CN110800732A - 一种脐带间充质干细胞贮藏液 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞贮藏液 Download PDF

Info

Publication number
CN110800732A
CN110800732A CN201910956516.6A CN201910956516A CN110800732A CN 110800732 A CN110800732 A CN 110800732A CN 201910956516 A CN201910956516 A CN 201910956516A CN 110800732 A CN110800732 A CN 110800732A
Authority
CN
China
Prior art keywords
umbilical cord
cells
cell
mesenchymal stem
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910956516.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110800732B (zh
Inventor
王健
郑春兵
王成
张浪
廖雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Source Cell Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Hunan Source Cell Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Source Cell Biotechnology Co Ltd filed Critical Hunan Source Cell Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910956516.6A priority Critical patent/CN110800732B/zh
Publication of CN110800732A publication Critical patent/CN110800732A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110800732B publication Critical patent/CN110800732B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明提供了一种脐带间充质干细胞贮藏液及其制备方法，属于干细胞保存技术领域，本发明中细胞贮藏液包括胎牛血清85‑93％(v/v)、二甲基亚砜5‑12％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.4‑0.8％(v/v)、低分子肝素钠注射液1‑1.2％(v/v)、花青素0.2‑0.4％(w/v)和表儿茶素0.4‑0.6％(w/v)，通过脐带间充质干细胞的分离、培养以及传代培养，进而将脐带间充质干细胞放于贮藏液中贮藏，能够保持干细胞的活性与存活率，与此同时，可以提高贮藏稳定性、延长贮藏时间并降低风险。

Description

一种脐带间充质干细胞贮藏液
技术领域
本发明涉及干细胞保存技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞贮藏液。
背景技术
脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。通常，脐带间充质干细胞在体外培养会不断分裂、生长，进而衰老，导致功能丧失、失去多项分化潜能，因此，制备出的干细胞通常不能即时应用时，需进行贮藏，而贮藏干细胞的贮藏液对于细胞的活性以及存活率有着极大的影响，这将进一步影响临床治疗的安全性和有效性。
目前，脐带间充质干细胞贮藏液多使用生理盐水，但生理盐水偏酸性，同时，此类保存液保存细胞时细胞的活性以及存活率均较差，只适用于细胞的短时间贮藏，而不适合其长时间贮藏。此外，二甲基亚砜和胎牛血清也是极为常用的细胞贮藏液，其中，二甲基亚砜能够防止细胞冻伤，但对细胞存在一定的毒性，使干细胞造成损伤，进而影响贮藏效果，因此常加入胎牛血清作为保护剂以降低二甲基亚砜对细胞的毒害并提高细胞存活率，但动物血清常常存在病菌感染的风险，导致不良反应的发生，此外，胎牛血清由于批次不同也存在着不稳定的问题。
中国专利CN201510518785.6公开了一种脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用，该发明中的保存液包括氯化钠及生理盐水以及添加在生理盐水中的胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸和L-谷氨酰胺，该保存液能够提供活性营养物质和能量物质，维持较低代谢水平，同时，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，对细胞起到保护作用，但该保存液在较低温度条件下使用时，虽有营养及能量物质提供但细胞冻伤进而活性受损时，并不能维持一定的代谢水平，进而导致细胞存活率较低。
李志刚等人的论文不同保存液及放置时间对脐带源间充质干细胞存活率的影响[J].中国组织工程研究,2015,19(23),3664-3668.公开了多种保存液对脐带源间充质干细胞存活率的影响，结果表明，24h内，保存液的类型对干细胞影响无明显区分，24h后生理盐水与白蛋白作为干细胞保存液，细胞数量和活性将随着时间的延长而下降；在生理盐水中加入白蛋白与表皮生长因子与未加入生长因子相比，干细胞状态并无明显变化；含有无酚红培养基和白蛋白的保存液以及含有肝素钙、白蛋白及无酚红培养基的培养液，保存效果优于其他各组。但该论文仅对不同保存液进行了对比，考察保存液及放置时间对于脐带源间充质干细胞存活率的影响，并未进一步针对现有技术存在的问题对保存液进行改进优化。
针对脐带间充质干细胞贮藏液存在的细胞存活率低、细胞活性低、不良反应风险较高以及稳定性差等问题，应当找寻一种脐带间充质干细胞贮藏液，使得该贮藏液所保存的脐带间充质干细胞在复苏后细胞存活率高、活性高的同时降低不良反应的发生、提高稳定性并延长保存时间。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种脐带间充质干细胞贮藏液，该贮藏液能够保持细胞的活性与存活率，与此同时，可以提高贮藏稳定性、延长贮藏时间并降低风险。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞贮藏液，所述脐带血造血干细胞贮藏液，包括：胎牛血清85-93％(v/v)、二甲基亚砜5-12％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.4-0.8％(v/v)、低分子肝素钠注射液1-1.2％(v/v)、花青素0.2-0.4％(w/v)和表儿茶素0.4-0.6％(w/v)。
