CN116036305B - 纳米药物及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米药物的制备方法,包括如下步骤:将由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体与心肌修复辅助剂混合,交替进行超声与冷却循环4次~8次,每次超声的时间为15s~60s,每次超声的振幅为20W~80W,每次冷却1min~5min,保持温度为2℃~8℃;交替进行超声与冷却循环结束后,于25℃~45℃恒温静置;超速离心去除游离的所述心肌修复辅助剂,超速离心的离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体;将包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体与心肌靶向配体混合,在2℃~6℃的温度下孵育8h~24h,超滤,超滤的离心力为3000g~5000g,超滤膜的截留分子量为10KDa~30KDa,洗涤4次~8次,制备所述纳米药物。
Description
技术领域
本发明涉及心血管疾病治疗药物技术领域,特别是涉及一种纳米药物及其制备方法、应用。
背景技术
心肌梗死(MI),又称心脏病发作,是心血管疾病引发死亡的主要原因,导致心肌梗死的主要病理特征是梗塞区血流受限,长期缺血,导致心肌细胞死亡。
传统的药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等治疗策略,对防止心肌细胞损失、防止左室重构以及终止心力衰竭等方面的疗效有限。近年来再生医学的发展对心肌梗死的治疗方法的改进起到了一定的推动作用,例如,间充质干细胞(MSCs)在病人和动物模型中,植入MSCs后均可以有效减少心肌细胞梗塞面积,防止组织过度损失,修复心肌梗死,恢复心脏功能。有研究表明,MSCs之所以能有利于心肌梗死的治疗,主要归因于MSCs所分泌的外泌体(exosome,Exo)。
外泌体是一种纳米级的膜囊泡,直径在30nm到150nm之间,是一种天然载体,可以将蛋白质、DNA、mRNA和microRNA等信号分子,从原始细胞转移到受体细胞,以促进细胞间的通讯。与脂质体、纳米球、胶束、微乳液以及偶联物等常规载体相比,外泌体具有低毒性、低免疫原性、高循环稳定性、生物相容性和生物屏障渗透性等各种更加突出的性能优势,在作为药物或治疗基因传递的载体方面具有极大的应用前景。
人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)分泌的外泌体,有研究证实其有利于心肌梗死后的心肌功能恢复,但单一的治疗效果有限,且常规载体和外泌体都容易被困在非特异性器官,特别是肺和肝脏内,导致对心肌缺血区域的靶向不足。将外泌体注射入梗塞心脏后,大部分细胞立即从注射区域扩散出去,分布在循环系统中,停留在目标位置的含量极少,极大地降低了外泌体对心肌功能恢复的疗效。
还有研究表明,通过调节葡萄糖代谢中若干酶的活性,提高细胞内三磷酸腺苷和磷酸肌酸的浓度,促进钾离子内流,增加红细胞内二磷酸甘油酸的含量以抑制氧自由基和组织胺的释放,能够减轻组织因缺血、缺氧造成的损害,尤其是对缺血心肌具有一定的保护作用。
有研究在动物实验与临床试验中已经证明,1,6-二磷酸果糖(Fructose 1,6-diphosphate,FDP)作为人体内一种细胞代谢的中间产物,不仅具有参与细胞供能代谢、稳定细胞膜、抑制细胞氧自由基的功能,还具有抑制细胞凋亡的作用,对缺血心肌细胞也能起到一定的保护作用。但是FDP经静脉注射后,在血浆中半衰期为10~15分钟,很快自血液分布到血循环以外的组织中,生物利用度低,进入循环系统后分布于全身,到达靶器官中的含量低,疗效受限。
发明内容
基于此,有必要提供一种能够提高对梗塞心脏的靶向能力、提高对心肌梗塞治疗效果的纳米药物及其制备方法、应用。
本发明提供一种纳米药物的制备方法,包括如下步骤:
将由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体与心肌修复辅助剂混合,交替进行超声与冷却循环4次~8次,每次超声的时间为15s~60s,每次超声的振幅为20W~80W,每次冷却1min~5min,保持温度为2℃~8℃;交替进行超声与冷却循环结束后,于25℃~45℃恒温静置;超速离心去除游离的所述心肌修复辅助剂,超速离心的离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体;
