CN114236113B - 一种2,4-滴的即用型免疫传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种2，4‑滴的即用型免疫传感器，在获得2，4‑滴模拟表位多肽后，将多肽与纳米荧光素酶分裂后的大片段融合表达，将纳米荧光素酶分裂后的小片段与2，4‑滴纳米抗体融合表达，通过优化融合蛋白中的连接臂长度及多肽拷贝数，选择具有较好信噪比和响应值组合用于2，4‑滴的检测，融合蛋白中的多肽和纳米抗体的结合，使得LgN和SmN重建形成具有催化发光活性的纳米荧光素酶，从而显著增强体系的发光强度，而2，4‑滴会将多肽与纳米抗体的结合解离，使得体系的发光强度降低，本发明实现了对小分子的免标记、免固定、免洗涤的检测，具有快速、简便、经济、实用性强、灵敏度高的优势。

Description

一种2,4-滴的即用型免疫传感器

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种2，4-滴的即用型免疫传感器。

背景技术

一些小分子化合物(如农药、毒素、有机污染物等)通常与食品安全、环境污染等社会普遍关注的议题相关。因此，建立针对小分子的快速检测方法，对提供及时的预警和监测具有十分重要的意义。在小分子快速检测技术中，基于抗原和抗体特异性识别的免疫检测得到了广泛的认可和应用。但免疫检测中的特异性识别和信号产生需要独立的试剂，这就使得试剂之间的标记、固定或者洗涤步骤不可避免，不仅增加了检测试剂的生产周期和检测时间，还会导致批次间差异和检测误差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于重组试剂的免标记、免合成、免洗涤的即用型免疫传感器，其制备方法和检测方法。

为实现上述目的，本发明将2，4-滴模拟表位多肽与纳米荧光素酶分裂后的大片段(LgN)融合表达，获得重组蛋白Pm-LgN，将纳米荧光素酶分裂后的小片段(SmN)与2，4-滴纳米抗体融合表达，获得重组蛋白Sm-VHH，其中，模拟表位多肽和2，4-滴纳米抗体的结合，使得LgN和SmN重建形成具有催化发光活性的纳米荧光素酶，从而显著增强体系的发光强度，而2，4-滴会将多肽与2，4-滴纳米抗体的结合解离，使得体系的发光强度降低。

所述2，4-滴模拟表位多肽，是麦芽糖结合蛋白(MBP)和2，4-滴纳米抗体的融合蛋白为靶标，从噬菌体展示随机十二肽库中，通过三轮亲和淘选获得，其氨基酸序列为AsnGly Phe Phe Glu Phe Trp Gln Val Val Tyr Val，所述2，4-滴纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述重组蛋白Pm-LgN的最佳重组形式为，模拟表位多肽以双拷贝的形式串联融合在LgN的N端，且与LgN之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂，所述重组蛋白Sm-VHH的最佳重组形式为， SmN融合在2，4-滴纳米抗体的N端，且与2，4-滴纳米抗体之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

(一)2，4-滴模拟表位多肽的亲和淘选：

第一步：靶标蛋白制备

利用质粒pMAL-p5X作为表达载体，通过酶切位点Not I and EocR I将2，4-滴纳米抗体克隆到MBP 下游，将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，25℃，终浓度1mM的IPTG，过夜诱导表达MBP与2， 4-滴纳米抗体的融合蛋白，表达结束后，离心收集菌体，使用“渗透休克法”提取细胞周质蛋白，依次使用直链淀粉树脂和镍柱从蛋白提取液中纯化出目的蛋白。

第二步：亲和淘选程序

将纯化后的MBP与2，4-滴纳米抗体的融合蛋白作为靶标蛋白，包被在酶标板上，用5％脱脂奶粉封闭酶标板，将噬菌体展示随机线十二肽库加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，并使用2，4-滴溶液竞争洗脱结合的噬菌体，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，每轮淘选降低用于竞争洗脱的2，4-滴的含量。

第三步：阳性克隆鉴定

3轮淘选后，挑选30个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，13个阳性克隆进行扩增、质粒提取、测序，共发现1种序列，其序列如SEQ ID NO 1所示：Asn Gly Phe Phe Glu Phe TrpGln Val Val Tyr Val。

(二)Pm-LgN和Sm-VHH的最佳重组形式确定：

第一步：不同重组形式的Pm-LgN和Sm-VHH制备

利用质粒pET28a作为表达载体，表达六种不同重组形式的Pm-LgN，包括多肽为单拷贝形式，且多肽与LgN之间无连接臂的PLgN以及带有一个GGGSGGGS间隔臂的P-LgN，多肽为双拷贝形式，且多肽与LgN之间无连接臂的p²LgN以及带有一个GGGSGGGS间隔臂的P²-LgN，多肽为三拷贝形式，且多肽与LgN之间无连接臂的p³LgN以及带有一个GGGSGGGS间隔臂的P³-LgN，利用质粒pET22b作为表达载体，表达四种不同重组形式的Sm-VHH，包括SmN和纳米抗体之间无连接臂的SmVHH，带有一个 GGGSGGGS间隔臂的Sm-S₁-VHH，带有两个GGGSGGGS间隔臂的Sm-S₂-VHH和带有三个个GGGSGGGS 间隔臂的Sm-S₃-VHH。

