CN114591902B - 间充质干细胞的培养方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及应用。所述间充质干细胞的培养方法，包括间充质干细胞原代细胞的提取、间充质干细胞原代细胞的培养扩增以及间充质干细胞的分离等步骤。本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法，生产成本低，过程简单，易于操作，培养出来的干细胞可用于生产组织和细胞。

Description

间充质干细胞的培养方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及应用。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的一类干细胞，存在于多种成体的组织内，如骨髓、脂肪组织、牙齿组织、胰腺、皮肤、外周血、脐带组织和胎盘等等。在一定条件下，间充质干细胞不仅可分化为中胚层来源细胞，还可分化为内胚层和外胚层来源细胞，例如神经元、肝细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、胰岛细胞、脂肪细胞和肺上皮细胞等。除了具有多向分化的能力外，间充质干细胞还具有营养和支持作用。间充质干细胞可以通过分泌大量生长因子、趋化因子、白介素等与造血干细胞相互作用，从而维持体内造血系统的稳态。间充质干细胞的营养功能可以帮助组织愈合和再生，通过分泌生长因子和神经营养因子来改善疾病。
间充质干细胞最具有临床价值的方面是其具有调节免疫系统的作用。间充质干细胞表面一般不表达MHCⅡ类分子或共刺激分子，且可以与多种固有或适应性免疫细胞相互作用，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞。间充质干细胞表面表达大量趋化因子受体，促使其可以沿着毛细血管迁移到受损或病变部位，对损伤部位进行修复。间充质干细胞还具有容易转染外源基因，促进干细胞植入等特性，是细胞治疗、组织工程研究中一种中药的种子细胞和基因治疗载体，在再生医学和细胞疗法中具有特殊的应用价值。
无血清培养基，是指在细胞培养中不需要添加动物或人源血清。但为了满足细胞生长的需要，通常会向培养基中添加替代血清功能的原料，主要包括结合蛋白、生长因子、粘附因子、激素、微量元素等加大类别。目前市面上的无血清培养基，牛血清白蛋白或人血清白蛋白是基础成分中的必须原料，添加比例大，成本高，但具有细胞传代及扩增能力不足的缺点。
发明专利CN 101525594B公开了一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和用该培养基培养间充质干细胞的方法，该完全培养基包括细胞基础培养基和终浓度为胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。该发明的低血清浓度完全培养基虽然达到了与使用高血清浓度培养试剂持平甚至更好的促进细胞增殖的作用，但是培养基中含有胎牛血清，其成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染，而且胎牛血清生产批次间差异较大，来源不稳定，对体外大规模培养扩增间充质干细胞工艺影响较大。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法及应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60-80％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入1-3mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化2-5min，细胞收缩变圆后加入3-8mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1000-1800rpm的转速离心4-8min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗1-3次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1-1.5接种至10cm细胞培养皿中，于30-40℃、4-7％CO2及饱和湿度条件下进行培养2-6天后，细胞融合65-75％时以1：5-8的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔二到五天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞、牙髓间充质干细胞原代细胞、脐带间充质干细胞原代细胞、胎盘间充质干细胞原代细胞或脂肪间充质干细胞原代细胞中的任意一种。
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入4-8mL原代培养基至没过组织块，于30-40℃、4-7％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养3-7天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
所述无血清培养基，包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子。
间充质干细胞在分离提取的过程中面临严重的低氧环境，导致细胞的存活率低，通常在缺氧状态下，引入抗氧化剂对细胞进行抗氧化、抗凋亡保护。
所述无血清培养基还包括抗氧化剂。
所述无血清培养基，以培养基的终浓度计，6-13mg/L非必需氨基酸、3-8mg/L L-谷氨酰胺、7-12mg/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、8-15mg/L重组人血清白蛋白、5-11mg/L转铁蛋白、1-3mg/L还原性谷胱甘肽、0.3-0.8μg/L亚硒酸钠、8-12mg/L胰岛素、6-13μg/L氢化可的松、1-2mg/Lβ-巯基乙醇、1-3mg/L青链霉素、7-14μg/L重组人表皮生长因子、6-12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、3-7mg/L抗氧化剂。
所述抗氧化剂为芒果叶提取物、虾青素、改性虾青素中的一种或多种。
所述抗氧化剂为芒果叶提取物。
