CN114269920A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述的技术涉及用于例如治疗癌症的改进的嵌合分子。如本文所述，本发明人已经开发了新型嵌合适体‑siRNA分子(AsiC)，其显示出比现有AsiC更好的功效并且可以成功地协同治疗癌症。这些AsiC靶向癌细胞标志物以将治疗性siRNA分子特异性地引导至癌细胞，从而提高递送效率和治疗效果，同时降低潜在的副作用。

Description

用于治疗癌症的方法和组合物
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2019年6月21日提交的美国临时申请No.62/864,726的权益，通过引用将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院资助的基金No.CA184718的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式通过电子方式提交的序列表，在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本(创建于2020年6月18日)被命名为701039-095310WOPT_SL.txt，大小为53,904字节。
技术领域
本文描述的技术涉及包含结合EpCAM的分子和抑制性核酸的嵌合分子以及使用此类组合物治疗癌症(例如上皮癌)的方法。
背景技术
RNA干扰(RNAi)已被开发用于减少肝中基因表达的治疗用途。然而，肝的独特之处在于易于用RNAi分子转染。小RNA的递送和由此导致的基因敲低在其它组织中仍然效率低下并且最终无效。特别地，递送障碍是利用RNAi来治疗癌症的主要阻碍。
发明内容
如本文所述，本发明人已经开发了新型嵌合适体-siRNA分子(AsiC)，其显示出比现有AsiC更好的功效并且可以成功地协同治疗癌症。这些AsiC靶向癌细胞标志物以将治疗性siRNA分子特异性地引导至癌细胞，从而提高递送效率和治疗效果，同时降低潜在的副作用。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、MCL1和CD47。
在任何方面的一些实施方式中，所述分子为适体-siRNA嵌合体(AsiC)。在任何方面的一些实施方式中，所述抑制性核酸与所选基因的基因产物特异性结合。
在任何方面的一些实施方式中，所述结合EpCAM的适体结构域包含SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列。在任何方面的一些实施方式中，所述抑制性核酸结构域包含选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126的序列或它们的反向互补序列。
在任何方面的一些实施方式中，所述嵌合分子包含第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域。在任何方面的一些实施方式中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，但各自抑制相同基因的表达。在任何方面的一些实施方式中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域各自抑制不同基因的表达。在任何方面的一些实施方式中，至少第二抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：PLK1和MCL1。
在任何方面的一些实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137中的一者的序列。在任何方面的一些实施方式中，所述嵌合分子的3'末端包含dTdT。在任何方面的一些实施方式中，所述嵌合分子包含至少一个2'-F嘧啶。在任何方面的一些实施方式中，所述嵌合分子进一步包含化疗剂。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了包含本文描述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物、试剂盒或组合。在任何方面的一些实施方式中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少两种嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。在任何方面的一些实施方式中，所述不同的抑制性核酸结构域识别不同的靶标。在任何方面的一些实施方式中，所述不同的抑制性核酸结构域具有不同的序列并识别相同的靶标。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含：
a.如本文所述的第一嵌合分子；
b.第二嵌合分子，所述第二嵌合分子包含：i.如本文所述的嵌合分子，其中，所述第二嵌合分子的抑制性核酸结构域与所述第一嵌合分子相比抑制不同基因的表达；或者ii.嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达；以及
c.任选的药学上可接受的载体。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予如本文所述的嵌合分子、组合物、试剂盒或组合。在任何方面的一些实施方式中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌、结肠癌或三阴性乳腺癌。在任何方面的一些实施方式中，所述给予为皮下给予。在任何方面的一些实施方式中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。在任何方面的一些实施方式中，所述癌症治疗为紫杉醇。
附图说明
图1表明EpCAM在上皮癌中高度表达。
图2描绘了使用指定AsiC在指定细胞类型中的基因敲低的图。
图3表明人类TNBC肿瘤以比正常乳腺组织更高的比率摄取Cy3-EpCAM-AsiC。
图4表明EpCAM-AsiC在体外癌症干细胞测定中抑制EpCAM+乳腺癌细胞系。第一行至第三行是基底(basal)A TNBC；第四行是管腔(luminal)；第五行至第六行是基底B TNBC。
图5表明EpCAM+TNBC细胞的离体处理防止肿瘤发生。
图6表明Alexa750-EpCAM-AsiC被选择性摄取到EpCAM+肿瘤中。
图7表明靶向PLK1的EpCAM-AsiC抑制EpCAM+TNBC肿瘤生长。
图8描绘了抗肿瘤免疫的图。部分摘自Sahin和Tureci，Science，2018。
图9A-图9E表明敲低RNA质量控制通路增强抗肿瘤免疫。图9A表明肿瘤阻遏；图9B表明CD8+TIL增加；图9C表明CD8+TIL上抑制性受体减少(第一系列为EpCAM适体，第二系列为UPF2 AsiC)；图9D表明CD8+TIL引起更多的脱粒(degranulation)和肿瘤杀灭；并且图9E表明CD8+TIL产生更多的细胞因子。
图10描绘了表明在Upf2 EpCAM-AsiC处理的4T1肿瘤中CD8 TIL增加的图。
图11表明通过敲低PARP1和APE1破坏DNA修复改善了肿瘤免疫。
图12A-图12E表明敲低PTPN2增强抗肿瘤免疫。图12A表明肿瘤阻遏；图12B表明CD8+TIL增加；图12C表明肿瘤抗原呈递增加；图12D表明CD8+TIL产生更多的细胞因子；并且图12E表明CD4+TIL产生更多的细胞因子。
图13表明通过AsiC敲低CD47抑制了肿瘤生长。条形图中的系列依次为EpCAM适体、3μM的CD47 AsiC和4μM的CD47 AsiC。
图14描绘了表明CD47-AsiC提高4TE-eGFP肿瘤的TAM体内吞噬作用的图。
图15A-图15B表明CD47敲低诱导抗肿瘤应答。图15A描绘了肿瘤中的CD8+T细胞增加和阻遏性Treg减少。图15B表明肿瘤中的T细胞活性增加。在图15A和图15B中，系列依次是EpCAM适体和CD47 AsiC。
图16表明CD47-AsiC处理导致TIL表达较少的抑制性受体。在条形图中，系列依次为EpCAM适体和CD47 AsiC。在饼图中，系列从箭头的钝端开始，依次为5种、4种、3种、2种和1种抑制性受体。
图17表明CD47-AsiC比抗CD47抗体(在II期临床试验中)更好地控制肿瘤。
图18A-图18E描绘了联合的AsiC的协同效应。图18A描绘了UPF2+CD47；图18B描绘了UPF2+CD47+MCL1；图18C描绘了UPF2+CD47+MCL1+PLK1；图18D描绘了UPF2+CD47+MCL1+PLK1+PARP1+APE1+PD-L1。图18E描绘了PARP1-AsiC、PARP1+PD-L1 AsiC和混合的AsiC(UPF2+CD47+MCL1+PLK1+PARP1+APE1+PD-L1 AsiC)对CD8+TIL的影响。图18E中的系列依次为对照、PARP1 AsiC、PARP1+PD-L1 AsiC和混合的AsiC。
图19表明经处理的肿瘤细胞未下调EpCAM。用CD47、UPF2、PLK1和MCL1 AsiC的混合物对小鼠进行处理。
图20比较了PD-Ll AsiC和CD47 AsiC的结果。条形图中的系列依次为EpCAM适体、CD47 AsiC和PD-L1 AsiC。
图21描绘了单一EpCAM-AsiC与AsiC组合的比较。
图22描绘了七种EpCAM-AsiC的组合来治疗具有4T1E肿瘤的小鼠。
图23和图24描绘了用联合的AsiC对ErbB2ΔEx16+小鼠进行处理。
