CN117916379A - 用于生物分子的稳定表达及递送的质粒平台 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的质粒平台包含编码已去除溶酶体相关膜蛋白‑2B(LAMP‑2B，Lysosome‑Associated Membrane Glycoprotein 2B)的胞内结构域(intracellular domain)、胞外结构域(extracellular domain)或它们的组合的修饰蛋白的核酸序列，本发明基于如下发现：当去除溶酶体相关膜蛋白‑2B的特定结构域时，显著稳定待表达的生物分子的表达，并显著提高待递送的生物分子的递送效率。该质粒平台有望在未来靶蛋白的表达和递送，尤其是利用外泌体的表达和递送方面提供高技术实用性，并且可以扩展到与此相关的各种技术领域或用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生物分子的稳定表达及递送的质粒平台。
背景技术
已知外泌体在晚期内体的出芽(budding)中产生，并在释放到细胞外空间之前与原生质膜融合。外泌体是由富含磷酸胆碱、胆固醇及神经酰胺的脂质双层膜组成的40～200nm尺寸的囊泡，几乎由所有类型的细胞分泌，稳定存在于血液、淋巴液及汗液等所有类型的体液中。并且，外泌体由于体积小、负电荷弱，因而具有在体内循环时间长、到达器官内部的优点。外泌体还可以递送亲水性或疏水性药物，避免吞噬作用(phagocytosis)，并且可以穿过血管内皮到达靶细胞。已知外泌体由于其特定的表面蛋白如四跨膜蛋白质(tetraspanin)而对特定细胞具有靶向作用。据报道，外泌体的封装可以提高姜黄素(curcumin)在体外(in vitro)及体内(in vivo)的稳定性和生物利用度，并增加抗炎活性，并且在其他研究中，据报道，外泌体可以将阿霉素穿过血-脑屏障递送到大脑，将siRNA递送至细胞，并有效降低作为癌症治疗的强大靶标的RAD51蛋白的水平。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的在于，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的质粒平台，其包含编码已去除LAMP-2B(溶酶体相关膜蛋白-2B，Lysosome-Associated MembraneGlycoprotein 2B)的胞内结构域(intracellular domain)、胞外结构域(extracellulardomain)或它们的组合的修饰蛋白的核酸序列。
本发明的一个目的在于，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的重组质粒，其还包含编码以在上述质粒平台内表达及递送为目的的生物分子的序列。
本发明的一个目的在于，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的外泌体，其包含上述重组质粒。
本发明的一个目的在于，提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含上述外泌体，上述生物分子为与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的肽。
本发明所要解决的技术问题并不限于上述技术问题，本领域技术人员可以从以下记载中明确理解未提及的其他技术问题。
解决问题的方案
在本发明的一方面，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的质粒平台，其包含编码已去除LAMP-2B的胞内结构域、胞外结构域或它们的组合的修饰蛋白的核酸序列。
上述质粒平台基于如下发现：当去除已知的LAMP-2B的胞内、胞外或这两者时，待与LAMP-2B一起在细胞的内部或外部表达的靶蛋白的表达稳定性显著提高，并且向靶细胞的递送性也显著提高。
上述LAMP-2B可以指已知的氨基酸序列、编码它的核酸序列，为了加载到质粒平台内，可以指核酸序列。根据具体的一实施例，可以是登录号(accession number)为NM_013995.2的序列，但不特别限定于此。
上述胞内结构域和胞外结构域可以分别指当LAMP-2B在细胞上表达时在细胞的磷脂双层内部表达的区域和在外部表达的区域。考虑到LAMP-2B在外泌体上表达的情况，优选地，胞内结构域可以指在外泌体的磷脂双层内部表达的区域，胞外结构域可以指在外泌体的磷脂双层外部表达的区域。
上述修饰蛋白的特征是LAMP-2B的胞内结构域、胞外结构域或它们的组合已被去除，为了稳定在细胞外部区域(或磷脂双层外部区域)待表达的生物分子(或靶蛋白)的表达、在细胞内部区域(或磷脂双层内部区域)待表达的生物分子(或活性蛋白)的表达，优选地，可以去除胞内结构域。从这种意义上来讲，上述质粒平台可以包含编码已去除LAMP-2B的胞内结构域的蛋白质的核酸序列。
并且，为了稳定在上述细胞外部区域待表达的生物分子和在上述细胞内部区域待表达的生物分子的表达，同时将生物分子稳定地递送至靶细胞中，优选地，上述修饰蛋白的胞内结构域和胞外结构域可以均被去除。从这种意义上来讲，上述质粒平台的LAMP-2B的胞内结构域和胞外结构域可以均被去除。
根据一实施例，上述核酸序列可以具有序列编号2至4中任一个核酸序列，为了稳定在上述细胞内部区域待表达的生物分子的表达，优选地，可以具有序列编号2或4的核酸序列，为了稳定在上述细胞内部区域待表达的生物分子的表达的同时将生物分子稳定地递送至靶细胞中，更优选地，可以具有序列编号4的核酸序列。
上述质粒平台还可以包含编码糖基化区域的核酸序列，其目的可以是通过加载到上述质粒平台上来稳定待表达的生物分子的表达和递送，更具体地，其目的可以是稳定所有生物分子在上述细胞内部区域和细胞外部区域中的表达和递送，但不特别限定于此。
上述糖基化区域可以自由地使用作为将糖基化导入蛋白质表达结构的手段而公知的手段来导入，就应用于上述质粒平台而言，可以是将编码糖基化区域的核酸序列包含在质粒平台内的形式。例如，可以选择选自由在上述质粒平台内包含编码GNSTM(糖基化序列)基序的核酸序列的方法；包含编码可诱导N联糖基化(N-linked glycosylation)的氨基酸特异性序列NXS(X可以是除脯氨酸(proline)之外的所有氨基酸序列)、NXT(X可以是除脯氨酸之外的所有氨基酸序列)、NXC(X可以是除脯氨酸之外的所有氨基酸序列)的序列的方法；还包含在上述N-糖基化氨基酸序列的C-末端(terminal)位点编码1～5个氨基酸的序列的方法；在上述N-糖基化氨基酸序列的C-末端位点中包含1～5个氨基酸的序列的N-末端位点包含编码甘氨酸(Glycine)的序列的方法；在四跨膜蛋白中包含编码N联糖基化基序(CD9SEL：小细胞外环结构域(Small Extracellular Loop Domain)，CD63 LEL：大细胞外环结构域(Large Extracellular Loop Domain)等)的序列的方法；以及包含作为诱导O-糖基化(glycosylation)的氨基酸序列的丝氨酸(Serine)或苏氨酸(Threonine)的方法组成的组中的至少一种方法，就同时最大化生物分子的稳定表达和递送效率而言，优选地，可以选择在上述质粒平台内包含编码GNSTM基序的核酸序列的方法来导入，但不特别限定于此。
上述编码糖基化区域的核酸序列的包含位置没有特别限制，只要是其能够包含在上述质粒平台内的方法即可，例如，包含位置能够以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞外区域(或磷脂双层的外部区域)方向。作为更具体的例子，编码生物分子(或靶蛋白)的序列可以位于上述编码修饰蛋白的核酸序列的胞外区域方向，上述编码糖基化区域的核酸序列可以位于上述编码生物分子的序列的上游(或胞外区域方向)或下游(或胞内区域方向)，但不特别限定于此。根据一个优选实施例，上述编码糖基化区域的核酸序列以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准，可以位于胞外区域方向。
上述编码糖基化区域的核酸序列可以包含序列编号11至13中任一个核酸序列，就同时最大化生物分子的稳定表达和递送效率而言，优选地，可以包含序列编号11的核酸序列。
