CN102784398A - 内皮抑素作为递送系统和化学合成的rna干扰分子组成的组合物及应用 - Google Patents
内皮抑素作为递送系统和化学合成的rna干扰分子组成的组合物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，公开了内皮抑素作为递送系统和化学合成的RNA干扰分子组成的组合物及应用。该组合物包含携带+5至+15电荷的内皮抑素重组蛋白和携带-15至-55电荷的化学合成的RNA干扰分子，二者通过正负电荷结合形成电荷值在-20到+20之间的组合物。该组合物大大降低了内皮抑素和化学合成的RNA干扰分子的使用剂量和电荷值，并且由于起递送作用的内皮抑素具有靶向病灶血管内皮细胞特殊性质，该组合物在静脉注射后1小时内或24小时内能靶向目标组织并稳定分布，使治疗效果更好，活性更稳定，有效作用时间更长，毒副作用更小。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及内皮抑素作为递送系统和化学合成的RNA干扰分子组成的组合物及应用。
背景技术
内皮抑素(endostatin)最早由原发性肿瘤细胞产生，能抑制肿瘤血管生长(0’Reily等1997，Cell 88：277)，是胶原蛋白XVIII的一个片段，由183个氨基酸组成，带高正电荷，是重组蛋白中极少见的带高正电荷的一种蛋白质。目前已经有183个氨基酸、184个氨基酸、N端带6个组氨酸的193个氨基酸和PEG修饰的内皮抑素均已经进行了临床研究或已经上市。但是内皮抑素作为递送系统递送化学合成的RNA干扰分子到相应的靶组织没有相应的报道。
目前已知内皮抑素有如下生物学功能：(1)通过抑制血管内皮细胞的增殖和生长来抑制血管生成。内皮抑素能特异性地抑制血管内皮细胞在成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导下的增殖，抑制内皮细胞的迁移，诱导内皮细胞凋亡，但对非内皮细胞，如平滑肌细胞、3T3成纤维细胞等均无抑制作用。(2)对生长的血管产生抑制作用，而对静止的血管组织不起作用。(3)抑制肿瘤的生长和转移。多项实验表明可以利用重组内皮抑素蛋白或内皮抑素基因进行肿瘤治疗，已经有报道表明，内皮抑素对60种以上的不同实体肿瘤的生长和转移能产生抑制作用。(4)内皮抑素有一定的体外抑制肿瘤细胞的作用。
内皮抑素虽然本身对肿瘤具有一定的治疗效果，但是临床单独使用7.5mg/m2内皮抑素没有明显的疗效。需要同化疗药物联合使用。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)自1998年发现以来备受瞩目。1998年，Fire等(Nature，1998，391：806-811)在线虫体内首次发现双链RNA(double strand RNA，dsRNA)能使基因表达沉默。2002年报道合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可以在培养的哺乳动物细胞中实现序列特异性的基因敲除。自首次成功地运用siRNA的基因沉默作用对小鼠丙型肝炎进行治疗以来，研究者开始尝试将siRNA应用于各种疾病的治疗，包括艾滋病和癌症的基因治疗等。
siRNA的作用原理为siRNA在细胞内能介导RNA干扰效应，识别与其序列互补的特异性mRNA，沉默相关基因的表达。作用具有特异性和高效性，是特异性抑制基因表达的强效方法。siRNA已成为许多疾病相关基因潜在的治疗手段，已经是临床应用研究的热点。siRNA药物在国际上已经有12项进入了I-III期临床研究。
2008年12月Sun等(Nature 2001，411：494-498.)提出正义链和反义链长度不一致的不对称双链小干扰RNA(asymmetric interfering RNA，asiRNA，aiRNA)可以更加有效地使哺乳细胞中相应的靶基因沉默。认为asiRNA有较多的优点将来可能取代siRNA进行创新药物的研究。与siRNA相比，asiRNA介导的基因沉默方式更加有效，持久，结构稳定，并且可以降低正义链的脱靶效应。asiRNA药物目前在国际上没有进入临床研究的报道。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度约为22-28nt的非编码小分子RNA，miRNA通过与靶mRNA 3’UTR(Untranslated Regions，即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段)完全或不完全的互补结合，导致靶mRNA降解或翻译抑制，从而调控靶基因的表达，影响细胞增殖、分化和凋亡。它们通过miRNA介导的特异性的基因沉默导致靶mRNA降解及抑制蛋白质的合成，从而调控转录后基因表达水平。miRNA对细胞的增殖、分化和凋亡有重要的调节作用。通常采用微小RNA模拟物(miRNA mimics)或抑制剂来进行基因表达调控研究。miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。miRNA mimics能进一步增强内源miRNA的沉默作用，降低细胞内靶向蛋白表达量。微小RNA抑制剂可以直接抑制miRNAs的功能。例如，丹麦制药公司Santafis Pharma宣布其开发的丙型肝炎新型治疗手段SPC3649(锁核酸LNA-antimiRTM-122)开始进入人体第一阶段临床试验，这是世界上首个进行人体临床试验的miRNA药物，直接抑制丙型肝炎微小RNA-122的功能。
上述三类化学合成的RNA干扰分子，无论是化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰(siRNA)、化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰(asiRNA，aiRNA)、还是微小RNA(miRNA)的模拟物或抑制剂。其共同特征为携带高负电荷-15至-55。在进行静脉全身给药时仍面临有剂量高、或稳定性不长、或毒副作用比较大、或制造成本高等问题。其中高负电荷是主要问题所在。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中以高负电荷为特征的siRNA、asiRNA、miRNA基因药物在进行静脉全身给药时存在的剂量高、稳定性差、毒副作用比较大或制造成本高等问题，提供一种内皮抑素作为递送系统和化学合成的RNA干扰分子组成的组合物及应用。
一种药用组合物，包含携带+5至+15电荷的内皮抑素重组蛋白和携带-15至-55电荷的化学合成的RNA干扰分子，二者通过正负电荷结合形成电荷值在-20到+20之间的组合物，优选形成电荷值在-10到+10之间的组合物。
所述的药用组合物还包含用于包裹所述的内皮抑素重组蛋白与RNA干扰分子以调节正负电荷量的阳离子脂质体、中性脂质体或PEG修饰长效脂质体。正负电荷值符合要求的组合物也可以不用脂质体包裹用注射用生理盐水溶解直接使用。
所述的内皮抑素重组蛋白为通过大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物或人细胞、病毒载体表达纯化后的重组蛋白，可以为目前市售的所有内皮抑素产品，也可以为按照本领域的常规实验手段与方法制备的内皮抑素；所述的内皮抑素重组蛋白优选不携带6组氨酸标签的由183-184个氨基酸组成的人源结构的内皮抑素重组蛋白，N端或/和C端携带6组氨酸标签的由190-200个氨基酸组成的人源结构改构的内皮抑素融合蛋白，或上述两类内皮抑素重组蛋白通过PEG修饰或白蛋白修饰后形成的长效内皮抑素；或人工合成的截短型内皮抑素(包括了183个氨基酸序列中的主要氨基酸组成)。所有类型的内皮抑素重组蛋白共同特征为携带高正电荷从+5至+15，并且与活跃病灶的血管内皮细胞具有特殊的亲合性。