图25A-图25G表明UPF2 AsiC的肿瘤抑制和免疫调节能力。图25A，用4T1E肿瘤攻击并用EpCAM Apt或UPF2 AsiC(5mg/kg，每3天，如红色箭头所示)中任一者处理的小鼠中肿瘤生长动力学的比较。图25B，每组肿瘤中CD8+TIL占肿瘤浸润CD4+Foxp3+Treg的比率。a-b，n＝5只小鼠/组。图25C，使用来自用EpCAM Apt或UPF2 AsiC中任一者处理的小鼠的原位植入4T1E肿瘤对CD8+TIL进行的H&E染色(上)和IHC染色(下)。黑色箭头表示乳腺。无尾箭头表示坏死区域。白色箭头表示CD8+TIL。每组两只小鼠用于成像，结果相似。比例尺：100mm。图25D，每个选定区域的CD8+TIL计数的比较。对于每个组，选择6个视野/切片进行计数。检查了两个肿瘤/组，结果相似。图25E，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL的百分比。图25F，在与已通过UPF2 siRNA敲低UPF2的4T1E肿瘤细胞共孵育6小时后，通过其CD107a/CD107b表面表达测量的CD8+TIL的脱粒以及细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔素的表达。还示出了CD8+TIL脱粒的代表性流式图像(右)。图25G，从经EpCAM Apt或UPF2 AsiC中任一者处理的4T1E肿瘤富集的CD8+TIL对靶标51Cr标记的UPF2 siRNA处理的4T1E肿瘤的细胞裂解。效应物:靶标比为5:1。图25E-图25F，n＝5个样本/组。图25G，n＝3个样本/组，对于每个样本，CD8+TIL是从两只小鼠中合并的。数据示出了平均值+s.e.m并代表至少两次实验。对于所有图：*p≤0.05、**p≤0.01、***p≤0.001、****p≤0.0001。
图26A-图26D描绘了PARP1 AsiC和PARP1抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)之间的肿瘤抑制和免疫调节能力的比较。图26A，携带4T1E肿瘤并用EpCAM Apt、PARP1 AsiC(5mg/kg，每3天)或奥拉帕尼(50mg/kg，每天)处理的小鼠中肿瘤生长的比较。图26B，每组肿瘤中CD8+TIL占肿瘤浸润CD4+Treg的比率的比较。图26C，通过PMA和离子霉素诱导的产生细胞因子IFN-g和TNF的CD8+TIL的百分比。图26D，通过PMA和离子霉素诱导的产生细胞因子IFN-g和TNF的CD4+TIL的百分比。n＝4只小鼠/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图27A-图27M表明CD47 AsiC的肿瘤抑制和免疫调节能力。图27A，携带4T1E肿瘤并用EpCAM Apt或CD47 AsiC中任一者处理的小鼠中肿瘤生长的比较。箭头表示每次处理。图27B，每组肿瘤中CD8+TIL占肿瘤浸润CD4+Treg的比率。图27C-图27D，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图27C)和CD4+TIL(图27D)的百分比。图27E，CD8+TIL产生的细胞毒性颗粒颗粒酶B和穿孔素。图27F，用EpCAM Apt或CD47 AsiC中任一者处理的小鼠中M1样TAM占M2样TAM的比率。图27G，每组肿瘤中CD11c+DEC205+DC占CD45+细胞的百分比。图27H，CD11c+DEC205+DC上CD40、CD86和MHCII的MFI水平。图27A-图27H，n＝5只小鼠/组。图27I，来自4T1E-eGFP肿瘤的eGFP+TAM的百分比，其吞噬肿瘤细胞。n＝5只小鼠/组。图27J，TAM在体外对用对照或CD47 siRNA处理的4T1E-eGFP肿瘤细胞的吞噬作用。n＝3个样本/组。图27K，用EpCAM Apt或CD47 AsiC处理并注射同种型对照Ab或消耗CD8+T细胞、CD4+T细胞或巨噬细胞的携带4T1E肿瘤的小鼠中肿瘤生长的比较。图27L，对分离自用EpCAM Apt、CD47AsiC处理或用CD47 AsiC处理并消耗Mac的小鼠的肿瘤的CD8+TIL用4T1E肿瘤细胞刺激6小时。比较了CD8+TIL的细胞因子产生(左)和脱粒。系列从左到右为EpCAM Apt、CD47 AsiC和CD47 AsiC+Mac depl。图27K-图27L，n＝5个样本/组。图27M，用EpCAM Apt、CD47 AsiC或抗CD47抗体(Ab)中任一者处理的小鼠中4T1E肿瘤生长的比较。n＝5只小鼠/组。a-m，示出的数据为平均值+s.e.m.并代表至少两次实验。
图28A-图28I描绘了免疫调节性EpCAM-AsiC以及与抗PD-1联合的EpCAM-AsiC的协同抗肿瘤作用。图28A，携带4T1E肿瘤并用EpCAM适体或eGFP AsiC(作为对照)、UPF2 AsiC、CD47 AsiC、MCL1 AsiC、Parp1AsiC或靶向UPF2、CD47、MCL1和Parp1的四种免疫调节性EpCAM-AsiC的组合处理的小鼠中肿瘤生长的比较。箭头表示小鼠皮下接受AsiC的天数。图28B，用EpCAM适体或四种EpCAM-AsiC的组合处理的小鼠中的个体肿瘤生长曲线。图28C，用EpCAM Apt或联合的AsiC处理的小鼠之间每毫克肿瘤的CD8+TIL数量的比较。图28D，每组肿瘤中CD8+TIL占肿瘤浸润CD4+Foxp3+Treg的比率。图28E，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL的百分比。右：代表性流式图。图28F，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD4+TIL的百分比。图28G，CD8+TIL产生的细胞毒性颗粒颗粒酶B和穿孔素。图28A-图28G，n＝4只小鼠/组。图28H，携带4T1E-eGFP肿瘤并用EpCAM适体或四种免疫调节性EpCAM-AsiC的组合处理的小鼠中肿瘤生长的比较。n＝5只小鼠/组。图28I，携带4T1E肿瘤并用EpCAM适体或联合的AsiC连同同种型对照或抗PD-1Ab一起进行处理的小鼠中肿瘤生长的比较。n＝4只小鼠/组。图28A、图28H、图28I，箭头表示每次处理的时间。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图29A-图29F描绘了通过单细胞RNA-seq进行分析的免疫调节性EpCAM-AsiC对肿瘤浸润免疫细胞的影响。将来自用EpCAM适体或EpCAM-AsiC混合物处理的携带原位4T1E肿瘤的小鼠的富集的CD45+细胞(n＝2只小鼠/组)合并用于单细胞-RNA测序。图29A，将联合所有四个样本而来的免疫细胞投影到均匀流形逼近和投影(UMAP)图上。每个点代表由推测簇标识符(inferred cluster identity)着色的单元格。对照：受污染细胞。图29B，示出了不同簇中的细胞类型标志物和差异表达基因(DEG)的Z分数归一化表达作为规范的热图。每道代表一个生物样本。图29C-图29D，对于增殖的T细胞(图29C)和单核细胞/巨噬细胞(图29D)，在EpCAM-AsiC混合物处理组中上调的DEG的基因本体(GO)富集。虚线表示p值＝0.05。图29E-图29F，示出了已知参与T细胞簇中的T细胞活化、效应物功能和记忆形成以及耗竭的基因(图29E)或参与单核细胞/巨噬细胞簇中的单核细胞/巨噬细胞表型和功能界定的基因(图29F)的表达的热图，在每个簇中进行平均并将Z分数跨簇标准化。
图30A-图30K描绘了联合的免疫调节性EpCAM-AsiC在ErbB2ΔEx16转基因小鼠中的抗肿瘤功效。图30A，ErbB2ΔEx16转基因小鼠中的肿瘤诱导和处理的实验方案。图30B，左：GFP+4T1E-eGFP肿瘤细胞和GFP+ErbB2ΔEx16转基因肿瘤细胞上EpCAM表达的定量比较；右：GFP+肿瘤细胞上EpCAM表达的代表性直方图。图30C，4T1E-eGFP肿瘤和ErbB2ΔEx16转基因肿瘤中CD8+TIL(左)和CD4+TIL(右)占活细胞的百分比的比较。图30B-图30C，4T1E-eGFP，n＝5只小鼠/组；ErbB2ΔEx16，n＝7只小鼠/组。图30D，多西环素(doxycycline)喂养的ErbB2ΔEx16转基因小鼠和用EpCAM适体或四种免疫调节性EpCAM-AsiC的组合处理的肿瘤生长的比较。图30E，左：直方图示出了来自用EpCAM适体或联合的EpCAM-AsiC处理的小鼠的肿瘤细胞上EpCAM表达的比较；右：两组肿瘤细胞上EpCAM表达的定量比较。图30F，通过每组ErbB2ΔEx16转基因小鼠中GFP+TAM的百分比测量的体内TAM吞噬作用。图30G-图30H，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图30G)和CD4+TIL(图30H)的百分比。图30I-图30K，每组肿瘤中CD8+TIL(图30I)、CD4+TIL(图30J)和NK细胞(图30K)产生的细胞毒性颗粒颗粒酶B和穿孔素。图30D-图30K，n＝6只小鼠/组。图30B-图30K，示出的数据为平均值+s.e.m.。
图31A-图31D表明联合的免疫调节性EpCAM-AsiC在肺转移性4T1E-Luc肿瘤模型中的抗肿瘤功效。图31A，尾静脉注射4T1E-Luc肿瘤细胞后不同时间点小鼠肺区域的代表性发光图像。上道：EpCAM适体处理组。下道：联合的EpCAM-AsiC处理组。图31B，肿瘤细胞植入后不同时间点各处理组中肺转移的总发光光子通量。数据示出了平均值±s.e.m.。图31C，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL的百分比。图31D，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD4+TIL的百分比。图31A-图31D，EpCAM适体，n＝5只小鼠/组；联合的AsiC，n＝6只小鼠/组。图31C-图31D，数据示出了平均值+s.e.m.。
图32A-图32B表明小鼠和人BC细胞的EpCAM表达和EpCAM适体摄取效率。图32A，小鼠(上)和人(下)BC细胞上的EpCAM蛋白表达。将小鼠L929细胞系用作阴性对照。每个图上的数字表示EpCAM MFI值。图32B，测量不同小鼠(左)和人(右)BC细胞系对Cy3标记的EpCAM适体的结合/内化亲和力的拟合曲线分析。将每个细胞系的结合/内化亲和力值(Kd)显示在表中。每个数据点都是从三个重复孔合并的样本中收集的。每个实验重复至少两次，结果相似。
图33A-图33G描绘了BC细胞中siRNA的滴定。图33A，用不同浓度的人特异性或小鼠和人交叉反应性(CR)UPF2 siRNA转染的MDA-MB-231细胞中UPF2 mRNA水平的比较。图33B，100nM UPF2 CR siRNA在不同的小鼠和人BC细胞系中的UPF2基因敲低效率。图33C-图33G，用不同浓度的小鼠特异性和/或小鼠和人CR siRNA转染的4T1E细胞中CD47(图33C)、PARP1(图33D)、APE1(图33E)、MCL1(图33F)和PD-L1(图33G)mRNA水平的比较。每个图中的箭头表示用于EpCAM AsiC设计的选定siRNA。数据表示平均值+s.e.m.，以一式两份进行(图33A、图33C-图33G，n＝2/条件)或以一式三份进行(图33B，n＝3)。