上述质粒平台的编码序列可以被配置为包含上述糖基化区域的同时具有上述修饰蛋白形式，对每一个的具体描述如上所述。根据一个优选实施例，上述质粒平台可以同时包含编码GNSTM基序的序列以及编码已去除LAMP-2B的胞外结构域和胞内结构域的修饰蛋白的序列。作为更具体的例子，可以包含上述编码GNSTM基序的序列，使其位于编码上述修饰蛋白的序列的上游(或胞外区域方向)。作为进一步的例子，上述质粒平台可以包含序列编号4的核酸序列以及序列编号11的核酸序列。
作为本发明的一方面，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的重组质粒，其还包含编码以在上述质粒平台内表达及递送为目的的生物分子的核酸序列。
上述编码生物分子的核酸序列的位置没有特别限制，只要是能够位于上述质粒平台内并成功表达靶生物分子的位置即可，具体地，例如可以位于i)上述编码糖基化区域的核酸序列与上述编码修饰蛋白的核酸序列之间，或者ii)以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞内区域方向，或者iii)位于上述两者中。
当作为上述编码生物分子的核酸序列以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞外方向时，其目的可以是在胞外(或磷脂双层外部区域)表达或递送生物分子，当以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞内方向时，其目的可以是在胞内(或磷脂双层内部区域)表达或递送生物分子，但不特别限定于此。
上述生物分子没有特别限制，只要是利用上述质粒平台待表达的生物分子即可，具体地，例如可以是选自由核酸分子(nucleic acid molecules)、适体(aptamer)、肽(peptides)、蛋白质(protein)、糖蛋白(glycoproteins)、脂蛋白(lipoproteins)、免疫球蛋白(immunoglobulins)、激素(hormone)、生长因子(growth factor)、重组酶(recombinase)及荧光蛋白(fluorescent protein)组成的组中的至少一种。
作为本发明的一方面，提供一种用于生物分子的稳定表达及递送的外泌体，其包含由上述重组质粒表达的产物。
上述外泌体包含由上述重组质粒表达的修饰蛋白和生物分子，上述生物分子可以通过位于外泌体的内部、外部或这两者中来稳定地表达，并且可以递送至靶细胞。
上述生物分子可能包含在外泌体的外部表达并特异性结合至靶细胞表面的物质，在此情况下，外泌体对靶细胞的靶向性增加，可以有效递送表达的生物分子，并且可通过检测表达的生物分子来辨别是否存在靶细胞，除此之外，外泌体可以不受特别限制地用于基于靶向靶细胞的公知的各种用途。作为具体例，当在外泌体的外部表达能够与在特定病毒感染细胞或癌细胞表面特异性表达的物质特异性结合的生物分子时，上述外泌体可以特异性结合至特定病毒感染细胞或癌细胞，利用这种原理判断特定病毒是否感染或是否存在癌细胞，同时可以将外泌体内包含的生物分子递送至病毒感染细胞或癌细胞内。
作为本发明的一方面，提供一种用于诊断癌症的组合物，其包含上述外泌体，上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质。
并且，作为本发明的一方面，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述外泌体，上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质以及待递送至癌细胞内的治疗物质。
上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质，可以包含在上述外泌体的双层外部区域表达的物质。在此情况下，由于在上述外部区域表达的生物分子特异性结合至癌细胞表面，外泌体靶向癌细胞，从而可用于基于这种靶向的癌症诊断用途。
并且，上述生物分子可以包含待递送至癌细胞内的治疗物质，这种治疗物质可以包含在上述外泌体的双层内部区域表达的物质。在此情况下，上述外泌体可以通过与癌细胞相互作用(例如，表面受体相互作用(surface receptor interaction)、膜融合(membrane fusion)、受体介导的内吞作用(receptor-mediated endocytosis)、吞噬作用(phagocytosis)或微胞饮作用(micropinocytosis)等)将上述治疗物质递送至癌细胞内，由此可以实现癌症预防或治疗效果。
上述癌症可以是选自如下中的任一种：包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌及包括鳞状细胞癌的皮肤癌的癌症；包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯克特淋巴瘤的淋巴造血干肿瘤；包括急性和慢性粒细胞白血病和早幼粒细胞白血病的骨髓型造血肿瘤；包括纤维肉瘤和横纹肌瘤的间叶源性肿瘤；包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤的其他肿瘤；包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤的中枢和周围神经系统肿瘤；包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤的间叶源性肿瘤；以及包括黑色素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌的其他肿瘤。根据一个优选实施例，可以是卵巢癌，但不限于此。
本发明的组合物还可以包含药学上可接受的载体，并且可以与载体一起配制。在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指不刺激活生物体并且不抑制所施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。配制为液体溶液的组合物中可接受的药物载体是无菌且生物相容的，可以将生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及这些成分中的一种以上成分混合使用，并且根据需要，可以添加其他常见的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。并且，可以另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂来配制可注射制剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂，例如水溶液、混悬液、乳液等。
本发明的组合物能够以含有本发明的外泌体作为有效成分的任何制剂来应用，并且可以制备成口服或肠胃外制剂。本发明的药物制剂包括适于口服(oral)、直肠(rectal)、鼻(nasal)、局部(topical；包括面颊和舌下)、皮下、阴道(vaginal)或肠胃外(parenteral；包括肌内、皮下及静脉内)施用的形式或适于通过吸入(inhalation)或注入(insufflation)施用的形式。
本发明的组合物以药学有效量施用。有效剂量水平可以取决于包括患者疾病的类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及排泄率、治疗持续时间、同时使用的药物在内的因素及其他医学领域已知的因素。本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂联合施用，可以与常规治疗剂依次或同时施用，并且可以单次或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用能够以最小量达到最大效果且没有副作用的量，这可以由本领域技术人员容易地确定。
