CN109439637B - 一种基于人钙调蛋白磷酸酶b亚基的靶向肽、制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于人钙调蛋白磷酸酶b亚基的靶向肽、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的靶向肽，该靶向肽是以CNB为基础的截短体。同时本发明公开了一种以Trun3作为靶向肽运输抗肿瘤药物的制备方法，用于介导抗肿瘤药物靶向到肿瘤部位的治疗方案。本发明的实验证明，Trun3融合蛋白能靶向到许多TLR4高表达的恶性肿瘤组织内，从而提高抗肿瘤药的药效，降低抗肿瘤药的副作用，起到靶向治疗的效果。Trun3是基于CNB的序列发明的，CNB是一个具有良好前景的抗肿瘤药物，因此该片段Trun3本身也具有一定的抗肿瘤效果，在抗肿瘤药物的治疗方面具有较好的应用前景。

Description

一种基于人钙调蛋白磷酸酶B亚基的靶向肽、制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种基于人钙调蛋白磷酸酶B亚基的多肽序列及用此序列作为靶向肽进行肿瘤治疗的方法。
背景技术
钙调蛋白磷酸酶是目前已知的唯一一个活性受Ca+/钙调素(CaM)调节的丝(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白磷酸酶。钙调蛋白磷酸酶由A，B两个亚基按1：1的比例组成，CNA是催化亚基，CNB是调节亚基。CNB基本的功能是调节CNA的催化活性，但是越来越多的研究表明，CNB有独立于CN的生理作用，CNB的缺失会增加患鳞状细胞癌的风险。我们实验室的研究表明，重组钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)具有良好的抗肿瘤效果，能显著抑制肉瘤，肝癌，胃癌，肺癌等多种荷瘤小鼠的生长。进一步的研究表明，rhCNB是一个免疫调节蛋白，主要调节了先天免疫细胞的活性，比如它能诱导DCs细胞的成熟，提高其抗原递呈能力，促进巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤活性，并诱导相关细胞因子的分泌和生产。
人的CNB由170个氨基酸组成，具有4个EF-hand结构，EF-hand的典型结构特征是螺旋-环-螺旋结构，每个EF-hand结构均可以结合一个钙离子，不同的EF-hand区域对钙离子的结合亲和力不同，甚至可以相差100万倍左右。此外，CNB还是高度疏水的分子，疏水性可能与CNB的抗肿瘤活性有关。
把抗肿瘤药物运输至肿瘤细胞是肿瘤靶向治疗的主要目的，可以大大减少药物的副作用，提高抗肿瘤药物的作用效果。基于肽的靶向运输系统是一个不错的选择，肽具有良好的生物降解性，生物相容性，低毒和易于合成的优点，此外，能进入细胞内部的药物运输系统具有更重要的价值，因此发展基于肽的靶向运输系统在抗肿瘤药物的开发中具有重要意义。
发明内容
本发明拟解决的关键问题是用CNB的截短体进行抗肿瘤治疗，克服CNB的耐药性，并将其作为靶向肽与其他抗肿瘤药物连接运输抗肿瘤药物至肿瘤部位，减少副作用，提高抗肿瘤治疗效果。
本发明采用了如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种靶向肽，所述靶向肽的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者
(3)对(1)或(2)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其靶向肽功能不变的氨基酸序列。
本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：
(1)非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；
(2)极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；
(3)带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；
(4)带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala和Ser、Val和Ile、Asp和Glu、Ser和Thr、Ala和Gly、Ala和Thr、Ser和Asn、Ala和Val、Ser和Gly、Tyr和Phe、Ala和Pro、Lys和Arg、Asp和Asn、Leu和Ile、Leu和Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在本发明的靶向肽上的任意一个氨基酸残基位置上。相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。
本发明的靶向肽还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有前面所述的氨基酸序列的靶向肽存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他己知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
优选地，所述靶向肽的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
更优选地，所述靶向肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了前面所述的靶向肽的制备方法，所述制备方法包括不限于化学合成法、基因重组表达法。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了编码前面所述的靶向肽的核苷酸序列。