图34A-图34I描绘了体外和体内的EpCAM+4T1E细胞中EpCAM AsiC敲低的基因表达。图34A，4T1E肿瘤细胞中靶向每种基因的100nM siRNA的基因敲低效率(n＝3/组)。对照为阴性对照siRNA处理的细胞。图34B，CD47 AsiC的设计。EpCAM适体折叠结构由mfold网络服务器预测。图34B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：78。图34C，4T1E肿瘤细胞中靶向每种基因的4mM EpCAM-AsiC的基因敲低效率(n＝3/组)。对照为EpCAM适体(Apt)处理的细胞。模拟(mock)：介质对照。图34D，分离自用EpCAM适体、eGFP AsiC或UPF2AsiC处理的4T1E肿瘤的EpCAM+4T1E肿瘤细胞和EpCAM-CD45-细胞中UPF2mRNA水平的比较。图34E，来自用EpCAM适体、eGFP AsiC或UPF2 AsiC处理的小鼠的EpCAM+4T1E肿瘤细胞中UPF2+细胞％的比较。右：代表性流式图像。图34F，来自用UPF2 AsiC处理的小鼠的EpCAM+肿瘤细胞中公认的NMD底物的mRNA与pre-mRNA的比率，归一化至来自用EpCAM适体处理的小鼠的该比例。图34D-图34F，n＝3只小鼠/组。图34G-图34I，分离自用EpCAM适体、CD47 AsiC、PARP1 AsiC或MCL1 AsiC处理的4T1E肿瘤的EpCAM+4T1E肿瘤细胞和EpCAM-CD45-细胞中CD47 mRNA(图34G)、PARP1 mRNA(图34H)和MCL1 mRNA(图34I)水平的比较。n＝3只小鼠/组。数据为平均值+s.e.m.并代表至少两次独立实验。
图35A-图35C描绘了siRNA基因敲低和EpCAM-AsiC对BC细胞活力的影响。图35A，用阴性对照siRNA或用敲低UPF2、CD47、PARP1、APEX1、PD-L1或MCL1的siRNA处理72小时的4T1E肿瘤细胞的活力。通过CellTiter-Glo评估细胞活力。n＝5个样本/组。图35B-图35C，用介质(模拟)、4mM EpCAM适体或4mM靶向UPF2或CD47的EpCAM AsiC处理72小时的4T1E肿瘤细胞的活力(图35B)以及三天内的细胞增殖率(图35C)。n＝4/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图36A-图36B表明UPF2 AsiC的长期肿瘤抑制和免疫调节能力。图36A，用EpCAMApt或UPF2 AsiC中任一者(5mg/kg，每3天，如箭头所示的攻击)处理携带8日龄4T1E肿瘤的小鼠。示出了肿瘤生长动力学。图36B，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL的百分比。EpCAM Apt组，n＝7；UPF2 AsiC组，n＝8。数据示出了平均值+s.e.m.。
图37A-图37B表明EpCAMhi MDA-MB-231BC细胞中的UPF2敲低产生新mRNA亚型并增加NMD敏感亚型的使用。图37A，左：DNAJC2基因(上)和LAT2基因(下)的不同mRNA亚型(包括NMD非敏感和NMD敏感转录物)；右：阴性siRNA(浅灰色)和UPF2 siRNA(黑色)处理的细胞之间亚型分数(IF)的比较。图37B，左：CENPH基因的两种mRNA亚型(一种蛋白质编码转录物和一种NMD敏感转录物)；右：阴性siRNA(浅灰色)和UPF2 siRNA(黑色)处理的细胞之间亚型分数(IF)的比较。图37A-图37B，对于左侧图，较长的黑条表示蛋白质编码外显子；较短的黑条表示非编码外显子；中间的线代表内含子。
图38A-图38C表明其它EpCAM AsiC的肿瘤抑制和免疫调节能力。图38A，携带4T1E肿瘤并用EpCAM Apt或APE1 AsiC处理的小鼠中肿瘤生长的比较。图38B，来自携带两周龄4T1E肿瘤的小鼠的EpCAM+4T1E肿瘤细胞上PD-L1的表达。细胞在活+CD45-EpCAM+细胞上门控。图38C，用EpCAM Apt或PD-L1 AsiC处理的小鼠中4T1E肿瘤生长的比较。图38A和图38C，n＝5只小鼠/组。箭头表示每次处理。数据示出了平均值+s.e.m.。
图39A-图39C描绘了4T1E小鼠乳腺肿瘤中MDSC子集及M1样和M2样TAM的门控策略。图39A，单核、单个(singlet)和活肿瘤浸润免疫细胞首先在CD45+细胞上门控，同时门控出CD3+/CD19+/TCRb+/Ter119+细胞。剩余的CD45+髓样细胞针对Gr-1hiCD11b+PMN-MDSC、Gr-1intCD11b+MO-MDSC和Gr-1-CD11b+细胞进行门控。Gr-1-CD11b+细胞然后针对F4/80+TAM及CD206-MHCII+M1样TAM和CD206+MHCII+M2样TAM进行门控。图39B，EpCAM适体或CD47 AsiC处理的4T1E肿瘤中M1与M2 TAM比率的比较。细胞在CD45+CD11b+F4/80+MCHII+TAM上门控。数字表示每个子集占TAM的百分比。图39C，在体外TAM对阴性siRNA或CD47 siRNA处理的4T1E-eGFP肿瘤细胞的吞噬作用。数字表示GFP+TAM的百分比。
图40A-图40C描绘了携带4T1E肿瘤的小鼠中CD8+T、CD4+T和巨噬细胞的消耗。图40A，携带4T1E肿瘤的小鼠中CD47 AsiC处理和免疫细胞消耗的实验方案。图40B，用同种型对照Ab或抗CD8和/或抗CD4 Ab处理的小鼠的外周血中CD4+和CD8+T细胞的代表性流式图。图40C，TAM消耗在用同种型对照或抗CSF1R Ab(0.3mg/处理)处理的小鼠中的影响。示出的数据是CD11b+F4/80+MHCII+TAM占CD45+肿瘤浸润免疫细胞的百分比。n＝5只小鼠/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图41A-图41C描绘了CD47 AsiC和抗CD47 Ab之间的抗肿瘤功效的比较。图41A-图41B，在用EpCAM Apt、CD47 AsiC或抗CD47 Ab处理的小鼠中通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图41A)和CD4+TIL(图41B)的百分比。图41C，PMN-MDSC和MO-MDSC占活细胞的百分比。右：三组小鼠中这两个细胞亚群的代表性流式图。a-c，n＝5只小鼠/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图42A-图42F描绘了MCL1 AsiC的肿瘤抑制和免疫调节能力。图42A，用4mM EpCAM适体或靶向MCL1的EpCAM AsiC处理48-96小时的4T1E肿瘤细胞的活力。n＝3个样本/组。图42B，携带4T1E肿瘤并用EpCAM Apt或MCL1 AsiC处理的小鼠中肿瘤生长的比较。箭头表示每次处理。图42C，每组肿瘤中CD8+TIL与肿瘤浸润CD4+Foxp3+Treg的比率。图42D-图42E，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图42D)和CD4+TIL(图42E)的百分比。图42F，CD8+TIL产生的细胞毒性分子颗粒酶B和穿孔素。图42B-图42F，n＝5只小鼠/组。图42A-图42F，示出的数据为平均值+s.e.m.，并代表两次实验。
图43A-图43G描绘了免疫调节性EpCAM-AsiC在4T1E-eGFP肿瘤模型中的协同作用。图43A，在用EpCAM适体或靶向UPF2、CD47、MCL1和Parp1的四种EpCAM-AsiC的组合处理的携带4T1E-eGFP肿瘤的小鼠中每毫克肿瘤的CD8+TIL数量。图43B，每组肿瘤中CD8+TIL占肿瘤浸润CD4+Foxp3+Treg的比率。图43c-图43d，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图43C)和CD4+TIL(图43D)的百分比。图43E-图43F，CD8+TIL(图43E)和CD4+TIL(图43F)产生的细胞毒性颗粒颗粒酶B和穿孔素。图43G，来自每组肿瘤的eGFP+肿瘤细胞上EpCAM表达的平均荧光强度(MFI)。图43A-图43G，n＝5只小鼠/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
图44A-图44E描绘了免疫调节性EpCAM-AsiC与抗PD-1的协同作用。图44A，携带4T1E肿瘤并用EpCAM适体或联合的AsiC连同同种型或抗PD-1抗体一起进行处理的小鼠中，CD44+CD8+TIL上共抑制因子(co-inhibitor)PD-1、CTLA-4、2B4、TIM-3和LAG-3表达的MFI水平。图44B，每组小鼠中每毫克肿瘤的CD8+TIL数量。图44C，每毫克肿瘤的NK细胞数量。图44D-图44E，通过PMA和离子霉素诱导的产生IFN-g和TNF的CD8+TIL(图44D)和CD4+TIL(图44E)的百分比。图44A-图44E，n＝4只小鼠/组。示出的数据为平均值+s.e.m.。
具体实施方式
将治疗分子靶向患病细胞可以提高治疗的有效性并减少副作用。本文描述的技术涉及与EpCAM(上皮癌细胞的常见标志物)结合的嵌合分子以及设计成靶向某些基因的抑制性核酸，本发明人已经证明这些基因对于癌细胞生长和存活是必不可少的。已证明本文所述的特定嵌合分子与此类嵌合体的早期世代相比具有惊人的改进功效；此外，本文所述的特定嵌合分子在组合使用时能够协同作用。因此，本文描述了用于治疗癌症(例如上皮癌)的改进的组合物和方法。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、PTPN2、MCL1、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、MCL1和CD47。
如本文所使用的，“嵌合分子”是指一种分子，例如包含两个以上不同区域的核酸分子，每个区域由至少一个单体单元组成，即在AsiC化合物的情况下为核苷酸。嵌合体不是天然存在的分子，是根据定义进行工程化的。这些区域在功能或结构上可以不同。
