CN112111448A

CN112111448A - 改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用

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Publication number: CN112111448A
Application number: CN202010847844.5A
Authority: CN
Inventors: 杨智广; 姬广聚; 张梦琦
Original assignee: Shenzhen Zhongke Guangrui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yuansheng Biotechnology (Qingdao) Co.,Ltd.
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: US20220056415A1; EP3957719A1; CN112111448B

Abstract

本发明涉及一种改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用，该改良的间充质干细胞培养基包基础培养基、第一组分和褪黑素，第一组分选自辅酶Q10及米托蒽醌甲磺酸盐中的至少一种，第一组分的工作浓度为1μM～20μM，褪黑素的工作浓度为1μM～20μM，第一组分与褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)。上述改良的间充质干细胞培养基能够提高间充质干细胞中线粒体活性和线粒体数量。

Description

改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术，特别是涉及一种改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用。

背景技术

线粒体是细胞内重要的半自主细胞器，具有可编码线粒体部分遗传信息的线粒体DNA，是细胞内有氧呼吸的主要场所，负责为细胞提供能量。此外，线粒体在细胞分化、细胞分泌、细胞增殖与凋亡等过程中起重要作用。

间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有强大的增殖能力和分化能力，且免疫源性低，具有广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是目前应用最多的间充质干细胞之一。骨髓间充质干细胞能应用于疾病治疗中主要是依赖于以下机制：1)细胞替代：骨髓间充质干细胞可分化为多种细胞，补充机体细胞的损伤或缺失，例如，在适宜的体内或体外环境下，骨髓间充质干细胞可以分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等。2)细胞分泌：骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子、细胞外基质、氧化还原酶、热激活蛋白和其他活性小分子参与机体代谢。3)线粒体转移：骨髓间充质干细胞的线粒体可转移到受损、衰老的组织或细胞中，修复或激活受损及衰老的组织、细胞，并调节细胞代谢。

然而，由于间充质干细胞中线粒体所处环境内的活性氧水平高，其线粒体DNA容易被攻击而损伤。随着间充质干细胞的传代培养，其线粒体的活性容易下降，其线粒体的数量也容易减少。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够延缓间充质干细胞中线粒体活性的降低且增加线粒体数量的改良的间充质干细胞培养基。此外，还提供一种线粒体活性高且线粒体数量多的骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用。

一种改良的间充质干细胞培养基，包括基础培养基、第一组分和褪黑素，所述第一组分选自辅酶Q10及米托蒽醌甲磺酸盐中的至少一种，所述第一组分的工作浓度为1μM～20μM，所述褪黑素的工作浓度为1μM～20μM，所述第一组分与所述褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)。

上述改良的间充质干细胞培养基通过在基础培养基中添加辅酶Q10及米托蒽醌甲磺酸盐中的至少一种和褪黑素，且第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)，使得间充质干细胞的线粒体DNA不易因被活性氧攻击而受到损伤，能够延缓间充质干细胞在培养过程中线粒体活性的降低，能够增加间充质干细胞中线粒体数量。

在其中一个实施例中，所述改良的间充质干细胞培养基还包括第二组分，所述第二组分选自烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖和NADH中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述第一组分与所述第二组分的摩尔之比为1：(0.2～10)。

在其中一个实施例中，所述改良的间充质干细胞培养基还包括第二组分，所述第二组分为烟酰胺单核苷酸，所述第一组分为辅酶Q10，所述第一组分的工作浓度为1μM～5μM，所述褪黑素的工作浓度为1μM～5μM，所述第二组分的工作浓度为0.5μM～10μM。