所述六种Pm-LgN和四种Sm-VHH均利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株作为表达菌株，诱导条件为25℃，终浓度1mM的IPTG，过夜表达，表达结束后，离心收集菌体，六种Pm-LgN均使用细胞裂解液提取总可溶性蛋白，四种Sm-VHH均使用渗透休克法提取细胞周质蛋白，PLgN和p2LgN的蛋白提取液依次使用镍柱和分子筛纯化出目的蛋白，其他重组蛋白的蛋白提取液使用镍柱纯化出目的蛋白。

第二步：不同Pm-LgN和Sm-VHH组合的响应值和背景值测定

用1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)将每种Pm-LgN和Sm-VHH均稀释至1.1μM，将35μL的六种Pm-LgN，分别与35μL的四种Sm-VHH在具有无蛋白吸附表面的白色微孔板中混合，共形成24种组合，随后分别加入20μL磷酸缓冲液(PBS)或100μM的2，4-滴标准溶液，室温振荡孵育30分钟后，加入 10μL含有0.4μL纳米荧光素酶催化底物的PBS，利用酶标仪记录微孔中的发光强度，其中，加入20μL PBS 的作为响应值，加入100μM的2，4-滴标准溶液的作为背景值。

第三步：最佳Pm-LgN和Sm-VHH组合确定

将响应值除背景值，作为信噪比，计算每种组合响应值和信噪比的乘积，乘积最大的确定为最佳组合，其中，多肽以双拷贝的形式串联融合在LgN的N端，且与LgN之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS 的间隔臂的p²-LgN，和SmN与2，4-滴纳米抗体之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂的SmN-S₁-VHH，形成的组合具有最大的乘积，其响应值为1.597×10⁷，信噪比为22.23，具体结果见表1所示。

表1 24种组合的响应值、背景值和信噪比

本发明技术方案实现的有益效果：

1.简便快速：无需任何固定、洗涤步骤，15分钟即可完成检测；

2.经济实用：所述两种重组蛋白均可通过细菌发酵快速、大量产生，且不需要进行标记，有效降低检测成本；

3.灵敏度高：利用本发明提供的模拟表位多肽和重组形式建立的即用型免疫传感器，对2，4-滴检测的抑制中浓度(IC₅₀)为3.64ng/mL，检测限(IC₁₀，LOD)为0.728ng/mL。

4.新颖度高：目前，国内外尚未见有针对小分子的全表达型免疫传感器的报道。

附图说明

图1为所述即用型免疫传感器的检测原理示意图；

图中“1”表示LgN；“2”表示双拷贝的模拟表位多肽；“3”表示SmN；“4”表示2，4-滴纳米抗体；“5”表示2，4-滴；

图2为所述即用型免疫传感器对不同浓度2，4-滴标准品溶液检测的标准曲线；

图3为所述即用型免疫传感器对不同浓度2，4-滴标准品溶液检测的检测图像；

图4为所述即用型免疫传感器对2，4-滴添加样品的检测图像。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

p²-LgN和SmN-S₁-VHH的重组基因片段委托金斯瑞公司合成，分别用Nde I和Xho I、Nco I和Xho I 酶切，凝胶纯化后，将重组基因片段分别克隆到pET-28a和pET-22b载体(购买自Novagen公司)中，连接后的载体转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，分别随机选择10个阳性克隆验证序列。将含有正确序列的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取转化后的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有100 μg/mL卡那霉素(pET-28a)或氨苄青霉素(pET-22b)的LB培养基中于37℃、250rpm培养直至OD₆₀₀值达到0.6，随后分别加入1mM异丙基硫代半乳糖苷(终浓度)，并在25℃，250rpm培养过夜，利用细胞裂解液提取位于胞质中的p²-LgN，使用1mL HisTrap HP柱纯化获得目的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，利用“渗透性休克法”提取位于周质的SmN-S₁-VHH，使用1mL HisTrap HP柱纯化获得目的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

用含有1mg/mL的PBS将p²-LgN和SmN-S₁-VHH分别稀释至0.57μM和0.072μM用于定量分析，将P²-LgN和SmN-S1-VHH分别稀释至2.3μM和0.28μM用于可视化分析，分别取35μL稀释后的P²-LgN 和SmN-S₁-VHH加入具有无蛋白吸附表面的白色微孔板中，随后加入20μL样品，室温振荡反应15分钟后，加入10μL含有0.4μL纳米荧光素酶催化底物的PBS，使用SpectraMax M5酶标仪读取微孔中的发光强度，用于定量分析，将微孔板置于暗盒中，用智能手机直接拍照，用于可视化检测。本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程如图1所示。