结合EpCAM的适体结构域与EpCAM特异性结合，从而将嵌合分子靶向至表达EpCAM的细胞(例如癌细胞)。这降低了治疗剂量大小和脱靶效应的机会。如本文所使用的，术语“适体”是指能够结合细胞和靶分子(例如多肽)的单链核酸。核酸适体包括能够特异性结合靶分子的RNA、DNA和/或合成核酸类似物(例如PNA)。适体的产生和治疗用途在本领域中已充分确立。参见例如美国专利No.5,475,096。
如本文所使用的，“EpCAM”或“上皮细胞粘附分子”是指在上皮细胞中介导Ca2+非依赖性同型细胞-细胞粘附的跨膜糖蛋白。对于多种物种(例如人EpCAM)，EpCAM的序列是已知的(参见例如NCBI Gene ID：4072；蛋白质序列：NCBI Ref Seq：NP_002345.2)。
作为非限制性实例，本文提供了示例性的结合EpCAM的适体。在任何方面的一些实施方式中，EpCAM适体可包含SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68的序列；或由SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68的序列组成；或基本上由SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68的序列组成。该适体具有特别的优势：其以相似的效力作用于人和小鼠的EpCAM，这允许在具有免疫能力的小鼠中对其进行体内测试，以确定其是否具有免疫刺激作用。
表1：示例性EpCAM适体序列。[f]表示2′氟-嘧啶修饰；
Figure BDA0003512851930000141
另外的EpCAM适体是本领域已知的。例如：TGCGGCACACACTTCTATCTTTGCGGAACTCCTGCGGCTC(基于ssDNA的EpCAM适体；SEQ ID NO：63)、ACGUAUCCCUUUUCGCGU(18nt RNA EpCAM适体；SEQ ID NO：64)和下文描述的适体是已知的EpCAM适体。
Figure BDA0003512851930000142
下面描述了另一个示例性EpCAM适体，其可从Aptagen商购获得(参见例如Kim等，Identification of DNA Aptamers toward Epithelial Cell Adhesion Molecule viaCell-SELEX.Molecules and Cells,2014,37(10),742-746ISSN：0219-1032；通过引用将其全部内容并入本文)。
Figure BDA0003512851930000151
在任何方面的一些实施方式中，EpCAM适体可以包含SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列；或由SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列组成；或基本上由SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列组成。
在任何方面的一些实施方式中，EpCAM适体可包含与SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；或由与SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，EpCAM适体可包含与SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了野生型EpCAM结合活性的序列；或由与SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了野生型EpCAM结合活性的序列组成；或基本上由与SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了野生型EpCAM结合活性的序列组成。
如上所述，嵌合分子还包含抑制性核酸结构域。如本文所使用的，“抑制性核酸结构域”是指包含抑制性核酸的结构域。如本文所使用的，“抑制性核酸”是指可以抑制靶标表达的核酸分子，例如双链RNA(dsRNA)、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等。抑制性核酸(iNA)的使用使得能够实现mRNA转录物的靶向降解，导致靶标的表达和/或活性降低或者导致mRNA加工发生变化(例如剪接变化)。
抑制性核酸结构域包含一种抑制性核酸，但如本文所述的嵌合分子可包含多个抑制性核酸结构域，例如单个抑制性核酸结构域的重复或多个不同抑制性核酸结构域的集合。
在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸可以是siRNA。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的组合物可以包含结合EpCAM的结构域(其包含适体)和抑制性核酸结构域(其包含siRNA)，例如，所述组合物可以包含适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
双链RNA分子(dsRNA)已显示出以称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机制阻断基因表达。本文所述的抑制性核酸可以包含具有长度为30个以下的核苷酸(即，长度为15-30个核苷酸、长度通常为19-24个核苷酸)的区域的RNA链(反义链)，该区域与所靶向的mRNA转录物的至少一部分实质上互补。
如本文所使用的，术语“抑制性寡核苷酸”、“抑制性核酸”或“iNA”是指含有寡核苷酸的试剂，例如介导RNA转录物的靶向切割的DNA或RNA分子。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的抑制性寡核苷酸引起靶基因的表达和/或活性的抑制。可用于本方法和组合物的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、核酶、外部引导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(如siRNA化合物)、修饰碱基/锁核酸(LNA)、antagomir、肽核酸(PNA)和其它寡聚化合物或寡核苷酸模拟物，其与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含修饰连接(linkage)的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、微小干扰RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)或短发夹RNA(shRNA)、小RNA诱导的基因活化(RNAa)、小活化RNA(saRNA)或它们的组合。关于抑制性核酸的进一步公开，请参见US2010/0317718(反义寡核苷酸)；US2010/0249052(双链核糖核酸(dsRNA))；US2009/0181914和US2010/0234451(LNA)；US2007/0191294(siRNA类似物)；US2008/0249039(修饰的siRNA)；以及WO2010/129746和WO2010/040112(抑制性核酸)。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的iNA引起靶标(例如一种或多种本文所述的基因)的表达和/或活性的抑制。在任何方面的一些实施方式中，与不存在iNA的细胞中发现的靶mRNA水平相比，用抑制剂(例如iNA)接触细胞造成细胞中的靶mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、上至并包括100％。在任何方面的一些实施方式中，与不存在iNA的受试者中发现的靶mRNA水平相比，向受试者给予抑制剂(例如iNA)造成受试者中的靶mRNA水平降低至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、上至并包括100％。
在任何方面的一些实施方式中，iNA可以是dsRNA。dsRNA包含两条充分互补的RNA链，以在将使用该dsRNA的条件下杂交形成双链结构。dsRNA的一条链(反义链)包含互补区域，该区域与靶序列实质上互补且通常完全互补。靶序列可以衍生自在靶标表达过程中形成的mRNA的序列，例如，其可以跨越一个或多个内含子边界。另一条链(正义链)包含与反义链互补的区域，从而使得当在适当条件下结合时，两条链杂交并形成双链结构。通常，双链结构的长度在15至30个碱基对之间，包括端值；长度更通常在18至25个碱基对之间，包括端值；长度更通常在19至24个碱基对之间，包括端值；并且长度最通常在19至22个碱基对之间，包括端值。类似地，与靶序列互补的区域的长度在15至30个碱基对之间，包括端值；长度更通常在18至25个碱基对之间，包括端值；长度更通常在19至24个碱基对之间，包括端值；并且长度最通常在19至21个碱基对之间，包括端值。在任何方面的一些实施方式中，dsRNA的长度在15至20个核苷酸之间，包括端值；并且在其它实施方式中，dsRNA的长度在25至30个核苷酸之间，包括端值。正如本领域普通技术人员将认识到的，被靶向以用于切割的RNA的被靶向区域最通常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。相关地，mRNA靶标的“部分”是具有足以成为RNAi引导的切割(即，通过RISC通路切割)的底物的长度的mRNA靶标的连续序列。在一些情况下，具有短至9个碱基对的双链的dsRNA可以介导RNAi引导的RNA切割。最常见地，靶标的长度为至少15个核苷酸，优选长度为15-30个核苷酸。
抑制性核酸的类型的示例性实施方式可包括例如：siRNA、shRNA、miRNA和/或amiRNA，它们是本领域公知的。
