CN101717751A - 人牙周膜干细胞库的构建方法 - Google Patents

Abstract

一种人牙周膜干细胞库的构建方法，本发明包括基本信息采集、牙周膜干细胞获取、牙周膜干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；应用时按照实际需要进行复苏和扩增培养。本发明由废弃的人健康牙齿的牙周膜中获得牙周膜干细胞，利用系统工程，建立有效资源的储备库，储存于库内的人牙周膜干细胞，经短期培养可获得大量富有功能活性的牙周膜干细胞，并能长期保存而不失其活性；与已有技术相比，本发明的构建操作规范，简单容易掌握，安全可行，建库成本低廉，标准化程度高，针对不同年龄段来源的细胞采用不同的冻存液使得复苏后细胞的活性增强，扩大了细胞的来源、增强了细胞的活性。本发明所用的牙齿均为各种原因被拔除废弃的牙齿，大大节约了医疗资源，具有广泛的应用前景。

Description

人牙周膜干细胞库的构建方法

技术领域

本发明属于生物组织材料技术领域，具体涉及人牙周膜干细胞的制备及其细胞库的构建方法。

背景技术

目前，牙周炎已成为危害口腔乃至人体健康的一大疾患，其发病率逐年上升。牙周炎发展最终的直接结果就是牙齿缺失，进而危及全身健康，因此，寻求有效的治疗途径是目前的迫切任务。如何有效地在病变根面上获得新生的牙骨质、牙周膜和牙槽骨，是治疗牙周炎的关键。牙周膜是介于牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。利用克隆筛选并用磁珠分离方法得到具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的牙周膜干细胞，证实了牙周膜中存在一种具有多向分化潜能的干细胞(Byoung-Moo Seo，Masako Miura，StanGronthos，et al，Investigation of multipotent postnatal stem cells from humanperiodontal ligament，Lancet 2004；364：149 55)。对牙周组织发育和牙周损伤后再生机制的研究表明：牙周组织在疾病或受到外界刺激时，通过牙周膜中不同细胞亚群的增殖、分化和定向迁移，能够实现组织的修复再生。

种子细胞来源是进行牙周组织工程的首要问题。近年来，随着对成体干细胞研究的深入，采用成体干细胞作为种子细胞治疗牙周病已成为研究热点，而骨髓基质干细胞、牙周膜细胞、牙周膜干细胞的应用也有报道。Seo的研究显示：只有不同亚群的牙周膜干细胞能分化为成牙骨质细胞样细胞、成骨细胞样细胞以及成纤维细胞样细胞，形成类似天然的牙周膜样结缔组织和牙周膜与牙骨质复合体的结构，实现完全意义上的牙周组织的自我更新，这是区别于其他成体干细胞的重要特征之一。另外，牙周炎已被证实是糖尿病、心脑血管疾病及呼吸系统疾病的危险因素，因此，利用牙周膜干细胞治疗牙周炎对全身性疾病的预防和治疗具有重要的意义。

总之，牙周膜干细胞研究为牙周炎的治疗提供了新思路，而对牙周膜干细胞的研究及临床应用则需要大量的牙周膜干细胞。

干细胞库是在深低温中储存干细胞以及搜集存储干细胞资源相关资料的场所，完善的干细胞库应具备随时随地将健康的干细胞提供于临床使用的能力。目前已成功建立有一些干细胞库(如脐带血干细胞库)，而至今仍无人牙周膜干细胞库。从乳恒牙替换至阻生牙、多生牙及正畸牙齿，大量的牙齿被废弃，其中的牙周膜干细胞资源被白白流失；因此，建立人牙周膜干细胞库，可以为自体及他人提供牙周疾病治疗及牙齿再生的种子细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种人牙周膜干细胞库的构建方法，并提出一种充分利用乳牙、阻生牙、多生牙及正畸牙为来源的人牙周膜干细胞的制备方法；为人牙周膜干细胞库的构建和人牙周膜干细胞的制备提供容易掌握、安全可行、成本低廉的操作规范。

本发明人牙周膜干细胞库的构建方法，有基本信息采集、牙周膜干细胞获取、牙周膜干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；具体包括：

步骤一、采集基本信息：如检索编码、供体姓名、年龄、身份证号码、出生日期、种族、通讯地址、联系方式、常规检查结果以及后续步骤的相关信息；所述的常规检查包括：供体血液的ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等，还可以包括供体三代以内上述项目的检测；

