CN108728410A - 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法。本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法包括:采用他汀类药物预处理间充质干细胞,并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。本发明还提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞的抗凋亡能力和/或促归巢能力的制剂中的应用,还提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞分泌具有心梗微环境改善作用和/或心肌修复能力的外泌体的制剂中的应用。
Description
技术领域
本发明是关于一种基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法,具体是关于一种基于他汀类药物预处理的高效间充质干细胞来源外泌体的制备方法。
背景技术
WHO统计数据表明:2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人,32.2%),其中有948万人死于缺血性心脏病(17.3%)(Collaborators GM.Global,regional,andnational under-5mortality,adult mortality,age-specific mortality,and lifeexpectancy,1970–2016:a systematic analysis for the Global Burden of DiseaseStudy 2016.The Lancet 2017;390(10100):1084-1150;Collaborators GCOD.Global,regional,and national age-sex specific mortality for 264causes of death,1980–2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.TheLancet 2017;390(10100):1151-1210)。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)导致大量心肌缺血坏死,继而被瘢痕组织替代引发心衰和死亡。现有治疗手段无法有效再生和修复心肌。近年来干细胞移植治疗,尤其是间充质干细胞(MSCs,mesenchymalstem cells),例如骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs),移植治疗AMI被寄予厚望(Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,Jakoniuk I,Anderson SM,LiB,Pickel J,McKay R,Nadal-Ginard B,Bodine DM and others.Bone marrow cellsregenerate infarcted myocardium.Nature 2001;410(6829):701-705;Fisher SA,DoreeC,Mathur A,Martin-Rendon E.Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for PatientsWith Heart Failure.Circulation Research 2015;116(8):1361-1377;Afzal MR,Samanta A,Shah ZI,Jeevanantham V,Abdel-Latif A,Zuba-Surma EK,Dawn B.AdultBone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease:Evidence and InsightsFrom Randomized Controlled Trials.Circ Res 2015;117(6):558-575)。然而临床研究表明,间充质干细胞虽能一定程度通过旁分泌保护作用改善梗死后心功能,但效果并不显著。进一步研究表明,其发挥旁分泌保护作用的主要机制是通过分泌一种细胞外囊泡结构——外泌体(exosome)实现的(Makridakis M,Roubelakis MG,Vlahou A.Stem cells:insights into the secretome.Biochim Biophys Acta 2013;1834(11):2380-2384;Huang P,Tian X,Li Q,Yang Y.New strategies for improving stem cell therapy inischemic heart disease.Heart Fail Rev2016;21(6):737-752;Lai RC,Arslan F,LeeMM,Sze NS,Choo A,Chen TS,Salto-Tellez M,Timmers L,Lee CN,El OR andothers.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusioninjury.Stem Cell Res 2010;4(3):214-222)。外泌体具有来源广、稳定、无免疫原性等优点,且BM-MSCs来源的外泌体(MSC-Exo)可改善心梗微环境,因此,有望成为新一代的心肌修复产品(Lamichhane TN,Sokic S,Schardt JS,Raiker RS,Lin JW,Jay SM.EmergingRoles for Extracellular Vesicles in Tissue Engineering and RegenerativeMedicine.Tissue Engineering Part B:Reviews 2015;21(1):45-54)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种高效间充质干细胞来源外泌体的制备方法。
本发明的研究发现,他汀类药物例如阿托伐他汀(Atorvastatin,ATV)预处理间充质干细胞,可显著提高间充质干细胞的抗凋亡能力和促归巢能力,制备出具有显著心梗微环境改善作用和高效心肌修复能力的干细胞来源外泌体。