所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后用中药粉碎机粉碎，过40-80目筛，然后用65-75wt％乙醇水溶液按料液比1g:(15-30)mL在温度65-75℃下超声提取60-120min，其中超声波频率为30-40kHz、超声功率为300-400W，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物。
本发明使用醇提法制备得到芒果叶提取物作为抗氧化剂，主要是由于芒果叶提取物中含有大量芒果苷，芒果苷是一种四羟基吡啶的碳糖苷，属于双苯吡酮类化合物，可降低体外细胞激活诱导的细胞死亡，减少活性氧的产生，具有阻止细胞中钙离子负荷超载、以及抗诱变和抗氧化的作用。同时芒果叶提取物能够影响细胞周期，加速细胞分裂，有效促进细胞增殖以及抑制细胞衰老。
虾青素是一种脂溶性的深红色类胡萝卜素，存在于各种水生动物中，主要用作动物和鱼类饲料中的颜色添加剂，为水生动物的肉提供粉红色酯橙红色。虾青素由于具有多烯链和长共轭双键，也是一种非常有效的抗氧化剂，其抗氧化活性比叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素等各种类胡萝卜素高数十倍。由于虾青素在水中溶解性差，将其用于体内应用研究时使用有机溶剂溶解成为一大难题，这也限制了虾青素的应用。
所述抗氧化剂为改性虾青素。
所述改性虾青素的制备方法如下：
L1、在室温下，将4-8重量份甲氧基聚乙二醇与20-30重量份ε-己内酯混合超声8-12min，然后加入0.1-0.2重量份催化剂，继续超声3-7min，然后放入温度120-150℃的油浴中，通入氮气并以100-150rpm的转速搅拌反应18-30h，结束后冷却至室温，加入20-30重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入80-120重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；
L2、将5-8重量份上述改性共聚物溶于8-15重量份丙酮中，再加入2-5重量份虾青素超声4-8min，得到混合液，然后将混合液加入40-60重量份水中，在500-800rpm转速下搅拌10-30min，随后在50-65℃下使用旋转蒸发仪旋蒸20-40min，最后将得到的产物用过滤器进行过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。
所述超声的工艺参数：超声波频率为30-50kHz、超声功率为300-500W。
所述催化剂为辛酸亚锡。
本发明将聚合物胶束作为一种有效载体，用于虾青素的包裹改性。该聚合物胶束具体是甲氧基聚乙二醇-聚己内酯，是一种含有生物相容性好的亲水-甲氧基聚乙二醇和疏水-聚己内酯自组装的二嵌段共聚物。亲水性好的甲氧基聚乙二醇可以保护内核物质免受水环境影响，而疏水性好的聚己内酯能够很好的将水溶性差的虾青素作为内核紧紧包裹住，提高虾青素的包封效率。在培养基应用中，本发明制备的改性虾青素，不仅可以通过孔道扩散进入培养基中，同时外部的聚合物胶束在水环境中会伴随降解和塌陷，进而有利于虾青素的有效释放。本发明使用聚合物胶束包封虾青素实现对虾青素的改性，有效延长了包裹在疏水域中的虾青素稳定性，以实现了虾青素在培养基中的可持续释放，从而降低了培养介质的更换频率，降低了生产成本。
本发明的改性虾青素外部是极为安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，而且具有良好的生物相容性，可以替代血清白蛋白在培养基中的载体作用，充当转运蛋白，有效提高间充质干细胞的增殖能力，还可以增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤，提高细胞活率，增强细胞活力，提高细胞增殖分化能力。
优选的，所述抗氧化剂为芒果叶提取物和改性虾青素的混合物，其中芒果叶提取物和改性虾青素的质量比为1:(2-5)。
本发明使用芒果叶提取物和改性虾青素二者共同作为抗氧化剂，能够有效降低培养基中的活性氧水平，增强细胞活力；同时虾青素具有增加间充质干细胞分化为中胚层谱系的附加作用，而芒果叶提取物能够增加间充质干细胞分化为外胚层和内胚层谱系的附加作用，二者相互作用，促进干细胞的增殖与分化。
本发明还提供了一种间充质干细胞的应用，将培养出来的干细胞用于生产组织和细胞。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种无血清培养基用于间充质干细胞的培养，通过引入抗氧化剂对细胞进行抗氧化、抗凋亡保护，与培养基中其他成分一起为间充质干细胞的培养提供了合适的生存环境，有效提高了间充质干细胞的活力和增殖能力。
2、本发明使用聚合物胶束包封虾青素实现对虾青素的改性，有效延长了包裹在疏水域中的虾青素稳定性，以实现了虾青素在无血清培养基中的可持续释放，从而降低了培养介质的更换频率，降低了生产成本。
3、本发明提供了一种间充质干细胞的培养方法，生产成本低，过程简单，易于操作，培养出来的干细胞可用于生产组织和细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
本申请中部分原料的介绍：
脐带，取自健康足月妊娠的剖宫产儿。
DMEM/F12培养基，货号：MA0214，由大连美仑生物技术有限公司提供。
青链霉素，采用青链霉素混合液(100×)，货号：P1400，由北京索莱宝科技有限公司提供。
甲氧基聚乙二醇，平均分子量2000，由上海易恩化学技术有限公司提供。
非必需氨基酸，产品编号：AN1250，由上海吉至生化科技有限公司提供。
重组人血清白蛋白，由上海柯雷生物科技有限公司提供。
转铁蛋白，CAS号：11096-37-0，由上海宝曼生物科技有限公司提供。
重组人表皮生长因子，CAS号：62253-63-8，由大连美仑生物技术有限公司提供。
碱性成纤维细胞生长因子，CAS号：62031-54-3，由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。
0.25％胰蛋白酶溶液，货号：PB180228，pH＝7.2-7.4，溶剂：10mM PBS，胰蛋白酶浓度：2.5g/L，由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。
实施例1
