CN112772639B - 一种牙周膜干细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents

一种牙周膜干细胞冻存液及冻存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基80‑90份、β‑谷甾醇2.5‑5份、肉桂醛0.9‑1.5份、硫代二丙酸二月桂酯0.5‑1.2份、补骨脂酚0.5‑0.8份、表皮细胞生长因子1‑5份。本发明提供的牙周膜干细胞冻存液中不添加DMSO和人血白蛋白，添加β‑谷甾醇和肉桂醛作为冷冻保护剂使用，提高细胞膜的通透性，减少冰晶的形成，冻存液中还添加硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚，维持冻存液的稳定性，使牙周膜干细胞分散且受到周围冻存液的充分浸润，防止细胞在冻存过程中沉淀后堆积成团，并在冻存过程中受到保护，减少损伤，各组分协同作用提高细胞的存活率。本发明还提供了一种牙周膜干细胞的冻存方法，方法简便易于操作，有效降低牙周膜干细胞的冻存成本。

Description

一种牙周膜干细胞冻存液及冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是存在于牙齿牙周组织中的一类可自我更新、增殖能力强及具有多向分化能力的成纤维细胞样干细胞。牙周膜干细胞具有多向分化的潜能，体外可分化为成脂细胞、成骨细胞样细胞、成牙骨质样细胞和神经前体细胞等，体内可分化为成牙骨质样和牙周膜样组织。因此，牙周膜干细胞在临床上应用极为广泛。
牙周膜干细胞的冻存是保证牙周膜干细胞在临床应用的重要手段。由于牙周膜干细胞低温保存的效果直接影响牙周膜干细胞的应用，因此，经低温保存的细胞能否存活并保持其生物学特性尤为重要。细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。冻存液在冻存过程中发挥着重要的保护作用。
现有技术中使用的牙周膜干细胞冻存液多含有二甲基亚砜(DMSO)。DMSO具有较强的穿透细胞的能力，降低细胞的冰点，从而减少冰晶的形成和对牙周膜干细胞造成的损伤，但DMSO具有毒性，与蛋白质疏水基团发生作用，会导致蛋白质变性，从而使冻存的牙周膜干细胞受到损伤，甚至对牙周膜干细胞的存活率造成不利影响，导致冻存效果不佳。
在专利CN107114357A中公开了一种不含DMSO的牙周膜干细胞冻存液，但该冻存液中添加有人血白蛋白，人血白蛋白为人血液制品，因原料来自人血，虽然对原料血浆进行了相关病原体的筛查，并在生产工艺中加入了去除和灭活病毒的措施，但仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风险，临床使用时应较为谨慎。
因此探索一种使用安全，保存时间长，细胞复苏存活率高并且成本低廉的牙周膜干细胞的冻存液对临床牙周膜干细胞的储存、应用具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙周膜干细胞冻存液，不添加DMSO，成分安全明确，经冻存后的牙周膜干细胞仍具有较高的存活率。
本发明的目的之二在于提供一种牙周膜干细胞的冻存方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基80-90份、β-谷甾醇2.5-5份、肉桂醛0.9-1.5份、硫代二丙酸二月桂酯0.5-1.2份、补骨脂酚0.5-0.8份、表皮细胞生长因子1-5份。
进一步地，所述牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基85份、β-谷甾醇4份、肉桂醛1.2份、硫代二丙酸二月桂酯1份、补骨脂酚0.7份、表皮细胞生长因子3份。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞的冻存方法，采用上述冻存液冻存。
进一步地，所述牙周膜干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)制备冻存液；
(2)制备牙周膜干细胞悬液：将收集的牙周膜干细胞加入到步骤(1)制备的冻存液中混合得到细胞悬液，分装在无菌冻存管中；
(3)将步骤(2)的冻存管程序降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冷冻保存。
进一步地，步骤(1)包括以下过程：向DMEM/F12培养基中加入β-谷甾醇、肉桂醛、硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚、表皮细胞生长因子，混合均匀即得。
进一步地，步骤(2)中牙周膜干细胞悬液中细胞密度为1-5×106个/mL。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的牙周膜干细胞冻存液中不添加DMSO和人血白蛋白，添加β-谷甾醇和肉桂醛作为冷冻保护剂使用，提高细胞膜的通透性，减少冰晶的形成，冻存液中还添加硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚，维持冻存液的稳定性，使牙周膜干细胞分散且受到周围冻存液的充分浸润，防止细胞在冻存过程中沉淀后堆积成团，并在冻存过程中受到保护，减少损伤，各组分协同作用提高牙周膜干细胞的存活率，延长细胞的保存时间。
2、本发明还提供了一种牙周膜干细胞的冻存方法，方法简便易于操作，有效降低牙周膜干细胞的冻存成本。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1至3冻存的牙周膜干细胞通过下述过程制备得到：
(1)收集拔除正畸牙青少年患者的2颗上颌前磨牙，保证牙根完整，PBS冲洗后无菌条件下刮下根中三分之一的牙周膜组织，800r/min离心5min，保留沉淀物，加入3g/LⅠ型胶原酶在37℃消化1h，再次离心后取沉淀物；
(2)向步骤(1)的沉淀物中加入含10％PBS的α-MEM培养基，制成混悬液，转移至25T培养瓶中，在37℃，5％CO2的培养箱中培养，每隔3天换液一次，待细胞密度达到80％时，收集细胞进行传代培养，取P5代细胞进行冻存实验。
实施例1
一种牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基85份、β-谷甾醇4份、肉桂醛1.2份、硫代二丙酸二月桂酯1份、补骨脂酚0.7份、表皮细胞生长因子3份。
一种牙周膜干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)制备冻存液：向DMEM/F12培养基中加入β-谷甾醇、肉桂醛、硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚、表皮细胞生长因子，混合均匀即得，保存在4℃备用；
(2)制备牙周膜干细胞悬液：将P5代牙周膜干细胞加入到步骤(1)制备的冻存液中混合得到细胞悬液，悬液中细胞密度为1×106个/mL，分装在无菌冻存管中，每管加入1.5mL细胞悬液；
(3)将步骤(2)的冻存管程序降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冷冻保存。
实施例2
一种牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基80份、β-谷甾醇2.5份、肉桂醛0.9份、硫代二丙酸二月桂酯0.5份、补骨脂酚0.5份、表皮细胞生长因子1份。
一种牙周膜干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)制备冻存液：向DMEM/F12培养基中加入β-谷甾醇、肉桂醛、硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚、表皮细胞生长因子，混合均匀即得，保存在4℃备用；
(2)制备牙周膜干细胞悬液：将P5代牙周膜干细胞加入到步骤(1)制备的冻存液中混合得到细胞悬液，悬液中细胞密度为3×106个/mL，分装在无菌冻存管中，每管加入1.5mL细胞悬液；
(3)将步骤(2)的冻存管程序降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冷冻保存。
实施例3
一种牙周膜干细胞冻存液，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基90份、β-谷甾醇5份、肉桂醛1.5份、硫代二丙酸二月桂酯1.2份、补骨脂酚0.8份、表皮细胞生长因子5份。
一种牙周膜干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
(1)制备冻存液：向DMEM/F12培养基中加入β-谷甾醇、肉桂醛、硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚、表皮细胞生长因子，混合均匀即得，保存在4℃备用；
(2)制备牙周膜干细胞悬液：将P5代牙周膜干细胞加入到步骤(1)制备的冻存液中混合得到细胞悬液，悬液中细胞密度为5×106个/mL，分装在无菌冻存管中，每管加入1.5mL细胞悬液；
(3)将步骤(2)的冻存管程序降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冷冻保存。
对比例1
对比例1提供一种牙周膜干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去β-谷甾醇，将肉桂醛的用量调整为5.2份，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙周膜干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去肉桂醛，将β-谷甾醇的用量调整为5.2份，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙周膜干细胞冻存液，和实施例1的区别为：将β-谷甾醇替换为乙二醇，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙周膜干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去补骨脂酚，将硫代二丙酸二月桂酯的用量调整为1.7份，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙周膜干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去硫代二丙酸二月桂酯，将补骨脂酚的用量调整为1.7份，其余均和实施例1相同。
将实施例1至3，对比例1至5中的牙周膜干细胞在冻存3个月后取出三个冻存管进行复苏，将取出的冻存管放入已预热至37℃的水浴锅中，轻轻震荡使其尽快溶解，观察每组冻存管中的沉淀情况，离心后用PBS冲洗两次去除冻存液，进行细胞计数，计算细胞的存活率，结果取平均值。
表1
Figure GDA0003317815570000061
Figure GDA0003317815570000071
由表1可以看出实施例1至3中的牙周膜干细胞在冻存三个月后，经复苏存活率均在97％以上，经复苏后管底无沉淀。对比例1至5中复苏的细胞存活率有不同程度的下降，管底有沉淀。这是因为在对比例1至5中调整了冻存液的组成。如在对比例1至3中分别省去肉桂醛或者β-谷甾醇中的一种，或者将β-谷甾醇替换为乙二醇，细胞的存活率均不及实施例1至3，这是因为本发明冻存液中的β-谷甾醇和肉桂醛作为冷冻保护剂使用，提高细胞膜的通透性，减少冰晶的形成，减少对细胞的损伤，从而提高复苏后细胞的存活率。对比例4至5中分别省去硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚中一种，经该冻存液保存的细胞在复苏后细胞的存活率和实施例至3相比也有不同程度的下降，沉淀增多，说明冻存液中添加的硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚维持冻存液的稳定性，使牙周膜干细胞分散且受到周围冻存液的充分浸润，防止细胞在冻存过程中沉淀后堆积成团，并在冻存过程中受到保护，减少损伤，各组分协同作用提高牙周膜干细胞的存活率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基80-90份、β-谷甾醇2.5-5份、肉桂醛0.9-1.5份、硫代二丙酸二月桂酯0.5-1.2份、补骨脂酚0.5-0.8份、表皮细胞生长因子1-5份。
2.根据权利要求1所述牙周膜干细胞冻存液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：DMEM/F12培养基85份、β-谷甾醇4份、肉桂醛1.2份、硫代二丙酸二月桂酯1份、补骨脂酚0.7份、表皮细胞生长因子3份。
3.一种牙周膜干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至2任一项所述冻存液冻存。
4.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备冻存液；
（2）制备牙周膜干细胞悬液：将收集的牙周膜干细胞加入到步骤（1）制备的冻存液中混合得到细胞悬液，分装在无菌冻存管中；
（3）将步骤（2）的冻存管程序降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冷冻保存。
5.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤（1）包括以下过程：向DMEM/F12培养基中加入β-谷甾醇、肉桂醛、硫代二丙酸二月桂酯、补骨脂酚、表皮细胞生长因子，混合均匀即得。
6.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤（2）中牙周膜干细胞悬液中细胞密度为1-5×106个/mL。
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