一方面,本发明提供了一种间充质干细胞来源外泌体的制备方法,该方法包括:采用他汀类药物预处理间充质干细胞,并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。
根据本发明的具体实施方案,本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法包括:
在间充质干细胞的培养基中加入他汀类药物预处理12-24小时后,更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基继续培养;48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得到经他汀类药物预处理间充质干细胞分泌的外泌体。
根据本发明的具体实施方案,本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中,所述超速离心法包括步骤:
收集条件培养基后,依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、高速离心去除大囊泡,然后超速离心收取沉淀并重悬后,再次超速离心获得外泌体;
在本发明的一优选具体实施方案中,收集条件培养基后,300g离心10min去除细胞;2000g离心20min去除细胞碎片;16500g高速离心30min去除大囊泡;120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后,再次120000g超速离心70min获得外泌体。
根据本发明的具体实施方案,本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中,所述他汀类药物包括阿托伐他汀。
根据本发明的具体实施方案,本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中,所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
另一方面,本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的外泌体。
另一方面,本发明还提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞的抗凋亡能力和/或促归巢能力的制剂中的应用。
另一方面,本发明还提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞分泌具有心梗微环境改善作用和/或心肌修复能力的外泌体的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案,本发明中,所述他汀类药物包括阿托伐他汀;优选地,利用1μM他汀类药物预处理间充质干细胞24小时。
根据本发明的具体实施方案,本发明中,所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
在本发明的一个具体实施方案中,利用1μM ATV预处理BM-MSC 24小时可获得具有高效心肌修复和内皮保护功能的外泌体。
附图说明
图1A-图1C显示本发明实施例中间充质干细胞来源外泌体的鉴定结果。
图2A-图2D显示不同浓度ATV预处理间充质干细胞来源外泌体对内皮细胞的作用差异。
图3A-图3H显示ATV预处理间充质干细胞来源外泌体促进血管内皮细胞成管、迁移和存活检测结果。
图4A-图4F显示经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体可显著改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积的检测结果。
图5A-图5K显示经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体的保护作用与其上调lncRNAH19有关的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果,但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中,各原始试剂材料均可商购获得,未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
间充质干细胞来源外泌体的制备方法:利用差速贴壁法分离原代大鼠(Sprague-Dawley大鼠,60-80g)BM-MSCs并传代扩增至第3-4代备用。在BM-MSCs完全培养基(IMDM,Invitrogen,美国)中加入ATV预处理24小时后,更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基(经超速离心18小时后得到的含10%FBSIMDM)继续培养。48小时后收取条件培养基并利用超速离心法分离得到经ATV预处理BM-MSCs分泌的外泌体(MSCATV-Exo)。超速离心法具体步骤包括:收取条件培养基后,300g离心10min去除细胞;2000g离心20min去除细胞碎片;16500g高速离心30min去除大囊泡;120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后,再次120000g超速离心70min获得外泌体。
对制备好的MSCATV-Exo进行鉴定:包括电镜(HITACHI,H-600IV,日本)分析观察形态结构,NTA(Malvern Instruments,NanoSight,英国)分析外泌体的粒径分布以及通过Western Blot检测外泌体蛋白标志物。
比较不同浓度ATV预处理对MSCATV-Exo功能的影响,筛选出最佳ATV预处理浓度。利用此最佳ATV浓度预处理制备的MSCATV-Exo进行功能学评价,包括对血管内皮细胞的成管、迁移和抗凋亡作用的影响和心肌内注射后改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积的效果。最后进行分子生物学评价,即MSCATV-Exo中lncRNA H19表达水平检测。
评价指标(研究结果)