在其中一个实施例中，所述基础培养基选自DMEM、EMEM、IMDM、GMEM、RPMI-1640及α-MEM中的一种。

在其中一个实施例中，所述改良的间充质干细胞培养基还包括维生素B、矿物质、多酚、左旋肉碱、α硫辛酸、吡咯并喹啉醌及肌酸中的至少一种。

一种骨髓间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

在上述的改良的间充质干细胞培养基中，培养骨髓间充质干细胞。

在其中一个实施例中，所述骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

一种骨髓间充质干细胞，由上述的骨髓间充质干细胞的培养方法培养得到。

上述的骨髓间充质干细胞在制备用于治疗二型糖尿病或脂肪肝的药物中的应用。

一种用于治疗二型糖尿病或脂肪肝的药物，包括上述的骨髓间充质干细胞。

附图说明

图1为实施例3中的HFD对照组、BMSCs组和eBMSCs组小鼠的体重与时间的关系；

图2为实施例3中的HFD对照组、BMSCs组和eBMSCs组小鼠第36周进行葡萄糖耐受实验的结果；

图3为实施例4的石蜡切片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种改良的间充质干细胞培养基，该改良的间充质干细胞培养基包括基础培养基、第一组分和褪黑素，第一组分选自辅酶Q10及米托蒽醌甲磺酸盐中的至少一种，第一组分的工作浓度为1μM～20μM，所述褪黑素的工作浓度为1μM～20μM，第一组分与褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)。该改良的间充质干细胞培养基能够延缓间充质干细胞中线粒体活性的降低且增加线粒体数量，由该培养基培养得到的间充质干细胞中线粒体活性高和线粒体的数量多。

具体地，基础培养基用于为间充质干细胞的生长提供必备的营养。本发明中的基础培养基可以选自DMEM、EMEM、IMDM、GMEM、RPMI-1640及α-MEM中的一种。基础培养基可以为无血清间充质干细胞培养基，也可以使用含有血清的间充质干细胞培养基。

在其中一个实施例中，改良的间充质干细胞培养基中含有添加剂。具体地，添加剂可是公知的添加物，只要不抑制间充质干细胞的增殖即可。例如有生长因子(例如胰岛素等)、铁源(例如转铁蛋白等)、聚胺类(例如腐胺等)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)和有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)等。

在其中一个实施例中，第一组分为辅酶Q10。在另一个实施例中，第一组分为米托蒽醌甲磺酸盐(mitoquinone mesylate，简称mitoQ)。

在其中一个实施例中，第一组分的工作浓度为1μM～20μM。第一组分的工作浓度为1μM～20μM时，能够保护线粒体，提高线粒体活力，降低ROS。进一步地，第一组分的工作浓度为1μM～10μM。更进一步地，第一组分的工作浓度为1μM～5μM。

在其中一个实施例中，辅酶Q10的工作浓度为1μM～20μM。辅酶Q10的工作浓度为1μM～20μM时，能够保护线粒体，提高线粒体活力，降低ROS。进一步地，辅酶Q10的工作浓度为1μM～10μM。更进一步地，辅酶Q10的工作浓度为1μM～5μM。

在其中一个实施例中，第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)。在第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)时，能够促进间充质干细胞增殖，提高细胞活力，提高线粒体活力，降低ROS。进一步地，第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(1～3)。

在其中一个实施例中，第一组分为辅酶Q10，第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)，进一步地，第一组分和褪黑素的摩尔比为1：(1～3)。

在其中一个实施例中，褪黑素的工作浓度为1μM～20μM。进一步地，褪黑素的工作浓度为1μM～10μM。更进一步地，褪黑素的工作浓度为1μM～5μM。

在其中一个实施例中，改良的间充质干细胞培养基还包括第二组分，第二组分选自烟酰胺单核苷酸(NMN)、烟酰胺核糖(NR)和NADH中的至少一种。第二组分与第一组分和褪黑素共同作用，能够进一步地提高间充质干细胞中线粒体的活性和线粒体的数量。进一步地，第一组分与第二组分的摩尔之比为1：(0.2～10)。第一组分与第二组分的摩尔之比为1：(0.2～10)时，能进一步提高线粒体活力。更进一步地，第一组分与第二组分的摩尔之比为1：(0.2～2.5)。

在其中一个实施例中，第二组分为烟酰胺单核苷酸，烟酰胺单核苷酸的工作浓度为0.5μM～10μM。进一步地，烟酰胺单核苷酸的工作浓度为0.5μM～5μM。

在其中一个实施例中，第一组分为辅酶Q10，辅酶Q10的工作浓度为1μM～5μM，褪黑素的工作浓度为1μM～5μM，烟酰胺单核苷酸的工作浓度为0.5μM～10μM。进一步地，辅酶Q10和褪黑素的摩尔比为1：(1～3)；辅酶Q10与烟酰胺单核苷酸的摩尔之比为1：(0.2～2.5)。

在其中一个实施例中，改良的间充质干细胞培养基由基础培养基、血清替代物、EGF、BEGF、辅酶Q10、褪黑素和烟酰胺单核苷酸组成；其中，辅酶Q10的工作浓度为1μM～5μM，褪黑素的工作浓度为1μM～5μM，烟酰胺单核苷酸的工作浓度为0.5μM～10μM。进一步地，辅酶Q10和褪黑素的摩尔比为1：(1～3)；辅酶Q10与烟酰胺单核苷酸的摩尔之比为1：(0.2～2.5)。