将包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体与心肌靶向配体混合,在2℃~6℃的温度下孵育8h~24h,超滤,超滤的离心力为3000g~5000g,超滤膜的截留分子量为10KDa~30KDa,洗涤4次~8次,制备所述纳米药物。
在其中一个实施例中,在制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体的步骤中,加入的所述外泌体的含量为1×1010个~1×1015个;和/或
在制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体的步骤中,加入的所述心肌修复辅助剂的体积为200μL~500μL,摩尔浓度为30mM~80mM;和/或
在制备所述纳米药物的步骤中,加入的所述心肌靶向配体的质量浓度为0.5mg/mL~1.5mg/mL,体积为15μL~45μL。
在其中一个实施例中,所述心肌修复辅助剂为1,6-二磷酸果糖、维生素C、儿茶素、甘露醇以及半胱氨酸中的一种或多种的混合;和/或
所述心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯。
在其中一个实施例中,在制备所述纳米药物的步骤中,还加入了荧光分子,所述步骤包括:将包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体、心肌靶向配体以及荧光分子混合。
在其中一个实施例中,加入的所述荧光分子的质量浓度为1mg/mL~3mg/mL,体积为1μL~3μL。
在其中一个实施例中,所述荧光分子为TVP以及TTVP中的至少一种。
在其中一个实施例中,在制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体的步骤之前,还包括如下收集所述外泌体的步骤:
收集所述人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞的细胞培养液上清,超速离心,离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,获得所述外泌体。
本发明还提供一种纳米药物,包括人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体、心肌修复辅助剂以及心肌靶向配体,所述外泌体包裹所述心肌修复辅助剂,所述心肌靶向配体嵌于所述外泌体的膜的脂质区域内;所述纳米药物通过如上述任一实施例中所述的纳米药物的制备方法制备得到。
在其中一个实施例中,每1×1010个~1×1015个所述外泌体中载有所述心肌修复辅助剂1mg~3mg;和/或
每1×1010个~1×1015个所述外泌体中载有所述心肌靶向配体1μg~5μg。
本发明还提供一种如上述任一实施例中所述的纳米药物在制备心肌修复制剂中的应用。
上述的纳米药物的制备方法中,通过特定的制备方法将心肌修复辅助剂包裹于人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体内,将外泌体与心肌修复辅助剂两者的优势结合进一步提高心肌缺血缺氧的治疗效果,同时还引入心肌靶向配体增强药物对受损心肌的靶向作用,提高纳米药物给药后在梗塞心脏内的药物含量和滞留时间,从而提高药物对心肌梗塞的治疗效果。
附图说明
图1为一实施方式的纳米药物的制备过程及结构示意图;
图2为实施例1~实施例4制备得到的Exo@FDP的NTA测定结果;
图3为实施例1~实施例4制备得到的Exo@FDP的粒径、浓度与超声条件之间的关系;
图4为实施例1~实施例4制备得到的Exo@FDP中,FDP的载量以及对于受损心肌修复效果与超声条件之间的关系;
图5为实施例5制备得到的TVP-PAC-Exo@FDP中FDP的装载量的表征结果;
图6为实施例5制备得到的TVP-PAC-Exo@FDP中PAC的装载量的表征结果;
图7为Exo、TVP、以及实施6制备得到的TVP-Exo在460nm波长激发下的荧光光谱图;
图8为Exo、TVP、以及实施6制备得到的TVP-Exo在488nm波长激发下的荧光光谱图;
图9为流式细胞术检测实施例6制备得到的TVP-Exo和实施例7制备得到的TVP-PAC-Exo分别在细胞内正常培养和缺血缺氧条件下培养的荧光信号强度谱图;
图10为荧光倒置显微镜观察实施例6制备得到的TVP-Exo和实施例7制备得到的TVP-PAC-Exo分别在细胞内正常培养和缺血缺氧条件下培养的摄取情况;