本发明的组合物的剂量范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而有很大变化，适当的剂量可以根据例如患者体内累积的药物量和/或所使用的本发明的递送载体的具体功效而变化。一般情况下，可以基于在体内动物模型和体外测得有效的EC50来计算，例如可以是每公斤体重0.01μg至1g，可以分次剂量施用，例如每日、每周、每月或每年单位，每个单位周期一次或数次，或者可以使用输液泵连续施用很长一段时间。重复施用次数是考虑到药物的体内停留的时间、体内药物浓度等来确定的。根据疾病治疗的过程，即使在治疗后也可以施用组合物以防止复发。
本发明的组合物还可以包含在癌症治疗方面表现出相同或相似功能的一种以上有效成分，或者维持/增加有效成分的溶解性和/或吸收性的化合物。并且，任选地，还可以包含化疗剂、抗炎剂、抗病毒剂和/或免疫调节剂等。
并且，本发明的组合物可以使用本领域已知的方法配制，以在施用于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。制剂可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软或硬明胶胶囊、无菌注射溶液或无菌粉末的形式。
本发明中描述的所有核酸序列都可以进行一定程度的修饰。本领域技术人员可以容易理解，通过这种人工修饰保持70％以上同源性的核酸序列与源自本发明的核酸序列是等同的，只要其具有本发明所期望的活性即可。
上述术语“同源性”是指表示与上述提供的核酸序列相同的程度，同源性的比较可以用肉眼或使用容易购买的比较程序来进行，两个以上序列之间的同源性能够以百分比(％)来计算。包含与本发明中提供的核酸序列具有优选为70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、最优选为95％以上同源性的核酸序列。
在本发明中，术语“质粒”是指含有必备调控元件例如启动子的基因构建体，以使得靶基因能够在合适的宿主中表达，也可以是整合到宿主细胞或微生物的基因组中的形式。
在本发明中，“可操作地连接(operably linked)”是指启动子或其变体核酸序列与编码目的蛋白质的核酸序列之间的功能性连接以执行一般功能。与质粒的操作性连接可以使用本领域熟知的基因重组技术进行，位点-特异性DNA(脱氧核糖核酸)切割及连接可以使用本领域通常已知的酶等进行。
在本发明中，“调控元件”是指帮助或影响编码蛋白质的核酸序列的转录、翻译或表达的增强的非翻译的核酸序列。本发明的质粒平台可以包含启动子或其变体作为调控元件，并且可以包含可以影响蛋白质表达的表达调控序列，例如起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、增强子、用于靶向膜或分泌的信号序列等。
并且，当本发明中的质粒为可复制表达质粒时，其可以包含作为开始复制的特定核酸序列的复制起点(replication origin)。
并且，本发明中的质粒可以包含选择标记(selection marker)。选择标记用于筛选用质粒转化的细胞或微生物，以使用赋予可选择表型例如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白表达的标记。由于只有表达选择标记的细胞或微生物才能在用选择剂(selective agent)处理的环境中存活，因此可以筛选经转化的个体。
本发明中的质粒可以是其中编码靶生物分子的基因可操作地连接(operativelylinked)至上述启动子的质粒，具体地，可以是连接至上述启动子的下游区域的质粒。
作为本发明的一方面，提供一种用于稳定递送核酸分子的质粒平台，其包含编码LAMP-2B的胞内结构域和胞外结构域均被去除的修饰蛋白的核酸序列；编码与以递送为目的的核酸分子特异性结合的蛋白质的核酸序列；以及编码糖基化区域的核酸序列。
上述编码修饰蛋白的核酸序列可以具有序列编号4的核酸序列。
上述编码糖基化区域的核酸序列可以具有选自由序列编号11至13组成的组中的至少一种核酸序列，就同时最大化生物分子的稳定表达和递送效率而言，优选地具有序列编号11的核酸序列。
上述编码糖基化区域的核酸序列的包含位置没有特别限制，只要是其能够包含在上述质粒平台内的位置即可，例如，包含位置能够以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞外区域(或磷脂双层的外部区域)方向。作为更具体的例子，编码生物分子(或靶蛋白)的序列可以位于上述编码修饰蛋白的核酸序列的胞外区域方向，上述编码糖基化区域的核酸序列可以位于上述编码生物分子的序列的上游(或胞外区域方向)或下游(或胞内区域方向)，但不特别限定于此。根据一个优选实施例，上述编码糖基化区域的核酸序列以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准，可以位于胞外区域方向。
上述编码特异性结合核酸分子的蛋白质的核酸序列的包含位置没有特别限制，只要是其能够包含在上述质粒平台内并表达以能够与以递送为目的的核酸分子特异性结合的位置即可，例如，包含位置能够以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞内区域(或磷脂双层的内部区域)方向。作为更具体的例子，编码与核酸分子特异性结合的蛋白质的序列可以位于上述编码修饰蛋白的核酸序列的下游(或胞内区域方向)，上述编码糖基化区域的核酸序列可以位于编码上述修饰蛋白的序列的上游(或胞外区域方向)，但不特别限定于此。
上述与核酸分子特异性结合的蛋白质可以是选自由双链RNA结合基序(doublestrand binding motif)衍生的结合蛋白、BIV(牛免疫缺陷病毒，BovineImmunodeficiency Virus)衍生的结合蛋白、JDV(杰姆布拉纳病毒，Jembrana DiseaseVirus)衍生的结合蛋白、HIV(人类免疫缺陷病毒，Human Immunodeficiency Virus)衍生的结合蛋白及上述蛋白衍生的变体组成的组中的至少一种，根据一个优选实施例，可以是JDV衍生的结合蛋白，但不特别限定于此。
根据具体的一实施例，编码上述与核酸分子特异性结合的蛋白质的核酸序列可以包含具有与序列编号30至34组成的组中的至少一种序列具有70％以上同源性的核酸序列，但不特别限定于此。
上述与核酸分子特异性结合的蛋白质可以包含与以递送为目的的核酸分子所具有的特异基序结合的结构域。根据具体的一实施例，可以是特异性结合至TAR(阈值自回归模型)序列的结构域，但不限于此。
作为本发明的一方面，提供一种用于稳定递送核酸分子的重组质粒，其包含以在上述质粒平台内递送为目的的核酸分子的序列。
上述核酸分子的序列在注入细胞内的质粒状态下通过适当的剪接工艺被切割，对其包含在质粒内的位置没有特别限制，只要其能够保持与上述与核酸分子特异性结合的蛋白质稳定结合即可。作为一个优选实施例，上述核酸分子的序列可以位于上述编码修饰蛋白的核酸序列与上述编码与核酸分子特异性结合的蛋白质的核酸序列之间。
上述核酸分子可以是选自由DNA、RNA(核糖核酸)及适体组成的组中的至少一种，但不限于此。
上述核酸分子可以包含使其能够保持与上述与核酸分子特异性结合的蛋白质的稳定结合的特异性基序，作为具体例，可以包含选自由TAR序列、TAR序列变体、双链DNA短链(优选7至27、9至27、11至27、13至27、7至25、9至25、11至25、13至25或14至25bp)及双链RNA短链(优选7至27、9至27、11至27、13至27、7至25、9至25、11至25、13至25、或14至25bp)组成的组中的至少一种，但不限于此。
作为本发明的一方面，提供一种用于稳定递送核酸分子的外泌体，其包含由上述重组质粒表达的产物。
在上述外泌体中，上述重组质粒还可以包含编码在外泌体的外部表达并特异性结合至靶细胞表面的蛋白质的序列，这可以是为了通过增加递送至靶细胞的靶向性来提高待递送的核酸分子的递送效率。
在上述外泌体中，上述与核酸分子特异性结合的蛋白质可以在外泌体的内部表达并与核酸分子结合，其可以发挥通过稳定核酸分子免于在外泌体内部降解(degradation)来最终稳定地递送至靶细胞的作用。
作为本发明的一方面，提供一种用于稳定递送包含上述外泌体的核酸分子的的组合物。
并且，作为本发明的一方面，提供一种RNA干扰(RNA interference)用组合物，其包含外泌体，上述核酸分子具有RNA干扰效应。
