CN114027294A - 一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫细胞冻存液，其组分包括：二甲基亚砜0.02‑0.06mg/mL，葫芦素1‑6mg/mL，皂荚多糖0.01‑0.03mL/mL，香菇多糖1‑2mg/mL，聚甘油脂肪酸酯1‑5μg/mL，聚乙二醇0.01‑0.03mg/mL，非必需氨基酸10‑16mg/mL，人血白蛋白12‑20mg/mL。本发明公开了一种免疫细胞冻存方法，将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2‑4×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至‑70℃，冻存10‑15h，然后转入液氮中冻存。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法。
背景技术
生物免疫细胞治疗通过体外培养、增殖、激活，回输体内即可诱导自体抗病毒免疫应答，人体抗病毒免疫一旦被激活就会源源不断产生抗病毒的物质杀灭病毒。有杀伤肿瘤细胞作用的T细胞经激活后在体内大多数变为记忆细胞储存在淋巴组织内，为彻底清除肿瘤细胞和防治转移复发提供了长期保护。
随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，对于患者的治疗相当有利。但细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，需要在冻存前加入冻存保护剂，在溶解后再将其去除。
目前最常用的冻存液为二甲基亚砜，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。但高浓度DMSO具有细胞毒性，还必须添加其他的液体成分，如胎牛血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。
目前现有细胞冻存液中的胎牛血清，含有大量的异种蛋白，既有传染病的危险，又很容易引起过敏反应或者免疫排斥，亟待解决。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种免疫细胞冻存液及免疫细胞冻存方法。
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.02-0.06mg/mL，
葫芦素1-6mg/mL，
皂荚多糖0.01-0.03mL/mL，
香菇多糖1-2mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯1-5μg/mL，
聚乙二醇0.01-0.03mg/mL，
非必需氨基酸10-16mg/mL，
人血白蛋白12-20mg/mL。
优选地，非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。
优选地，二甲基亚砜、聚乙二醇、葫芦素的质量比为3-5：1.5-2.5：2-5。
优选地，皂荚多糖与香菇多糖、聚甘油脂肪酸酯的体积质量比为1.5-2.5mL：130-170mg：200-400μg。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心10-20min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-4×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存10-15h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1-2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，得到复苏免疫细胞。
本发明的技术效果如下所示：
(1)本发明所得免疫细胞冻存液中，发明人采用二甲基亚砜协同聚乙二醇复配，可有效改变细胞膜的通透性，使细胞内的自由水排除细胞外，减少在冻存过程中细胞内形成冰晶对细胞造成损害，但发现细胞存活率明显下降，冻存效果并不如理想猜测，然而通过添加葫芦素，发明人发现可明显提高细胞复苏后活性，促使细胞快速恢复活性，有效提高细胞冻存后的存活率，保持较好的增值能力；
(2)发明人再将聚甘油脂肪酸酯与皂荚多糖、香菇多糖配合，发现三者协同可有效使细胞外环境保持稳定的渗透压，避免脱水后细胞因为局部电解质浓度升高，引起内部空间结构紊乱，所得冻存液对冻存细胞有极好的保护作用，冻存细胞复苏后依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高。
(3)本发明还提供一种免疫细胞冻存方法，不含动物血清，不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，同时易于操作，过程简单，在不含胎牛血清，同时DMSO含量低的前提下，使得复苏细胞存活率依旧可达到95％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性，同时不会对人体过继免疫治疗产生影响，可满足医药等领域对免疫细胞的需求。
附图说明
图1为采用实施例5与对比例1-2所得冻存液将免疫细胞冻存复苏后细胞活性对比图。
图2为采用实施例5与对比例1-2所得冻存液将免疫细胞冻存复苏后CD3+CD56表达率对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.02mg/mL，
葫芦素1mg/mL，
皂荚多糖0.01mL/mL，
香菇多糖1mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯1μg/mL，
聚乙二醇0.01mg/mL，
非必需氨基酸10mg/mL，
人血白蛋白12mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心10min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存10h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2次，得到复苏免疫细胞。
实施例2
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.06mg/mL，
葫芦素6mg/mL，
皂荚多糖0.03mL/mL，
香菇多糖2mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯5μg/mL，
聚乙二醇0.03mg/mL，
非必需氨基酸16mg/mL，
人血白蛋白20mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心20min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为4×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存15h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
实施例3
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.03mg/mL，
葫芦素5mg/mL，
皂荚多糖0.015mL/mL，
香菇多糖1.7mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯2μg/mL，
聚乙二醇0.025mg/mL，
非必需氨基酸12mg/mL，
人血白蛋白18mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心13min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3.5×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存11h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1.8min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
实施例4
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.05mg/mL，
葫芦素2mg/mL，
皂荚多糖0.025mL/mL，
香菇多糖1.3mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯4μg/mL，
聚乙二醇0.015mg/mL，
非必需氨基酸14mg/mL，
人血白蛋白14mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心17min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2.5×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存14h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1.2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
实施例5
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.04mg/mL，
葫芦素3.5mg/mL，
皂荚多糖0.02mL/mL，
香菇多糖1.5mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯3μg/mL，
聚乙二醇0.02mg/mL，
非必需氨基酸13mg/mL，
人血白蛋白16mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心15min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存13h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1.5min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
对比例1
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.04mg/mL，
皂荚多糖0.02mL/mL，
香菇多糖1.5mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯3μg/mL，
聚乙二醇0.02mg/mL，
非必需氨基酸13mg/mL，
人血白蛋白16mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心15min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存13h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1.5min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
对比例2
一种免疫细胞冻存液，其组分包括：
二甲基亚砜0.04mg/mL，
葫芦素3.5mg/mL，
聚乙二醇0.02mg/mL，
非必需氨基酸13mg/mL，
人血白蛋白16mg/mL。
一种免疫细胞冻存方法，包括如下步骤：
S1、取外周血于离心管中，离心15min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞；
S2、将外周血单核细胞与上述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为3×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存13h，然后转入液氮中冻存。
一种免疫细胞复苏方法，包括如下步骤：将上述冻存方法所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1.5min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，得到复苏免疫细胞。
将实施例5和对比例1-2的冻存方法中S2所得细胞悬浮液进行台盼蓝染色计算活性，采用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将余下的细胞悬液加入冻存管中，每管1mL；分为10天、30天、60天三组，每组3管细胞，总共9管细胞；将冻存管放入-70℃冰箱中冻存10-15h，转移至液氮中保存。
将分别在液氮中保存10天、30天、60天的免疫细胞取出，按各组复苏方法执行，将解冻后的CIK细胞进行台盼蓝染色计算活性，同时用流式仪检测CIK的表面标记物CD3与CD56；将复苏后的细胞活性以及表面标记物取平均值与冻存前细胞的数值进行对比。
其结果如图1和图2所示，由图1和图2可知：对比例1不添加葫芦素，细胞冻存后的存活率降低明显，同时无法保证高增殖能力，而对比例2细胞复苏后细胞回收率低，这是局部电解质浓度升高，引起内部空间结构紊乱导致。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其组分包括：
二甲基亚砜0.02-0.06mg/mL，
葫芦素1-6mg/mL，
皂荚多糖0.01-0.03mL/mL，
香菇多糖1-2mg/mL，
聚甘油脂肪酸酯1-5μg/mL，
聚乙二醇0.01-0.03mg/mL，
非必需氨基酸10-16mg/mL，
人血白蛋白12-20mg/mL。
2.根据权利要求1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。
3.根据权利要求1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，二甲基亚砜、聚乙二醇、葫芦素的质量比为3-5：1.5-2.5：2-5。
4.根据权利要求1所述免疫细胞冻存液，其特征在于，皂荚多糖与香菇多糖、聚甘油脂肪酸酯的体积质量比为1.5-2.5mL：130-170mg：200-400μg。
5.一种免疫细胞冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：将外周血单核细胞与如权利要求1-4任一项所述免疫细胞冻存液混合均匀得到细胞悬浮液，细胞悬浮液中细胞的浓度为2-4×107个/mL，移入无菌冻存管然后放入冻存盒中，程序降温至-70℃，冻存10-15h，然后转入液氮中冻存。
6.根据权利要求5所述免疫细胞冻存方法，其特征在于，外周血单核细胞采用如下工艺制取：取外周血于离心管中，离心10-20min，去除上层血浆，下层细胞加入等体积的PBS缓冲液混合均匀，再加入Ficoll分离液使分层清晰，离心后吸取外周血单个核细胞层，加入PBS缓冲液混匀，离心，得到外周血单核细胞。
7.一种免疫细胞复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求5或6所得冻存管取出，置于37℃恒温水浴锅中1-2min，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，采用淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，得到复苏免疫细胞。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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