图11为缺血缺氧细胞加入Exo、FDP、实施例3的Exo@FDP、实施例8的PAC-Exo以及实施例9的PAC-Exo@FDP处理后的细胞存活情况。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面结合实施例和附图对本发明的纳米药物及其制备方法、应用进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
如图1所示,本发明一实施方式提供一种纳米药物的制备方法,包括如下步骤S110~步骤S120。
步骤S110:外泌体包载心肌修复辅助剂。
心肌修复辅助剂是一种适用于心肌缺血缺氧治疗的制剂。在一个具体的示例中,心肌修复辅助剂可以但不限于是1,6-二磷酸果糖、维生素C、儿茶素、甘露醇以及半胱氨酸中的一种或多种的混合。进一步地,心肌修复辅助剂为1,6-二磷酸果糖。
发明人发现,虽然由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体对心肌梗塞具有良好的修复效果,但是仅采用外泌体这一单一物质治疗心肌梗塞的效果有限。发明人进一步研究发现,将外泌体包裹上心肌修复辅助剂,将外泌体与心肌修复辅助剂对缺血心肌细胞的治疗效果双重联合,能够进一步提升纳米药物对心肌缺血缺氧的治疗效果。
具体地,步骤S110将外泌体包载心肌修复辅助剂的步骤包括步骤S111~步骤S113。
步骤S111:将由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体与心肌修复辅助剂混合,交替进行超声与冷却循环4次~8次,每次超声的时间为15s~60s,每次超声的振幅为20W~80W,每次冷却1min~5min,保持温度为2℃~8℃。
可以理解地,通过交替进行超声与冷却循环实现将心肌修复辅助剂包裹于外泌体内,能够尽可能地提高心肌修复辅助剂的载药率。本实施方式中,采用特定的多次交替进行的超声与冷却循环工艺既能够提高外泌体装载心肌修复辅助剂的装载能力,还能够使制备得到的纳米药物具有适宜的粒径,进一步地,能够有效提高纳米药物对受损心肌的修复能力。
进一步地,在步骤S111中,交替进行超声与冷却循环的次数例如可以是4次、5次、6次、7次以及8次等等。
进一步地,在步骤S111中,每次超声的时间例如可以是15s、20s、23s、25s、28s、30s、33s、35s、38s、40s、42s、45s、48s、48s、50s、53s、55s、58s、60s等等,不限于此。
进一步地,在步骤S111中,每次超声的振幅例如可以是20W、30W、40W、50W、60W、70W、80W等等,不限于此。
进一步地,在步骤S111中,每次冷却时间例如可以是1min、2min、3min、4min、5min等等,不限于此。
进一步地,在步骤S111中,加入的外泌体的含量为1×1010个~1×1015个。
进一步地,在步骤S111中,加入的外泌体的含量例如可以是1×1010个、1×1011个、1×1012个、1×1013个、1×1014个、1×1015个等等,不限于此。
进一步地,在步骤S111中,加入的心肌修复辅助剂的体积为200μL~500μL,摩尔浓度为30mM~80mM。
进一步地,在步骤S111中,加入的心肌修复辅助剂的体积例如可以是200μL、300μL、400μL、500μL,等等,不限于此。
进一步地,在步骤S111中,加入的心肌修复辅助剂的摩尔浓度例如可以是30mM、40mM、50mM、60mM、80mM等等,不限于此。
步骤S112:交替进行超声与冷却循环结束后,于25℃~45℃恒温静置。
进一步地,在步骤S112中,恒温的温度例如可以是25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃等等,不限于此。
进一步地,在步骤S112中,恒温静置的时间为0.5h~2h。
进一步地,在步骤S112中,恒温静置的时间例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h等等,不限于此。
步骤S113:超速离心去除游离的心肌修复辅助剂,超速离心的离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,制备包载有心肌修复辅助剂的外泌体。
进一步地,在步骤S113中,超速离心的离心力例如可以是100000g、120000g、300000g、500000g、1000000g、1500000g、1750000g、2000000g等等,不限于此。
进一步地,在步骤S113中,离心温度例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃等等,不限于此。
