KR100874156B1 - ＭＤＲ１에 대한 ｓｈＲＮＡ 및 ＮＩＳ를 발현하는 재조합벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS를 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 숙주세포내에서 MDR1에 대한 shRNA와 NIS를 효율적으로 발현시키는 재조합 벡터, 이를 포함하는 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터를 포함하는 종양성 질환 치료용 조성물 및 상기 재조합 벡터를 이용한 종양성 질환 위치의 영상화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포내에서 MDR1에 대한 shRNA와 NIS를 효율적으로 발현시켜 항암제의 병합치료에 뛰어난 효과를 가지며 종양성 질환 위치의 영상화가 가능하게 하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터는 종양성 질환의 치료의 목적에 다른 항암제와 병합하여 사용할 수 있다.

MDR1, shRNA, NIS, 재조합 벡터, 종양, 치료

Description

ＭＤＲ１에 대한 ｓｈＲＮＡ 및 ＮＩＳ를 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vector expressing shRNA for MDR1 and NIS and use thereof}

도 1은 본 발명의 shMDR-NIS 재조합 벡터의 발현 구조체(A) 및 개열지도(B)를 나타낸 것이다.(P_U6 : U6 프로모터, P_CMV : CMV 프로모터, NIS : 요오드화 나트륨 심포터, P_SV40 : SV40 프로모터, Neo^r : 네오마이신 저항성 유전자)

도 2는 본 발명의 형질전환 세포에서 MDR1에 대한 shRNA의 발현으로 MDR1의 발현이 감소하는 것을 RNA 수준(A) 및 단백질 수준(B)에서 확인한 것이다.

도 3은 본 발명의 형질전환 세포에서 NIS의 발현을 단백질 수준(A) 및 면역형광염색(B)으로 확인한 것이다.

도 4는 본 발명의 형질전환 세포의 항암제(파클리탁셀) 축적능을 조사한 것이다.

도 5는 본 발명의 형질전환 세포의 항암제(독소루비신)에 대한 감수성을 조사한 것이다.

도 6은 본 발명의 형질전환 세포의 요오드 축적능을 조사한 것이다.(blank : 실험군, solid : 대조군)

도 7은 본 발명의 형질전환 세포의 시간에 따른 요오드 축적(A) 및 배출(B) 을 조사한 것이다.

도 8은 본 발명의 형질전환 세포에서의 항암제 병용치료 효과를 확인한 것이다.

도 9는 본 발명의 형질전환 세포를 이식한 동물모델에서 암 조직을 영상화하여 나타낸 것이다.

본 발명은 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS를 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 숙주세포내에서 MDR1에 대한 shRNA와 NIS를 효율적으로 발현시키는 재조합 벡터, 이를 포함하는 형질전환 세포, 상기 재조합 벡터를 포함하는 종양성 질환 치료용 조성물 및 상기 재조합 벡터를 이용한 종양성 질환 위치의 영상화 방법에 관한 것이다.

암은 형질전환(形質轉換)된 세포의 억제되지 않는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환으로서, 대부분의 암은 환경적 요인, 유전적 요인 등의 여러 원인에 의해 발암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)에 변이가 일어나 발생한다. 암세포는 초기에는 증식하여 인접한 조직에 침투하여 이를 파괴하다가, 점점 순환계를 침범하여 암 발생부위로부터 멀리 떨어진 신 체의 다른 부위로 전이되어 결국 개체를 죽게 한다.

이러한 암을 치료하기 위하여 외과적 수술, 방사능 요법, 화학 요법 등이 다양하게 사용되고 있으며, 다양한 물질들에서 항암 효과를 지닌 성분들이 밝혀져서 이용되고 있으나, 대부분의 화학적 항암제들은 정상세포에 오히려 독성을 나타내기 때문에 새로운 암 치료방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.

더욱이, 암은 종양 세포가 원래 부위로부터 퍼져 전이되는 특성을 가지고 있기 때문에 외과적 수술, 방사능 요법, 화학 요법 등의 진보에도 불구하고, 질병이 전이되는 결과로서 많은 암 환자가 사망한다. 따라서, 이러한 종양 세포의 전이 부위의 효율적인 탐색을 위한 영상화 방법 등의 검출방법의 개발 역시 요구되고 있다.

요오드화 나트륨 심포터(NIS, Sodium iodide symporter)는 갑상선 소포성 세포(thyoid follicular cells)의 막을 가로질러 1개의 요오드(iodide) 이온과 2개의 나트륨이온의 능동적 포획을 매개하는 막 당단백질(glycoprotein)이다(Dai, G. et al., Nature, 379: 458-460, 1996; Carrasco, M. et al., Biochim Biophys Acta, 1154:65-82, 1993). 최근 NIS 유전자에 대한 클로닝 및 기능적 연구를 통해 NIS가 종양 치료를 위한 대상이 될 수 있는 점(Spizweg, C. et al., Gene Therapy, 8:1524-1531, 2001; Nakamoto, Y. et al., J Nucl Med, 41:1898-1904, 2000; Dingli, D. et al., Blood, 102:489-496, 2003) 및 종양 세포의 영상화를 위한 대상이 될 수 있는 점(Mandell, R. B.et al., Cancer Res, 59:661-668, 1999; Spizweg, C. et al., Cancer Res, 60:6526-6530, 2000)이 밝혀졌다.

한편, P-당단백질(P-glycoprotein)은 ATP 바인딩 카세트 트랜스포터(ATP binding cassette transporter)로 분류되는 막 단백질로서(Ambudkar, S. V. et al., Oncogene, 22:7468-7485, 2003), P-당단백질은 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴(vincristine)과 같이 구조적이나 표적물질에 대한 특이성 등이 서로 상이한 비관련성 약제들에 대한 저항성(resistance)에 관여하며, 이들 저항성으로 인해 암의 화학적치료(chemotherapy) 제제에 의한 치료가 제약을 받아왔다. 이에 이러한 저항성을 극복하기 위하여 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 라이보자임, 전사인자 등과 같은 물질들이 이용되었으나(Mechetner, E. B. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89:5824-5828, 1992; Holm, P. S. et al., Br J Cancer, 70:239-243, 1994; Cucco, C. et al., Cancer Res, 56:4332-4337, 1996; Marthinet, E. et al., 7:1224-1233, 2000), 그 효과에 있어서는 미흡하였다.

최근, 이중나선 RNA를 이용한 유전자 발현 억제 기법이 인간세포와 같은 다세포 기관에서 유전자 발현의 효과적인 억제기법으로 대두되었다. RNA 간섭(RNA interference; RNAi) 기법은 mRNA와 siRNA(small interfering RNA)사이의 염기서열 특이적인 상호작용을 기본으로 한다. 긴 이중나선 RNA는 이중나선 RNA-특이적 RNase III 다이서(double strand RNA specific RNase III Dicer)에 의해 siRNA로 분해되며, 이중나선 siRNA 혹은 세포내에 발현된 shRNA(short hairpin RNA)는 RISC(RNA-induced silencing complex)내로 병합된다. 그 후 이중나선 siRNA는 단일가닥의 RNA로 분리된 후 안티센스 가닥이 표적 mRNA에 염기서열 특이적으로 결합되어 표적 mRNA를 자르고 파괴시킴으로써 발현을 억제하게 되는 것이다(Nykanen, A. et al., Cell, 107: 1090-1098, 2001).