在任何方面的一些实施方式中，对iNA的核酸(例如dsRNA)进行化学修饰，以增强稳定性或其它有益的特性。可以通过本领域完善建立的方法修饰和/或合成本文所述的核酸，例如描述于“Current protocols in nucleic acid chemistry”，Beaucage，S.L.等(编)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中的方法，通过引用由此将其并入本文。修饰包括例如(a)末端修饰，例如5’末端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3’末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；(b)碱基修饰，例如用稳定碱基、不稳定碱基或与扩大体系(expanded repertoire)的伴侣碱基配对的碱基进行置换；移除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合碱基；(c)糖修饰(例如在2’位或4’位)或糖置换；以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或置换。可用于本文所述的实施方式中的RNA化合物的具体示例包括但不限于含有经修饰的骨架或无天然核苷间连接的RNA。其中，具有经修饰的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的RNA。为了本申请文件的目的并且如本领域有时所引用的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷酸。在任何方面的一些实施方式中，经修饰的RNA在其核苷间骨架中具有磷原子。
经修饰的RNA骨架可以包括例如：具有正常3’-5’连接的硫代磷酸酯(phosphorothioates)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基磷酸氨基酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)、硫羰烷基磷酸三酯和boranophosphates；它们的2’-5’连接的类似物；以及具有反极性的物质(其中，相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接)。各种盐、混合盐和游离酸形式也包括在内。在其中不包含磷原子的经修饰的RNA骨架具有由如下连接形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接；混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接；或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些骨架包括：具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；formacetyl和thioformacetyl骨架；methyleneformacetyl和thioformacetyl骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它骨架，以及具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)骨架或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]。
在适于或考虑用于iNA中的其它RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(即骨架)均被新基团所取代。碱基单元被保留用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已显示具有良好的杂交性质的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含酰胺骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核碱基被保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂(aza)氮原子。
iRNA的RNA也可以被修饰成包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中，所述核糖部分包含连接2’位和4’位碳原子的另外的桥。这一结构有效地将核糖“锁定”在3’-内向结构构象中。已经显示出，将锁核酸添加至siRNA增加了血清中的siRNA稳定性并降低了脱靶效应(Elmen，J.等，(2005)Nucleic Acids Research33(1):439-447；Mook，OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller，A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
iRNA的RNA也可以被修饰成包含一个或多个未锁核酸(UNA)。UNA是缺乏核糖环的C2'-C3'键的RNA的无环衍生物。参见例如Langkjaer等，Bioorganic&Medicinal Chemistry2009 17：5420-5。位于RNA分子5'末端的UNA可以改善iRNA靶向，参见例如Snead等，Molecular Therapy Nucleic Acids 2013 2：E103。在一些实施方式中，嵌合分子和/或抑制性核酸的5'位置为UNA。
经修饰的RNA还可以包含一个或多个取代的糖部分。本文所述的iRNA(例如dsRNA)在2’位置可以包含如下中的一种：OH；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和C2-C10炔基。示例性的适当的修饰包括：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中，n和m为从1至约10。在任何方面的一些实施方式中，dsRNA在2’位置包含如下中的一种：C1-C10低级烷基；取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基；SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2；杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告子基团、嵌入剂、改善iRNA的药代动力学性质的基团或改善iRNA的药效动力学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在任何方面的一些实施方式中，所述修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰是如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，又称为2’-DMAOE；以及同样如下文的实施例所述的2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置进行，特别是2’-5’连接的dsRNA中或3’末端核苷酸上的糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。iRNA也可以具有糖模拟物，例如取代呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖的环丁基部分。
抑制性核酸还可包含核碱基(在本领域通常简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。这些核碱基中的一些对于增高本发明中的特征性抑制性核酸的结合亲和力特别有用。这些核碱基包括：5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示出5-甲基胞嘧啶置换使核酸双链稳定性增高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编，dsRNA Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，pp.276-278)并且是示例性碱基置换，甚至更特别是当与2'-O-甲氧乙基糖修饰组合时。
上述经修饰的核酸、骨架和核碱基的制备是本领域公知的。
本发明中的特征性抑制性核酸的另一修饰涉及将一个或多个配体、部分或缀合物(其增强iRNA的细胞摄取、活性、细胞分布或药代动力学性质)化学连接至抑制性核酸。此类部分包括但不限于：脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553-6556)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053-1060)；硫醚，例如beryl-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533-538)；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651-3654)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229-237)；或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923-937)。
如本文所述的双链抑制性核酸可进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端。可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成双链抑制性核酸，例如通过使用自动化DNA合成仪(例如可从例如Biosearch、Applied Biosystems,Inc.商购获得)。在任何方面的一些实施方式中，双链抑制性核酸的反义链在3'末端和/或5'末端具有1-10个核苷酸的突出端。在任何方面的一些实施方式中，双链抑制性核酸的正义链在3'末端和/或5'末端具有1-10个核苷酸的突出端。在任何方面的一些实施方式中，双链抑制性核酸的至少一个末端具有1-4个(通常为1或2个)核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的双链抑制性核酸相对于它们的平末端对应物具有出乎意料地优越的抑制特性。在任何方面的一些实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替换。
