TW202242109A - 醫藥組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種醫藥組合物及其用途。所述醫藥組合物包含miR-4759和藥學上可接受之載體。所述miR-4759可降低PD-L1的表現量，提高周邊血免疫細胞對癌細胞的免疫毒殺作用。藉此，所述醫藥組合物可用於製備治療癌症之藥物，以及可用於製備免疫調節劑。

Description

醫藥組合物及其用途

本發明係關於一種醫藥組合物及其用途，特別是一種包含miR-4759的醫藥組合物及其用途。

癌症免疫治療是一種透過激活自體免疫系統來治癒癌症之方法。此類治療是近年來癌症治療快速發展的研究方向。免疫治療可分為主動免疫、被動免疫與合併免疫。主動免疫治療直接誘導自體免疫系統，使其能辨識腫瘤抗原，進而攻擊腫瘤細胞。主動細胞療法一般會由血液或腫瘤中分離出免疫細胞，將這些細胞體外培養後再輸回患者體內去攻擊腫瘤。近年也有經由基因工程改造嵌合抗原受體後使免疫細胞表現腫瘤特異性受體，再經培養後輸回患者體內進行治療。被動免疫療法是藉助外源物激發抗腫瘤作用，其中常見的方式有單株抗體、淋巴細胞、細胞因子等。而合併免疫則為主動、被動免疫合併治療之方式。

免疫檢查點是影響免疫系統功能的開關之一，其可以是激活性或抑制性的。免疫檢查點的功能原可避免免疫細胞在對抗外來病原體時傷及自身細胞或組織，或引起自體免疫反應。而腫瘤細胞會利用這些免疫檢查點來保護自己、逃避免疫系統的攻擊。針對免疫檢查點治療之藥物以抗體藥為主，全球開發中的免疫檢查點抗體超過90項，大部分的產品還在臨床前試驗階段。

跨膜蛋白細胞程序性死亡受體1 (Programmed cell death protein 1, PD-1)為表現在T淋巴球表面的一種免疫檢查點，當PD-1與其目標細胞上的配體細胞程序性死亡配體1 (programmed cell death ligand-1 , PD-L1)接合，便可抑制T淋巴球的毒殺反應，這條路徑可提供了癌細胞一種自我保護機制而免於免疫細胞介導的細胞凋亡。所謂PD-1/PD-L1抑制劑為能與PD-1或PD-L1結合的藥物，目前臨床上核准使用的皆為單株抗體，其可用於阻斷PD-1和PD-L1之間的相互作用，使T淋巴球啟動免疫反應並毒殺腫瘤細胞。PD-1/PD-L1抑制劑目前已經在部分癌別看到治療成效，尤其是黑色素瘤及肺癌。其在許多臨床試驗中都看到優於目前二線用藥之效果，應用日益廣泛。但癌細胞上PD-L1蛋白的轉譯後修飾(例如過度醣基化修飾和分泌型PD-L1蛋白變體)及針對外來PD-L1抗體藥的人體免疫反應，會阻斷PD-L1抗體藥的治療效果，使目前臨床上以PD-L1抗體做為PD-L1抑制劑具有用藥低反應率以及抗藥性等問題。

本發明之一態樣是在提供一種醫藥組合物，其包含miR-4759和藥學上可接受之載體。miR-4759之序列如SEQ ID NO: 1所示，藥學上可接受之載體用以包覆miR-4759。

依據前述之醫藥組合物，其中所述藥學上可接受之載體可包含奈米微粒(nanoparticle)、微脂體(liposome)、固態脂質奈米微粒(solid lipid nanoparticle, SLN)、奈米懸浮液(nanosuspension)和病毒載體(viral vector)。

依據前述之醫藥組合物，可更包含至少一癌症治療劑。較佳地，所述至少一癌症治療劑可選自由一化學治療劑、一放射治療劑、一激素治療劑、一毒素、一標靶治療劑和一免疫調節劑所組成之群組。

本發明之另一態樣是在提供一種醫藥組合物之用途，其係用以製備治療癌症之藥物。

依據前述之醫藥組合物之用途，其中所述治療癌症之藥物可抑制腫瘤生成或轉移。

依據前述之醫藥組合物之用途，其中所述癌症可選自由乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、骨癌、黑色素瘤、皮膚癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、白血病、胰島細胞瘤、星形細胞瘤、前列腺癌、子宮癌、軟組織腺泡狀肉瘤、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、頸動脈體瘤、皮膚良性纖維組織細胞瘤、伊文氏腫瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、甲狀旁腺腫瘤、乳頭狀甲狀腺癌、膽囊或膽管癌、骨纖維性結構不良、生殖細胞瘤、妊娠性滋養細胞疾病、AIDS-相關癌症、卡波西氏肉瘤、淋巴瘤、神經管胚細胞瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、腦膜瘤、垂體瘤、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移癌、胸腺癌、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、肉瘤、軟組織肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌和腎上腺腫瘤所組成之群組。較佳地，所述癌症可為三陰性乳腺癌。