优选地，所述脐带间充质干细胞贮藏液，包括：所述脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清87.2-89.55％(v/v)、二甲基亚砜8-10％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.6-0.7％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.05-1.15％(v/v)、花青素0.3-0.35％(w/v)和表儿茶素0.5-0.6％(w/v)。
进一步优选地，所述脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清88.4％(v/v)、二甲基亚砜9％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.6％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.1％(v/v)、花青素0.35％(w/v)和表儿茶素0.55％(w/v)。
优选地，所述低分子肝素钙注射液与所述低分子肝素钠注射液的重量比为1:1.6-2。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞贮藏液的制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用乙醇浸泡，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清，剪成小段并使用生理盐水洗涤3次以上，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至完全培养基培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：向步骤(1)中的原代细胞培养液中加入生理盐水，洗涤组织贴壁面，加入胰蛋白酶，均匀浸润细胞贴壁面，孵育，待细胞变圆后加入终止液，吸出细胞悬液后加入生理盐水，离心，弃去上清液，使用生理盐水将沉淀洗涤，使用完全培养基重悬计数，培养，得到传代细胞；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；向步骤(2)中的传代细胞加入胰蛋白酶，当细胞明显回缩后，加入终止液，再加入生理盐水并轻柔吹打，离心后，弃去上清液，使用生理盐水将沉淀重悬并过滤，使用完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上。
进一步地，在一些具体的实施方案中，所述制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上。
其中，所述完全培养基包括：所述完全培养基包括：达优MSCMB培养基79.5-90.4％(v/v)、Helios血清替代物8-15％(v/v)、氢化可的松1-3％(w/v)、甲硫氨酸0.1-0.5％(w/v)和精氨酸0.5-2％(w/v)；所述终止液包括：α-MEM培养基89.9-95.2％(v/v)、胎牛血清3-7％(v/v)、核黄素0.8-1.5％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1-1.6％(w/v)。
进一步优选地，所述完全培养基包括：达优MSCMB培养基83.6-89.5％(v/v)、Helios血清替代物8-12％(v/v)、氢化可的松1.5-2.5％(w/v)、甲硫氨酸0.2-0.4％(w/v)和精氨酸0.8-1.5％(w/v)；所述终止液包括：α-MEM培养基90.1-94.9％(v/v)、胎牛血清3-7％(v/v)、核黄素1-1.4％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.1-1.5％(w/v)。
更进一步优选地，所述完全培养基包括：达优MSCMB培养基86.5％(v/v)、Helios血清替代物10％(v/v)、氢化可的松2％(w/v)、甲硫氨酸0.3％(w/v)和精氨酸1.2％(w/v)；所述终止液包括：α-MEM培养基93.5％(v/v)、胎牛血清4％(v/v)、核黄素1.2％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.3％(w/v)。
优选地，步骤(1)中所述完全培养基中的甲硫氨酸与精氨酸重量比为1:3-4。
进一步地，所述细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。
进一步地，所述终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
进一步地，步骤(3)中所述最终细胞总数不少于2.5×107个，若细胞总数较少应继续进行传代。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明中低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素的加入，降低了风险，同时能够增强贮藏液的稳定性，进而延长保存时间；
2.本发明中的细胞贮藏液能够保证细胞较强的活性，同时提高细胞存活率。
具体实施方式
脐带组织由中南大学附属湘雅三医院提供，其余原料及仪器均为普通市售材料和仪器，因此，对其来源不做具体限定。
实施例1
一种脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清85％(v/v)、二甲基亚砜12％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.8％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.2％(v/v)、花青素0.4％(w/v)和表儿茶素0.6％(w/v)。
其中，脐带间充质干细胞贮藏液制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上，最终细胞总数不少于2.5×107个。
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基79.5％(v/v)、Helios血清替代物15％(v/v)、氢化可的松3％(w/v)、甲硫氨酸0.5％(w/v)和精氨酸2％(w/v)；终止液包括：α-MEM培养基95.2％(v/v)、胎牛血清3％(v/v)、核黄素0.8％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1％(w/v)。
细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
实施例2