进一步地,在步骤S113中,离心时间例如可以是50min、60min、70min、85min、100min等等,不限于此。
步骤S120:心肌靶向配体修饰外泌体。
心肌靶向配体能够靶向与受损心肌过表达的β1-肾上腺素受体结合,作用于受损心肌细胞,使纳米药物尽可能定向停留在受损心脏内。可以理解地,心肌靶向配体可以是各种对受损心肌细胞具有靶向作用靶向分子、多肽或者适配体等等。在一个具体的示例中,心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)。3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯是一种艾司洛尔类似物,能够与受损心肌过表达的β1-肾上腺素受体靶向结合,负载有3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯的纳米药物在靶向引导下,使纳米药物定向给药至心肌梗塞部位,可以实现定向给药的目的,能够提高纳米药物在梗塞心脏内的含量和保留时间,提高纳米药物的治疗心肌梗塞疾病的效果。
具体地,步骤S120中采用心肌靶向配体对外泌体进行修饰的步骤包括步骤S121。
步骤S121:将包载有心肌修复辅助剂的外泌体与心肌靶向配体混合,在2℃~6℃的温度下孵育8h~24h,超滤,超滤的离心力为3000g~5000g,超滤膜的截留分子量为10KDa~30KDa,洗涤4次~8次,制备纳米药物。
进一步地,在步骤S121中,孵育温度例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,孵育时间例如可以是8h、10h、13h、15h、18h、20h、24h等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,超滤的离心力例如可以是3000g、3500g、4000g、4500g、4800g、5000g等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,超滤时间为3min~15min。
进一步地,在步骤S121中,超滤的时间例如可以是3min、5min、10min、15min等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,超滤膜的截留分子量例如可以是10KDa、20KDa、30KDa等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,洗涤次数例如可以是4次、5次、6次、7次、8次等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,加入的心肌靶向配体的质量浓度为0.5mg/mL~1.5mg/mL,体积为15μL~45μL。
进一步地,在步骤S121中,加入的心肌靶向配体的质量浓度例如可以是0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL等等,不限于此。
进一步地,在步骤S121中,加入的心肌靶向配体的体积例如可以是15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、45μL、等等,不限于此。
在一个具体的示例中,在步骤S120中,还加入了荧光分子。相应地,步骤S120调整为步骤S120’。
步骤S120’:将包载有心肌修复辅助剂的外泌体、心肌靶向配体以及荧光分子混合。
在纳米药物中添加荧光分子标记,通过荧光成像可以监测并分析纳米药物在心脏内的滞留水平。荧光分子是一种可用于荧光成像的物质,能够实时监测纳米药物在受损心脏内的药物水平,根据荧光监测结果,可便于临床制定给药方案,例如确定是否需要多次给药,以及确定具体的给药时间节点等等。
进一步地,荧光分子为水溶性的荧光小分子,选用的AIE荧光分子能够插入外泌体膜内,发出荧光信号,游离的未与外泌体结合的荧光分子并不会发光,且荧光背景低,信号强。进一步地,荧光分子可以但不限于是TVP以及TTVP中的一种或多种的混合。TVP和TTVP荧光分子是基于AIE发光的荧光染料。
优选地,荧光分子为TVP。将TVP与外泌体、心肌修复辅助剂以及心肌靶向配体复合后,TVP能够嵌于外泌体的膜表面后,组织穿透深度更高,荧光背景更低,信号更强,更有利于监测纳米药物的给药水平。
进一步地,在步骤S120’中,加入的荧光分子的质量浓度为1mg/mL~3mg/mL,体积为1μL~3μL。