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入5mL原代培养基至没过组织块，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养5天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合70％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化3min，细胞收缩变圆后加入5mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗2次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1接种至10cm细胞培养皿中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行培养3天后，细胞融合70％时以1：6的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔三天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子加入DMEM/F12培养基中，即得；其中以无血清培养基的终浓度计，8mg/L非必需氨基酸、5mg/L L-谷氨酰胺、10mg/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L重组人血清白蛋白、8mg/L转铁蛋白、2mg/L还原性谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、10mg/L胰岛素、9μg/L氢化可的松、1mg/Lβ-巯基乙醇、2mg/L青链霉素、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。
实施例2
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入5mL原代培养基至没过组织块，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养5天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合70％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化3min，细胞收缩变圆后加入5mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗2次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1接种至10cm细胞培养皿中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行培养3天后，细胞融合70％时以1：6的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔三天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和芒果叶提取物加入DMEM/F12培养基中，即得；其中以无血清培养基的终浓度计，8mg/L非必需氨基酸、5mg/LL-谷氨酰胺、10mg/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L重组人血清白蛋白、8mg/L转铁蛋白、2mg/L还原性谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、10mg/L胰岛素、9μg/L氢化可的松、1mg/Lβ-巯基乙醇、2mg/L青链霉素、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5mg/L芒果叶提取物。
所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后用中药粉碎机粉碎，过60目筛，然后用70wt％乙醇水溶液按料液比1g:20mL在温度70℃下超声提取90min，其中超声波频率为35kHz、超声功率为350W，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物。
实施例3
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入5mL原代培养基至没过组织块，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养5天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合70％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化3min，细胞收缩变圆后加入5mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗2次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1接种至10cm细胞培养皿中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行培养3天后，细胞融合70％时以1：6的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔三天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和虾青素加入DMEM/F12培养基中，即得；其中以无血清培养基的终浓度计，8mg/L非必需氨基酸、5mg/L L-谷氨酰胺、10mg/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L重组人血清白蛋白、8mg/L转铁蛋白、2mg/L还原性谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、10mg/L胰岛素、9μg/L氢化可的松、1mg/Lβ-巯基乙醇、2mg/L青链霉素、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5mg/L虾青素。
实施例4