一种脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清93％(v/v)、二甲基亚砜5％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.4％(v/v)、低分子肝素钠注射液1％(v/v)、花青素0.2％(w/v)和表儿茶素0.4％(w/v)。
其中，脐带间充质干细胞贮藏液制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上，最终细胞总数不少于2.5×107个。
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基90.4％(v/v)、Helios血清替代物8％(v/v)、氢化可的松1％(w/v)、甲硫氨酸0.1％(w/v)和精氨酸0.5％(w/v)；终止液包括：α-MEM培养基89.9％(v/v)、胎牛血清7％(v/v)、核黄素1.5％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.6％(w/v)。
细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
实施例3
一种脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清88.4％(v/v)、二甲基亚砜9％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.6％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.1％(v/v)、花青素0.35％(w/v)和表儿茶素0.55％(w/v)。
其中，脐带间充质干细胞贮藏液制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上，最终细胞总数不少于2.5×107个。
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基86.5％(v/v)、Helios血清替代物10％(v/v)、氢化可的松2％(w/v)、甲硫氨酸0.3％(w/v)和精氨酸1.2％(w/v)；终止液包括：α-MEM培养基93.5％(v/v)、胎牛血清4％(v/v)、核黄素1.2％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.3％(w/v)。
细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
实施例4
一种脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清87.2％(v/v)、二甲基亚砜10％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.7％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.15％(v/v)、花青素0.35％(w/v)和表儿茶素0.6％(w/v)。
其中，脐带间充质干细胞贮藏液制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上，最终细胞总数不少于2.5×107个。
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基83.6％(v/v)、Helios血清替代物12％(v/v)、氢化可的松2.5％(w/v)、甲硫氨酸0.4％(w/v)和精氨酸1.5％(w/v)；终止液包括：α-MEM培养基94.9％(v/v)、胎牛血清3％(v/v)、核黄素1％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.1％(w/v)。
细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
实施例5
一种脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清89.55％(v/v)、二甲基亚砜8％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.6％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.05％(v/v)、花青素0.3％(w/v)和表儿茶素0.5％(w/v)。
其中，脐带间充质干细胞贮藏液制备方法，包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用质量分数为75％的乙醇浸泡1min，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清；将干细胞剪成2cm小段并使用生理盐水洗涤3次以上，转移人脐带组织至一新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没MSC组织1/2处，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至已加入25mL完全培养基的培养瓶中培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；其中，撕取的华通胶应不少于8mL。
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：用去头移液管吸弃步骤(1)原代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次，每瓶加入质量分数为0.25％的胰蛋白酶3mL，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min。待细胞变圆后每瓶加终止液10mL，快速震荡，用10mL移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50mL离心管中，各培养瓶每瓶加10mL生理盐水，吹洗一次，汇入50mL离心管中；在转速为1200rpm条件下，离心6min，弃去上清液，合并沉淀至1管，加40mL生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10mL完全培养基重悬计数；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；用移液管吸弃向步骤(2)中的传代细胞的旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10mL生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；每瓶加入3mL质量分数为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10mL瓶，终止消化，收集所有液体到50mL离心管中，再每瓶加10mL生理盐水，轻柔吹打后汇入50mL离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，沉淀用10mL生理盐水重悬，经100μm细胞筛过滤，使用6mL完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整细胞浓度至5×106/mL以上，最终细胞总数不少于2.5×107个。