이에, 본 발명자들은 종양 치료에 대한 효과적인 방법을 탐색하던 중 NIS 유전자와 MDR1의 siRNA를 하나의 벡터 시스템내에 클로닝하여 하나의 벡터를 이입함으로써 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 항암제의 병합치료를 가능하게 하여 종양치료효과를 극대화하였고, NIS 유전자를 통해 종양의 핵의학적 영상을 얻을 수 있다는 점을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS를 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS 를 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 종양성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한 종양성 질환의 위치의 영상화 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 재조합 벡터는 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS를 발현하는 것을 특징으로 한다.

P-당단백질(P-glycoprotein)은 상기 MDR1(Multidrug resistance 1) 유전자의 산물로서 상기 단백질은 신장근위세뇨관(renal proximal tubules), 간담관(hepatic bile ducts), 대장 융모(colon villi)의 윗막(apical membrane)에 정상적으로 존래하며, 세포로부터 천연약제(natural drug)를 제거하기 위한 에너지-의존성 배출 펌프(energy-dependent efflux pump)로서 작용하지만 그 기능은 명확하지 않다 (Crodon-Cardo, C. et al., Cytochem, 38:1277-1287). 바람직하게는 상기 MDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, Genbank Accession No. P08183, NP_000918, CAA41558, AAB70218, AAB69423, AAR99172, AAA59575, AAA59576, AAR91622, AAR91621에 기재된 P-당단백질일 수 있다.

shRNA는 50 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 in vivo상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루고 있으며, 5 내지 10 뉴클레오티드의 루프(loop) 부위 양쪽으로 상보적으로 19 내지 29 뉴클레오티드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템(stem)을 형성한다. shRNA는 일반적으로 in vivo상에서 Pol III 프로모터에 의해 전사되어 합성되며 이후 shRNA는 다이서(Dicer)에 의해 루프가 절단되고 siRNA처럼 RISC와 작용하게 된다. 본 발명의 MDR1의 발현억제를 위한 shRNA는 바람직하게는 서열번호 2의 센스 서열 및 서열번호 3의 안티센스 염기서열을 가질 수 있으며, 이러한 본원발명의 shRNA는 MDR1의 발현이 효율적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).

아울러, NIS는 요오드화 나트륨 심포터(Sodium iodide symporter)로서 요오드(iodide) 이온과 나트륨이온의 능동적 수송에 관여하는 단백질이다. 바람직하게는 상기 NIS는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가질 수 있으며, Genbank Accession No. NP_000444, NP_444478, Q92911, AAI05050, AAI05048, AAC14697, AAF70339, NP_000334에 기재된 NIS일 수 있다.

상기 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS의 발현을 위해서 프로모터가 작동가능하게 연결된다. 상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 U6 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol . Biol . 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

MDR1에 대한 shRNA 및 NIS의 발현을 위한 프로모터는 서로 동일한 프로모터 를 사용할 수도 있고, 서로 상이한 프로모터를 사용할 수도 있으며, 이는 발현되는 숙주세포, 발현 수준 등에 따라서 적절히 조절될 수 있다. 구분의 편의상 본 발명에서는 MDR1에 대한 shRNA의 발현을 위한 프로모터를 제1프로모터로, NIS의 발현을 위한 프로모터를 제2프로모터로 명명하였다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 발현벡터는 shMDR-NIS일 수 있다.

상기 shMDR-NIS 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조되었다:

먼저, MDR1에 대한 shRNA가 발현되는 벡터를 제작하기 위해 표적 서열로 서열번호 6의 염기서열(5’-GGCCUAAUGCCGAACACAU-3’)을 정하였고, 본 발명의 발현벡터에서 이 서열에 대한 shRNA가 발현되게 하는 삽입 절편을 만들기 위해 한 쌍의 프라이머(서열번호 2과 서열번호 3)를 디자인하였다. 상기 서열번호 2 및 서열번호 3에는 서열번호 6의 염기서열에 대해서 센스와 안티센스 염기서열을 포함하고 있고, 그 사이에는 4개의 염기서열(CGAA)을 넣어 loop를 형성할 수 있게 하였다.

이렇게 디자인된 프라이머를 업체(Bionics, 한국)에 의뢰하여 프라이머 단편 을 제작한 다음 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 단편 200 pmoles을 STE 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 녹였다. 이를 95℃로 가열하여 5분간 둔 후 서서히 식히면서 두 프라이머가 결합하게 하여 삽입절편을 제작하였다. 이렇게 형성된 삽입절편을 pRNAT/U6 벡터(GenScript, 미국)의 BamH I과 Xho I 제한효소 자리에 T4 접합효소(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pRNAT/shMDR'를 제조하였다.

pRNAT/shMDR의 내에 존재하는 GFP(Green fluorescent protein) 유전자를 제거함과 동시에 NIS 유전자를 삽입하기 위한 Sal I의 제한효소 자리를 만들기 위해 한 쌍의 프라이머(서열번호 7과 서열번호 8)를 사용하고 pRNAT/shMDR 벡터를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 Nhe I과 Sma I의 제한효소로 자른 후 pRNAT/shMDR 벡터의 동일한 제한효소(Nhe I과 Sma I의 제한효소) 자리에 T4 접합효소를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pRNAT/shMDR(Sal)'를 제조하였다.

그 다음 NIS cDNA를 한 쌍의 프라이머(서열번호 9과 서열번호 10)를 사용하고 pcDNA-NIS 벡터(경북대학교 치과대학 조재열교수님에게서 제공받음)를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 Nhe I과 Sal I 제한효소로 자른 후 상기 pRNAT/shMDR(Sal) 벡터의 동일한 제한효소(Nhe I과 Sal I 제한효소) 자리에 T4 접합효소를 사용하여 삽입함으로써 U6 프로모터 하부에 MDR1 shRNA가 존재하며, CMV 프로모터 하부에 NIS 유전자가 존재하는 재조합 발현 벡터 ‘shMDR-NIS'를 제조하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 도입방법은 바람직하게는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등 공지의 방법를 이용할 수 있다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스( Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 인간 세포일 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 인간 대장암 세포주는 항암제의 단독사용의 경우에 비해 보다 뛰어난 감수성을 보였다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터 및 항암제를 포함하는 종양성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터와 병용되는 항암제는 공지의 항암제라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 치료용 아이오다인(¹³¹I), 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이 드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571)과 같은 항암제일 수 있다. 바람직하게는 항암제는 둘이상의 복수의 항암제의 조합일 수 있으며, 더 바람직하게는 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴으로 이루어진 군에서 선택된 것의 조합일 수 있다.

본 발명의 종양성 질환은 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 바람직하게는 대장암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma)일 수 있으며, 더 바람직하게 본 발명의 종양성 질환은 대장암일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 재조합 벡터 및 항암제를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 종양성 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터 및 항암제의 약학적으로 유효한 양으로는 0.0001 내지 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.01 내지 1mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화 될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같 은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종양성 질환을 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 재조합 벡터로 종양 세포를 형질전환하는 단계; (b) 영상화 제제를 개체에 투여하는 단계; 및 (c) 상기 영상화 제제를 검출하는 단계를 포함하는 종양성 질환의 영상화 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포가 NIS를 발현하도록 하기 때문에 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 종양 세포는 영상화 제제를 선택적으로 흡수할 수 있다. 상기 영상화 제제란 NIS에 의해 선택적으로 흡수가 가능한 물질로서 바람직하게는 ¹²³I, ¹²⁴I, 99mTcO₄ ^-일 수 있다.

영상화 제제의 검출은 상기 영상화 제제에 따라 당업계에 공지된 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 감마 섬광조영법(gamma scintigraphy)에 의할 수 있다(Meller, J. et al., Eur J Nucl Med Imaging, 2002, 29 Suppl 2:S425-38).

