Res. 66:4843-4851) 作為陽性對照。使用來自健康人類供體之原代單核球源巨噬球作為效應細胞及 SEM 人類急性淋巴母細胞性白血病細胞作為標靶細胞來實施 ADCP 分析。簡言之，藉由使用正向選擇自健康人類 PBMC 分離 CD14 陽性細胞來生成原代人類巨噬球 (Miltenyi Biotec Inc, Auburn, California) 並在巨噬球分化培養基 (RPMI 1640、10% FBS、1% Glutamax、1% 青黴素 (penicillin)/鏈黴素 (streptomycin) 及 20 ng/mL M-CSF (R&D Systems, Minneapolis, MN)) 中於 37 ℃ 下在含有 5% CO 2的加濕培育器中進行培養。在第 3 天，使用 50ng/mL M-CSF 刺激細胞且再培養 4 天。在第 7 天，使用 10 μM Cell Trace Violet (Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR) 將巨噬球染色，在 ADCP 分析培養基 (IMDM、10% FBS、1% Glutamax、1%青黴素/鏈黴素) 中稀釋至 1 × 10 6個細胞/mL，並以 50 uL/孔添加至 96 孔低黏附性 U 形底板 (Costar, Corning, NY) 中。將標靶 SEM 細胞在 ADCP 分析培養基中稀釋至 2 × 10 6個細胞/mL，使用 pHrodo (Thermo Fisher Scientific, Eugene, OR) 預標記，並添加 (50 uL/孔) 至含有巨噬球之分析板中。然後將 100 uL 測試抗體連續稀釋液 (表 1) 添加至含有巨噬球及 SEM 細胞之每一孔中，隨後在 37℃ 及 5% 二氧化碳下培育 4.5 小時。在連續進行 3‑倍稀釋以針對每一測試抗體總共獲得 11 個樣品後，最終抗體濃度介於 0.457-3000 ng/mL 之間。在培育之後，將細胞在 1200 rpm 下離心 5 min 並在 PBS 中洗滌，然後在 4 ℃ 下於 4% 低聚甲醛中固定 10 min。使用流式細胞儀 (BD Biosciences FACSCanto IVD 10) 分析細胞。經由 FlowJo (Tree Star, Inc.; Ashland, OR) 分析吞噬作用。使用 Cell Trace Violet 螢光來圈選樣品群體中之巨噬球。藉由測量 pHrodo Green 陽性巨噬球之百分比來確定吞噬作用。藉由自對照條件 (不存在抗體) 扣除 pHrodo Green 陽性巨噬球百分比來標準化吞噬作用程度。一式兩份收集所有資料點。將吞噬作用百分比 (ADCP %) 繪圖抗體濃度並使用 GraphPad Prism (LaJolla, CA) 擬合至 4-參數模型。在使用 3 個供體之獨立實驗中實施此程序。
在此研究中，使用表現 Flt3 之 SEM 細胞作為標靶細胞。使用在酸性 pH 中發出明亮螢光之 pHrodo AM 預‑標記 SEM 標靶細胞。隨著含有標靶細胞之吞噬體的酸性變得更高，pHrodo green 螢光訊號有所增加，此可在流式細胞儀上檢測到。檢驗藉由具有 hIgG1.NG2LH 之 Fc 之 Flt3L (SEQ ID NO:26, 5.1 mg/mL)、具有 hIgG1.N297G 之 Flt3L (SEQ ID NO:28, 1.92 mg/mL)、具有 WT IgG1 之 Flt3L (SEQ ID NO:27, 2.5 mg/mL) 及 EB10.hIgG1 (3.17 mg/mL) 誘導的 ADCP 活性，且在三個獨立實驗中使用來自三個不同供體之單核球源巨噬球進行比較。
一式兩份收集所有資料點，且將平均吞噬作用 % (ADCP %)針對測試分子之濃度 (藥物濃度：3 ug/mL-0.457 ng/mL) 繪圖。使用 4‑參數模型擬合資料。一種代表性劑量‑反應 ADCP 曲線展示於 圖 10 中。因 ADCP 分析之固有限制，在所有三個實驗中，在 Flt3 表現細胞中觀察到由具有 WT IgG1 之 Flt3L 及 EB10.hIgG1 誘導的 ADCP 活性。另外，FLT3L-Fc-IgG-N297G 誘導相對較低之 ADCP，而使用 FLT 3L-Fc-IgG NG2LH 檢測到極小 ADCP 活性。
可進行其他研究以測量包含 Fc NG2LH (SEQ ID NO:13) 之其他 Flt3L-Fc 融合蛋白 (例如在 Flt3L 部分中含有 1、2 或 3 個胺基酸取代之 Flt3L-Fc 融合蛋白) 的 ADCP 活性。該等研究可展示具有極小 ADCP 活性但可活化活體內 DC 擴增的其他 Flt3L-Fc 融合蛋白。
表 10
序列表
SEQ ID NO: 重鏈恆定區 (CH1 – CH3) 之說明 取代 (EU 編號) 序列
1 IgG1 WT    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2 IgG1 NG2LH, aka IgG1 NG PVA# (NG2LH) N297G/E233P/L234V/L235A/G236# ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3 IgG1 NG N297G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4 IgG1 PVA# E233P/L234V/L235A/G236# ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
5 IgG1 NG PVA# G N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6 IgG1 NG PVA# GSS N297G/E233P/L234V/L235A/G236#/A327G/A330S/P331S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
7 IgG1 PG P329G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
8 IgG1 LALA L234A/L235A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9 IgG1 LALAPG L234A/L235A/P329G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10 IgG2 WT    ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
11 IgG4 SP S228P ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
12 IgG1 Fc 區    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
13 Fc(NG2LH)    DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 構築體名稱 序列
14 IgG1 N297G Fc 區 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
15 NVA# Fc 區 DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
16 IgG1 PG Fc 域 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
17 IgG1 LALA Fc 域 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
18 LALAPG Fc 區 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
19 LH 殘基 (wt) ELLG
20 PVAGP (Fc 之非變異部分) PVAGP
21 P49771 MTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSGTQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPTAPQPPLLLLLLLPVGLLLLAAAWCLHWQRTRRRTPRPGEQVPPVPSPQDLLLVEH
22 Flt3L 27-167 TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPP
23 CDX-301 TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAP
24 Flt3L 訊息序列 MTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSG
25 hFLT3L.P168.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 請證實此序列 TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
27 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1 TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
28 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
29    hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
30 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.LALAPG TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
31    hFLT3L.P167.7aa.hinge.hIgG4 TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
32 hFLT3L.P166.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
33 hFLT3L.L165.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
34 hFLT3L.L164.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
35 hFLT3L.C158.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
36 hFLT3L.P179.hIgG1.N297G TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPGGGSVTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
37 hFLT3L.Q159.hIgG1.N297G TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQGGGSVTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
38 hFTL3L.C158.3aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
39 hFTL3L.C158.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
40 hFTL3L.D161.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
41 hFTL3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
42 Hs_FLT3LG.M1-L165.W144D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPDITRQNFSRCLELQCQPDSSTLDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
43 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151D.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFDRCLELQCQPDSSTLDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
44 Hs_FLT3LG.M1-L165.S151E.O.pRK-5aa.hIgG1.NG2LH TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFDRCLELQCQPDSSTLDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
45 具有天然訊息序列之 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# MTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLSGTQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