所述的RNA干扰分子选自化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰分子(siRNA)，化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰分子(asiRNA，aiRNA)，或者化学修饰或不修饰的miRNA。
所述的两条链对称的小核酸干扰分子(siRNA)为正义链与反义链长度一致、能抑制目的基因表达，长度为19-25nt的双链配对的RNA，其两条链3’端含有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂；所述的两条链配对不对称的小核酸干扰分子(asiRNA，aiRNA)是经化学合成得到，从靶基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发，通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基，形成两条链碱基长度不一致，每条链3’端有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。
所述的miRNA包括miRNA模拟物(miRNA mimics)和miRNA抑制剂。miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。miRNA抑制剂是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂，能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。
所述的化学修饰指硫代修饰、甲基化修饰、磷酸化修饰、胆固醇修饰或氟代修饰。
本发明所涉及的siRNA、或asiRNA、或miRNA无论是否经过化学修饰，均属于化学合成的RNA干扰分子，共同特征为带高负电荷从-15至-55，均能调控目的基因的表达。
所述的药用组合物中各组分分开封装临用时混合，或直接混合后封装在一起。
所述的药用组合物在制备治疗恶性肿瘤、肝炎或艾滋病药物中的应用。
所述的药用组合物中各组分分开封装临用时混合，或直接混合后封装在一起。
本发明采用的内皮抑素重组蛋白同抑制基因表达的RNA干扰分子通过正负电荷结合，既可以直接按正负电荷比例计算出合适的配比直接混合一起，也可以分别瓶装临用时按照正负电荷比例混合后使用。其中正负电荷比例可通过电泳、电荷测定计算出合适的配比，合适的配比指混合后使最终组合物的电荷值在-20到+20之间。该组合物还可以用阳离子脂质体、中性脂质体、或PEG化长效脂质体包裹以调节正负电荷的比例达到更合适的电荷值范围(即电荷值在-10到+10)内，并且使该组合物在注射用生理盐水中不析出、不沉淀、不影响活性、更稳定，更容易进入细胞，能皮下注射、局部注射、静脉注射、静脉滴注递送化学合成的RNA干扰分子到靶器官调控目的基因的表达。
有益效果：本发明提供的重组人内皮抑素具有高正电荷特性，在有或无脂质体包裹情况下，与携带高负电荷的化学合成的RNA干扰分子通过正负电荷结合形成组合物。在注射用生理盐水中不析出、不沉淀、不影响活性、更稳定，更容易进入细胞。该药用组合物大大降低了内皮抑素和化学合成的RNA干扰分子的使用剂量和电荷值，并且由于起递送作用的内皮抑素具有靶向病灶血管内皮细胞的特殊性质，该组合物在静脉注射后1小时内或24小时内能靶向目标组织并稳定分布，使治疗效果更好，活性更稳定，有效作用时间更长，毒副作用更小。本发明药用组合物兼具了靶向性和基因调控两种作用，在治疗恶性肿瘤、肝炎或艾滋病中发挥积极作用，可用于制备治疗恶性肿瘤、肝炎或艾滋病药物。
附图说明
图1、Bcl2-siRNA、内皮抑素、PEG脂质体(复合脂)形成能静脉给药的Bcl2-siRNA干扰组合物的模式图。其中Bcl2-siRNA、内皮抑素、PEG脂质体各单独一瓶，临用时混合在一起。
图2、内皮抑素的电荷与溶剂pH的对应关系图，横坐标为溶剂pH值，纵坐标为内皮抑素电荷值。
图3、内皮抑素与Bcl2-siRNA及PEG脂质体结合形成的组合物的Zeta电位图。Zeta电位为+2.6mV。
图4、内皮抑素与VEGF-asiRNA及PEG脂质体-壳聚糖结合形成的组合物的Zeta电位图。Zeta电位为+13.7mV
图5、内皮抑素与Bcl2-siRNA在不同脂质体包裹情况下形成组合物的电泳图。
各条带对应的样品如下：1、Bcl2-siRNA(20nM)1.5μl；2、Blc2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体质量比1∶10∶5；3、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶2.5；4、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶5；5、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶10；6、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶15；7、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶20；8、Bcl2-siRNA∶内皮抑素∶PEG脂质体∶壳聚糖质量比1∶10∶5∶25。
图6、内皮抑素与不同基因的siRNA、asiRNA、miRNA在有或没有脂质体包裹情况下形成组合物的电泳图。
a：无脂质体包裹情况下VEGF-asiRNA与内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为VEGF-asiRNA与内皮抑素以1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60质量比形成的组合物的电泳图；
b：有脂质体包裹情况下VEGF-asiRNA与内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为VEGF-asiRNA、内皮抑素、PEG脂质体、壳聚糖、β-环糊精以1∶10∶5∶0∶2.5、1∶10∶5∶5∶2.5、1∶10∶5∶10∶2.5、1∶10∶5∶15∶2.5、1∶10∶5∶20∶2.5、1∶10∶5∶30∶2.5、1∶10∶5∶0∶5、1∶10∶5∶5∶5、1∶10∶5∶10∶5、1∶10∶5∶15∶5、1∶10∶5∶20∶5、1∶10∶5∶30∶5质量比形成的组合物的电泳图。
c：无脂质体包裹情况下anti-Has-122 miRNA抑制剂与PEG内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为anti-Has-122 miRNA抑制剂与PEG内皮抑素以3∶0、3∶5、3∶10、3∶15、3∶20、3∶25、3∶30、3∶40、3∶50质量比形成的组合物的电泳图。
d：无脂质体包裹情况下CCR5-asiRNA与恩度内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为CCR5-asiRNA与内皮抑素以1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50质量比形成的组合物的电泳图。