本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的靶向肽功能不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述的靶向肽功能一致的氨基酸序列。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了包含前面所述的核苷酸序列的重组载体。
本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的靶向肽的核苷酸序列。
在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域己知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用Sal I、BamH I、EcoR I等，对于pET28a，可用Ndel、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII等，对于pET28b可用EcoRI、Nde I、BamH、HindIII等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了包含前面所述的重组载体的重组宿主细胞。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。最优选所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。
可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化本发明的靶向肽。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化本发明的靶向肽。对于分离纯化所得的本发明的靶向肽的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含前面所述的靶向肽。
所述融合蛋白还包括其他蛋白序列或多肽序列，所述其他蛋白序列或多肽序列连接在融合蛋白的N端或C端，所述其他蛋白序列或多肽序列通过Linker连接到前面所述的靶向肽上。
可用于本发明的Linker序列可以是(GGGS)m，其中m＝1、2、3、4…………。
在本发明的具体实施方案中，所使用的Linker序列是GGGSGGGS。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述的靶向肽。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的成分。该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、抑菌剂、稳定剂、悬浮剂、增溶剂、表面活性剂(例如润湿剂)、着色剂和致等渗(isotonicizing)溶质(即其使制剂与目标患者的血液或其它相关的体液等渗)。适当的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药学书籍中找到。参见，例如药物添加剂手册(Handbookof PharmaceuticalAdditives)，第二版(编者M.Ash和I.Ash)，2001(SynapseInformation Resources，Inc.，Endicott，New York，USA)；Remington′sPharmaceutical Science，第18版，MackPublishing Company，Easton，Pa.，1990；以及药物赋形剂手册(HandbookofPharmaceutical Excipients)，第二版，1994。
文中使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们在医学判断的合理范围内，适于与上述患者(例如人类)的组织接触，并未带来过度的不希望的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并有合理的益处/风险比。每种载体、稀释剂、赋形剂等还必须就与组合物的其它成分可配伍的意义而言是“可接受的”。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种靶向递送系统，所述靶向递送系统包含前面所述的靶向肽。
进一步，所述靶向递送系统还包括功能体；所述功能体包括治疗剂、诊断剂；所述功能体与所述靶向肽的N端连接或C端连接。
所述治疗剂包括抗体药物、小分子药物、抗生素、多肽、肽核酸、纳米粒、或脂质体；所述诊断剂包括荧光物质。
进一步，所述治疗剂包括但不限于抗体药物、小分子药物、抗生素、多肽、肽核酸、纳米粒、脂质体。
抗体药物可以是针对任何肿瘤分子的抗体药物，只要其能治疗该肿瘤即可。抗体药物包括：分子靶向单抗药物、靶向抗体偶联药物、双特异性抗体药物、靶向免疫检验点药物等。这样的抗体药物的实例包括但不限于：利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、地诺单抗、伊匹木单抗、本妥昔单抗、帕妥珠单抗、ado-曲妥珠单抗、阿托珠单抗、雷莫芦单抗、派姆单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、达雷木单抗、地努图希单抗、耐昔妥珠单抗、埃罗妥珠单抗、阿特朱单抗、阿维单抗、狄诺塞麦、吉姆单抗、Necitumumab、Atezolizumab。