본 발명의 일실시예에서는 NIS 유전자와 MDR1의 shRNA를 하나의 벡터 시스템내에 병합하여 하나의 벡터를 세포내에 이입함으로써 벡터내에 포함된 두가지 유전자의 작용에 의해 종양의 유전자치료에 유용하며, 종양 부위의 영상화가 가능한 벡터(shMDR-NIS 재조합벡터)를 새롭게 제조하였으며, 상기 벡터로 형질전환된 인간 대장암 세포주를 제조하였다(실시예 1 참조).

한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 형질전환된 대장암 세포주에서 MDR1에 대한 shRNA가 효과적으로 발현하는지 여부를 조사하였다. 그 결과, 대조군 세포에 비해 형질전환된 대장암 세포주에서 MDR1의 mRNA가 감소되어 있음을 확인하 였고, MDR1 유전자의 생성물인 P-당단백질의 양이 감소되어 있음을 확인할 수 있었다(실시예 2 참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기 형질전환된 대장암 세포주에서 NIS 단백질이 발현되는지 조사하였다. 그 결과, 대조군 세포에 존재하지 않던 NIS 단백질이 형질전환된 대장암 세포주에서 발현됨을 알 수 있었으며(실시예 3 참조), 이상의 결과에서 본 발명의 벡터(shMDR-NIS 재조합벡터)가 MDR1에 대한 shRNA와 NIS 단백질을 동시에 효과적으로 발현시킬 수 있는 벡터임을 확인할 수 있었다.

나아가, 본 발명의 형질전환된 대장암 세포주에서 발현되는 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS가 효과적으로 기능하는지 알아보기 위하여 본 발명의 또다른 실시예에서는 형질전환 세포주인 MN-61, MN-62세포에서 항암제의 축적여부과 항암제에 대한 감수성을 조사하였다(실시예 4 참조). 그 결과, 대조군 세포에 비해 MN-61, MN-62세포에서 동위원소가 표지된 항암제가 월등히 세포내에 축적됨을 확인할 수 있었으며, 항암제의 감수성 또한 증가되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 4 및 도 5 참조). 따라서, 세포내에 이입된 MDR1 shRNA가 P-당단백질의 발현을 억제하여 항암제의 세포내로의 축적을 증가시키고 항암제에 대한 감수성을 증가시키는 기능을 효과적으로 수행함을 확인하였다.

아울러, 본 발명의 또다른 실시예에서는 MN-61, MN-62세포에서 아이오다 인(¹²⁵I)의 축적여부과 시간에 따른 축적과 배출정도를 조사하였다(실시예 5 참조). 그 결과, 대조군 세포에 비해 MN-61, MN-62세포에서 아이오다인(¹²⁵I)이 월등히 세포내에 축적됨을 확인할 수 있었으며(도 6 참조), 아이오다인이 20분내에 효과적으로 축적되며 10분내로 배출됨을 확인 할 수 있었다 (도 7A 및 도 7B 참조). 따라서, 세포내에 이입된 NIS 유전자에 의한 NIS 단백질의 발현이 아이오다인의 세포내로의 축적을 증가시키는 기능을 효과적으로 수행함을 확인하였다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 형질전환 세포주에서 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 항암제의 병합투여가 암세포에 효과적인지를 조사하였다. 이를 위해, 상기 MN-61세포를 치료용 아이오다인과 전배양한 후 항암제를 일정기간 동안 투여하고 이들 세포에서의 효과를 조사하였다(실시예 6 참조). 그 결과 치료용 아이오다인(¹³¹I) 및 항암제의 병용투여가 각각의 단독 투여에 비해 월등한 효과가 있음을 확인하였다(도 8A 및 8B 참조).

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기 shMDR-NIS가 이입된 종양조직을 NIS 단백질을 이용해서 영상화가 가능한지를 조사하였다(실시예 7 참조). 그 결과 아이오다인(¹²⁴I)이 축적된 영상이 정상적으로 NIS를 발현하는 조직과 더불어 shMDR-NIS 벡터가 이입된 종양에서 선택적으로 나타났다(도 9 참조).

상술한 바와 같이 본 발명에서는 MDR1 shRNA와 NIS 단백질이 동시에 발현되는 벡터를 최초로 클로닝하였으며, 이 벡터의 이입에 의한 치료용 아이오다인과 항암제의 병용투여가 각각의 단독 투여에 비해서 암세포의 월등한 효과를 보임을 최초로 규명하였다.

따라서, 본 발명은 MDR1에 대한 shRNA 및 NIS를 발현하는 재조합 벡터 및 이의 용도를 제공한다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

MDR1 shRNA 와 NIS 유전자가 동시에 발현되는 벡터의 클로닝

<1-1> 이중 발현 벡터의 제조

먼저, MDR1에 대한 shRNA가 발현되는 벡터를 제작하기 위해 표적 서열로 서열번호 6의 염기서열(5’-GGCCUAAUGCCGAACACAU-3’)을 정하였고, 본 발명의 발현벡터에서 이 서열에 대한 shRNA가 발현되게 하는 삽입 절편을 만들기 위해 한 쌍의 프라이머(서열번호 2과 서열번호 3)를 디자인하였다. 상기 서열번호 2 및 서열번호 3에는 서열번호 6의 염기서열에 대해서 센스와 안티센스 염기서열을 포함하고 있고, 그 사이에는 4개의 염기서열(CGAA)을 넣어 loop를 형성할 수 있게 하였다.

이렇게 디자인된 프라이머를 업체(Bionics, 한국)에 의뢰하여 프라이머 단편을 제작한 다음 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머 단편 200 pmoles을 STE 완충액(10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 녹였다. 이를 95℃로 가열하여 5분간 둔 후 서서히 식히면서 두 프라이머가 결합하게 하여 삽입절편을 제작하였다. 이렇게 형성된 삽입절편을 pRNAT/U6 벡터(GenScript, 미국)의 BamH I과 Xho I 제한효소 자리에 T4 접합효소(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pRNAT/shMDR'를 제조하였다.

pRNAT/shMDR의 내에 존재하는 GFP(Green fluorescent protein) 유전자를 제거함과 동시에 NIS 유전자를 삽입하기 위한 Sal I의 제한효소 자리를 만들기 위해 한 쌍의 프라이머(서열번호 7과 서열번호 8)를 사용하고 pRNAT/shMDR 벡터를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 Nhe I과 Sma I의 제한효소로 자른 후 pRNAT/shMDR 벡터의 동일한 제한효소(Nhe I과 Sma I의 제한효소) 자리에 T4 접합효소를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터 ‘pRNAT/shMDR(Sal)'를 제조하였다.

그 다음 NIS cDNA를 한 쌍의 프라이머(서열번호 9과 서열번호 10)를 사용하고 pcDNA-NIS 벡터(경북대학교 치과대학 조재열교수님에게서 제공받음)를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분 동안의 반응을 30회 반복수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 Nhe I과 Sal I 제한효소로 자른 후 상기 pRNAT/shMDR(Sal) 벡터의 동일한 제한효소(Nhe I과 Sal I 제한효소) 자리에 T4 접합효소를 사용하여 삽입함으로써 U6 프로모터 하부에 MDR1 shRNA가 존재하며, CMV 프로모터 하부에 NIS 유전자가 존재하는 재조합 발현 벡터 ‘shMDR-NIS'를 제조하였다. 상기에서 제조된 벡터 ‘shMDR-NIS'를 염기서열 분석기(Applied Biosystems사, 모델 AB13700)에서 분석하며 올바르게 클로닝되었는지를 최종 확인하였다(결과 미도시).

shMDR-NIS 클로닝에 사용된 프라이머

프라이머	서열	서열번호
shMDR1 센스	5'-gat ccc ggc cta atg ccg aac aca tcg aaa tgt gtt cgg cat tag gcc ttt ttt cca ac-3'	2
shMDR1 안티센스	5'-tcg agt tgg aaa aaa ggc cta atg ccg aac aca ttt cga tgt gtt cgg cat tag gcc gg-3'	3
Nhe-Sal 센스	5'-aaa agc tac cgt cga cta gat aac tga act tg-3'	7
Nhe-Sal 안티센스	5'-tct tga tca gat ccg aaa atg g-3'	8
NIS 센스	5'-aaa aac cat gga ggc cgt gga gac-3'	9
NIS 안티센스	5'-aaa aag tcg act cag agg ttt gtc tcc tgc-3'	10

<1-2> HCT-15 세포의 형질전환

상기 실시예 <1-1>의 발현 벡터 shMDR-NIS로 인간 대장암세포인 HCT-15 세포(한국세포주은행, 대한민국)를 다음과 같이 형질전환하였다.