进一步地,在步骤S120’中,加入的荧光分子的质量浓度例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL等等,不限于此。
进一步地,在步骤S120’中,加入的荧光分子的体积例如可以是1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL等等,不限于此。
可以理解地,通常外泌体并不是通过市面购买的方式直接获得,因此,在步骤S110之前,通常还需要收集外泌体。
在一个具体的示例中,提供了一种收集外泌体的方法,具体步骤包括:收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞的细胞培养液上清,超速离心,离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,获得外泌体。
本发明一实施例还提供一种纳米药物,包括外泌体、心肌修复辅助剂以及心肌靶向配体,外泌体包裹心肌修复辅助剂,心肌靶向配体嵌于外泌体的膜的脂质区域内,外泌体是由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的;纳米药物通过如上述任一实施例中的纳米药物的制备方法制备得到。
进一步地,每1×1010个~1×1015个外泌体中载有心肌修复辅助剂1mg~3mg。在这一范围内,外泌体与心肌修复辅助剂联合,能够充分发挥二者治疗心肌缺血缺氧的协同作用,使纳米药物对心肌梗塞的治疗效果更好。可以理解地,每1×1010个~1×1015个外泌体中载有心肌修复辅助剂的含量例如可是1mg、1.2mg、1.5mg、2mg、3mg等等,不限于此。
进一步地,每1×1010个~1×1015个外泌体中载有心肌靶向配体1μg~5μg。在这一范围内,心肌靶向配体对受损心肌过表达的β1-肾上腺素受体靶向结合效果最好。可以理解地,每1×1010个~1×1015个外泌体中载有心肌靶向配体的含量例如可以是1μg、2μg、3μg、4μg、5μg等等,不限于此。
可以理解地,本实施例中提供纳米药物通常在低温下如4℃避光保存。
本发明一实施例还提供一种如上述任一实施例中的纳米药物在制备心肌修复制剂中的应用。
可以理解地,当上述纳米药物中还具有荧光分子时,上述任一实施例中的纳米药物还可以应用于心肌修复辅助给药监测制剂中的制备。
上述的纳米药物的制备方法中,通过特定的方法将心肌修复辅助剂包裹于人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体内,将外泌体与心肌修复辅助剂两者的优势结合进一步提高心肌缺血缺氧的治疗效果,同时还引入心肌靶向配体增强药物对受损心肌的靶向作用,提高纳米药物给药后在梗塞心脏内的药物含量和滞留时间,从而提高药物对心肌梗塞的治疗效果。进一步地,还可以通过荧光分子标记实现对纳米药物给药水平的实时监测。
以下结合具体实施例对本发明的纳米药物及其制备方法、应用作详细说明,可以理解地,本发明的纳米药物及其制备方法、应用并不限于以下实施例。以下具体实施例中,若无特殊说明,所有原料均可来源于市售。
第一部分外泌体对心肌修复辅助剂联合治疗对受损心肌修复能力研究
实施例1:超声振幅为20W制备Exo@FDP
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2、外泌体包载心肌修复辅助剂:
将外泌体与心肌修复辅助剂1,6-二磷酸果糖混合,多次超声、冷却循环,恒温静置,超速离心去上清,制备包载有心肌修复辅助剂的外泌体(Exo@FDP)。
其中,1,6-二磷酸果糖的体积为300μL,浓度为50mM,外泌体的含量为1013个。
超声、冷却循环的次数为6次,每次超声的时间为30s,每次超声的振幅为20W,每次超声结束后冷却2min,然后再开始下一次超声。
超声结束后,于37℃恒温静置1h。
超速离心的离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min。
实施例2:超声振幅为40W制备Exo@FDP
与实施例1的步骤基本相同,区别在于步骤2中:每次超声振幅为40W。
实施例3:超声振幅为60W制备Exo@FDP
与实施例1的步骤基本相同,区别在于步骤2中:每次超声振幅为60W。
实施例4:超声振幅为80W制备Exo@FDP
与实施例1的步骤基本相同,区别在于步骤2中:每次超声振幅为80W。
对实施例1~实施例4制备的包载有心肌修复辅助剂的外泌体(Exo@FDP)进行表征和评价:
表征方法为:通过Fructose-6-Phosphate Assay试剂盒测定实施例1~实施例4制备的Exo@FDP中FDP的装载量,通过NTA测定实施例1~实施例4制备的Exo@FDP的浓度以及粒径分布,通过CCK8试剂盒评价实施例1~实施例4制备的Exo@FDP对于受损心肌细胞的修复水平。
表征结果:如图2至图4所示,不同超声振幅条件下,Exo@FDP的粒径分布不同,刚开始随着超声振幅的增大,Exo@FDP的粒径变小,Exo对于FDP的装载能力不断提高,Exo@FDP对于受损心肌的修复能力不断增强。但当超声振幅超过60W时,外泌体膜修复能力受限,发生聚集,Exo@FDP的粒径明显增大,Exo对于FDP的装载能力发生下降,Exo@FDP对于受损心肌的修复能力也受到限制,当超声振幅增大到80W时,Exo对于FDP的装载能力已经低于采用超声振幅20W时的装载能力,Exo@FDP对于受损心肌的修复能力也回落至采用超声振幅20W时的水平。可见,当超声振幅为60W时,Exo对于FDP的装载能力达到最大,且Exo@FDP对于受损心肌的修复能力最强,因此,选用超声振幅为60W时制备得到的Exo@FDP进行后续的实验。
第二部分外泌体对心肌修复辅助剂以及心肌靶向配体装载能力研究
实施例5:制备TVP-PAC-Exo@FDP
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2、外泌体包载心肌修复辅助剂:
将外泌体与心肌修复辅助剂1,6-二磷酸果糖混合,多次超声、冷却循环,恒温静置,超速离心去上清,获得包载有心肌修复辅助剂的外泌体(Exo@FDP)。
其中,1,6-二磷酸果糖的体积为300μL,浓度为50mM,外泌体的含量为1013个。
超声、冷却循环的次数为6次,每次超声的时间为30s,每次超声的振幅为60W,每次超声结束后冷却2min,然后再开始下一次超声。
超声结束后,于37℃恒温静置1h。
超速离心的离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min。
步骤3、心肌靶向配体修饰及荧光分子标记:
将包载有心肌修复辅助剂的外泌体、荧光分子以及心肌靶向配体混合,在4℃下孵育8h,然后通过超滤的方式去除游离荧光分子以及心肌靶向配体(10KDa,3500g,10min,洗涤6次),获得纳米药物(TVP-PAC-Exo@FDP)。
其中,加入的荧光分子的质量浓度为2mg/mL,体积为1.5μL,荧光分子分子为TVP。加入的心肌靶向配体的质量浓度为1mg/mL,体积为30μL,心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)。
对实施例5制备得到的纳米药物(TVP-PAC-Exo@FDP)中FDP和PAC的装载量进行表征:
表征方法为:通过Fructose-6-Phosphate Assay试剂盒测定FDP的装载量,通过HPLC测定PAC的装载量。
表征结果:结果如图5和图6,TVP-PAC-Exo@FDP中FDP的包封率为29.41%,PAC的包封率为10.08%,每1013个外泌体中载有1.26mg的FDP,每1013个外泌体中载有3μg的PAC。
第三部分荧光分子成像监测能力研究
实施例6:制备TVP-Exo
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2:荧光标记外泌体:
取1013个外泌体,将外泌体、荧光分子混合,在4℃下孵育8h,然后通过超滤的方式去除游离荧光分子(10KDa,3500g,10min,洗涤6次),获得荧光标记的外泌体(TVP-Exo)。
其中,加入的荧光分子的质量浓度为2mg/mL,体积为1.5μL,荧光分子分子为TVP。
对实施例6制备的荧光标记的外泌体(TVP-Exo)的荧光信号水平和荧光成像能力进行表征:
表征方法为:取单独的Exo、TVP以及实施例6负载了TVP的Exo(TVP-Exo),通过酶标仪分别测定Exo、TVP、TVP-Exo的荧光光谱。
表征结果:如图7所示,游离的TVP以及Exo无荧光信号,TVP标记在Exo上后发出强烈的荧光信号。如图8所示,在488nm激光激发下,Exo、TVP以及TVP-Exo的荧光成像信号表现出与荧光光谱图同样的结果,表明TVP能够有效标记Exo进行后续观察以及实时成像,可以用于后续治疗成像研究。
第四部分心肌靶向配体的靶向能力研究
实施例7:制备TVP-PAC-Exo
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2:心肌靶向配体修饰及荧光分子标记:
取1013个外泌体,将外泌体、荧光分子以及心肌靶向配体混合,在4℃下孵育8h,然后通过超滤的方式去除游离荧光分子以及心肌靶向配体(10KDa,3500g,10min,洗涤6次),获得荧光标记、心肌靶向配体修饰的外泌体(TVP-PAC-Exo)。