46 Flt3L-Fc(IgG4) TQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGSKMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPDSSTLPPPWSPRPLEATAPTAPQPPRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
47 huMAb4D5-8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
儘管出於清楚理解之目的藉由圖示及實例的方式略微詳細地闡述上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發明範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的揭示內容均以引用的方式明確納入其全部內容。
圖 1展示具有野生型或變異 Fc 域之抗 Her2 抗體的不同 ADCP 活性程度。將原代 M1 巨噬球與 SkBr3 標靶細胞一起培育。x 軸展示抗體濃度且 y 軸展示吞噬作用百分比。 圖 2A-2E展示在一起培育具有野生型或變異 Fc 域之抗 Her2 抗體與原代 M1 巨噬球及 SkBr3 標靶細胞時巨噬球的細胞激素釋放。x 軸展示抗體濃度且 y 軸展示 pg/ml 細胞激素。 圖 2A ：G-CSF； 圖 2B：GM-CSF； 圖 2C：IL-10； 圖 2D：IL-1ra； 圖 2E：IL-6、 圖 2F-2J展示在一起培育具有野生型或變異 Fc 域之抗 Her2 抗體與原代 M1 巨噬球及 SkBr3 標靶細胞時巨噬球的細胞激素釋放。x 軸展示抗體濃度且 y 軸展示 pg/ml 細胞激素。 圖 2F ：IL-8； 圖 2G：MIP-1α； 圖 2H：MIP-1β； 圖 2I：RANTES； 圖 2J：TNFα。 圖 2K展示具有野生型及變異 Fc 蛋白之抗 CD20 抗體的 ADCC 活性。 圖 2L展示具有野生型及變異 Fc 蛋白之抗 Her2 抗體的 ADCC 活性。 圖 3A-3C展示 Flt3L-FcNG2LH 融合蛋白關於聚集及雙硫鍵性質之不同特性。藉由以下方式來展示 hFLT3L.S163.no.hinge.hIgG1.NG.PVA# 聚集及表現於 CHO 細胞及 HEK293 細胞中之蛋白質之二聚體形成的分析：SDS-PAGE ( 圖 3A) 及 SEC-HPLC ( 圖 3B：293 細胞；及 圖 3C：HEK297 細胞)。在 圖 3B-3C中，x 軸為時間且 y 軸為 mAU。 圖 3D-3F展示 Flt3L-FcNG2LH 融合蛋白關於聚集及雙硫鍵性質之不同特性。藉由以下方式來展示 hFLT3L.P167.5aa.hinge.hIgG1.NG.PVA# 聚集及表現於 CHO 細胞及 HEK293 細胞中之蛋白質之二聚體形成的分析：SDS-PAGE ( 圖 3D) 及 SEC-HPLC ( 圖 3E：293 細胞；及 圖 3F：HEK297 細胞)。在 圖 3E-3F中，x 軸為時間且 y 軸為 mAU。 圖 4A-4B展示，Flt3L 在活體外誘導 OCI-AML5 細胞之增殖。 圖 4A展示 hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 及 gCDX-301 之劑量反應曲線。所展示資料為三重複值之平均值 ± SD。將資料標準化至 10 ug/mL hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH (作為最大 (100%) 反應)。 圖 4B展示 hFLT3L.P167.hIgG1.NG2LH 及 gCDX-301 之EC50 功效。展示 5 個獨立實驗之結果，其中線條標記平均值 ± SEM。 圖 5展示在投用 0.1 mg/kg、1 mg/kg 或 10 mg/kg 融合蛋白之動物中檢測之 Flt3L-Fc (SEQ ID NO:28) 融合蛋白的血清濃度。 圖 6A-6B展示投予 0.1 mg/kg、1 mg/kg 或 10 mg/kg 融合蛋白之動物中之單核球 ( 圖 6A) 及 DC ( 圖 6B) 的劑量依賴性細胞擴增。抗 gD 為陰性對照人源化 IgG 抗體。 圖 7展示投予 0.1 mg/kg、1 mg/kg 或 10 mg/kg 融合蛋白之動物中之 Flt3L-Fc(NG2LH) 的血漿濃度。抗 gD 為陰性對照人源化 IgG 抗體。 圖 8A-8C展示投予 0.1 mg/kg、1 mg/kg 或 10 mg/kg 融合蛋白之動物中之單核球 ( 圖 8A)、cDC1 細胞 ( 圖 8B) 及 cDC2 細胞 ( 圖 8C) 的劑量依賴性細胞擴增。抗 IgD 為陰性對照人源化 IgG 抗體。 圖 9A展示所選含 Fc 蛋白之免疫原性。 圖 9B展示所選含 Fc 蛋白之免疫原性。 圖 10展示如實例 10 中所闡述之一個代表性活體外 ADCP分析的結果，從而比較各種 Flt3L-Fc 蛋白之 ADCP 活性。 
<![CDATA[<110> 美商建南德克公司(GENENTECH, INC.)]]>
          <![CDATA[<120> FLT3 配位體融合蛋白及使用方法]]>
          <![CDATA[<130> P36298-TW]]>
          <![CDATA[<140>]]>
          <![CDATA[<141>]]>
          <![CDATA[<150> 63/062,713]]>
          <![CDATA[<151> 2020-08-07]]>
          <![CDATA[<160> 53]]>
          <![CDATA[<170> PatentIn 3.5 版]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 329]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                  195                 200                 205             
          Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
                      260                 265                 270         
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
              290                 295                 300                 
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 329]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                  195                 200                 205             
          Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
                      260                 265                 270         
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
              290                 295                 300                 
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 
          <![CDATA[<210> 5]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                  195                 200                 205             
          Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
                      260                 265                 270         
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
              290                 295                 300                 
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 329]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
              130                 135                 140                 
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
                          165                 170                 175     
          Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
                      180                 185                 190         
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                  195                 200                 205             
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
              210                 215                 220                 
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
                          245                 250                 255     
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
                      260                 265                 270         
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                  275                 280                 285             
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
              290                 295                 300                 
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 8]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 8]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 326]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325     
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 327]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                          325         
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 227]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 智人]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 226]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                      20                  25                  30          
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
              50                  55                  60                  