상기 HCT-15 세포를 20% 열불활성화 우태아혈청(FBS, fetal bovine serum), 100 units/ml 페니실린G 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 상기 HCT-15 세포를 재조합 발현벡터 shMDR-NIS로 형질전환하기 위하여 리포펙타민 (Lipofectamine, Invitrogen, 미국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 형질전환하였다. 형질전환한 후 48시간에 제네티신(Geneticin; G418, 500 ㎍/ml; invitrogen, 미국)을 처리하여 10 내지 12일 동안 배양하면서 저항성을 나타내는 각각의 콜로니를 분리하였다. 상기와 같은 방법으로 형질전환된 세포 중 둘을 선별하여 이를 각각 MN-61 및 MN-62로 명명하였다. 이하에서 음성 대조군(HCT/Mock)으로는 shMDR-NIS 유전자가 포함되지 않은 벡터인 pRNAT/U6로 형질전환한 세포를 사용하였다.

< 실시예 2>

형질전환 세포에서 shRNA 발현 여부 확인

<2-1> mRNA 발현 분석

상기 실시예 <1-2>의 MN-61 및 MN-62세포에서 MDR1에 대한 shRNA가 발현되는지를 다음과 같이 RT-PCR로 확인하였다. HCT-15, HCT/Mock, MN-61, MN-62세포에서 전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였으며, 분리된 전체 RNA 2 μg을 주형으로 Oligo(dT)₁₅ 프라이머(Bionics, 한국)와 역전사효소(Promega, 미국)를 사용하여 cDNA를 제조하였으며제조한 cDNA를 주형으로하고 한 쌍의 프라이머(서열번호 11과 서열번호 12)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 45초 동안의 반응을 30회 반복수행하였다..

MDR1 증폭용 프라이머

프라이머	서열	서열번호
MDR1 센스	5'-gga gtg tcc gtg gat cac a-3'	11
MDR1 안티센스	5'-aat aca tca ttg cct ggg tga ag-3'	12

실험 결과, 도 2A에서 보듯이 대조군인 HCT-15 및 HCT/Mock 세포에서는 MDR1의 mRNA가 거의 감소하지 않았으나, MN-61 및 MN-62 세포에서는 MDR1의 mRNA가 상당량이 감소되어 있음을 확인하였다.

<2-2> 단백질 발현 분석

세포에 이입된 shRNA가 MDR1의 생산물인 P-당단백질(P-glycoprotein)의 발현을 억제하는지 알아보기 위해 HCT-15, HCT/Mock, MN-61 및 MN-62 세포에서 분리한 단백질에 대해서 웨스턴 블럿 분석을 하였다. 이를 간략히 설명하면 다음과 같다. HCT-15, HCT/Mock, MN-61, MN-62세포를 세포용해완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂와 단백질 분해 효소 저해제 혼합물(Roche, 미국)이 포함되어 있음, pH 7.4)을 가하여 용해시켰다. 용해물 중 30 μg의 단백질을 7% SDS를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고, 이를 니트로셀룰로스 막에 이동시켰다. 이후, 항 P-당단백질 항체(Calbiochem, 미국; 클론 C219)를 TBS-T 용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 희석하여 냉장 상태에서 16시간 이상 니트로셀룰로스 막과 결합 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 막을 TBS-T 용액으로 3회 세척하였다. 이후, HRP-결합-항-쥐 IgG 항체(Santa Cruz, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 결합 반응시켰다. 막을 다시 TBS-T 용액으로 3회 세척한 후, 화학발광용액(ECL^TM, Amercham, 미국) 1 ㎖를 첨가하여 항원-항체 반응이 일어난 부위를 형광으로 가시화하고, X-레이 필름으로 감광시켰다. 또한, 대조군으로 상기 니트로셀룰로스막을 항 액틴(Actin) 항체(Sigma, 미국)와 반응시켜서 실험하였다.

실험 결과, 도 2B에서 보듯이, 상기 실시예 <2-1>의 결과와 유사하게 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포에서는 P-당단백질의 양에 거의 영향이 없었으나, MN-61과 MN-62세포에서 P-당단백질의 양이 상당량으로 감소되어 있음을 확인하였다.

<실시예 3>

MN-61, MN-62 세포에서 NIS 유전자의 발현 여부 확인

<3-1> 단백질 분석

세포내에 이입된 NIS 유전자의 발현을 확인하기 위해 HCT-15, HCT/Mock, MN-61, MN-62세포에서 분리한 단백질에 대해서 항 NIS 항체(Labvision, 미국; 클론 F14)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <2-2>와 동일하게 웨스턴 블럿 분석을 하였다.

실험 결과, 도 3A에서 보듯이, 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포에서는 NIS 단백질이 거의 발현되지 않았고, MN-61 및 MN-62세포에서 상당량의 NIS 단백질의 양이 발현됨을 알 수 있었다. 이와 같은 결과를 종합하여 MN-61 및 MN-62세포를 대상으로 하여 이하의 실험을 수행하였다.

<3-2> 면역형광염색 분석

세포내에 이입된 NIS 유전자의 발현을 더욱 규명하기위해 MN-62세포를 사용하여 다음과 같이 면역형광염색 분석을 수행하였다. 먼저, MN-62세포와 대조군인 HCT/Mock 세포를 슬라이드에서 상기 실시예 <1-2>에서와 같이 배양한 다음 10% 염소 혈청을 1시간 동안 상온에서 반응시켜 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 이후, 항 NIS 항체(Chemicon 미국; 클론 FP5A)를 2% 염소 혈청 용액에 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 세포를 인산완충액으로 3회 세척하였다. 이후, 로다민-결합-항-쥐 IgG 항체(Molecular Probe, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 추가로 결합 반응시켰다. 세포를 다시 인산완충액(PBS)으로 3회 세척한 후, 슬라이드에 안티-페이드(anti-fade) 용액(Molecular Probe, 미국)을 세포위에 덮고 형광현미경으로 확인하였다. 또한, 대조군으로 항 NIS 항체와 반응시키는 항체에 대한 동일 아이소타입(isotype)의 면역글로불린을 사용하여 실험하였다.

실험 결과, 도 3B에서 보듯이 MN-61세포에서 상당량의 NIS 단백질의 양이 발현되어 있음을 확인했으며, 대조군에서는 형광이 관찰되지 않음을 확인하였다.

