CN109998992B - 治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。溶剂可以为富含血小板的脐带血浆或含有人血清白蛋白的注射用PBS。其制备方法为脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个所述脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与溶剂轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。该细胞取自医疗废弃物脐带，具有易分离、增殖速度快、免疫原性低的特性。含5％人血清白蛋白的PBS或富含血小板的脐带血浆重悬脐带动脉旁干细胞后制备成注射悬液，悬液注射后显著改善下肢缺血模型小鼠的血流供应。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种注射液，尤其涉及一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法。
背景技术
下肢缺血性疾病是一种常见的外周动脉疾病，是指由各种原因导致的下肢动脉狭窄或闭塞、血流灌注不足，从而导致下肢出现间歇性跛行、溃疡、坏疽等缺血表现的一类疾病。目前下肢缺血性疾病的治疗尚未有有效的治疗和控制方法，不足以在广泛的缺血缺氧区域内诱导足够的新生血管的构建。寻找优质的干细胞移植改善缺血下肢的血流灌注是亟待解决的重要问题。
目前，人脐带间充质干细胞的研究方面尚有缺陷。主要包括：(1)目前临床应用的主要是脐带华通氏胶间充质干细胞/脐带干细胞混合物，特性不明确，细胞表面CD146表达量低，其血管生成能力较弱。(2)下肢缺血性疾病患者的康复有赖于充分的血供重建，人脐带华通氏胶间充质干细胞在下肢缺血性疾病中的应用疗效不佳。
发明内容
本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，溶剂为富含血小板的脐带血浆。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。其中，5×106/mL指，1mL溶剂中悬浮5×106个脐带动脉旁干细胞。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，溶剂为含人血清白蛋白的注射用PBS。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL，人血清白蛋白的含量为PBS体积的5％。
本发明还提供上述治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与富含血小板的脐带血浆轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，脐带动脉旁干细胞的制备过程为：足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方向剪碎至1-2mm3大小组织块，组织块均匀铺于100mm细胞培养皿底，放置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内3h；然后缓慢加入5ml DMEM-LG培养基至100mm皿中，轻放置于培养箱中培养；第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培养基3ml、2ml，之后第二周半量换液2次，之后第三周全量换液2次，期间观察组织块周围贴壁细胞爬出情况；3周后细胞长到80％融合时去除脐带动脉组织块，0.05％胰酶消化，传代培养；取P3-P5代细胞用于注射悬液制备。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，富含血小板的脐带血浆的制备方法为：在50mL离心管中加入750IU肝素钠收集脐带血40mL；在室温下200g低速离心10-15min，收集上层液体；对该上层液体再次2000g高速离心10min，血小板沉积离心管底部，弃去部分上清血浆，留200uL血浆及底部沉积的血小板，轻轻重悬获得富含血小板的脐带血浆(PRP)。
进一步，本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，获得的脐带动脉旁干细胞的单细胞悬液，使用不含钙、镁的PBS洗涤2次，然后细胞沉淀采用富含血小板的脐带血浆加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
本发明还提供上述治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤两次，然后细胞沉淀采用含有5％人血清白蛋白的PBS加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液及其制备方法，脐带动脉旁干细胞不需要借助生长因子，能够体内自发形成类似于血管或脉管系统的芽样或管样结构，同时可以促进血管内皮细胞在体内形成血管样结构。此外，富含血小板脐带血浆(PRP)中存在多种血管生成因子，参与新生血管的生成；PRP中还含有众多能促进干细胞增殖、分化、迁移、黏附的细胞因子和蛋白质。脐带动脉旁干细胞与富含血小板脐带血浆协同作用，效果显著。重悬于富含血小板的脐带血浆的人脐带动脉旁干细胞注射液移植治疗下肢缺血模型小鼠，其缺血下肢血流供应显著改善。
附图说明
图1a为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色图；
图1b为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色量化统计图；
图1c为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的mCD31免疫组化染色；
图1d为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的mCD31免疫组化染色量化统计图；
图2a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色；
图2b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色量化统计图；
图3a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的多普勒超声血流图；
图3b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的血流量化。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和富含血小板的脐带血浆。其中，脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。
治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法为：脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤2次，然后细胞沉淀采用富含血小板的脐带血浆加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液。脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
其中，脐带动脉旁干细胞的制备过程为：足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方向剪碎至1-2mm3大小组织块，组织块均匀铺于100mm细胞培养皿底，放置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内3h；然后缓慢加入5ml DMEM-LG培养基至100mm皿中，轻放置于培养箱中培养；第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培养基3ml、2ml，之后第二周半量换液2次，之后第三周全量换液2次，期间观察组织块周围贴壁细胞爬出情况；3周后细胞长到80％融合时去除脐带动脉组织块，0.05％胰酶消化，传代培养；取P3-P5代细胞用于注射悬液制备。
其中，富含血小板的脐带血浆的制备方法为：在50mL离心管中加入750IU肝素钠收集脐带血40mL；在室温下200g低速离心10-15min，收集上层液体；对该上层液体再次2000g高速离心10min，血小板沉积离心管底部，弃去部分上清血浆，留200uL血浆及底部沉积的血小板，轻轻重悬获得富含血小板的脐带血浆(PRP)。
治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的应用方法为：注射用。具体的，于腓肠肌内多点注射。
对脐带动脉旁干细胞进行体内基质胶塞实验：
1、BALB/C免疫缺陷鼠随机分组
各窝小鼠共20只按初始体重大小排序，由计算机随机产生20个两位数随机数字，大小排序与体重相对应，随机分组、产生5组，每组4只，分组后统计各组体重均数间无统计学差异。按饲养密度要求每组4只分笼饲养。标记组号、笼号并用苦昧酸标记每笼动物序号。将小鼠分组后适应环境饲养1周，观察小鼠生活状态，体重变化；1周后各组小鼠体重增长满意，外观健康活跃，温顺无激惹，体重平均20-30g，达7-9周龄，每组平均体重无显著性差异。符合入选实验标准，进入实验。
2、体内成血管模型的建立
小鼠麻醉后于腹侧沿腹股沟下方皮下注入细胞混悬液，分成4组，分别为：①脐带动脉旁干细胞组：200μl Matrigel基质胶+50μl PBS内含7.5×105个脐带动脉旁干细胞；②脐带华通氏胶干细胞组：200μl Matrigel基质胶+50μl PBS内含7.5×105个脐带华通氏胶干细胞；③阴性对照组：200μl Matrigel基质胶+50μl PBS；④阳性对照组：200μl Matrigel基质胶+50μl PBS内含bFGF 37.5ng。
3、冰冻切片免疫荧光染色
14d后处死小鼠，取出各组皮下的matrigel plugs。将组织块平放于软塑小盒内(直径约2cm)，可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时保持小盒原位。切勿进入液氮中，约10-20s组织冰结成块。制成冻块后即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。恒温切片机(Leica)刀室设置为-25℃、机室设置为-20℃。抗卷板的位置及角度放置适当位置，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
切片室温放置30min后，放至4℃丙酮固定5-10min。PBS洗5min×3次。冰冻切片室温晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时。滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(mCD31，Abcam；hCD31，BD；vWF，Abcam)，均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸。将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。滴加用PBS稀释好的二抗Alexa Fluor488-conjugated goatanti-rabbit IgG(1:200,Invitrogen)/Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit IgG(1:200,Invitrogen)(避光)置于烘箱中37℃孵育1小时。切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。滴加DAPI工作液染核，室温10-20min(工作浓度0.1％染色15min)。回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，采用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
图1a为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色图，图1b为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的vWF、mCD31、hCD31免疫荧光染色量化统计图，图1c为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的mCD31免疫组化染色，图1d为人脐带动脉旁干细胞与华通氏胶间充质干细胞组matrigel plugs的mCD31免疫组化染色量化统计图。
关于人脐带动脉旁干细胞、脐带华通氏胶干细胞体内自成环及促成环能力的比较，如图1a、1b和1c所示，vWF、mCD31、hCD31免疫荧光结果显示人脐带动脉旁干细胞复合Matrigel基质胶移植至免疫缺陷小鼠腹股沟皮下后，胶块内新生血管数多于华通氏胶间充质干细胞，如图1d所示，数据量化结果显示其每高倍镜荧光强度亦显著高于人脐带华通氏胶间充质干细胞组(1D)。提示人脐带动脉旁干细胞体内自成血管及促小鼠内皮细胞成血管能力显著优于华通氏胶间充质干细胞。
对治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液进行小鼠的下肢缺血模型实验：
1、实验动物
BALB/C裸鼠雄鼠为6-8周，饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验中心IVC动物房，室温22℃，采用12小时明/暗光照周期(06:00-18:00)，自由饮水和进食。
2、模型构建
用托盘称对小鼠称重以后，按照0.3ml/kg的1％水合氯醛腹腔注射麻醉。小鼠被麻醉后，置仰卧位，用橡皮筋将小鼠固定于手术板上。常规备皮，碘伏消毒，铺无菌洞巾。使用眼科镊轻轻提起皮肤，从腹股沟到大腿内侧沿着血管走向用眼科剪剪开一纵形切口，长约5mm。在20倍的解剖显微镜视野下使用尖镊轻轻地刺破膜状血管鞘，暴露股动脉、静脉及其分支。用7号线结扎股总动脉远端及其各分支。
3、实验分组
裸鼠建模完毕后四周，随机分为三组：PBS组，含有脐带华通氏胶干细胞的PRP组(脐带华通氏胶干细胞注射液)，含有脐带动脉旁干细胞的PRP组(脐带动脉旁干细胞注射液)，假手术组作为对照。随机选取缺血下肢腓肠肌5个点，PBS组注射PBS 100μl；含有脐带华通氏胶干细胞的PRP组注射混有5×106脐带华通氏胶干细胞的PRP悬液100μl；含有脐带动脉旁干细胞的PRP组注射混有5×106脐带动脉旁干细胞的PRP悬液100μl。裸鼠手术完毕后饲养在IVC动物房中。
4、免疫组化微血管密度计数
裸鼠缺血下肢腓肠肌肌肉组织，4％多聚甲醛固定。裸鼠缺血下肢以5μm厚度连续切片，每5张切片选1张行HE染色。1张切片行免疫组化染色。每张切片随机选取5个高倍镜视野(100×)计数，被CD31抗体染成棕色的血管数目，任何染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇均为一个血管计数。管腔>8个红细胞，具有较厚肌层的血管不计数。
5、激光多普勒检测血流变化
小鼠麻醉成功后，俯卧位于激光多普勒仪专用灰色软垫上，使用双面胶固定其双足使其足底面朝上且左右对称，在小鼠正上方调整扫描探头的位置，距小鼠大约15cm，激光多普勒仪检测血流指数。
图2a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色。图2b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液、PBS移植组缺血腓肠肌的mCD31免疫组化染色量化统计图(每高倍镜视野下血管环数&每高倍镜视野下血管环数/肌纤维数)。
关于人脐带动脉旁干细胞注射液、脐带华通氏胶干细胞注射液移植后小鼠腓肠肌新生血管数量的比较，如图2a所示，mCD31免疫组化结果显示人脐带动脉旁干细胞注射液组的缺血下肢新生血管数目多于脐带华通氏胶注射液组和PBS组，如图2b所示，数据量化结果显示其每高倍镜视野下血管环数和每高倍镜视野下血管环数/肌纤维数显著高于脐带华通氏胶间充质干细胞注射液组，提示人脐带动脉旁干细胞PRP注射液显著改善小鼠缺血下肢的血管新生。
图3a为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的多普勒超声血流图。图3b为人脐带华通氏胶间充质干细胞注射液、动脉旁干细胞注射液移植组小鼠缺血下肢的血流量化。
关于人脐带动脉旁干细胞注射液、脐带华通氏胶干细胞注射液移植后小鼠腓肠肌血流量的比较，如图3a和3b所示，超声多普勒血流图及数据量化结果显示人脐带动脉旁干细胞注射液组的缺血下肢血流丰度显著高于脐带华通氏胶注射液组和PBS组，提示人脐带动脉旁干细胞注射液改善小鼠缺血下肢血供能力显著优于华通氏胶间充质干细胞注射液。
实施例2
一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，包括悬浮的脐带动脉旁干细胞、含人血清白蛋白的注射用PBS。其中，所述脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL，人血清白蛋白的含量为PBS体积的5％。
治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法为：脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤两次，然后细胞沉淀采用含有5％人血清白蛋白的PBS加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
Claims (10)
1.一种治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
包括悬浮的脐带动脉旁干细胞和溶剂。
2.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述溶剂为富含血小板的脐带血浆。
3.根据权利要求2所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL。
4.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述溶剂为含有人血清白蛋白的注射用PBS。
5.根据权利要求4所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述脐带动脉旁干细胞的含量为5×106/mL；
人血清白蛋白的含量为PBS体积的5％。
6.如权利要求2所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，其特征在于：
脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个所述脐带动脉旁干细胞，经PBS洗涤两次后，再与所述富含血小板的脐带血浆轻轻混匀，获得脐带动脉旁干细胞注射液。
7.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述脐带动脉旁干细胞的制备过程为：
足月生产后取新鲜人脐带7-15cm，4h内用含有10％青链双抗和1％肝素的PBS冰上4℃运至实验室；
在超净工作台内取出脐带，挤出脐带中的血，PBS反复冲洗直至无血液和血块后，剪刀修齐两断面，沿脐带内血管长轴方向剪开脐带，用镊子钝性分离脐带动脉；
将脐带动脉沿与脐带动脉垂直方向剪碎至1-2mm3大小组织块，组织块均匀铺于100mm细胞培养皿底，放置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内3h；
然后缓慢加入5ml DMEM-LG培养基至100mm皿中，轻放置于培养箱中培养；
第一周第3天和第7天各加DMEM-LG培养基3ml、2ml，之后第二周半量换液2次，之后第三周全量换液2次，期间观察组织块周围贴壁细胞爬出情况；
3周后细胞长到80％融合时去除脐带动脉组织块，0.05％胰酶消化，传代培养；
取P3-P5代细胞用于注射悬液制备。
8.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，所述富含血小板的脐带血浆的制备方法为：
在50mL离心管中加入750IU肝素钠收集脐带血40mL；
在室温下200g低速离心10-15min，收集上层液体；
对所述上层液体再次2000g高速离心10min，血小板沉积离心管底部，弃去部分上清血浆，留200uL血浆及底部沉积的血小板，轻轻重悬获得富含血小板的脐带血浆。
9.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液，其特征在于：
其中，获得的脐带动脉旁干细胞的单细胞悬液，使用不含钙、镁的PBS洗涤2次，然后细胞沉淀采用所述富含血小板的脐带血浆加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；
所述脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
10.如权利要求4所述的治疗缺血性疾病的脐带动脉旁干细胞注射液的制备方法，其特征在于：
脐带动脉组织培养后衍生出动脉旁干细胞，酶解法消化获得单个所述脐带动脉旁干细胞，使用不含钙、镁的PBS洗涤两次，然后细胞沉淀采用含有5％人血清白蛋白的PBS加以重悬，轻轻混匀制成脐带动脉旁干细胞注射液；
所述脐带动脉旁干细胞注射液放于4℃短暂储存，12h内使用，使用前轻轻摇匀。
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