KR102577502B1 - 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼 - Google Patents

생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명에서 제시하는 플라스미드 플랫폼은 LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain), 세포 외 도메인(extracellular domain) 또는 이들의 조합이 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것으로서, LAMP-2B의 특정 도메인을 제거한 경우 발현시키고자 하는 생체분자의 발현이 현저히 안정화되고, 전달하고자 하는 생체분자의 전달효율이 현저히 상승함을 발견함에 기반한 것이다. 이는, 향후 목적 단백질의 발현과 전달, 특히 엑소좀을 이용한 발현과 전달에 있어 높은 기술적 효용을 제시할 것으로 기대하며, 이와 연계된 다양한 기술분야 또는 용도로 확장될 수 있을 것이다.

Description

생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼{Plasmid platform for stable expression and delivery of biomolecules}
본 발명은 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼에 관련된 것이다.
엑소좀은 후기 엔도좀의 출아 (budding)에서 생산되고 세포 외 공간으로 방출되기 전에 원형질막과 융합되는 것으로 알려져 있다.　엑소좀은 포스포콜린, 콜레스테롤 및 세라마이드가 풍부한 지질 이중층 막으로 구성된 40-200 nm 크기의 소낭이며, 거의 모든 종류의 세포에서 분비되고, 혈액, 림프 및 땀과 같은 모든 종류의 체액에서 안정하게 존재한다. 또한,　엑소좀은 작은 크기와 약한 음전하로 인해 오랜 체내 순환 시간과 기관의 내부까지 도달하는 이점을 가지고 있다.　엑소좀은 또한 식균 작용 (phagocytosis)에서 회피하여 친수성 또는 소수성 약물을 전달할 수 있으며, 표적 세포로 혈관 내피를 통과할 수 있다.　엑소좀은 테트라스파닌 (tetraspanin)과 같은 특정 표면 단백질로 인해 특정 세포에 표적 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.　엑소좀의 캡슐화는 in vitro 및 in vivo에서 커큐민 (curcumin)의 안정성과 생체 이용률을 증가시키고, 항염증 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있으며, 다른 연구에서,　엑소좀은 혈액-뇌 장벽을 넘어 뇌로 독소루비신을 전달하고, siRNA를 세포에 전달하며, 암 치료에 강력한 표적인 RAD 51 단백질의 수준을 효과적으로 감소시키는 것으로 보고된 바 있다.
한국등록특허 제2311658호
본 발명의 일 목적은 LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain), 세포 외 도메인(extracellular domain) 또는 이들의 조합이 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼을 제공함에 있다.
본 발명의 일 목적은 상기 플라스미드 플랫폼 내, 발현 및 전달을 목적하는 생체분자를 코딩하는 서열을 더 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 재조합 플라스미드를 제공함에 있다.
본 발명의 일 목적은 상기 재조합 플라스미드를 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 엑소좀을 제공함에 있다.
본 발명의 일 목적은 상기 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드인, 암의 진단을 위한 조성물을 제공함에 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업계 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태로서, LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain), 세포 외 도메인(extracellular domain) 또는 이들의 조합이 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼을 제공한다.
상기 플라스미드 플랫폼은 종래 알려진 LAMP-2B의 세포 내, 세포 외, 또는 이들 모두를 제거하는 경우 LAMP-2B와 함께 세포의 내부 또는 외부에 발현시키고자 하는 목적 단백질의 발현의 안정성이 현저히 상승하고, 목적세포에의 전달성 또한 현저히 상승함을 발견함에 기반한 것이다.
상기 LAMP-2B는 종래 공지된 아미노산 서열, 이를 코딩하는 핵산 서열에 대한 것으로서, 플라스미드 플랫폼 내 탑재되기 위해서는 핵산 서열을 의미하는 것일 수 있다. 구체적인 일 실시예에 따를 때, NM_013995.2의 accession number를 갖는 서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 세포 내 도메인과 세포 외 도메인은 각각 LAMP-2B의 세포 상 발현시 세포의 인지질 이중층 내부에 발현되는 영역과, 외부에 발현되는 영역을 의미하는 것일 수 있다. LAMP-2B가 엑소좀 상에서 발현되는 경우를 고려할 때 바람직하게는, 세포 내 도메인은 엑소좀의 인지질 이중층 내부에 발현되는 영역을, 세포 외 도메인은 엑소좀의 인지질 이중층 외부에 발현되는 영역을 각각 의미하는 것일 수 있다.
상기 변형 단백질은 LAMP-2B의 세포 내 도메인, 세포 외 도메인, 또는 이들의 조합이 제거된 것을 특징으로 하는데, 세포 외부 영역(또는, 인지질 이중층 외부 영역)에서 발현시키고자 하는 생체분자(또는, 타겟 단백질)와, 세포 내부 영역(또는, 인지질 이중층 내부 영역)에 발현시키고자 하는 생체분자(또는, 활성 단백질)의 발현을 안정화하고자 하는 목적 하에 바람직하게는 세포 내 도메인이 제거된 것일 수 있다. 이러한 의미에서, 상기 플라스미드 플랫폼은 LAMP-2B의 세포 내 도메인이 제거된 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 변형 단백질은 상기 세포 외부 영역에서 발현시키고자 0하는 생체분자와 상기 세포 내부 영역에서 발현시키고자 하는 생체분자의 발현을 안정시킴과 동시에, 생체분자를 목적하는 세포에 안정적으로 전달하고자 하는 목적 하에 바람직하게는 세포 내 도메인과 세포 외 도메인이 모두 제거된 것일 수 있다. 이러한 의미에서, 상기 플라스미드 플랫폼은 LAMP-2B의 세포 내 도메인과 세포 외 도메인이 모두 제거된 것일 수 있다.
일 실시예에 따를 때, 상기 핵산 서열은 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있고, 상기 세포 내부 영역에 발현시키고자 하는 생체분자의 발현을 안정화하고자 하는 목적 하에 바람직하게는 서열번호 2 또는 4의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 세포 내부 영역에서 발현시키고자 하는 생체분자의 발현을 안정시킴과 동시에, 생체분자를 목적하는 세포에 안정적으로 전달하고자 하는 목적 하에 보다 바람직하게는 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 플라스미드 플랫폼은 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있는데, 이는 상기 플라스미드 플랫폼에 탑재하여 발현시키고자 하는 생체분자의 발현과 전달을 안정화시키기 위한 목적일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 세포 내부 영역과 세포 외부 영역에서의 생체분자 모두에 대한 발현과 전달을 안정화시키기 위한 목적일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 글리코실화된 영역은 단백질 발현 구조에 글리코실화를 도입할 수 있는 수단으로 주지된 수단을 자유로이 사용하여 도입할 수 있고, 상기 플라스미드 플랫폼에 적용하는 측면에서 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열을 플라스미드 플랫폼 내 포함시키는 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스미드 플랫폼 내 GNSTM 모티프를 코딩하는 핵산 서열을 포함시키는 방법; N-linked glycosylation을 유도할 수 있는 아미노산 특이 서열 NXS (X는 proline을 제외한 모든 아미노산 서열 가능), NXT (X는 proline을 제외한 모든 아미노산 서열 가능), NXC (X는 proline을 제외한 모든 아미노산 서열 가능)을 코딩하는 서열을 포함 시키는 방법; 상기 N-glycosylation 아미노산 서열의 C-terminal부위에 1-5개 아미노산을 코딩하는 서열을 더 포함 시키는 방법; 상기 N-glycosylation 아미노산 서열의 C-terminal부위에 1-5개 아미노산을 포함하는 서열의 N-terminal부위에 Glycine을 코딩하는 서열을 포함시키는 방법; 테트라스파닌에서의 N-linked glycosylation 모티프 (CD9 SEL: Small Extracellular Loop Domain, CD63 LEL: Large Extracellular Loop Domain 등)를 코딩하는 서열을 포함시키는 방법; O-glycosylation을 유도하는 아미노산 서열인 Serine 또는 Threonine을 포함시키는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 택할 수 있고, 생체분자의 안정적인 발현과 전달 효율을 동시에 극대화하는 측면에서 바람직하게는 상기 플라스미드 플랫폼 내 GNSTM 모티프를 코딩하는 핵산 서열을 포함시키는 방법을 택하여 도입할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 플라스미드 플랫폼 내 포함될 수 있는 방법이라면 특별한 포함 위치의 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들면, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 외 영역(또는, 인지질 이중층의 외부 영역) 방향에 위치할 수 있도록 포함시킬 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 세포 외 영역 방향에 생체분자(또는, 타겟 단백질)를 코딩하는 서열이 위치할 수 있고, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 생체분자를 코딩하는 서열의 상위(또는, 세포 외 영역 방향) 또는 하위(또는, 세포 내 영역 방향)에 위치할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 일 실시예에 따를 때, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 외 영역 방향에 위치할 수 있다.