其中,加入的荧光分子的质量浓度为2mg/mL,体积为1.5μL,荧光分子分子为TVP。加入的心肌靶向配体的质量浓度为1mg/mL,体积为30μL,心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)。
对实施例7制备的荧光标记、心肌靶向配体修饰的外泌体(TVP-PAC-Exo)的靶向效果评价:
表征方法为:使用实施例6的TVP-Exo和实施例7的TVP-PAC-Exo分别处理正常的H9C2细胞以及缺血缺氧的H9C2细胞,通过流式细胞术以及激光共聚焦显微镜观察不同组别,不同时间点的荧光信号分布情况。
表征结果:如图9所示,通过流式细胞术检测不同样本与不同细胞孵育不同时间后细胞内TVP荧光信号的强度,可见,TVP-PAC-Exo具有更强的荧光信号,说明TVP-PAC-Exo的摄取效率明显高于TVP-Exo,同时当心肌细胞处于缺血缺氧状态时,其对TVP-PAC-Exo的摄取效率显著提高,而TVP-Exo无明显变化,表明PAC修饰后,心肌细胞对于外泌体的摄取能力有一定提高,且当心肌细胞处于缺血缺氧状态时,其对PAC修饰后的外泌体的摄取能力显著增强,在孵育6h后即达到最大摄取量,表明PAC可用来作为缺血缺氧心肌细胞的靶向配体分子。
如图10所示,通过荧光倒置显微镜观察孵育6小时后,TVP-EXO和TVP-PAC-Exo在H9C2细胞以及缺血缺氧H9C2细胞中的摄取情况,可见,PAC修饰后外泌体在细胞内的荧光分布强度明显高于未修饰组别,同时,TVP-PAC-Exo在缺血缺氧的H9C2细胞中的荧光强度明显高于正常培养的H9C2细胞,而对于TVP-Exo而言,二者并无明显差异。表明PAC修饰后,心肌细胞对于外泌体的摄取能力有所增强,可用于提高缺血缺氧的心肌细胞目标位置的靶向摄取与保留能力。
第五部分外泌体与心肌修复辅助剂联合并靶向定位对受损心肌修复能力研究
实施例8:制备PAC-Exo
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2、心肌靶向配体修饰:
取1013个外泌体,将外泌体、以及心肌靶向配体混合,在4℃下孵育8h,然后通过超滤的方式去除游离心肌靶向配体(10KDa,3500g,10min,洗涤6次),获得心肌靶向配体修饰的外泌体(PAC-Exo)。
其中,加入的心肌靶向配体的质量浓度为1mg/mL,体积为30μL,心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)。
实施例9:制备PAC-Exo@FDP
步骤1、收集外泌体:
收集人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞(iPS-MSCs)的细胞培养液上清,进行超速离心,离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min,获得外泌体(Exo)。
步骤2、外泌体包载心肌修复辅助剂:
将外泌体与心肌修复辅助剂1,6-二磷酸果糖混合,多次超声、冷却循环,恒温静置,超速离心去上清,获得包载有心肌修复辅助剂的外泌体(Exo@FDP)。
其中,1,6-二磷酸果糖的体积为300μL,浓度为50mM,外泌体的含量为1013个。
超声、冷却循环的次数为6次,每次超声的时间为30s,每次超声的振幅为60W,每次超声结束后冷却2min,然后再开始下一次超声。
超声结束后,于37℃恒温静置1h。
超速离心的离心力为120000g,离心温度为4℃,离心时间为70min。
步骤3、心肌靶向配体修饰:
将包载有心肌修复辅助剂的外泌体、以及心肌靶向配体混合,在4℃下孵育8h,然后通过超滤的方式去除游离心肌靶向配体(10KDa,3500g,10min,洗涤6次),获得纳米药物(PAC-Exo@FDP)。
其中,加入的心肌靶向配体的质量浓度为1mg/mL,体积为30μL,心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯(PAC)。
对实施例9制备得到的纳米药物(PAC-Exo@FDP)心肌缺氧的治疗效果进行表征。
表征方法为:将H9C2细胞铺在96孔板里,3000cells/well,过夜生长使其贴壁。更换培养基为缺血缺氧培养基(150μM CoCl2模拟缺氧环境,DMEM无血清含双抗模拟缺血环境)培养24小时。