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
                          85                  90                  95      
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                      180                 185                 190         
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys 
          225     
          <![CDATA[<210> 14]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 226]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                      20                  25                  30          
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
              50                  55                  60                  
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
                          85                  90                  95      
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                      100                 105                 110         
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                      180                 185                 190         
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                  195                 200                 205             
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys 
          225     
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 227]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 227]]>
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          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
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          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
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          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
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                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
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                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
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          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
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          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
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          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
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                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro Gly Lys 
          225         
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          Glu Leu Leu Gly 
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          Pro Val Ala Gly Pro 
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          Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                      100                 105                 110         
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          Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 
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          Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 
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                      100                 105                 110         
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          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
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          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
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          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
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          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 
              130                 135                 140                 
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
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          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
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          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
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          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
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          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
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          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
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          Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                  275                 280                 285             
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          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
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          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Asp Lys Thr 
              130                 135                 140                 
          His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                  275                 280                 285             
          Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 
              290                 295                 300                 
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                      340                 345                 350         
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365             
          <![CDATA[<210> 29]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Asp Lys Thr 
              130                 135                 140                 
          His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 
                      180                 185                 190         
          Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 
                  195                 200                 205             
          Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
                      260                 265                 270         
          Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 
                  275                 280                 285             
          Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 
              290                 295                 300                 
          Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 
                          325                 330                 335     
          Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 
                      340                 345                 350         
          His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365         
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          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Asp Lys Thr 
              130                 135                 140                 
          His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
                          165                 170                 175     
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
                      180                 185                 190         
          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                  195                 200                 205             
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 
              210                 215                 220                 
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr 
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              290                 295                 300                 
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                      340                 345                 350         
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365             
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          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Glu Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          165                 170                 175     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 
                      180                 185                 190         
          Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  195                 200                 205             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 
              210                 215                 220                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 
                          245                 250                 255     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      260                 265                 270         
          Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  275                 280                 285             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              290                 295                 300                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp 
                          325                 330                 335     
          Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Gly Lys 
              370 
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 366]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Asp Lys Thr His 
              130                 135                 140                 
          Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                          165                 170                 175     
          Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 
                      180                 185                 190         
          Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 
                  275                 280                 285             
          Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 
              290                 295                 300                 
          Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 
                          325                 330                 335     
          Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 
                      340                 345                 350         
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365     
          <![CDATA[<210> 33]]>
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          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 33]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Asp Lys Thr His Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 
                          325                 330                 335     
          Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 
                      340                 345                 350         
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210> 34]]>
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          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 34]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Asp Lys Thr His Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
              210                 215                 220                 
          Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 
                          245                 250                 255     
          Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
                      260                 265                 270         
          Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 
                  275                 280                 285             
          Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
              290                 295                 300                 
          Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
                          325                 330                 335     
          Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 
          <![CDATA[<210> 35]]>
          <![CDATA[<211> 358]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 35]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
                      180                 185                 190         