상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11 내지 13 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 생체분자의 안정적인 발현과 전달 효율을 동시에 극대화하는 측면에서 바람직하게는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 플라스미드 플랫폼은 상기 글리코실화 영역을 포함하면서 상기 변형 단백질 형태를 동시에 갖도록 코딩 서열이 구성될 수 있고, 각각에 대한 구체적인 설명은 상술한 바와 같다. 바람직한 일 실시예에 따를 때, 상기 플라스미드 플랫폼은 GNSTM 모티프를 코딩하는 서열과, LAMP-2B의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인이 모두 제거된 변형 단백질을 코딩하는 서열을 동시에 포함할 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 상기 GNSTM 모티프를 코딩하는 서열이 상기 변형 단백질을 코딩하는 서열의 상위(또는, 세포 외 영역 방향)에 위치하도록 포함할 수 있다. 추가적인 예로서, 상기 플라스미드 플랫폼은 서열번호 4의 핵산 서열 및 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 플라스미드 플랫폼 내, 발현 및 전달을 목적하는 생체분자를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 재조합 플라스미드를 제공한다.
상기 생체분자를 코딩하는 핵산 서열은 상술한 플라스미드 플랫폼 내 위치하여 성공적으로 목적하는 생체분자를 발현시킬 수 있다면 그 위치에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 구체적인 예를 들면, i) 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열과 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이, ii) 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 내 영역 방향 또는 iii) 이들 모두에 위치하는 것일 수 있다.
상기 생체분자를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 외 방향에 위치시키는 경우, 세포 외(또는, 인지질 이중층 외부영역)에 생체분자를 발현시키거나 전달하려는 목적일 수 있고, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 내 방향에 위치시키는 경우, 세포 내(또는, 인지질 이중층 내부영역)에 생체분자를 발현시키거나 전달하려는 목적일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 생체분자는 상기 플라스미드 플랫폼을 이용하여 발현시키고자 하는 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니고, 구체적인 예를 들면 핵산분자(nucleic acid molecules), 압타머(aptamer), 펩타이드(peptides), 단백질(protein), 글라이코프로테인(glycoproteins), 리포프로테인(lipoproteins), 면역글로불린(immunoglobulins), 호르몬(hormone), 성장인자(growth factor), 재조합 효소(recombinase) 및 형광단백질(fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 재조합 플라스미드로부터 발현된 산물을 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 엑소좀을 제공한다.
상기 엑소좀은 상술한 재조합 플라스미드로부터 발현된 변형 단백질과 생체분자를 포함하고 있는데, 상기 생체분자는 엑소좀의 내부, 외부 또는 이들 모두에 위치하여 안정적으로 발현될 수 있고, 목적하는 세포에 전달될 수 있다.
상기 생체분자는 엑소좀의 외부에 발현되어 타겟하는 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 것일 수 있는데, 이러한 경우 엑소좀이 타겟하는 세포에의 표적성이 증가하여 발현된 생체분자를 효과적으로 전달할 수 있고, 발현된 생체분자를 탐지하여 타겟하는 세포의 존재 여부를 판별할 수 있을 것이며, 이 외 특별한 제한 없이 표적세포에 대한 타겟팅에 기반한 주지된 다양한 용도로 엑소좀이 사용될 수 있다. 구체적인 예로서, 특정 바이러스에 감염된 세포나 암 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 생체분자가 엑소좀의 외부에 발현되는 경우 상기 엑소좀은 특정 바이러스에 감염된 세포나 암 세포에 특이적으로 결합할 수 있을 것이고, 이를 이용하여 특정 바이러스의 감염여부나 암 세포의 존재여부를 판단함과 동시에 엑소좀 내 포함하는 생체분자를 바이러스 감염세포나 암 세포 내 전달할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 포함하는 것인, 암의 진단을 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태로서, 상술한 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것과, 암 세포 내 전달하고자 하는 치료물질을 포함하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 포함하는 것으로서, 상기 엑소좀의 이중층 외부 영역에 발현되는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 외부 영역에 발현된 생체분자가 암 세포의 표면에 특이적으로 결합함에 따라 엑소좀이 암 세포를 타겟하게 되고, 이러한 타겟팅에 근거한 암의 진단 용도로의 활용이 가능하게 된다.
또한, 상기 생체분자는 암 세포 내 전달하고자 하는 치료물질을 포함할 수 있고, 이러한 치료물질은 상기 엑소좀의 이중층 내부 영역에 발현되는 것을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상술한 엑소좀이 암 세포와 상호작용(예를 들어, 표면 수용체 상호작용(surface receptor interaction), 멤브레인 융합(membrane fusion), 수용체 매개 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis), 파고시토시스(phagocytosis) 또는 마이크로피노시토시스(micropinocytosis) 등)에 의해 상기 치료물질을 암 세포 내 전달할 수 있게 되고, 이를 통해 암의 예방 또는 치료효과를 거둘 수 있게 된다.
상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 경부암, 갑상선암 및 편평세포암종을 포함하는 피부암을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 비-호지킨스 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버켓 림프종을 포함하는 림프계 조혈모 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구 백혈병을 포함하는 골수형의 조혈 종양; 섬유 육종 및 횡문 근육종을 포함하는 간엽 유래 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경 시스템의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 유래 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포상암 및 기형 암종을 포함하는 기타 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 난소암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 전달체의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 암의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에서 서술하는 모든 핵산 서열은 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 핵산 서열이 본 발명에서 목적하는 활성을 보유하는 한, 본 발명의 핵산 서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
상기 용어 '상동성'이란, 상기 제시된 핵산 서열과의 동일한 정도를 나타내는 것으로 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 본 발명 내 제시된 핵산 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 핵산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 '플라스미드'란, 적당한 숙주 내에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로서, 숙주 세포 또는 미생물의 게놈내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다.
본 발명에서 '작동가능하게 연결된(operably linked)'는 일반적 기능을 수행하도록 프로모터 또는 그의 변이체 핵산 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 플라스미드와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 '조절 요소'란 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 플라스미드 플랫폼은 조절 요소로　프로모터 또는 그의 변이체를 포함할 수 있고, 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서의 플라스미드가 복제가능한 발현 플라스미드인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서의 플라스미드는 선택마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 플라스미드로 형질전환된 세포 또는 미생물을 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포 또는 미생물만 생존하므로 형질전환된 개체를 선별 가능하다.
본 발명에서의 플라스미드는 목적 생체분자를 코딩하는 유전자가 상기 프로모터와 작동가능하도록 연결된(operatively linked) 것일 수 있고, 구체적으로는 상기 프로모터의 하위 영역에 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain)과 세포 외 도메인(extracellular domain)이 모두 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 전달을 목적하는 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산분자의 안정적인 전달을 위한 플라스미드 플랫폼을 제공한다.
상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11 내지 13으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있고, 생체분자의 안정적인 발현과 전달 효율을 동시에 극대화하는 측면에서 바람직하게는 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 플라스미드 플랫폼 내 포함될 수 있는 방법이라면 특별한 포함 위치의 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들면, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 외 영역(또는, 인지질 이중층의 외부 영역) 방향에 위치할 수 있도록 포함시킬 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 세포 외 영역 방향에 생체분자(또는, 타겟 단백질)를 코딩하는 서열이 위치할 수 있고, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 생체분자를 코딩하는 서열의 상위(또는, 세포 외 영역 방향) 또는 하위(또는, 세포 내 영역 방향)에 위치할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 일 실시예에 따를 때, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 외 영역 방향에 위치할 수 있다.
상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 상기 플라스미드 플랫폼 내 포함되어 전달을 목적하는 핵산분자와 특이적으로 결합할 수 있도록 발현시킬 수 있는 방법이라면 특별한 포함 위치의 제한이 있는 것은 아니나, 예를 들면 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 세포 내 영역(또는, 인지질 이중층의 내부영역) 방향에 위치할 수 있도록 포함시킬 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 하위(또는, 세포 내 영역 방향)에 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 서열이 위치할 수 있고, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 변형 단백질을 코딩하는 서열의 상위(또는, 세포 외 영역 방향)에 위치할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질은 이중가닥 리보핵산 결합 모티프(double strand binding motif), BIV(Bovine Immunodeficiency Virus) 유래 결합 단백질, JDV(Jembrana Disease Virus) 유래 결합 단백질, HIV(Human Immunodeficiency Virus) 유래 결합 단백질 및 상기 단백질 유래 변이체로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 JDV 유래 결합 단백질일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 구체적인 일 실시예에 따를 때, 서열번호 30 내지 34로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질은, 전달을 목적하는 핵산분자가 가지고 있는 특이적 모티프에 결합하는 도메인을 포함할 수 있다. 구체적인 일 실시예에 따를 때, TAR 서열에 특이적으로 결합하는 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 플라스미드 플랫폼 내, 전달을 목적하는 핵산분자의 서열을 포함하는, 핵산분자의 안정적 전달을 위한 재조합 플라스미드를 제공한다.
상기 핵산분자의 서열은, 세포 내 주입된 플라스미드 상태에서 적절한 스플라이싱 공정에 의해 절단되어, 상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질과 안정적으로 결합을 유지하도록 할 수 있다면 플라스미드 내 포함되는 위치에 특별한 제한이 있지는 아니한다. 바람직한 일 실시예로서, 상기 핵산분자의 서열은 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이에 위치할 수 있다.