步骤二、获取牙周膜干细胞：(1)将供体新鲜含丰富牙周膜组织的牙齿采用含V/V为5％～20％新生牛血清的DMEM培养液完成转移，在无菌状态下用PBS液冲洗，在所述含新生牛血清的DMEM培养液中刮取牙周膜组织，用PBS液冲洗组织碎块；(2)在1000～2000转/分钟离心3～10分钟，去除上清液，加入5～10倍体积的消化液后，用吸管吹散均匀，置入37℃孵箱中透气孵育10～60分钟；所述的消化液为3～9U/ml胶原酶溶液与相同体积的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；(3)孵育完成后，在悬液中加入所述含新生牛血清的DMEM培养液，吹散组织细胞悬液阻止消化，在800～2000转/分钟离心3～10分钟，弃上清后，加入5～10倍体积的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养，期间1～4天换液一次；(4)细胞培养至7～9天后用3～9U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；再用干细胞标志物(如STRO-1和CD146)对所得到的细胞进行鉴定，然后采用细胞工厂进行扩增培养；

所述的完全培养基是在α-MEM培养液中按体积比加有10～30％的胎牛血清，终浓度为400～600ng/ml的Noggin和终浓度为20～60ng/ml的成纤维细胞生长因子；另外，细胞条件培养基是牙周膜干细胞在完全培养基中培养2～4天后，收集其培养液去除杂质后的液体。

步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将所获得的牙周膜干细胞按2×10⁷～9×10⁷个/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，将冻存管在0～4℃条件下，以0.5～2℃/分钟的速度冷冻至-80～-120℃；再将冻存管转移至-196℃液氮中贮存入库；贮存入库可以按ABO/Rh和HLA分型进行分类保存；

所述的冻存液包括以下四种：①完全培养基中含10％体积的甘油；②完全培养基中含10％体积的二甲基亚砜(DMSO)；③所述冻存液①与同体积细胞条件培养基的混合；④所述冻存液②与同体积细胞条件培养基的混合。其中，①和②适用于乳牙及≤40岁供体的恒牙牙周膜干细胞库的构建；③和④适用于40～60岁供体的牙周膜干细胞库的构建。所述冻存液中的二甲基亚砜和甘油，能够快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点、延缓冷冻过程，同时提高胞内离子浓度，避免液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的细胞损伤。

步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集供体基本信息和相应牙周膜干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，纳入细胞库管理；即完成人牙周膜干细胞库的构建。

本发明所构建人牙周膜干细胞库的应用方法是，按检索编码在细胞库管理中核对相关信息后，将对应的存贮细胞冻存管由液氮中取出，即刻放入37℃～45℃的水浴中，30秒至1分钟内融化，急速融化复苏可防止损害细胞；将所复苏细胞按照实际需要进行扩增培养后即可应用。

本发明的人牙周膜干细胞制备及其细胞库的构建方法，可从废弃的人健康牙齿的牙周膜中获得大量的牙周膜干细胞，利用系统工程，建立有效资源的储备库。本发明储存于库内的人牙周膜干细胞，经短期培养可获得大量(2×10¹⁰～8×10¹⁰)富有功能活性的牙周膜干细胞，并能长期保存而不失其活性。与已有的干细胞库相比，本发明的构建操作规范，简单容易掌握，安全可行，建库成本低廉，标准化程度高，针对不同年龄段来源的细胞采用不同的冻存液使得复苏后细胞的活性增强，扩大了细胞的来源、增强了细胞的活性。此外，本发明所使用的牙齿均为各种原因被拔除废弃的牙齿，大大节约了医疗资源；因此，人牙周膜干细胞库的构建具有广泛的应用前景。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案作进一步说明，但并不受限于下述实例。实例中的操作均在严格无菌环境进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的PBS、o-MEM及DMEM的溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。

实施例1、人智齿牙周膜干细胞的制备及其干细胞库的构建

步骤一、采集基本信息：抽取供体静脉血经过检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安全性后记录，采集供体基本信息包括：检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通讯地址及联系方式等；

步骤二、获取牙周膜干细胞：获取供体阻生智齿两颗置入准备好的含V/V为10％小牛血清的DMEM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用pH7.4的PBS液反复冲洗去除表面残留血液，在含V/V为10％小牛血清的DMEM培养液中刮取牙周膜，用PBS液冲洗组织碎块；把所得到的组织碎块采用1200转/分钟离心5分钟，去除上清液，加入2ml消化液(为6.25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的1U/ml分散酶溶液的混合)后用吸管吹散牙周膜组织碎块，放入37℃、5％CO2条件的孵箱中透气孵育50分钟；孵育完成后，在悬液中加入上述含小牛血清的DMEM培养液5ml，吹散组织细胞悬液阻止其继续消化，1000转/分钟离心5分钟，去除上清，加入4ml的完全培养基重悬细胞(完全培养基是在α-MEM培养液中按体积比加有20％的胎牛血清，终浓度为400ng/ml的Noggin和终浓度为60ng/ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养，12小时后换液，此后每间隔2～4天换液；8天后用3U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；对所获得的牙周膜干细胞进行STRO-1及CD146鉴定检测；然后将牙周膜干细胞接种于细胞工厂中扩增培养；

步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将扩增所得的牙周膜干细胞按4×10⁷个/ml的密度在冻存液(细胞条件培养基与同体积含10％二甲基亚砜的完全培养基的混合)中重悬，分装进冻存管，将冻存管置于4℃环境中，以1℃/分钟的速度冷冻至-120℃，然后将冻存管转移到-196℃液氮罐中贮存入库；按ABO/Rh和HLA分型进行分类保存；

步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙周膜干细胞制备及细胞库构建过程的相关信息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人智齿牙周膜干细胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。

实施例2、人正畸拔除牙牙周膜干细胞的制备及其干细胞库的构建

步骤一、采集基本信息：抽取供体静脉血经过检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安全性后记录，采集供体基本信息包括：检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通讯地址及联系方式等；

步骤二、获取牙周膜干细胞：获取供体因正畸需拔除的尖牙4颗放入准备好的含V/V为15％小牛血清的DMEM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用pH7.4的PBS液反复冲洗去除表面残留血液，在所述含小牛血清的DMEM培养液中刮取根部牙周膜，并使牙周膜组织块成碎块，用PBS液冲洗，采用1200转/分钟离心5分钟，弃上清液，加入2ml消化液(为6.25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的1U/ml的分散酶溶液的混合)后用吸管吹散牙周膜组织碎块，放入37℃、5％CO2条件的孵箱中透气孵育50分钟；孵育完成后，在悬液中加入所述含小牛血清的DMEM培养液3ml，吹散组织细胞悬液阻止其继续消化，1000转/分钟离心5分钟，去除上清，加入4ml的完全培养基重悬细胞(完全培养基是在α-MEM培养液中按体积比加有20％的胎牛血清，终浓度为600ng/ml的Noggin和终浓度为40ng/ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养，12小时后换液，此后每间隔2天换液；7天后用6U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；对所获得的牙周膜干细胞进行STRO-1及CD146鉴定检测；然后将牙周膜干细胞接种于细胞工厂中扩增培养；

步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将扩增所得的牙周膜干细胞按5×10⁷个/ml的密度在冻存液(含10％体积的二甲基亚砜的完全培养基)中重悬，分装进冻存管，将冻存管置于2℃环境中，以1℃/分钟的速度冷冻至-100℃，然后将冻存管转移到-196℃液氮罐中贮存入库；按ABO/Rh和HLA分型进行分类保存；

步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙周膜干细胞制备及细胞库构建过程的相关信息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人牙周膜干细胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。

实施例3、人乳牙牙周膜干细胞的制备及其干细胞库的构建

步骤一、采集基本信息：抽取供体静脉血经过检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、异型肝炎抗原抗体检测、CMV抗体检测及HIV免疫检测等)确定安全性后记录，采集供体基本信息包括：检索编码、姓名、年龄、身份证号、出生日期、种族、通讯地址及联系方式等；

步骤二、获取牙周膜干细胞：获取供体因乳恒牙替换需拔除的乳牙3颗置入准备好的含V/V为10％小牛血清的DMEM培养液的离心管中，用膜封口后转移至无菌超净台，用pH7.4的PBS液反复冲洗去除表面残留血液，在所述含小牛血清的DMEM培养液中刮取牙周膜，并使牙周膜组织块成碎块，用PBS液冲洗；采用1200转/分钟离心4分钟，去除上清液，加入2ml消化液(为4.25U/ml的胶原酶溶液与相同体积的0.4U/ml分散酶溶液的混合)后用吸管吹散牙周膜组织碎块，放入37℃、5％CO₂条件的孵箱中透气孵育40分钟；孵育完成后，在悬液中加入所述含小牛血清的DMEM培养液2ml，吹散组织细胞悬液阻止其继续消化，800转/分钟离心5分钟，去除上清，加入4ml的完全培养基重悬细胞(完全培养基是在α-MEM培养液中按体积比加有20％的胎牛血清，终浓度为500ng/ml的Noggin和终浓度为50ng/ml的成纤维细胞生长因子)，将细胞悬液移入T型培养瓶进行原代培养，12小时后换液，此后每间隔3天换液；7天后用5U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；对所获得的牙周膜干细胞进行STRO-1及CD146鉴定检测；然后将牙周膜干细胞接种于细胞工厂中扩增培养；

步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将扩增所得的牙周膜干细胞按3×10⁷个/ml的密度在冻存液(含10％体积甘油的完全培养基)中重悬，分装进冻存管，将冻存管置于4℃环境中，以1℃/分钟的速度冷冻至-100℃，再将冻存管转移到-196℃液氮罐中贮存入库；按ABO/Rh和HLA分型进行分类保存；

步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息(如检索编码和供体姓名)，将前述所采集供体基本信息和牙周膜干细胞制备及细胞库构建过程的相关信息(如细胞培养液构成及浓度、胰酶及胶原酶浓度及消化时间、细胞接种密度及原代与扩增培养时间、冻存液构成及冻存时间等)录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，确认所有资料及操作准确无误，纳入细胞库管理；即完成人乳牙牙周膜干细胞库的构建。应用时将上述细胞按照实际需要进行复苏和扩增培养。

Claims (4)

1.一种人牙周膜干细胞库的构建方法，其特征在于，有基本信息采集、牙周膜干细胞获取、牙周膜干细胞的冻存、入库以及信息记录与核对的步骤；具体包括：

步骤一、采集基本信息：包括检索编码，供体姓名、年龄、身份证号码、出生日期、种族、通讯地址、联系方式、常规检查结果以及后续步骤的相关信息；

步骤二、获取牙周膜干细胞：①将供体新鲜牙齿组织采用含V/V为5％～20％新生牛血清的DMEM培养液完成转移，在无菌条件下用PBS液冲洗，在所述含小牛血清的DMEM培养液中刮取牙周膜，并使牙周膜组织成碎块用PBS液冲洗；②在1000～2000转/分钟离心3～10分钟，去除上清液，加入5～10倍体积的消化液后，用吸管吹散均匀，置入37℃孵箱中透气孵育10～60分钟；所述的消化液为3～9U/ml胶原酶溶液与相同体积的0.2～5U/ml分散酶溶液的混合；③孵育完成后，在悬液中加入所述含新生牛血清的DMEM培养液，吹散组织细胞悬液阻止消化，在800～2000转/分钟离心3～10分钟，弃上清后，加入5～10倍体积的完全培养基重悬细胞，转入培养瓶中进行原代培养，期间1～4天换液一次；④培养7～9天后用3～9U/ml浓度的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱落后重新接种培养；待细胞长满瓶底80～90％时，采用磁珠分离法分离出牙周膜干细胞；采用干细胞标志物对所得到的细胞进行鉴定，再采用细胞工厂进行扩增培养；

步骤三、牙周膜干细胞冻存、入库：将所获得的牙周膜干细胞按2×10⁷～9×10⁷个/ml的密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，在0～4℃条件下以0.5～2℃/分钟的速度冷冻至-80～-120℃；再将冻存管转移至-196℃液氮中贮存入库；

步骤四、信息记录与核对：在贮存入库的容器载体上建立相关信息，将前述所采集供体基本信息和相应牙周膜干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机信息库；并按检索编码调出相关记录与供体资料进行核实，纳入细胞库管理；即完成人牙周膜干细胞库的构建。

2.根据权利要求1所述的细胞库构建方法，其特征在于，所述的完全培养基是在α-MEM培养液中按体积比加有10～30％的胎牛血清，终浓度为400～600ng/ml的Noggin和终浓度为20～60ng/ml的成纤维细胞生长因子；所述的细胞条件培养基是牙周膜干细胞在完全培养基中培养2～4天后，收集其培养液去除杂质后的液体。

3.根据权利要求1所述的细胞库构建方法，其特征在于，所述的冻存液包括以下四种：①完全培养基中含10％体积的甘油；②完全培养基中含10％体积的二甲基亚砜；③所述冻存液①与同体积细胞条件培养基的混合；④所述冻存液②与同体积细胞条件培养基的混合。

4.根据权利要求1或2所述的细胞库构建方法，其特征在于，在所有使用的PBS、α-MEM及DMEM的溶液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。