具有上述RNA干扰效应的核酸分子可以是非编码RNA(non-coding RNA)，优选地，可以是选自由miRNA(微小核糖核酸)、shRNA(短发夹核糖核酸)、siRNA(小干扰核糖核酸)、piRNA(piwi相互作用核糖核酸(piwi-interacting RNA))及lncRNA(长链非编码核糖核酸(long non coding RNA))组成的组中的至少一种，但不限于此。
作为本发明的一方面，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述外泌体，上述重组质粒还包含编码在外泌体的外部表达并特异性结合至癌细胞表面的蛋白质的序列，上述核酸分子对癌症具有预防或治疗效果。
上述组合物包含在外部区域表达并与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的外泌体，由于在上述外部区域表达的外泌体特异性结合至癌细胞表面，因此外泌体靶向癌细胞，从而可用于基于这种靶向的癌症预防或治疗用途。
并且，包含上述外泌体的核酸分子对癌症具有预防或治疗效果，这种物质可以在上述外泌体的双层内部区域表达后递送至靶癌细胞来发挥效果。在此情况下，上述外泌体可以通过与癌细胞相互作用(例如，表面受体相互作用(surface receptor interaction)、膜融合(membrane fusion)、受体介导的内吞作用(receptor-mediated endocytosis)、吞噬作用(phagocytosis)或微胞饮作用(micropinocytosis)等)将上述核酸分子递送至癌细胞内，由此可以实现癌症预防或治疗效果。
上述癌症可以是选自如下中的任一种：包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌及包括鳞状细胞癌的皮肤癌的癌症；包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯克特淋巴瘤的淋巴造血干肿瘤；包括急性和慢性粒细胞白血病和早幼粒细胞白血病的骨髓型造血肿瘤；包括纤维肉瘤和横纹肌瘤的间叶源性肿瘤；包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤的其他肿瘤；包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤的中枢和周围神经系统肿瘤；包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤的间叶源性肿瘤；以及包括黑色素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌的其他肿瘤。根据一个优选实施例，可以是卵巢癌，但不限于此。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以参照本发明中有关用于稳定表达及递送上述生物分子的质粒平台的具体描述来对本发明中用于稳定递送上述核酸分子的质粒平台的具体描述进行解释。
发明的效果
本发明的质粒平台包含编码已去除LAMP-2B的胞内结构域、胞外结构域或它们的组合的修饰蛋白的核酸序列，因此可以稳定表达及递送生物分子。
本发明的重组质粒还包含编码以在上述质粒平台内表达及递送为目的的生物分子的序列，因此可以稳定表达及递送生物分子。
本发明的外泌体包含上述重组质粒，因此可以稳定表达及递送生物分子。
本发明的用于诊断癌症的组合物包含上述外泌体，上述生物分子为与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的肽，因此可以有效诊断癌症。
本发明的用于预防或治疗癌症的药物组合物包含上述外泌体，上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质以及待递送至癌细胞内的治疗物质，因此可以有效预防和治疗癌症。
然而应当理解，本发明不限于上述效果，并且包括可以从详细描述或发明要求保护范围中记载的发明结构推断出的所有效果。
附图说明
图1至图5图示作为本发明的一方面来提供的质粒平台。
图6为通过蛋白质印记实验确认待表达生物分子对LAMP2-GFP、LAMP2-△IC-GFP、LAMP2-△EC-GFP、LAMP2-△EC/IC-GFP各自的表达水平的结果。
图7为图6的蛋白质印记实验结果的定量曲线。
图8为在将图6的实验中使用的重组质粒过表达之后，用显微镜观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光发光水平的结果。
图9为在将LEL-LAMP2-△EC-GFP、LEL-LAMP2-△EC/IC-GFP分别过表达之后，用显微镜观察GFP荧光发光水平的结果。
图10为通过蛋白质印记实验确认待表达生物分子对GNS TM-LAMP2-GFP、GNSTM-LAMP2-△IC-GFP、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP各自的表达水平的结果。
图11为图10的蛋白质印记实验结果的定量曲线。
图12为在将图10的实验中使用的重组质粒过表达之后，用显微镜观察GFP荧光发光水平的结果。
图13为在将SEL-LAMP2-△EC-GFP、SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP分别过表达之后，用显微镜观察GFP荧光发光水平的结果。
图14为在将GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP、Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP分别过表达之后，用显微镜观察GFP荧光发光水平的结果。
图15为通过蛋白质印记实验确认待表达生物分子对GNS TM-LAMP2-GFP、GNSTM-LAMP2-△IC-GFP、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP、GNSTM-LAMP2-EC5△IC-GFP、Gly-LAMP2-EC△IC-GFP、LAMP2-EC25△IC-GFP各自的表达水平的结果。
图16为基于GFP荧光发光水平观察当包含癌细胞靶向肽作为活性分子时外泌体与癌细胞的特异性结合能力的结果。
图17至19为在将未经质粒转化的细胞系的外泌体(图17)、GNS TM-LAMP2-GFP(图18)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(图19)过表达之后，确认外泌体的尺寸的结果。
图20为在转染细胞和由其分泌的外泌体中分别确认GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP(w/o BIV)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(w/BIV)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV_WT)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV_MT)各自的表达水平的结果。
图21为通过qPCR(实时荧光定量核酸扩增检测系统)确认在用靶细胞处理未经质粒转化的细胞系(对照组(Control))、不含miRNA的SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP(w/o miRNA)、含有miRNA的SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP(w/miRNA)转染细胞系和由其分泌的外泌体时表达的miRNA表达水平的结果。
图22为在用GFP的表达细胞处理未经质粒转化的细胞系(对照组(Control))、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WT shGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP)各自的质粒转化细胞系中分离的外泌体时确认GFPRNA表达抑制水平的结果。