상기 핵산분자는 DNA, RNA 및 압타머로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산분자는 상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질과 안정적으로 결합을 유지할 수 있도록 하는 특이적 모티프를 포함하는 것일 수 있고, 구체적인 예로서, TAR 서열, TAR 서열 변형체, 이중 DNA 짧은 가닥 (바람직하게는, 7 내지 27, 9 내지 27, 11 내지 27, 13 내지 27, 7 내지 25, 9 내지 25, 11 내지 25, 13 내지 25, 또는 14 내지 25 bp) 및 이중 RNA 짧은 가닥 (바람직하게는, 7 내지 27, 9 내지 27, 11 내지 27, 13 내지 27, 7 내지 25, 9 내지 25, 11 내지 25, 13 내지 25, 또는 14 내지 25 bp)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 재조합 플라스미드로부터 발현된 산물을 포함하는, 핵산분자의 안정적 전달을 위한 엑소좀을 제공한다.
상기 엑소좀에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 엑소좀의 외부에 발현되어 타겟하는 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하는 것일 수 있는데, 이는 타겟하는 세포에의 전달 표적성을 높여 전달하고자 하는 핵산분자의 전달 효율성을 높이기 위함일 수 있다.
상기 엑소좀에 있어서, 상기 핵산분자에 특이적으로 결합하는 단백질은 엑소좀의 내부에 발현되어 핵산분자와 결합하는 것일 수 있는데, 이는 엑소좀 내부에서 핵산분자가 분해(degradation)되지 않도록 안정화시켜 최종 타겟 세포에까지 안정적으로 전달될 수 있도록 하는 역할을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 엑소좀을 포함하는 핵산분자의 안정적 전달을 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 양태로서, 엑소좀을 포함하고, 상기 핵산분자는 RNA 간섭효과를 갖는 것인, RNA 간섭(RNA interference)용 조성물을 제공한다.
상기 RNA 간섭효과를 갖는 핵산분자로서, non-coding RNA로서 바람직하게는 miRNA, shRNA, siRNA, piRNA(piwi-interacting RNA) 및 lncRNA(long non coding RNA)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 상술한 엑소좀을 포함하고, 상기 재조합 플라스미드는 엑소좀의 외부에 발현되어 암 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하고, 상기 핵산분자는 암에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 외부 영역에 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 발현된 엑소좀을 포함하는 것으로서, 상기 외부 영역에 발현된 것이 암 세포의 표면에 특이적으로 결합함에 따라 엑소좀이 암 세포를 타겟하게 되고, 이러한 타겟팅에 근거한 암의 예방 또는 치료 용도로의 활용이 가능하게 된다.
또한, 상기 엑소좀이 포함하는 핵산분자는 암에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것으로서, 이러한 물질은 상기 엑소좀의 이중층 내부 영역에 발현된 후 타겟하는 암 세포에 전달되어 효과를 발휘하는 것일 수 있다. 이러한 경우, 상술한 엑소좀이 암 세포와 상호작용(예를 들어, 표면 수용체 상호작용(surface receptor interaction), 멤브레인 융합(membrane fusion), 수용체 매개 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis), 파고시토시스(phagocytosis) 또는 마이크로피노시토시스(micropinocytosis) 등)에 의해 상기 핵산분자를 암 세포 내 전달할 수 있게 되고, 이를 통해 암의 예방 또는 치료효과를 거둘 수 있게 된다.
상기 암은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 위암, 경부암, 갑상선암 및 편평세포암종을 포함하는 피부암을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 비-호지킨스 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버켓 림프종을 포함하는 림프계 조혈모 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수구 백혈병을 포함하는 골수형의 조혈 종양; 섬유 육종 및 횡문 근육종을 포함하는 간엽 유래 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경 시스템의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 유래 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포상암 및 기형 암종을 포함하는 기타 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직한 일 실시예에 따를 때 난소암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산분자의 안정적인 전달을 위한 플라스미드 플랫폼과 관련된 발명의 구체적인 설명에 있어, 상기 생체분자의 안정적인 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼에 관련된 발명의 구체적인 설명을 참조하여 해석할 수 있음은 당업계 통상의 기술자에 자명한 것이다.
본 발명의 플라스미드 플랫폼은 LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain), 세포 외 도메인(extracellular domain) 또는 이들의 조합이 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고 있어, 생체분자의 안정적 발현 및 전달이 가능하다.
본 발명의 재조합 플라스미드는 상기 플라스미드 플랫폼 내, 발현 및 전달을 목적하는 생체분자를 코딩하는 서열을 더 포함하고 있어, 생체분자의 안정적 발현 및 전달이 가능하다.
본 발명의 엑소좀은 상기 재조합 플라스미드를 포함하고 있어, 생체분자의 안정적 발현 및 전달이 가능하다.
본 발명의 암의 진단을 위한 조성물은 상기 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드로서, 암의 효과적인 진단이 가능하다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것과, 암 세포 내 전달하고자 하는 치료물질을 포함하고 있어, 암의 효과적인 예방과 치료가 가능하다.
다만, 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1 내지 도 5는 본 발명의 일 양태로서 제시하는 플라스미드 플랫폼을 도식화한 것이다.
도 6은 LAMP2-GFP, LAMP2-△IC-GFP, LAMP2-△EC-GFP, LAMP2-△EC/IC-GFP 각각에 대해 발현 목표 생체분자의 발현수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 7은 도 6의 웨스턴 블롯 결과를 정량적 그래프화 한 것이다.
도 8은 도 6의 실험에 사용된 재조합 플라스미드를 과발현시킨 후, GFP 형광 발광 수준을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9는 LEL-LAMP2-△EC-GFP, LEL-LAMP2-△EC/IC-GFP 각각에 대해 과발현시킨 후, GFP 형광 발광 수준을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10은 GNSTM-LAMP2-GFP, GNSTM-LAMP2-△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP 각각에 대해 발현 목표 생체분자의 발현수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 11은 도 10의 웨스턴 블롯 결과를 정량적 그래프화 한 것이다.
도 12는 도 10의 실험에 사용된 재조합 플라스미드를 과발현시킨 후, GFP 형광 발광 수준을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 13은 SEL-LAMP2-△EC-GFP, SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP 각각에 대해 과발현시킨 후, GFP 형광 발광 수준을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 14는 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP, Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP 각각에 대해 과발현시킨 후, GFP 형광 발광 수준을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 15는 GNSTM-LAMP2-GFP, GNSTM-LAMP2-△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP, GNSTM-LAMP2-EC5△IC-GFP, Gly-LAMP2-EC△IC-GFP, LAMP2-EC25△IC-GFP 각각에 대해 발현 목표 생체분자의 발현수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 16은 활성분자로서 암 세포 표적 펩타이드를 포함하는 경우, 암 세포에 대한 엑소좀의 특이적 결합능력을 GFP 형광 발광 수준을 토대로 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 17 내지 19는 플라스미드를 형질전환 하지 않은 세포주의 엑소좀(도 17), GNSTM-LAMP2-GFP(도 18), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(도 19)을 과발현시킨 후, 엑소좀의 크기를 확인한 결과이다.
도 20은 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP(w/o BIV), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(w/BIV), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV_WT), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV_MT) 각각에 대한 발현수준을 형질주입된 세포와 이로부터 분비된 엑소좀 내 각각 확인한 결과이다.
도 21은 플라스미드를 형질전환 하지 않은 세포주 (Control), miRNA가 없는 SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP (w/o miRNA), miRNA가 있는 SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP (w/ miRNA) 형질주입 세포주와 이로부터 분비된 엑소좀을 표적세포에서 처리시에 발현하는 miRNA발현 수준을 qPCR로 확인한 결과이다.
도 22는 플라스미드 형질 전환하지 않은 세포주(Control)와 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WT shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP) 각각의 플라스미드 형질전환한 세포주에서 분리한 엑소좀을 GFP의 발현 세포에 처리시에 GFP RNA 발현 억제 수준을 확인한 결과이다.
도 23은 플라스미드 형질 전환하지 않은 세포주(Control)와 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WT shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP) 각각의 플라스미드 형질전환한 세포주에서 분리한 엑소좀을 GFP의 발현 세포에 처리시에 GFP 발현 억제 수준을 웨스턴 블롯후 정량화한 그래프이다.
도 24는 상기 도 23 그래프의 웨스턴 블롯 결과이다.
도 25는 플라스미드 형질 전환하지 않은 세포주(Control)와 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scrambleGFP(scramble GFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(BIV shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(JDV WT shGFP), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(JDV MT shGFP) 각각의 플라스미드 형질전환한 세포주에서 분리한 엑소좀을 GFP의 발현 세포에 처리시에 GFP 형광 발현 억제 수준을 현미경 관찰로 확인한 결과이다.