e：无脂质体包裹情况下Rab11b-siRNA与恩度内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为Rab11b-siRNA与内皮抑素以1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50质量比形成的组合物的电泳图。
f：无脂质体包裹情况下MDR1-siRNA与恩度内皮抑素形成的组合物的电泳图，从左到右各泳道分别为MDR1-siRNA与内皮抑素以1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50质量比形成的组合物的电泳图。
图7、内皮抑素与化学合成的RNA干扰分子形成组合物的粒径。
a，Bcl2-asiRNA与内皮抑素及PEG脂质体的组合物的粒径图，
b，VEGF-asiRNA与内皮抑素及壳聚糖脂质体的组合物的粒径图。
图8、内皮抑素与Bcl2-asiRNA形成组合物对顺铂IC50的影响。
其中对照组不进任何转染，只加入不同浓度顺铂。Bcl2-asiRNA-内皮抑素组为利用内皮抑素-PEG脂质体递送系统转染Bcl2-asiRNA后再加入不同浓度顺铂。
图9、内皮抑素与Bcl2-asiRNA形成组合物的细胞毒性。
a.不同脂质体、内皮抑素与Bcl2-asiRNA形成组合物的细胞毒性；其中1-4分别代表Lipo2000脂质体与Bcl2-asiRNA形成的组合物、内皮抑素-PEG脂质体与Bcl2-asiRNA形成的组合物、内皮抑素-壳聚糖脂质体与Bcl2-asiRNA形成的组合物及不进行任何处理的空白细胞对照。
b.PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物浓度与细胞毒性的关系；其中1-8分别为1：不进行任何处理2：0.125μl PEG脂质体+0.25μl内皮抑素+0.125μl Bcl2-asiRNA复合物；3：0.25μl PEG脂质体+0.5μl内皮抑素+0.25μl Bcl2-asiRNA复合物；4：0.5μl PEG脂质体+1μl内皮抑素+0.5μl Bcl2-asiRNA复合物；5、1μl PEG脂质体复合物+2μl内皮抑素+1μl Bcl2-asiRNA；6、2μl PEG脂质体+4μl内皮抑素+2μl Bcl2-asiRNA复合物；7、4μl PEG脂质体+8μl内皮抑素+4μl Bcl2-asiRNA复合物；8、8μl PEG脂质体+16μl内皮抑素+8μl Bcl2-asiRNA复合物。
图10、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物与顺铂联合使用对HelaB2细胞体外抑制作用试验结果图。
1～6分别代表：1：Lipo 2000转染Bcl2-asiRNA组；2：PEG脂质体-内皮抑素复合物转染Bcl2-asiRNA组；3：Lipo 2000转染Bcl2-asiRNA+低剂量顺铂(1微克)组；4：PEG脂质体-内皮抑素复合物转染Bcl2-asiRNA+低剂量顺铂组；5：低剂量顺铂(1微克)单独组；6：增倍剂量顺铂(2微克)单独组。
图11、内皮抑素与经化学修饰的Bcl2-asiRNA形成组合物对荷H22肝癌小鼠肿瘤体积的抑制曲线。
其中生理盐水组为静脉注射生理盐水的空白对照；CTX(15mg/kg)组及CTX(30mg/kg)组为腹腔注射化疗药物环磷酰胺的阳性对照；PEG脂质体-内皮抑素-不相关siRNA组为尾静脉注射PEG脂质体-内皮抑素与不相关siRNA形成复合物的阴性对照；PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA组尾静脉注射PEG脂质体-内皮抑素与Bcl2-asiRNA形成的复合物；PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA+CTX组为在上一组基础上使用CTX(15mg/kg)的联合组。
图12、内皮抑素与化学合成的RNA干扰分子形成组合物对荷H22肝癌小鼠肿瘤体积的抑制曲线。
其中生理盐水组为静脉注射生理盐水的空白对照；CTX(30mg/kg)组为腹腔注射化疗药物环磷酰胺的阳性对照；PEG脂质体组为尾静脉注射PEG脂质体，PEG脂质体-内皮抑素-VEGF-asiRNA组尾静脉注射PEG脂质体-内皮抑素与VEGF-asiRNA形成的复合物。
图13、注射内皮抑素-经化学修饰的Bcl2-asiRNA形成组合物的H22荷瘤小鼠的生存曲线。各组样品及注射情况同图11。
图14、注射内皮抑素与化学合成的VEGF的RNA干扰分子形成组合物的H22荷瘤小鼠的生存曲线。各组样品及注射情况同图12。
图15、内皮抑素与经化学修饰且进行荧光标记的Bcl2-asiRNA在荷人肝癌裸鼠各器官的Bcl2-asiRNA残留量。
图16、内皮抑素与经化学修饰且进行荧光标记的Bcl2-asiRNA在荷人肝癌裸鼠各器官的分布及靶向肿瘤作用，图中从左向右依次为心、肝、脾、肺、肾、肿瘤。
图17、恩度内皮抑素与经化学修饰且进行荧光标记的CCR5-asiRNA在正常裸鼠各器官的分布。
a：样品注射1小时和24小时进行活体成像定量观察各器官CCR5-asiRNA残留量柱状图；
b：样品注射1小时处死动物取出内脏进行活体成像图，从左向右依次为心、肝、脾、肺、肾；
c：样品注射24小时处死动物取出内脏进行活体成像图，从左向右依次为心、肝、脾、肺、肾。
图18.内皮抑素与化学合成的RNA干扰分子形成组合物对人体肺癌A549裸鼠移植瘤的疗效。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例1
将内皮抑素与siRNA在有脂质体存在情况下通过正负电荷结合形成复合物的过程用模式图(图1)表示，这种将siRNA、内皮抑素、脂质体分三瓶分装的优点是每一种成分的质量控制比较容易，储存比较方便，但是使用时比较麻烦。也可以将三瓶的成分按照以下实施例描述的一定的电荷比例配比预先混合在一起，组合于1瓶，这样使用方便，但是混合组分的质量控制比较难。图1所示的是肿瘤抗凋亡基因(B-cell lymphoma/le μkemia-2，Bcl2，原称B细胞淋巴瘤/白血病2基因，Bcl2)的siRNA，可以更换为该基因或其它基因的asiRNA或miRNA，图1所例举的脂质体可以是阳离子脂质体、中性脂质体、或PEG修饰长效脂质体、也可以不用脂质体，用注射用生理盐水将内皮抑素与RNA干扰分子组合物溶解混合后静脉滴注。
实施例2
本实施例使用的内皮抑素重组蛋白由江苏吴中医药集团有限公司中凯生物制药厂生产出品，以下简称内皮抑素，由184个氨基酸组成，氨基酸序列为：SEQ ID NO.1，等电点为9.3。pH5.0时，内皮抑素电荷为+12.89；pH5.5时，内皮抑素电荷为+10.84；pH6时，内皮抑素电荷为+8.65(图2)。用pH5.5、电荷值为+10.84的内皮抑素，与电荷值为-40的Bcl2-siRNA(序列为：正义链5’CGGAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’，反义链3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’)，通过正负电荷计算结合比例，将Bcl2-siRNA、内皮抑素、PEG脂质体(聚乙二醇2000-二硬酯酰磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)与二油基磷脂酰丝氨酸(DOPS)的混合物，PEG-PE与DOPS质量比为1∶1，终浓度为1mg/ml，下同)以质量比1∶10∶5的比例混合，并稀释15倍，用Zeta Sizer3000动态激光散射仪测定其Zeta电位。PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-siRNA的Zeta电位见图3。由图3可见，PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-siRNA的平均Zeta电位为2.6mV。