如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从抑制性核酸(例如dsRNA)的双链结构伸出的至少一个未配对核苷酸。例如，当双链抑制性核酸的一条链的3'末端延伸超过另一条链的5'末端时(反之亦然)，则存在核苷酸突出端。双链抑制性核酸可包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多核苷酸。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)组成。突出端可在正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可存在于双链抑制性核酸的反义链或正义链的5'末端、3'末端或两端。
如本文所用的关于双链抑制性核酸的术语“平端的(blunt)”或“平末端的(blunt-ended)”是指在dsRNA的给定末端没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即没有核苷酸突出端。双链抑制性核酸的一端或两端可为平端的。在双链抑制性核酸的两端都是平端的情况下，称双链抑制性核酸是平末端的。明确地说，“平末端的”双链抑制性核酸是两端都是平端的双链抑制性核酸，即在分子的任一端都没有核苷酸突出端。最通常地，这样的分子在其整个长度上都是双链的。
在这方面，两条链中的一条与两条链中的另一条互补，其中一条链与靶基因前体或成熟miRNA的序列实质上互补。因此，在这方面，双链抑制性核酸将包含两种寡核苷酸，其中一种寡核苷酸被描述为正义链，而第二种寡核苷酸被描述为正义链的相应反义链。如本文别处所述和本领域已知的，双链抑制性核酸的互补序列也可以作为单个核酸分子的自互补区域包含在内，而不是在单独的寡核苷酸上。在一些实施方式中，仅所述分子的一部分(例如抑制性核酸结构域)是双链分子。
本领域技术人员熟知具有20至23个碱基对之间(特别是21个碱基对)的双链结构的抑制性核酸被誉为在诱导反义介导的抑制方面特别有效(Elbashir等，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，其它人已经发现更短或更长的抑制性核酸也可以是有效的。
此外，考虑了对于所鉴定的任何序列，可以通过如下方式来实现进一步优化：通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列，并对通过将更长或更短尺寸的窗口从该点在靶RNA上下移动而产生的序列进行测试。再次，将这种产生新候选靶标的方法与在抑制测定中对基于这些靶序列的抑制性核酸的有效性进行的测试(如本领域所知或本文所述)相结合，可以使得进一步提高抑制效率。此外，可以通过例如引入如本文所述或如本领域已知的修饰的核苷酸、添加或改变突出端、或如本领域已知和/或如本文讨论的其它修饰来调整此类优化的序列，以进一步优化该分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从内体的释放等)来作为表达抑制剂。
如本文所述的抑制性核酸可以包含与靶序列的一个或多个错配。在任何方面的一些实施方式中，如本文所述的抑制性核酸包含不超过3个错配。如果抑制性核酸的反义链包含与靶序列的错配，优选错配区域不位于互补区域的中央。如果抑制性核酸的反义链包含与靶序列的错配，优选将错配限制在互补区域的5'末端或3'末端起的最后5个核苷酸内。例如，对于与靶基因或其前体的区域互补的23个核苷酸的抑制性核酸试剂链，该链通常在中央的13个核苷酸内不包含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定包含与靶序列的错配的抑制性核酸在抑制靶基因的表达方面是否有效。对具有错配的抑制性核酸在抑制靶基因的表达方面的功效所进行的考虑很重要，特别是在如果已知靶基因中的特定互补区域在群体内具有多态性序列变异的情况下。
在任何方面的一些实施方式中，配体改变其所掺入的抑制性核酸试剂的分布、靶向性或寿命。在任何方面的一些实施方式中，例如与缺乏此类配体的物种相比，该配体提供对选定靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室)、组织、器官或身体区域)的增强的亲和力。优选的配体不参与双链核酸中的双链配对。
配体可以包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树枝状(dendrimer)聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂(例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(例如肝细胞或巨噬细胞)结合的抗体)。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐/酯、聚谷氨酸盐/酯、聚天冬氨酸盐/酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其它实例包括染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳香族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、牻牛儿基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触足肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐/酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇(imidazole clusters)、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白(例如糖蛋白)或肽(例如对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如结合特定细胞类型(例如肝细胞或巨噬细胞)的抗体)。配体还可以包括激素和激素受体。配体还可以包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡糖胺、多价甘露糖或多价岩藻糖。
配体可以是能够通过例如破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝)来增加抑制性核酸试剂向细胞内的摄取的物质(例如药物)。所述药物可为例如taxon、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine或myoservin。
在任何方面的一些实施方式中，附接至本文所述的抑制性核酸的配体作为药代动力学(PK)调节剂起作用。如本文所使用的，“PK调节剂”是指药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂性物质(lipophiles)、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含若干硫代磷酸酯连接的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此，在骨架中包含多个硫代磷酸酯连接的短寡核苷酸(例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适合用作本发明的配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清成分(例如血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方式中的PK调节配体。
对于不能轻易穿过双层膜的大分子药物和亲水性药物分子，细胞内体/溶酶体隔室中的截留被认为是有效递送至它们的作用位点的最大障碍。已经策划了许多方法和策略来解决这个问题。对于脂质体制剂，在制剂中使用促融合脂质(fusogenic lipid)是最常见的方法(Singh，R.S.，Goncalves，C.等(2004)On the Gene Delivery Efficacies of pH-Sensitive Cationic Lipids via Endosomal Protonation.A Chemical BiologyInvestigation.Chem.Biol.11，713-723)。通过质子化作用和/或pH诱导的构象变化表现出pH敏感性内体裂解(endosomolytic)活性的其它成分包括带电荷的聚合物和肽。示例可在如下文献中找到：Hoffman，A.S.，Stayton，P.S.et al.(2002).Design of″smart″polymersthat can direct intracellular drug delivery.Polymers Adv.Technol.13，992-999；Kakudo，Chaki，T.，S.et al.(2004).Transferrin-Modified Liposomes Equipped with apH-Sensitive Fusogenic Peptide:An Artificial Viral-like DeliverySystem.Biochemistry 436，5618-5628；Yessine，M.A.and Leroux，J.C.(2004).Membrane-destabilizing polyanions：interaction with lipid bilayers and endosomal escapeof biomacromolecules.Adv.Drug Deliv.Rev.56，999-1021；Oliveira，S.，van Rooy，I.etal.(2007).Fusogenic peptides enhance endosomal escape improving inhibitorynucleic acid-induced silencing of oncogenes.Int.J.Pharm.331.211-4。它们通常在药物递送系统的情况下使用，例如脂质体或lipoplexes。对于使用脂质体制剂的叶酸受体介导的递送，例如，已将pH敏感性促融合肽掺入脂质体中，并显示其通过改善吸收过程期间的药物卸载而增强了活性(描述于Turk，M.J.，Reddy，J.A.等(2002)Characterization ofa novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targetedliposomes at endosomal pHs，Biochim.Biophys.Acta 1559，56-68中)。