이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예와 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예와 실험예는 예시적인 것으로, 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 변형된 펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조
LAMP-2B (NM_013995.2)를 코딩하는 전체서열을 합성후 PCR 증폭하여 Infusion cloning kit (In-Fusion® HD cloning kit, clontech, Cat No. 639648) 방법에 따라 pcDNA 3.1 (+) 벡터에 (또는 동물 세포 과발현 벡터에 삽입 가능) 삽입하여 LAMP2B가 포함된 플라스미드를 제작하였다. 본 플라스미드에 Michelle E. Hung 외 (The Journal of Biological Chemistry 2015. Mar 27) 보고와 동일하게 HA(Hyaluronic Acid)를 코딩하는 서열, 타겟 펩타이드(Target Peptide)를 코딩하는 서열, 활성 단백질(Active Protein)을 코딩하는 서열을 각각을 합성한 후, PCR 증폭하여 Infusion cloning kit을 이용하여 각 서열 위치에 삽입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다(SP: Signal Peptide, 신호 펩타이드를 코딩하는 서열; HA: Hyaluronic Acid, 히알루론산을 코딩하는 서열; Target Peptide: 타겟 펩타이드를 코딩하는 서열, FLAG 단백질을 코딩하는 서열 사용; Active Protein: 활성 단백질, GFP를 코딩하는 서열 사용). 또한, 상기와 같은 방법에 Mutagenesis kit (EZchange?? Site-directed Mutagenesis kit, Enzynomics, Cat No. EZ004S) 방법으로 LAMP-2B의 세포 내 도메인(Intracellular Domain; IC)을 코딩하는 서열이 제거된 서열을 삽입한 재조합 플라스미드(LAMP2-△IC-GFP), LAMP-2B의 세포 외 도메인(Extracellular Domain; EC)을 코딩하는 서열이 제거된 서열을 삽입한 재조합 플라스미드(LAMP2-△EC-GFP), LAMP-2B의 세포 내 도메인과 세포 외 도메인을 코딩하는 서열 모두가 제거된 서열을 삽입한 재조합 플라스미드(LAMP2-△EC/IC-GFP)를 각각 제조하였고, 이를 도식화하면 도 1과 같다.
또한, 상기 도 1의 골격구조 중 일부에 대하여, LAMP-2B의 세포 외 도메인(EC) 영역을 코딩하는 서열을 테트라스파닌(tetraspanin)에서의 CD9의 LEL(CD9의 Large Extracellular Domain)을 코딩하는 서열을 합성 후 PCR증폭하여 Infusion cloning kit방법으로 치환한 재조합 플라스미드(LEL-LAMP-△EC-GFP, LEL-LAMP-△EC/IC-GFP)를 제조하였고, 이를 도식화하면 도 2와 같다.
또한, 상기 도 1 골격구조 중 일부에 대하여, Targeting Peptide의 상위(upstream; 세포 외부 방향) 또는 하위(downstream; 세포 내부 방향) 영역에서 글리코실화(glycosylation)를 도입하기 위해 ① GNSTM 모티프(GNSTM은 아미노산 서열로 세포 내에서 가장 강하게 N-glycosylation 되는 서열임)를 코딩하는 서열을 해당 위치에 Mutagenesis kit (EZchange?? Site-directed Mutagenesis kit, Enzynomics, Cat No. EZ004S)방법으로 도입하거나(GNSTM-LAMP2-GFP, GNSTM-LAMP2-△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP), ② 테트라스파닌에서의 CD9 SEL(CD9의 Small Extracellular Domain)을 코딩하는 서열을 합성 후 PCR증폭하여 Infusion cloning kit방법으로 기존 LAMP2B-GFP 변형 플라스미드에 도입하거나(SEL-LAMP2-△EC-GFP, SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP), ③ LAMP2-βEC/IC-GFP의 FLAG 단백질을 코딩하는 서열의 하위에 N-glycosylation서열 AAC를 Mutagenesis kit (EZchange?? Site-directed Mutagenesis kit, Enzynomics, Cat No. EZ004S)방법으로 도입(Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP)하여 재조합 플라스미드를 각각 제조하였고, 이를 도식화하면 도 3과 같다.
또한, 도 3의 골격구조 중 일부에 대하여, LAMP-2B의 세포 외 도메인을 코딩하는 서열 중 일부 서열(EC25)을 Mutagenesis kit (EZchange?? Site-directed Mutagenesis kit, Enzynomics, Cat No. EZ004S)방법으로 삽입한 재조합 플라스미드(LAMP2-EC25△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-EC25△IC-GFP, Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP)를 제조하였고, 이를 도식화하면 도 4와 같다.
또한, 도 3의 골격구조 중 일부에 대하여, GNSTM-LAMP-GFP-△EC/IC 또는 SEL-LAMP2-ΔEC/IC에서의 활성 단백질을 코딩하는 서열을 (sh)RNA와 결합하는 단백질을 코딩하는 서열로 치환하고, HA를 코딩하는 서열과 상기 (sh)RNA 결합 단백질(RNA Binding protein; RBP)을 코딩하는 서열 사이에 Pri-miRNA 서열을 합성하여 PCR증폭한 후 Infusion kit을 이용하여 재조합 플라스미드(GNSTM-LAMP2-△EC/IC-RBP, SEL-LAMP2-△EC/IC-RBP)를 제조하였고, 이를 도식화하면 도 5와 같다. 상기 Pri-miRNA로는 miRNA-199의 Pri-miRNA 기본서열, miRNA-199 기본서열에 GFP 타겟 서열을 포함한 shGFP의 Pri-miRNA 서열을 사용하였다. 상기 Pri-miRNA 서열구조 내 TAR 서열을 포함하고 있는 바, RBP로는 TAR 부위에 특이적으로 결합하는 단백질을 도입하고자 하였다. 따라서, 상기 (sh)RNA와 결합하는 단백질(RNA Binding protein; RBP)로서, BIV(Bovine Immunodeficiency Virus) 유래 야생형 단백질과, JDV(Jembrana Disease Virus) 유래 단백질의 야생형(WT)과 돌연변이형(MT) 단백질을 이용하였다.
상기 제조된 재조합 플라스미드의 구체적인 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
재조합 플라스미드 구체적인 서열
LAMP2(서열번호 1) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagttcgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgcctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcactattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgTAA
LAMP2-△IC(서열번호 2) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcattggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagttcgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgcctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcactattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaTAA
LAMP2-△EC(서열번호 3) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcactaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgTAA
LAMP2-△EC/IC(서열번호 4) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcactaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaTAA
LAMP2-GFP(서열번호 5) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtttggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagttcgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgcctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcactattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
LAMP2-△IC-GFP(서열번호 6) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtttggaacttaatttgacagattcagaaaatgccacttgcctttatgcaaaatggcagatgaatttcacagttcgctatgaaactacaaataaaacttataaaactgtaaccatttcagaccatggcactgtgacatataatggaagcatttgtggggatgatcagaatggtcccaaaatagcagtgcagttcggacctggcttttcctggattgcgaattttaccaaggcagcatctacttattcaattgacagcgtctcattttcctacaacactggtgataacacaacatttcctgatgctgaagataaaggaattcttactgttgatgaacttttggccatcagaattccattgaatgacctttttagatgcaatagtttatcaactttggaaaagaatgatgttgtccaacactactgggatgttcttgtacaagcttttgtccaaaatggcacagtgagcacaaatgagttcctgtgtgataaagacaaaacttcaacagtggcacccaccatacacaccactgtgccatctcctactacaacacctactccaaaggaaaaaccagaagctggaacctattcagttaataatggcaatgatacttgcctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactcaggataaggttgcttcagttattaacatcaaccccaatacaactcactccacaggcagctgccgttctcacactgctctacttagactcaatagcagcactattaagtatctagactttgtctttgctgtgaaaaatgaaaaccgattttatctgaaggaagtgaacatcagcatgtatttggttaatggctccgttttcagcattgcaaataacaatctcagctactgggatgcccccctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcagactgtttcagtgtctggagcatttcagataaatacctttgatctaagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
LAMP2-△EC-GFP(서열번호 7) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
LAMP2-△EC/IC-GFP(서열번호 8) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
LEL-LAMP2-△EC-GFP(서열번호 9) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtTATTCCCACAAGGATGAGGTGATTAAGGAAGTCCAGGAGTTTTACAAGGACACCTACAACAAGCTGAAAACCAAGGATGAGCCCCAGCGGGAAACGCTGAAAGCCATCCACTATGCGTTGAACTGCTGTGGTTTGGCTGGGGGCGTGGAACAGTTTATCTCAGACATCTGCCCCAAGAAGGACGTACTCGAAACCTTCACCGTGAAGTCCTGTCCTGATGCCATCAAAGAGGTCTTCGACctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgcttaa
LEL-LAMP2-△EC/IC-GFP(서열번호 10) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtTATTCCCACAAGGATGAGGTGATTAAGGAAGTCCAGGAGTTTTACAAGGACACCTACAACAAGCTGAAAACCAAGGATGAGCCCCAGCGGGAAACGCTGAAAGCCATCCACTATGCGTTGAACTGCTGTGGTTTGGCTGGGGGCGTGGAACAGTTTATCTCAGACATCTGCCCCAAGAAGGACGTACTCGAAACCTTCACCGTGAAGTCCTGTCCTGATGCCATCAAAGAGGTCTTCGACctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgcttaa
GNSTM(서열번호 11) GGTAACTCGACTATG
SEL(서열번호 12) CTCCGATTCGACTCTCAGACCAAGAGCATCTTCGAGCAAGAAACTAATAATAATAATTCCAGCTTCTAC
Gly(서열번호 13) AAC