同样方法，用溶剂pH5.5、电荷值为+10.84的内皮抑素，与电荷值为-38的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)不对称asiRNA(序列为：正义链5’GUGAAUGCAGACCAAAGAA dTdT 3’，反义链3’dTdTUACACUUACGUCUGGUUUCUU 5’)，通过正负电荷计算结合比例。将VEGF-asiRNA、内皮抑素、PEG脂质体、壳聚糖、β-环糊精分别以1∶10∶5∶15∶5的质量比混合，用DEPC水稀释20倍至5ml，并用0.22μm的滤膜过滤，封口。其中PEG脂质体、壳聚糖、β-环糊精以5∶15∶5形成的混合物称为壳聚糖脂质体，下同。检测该内皮抑素-VEGF-asiRNA-壳聚糖脂质体组合物的zeta电位，平均Zeta电位为13.7mV，结果见图4。
实施例3
除了按照实施例2的方法在有脂质体包裹情况下进行检测zeta电位，以确定内皮抑素重组蛋白与RNA干扰分子通过正负电荷结合后的组合物的电荷值外，还可以通过电泳的方法判断有脂质体包裹或没有脂质体包裹情况下内皮抑素重组蛋白与RNA干扰分子组成的组合物的电荷情况。配制TBE溶液，Tris 10.8g，硼酸5.5g，EDTA 0.58g，加入灭菌的DEPC水定容至1000ml。称取0.6g琼脂糖，溶于60ml TBE溶液中，加热两分钟，冷却后加入少量EB，倒入制胶槽，插入梳子，制得琼脂糖凝胶。将Bcl2-siRNA 1.5μl(序列、电荷值均同实施例2，浓度为20nM)与内皮抑素(序列、电荷值均同实施例2)、PEG脂质体轻轻混匀，使其质量比为1∶10∶5，再与不同比例的壳聚糖混合，使Bcl2-siRNA、与壳聚糖之间的质量比分别为1∶0、1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。将上述样品室温静置15min后加入RNA loading buffer，上样进行琼脂糖凝胶电泳，100V，电泳30min。电泳结束后将胶置于紫外灯下显像，拍照，结果见图5。由图5可见，带负电荷的各种不同浓度的Bcl2-siRNA与内皮抑素混合后，不经脂质体包裹及经过脂质体包裹后，电泳条带有滞后现象，并呈现从负到正电荷一定的梯度，说明Bcl2-siRNA与内皮抑素及脂质体形成带正电荷的一系列组合物。
将合成的VEGF-aiRNA粉末(序列、电荷值均同实施例2)用DEPC水溶解，配成20nM的储备溶液。琼脂糖凝胶配置方法同上。将VEGF-asiRNA和内皮抑素(序列、电荷值均同实施例2)分别以质量比为1∶0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60在无RNA酶的EP管内混合，静置15min，加入琼脂糖凝胶孔中。以100V恒压，电泳30min。拍照，观察条带，结果见图6a。
VEGF-asiRNA(序列、电荷值均同实施例2)、内皮抑素(序列、电荷值均同实施例2)、PEG脂质体以1∶10∶5质量比混合，分别与壳聚糖以：1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30的质量比混合，再分别与β-环糊精以1∶2.5、1∶5的质量比，在无RNA酶的EP管内混合，静置15min。按照质量比从小到大的比例，加入琼脂糖凝胶孔中。以70V恒压，电泳30min。拍照，观察条带和分析组合物不同比例所带的电荷量，结果见图6b。
同样方法的电泳可以用于观察没有脂质体包裹情况下内皮抑素重组蛋白与RNA干扰分子组成的组合物的电荷情况。取肝炎相关的Has-122 miRNA抑制剂anti-Has-122(序列为5’ACAAACACCAUUGUCACACUCCA-3’(SEQ ID NO.2))4.5μl，PEG修饰的长效内皮抑素(1mg/ml，江苏吴中医药集团有限公司中凯生物制药厂生产出品，采用单甲氧基聚乙二醇丙醛与内皮抑素在还原剂氰基硼酸氢钠条件下反应形成的PEG内皮抑素，纯度98％以上，以下简称PEG内皮抑素)，Has-122 miRNA抑制剂anti-Has-122与PEG内皮抑素两者分别按照质量比3∶0、3∶5、3∶10、3∶15、3∶20、3∶25、3∶30、3∶40、3∶50混合，室温放置20min。将上述样品加入RNAloading buffer，上样进行琼脂糖凝胶电泳，100V，分别于10min、15min、20min、25min将胶置于紫外灯下显像，拍照。电泳图见图6c。不同配比的anti-Has-122和PEG内皮抑素形成的组合物在电泳中呈现不同电荷值，选择其中带微弱正电荷的组合物进行Zeta电位测定，测得的电位值通常在10mV内，可见通过电泳能方便的找到合适的组合物电荷值所对应的anti-Has-122和PEG内皮抑素的配比。
同样，分别取艾滋病受体相关基因CCR5的asiRNA(序列为：正义链5’GUCAAGUCCAAUCUAUGdTdT 3’，反义链3’dTdTCACAGUUCAGGUUAGAUAC 5’)，肿瘤离子通道相关的Rab11b的siRNA(序列为：正义链5’UGUCAGACAGACGCGAAAAdTdT3’，反义链3’dTdTACAGUCUGUCUGCGCUUUU 5’)，肿瘤化疗药物耐药相关的耐药基因MDR1的siRNA，(序列为：正义链5’AAAAUGUUGUCUGGACAAGCAdTdT3’，反义链3’dTdTUUUUACAACAGACCUGUUCGU 5’)各1.5μl与N端带6个组氨酸的内皮抑素(1mg/ml，商品名为恩度，由山东先声麦得津生物制药有限公司生产出品，南京先声药业有限公司经销，由193个氨基酸组成，以下简称恩度内皮抑素)分别按照质量比1∶0、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50混合，室温放置20min。将上述样品加入RNA loading buffer，上样进行琼脂糖凝胶电泳，100V，分别于10min、15min、20min、25min将胶置于紫外灯下显像，拍照。恩度内皮抑素与CCR5-asiRNA、Rab11b-siRNA、MDR1-siRNA正负电荷结合的电泳图分别见图6d、6e、6f。不同配比的siRNA、asiRNA、miRNA和恩度内皮抑素形成的组合物在电泳中呈现不同电荷值，选择其中带微弱正电荷的组合物进行Zeta电位测定，测得的电位值在10mV内，因此通过电泳能方便的找到合适的组合物电荷值所对应的siRNA、asiRNA、miRNA和恩度内皮抑素的配比。由图6a-f可见，带不同负电荷的RNA干扰分子与带不同正电荷的内皮抑素重组蛋白混合后，不管是否经脂质体包裹，电泳条带均有滞后现象，并呈现一定的梯度，说明不同RNA干扰分子与不同浓度的内皮抑素形成带不同量正电荷的一系列组合物，均改变了siRNA、asiRNA、miRNA的高负电荷特征。
实施例4