图23为在蛋白质印记实验后，对在用GFP的表达细胞处理未经质粒转化的细胞系(对照组(Control))、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WTshGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP)各自的质粒转化的细胞系中分离的外泌体时的GFP表达抑制水平的定量曲线。
图24为上述图23的曲线的蛋白质印记实验结果。
图25为在用GFP的表达细胞处理未经质粒转化的细胞系(对照组(Control))、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WT shGFP)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP)各自的质粒转化的细胞系中分离的外泌体时通过显微镜观察来确认GFP荧光表达抑制水平的结果。
具体实施方式
以下，为了更具体地描述，将举出实施例和实验例来详细描述。然而，以下实施例和实验例是示例性的，本发明的范围但不限于此。
实施例1.制备包含编码修饰肽的基因的重组质粒
对编码LAMP-2B(NM_013995.2)的完整序列进行合成后，进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，并按照Infusion克隆试剂盒(Infusion cloning kit)(In-HD cloningkit，clontech，Cat No.639648)方法在pcDNA 3.1(+)载体中插入(或者可以插入动物细胞过表达载体中)来制备出包含LAMP2B的质粒。与Michelle E.Hung等人(生物化学杂志2015年3月27日(The Journal of Biological Chemistry 2015.Mar 27))报道相同地，在该质粒中合成编码HA(透明质酸(Hyaluronic Acid))的序列、编码目标肽(Target Peptide)的序列、编码活性蛋白(Active Protein)的序列之后，进行PCR扩增，并利用Infusion克隆试剂盒插入每个序列位置中来制备出重组质粒(SP：信号肽(Signal Peptide)，编码信号肽的序列；HA：透明质酸(Hyaluronic Acid)，编码透明质酸的序列；目标肽(Target Peptide)：编码目标肽的序列，使用编码FLAG蛋白的序列；Active Protein：活性蛋白，使用编码GFP的序列)。并且，使用诱变试剂盒(Mutagenesis kit)(EZchange Site-directed Mutagenesiskit，Enzynomics，Cat No.EZ004S)以与上述相同的方法分别制备出插入编码LAMP-2B的胞内结构域(Intracellular Domain；IC)的序列已被去除的序列的重组质粒(LAMP2-△IC-GFP)、插入编码LAMP-2B的胞外结构域(Extracellular Domain；EC)的序列已被去除的序列的重组质粒(LAMP2-△EC-GFP)、插入编码LAMP-2B的胞内结构域和胞外结构域的序列均已被去除的序列的重组质粒(LAMP2-△EC/IC-GFP)，其示意图如图1所示。
并且，对于上述图1的部分框架结构，将编码LAMP-2B的胞外结构域(EC)区域的序列与四跨膜蛋白质(tetraspanin)中的CD9的LEL(CD9的大胞外域(Large ExtracellularDomain))的序列合成之后，进行PCR扩增，然后利用Infusion克隆试剂盒方法制备出替换的重组质粒(LEL-LAMP-△EC-GFP、LEL-LAMP-△EC/IC-GFP)，其示意图如图2所示。
并且，对于上述图1的部分框架结构，为了在目标肽(Targeting Peptide)的上游(upstream；细胞外部方向)或下游(downstream；细胞内部方向)区域导入糖基化(glycosylation)，①使用诱变试剂盒(Mutagenesis kit)(EZchange Site-directedMutagenesis kit，Enzynomics，Cat No.EZ004S)方法，在相应位置导入编码GNSTM基序(GNSTM是细胞内N-糖基化(N-glycosylation)最强的氨基酸序列)的序列(GNSTM-LAMP2-GFP、GNSTM-LAMP2-△IC-GFP、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP)，或者②四跨膜蛋白中合成编码CD9 SEL(CD9的小细胞外结构域(Small Extracellular Domain))的序列后，进行PCR扩增，并使用Infusion克隆试剂盒方法将其导入现有的LAMP2B-GFP修饰质粒(SEL-LAMP2-△EC-GFP、SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP)中，或者③在编码LAMP2-βEC/IC-GFP的FLAG蛋白的序列的下游，通过诱变试剂盒(Mutagenesis kit)(EZchange Site-directed Mutagenesis kit，Enzynomics，Cat No.EZ004S)方法导入N-糖基化(N-glycosylation)序列AAC(Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP)来分别制备重组质粒，其示意图如图3所示。
并且，对于图3的部分框架结构，制备出使用诱变试剂盒(Mutagenesis kit)(EZchange Site-directed Mutagenesis kit，Enzynomics，Cat No.EZ004S)方法插入编码LAMP-2B的胞外结构域的序列中的一部分序列(EC25)的重组质粒(LAMP2-EC25△IC-GFP、GNSTM-LAMP2-EC25△IC-GFP、Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP)，其示意图如图4所示。
并且，对于图3的部分框架结构，将GNSTM-LAMP-GFP-△EC/IC或SEL-LAMP2-ΔEC/IC中编码活性蛋白的序列替换为编码与(sh)RNA结合的蛋白质的序列，在编码HA的序列和编码与上述(sh)RNA结合蛋白质(RNA Binding protein；RBP)的序列之间合成Pri-miRNA序列，进行PCR扩增，然后利用Infusion试剂盒(Infusion kit)制备重组质粒(GNS TM-LAMP2-△EC/IC-RBP、SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP)，其示意图如图5所示。作为上述Pri-miRNA，使用miRNA-199的Pri-miRNA基本序列，以及在miRNA-199基本序列中包含GFP靶序列的shGFP的Pri-miRNA序列。由于上述Pri-miRNA序列结构中包含TAR序列，因而作为RBP，尝试导入一种与TAR位点特异性结合的蛋白质。因此，作为与上述(sh)RNA结合的蛋白质(RNA Bindingprotein；RBP)，利用BIV(牛免疫缺陷病毒，Bovine Immunodeficiency Virus)衍生的野生型蛋白质，以及JDV(杰姆布拉纳病毒，Jembrana Disease Virus)衍生的蛋白质的野生型(WT)和突变型(MT)蛋白质。
上述制备的重组质粒的具体序列如下表1所示。
表1
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实施例2.重组质粒的表达
为了表达重组质粒，在100mm2培养皿中，在含有10％胎牛血清(10％Fetal BovineSerum(FBS)，GibcoTM，Cat No.16000044)和1％抗生素(1％Penicllin/Streptomycin，GibcoTM，Cat No.15140122)的DMEM(Welgene，Cat No.LM001-05)培养基状态下将2.5X106个HEK293T细胞培养24小时。按照PolyJetTM转染试剂盒(transfection kit)(Laboratories，Cat No.SL100688)方法，将含有靶基因的重组质粒pcDNA3.1(+)载体2μg导入细胞中，培养48小时。