GNSTM-LAMP2-GFP(서열번호 14) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTTTGGAACTTAATTTGACAGATTCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCAGATGAATTTCACAGTTCGCTATGAAACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGCACTGTGACATATAATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGAATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGTTCGGACCTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACTTATTCAATTGACAGCGTCTCATTTTCCTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGAAGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTTTTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCAATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATGTTGTCCAACACTACTGGGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACAAATGAGTTCCTGTGTGATAAAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACACCACTGTGCCATCTCCTACTACAACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACTTGCCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTCAGGATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAATACAACTCACTCCACAGGCAGCTGCCGTTCTCACACTGCTCTACTTAGACTCAATAGCAGCACTATTAAGTATCTAGACTTTGTCTTTGCTGTGAAAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGTATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTGGGATGCCCCCCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTAAGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACAAGGAAAGTATTCTACAGCCCAAGAGTGTTCGCTGGATGATGACACCATTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAAGAAAAAGTTATGCTGGATATCAGACTCTGGGAAGCGGATACCCATACGATGTGCCAGATTACGCTAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
GNSTM-LAMP2-△IC-GFP(서열번호 15) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTTTGGAACTTAATTTGACAGATTCAGAAAATGCCACTTGCCTTTATGCAAAATGGCAGATGAATTTCACAGTTCGCTATGAAACTACAAATAAAACTTATAAAACTGTAACCATTTCAGACCATGGCACTGTGACATATAATGGAAGCATTTGTGGGGATGATCAGAATGGTCCCAAAATAGCAGTGCAGTTCGGACCTGGCTTTTCCTGGATTGCGAATTTTACCAAGGCAGCATCTACTTATTCAATTGACAGCGTCTCATTTTCCTACAACACTGGTGATAACACAACATTTCCTGATGCTGAAGATAAAGGAATTCTTACTGTTGATGAACTTTTGGCCATCAGAATTCCATTGAATGACCTTTTTAGATGCAATAGTTTATCAACTTTGGAAAAGAATGATGTTGTCCAACACTACTGGGATGTTCTTGTACAAGCTTTTGTCCAAAATGGCACAGTGAGCACAAATGAGTTCCTGTGTGATAAAGACAAAACTTCAACAGTGGCACCCACCATACACACCACTGTGCCATCTCCTACTACAACACCTACTCCAAAGGAAAAACCAGAAGCTGGAACCTATTCAGTTAATAATGGCAATGATACTTGCCTGCTGGCTACCATGGGGCTGCAGCTGAACATCACTCAGGATAAGGTTGCTTCAGTTATTAACATCAACCCCAATACAACTCACTCCACAGGCAGCTGCCGTTCTCACACTGCTCTACTTAGACTCAATAGCAGCACTATTAAGTATCTAGACTTTGTCTTTGCTGTGAAAAATGAAAACCGATTTTATCTGAAGGAAGTGAACATCAGCATGTATTTGGTTAATGGCTCCGTTTTCAGCATTGCAAATAACAATCTCAGCTACTGGGATGCCCCCCTGGGAAGTTCTTATATGTGCAACAAAGAGCAGACTGTTTCAGTGTCTGGAGCATTTCAGATAAATACCTTTGATCTAAGGGTTCAGCCTTTCAATGTGACACAAGGAAAGTATTCTACAGCCCAAGAGTGTTCGCTGGATGATGACACCATTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggaTACCCATACGATGTGCCAGATTACGCTAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(서열번호 16) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
SEL-LAMP2-△EC-GFP(서열번호 17) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtCTCCGATTCGACTCTCAGACCAAGAGCATCTTCGAGCAAGAAACTAATAATAATAATTCCAGCTTCTACACAGGAGTCctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaagaaaaagttatgctggatatcagactctgggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGtaa
SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP(서열번호 18) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtCTCCGATTCGACTCTCAGACCAAGAGCATCTTCGAGCAAGAAACTAATAATAATAATTCCAGCTTCTACACAGGAGTCctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGtaa
Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP(서열번호 19) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtAACggatctggtctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
LAMP2-EC25△IC-GFP(서열번호 20) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGtaa
GNSTM-LAMP2-EC25△IC-GFP(서열번호 21) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP(서열번호 22) atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtAACggatctggtagggttcagcctttcaatgtgacacaaggaaagtattctacagcccaagagtgttcgctggatgatgacaccattctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGtaa
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP(서열번호 23) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGATCGGGTAGGCACCAGgtaggggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCGTCTATATCATGGCCGACATCTCTGAGCCTGGGAGCTCTGTCGGCCATGATATAGACGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCTAA
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV(서열번호 24) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGATCGGGTAGGCACCAG gtag gggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCGTCTATATCATGGCCGACATCTCTGAGCCTGGGAGCTCTGTCGGCCATGATATAGACGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCGGCAGCGGCCGACCACGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGGTAA
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT)(서열번호 25) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGATCGGGTAGGCACCAGgtaggggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCGTCTATATCATGGCCGACATCTCTGAGCCTGGGAGCTCTGTCGGCCATGATATAGACGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCGGCAGCGGCCGACGAAAAAAGCGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGAAGATTCACTATTAACGGTAA
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT)(서열번호 26) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGATCGGGTAGGCACCAGgtaggggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCGTCTATATCATGGCCGACATCTCTGAGCCTGGGAGCTCTGTCGGCCATGATATAGACGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCGGCAGCGGCCGACGAAAAAAGCGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGGTAA
SEL-LAMP2-△EC/IC-BIV
(서열번호 27)		 atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtCTCCGATTCGACTCTCAGACCAAGAGCATCTTCGAGCAAGAAACTAATAATAATAATTCCAGCTTCTACACAGGAGTCctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGCAGCGGCGGCAGCGGCCGACCACGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGGtaa
SEL-LAMP2-△EC/IC-(Pri-miRNA-199)-BIV
(서열번호 28)		 atggtgtgcttccgcctcttcccggttccgggctcagggctcgttctggtctgcctagtcctgggagctgtgcggtcttatgcagactataaagatgacgatgacaagggctcgagtGgtggaggatctggtCTCCGATTCGACTCTCAGACCAAGAGCATCTTCGAGCAAGAAACTAATAATAATAATTCCAGCTTCTACACAGGAGTCctaatcccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacgtaattggcagaGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctGGATCGGGTAGGCACCAGgtaggggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTCTCTGAGCCTGGGAGCTCACAGTAGTCTGCACATTGGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCGGCAGCGGCCGACCACGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGGTAA
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-scramble shGFP(서열번호 29) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAGACTATAAAGATGACGATGACAAGGGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTGGAAGCGGATACCCATACGATGTGCCAGATTACGCTGGATCGGGTAGGCACCAGgtaggggagctggctgggtggggcagccccgggaaggggggaaagctgaatgcaacccctggtgcaggaagggaggcttttcctgaggaccgggagaggattttaagtacatagaaggaagcttctggagatcctgctccgtcgcCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGTCTCTGAGCCTGGGAGCTCCGAGGGCGACTTAACCTTAGTTAgactgggcaagggagagcaacgccatggaccgctggggacaaaatgggctgtttccaaggagaagacatttgtttgctccttttttgattcttgtcctttccttcccagGGCGTGATGGGCAGCGGCTAA
Double stranded RNA Binding Domain motif(DRBD)(서열번호 30) TTCTTCATGGAGGAACTTAATACATACCGTCAGAAGCAGGGAGTAGTACTTAAATATCAAGAACTGCCTAATT
CAGGACCTCCACATGATAGGAGGTTTACATTTCAAGTTATAATAGATGGAAGAGAATTTCCAGAAGGTGA
AGGTAGATCAAAGAAGGAAGCAAAAAATGCCGCAGCCAAATTAGCTGTTGAGATACTTAATAAGGAA
BIV 유래 RBD(BIV)
(서열번호 31)		 CGACCACGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGG
JDV 유래 RBD(JDV(WT))
(서열번호 32)		 CGACGAAAAAAGCGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGAAGATTCACTATTAA
JDV 유래 변이체 RBD(JDV(MT))
(서열번호 33)		 CGACGAAAAAAGCGTGGGACACGCGGCAAGGGCCGGCGCATTAGGCGG
HIV 유래 RBD(서열번호 34) AGGAAGAAGAGGAGGCAGAGGAGGAGG
실시예 2. 재조합 플라스미드의 발현
재조합 플라스미드를 발현하기 위하여 HEK293T세포 2.5X106 세포수를 100mm2배양접시에서 10% 소태아 혈정 (10% Fetal Bovine Serum (FBS), GibcoTM, Cat No. 16000044)과 1% 항생제 (1% Penicllin/Streptomycin, GibcoTM, Cat No. 15140122)가 포함된 DMEM (Welgene, Cat No. LM001-05) 배양액상태에서 24시간 배양하였다. 표적 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pcDNA3.1(+) 벡터를 PolyJetTM transfection kit (Signagen® Laboratories, Cat No. SL100688)의 방법에 따라 세포에 2μg을 도입하여 48시간 동안 배양하였다.