进一步，所述抗生素包括抗肿瘤抗生素，是由微生物代谢产生的具有抗肿瘤活性的化学物质。可用于本发明的抗肿瘤抗生素包括C1027、丝裂霉素、阿霉素、CC-1065、adozelesin、ducarmycins、gilvusmycin、四环素类、肉桂酰胺、MMI-166、batimastat、绿茶多酚、丹酚酸A、C3368-A、C3368-B、大黄素、三环吡喃酮类、gel danamycin、17AAG、紫杉酸、epothilone A、epothilone B、卡里奇霉素、力达霉素。
进一步，所述小分子药物通常是信号传导抑制剂，它能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路，从而达到治疗的目的，小分子药物的实例包括但不限于：伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、依维莫司、厄洛替尼、舒尼替尼、依鲁替尼、索拉非尼、克唑替尼、帕唑帕尼、吉非替尼、卡非佐米、托法替尼、阿西替尼、瑞戈非尼、威罗非尼、西罗莫司、泊那替尼、乐伐替尼、奥拉帕尼、阿柏西普、色瑞替尼、罗米地辛、艾乐替尼、贝利司他、博舒替尼、凡德他尼、卡博替尼、帕比司他、阿法替尼、帕利夫明、曲美替尼、达拉非尼、坦西莫司、拉帕替尼、伏立诺他、Venetoclax、格列卫、易瑞沙。
进一步，所述多肽的实例包括但不限于毒素、环肽、微管抑制因子、蛋白酶激活受体。毒素的实例如鹅膏蕈碱，环肽的实例如鬼笔环肽，微管抑制因子实例如单甲基艾瑞他汀E(MMAE)，蛋白酶激活受体实例如P1AP。
进一步，所述肽核酸包括anti-miR(反义核酸)寡核苷酸肽。
进一步，纳米粒包括壳聚糖靶向纳米粒、长循环纳米粒、聚乳酸纳米粒、固体脂质纳米粒、金纳米粒、载多柔比星介孔硅纳米粒、超顺磁性氧化铁纳米粒。
进一步，所述脂质体包括磷脂、胆固醇。
本发明所述的磷脂包括但不限于，大豆磷脂(SPC)、聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二硬酯酰卵磷脂(DPPC)，二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的任一种或任几种的混合，其中优选的为：大豆卵磷脂(SPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
进一步，所述诊断剂包括荧光物质。荧光物质包括但不限于荧光蛋白或荧光染料；荧光染料包括Alexa750、Alexa546、Alexa647、Cy5.5、DyLight 680、DyLight 680 4*PEG-conjugate(DyP680)、
Figure BDA0001860308190000081
(IR680)、
Figure BDA0001860308190000082
(IR800)、吲哚花青绿ICG、PE、Percy-Cy5.5、FITC、APC、Cy7、FITC、GFP、Alexa Fluar488、Bidipy、Fluo-3、PropidiumIodide(PI)、PerCP、PE-Cy5、PE-Teses Red、7-AAD、PE-Cy7、PE-Alexa Flour750、AlexaFluor660、Alexa Fluor700、APC-Cy7、APC-Alexa Flour750、Hoechsr33342-Blue、DAPI、Hoechsr33342-Red、arific Blue、Cascade Blue、Alexa Flour 405、Parific orange。
根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的靶向肽在制备前面所述的融合蛋白、药物组合物或靶向递送系统中的应用。
所述融合蛋白、药物组合物或靶向递送系统靶向表达TLR4受体复合物的细胞。
优选地，所述表达TLR4受体复合物的细胞包括肿瘤细胞。
本发明的优点和有益效果：
本发明的实验证明，以Trun3作为靶向肽，与目的蛋白融合后，可以很好的将目的蛋白运输到肿瘤细胞内部、或TLR4高表达的肿瘤组织部位。因此，基于CNB的此段序列在肿瘤的靶向治疗中具有重要的意义。
附图说明
图1显示靶向肽融合蛋白的结构示意图；
图2显示靶向肽融合蛋白的细胞荧光图；
图3显示靶向肽融合蛋白的细胞荧光强度统计图；
图4显示靶向肽融合蛋白的免疫印迹结果图；
图5显示靶向肽在动物活体内的显像图，其中，A：动物整体；B：离体组织。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围内。
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1靶向肽融合蛋白的表达
1、靶向肽融合蛋白结构设计
靶向肽融合蛋白的结构示意图如图1所示，GFP位于融合蛋白N端，全长CNB或不同长度的CNB截短体位于融合蛋白C端，中间用GGGSGGGS linker连接。每个CNB截短体所含的氨基酸个数以及氨基酸在全长CNB中的分布如图显示。GFP-CNB包含的全长CNB具有第1-170位氨基酸序列(如SEQ ID NO.3所示)；GFP-Trun1包含的CNB截短体Trun1具有全长CNB的第1-85位氨基酸序列；GFP-Trun2包含的CNB截短体Trun2具有全长CNB的第86-170位氨基酸序列；GFP-Trun3包含的CNB截短体Trun3具有全长CNB的第125-170位氨基酸序列(KDTQLQQIVDKTIINADKDGDGRISFEEFCAVVGGLDIHKKMVVDV，如SEQ ID NO.1所示)；GFP-Trun4包含的CNB截短体Trun4具有全长CNB的第1-115位氨基酸序列；GFP-Trun6包含的CNB截短体Trun6具有全长CNB的第1-124位氨基酸序列