将电荷值为-38的Bcl2-asiRNA(序列为：正义链：5’GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’，反义链：3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’，浓度为20nM)与内皮抑素(1mg/ml，序列、电荷值均同实施例2)、PEG脂质体(1mg/ml)以质量比1∶10∶5轻轻混匀，室温放置15min。用0.05M醋酸-醋酸钠缓冲液将以上混合物稀释15倍。用Mastersizer2000粒度仪测定其粒径。粒径见图7a，由图7a可见，PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA的粒径分布比较均匀，平均粒径为142.4nm。Zeta电位测定为+3mV。
将VEGF-asiRNA(序列、电荷值均同实施例2)、内皮抑素(1mg/ml，序列、电荷值均同实施例2)、PEG脂质、壳聚糖(CS)、β-环糊精(β-CD)以1∶10∶5∶15∶5的质量比混合，即30μl VEGF-aiRNA与80μl内皮抑素轻轻吹打混合，室温下静置5min，加入PEG脂质40μl，混合后室温下静置10min，再加入CS 60μl、β-CD 40μl，均匀混合后，用灭菌的DEPC水稀释20倍至5ml。将上述壳聚糖脂质体-内皮抑素-VEGF-asiRNA组合物用0.22μm的滤膜过滤，封口。Mastersizer2000粒度仪检测PEG/壳聚糖脂质体-VEGF-aiRNA组合物的粒径为219.6nm。见图7b。Zeta电位测定为+14mV。
实施例5
本发明使用PEG脂质体-内皮抑素系统转染Bcl2-asiRNA片段的电荷值、序列同实施例4，Bcl2-asiRNA粉末用DEPC水溶解，配成20nM的储备溶液。转染操作前一天，用含小牛血清、青霉素、链霉素的DMEM细胞培养基将高表达Bcl2的人宫颈癌细胞HeLaB2细胞(购于中国医学科学院中国协和大学肿瘤研究所)接种至96孔板中，于37℃，含5％ CO2的培养箱进行培养，当细胞的密度达到50％时，弃去原培养基，用不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基洗一次，并加入100μl不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基。用25μl不含血清培养基的Opti-MEM稀释50pmol Bcl2-asiRNA，轻轻混匀并室温放置5分钟。用25μlOpti-MEM稀释0.5μl内皮抑素(电荷值、序列同实施例2)及0.25μl PEG脂质体，轻轻混匀并室温放置5分钟，将上述两溶液轻轻混匀得到PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA混合液，Zeta电位测定为+3mV，室温孵育20分钟后，取50μl Bcl2-asiRNA-内皮抑素-PEG脂质体混合液加入含有细胞及培养液的培养板相应孔中，轻轻混匀。将培养板置于37℃，含5％ CO2的培养箱进行培养。培养4-6小时后，将孔中含有PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA混合液的培养基移去，并更换新鲜的含小牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基100μl，作为实验组。对照组不进行转染。转染24h后，实验组、对照组各孔均加入不同浓度梯度的顺铂，使顺铂的终浓度分别为0.5、1、2、4、8μg/ml。每个浓度至少做3个平行孔。将培养板置于培养箱中继续培养48小时后，吸去培养基，按照CCK-8试剂盒(购于上海同仁化学研究所)说明书，每孔加100μl单独DMEM培养液和10μl CCK-8试剂，置于37℃培养箱中继续培养1小时，并用酶标仪进行OD450的检测。按照以下公式进行细胞活力的计算：
其中，As为实验组OD值(含细胞、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA)，Ab为空白组的OD值(不含细胞和PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA)，Ac为不经过转染的对照组的OD值(含细胞，不含PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA)，最终求出细胞活力为50％时的顺铂浓度，即为IC50。对照组顺铂的IC50为(2.19±0.08)μg/ml，实验组顺铂的IC50为(1.09±0.02)μg/ml。CCK8检测不同浓度顺铂对转染及不转染PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA的HelaB2细胞增殖影响的试验结果见图8，由图8可见HelaB2转染PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA后，顺铂的IC50明显降低，即细胞转染PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA后仅需较低浓度的顺铂即可抑制癌细胞增殖。
实施例6
将高表达Bcl2的人宫颈癌细胞HeLaB2细胞(购于中国医学科学院中国协和大学肿瘤研究所)接种至96孔板中，于37℃，含5％ CO2的培养箱进行培养，当细胞的密度达到50％，进行转染。实验分为4组，每组至少有三个平行对照孔。组1每孔加入0.25μ1LipofectAMINETM2000(Lipo 2000)脂质体(Life Techonolobies，产品货号：11668-019，商标为Inivitrogen，下同)+0.25μl Bcl2-asiRNA(浓度、电荷值、序列同实施例4，下同)；组2每孔加入0.25μl Bcl2-asiRNA+0.5μl内皮抑素(浓度、电荷值、序列均同实施例4，下同)+0.25μl PEG脂质体(浓度同实施例4，下同)，该PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA的Zeta电位测定为+3mV；组3每孔加入0.25μl Bcl2-asiRNA+0.5μl内皮抑素+0.25μl壳聚糖脂质体；组4为不进行任何处理的空白对照。培养板放入37℃，5％ CO2的培养箱中继续培养24h后，吸去培养基，按照CCK-8试剂盒说明书，每孔加100μl单独DMEM培养液和10μlCCK-8试剂，置于37℃培养箱中继续培养1小时，并用酶标仪进行OD450的检测。按实施例5中的方法进行细胞活力的计算，可得出PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物、壳聚糖脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物对细胞的毒性，实验结果见图9a，由图可见在正常的转染浓度下PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物、壳聚糖脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物对细胞均几乎没有任何毒性，且对细胞的影响小于商业化转染试剂Lipo 2000。
