CN114350596B - 一种毛囊外根鞘细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种毛囊外根鞘细胞培养基，以DMEM/F‑12为基础培养基，包含以下含量的组分：人参皂苷40‑60μg/mL、黄芪多糖20‑90μg/mL、表皮生长因子0.1‑6ng/mL、纤维生长因子16‑20ng/mL、氢化可的松0.1‑10μg/mL、转铁蛋白9‑15μg/mL、壳聚糖4‑9μg/mL、烟酰胺1‑7μg/mL。本发明提供的一种毛囊外根鞘细胞培养基，添加的人参皂苷和黄芪多糖具有协同作用，能够显著提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力，表皮生长因子和纤维生长因子的加入可以进一步促进毛囊外根鞘细胞的分裂、繁殖和生长分化。
Description
技术领域
本发明是一种毛囊外根鞘细胞培养基，属于细胞工程技术领域。
背景技术
毛囊是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官。
外根鞘是毛囊结构的重要组成部分，具有高度增生的潜能，因此外根鞘细胞(ORSC)在创面愈合领域具有较高的研究价值。目前毛囊外根鞘细胞的培养较为复杂，再生和分化效率比较低，因此，开发新的技术和方法来提高细胞的再生和分化能力是非常重要的。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种毛囊外根鞘细胞培养基，使毛囊外根鞘细胞具有较高的再生和分化能力。
为了实现上述目的，本发明提供了一种毛囊外根鞘细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
采用上述方案，人参皂苷和黄芪多糖具有协同作用，能够提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力，表皮生长因子和纤维生长因子的加入可以进一步促进毛囊外根鞘细胞的分裂、繁殖和生长分化，氢化可的松能够抗病毒，防止细菌内毒素的损害作用，转铁蛋白、壳聚糖和烟酰胺为毛囊外根鞘细胞提供了营养物质，促使毛囊外根鞘细胞生长。
优选的，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
优选的，还包括自体血清，所述自体血清的体积百分含量为4-6％。
采用上述方案，加入的自体血清不会引入外源蛋白，避免了外源血清存在的安全隐患。
优选的，还包括无机盐，所述无机盐的含量为1-4mg/mL。
优选的，还包括维生素C，所述维生素C的含量为50-56μg/mL。
优选的，还包括氨基酸，所述氨基酸的含量为40-60ng/mL。
优选的，所述氨基酸为非必需氨基酸。
采用上述方案，加入的无机盐、维生素C和氨基酸为细胞再生提供了营养物质。
优选的，还包括羟基乙醇，所述羟基乙醇的含量为15-18mg/mL。
优选的，还包括海藻糖，所述海藻糖的含量为50-200μg/mL。
采用上述方案，加入的海藻多糖能够有效的保持毛囊外根鞘细胞的活性，并且对人体无任何伤害。
优选的，还包括牛垂体提取物、胰岛素、肾上腺素、氯化钙，所述牛垂体提取物的含量为10-50mg/mL、所述胰岛素的含量为2-10μg/mL，所述肾上腺素的含量为0.1-0.6μg/mL，所述氯化钙的含量为10-15μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：培养基中添加的人参皂苷和黄芪多糖具有协同作用，能够显著提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力，表皮生长因子和纤维生长因子的加入可以进一步促进毛囊外根鞘细胞的分裂、繁殖和生长分化，加入的无机盐、维生素C和氨基酸为细胞再生提供了营养物质，从而能够进行体外传代培养，使毛囊外根鞘细胞具有较高的再生和分化能力。
附图说明
图1为采用不同毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的生长曲线图，培养基分别为实施例3、对比例1、对比例3、对比例5和对比例7的毛囊外根鞘细胞培养基。
图2为采用不同毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的生长曲线图，培养基分别为实施例4、对比例2、对比例4、对比例6和对比例7的毛囊外根鞘细胞培养基。
图3为采用实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的细胞形态图，培养时间为第3天。
图4为采用实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的细胞形态图，培养时间为第9天。
图5为图4的局部放大图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种毛囊外根鞘细胞培养基，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
还包括自体血清，自体血清的体积百分含量为4％。
实施例2
一种毛囊外根鞘细胞培养基，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
还包括自体血清，自体血清的体积百分含量为6％。
实施例3
一种毛囊外根鞘细胞培养基，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
还包括自体血清，自体血清的体积百分含量为5％。
实施例4
一种毛囊外根鞘细胞培养基，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
还包括自体血清，自体血清的体积百分含量为6％。
对比例1
具体同实施例3，所不同的是，对比例1中不加入人参皂苷。
对比例2
具体同实施例4，所不同的是，对比例2中不加入人参皂苷。
对比例3
具体同实施例3，所不同的是，对比例3中不加入黄芪多糖。
对比例4
具体同实施例4，所不同的是，对比例4中不加入黄芪多糖。
对比例5
具体同实施例3，所不同的是，对比例5中不加入人参皂苷和黄芪多糖。
对比例6
具体同实施例4，所不同的是，对比例6中不加入人参皂苷和黄芪多糖。
对比例7
以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：5ng/mL表皮生长因子、0.4μg/mL氢化可的松、40mg/mL牛垂体提取物、5μg/mL胰岛素、0.4μg/mL肾上腺素、10μg/mL转铁蛋白、13μg/mL氯化钙。
试验例1人参皂苷和黄芪多糖对毛囊外根鞘细胞的影响
利用实施例1-4、对比例1-7中的培养基对毛囊外根鞘细胞进行培养，培养条件具体为：在37℃、含5％CO2的组织培养箱中对毛囊外根鞘细胞进行培养，每两天更换一次培养基，培养时间为24h、72h、120h，具体实验结果详见表1。
表1利用实施例1-4和对比例1-7的培养基培养毛囊外根鞘细胞的结果
由表1可以看出，实施例3-4的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞24h时，毛囊外根鞘细胞有明显增加，无杂细胞，培养72h时，毛囊外根鞘细胞明显增加，杂细胞数量小于0.1％，培养120h时，毛囊外根鞘细胞持续增加，杂细胞数量小于0.2％；
与实施例3-4相比，对比例1-2的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞24h时，毛囊外根鞘细胞基本没有增加，培养72h和120h时，毛囊外根鞘细胞有少量增加，杂细胞很少，说明对比例1-2中仅加入黄芪多糖用于提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力作用不明显；
与实施例3-4相比，对比例3-4的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞24h和72h时，毛囊外根鞘细胞有少量增加，杂细胞量很少，培养120h时，毛囊外根鞘细胞有明显增加，杂细胞量很少，说明对比例3-4中仅加入人参皂苷用于提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力作用不明显；
与实施例3-4相比，对比例5-6的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞24h时，毛囊外根鞘细胞基本没有增加，培养72h时，毛囊外根鞘细胞有少量增加，无杂细胞，说明实施例3-4中加入的人参皂苷和黄芪多糖具有协同作用，能够明显提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力；
与实施例3-4相比，对比例7的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞24h时，毛囊外根鞘细胞增加，有少量杂细胞，培养72h和120h时，毛囊外根鞘细胞明显增加，杂细胞数量小于0.1％，说明与普通的毛囊外根鞘细胞培养基相比，利用本发明实施例3-4的毛囊外根鞘细胞培养基培养毛囊外根鞘细胞，能够使其具有较高的再生和分化能力。
试验例2不同毛囊外根鞘细胞培养基对毛囊外根鞘细胞生长数量的影响
对毛囊外根鞘细胞进行游离提取，将毛囊外根鞘细胞在无菌条件下分离，然后利用实施例3-4、对比例1-7的培养基分别对分离得到的毛囊外根鞘细胞进行培养，培养时间为14天，毛囊外根鞘细胞的增殖数量如图1-2所示。
由图1-2可以看出，在相同培养时间的情况下，与对比例1、对比例3、对比例5、对比例7相比，实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的数量最多；在相同培养时间的情况下，与对比例2、对比例4、对比例6、对比例7相比，实施例4的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞的数量最多，说明实施例3-4中加入的人参皂苷和黄芪多糖能够明显提高毛囊外根鞘细胞的再生和分化能力；在相同培养时间的情况下，与实施例3-4相比，对比例7的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞数量最少，说明与普通的毛囊外根鞘细胞培养基相比，本发明实施例3-4的毛囊外根鞘细胞培养基使毛囊外根鞘细胞具有较高的再生和分化能力。
图3为采用实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞第3天的细胞形态图，图4为采用实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基培养的毛囊外根鞘细胞第9天的细胞形态图，图5为图4的局部放大图。由图3-图5可以看出，培养至第3天时，毛囊外根鞘细胞的轮廓清晰，数量较少，当培养至第9天时，毛囊外根鞘细胞数量明显增多，且与图3相比，图4和图5更具有典型的纺锥形的毛囊外根鞘细胞形状，说明本发明实施例3的毛囊外根鞘细胞培养基具有更优异的诱导分化能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
2.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，以DMEM/F-12为基础培养基，包含以下含量的组分：
3.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括自体血清，所述自体血清的体积百分含量为4-6％。
4.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括无机盐，所述无机盐的含量为1-4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括维生素C，所述维生素C的含量为50-56μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括氨基酸，所述氨基酸的含量为40-60ng/mL。
7.根据权利要求6所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，所述氨基酸为非必需氨基酸。
8.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括羟基乙醇，所述羟基乙醇的含量为15-18mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括海藻糖，所述海藻糖的含量为50-200μg/mL。
10.根据权利要求1所述的一种毛囊外根鞘细胞培养基，其特征在于，还包括牛垂体提取物、胰岛素、肾上腺素、氯化钙，所述牛垂体提取物的含量为10-50mg/mL、所述胰岛素的含量为2-10μg/mL，所述肾上腺素的含量为0.1-0.6μg/mL，所述氯化钙的含量为10-15μg/mL。
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