在其中一个实施例中，改良的间充质干细胞培养基还包括维生素B、矿物质(或称无机盐)、多酚、左旋肉碱、α硫辛酸、吡咯并喹啉醌及肌酸中的至少一种。

需要说明的是，第一组分的工作浓度是第一组分在改良的间充质干细胞培养基中的浓度；褪黑素的工作浓度是指褪黑素在改良的间充质干细胞培养基中的浓度；第二组分的工作浓度是指第二组分在改良的间充质干细胞培养基中的浓度。

在其中一个实施例中，上述改良的间充质干细胞培养基用于培养骨髓间充质干细胞。当然，在其他一些实施例中，上述改良的间充质干细胞培养基还可以用于培养除骨髓间充质干细胞外的其他间充质干细胞(例如脐带间充质干细胞)，能够提高其他间充质干细胞的线粒体的活性及线粒体数量。

本发明一实施方式还提供了一种骨髓间充质干细胞的培养方法，该培养方法包括步骤a～步骤b。具体地：

步骤a：从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。

具体地，从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞的方法为全骨髓培养法(也称直接培养法)或密度梯度离心法。

在其中一个实施例中，采用密度梯度离心法从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞。具体地，在骨髓中加入等量的生理盐水稀释骨髓，然后以1体积份淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)加2体积份稀释骨髓的比例，将稀释后的骨髓缓慢加入Ficoll液面上，水平离心机20℃条件下2000r/min离心25～30分钟，从界面上取出骨髓间充质干细胞。接着用生理盐水洗涤2次～3次后，加适量培养液计数。

在本实施方式中，骨髓为人骨髓。当然，可以理解的是，在其他一些实施例中，骨髓还可以是动物骨髓，例如小鼠骨髓。当然，在一些实施例中，步骤a可以省略，此时骨髓间充质干细胞可以购得。

步骤b：在上述任意一种改良的间充质干细胞培养基中培养骨髓间充质干细胞。

具体地，将从骨髓中分离出的骨髓间充质干细胞采用上述任意一种改良的间充质干细胞培养基进行原代培养。

在其中一个实施例中，将骨髓间充质干细胞进行原代培养的步骤包括：将浓度为5×10⁶个/mL的从骨髓中分离出的骨髓间充质干细胞接种于上述任意一种改良的间充质干细胞培养基中进行培养，3天后换液去除非贴壁细胞，之后每3天～4天半量换培养基1次。需要说明的是，本文中的原代培养是指从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。

在其中一个实施例中，在将骨髓间充质干细胞进行原代培养的步骤之后，还包括传达培养的步骤。具体地，当细胞达到90％融合度时进行传代培养。进一步地，传代培养的步骤包括：消化骨髓间充质干细胞，然后按照2×10⁵个/mL～5×10⁵个/mL的密度将消化后的骨髓间充质干细胞接种于新的改良的间充质干细胞培养基中进行培养。

一个可选地具体示例中，当细胞达到90％融合度时，弃去培养瓶中原有的培养基，然后用生理盐水洗涤骨髓间充质干细胞二次，加入37℃预热的0.25％(2.5g/L，0.25％)胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L的EDTA-Na2配制)消化1～2分钟，倒置显微镜下观察，骨髓间充质干细胞开始皱缩时加入改良的间充质干细胞培养基(3mL左右)终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15mL离心管中，1500r/min离心10分钟后弃上清，再用生理盐水液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将骨髓间充质干细胞再悬浮于改良的间充质干细胞培养基中，按2×10⁵个/mL～5×10⁵个/mL接种传代于新的培养瓶中进行培养。

上述骨髓间充质干细胞的培养方法简捷，易操作。经证实，按照上述方法培养得到的骨髓间充质干细胞中线粒体的活性高且线粒体的数量多。

此外，本发明一实施方式还提供了一种骨髓间充质干细胞，该骨髓间充质干细胞由上述骨髓间充质干细胞的培养方法制得。

本发明一实施方式还提供了一种上述骨髓间充质干细胞在制备用于治疗二型糖尿病或脂肪肝的药物中的应用。上述骨髓间充质干细胞中线粒体的活性高且线粒体的数量多，经证实，上述骨髓间充质干细胞对二型糖尿病和脂肪肝均具有显著的治疗效果。