在上述浓度PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物对细胞几乎无毒性的基础上，进一步增加PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物的浓度观察细胞毒性。细胞接种至96孔板，分别加入以下浓度的PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物。1：不进行任何处理；2：加入0.125μl PEG脂质体+0.25μl内皮抑素+0.125μl Bcl2-asiRNA复合物；3：加入0.25μlPEG脂质体+0.5μl内皮抑素+0.25μl Bcl2-asiRNA复合物；4：加入0.5μl PEG脂质体+1μl内皮抑素+0.5μl Bcl2-asiRNA复合物；5、加入1μl PEG脂质体+2μl内皮抑素+1μlBcl2-asiRNA复合物；6：加入2μl PEG脂质体复合物+4μl内皮抑素+2μl Bcl2-asiRNA；7：加入4μl PEG脂质体+8μl内皮抑素+4μl Bcl2-asiRNA复合物；8：加入8μl PEG脂质体+16μl内皮抑素+8μl Bcl2-asiRNA复合物。培养板放入37℃，5％ CO2的培养箱中继续培养24h后，吸去培养基，按照CCK-8试剂盒说明书，每孔加100μl单独DMEM培养液和10μl CCK-8试剂，置于37℃培养箱中继续培养1小时，并用酶标仪进行OD450的检测，按实施例5中的方法进行细胞活力的计算。PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物浓度与细胞毒性的关系如图9b。由图可见，随着PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物浓度的增加，细胞存活率下降，即对细胞的毒性增加，但整体来看对细胞的毒性不大，当PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物浓度达到正常转染浓度的32倍时，细胞活力约为77％，对细胞的毒性不大。
实施例7
实验分为以下7组：1：用LipofectAMINETM2000(Lipo 2000)脂质体转染Bcl2-asiRNA组(电荷值、序列同实施例4)；2：PEG脂质体-内皮抑素复合物转染Bcl2-asiRNA组；3：Lipo 2000转染Bcl2-asiRNA+低剂量顺铂(1微克)组；4：PEG脂质体-内皮抑复合物转染Bcl2-asiRNA+低剂量顺铂(1微克)组；5：低剂量顺铂(1微克)单独组；6：增倍剂量顺铂(2微克)组；7、空白对照组。转染前一天将处于对数生长期的HelaB2细胞接种至96孔板，待到细胞密度生长至50％覆盖率时，弃去原培养基，用不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基洗一次，并加入100μl不含小牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基。组1和组3按如下方法进行转染：用25μl不含血清培养基的Opti-MEM稀释0.25μlBcl2-asiRNA(20nM)，轻轻混匀并室温放置5分钟。用25μl Opti-MEM稀释Lipo 2000脂质体，轻轻混匀并室温放置5分钟，将上述两溶液轻轻混匀，室温孵育20分钟后，把混合液加入到96孔板中，轻轻混匀。将培养板置于37℃，含5％ CO2的培养箱进行培养。培养4-6小时后，将孔中含有PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA混合液的培养基移去，并更换新鲜的含小牛血清、青霉素和链霉素的DMEM培养基100μl。组2和组4将上述转染方法中的0.25μl Lipo 2000脂质体换为0.25μl PEG脂质体+0.5μl内皮抑素复合物。其他转染方法同上。组2的PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA的Zeta电位测定为+5mV。空白对照组不进行转染。转染24h后，组3、4、5分别加入1微克顺铂，组6加入2微克顺铂。转染72h后，按实施例5中所述方法进行CCK-8检测。设定空白对照组OD值为100％，其余各组的OD值与空白对照组OD值的相对值即可反映各组细胞数的相对水平。PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA复合物与顺铂联合使用对HelaB2细胞体外抑制作用试验结果见图10。由图10可见与商业化转染脂质体Lipo 2000相比，PEG脂质体-内皮抑素复合物同样可以转染Bcl2-asiRNA进入细胞，从而对细胞生长产生抑制。且PEG脂质体-内皮抑素复合物转染Bcl2-asiRNA与低倍顺铂联合使用时能更好地抑制细胞增殖，其对细胞生长的抑制率高于单独增倍剂量的顺铂组(图10)。
注：本实施例所使用的内皮抑素同实施例2。
实施例8
本实施例所用RNA干扰分子为电荷值为-35的胆固醇修饰的Bcl2-asiRNA(正义链：5’chol-GAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT3’，反义链：3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA5’，chol表示胆固醇修饰)。不相关siRNA序列为(正义链：5’UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3’，反义链：3’dTdTAAGAGGCUUGCACAGUGCA 5’)。雄性昆明种小鼠，约8周龄，体重20±1g，购自南京江宁青龙山实验动物中心，用颗粒饲料喂养在21±2℃的环境中，使其自由取食和饮水，实行12小时的白天和黑夜循环。小鼠肝癌H22肝癌腹水细胞(中科院上海药物研究所实验动物中心)37℃复苏后每只小鼠腹腔注射0.3ml，7天后接种第二代。取第二代腹水，用生理盐水调整细胞浓度为5×106个/ml，每只小鼠前肢右侧腋下皮下注射0.2mL，约1×106个瘤细胞。小鼠自由进食，正常喂养。小鼠接种后随机分为六组：生理盐水组、化疗药物环磷酰胺CTX(15mg/kg)组、化疗药物环磷酰胺CTX(30mg/kg)组、PEG脂质体-内皮抑素-不相关siRNA组、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA组(Zeta电位测定为+3mV)、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA联合化疗药物环磷酰胺CTX(15mg/kg)组。接种后次日开始给药，Bcl2-asiRNA的给药剂量为1mg/kg，Bcl2-asiRNA与内皮抑素、PEG脂质体的质量比为1∶10∶5。生理盐水、PEG脂质体-内皮抑素-不相关siRNA组、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA组和PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-siRNA联合化疗药物环磷酰胺CTX(15mg/kg)组连续尾静脉给药7天(0.4ml/只)，CTX(15mg/kg)组及CTX(30mg/kg)组在接种后的第2、4、6、8、天经腹腔注射给药。在给药的第5、第10、第15和第20天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并通过以下的公式计算肿瘤的体积：a*b2*0.5(a为长，b为宽)。各组肿瘤体积曲线如图11。由图11可见与生理盐水组及不相关siRNA组相比，PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA能很好地抑制肿瘤生长，联合化疗药物环磷酰胺CTX后，抑瘤效果进一步增加。
