CN113215082A - 一种表皮干细胞复苏液及复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表皮干细胞复苏液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸。在复苏液中各成分协同作用，有效提高表皮干细胞的复苏率，尤其是雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷在复苏液中发挥作用，为表皮干细胞的复苏提供稳定的外环境，并对表皮干细胞形成有效刺激，使经液氮超低温保存的细胞快速恢复活性，提高细胞的复苏率，保障经低温冻存的表皮干细胞在科研及临床应用的效果。本发明还提供了一种表皮干细胞的复苏方法，在复苏过程中添加本发明的复苏液，有助于表皮干快速恢复增殖活性，减少细胞凋亡，此后再经常规培养即可收获大量的表皮干细胞。

Description

一种表皮干细胞复苏液及复苏方法

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种表皮干细胞复苏液及复苏方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，也是人体的第一道防线。在抵御微生物入侵、紫外线辐射及防止水分的丢失、调节体温上起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。人体表皮干细胞是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞，可使皮肤再生，由于皮肤表皮干细胞再生周期长，随着年龄的增长，皮肤表皮干细胞数量也在逐渐减少。

表皮干细胞（ESCs）是一类具有无限增殖能力，可增殖分化为表皮中各种功能细胞的细胞群。主要位于表皮基底层，属于成体干细胞，具有很强的分裂增殖能力，以补充衰老脱落的角质细胞。表皮干细胞具有干细胞的特征：未成熟、体积小、细胞器小、克隆形成能力高、细胞周期慢、无限次分裂等。它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器结构和功能完整的基本要求。是皮肤及附属器官发生、修复的基础，也是皮肤创面修复过程中的重要种子细胞，可通过增殖、分化、迁移等方式参与创面修复。表皮干细胞在特定诱导条件下可以诱导分化成皮肤和附属器官，在缺失表皮干细胞的情况下，上皮组织的修复进度将受到明显的影响。

在表皮干细胞的应用中，经常需要将作为种子细胞的表皮干细胞在液氮中进行超低温保存，需要时再将冻存的表皮干细胞自液氮中取出，经复苏后再正常使用，现有的复苏液存在成分有安全隐患，如添加胎牛血清等，经复苏后的细胞存活率低，细胞增殖活性差等问题，导致复苏后的表皮干细胞不能满足科研及临床的使用需求，因此有必要研究一种表皮干细胞的复苏液及复苏方法，来提高表皮干细胞的复苏效率。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种表皮干细胞复苏液，有效提高表皮干细胞的复苏率，提高复苏后细胞的增殖活性。

本发明的目的之二在于提供一种表皮干细胞的复苏方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种表皮干细胞复苏液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸。

进一步地，培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙2.8-3.5μg/mL、雪胆素甲1.5-2ng/mL、Fe₃O₄磁性纳米微球5-10 ng/mL、肌苷3.5-5.5ng/mL、右旋糖酐1.3-2.5μg/mL、谷氨酰胺1-5μg/mL、抗坏血酸5-10μg/mL。

进一步地，培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙3.1μg/mL、雪胆素甲1.8ng/mL、Fe₃O₄磁性纳米微球8ng/mL、肌苷4ng/mL、右旋糖酐2.2μg/mL、谷氨酰胺3μg/mL、抗坏血酸7μg/mL。

进一步地，所述Fe₃O₄磁性纳米微球的粒径为100-200nm。

进一步地，所述培养基为DMEM/F12培养基。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种表皮干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

（1）取出在液氮中冻存的表皮干细胞置于37-40℃的水浴中震荡复温，融化后加入权利要求1至5任一项所述的复苏液，混合均匀后离心，去除上清；

（2）向步骤（1）的表皮干细胞中再次加入复苏液重悬细胞，放入37℃，5%CO₂的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。

进一步地，步骤（2）中复苏液中表皮干细胞的密度为4-9×10⁵个/mL。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种表皮干细胞复苏液，在复苏液中各成分协同作用，有效提高表皮干细胞的复苏率，尤其是雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷在复苏液中发挥作用，为表皮干细胞的复苏提供稳定的外环境，并对表皮干细胞形成有效刺激，使经液氮超低温保存的细胞快速恢复活性，提高细胞的复苏率，经复苏培养24h后的表皮干细胞仍保持较好的增殖活性，保障经低温冻存的表皮干细胞在科研及临床应用的效果。

2、本发明还提供了一种表皮干细胞的复苏方法，在复苏过程中添加本发明的复苏液，并在37℃，5%CO₂的条件下培养24h，该过程细胞几乎不增殖，主要是帮助冻存后的表皮干细胞适应外部环境，快速恢复增殖活性，减少细胞凋亡，此后再经常规培养即可收获大量的表皮干细胞。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

实施例1

一种表皮干细胞复苏液，由DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸；培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙3.1μg/mL、雪胆素甲1.8ng/mL、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球8ng/mL、肌苷4ng/mL、右旋糖酐2.2μg/mL、谷氨酰胺3μg/mL、抗坏血酸7μg/mL。

一种表皮干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

（1）取出在液氮中冻存6个月的P3代表皮干细胞置于37℃的水浴中震荡复温，融化后加入等量复苏液，混合均匀后800rpm离心10min，去除上清；

（2）向步骤（1）的表皮干细胞中再次加入复苏液重悬细胞，复苏液中表皮干细胞的密度为7×10⁵个/mL，放入37℃，5%CO₂的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。

实施例2

一种表皮干细胞复苏液，由DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸；培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙2.8μg/mL、雪胆素甲1.5ng/mL、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球5ng/mL、肌苷3.5ng/mL、右旋糖酐1.3μg/mL、谷氨酰胺1μg/mL、抗坏血酸5μg/mL。

一种表皮干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

（1）取出在液氮中冻存3个月的P3代表皮干细胞置于38℃的水浴中震荡复温，融化后加入等量复苏液，混合均匀后800rpm离心10min，去除上清；

（2）向步骤（1）的表皮干细胞中再次加入复苏液重悬细胞，复苏液中表皮干细胞的密度为4×10⁵个/mL，放入37℃，5%CO₂的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。

实施例3

一种表皮干细胞复苏液，由DMEM/F12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸；培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙3.5μg/mL、雪胆素甲2ng/mL、粒径为100-200nm的Fe₃O₄磁性纳米微球10 ng/mL、肌苷5.5ng/mL、右旋糖酐2.5μg/mL、谷氨酰胺5μg/mL、抗坏血酸10μg/mL。

一种表皮干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

（1）取出在液氮中冻存3个月的P3代表皮干细胞置于40℃的水浴中震荡复温，融化后加入等量复苏液，混合均匀后800rpm离心10min，去除上清；

（2）向步骤（1）的表皮干细胞中再次加入复苏液重悬细胞，复苏液中表皮干细胞的密度为9×10⁵个/mL，放入37℃，5%CO₂的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。

对比例1

对比例1提供一种表皮干细胞复苏液，和实施例1的区别为：省去雪胆素甲，其余均和实施例1相同。

对比例2

对比例2提供一种表皮干细胞复苏液，和实施例1的区别为：省去雪胆素甲，将肌苷的用量调整为5.8ng/mL，其余均和实施例1相同。

对比例3

对比例3提供一种表皮干细胞复苏液，和实施例1的区别为：省去Fe₃O₄磁性纳米微球，其余均和实施例1相同。

对比例4

对比例4提供一种表皮干细胞复苏液，和实施例1的区别为：省去雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球，其余均和实施例1相同。

对比例5

对比例5提供一种表皮干细胞复苏液，和实施例1的区别为：省去肌苷，其余均和实施例1相同。

对比例6

对比例6提供一种表皮干细胞复苏液，该复苏液为DMEM/F12培养基，其余均和实施例1相同。

分别统计实施例1至3和对比例1至6中表皮干细胞的复苏率，复苏率的计算公式如下：复苏率=复苏后活细胞的总数/复苏后细胞总数×100%，采用0.4%台盼蓝染色后用CountStar细胞计数仪对表皮干细胞进行计数。结果如表1所示。

表1

样品	复苏率
		实施例1	75.39%
实施例2	74.14%
		实施例3	73.55%
对比例1	52.72%
		对比例2	50.79%
对比例3	47.03%
		对比例4	39.67%
对比例5	54.26%
		对比例6	30.04%

由表1可以看出，实施例1至3中表皮干细胞的复苏率高于对比例1至5，对比例1至5中调整了复苏液的组成。

对比例1中省去了雪胆素甲，对比例2中在省去雪胆素甲后增加了肌苷的用量，细胞的复苏率均不及实施例1至3，说明雪胆素甲的添加有助于表皮干细胞的复苏，对提高细胞的复苏活性有显著效果。

对比例3中省去了Fe₃O₄磁性纳米微球，对比例4中同时省去了胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球，对比例3的复苏效果要好于对比例4，但是不及实施例1，说明Fe₃O₄磁性纳米微球在细胞的复苏外环境中也发挥重要作用，对避免细胞凋亡，保持细胞活性有帮助。

对比例5中省去了肌苷，表皮干细胞的复苏效果要优于对比例1至4，但是不及实施例1，这是因为肌苷在复苏液中有助于表皮干细胞快速复苏并进入活性增殖状态，对提高细胞的成活率做出贡献。对比例6中在复苏过程中仅添加DMEM/F12培养基，表皮干细胞的复苏率是最低的。

综上，本发明复苏液中的雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷在复苏液中协同作用，为表皮干细胞的复苏提供稳定的外环境，并对表皮干细胞形成有效刺激，使经液氮超低温保存的细胞快速恢复活性，避免细胞凋亡，提高细胞的复苏率。

将实施例1，对比例1至6中复苏后的表皮干细胞离心去除复苏液后加入培养基重悬，培养基为含有以下成分的DMEM/F12培养基：0.5ng/mL的胰岛素、10μg/mL的转铁蛋白、0.1ng/mL的青霉素、5μg/mL的羧甲基壳聚糖。细胞密度为1×10⁴个/mL，分别接种于6孔板中，在37℃，5%CO₂的培养箱中培养3天。分别收集各组细胞，PBS洗涤3次，用预冷的75%乙醇固定，4 ℃过夜，然后再用PBS洗涤3次，制成1×10⁶个/mL的细胞悬液，加入RNA酶至终浓度为0.15 mg/mL，在37 ℃、5%CO2孵箱内孵育30 min，加入50μg/mL碘化丙啶室温避光染色30min，流式细胞仪检测。统计表皮干细胞的增殖指数PI，结果如表2所示。

PI=( S+ G₂ /M ) / ( G₀ /G₁ + S+ G₂ /M ) ×100% （其中G₀/G₁为DNA合成前期、S为DNA合成期、G₂/M为有丝分裂期）。

表2

组别	PI
		实施例1	45.27%
对比例1	29.62%
		对比例2	26.13%
对比例3	24.86%
		对比例4	21.09%
对比例5	34.70%
		对比例6	18.99%

由表2可以看出经相同条件的培养后，实施例1中的表皮干细胞增殖指数更高，说明实施例1中的细胞增殖活性较高。对比例1至6中细胞的增殖指数均有不同程度的下降。

对比例1至6中分别调省去了雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷中一种或者多种，或者直接采用DMEM/F12培养基复苏，经相同的培养过程中表皮干细胞的增殖活性均不及实施例1，说明经本发明复苏液复苏培养24h后的表皮干细胞具有较好的增殖活性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种表皮干细胞复苏液，其特征在于，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：葡萄糖酸钙、雪胆素甲、Fe₃O₄磁性纳米微球、肌苷、右旋糖酐、谷氨酰胺、抗坏血酸。

2.根据权利要求1所述表皮干细胞复苏液，其特征在于，培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙2.8-3.5μg/mL、雪胆素甲1.5-2ng/mL、Fe₃O₄磁性纳米微球5-10 ng/mL、肌苷3.5-5.5ng/mL、右旋糖酐1.3-2.5μg/mL、谷氨酰胺1-5μg/mL、抗坏血酸5-10μg/mL。

3.根据权利要求2所述表皮干细胞复苏液，其特征在于，培养基中各成分的浓度为：葡萄糖酸钙3.1μg/mL、雪胆素甲1.8ng/mL、Fe₃O₄磁性纳米微球8ng/mL、肌苷4ng/mL、右旋糖酐2.2μg/mL、谷氨酰胺3μg/mL、抗坏血酸7μg/mL。

4.根据权利要求1所述表皮干细胞复苏液，其特征在于，所述Fe₃O₄磁性纳米微球的粒径为100-200nm。

5.根据权利要求1所述表皮干细胞复苏液，其特征在于，所述培养基为DMEM/F12培养基。

6.一种表皮干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取出在液氮中冻存的表皮干细胞置于37-40℃的水浴中震荡复温，融化后加入权利要求1至5任一项所述的复苏液，混合均匀后离心，去除上清；

（2）向步骤（1）的表皮干细胞中再次加入复苏液重悬细胞，放入37℃，5%CO₂的培养箱中，培养24h，即完成复苏培养。

7.根据权利要求1所述表皮干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤（2）中复苏液中表皮干细胞的密度为4-9×10⁵个/mL。