实施例2-1.荧光成像实验
为了确认重组质粒在细胞内的荧光表达，将培养基替换为不含胎牛血清的DMEM培养基，并进一步培养48小时。完成培养后，利用Cytation 5(Biotek)确认了细胞内绿色荧光表达。
实施例2-2.外泌体分离、蛋白质表达、RNA表达等
用1X DPBS(Welgene，Cat No.LB001-02)洗涤1次后，将1mL Trypsin-EDTA(Welgene，Cat No.LS015-10)加入培养皿中并将细胞从培养皿中滴下，然后加入含有胎牛血清及抗生素的DMEM培养基10mL，收集细胞并以1000rpm离心2分钟。去除培养基，向收集的细胞中加入不含胎牛血清的DMEM培养基10mL，释放细胞后加入到悬浮细胞专用培养皿(suspension culture dish，SPL life science，Cat No.11151)中，在仅含有1％抗生素的DMEM培养基中进一步培养48小时，然后分离外泌体和细胞，进行了蛋白质表达和RNA表达实验。
实验例1.利用修饰肽的活性蛋白的稳定表达及递送至靶点
1.确认去除胞内结构域(IC)、胞外结构域(EC)后靶蛋白质表达水平的上升效果
(1)实验方法
在图1和图2的质粒框架结构中分别插入编码FLAG蛋白作为靶向肽(Targetingpeptide)的基因以及编码GFP作为活性蛋白(Active protein)的基因之后，按照实施例2-1或2-2的方法过表达每个重组质粒。
即，为了确认细胞的实际荧光表达，按照实施例2-1的方法过表达每个重组质粒，然后测量了荧光表达。
并且，为了确认蛋白质表达水平，按照实施例2-2的方法完成培养后，在50mL锥形管(SPL，Cat No.50040)中收集细胞和培养基并以1000rpm离心2分钟，然后将收集的细胞用1X PBS洗涤2次，然后在稀释至1X的细胞裂解缓冲液(Cell lysis buffer)(10X Celllysis buffer，Cell Signaling Technology，Cat No.9803)中加入PMSF来从细胞中分离蛋白质。然后，将分离的培养基进一步以4000rpm离心30分钟并去除细胞残留物后，将上清液放入10kDa滤管(Filter tube，Mlliopore，Cat No.UFC9010)中并以4000rpm离心30分钟。在最终剩余的上清液中放入1X PBS，混匀后进一步离心，将该过程重复2次后，用装有27-G针头的注射器通过0.2μm过滤器过滤滤管中剩余的上清液，得到尺寸单一的外泌体。通过蛋白质印记实验比较上述细胞裂解物(lysate)和得到的外泌体中含有的重组蛋白的表达量。
(2)实验结果
与过表达图1的质粒的情况、过表达插入编码LAMP-2B的完整序列的重组质粒(LAMP2-GFP)的情况相比，当过表达插入编码胞内结构域(LAMP2-△IC-GFP)、胞外结构域(LAMP2-△EC-GFP)或这两者(LAMP2-△EC/IC-GFP)的序列被去除的序列时，FLAG蛋白和GFP的表达水平显著高(图6、7)。尤其，在LAMP2-△EC/IC-GFP的情况下，与LAMP2-GFP相比，细胞中FLAG蛋白约增加6倍～20倍，细胞和外泌体中GFP蛋白增加约50～100倍(图6A-B)。通过实际荧光测量结果也可以确认，与LAMP2-GFP相比，LAMP2-△IC-GFP、LAMP2-△EC-GFP及LAMP2-△EC/IC-GFP中荧光强度明显更强，尤其在LAMP2-△EC/IC-GFP中的荧光强度最强(图8)。
这证实，当去除LAMP2的胞内结构域时，可以增加外泌体分泌细胞或外泌体中靶蛋白和活性蛋白的稳定表达，并且进一步表明，当LAMP2的胞外结构域也被去除时，可以显著增加表达的稳定性。由此推测通过去除已知为参与溶酶体降的蛋白质的LAMP2的胞内结构域，可以避免溶酶体降解，从而提高靶蛋白的表达率。然而，当LAMP2的胞外结构域也被去除时，LAMP2本身的稳定性显著降低，预计会对靶蛋白的表达率产生负面影响，但表达率显著上升是意想不到的效果，对此需要进一步研究。
并且，当过表达图2的质粒时，可以确认，与未去除编码LAMP2的胞内结构域的序列的情况(LEL-LAMP2-△EC)相比，去除时(LEL-LAMP2-△EC/IC)的荧光强度明显更强(图9)。
这更清楚地表明，当去除LAMP2的胞内结构域时，可以通过抑制由于胞内结构域外源蛋白流入细胞而导致的细胞溶酶体降解作用，提高靶蛋白和活性蛋白的表达水平，即使将LAMP2的胞外结构域区域替换为另一种蛋白质的胞外结构域区域，也表现出相同的结果。
2.确认通过糖基化的表达水平上升效果
(1)实验方法
在图3和图4的质粒框架结构中分别插入编码FLAG蛋白作为靶向肽(Targetingpeptide)的基因以及编码GFP作为活性蛋白(Active protein)的基因之后，按照实施例2-1和2-2的方法过表达每个重组质粒。除此之外，实验方法与上述实验例1-1-(1)中的描述相同。
(2)实验结果
当过表达图3的质粒时，GNSTM基序序列中含有LAMP2完整序列的质粒(GNSTM-LAMP2-GFP)具有非常低的作为靶蛋白的FLAG蛋白和作为活性蛋白的GFP的表达量(图10)。这个结果与现有论文报道的结果不一致，意味着GNSTM基序实际上并没有为LAMP2中的靶蛋白提供稳定效果。然而，当LAMP2的胞内结构域被去除(GNSTM-LAMP2-△IC-GFP)或连胞外结构域也被去除(GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP)时，表现出GNSTM基序极大地稳定靶蛋白表达的结果。尤其，当LAMP2的胞内结构域和胞外结构域均被去除(GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP)时，作为靶蛋白的FLAG蛋白和作为活性蛋白的GFP的表达水平均显著升高，与LAMP2完整序列和GNSTM基序序列结合的情况相比，FLAG增加了200～900倍，GFP增加了40～80倍(图11)。荧光发光水平也反映了相同的结果，与GNSTM-LAMP2-GFP相比，GNS TM-LAMP2-△IC-GFP中荧光强度更强，GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP中强度强且具有显著差异(图12)。
即使在将已知含有糖基化氨基酸的常规CD9 SEL结构域包含在靶蛋白的下游区域的情况下，也表现出相同的趋势，与将LAMP2的胞外结构域替换为SEL的情况(SEL-LAMP2-△EC-GFP)相比，当进一步去除胞内结构域(SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP)时，表现出更强的荧光强度(图13)。
并且，为了将LAMP2-△EC/IC-GFP质粒中位于FLAG下游的接点的中间位点替换为作为糖基化活性氨基酸的“GNG(Glycine-Asparagine-Glycine)”，利用诱变试剂盒(Mutatgenesis kit)在相应位置变换为DNA序列。即，将接点的氨基酸序列“GSSGGGSG(DNA序列：ggctcgagtGgtggaggatctggt)”替换为“GSSGNGSG(DNA序列：ggctcgagtGgtAACggatctggt)”。结果，即使当靶蛋白的下游区域被糖基化(Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP)时，也表现出相同的趋势，当LAMP2的胞外结构域和胞内结构域均被去除时，可以确认到与导入GNSTM基序和SEL的情况相同地表现出非常强的荧光强度(图14)。