本发明一实施方式还提供了一种药物，该药物可以用于治疗二型糖尿病或脂肪肝。具体地，该药物包括上述骨髓间充质干细胞，上述骨髓间充质干细胞作为活性成分。当然，在一些实施例中，上述药物还包括药学上可接受的辅料。例如，用于保存上述骨髓间充质干细胞的载体。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。本文中的“μM”指“μmol/L”；“mM”指“mmol/L”。以下实施例中：辅酶Q10购自Selleck，货号S2398；NMN购自Selleck，货号S5259；褪黑素购自Sigma，货号73-31-4。无血清间充质干细胞培养基由在α-MEM(购自Sigma)中添加血清替代物(购自Helios)、EGF(购自Sigma)和BFGF(购自Sigma)制成，在无血清间充质干细胞培养基中，α-MEM与血清替代物的体积比为20：1，EGF的浓度为1μg/L，BEGF的浓度为1μg/L。

实施例1

(1)骨髓间充质干细胞分离：抽取人骨髓15mL，按每毫升骨髓100U肝素抗凝处理。骨髓加入等量生理盐水混匀，以1份淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)加2份稀释骨髓的比例，将稀释骨髓缓慢加入Ficoll液面上，水平离心机20℃条件下2000r/min离心30分钟，从界面上取出的骨髓间充质干细胞用生理盐水洗涤3次后，加适量培养液计数。

(2)骨髓间充质干细胞的原代培养：按照0.3×10⁶/mL的密度将步骤(1)得到的骨髓间充质干细胞接种于分别接种在不同的间充质干细胞培养基(由基础培养基+培养基添加剂组成，具体组成见表1)中培养3天，然后检测各组培养基培养的得到的骨髓间充质干细胞的数量，结果如表1所示。

表1

由表1可知，在基础培养基中添加辅酶Q10和褪黑素，并使辅酶Q10在培养基中的浓度为1μM～20μM，褪黑素在培养基中的浓度为1μM～20μM，且辅酶Q10和褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)，能够促进骨髓间充质干细胞增殖。

实施例2

(2)骨髓间充质干细胞的原代培养：按照5×10⁶/mL的密度将步骤(1)得到的骨髓间充质干细胞接种于分别接种在不同的间充质干细胞培养基中，其中：第一组所用的间充质干细胞培养基由无血清间充质干细胞培养基、1μM辅酶Q10、1μM褪黑素和1μM烟酰胺单核苷酸组成；第二组所用的间充质干细胞培养基由无血清间充质干细胞培养基、1μM辅酶Q10和1μM褪黑素组成；第三组所用的间充质干细胞培养基为无血清间充质干细胞培养基(即对照组)。3天后，各组分别进行更换对应的培养基以去除非贴壁细胞，之后每3天半量换液1次。将原代培养得到的骨髓间充质干细胞记为P0代。

(3)骨髓间充质干细胞的传代培养：待各组的骨髓间充质干细胞达到90％融合度时分别进行传代培养：先全部吸出间充质干细胞培养基后，用生理盐水洗涤二次，加入37℃预热的0.25％(2.5g/L，0.25％)胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制)消化1～2分钟，倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时加入对应的间充质干细胞培养基(3mL左右)终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15mL离心管中，1500r/min离心10分钟后弃上清，再用生理盐水液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。将细胞悬浮于间充质干细胞培养基中，按5×10⁵/mL密度接种传代于对应的新的间充质干细胞培养基中并培养。将原代细胞第一次传代培养得到的骨髓间充质干细胞记为P1代。依次类推，经过不断地传代培养，各组均收获P2～P9代的骨髓间充质干细胞。

需要说明的是，在制备各组的P2～P9代的骨髓间充质干细胞时均进行了如下质量控制，结果均合格：1)病原体检测：取骨髓前抽取2管(各约2mL)人静脉血于促凝管中，进行病原体检测，不得检出以下病毒：乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒病毒、HIV病毒、CMV病毒、EBV病毒、HTLV病毒。2)流式检测：P2代的骨髓间充质干细胞进行传代培养前进行以下表面标记物检测：CD105不得低于90％；CD 73不得低于90％；CD 90不得低于90％；CD 45不得过2％；CD19不得过2％；CD HLA-DR不得过2％；CD 34不得过2％；CD 11b不得过2％。