同上肿瘤模型，本实施例所用正义链5’胆固醇修饰的VEGF对称和不对称的RNA干扰分子，电荷值为-38的VEGF-asiRNA(19+2/21+2，正义链5’chol-GUGAAUGCAGACCAAAGAAdTdT 3’，反义链3’dTdTUACACUUACGUCUGGUUUCUU 5’)和电荷值为-40的VEGF-siRNA(21+2/21+2，序列为：正义链5’AUGUGAAUGCAGACCAAAGAAdTdT3’，反义链为3’dTdTUACACUUACGUCUGGUUUCUU5’)。小鼠接种后随机分为5组：生理盐水组(NS)、化疗药物环磷酰胺CTX组、PEG脂质体组、PEG脂质体-内皮抑素-VEGF-asiRNA21/23(Zeta电位测定为+13mV)。、PEG脂质体-内皮抑素-VEGF-siRNA23/23组，(Zeta电位测定为+15mV。)。接种后次日开始给药，siRNA、asiRNA的给药剂量为1mg/kg，NS(0.4ml/只)、PEG脂质体组(0.3ml/只)，连续尾静脉给药14天，CTX(30mg/kg)在接种后的第2、4、6、8、10、12天经腹腔注射给药。在给药的第5、第10、第15天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并通过以下的公式计算肿瘤的体积：a*b2*0.5(a为长，b为宽)。脂质体-VEGF-asiRNA组小鼠的肿瘤体积明显小于其他组，具有良好的抑瘤效果。各组肿瘤体积曲线如图12。
注：本实施例所使用的内皮抑素同实施例2。
实施例9
雄性昆明种小鼠接种、分组、具体给药方式及剂量均同实施例8中的Bcl2部分，所用PEG脂质体、Bcl2-asiRNA、内皮抑素以及PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA的电荷值也均与实施例8中相同。整个治疗过程中小鼠自由进食饮水，并观察记录小鼠的生活状态和生存情况，从接种肿瘤细胞次日开始计算天数，到第60天为止，60天以上生存时间也按照60天计算。各组的中位生存时间如下：生理盐水组：29天；化疗药物环磷酰胺CTX(15mg/kg)组：39天；化疗药物环磷酰胺CTX(30mg/kg)组：17天；脂质体-内皮抑素-不相关siRNA组：34天；脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA组：41天；脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA联合化疗药物环磷酰胺CTX(15mg/kg)组：58天。各组小鼠的生存曲线如图13。由各组中位生存时间及生存曲线可见脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA能明显延长荷瘤小鼠的生存期，且与低剂量化疗药物联合时比化疗药单独使用时的生存期有所延长。
雄性昆明种小鼠接种、分组、具体给药方式及剂量均实施例8中的VEGF部分，所用PEG脂质体、各RNA干扰分子、内皮抑素以及PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-VEGF-asiRNA21/23、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-VEGF-siRNA23/23的电荷值也均与实施例8中相同。整个治疗过程中小鼠自由进食饮水，并观察记录小鼠的生活状态和生存情况，从接种肿瘤细胞次日开始计算天数，到第60天为止，60天以上生存时间也按照60天计算。各组的中位生存时间如下：生理盐水组：35天；CTX(30mg/kg)组：18天；PEG脂质体组：20天；PEG脂质体-内皮抑素-VEGF-asiRNA21/23组：38天；PEG脂质体-内皮抑素-VEGF-siRNA23/23组：32天。各组小鼠的生存曲线如图14。由各组中位生存时间及生存曲线可见PEG脂质体-VEGF-asiRNA21/23能明显延长荷瘤小鼠的生存期。
实施例10
经化学修饰及Cy5荧光标记的Bcl2-asiRNA(电荷值为-35，序列为：正义链：5’Chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(FU)(FU)(FU)dT-s-dT-Cy53’，Chol为胆固醇修饰，m为甲基化修饰，F为氟代修饰，s为硫代修饰，反义链：3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’)，通过内皮抑素-PEG脂质体递送系统将其尾静脉注射入BALB/c荷瘤裸鼠体内，并观察其在裸鼠体内的分布情况，样品给药前现配，取PEG脂质体-内皮抑素复合物2ml(其中内皮抑素与PEG脂质体的质量比为2∶1)与荧光标记的BCL2-asiRNA-Cy520nmol混合摇匀，室温孵化20min(该PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA-Cy5的Zeta电位测定为+7mV)。BALB/C裸鼠(SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司)，雄性，体重18-20g，移植性肿瘤为SMMC-7721肝癌。将浓度为5×106个(0.2mL/只)的人肝癌细胞SMMC-7721细胞(购于上海中国科学院细胞库)注入BLBA/c裸鼠的颈背部皮下。待肿瘤长到40-50mm3时开始动物实验。取配制好的受试药物，尾静脉注射(0.3ml/只)荷瘤裸鼠，在不同时间点进行活体成像观察，在24h处死动物取内脏进行荧光定量；将剩余的0.2mlPEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA-Cy5混合物稀释成六个浓度用活体成像进行定量，做浓度与荧光强度的标准曲线，最后根据活体成像仪指示的数据根据标准曲线计算主要脏器心、肝、脾、肺、肾的Bcl2-asiRNA残留量，结果见图15～16。所用仪器为in-vivoimaging system(Maestro，Cambridge Research & Instrument)和荧光分光光度计(LS55，美国Perkin Elmer)，实验结果见图16，结果显示在不同时间点Bcl-2-asiRNA-Cy5在BLBA/c荷瘤裸鼠的各主要脏器中均有分布，通过24h的荧光定量看到Bcl-2-asiRNA-Cy5大量聚集在肿瘤组织中，有明显的肿瘤靶向作用。注：本实验中使用的内皮抑素同实施例2。
本实施例又采用化学修饰及Cy5荧光标记的CCR5-asiRNA(序列为：正义链：5’Chol-(mG)(mU)(mC)AAGUCCAAUCU(FA)(FU)(FG)dT-s-dT-Cy53’，Chol为胆固醇修饰，m为甲基化修饰，F为氟代修饰，s为硫代修饰，，反义链：3’dTdTCACAGUUCAGGUUAGAUAC 5’)，通过PEG脂质体-恩度内皮抑素将其递送系统尾静脉注射入BALB/c裸鼠体内，并观察其在裸鼠体内的分布情况。样品给药前现配，取PEG脂质体-恩度内皮抑素复合物2ml(其中恩度内皮抑素与PEG脂质体的质量比为2∶1，制备方法同PEG脂质体-内皮抑素复合物)与荧光标记化学修饰的CCR5-asiRNA-Cy5 20nmol混合摇匀，室温孵化20min，Zeta电位测定为+10mV。BALB/C裸鼠(SPF级，上海斯莱克实验动物有限责任公司)，雄性，体重18-20g，取配制好的受试药物，正常裸鼠尾静脉注射(0.3ml/20g)，在1、3、5、24h时进行活体成像观察，在1h及24h(各3只)后处死取内脏进行活体成像观察，将剩余的0.2ml PEG脂质体-恩度内皮抑素-CCR5-asiRNA-Cy5混合物稀释成六个浓度用活体成像进行定量，做浓度与荧光强度的标准曲线，最后根据活体成像仪指示的数据定量计算主要脏器心、肝、脾、肺、肾的CCR5-asiRNA-Cy5残留剂量。所用仪器同上，实验结果见图17，结果显示在不同时间点CCR5-asiRNA-Cy5在BLBA/c裸鼠的各主要脏器中均有分布，通过24h的荧光定量看到CCR5-asiRNA-Cy5大量聚集在肾组织中，说明本品主要为肾排泄。