<실시예 4>

MDR1 shRNA에 의한 기능 동정

<4-1> 항암제의 축적능 조사

MDR1 shRNA에 의한 세포에서 약물의 축적정도를 조사하였다. 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MN-61, MN-62세포와 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 배양한 후 여기에 50 nM의 동위원소가 결합되어있는 항암제([³H]-paclitaxel)를 첨가한 다음 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 그 후 인산완충액으로 3회 세척하고 세포용해완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% SDS)을 가하여 용해시킨 다음 각 시료에서 동위원소활성을 베타카운터(beta-counter)를 이용하여 조사하였다.

실험 결과, 도 4에서 보듯이, shMDR을 발현하는 MN-61, MN-62세포에서 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포에 비해 많은 양의 파클리탁셀이 축적됨을 확인하였다.

<4-2> 항암제의 감수성 조사

상기 MN-61, MN-62세포에 항암제의 축적능의 증가로 인해 항암제에 대한 감수성(sensitivity)이 증가하는지를 확인하였다.

먼저, MN-61, MN-62세포와 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 96-웰 플레이트에서 10³개의 세포를 배양한 후 항암제(doxorubicin)을 여러가지 농도(0, 1, 10, 50, 100, 500, 1000nM)로 첨가한 후 4일 동안 배양하였다. 그 후 Celltitre 96 Aqueous One Solution cell proliferation assay kit (Promega, 미국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 제공되는 발색 시약을 20 ul 첨가한 후 90분간 추가로 배양하여 발색이 된 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식정도를 확인하였다.

실험 결과, 도 5에서 보듯이 HCT-15, HCT/Mock 세포는 독소루비신이 100nM 이상에서 증식에 영향을 받는 데에 비해 MN-61, MN-62세포는 10nM이상에서 증식에 영향을 받아 항암제 대한 감수성이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

NIS 수용체에 의한 기능 동정

<5-1> 아이오다인( ¹²⁵ I)의 축적능 조사

NIS 유전자에 의한 아이오다인(¹²⁵I)의 축적정도를 다음과 같이 조사하였다. 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MN-61, MN-62세포와 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 배양한 후 여기에 10 mM NaI, 0.1 μCi Na¹²⁵I, 10 mM HEPES (pH 7.3)를 첨가한 다음 37℃에서 45분동안 배양하였다. 대조군으로는 NIS 유전자의 특이적 저해제인 100 mM KClO₄를 추가적으로 첨가한 다음 동일조건으로 배양하였다. 그 후 인산완충액으로 3회 이상 세척하고 세포용해완충액(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% SDS)을 가하여 용해시킨 다음 각 시료에서 동위원소활성을 감마카운터(gamma-counter)를 이용하여 조사하였다.

실험 결과, 도 6에서 보듯이, NIS 유전자를 발현하는 MN-61, MN-62세포에서 대조군인 HCT-15, HCT/Mock 세포에 비해 많은 양의 아이오다인(¹²⁵I)이 축적됨을 확인하였다. 또한 아이오다인의 축적은 NIS 유전자의 특이적 저해제인 KClO₄에 의해서 거의 완벽하게 억제되는 것으로 보아 NIS 유전자에 의한 것임을 확인하였다.

<5-2> 시간에 따른 아이오다인( ¹²⁵ I)의 축적 및 배출정도 조사

NIS 유전자에 의한 시간에 따른 아이오다인(¹²⁵I)의 축적정도과 배출 정도를 다음과 같이 조사하였다. 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MN-61 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 배양한 후 여기에 10 mM NaI, 0.1 μCi Na¹²⁵I, 10 mM을 첨가한 다음 37℃에서 60분동안 배양하면서 10분, 20분, 40분 및 60분에 아이오다인의 축적정도를 조사하였다.

실험 결과, 도 7A에서 보듯이 MN-61 세포는 10분에 전체 축적량의 80%이상이 축적되었으며, 20분 이후부터 이미 전체 축적량이 축적되었다.

또한, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MN-61 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 48시간 동안 배양한 후 여기에 10 mM NaI, 0.1 μCi Na¹²⁵I, 10 mM을 첨가한 다음 37℃에서 30분동안 배양한 다음 배지를 아이오다인이 포함되어있지 않은 배지로 교환하고 3분마다 배지내로 배출 되는 아이오다인의 양을 조사하였다.

그 결과 도 7B에서 보듯이, MN-61 세포는 10분정도에 80%이상의 아이오다인을 배출하는 것으로 나타났다.

따라서, 세포내에 이입된 NIS 유전자에 의한 NIS 단백질의 발현이 아이오다인의 세포내로의 축적을 증가시키는 기능을 효과적으로 수행함을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

치료용 아이오다인( ¹³¹ I)과 항암제( doxorubicin )의 병용효과

암세포에서 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 항암제(doxorubicin)의 병용효과를 확인하기 위해 클로노제닉 분석(clonogenic assay)를 수행하였다. 먼저, MN-61세포와 대조군인 HCT/Mock 세포를 RPMI1640 배지가 포함된 100 mm 플레이트에서 세포를 배양한 후 치료용 아이오다인(¹³¹I)을 3가지 농도(0, 0.5 μCi, 1.0 μCi)로 첨가한 후 7시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 배지로 3회 세척한 후 세포를 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 사용하여 플레이트에서 떼어내고 1000개의 세포를 개수하여 6-웰 플레이트에 항암제(doxorubicin, 25 nM)가 포함된 것과 미포함된 것으로 나누어서 7일간 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 세포를 인산완충액으로 3회 세척한 후 염색하고 콜로니의 생성을 확인하고 개수하였다.

실험 결과, 도 8에서 보듯이, 대조군인 HCT/Mock 세포는 치료용 높은 농도의 아이오다인이 추가되었음에도 영향을 받지 않았으며 항암제와의 병용효과도 보이지 않았다. 그러나, shMDR-NIS 벡터가 이입된 MN-61 세포는 치료용 아이오다인(¹³¹I)에 노출된 경우, 그렇지 않은 경우에 비해서 0.5 μCi의 아이오다인에 노출되었을 때는 24.6 ± 3.4%의 생존율을 1.0 μCi의 아이오다인에 노출되었을때는 15.3 ± 2.1%의 생존율을 보였다. 또한, 25 nM의 항암제가 0.5 μCi의 아이오다인에 병합되었을때는 0.5 μCi의 아이오다인 단독인 24.6 ± 3.4%와 25 nM 항암제 단독인 36.3 ± 2.7%에 비교해서 윌등히 효과적인 4.9 ± 2.1%의 생존율을 보였으며, 25 nM의 항암제가 1.0 μCi의 아이오다인에 병합되었을 때도 1.0 μCi의 아이오다인 단독인 15.3 ± 2.1%와 25 nM 항암제 단독인 36.3 ± 2.7%에 비교해서 월등히 효과적인 4.5 ± 1.6%의 생존율을 보였다.

따라서, shMDR-NIS 베터의 이입을 통한 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 항암제(doxorubicin)의 병용은 각각의 단독 치료에 비해 월등히 효과적임을 알수 있었다.

< 실시예 7>

암세포를 이식한 동물모델에서 ¹²⁴ I을 통해서 암조직의 영상화

상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MN-61세포와 대조군인 HCT/Mock세포를 8-12주령의 쥐에 피하주사하여 종양을 만들었다. 그 후 종양의 크기가 약 10 mm 정도될 때 500 μCi의 아이오다인(¹²⁴I)를 쥐의 꼬리 정맥으로 주입한 후 감마카메라를 이용하여 종양의 위치를 조사하였다.