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                  275                 280                 285             
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
              290                 295                 300                 
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355             
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          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 36]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Gly Gly Gly Ser Val Thr Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                      180                 185                 190         
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                  195                 200                 205             
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
              210                 215                 220                 
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
                          245                 250                 255     
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                      260                 265                 270         
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                  275                 280                 285             
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
              290                 295                 300                 
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                      340                 345                 350         
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                  355                 360                 365             
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
              370                 375                 380                 
          Gly Lys 
          385     
          <![CDATA[<210> 37]]>
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          <![CDATA[<400> 37]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Gly Gly Gly Ser Val Thr Asp Lys Thr His Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                          165                 170                 175     
          Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 
                      180                 185                 190         
          Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
              210                 215                 220                 
          Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
                      260                 265                 270         
          Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 
                  275                 280                 285             
          Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 
              290                 295                 300                 
          Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 
                          325                 330                 335     
          Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 
                      340                 345                 350         
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365     
          <![CDATA[<210> 38]]>
          <![CDATA[<211> 356]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 38]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                          165                 170                 175     
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                      180                 185                 190         
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
                  195                 200                 205             
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                      260                 265                 270         
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Pro Gly Lys 
                  355     
          <![CDATA[<210> 39]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 39]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 
              130                 135                 140                 
          Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 
                          165                 170                 175     
          Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 
                      180                 185                 190         
          Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val 
                  195                 200                 205             
          Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 
              210                 215                 220                 
          Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 
                      260                 265                 270         
          Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 
                  275                 280                 285             
          Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 
              290                 295                 300                 
          Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 
                          325                 330                 335     
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                      340                 345                 350         
          <![CDATA[<210> 40]]>
          <![CDATA[<211> 356]]>
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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 40]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                          165                 170                 175     
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                      180                 185                 190         
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr 
                  195                 200                 205             
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