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入5mL原代培养基至没过组织块，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养5天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合70％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化3min，细胞收缩变圆后加入5mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗2次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1接种至10cm细胞培养皿中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行培养3天后，细胞融合70％时以1：6的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔三天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和改性虾青素加入DMEM/F12培养基中，即得；其中以无血清培养基的终浓度计，8mg/L非必需氨基酸、5mg/L L-谷氨酰胺、10mg/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L重组人血清白蛋白、8mg/L转铁蛋白、2mg/L还原性谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、10mg/L胰岛素、9μg/L氢化可的松、1mg/Lβ-巯基乙醇、2mg/L青链霉素、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5mg/L改性虾青素。
所述改性虾青素的制备方法如下：
L1、在室温下，将5重量份甲氧基聚乙二醇与25重量份ε-己内酯混合超声10min，然后加入0.15重量份辛酸亚锡，继续超声5min，然后放入温度140℃的油浴中，通入氮气并以120rpm的转速搅拌反应24h，结束后冷却至室温，加入25重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入100重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；
L2、将6重量份上述改性共聚物溶于10重量份丙酮中，再加入3重量份虾青素超声5min，得到混合液，然后将混合液加入50重量份水中，在600rpm转速下搅拌15min，随后在60℃下使用旋转蒸发仪旋蒸30min，最后将得到的产物用0.45μm的过滤器进行过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。所述超声的工艺参数：超声波频率为40kHz、超声功率为400W。
实施例5
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述间充质干细胞原代细胞的提取，包括以下步骤：
H1、取新鲜健康脐带，用无菌PBS冲洗干净后，剔除脐带外膜及动静脉，剥出华氏胶组织，并将华氏胶组织剪成1mm3组织块；
H2、将上述组织块接种于10cm细胞培养皿中，其中组织块间距3mm，加入5mL原代培养基至没过组织块，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行原代培养5天，得到间充质干细胞原代细胞；
所述原代培养基由以下原料组成：10wt％胎牛血清、1wt％青链霉素、余量为DMEM/F12培养基。
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合70％时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入2mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化3min，细胞收缩变圆后加入5mL上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液以1500rpm的转速离心5min，弃掉上清液，用PBS离心漂洗2次，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1接种至10cm细胞培养皿中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下进行培养3天后，细胞融合70％时以1：6的比例传代至15cm细胞培养皿中；
S3、间充质干细胞的分离：每隔三天换一次培养液，当细胞融合程度80％时，按传代的要求消化、中和、洗涤后，收集得到所述间充质干细胞。
所述无血清培养基的制备方法为：将非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗氧化剂加入DMEM/F12培养基中，即得；其中以无血清培养基的终浓度计，8mg/L非必需氨基酸、5mg/L L-谷氨酰胺、10mg/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10mg/L重组人血清白蛋白、8mg/L转铁蛋白、2mg/L还原性谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、10mg/L胰岛素、9μg/L氢化可的松、1mg/Lβ-巯基乙醇、2mg/L青链霉素、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5mg/L抗氧化剂。
所述抗氧化剂为芒果叶提取物和改性虾青素的混合物，其中芒果叶提取物和改性虾青素的质量比为1:3。
所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后用中药粉碎机粉碎，过60目筛，然后用70wt％乙醇水溶液按料液比1g:20mL在温度70℃下超声提取90min，其中超声波频率为35kHz、超声功率为350W，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物。
所述改性虾青素的制备方法如下：
L1、在室温下，将5重量份甲氧基聚乙二醇与25重量份ε-己内酯混合超声10min，然后加入0.15重量份辛酸亚锡，继续超声5min，然后放入温度140℃的油浴中，通入氮气并以120rpm的转速搅拌反应24h，结束后冷却至室温，加入25重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入100重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；