本發明之又一態樣是在提供一種醫藥組合物之用途，其係用以製備免疫調節劑。

依據前述之醫藥組合物之用途，其中所述免疫調節劑可為PD-L1抑制劑。

藉此，本發明之醫藥組合物利用體外合成技術合成miR-4759，並利用藥學上可接受之載體將其包覆以運送，其藉由miR-4759靶向癌症細胞中PD-L1的信息核糖核酸(mRNA)，抑制PD-L1的轉譯進而減少PD-L1的蛋白表現，以提升癌症患者自身免疫系統對於癌症細胞之免疫毒殺作用，並可提升PD-L1抑制劑療法的反應率和克服PD-L1抗體藥可能造成之抗藥性問題。是以本發明之醫藥組合物可用於製備治療癌症之藥物，以及可用於製備免疫調節劑。

除非另有說明，本文中所使用之所有專門術語、符號或其他科學名詞或術語具有本發明所屬領域中熟諳此技藝者習知之含意。在某些情況下，具有習知含意之術語係在本文中界定以達到明確及/或即時參考之目的，且本文中所納入的這些定義應被解釋為不一定與該領域中習知之意義有實質差異。本文中所敘述或引用之許多技術與程序均為大眾所習知且時常為該領域中之技術人員以常規方法使用。在適當情況下，除非另有說明，市售套組和試劑的使用程序一般均根據製造商界定的使用說明及/或參數來進行。

本說明書所述之「一」及「一個」意指文章中的文法對象為一或多個(即至少一個)。本說明書所述之「或」意指「及/或」，除非有明確表示要僅僅意指另一個選擇，或除非其他的選擇互相排斥。而本說明書所述之「多核酸序列」包含了正股之序列和反股之序列。

本說明書所述之「微小核酸 (microRNA, miRNA, miR)」為長度約19-23個核苷酸之單股非編碼RNA分子，其功能可調節其他基因的表現。微小核酸透過與目標訊息RNA的3'端非轉譯區(3'-UTR)互補結合，造成其目標mRNA之裂解或蛋白質轉譯抑制，進而抑制轉錄後的基因表現。

本說明書所述之「治療」是指將本發明之醫藥組合物施用予有需要的受試者，例如癌症患者。

本說明書所述之「改善」意指減小、抑制、削弱、減少、停止或穩定疾病或其症狀的發展或進展。

本說明書所述之「癌症」是指或描述哺乳動物中以細胞生長失調為典型特徵的生理狀況。「腫瘤」包括一種或多種癌細胞。癌症的實例包含但不限於乳腺癌、三陰性乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、骨癌、黑色素瘤、皮膚癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、白血病、胰島細胞瘤、星形細胞瘤、前列腺癌、子宮癌、軟組織腺泡狀肉瘤、腦脊髓癌、轉移性腦瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌、透明細胞癌、頸動脈體瘤、皮膚良性纖維組織細胞瘤、伊文氏腫瘤、促纖維增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、甲狀旁腺腫瘤、乳頭狀甲狀腺癌、膽囊或膽管癌、骨纖維性結構不良、生殖細胞瘤、妊娠性滋養細胞疾病、AIDS-相關癌症、卡波西氏肉瘤、淋巴瘤、神經管胚細胞瘤、多發性內分泌腫瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常症候群、腦膜瘤、垂體瘤、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液疾病、腎轉移癌、胸腺癌、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、肉瘤、軟組織肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌和腎上腺腫瘤。