실시예 2-1. 형광 이미징 실험
세포 내 재조합 플라스미드 형광 발현을 확인하기 위하여, 소태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 종료 후, Cytation 5 (Biotek)을 이용하여 세포내 녹색 형광 발현을 확인하였다.
실시예 2-2. 엑소좀 분리, 단백질 발현, RNA발현 등
1X DPBS (Welgene, Cat No. LB001-02)로 1회 세척후 1mL Trypsin-EDTA (Welgene, Cat No. LS015-10)를 배양접시 에 첨가하여 세포를 배양접시에서 떨어뜨린 후 소태아 혈청 및 항생제가 포함된 DMEM배지 10mL를 첨가하여 세포를 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리하였다. 배양액을 제거하고 모아진 세포를 소태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 10mL를 첨가하여 세포를 풀어준 후, 부유 세포 전용 배양접시 (suspension culture dish, SPL life science, Cat No. 11151)에 첨가하여 1% 항생제만 포함된 DMEM배양액에서 48시간 추가 배양 후 엑소좀 및 세포를 분리하여 단백질 발현 및 RNA발현 실험을 진행하였다.
실험예 1. 변형된 펩타이드를 이용한 활성 단백질의 안정적 발현 및 타겟에의 전달
1. 세포 내 도메인(IC), 세포 외 도메인(EC)의 제거 후 목적 단백질 발현수준 상승효과 확인
(1) 실험방법
도 1과 도 2의 플라스미드 골격구조들에 타겟팅 펩타이드(Targeting peptide)로서 FLAG 단백질을 코딩하는 유전자를, 활성 단백질(Active protein)으로서 GFP를 코딩하는 유전자를 각각 삽입한 후, 실시예 2-1 또는 2-2의 방법에 따라 각각의 재조합 플라스미드들을 과발현시켰다.
즉, 세포의 실제 형광 발현을 확인하기 위해, 실시예 2-1의 방법에 따라 각각의 재조합 플라스미드를 과발현 시킨 후 형광 발현을 측정하였다.
또한, 단백질 발현수준을 확인하기 위해 실시예 2-2 방법에 따라 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 모아진 세포는 1X PBS로 2회 세척 후 1X로 희석한 Cell lysis buffer (10X Cell lysis buffer, Cell Signaling Technology, Cat No. 9803)에 PMSF를 첨가하여 세포에서 단백질을 분리하였다. 이후, 분리한 배양액은 추가로 4000 rpm에서 30분간 원심 분리 후 세포 잔여물을 제거한 후, 상층액을 10kDa Filter tube (Mlliopore, Cat No. UFC9010)에 넣고 4000 rpm에서 30분간 원심분리 한다. 최종적으로 남은 상층액에 1X PBS를 넣고 섞은 후 추가 원심 분리하며 이 과정을 2회 반복한 후 filter tube에 남은 상층액을 27-G바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2 μm필터로 여과하여 단일 크기의 엑소좀을 수득하였다. 상기 세포 lysate와 수득한 엑소좀을 웨스턴 블럿을 통하여, 세포와 엑소좀 안에 들어 있는 재조합 단백질 발현양을 비교하였다.
(2) 실험결과
도 1의 플라스미드들을 과발현시킨 경우, LAMP-2B를 코딩하는 전체서열을 삽입(LAMP2-GFP)한 재조합 플라스미드를 과발현시킨 경우 대비, 세포 내 도메인(LAMP2-△IC-GFP), 세포 외 도메인(LAMP2-△EC-GFP) 또는 이들 모두(LAMP2-△EC/IC-GFP)를 코딩하는 서열이 제거된 서열을 삽입한 재조합 플라스미드를 과발현시킨 경우 FLAG 단백질과 GFP의 발현 수준이 현저히 높았다(도 6, 7). 특히, LAMP2-△EC/IC-GFP의 경우, LAMP2-GFP 대비 세포에서 FLAG단백질은 약 6배-20배, GFP 단백질 은 세포에서 약 50-100배 세포 및 엑소좀에서 증가하였다(도 6A-B). 실제 형광 측정결과 역시, LAMP2-GFP 대비 LAMP2-△IC-GFP, LAMP2-△EC-GFP 및 LAMP2-△EC/IC-GFP에서 형광의 강도가 현저히 강함을 확인할 수 있었고, 특히 LAMP2-△EC/IC-GFP에서의 형광 강도가 가장 강함을 확인할 수 있었다(도 8).
이는, LAMP2의 세포 내 도메인을 제거하는 경우 엑소좀을 분비하는 세포 또는 엑소좀에서 타겟 단백질과 활성 단백질 모두의 안정적 발현을 증가시킬 수 있음을 입증하는 것이고, 더 나아가, LAMP2의 세포 외 도메인까지 제거하는 경우 발현의 안정성을 현저히 증가시킬 수 있음을 보여주는 것이다. 이는, LAMP2가 리소좀 분해에 관여하는 단백질로 알려져 있는데, 이의 세포 내 도메인을 제거함에 따라 리소좀 분해를 회피하여 목적 단백질들의 발현율이 높아지는 것으로 추측한다. 그러나, LAMP2의 세포 외 도메인까지 제거하는 경우, LAMP2 자체의 안정성이 현저히 낮아져 목적 단백질들의 발현율에 부정적인 역할을 예상하였으나, 오히려 발현율이 현저하게 상승하였다는 점은 예상하지 못한 효과이며, 이에 대한 추후 연구가 필요할 것으로 보인다.
또한, 도 2의 플라스미드들을 과발현시킨 경우, LAMP2의 세포 내 도메인을 코딩하는 서열이 제거되지 않은 경우(LEL-LAMP2-△EC) 대비, 제거된 경우(LEL-LAMP2-△EC/IC) 형광 강도가 현저히 강함을 확인할 수 있다(도 9).
이는, LAMP2의 세포 내 도메인을 제거하는 경우 세포 내 도메인에 의한 세포 내 외부 단백질 유입에 따른 세포의 리소좀 분해 작용을 억제함으로써 타겟 단백질과 활성 단백질의 발현수준을 높일 수 있음을 보다 명확하게 보여주는 것으로, LAMP2의 세포 외 도메인 영역에 타 단백질의 세포 외 도메인 영역으로 치환되더라도 같은 결과를 보여주었다.
2. 글리코실화에 의한 발현수준 상승효과 확인
(1) 실험방법
도 3과 도 4의 플라스미드 골격구조들에 타겟팅 펩타이드(Targeting peptide)로서 FLAG 단백질을 코딩하는 유전자를, 활성 단백질(Active protein)으로서 GFP를 코딩하는 유전자를 각각 삽입한 후, 실시예 2-1과 2-2의 방법에 따라 각각의 재조합 플라스미드들을 과발현시켰다. 이 외, 실험방법은 상기 실험예 1-1-(1)에 기재된 바와 같다.
(2) 실험결과
도 3의 플라스미드들을 과발현시킨 경우, GNSTM 모티프 서열에 LAMP2 전체 서열을 포함하는 플라스미드(GNSTM-LAMP2-GFP)는 타겟 단백질인 FLAG 단백질과 활성 단백질인 GFP의 발현량이 매우 낮았다(도 10). 이는, 기존 논문들에서 보고된 바와 불일치하는 결과로, GNSTM 모티프가 실제 LAMP2에서 목적 단백질의 안정화 효과를 제공하지 못하는 것을 의미한다. 그러나, LAMP2의 세포 내 도메인이 제거되거나(GNSTM-LAMP2-△IC-GFP), 이에 더해 세포 외 도메인까지 제거된 경우(GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP), GNSTM 모티프가 목적 단백질들의 발현을 매우 안정화시키는 결과를 보여주었다. 특히, LAMP2의 세포 내 도메인과 세포 외 도메인 모두가 제거된 경우(GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP)는 타겟 단백질인 FLAG 단백질과 활성 단백질인 GFP 모두 발현 수준이 현저히 높았는데, LAMP2 전체 서열에 GNSTM 모티프 서열이 결합된 경우 대비 FLAG은 200-900배 증가하였으며, GFP는 40-80배 증가하였다(도 11). 형광발광 수준 역시 이와 같은 결과를 동일하게 반영하듯, GNSTM-LAMP2-GFP 대비 GNSTM-LAMP2-△IC-GFP에서 형광의 세기가 더 높았고, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP에서는 그 세기가 현저한 차이를 보여주며 강하게 나타났다(도 12).