              210                 215                 220                 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                          245                 250                 255     
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                      260                 265                 270         
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
              290                 295                 300                 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Pro Gly Lys 
                  355     
          <![CDATA[<210> 41]]>
          <![CDATA[<211> 358]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 41]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
                      180                 185                 190         
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
              210                 215                 220                 
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
                          245                 250                 255     
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
                      260                 265                 270         
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                  275                 280                 285             
          Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
              290                 295                 300                 
          Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
                      340                 345                 350         
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355             
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          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 42]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Asp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Asp Lys Thr His Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 
                          325                 330                 335     
          Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 
                      340                 345                 350         
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210> 43]]>
          <![CDATA[<211> 365]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 43]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Asp Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Asp Lys Thr His Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 
                          325                 330                 335     
          Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 
                      340                 345                 350         
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210> 44]]>
          <![CDATA[<211> 365]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 44]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Asp Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Asp Lys Thr His Thr 
              130                 135                 140                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 
                          165                 170                 175     
          Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 
                      180                 185                 190         
          Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 
                      260                 265                 270         
          Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 
                          325                 330                 335     
          Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 
                      340                 345                 350         
          His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 360                 365 
          <![CDATA[<210> 45]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 45]]>
          Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu 
              50                  55                  60                  
          Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala 
                      100                 105                 110         
          Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser 
                  115                 120                 125             
          Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                      180                 185                 190         
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                  195                 200                 205             
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 
              210                 215                 220                 
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
                          245                 250                 255     
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                      260                 265                 270         
          Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                  275                 280                 285             
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
              290                 295                 300                 
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
                          325                 330                 335     
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                      340                 345                 350         
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 
                  355                 360                 365             
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
              370                 375                 380                 
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
          385                 390             
          <![CDATA[<210> 46]]>
          <![CDATA[<211> 385]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 46]]>
          Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp 
                  35                  40                  45              
          Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe 
                          85                  90                  95      
          Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 
                          165                 170                 175     
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                      180                 185                 190         
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
              210                 215                 220                 
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
          225                 230                 235                 240 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
                          245                 250                 255     
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                  275                 280                 285             
          Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
                          325                 330                 335     
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 
                      340                 345                 350         
          Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                  355                 360                 365             
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Lys 
          385 
          <![CDATA[<210> 47]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400> 47]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln 
          1               5                   10                  15      
          Pro Pro 
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Pro 
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221> 源]]>
          <![CDATA[<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro 
          1               5                   10
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (45)

  1. 一種包含無效應物 Fc 蛋白之 Fc 融合蛋白，其包含 Flt3 配位體 (Flt3L) 蛋白及該無效應物 Fc 蛋白，其中該無效應物 Fc 蛋白與殘基 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同，且其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。
  2. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該 Flt3L 包含蛋白質，該蛋白質包含與 SEQ ID NO:22 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列。
  3. 如請求項 1 或 2 之 Fc 融合蛋白，其中該 Flt3L 包含蛋白質，該蛋白質包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列。
  4. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該 Flt3L 包含蛋白質，該蛋白質與包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸 27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184 或 27-185 之蛋白質至少約 90% 相同。
  5. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該無效應物 Fc 蛋白之 N 端係由肽鍵連結至 Flt3L 蛋白之 C 端。
  6. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該融合蛋白包含與 SEQ ID NO:26 至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列，且其中該融合蛋白包含與 SEQ ID NO:13 相同之胺基酸序列。
  7. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該 Fc 融合蛋白具有 Fc 效應物功能，該 Fc 效應物功能相對於包含 SEQ ID NO:12 之野生型 IgG1 Fc 區之 Fc 效應物功能而言被減弱。
  8. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該 Fc-無效應物 Flt3L-Fc 融合蛋白在活體外測定中使抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活化之活性程度不超過由包含融合至野生型 IgG1 Fc (SEQ ID NO:12) 之野生型 Flt3L 之 Flt3L-Fc 融合蛋白在該活體外測定中所達活性程度之 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 99%。
  9. 如請求項 1 之 Fc 融合蛋白，其中該 Fc 融合蛋白係連結至抗體之重鏈可變域。
  10. 一種經分離核酸，其編碼如請求項 1 至 9 中任一項之 Fc 融合蛋白。
  11. 如請求項 10 之經分離核酸，其中該經分離核酸進一步編碼該 Fc 融合蛋白之 N 末端之訊息序列。
  12. 一種編碼 Flt3L-Fc 融合蛋白之經分離核酸，其中該 Flt3L-Fc 融合蛋白包含 SEQ ID NO:45。
  13. 一種宿主細胞，其包含如請求項 10 至 12 中任一項之核酸。
  14. 一種生產 Fc 融合蛋白之方法，其包含培養如請求項 13 之宿主細胞。
  15. 如請求項 14 之方法，其中該宿主細胞為真核細胞或原核細胞。
  16. 如請求項 14 或 15 之方法，其中該宿主細胞為大腸桿菌 ( E. coli)。
  17. 如請求項 14 或 15 之方法，其中該宿主細胞為 CHO 細胞。
  18. 一種醫藥調配物，其包含如請求項 1 至 8 中任一項之 Fc 融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
  19. 如請求項 18 之醫藥調配物，其進一步包含第二治療劑。
  20. 如請求項 18 或 19 之醫藥調配物，其中該第二治療劑為佐劑、樹突成熟因子及/或查核點抑制劑。
  21. 一種如請求項 1 至 9 中任一項之 Flt3L-Fc 融合蛋白在製造藥物中之用途，該藥物用於擴充受試者體內樹突細胞 (DC) 之數量。
  22. 如請求項 21 之用途，其中該藥物供投予該受試者之劑量為約 0.1 mg/kg 至 50 mg/kg 之該 Flt3L-Fc 融合蛋白。
  23. 一種如請求項 1 至 9 中任一項之 Flt3L-Fc 融合蛋白或如請求項 18 至 20 中任一項之醫藥調配物在製造藥物中之用途，該藥物用於治療受試者之癌症。
  24. 如請求項 23 之用途，其中該藥物供投予該受試者之劑量為約 0.1 mg/kg 至 50 mg/kg 之該 Flt3L-Fc 融合蛋白。
  25. 如請求項 23 或 24 之用途，其中該藥物進一步包含第二治療劑或與之組合使用。
  26. 如請求項 25 之用途，其中該第二治療劑為佐劑、樹突成熟因子及/或查核點抑制劑。
  27. 如請求項 21 之用途，其中該藥物進一步包含 DC 成熟因子或與之組合使用。
  28. 如請求項 27 之用途，其中該 DC 成熟因子係選自 polyIC、polyICLC、DC40、放射療法及化學療法。
  29. 如請求項 21 之用途，其中該藥物進一步包含免疫查核點抑制劑或與之組合使用。
  30. 如請求項 29 之用途，其中該查核點抑制劑係在投予該 Fc-無效應物 Flt3L-Fc 融合蛋白之前、同時或之後投予。
  31. 如請求項 30 之用途，其中該免疫查核點抑制劑係選自由以下所組成之群組：帕博利珠單抗、納武利尤單抗、匹定利珠單抗、BMS 936559、阿替利珠單抗及阿維魯單抗。
  32. 如請求項 21 之用途，其中該癌症係選自由以下所組成之群組：非小細胞肺癌 (NSCLC)、小細胞肺癌 (SCLC)、黑色素瘤、胰管腺癌 (PDAC)、三陰性乳癌 (TNBC)、非何杰金氏淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma，NHL)、結直腸癌 (CRC)、乳癌、膀胱癌、腎癌、或其組合。
  33. 如請求項 21 中任一項之用途，其中該受試者先前已接受查核點抑制劑治療。
  34. 如請求項 33 之用途，其中該受試者對查核點抑制劑療法無反應且/或在接受查核點免疫療法之最後一劑後超過 3 個月、4 個月、5 個月、6 個月、7 個月、8 個月、9 個月、10 個月、1 年、1.5 年或 2 年時間對該查核點抑制劑療法無反應。
  35. 如請求項 21 之用途，其中該受試者之該癌症之特徵在於包含免疫沙漠型腫瘤。
  36. 一種無效應物 Fc 蛋白，其包含與殘基 SEQ ID NO:13 至少 95%、96%、97%、98% 或 99% 相同之胺基酸序列，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 或 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。
  37. 如請求項 36 之無效應物 Fc 蛋白，其中 SEQ ID NO:13 之殘基 13-17 包含胺基酸序列 PVAGP (SEQ ID NO:20) 且 SEQ ID NO:13 之殘基 76 為甘胺酸。
  38. 如請求項 36 之無效應物 Fc 蛋白，其包含與 SEQ ID NO:13 相同之胺基酸序列。
  39. 一種無效應物 Fc 蛋白，其包含與 SEQ ID NO: 2、4、5、6、13 或 15 相同之胺基酸序列。
  40. 如請求項 36 之無效應物 Fc 蛋白，其中該 Fc 蛋白係相對於包含 SEQ ID NO:12 之野生型 IgG1 Fc 區被減弱。
  41. 一種抗體，其包含如請求項 36 之無效應物 Fc 蛋白。
  42. 如請求項 41 之抗體，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域。
  43. 如請求項 41 之抗體，其中該抗體為單株抗體。
  44. 如請求項 41 之抗體，其中該抗體為人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
  45. 如請求項 41 之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體或多特異性抗體。
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