本文所述的嵌合分子可以与大分子缀合或结合以延长它们的半衰期。合适的大分子包括胆固醇、PEG、脂质体或Fc。
在某些实施方式中，内体裂解组分可以是显示pH依赖性膜活性和/或促融合性的聚阴离子肽或肽模拟物。肽模拟物可以是设计来对肽进行模拟的小蛋白样链。肽模拟物可以源自为了改变分子的特性而对现有肽进行的修饰，或者使用非天然氨基酸或其类似物合成肽样分子。在某些实施方式中，与肽相比，肽模拟物具有改进的稳定性和/或生物活性。在某些实施方式中，内体裂解组分在内体pH(例如pH5-6)下呈现其活性构象。“活性”构象是内体裂解组分促进内体裂解和/或促进本发明的模块化组合物或其任何组分(例如核酸)从内体转运至细胞的细胞质的构象。
示例性的内体裂解组分包括GALA肽(Subbarao等，Biochemistry，1987，26：2964-2972)、EALA肽(Vogel等，J.Am.Chem.Soc.，1996，118：1581-1586)及它们的衍生物(Turk等，Biochem.Biophys.Acta，2002，1559：56-68)。在某些实施方式中，内体裂解组分可包含化学基团(例如氨基酸)，其响应于pH的变化而经历电荷或质子化的变化。内体裂解组分可以是线性的或支化的。内体裂解组分的示例性一级序列包括
Figure BDA0003512851930000271
在某些实施方式中，可以将多于一种内体裂解组分并入本发明的抑制性核酸试剂中。在任何方面的一些实施方式中，这将需要将多于一种相同的内体裂解组分并入抑制性核酸试剂中。在其它实施方式中，这将需要将两种以上不同的内体裂解组分并入抑制性核酸试剂中。
这些内体裂解组分可以通过例如改变内体pH下的构象来介导内体逃逸。在某些实施方式中，内体裂解组分可以在中性pH下以无规卷曲构象存在，并且在内体pH下重排为两亲性螺旋。作为这种构象转变的结果，这些肽可能插入内体的脂质膜中，导致内体内容物渗漏到细胞质中。由于构象转变是pH依赖性的，因此内体裂解组分在血液中(pH～7.4)循环时可以表现为没有或几乎没有促融合活性。如本文所使用的，“促融合活性”被定义为导致脂质膜被内体裂解组分破坏的活性。促融合活性的一个例子是内体裂解组分破坏内体膜，导致内体裂解或渗漏以及将本发明的模块化组合物的一种或多种成分(例如核酸)从内体转运至细胞质中。
合适的内体裂解组分可由本领域技术人员测试和鉴定。例如，可以在例如细胞测定中通过常规方法测试化合物对例如根据pH环境改变电荷的响应的能力。在某些实施方式中，使测试化合物与细胞结合或接触，并且允许细胞例如通过内吞作用内化测试化合物。然后可以由接触的细胞制备内体制剂，并将该内体制剂与来自对照细胞的内体制剂对比。与对照细胞相比，来自接触细胞的内体部分的变化(例如减少)表明测试化合物可以作为促融合剂发挥功能。或者，可以例如通过显微术(例如通过光学或电子显微术)评估接触细胞和对照细胞，以确定细胞中的内体群的差异。可以标记测试化合物和/或内体，例如来量化内体渗漏。
在另一种类型的测定中，使用一种或多种测试促融合剂或公认的促融合剂构建本文所述的抑制性核酸试剂。可以标记抑制性核酸试剂以便于可视化。一旦抑制性核酸试剂被细胞摄取，可以例如通过制备内体制剂或通过显微技术(这实现了细胞的细胞质中经标记的抑制性核酸试剂的可视化)评估内体裂解组分促进内体逃逸的能力。在某些其它实施方式中，基因表达的抑制或任何其它生理参数可用作内体逃逸的替代标志物。
在其它实施方式中，圆二色谱可用于鉴定表现出pH依赖性结构转变的化合物。也可以进行两步测定法，其中，第一测定评估单独的测试化合物对pH变化的响应能力，而第二测定评估包含测试化合物的模块化组合物对pH变化的响应能力。
在本文所述方面的一些实施方式中，配体或缀合物为脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许将缀合物分配到靶组织，例如身体的非肾靶组织。其它可以结合HSA的分子也可以用作配体。例如，可以使用neproxin或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抵抗力；(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中；和/或(c)可用于调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
在另一方面，配体为细胞渗透剂，优选为螺旋细胞渗透剂。优选地，这种试剂是两亲性的。示例性试剂为肽，例如tat或触足肽。如果该试剂是肽，则可以对其进行修饰，包括肽模拟物、反转异构体(invertomer)、非肽或伪肽连接以及D-氨基酸的使用。螺旋剂优选为α-螺旋剂，其优选具有亲脂相和疏脂相。
适用于本发明的肽可以是天然肽(例如tat或触足肽)、合成肽或肽模拟物。此外，所述肽可以是修饰的肽，例如，肽可以包含非肽或伪肽连接和D-氨基酸。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与抑制性核酸试剂的连接可以例如通过增强细胞识别和吸收来影响抑制性核酸的药代动力学分布。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸的长度，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。
肽或肽模拟物可以是例如细胞穿透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状(dendrimer)肽、受限(constrained)肽或交联肽。在另一替代方案中，肽部分可包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的包含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:141)的RFGF。包含疏水性MTS的RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:142))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带大极性分子(包括肽、寡核苷酸和蛋白)穿过细胞膜。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:143))和果蝇触足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQID NO:144))的序列能够作为递送肽发挥功能。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码(例如从噬菌体展示文库或单珠单化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽)(Lam等，Nature，354：82-84，1991)。优选地，经由掺入的单体单元栓系至(tethered to)dsRNA试剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或引导构象特性。可以利用下面描述的任何结构修饰。
“细胞穿透肽”能够穿透细胞，例如微生物细胞(例如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(例如人类细胞)。微生物细胞穿透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如LL-37或CeropinP1)；含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或bactenecin)；或仅包含一个或两个主要氨基酸的肽(例如PR-39或indolicidin)。细胞穿透肽还可包含核定位信号(NLS)。例如，细胞穿透肽可以是双组分两亲肽(bipartite amphipathic peptide)，例如MPG，其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等，Nucl.Acids Res.31：2717-2724，2003)。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的抑制性核酸寡核苷酸进一步包含碳水化合物缀合物。如本文所述，碳水化合物缀合物有利于适合体内治疗用途的核酸以及组合物的体内递送。如本文所使用的，“碳水化合物”是指这样的化合物：其本身是由具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)并且每个碳原子结合有氧、氮或硫原子的一个或多个单糖单元组成的碳水化合物；或是具有碳水化合物部分作为其一部分的化合物，所述碳水化合物部分由具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)并且每个碳原子结合有氧、氮或硫原子的一个或多个单糖单元组成。代表性的碳水化合物包括糖类(包含约4-9个单糖单元的单糖、二糖、三糖和寡糖)和多糖(例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶)。具体的单糖包括C5及以上(优选C5-C8)的糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(优选C5-C8)的糖。在任何方面的一些实施方式中，碳水化合物缀合物进一步包含其它配体，例如但不限于PK调节剂、内体裂解配体和细胞穿透肽。
在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域特异性结合至本文所述基因(例如UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS、CD47、PLK1和/或MCL-1)之一的基因产物。本领域普通技术人员知道如何设计和生产抑制本文所述的一种或多种基因的抑制性核酸。在下文中提供抑制性核酸结构域序列的示例性非限制性实例。