이러한 경향은 종래 글리코실화된 아미노산을 포함하는 것으로 알려진 CD9 SEL 도메인을 타겟 단백질의 하위 영역에 포함하는 경우에도 동일한 경향을 나타났는데, LAMP2의 세포 외 도메인을 SEL로 치환한 경우 대비(SEL-LAMP2-△EC-GFP), 세포 내 도메인을 더 제거한 경우(SEL-LAMP2-△EC/IC-GFP)에서 형광의 세기가 더 강하게 나타났다(도 13).
또한, LAMP2-△EC/IC-GFP 플라스미드에 FLAG하위에 위치한 링커의 중간 부위에 글리코실화 활성 아미노산인 "GNG (Glycine-Asparagine-Glycine)로 치환하기 위하여 Mutatgenesis kit을 이용하여 해당 위치에 DNA 서열을 치환하였다. 즉, 링커의 아미노산 서열 "GSSGGGSG (DNA서열: ggctcgagtGgtggaggatctggt)"을 "GSSGNGSG (DNA서열: ggctcgagtGgtAACggatctggt)"로 변형시킨 것이다. 그 결과, 타겟 단백질의 하위 영역에 글리코실화 시킨 경우(Gly-LAMP2-△EC/IC-GFP)에서도 동일한 경향을 나타내며, LAMP2의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인을 모두 제거한 경우, GNSTM 모티프의 도입과 SEL의 도입의 경우와 같이 형광의 세기가 매우 강하게 나타남을 확인할 수 있었다(도 14).
또한, LAMP2의 세포 외 도메인 일부를 포함하는 경우 글리코실화의 위치와 구조에 따라 타겟 단백질의 안정화를 보다 높일 수 있을 것이라는 기대 하에, LAMP2의 하위 25개 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 삽입한 플라스미드(LAMP2-EC25△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-EC25△IC-GFP, Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP)를 추가로 제조한 후, 목적 단백질의 발현량을 확인하였다. 그 결과, GNSTM-LAMP2-GFP 대비 GNSTM-LAMP2-EC25△IC-GFP, Gly-LAMP2-EC25△IC-GFP, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP 모두에서 타겟 단백질인 FLAG 단백질과 활성 단백질인 GFP의 발현 수준이 높았고, 특히 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP에서 현저하게 높았다. 즉, 동일한 경향성 하에, LAMP2의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인이 모두 제거된 경우에 가장 높은 목적 단백질의 발현 효과가 나타남을 보여주는 것이다. 또한, LAMP2-EC25△IC-GFP의 경우 보다 높은 목적 단백질 발현수준을 보여주었는데, 이는 GNSTM 모티프가 LAMP2의 세포 외 도메인 존재 하에서는 발현 안정화 효과를 발휘하지 못하는 것을 보여주는 것이라 생각한다(도 15).
이는, 기존 알려진 GNSTM 모티프가 LAMP2와 함께 작용하여 목적 단백질의 발현 안정화 효과를 나타내기 위해서는 적어도 LAMP2의 세포 내 도메인이 제거된 형태여야 하고, 세포 외 도메인까지 제거된 경우 현저하게 목적 단백질의 발현수준을 상승시킬 수 있음을 보여주는 것으로서, 종전 알려진 바로부터 쉽게 예측할 수 없는 결과이다.
3. 엑소좀을 이용한 암 세포 타겟팅
(1) 실험방법
도 3의 플라스미드 골격구조들 중, GNSTM을 포함하는 플라스미드에서 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP의 FLAG발현율이 세포와 엑소좀에서의 발현율이 현저히 증가함을 확인하여, 이 플라스미드의 타겟 펩타이드 위치에 암 표적 펩타이드 서열("MHTAPGWGYNLS")(folate receptor binding peptide)을 코딩하는 핵산 서열로 치환(하기 표 2)한 후 실시예 2-2의 방법에 따라 각각의 재조합 플라스미드들을 과발현시키고, 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 상층액을 추가로 4000 rpm에서 30분간 원심 분리 후 세포 잔여물을 제거하였다. 최종 상층액을 10kDa Filter tube (Mlliopore, Cat No. UFC9010)에 넣고 4000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 최종적으로 남은 상층액에 1X PBS를 넣고 섞은 후 추가 원심 분리하며 이 과정을 2회 반복한 후 filter tube에 남은 상층액을 27-G바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2μm필터로 여과하여 단일 크기의 엑소좀을 수득하였다. 수득한 엑소좀을 BCA kit 로 정량하여 100μg의 엑소좀을 PKH67 green fluorescence cell linker kit (sigma,Cat No. PKH67GL)방법에 따라 염색 하였다. 염색된 엑소좀을 100kDa filter (Mlliopore, Cat No. UFC510008)에 넣고 14000 rcm에서 5분간 원심 분리후 상층액에 1X PBS를 넣고 추가 원심 분리하였으며 이 과정을 2회 반복한다. 최종 엑소좀 산물은 27G바늘이 장착된 0.2μm filter로 여과 후 folate receptor를 발현하는 난소암 세포인 SKOV3 세포에 처리한 후 24시간 배양한다. 배양 종료 후, 1X DPBS로 2회 세척 후 SKOV3 배양액으로 교체하고 녹색 형광 정도를 cytation 5(Biotek)으로 측정하였다.
재조합 플라스미드 구체적인 서열
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-SKOV3 (서열번호 35) ATGGTGTGCTTCCGCCTCTTCCCGGTTCCGGGCTCAGGGCTCGTTCTGGTCTGCCTAGTCCTGGGAGCTGTGCGGTCTTATGCAGGTAACTCGACTATGGGCAGTGGAATGCATACCGCACCGGGATGGGGCTATAACCTGTCG GGCAGTGGATCTGGATCCGGTGGCTCGAGTCTAATCCCAATTATAGTTGGTGCTGGTCTTTCAGGCTTGATTATCGTTATAGTGATTGCTTACGTAATTGGCAGAGGTAGCGGTggaagcggatacccatacgatgtgccagattacgctAAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
(2) 실험결과
플라스미드를 과발현 하지 않은 엑소좀(엑소좀 (+)), 도 3의 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP의 FLAG을 삽입한 엑소좀(대조군 펩타이드 엑소좀 (+))과 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP의 FLAG위치에 암 표적 펩타이드를 삽입한 엑소좀(표적 펩타이드 엑소좀 (+))을 각각 처리한 SKOV3 세포의 형광 발현을 비교한 결과로서, 과발현된 엑소좀의 형광발현이 다른 두 그룹에 비해 현저히 강하고 많은양이 분포함을 확인할 수 있었다 (도 16).
이는 표적 펩타이드를 코딩하는 서열을 탑재한 플라스미드가 안정적으로 세포와 엑소좀에서 발현하고 엑소좀 표면에서 활성을 나타내 선택적으로 암 표적 펩타이드 결합 수용체를 발현하는 세포에 많은 양 이동하게 할 수 있음을 확인한 것으로, 생체분자의 효과적인 발현을 통해 암 타겟팅에 근간한 치료물질로의 사용가능성을 암시하는 것이다.
4. 엑소좀 크기의 분포도 측정
(1) 실험방법
실시예 2-2의 방법에 따라 플라스미드를 형질전환 하지 않은 세포주의 엑소좀(도 17), GNSTM-LAMP2-GFP(도 18), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(도 19)을 과발현시키고, 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 상층액을 추가로 4000 rpm에서 30분간 원심 분리 후 세포 잔여물을 제거하였다. 최종 상층액을 10kDa Filter tube (Mlliopore, Cat No. UFC9010)에 넣고 4000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 최종적으로 남은 상층액에 1X PBS를 넣고 섞은 후 추가 원심 분리하며 이 과정을 2회 반복한 후 filter tube에 남은 상층액을 27-G바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2 μm필터로 여과하여 단일 크기의 엑소좀을 수득하였다. 수득된 엑소좀의 크기를 DLS (Dynamic Light Scattering)로 측정하였다.
(2) 실험결과
도 17 내지 19에서 확인할 수 있듯, 플라스미드를 형질전환 하지 않은 세포주의 엑소좀 (도 17), GNSTM-LAMP2-GFP(도 18), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-GFP(도 19)이 과발현된 엑소좀의 경우 크기에 차이가 없었다. LAMP2의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인 모두를 제거하였음에도 불구하고, 과발현시 엑소좀의 크기에 차이가 없었다. 이는, 본 발명의 LAMP2-△EC/IC를 사용하여도 과발현 후 엑소좀의 기본적 성질에 변화가 없음을 의미하는 것으로 볼 수 있어, 종래 알려진 엑소좀을 사용한 다양한 생물학적 용도로의 활용에 문제가 없음을 시사한다.
실험예 2. 변형된 펩타이드를 이용한 활성 RNA의 안정적 발현 및 타겟에의 전달
1. 발현수준 확인
(1) 실험방법
도 5의 플라스미드 골격구조들에 타겟팅 펩타이드(Targeting peptide)로서 FLAG 단백질을 코딩하는 유전자를, 활성 단백질(Active protein) 로서 RNA와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자를 각각 삽입한 후, 실시예 2-2의 방법에 따라 각각의 재조합 플라스미드들을 과발현시켰다.