其中，完全培养基包括：达优MSCMB培养基89.5％(v/v)、Helios血清替代物8％(v/v)、氢化可的松1.5％(w/v)、甲硫氨酸0.2％(w/v)和精氨酸0.8％(w/v)；终止液包括：α-MEM培养基90.1％(v/v)、胎牛血清7％(v/v)、核黄素1.4％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.5％(w/v)。
细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
对比例1
与实施例3的区别仅在于，脐带血造血干细胞贮藏液，包括：胎牛血清94.5％(v/v)、二甲基亚砜4％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.3％(v/v)、低分子肝素钠注射液0.7％(v/v)、花青素0.1％(w/v)和表儿茶素0.4％(w/v)。
对比例2
与实施例3的区别仅在于，脐带血造血干细胞贮藏液，包括：胎牛血清82％(v/v)、二甲基亚砜14％(v/v)、低分子肝素钙注射液1％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.5％(v/v)、花青素0.5％(w/v)和表儿茶素1％(w/v)。
对比例3
与实施例3的区别仅在于，完全培养基包括：达优MSCMB培养基92.7％(v/v)、Helios血清替代物6％(v/v)、氢化可的松0.8％(w/v)、甲硫氨酸0.08％(w/v)和精氨酸0.42％(w/v)。
对比例4
与实施例3的区别仅在于，终止液包括：α-MEM培养基87％(v/v)、胎牛血清9％(v/v)、核黄素2％(w/v)和3-吗啉丙磺酸2％(w/v)。
对比例5
与实施例3的区别仅在于，脐带血造血干细胞贮藏液中低分子肝素钙注射液与低分子肝素钠注射液的重量比为1:3(低分子肝素钙注射液与低分子肝素钠注射液的总重量与实施例3相同)。
对比例6
与实施例3的区别仅在于，完全培养基中的甲硫氨酸与精氨酸重量比为1:5(甲硫氨酸与精氨酸的总重量与实施例3相同)。
一、贮藏液对脐带间充质干细胞活性影响试验
将实施例1-5和对比例1-6的脐带间充质干细胞分别在贮藏液中贮藏48h后，重新接种并培养24h后观察细胞贴壁生长状态，根据细胞生长和繁殖能力判断其活性，每个实例进行三次平行实验，计算平均结果，其中，细胞贴壁率(％)＝已贴壁细胞总数/接种细胞数，得到表1。
表1
由表1可知，各个实施例中，细胞贴壁率在75.8-80.3％范围内，细胞呈梭形生长，其中，实施例3的细胞贴壁率最高，为80.3％。对比例1-6的贴壁率均低于实施例3，其中，对比例1-2中细胞贴壁率明显低于实施例3，其次为对比例6，最后为对比例3-4和对比例5，由此可知，脐带血造血干细胞贮藏液的组分配比、完全培养基的组分配比以及终止液的组分配比均能够影响细胞的贴壁率，其中，贮藏液对细胞的贴壁率影响最大。
二、贮藏液对脐带间充质干细胞存活率影响试验
将实施例1-5和对比例1-6的脐带间充质干细胞置于4℃冷藏箱保存，分别在0h、6h、12h、24h、36h和48h取样，通过台盼蓝染色法对干细胞存活率进行计数，得到表2。
其中，台盼蓝染色法即：经不同时间保存后的脐带间充质干细胞离心(1000rpm，5min)弃去上清；用PBS重悬细胞沉淀，充分混匀，取18μL细胞悬液与2μL的0.4％台盼蓝染液充分混匀；取适量悬液滴加到血球计数板计数腔内，加盖玻片，显微镜下观察；分别计数活细胞与死细胞，计数过程在3min内完成，未着色的细胞为活细胞，染成蓝色的细胞为死细胞。细胞存活率(％)＝活细胞数/总细胞数*100％。
表2
Figure BDA0002227481350000141
由表2可知，各实例中细胞存活率随着时间的延长逐渐降低，其中，实施例1-5细胞存活率下降速率较低，实施例3中细胞存活率的下降速率最低，对比例1-2以及对比例5对细胞的存活率影响较大，在18h时，对比例1-2的细胞存活率急速下降，同理对比例5，对比例3-4以及对比例6的细胞存活率随着时增大也有所下降，但下降的较不明显。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种脐带间充质干细胞贮藏液，其特征在于，所述脐带血造血干细胞贮藏液，包括：胎牛血清85-93％(v/v)、二甲基亚砜5-12％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.4-0.8％(v/v)、低分子肝素钠注射液1-1.2％(v/v)、花青素0.2-0.4％(w/v)和表儿茶素0.4-0.6％(w/v)。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞贮藏液，其特征在于：所述脐带间充质干细胞贮藏液，包括：胎牛血清87.2-89.55％(v/v)、二甲基亚砜8-10％(v/v)、低分子肝素钙注射液0.6-0.7％(v/v)、低分子肝素钠注射液1.05-1.15％(v/v)、花青素0.3-0.35％(w/v)和表儿茶素0.5-0.6％(w/v)。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞贮藏液，其特征在于：所述低分子肝素钙注射液与所述低分子肝素钠注射液的重量比为1:1.6-2。
4.如权利要求1-3任一项所述的脐带间充质干细胞贮藏液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)脐带间充质干细胞的分离、培养：将人脐带组织使用乙醇浸泡，再用生理盐水洗涤3次以上，将人脐带组织两端各减去1cm丢弃，剩余部分使用盐水洗涤3次以上至洗涤液澄清，剪成小段并使用生理盐水洗涤3次以上，沿人脐带组织静脉腔剪口并向静脉血管边缘纵向撕开，剖离1根静脉血管和2根动脉血管，同时去除羊膜，撕取华通氏胶并将其置于生理盐水中洗涤3次以上，剪碎后转移至完全培养基培养，待细胞生长至80-90％融合状态时，用胰蛋白酶消化传代细胞，得到原代细胞；
(2)脐带间充质干细胞的传代培养：向步骤(1)中的原代细胞培养液中加入生理盐水，洗涤组织贴壁面，加入胰蛋白酶，均匀浸润细胞贴壁面，孵育，待细胞变圆后加入终止液，吸出细胞悬液后加入生理盐水，离心，弃去上清液，使用生理盐水将沉淀洗涤，使用完全培养基重悬计数，培养，得到传代细胞；