测试

1.细胞存活率检测

对实施例2得到的各组的P2代骨髓间充质干细胞和P9代(传代培养3天后)骨髓间充质干细胞进行检测：采用台盼蓝染色对各组P2代骨髓间充质干细胞和P9代骨髓间充质干细胞的细胞存活状况进行检测，并计算细胞存活率，各组细胞存活率的结果表2所示。

表2

由表2可知，对照组、第一组和第二组的P2代骨髓间充质干细胞的细胞存活率均在98％以上，对照组、第一组和第二组的P9代骨髓间充质干细胞的细胞存活率均在98％以上。

2.流式细胞检测细胞表面标记物

使用BD公司人间充质干细胞检测试剂盒(货号：562245)对实施例2制备的三组P2代骨髓间充质干细胞分别进行标记，并用流式细胞仪(型号：BD Accuri C6)检测表面标记物，结果如表3所示。

表3

由表3可知，对照组、第一组和第二组的P2代骨髓间充质干细胞均符合间充质干细胞表面标记物的标准。

3.骨髓间充质干细胞中线粒体膜电位检测

对实施例2的制备的各组的P2代骨髓间充质干细胞和P9待骨髓间充质干细胞分别进行了膜电位检测：标记TMRE(四甲基罗丹明乙酯)后通过流式细胞仪检测TMRE阳性细胞数，并与对照组进行显著性分析，同时进行三组平行试验，结果如表4所示。

表4

由表4可知，随着骨髓间充质干细胞代数的增加，TMRE阳性细胞数逐渐减少。第一组的P2代骨髓间充质干细胞和第二组P2代骨髓间充质干细胞中TMRE阳性细胞数均高于对照组，且与对照组相比具有显著差异；第一组的P9代骨髓间充质干细胞和第二组P9代骨髓间充质干细胞中TMRE阳性细胞数也均高于对照组，且与对照组相比具有显著差异。所以，第一组和第二组所用的培养基均对其培养的骨髓间充质干细胞中线粒体膜电位有保护作用，能减缓骨髓间充质干细胞中线粒体因传代而导致的活性降低。

4.骨髓间充质干细胞中线粒体超氧化合物检测

对实施例2制得的各组的P2代骨髓间充质干细胞和P9代骨髓间充质干细胞进行线粒体超氧化合物检测：标记MitoSOX(细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子)后，通过流式细胞仪检测MitoSOX阳性细胞数，并与对照组进行显著性分析，同时进行三组平行试验，结果如表5所示。

表5

由表5可知，随着骨髓间充质干细胞代数增加，MitoSOX阳性细胞数逐渐增加。第一组的P2代骨髓间充质干细胞和第二组P2代骨髓间充质干细胞中MitoSOX阳性细胞数均低于对照组，且与对照组相比具有显著差异；第一组的P9代骨髓间充质干细胞和第二组P9代骨髓间充质干细胞中MitoSOX阳性细胞数也均低于对照组，且与对照组相比具有显著差异。所以，第一组和第二组所用的培养基均能提高其培养的骨髓间充质干细胞中线粒体活性。

5.线粒体相对数量检测

使用qPCR方法通过扩增mtDNA上ND1基因来检测细胞内线粒体相对含量，相关引物：ND1-F：5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’(SEQ ID No.1),ND1-R：5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’(SEQ ID No.2)；β-actin-F：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID No.3)，β-actin-R：5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’(SEQ ID No.4)。使用2x TransGreen QPCR Mix(Abgent公司)进行实验，使用Qiagen公司qPCR仪进行上机，进行半定量实验，以P2代对照组相对值为1，同时进行三组平行试验，结果如表6所示。

表6

由表6可知，整体上，随着骨髓间充质干细胞代数增加，线粒体数量呈下降趋势。第一组的P2代骨髓间充质干细胞和第二组P2代骨髓间充质干细胞中MitoSOX阳性细胞数均高于对照组，且与对照组相比具有显著差异；第一组的P9代骨髓间充质干细胞和第二组P9代骨髓间充质干细胞中MitoSOX阳性细胞数也均高于对照组，且与对照组相比具有显著差异。所以，第一组和第二组所用的培养基能够提高其培养的骨髓间充质干细胞中线粒体的数量。

综上，由无血清间充质干细胞培养基、1μM辅酶Q10、1μM褪黑素和1μM烟酰胺单核苷酸组成的间充质干细胞培养基和由无血清间充质干细胞培养基、1μM辅酶Q10和1μM褪黑素组成的间充质干细胞培养基均可以增强骨髓间充质干细胞线粒体活性，提高线粒体数量。

实施例3

实施例2制备的骨髓间充质干细胞的在治疗二型糖尿病中的效果

将实施例2中使用由无血清间充质干细胞培养基、1μM辅酶Q10、1μM褪黑素和1μM烟酰胺单核苷酸组成的间充质干细胞培养基培养得到的P3代骨髓间充质干细胞(我们称为“增强型骨髓间充质干细胞”，下文简称eBMSCs)在二型糖尿病小鼠中进行临床前实验。具体地：

(1)将8周的雄性C57BL/6小鼠分为两组，一组(12只)小鼠饲喂脂肪含量为60％的高脂饲料，为HFD(high-fat diet)组；同时另一组(6只)小鼠饲喂普通的小鼠维持饲料，为ND(normal diet)组。两组小鼠体重随时间变化的统计结果如表7所示。

表7

由表7可知，建模10周开始实验组(HFD组)体重相比于对照组(ND组)有显著性差异。另外，经统计分析，从第14周开始HFD组与ND组有极显著差异。

(2)2016年WHO制定的二型糖尿病小鼠诊断标准规定：小鼠体重连续4周大于40g，空腹血糖超过6.1mM，并且腹腔注射葡萄糖2h后血糖大于11.1mM即为饮食诱导的二型糖尿病模型小鼠。因此，对建模28周小鼠进行葡萄糖耐受测试：饥饿16小时后，腹腔注射1g/kg体重的葡萄糖，并测试血糖，结果如表8所示。

表8

由表8可知，28周的HFD组的小鼠的体重已连续4周大于40g，平均血糖值超过6.1mM，且同ND组有显著性差异，空腹注射葡萄糖120分钟后血糖均值19.4mM，大于11.1mM。因此，饮食诱导的二型糖尿病小鼠模型构建成功。

此外，我们还进一步检测了HFD组小鼠和ND组小鼠在空腹5小时后血清胰岛素的含量，结果如表9所示。

表9

由表9可知，HFD组小鼠的血清胰岛素水平相比于对照组显著提高，结合饥饿后HFD组血糖显著上升的结果，显示HFD组出现明显二型糖尿病症状，即胰岛素抵抗。

另外，我们又进行了胰岛素耐受实验：饥饿4小时后，腹腔注射1U/kg体重的胰岛素，结果如表10所示。

表10

由表10可知，注射胰岛素后，HFD组小鼠的血糖相比于ND组小鼠没有同等幅度下降，进一步验证了HFD组出现胰岛素抵抗症状，说明二型糖尿病模型成功。

(3)采用高脂饲料继续喂养HFD组小鼠，并在第32周、第34周(自开始饲喂高脂饲料起计算)分别对HFD组建模成功的小鼠尾静脉注射给药，具体给药分以下几组：

HFD对照组：注射生理盐水；BMSCs组：按照5×10⁶个细胞/小鼠注射无血清间充质干细胞培养基培养的P3代骨髓间充质干细胞；eBMSCs组：按照5×10⁶个细胞/小鼠注射eBMSCs。

在继续饲养过程中，对小鼠体重进行了称重，结果如表11和图1所示。

表11

由表11和图1可知，与HFD对照组相比，BMSCs组小鼠的体重在两周内出现显著性下降，eBMSCs组小鼠的体重在一周内显著下降，因此，骨髓间充质干细胞有明显减肥作用。另外，根据统计学分析，eBMSCs组的效果显著优于BMSCs组，且eBMSCs组的作用效果可以在小鼠中至少持续11周。

此外，在第36周时(即最后一次注射药物后2周)进行葡萄糖耐受实验，结果如表12和图2所示。

表12

由表12和图2可知，BMSCs组相对于HFD对照组有明显降糖作用，eBMSCs组降糖作用更优，eBMSCs组的降糖效果显著优于BMSCs组。

实施例4

实施例2制备的骨髓间充质干细胞对脂肪肝影响：

将实施例3的ND组小鼠、HFD对照组小鼠、BMSCs组小鼠和eBMSCs组小鼠继续采用对应的饲料(ND组小鼠用普通饲料，HFD对照组、BMSCs组和eBMSCs组均用高脂饲料)饲养到46周后处死，并分别取肝脏组织进行石蜡切片，并苏木精染色，具体过程如下：

(1)组织石蜡切片制备：

a、腹腔注射5％水合氯醛(100μL/10g体重)，小鼠麻醉后，迅速打开胸腔，取出肝脏，置于PBS溶液中。b、用显微剪去除脂肪组织，放入4％的多聚甲醛溶液中(PBS为溶剂)，4℃摇床摇48小时固定。

c、将固定好的肝脏组织放入75％的乙醇溶液中脱水。

d、将脱水后的组织放入梯度二甲苯溶液中浸泡。

e、将组织放入石蜡包埋机(Leica)中包埋，热台60℃，铁槽深6mm，放入槽内，滴入石蜡后放凉台成型；

f、用石蜡切片机(Leica)切片，厚度5μm，45℃水中展片后，置于防脱玻片上，60℃烘箱5min烤干备用。

(2)H&E染色：

a、H&E染色试剂：苏木精配方：苏木精2g，无水乙醇40mL，硫酸铝钾100g，蒸馏水600mL，碘酸钠0.4g，冰醋酸20mL。

b、配制方法：先加入蒸馏水，硫酸铝钾加入后稍微加热，之后加入苏木精、无水乙醇、碘酸钠、冰醋酸充分溶解；伊红溶液配方：伊红(醇溶性)2.5g，95％乙醇1L；冰醋酸配置方法：伊红容于95％乙醇中，搅拌，用冰醋酸调节pH值为4.5；盐酸乙醇分化液：浓盐酸1mL，75％乙醇200mL。

c、染色步骤：

常规脱蜡：60℃烘箱烤片15min，二甲苯3遍各10min，分别过100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、90％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各5min。

染色：苏木精浸泡5min，自来水洗净；盐酸、乙醇各分化30s；自来水洗净；伊红溶液浸泡5min，自来水洗净。

脱水：95％乙醇中迅速取出，100％乙醇三遍各10s，二甲苯3遍各1.5min，用中性树胶封片，盖玻片厚度为0.13mm～0.17mm。

各组的石蜡切片染色后如图3所示。由图3可知，BMSCs组小鼠的脂肪肝明显减少，有效率约80％，eBMSCs组小鼠也显示脂肪肝明显减少，有效率100％。因此，骨髓间充质干细胞对脂肪肝有明显治疗作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市中科广瑞生物技术有限公司

<120> 改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atacaactac gcaaaggccc ca 22

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Claims

1.一种改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基、第一组分和褪黑素，所述第一组分选自辅酶Q10及米托蒽醌甲磺酸盐中的至少一种，所述第一组分的工作浓度为1μM～20μM，所述褪黑素的工作浓度为1μM～20μM，所述第一组分与所述褪黑素的摩尔比为1：(0.2～10)。

2.根据权利要求1所述的改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述改良的间充质干细胞培养基还包括第二组分，所述第二组分选自烟酰胺单核苷酸、烟酰胺核糖和NADH中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述第一组分与所述第二组分的摩尔之比为1：(0.2～10)。

4.根据权利要求1所述的改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述改良的间充质干细胞培养基还包括第二组分，所述第二组分为烟酰胺单核苷酸，所述第一组分为辅酶Q10，所述第一组分的工作浓度为1μM～5μM，所述褪黑素的工作浓度为1μM～5μM，所述第二组分的工作浓度为0.5μM～10μM。

5.根据权利要求1～4任一项所述的改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM、EMEM、IMDM、GMEM、RPMI-1640及α-MEM中的一种。

6.根据权利要求5所述的改良的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述改良的间充质干细胞培养基还包括维生素B、矿物质、多酚、左旋肉碱、α硫辛酸、吡咯并喹啉醌及肌酸中的至少一种。

7.一种骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

在权利要求1～6任一项所述的改良的间充质干细胞培养基中，培养骨髓间充质干细胞。

8.根据权利要求7所述的骨髓间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

9.一种骨髓间充质干细胞，其特征在于，由权利要求7或8所述的骨髓间充质干细胞的培养方法培养得到。

10.权利要求9所述的骨髓间充质干细胞在制备用于治疗二型糖尿病或脂肪肝的药物中的应用。

11.一种用于治疗二型糖尿病或脂肪肝的药物，其特征在于，包括权利要求10所述的骨髓间充质干细胞。