并且，在含有LAMP2的部分胞外结构域时会根据糖基化的位置和结构进一步提高靶蛋白稳定性的期待下，在进一步制备插入有编码LAMP2的下游25个氨基酸序列的核酸序列的质粒(LAMP2-EC25△IC-GFP、GNS TM-LAMP2-EC25△IC-GFP、Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP)之后，确认了靶蛋白的表达量。结果，与GNSTM-LAMP2-GFP相比，在GNS TM-LAMP2-EC25△IC-GFP、Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-GFP中，作为靶蛋白的FLAG蛋白和作为活性蛋白的GFP的表达水平均很高，尤其在GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP中显著高。即，这表明在同样的趋势下，当LAMP2的胞外结构域和胞内结构域均被去除时，靶蛋白的表达效果最高。并且，在LAMP2-EC25△IC-GFP的情况下，表现出更高的靶蛋白质表达水平，这被视为表明GNSTM基序在LAMP2的胞外结构域存在下无法发挥稳定表达效果(图15)。
这表明，为了使现有已知的GNSTM基序与LAMP2协同作用来表现出靶蛋白的稳定表达效果，至少应该是LAMP2的胞内结构域被去除的形式，而当胞外结构域也被去除时，可以显著提高靶蛋白的表达水平，这是根据已知的现有技术无法轻易预测的结果。
3.利用外泌体靶向癌细胞
(1)实验方法
在图3的质粒框架结构中，确认到含有GNSTM的质粒中GNS TM-LAMP2-△EC/IC-GFP的FLAG表达率在细胞和外泌体中显著增加，从而将该质粒的目标肽位置替换为编码癌症靶向肽序列(“MHTAPGWGYNLS”)(叶酸受体结合肽(folate receptor binding peptide))的核酸序列(下表2)，然后按照实施例2-2的方法过表达每个重组质粒，完成培养后，在50mL锥形管(SPL，Cat No.50040)中收集细胞和培养基并以1000rpm离心2分钟，然后进一步将上清液以4000rpm离心30分钟，然后去除细胞残留物。将最终的上清液放入10kDa滤管(Mlliopore，Cat No.UFC9010)中并以4000rpm离心30分钟。在最终剩余的上清液中放入1X PBS，混匀后进一步离心，将该过程重复2次后，用装有27-G针头的注射器通过0.2μm过滤器过滤滤管中剩余的上清液，得到尺寸单一的外泌体。使用BCA试剂盒(BCA kit)对得到的外泌体进行定量，并按照PKH67绿色荧光细胞接头试剂盒(PKH67 green fluorescence cell linkerkit)(sigma，Cat No.PKH67GL)方法对100μg外泌体进行染色。将染色后的外泌体放入100kDa过滤器(filter)(Mlliopore，Cat No.UFC510008)中并以14000rcm离心5分钟之后，在上清液中放入1X PBS并进一步离心，将该过程重复2次。用装有27-G针头的0.2μm过滤器过滤最终外泌体产物后，用作为表达叶酸受体的卵巢癌细胞的SKOV3细胞处理，然后培养24小时。完成培养后，用1X DPBS洗涤2次，然后替换为SKOV3培养基，并通过cytation5(Biotek)测量了绿色荧光程度。
表2
(2)实验结果
对分别用未过表达质粒的外泌体(外泌体(+))、图3中插入有GNS TM-LAMP2-△EC/IC-GFP的FLAG的外泌体(对照组肽外泌体(+))、以及GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP的FLAG位置插入癌症靶向肽的外泌体(靶向肽外泌体(+))处理的SKOV3细胞的荧光表达进行比较，结果可以确认与其他两组相比，过表达的外泌体的荧光表达明显更强并且大量分布(图16)。
由此确认了加载编码靶向肽的序列的质粒可以在细胞和外泌体中稳定地表达，并在外泌体表面表现出活性，从而可以任选地大量移动至表达癌症靶向肽结合受体的细胞，这暗示通过生物分子的有效表达用作基于癌症靶向的治疗物质的可能性。
4.测量外泌体尺寸的分布率
(1)实验方法
按照实施例2-2的方法过表达未经质粒转化的细胞系的外泌体(图17)、GNSTM-LAMP2-GFP(图18)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(图19)，完成培养后，在50mL锥形管(SPL，CatNo.50040)中收集细胞和培养基并以1000rpm离心2分钟，然后进一步将上清液以4000rpm离心30分钟，然后去除细胞残留物。将最终的上清液放入10kDa滤管(Mlliopore，CatNo.UFC9010)中并以4000rpm离心30分钟。在最终剩余的上清液中放入1X PBS，混匀后进一步离心，将该过程重复2次后，用装有27-G针头的注射器通过0.2μm过滤器过滤滤管中剩余的上清液，得到尺寸单一的外泌体。通过DLS(动态光散射分析，Dynamic LightScattering)测量了得到的外泌体的尺寸。
(2)实验结果
从图17至图19中可以确认，在过表达未经质粒转化的细胞系的外泌体(图17)、GNSTM-LAMP2-GFP(图18)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(图19)的外泌体的情况下，尺寸没有差异。尽管LAMP2的胞外结构域和胞内结构域均被去除，当过表达时，外泌体的尺寸也没有差异。这可以视为意味着即使使用本发明的LAMP2-△EC/IC，过表达后外泌体的基本性质也没有变化，从而表明将常规已知的外泌体用于各种生物学用途方面没有问题。
实验例2.利用修饰肽稳定表达活性RNA并递送至靶点
1.确认表达水平
(1)实验方法
在图5的质粒框架结构中分别插入编码FLAG蛋白作为靶向肽(Targetingpeptide)的基因以及编码与RNA结合的蛋白作为活性蛋白(Active protein)的基因之后，按照实施例2-2的方法过表达每个重组质粒。
为了确认细胞中活性shRNA表达水平，在按照实施例2-2的方法完成培养后，在50mL锥形管(conical tube)(SPL，Cat No.50040)中收集细胞和培养基，并以1000rpm离心2分钟后，收集的细胞用1X PBS洗涤2次，然后通过Trizol法(ThermoFisher Scientific，CatNo.15596026)分离RNA，然后利用聚腺苷酸化试剂盒(polyadenylation kit，Enzynomics，Cat No.EX041S)将500ng RNA与poly A序列结合，并利用导入PrimeScriptTMcDNA kit(Takara，Cat No.6210A)的shRNA序列特异性引物(primer)，按照基因特异性引物(genespecific primer)cDNA合成方法合成cDNA。cDNA合成后，利用靶标shRNA序列寡核苷酸探针(Taqman probe)，通过TOPrealTM Probe qPCR PreMix(Enzynomics，Cat.No.RT600S)测量了shRNA的表达量。
为了确认外泌体中活性shRNA表达水平，在按照实施例2-2的方法完成培养后，在50mL锥形管(SPL，Cat No.50040)中收集细胞和培养基，并以1000rpm离心2分钟后，进一步将上清液以4000rpm离心30分钟，然后去除细胞残留物。将最终的上清液放入10kDa滤管(Mlliopore，Cat No.UFC9010)中并以4000rpm离心30分钟。在最终剩余的上清液中放入1XPBS，混匀后进一步离心，将该过程重复2次后，用装有27-G针头的注射器通过0.2μm过滤器过滤滤管中剩余的上清液，得到尺寸单一的外泌体。通过Trizol方法(ThermoFisherScientific，Cat No.15596026)在收集的外泌体中分离RNA之后，利用聚腺苷酸化试剂盒(Enzynomics，Cat No.EX041S)将500ng RNA与poly A序列结合，并利用导入PrimeScriptTMcDNA kit(Takara，Cat No.6210A)的shRNA序列特异性引物，按照基因特异性引物cDNA合成方法合成cDNA。cDNA合成后，利用靶标shRNA序列寡核苷酸探针，通过TOPrealTM Probe qPCR PreMix(Enzynomics，Cat.No.RT600S)测量了shRNA的表达量。