(3)脐带间充质干细胞贮藏液的制备：将配方用量二甲基亚砜与胎牛血清的混合液滴加至胎牛血清中，再加入配方用量低分子肝素钙注射液、低分子肝素钠注射液、花青素和表儿茶素混匀，得到细胞贮藏液；向步骤(2)中的传代细胞加入胰蛋白酶，当细胞明显回缩后，加入终止液，再加入生理盐水并轻柔吹打，离心后，弃去上清液，使用生理盐水将沉淀重悬并过滤，使用完全培养基冲洗筛网，并使用生理盐水使细胞沉淀悬浮，将二者混匀后加入生理盐水并离心，将离心得到的沉淀用适量的细胞贮藏液悬浮细胞，调整最终细胞浓度至5×106/mL以上；
所述完全培养基包括：达优MSCMB培养基79.5-90.4％(v/v)、Helios血清替代物8-15％(v/v)、氢化可的松1-3％(w/v)、甲硫氨酸0.1-0.5％(w/v)和精氨酸0.5-2％(w/v)；
所述终止液包括：α-MEM培养基89.9-95.2％(v/v)、胎牛血清3-7％(v/v)、核黄素0.8-1.5％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1-1.6％(w/v)。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述完全培养基中的甲硫氨酸与精氨酸重量比为1:3-4。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述细胞完全培养基的配制：将Helios血清替代物、氢化可的松、甲硫氨酸和精氨酸添加至达优MSCMB培养基，混匀后即得。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述完全培养基包括：达优MSCMB培养基83.6-89.5％(v/v)、Helios血清替代物8-12％(v/v)、氢化可的松1.5-2.5％(w/v)、甲硫氨酸0.2-0.4％(w/v)和精氨酸0.8-1.5％(w/v)。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述终止液包括：α-MEM培养基90.1-94.9％(v/v)、胎牛血清3-7％(v/v)、核黄素1-1.4％(w/v)和3-吗啉丙磺酸1.1-1.5％(w/v)。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述终止液的制备包括：将α-MEM培养基、胎牛血清、核黄素和3-吗啉丙磺酸混匀后过滤，即得。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述最终细胞总数不少于2.5×107个。
CN201910956516.6A 2019-10-10 2019-10-10 一种脐带间充质干细胞贮藏液 Active CN110800732B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910956516.6A CN110800732B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 一种脐带间充质干细胞贮藏液

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910956516.6A CN110800732B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 一种脐带间充质干细胞贮藏液

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110800732A true CN110800732A (zh) 2020-02-18
CN110800732B CN110800732B (zh) 2021-02-02

Family

ID=69488105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910956516.6A Active CN110800732B (zh) 2019-10-10 2019-10-10 一种脐带间充质干细胞贮藏液

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110800732B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111544453A (zh) * 2020-04-27 2020-08-18 高连如 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法
CN111557951A (zh) * 2020-05-23 2020-08-21 湖南源品细胞生物科技有限公司 一种间充质干细胞治疗病毒性感染患者的新方法
CN112522190A (zh) * 2020-12-08 2021-03-19 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种脐带组织高成活率的储运方法
CN112881113A (zh) * 2021-01-12 2021-06-01 武汉呵尔医疗科技发展有限公司 一种稳定的粘液处理剂
CN113812401A (zh) * 2021-11-17 2021-12-21 胡平原 一种脐带间充质干细胞的运输保存液及保存方法
CN113943701A (zh) * 2021-11-04 2022-01-18 广东食品药品职业学院 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN116465700A (zh) * 2023-04-21 2023-07-21 上海腾瑞制药股份有限公司 一种药物凝胶剂中活性蛋白及多肽生物学活性的检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008071074A1 (fr) * 2006-12-13 2008-06-19 Songling Wang Utilisation de cellules souches mésenchymateuses, et procédé pour isoler des cellules couches dans des tissus humains et les conserver
US20090074731A1 (en) * 2007-09-13 2009-03-19 Librach Clifford L Method of isolation and use of cells derived from first trimester umbilical cord tissue
WO2009047568A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Antoxis Limited In vitro preservation of living animal cells and compounds suitable for use in the preservation of living animal cells