本發明之醫藥組合物可與至少一種其它癌症治療劑聯合施用，例如可與化學治療劑、放射治療劑、激素治療劑、毒素、標靶治療劑和免疫調節劑或其組合聯合施用。

所述化療治療劑可選自烷基化劑、亞硝基脲劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、植物來源的生物鹼、拓撲異構酶抑製劑、激素治療藥、激素拮抗劑、芳香酶抑製劑、P-糖蛋白抑製劑和鉑絡合物衍生物所組成之群組。化療治療劑的實例包含但不限於酸阿比特龍、阿法替尼、阿地白介素、阿來組單抗、阿利維A酸、六甲蜜胺、氨磷丁(Amifostine)、氨魯米特、阿那格雷、阿那曲唑、三氧化二砷、天冬醯胺酶、氮雜胞苷、硫唑嘌呤、賓達氮芥、貝伐單抗、蓓薩羅丁(Bexarotine)、比卡魯胺、博來黴素、硼替佐米、白消安、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、克唑替尼、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、達沙替尼、柔紅黴素、地尼白介素、地西他濱、多西他賽、地塞米松、去氧氟尿苷、阿黴素、表柔比星、重組人類紅細胞生成素α(Epoetin Alpha)、埃博黴素(Epothilone)、厄洛替尼、雌莫司汀、恩替諾特、依託泊苷、依維莫司、依西美坦、非格司亭、氟尿苷、氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、葉酸連接的生物鹼(folated linked alkaloid)、吉非替尼、吉西他濱、吉妥珠單抗(Gemtuzumab ozogamicin)、GM-CT-01、戈舍瑞林、羥基脲、替伊莫單抗、伊達比星、異環磷醯胺、伊馬替尼、干擾素α、干擾素β、伊立替康、伊沙匹隆、拉帕替尼、甲醯四氫葉酸、利普安、來那度胺、來曲唑、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米托蒽醌、奈拉濱、尼祿替尼、尼魯米特、奧曲肽、奧法木單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉑、紫杉醇、帕尼單抗、培美曲塞、噴司他丁、多糖半乳凝集素抑制劑、甲基苄肼、雷洛昔芬、視黃酸、利妥昔單抗、羅米司亭、沙格司亭、索拉非尼、鏈脲黴素、舒尼替尼、他莫西芬、坦羅莫司、替莫唑胺、替尼泊苷、沙立度胺、硫鳥嘌呤、噻替派、硫鳥嘌呤、拓撲替康、托瑞米芬、托西莫單抗、曲美替尼、曲妥珠單抗、維甲酸、戊柔比星、VEGF抑制劑和捕獲劑、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞賓、Vintafolide (EC145)、伏立諾他、其鹽或前述任意組合。

所述放射治療劑可選自α-發射放射性核素、β-發射放射性核素、γ-發射放射性核素或前述任意組合。

所述激素治療劑包含但不限於:芳香酶抑制藥[例如，氨魯米特、阿那曲唑(Arimidex ^®)、來曲唑(Femara ^®)、伏氯唑、依西美坦(Aromasin ^®)、4-雄烯-3,6,17-三酮(6-OXO)、1,4,6-雄三烯-3,17-二酮(ATD)、福美坦(Lentaron ^®)]；選擇性雌激素受體調節劑(例如，巴多昔芬、氯米芬、氟維司群、拉索昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬)；固醇類(例如，地塞米松)；非那雄胺以及促性腺素釋放激素激動劑(GnRH)如戈舍瑞林，其藥學上可接受的鹽；其立體異構體；其衍生物；其類似物或前述任意組合。

所述標靶治療劑可為小分子、小分子偶聯物或單株抗體。其可選自由酪氨酸激酶抑制劑、裂原活化蛋白激酶抑制劑、JAK激酶抑制劑、間變性淋巴瘤激酶抑制劑、B細胞淋巴瘤-2抑制劑、聚ADP核糖聚合酶抑制劑、選擇性雌性激素受體調節劑、磷脂醯肌醇三激酶抑制劑、Braf抑制劑、周期蛋白依賴性激酶抑制劑和熱休克蛋白90抑制劑所組成之群組。靶向治療藥物的實例包含但不限於甲磺酸伊馬替尼、吉非替尼、厄洛替尼、硼替佐米、三苯氧胺、托法替尼、克唑替尼、ABT-263、棉酚、奧拉帕、哌立福辛、阿帕替尼、AN-152、(AEZS-108)阿黴素結合[D-Lys(6)]-LHRH、維羅非尼、達拉菲尼、LGX818、曲美替尼、MEK162、PD-0332991、LEE011、沙利黴素、Vintafolide、利妥昔單抗、曲妥單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗或前述任意組合。

所述免疫調節劑係選自細胞因子和免疫檢查點抑制劑。免疫調節劑的實例包含但不限於TLR促效劑(TLR1 、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11促效劑)、1型干擾素(視情況為α干擾素或β干擾素)、CD40促效劑、IL-6拮抗劑、TNF拮抗劑、細胞毒素T淋巴細胞相關聯之抗原4 (CTLA-4)抑制劑[例如伊派利單抗(ipilimumab) (Yervoy ^®)]、細胞程序死亡-1 (PD-1)抑制劑[例如派立珠單抗(pembrolizumab) (Keytruda ^®)或納武單抗(nivolumab) (Opdivo ^®)]及細胞程式死亡-配體1 (PD-L1)抑制劑[例如阿特唑單抗(atezolizumab) (Tecentriq ^®)]。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

[試驗例]

一、本發明之醫藥組合物

本發明之醫藥組合物包含miR-4759和藥學上可接受之載體。miR-4759係指其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示之微小核酸，藥學上可接受之載體用以包覆miR-4759。進一步地，所述藥學上可接受之載體可包含奈米微粒(nanoparticle)、微脂體(liposome)、固態脂質奈米微粒(solid lipid nanoparticle, SLN)、奈米懸浮液(nanosuspension)和病毒載體(viral vector)。

本發明之miR-4759包含根據成熟的人類miR-4759序列設計的DNA核苷酸，其係發明人自有潛力作為免疫檢查點抑制劑的713個微小核酸中，經由6種以上生物信息學工具分析後，預測為可負調控PD-L1的候選微小核酸。請參照第1圖，為hsa-miR-4759與PD-L1之間的表現相關性的預測分析結果圖，其中hsa-miR-4759表示為人類(Homo sapiens)的miR-4759。第1圖的結果顯示，hsa-miR-4759與其標靶的PD-L1之間的表現相關呈負相關，皮爾森相關係數小於-0.1，且P值為0.016。

二、本發明之醫藥組合物抑制PD-L1的表現量

本試驗上進一步地驗證miR-4759靶向PD-L1 mRNA的位置，以及證明miR-4759確實能抑制PD-L1的表現量。

請參照第2A圖，為hsa-miR-4759與PD-L1 mRNA的預測靶向序列的示意圖，生物信息學分析顯示，在PD-L1 mRNA的3'-UTR中存在miR-4759的兩個預測的結合序列，分別為位點1 (no. 1950-1957)和位點2 (no. 2460-2466)。為了驗證miR-4759確實藉由預測的結合序列直接靶向PD-L1基因的表現，在野生型3'-UTR (WT)和miR-4759結合位點突變體(MUT)的控制下，對冷光素酶基因進行了冷光素酶測定。試驗上製備靶向人類野生型(WT)位點1或位點2的冷光素酶載體，或靶向PD-L1 3'-UTR區的位點1或位點2突變體(MUT)的冷光素酶載體，再將製備好的冷光素酶載體分別與miR-4759或干擾miRNA (miR-Scr)共轉染到人類乳腺癌細胞MDA-MB-231 (以下簡稱為MDA-MB-231)或人類乳腺癌細胞BT-549 (以下簡稱為BT-549)中，並在轉染48小時後，分析細胞中的相對冷光素酶活性。其中MDA-MB-231和BT-549皆為三陰性(ER (-), PR (-), HER2(-); TNBC)乳腺癌細胞株。

請參照第2B圖和第2C圖，為miR-4759與PD-L1 mRNA結合位置的分析結果圖，其中第2B圖為位點1的分析結果圖，第2C圖為位點2的分析結果圖。結果數據以平均值±標準差表示(n = 6)，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析，其中*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜ 0.01，***表示P ＜ 0.001。

第2B圖的結果顯示，在MDA-MB-231和BT-549中，共轉染野生型PD-L1和miR-4759會抑制冷光酶活性，而共轉染PD-L1位點1突變體和miR-4759則不會影響冷光酶活性。第2C圖的結果顯示，在MDA-MB-231和BT-549中，共轉染野生型PD-L1和miR-4759會抑制冷光酶活性，而共轉染PD-L1位點2突變體和miR-4759則不會影響冷光酶活性。由第2B圖和第2C圖的結果顯示，miR-4759確實會結合至PD-L1 3'-UTR區的位點1和位點2，進而抑制PD-L1的轉譯。

進一步地，試驗上將miR-4759或miR-Scr轉染至MDA-MB-231或BT-549中，再藉由qRT-PCR分析確定miR-4759和PD-L1的mRNA表現量，藉以增加細胞內miR-4759的表現量，來觀察對癌細胞之影響。並將細胞裂解收取蛋白質樣本，以西方墨點法確定PD-L1的蛋白表現量。

請參照第2D圖、第2E圖和第2F圖，第2D圖和第2E圖為miR-4759抑制PD-L1的mRNA表現量的分析結果圖，其中第2D圖為MDA-MB-231的結果，第2E圖為BT-549的結果。miR-4759表現量為藉由非編碼核的小RNA U6來標準化並視為內部控制，PD-L1 mRNA抑制效果為以定量RT-PCR所測量的PD-L1 cDNA量來判斷。結果數據以平均值±標準差表示(n = 3)，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析，其中*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜ 0.01。第2F圖為miR-4759抑制PD-L1的蛋白質表現量的分析結果圖，PD-L1蛋白表現量為藉由β-肌動蛋白表現量來標準化並視為內部控制。

第2D圖和第2E圖的結果顯示，miR-4759質體可有效提升使miR-4759之表現，在MDA-MB-231中miR-4759的表現量比控制組增加38646.5倍，而在BT-549中則增加了2722.8倍。而MDA-MB-231中PD-L1的mRNA表現量顯著降低了34.5%，在BT-549中PD-L1的mRNA表現量則下降了33.8%，是以轉染miR-4759確實會抑制MDA-MB-231和BT-549中PD-L1的mRNA表現量。而第2F圖的結果顯示，轉染miR-4759確實會顯著地抑制MDA-MB-231和BT-549中PD-L1的蛋白質表現量，且隨miR-4759濃度增加而提升抑制效果。上述結果顯示，miR-4759會藉由靶向PD-L1基因的3'-UTR直接抑制PD-L1表現。

三、本發明之醫藥組合物刺激免疫細胞毒殺癌細胞之結果

癌細胞上調節其PD-L1的表現量為逃避T細胞毒殺作用的主要原因之一。為了確定miR-4759是否藉由抑制PD-L1的表現量來增強三陰性乳腺癌細胞對T細胞免疫的敏感性，進行了將外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)與三陰性乳腺癌細胞共培養的細胞毒殺試驗。

試驗上將志願者的新鮮全血以Ficoll-Paque分離液方法取出外周血單個核細胞，並置於具有1%青黴素/鏈黴素和10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基中生長，以100 ng/mL之anti-CD3、anti-CD28 (#317303; #302913; BioLegend Inc.)及IL-2(#200-02; PeproTech, Inc.)激活24小時後待用；將分別轉染miR-4759及miR-Scr後12小時的BT-549和MDA-MB-231分別以3 × 10 ³細胞/孔的密度種入96孔盤中，待8小時後細胞貼盤，以3 × 10 ⁴細胞/孔的密度種入激活的PBMC進行共培養，並依製造商指示加入IncuCyte ^®Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Reagent 以IncuCyte ^®ZOOM system活細胞動態成像分析系統進行凋亡細胞的綠螢光測量。

請參照第3A圖和第3B圖，第3A圖為miR-4759增強免疫細胞毒殺癌細胞效果的分析結果圖，第3B圖為第3A圖的統計結果圖，結果數據以平均值±標準差表示(n = 3)，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析，其中*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜ 0.01。結果顯示miR-4759可顯著提升與人類外周血單個核細胞共培養的癌細胞凋亡，其中在MDA-MB-231中癌細胞凋亡表現量比控制組增加1.33倍，而在BT-549中癌細胞凋亡的狀況和控制組相比則增加了1.83倍。顯示miR-4759的轉導可有效地使MDA-MB-231和BT-549對PBMC毒殺作用敏感。

此外，以酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定共培養基中IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α和IL-10表現量，結果請參照第3C圖，其為共培養基中IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α和IL-10表現量的分析結果圖。結果數據以平均值±標準差表示(n = 3)，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析，其中*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜ 0.01，***表示P ＜ 0.001。結果顯示，將PBMC與轉染miR-4759的MDA-MB-231和BT-549共培養，可顯著增加MDA-MB-231和BT-549中IFN-γ、TNF-α和顆粒酶B的分泌，並降低培養基中IL-10的表現量。

此外，為再次確認上述免疫細胞毒殺作用的增強效果為藉由miR-4759抑制PD-L1的表現，試驗上將miR-4759或miR-Scr轉染至具有穩定表現外源性PD-L1 (pCDH-PD-L1)或不具有穩定的外源性PD-L1表現(pCDH)的MDA-MB-231或BT-549中，再藉由西方墨點法分析PD-L1的蛋白質表現量，結果請參照第3D圖，為miR-4759對具有或不具有穩定的PD-L1過度表現的三陰性乳腺癌細胞影響的分析結果圖。結果顯示，因外源性質體所表現之PD-L1缺乏其3'-UTR序列，miR-4759無法接合外源性PD-L1 mRNA序列並抑制其表現，因此在表現外源性PD-L1的組別中，不論是否有轉染miR-4759，PD-L1的蛋白質表現量均會增加，顯示表現不具3'-UTR序列之外源性PD-L1會對於miR-4759的抑制作用有抗性，這結果也指出miR-4759是透過接合PD-L1之3'-UTR序列而對其進行表現之抑制。

再將miR-4759或miR-Scr轉染至具有穩定表現外源性PD-L1 (pCDH-PD-L1)或不具有穩定的外源性PD-L1表現(pCDH)的MDA-MB-231或BT-549中後12小時，與激活的PBMC共培養48小時並檢測凋亡細胞訊號，結果請參照第3E圖和第3F圖，第3E圖為免疫細胞對於轉染miR-4759於具有或不具有穩定的PD-L1過度表現的三陰性乳腺癌細胞毒殺效果的分析結果圖，第3F圖為第3E圖的統計結果圖。結果數據以平均值±標準差表示(n = 3)，而實驗組和控制組之差異以Student T test分析，其中*表示P ＜ 0.05，**表示P ＜ 0.01，***表示P ＜ 0.001。結果顯示，表現外源性PD-L1確實會使miR-4759增強的PBMC毒殺癌細胞敏感性被抑制。上述結果顯示，miR-4759抑制PD-L1的表現可刺激免疫細胞對於癌細胞的毒殺作用，進而增強抗腫瘤免疫力。

四、本發明之醫藥組合物對於癌症之治療效果

試驗上進一步地將本發明之醫藥組合物施用於腫瘤小鼠模式，以確定其對於癌症之治療效果。

1.離體( ex vivo)原位腫瘤模型

試驗動物為6周大且體重為18-22 g的雌性BALB/c和SCID小鼠，其購自樂斯科生物科技(台灣)。所有動物實驗均遵守實驗動物飼養及使用規範，並藉由隨意提供食物和水使試驗動物保持在12:12小時的光照：黑暗週期中，本試驗的動物倫理學批准號為2016-290。其中BALB/c小鼠為免疫健全的小鼠，SCID小鼠為免疫不健全的小鼠。試驗上先於體外培養小鼠三陰性乳腺癌細胞株4T1-Luc，細胞以1 × 10 ⁵細胞/孔的密度接種進6孔盤中。在生長24小時後，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)並依製造商指示分別轉染濃度為50nM的miR-4759及miR-Scr (miR-Scr做為控制組；各組別5隻小鼠)。經24小時培養後，將細胞以2.5 × 10 ⁴/20 μL的濃度與20 μL的Matrigel ^™Membrane Matrix (Thermo FisherScientific Inc.)對混均勻，以針頭注射到試驗動物的乳腺中(第0天)，每週兩次以IVIS Spectrum定量活體螢光冷光影像系統觀測腫瘤大小。在第28天犧牲試驗動物，測量腫瘤的大小和重量，固定組織並保存用於隨後的染色。

請參照第4A圖，為本發明之醫藥組合物抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖，結果可見，在免疫功能健全的BALB/c小鼠中，miR-4759可顯著抑制4T1-Luc腫瘤之生長，miR-4759組之腫瘤訊號於注射癌細胞後24天開始與控制組有顯著差異。而在免疫缺陷之SCID小鼠中，miR-4759組的腫瘤生長與控制組並無顯著差異。

2.miR-4759腫瘤內注射給藥之腫瘤小鼠模式

試驗動物為6周大且體重為18-22 g的BALB/c小鼠，其購自樂斯科生物科技(台灣)，所有動物實驗均遵守實驗動物飼養及使用規範。體外培養小鼠三陰性乳腺癌細胞株4T1-Luc，將細胞以2.5 × 10 ⁴/20 μL的濃度與20 μL的Matrigel ^™Membrane Matrix(Thermo Fisher Scientific Inc.)對混均勻，以針頭注入BALB/c小鼠四號乳腺中，於注射癌細胞後3天開始以腫瘤內注射方式給予劑量為10 μg/40μL的miR-4759及miR-Scr (miR-Scr做為控制組；各組別5隻小鼠)，miR-4759及miR-Scr於給藥前分別以 in vivo-jetPEI ^® in vivotransfection reagent (Polyplus-transfection Inc.)依製造商指示進行包覆，溶於滅菌之5%葡萄糖溶液中，每2天給予藥物一次。於注射癌細胞後3天開始以IVIS Spectrum 定量活體螢光冷光影像系統觀測腫瘤大小，每3天一次進行測量。於注射癌細胞後29天犧牲小鼠，摘取腫瘤組織進行病理組織免疫染色切片分析組織內PD-L1表現量及以流式細胞儀檢測CD8 ⁺T細胞浸潤情形。

請參照第4B圖、第4C圖、第4D圖和第4E圖，第4B圖為以腫瘤內注射本發明之醫藥組合物其抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖，第4C圖為腫瘤內注射本發明之醫藥組合物的試驗動物在第27天腫瘤體積的分析結果圖，第4D圖為腫瘤內注射本發明之醫藥組合物的試驗動物腫瘤組織中PD-L1表現量的分析結果圖，第4E圖為腫瘤內注射一實施方式之本發明之醫藥組合物的試驗動物腫瘤浸潤CD8 ⁺T細胞群體定量的分析結果圖。

第4B圖至第4E圖的結果顯示，以腫瘤內注射給藥之小鼠腫瘤模式來評估本發明之醫藥組合物治療癌症之效果，可見腫瘤內注射給予本發明之醫藥組合物可顯著抑制BALB/c小鼠腫瘤生長。於腫瘤注射本發明之醫藥組合物29天後犧牲小鼠，以病理組織免疫染色發現，本發明之醫藥組合物處理組的腫瘤組織中有較控制組少的PD-L1蛋白表現量。將腫瘤組織染色以流式細胞儀分析可發現本發明之醫藥組合物處理組的腫瘤組織中有較控制組多之CD8 ⁺T細胞浸潤，和控制組相比增加了2.45倍。由上述結果可見，給予本發明之醫藥組合物可降低小鼠腫瘤微環境中PD-L1的表現量同時增加CD8 ⁺T細胞浸潤，以抑制小鼠腫瘤之生長及轉移。

3.miR-4759合併紫杉醇治療之腫瘤小鼠模式

本發明之醫藥組合物除了miR-4759和藥學上可接受之載體以外，可更包含至少一癌症治療劑。於本試驗例中以紫杉醇作為至少一癌症治療劑的例示，試驗動物為6周大且體重為18-22 g的BALB/c小鼠，其購自樂斯科生物科技(台灣)，所有動物實驗均遵守實驗動物飼養及使用規範。體外培養小鼠三陰性乳腺癌細胞株4T1-Luc，將細胞以2.5 × 10 ⁴/20 μL的濃度與20 μL的Matrigel ^™Membrane Matrix (Thermo Fisher Scientific Inc.)對混均勻，以針頭注入BALB/c小鼠四號乳腺中，於注射癌腫瘤後六天開始給予藥物。試驗上分為四組：對照組僅給予5%葡萄糖溶液作為安慰劑；紫杉醇組給予每劑20 μg的紫杉醇(輝克癒蘇；杏輝藥品工業)；PD-L1抗體合併紫杉醇組給予每劑100μg anti-PD-L1(#BE0101; Bio X Cell Inc.)及20 μg的紫杉醇；miR-4759合併紫杉醇組給予每劑40 μg的miR-4759及20 μg的紫杉醇。其中miR-4759每2天給予一次；PD-L1抗體每3天給予一次；紫杉醇每6天施打一次，給藥至注射腫瘤後24天。腫瘤以IVIS Spectrum定量活體螢光冷光影像系統觀測腫瘤大小。

請參照第5圖，為另包含紫杉醇之本發明之醫藥組合物抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖，結果顯示比較四個經不同治療處理之組別小鼠在植入腫瘤後20天後的腫瘤體積，可以觀察到miR-4759合併紫杉醇治療之組別的腫瘤體積顯著小於對照組及PD-L1抗體合併紫杉醇組。其結果顯示，給予miR-4759合併紫杉醇治療可顯著抑制小鼠4T1腫瘤之生長，且其效果優於目前三陰性乳腺癌臨床治療所常用之化療藥物及化療藥物合併PD-L1免疫檢查點抑制劑療法。

藉此，本發明之醫藥組合物利用體外合成技術合成miR-4759，並利用藥學上可接受之載體將其包覆以運送，經由體外細胞試驗證實miR-4759可藉由靶向癌症細胞中PD-L1 mRNA的3'-UTR，抑制PD-L1的轉譯進而減少PD-L1的蛋白表現，並可刺激免疫細胞對於癌細胞的毒殺作用，進而增強抗腫瘤免疫力。於腫瘤動物模型中亦證實其具有優異的治療癌症效果，若進一步搭配至少一癌症治療劑，其治療效果優於目前癌症臨床治療所常用之化療藥物及化療藥物合併PD-L1免疫檢查點抑制劑療法。是以本發明之醫藥組合物可提升癌症患者自身免疫系統對於癌症細胞之免疫毒殺作用，並可提升PD-L1抑制劑療法的反應率和克服PD-L1抗體藥可能造成之抗藥性問題，具有運用於生醫保健市場之潛能。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

無

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖為hsa-miR-4759與PD-L1之間的表現相關性的預測分析結果圖； 第2A圖為hsa-miR-4759與PD-L1 mRNA的預測靶向序列的示意圖； 第2B圖和第2C圖為miR-4759與PD-L1 mRNA結合位置的分析結果圖； 第2D圖和第2E圖為miR-4759抑制PD-L1的mRNA表現量的分析結果圖； 第2F圖為miR-4759抑制PD-L1的蛋白質表現量的分析結果圖； 第3A圖為miR-4759增強免疫細胞毒殺癌細胞效果的分析結果圖； 第3B圖為第3A圖的統計結果圖； 第3C圖為共培養基中IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α和IL-10表現量的分析結果圖； 第3D圖為miR-4759對具有或不具有穩定的PD-L1過度表現的三陰性乳腺癌細胞影響的分析結果圖； 第3E圖為免疫細胞對於轉染miR-4759於具有或不具有穩定的PD-L1過度表現的三陰性乳腺癌細胞毒殺效果的分析結果圖； 第3F圖為第3E圖的統計結果圖； 第4A圖為一實施方式之本發明之醫藥組合物抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖； 第4B圖為以腫瘤內注射一實施方式之本發明之醫藥組合物其抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖； 第4C圖為腫瘤內注射一實施方式之本發明之醫藥組合物的試驗動物在第27天腫瘤體積的分析結果圖； 第4D圖為腫瘤內注射一實施方式之本發明之醫藥組合物的試驗動物腫瘤組織中PD-L1表現量的分析結果圖； 第4E圖為腫瘤內注射一實施方式之本發明之醫藥組合物的試驗動物腫瘤浸潤CD8 ⁺T細胞群體定量的分析結果圖 ；以及 第5圖為另一實施方式之本發明之醫藥組合物抑制試驗動物腫瘤生長的分析結果圖。

Claims (10)

1. 一種醫藥組合物，包含： 一miR-4759，該miR-4759之序列如SEQ ID NO: 1所示；以及 一藥學上可接受之載體，用以包覆該miR-4759。
2. 如請求項1所述之醫藥組合物，其中該藥學上可接受之載體包含一奈米微粒(nanoparticle)、一微脂體(liposome)、一固態脂質奈米微粒(solid lipid nanoparticle, SLN)、一奈米懸浮液(nanosuspension)和一病毒載體(viral vector)。
3. 如請求項1所述之醫藥組合物，更包含至少一癌症治療劑。
4. 如請求項3所述之醫藥組合物，其中該至少一癌症治療劑係選自由一化學治療劑、一放射治療劑、一激素治療劑、一毒素、一標靶治療劑和一免疫調節劑所組成之群組。
5. 一種如請求項1至4任一項所述之醫藥組合物之用途，其係用以製備一治療癌症之藥物。
6. 如請求項5所述之醫藥組合物之用途，其中該治療癌症之藥物能抑制腫瘤生成或轉移。
7. 如請求項5所述之醫藥組合物之用途，其中該癌症係選自由一乳腺癌、一卵巢癌、一子宮頸癌、一肝癌、一胰腺癌、一肺癌、一胃癌、一膀胱癌、一骨癌、一黑色素瘤、一皮膚癌、一頭頸癌、一鱗狀細胞癌、一結腸癌、一結腸直腸癌、一腎癌、一白血病、一胰島細胞瘤、一星形細胞瘤、一前列腺癌、一子宮癌、一軟組織腺泡狀肉瘤、一腦脊髓癌、一轉移性腦瘤、一軟骨肉瘤、一脊索瘤、一腎嫌色細胞癌、一透明細胞癌、一頸動脈體瘤、一皮膚良性纖維組織細胞瘤、一伊文氏腫瘤、一促纖維增生性小圓細胞瘤、一室管膜瘤、一骨外黏液樣軟骨肉瘤、一不完全性骨纖維生成、一甲狀旁腺腫瘤、一乳頭狀甲狀腺癌、一膽囊或膽管癌、一骨纖維性結構不良、一生殖細胞瘤、一妊娠性滋養細胞疾病、一AIDS-相關癌症、一卡波西氏肉瘤、一淋巴瘤、一神經管胚細胞瘤、一多發性內分泌腫瘤、一多發性骨髓瘤、一骨髓增生異常症候群、一腦膜瘤、一垂體瘤、一神經胚細胞瘤、一神經內分泌腫瘤、一兒科癌症、一周圍神經鞘瘤、一嗜鉻細胞瘤、一後葡萄膜黑色素瘤、一罕見血液疾病、一腎轉移癌、一胸腺癌、一脂瘤/良性脂肪瘤、一脂肉瘤/惡性脂肪瘤、一橫紋肌樣瘤、一橫紋肌肉瘤、一滑膜肉瘤、一肉瘤、一軟組織肉瘤、一睾丸癌、一胸腺瘤、一甲狀腺轉移癌和一腎上腺腫瘤所組成之群組。
8. 如請求項5所述之醫藥組合物之用途，其中該癌症為一三陰性乳腺癌。
9. 一種如請求項1所述之醫藥組合物之用途，其係用以製備一免疫調節劑。
10. 如請求項9所述之醫藥組合物之用途，其中該免疫調節劑為一PD-L1抑制劑。

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