利用超速离心法分离得到的MSCATV-Exo在电镜下呈现球形或圆盘形,大小在100nm左右;NTA分析其粒径分布在30-150nm范围内;Western Blot检测显示MSCATV-Exo高表达TSG101、Alix、CD63、CD81等外泌体蛋白标志物。ATV预处理后与无预处理的BM-MSC分泌的外泌体在形态、粒径分布和蛋白标志物上没有显著差异。具体结果可参见图1A-图1C,其中,图1A:电镜下观察间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exo)的形态结构,呈球形或圆盘形,大小在100nm左右,经他汀预处理后形态不变;图1B:用NTA分析MSC-Exo的粒径分布,他汀预处理和未处理的MSC-Exo的粒径分布均在30-150nm范围内;图1C:外泌体的蛋白标志物鉴定,他汀预处理的MSC-Exo高表达TSG101、Alix、CD63、CD81等外泌体蛋白标志物。
对通过不同浓度ATV(0.01、0.1、1、10μM)预处理所得的MSCATV-Exo进行功能学分析,发现利用1μM ATV预处理得到的MSCATV-Exo促进内皮细胞成管和迁移的作用最为显著。具体结果可参见图2A-图2D。其中,图2A-图2B:不同浓度ATV(0.01、0.1、1、10μM)预处理间充质干细胞后提取的外泌体对内皮细胞成管的作用差异比较,其中1μMATV预处理后效果最佳(图2B);图2C-图2D:不同浓度ATV预处理间充质干细胞后提取的外泌体对内皮细胞迁移的作用差异比较,其中1μM ATV预处理后效果最佳(图2D)。
与未经ATV预处理的MSC-Exo相比,MSCATV-Exo可显著促进血管内皮细胞的成管和迁移,并能够促进缺氧无血清条件下内皮细胞的存活和抗凋亡作用。具体可参见图3A-图3H,其中,图3A-图3B:成管试验,与对照组相比,经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体(MSCATV-Exo)显著促进血管内皮细胞成管;图3C-图3D:划痕试验,与对照组相比,MSCATV-Exo显著促进血管内皮细胞迁移;图3E-图3F:流式细胞学检测,与对照组相比,MSCATV-Exo显著促进血管内皮细胞在缺氧无血清条件下的存活;图3G-图3H:Hoechst 33342染色,与对照组相比,MSCATV-Exo显著减少血管内皮细胞在缺氧无血清条件下的凋亡。
与未经ATV预处理的MSC-Exo相比,MSCATV-Exo心肌内注射后可显著改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积。具体可参见图4A-图4F,其中,图4A-图4B:经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体(MSCATV-Exo)移植显著改善心梗大鼠心功能;图4C-图4D:Masson染色显示MSCATV-Exo移植显著减小大鼠心梗面积;图4E-图4F:天狼星红染色提示MSCATV-Exo移植显著减小大鼠心梗局部胶原沉积。
与MSC-Exo相比,MSCATV-Exo高表达lncRNA H19,达到10倍以上。利用小干扰RNA敲低经ATV预处理的MSC中lncRNA H19的表达水平再提取其分泌的外泌体(MSCATV(Si)-Exo)则上述保护作用消除,说明lncRNA H19与MSCATV-Exo高效的内皮细胞保护作用、心功能改善以及缩小梗死面积的作用有关。具体可参见图5A-图5K,其中,图5A-图5B:经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体(MSCATV-Exo)高表达lncRNA H19,利用小干扰RNA敲低后的外泌体(MSCATV(Si)-Exo)中lncRNA H19表达水平显著下降;图5C-图5H:与MSCATV-Exo相比,MSCATV(Si)-Exo的内皮保护作用减弱;图5I-图5K:与MSCATV-Exo相比,MSCATV(Si)-Exo的改善梗死后心功能、心肌修复的作用减弱。
结论:利用1μM ATV预处理BM-MSC 24小时可获得具有高效内皮保护和心肌修复功能的外泌体,其机制与上调外泌体中lncRNAH19水平有关。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞来源外泌体的制备方法,该方法包括:采用他汀类药物预处理间充质干细胞,并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法,该方法包括:
在间充质干细胞的培养基中加入他汀类药物预处理12-24小时后,更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基继续培养;48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得到经他汀类药物预处理间充质干细胞分泌的外泌体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述超速离心法包括步骤:
收集条件培养基后,300g离心10min去除细胞;2000g离心20min去除细胞碎片;16500g高速离心30min去除大囊泡;120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后,再次120000g超速离心70min获得外泌体。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述他汀类药物包括阿托伐他汀。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
6.按照权利要求1~5任一项所述方法制备得到的外泌体。
7.他汀类药物在制备促进间充质干细胞的抗凋亡能力和/或促归巢能力的制剂中的应用。
8.他汀类药物在制备促进间充质干细胞分泌具有心梗微环境改善作用和/或心肌修复能力的外泌体的制剂中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其中,所述他汀类药物包括阿托伐他汀;优选地,利用1μM他汀类药物预处理间充质干细胞24小时。
10.根据权利要求7或8所述的应用,其中,所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
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Legal Events
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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