실험 결과, 도 9에서 보듯이 아이오다인의 포획이 정상적으로 NIS 유전자를 발현하는 위장과 감상선에 나타났다. 대조군인HCT/Mock 세포로 이루어진 종양에는 아이오다인의 축적이 보이지 않았으며, shMDR-NIS 유전자가 이입된 MN-61 세포로 구성된 암조직에 상당량의 아이오다인이 축적됨을 알 수 있었다. 따라서, shMDR-NIS 유전자의 종양내로의 이입은 NIS 유전자를 통한 종양조직의영상화에 유용함을 알수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터는 숙주세포내에서 MDR1에 대한 shRNA와 NIS를 효율적으로 발현시켜 항암제의 병합치료에 뛰어난 효과를 가지며 종양성 질환 위치의 영상화가 가능하게 하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 재조합 벡터는 종양성 질환의 치료의 목적에 다른 항암제와 병합하여 사용할 수 있다.

<110> Kyungpook national university industry-academic cooperation foundation <120> Recombinant vector expressing shRNA for MDR1 and NIS and use thereof <130> NP07-0018 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1280 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Leu Glu Gly Asp Arg Asn Gly Gly Ala Lys Lys Lys Asn Phe 1 5 10 15 Phe Lys Leu Asn Asn Lys Ser Glu Lys Asp Lys Lys Glu Lys Lys Pro 20 25 30 Thr Val Ser Val Phe Ser Met Phe Arg Tyr Ser Asn Trp Leu Asp Lys 35 40 45 Leu Tyr Met Val Val Gly Thr Leu Ala Ala Ile Ile His Gly Ala Gly 50 55 60 Leu Pro Leu Met Met Leu Val Phe Gly Glu Met Thr Asp Ile Phe Ala 65 70 75 80 Asn Ala Gly Asn Leu Glu Asp Leu Met Ser Asn Ile Thr Asn Arg Ser 85 90 95 Asp Ile Asn Asp Thr Gly Phe Phe Met Asn Leu Glu Glu Asp Met Thr 100 105 110 Arg Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ile Gly Ala Gly Val Leu Val Ala 115 120 125 Ala Tyr Ile Gln Val Ser Phe Trp Cys Leu Ala Ala Gly Arg Gln Ile 130 135 140 His Lys Ile Arg Lys Gln Phe Phe His Ala Ile Met Arg Gln Glu Ile 145 150 155 160 Gly Trp Phe Asp Val His Asp Val Gly Glu Leu Asn Thr Arg Leu Thr 165 170 175 Asp Asp Val Ser Lys Ile Asn Glu Gly Ile Gly Asp Lys Ile Gly Met 180 185 190 Phe Phe Gln Ser Met Ala Thr Phe Phe Thr Gly Phe Ile Val Gly Phe 195 200 205 Thr Arg Gly Trp Lys Leu Thr Leu Val Ile Leu Ala Ile Ser Pro Val 210 215 220 Leu Gly Leu Ser Ala Ala Val Trp Ala Lys Ile Leu Ser Ser Phe Thr 225 230 235 240 Asp Lys Glu Leu Leu Ala Tyr Ala Lys Ala Gly Ala Val Ala Glu Glu 245 250 255 Val Leu Ala Ala Ile Arg Thr Val Ile Ala Phe Gly Gly Gln Lys Lys 260 265 270 Glu Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Asn Leu Glu Glu Ala Lys Arg Ile Gly 275 280 285 Ile Lys Lys Ala Ile Thr Ala Asn Ile Ser Ile Gly Ala Ala Phe Leu 290 295 300 Leu Ile Tyr Ala Ser Tyr Ala Leu Ala Phe Trp Tyr Gly Thr Thr Leu 305 310 315 320 Val Leu Ser Gly Glu Tyr Ser Ile Gly Gln Val Leu Thr Val Phe Phe 325 330 335 Ser Val Leu Ile Gly Ala Phe Ser Val Gly Gln Ala Ser Pro Ser Ile 340 345 350 Glu Ala Phe Ala Asn Ala Arg Gly Ala Ala Tyr Glu Ile Phe Lys Ile 355 360 365 Ile Asp Asn Lys Pro Ser Ile Asp Ser Tyr Ser Lys Ser Gly His Lys 370 375 380 Pro Asp Asn Ile Lys Gly Asn Leu Glu Phe Arg Asn Val His Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Arg Lys Glu Val Lys Ile Leu Lys Gly Leu Asn Leu Lys 405 410 415 Val Gln Ser Gly Gln Thr Val Ala Leu Val Gly Asn Ser Gly Cys Gly 420 425 430 Lys Ser Thr Thr Val Gln Leu Met Gln Arg Leu Tyr Asp Pro Thr Glu 435 440 445 Gly Met Val Ser Val Asp Gly Gln Asp Ile Arg Thr Ile Asn Val Arg 450 455 460 Phe Leu Arg Glu Ile Ile Gly Val Val Ser Gln Glu Pro Val Leu Phe 465 470 475 480 Ala Thr Thr Ile Ala Glu Asn Ile Arg Tyr Gly Arg Glu Asn Val Thr 485 490 495 Met Asp Glu Ile Glu Lys Ala Val Lys Glu Ala Asn Ala Tyr Asp Phe 500 505 510 Ile Met Lys Leu Pro His Lys Phe Asp Thr Leu Val Gly Glu Arg Gly 515 520 525 Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Ala Ile Ala Arg Ala 530 535 540 Leu Val Arg Asn Pro Lys Ile Leu Leu Leu Asp Glu Ala Thr Ser Ala 545 550 555 560 Leu Asp Thr Glu Ser Glu Ala Val Val Gln Val Ala Leu Asp Lys Ala 565 570 575 Arg Lys Gly Arg Thr Thr Ile Val Ile Ala His Arg Leu Ser Thr Val 580 585 590 Arg Asn Ala Asp Val Ile Ala Gly Phe Asp Asp Gly Val Ile Val Glu 595 600 605 Lys Gly Asn His Asp Glu Leu Met Lys Glu Lys Gly Ile Tyr Phe Lys 610 615 620 Leu Val Thr Met Gln Thr Ala Gly Asn Glu Val Glu Leu Glu Asn Ala 625 630 635 640 Ala Asp Glu Ser Lys Ser Glu Ile Asp Ala Leu Glu Met Ser Ser Asn 645 650 655 Asp Ser Arg Ser Ser Leu Ile Arg Lys Arg Ser Thr Arg Arg Ser Val 660 665 670 Arg Gly Ser Gln Ala Gln Asp Arg Lys Leu Ser Thr Lys Glu Ala Leu 675 680 685 Asp Glu Ser Ile Pro Pro Val Ser Phe Trp Arg Ile Met Lys Leu Asn 690 695 700 Leu Thr Glu Trp Pro Tyr Phe Val Val Gly Val Phe Cys Ala Ile Ile 705 710 715 720 Asn Gly Gly Leu Gln Pro Ala Phe Ala Ile Ile Phe Ser Lys Ile Ile 725 730 735 Gly Val Phe Thr Arg Ile Asp Asp Pro Glu Thr Lys Arg Gln Asn Ser 740 745 750 Asn Leu Phe Ser Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gly Ile Ile Ser Phe Ile 755 760 765 Thr Phe Phe Leu Gln Gly Phe Thr Phe Gly Lys Ala Gly Glu Ile Leu 770 775 780 Thr Lys Arg Leu Arg Tyr Met Val Phe Arg Ser Met Leu Arg Gln Asp 785 790 795 800 Val Ser Trp Phe Asp Asp Pro Lys Asn Thr Thr Gly Ala Leu Thr Thr 805 810 815 Arg Leu Ala Asn Asp Ala Ala Gln Val Lys Gly Ala Ile Gly Ser Arg 820 825 830 Leu Ala Val Ile Thr Gln Asn Ile Ala Asn Leu Gly Thr Gly Ile Ile 835 840 845 Ile Ser Phe Ile Tyr Gly Trp Gln Leu Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ile 850 855 860 Val Pro Ile Ile Ala Ile Ala Gly Val Val Glu Met Lys Met Leu Ser 865 870 875 880 Gly Gln Ala Leu Lys Asp Lys Lys Glu Leu Glu Gly Ser Gly Lys Ile 885 890 895 Ala Thr Glu Ala Ile Glu Asn Phe Arg Thr Val Val Ser Leu Thr Gln 