对照组继续缺血缺氧,在缺血缺氧培养基中分别加入Exo、FDP、PAC、实施例8制备的PAC-Exo、实施例3制备的Exo@FDP以及实施例9制备的PAC-Exo@FDP,使用CCK8法测试的细胞存活率。
通过CCK8细胞存活率评价Exo、FDP、PAC、PAC-Exo、Exo@FDP以及PAC-Exo@FDP对于缺血缺氧H9C2细胞的治疗效果,细胞存活率的计算公式为:
细胞存活率(%)=A样本处理组/A正常培养细胞×100%
表征结果:如图11所示,单独的Exo、FDP治疗效果并不明显,当二者联合形成Exo@FDP后,缺血缺氧H9C2细胞存活率大幅度上升,表明Exo与FDP对心肌缺血缺氧有着良好的联合治疗效果。PAC-Exo的治疗效果也不明显。对Exo@FDP进行PAC修饰后,其治疗效果进一步增强,表明PAC修饰,能够促进Exo@FDP在受损心肌细胞内的摄取与保留细胞,PAC-Exo@FDP对受损心肌细胞的治疗效果得到了进一步改善。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种纳米药物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
将由人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体与心肌修复辅助剂混合,交替进行超声与冷却循环4次~8次,每次超声的时间为15s~60s,每次超声的振幅为40W~60W,每次冷却1min~5min,保持温度为2℃~8℃;交替进行超声与冷却循环结束后,于25℃~45℃恒温静置;超速离心去除游离的所述心肌修复辅助剂,超速离心的离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体;
将包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体与心肌靶向配体混合,在2℃~6℃的温度下孵育8h~24h,超滤,超滤的离心力为3000g~5000g,超滤膜的截留分子量为10KDa~30KDa,洗涤4次~8次,制备所述纳米药物;
其中,加入的所述外泌体的含量为1×1010个~1×1015个;加入的所述心肌修复辅助剂的体积为200μL~500μL,摩尔浓度为30mM~80mM;加入的所述心肌靶向配体的质量浓度为0.5mg/mL~1.5mg/mL,体积为15μL~45μL;
所述心肌修复辅助剂为1,6-二磷酸果糖;所述心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯。
2.根据权利要求1所述的纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备所述纳米药物的步骤中,还加入了荧光分子,所述步骤包括:将包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体、心肌靶向配体以及荧光分子混合。
3.根据权利要求2所述的纳米药物的制备方法,其特征在于,加入的所述荧光分子的质量浓度为1mg/mL~3mg/mL,体积为1μL~3μL。
4.根据权利要求2所述的纳米药物的制备方法,其特征在于,所述荧光分子为TVP以及TTVP中的至少一种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的纳米药物的制备方法,其特征在于,在制备包载有所述心肌修复辅助剂的外泌体的步骤之前,还包括如下收集所述外泌体的步骤:
收集所述人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞的细胞培养液上清,超速离心,离心力为100000g~2000000g,离心温度为2℃~6℃,离心时间为50min~100min,获得所述外泌体。
6.一种纳米药物,其特征在于,包括人诱导多能干细胞分化成的间充质干细胞分泌的外泌体、心肌修复辅助剂以及心肌靶向配体,所述外泌体包裹所述心肌修复辅助剂,所述心肌靶向配体嵌于所述外泌体的膜的脂质区域内;所述纳米药物通过如权利要求1~5任一项所述的纳米药物的制备方法制备得到;所述心肌修复辅助剂为1,6-二磷酸果糖,所述心肌靶向配体为3-{4-[2-羟基-(1-甲基乙胺基)丙氧基]苯基}丙酸十六醇酯;每1×1010个~1×1015个所述外泌体中载有所述心肌修复辅助剂1mg~3mg;每1×1010个~1×1015个所述外泌体中载有所述心肌靶向配体1μg~5μg。
7.一种如权利要求6所述的纳米药物在制备心肌修复制剂中的应用。
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