세포에서의 활성 shRNA 발현수준을 확인하기 위해, 실시예 2-2 방법에 따라 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 모아진 세포는 1X PBS로 2회 세척 후 Trizol 방법으로 (ThermoFisher Scientific, Cat No. 15596026) RNA를 분리한 후 500ng RNA에 polyadenylation kit(Enzynomics, Cat No. EX041S)를 이용하여 RNA에 poly A서열을 결합 시키고 PrimeScriptTM cDNA kit (Takara,Cat No. 6210A)의 도입 shRNA서열 특이적 primer를 이용하여 gene specific primer cDNA합성방법에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA합성 후 표적 shRNA 서열 Taqman probe를 이용하여 TOPrealTM Probe qPCR PreMix (Enzynomics, Cat. No. RT600S)로 shRNA의 발현양을 측정하였다.
엑소좀에서의 활성 shRNA 발현수준을 확인하기 위해, 실시예 2-2 방법에 따라 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 상층액을 추가로 4000 rpm에서 30분간 원심 분리 후 세포 잔여물을 제거하였다. 최종 상층액을 10kDa Filter tube (Mlliopore, Cat No. UFC9010)에 넣고 4000 rpm에서 30분간 원심분리 한다. 최종적으로 남은 상층액에 1X PBS를 넣고 섞은 후 추가 원심 분리하며 이 과정을 2회 반복한 후 filter tube에 남은 상층액을 27-G바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2μm필터로 여과하여 단일 크기의 엑소좀을 수득하였다. 모아진 엑소좀은 Trizol 방법으로 (ThermoFisher Scientific, Cat No. 15596026) RNA를 분리한 후 500ng RNA에 polyadenylation kit(Enzynomics, Cat No. EX041S)를 이용하여 RNA에 poly A서열을 결합 시키고 PrimeScriptTM cDNA kit (Takara,Cat No. 6210A)의 도입 shRNA서열 특이적 primer를 이용하여 gene specific primer cDNA합성방법에 따라 cDNA 를 합성하였다. cDNA합성 후 표적 shRNA 서열 Taqman probe를 이용하여 TOPrealTM Probe qPCR PreMix (Enzynomics, Cat. No. RT600S)로 shRNA의 발현양을 측정하였다.
활성 shRNA포함 엑소좀 처리 SKOV3세포에서의 GFP발현양 측정을 위해, 엑소좀 분리 실시예 2-2의 방법에 따라 배양 종료 후 50mL conical tube (SPL, Cat No. 50040)에 세포와 배양액을 모아 1000 rpm에서 2분동안 원심 분리 후 상층액을 추가로 4000 rpm에서 30분간 원심 분리 후 세포 잔여물을 제거하였다. 최종 상층액을 10kDa Filter tube (Mlliopore, Cat No. UFC9010)에 넣고 4000 rpm에서 30분간 원심분리 한다. 최종적으로 남은 상층액에 1X PBS를 넣고 섞은 후 추가 원심 분리하며 이 과정을 2회 반복한 후 filter tube에 남은 상층액을 27-G바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2 μm필터로 여과하여 단일 크기의 엑소좀을 수득하였다.
shGFP를 포함하는 엑소좀의 GFP 과발현 세포에서의 발현 억제 효능을 검증하기 위해, SKOV3 세포주 1X105세포수를 6well plate 각 well에 분주후 24시간 배양한다. PolyJetTM transfection kit (Signagen® Laboratories, Cat No. SL100688) 방법에 따라 GFP형광 벡터인 pAcGFP1-N1 (Clonetech, PT3716) 500ng을 각 well에 도입한 후 24시간 후에 새로운 배양액으로 교체하였으며 상기 분리한 shRNA를 포함하는 엑소좀을 각 well당 50μg 처리 48시간 후에 GFP형광 및 단백질 발현양을 측정하였다.
(2) 실험결과
GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT) 4개의 플라스미드 과발현 모델 모두, 세포에서 엑소좀 단독 처리군 대비 (NC) 대조군 대비 높은 발현량을 나타냈다. 특히, BIV 유래 RBP와 JDV 유래 RBP를 활성 단백질로 삽입한 경우, 삽입하지 않은 경우 (w/o BIV: RBP없는 구조) 대비 엑소좀 전체에서 shGFP의 발현량이 다른 군 대비 현저하게 높았다. JDV 야생형 유래 RBP를 삽입한 경우, BIV 유래 RBP를 삽입한 경우 대비 약 80배의 차이가 날 정도로, 가장 효과가 우수했다(도 20).
또한, GNSTM이 아닌 SEL을 이용한 글리코실화 모델인 SEL-LAMP2-△EC/IC-(Pri-miRNA-199)-RBP 플라스미드를 과발현시킨 경우에도, 형질주입된 세포에서 miRNA-199가 우수하게 발현됨을 확인하였다(도 21).
이들 실험결과는, LAMP2의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인이 모두 제거된 형태와, 글리코실화의 도입에 의해, 형질주입된 세포와 이로부터의 엑소좀 모두에서 안정적으로 RNA와 활성 단백질을 발현시킬 수 있음을 보여주는 것으로서, 최종적으로 엑소좀을 통해 생리활성 핵산분자를 전달할 수 있는 가능성을 암시하는 것이다.
2. 전달수준 확인
SEL을 이용한 글리코실화 모델인 SEL-LAMP2-△EC/IC-(Pri-miRNA-199)-RBP 플라스미드를 과발현시킨 경우, 이를 형질주입한 세포를 제거한 후 분리된 엑소좀을 처리한 세포에서도 miRNA-199가 우수하게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 21).
또한, GNSTM을 이용한 글리코실화 모델인 GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-BIV, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT), GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(MT) 4개 플라스미드를 과발현시킨 경우에서도, 이들을 형질주입한 세포를 제거한 후 분리된 엑소좀을 처리한 GFP 단백질 형질 전환 SKOV3 세포주에서 shGFP가 우수하게 발현되어 GFP의 발현(RNA 수준, Protein 수준)을 매우 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다(도 22, 23). 특히, RBP로서 JDV(WT) 유래 단백질을 활성 단백질로 사용한 경우에 가장 효과가 우수했고, 이러한 경향은 타겟 세포에서의 웨스턴 블롯 결과와, 형광 분석 결과에서도 동일하게 나타났다(도 24, 25). 형광 분석 결과는 특히, GNSTM-LAMP2-△EC/IC-shGFP-JDV(WT) 플라스미드 과발현의 경우에 GFP mRNA와 단백질을 90 내지 99%까지 억제시킬 수 있음을 보여주었다.
이들 실험결과는, LAMP2의 세포 외 도메인과 세포 내 도메인이 모두 제거된 형태와, 글리코실화의 도입에 의해, 형질주입된 세포와 이로부터의 엑소좀 모두에서 안정적으로 RNA와 활성 단백질을 발현시킴과 동시에, 최종적으로 엑소좀 내 RNA와 RBP간 결합이 효율적으로 해리되어 RNA가 표적 세포에 성공적으로 전달되었음을 의미한다. 특히, JDV 유래 RBP와 글리코실화된 LAMP2-△EC/IC가 삽입된 플라스미드의 경우, shRNA의 활성을 극대화시킬수 있음을 보여준다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. LAMP-2B(Lysosome-Associated Membrane Glycoprotein 2B)의 세포 내 도메인(intracellular domain)과 세포 외 도메인(extracellular domain) 이 모두 제거된 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 4의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것인, 플라스미드.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 플라스미드는 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 것인, 플라스미드.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 상위(upstream) 영역에 위치하는 것인, 플라스미드.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11 내지 13 중 어느 하나의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것인, 플라스미드.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 11의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것인, 플라스미드.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 플라스미드는 서열번호 4의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열 및 서열번호 11의 핵산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것인, 플라스미드.
  12. 청구항 1, 6 내지 11 중 어느 한 항의 플라스미드 내, 발현 및 전달을 목적하는 생체분자를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 재조합 플라스미드.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 생체분자를 코딩하는 핵산 서열은 i) 상기 글리코실화된 영역을 코딩하는 핵산 서열과 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열 사이, ii) 상기 변형 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기준으로 하위(downstream) 영역 또는 iii) 이들 모두에 위치하는 것인, 재조합 플라스미드.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 생체분자는 핵산분자(nucleic acid molecules), 압타머(aptamer), 펩타이드(peptides), 단백질(protein), 글라이코프로테인(glycoproteins), 리포프로테인(lipoproteins), 면역글로불린(immunoglobulins), 호르몬(hormone), 성장인자(growth factor), 재조합 효소(recombinase) 및 형광단백질(fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 재조합 플라스미드.
  15. 청구항 12의 재조합 플라스미드로부터 발현된 산물을 포함하는, 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 엑소좀.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 생체분자는 엑소좀의 외부에 발현되어 타겟하는 세포의 표면에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 것인, 엑소좀.
  17. 청구항 15의 엑소좀을 포함하고, 상기 생체분자는 암 세포 표면 특이적 발현 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 포함하는 것인, 암의 진단을 위한 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 암은 난소암인, 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
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