900 905 910 Glu Gln Lys Phe Glu His Met Tyr Ala Gln Ser Leu Gln Val Pro Tyr 915 920 925 Arg Asn Ser Leu Arg Lys Ala His Ile Phe Gly Ile Thr Phe Ser Phe 930 935 940 Thr Gln Ala Met Met Tyr Phe Ser Tyr Ala Gly Cys Phe Arg Phe Gly 945 950 955 960 Ala Tyr Leu Val Ala His Lys Leu Met Ser Phe Glu Asp Val Leu Leu 965 970 975 Val Phe Ser Ala Val Val Phe Gly Ala Met Ala Val Gly Gln Val Ser 980 985 990 Ser Phe Ala Pro Asp Tyr Ala Lys Ala Lys Ile Ser Ala Ala His Ile 995 1000 1005 Ile Met Ile Ile Glu Lys Thr Pro Leu Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Glu 1010 1015 1020 Gly Leu Met Pro Asn Thr Leu Glu Gly Asn Val Thr Phe Gly Glu Val 1025 1030 1035 1040 Val Phe Asn Tyr Pro Thr Arg Pro Asp Ile Pro Val Leu Gln Gly Leu 1045 1050 1055 Ser Leu Glu Val Lys Lys Gly Gln Thr Leu Ala Leu Val Gly Ser Ser 1060 1065 1070 Gly Cys Gly Lys Ser Thr Val Val Gln Leu Leu Glu Arg Phe Tyr Asp 1075 1080 1085 Pro Leu Ala Gly Lys Val Leu Leu Asp Gly Lys Glu Ile Lys Arg Leu 1090 1095 1100 Asn Val Gln Trp Leu Arg Ala His Leu Gly Ile Val Ser Gln Glu Pro 1105 1110 1115 1120 Ile Leu Phe Asp Cys Ser Ile Ala Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Asp Asn 1125 1130 1135 Ser Arg Val Val Ser Gln Glu Glu Ile Val Arg Ala Ala Lys Glu Ala 1140 1145 1150 Asn Ile His Ala Phe Ile Glu Ser Leu Pro Asn Lys Tyr Ser Thr Lys 1155 1160 1165 Val Gly Asp Lys Gly Thr Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile 1170 1175 1180 Ala Ile Ala Arg Ala Leu Val Arg Gln Pro His Ile Leu Leu Leu Asp 1185 1190 1195 1200 Glu Ala Thr Ser Ala Leu Asp Thr Glu Ser Glu Lys Val Val Gln Glu 1205 1210 1215 Ala Leu Asp Lys Ala Arg Glu Gly Arg Thr Cys Ile Val Ile Ala His 1220 1225 1230 Arg Leu Ser Thr Ile Gln Asn Ala Asp Leu Ile Val Val Phe Gln Asn 1235 1240 1245 Gly Arg Val Lys Glu His Gly Thr His Gln Gln Leu Leu Ala Gln Lys 1250 1255 1260 Gly Ile Tyr Phe Ser Met Val Ser Val Gln Ala Gly Thr Lys Arg Gln 1265 1270 1275 1280 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shMDR1(sense) <400> 2 gatcccggcc taatgccgaa cacatcgaaa tgtgttcggc attaggcctt ttttccaac 59 <210> 3 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shMDR1(antisense) <400> 3 tcgagttgga aaaaaggcct aatgccgaac acatttcgat gtgttcggca ttaggccgg 59 <210> 4 <211> 643 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Ala Val Glu Thr Gly Glu Arg Pro Thr Phe Gly Ala Trp Asp 1 5 10 15 Tyr Gly Val Phe Ala Leu Met Leu Leu Val Ser Thr Gly Ile Gly Leu 20 25 30 Trp Val Gly Leu Ala Arg Gly Gly Gln Arg Ser Ala Glu Asp Phe Phe 35 40 45 Thr Gly Gly Arg Arg Leu Ala Ala Leu Pro Val Gly Leu Ser Leu Ser 50 55 60 Ala Ser Phe Met Ser Ala Val Gln Val Leu Gly Val Pro Ser Glu Ala 65 70 75 80 Tyr Arg Tyr Gly Leu Lys Phe Leu Trp Met Cys Leu Gly Gln Leu Leu 85 90 95 Asn Ser Val Leu Thr Ala Leu Leu Phe Met Pro Val Phe Tyr Arg Leu 100 105 110 Gly Leu Thr Ser Thr Tyr Glu Tyr Leu Glu Met Arg Phe Ser Arg Ala 115 120 125 Val Arg Leu Cys Gly Thr Leu Gln Tyr Ile Val Ala Thr Met Leu Tyr 130 135 140 Thr Gly Ile Val Ile Tyr Ala Pro Ala Leu Ile Leu Asn Gln Val Thr 145 150 155 160 Gly Leu Asp Ile Trp Ala Ser Leu Leu Ser Thr Gly Ile Ile Cys Thr 165 170 175 Phe Tyr Thr Ala Val Gly Gly Met Lys Ala Val Val Trp Thr Asp Val 180 185 190 Phe Gln Val Val Val Met Leu Ser Gly Phe Trp Val Val Leu Ala Arg 195 200 205 Gly Val Met Leu Val Gly Gly Pro Arg Gln Val Leu Thr Leu Ala Gln 210 215 220 Asn His Ser Arg Ile Asn Leu Met Asp Phe Asn Pro Asp Pro Arg Ser 225 230 235 240 Arg Tyr Thr Phe Trp Thr Phe Val Val Gly Gly Thr Leu Val Trp Leu 245 250 255 Ser Met Tyr Gly Val Asn Gln Ala Gln Val Gln Arg Tyr Val Ala Cys 260 265 270 Arg Thr Glu Lys Gln Ala Lys Leu Ala Leu Leu Ile Asn Gln Val Gly 275 280 285 Leu Phe Leu Ile Val Ser Ser Ala Ala Cys Cys Gly Ile Val Met Phe 290 295 300 Val Phe Tyr Thr Asp Cys Asp Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ser Ala 305 310 315 320 Pro Asp Gln Tyr Met Pro Leu Leu Val Leu Asp Ile Phe Glu Asp Leu 325 330 335 Pro Gly Val Pro Gly Leu Phe Leu Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Thr Leu 340 345 350 Ser Thr Ala Ser Thr Ser Ile Asn Ala Met Ala Ala Val Thr Val Glu 355 360 365 Asp Leu Ile Lys Pro Arg Leu Arg Ser Leu Ala Pro Arg Lys Leu Val 370 375 380 Ile Ile Ser Lys Gly Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Ser Ala Cys Leu Thr 385 390 395 400 Val Ala Ala Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Ser 405 410 415 Phe Thr Val Met Gly Val Ile Ser Gly Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ile 420 425 430 Leu Gly Met Phe Leu Pro Ala Cys Asn Thr Pro Gly Val Leu Ala Gly 435 440 445 Leu Gly Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Trp Val Ala Leu Gly Ala Thr 450 455 460 Leu Tyr Pro Pro Ser Glu Gln Thr Met Arg Val Leu Pro Ser Ser Ala 465 470 475 480 Ala Arg Cys Val Ala Leu Ser Val Asn Ala Ser Gly Leu Leu Asp Pro 485 490 495 Ala Leu Leu Pro Ala Asn Asp Ser Ser Arg Ala Pro Ser Ser Gly Met 500 505 510 Asp Ala Ser Arg Pro Ala Leu Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Ile Ser Tyr 515 520 525 Leu Tyr Tyr Gly Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Val Leu Cys Gly Ala 530 535 540 Leu Ile Ser Cys Leu Thr Gly Pro Thr Lys Arg Ser Thr Leu Ala Pro 545 550 555 560 Gly Leu Leu Trp Trp Asp Leu Ala Arg Gln Thr Ala Ser Val Ala Pro 565 570 575 Lys Glu Glu Val Ala