CN113924126A - 为癌症肿瘤定制的低免疫纳米囊泡递送系统 - Google Patents

为癌症肿瘤定制的低免疫纳米囊泡递送系统 Download PDF

Info

Publication number
CN113924126A
CN113924126A CN202080041577.0A CN202080041577A CN113924126A CN 113924126 A CN113924126 A CN 113924126A CN 202080041577 A CN202080041577 A CN 202080041577A CN 113924126 A CN113924126 A CN 113924126A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bionv
cells
virus
cell
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080041577.0A
Other languages
English (en)
Inventor
托马斯·马尔科姆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tuo MasiMaerkemu
Original Assignee
Tuo MasiMaerkemu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tuo MasiMaerkemu filed Critical Tuo MasiMaerkemu
Publication of CN113924126A publication Critical patent/CN113924126A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

提供了低免疫原性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的仿生纳米囊泡(hypo‑bioNV)，这些hypo‑bioNV包含经定制的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体可通过抗体片段scFV区域或病毒表位识别受体(VERR)识别靶标生物标志。提供了一种制备hypo‑bioNV的方法。提供了一种通过以下来治疗患有癌症的个体的方法：向个体施用这些hypo‑bioNV、靶向癌细胞和治疗该癌症。提供了一种通过以下来靶向个体的细胞的方法：向个体施用这些hypo‑bioNV和靶向待破坏或待治疗的细胞。

Description

为癌症肿瘤定制的低免疫纳米囊泡递送系统
发明背景
1.技术领域
本发明涉及用于递送治疗剂和基因编辑化合物的组合物和方法。
2.背景技术
将基因编辑治疗剂在体内有效地靶向递送至患病细胞仍然是现代生物技术面临的最大挑战之一。即使最近有所改进，递送机制始终存在抑制性问题，例如靶向不一致且低频、靶向适应性低、缺乏非自体方法、高度免疫中和、制造成本高、监管障碍(FDA临床持有)、产量/收集量/扩增量低、包装尺寸限制、低效包装、器官沉降(organ sinking)(肝脏和骨髓)、递送囊泡半衰期短和IP锁定(IP lock-up)。
AAV(腺相关病毒)是一种载体，通常用作基因编辑治疗剂的载体。AAV的大小约为22nm。AAV具有较高的肝沉降(尽管新突变体的较低)、有限的剂量(尽管新血清型的较高)、约1100个氨基酸的大小限制，大多数血清型是可扩展的，并且靶向效率受血清型嗜性的限制。
脂质体也可用作递送机制。脂质体的大小为50-1000nm。器官沉降和中和作用包括RES(网状内皮系统)、EPR(增强通透性和保留)、ABC(加速血液清除)、CARPA(补体激活相关的假性过敏)和调理作用。免疫中和是不同的并且依赖于配体。没有大小限制，但主动负载对于大多数化合物来说是有必要的，这很昂贵。制造还可以涉及配体添加或聚乙二醇化。脂质体是配体靶向的并且具有较差的肿瘤渗透性。
可调的树状大分子为1.5至10nm。它们与血液蛋白高度相互作用，并且增加了IgG巨噬细胞Fc清除率。包装限制包括外部缀合的核酸。可调的树状大分子尚未经过基因编辑用途的广泛测试。
聚合物胶束的大小为10-100nm。没有已知的器官沉降或中和作用或免疫中和。可能没有大小限制，并且它们还未经过基因编辑的广泛测试。聚合物胶束是配体靶向的和可诱导/可释放的刺激物。
外泌体的大小为30-150nm。它们的器官沉降和中和作用程度很高，但新突变体的可能会较低。它们具有低免疫原性，但其程度因每种配体而异。没有大小限制，但它们的负载效率非常低。治疗量的生产也很困难。外泌体是配体靶向的，并且具有平均肿瘤渗透性。
CAR T细胞也已被用于靶向细胞以治疗癌症。CAR T细胞疗法是一种需要收集患者自身的免疫细胞(T细胞)来治疗癌症的癌症疗法。T细胞通常攻击侵入性微生物，但在CAR T细胞疗法中，T细胞被重新工程化以攻击癌细胞。首先，T细胞从患者的血液中分离出来，并经过基因工程化以在其表面产生嵌合抗原受体(CAR)，使这些T细胞能够附着在特定的肿瘤抗原上。CAR并非天然存在的，而是由合成抗体的片段组成。CAR依靠T细胞内的信号传导和共刺激结构域来发挥作用。
一旦产生了CAR T细胞，它们就会扩增以大量产生，然后可以输回患者体内。通常地，患者在输注前已接受化学疗法以耗尽其淋巴细胞。CAR T细胞受其设计针对的癌细胞上的肿瘤抗原所吸引，并杀死具有这些抗原的癌细胞。
CAR T细胞疗法已被批准用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和成人晚期淋巴瘤。例如，靶向CD-19的CAR T细胞(tisangenlecleucel，KYMRIAHTM，诺华公司(Novartis))已用于治疗ALL。YESCARTATM(益基利仑赛(axicabtageneciloleucel)，风筝制药公司(Kite Pharmaceuticals))用于治疗淋巴瘤。已经进行了在CD-19表达缺失的细胞中靶向CD-22的研究。还研究了白血病中CD-19和CD-123的双重靶向。对于多发性骨髓瘤，已经研发出靶向BCMA的CAR T细胞。由于实体瘤周围的微环境，目前尚不清楚CAR T细胞是否可以治疗实体瘤，但正在进行关于靶向胰腺癌和肺癌上表达的间皮素以及靶向胶质母细胞瘤上表达的EGFRvIII的研究。
CAR T细胞疗法有几个缺点。它会导致引起高烧和低血压的细胞因子释放综合征。这可能需要额外的阻断IL-6活性的治疗。它还可能导致B细胞相继死亡(B细胞发育不全)，因此需要进一步用免疫球蛋白治疗以提供抗体。其他副作用包括脑水肿和神经毒性。患者也可能没有足够的T细胞可用于采集和工程化。第二轮治疗可能是必要的，尤其当肿瘤细胞失去抗原表达时。
另一种递送媒介物是仿生纳米囊泡(BioNV)或生物功能化脂质体样纳米囊泡(BLN)，它们是生物衍生的纳米级囊泡，类似于外泌体但更大。BioNV已成功用于被动靶向癌细胞(肿瘤组织中的积聚)的治疗(Wu等人(2018))，最近用于主动靶向癌细胞(功能化纳米囊泡识别肿瘤细胞中的受体)的治疗(Zhang等人(2018),Goh等人(2017)和Lunavat等人(2016))。此外，它们已成功用于测试抗炎特性(α4β7整合素-对炎性肠病的潜在作用)(Corbo等人(2017))以及衍生自原代肝细胞的肝细胞增殖(Wu等人(20108))。Molinaro等人(2018)使用基于微流体的平台将膜蛋白掺入仿生纳米囊泡的双层中，从而延长了保质期并保留了供体细胞的生物学功能。Jang等人(2013)研发了在全身施用后将化学治疗剂递送至肿瘤组织的生物启发的外泌体模拟纳米囊泡，这些纳米囊泡通过分解单核细胞或巨噬细胞(使用连续挤压以通过孔径逐渐减小的过滤器)而产生。纳米囊泡通过维持质膜蛋白的拓扑结构而具有天然的细胞靶向能力，并且负载有化学治疗药物的纳米囊泡被运送至肿瘤组织并减少肿瘤生长。
与外泌体相比，使用BioNV有几个优点。与收集外泌体(从患者身上采集时受到限制)相比，制造BioNV容易得多。因此，BioNV的可扩展性更大，制造也更容易。
BioNV是CRISPR Cas9系统的递送媒介物的一种选择(美国专利申请公开号20160281111、20170022507、20180119123、20180155789、20180236103和20180251770)。BioNV也可以通过CRISPR进行工程化(美国专利申请公开号20190085284)。Dooley等人的美国专利申请公开号20190060483披露了纳米囊泡的纯化方法，并且该纯化可能与外泌体上的表面蛋白有关。
仍然需要一种能够有效地在体内递送基因编辑产物和其他治疗剂的递送系统以及可以利用CAR T细胞靶向的递送系统。
发明内容
本发明提供了一种由基因编辑的iPSC产生仿生纳米囊泡(BioNV)的方法，该方法通过超声处理法、洗涤剂破碎法、酶破碎法或电穿孔法破坏基因编辑的iPSC的细胞膜以产生BioNV，然后通过微滤法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶纯化法、离心法或其组合纯化BioNV。
本发明提供了通过上述一种或多种方法产生的BioNV。
本发明提供了一种用于治疗疾病的包装在BioNV中的治疗剂的组合物。
本发明提供了一种产生具有靶向能力的BioNV的方法，该方法通过超声处理法、洗涤剂破碎法、酶破碎法或电穿孔法破坏具有靶向表面标志的基因编辑的iPSC的细胞膜。
本发明提供了具有靶向能力的BioNV。
本发明还提供了一种包装在具有靶向能力的BioNV中的治疗剂的组合物。
本发明提供了低免疫原性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的仿生纳米囊泡(hypo-bioNV)，这些hypo-bioNV包含经定制的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体可通过抗体片段scFV区域或病毒表位识别受体(VERR)识别靶标生物标志。VERR的实例可以是在各种癌细胞上靶向TEM8的SVV的vp1、vp2或vp3。其中任一个都可以用于CAR设计，以使得bioNV可靶向任何目的细胞。bioNV还可以包封和递送任何选择的生物药物。
本发明提供了一种制备hypo-bioNV的方法。
本发明提供了一种通过以下来治疗患有癌症的个体的方法：向个体施用这些hypo-bioNV、靶向癌细胞和治疗该癌症。
本发明提供了一种通过以下来靶向个体的细胞的方法：向个体施用这些hypo-bioNV和靶向待破坏或待治疗的细胞。
附图说明
在与以下附图结合考虑时，参照以下详细描述，会容易认识到并更好地理解本发明的其他优点：
图1是本发明的仿生纳米囊泡的衍生示意图；
图2是低免疫原性iPSC衍生的仿生纳米囊泡(hypo-bioNV)的实例；
图3是用于基因编辑的hypo-bioNV的实例；
图4是显示如何制造hypo-bioNV的示意图；
图5是两种不同的bioNV的示意图；
图6是bioNV的两种路径的示意图；
图7是bioNV的两种路径的示意图；
图8是制造过程的示意图；
图9是粒度分布图；以及
图10示出了hypo-bioNV的实例。
具体实施方式
本发明提供了低免疫原性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的仿生纳米囊泡(hypo-bioNV)，这些hypo-bioNV包含经定制的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体可通过抗体片段scFV区域或病毒表位识别受体(VERR)识别靶标生物标志。其中任一个都可以用于CAR设计，以使得bioNV可靶向任何目的细胞。bioNV还可以包封选择的任何小分子、生物、核酸和/或基因编辑治疗剂并将其递送至任何预期的细胞靶标，并且还可以治疗疾病，尤其是由病毒引起的疾病。图1示出了制备BioNV的方法，图2示出了hypo-BioNV的实例。
如本文所使用的“BioNV”是指可以具有设计的生物功能化的、生物衍生的纳米级囊泡。
如本文所使用的“iPSC”是指诱导多能干细胞，它是可以由成体细胞直接产生的干细胞。iPSC可以无限繁殖，并可以成为体内任何细胞类型。
术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合型(或非整合型)载体。“表达载体”是包含调控区域的载体。以下还进一步描述了载体。
术语“慢病毒载体”包括整合型和非整合型慢病毒载体。
病毒通过两个周期(裂解周期或溶原周期)之一复制。在裂解周期中，首先病毒穿透宿主细胞并释放其自身的核酸。然后，宿主细胞的代谢机制用于复制病毒核酸并在宿主细胞内积聚该病毒。一旦在宿主细胞内产生足够的病毒粒子，则宿主细胞破裂(裂解)并且病毒粒子继续感染另外的细胞。裂解性病毒可以将病毒DNA整合到宿主基因组中并且是非整合型的，其中在细胞感染期间不发生裂解。
如本文所使用的“溶原性病毒”是指通过溶原周期复制的病毒(即不导致宿主细胞破裂且将病毒核酸整合到宿主细胞DNA中)。溶原性病毒能够主要通过溶原周期复制，但有时通过裂解周期复制。在溶原周期中，病毒粒子DNA被整合到宿主细胞中，并且当宿主细胞繁殖时，病毒粒子DNA被复制到由细胞分裂所得的细胞中。在溶原周期中，宿主细胞不会破裂。使用本发明的组合物和方法治疗的溶原性病毒可以包括但不限于：甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、劳斯肉瘤病毒、HPV病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、狂犬病病毒、水疱性病毒、细胞质弹状病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、布尼奥罗病毒、拉沙病毒、胡宁病毒、马邱波病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、弗莱克索病毒、怀特沃特阿罗约病毒(Whitewater Arroyo virus)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、JC病毒、以及BK病毒。
如本文所使用的“裂解性病毒”是指通过裂解周期复制的病毒(即在细胞内病毒积聚后导致宿主细胞破裂)。裂解性病毒能够主要通过裂解周期复制，但有时通过溶原周期复制。使用本发明的组合物和方法治疗的裂解性病毒可以包括但不限于：甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、柯萨奇病毒、HSV-1、HSV-2、巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、劳斯肉瘤病毒、轮状病毒、东南亚十二节段RNA病毒(seadornavirus)、科罗拉多蜱传热病毒(coltivirus)、JC病毒和BK病毒。
本发明的组合物可用于治疗由活性病毒或潜伏性病毒引起的感染。本发明的组合物可用于治疗其体内存在潜伏性病毒但个体尚未表现出病毒症状的个体。这些组合物可以在个体的任何细胞中靶向病毒，例如但不限于：CD4+淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突细胞(如朗格汉斯细胞和滤泡树突状细胞)、造血干细胞、内皮细胞、脑小胶质细胞和胃肠上皮细胞。
如本文所使用的“gRNA”指的是指导RNA。CRISPR Cas系统中的gRNA和本文中的其他CRISPR核酸酶用于将CAR T细胞工程化。这通过使用一种或多种特异性设计的gRNA来实现，以避免使用单个gRNA所见的问题，例如突变。该gRNA可以是与编码序列或非编码序列互补的序列，并且可以针对待靶向的特定序列进行定制。该gRNA可以是与蛋白质编码序列互补的序列，例如编码一种或多种病毒结构蛋白的序列。该gRNA序列可以是正义序列或反义序列。应当理解，当在本文中施用基因编辑器组合物时，这优选地(但不限于)包括两个或更多个gRNA；然而，也可以使用单个gRNA。
如本文所使用的“核酸”是指RNA和DNA两者，包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和含有核酸类似物的DNA(或RNA)，以上中的任何一种可以编码本发明的多肽，并且以上所有都涵盖在本发明中。多核苷酸可以基本上具有任何三维结构。核酸可以是双链或单链的(即，正义链或反义链)。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)及其部分、转移RNA、核糖体RNA、siRNA、微小RNA、短发夹RNA(shRNA)、干扰RNA(RNAi)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化型多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物，以及核酸类似物。在本发明的上下文中，核酸可以编码良性表面标志，其表达受病毒(用于清除病毒感染的细胞)或表观遗传调控元件(用于清除癌细胞)的调控。
“分离的”核酸可以是例如天然存在的DNA分子或其片段，其条件是通常发现在天然存在的基因组中紧密侧接该DNA分子的核酸序列中的至少一个被去除或不存在。因此，分离的核酸包括但不限于作为单独的分子存在、不依赖于其他序列的DNA分子(例如化学合成的核酸，或由聚合酶链式反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。分离的核酸还指被整合到载体、自主复制性质粒、病毒中或者原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。另外，分离的核酸可以包括工程化的核酸，例如作为杂交体或融合核酸的一部分的DNA分子。存在于例如cDNA文库或基因组文库中的或含有基因组DNA限制性消化的凝胶切片中的许多(例如数十或数百至数百万)其他核酸不是分离的核酸。
分离的核酸分子可以通过标准技术生产。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得含有本文所述核苷酸序列(包括编码本文所述多肽的核苷酸序列)的分离的核酸。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。例如，各种PCR方法描述于例如：PCR Primer:ALaboratory Manual[PCR引物:实验室手册],Dieffenbach和Dveksler编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1995。通常，来自目的区域的末端或更远端的序列信息被用来设计与待扩增的模板的相反链的序列相同或相似的寡核苷酸引物。各种PCR策略也可用于将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。
分离的核酸也可以是化学合成的，作为单个核酸分子(例如，使用亚磷酰胺技术在3'至5'方向使用自动化DNA合成)或作为一系列寡核苷酸。例如，可以合成含有所需序列的一对或多对长寡核苷酸(例如，>50-100个核苷酸)，其中每对含有具有互补性的短区段(例如约15个核苷酸)，使得寡核苷酸对退火时形成双链体。使用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸，产生单个双链核酸分子/寡核苷酸对，然后可以将其连接到载体中。本发明的分离的核酸也可以通过诱变例如编码Cas9的DNA的天然存在部分(根据例如上式)而获得。
更具体地，本发明提供了一种由基因编辑的iPSC产生生物纳米囊泡(BioNV)的方法，该方法通过超声处理、洗涤剂破碎细胞、酶破碎细胞(例如胰蛋白酶化)或使用电穿孔破坏基因编辑的iPSC的细胞膜。应当理解，虽然下文进一步提及超声处理，但上述任何方法均可用于破坏细胞膜。BioNV通常是包封可用于运送治疗剂的内部空间的膜。该方法包括在摇床中用温和的洗涤剂处理诱导囊泡出芽、低速离心以收集囊泡和Covaris超声处理(囊泡粒度测定和负载)。可以使用马尔文纳米粒径电位分析仪(Malvern Zetasizing)和流式细胞术进行分析。本发明还提供了通过该方法产生的BioNV。BioNV的直径可以是20-1000nm。
最优选地，基因编辑的iPSC是CRISPR修饰的iPSC并且是低免疫原性的(Hypo-iPSC)，如Deuse等人(Nature Biotechnology[自然生物技术],第37卷,2019年3月,第252-258页)中所描述。这些iPSC已被修饰为使MHC I类和II类基因失活并过表达CD47，因此产生的iPSC是同种异体的，并且不会在施用它们的患者中引起免疫反应。因此，衍生自此类iPSC的BioNV可用于所有患者。多种基因编辑方法(下文进行了进一步描述)可替代CRISPR/Cas9用于产生iPSC细胞，例如但不限于TALEN、ZFN、RNA酶P RNA、C2c1、C2c2、C2c3、Cas9、Cpf1、TevCas9、古细菌Cas9、CasY.1、CasY.2、CasY.3、CasY.4、CasY.5、CasY.6或CasX。如图1所示，使用CRISPR或其他基因编辑方法对Hypo-iPSC进行修饰，以将所需Hypo-iPSC衍生的稳定细胞系工程化，该细胞系过表达可用于靶向策略以治疗任何疾病的任何潜在的表面配体。Hypo-iPSC可以包括靶向所需细胞或组织的表面标志或配体，例如但不限于靶向CD4+细胞的HIV gp120/gp41、治疗HBV的肝细胞ApoE或用于各种癌症和/或病毒感染的细胞靶标的CAR或VERR。然后，对Hypo-iPSC标志/配体阳性细胞进行超声处理以剪切细胞从而产生BioNV，通过微滤法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶纯化法、离心法或其组合进行纯化，并且1.负载治疗剂(例如但不限于，具有由DNA载体、蛋白质、RNA和/或小分子表达的gRNA的CRISPR Cas核酸酶)，2.通过表达CRISPR Cas核酸酶和/或由染色体整合和稳定的“基因编辑盒”(可以通过药物如四环素-Tet On/Off系统进行调控)表达gRNA进行预负载。结果得到可注射治疗剂。
因此，BioNV可使用超声处理进行扩展，从而不再个性化。以前从个体患者的PBMC(使用超声FAF方法)获得BioNV的方法提供了个性化的BioNV制造和开发方法，由于在跨患者群体中会发生免疫反应，这种方法会仅限于个体患者，因此商业上不可行。本发明通过提供可用于所有患者群体的BioNV来解决该问题。
本发明具有优于现有技术的几个优点。通过使用同种异体iPSC作为BioNV衍生的来源，可以对BioNV进行工程化以负载任何可以靶向所需受体的配体。同种异体iPSC可以被工程化成过表达任何配体，该配体又可以识别任何受体。一旦负载配体的同种异体iPSC被工程化，BioNV就会从细胞系中衍生出来，与正确的载体治疗剂(例如DNA载体上的CRISPRCas核酸酶和gRNA)一起包装，然后递送至靶细胞。
本发明还提供了一种用于治疗疾病(例如由病毒和癌症引起的疾病)的包装在BioNV中的治疗剂的组合物。该治疗剂可以是但不限于DNA、质粒DNA、RNA、蛋白质或其组合。该组合物可以通过超声处理、转染或电穿孔法制备。该治疗剂可递送至任何靶标，并且BioNV递送可以是全身性的，因为BioNV衍生自没有任何表面标志的iPSC。
本发明还提供具有靶向能力的BioNV和制备具有靶向能力的BioNV的方法。使用标准细胞系开发方案，并使用CRISPR(或其他基因编辑器)修饰的同种异体iPSC，可以开发稳定的细胞系，其中所需靶器官或细胞类型的表面标志(例如肝细胞靶向的ApoE)，在CRISPR修饰的同种异体iPSC中组成型表达(由强启动子，如CMV等)。所需表面标志的表达使得iPSC可在其细胞膜上呈现表面标志。一旦表面标志在CRISPR修饰的同种异体iPSC(“具有靶向能力”的iPSC细胞系)的细胞膜上表达，就使用上述超声处理方案从细胞系中衍生出BioNV。现在BioNV上包覆了表面标志(例如用于肝细胞靶向的ApoE)，从而赋予它们靶向特性。
本发明还提供了一种包装在具有靶向能力的BioNV中的治疗剂的组合物。如上所述，治疗剂可以包装在BioNV中。
本文的组合物可用于治疗上述任何病毒(由其引起的疾病)，无论是溶原性病毒还是裂解性病毒或这两者。组合物还可用于治疗各种不希望的细胞类型，例如癌前细胞、癌细胞或由病毒引起的癌细胞。
Hypo-bioNV还可以负载任何CRISPR-gRNA(或基因编辑器)表达质粒治疗剂，用于有效和纠正性基因疗法。图3示出了实例。
CRISPR Cas9基因编辑已被用于产生衍生自人CD34+脐带血的低免疫原性hiPSC细胞系。这种CD34+脐带血衍生的细胞系作为bioNV开发、生产和制造的基础来源，用于递送针对遗传性疾病的基因编辑治疗剂、以及针对癌细胞微环境的抗癌治疗剂。Deuse等人(2019)广泛测试了CD34+脐带血衍生的低免疫原性细胞系，以证实HLA 1/2的低表达和CD47的过表达。一旦得到证实，就会在人源化小鼠研究中另外对细胞进行低免疫表型测试。与导致INF-Υ表达、IgM反应和NK细胞激活的野生型细胞系相比，低免疫原性iPSC不会引发这些反应中的任一种。当iPSC系分化为心肌细胞和上皮细胞时，重复这些实验中的每一个(具有相似的结果)。
CAR T细胞已被证明是含有CAR表面受体的仿生纳米囊泡的极佳来源。与单独的CAR T细胞疗法相比，CAR包覆的BioNV已被证明具有几个关键优势。Deuse等人报道了它们具有强效的抗癌特性，而不会发生细胞因子风暴或无法控制的细胞毒性。它们可以进入肿瘤微环境而不会丧失功能和肿瘤渗透性。没有任何可能导致畸胎瘤形成的基因信息转移。存在针对单一癌症类型或同时针对多种癌症的多靶标功能。
Fu等人(2019)报道了CAR T细胞已被证明分泌外泌体(典型地比BNV小10倍)，这些外泌体表面含有等效浓度的CAR受体，同时含有抑制肿瘤生长的高水平细胞毒性分子。Fu等人证明了当CAR T细胞受到抗原刺激时，释放的外泌体浓度高出约7-8倍。免疫印迹分析显示衍生自全细胞提取物的CAR T细胞表面上的CAR浓度，以及衍生自CAR T细胞(受到CD28/CD3珠或癌细胞抗原刺激的刺激)的外泌体的浓度。外泌体CAR以浓度依赖性方式与癌症抗原结合，而这种相互作用可以被阻断抗体CTX(西妥昔单抗)和TTZ(曲妥珠单抗)破坏。Fu等人还证明了CAR外泌体在多种癌症类型中具有抗肿瘤活性。以增加的CAR-EXO浓度依赖性方式，CAR-EXO-CTX(具有西妥昔单抗scFv的CAR外泌体)和CAR-EXO-TTZ(具有曲妥珠单抗scFv的CAR外泌体)在含乳腺癌和肺腺癌肿瘤的小鼠异种移植模型中显示出肿瘤显著减少。将建立为皮下异种移植物的衍生自患者的肿瘤组织片段用100μg剂量的CAR-EXO-TTZ处理，在HER2阳性乳腺癌和卵巢癌模型中显示出相当大的肿瘤抑制作用。
在本发明中，可在衍生自CD34+脐带血的无HLA1/HLA2细胞系中的低免疫原性iPSC中产生关键基因的减除和增加。
B2M-/-→HLA1低免疫的
CIITA-/-→HLA2低免疫的
CD47-/-→无CD47(恢复的吞噬作用)
PD1-/-→PDL1抗性消除
具有Cpf1指导的核酸酶交换系统(swap out system)的上游CRISPRa CAR表达盒可用于改变基因。
本发明的hypo-bioNV可以如下制备，如图4中的示意图所示。首先是药物调控的(例如Tet调控的)CRISPRa+靶向3x转录因子靶向gRNA系统(Drm2、Fr5、Bxp2-已显示可上调抗体产生的基因)的稳定细胞整合(安全港基因组定位)。三个上游转录因子的CRISPR激活系统触发信号级联事件，该事件增强了CAR的产生，这些CAR在指定基因座取代了内源性抗体ORF。然后，使用Cpf1定向的(或任何其他CRISPR Cas/ZFN、TALEN)HDR，将CDR和H&L抗体区域稳定替换成CAR盒。一旦CAR盒稳定整合，就可以使用Cpf1定向的(或任何其他CRISPRCas/ZFN、TALEN)HDR将该盒的scFV和VERR区域(靠近该盒的5'端)“交换”为任何所需的scFV或VERR。
这个方法可用于产生具有不同功能的hypo-bioNV，如图5所示，其中详细说明了如何在hypo-bioNV表面表达第一代和第二代CAR。例如，一种类型的hypo-bioNV可以仅衍生自仅表达CAR(scFV或VERR)表面配体的靶细胞系。这些细胞系可以经进一步改造来表达必需的和定制的蛋白质或核酸，这些蛋白质或核酸可以包装在最终结果bioNV中。另一种类型的hypo-bioNV可以衍生自含有激活淋巴细胞颗粒和细胞因子反应所必要的胞内CAR(scFV或VERR)组分的靶细胞系。此外，这个基础细胞系可以从其多能状态分化为所需淋巴细胞(T细胞、NK、巨噬细胞)，然后可以从淋巴细胞衍生出bioNV。由此产生的bioNV表面包覆有第2代CAR(scFV或VERR)配体，并负载有引发肿瘤杀伤的因子。
细胞系可以设计为表达任何具有抗癌或抗病毒特性的蛋白质和/或核酸治疗剂，如表1所示。
表1
修饰 表型
B2M-/-CIITA-/- HLA1/HLA2低免疫性
CD47-/- 吞噬功能化
PD1-/- PDL1抗性消除
CORE初级CAR表达盒 特定生物标志靶向
↑↑穿孔素和颗粒酶B表达 肿瘤细胞毒性/细胞凋亡
Fas配体+ve 诱导细胞凋亡
↑↑NCAM(可选的) 细胞黏附(神经和造血)
选择治疗性表达 特定药物作用
这可以消除对生物治疗剂的过表达和预包装的需要。使用此过程开发的细胞系含有激活淋巴细胞所必要的第二代CAR配体。一旦表达了所需的CAR配体，细胞系就会分化为CAR淋巴细胞，使用适当的抗原激活，然后进行加工以产生“负载和靶向的”bioNV。细胞系可以具有表2中列出的修饰。
表2
修饰 表型
B2M-/-CIITA-/- HLA1/HLA2低免疫性
CD47-/- 吞噬功能化
PD1-/- PDL1抗性消除
ADVANCE第2代CAR表达盒 具有淋巴细胞激活的特定生物标志靶向
淋巴细胞激活修饰N/A 负载激活的淋巴细胞的BioNV
图6示出了在递送各种类型的药物或细胞因子的情况下、在bioNV表面上的第一代与第二代CAR的情况下制备bioNV的方法。在一种路径中，CAR和蛋白质仅表达且无分化。存在初级CAR和所需的蛋白治疗性表达。存在从iPSC进行bioNV加工。BioNV含有初级表面CAR和必需的(但有限的)淋巴细胞激活蛋白＝穿孔素和颗粒酶B。不需要抗原激活，并且可以添加额外的抗癌药物。
在图7中的另一种路径中，iPSC分化为淋巴细胞细胞系，并且不需要包装。存在第二代CAR表达。为了表达淋巴细胞细胞因子库，需要抗原刺激。存在从淋巴细胞进行bioNV加工。衍生自淋巴细胞的所得bioNV含有激活和靶向能力的特性。
可以进行修饰，如表3所示。通过在衍生自CD34+脐带血的无HLA1/HLA2细胞系中工程化关键基因的减除和添加，基础iPSC具有低免疫原性。
表3
Figure BDA0003389623360000131
Figure BDA0003389623360000141
图7示出了用于制备用于递送基因编辑治疗剂的bioNV的两种途径。在一种路径中，CAR和蛋白质表达且无分化。存在初级(第一代)CAR表达。存在从iPSC进行bioNV加工。存在ASA介导的质粒或狗骨架负载。存在基因编辑器和gRNA编码质粒或狗骨架DNA，其经由电穿孔或超声处理插入bioNV中。
在图7中的另一种路径中，存在初级(第一代)CAR和基因编辑器/gRNA过表达且无分化。存在初级CAR和所需的编辑器/gRNA治疗性表达。存在从iPSC进行bioNV加工。存在预负载的基因编辑器以及由稳定整合和药物诱导的“基因编辑盒”表达的gRNA。
图8示出了hypo-bioNV的制造过程。使用以下两种既定方法完成从亲本iPSC细胞系中释放BNV：1)脱氧胆酸钠出芽(研究目的)或2)温和的洗涤剂破碎(制造)。这导致hypo-bioNV的大小范围为1000-1200nm，HLA1/HLA2阴性(低免疫的)，CD47-/-以促进吞噬作用，PD1-/-用于PDL1抗性消除。
图9示出了按强度划分的大小分布。Zetasizer Nano ZS通过激光散射测量溶液中的粒度。这个样品显示三个峰：1)约12nm＝蛋白质聚集体，2)约50nm＝亚细胞碎片、膜片段和3)约1000nm＝经定制的纳米囊泡。图10示出了bioNV的实例。
Hypo-bioNV可以含有各种治疗剂，例如TALEN、ZFN、RNA酶P RNA、C2c1、C2c2、C2c3、Cas9、Cpf1、TevCas9、古细菌Cas9、CasY.1、CasY.2、CasY.3、CasY 4、CasY.5、CasY.6或CasX的基因编辑器。基因编辑器还可以包括gRNA，如本文所使用的，它指的是指导RNA。该gRNA可以是与编码序列或非编码序列互补的序列，并且可以针对待靶向的特定序列进行定制。该gRNA可以是与蛋白质编码序列互补的序列，例如编码一种或多种病毒结构蛋白(例如gag、pol、env和tat)的序列。该gRNA序列可以是正义序列或反义序列。应当理解，当在本文中施用基因编辑器组合物时，这优选地(但不限于)包括两个或更多个gRNA；然而，也可以使用单个gRNA。
本发明提供了一种通过以下来治疗患有癌症的个体的方法：向个体施用这些hypo-bioNV、靶向癌细胞和治疗该癌症。CAR受体(可由scFV或VERR区域组成)可以识别其在癌细胞上的特定生物标志。一旦CAR与癌细胞(靶标)上的生物标志对接/相互作用，它就会释放其有效负载(药物、细胞因子、肽、基因编辑器/gRNA、质粒等)
hypo-bioNV可以靶向与以下疾病相关的癌症细胞：腺样囊性癌、肾上腺肿瘤、淀粉样变性、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、减毒家族性腺瘤性息肉病、贝克威思－威德曼综合征(Beckwith-Wiedermann Syndrome)、胆管癌、伯特-霍格-杜布综合征、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、类癌、卡尼综合征、中枢神经系统肿瘤、子宫颈癌、结直肠癌、多发性错构瘤综合征、颅咽管瘤、婴儿促纤维增生性神经节细胞胶质瘤、内分泌肿瘤、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、眼癌、眼睑癌、输卵管癌、家族性腺瘤性息肉病、家族性恶性黑色素瘤、家族性非VHL透明细胞肾细胞癌、胆囊癌、加德纳综合征、胃肠道间质瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层疾病、头颈癌、弥漫性胃癌、平滑肌瘤病及肾细胞癌、混合性息肉病综合征、胰腺炎、乳头状肾细胞癌、HIV和AIDS相关癌症、胰岛细胞肿瘤、幼年性息肉病综合征、肾癌、泪腺肿瘤、喉癌及下咽癌、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性T细胞淋巴细胞白血病、嗜酸性粒细胞白血病、利-弗劳梅尼综合征、肝癌、肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、林奇综合征、肥大细胞增多症、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、Muir-Torre综合征、多发性内分泌肿瘤1型、多发性内分泌肿瘤2型、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、MYH相关息肉病、鼻腔癌及鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、神经纤维瘤病1型、神经纤维瘤病2型、痣样基底细胞癌综合征、口腔癌及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、波伊茨-耶格综合征、垂体肿瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、腺泡状软组织和心脏肉瘤、卡波西肉瘤、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、结节性硬化症综合征、特科特综合征、不明原发癌、子宫癌、阴道癌、希佩尔-林道综合征、肾母细胞瘤或着色性干皮病。
本发明提供了一种通过以下来靶向个体的细胞的方法：向个体施用这些hypo-bioNV和靶向待破坏或待治疗的细胞。CAR受体(可由scFV或VERR区域组成)可以识别其在待破坏或待治疗的细胞上的特定生物标志。一旦CAR与细胞(靶标)上的生物标志对接/相互作用，它就会释放其有效负载(药物、细胞因子、肽、基因编辑器/gRNA、质粒等)。bioNV可以进入肿瘤微环境而不会失活，并且可以较其他方法更有效地递送其有效负载。
Hypo-bioNV包封了激活T细胞的关键强效组分。与在肿瘤微环境中功效有限的CAR疗法不同，本发明的hypo-bioNV克服了这个问题，通过将淋巴细胞拳(punch)包装到患病细胞，并且没有与当前方法相关的副作用。Hypo-bioNV消除了细胞因子风暴的可能性，为任何肿瘤微环境提供了稳定且定制的靶向通路，并且与其他递送系统相比具有更高的肿瘤渗透功效。Hypo-bioNV具有高频和定制靶向的优势，具有高度的适应性，是现成的同种异体，具有低免疫性，允许高质量的制造和可扩展性，以及均匀和有靶向性的生物分布。
可用于工程化iPSC的基因编辑器如下。一旦构建了iPSC，基因编辑器表达盒(可受药物调控，也可不受药物调控)也可以稳定掺入。iPSC系现在将有可以开启的基因编辑器表达盒。一旦开启，编辑器(和gRNA)将在细胞中过表达。然后对细胞进行处理以产生bioNV，并且bioNV现在具有基因编辑器，该基因编辑器中包装有所需的gRNA，用于作为治疗剂递送至其预期的细胞靶标。下面列出的任何基因编辑器都可以在这种情况下起作用。
锌指核酸酶(ZFN)在特定DNA位置产生双链断裂。ZFN具有两个功能域，一个识别6bp DNA序列的DNA结合结构域和一个核酸酶Fok I的DNA切割结构域。
TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)包括TAL效应DNA结合结构域，该结构域与产生DNA中双链断裂的DNA切割结构域融合。
人WRN是由维尔纳综合征基因编码的RecQ解旋酶。它涉及基因组维护，包括复制、重组、切除修复和DNA损伤应答。这些遗传过程和WRN的表达在许多类型的癌症中同时上调。因此，有人提出，该解旋酶的靶向破坏可用于消除癌细胞。报告已经应用外部指导序列(EGS)方法指导RNA酶P RNA有效切割培养的人细胞系中的WRN mRNA，从而消除了这种独特的3'-5'DNA解旋酶-核酸酶的翻译和活性。
2类VI-A型CRISPR/Cas效应子“C2c2”展示了RNA指导的RNA酶功能，并且可以通过如上所述的盒在iPSC中作为治疗剂进行包装和递送。C2c2来自细菌沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)，并提供对RNA噬菌体的干扰。体外生化分析显示C2c2由单个crRNA指导，并且可以被编程以切割携带互补原型间隔子的ssRNA靶标。在细菌中，C2c2可以被编程以敲低特定的mRNA。切割由两个保守的HEPN结构域中的催化残基介导，其中的突变产生催化失活的RNA结合蛋白。C2c2的聚焦RNA的行动补充了CRISPR-Cas9系统，该系统靶向DNA，即细胞身份和功能的基因组蓝图。仅靶向RNA的能力(其有助于执行基因组指令)提供了以高通量方式特异性操纵RNA—并且更广泛地操纵基因功能的能力。这些结果证明了C2c2作为新的RNA靶向工具的能力。
在本发明中还可以使用另一种2类V-B型CRISPR/Cas效应子“C2c1”用于编辑DNA。C2c1含有与Cpf1较远相关的RuvC样内切核酸酶结构域(以下所述)。C2c1可以位点特异性地靶向和切割靶DNA的两条链。根据Yang等人(PAM-Dependent Target DNA Recognition andCleavage by C2c1 CRISPR-Cas Endonuclease[C2c1CRISPR-Cas内切核酸酶的PAM依赖性靶DNA识别和切割],Cell[细胞],2016年12月15日；167(7):1814-1828))，晶体结构证实酸土脂环酸芽孢杆菌C2c1(AacC2c1)与sgRNA结合作为二元复合物并且靶向DNA作为三元复合物，从而捕获AacC2c1的催化能力构象，其中靶和非靶DNA链两者独立地定位在单个RuvC催化口袋内。Yang等人证实C2c1介导的切割导致靶DNA的错开的七-核苷酸断裂，crRNA在二元复合物中采用预先排序的五-核苷酸A型种子序列，其中释放插入的色氨酸，促进20-bp指导RNA:三元复合物形成上的靶DNA异源双链的拉链式配对，并且PAM相互作用的裂缝在三元复合物形成上采用“锁定”构象。
C2c3是V-C型基因编辑器效应子，与C2c1有较远关系，并含有RuvC样核酸酶结构域。C2c3也类似于以下描述的CasY.1-CasY.6组。
如本文所使用的“CRISPR Cas9”是指成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关内切核酸酶Cas9。在细菌中，CRISPR/Cas基因座编码针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的RNA指导的适应性免疫系统。已经鉴定了三种类型(I-III)的CRISPR系统。CRISPR簇含有间隔子，即与先前的移动元件互补的序列。CRISPR簇被转录并加工成成熟的CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)RNA(crRNA)。CRISPR相关内切核酸酶Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，并具有强的切割靶DNA的内切核酸酶活性。Cas9由成熟的crRNA(其含有约20个碱基对(bp)的独特靶序列(称为间隔子))和反式激活的小RNA(tracrRNA)(其可用作前crRNA的核糖核酸酶III辅助的加工的指导)指导。crRNA:tracrRNA双链体经由crRNA上的间隔子与靶DNA上的互补序列(称为原型间隔子)之间的互补碱基配对来指导Cas9靶向DNA。Cas9识别三核苷酸(NGG)原型间隔子相邻基序(PAM)以指定切割位点(来自PAM的第3核苷酸)。crRNA和tracrRNA可以单独表达或经由合成的茎环(AGAAAU)工程化到人工融合小指导RNA(sgRNA)中以模拟天然crRNA/tracrRNA双链体。这种sgRNA，如shRNA，可被合成或体外转录用于直接RNA转染或者从U6或H1促进的RNA表达载体表达，尽管人工sgRNA的切割效率低于具有单独表达的crRNA和tracrRNA的系统的切割效率。
CRISPR/Cpf1是一种类似于CRISPR/Cas9系统的DNA编辑技术，由博德研究所(Broad Institute)和麻省理工学院(MIT)的Feng Zhang小组于2015年表征。Cpf1是II类CRISPR/Cas系统的RNA指导型内切核酸酶。这种获得性免疫机制见于普雷沃菌属(Prevotella)和弗朗西丝氏菌属(Francisella)细菌中。它可以防止病毒对基因的损伤。Cpf1基因与CRISPR基因座相关联，编码使用指导RNA来发现和切割病毒DNA的内切核酸酶。Cpf1是一种比Cas9更小更简单的内切核酸酶，克服了CRISPR/Cas9系统的一些局限性。CRISPR/Cpf1可以具有多种应用，包括遗传性疾病和退行性病症的治疗。
还可以使用CRISPR/TevCas9系统。在某些情况下，已经表明一旦CRISPR/Cas9在一个点中切割DNA，生物体细胞中的DNA修复系统将修复切割位点。TevCas9酶被开发用于在靶标的两个位点处切割DNA，因此细胞的DNA修复系统难以修复切割(Wolfs等人,Biasinggenome-editing events toward precise length deletions with an RNA-guidedTevCas9 dual nuclease[用RNA指导的TevCas9双核酸酶使基因组编辑事件偏向精确长度的缺失],PNAS[美国科学院院报],doi:10.1073)。TevCas9核酸酶是I-Tevi核酸酶结构域与Cas9的融合体。
Cas9核酸酶可以具有与野生型酿脓链球菌(Streptococcuspyrogenes)序列相同的核苷酸序列。在一些实施例中，CRISPR相关内切核酸酶可以是来自其他物种的序列，例如其他链球菌属(Streptococcus)物种，例如嗜热链球菌；铜绿假单胞菌(Psuedomonaaeruginosa)，大肠杆菌(Escherichia coli)，或其他经测序的细菌基因组和古细菌，或其他原核微生物。可替代地，可以修饰野生型酿脓链球菌Cas9序列。可以对核酸序列进行密码子优化以在哺乳动物细胞中有效表达，即“人源化”。人源化Cas9核酸酶序列可以是例如由Genbank登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765中列出的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。可替代地，Cas9核酸酶序列可以是例如含有在可商购载体例如来自Addgene公司(剑桥，马萨诸塞州)的PX330或PX260内的序列。在一些实施例中，Cas9内切核酸酶可以具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列是Genbank登录号KM099231.1GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；或KM099233.1GI:669193765的任何Cas9内切核酸酶序列的变体或片段，或是PX330或PX260(Addgene公司，剑桥，马萨诸塞州)的Cas9氨基酸序列。可以修饰Cas9核苷酸序列以编码Cas9的生物活性变体，并且这些变体可以具有或可以含有例如由于含有一个或多个突变(例如，添加、缺失或取代突变、或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。这些取代突变中的一个或多个可以是取代(例如，保守的氨基酸取代)。例如，Cas9多肽的生物活性变体可以具有与野生型Cas9多肽具有至少或约50％序列同一性(例如，至少或约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。保守性氨基酸取代典型地包括在下组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。Cas9氨基酸序列中的氨基酸残基可以是非天然存在的氨基酸残基。天然存在的氨基酸残基包括由遗传密码天然编码的氨基酸残基以及非标准氨基酸(例如具有D-构型而不是L-构型的氨基酸)。本发明的肽还可以包括是标准残基的修饰版本的氨基酸残基(例如吡咯赖氨酸可以用来代替赖氨酸，以及硒代半胱氨酸可以用来代替半胱氨酸)。非天然存在的氨基酸残基是那些在自然界中未被发现，但符合氨基酸的基本化学式并可以掺入肽中的氨基酸残基。这些包括D-别异亮氨酸(2R,3S)-2-氨基-3-甲基戊酸和L-环戊基甘氨酸(S)-2-氨基-2-环戊基乙酸。对于其他实例，可以查阅教科书或浏览万维网(该网站目前由加利福尼亚理工学院维护并显示已经成功掺入功能性蛋白质中的非天然氨基酸的结构)。Cas-9还可以是下表4中示出的任何一种。
表4
Figure BDA0003389623360000201
Figure BDA0003389623360000211
尽管RNA指导的内切核酸酶Cas9已经成为一种通用的基因组编辑平台，但有些报道称，常用的来自酿脓链球菌(SpCas9)的Cas9的大小限制了其用于基础研究和使用高度通用的腺相关病毒(AAV)递送媒介物的治疗应用的效用。因此，已经使用了六个较小的Cas9直系同源物，并且报道已显示来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)可以编辑基因组，其效率类似于SpCas9，但是比它短了多于1千碱基。
SaCas9为1053bp，而SpCas9为1358bp。
Cas9核酸酶序列或本文所述的任何基因编辑器效应序列可以是突变序列。例如，Cas9核酸酶可以在保守的HNH和RuvC结构域中突变，这些结构域参与链特异性切割。例如，RuvC催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸(D10A)突变允许Cas9切口酶突变体(Cas9n)使DNA产生缺口而不是切割DNA，以产生单链断裂，并且随后通过HDR进行的优先修复可以潜在地减少不希望的来自脱靶双链断裂的插入缺失突变的频率。通常地，基因编辑器效应序列的突变可以最小化或阻止脱靶。
基因编辑器效应子也可以是古细菌Cas9。古细菌Cas9的大小为950aa ARMAN 1和967aa ARMAN 4。古细菌Cas9可以衍生自ARMAN-1(CandidatusMicrarchaeumacidiphilumARMAN-1)或ARMAN-4(CandidatusParvarchaeumacidiphilum ARMAN-4)。
本文的任何基因编辑器效应子也可以用Tev或任何其他合适的归巢蛋白结构域标记。根据Wolfs等人(Proc Natl Acad Sci USA.[美国科学院院报]2016年12月27日；113(52):14988-14993.doi:10.1073/pnas.1616343114.Epub 2016年12月12日)，Tev是RNA指导的双活性位点核酸酶，可在靶位点产生两个不相容的DNA断裂，有效地删除大部分靶位点，使其无法再生。
还提供了含有例如本文所述的那些核酸的载体。“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，向其中可插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。通常，载体在与适当控制元件缔合时能够复制。合适的载体骨架包括例如本领域常规使用的那些，例如质粒、病毒、人造染色体、BAC、YAC或PAC。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体和整合型载体。“表达载体”是包含调控区域的载体。许多载体和表达系统可从诺瓦根公司(Novagen)(麦迪逊，威斯康辛州)、克隆科技公司(Clontech)(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)、斯图特基因公司(Stratagene)(拉荷亚，加利福尼亚州)和英杰公司/生命技术公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)等公司商购。
本文提供的载体还可以包括例如复制起点、支架附着区(SAR)和/或标志。标志基因可赋予宿主细胞可选择的表型。例如，标志可赋予杀生物剂抗性，例如对抗生素(例如卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)的抗性。如上所指出，表达载体可以包括标签序列，该标签序列被设计成促进表达的多肽的操作或检测(例如纯化或定位)。标签序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素或FlagTM标签(柯达公司，纽黑文，康涅狄格州)序列典型地表达为与编码的多肽的融合体。这样的标签可以插入多肽内的任何位置，包括羧基或氨基末端处。
另外的表达载体也可以包括例如染色体的、非染色体的和合成的DNA序列的区段。合适的载体包括SV40的衍生物和已知细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如噬菌体1的众多衍生物，例如NM989，以及其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA组合的载体，例如已修饰为采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒。
该载体还可以包括调控区域。术语“调控区域”是指影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列。调控区域包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列、核定位信号和内含子。
如本文所使用的，术语“有效地连接”是指将调控区域和待转录的序列定位在核酸中以影响这种序列的转录或翻译。例如，为了使编码序列处于启动子的控制之下，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点典型地位于启动子下游一个至约五十个核苷酸之间。然而，启动子可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸处或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。启动子典型地包含至少一个核心(基础)启动子。启动子还可以包括至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或上游激活区域(UAR)。待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平以及细胞或组织优先表达。本领域技术人员通过适当选择和定位相对于编码序列的启动子和其他调控区域来调控编码序列的表达是常规问题。
载体包括例如病毒载体(例如腺病毒(“Ad”)、腺相关病毒(AAV)、以及水泡性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其他含脂质的复合物，以及其他能够介导多核苷酸到宿主细胞的递送的大分子复合物。载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或者以其他方式对靶细胞提供有益特性的其他组分或功能性。如以下所述以及更详细所示，这样的其他组分包括，例如，影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞型或组织特异性结合的组分)；影响细胞吸收载体核酸的组分；影响吸收后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如介导核定位的试剂)；和影响多核苷酸表达的组分。此类组分还可能包括标志，例如可以用来检测或选择细胞的可检测和/或选择性标志，这些细胞已经摄取并且正在表达由该载体递送的核酸。此类组分可以作为载体(例如使用某些具有或介导结合以及摄取的组分或功能性的病毒载体)的自然特征而提供，或者载体可以被改性为提供此种功能性。其他载体包括那些由Chen等人(BioTechniques[生物技术],34:167-171(2003))描述的载体。各种各样的此类载体在本领域中是已知的，并且通常是可得的。
“重组病毒载体”是指包含一种或多种异源基因产物或序列的病毒载体。由于许多病毒载体表现出与包装相关的尺寸限制，所以这些异源基因产物或序列典型地通过替代该病毒基因组的一个或多个部分而引入。此类病毒可能变成复制缺陷型的，从而要求在病毒的复制和包封期间以反式提供一种或多种删除功能(通过使用，例如携带复制和/或包封所必要的基因产物的辅助病毒或包装细胞系)。已经对其中在病毒颗粒外面携带有待递送的多核苷酸的经修饰的病毒载体进行了描述(参见，例如Curiel,D T等人,PNAS[美国科学院院报]88:8850-8854,1991)。
适合的核酸递送系统包括重组病毒载体，典型地是来自腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、依赖辅助病毒的腺病毒、逆转录病毒、或日本脂质体(HVJ)复合物的血凝病毒中至少一种的序列。在这样的情况中，该病毒载体包含有效地连接到该多核苷酸上的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。重组病毒载体可以在其中包含一个或多个多核苷酸，优选约一个多核苷酸。在一些实施例中，在本发明的方法中所使用的病毒载体具有从约108至约5x 1010pfu的pfu(斑形成单位)。在其中多核苷酸与一种非病毒载体一起施用的实施例中，使用从约0.1纳克至约4000微克经常是有用的，例如约1纳克至约100微克。
另外的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒以及基于HIV的病毒。一种基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组并且env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体包括痘病毒载体，例如正痘病毒或禽痘病毒载体；疱疹病毒载体，例如单纯疱疹病毒I(HSV)载体[Geller,A.I.等人,J.Neurochem[神经化学杂志],64:487(1995)；Lim,F.等人,DNA Cloning:MammalianSystems[DNA克隆：哺乳动物系统],D.Glover编辑(Oxford Univ.Press,Oxford England[牛津大学出版社，英格兰牛津])(1995)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.[美国国家科学院院刊]:90 7603(1993)；Geller,A.I.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]:87:1149(1990)]；腺病毒载体[LeGal LaSalle等人,Science[科学],259:988(1993)；Davidson等人,Nat.Genet.[自然基因学]3:219(1993)；Yang,等人,J.Virol.[病毒学杂志]69:2004(1995)]；以及腺相关病毒载体[Kaplitt,M.G.等人,Nat.Genet.[自然遗传学]8:148(1994)]。
痘病毒载体可将基因导入到细胞质内。禽痘病毒载体只产生核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒(HSV)载体可以是一些发明实施例的指示。腺病毒载体导致了比腺相关病毒更短期的表达(例如，小于约一个月)，在一些实施例中可以表现远远更长期的表达。所选择的具体载体将取决于靶细胞以及正在治疗的病况。适当的启动子的选择可以很容易地完成。适合的启动子的实例是763-碱基对巨细胞病毒(CMV)启动子。可用于基因表达的其他合适的启动子包括但不限于劳斯肉瘤病毒(RSV)(Davis等人,HumGeneTher[人类基因治疗]4:151(1993))、SV40早期启动子区域、疱疹胸苷激酶启动子、金属硫蛋白(MMT)基因的调控序列、原核表达载体(如β-内酰胺酶启动子)、tac启动子、来自酵母或其他真菌的启动子元件(如GAL4启动子)、ADH(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；以及表现组织特异性且已用于转基因动物中的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区，在胰岛β细胞中有活性的胰岛素基因控制区，在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区，在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，在肝中有活性的白蛋白基因控制区，在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区，在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区，在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区，在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。某些蛋白可以使用其天然启动子表达。还可以包括其他的增强表达的元件，例如导致高水平表达的增强子或系统，例如tat基因和tar元件。这种盒然后可以插入到载体中，例如质粒载体，如pUC19、pUC118、pBR322或其他已知的质粒载体，该盒包括例如大肠杆菌复制起点。参见，Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆:实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],(1989)。这种质粒载体还可以包括一种选择性标志，例如用于氨苄青霉素耐药性的β-内酰胺酶基因，条件是标志多肽不会不利地影响正在治疗的有机体的新陈代谢。该盒还可以与合成递送系统(例如在WO95/22618中披露的系统)中的核酸结合部分进行结合。
如果需要，本发明的多核苷酸还可以与微量递送媒介物例如阳离子脂质体和腺病毒载体一起使用。对于脂质体制备、内容物的靶向和递送程序的综述，参见Mannino和Gould-Fogerite,BioTechniques[生物技术公司]，6:682(1988)。还参见Felgner和Holm,Bethesda Res.Lab.Focus[贝塞斯达研究实验室焦点杂志],11(2):21(1989)以及Maurer,R.A.,Bethesda Res.Lab.Focus[贝塞斯达研究实验室焦点杂志],11(2):25(1989)。
复制缺陷型重组腺病毒载体可以根据已知技术生产。参见，Quantin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志],90:626-630(1992)；以及Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143-155(1992)。
另一种递送方法是使用产生单链DNA的载体，这些载体可以在细胞内生产生表达产物。参见，例如Chen等人,BioTechniques[生物技术],34:167-171(2003)，将其通过引用以其全文并入本文。
如上所述，本发明的组合物能以本领域普通技术人员已知的各种方式制备。无论其原始来源或获得其的方式如何，本发明的组合物都可以根据它们的用途来配制。例如，可将上述核酸和载体配制在组合物中以施用于组织培养中的细胞或施用患者或受试者。可以配制本发明的任何药物组合物用于制备药物，并且具体用途在治疗的上下文中如下所示，例如治疗具有病毒或处于感染病毒的风险中的受试者。当用作药物时，任何核酸和载体能以药物组合物的形式施用。这些组合物可以按制药领域中熟知的方式制备，并且可以通过多种途径施用，取决于希望局部治疗还是全身性治疗并且取决于有待治疗的部位。施用可以是局部的(包括眼的和至粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮肤)、眼部的、口腔的或肠胃外的。用于眼部递送的方法可以包括局部施用(滴眼剂)，结膜下、眼周或玻璃体内注射或者通过用手术方法放置在结膜囊中的气囊式导管或眼科插入件引入。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用。肠胃外施用可以处于单次推注剂量的形式，或者可以例如通过连续灌注泵。用于局部施用的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体、粉剂等。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或希望的。
本发明还包括药物组合物，其含有与一种或多种药学上可接受的载体组合的作为活性成分的本文所述的核酸和载体。术语“药学上可接受的”(或者“药理学上可接受的”)是指当施用于适当的动物或人类时，不产生不利的、过敏的或者其他不良反应的分子实体和组合物。本文披露的方法和组合物可以应用于广泛范围的物种，例如人类、非人类灵长类动物(例如猴子)、马或其他家畜；作为宠物饲养的狗、猫、雪貂或其它哺乳动物；大鼠，小鼠或其他实验室用动物。如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、黏合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等，其可以用作用于药学上可接受的物质的介质。在制备本发明的组合物中，典型地将活性成分与赋形剂混合，用赋形剂稀释或封装在这样一种载体之内，该载体呈例如胶囊、片剂、药袋(sachet)、纸或其他容器的形式。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体、或液体材料(例如，生理盐水)，用作活性成分的媒介物、载体或介质。因此，这些组合物可以呈片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆剂、气溶胶(作为固体或在液体介质中)、洗剂、乳膏、软膏、凝胶剂、软和硬明胶胶囊剂、栓剂、无菌可注射溶液以及无菌包装粉剂的形式。如本领域已知的，稀释剂的类型可以根据预期的施用途径而变化。所得组合物可包括另外的试剂，例如防腐剂。在一些实施例中，载体可以是或可以包括基于脂质或基于聚合物的胶体。在一些实施例中，载体材料可以是配制成脂质体、水凝胶、微粒、纳米颗粒或嵌段共聚物胶束的胶体。如指出的，载体材料可以形成胶囊，并且该材料可以是基于聚合物的胶体。
bioNV也可以应用于装置(例如导管)的表面或包含在泵、贴片或其他药物递送装置内。本发明的核酸和载体可以是在药学上可接受的赋形剂或载体(例如生理盐水)的存在下单独或以混合物的形式施用。根据施用方式和途径选择赋形剂或载体。用于药物配制品的合适的药物载体以及药物必需品描述于本领域公知的参考文献雷明顿的药学科学(E.W.Martin)，以及USP/NF(美国药典和国家处方集)中。
在整个申请中，将包括美国专利在内的各种出版物均通过作者和年份以及专利号进行引用。下面列出了这些出版物的完整引文。这些出版物和专利的披露内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。
已经以示例性的方式描述了本发明，并且应理解，已经使用的术语意在具有说明性词语的性质，而非限制性的。
显而易见地，能够根据以上教导进行本发明的很多修改和变化。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内可以用不同于具体描述的方式来实践本发明。

Claims (1)

1.一种组合物，该组合物包含低免疫原性诱导多能干细胞(iPSC)衍生的仿生纳米囊泡(hypo-bioNV)，这些hypo-bioNV表面包覆有经工程化/经定制的嵌合抗原受体(CAR)并且能够将小分子、生物、核酸和/或基因编辑治疗剂递送至任何预期的细胞靶标，该嵌合抗原受体可通过抗体片段scFV区域或病毒表位识别受体(VERR)识别靶标生物标志。
CN202080041577.0A 2019-05-06 2020-05-06 为癌症肿瘤定制的低免疫纳米囊泡递送系统 Pending CN113924126A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962843713P 2019-05-06 2019-05-06
US62/843,713 2019-05-06
PCT/US2020/031616 WO2020227369A1 (en) 2019-05-06 2020-05-06 Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113924126A true CN113924126A (zh) 2022-01-11

Family

ID=73051669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080041577.0A Pending CN113924126A (zh) 2019-05-06 2020-05-06 为癌症肿瘤定制的低免疫纳米囊泡递送系统

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220218842A1 (zh)
EP (1) EP3965829A4 (zh)
JP (1) JP7479399B2 (zh)
KR (1) KR20220004175A (zh)
CN (1) CN113924126A (zh)
AU (1) AU2020267758B2 (zh)
CA (1) CA3139287A1 (zh)
IL (1) IL287734A (zh)
MX (1) MX2021013311A (zh)
WO (1) WO2020227369A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250880A1 (en) * 2021-05-25 2022-12-01 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
WO2022266399A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
WO2023081109A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 Malcolm Thomas Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
WO2023230231A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Malcolm Thomas Controlled expression of therapeutically relevant biomolecules for lumen-localized payloads in biomimetic nanovesicles and exosomes
WO2023230568A2 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 Malcolm Thomas Hypoimmunogenic cells for generating biomimetic nanovesicles

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108175759A (zh) * 2016-12-08 2018-06-19 暨南大学 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
WO2018208728A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Flagship Pioneering, Inc. Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof
WO2019045775A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Orig3N, Inc. SECRETED COMPOSITIONS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS
CN109689097A (zh) * 2016-07-21 2019-04-26 医福斯治疗有限公司 包含具有fc结合能力的融合蛋白的细胞外囊泡

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1447079A1 (de) 2003-02-15 2004-08-18 Fraunhofer-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Vesikel mit chimären Rezeptoren zur Induktion einer gerichteten T-Zellantwort in vivo
AU2016214301B2 (en) 2015-02-06 2022-05-19 Cellectis Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles
EP3334417A4 (en) 2015-08-12 2019-07-17 Massachusetts Institute of Technology CELL SURFACE COUPLING OF NANOPARTICLES
RU2019133280A (ru) 2017-03-22 2021-04-22 Новартис Аг Композиции и способы для иммуноонкологии

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109689097A (zh) * 2016-07-21 2019-04-26 医福斯治疗有限公司 包含具有fc结合能力的融合蛋白的细胞外囊泡
CN108175759A (zh) * 2016-12-08 2018-06-19 暨南大学 一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
WO2018208728A1 (en) * 2017-05-08 2018-11-15 Flagship Pioneering, Inc. Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof
WO2019045775A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Orig3N, Inc. SECRETED COMPOSITIONS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS, AND ASSOCIATED SYSTEMS AND METHODS

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FU ET AL.: "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity", 《NATURE COMMUNICATION》, vol. 10 *
RAJENDRAN JC. BOSE ET AL.: "Bioengineered stem cell membrane functionalized nanocarriers for therapeutic targeting of severe hindlimb ischemia", 《BIOMATERIALS》, vol. 185, pages 360 - 370, XP093039018, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2018.08.018 *
SUN ET AL.: "ALIX increases protein content and protective function of iPSC-derived exosomes", 《JOURNAL OF MOLECULAR MEDICINE》, pages 1 - 16 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA3139287A1 (en) 2020-11-12
AU2020267758B2 (en) 2023-11-23
JP7479399B2 (ja) 2024-05-08
MX2021013311A (es) 2022-02-11
US20220218842A1 (en) 2022-07-14
AU2020267758A1 (en) 2021-11-25
EP3965829A1 (en) 2022-03-16
JP2022531473A (ja) 2022-07-06
KR20220004175A (ko) 2022-01-11
IL287734A (en) 2021-12-01
WO2020227369A1 (en) 2020-11-12
EP3965829A4 (en) 2023-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7479399B2 (ja) 癌腫瘍に対するテーラード低免疫ナノ小胞送達系
JP2020513783A (ja) Ｃｒｉｓｐｒ
JP2019512458A (ja) Ｒｎａによって誘導された、ヒトｊｃウイルス及び他のポリオーマウイルスの根絶
CA3026112A1 (en) Cpf1 complexes with reduced indel activity
JP2019508364A (ja) 免疫抑制療法中のｊｃウイルス活性化およびｐｍｌ（進行性多巣性白質脳症）のリスクを除去するための遺伝子編集方法および組成物
US20220040106A1 (en) Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
JP2022548308A (ja) カーゴを標的細胞に送達するための組成物及び方法
WO2022250880A1 (en) Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
US20180208914A1 (en) Lentivirus and non-integrating lentivirus as viral vector to deliver crispr therapeutic
US20230144704A1 (en) Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
CN114127290A (zh) 用于治疗癌症的变体nrf2的基因敲除
US20220241391A1 (en) Methods of blocking asfv infection through interruption of cellular and viral receptor interactions
CN115867650A (zh) 用于肺癌治疗的aav递送系统
KR20200098639A (ko) 엑소좀 관련 유전자 편집을 이용한 암 치료 방법 및 조성물
KR20220030945A (ko) 암의 치료를 위한 nrf2의 유전자 녹아웃
WO2020055941A1 (en) Compositions and methods for excision with single grna
WO2022266399A1 (en) Tailored hypoimmune nanovesicular delivery systems for cancer tumors, hereditary and infectious diseases
KR20200143416A (ko) 엑소좀을 사용하는 종양 유전자의 치료학적 표적화
EP4119166A1 (en) Composition for inducing apoptosis of cells having genomic sequence variation and method for inducing apoptosis of cells by using composition
JP2024510604A (ja) Ｃ３セーフハーバー部位へのノックイン戦略
WO2024064637A2 (en) Biallelic knockout of faslg
WO2024064633A2 (en) Biallelic knockout of pdcd1

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40065790

Country of ref document: HK