实施例11
本实施例使用的RNA干扰分子为电荷值为-35的经化学修饰的Bcl2-asiRNA，序列为：正义链：5’chol-(mG)(mA)(mG)GCUGGGAUGCC(mU)(mU)(mU)dT-s-dT 3’，Chol为胆固醇修饰，m为甲基化修饰，s为硫代修饰，反义链：3’dTdT GCCUCCGACCCUACGGAAA 5’，使用的内皮抑素-PEG脂质体同实施例2。试验选用ICR小鼠40只，根据动物体重按区组随机化分组法分为两组，每组20只，雌雄各半。本次急性毒性研究选择Bcl2-asiRNA的剂量为100mg/kg作为急性毒性研究的给药剂量(相当于小鼠药效学有效剂量10mg/kg的100倍)，内皮抑素-PEG脂质体剂量为50mg/kg(相当于内皮抑素小鼠药效学有效剂量5mg/kg的10倍)进行联合使用；同时设阴性对照组给予0.1％的灭菌DEPC水，给药体积均按0.4ml/20g体重。试验结果如下：与阴性对照组相比，供试品给药组动物临床症状观察未发现明显异常情况，体重增加亦未出现明显的异常情况。观察期结束后，所有存活实验小鼠解剖后大体肉眼观察结果显示与阴性对照组相比，供试品给药组小鼠各主要脏器组织均未见明显异常病理变化。因此，ICR小鼠一次性静脉推注给予供试品Bcl2-asiRNA的最小致死剂量(LD50)大于100mg/kg。
实施例12
本实施例所用Bcl2-asiRNA、内皮抑素同实施例11，BALB/C裸鼠(SPF级)，雄性，18-20g购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。取生长良好的A549人源肺癌实体瘤(上海医药工业研究院提供)，无菌条件下切割成约3mm大小的均匀小块，用套管针每只小鼠右腋皮下接种一块，随机分为5组，分别为：生理盐水组(空白对照)、化疗药物环磷酰胺CTX(30mg/kg)组(阳性对照)、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA高剂量组、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA中剂量组、PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA低剂量组。各组配比相同，只是所注射的量分别为0.4、0.2、0.1ml，因此三组的Zeta电位测定均为+3mV。接种后13日根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始给药。高剂量组的给药剂量为Bcl2-asiRNA 2mg/kg、内皮抑素15mg/kg、PEG脂质体5mg/kg，给药体积为0.4ml，中剂量组的给药剂量是高剂量组的1/2，低剂量组的剂量是高剂量组的1/4。生理盐水组及PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA高、中、低剂量组均连续尾静脉注射14天，CTX(30mg/kg)组连续腹腔注射7天。接种后29天处死动物，解剖取瘤块，拍照。与生理盐水组相比，PEG脂质体-内皮抑素-Bcl2-asiRNA各组均有一定的抑瘤效果，且抑瘤效果随剂量增大而升高，高剂量组的抑瘤效果最为明显，各组解剖后的瘤块如图18。
本发明实施例4～12中所涉及的所有脂质体-内皮抑素重组蛋白-RNA干扰分子的电荷值均采用Zeta Sizer 3000动态激光散射仪测定其Zeta电位法测得。
本发明各实施例中所使用的恩度内皮抑素的生产方法详见中国专利申请200510040941.9中具体实施方式部分1PEG-ES的制备部分。本发明各实施例中所使用的内皮抑素的生产方法详见中国专利申请97107112.8实施例。本发明各实施例中所使用的PEG内皮抑素的生产方法详见中国专利申请200510040941.9中具体实施方式部分的制备部分。
Claims (10)
1.一种药用组合物，其特征在于所述的组合物包含携带+5至+15电荷的内皮抑素重组蛋白和携带-15至-55电荷的化学合成的RNA干扰分子，二者通过正负电荷结合形成电荷值在-20到+20之间的组合物，优选形成电荷值在-10到+10之间的组合物。
2.根据权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述的药用组合物还包含用于包裹所述的内皮抑素重组蛋白与RNA干扰分子以调节正负电荷量的阳离子脂质体、中性脂质体、或PEG修饰长效脂质体。
3.根据权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述的内皮抑素重组蛋白选自不携带6组氨酸标签的由183-184个氨基酸组成的人源结构的内皮抑素重组蛋白，N端或/和C端携带6组氨酸标签的由190-200个氨基酸组成的人源结构改构的内皮抑素融合蛋白，或上述两类内皮抑素重组蛋白通过PEG修饰或白蛋白修饰后形成的长效内皮抑素；或人工合成的截短型内皮抑素。
4.根据权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述的RNA干扰分子选自化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰分子，化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰分子，或者化学修饰或不修饰的miRNA。
5.根据权利要求4所述的药用组合物，其特征在于所述的两条链对称的小核酸干扰分子为正义链与反义链长度一致的能抑制目的基因表达的长度为19-25nt的双链配对RNA，其每条链3’端含有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂。
6.根据权利要求4所述的药用组合物，其特征在于所述的两条链配对不对称的小核酸干扰分子是从靶基因对称性小核酸干扰分子siRNA出发，通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁减1-5nt碱基，形成两条链碱基长度不一致，每条链3’端有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子asiRNA。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的药用组合物，其特征在于所述的化学修饰指硫代修饰、甲基化修饰、磷酸化修饰、胆固醇修饰和氟代修饰。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的药用组合物，其特征在于所述的药用组合物中各组分分开封装临用时混合，或直接混合后封装在一起。
9.权利要求1～4中任一项所述的药用组合物在制备治疗恶性肿瘤、肝炎或艾滋病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的药用组合物中各组分分开封装临用时混合，或直接混合后封装在一起，用于皮下注射、局部注射、静脉注射或静脉滴注。
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