实施例1：即用型免疫传感器对2，4-滴农药标准品的检测

1.2，4-滴农药标准溶液的配制

用甲醇配制2，4-滴标准品母液(1mg/mL)，用PBS将母液倍比稀释为2590ng/mL至1.25ng/mL的系列浓度用于检测。

2.2，4-滴和p²-LgN中的模拟表位多肽竞争结合SmN-S₁-VHH中的纳米抗体，使得重建的纳米荧光素酶被破坏。

将35μL的P²-LgN、35μL的SmN-S₁-VHH和20μL 2，4-滴标准溶液混合，在具有无蛋白吸附表面的白色微孔板中振荡反应15分钟，随后加入10μL含有0.4μL纳米荧光素酶催化底物的PBS。

3.信号检测及分析

方法1：将微孔板置于SpectraMax M5酶标仪中，读取微孔中的发光强度，以2，4-滴标准溶液的浓度为横坐标，对应的发光强度为纵坐标，利用GraphPad Prism 8软件建立四参数拟合方程，得到标准曲线，如图2所示，抑制中浓度(IC₅₀)为3.64ng/mL，检测限(IC₁₀，LOD)为0.728ng/mL。

方法2：将微孔板置于暗盒中，用智能手机拍照，如图3所示，用肉眼直接观察拍摄的图像，相对阴性对照的结果(0ng/mL)，随着2，4-滴浓度的增大，微孔中的发光逐渐减弱，当2，4-滴浓度达到16ng/mL 的，发光强度出现明显减弱，则判断为阳性。

本发明提供的即用型免疫传感器方法，特异性通过交叉反应率(CR)进行评价，其计算公式为CR＝IC₅₀(2，4-滴)/IC₅₀(其他化合物)×100，9种2，4-滴类似物的交叉反应率如表2所示。

表2 即用型免疫传感器对2，4-滴类似物的交叉反应率

实施例2：即用型免疫传感器对2，4-滴添加样品进行检测

1.添加样品的制备及处理

将2，4-滴标准品添加到麦粉样品进行添加回收试验，称取粉碎混匀后的麦粉样品10g，添加标准品至40、160、640和1280ng/g的终浓度，混匀，暗处室温静置过夜，加入20mL含30％甲醇的PBS缓冲液混匀，涡旋15mint，4000rpm离心5min，通过真空抽滤收集上清，用PBS稀释3倍用于检测。

2.2，4-滴和P²-LgN中的模拟表位多肽竞争结合SmN-S₁-VHH中的纳米抗体，使得重建的纳米荧光素酶被破坏。

将35μL的p²-LgN、35μL的SmN-S₁-VHH和20μL稀释后的样品提取液混合，在具有无蛋白吸附表面的白色微孔板中振荡反应15分钟，随后加入10μL含有0.4μL纳米荧光素酶催化底物的PBS。

3.信号检测及分析

方法1：将微孔板置于SpectraMax M5酶标仪中，读取微孔中的发光强度，将其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中2，4-滴的含量，并用样品前处理过程中的稀释倍数进行校正，获得样品中2，4-滴的残留量，结果见表3。

方法2：将微孔板置于暗盒中，用智能手机拍照，如图4所示，用肉眼直接观察拍摄的图像，相对阴性对照的结果(0ng/mL)，

40和160ng/g样品检测结果显示发光强度未出现明显降低，为阴性，640和1280ng/g样品检测结果显示发光强度出现明显降低，为阳性。

本发明提供的双信号侧流免疫层析方法，对添加样品的检测准确，结果如表3所示。

表3 即用型免疫传感器对添加样品进行检测的结果

Claims (1)

1.一种检测2，4-滴的即用型免疫传感器，包括一种能够特异性识别2，4-滴纳米抗体的多肽与纳米荧光素酶分裂后的大片段LgN融合表达后的重组蛋白Pm-LgN，及一种纳米荧光素酶分裂后的小片段SmN与2，4-滴纳米抗体融合表达后的重组蛋白Sm-VHH，多肽和2，4-滴纳米抗体的结合，使得LgN和SmN重建形成具有催化发光活性的纳米荧光素酶，体系的发光强度显著增强，而分析物使多肽与2，4-滴纳米抗体的结合解离，体系的发光强度降低，其特征在于：

所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，所述Pm-LgN的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，所述Sm-VHH的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示氨基酸序列；

多肽以两个拷贝的形式串联融合在LgN的N端，且与LgN之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂；

SmN融合在2，4-滴纳米抗体的N端，且与2，4-滴纳米抗体之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂。