CN111544453B - 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents
一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111544453B CN111544453B CN202010341933.2A CN202010341933A CN111544453B CN 111544453 B CN111544453 B CN 111544453B CN 202010341933 A CN202010341933 A CN 202010341933A CN 111544453 B CN111544453 B CN 111544453B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- culture
- injection
- adventitia
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002347 injection Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 239000007924 injection Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 348
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 210000001644 umbilical artery Anatomy 0.000 claims abstract description 79
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 239000008274 jelly Substances 0.000 claims abstract description 31
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 96
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 61
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 53
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 32
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 26
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 15
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 14
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 10
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 10
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 10
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 29
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000002792 vascular Effects 0.000 abstract description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 abstract description 3
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 60
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 46
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 42
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 27
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 27
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 26
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 20
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 17
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 14
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 14
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 6
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000002945 adventitial reticular cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 3
- 230000008081 blood perfusion Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 2
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710149632 Pectinesterase A Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,其包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk‑1+细胞。本发明是以新生儿遗弃的脐带为材料来源,从脐动脉外膜中提取Flk‑1+细胞和脐带动脉外膜周细胞APC,这两种细胞为血管再生提供了直接的、特有的两种前体细胞,再通过WJMSCs所补充、更新及构成的新生血管的细胞外基质成分,进一步形成血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。将这三种干细胞按比例混合进行体外培养实验,结果证实在体外培养13天后成功形成了血管网。本发明的注射液可制成用于血管再生的注射剂,用于治疗缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其是一种包含了多种血管再生属性的干细胞的注射液及其制备方法。
背景技术
血管病变所致的缺血性疾病如:冠心病、脑梗塞、肢体缺血性坏死,乃至眼缺血性失明…等,迄今为止,一直是世界死亡、致残原因之首。现代医学以药物、介入、手术、器官移植均未能根本改善其预后。21世纪干细胞再生医学虽带来了新机,但种子细胞再生血管的特异性、功能性、安全性大大制约了干细胞再生血管理念的实现。
目前,具有全分化潜能的胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPS),虽可再生血管,但ESC涉及伦理及致畸胎瘤,iPS涉及致肿瘤风险,均不能用于临床。成体干细胞包括不同来源的间充质干细胞仅可通过旁/自分泌潜能有限地刺激血管再生。因为目前的研究发现,任何一种成体细胞如CD133、CD34,间充质干细胞等均无法再生形成具有血液灌注功能的血管。
相关研究发现,动脉外膜是一个储存血管前体细胞巢(niche)。动脉外膜周细胞(Pericytes)是血管发生、发育、再生、稳定血管结构、调控血流、及调节局部免疫功能的关键细胞;动脉外膜Flk-1+细胞(血管内皮生长因子受体阳性细胞)是血管及心肌前体细胞,其直接参与及调控血管发生、再生;华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)具有促血管再生的旁/自分泌功能,其分泌多种细胞因子如血管内皮生长因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子…等,并直接参与构建血管再生基质成分。
2018年,西班牙Dr.Alvino首次应用冠心病搭桥患者余下的大隐静脉分离培养出血管外膜周细胞,并移植到猪心梗模型上,增加了血管及心肌灌注。但到目前为止,国际上仅提出了利用病人血管作为提取周细胞的来源。但很显然,从病人血管外膜取材非常困难、有创,难以推广。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题,本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法,三种血管再生属性干细胞分别为人脐带动脉外膜周细胞(APC)、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和华通胶间充质干细胞(WJMSCs),其中APC,Flk-1+细胞两种细胞由新生儿遗弃的脐动脉外膜中提取而来,为血管再生直接提供特有的两种前体细胞;WJMSCs来自脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织,用于补充、更新及构成新生血管的细胞外基质成分,进一步提供血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。
本发明的注射液可促进具有传送血液功能的小动脉/微血管,不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能,而且避开了ESC,iPS难以应用于临床的缺陷。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本发明采用的主要技术方案包括:
一方面,本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,其包含:华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞。
根据本发明较佳实施例,所述注射液还含有生理盐水,生理盐水为注射液的溶剂。
根据本发明较佳实施例,所述注射液中,人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配。
优选地,人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:50:100进行混配。
根据本发明较佳实施例,所述注射液中还含有人血白蛋白,人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2%~0.25%。
根据本发明较佳实施例,所述注射液的规格为2mL/管,每管中细胞总数量为(1.5~2.5)×107。
另一方面,本发明提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液的制备方法,其包含如下步骤:
S1:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备;
S2:人脐带动脉外膜周细胞APC的制备;
S3:华通胶源间充质干细胞WJMSCs的提取与培养;
S4:将人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs按比例混合,用注射用水或生理盐水配制成注射液。
需要说明的是,步骤S1-S3的顺序并不限制,只要完成人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、周细胞APC、华通胶间充质干细胞WJMSCs的制备即可。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S4中,人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配,优选是按1:50:100混配。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S4中,取经低氧培养的第二代或第三代人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、WJMSCs分别加入生理盐水,在(100-200)g离心力离心洗涤细胞,弃上清,将细胞洗涤2-4遍,把三种细胞分别用生理盐水配成每毫升(1.5-2.5)×107浓度的细胞悬液,再按预定三种细胞数量比混合三种细胞悬液,用生理盐水补充至预定注射液规格;密封,即时使用,或4-8℃下保存,12小时内使用。
根据本发明较佳实施例,其中;每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×107。通常在细胞使用时,按照人的体重计算,60公斤使用6×107的细胞数量,每管2×107细胞数量恰可取用三管,且根据体重的增减使用细胞的数量易于增减。为了使用细胞时注射器抽取顺畅,约2×107左右的细胞数量在2mL体积里属于恰当浓度,细胞浓度过高或过低均给使用和操作带来不便。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S4中,制备注射液时,还加入了人血白蛋白,人血白蛋白的质量浓度为0.2%~0.25%,制备成每2mL、含(1.5-2.5)×107细胞数量为一个包装单位的注射液。加入人血白蛋白,作用之一是保证细胞间电荷平衡,防止细胞的聚集,其二是给生理盐水中的细胞提供适当的营养,维持细胞活性。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S1包括按顺序进行的如下步骤:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养;其中,人脐带动脉外膜Flk-1+细胞是从新生儿新鲜脐带中提取,用于配制注射液的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞为完成低氧培养后的Flk-1+细胞。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S2包括按顺序进行的如下步骤:人脐带动脉外膜周细胞APC的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养;其中,人脐带动脉外膜周细胞APC是从新生儿新鲜脐带中提取,用于配制注射液的人脐带动脉外膜周细胞APC为完成低氧培养后的CD140和CD146双阳性细胞。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S3包括按顺序进行的如下步骤:WJMSCs提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养,其中WJMSCs是新生儿新鲜脐带中提取,用于配制注射液的WJMSCs是完成低氧培养后第二或第三代的WJMSCs。
根据本发明较佳实施例,其中:步骤S1-S3还包括细胞冻存,即将完成了低氧培养的细胞,洗涤后,加入含8-12%DMSO的完全细胞培养基中充分混匀,使细胞浓度为(1.5-2.5)×107/mL,使用程序降温仪以0.5~1.5℃/min的速度降温,当温度降至-80℃时,将细胞放入液氮冻存。
(三)有益效果
本发明的有益效果包含以下几点:
(1)本发明的注射液中,三种血管再生属性的细胞均取材于新生儿遗弃的脐带,具体是从新生儿脐带内两条动脉中提取了脐带动脉外膜Flk-1+细胞和脐带动脉外膜周细胞(APC),这两种细胞为血管再生提供了直接的、特有的二种前体细胞;此外,本发明的注射液还包含了从新生儿脐带中提取的华通胶间充质干细胞(WJMSCs,取材于脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织),通过WJMSCs补充、更新及构成的新生血管的细胞外基质成分,进一步形成了血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境:形成了以内皮细胞为血管内膜,周细胞APC则插入内皮细胞周围与其整合,并与Flk-1+细胞分化的外层基底膜,及周细胞APC分化来源的平滑肌细胞共同形成了具有传送血液功能的小动脉/微血管。
(2)本发明的包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能,而且避开了ESC,iPS难以应用于临床的缺陷。
(3)本发明首次选用包含三种血管再生属性的干细胞共同组成了细胞混合液,代替了只有ESC、iPS等全能及亚全能干细胞才能成功达到再生血管效应;克服了ESC、iPS不能用于临床的缺点。
(4)本发明首次突破了现有成体干细胞不能成功分化形成具有血液灌注功能小血管的障碍,避免了脐带动脉外膜周细胞自体静脉取材困难及有创性的问题;首次为血管分化前体细胞创建了以具有显著旁/自分泌功能的WJMSCs为基础的血管分化微环境。
(5)本发明的注射液中APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、WJMSCs的数量比为1:40-60:80-120,主要是依据周细胞、Flk-1+细胞、WJMSCs在人体解剖学存在的位置特点及特殊的生理功能设计的配比。解剖学上周细胞APC是存在于内皮细胞周围,依据内皮屏障要求的严格程度,周细胞APC在不同的器官中其密度、形态、生物学等方面均有所不同,它与内皮细胞的比例也严格不同。例如,在骨骼肌中周细胞与内皮细胞比值为1:100,而在神经系统为1:3,在视网膜则为1:1。依据这一特点,本发明在实验中确定,当周细胞与Flk-1+细胞二者比例在1:50左右时最为适用于再生多数种器官的血管。而WJMSCs主要作用是为周细胞APC、Flk-1+细胞分化/再生血管提供微环境,其细胞数量占比相对更大一些。故本发明将三种细胞按其生物功能需要以1:40-60:80-120的数量比混合,而更优以1:50:100的数量比混合制备注射液。
(6)本发明在脐带动脉外膜成功分离了高纯度周细胞、Flk1+细胞,其细胞活力和分化潜能(0.81±0.07,MTT法OD值)、增殖力(0.76±0.08,24h增殖力,MTT法OD值)远远强于自体大隐静脉来源周细胞及骨髓来源Flk-1+细胞。
据实验验证,本发明提供的血管再生混合干细胞注射液,在体外培养13天后成功形成了血管网;成功形成了以内皮细胞、周细胞、基底膜、平滑肌细胞共同组成的小血管。
(7)脐动脉外膜来源的APC、Flk-1+细胞,及脐带华通胶来源的WJMSCs,均仅表达HLA-ABC,不表达HLA-II类抗源HLA-DR,且因协同刺激抗源CD80和CD86而表达HLA-G,故为低免疫源性,排异反应小,可异体应用,可规模制备,可制成生物“注射剂药品”加以推广应用。
附图说明
图1为本发明提取纯化的脐带动脉外膜Flk-1+细胞形态图片。
图2A-图2B为本发明提取纯化的脐带动脉外膜Flk-1+细胞的特异标志表达。
图3为本发明提取纯化的脐带动脉外膜周细胞APC形态图片。
图4A-图4B为本发明提取纯化的脐带动脉外膜周细胞APC的特异标志表达。
图5为实施例1中APC、Flk-1+、WJMSCs三种细胞按1:50:100的细胞数量混合培养形成的血管网的倒置显微镜下图片。
图6为图5中血管内皮细胞标志CD31+细胞的特异表达。
图7为实施例1中APC、Flk-1+、WJMSCs三种细胞按1:50:100的细胞数量混合培养形成的血管网的倒置显微镜下图片。
图8为图7中血管内皮细胞标志CD31+细胞的特异表达。
具体实施方式
为了更好的解释本发明,以便于理解,下面结合附图,通过具体实施方式,对本发明作详细描述。
本发明的整体技术方案构思为:
以新生儿遗弃的脐带为材料来源,提取从脐动脉外膜中提取Flk-1+细胞和脐带动脉外膜周细胞APC,从脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织中提取华通胶来源的WJMSCs,将这三种干细胞按比例混合,制成用于血管再生的注射剂,用于治疗缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等疾病。
为了制备上述包含三种血管再生属性的混合干细胞注射剂,需要预先制备三种干细胞,最后将三种干细胞分别分散于生理盐水中,配制得到注射液。三种干细胞的制备过程如下:
(一)脐带动脉外膜Flk-1+细胞制备方法,其过程为:
①人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的提取:取新鲜脐带,PBS漂洗,洗去脐带残留的血液,沿脐动脉的走向剪开华通胶,沿脐带动脉腔将脐动脉纵向剪开,其断面处由外到内仅两层,分别为外膜和内膜,用带齿镊子在剪开的脐动脉断面处撕除内膜后,再撕取脐动脉的外膜,将撕取的脐动脉外膜放于无菌皿中剪成尽可能细小的碎沫状。
将剥离下来的脐动脉外膜碎片放入无菌细胞培养瓶中,在培养瓶中加入无血清细胞培养基,将培养瓶放入36-37℃、体积浓度为5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后将细胞培养瓶中培养基更换为改良的内皮细胞(EC)生长培养基,以后每2-5天更换细胞培养基,显微镜下观察细胞生长情况,至细胞铺满瓶底的80%以上。
②Flk-1+细胞纯化:
制成单细胞悬液:弃细胞培养瓶中的培养基,加入PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入浓度为0.08%-0.15%的胰蛋白酶,并均匀地铺满瓶底,此为此为消化细胞步骤;1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩,加入细胞培养基中止消化,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。
洗涤细胞:将单细胞悬液移到离心管中,加入PBS混匀,(100-200)g离心10-20min,弃上清液,此为洗涤细胞,再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
分选:弃上清后,加入细胞分选缓冲液,调整细胞浓度为2×107/mL,加入一抗Flk1、CD34抗体,每1×106细胞加入0.25μg,4℃孵育30min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心4-10分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,调整细胞浓度为2×107/mL;加入二抗包被的磁珠,每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠,8-15℃孵育10-15min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀得到细胞悬液,加入分选缓冲液的量为500μL/108个细胞;预先用缓冲液冲洗分离柱,把柱子安装到磁场中,把细胞悬液加入到柱子中,用缓冲液冲洗柱子三遍,将柱子移开磁场到一新的离心管中,用少量缓冲液用力冲洗,把细胞冲洗到离心管中,收取到的细胞,即为Flk-1+脐动脉外膜细胞。
③3D培养:将Flk-1+细胞加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为(0.8-1)×105细胞/mL,此为水凝胶细胞悬液,在新的培养瓶中加入水凝胶细胞悬液,使每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶置于36-37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
④3D传代培养:3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入36-37℃PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中,待水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入离心管中,(100-200)g离心力离心10-20min,弃上清,再加入水凝胶混匀,加入培养瓶中,使每个培养瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况,取第二、三代Flk-1+细胞进入下一工序。
⑤低氧培养:取第二代Flk-1+细胞洗涤后,加入完全细胞培养基,调整细胞浓度为(0.8-1)×105/mL,取10mL加入细胞培养瓶中,细胞的总数量为(0.8-1)x106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养至60%融合时,把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后进入下一工序。通过低氧培养,提高细胞耐性、活性和生存能力。
此时的Flk-1+细胞即可用于配制注射液,如果暂不使用就将其冻存备用。
⑥细胞冻存:取第二代或第三代细胞,洗涤后,加入含8-12%DMSO的完全细胞培养基中充分混匀,使细胞浓度为(1.5-2.5)×107/mL,使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温,当温度降至-80℃时,将细胞放入液氮冻存,以备需要时进行复苏培养和使用。
(二)人脐带动脉外膜周细胞APC的制备方法,其过程为:
①人脐带动脉外膜周细胞APC的提取:取剖腹产新鲜脐带,PBS漂洗2-4遍,洗去脐带残留的血液,洗去残留的血液,将其剪成小段,沿脐带动脉的走向剪开脐带,用有齿镊夹取脐动脉一端,撕取脐带两根动脉外膜层,撕取脐带动脉外膜层后,放入无菌平皿中,用PBS漂洗2-4遍从脐带动脉撕下来的脐动脉外膜。
把撕取下来的脐带动脉外膜移到离心管中,加入比脐动脉内膜体积量多5倍的浓度为0.2%~0.25%的II型胶原酶,把离心管密封,放置于水浴中,调整水浴的温度为36-37℃,此步骤为消化;消化60-90分钟后,加入与离心管中消化液同体积的无血清培养基,用移液管充分混匀,(100-200)g离心8-20min,弃上清液,此为洗涤细胞;重复上述洗涤步骤,把细胞再洗涤2-4遍,弃上清,加入无血清培养基充分混匀,形成细胞悬液,取一新的离心管,管口放置70μm过滤器,将细胞悬液通过过滤器将细胞过滤至新的离心管中。
计数过滤后的细胞悬液中的细胞,用无血清培养基把细胞悬液配成(0.8-1)×105/mL的浓度,取10mL细胞悬液加入到细胞培养瓶中,再加入无血清培养基,使细胞培养瓶中的总液体量为15mL,细胞总数为(0.8-1)×106,把细胞培养瓶放置于36-37℃,5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中,每天观察细胞,每三天半量更换细胞培养瓶中的培养基,待细胞融合度达90%以上,进入下一工序。
②周细胞APC纯化:
制成单细胞悬液:弃细胞培养瓶中的培养基,加入PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入浓度为0.08%-0.15%的胰蛋白酶,并均匀地铺满瓶底,此为消化细胞的步骤;放置1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。
洗涤细胞:将单细胞悬液移到离心管中,加入PBS混匀,(100-200)g离心10-20min,弃上清液,此为洗涤细胞,再重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
分选:弃上清后加入细胞分选缓冲液,调整细胞浓度为2×107/mL,加入一抗CD140、CD146抗体,每1×106细胞加入0.25μg;4℃孵育30min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心5-10分钟洗涤;弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,调整细胞浓度为2×107/mL,加入二抗包被的磁珠,每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠,8-15℃孵育10-15min;加入20倍体积分选缓冲液,300g离心7分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,加入分选缓冲液的量为500μL/108个细胞,预先用缓冲液冲洗分离柱,把柱子安装到磁场中,把细胞悬液加入到柱子中,用缓冲液冲洗柱子三遍,将柱子移开磁场到一新离心管中,用少量缓冲液用力冲洗,把细胞冲洗到离心管中,收取到的细胞,即为CD140+、CD146+脐动脉外膜周细胞(APC)。
③CD140+、CD146+细胞3D培养:将CD140+、CD146+细胞悬液(100-200)g离心10-20min,弃上清液,加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为每毫升(0.8-1)×105细胞,此为水凝胶细胞悬液,在新的细胞培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
④CD140+、CD146+细胞3D传代培养:3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入36-37℃PBS 10mL并放置于36-37℃水浴中,40-60min后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入离心管中,(100-200)g离心力离心10-20min,弃上清,再加入水凝胶混匀,加入到细胞培养瓶中,使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况,取第二、三代CD140和CD146双阳性细胞(认定是周细胞APC)进入下一工序。
⑤低氧培养:取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基,调整细胞浓度为(0.8-1)×105,取10mL加入细胞培养瓶中,细胞的总数量为(0.8-1)×106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养60%融合,把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后进入下一工序。通过低氧培养,提高细胞耐性、活性和生存能力。
此时的CD140和CD146双阳性细胞(就是周细胞APC)即可用于配制注射液,如果暂不使用就将其冻存备用。
⑥细胞冻存:取第二代或第三代生长良好的细胞,洗涤后,加入含8-12%DMSO的无血清细胞培养基中充分混匀,使细胞浓度为(1.5-2.5)×107/mL,使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温,当温度降至-80℃时,将细胞放入液氮冻存,以备需要时进行复苏培养和使用。
(三)人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)提取与培养,其过程为:
①人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)提取:取人新鲜脐带,使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液,将脐带剪成小段,将每一段脐带沿脐静脉腔剪开,再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液,将脐带平铺于无菌皿中,剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织,剪切成1立方毫米及以下块状,再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。
华通胶间充质干细胞提取培养:在培养瓶中加入10mL无血清培养基,将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中,将已放入华通胶组织的培养瓶放置于36-37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养,3天半量换液,5-6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长,10-12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80%以上,进入下一工序。
②纯化
制成单细胞悬液:弃细胞培养瓶中的培养基,加入PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入浓度为0.08%-0.15%的胰蛋白酶,并均匀的铺满瓶底进行消化,1-2分钟后显微镜下可见细胞收缩,加入3mL细胞培养基中止消化,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。
洗涤:将细胞悬液经过100μm筛网移到50mL离心管中,加入20mL PBS混匀,(100-200)g离心10min,弃上清液,此为洗涤细胞,可重复前述步骤把细胞洗涤一遍。
传代:加入无血清培养基,调整细胞浓度为(0.8-1)×105/mL,将细胞悬液加入到细胞培养瓶中,使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞,此步骤为传代,将传代细胞放置于36-37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养,每三天换液,待细胞融合至80-90%时再传代培养,以便进入下一工序(或即时用于配制注射液)。
③WJMSCs的3D培养:将第二代WJMSCs细胞悬液以(100-200)g离心10-20min,弃上清液,加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为(0.8-1)×105细胞/mL,此为水凝胶细胞悬液,在新的培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积浓度为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
④WJMSCs的3D传代培养:3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入36-37℃PBS10mL并放置于36-37℃水浴中,40-70min后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,(100-200)g离心力离心10m-20in;弃上清,再加入水凝胶混匀,加入细胞培养瓶中,使每瓶中细胞数量为(0.8-1)×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于36-37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况,取第二、三代WJMSCs进入下一工序。
⑤低氧培养:取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基,调整细胞浓度为(0.8-1)×105,取10mL加入细胞培养瓶中,细胞的总数量为(0.8-1)×106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养60%融合,把细胞培养瓶放入氧气体积浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后进入下一工序。通过低氧培养,提高细胞耐性、活性和生存能力。
此时的细胞即可用于配制注射液,如果暂不使用就将其冻存备用。
⑥细胞冻存:取第二代或第三代细胞,洗涤后,加入含8-12%DMSO的无血清细胞培养基中充分混匀,细胞浓度为(1.5-2.5)×107/mL,使用程序降温仪以0.5-1.5℃/min的速度降温,当温度降至-80℃时,将细胞放入液氮冻存,以备需要时进行复苏培养和使用。
需要说明的是,上述(一)、(二)、(三)中,步骤⑥不是必须的步骤,用于制备注射液的细胞可来源于完成了步骤⑤低氧培养的细胞,也可以是经步骤⑥冻存后经复苏培养、低氧培养的细胞。细胞经过步骤⑤低氧培养后用于配制注射液,如果暂不使用就将其冻存备用。
(四)配制混合干细胞注射液,用于血管再生,具体步骤为:
取经缺(低)氧培养的3代APC、Flk-1+细胞、WJMSCs分别加入用生理盐水,在(100-200)g离心力离心5min-10min洗涤细胞,弃上清,将细胞洗涤2-4遍,把三种细胞分别用生理盐水配成每毫升(1.5-2.5)×107浓度,把三种细胞按细胞数量配成如下的配比,APC:Flk-1+细胞:WJMSCs=1:40-60:80-120,三种细胞配比悬液为血管再生干细胞混合注射液,注入无菌注射液药管中,每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×107,用生理盐水补充至2mL。
由APC、Flk-1+细胞、WJMSCs三种细胞混合成的血管再生干细胞混合注射液经过安全性检测后,加入人血白蛋白,人血白蛋白的质量浓度为0.2%-0.25%,制备成每2mL人血白蛋白/生理盐水中含有(1.5-2.5)×107细胞数量为一个包装单位的注射液;密封,即时使用,或4-8度保存,12小时内使用。
以下为本发明的具体实施例。
实施例1
本实施例的一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,其制备步骤如下:
S1按如下方法制备人脐带动脉外膜Flk-1+细胞:
(S11)人脐带动脉外膜Flk-1+细胞提取:
取剖腹产新鲜脐带,PBS漂洗三遍,洗去脐带残留的血液,沿脐动脉的走向剪开华通胶,用眼科剪沿脐动脉腔将脐动脉纵向剪开,其断面处由外到内仅两层是外膜、内膜,用有齿眼科镊在剪开的脐动脉断面处撕除内膜后,再撕取脐动脉的外膜,将撕取的脐动脉外膜放于无菌皿中剪成尽可能小的碎沫状。将剥离下来的脐动脉外膜碎片放入底面积是75平方厘米无菌细胞培养瓶中,在培养瓶中加入15mL无血清细胞培养基,将培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后将细胞培养瓶中培养基更换为改良的内皮细胞(EC)生长培养基,以后每3天更换细胞培养基,显微镜下观察细胞生长情况,至细胞铺满瓶底80%后,继续以下处理:
(S12)Flk-1+细胞纯化:弃细胞培养瓶中的培养基,加入3mL PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入浓度为0.125%的胰蛋白酶3mL,并均匀的铺满瓶底以进行细胞细化,1分钟后显微镜下可见细胞收缩,加入3mL细胞培养基中止消化,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。将细胞悬液移到50mL离心管中,加入20mLPBS混匀,(100-200)g离心10min,弃上清液,此为洗涤细胞,再重复上述步骤把细胞洗涤一遍,弃上清后,加入细胞分选缓冲液,调整细胞浓度为2×107/mL,加入一抗Flk-1、CD34抗体,每1×106细胞加入0.25μg抗体,4℃孵育30min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心7分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,调整细胞浓度为2×107/mL,加入二抗包被的磁珠,每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠,8-15℃孵育10-15min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心7分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,加入缓冲液的量为500μL/108细胞,预先用500μL缓冲液冲洗分离柱,把柱子安装到磁场中,把细胞悬液加入到柱子中,用500μL缓冲液冲洗柱子3遍,将柱子移开磁场到一新50mL离心管中,用1mL的缓冲液用力冲洗,把细胞冲洗到离心管中,收取到的细胞,即为Flk-1+细胞。
在电子显微镜下观察Flk-1+细胞,其形态如图1所示。
采用流式细胞分析仪对人脐带动脉外膜Flk-1+细胞进行检测,如图2A-2B所示为制得的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞特异标志表达。其中,图2A横坐标FSC-A表示向前角散射光波状曲线的面积(向前角散射光脉冲信号强度),反映了细胞大小;纵坐标SSC-A为侧向角散射光波状曲线的面积(侧向角散射光脉冲信号强度),反映了细胞粒度及细胞内相对复杂性。其图2B的横坐标为采用荧光素APC(allophycocyanin)荧光标记所采集的荧光信号强度,纵坐标为细胞计数。由图1及图2A-图2B的特异标志表达确定已分离纯化得Flk-1+细胞。
(S13)Flk-1+细胞3D培养:将Flk-1+细胞加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为每毫升1×105细胞,此为水凝胶细胞悬液,在新的底面积是75cm2培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
(S14)Flk-1+细胞3D传代培养:待细胞3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入37℃PBS 10mL并放置于37℃水浴中,1小时后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,150g离心力离心10min,弃上清,再加入水凝胶混匀,加入底面积是75cm2培养瓶中,使每瓶中细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况,取第二代Flk-1+细胞进入下一工序。
(S15)低氧培养:取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基,调整细胞浓度为1×105,取10mL加入75cm2细胞培养瓶中,细胞的总数量为1×106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养60%融合,把细胞培养瓶放入氧气浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后备用。
S2:按如下方法制备人脐带动脉外膜周细胞APC:
(S21)人脐带动脉外膜周细胞的提取:取剖腹产新鲜脐带,PBS漂洗三遍,洗去脐带残留的血液,洗去残留的血液,将其剪成3-4cm的小段,沿脐带动脉的走向剪开脐带采用蚊式钳夹取脐动脉一端,撕取脐带两根动脉外膜层,撕取脐带动脉外膜层后,放入无菌平皿中,用PBS漂洗2-3遍从脐带动脉撕下来的脐动脉外膜。
把撕取下来的脐带动脉外膜移到50mL离心管中,加入比脐动脉内膜体积量多5倍的浓度为0.2%的II型胶原酶,把离心管密封,放置于水浴中,调整水浴的温度为37℃,此步骤为消化,消化90分钟后,加入与离心管中消化液同体积的无血清培养基,用移液管充分混匀,150g离心10min,弃上清液,此为洗涤细胞,重复上述洗涤步骤,把细胞再洗涤2遍,弃上清,加入无血清培养基充分混匀,形成细胞悬液,取一新的离心管,管口放置70μm过滤器,将细胞悬液通过过滤器将细胞过滤至新的离心管中。