Ile Leu Asp Asp Asn Leu Val Lys Gly Pro Glu 580 585 590 Glu Leu Pro Thr Gly Asn Lys Lys Pro Pro Gly Phe Leu Pro Thr Asn 595 600 605 Glu Asp Arg Leu Phe Phe Leu Gly Gln Lys Glu Leu Glu Gly Ala Gly 610 615 620 Ser Trp Thr Pro Cys Val Gly His Asp Gly Gly Arg Asp Gln Gln Glu 625 630 635 640 Thr Asn Leu <210> 5 <211> 2490 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gctgtcagcg ctgagcacag cgcccaggga gagggacaga cagccggctg catgggacag 60 cggaacccag agtgagaggg gaggtggcag gacagacaga cagcaggggc ggacgcagag 120 acagacagcg gggacaggga ggccgacacg gacatcgaca gcccatagat tcctaaccca 180 gggagccccg gcccctctcg ccgcttccca ccccagacgg agcggggaca ggctgccgag 240 catcctccca cccgccctcc ccgtcctgcc tcctcggccc ctgccagctt cccccgcttg 300 agcacgcagg gcgtccgagg acgcgctggg cctccgcacc cgccctcatg gaggccgtgg 360 agaccgggga acggcccacc ttcggagcct gggactacgg ggtctttgcc ctcatgctcc 420 tggtgtccac tggcatcggg ctgtgggtcg ggctggctcg gggcgggcag cgcagcgctg 480 aggacttctt caccgggggc cggcgcctgg cggccctgcc cgtgggcctg tcgctgtctg 540 ccagcttcat gtcggccgtg caggtgctgg gcgtgccgtc ggaggcctat cgctatggcc 600 tcaagttcct ctggatgtgc ctgggccagc ttctgaactc ggtcctcacc gccctgctct 660 tcatgcccgt cttctaccgc ctgggcctca ccagcaccta cgagtacctg gagatgcgct 720 tcagccgcgc agtgcggctc tgcgggactt tgcagtacat tgtagccacg atgctgtaca 780 ccggcatcgt aatctacgca ccggccctca tcctgaacca agtgaccggg ctggacatct 840 gggcgtcgct cctgtccacc ggaattatct gcaccttcta cacggctgtg ggcggcatga 900 aggctgtggt ctggactgat gtgttccagg tcgtggtgat gctaagtggc ttctgggttg 960 tcctggcacg cggtgtcatg cttgtgggcg ggccccgcca ggtgctcacg ctggcccaga 1020 accactcccg gatcaacctc atggacttta accctgaccc gaggagccgc tatacattct 1080 ggacttttgt ggtgggtggc acgttggtgt ggctctccat gtatggcgtg aaccaggcgc 1140 aggtgcagcg ctacgtggct tgccgcacag agaagcaggc caagctggcc ctgctcatca 1200 accaggtcgg cctgttcctg atcgtgtcca gcgctgcctg ctgtggcatc gtcatgtttg 1260 tgttctacac tgactgcgac cctctcctcc tggggcgcat ctctgcccca gaccagtaca 1320 tgcctctgct ggtgctggac atcttcgaag atctgcctgg agtccccggg cttttcctgg 1380 cctgtgctta cagtggcacc ctcagcacag catccaccag catcaatgct atggctgcag 1440 tcactgtaga agacctcatc aaacctcggc tgcggagcct ggcacccagg aaactcgtga 1500 ttatctccaa ggggctctca ctcatctacg gatcggcctg tctcaccgtg gcagccctgt 1560 cctcactgct cggaggaggt gtccttcagg gctccttcac cgtcatggga gtcatcagcg 1620 gccccctgct gggagccttc atcttgggaa tgttcctgcc ggcctgcaac acaccgggcg 1680 tcctcgcggg actaggcgcg ggcttggcgc tgtcgctgtg ggtggccttg ggcgccacgc 1740 tgtacccacc cagcgagcag accatgaggg tcctgccatc gtcggctgcc cgctgcgtgg 1800 ctctctcagt caacgcctct ggcctcctgg acccggctct cctccctgct aacgactcca 1860 gcagggcccc cagctcagga atggacgcca gccgacccgc cttagctgac agcttctatg 1920 ccatctccta tctctattac ggtgccctgg gcacgctgac cactgtgctg tgcggagccc 1980 tcatcagctg cctgacaggc cccaccaagc gcagcaccct ggccccggga ttgttgtggt 2040 gggacctcgc acggcagaca gcatcagtgg cccccaagga agaagtggcc atcctggatg 2100 acaacttggt caagggtcct gaagaactcc ccactggaaa caagaagccc cctggcttcc 2160 tgcccaccaa tgaggatcgt ctgtttttct tggggcagaa ggagctggag ggggctggct 2220 cttggacccc ctgtgttgga catgatggtg gtcgagacca gcaggagaca aacctctgag 2280 gacagggcca gccgcgggac tgacaccctg ggatggaacc tcaggatggg ccaaacccag 2340 acaacgggcc catggccttg ggctctgatt ggctggattg ccttgtatgc aaatgagttc 2400 aggactacaa taccctaccc tatggggagg ccctgcctcc gggaggtcat tttttaaatc 2460 cagccccttg cttcaaccgt ccccagtatt 2490 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence for shRNA for MDR1 <400> 6 ggccuaaugc cgaacacau 19 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nhe-Sal sense <400> 7 aaaagctacc gtcgactaga taactgaact tg 32 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nhe-Sal antisense <400> 8 tcttgatcag atccgaaaat gg 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIS sense <400> 9 aaaaaccatg gaggccgtgg agac 24 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NIS antisense <400> 10 aaaaagtcga ctcagaggtt tgtctcctgc 30 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDR1 sense <400> 11 ggagtgtccg tggatcaca 19 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MDR1 antisense <400> 12 aatacatcat tgcctgggtg aag 23

Claims (11)

1. 제1프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 MDR1에 대한 shRNA; 및 제2프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 NIS(Sodium iodide symporter)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 MDR1에 대한 shRNA는 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 NIS(Sodium iodide symporter)는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 벡터.
5. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 1B에 기재된 개열 지도를 가지는 shMDR-NIS 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
6. 제1항의 벡터로 형질전환된 형질전환 세포.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 인간세포인 것을 특징으로 하는 세포.
8. 제1항의 재조합 벡터 및 항암제를 포함하는 종양성 질환의 치료용 약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 항암제는 치료용 아이오다인(¹³¹I)과 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴으로 이루어진 군에서 선택된 것의 조합인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. (a) 제1항의 재조합 벡터로 종양 세포를 형질전환하는 단계;

    (b) 영상화 제제를 개체에 투여하는 단계; 및

    (c) 상기 영상화 제제를 검출하는 단계를 포함하는 종양성 질환의 영상화 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 영상화 제제는 ¹²³I, ¹²⁴I 및 99mTcO₄ ^-로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.

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