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008071074A1 (fr) * 2006-12-13 2008-06-19 Songling Wang Utilisation de cellules souches mésenchymateuses, et procédé pour isoler des cellules couches dans des tissus humains et les conserver
US20090074731A1 (en) * 2007-09-13 2009-03-19 Librach Clifford L Method of isolation and use of cells derived from first trimester umbilical cord tissue
WO2009047568A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Antoxis Limited In vitro preservation of living animal cells and compounds suitable for use in the preservation of living animal cells
CN103060264A (zh) * 2012-12-20 2013-04-24 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
屈玟等: "人脐带间充质干细胞不同培养方案的比较与优化", 《海南医学院学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111544453A (zh) * 2020-04-27 2020-08-18 高连如 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法
CN111544453B (zh) * 2020-04-27 2021-01-22 高连如 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法
CN111557951A (zh) * 2020-05-23 2020-08-21 湖南源品细胞生物科技有限公司 一种间充质干细胞治疗病毒性感染患者的新方法
CN112522190A (zh) * 2020-12-08 2021-03-19 山东省齐鲁干细胞工程有限公司 一种脐带组织高成活率的储运方法
CN112881113A (zh) * 2021-01-12 2021-06-01 武汉呵尔医疗科技发展有限公司 一种稳定的粘液处理剂
CN113943701A (zh) * 2021-11-04 2022-01-18 广东食品药品职业学院 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN113812401A (zh) * 2021-11-17 2021-12-21 胡平原 一种脐带间充质干细胞的运输保存液及保存方法
CN116465700A (zh) * 2023-04-21 2023-07-21 上海腾瑞制药股份有限公司 一种药物凝胶剂中活性蛋白及多肽生物学活性的检测方法
CN116465700B (zh) * 2023-04-21 2023-11-28 上海腾瑞制药股份有限公司 一种药物凝胶剂中活性蛋白及多肽生物学活性的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110800732B (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110800732B (zh) 一种脐带间充质干细胞贮藏液
CN112322580B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基的应用
CN110923196B (zh) 无血清培养基及其制备方法和间充质干细胞的培养方法
US20120276632A1 (en) Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics
EP2865749A1 (en) High-concentration stem cell production method
CN108184818B (zh) 一种人胎盘间充质干细胞悬液保护剂
CN111494420A (zh) 人脐带间充质干细胞注射液、制备方法及其应用
CN112021304A (zh) 一种脐带间充质干细胞的冻存方法及复苏方法
CN111602652A (zh) 一种脐带间充质干细胞冻存保护液
CN114591902B (zh) 间充质干细胞的培养方法及应用
CN112111448A (zh) 改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用
CN111808804A (zh) 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备方法
CN111840646B (zh) 一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用
CN113249314B (zh) 促进间充质干细胞增殖与分化的培养方法及无血清培养基
CN113287603A (zh) 一种生物样本保存液及其制备方法与应用
CN113201489A (zh) 一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法
CN110839614B (zh) 一种自体脐带间充质干细胞冻存液及其制备和冻存方法
CN111961640A (zh) 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系
EP2730648B1 (en) Culture medium for human mesenchymal stem cells
US20150329826A1 (en) Materials and methods for cell culture
CN112094844B (zh) miRNA激动剂及应用、人源间充质干细胞培养基及培养方法
CN108660108A (zh) 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法
CN113736731A (zh) 脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法和应用
WO2010140162A2 (en) A process for preparing stem cell based formulations
CN114350596B (zh) 一种毛囊外根鞘细胞培养基

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant