KR20210081362A - 골수 유래 억제 세포에 대한 표적화 치료를 위한 세포 외 소포체 - Google Patents

골수 유래 억제 세포에 대한 표적화 치료를 위한 세포 외 소포체 Download PDF

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KR20210081362A
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다니엘 갈레고-페레즈
산미구엘 실비아 두아르테
나탈리아 히구이타-카스트로
윌리엄 카슨
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오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
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Abstract

본원에는 치료용 카르고와 함께 로딩된 MDSC-표적화된 세포 외 소포체(EV)뿐만 아니라 조성물, 시스템 및 이를 제조하기 위한 방법이 개시된다. 또한, 본원에는 MDSC-표적화 모이어티를 함유하는 융합 단백질과 같은 MDSC-표적화 리간드가 개시된다. 또한 개시된 융합 단백질을 함유하는 EV가 개시된다. 일부 구현예에서, EV는 또한 치료용 카르고로 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 생산하도록 조작된 EV 생산 세포가 개시된다. 또한, EV를 생산하기에 적합한 조건 하에서 개시된 EV 생산 세포를 배양하는 단계를 수반하는 개시된 EV를 제조하는 방법이 개시된다.

Description

골수 유래 억제 세포에 대한 표적화 치료를 위한 세포 외 소포체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 19일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/747,982에 우선권을 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 편입된다.
서열목록
본 출원은 2019년 10월 16일에 생성된 "321501-2360 서열목록_ST25"라는 제목의 ASCII.txt 파일로 전자 형식으로 제출된 서열목록을 함유한다. 서열목록의 내용은 그 전체가 본원에 편입된다.
골수 유래 억제 세포(MDSC)는 암, 상처 치유 및 조직 복구를 포함한 다수의 생리학적 및 병리학적 과정에서 기본적인 역할을 한다. 예를 들어, MDSC는 숙주의 면역계 및/또는 항암 요법으로부터 종양 세포를 보호하고 종양 세포 전파/확산을 촉진함으로써 종양/암 진행을 가능하게 한다. 따라서, MDSC를 선택적으로 표적화하고 그들의 활동을 조절하기 위한 치료적 접근 방식이 개발되어야 한다.
MDSC를 효과적으로 표적화하고 치료용 카르고(therapeutic cargo)을 전달하기 위한 나노 캐리어 시스템이 본원에 개시된다. 이러한 나노 캐리어는, 설계자 세포 외 소포체(EVs)를 기반으로 하며, 이는 자연에서 자가 조직(autologous)(즉, 동일한 환자의 세포에서 유래된) 또는 동종이계(allogeneic)(즉, 기증자의 세포에서 유래된)일 수 있다. 세포는 자연스럽게 EV를 생산한다. 그러나 면역 반응을 피하기 위해, 항원 제시 세포(예: 수지상 세포) 또는 대식세포와 같은 면역계의 세포가 사용될 수 있다.
개시된 ICAM-데코레이션된(ICAM-decorated) EV는, 암 및 자가 면역 질환과 같은 많은 다양한 조건에서 골수 세포를 표적으로 하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서 데코레이션(decoration)은 ICAM-발현 벡터를 "공여자" 세포 또는 조직으로 형질 감염시킴으로써 달성된다. 대안적으로, 본질적으로 높은 수준의 ICAM 발현을 갖는 공여자 세포 및 조직이 사용될 수 있다.
따라서 설계자 EV는 다양한 형질 감염 기술(예: 벌크 전기천공, 나노 전기천공, 조직 나노 형질 감염, 바이러스 형질 감염, 소노포레이션, 나노 입자, 마이크로 입자, 화학적 형질 감염)을 사용하여, 시험관내 세포 또는 생체내 조직의 형질 감염 후에 얻어질 수 있다. 치료용 카르고로 로딩 및/또는 MDSC-표적화 리간드로 데코레이션은, 예를 들어, ICAM1을 인코딩하는 플라스미드 DNA로 세포를 형질 감염시킴으로써 달성될 수 있다. ICAM1-기반 표적화는 몇 분 이내에 MDSC에 선택적 EV/카르고 배송을 가능하게 한다.
수집되면, 조영제(진단용) 또는 추가 표적화 또는 추적 단백질/성분을 포함하기 위해, 이러한 EV는 전기천공(카르고를 더 추가하기 위해), 생화학적 또는 화학적 기능화를 통하여 추가로 수정될 수 있다. EV는 또한 카르고를 추가로 수정하기 위해, 농도 기울기를 통하여 EV에 들어갈 수 있는 지질 투과성 약물/화학 물질로 추가로 수정될 수 있다(예: 유전적 카르고에 약리학적 제제를 추가하기 위해).
치료용 카르고는 치료중인 상태에 따라 골수 억제제 활동(myelosuppresor activity)을 강화할지 또는 길들일지에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, miR146a로 ICAM1-데코레이션된 EV를 로딩하는 것은, 종양 니치(tumor niche) 내에서 MDSC 활동에 대응하는 데 사용될 수 있다. 핵산 기반 치료용 카르고 외에도, ICAM1-데코레이션된 EV에는 막투과성 약리학적 화합물(예: 이브루티닙)을 로딩될 수 있으며, 이는 농도 기울기를 통해 EV로 확산될 수 있다. 일부 구현예에서, 카르고는, 진단 이미징을 위한 조영제와 같은 이미징 에이전트이다.
본 발명의 하나 또는 그 이상의 구현예의 세부사항은 첨부한 도면 및 하기 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 MDSC를 표적으로 하는 ICAM1-데코레이션된 EV의 생산을 개략적으로 나타낸 것이다. EV는 ICAM1 및 치료용 카르고(핵산 기반 치료제용)을 인코딩하는 플라스미드를 자가 조직 또는 동종이계 세포(시험관내 또는 생체내)로 전달하여 만들어진다. 세포 기계는 이러한 플라스미드들을 처리하여 ICAM1로 데코레이션되고 관심 핵산이 로딩된 설계자 EV의 생산을 가능하게 한다.
도 2는 약물치료용 카르고, 예를 들어 브루톤 티로신 키나제(BTK)를 억제하는 막투과성 약리학적 화합물인 이브루티닙으로 로딩된 표면-데코레이션된 EV의 개략도이다.
도 3은 ICAM1-데코레이션된 EV가 종양 미세환경 내의 MDSC 및 종양 관련 대식세포(TAM)를 표적화하여 면역억제 활성에 대응하고 종양의 치료를 용이하게 하는 데 사용될 수 있음을 예시한다.
도 4a는 ICAM1-데코레이션된 EV가, 15분의 인큐베이션 후 암세포(A549)가 아닌 MDSC 또는 대식세포(예: TAM)에 의해 우선적으로 내재화되었음을 보여준다(EV는 녹색 형광 염료로 라벨링됨). 도 4b는 데코레이션된 EV에서 miR-146a의 로딩을 보여준다. Scr-CT는 세포를 스크램블된 플라스미드로 형질 감염시켜 만든 대조군(CT)다.
도 5는 EV 기반 치료가 종양 성장을 방해한다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6a 및 6b는 EV 기반 치료가 종양의 면역 세포 구성에 영향을 미치고(도 6a), MDSC를 감소시키는 것(도 6b)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 조작된 EV를 검증하는 실험을 예시한다.
도 8a 및 8b는 로딩된 EV에서 발견된 miR146a의 수준이 대조군 EV에 비해 ~400배 증가하고(도 8a) GLUT-1 수준이 ~3000배 증가했음을 보여준다(도 8b). 도 8c는 EV가 ICAM-1로 데코레이션되었음을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 9a는 ICAM-데코레이션된 EV가 MDSC를 타겟으로 하는 것을 보여준다. 본 발명자들은 MDCS와 암세포를 공동 배양하고, 72시간 동안 EEV로 처리했다. 도 9b는 MDSC가 전염증성 표현형으로 전환되었음을 보여준다.
도 10은 조작된 EV가 유방암의 뮤린 모델(PyMT)에서 종양 진행을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 11a 및 11b는 조작된 EV가 면역중재(immunomodulatory) 활성을 나타내는 것을 보여준다. 조작된 EV로 주사된 종양은 베이스라인에 비해 단핵구 MDSC가 적었지만(도 11), 대식세포에는 변화가 없었다(도 11b).
도 12a 및 12b는 조작된 EV가 T 세포 침투를 증가시켰음을 보여준다.
본 개시가 더 상세하게 설명되기 전에, 본 개시는 설명된 특정 구현예들에 제한되지 않고, 물론 그 자체가 변할 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해된다. 왜냐하면 본 개시의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한 및 하한과 기타 언급된 또는 그 언급된 범위의 중간 값 사이의 각 중간 값은, 하한 단위의 10분의 1까지가 본 개시 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 특별히 제외된 제한에 따라 본 개시 내에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 개시에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 지금부터 설명된다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허는, 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되고 참조로 본원에 포함되어, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하는 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 공개하기 위한 것이며, 본 개시는 이전의 개시로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공되는 간행물은 개별적으로 확인되어야 하는 실제 공개일과 다를 수 있다.
본 개시를 읽을 때 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 설명되고 예시된 각각의 개별 구현예들은, 본 개시의 범위 또는 정신으로부터 이탈하지 않고, 임의의 다른 몇몇 구현예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 이벤트 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시의 구현예는 달리 표시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술 내에 있는 화학, 생물학 등의 기술을 적용할 것이다.
다음의 예는 본원에 개시되고 청구된 방법을 수행하고 프로브를 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 통상의 기술자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자(예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 오류들과 편차들이 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부품은 중량 부(parts by weight), 온도는 ℃, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 온도 및 압력은 20 ℃ 및 1 기압으로 정의된다.
본 개시의 구현예들이 상세하게 설명되기 전에, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시는 특정 물질, 시약, 반응 물질, 제조 공정 등에 제한되지 않고, 그 자체가 변할 수 있음을 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 개시에서, 이것이 논리적으로 가능한 다른 순서로 단계들이 실행될 수 있다는 것도 가능하다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점을 유의해야 한다.
치료용 카르고와 함께 로딩된 MDSC-표적화된 세포 외 소포체(EV)뿐만 아니라 조성물, 시스템 및 이를 제조하기 위한 방법이 개시된다. 또한, 본원에는 MDSC-표적화 모이어티를 함유하는 융합 단백질과 같은 MDSC-표적화 리간드가 개시된다. 또한, 개시된 융합 단백질을 함유하는 EV가 개시된다. 일부 구현예에서, EV는 또한 치료용 카르고로 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 생산하도록 조작된 EV 생산 세포가 개시된다. 또한, EV를 생산하기에 적합한 조건 하에서 개시된 EV 생산 세포를 배양하는 단계를 수반하는 개시된 EV를 제조하는 방법이 개시된다. 이 방법은 세포에서 EV를 정제하는 단계를 더 수반할 수 있다.
본 개시가 더 상세하게 설명되기 전에, 본 개시는 설명된 특정 구현예들에 제한되지 않고, 물론 그 자체가 변할 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해된다. 왜냐하면 본 개시의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 해당 범위의 상한 및 하한과 기타 언급된 또는 그 언급된 범위의 중간 값 사이의 각 중간 값은, 하한 단위의 10분의 1까지가 본 개시 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 특별히 제외된 제한에 따라 본 개시 내에 포함된다. 명시된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 제한 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 개시에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 지금부터 설명된다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허는, 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되고 참조로 본원에 포함되어, 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하는 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 공개하기 위한 것이며, 본 개시는 이전의 개시로 인해 그러한 간행물보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공되는 간행물은 개별적으로 확인되어야 하는 실제 공개일과 다를 수 있다.
본 개시를 읽을 때 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본원에서 설명되고 예시된 각각의 개별 구현예들은, 본 개시의 범위 또는 정신으로부터 이탈하지 않고, 임의의 다른 몇몇 구현예의 특징으로부터 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 이벤트 순서 또는 논리적으로 가능한 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 개시의 구현예는 달리 표시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술 내에 있는 화학, 생물학 등의 기술을 적용할 것이다.
다음의 예는 본원에 개시되고 청구된 방법을 수행하고 프로브를 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 통상의 기술자에게 제공하기 위해 제시된다. 숫자(예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 오류들과 편차들이 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부품은 중량 부(parts by weight), 온도는 ℃, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 표준 온도 및 압력은 20 ℃ 및 1 기압으로 정의된다.
본 개시의 구현예들이 상세하게 설명되기 전에, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시는 특정 물질, 시약, 반응 물질, 제조 공정 등에 제한되지 않고, 그 자체가 변할 수 있음을 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 개시에서, 이것이 논리적으로 가능한 다른 순서로 단계들이 실행될 수 있다는 것도 가능하다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다는 점을 유의해야 한다.
세포 외 비히클(EV)
개시된 EV는 일부 구현예에서 세포에 의해 분비될 수 있는 임의의 소포 일 수 있다. 세포는 세포사멸체(1-5 μm), 미소낭포(microvesicles)(크기 100-1000 nm), 엑소좀(50-150 nm)으로 알려진 엔도좀 기원의 소포체를 포함하여, 광범위한 직경과 기능을 가진 세포 외 소포체(EV)를 분비한다.
개시된 세포 외 소포체는 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 개시된 세포 외 소포체는 진핵 세포에서 세포-표적화 리간드를 인코딩하는 mRNA를 발현함으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 또한 치료용 카르고를 인코딩하는 mRNA를 발현한다. 세포-표적화 리간드 및 치료용 카르고에 대한 mRNA는, 개시된 EV를 생산하기 위해 적합한 생산 세포로 형질 감염된 벡터로부터 발현될 수 있다. 세포-표적화 리간드 및 치료용 카르고에 대한 mRNA는 동일한 벡터(예: 벡터가 별도의 프로모터로부터 세포 표적화 리간드 및 치료용 카르고에 대한 mRNA를 발현하는 경우)로부터 발현될 수 있거나, 또는 세포- 표적화 리간드 및 치료용 카르고는 별도의 벡터로부터 발현될 수 있다. 세포-표적화 리간드 및 치료용 카르고에 대한 mRNA를 발현하기 위한 벡터 또는 벡터들은 개시된 세포 외 소포체를 제조하기 위해 설계된 키트에 포장될 수 있다.
또한, 개시된 표적화 리간드를 함유하는 EV를 포함하는 조성물이 개시된다. 일부 구현예에서, EV에는 개시된 치료용 카르고가 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 분비하도록 조작된 EV 생산 세포가 개시된다.
엑소좀과 같은 EV는, B 림프구, T 림프구, 수지상 세포(DC) 및 대부분의 세포와 같은 면역 세포를 포함한 많은 다양한 유형의 세포에 의해 생산된다. 또한, EV는 예를 들어, 신경 교종 세포, 혈소판, 망상적혈구, 뉴런, 장상피세포 및 종양 세포에 의해 생산된다. 개시된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 EV는 상기 확인된 세포를 포함하는 임의의 적합한 세포로부터 유래될 수 있다. 대량 생산에 적합한 EV 생산 세포의 비제한적인 예는, 수지상 세포(예: 미성숙 수지상 세포), 인간 배아 신장 293(HEK) 세포, 293T 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 및 인간 ESC 유래 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 또한, EV는 자가 환자 유래, 이종 일배체형 일치(heterologous haplotype-matched) 또는 이종 줄기 세포로부터 얻을 수 있으므로, 엑소좀이 전달된 환자에서 면역 반응의 생성을 줄이거나 피할 수 있다. 이 목적을 위해 모든 EV 생산 세포가 사용될 수 있다.
또한, 개시된 EV를 분비하도록 조작된, 개시된 EV 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 치료용 카르고가 로딩된 개시된 EV를 제조하는 방법이 개시된다. 이 방법은 세포로부터 EV를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
세포에서 생산된 EV는 임의의 적합한 방법에 의해 배양 배지에서 수집될 수 있다. 일반적으로, EV의 제조는 원심 분리, 여과 또는 이러한 방법의 조합에 의해 세포 배양 또는 조직 상층액으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, EV는 차등 원심 분리, 즉 더 큰 입자를 펠릿하기 위한 저속(<20000g) 원심 분리에 이어서 EV를 펠릿으로 고속(>100000g) 원심 분리, 적절한 필터를 사용한 크기 여과, 기울기 초 원심 분리(예: 자당 기울기) 또는 이러한 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다.
MDSC 표적화 리간드
개시된 EV는, MDSC의 표면에서 발현되는 세포 표면 모이어티에 결합하는 표적화 모이어티를 EV의 표면에서 발현함으로써 MDSC로 표적화될 수 있다. 적합한 표적화 모이어티의 예는, 표적화 모이어티가 엑소좀의 표면에서 발현될 수 있는 한, 짧은 펩티드, scFv 및 완전 단백질이다. 펩티드 표적화 모이어티는 일반적으로 길이가 100 개 미만의 아미노산, 예를 들어 길이가 50 개 미만, 길이가 30 개 미만, 최소 길이가 10, 5 또는 3 개 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 표적화 리간드는 ICAM1이다. ICAM1-기반 표적화를 사용하면 몇 분 내에 MDSC에 선택적 EV/카르고 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 표적화 리간드가 ICAM-1과 아미노산 서열: MASTRAKPTLPLLLALVTVVIPGPGDAQVSIHPREAFLPQGGSVQVNCSSSCKEDLSLGLETQWLKDELESGPNWKLFELSEIGEDSSPLCFENCGTVQSSASATITVYSFPESVELRPLPAWQQVGKDLTLRCHVDGGAPRTQLSAVLLRGEEILSRQPVGGHPKDPKEITFTVLASRGDHGANFSCRTELDLRPQGLALFSNVSEARSLRTFDLPATIPKLDTPDLLEVGTQQKLFCSLEGLFPASEARIYLELGGQMPTQESTNSSDSVSATALVEVTEEFDRTLPLRCVLELADQILETQRTLTVYNFSAPVLTLSQLEVSEGSQVTVKCEAHSGSKVVLLSGVEPRPPTPQVQFTLNASSEDHKRSFFCSAALEVAGKFLFKNQTLELHVLYGPRLDETDCLGNWTWQEGSQQTLKCQAWGNPSPKMTCRRKADGALLPIGVVKSVKQEMNGTYVCHAFSSHGNVTRNVYLTVLYHSQNNWTIIILVPVLLVIVGLVMAASYVYNRQRKIRIYKLQKAQEEAIKLKGQAPPP (서열번호:1), 또는 MDSC상의 분자를 표적으로 할 수 있는 서열번호:1에 대하여 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 변이체 및/또는 이의 단편을 갖는다. 예를 들어, 표적화 리간드는, 아미노산 서열 LYQAKRFKV(서열번호:2)에 결합할 수 있는 서열번호:1의 단편 및/또는 변이체일 수 있으며, 일부 구현예에서 ICAM-1- 결합 부위를 정의할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 리간드는 서열번호:1의 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 156, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 420, 430, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 456, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 또는 537개의 인접 아미노산 또는 이의 변이체를 포함하는, ICAM-1의 단편이다.
ICAM-1의 결합 부위는 예를 들어 Diamond MS, et al. Cell 1991 65 : 961-971 및 Hermand P, et al. J Biol Chem 2000 275 (34) : 26002-26010에서 설명되고, 이는 이들 결합 도메인의 교시를 위해 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 세포 표적화 리간드는 엑소좀 또는 리소좀 막관통 단백질과의 융합 단백질로서 발현함으로써 EV의 표면상에서 발현될 수 있다.
치료용 카르고
개시된 세포 외 소포체는 치료제가 추가로 로딩될 수 있으며, 여기서 세포 외 소포체는 제제를 표적 세포로 전달한다. 적합한 치료제는 치료 약물(예: 소분자 약물), 치료 단백질 및 치료 핵산(예: 치료 RNA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 개시된 세포 외 소포체는 치료 RNA(본원에서 "카르고 RNA"로도 지칭됨)를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서 세포-표적화 모티프를 함유하는 융합 단백질은, 또한 세포 외 소포체가 세포로부터 분비되기 전에 카르고 RNA를 세포 외 소포체로 카르고 RNA를 포장하기 위해, 카르고 RNA에 존재하는 하나 이상의 RNA-모티프에 결합하는 RNA-도메인(예: 융합 단백질의 사이토솔의 C-말단에서)을 포함한다. 이와 같이, 융합 단백질은 "세포 표적 단백질" 및 "포장 단백질" 둘 다로 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 포장 단백질은 세포 외 소포체-로딩 단백질 또는 "EV 로딩 단백질"로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 카르고 RNA는 miRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, sgRNA 또는 이들의 임의의 조합이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항염증제는 micro-RNA 146a이다. 다른 miRNA는 M1-우선적인 해당 대사를 담당하는 핵심 분자의 발현을 조절하는 것으로 보고되었다(예: mRr9, miR127 및 miR155).
개시된 세포 외 소포체의 카르고 RNA는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 카르고 RNA는, 적어도 약 10 nt, 20 nt, 30 nt, 40 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt, 5000 nt 또는 이상의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 카르고 RNA는 약 5000 nt, 2000 nt, 1000 nt, 500 nt, 200 nt, 100 nt, 50 nt, 40 nt, 30 nt, 20 nt 또는 10 nt 이하의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 더 추가의 구현예에서, 카르고 RNA는 이러한 고려된 뉴클레오티드 길이 범위내의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 약 10 nt-5000 nt 범위 또는 다른 범위의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 개시된 세포 외 소포체의 카르고 RNA는, 예를 들어 카르고 RNA가 mRNA 또는 다른 상대적으로 긴 RNA를 포함하는 경우 비교적 길 수 있다.
일부 구현예에서, 치료용 카르고는 세포에 의해 분비된 후 EV에 로딩되는 막투과성 약리학적 화합물이다. 일부 구현예에서, 카르고는 표적화된 종양 세포의 아폽토시스 또는 파이롭토시스를 유발할 수 있는 항암제이다. 일부 구현예에서, 항암제는 소분자 약물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 카르고는 이브루티 닙이다. 본원에 기재된 종양 표적화 펩티드에 부착될 항암 약물 또는 항종양제의 추가적 예는, 아클라루비신, 알트레타민, 아미노프테린, 암루비신, 아자시티딘, 아자티오프린, 벨로테칸, 부술판, 캄프토테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카모푸르, 카르무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 시클로포스 파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 데시타빈, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 젬시타빈, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 피라루비신, 피산트론, 프로카르바진, 피리메타민 랄티트렉시트, 루비테칸, 사트라플라틴, 스트렙토조신, 티오구아닌, 트리플라틴 테트라니트레이트, 테니포사이드, 토포테칸, 테가푸르, 트리메토프림, 우라무스틴, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈플루닌, 비노렐빈 및 조루비신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
작은 RNA를 EV에 로딩하기 위해, 형질 감염 기반 접근법이 제안되었다. 다른 보고서는 세포내에서 작은 RNA의 벡터 유도 발현을 사용하여, EV에 작은 RNA 로딩을 달성할 수 있음을 보여주었다. 대안적으로, EV 기증자 세포는 작은 RNA로 직접 형질 감염될 수 있다. 화학 요법 약물로 종양 세포를 배양하는 것도 약물을 EV로 포장하는 또 다른 방법이다. 약물이 로딩된 EV의 형성을 자극하기 위해, 세포에 자외선을 조사하여 아폽토시스를 유도한다. 퓨소제닉(fusogenic) 리포좀과 같은 대체 접근 방식은 또한 약물을 EV에 로딩한다.
일부 구현예에서, 치료용 카르고는 농도 기울기를 통한 확산에 의해 EV에 로딩된다.
방법
또한 개시된 EV를 사용하는 방법이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 개시된 세포 외 소포체는 개시된 치료용 카르고를 골수 유래 억제 세포(MDSC)에 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 방법은 표적 세포를 개시된 EV와 접촉시키는 단계를 포함한다.
MDSC는 암, 상처 치유 및 조직 복구를 포함한, 여러 생리학적 및 병리학 적 과정에서 기본적인 역할을 한다. 개시된 EV는 MDSC를 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약학적 조성물의 일부로서 제형화 될 수 있고, 약학적 조성물은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 표적 MDSC에 카르고를 전달하기 위해 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 개시된 앞선은, 본원에 개시된 카르고 로딩된 MDSC-표적화 EV를 함유하는 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 수반하는, 대상체에 MDSC를 포함하는 질병을 치료하는 방법이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암에 걸린다. 일부 구현예에서, 대상체는 검출 가능한 순환 MDSC로서. 최근 연구에 따르면 MDSC는 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염, 외상성 스트레스, 패혈증, 급성 염증, 이식편 대숙주 질환 및 당뇨병, 뇌척수염과 대장염과 같은 다양한 자가 면역 질환과 같은 많은 병리학적 상태에 관련될 수 있음을 입증하였다.
개시된 EV는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 인간 또는 동물 대상체에 대한 투여는 비경구, 근육내, 뇌내, 혈관내, 피하 또는 경피 투여로부터 선택될 수 있다. 일반적으로 전달 방법은 주사다. 바람직하게는, 주사는 근육내 또는 혈관내(예: 정맥내)이다. 의사는 각 특정 환자에게 필요한 투여 경로를 결정할 수 있다.
EV는 바람직하게는 조성물로 전달된다. 조성물은 비경구, 근육내, 뇌내(intracerebral), 혈관내(정맥내 포함), 피하 또는 경피 투여용으로 제형화 될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. EV는 약학적 조성물로 제형화 될 수 있으며, 이는 약학적으로 허용되는 담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제 및 기타 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 등을 EV에 추가하여 포함할 수 있다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내와 같은 주사를 특징으로 한다. 비경구 투여를 위한 제제는, 주사 준비가 된 멸균 용액, 동결 건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 제품, 사용 직전에 용매와 결합될 준비가 된 제품 (피하 정제, 주사 준비가 된 멸균 현탁액, 사용 직전 비히클 및 멸균 에멀젼과 즉시 결합 가능한 멸균 건조 불용성 제품 포함)을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥내로 투여되는 경우, 적합한 담체에는 생리 식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS) 및 증점제 및 가용화제(예: 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리 프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물)를 함유하는 용액을 포함한다. 비경구 제제에 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제 또는 킬레이트제 및 기타 약학적으로 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 락테이트 링거 주사를 포함한다. 비수성 비경구용 비히클은 식물성 고정유(fixed oils of vegetable origin), 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩유를 포함한다. 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p- 히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화 벤잘코늄 및 염화 벤제토늄을 포함하는, 다회 복용량 용기에 포장된 비경구 제제에 정균 또는 진균 농도의 항균제가 첨가되어야 한다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 버퍼는 인산염과 구연산염을 포함한다. 항산화제는 중 황산 나트륨을 포함한다. 국소 마취제는 프로카인 염산염이 포함한다. 현탁제 및 분산제는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속 이온의 봉쇄제(sequestering agent) 또는 킬레이트제(chelating agent)는 EDTA를 포함한다. 또한, 약학적 담체는 물과 혼합될(miscible) 수 있는 비히클용 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조정을 위한 수산화 나트륨, 염산, 구연산 또는 젖산을 포함한다. 약학적으로 활성 화합물의 농도는, 주사가 바람직한 약리학적 효과를 생산하기 위한 유효량을 제공하도록 조정된다. 정확한 복용량은 당업계에 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 따라 달라진다.
단위 복용량(unit-dose) 비경구 제제는 앰플(ampoule), 바이알 또는 바늘이있는 주사기(syringe)에 포장될 수 있다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당 업계에 알려지고 실행되는 바와 같이 멸균되어야 한다.
치료적 유효량의 조성물이 투여된다. 용량은 다양한 파라미터, 특히 치료될 환자의 상태, 연령 및 체중의 중증도; 투여의 경로; 그리고 필요한 식이 요법(regimen)에 따라 결정될 수 있다. 의사는 임의의 특정 환자에게 필요한 투여의 경로와 정량(dosage)을 결정할 수 있다. 최적의 정량은 개별 작제물의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50을 기반으로 추정될 수 있다. 일반적으로, 정량은 체중의 0.01 mg/kg에서 100 mg/kg이다. 전형적인 일일 복용량(dose)은, 특정 작제물의 효능, 치료받을 대상체의 연령, 체중 및 상태, 질병의 중증도 및 투여 빈도 및 경로에 따라, 체중의 약 0.1 내지 50 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 투여가 근육 내 주사인지 전신(정맥 또는 피하) 주사인지에 따라 상이한 정량의 작제물이 투여될 수 있다.
바람직하게는, 단일 근육 내(intramuscular) 주사의 복용량은 약 5 내지 20 μg 범위이다. 바람직하게는, 단일 또는 다중 전신 주사의 복용량은 10 내지 100 mg/kg 체중 범위이다.
작제물 제거(및 임의의 표적화 분자의 분해)로 인해, 환자는, 예를 들어 매일, 매주, 매월 또는 매년 한 번 이상, 반복적으로 치료되어야 할 수 있습니다. 통상의 기술자는 체액 또는 조직에서 작제물의 측정된 체류시간 및 농도를 기반으로, 투약 반복율을 쉽게 추정할 수 있다. 성공적인 치료 후, 환자에게 유지 요법을 받는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서 작제물은 체중 kg 당 0.01mg/kg 내지 100mg 범위의 유지 복용량으로 1일 1회 이상, 20년에 1회 투여된다.
본 발명의 다수의 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 따라서, 다른 구현예는 다음 청구항의 범위 내에 있다.
본 발명의 다수의 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 할 것이다. 따라서, 다른 구현예는 다음 청구항의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1:
DC는 miR146a에 대한 플라스미드로 나노 형질감염되었다. EV는 ExoQuick을 사용하여 배양 배지로부터 분리되었다. 시험관내 효능을 평가하기 위해, 암세포가 아닌 MDSC 또는 대식세포와 함께 시험관내 단일 배양이 사용되었다 (A549). 세포는 카르고 EV로 처리되었다. 도 4a는 ICAM1-데코레이션된 EV가 15분 배양 후 암세포(A549)가 아닌 MDSC 또는 대식세포(예: TAM)에 의해 우선적으로 내재화되었음을 보여준다(EV는 녹색 형광 염료로 라벨링됨). miR146a에 대한 rq-PCR이 수행되었다. 그림 4b는 데코레이션된 EV에서 miR-146a의 로딩을 보여준다. Scr-CT는 세포를 스크램블된 플라스미드로 형질 감염시켜 만든 대조군(CT) EV다. +
실시예 2:
골수 유래 억제 세포에 대한 표적 치료를 위한 설계자 EV는 종양 성장을 방해한(도 5). 도 6a 및 6b에 나타난 것처럼, EV 기반 치료는 CD4 및 CD8 세포를 증가시키고 MDSC를 감소시킴으로써 종양의 면역 세포 구성에 영향을 준다(도 6b).
실시예 3:
종양 환경의 면역 조절을 촉진하기 위해 TNT에 의해 생성된 EV의 직접 주사. EV가 종양 진행의 감소에 실제로 책임이 있음을 보여주기 위해, EV는 나노 전기충격법(nano-electrophoration)을 사용하여 시험관내에서 제작되었으며, 그런 다음 miR146a, GLUT-1 및 ICAM-1이 로딩된 "조작된 EV"(도 7)로 지칭된다. 조작된 EV는 피부 모델로 배아 섬유아세포에서 생산되었다.
조작된 EV가 관심의 카르고로 로딩되었을 때, 대조군 EV에 비하여 로딩된 EV에서 발견된 miR146a의 수준은 대략 400배 증가되었고, GLUT-1의 수준은 대략 3000배 증가되었다(도 8a 및 8b). 도 8c는 EV가 ICAM-1로 데코레이션되었음을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
EEV가 MDSC를 표적으로 하였는지 테스트하기 위해, MDCS와 암세포는 공동 배양되었고 72시간 동안 조작된 EV로 처리되었다. EV가 데코레이션되지 않았을 때, MDSC와 종양 세포 모두에 의해 촬영되었다. 그러나, 데코레이션된 조작된 EV는 종양 세포가 아닌 MDSC를 선택적으로 표적으로 하였다(도 9a). 또한, MDSC는 전염증성 표현형으로 전환되었다: 전염증성 마커의 수준이 증가하고 항염증성 또는 종양 보호 마커의 수준이 감소했다(도 9b).
기능적으로 조작된 EV는 유방암의 뮤린 모델(PyMT)의 종양에 직접 주사되어, 치료된 동물에서 종양 진행이 감소되었다(도 10). 도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, 조작된 EV가 주사된 종양은 베이스라인에 비해 단핵구 MDSC가 적었다 (도 11a). 이러한 결과는 조작된 EV가 종양에서 전염증성 골수 세포의 비율을 증가시키는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
마지막으로, 조작된 EV의 주사는 대조군에 비해 세포독성 T 세포에 의한 침투 증가를 분명히 촉진했다(도 12a 및 12b). 따라서, 이러한 결과는 EV가 주사될 때, 종양이 "더 뜨거워지거나" 더욱 전염증성을 유발한다는 것을 확인시켜준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 인용된 간행물 및 인용된 물질은 구체적으로 참고로 포함된다.
통상의 기술자는, 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에서 설명된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구항에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ohio State Innovation Foundation <120> EXTRACELLULAR VESICLES FOR TARGETED THERAPIES AGAINST MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS <130> 321501-2360 <150> US 62/747,982 <151> 2018-10-19 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 537 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Thr Arg Ala Lys Pro Thr Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Val Val Ile Pro Gly Pro Gly Asp Ala Gln Val Ser Ile His 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Phe Leu Pro Gln Gly Gly Ser Val Gln Val Asn Cys 35 40 45 Ser Ser Ser Cys Lys Glu Asp Leu Ser Leu Gly Leu Glu Thr Gln Trp 50 55 60 Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ser Gly Pro Asn Trp Lys Leu Phe Glu Leu 65 70 75 80 Ser Glu Ile Gly Glu Asp Ser Ser Pro Leu Cys Phe Glu Asn Cys Gly 85 90 95 Thr Val Gln Ser Ser Ala Ser Ala Thr Ile Thr Val Tyr Ser Phe Pro 100 105 110 Glu Ser Val Glu Leu Arg Pro Leu Pro Ala Trp Gln Gln Val Gly Lys 115 120 125 Asp Leu Thr Leu Arg Cys His Val Asp Gly Gly Ala Pro Arg Thr Gln 130 135 140 Leu Ser Ala Val Leu Leu Arg Gly Glu Glu Ile Leu Ser Arg Gln Pro 145 150 155 160 Val Gly Gly His Pro Lys Asp Pro Lys Glu Ile Thr Phe Thr Val Leu 165 170 175 Ala Ser Arg Gly Asp His Gly Ala Asn Phe Ser Cys Arg Thr Glu Leu 180 185 190 Asp Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ala Leu Phe Ser Asn Val Ser Glu Ala 195 200 205 Arg Ser Leu Arg Thr Phe Asp Leu Pro Ala Thr Ile Pro Lys Leu Asp 210 215 220 Thr Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly Thr Gln Gln Lys Leu Phe Cys Ser 225 230 235 240 Leu Glu Gly Leu Phe Pro Ala Ser Glu Ala Arg Ile Tyr Leu Glu Leu 245 250 255 Gly Gly Gln Met Pro Thr Gln Glu Ser Thr Asn Ser Ser Asp Ser Val 260 265 270 Ser Ala Thr Ala Leu Val Glu Val Thr Glu Glu Phe Asp Arg Thr Leu 275 280 285 Pro Leu Arg Cys Val Leu Glu Leu Ala Asp Gln Ile Leu Glu Thr Gln 290 295 300 Arg Thr Leu Thr Val Tyr Asn Phe Ser Ala Pro Val Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Gln Leu Glu Val Ser Glu Gly Ser Gln Val Thr Val Lys Cys Glu Ala 325 330 335 His Ser Gly Ser Lys Val Val Leu Leu Ser Gly Val Glu Pro Arg Pro 340 345 350 Pro Thr Pro Gln Val Gln Phe Thr Leu Asn Ala Ser Ser Glu Asp His 355 360 365 Lys Arg Ser Phe Phe Cys Ser Ala Ala Leu Glu Val Ala Gly Lys Phe 370 375 380 Leu Phe Lys Asn Gln Thr Leu Glu Leu His Val Leu Tyr Gly Pro Arg 385 390 395 400 Leu Asp Glu Thr Asp Cys Leu Gly Asn Trp Thr Trp Gln Glu Gly Ser 405 410 415 Gln Gln Thr Leu Lys Cys Gln Ala Trp Gly Asn Pro Ser Pro Lys Met 420 425 430 Thr Cys Arg Arg Lys Ala Asp Gly Ala Leu Leu Pro Ile Gly Val Val 435 440 445 Lys Ser Val Lys Gln Glu Met Asn Gly Thr Tyr Val Cys His Ala Phe 450 455 460 Ser Ser His Gly Asn Val Thr Arg Asn Val Tyr Leu Thr Val Leu Tyr 465 470 475 480 His Ser Gln Asn Asn Trp Thr Ile Ile Ile Leu Val Pro Val Leu Leu 485 490 495 Val Ile Val Gly Leu Val Met Ala Ala Ser Tyr Val Tyr Asn Arg Gln 500 505 510 Arg Lys Ile Arg Ile Tyr Lys Leu Gln Lys Ala Gln Glu Glu Ala Ile 515 520 525 Lys Leu Lys Gly Gln Ala Pro Pro Pro 530 535 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val 1 5

Claims (11)

  1. ICAM1 및 엑소좀 또는 리소좀 막관통 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항의 융합 단백질을 포함하는, 세포 외 소포체.
  3. 제2항에 있어서,
    치료용 카르고(cargo)를 더 포함하는, 세포 외 소포체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 치료용 카르고는 miR146a를 포함하는, 세포 외 소포체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 치료용 카르고는 이브루티닙을 포함하는, 세포 외 소포체.
  6. 제1항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    치료용 RNA를 인코딩하는 핵산을 더 포함하는, 세포.
  8. 세포 외 소포체를 생산하는 방법에 있어서, 제6항 또는 제7항의 세포를 소포체 분비에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 세포에서 분비된 세포 외 소포체를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    치료용 약물과 함께 세포 외 소포체를 로딩하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 대상체의 암을 치료하는 방법에 있어서, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포 외 소포체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 대상체는 순환 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 갖는, 방법.
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