L2、将6重量份上述改性共聚物溶于10重量份丙酮中，再加入3重量份虾青素超声5min，得到混合液，然后将混合液加入50重量份水中，在600rpm转速下搅拌15min，随后在60℃下使用旋转蒸发仪旋蒸30min，最后将得到的产物用0.45μm的过滤器进行过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。所述超声的工艺参数：超声波频率为40kHz、超声功率为400W。
测试例1
间充质干细胞活力评价：
分别将各实施例中获得的细胞按传代要求进行消化、中和、洗涤处理后，以4×104个/mL密度接种于96孔板内，每孔加入相对应实施例的无血清培养基100μL，每组实施例细胞接种5个平行孔。细胞贴壁72h后，每孔加入10μL MTS试剂，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养4h，随后使用酶标仪，检测490nm的OD值。用OD值来评价间充质干细胞活力，OD值越大表示间充质干细胞活力越好，OD值越小表示间充质干细胞活力越差。
表1：间充质干细胞活力评价
OD490nm值
实施例1 1.295
实施例2 1.867
实施例3 1.530
实施例4 2.051
实施例5 2.204
由以上结果可知，与实施例1相比，实施例2-5的间充质干细胞具有较高的细胞活力，可能是由于间充质干细胞在分离提取的过程中面临严重的低氧环境，导致细胞的存活率低，本发明在培养基中引入的抗氧化剂，能够对细胞进行抗氧化、抗凋亡保护，有利于细胞活力的提高。与实施例3相比，实施例4的间充质干细胞活力较好，主要可能是将聚合物胶束-甲氧基聚乙二醇-聚己内酯作为虾青素的有效载体，具有良好的生物相容性，制备的改性虾青素不仅可以通过孔道扩散进入培养基中，同时外部的聚合物胶束在水环境中会伴随降解和塌陷，有利于虾青素的有效释放；还可以替代血清白蛋白在培养基中的载体作用，充当转运蛋白，有效提高间充质干细胞的增殖能力，以及增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤，提高细胞活率，增强细胞活力，提高细胞增殖分化能力。与实施例2和4相比，实施例5使用芒果叶提取物和改性虾青素二者共同作为抗氧化剂，能够有效降低培养基中的活性氧水平，增强细胞活力。
测试例2
细胞增殖能力评价：分别将各实施例中获得的细胞按传代要求进行消化、中和、洗涤处理后，以2×104个/mL密度接种于12孔板中，分成5组，每组12孔，每孔加入相对应实施例的无血清培养基1ml，放入37℃、5％CO2培养箱中培养，分别于培养2d、3d和4d时各取3孔用台盼兰染色进行细胞计数，取平均值。
表2：间充质干细胞增殖能力评价
以上结果可以看出，实施例2-5的细胞数量远高于实施例1，表明本发明的无血清培养基中添加抗氧化剂，显著提高了间充质干细胞的增殖能力。与实施例2相比，实施例3的细胞数量较少，主要可能是虾青素较芒果叶提取物相比，其水溶性较差，限制了虾青素作为抗氧化剂在培养基中发挥对活性氧的抑制作用，进而导致培养基中活性氧水平较高，不利于细胞增殖。实施例4的细胞数量明显高于实施例3，原因可能是使用聚合物胶束包封虾青素实现对虾青素的改性，不仅可以有效提高虾青素的溶解性，还可以延长虾青素的稳定性，能够实现虾青素在培养基中的可持续释放，在增强细胞增殖能力的同时延长培养基的使用时间。与实施例2和4相比，实施例5使用芒果叶提取物和改性虾青素二者共同作为抗氧化剂，细胞增殖能力进一步提高，主要可能是虾青素具有增加间充质干细胞分化为中胚层谱系的附加作用，而芒果叶提取物能够增加间充质干细胞分化为外胚层和内胚层谱系的附加作用，二者相互作用，共同促进间充质干细胞的增殖与分化。

Claims (2)

1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、间充质干细胞原代细胞的提取；
S2、间充质干细胞原代细胞的培养扩增；
S3、间充质干细胞的分离；
所述步骤S2具体为：将间充质干细胞原代细胞培养至细胞融合60-80%时，收集培养上清液，用PBS洗涤细胞两次，再向培养皿中加入胰蛋白酶消化，细胞收缩变圆后加入上述收集的培养上清液终止消化，吹打细胞团，得到细胞悬液；然后将细胞悬液离心，弃掉上清液，用PBS离心漂洗，重新加入无血清培养基重悬，按照1传1-1.5接种至细胞培养皿中，于30-40℃、4-7% CO2及饱和湿度条件下进行培养2-6天后，细胞融合65-75%时以1：5-8的比例传代至细胞培养皿中；
所述无血清培养基，包括DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶抑制剂、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、重组人血清白蛋白、转铁蛋白、还原性谷胱甘肽、亚硒酸钠、胰岛素、氢化可的松、β-巯基乙醇、青链霉素、重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，所述无血清培养基还包括抗氧化剂，所述抗氧化剂为芒果叶提取物和改性虾青素的混合物，其中芒果叶提取物和改性虾青素的质量比为1:（2-5）；
所述芒果叶提取物的制备方法如下：将芒果叶干燥后粉碎，然后用65-75wt%乙醇水溶液按料液比1g:（15-30）mL在温度65-75℃下超声提取60-120min，结束后进行抽滤，收集滤液，冷冻干燥，得到芒果叶提取物；
所述改性虾青素的制备方法如下：
L1、在室温下，将4-8重量份甲氧基聚乙二醇与20-30重量份ε-己内酯混合超声8-12min，然后加入0.1-0.2重量份催化剂，继续超声3-7min，然后放入温度120-150℃的油浴中，通入氮气并搅拌反应18-30h，结束后冷却至室温，加入20-30重量份二氯甲烷混合均匀，最后加入80-120重量份无水甲醇混合，将得到的混合过滤，取沉淀冷冻干燥，得到改性共聚物；
L2、将5-8重量份上述改性共聚物溶于8-15重量份丙酮中，再加入2-5重量份虾青素超声4-8min，得到混合液，然后将混合液加入40-60重量份水中搅拌10-30min，随后旋蒸、过滤，滤液冷冻干燥，得到改性虾青素。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞、牙髓间充质干细胞原代细胞、脐带间充质干细胞原代细胞、胎盘间充质干细胞原代细胞或脂肪间充质干细胞原代细胞中的任意一种。
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