过滤后的细胞悬液计数细胞,用无血清培养基把细胞悬液配成1×105/mL的浓度,取10mL细胞悬液加入到底面积是75cm2细胞培养瓶中,再加入5mL无血清培养基,使细胞培养瓶中的总液体量为15mL,细胞总数为1×106,把细胞培养瓶放置于37℃,5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中,每天观察细胞,每三天半量更换细胞培养瓶中的培养基,待细胞融合度达90%时,继续以下处理。
(S22)脐带动脉外膜周细胞纯化:弃培养瓶中的液体,加入PBS3mL铺满瓶底清洗,弃清洗液,在培养瓶中加入0.125%胰蛋白酶3mL,并铺满瓶底以进行细胞消化,消化放置1-2分钟,观察细胞收缩成圆形时加入无血清培养基中止消化反应,移液管吹打细胞悬液和瓶底混匀细胞,将细胞悬液移入50mL离心管中制成单细胞悬浮液。用150g离心5min,弃上清液,此为洗涤细胞,再加入PBS 20mL,混匀细胞,重复上述洗涤步骤再洗涤一遍。弃上清后加入细胞分选缓冲液,调整细胞浓度为2×107/mL,加入一抗CD140、CD146抗体,每1×106细胞加入0.25μg,4℃孵育30min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心7分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,调整细胞浓度为2×107/mL,加入二抗包被的磁珠,每1×106细胞加入5μL二抗包被的磁珠,8-15℃孵育10-15min,加入20倍体积分选缓冲液,300g离心7分钟洗涤,弃上清,加入分选缓冲液混匀细胞,加入缓冲液的量为500μL/108,预先用500μL缓冲液冲洗分离柱,把柱子安装到磁场中,把细胞悬液加入到柱子中,用500μL缓冲液冲洗柱子三遍,将柱子移开磁场到一新50mL离心管中,用1mL的缓冲液用力冲洗,把细胞冲洗到离心管中,收取到的细胞,即为CD140+、CD146+脐动脉外膜周细胞(APC)。
(S23)CD140+、CD146+细胞3D培养:将CD140+、CD146+细胞悬液150g离心10min,弃上清液,加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为每毫升1×105细胞,此为水凝胶细胞悬液,在新的底面积是75cm2培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
(S24)CD140+、CD146+细胞3D传代培养:待细胞3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入37℃PBS 10mL并放置于37℃水浴中,1小时后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,150g离心力离心10min,弃上清,再加入水凝胶混匀,加入底面积是75cm2培养瓶中,使每瓶中细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况,取第二代生长良好的CD140+、CD146+(CD140和CD146双阳性)细胞进入下一工序。
在倒置显微镜下观察人脐动脉外膜周细胞APC,形态如图3所示。
采用流式细胞分析仪对周细胞表面标志物CD140、CD146进行检测,如图4A-4B所示为制得的人脐动脉外膜周细胞特异标志物CD140和CD146表达。CD146采用绿色荧光FITC标记,CD140采用PE红色标记。其中图4A的横坐标FITC-A为采用荧光素FITC荧光标记所采集的荧光信号强度,即CD146阳性的人脐动脉外膜周细胞的荧光信号强度;纵坐标PE-A为采用荧光素PE荧光标记所采集的荧光信号强度,即CD140阳性的人脐动脉外膜周细胞的荧光信号强度。图4B的横坐标为采用荧光素PE荧光标记所采集的荧光信号强度,纵坐标为细胞计数。由图3及图4A-图4B的特异标志表达可确定已分离纯化得人脐动脉外膜周细胞CD140+、CD146+(CD140和CD146双阳性细胞)。
(S25):低氧培养:取第二代细胞洗涤后加入完全细胞培养基,调整细胞浓度为1×105,取10mL加入75cm2细胞培养瓶中,细胞的总数量为1×106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养60%融合,把细胞培养瓶放入氧气浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后备用。
S3:按如下方法制备脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)
(S31)人脐带华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)的提取:取人新鲜脐带,使用等渗的平衡盐溶液洗去脐带残留血液,将脐带剪成3厘米的小段,将每一段脐带沿脐静脉腔剪开,再使用等渗的平衡盐溶液洗去静脉腔中残留的血液,将脐带平铺于无菌皿中,剔除脐动脉、脐静脉及脐带外膜,提取脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织,并用眼科剪剪切成1立方毫米及以下块状,再以等渗的平衡盐溶液清洗剪成块状的华通胶组织。
(S32)纯化:在底面积为75平方厘米的培养瓶中加入10mL无血清培养基,将剪成块状的华通胶组织均匀放置于培养瓶中,将已放入华通胶组织的培养瓶放置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养,3天半量换液,5-6天可观察到有间充质干细胞贴壁生长,10-12天贴壁生长的华通胶间充质干细胞融合至80%。弃细胞培养瓶中的培养基,加入3mL PBS冲洗瓶底,弃冲洗液,加入浓度为0.125%的胰蛋白酶3mL,并均匀的铺满瓶底以进行细胞消化,1分钟后显微镜下可见细胞收缩,加入3mL细胞培养基中止消化,用移液器抽吸吹打细胞悬液混匀,把细胞制成单细胞悬液。将细胞悬液经过100μm筛网移到50mL离心管中,加入20mL PBS混匀,150g离心10min,弃上清液,此为洗涤细胞,加入无血清培养基,调整细胞浓度为1×105/mL,将细胞悬液加入底面积是75cm2培养瓶中,使每瓶中细胞数量为1×106细胞,此步骤为传代,将传代细胞放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中扩增培养,每三天换液,待细胞融合至80-90%时再传代培养进入下一工序。
(S33)WJMSCs 3D培养:将第二代WJMSCs细胞悬液以150g离心10min,弃上清液,加入水凝胶培养基混匀,使细胞浓度为每毫升1×105细胞,此为水凝胶细胞悬液,在新的底面积是75cm2培养瓶中加入10mL水凝胶细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养,每天观察细胞生长情况。
(S34)WJMSCs的3D传代培养:待细胞3D培养6-7天后,细胞融合(70-80)%时加入37℃PBS 10mL并放置于37℃水浴中,1小时后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,150g离心力离心10min,弃上清,再加入水凝胶混匀,加入底面积是75cm2培养瓶中,使每瓶中细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL无血清培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养6-7天,每天观察细胞生长情况。取第二代WJMSCs进入下一工序。
(S35)低氧培养,取第二代细胞洗涤后加入无血清细胞培养基,调整细胞浓度为1×105,取10mL加入75cm2细胞培养瓶中,细胞的总数量为1×106,先将细胞培养瓶放入37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养,待细胞贴壁培养60%融合,把细胞培养瓶放入氧气浓度为5%、37℃、饱和湿度的低氧培养箱中培养12小时,洗涤后备用。
S4注射液制备:将脐带动脉外膜来源的Flk-1+细胞、APC及WJMSCs混合制备成血管再生注射液;
取经低氧培养的第三代APC、Flk-1+细胞、WJMSCs分别加入生理盐水,150g离心力离心5min洗涤细胞,弃上清,将细胞洗涤3遍,把三种细胞分别用生理盐水配成2×107浓度,把三种细胞按细胞数量配成如下的配比,APC:Flk-1+细胞:WJMSCs=1:50:100,三种细胞配比悬液为血管再生干细胞混合注射液,放入2mL无菌瓶中,每瓶中的细胞总数量为2×107,注射液总体积用生理盐水补充至2mL。
由APC、Flk-1+细胞、WJMSCs三种细胞混合成的血管再生干细胞混合注射液经过安全性检测后,加入人血白蛋白,人血白蛋白的浓度为0.2%,制备成每2mL人血白蛋白/生理盐水中含有2×107细胞数量为一个包装单位的注射液。
混合细胞体外培养血管成型实验
将上述实验提取分离及低氧培养的APC、Flk-1+细胞、WJMSCs三种细胞按照1:50:100的数量比混合制成的注射液,用150g离心力离心5min,弃上清,加入水凝胶培养基混匀,使按比例配成的混合细胞浓度为每毫升1×105细胞,制备成水凝胶混合细胞悬液,在底面积是75cm2培养瓶中加入10mL水凝胶混合细胞悬液,每个培养瓶中接种细胞数量为1×106细胞,在培养瓶中加入交联剂0.1mL,促进水凝胶形成胶胨状,在培养瓶中水凝胶液面上加入5mL完全细胞培养基,将含水凝胶细胞悬液的培养瓶放置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳、饱和湿度培养箱扩增培养。培养13天后,采用倒置显微镜观察,如图5、图7所示,可在培养瓶中观察到血管网的形成。
细胞融合(70-80)%时加入37℃PBS 10mL并放置于37℃水浴中,1小时后水凝胶分解形成细胞悬液,用移液器抽吸并混匀细胞悬液,将悬液移入50mL离心管中,150g离心力离心10min,弃上清,再加入PBS混匀,150g离心力离心10min,洗涤2遍,用PBS调整细胞浓度为2×107细胞/mL,分别取0.5mL放置于2个离心管中,其中一管加入CD31-PE抗体20μL,孵育20min,PBS洗涤2遍,此为检测管,另一管加入20μL生理盐水与检测管一致处理,为空白对照管,经流式细胞仪进行流式检测,记录标记CD31-PE细胞百分比,如图6、图8所示流式检测分析结果显示代表血管内皮标志的CD31细胞高表达。
由此可见,本发明的包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,确实具有再生血管功能,突破了现有成体干细胞不能成功分化形成具有血液灌注功能小血管的障碍,将为当今世界范围发病率、死亡率最高的包括缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等在内的缺血性疾病的治疗带来一个重大进展。
Claims (10)
1.一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液,其特征在于,所述混合干细胞为华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的混合物。
2.根据权利要求1所述的注射液,其特征在于,所述注射液中,人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1: 40-60 :80-120进行混配。
3.根据权利要求1或2所述的注射液,其特征在于,所述注射液中还含有人血白蛋白,人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2%~0.25%。
4.根据权利要求1所述的注射液,其特征在于,所述注射液的规格为2mL/管,每管中细胞总数量为1.5×107~2.5×107。
5.一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液的制备方法,其包含如下步骤:
S1:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备;
S2:人脐带动脉外膜周细胞APC的制备;
S3:华通胶源间充质干细胞WJMSCs的提取与培养;
S4:将人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs按比例混合,用注射用水或生理盐水配制成注射液。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1: 40-60 :80-120进行混配。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,取经低氧培养的第二代或第三代人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和WJMSCs分别加入生理盐水,在100-200g离心力离心洗涤细胞,弃上清,将细胞洗涤2-4遍,将三种细胞分别用生理盐水配成每毫升1.5×107~2.5×107浓度的细胞悬液,再按照三种细胞数量的比例混合三种细胞悬液,用生理盐水补充至预定注射液规格;密封,即时使用,或4-8℃下保存,12小时内使用。
8.根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于,步骤S4中,制备注射液时还加入了人血白蛋白,人血白蛋白的质量浓度为0.2%-0.25%,制备成每管2mL、含1.5×107~2.5×107细胞数量为一个包装单位的注射液。
9.根据权利要求5至7任一所述的制备方法,其特征在于,
步骤S1包括按顺序进行的如下步骤:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养;其中,人脐带动脉外膜Flk-1+细胞是从新生儿新鲜脐带中提取,用于配制注射液的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞为完成低氧培养后的Flk-1+细胞;
步骤S2包括按顺序进行的如下步骤:
人脐带动脉外膜周细胞APC的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养;其中,人脐带动脉外膜周细胞APC是从新生儿新鲜脐带中提取,用于配制注射液的人脐带动脉外膜周细胞APC为完成低氧培养后的CD140和CD146双阳性细胞;
步骤S3包括按顺序进行的如下步骤:WJMSCs提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养,其中WJMSCs是从新生儿新鲜脐带脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织中提取,用于配制注射液的WJMSCs细胞是完成低氧培养后第二或第三代WJMSCs。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤S1、S2、S3还分别包括细胞冻存步骤,即将完成了低氧培养的细胞,洗涤后,加入含8-12%DMSO的完全细胞培养基中充分混匀,细胞浓度为1.5×107~2.5×107/mL,使用程序降温仪以0.5~1.5℃/min的速度降温,当温度降至-80℃时,将细胞放入液氮冻存,以备需要时取用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010341933.2A CN111544453B (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010341933.2A CN111544453B (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111544453A CN111544453A (zh) | 2020-08-18 |
CN111544453B true CN111544453B (zh) | 2021-01-22 |
Family
ID=71996327
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010341933.2A Active CN111544453B (zh) | 2020-04-27 | 2020-04-27 | 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111544453B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113057937A (zh) * | 2021-03-23 | 2021-07-02 | 辽宁何氏医学院 | 干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104922059A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-23 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN110800732A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-02-18 | 湖南源品细胞生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞贮藏液 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006238835A (ja) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Reprocell Inc | 成体型造血幹細胞のマーカー |
US9962558B2 (en) * | 2005-08-05 | 2018-05-08 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization and enhance function of cells |
CN101629165B (zh) * | 2009-07-24 | 2012-12-26 | 中国人民解放军海军总医院 | 一种原始间充质干细胞的制备方法 |
US8460269B2 (en) * | 2009-09-14 | 2013-06-11 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Directed cell-based therapy using microbubble tagged cells |
KR20200138445A (ko) * | 2014-04-24 | 2020-12-09 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포의 응용 |
GB2552473A (en) * | 2016-07-21 | 2018-01-31 | Evox Therapeutics Ltd | Surface decoration of extracellular vesicles |
CN107748260B (zh) * | 2017-08-29 | 2020-05-15 | 西安组织工程与再生医学研究所 | 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 |
US20200017835A1 (en) * | 2018-07-13 | 2020-01-16 | Indiana University Research And Technology Corporation | Identification, isolation, and therapeutic uses of endothelial stem cells that express the abcg2+ surface marker |
CN109998992B (zh) * | 2019-05-05 | 2019-11-12 | 南京鼓楼医院 | 治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法 |
CN110898078B (zh) * | 2019-12-09 | 2023-04-28 | 上海市东方医院(同济大学附属东方医院) | 一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用 |
-
2020
- 2020-04-27 CN CN202010341933.2A patent/CN111544453B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104922059A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-09-23 | 北京青藤谷禧干细胞科技研究院有限公司 | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 |
CN110800732A (zh) * | 2019-10-10 | 2020-02-18 | 湖南源品细胞生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞贮藏液 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111544453A (zh) | 2020-08-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2018103406A1 (zh) | 一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液及其制备方法和使用方法 | |
WO2019161591A1 (zh) | 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 | |
US20040203142A1 (en) | Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation thereof for therapeutic purposes | |
JP2009500048A (ja) | 組織増加のための分化した未成熟脂肪細胞および生分解性骨格の移植 | |
CN111542350B (zh) | 用于制备脂肪来源干细胞的系统和方法 | |
CN106434557A (zh) | 由脐带间充质干细胞制备cd34阳性细胞的方法 | |
CN106367389A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用 | |
CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
CN103263440A (zh) | 从胎盘、脐带中提、制同源性间充质干细胞注射剂的方法 | |
CN105820998A (zh) | 临床回输级细胞治疗用人脂肪干细胞ADSCs分离提取培养方法 | |
JP2016509863A (ja) | 細胞、臍帯血収集のための方法及び装置、並びに細胞の単離のための方法及び装置 | |
CN108728410A (zh) | 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法 | |
JP2016509863A5 (zh) | ||
CN102154202A (zh) | 储存宫内膜干细胞的方法 | |
CN107034186A (zh) | 一种从人脐带血中分离纯化干细胞的方法 | |
CN101848718A (zh) | 用于组织再生的细胞组合物 | |
US20080025955A1 (en) | Method Of Producing Vascular Endothelial Cells From Primate Embryonic Stem Cells | |
CN111088229B (zh) | 一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法 | |
EP3984596A1 (en) | Cell population including mesenchymal cells, pharmaceutical composition including same, and method for producing same | |
CN111544453B (zh) | 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 | |
CN110693911A (zh) | 经血源性子宫内膜干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
CN108619169A (zh) | 一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法 | |
CN104630135B (zh) | 大规模制备肝干细胞的方法与用途 | |
CN108728408A (zh) | 犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基 | |
CN106190969A (zh) | 一种蜕膜间充质干细胞的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240319 Address after: Room 4296, 4th Floor, Building 1, No. 35 West Fourth Ring South Road, Fengtai District, Beijing, 100161 Patentee after: Beijing Ruizhan Technology Co.,Ltd. Country or region after: Zhong Guo Address before: Room 8012, outpatient building, No.6 hospital, Fucheng Road, Haidian District, Beijing 100048 Patentee before: Gao Lianru Country or region before: Zhong Guo |