为了测量用含有活性shRNA的外泌体处理的SKOV3细胞中的GFP表达量，在按照外泌体分离实施例2-2的方法完成培养后，在50mL锥形管(SPL，Cat No.50040)中收集细胞和培养基，并以1000rpm离心2分钟后，进一步将上清液以4000rpm离心30分钟，然后去除细胞残留物。将最终的上清液放入10kDa滤管(Mlliopore，Cat No.UFC9010)中并以4000rpm离心30分钟。在最终剩余的上清液中放入1X PBS，混匀后进一步离心，将该过程重复2次后，用装有27-G针头的注射器通过0.2μm过滤器过滤滤管中剩余的上清液，得到尺寸单一的外泌体。
为了验证含有shGFP的外泌体在GFP过表达细胞中的表达抑制功效，SKOV3细胞系的1X105个细胞分配到6孔板(6well plate)的每个孔(well)中并培养24小时。按照PolyJetTM转染试剂盒(Laboratories，Cat No.SL100688)方法，每孔导入500ng作为GFP荧光载体的pAcGFP1-N1(Clonetech，PT3716)，24小时后替换新培养基，每孔加入50μg含有上述分离shRNA的外泌体，处理48小时后，测量了GFP荧光及蛋白质表达量。
(2)实验结果
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)、GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)这4种质粒过表达模型均在细胞中与外泌体单独处理组(NC)和对照组相比表现出高表达量。尤其，当插入BIV衍生的RBP和JDV衍生的RBP作为活性蛋白时，与未插入的情况(w/o BIV：没有RBP的结构)相比，整个外泌体中shGFP的表达量显著高于其他组。当插入JDV野生型衍生的RBP时，效果最优异，与插入BIV衍生的RBP的情况下相比相差约80倍(图20)。
并且，即使当过表达作为利用SEL而非GNSTM的糖基化模型的SEL-LAMP2-△EC/IC-(Pri-miRNA-199)-RBP质粒时，也确认到miRNA-199在转染细胞中优异地表达(图21)。
这些实验结果表明，通过LAMP2的胞外结构域和胞内结构域均被去除的形式和导入糖基化，在转染细胞及其外泌体中均可以稳定地表达RNA和活性蛋白，最终暗示通过外泌体递送生物活性核酸分子的可能性。
2.确认递送水平
当过表达作为利用SEL的糖基化模型的SEL-LAMP2-△EC/IC-(Pri-miRNA-199)-RBP质粒时，可以确认即使在去除转染的细胞后用分离的外泌体处理的细胞中，miRNA-199也优异地表达(图21)。
并且，即使在过表达作为利用GNSTM的糖基化模型的GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)、GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)质粒时，可以确认在去除转染的细胞后用分离的外泌体处理的GFP蛋白转化的SKOV3细胞系中，shGFP优异地表达，从而非常有效地抑制GFP的表达(RNA水平，蛋白(Protein)水平)(图22、23)。尤其，作为RBP，当使用JDV(WT)衍生蛋白作为活性蛋白时，效果最优异，并且这种趋势同样地表现在靶细胞中的蛋白质印记实验结果和荧光分析结果中(图24、25)。荧光分析结果显示，在尤其过表达GNS TM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)质粒的情况下，GFP mRNA和蛋白质可被抑制90至99％。
这些实验结果表明，通过LAMP2的胞外结构域和胞内结构域均被去除的形式以及糖基化的导入，转染细胞及其外泌体均稳定地表达RNA和活性蛋白的同时，最终使外泌体中RNA与RBP之间的结合有效解离，从而将RNA成功递送至靶细胞。尤其，插入有JDV衍生的RBP和糖基化LAMP2-△的质粒可以最大限度地提高shRNA的活性。
本发明的范围由所附的发明要求保护范围表示，从发明要求保护范围的含义、范围及其等同概念导出的所有变更或修饰形式应当被解释为包括在本发明的范围内。
Claims (20)
1.一种质粒平台，用于生物分子的稳定表达及递送，其特征在于，包含编码已去除溶酶体相关膜蛋白-2B的胞内结构域、胞外结构域或它们的组合的修饰蛋白的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述质粒平台包含编码已去除溶酶体相关膜蛋白-2B的胞内结构域的蛋白质的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述质粒平台是溶酶体相关膜蛋白-2B的胞内结构域和胞外结构域均已被去除的平台。
4.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述核酸序列具有与序列编号2至4中任一个核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述核酸序列具有与序列编号2或4的核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述核酸序列具有与序列编号4的核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述质粒平台还包含编码糖基化区域的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的质粒平台，其特征在于，上述编码糖基化区域的核酸序列以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞外区域方向。
9.根据权利要求7所述的质粒平台，其特征在于，上述编码糖基化区域的核酸序列包含与序列编号11至13中任一个核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
10.根据权利要求7所述的质粒平台，其特征在于，上述编码糖基化区域的核酸序列包含与序列编号11的核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
11.根据权利要求1所述的质粒平台，其特征在于，上述质粒平台包含与序列编号4的核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列以及与序列编号11的核酸序列具有70％以上同源性的核酸序列。
12.一种重组质粒，用于生物分子的稳定表达及递送，其特征在于，还包含编码以在根据权利要求1至11中任一项所述的质粒平台内表达及递送为目的的生物分子的核酸序列。
13.根据权利要求12所述的重组质粒，其特征在于，上述编码生物分子的核酸序列位于i)上述编码糖基化区域的核酸序列与上述编码修饰蛋白的核酸序列之间，或者ii)以上述编码修饰蛋白的核酸序列为基准位于胞内区域方向，或者iii)位于上述两者中。
14.根据权利要求12所述的重组质粒，其特征在于，上述生物分子为选自由核酸分子、适体、肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白、激素、生长因子、重组酶及荧光蛋白组成的组中的至少一种。
15.一种外泌体，用于生物分子的稳定表达及递送，其特征在于，包含由根据权利要求12所述的重组质粒表达的产物。
16.根据权利要求15所述的外泌体，其特征在于，上述生物分子包含在外泌体的外部表达并特异性结合至靶细胞表面的物质。
17.一种组合物，用于诊断癌症，其特征在于，包含根据权利要求15所述的外泌体，上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质。
18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，上述癌症为卵巢癌。
19.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求15所述的外泌体，上述生物分子包含与癌细胞表面特异性表达蛋白特异性结合的物质以及待递送至癌细胞内的治疗物质。
20.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，上述癌症为卵巢癌。
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