(MGNEASYPLEMCSHFDADEIKRLGKRFKKLDLDNSGSLSVEEFMSLPELQQNPLVQRVIDIFDTDGNGEVDFKEFIEGVSQFSVKGDKEQKLRFAFRIYDMDKDGYISNGELFQVLKMMVGNNL，如SEQ ID NO.2所示)。
2、融合蛋白表达纯化
以全长CNB基因序列为模板，扩增出不同长度截短体的DNA序列，双酶切PCR产物和含GFP基因的质粒载体；连接PCR产物和质粒载体的酶切产物形成融合载体；将构建的融合载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。大肠杆菌细胞在补充有1％酪蛋白氨基酸(BD，NJ，USA)，0.5％酵母提取物(Amersco，Solon，OH，USA)和100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37℃，培养至中对数生长期，加入IPTG诱导数小时。离心收集菌体，在冰上用含有30mM咪唑、0.3M NaCl的binding buffer重悬菌液，超声破碎后，离心收上清(蛋白粗提液)，用AKTA系统进行纯化，1ml预装Ni柱，流速为1ml/min。经过上样，洗杂，洗脱，收样；再经离子交换柱，G25脱盐柱后得到纯化的蛋白。将纯化的蛋白浓缩，应用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce，Rockford，IL，USA)测定其蛋白浓度。
3、融合蛋白入胞内化筛选
将SK-HEP-1细胞以3×104个/孔铺到24孔板中，贴壁后，用上述纯化所得到的融合蛋白以10μM的量加入24孔板与SK-HEP-1共孵育30min，37℃；经洗涤，酸剥液洗，固定后，进行拍照观察。之后收集细胞经过裂解、免疫印迹实验检测融合蛋白的表达情况。
荧光结果如图2所示，GFP-CNB、GFP-Trun3和GFP-Trun6能够使SK-HEP-1细胞带上绿色荧光，而GFP-Trun1、GFP-Trun2、GFP-Trun4则不能使细胞染上荧光，同时GFP也不能使细胞染上荧光，以上结果说明GFP-CNB、GFP-Trun3和GFP-Trun6可以进入细胞，并且它们入胞并不是由于GFP的存在所造成的。另外，观察GFP-CNB、GFP-Trun3和GFP-Trun6的荧光强度以及荧光强度统计结果(图3)可以看出，GFP-Trun3的荧光强度优于GFP-Trun6，表明截短体Trun3的内化效率高于Trun6。
免疫印迹实验结果如图4所示，GFP-CNB、GFP-Trun3和GFP-Trun6均能在细胞中检测到，且GFP-Trun3的含量高于GFP-Trun6，表明截短体Trun3的内化效率高于Trun6。
实施例2靶向肽在动物活体内的靶向运输
1、肿瘤动物模型建立
将购买的Balb/c 5-6周龄雌性裸鼠进行随机分组，皮下接种2*106个HepG2肿瘤细胞至小鼠腋下，待肿瘤长至黄豆大小，约200-500mm3，即可进行实验。
2、靶向肽的荧光标记
选取花氰染料Cy7作为荧光物质，按照常规技术对Trun3截短体(可化学合成)和全长CNB(可化学合成)进行标记，标记好的靶向肽用于靶向研究。
3、靶向肽的实时荧光定量检测
将小鼠分为3组，空白对照组(1只)，阳性对照CNB-Cy7(4只)，实验组Trun3-Cy7(4只)；然后将Cy7标记好的蛋白用BCA蛋白定量分析试剂盒测浓度，用PBS将蛋白稀释至1.25mg/mL；空白对照组不做任何处理，进行荧光拍摄和X光拍摄，用于排除本底的荧光污染，正常情况下是检测不到荧光信号的；对阳性对照组，实验组分别通过尾静脉注射200μl相应的标记蛋白；分别在2h、4h、、6h、8h、10h、24h、进行活体成像系统的拍照观察；拍照前用1％的戊巴比妥钠进行麻醉，注意麻醉剂的用量，过多可能造成小鼠死亡，过少小鼠表现出抽搐；在6h、10h及24h将小鼠处死解剖取出肿瘤组织，并同时取出心脏，肝脏，肺，脾脏等组织，进行离体拍摄，进一步检测靶向肽是否靶标到肿瘤组织上。实验结果如图5显示，阳性对照组和实验组都表现出了靶向肽在肿瘤部位的富集，说明CNB-Cy7与Trun3-Cy7对肿瘤有靶向作用，二者在肿瘤部位的富集表现出随着时间先上升后下降的趋势，其中在6h-10h这段时间内表现出最强的荧光信号，说明靶向肽在肿瘤内的含量达到峰值。在24h后解剖的肿瘤中还能检测到较强的药物信号，说明Trun3能够在较长的一段时间驻留在肿瘤组织中，这对Trun3无论是进一步开发靶向肽还是作为抗肿瘤药物的研究都具有重要意义。
实施例3抗肿瘤靶向药物的靶向运输
根据前面实施例的实验结果可以得出，Trun3和Trun6可以作为靶向运输肽，将其他物质带入肿瘤细胞或者肿瘤组织，因此可以将抗肿瘤药物与Trun3或Trun6连接，将其以静脉注射、口服或者其他方式导入到肿瘤患者体内，使得抗肿瘤药物靶向肿瘤组织，特异性的杀伤肿瘤细胞，减少肿瘤治疗的药物副作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司、魏群
<120> 一种基于人钙调蛋白磷酸酶B亚基的靶向肽、制备方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Asp Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala
1 5 10 15
Asp Lys Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val
20 25 30
Val Gly Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val
35 40 45
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp
1 5 10 15
Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu
20 25 30
Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr
50 55 60
Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser
65 70 75 80
Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe
85 90 95
Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu
100 105 110
Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Leu
115 120
<210> 3
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp
1 5 10 15
Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu
20 25 30
Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr
50 55 60
Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser
65 70 75 80
Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe
85 90 95
Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu
100 105 110
Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Leu Lys Asp Thr Gln
115 120 125
Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys Asp Gly
130 135 140
Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly Gly Leu
145 150 155 160
Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val
165 170

Claims (11)

1.一种靶向肽，其特征在于，所述靶向肽的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者，
(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的靶向肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括化学合成法、基因重组表达法。
3.编码权利要求1所述的靶向肽的核苷酸序列。
4.包含权利要求3所述的核苷酸序列的重组载体。
5.包含权利要求4所述的重组载体的重组宿主细胞。
6.一种融合蛋白、靶向药物或靶向递送系统，其特征在于，所述融合蛋白、靶向药物或所述靶向递送系统包含权利要求1所述的靶向肽。
7.根据权利要求6所述的靶向递送系统，其特征在于，所述靶向递送系统包括功能体；所述功能体包括治疗剂、诊断剂；所述功能体与所述靶向运输肽的N端连接或C端连接。
8.根据权利要求7所述的靶向递送系统，其特征在于，所述治疗剂包括抗体药物、小分子药物、抗生素、多肽、肽核酸、纳米粒、或脂质体；所述诊断剂包括荧光物质。
9.权利要求1所述的靶向肽在制备权利要求6-8中任一项所述的融合蛋白、靶向药物或靶向递送系统中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白、靶向药物或所述靶向递送系统靶向表达TLR4受体复合物的细胞。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述表达TLR4受体复合物的细胞包括肿瘤细胞。
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A Truncated HIV-1 Tat Protein Basic Domain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus;Eric Vives et al;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;19970620;第272卷(第25期);摘要，第10页最后一段 *
Cellular uptake of exogenous calcineurin B is dependent on TLR4/MD2/CD14 complexes, and CnB is an endogenous ligand of TLR4;Jinju Yang et al;《Scientific Reports》;20160419;摘要，第10页最后一段 *
Jinju Yang et al.Cellular uptake of exogenous calcineurin B is dependent on TLR4/MD2/CD14 complexes, and CnB is an endogenous ligand of TLR4.《Scientific Reports》.2016, *

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