在任何方面的一些实施方式中，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、PTPN2、SMG1、MCL1、TREX1、CMAS和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。在任何实施方式的一个方面，本文描述了嵌合分子，所述分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：UPF2、PARP1、MCL1和CD47。
如本文所使用的，“UPF2”或“无义转录物2调节因子”是指编码作为外显子连接复合物的一部分的蛋白的基因，其调节mRNA监控。许多物种的UPF2序列是本领域已知的，例如人UPF2(NCBI Gene ID：26019)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_015542.4和NM_0805992.2)。
如本文所使用的，“PARP1”或“聚[ADP-核糖]聚合酶1”是指编码靶向DNA单链上的核蛋白的聚ADP-核糖化酶的基因。许多物种的PARP1序列是本领域已知的，例如人PARP1(NCBI Gene ID：142)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001618.4)。
如本文所使用的，“APE1”、“APEX1”或“脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶1”是指编码参与碱基切除修复的核酸内切酶的基因。许多物种的APE1序列是本领域已知的，例如人APE1(NCBI Gene ID：328)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001244249.2、NM_001641.4、NM_080648.3和NM_080649.3)。
如本文所使用的，“PD-L1”或“程序性死亡配体1”是指编码调节免疫活性的跨膜蛋白的基因。许多物种的PD-L1序列是本领域已知的，例如人PD-L1(NCBI Gene ID：29126)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001267706.1、NM_001314029.2和NM_014143.4)。
如本文所使用的，“PTPN2”或“酪氨酸-蛋白磷酸酶非受体2型”是指编码作用于EGFR和Shc的酪氨酸磷酸酶的基因。许多物种的PTPN2序列是本领域已知的，例如人PTPN2(NCBI Gene ID：5771)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001207013.1、NM_001308287.1、NM_002828.4、NM_080422.2和NM_080423.2)。
如本文所使用的，“SMG1”或“丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶1”是指编码参与无义介导的mRNA衰变(NMD)途径的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶蛋白家族成员的基因。许多物种的PTPN2序列是本领域已知的，例如人SMG1(NCBI Gene ID：23049)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_015092.4)。
如本文所使用的，“TREX1”或“3'修复核酸外切酶1”是指编码形成SET复合体一部分的5'-3'核酸外切酶的基因。许多物种的TREX1序列是本领域已知的，例如人TREX1(NCBIGene ID：11277)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_007248.5和NM_033629.6)。
如本文所使用的，“CMAS”或“单磷酸胞苷N-乙酰神经氨酸合成酶”是指编码将N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)转化为胞苷5'-单磷酸N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuNAc)的酶的基因。该过程对于唾液酸化糖蛋白和糖脂的形成很重要。这种修饰在细胞-细胞通讯和免疫应答中发挥作用。许多物种的CMAS序列是本领域已知的，例如人CMAS(NCBI Gene ID：55907)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_018686.6)。
如本文所使用的，“CD47”是指编码参与细胞粘附至细胞外基质时发生的细胞内钙浓度增加的膜蛋白的基因。所编码的蛋白也是血小板反应蛋白C端细胞结合结构域的受体，并且它可能在膜转运和信号转导中发挥作用。许多物种的CD47序列是本领域已知的，例如人CD47(NCBI Gene ID：961)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001777.3和NM_198793.2)。
本文描述的嵌合分子的抑制性核酸结构域可包含一个或多个siRNA序列。示例性的siRNA序列在下表2和表3以及表5和表6中提供。
在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含选自于SEQ ID NO：1-SEQID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列；或由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ IDNO：162的序列组成；或基本上由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ IDNO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；或由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与选自于SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列；或由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成；或基本上由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成。
在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含选自于SEQ ID NO：1-SEQID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列；或由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列组成；或基本上由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；或由与选自于SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ IDNO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列；或由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成；或基本上由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQID NO：97和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成。
在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含选自于SEQ ID NO：1-SEQID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列；或由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列组成；或基本上由选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；或由与选自于SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ IDNO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，抑制性核酸结构域包含与选自于SEQ ID NO：1-SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列；或由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成；或基本上由与选自于SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：38-SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：63-SEQID NO：92和SEQ ID NO：103-SEQ ID NO：122的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如特异性结合靶基因产物和/或抑制靶基因表达的能力)的序列组成。
表2：示例性siRNA序列
Figure BDA0003512851930000361
Figure BDA0003512851930000371
在表3中，提供了正义和反义序列对。由于siRNA的功能，本文考虑了例如在与适体相同的连续核酸链中，可将正义或反义序列中任一者并入嵌合分子。因此，在任何方面的一些实施方式中，本文所述的任何嵌合分子可包含本文提供的抑制性核酸序列之一或其反向互补序列。
表3：示例性抑制性核酸结构域。[f]表示2'氟-嘧啶修饰；{Phos(H).}表示5'磷酸；d表示2'脱氧碱基。在提供反义序列的情况下，它们是相对于紧接在前的正义序列的反义序列。
Figure BDA0003512851930000381
Figure BDA0003512851930000391
本文所述的嵌合分子可包含多于一个例如串联或位于适体侧翼的抑制性核酸结构域。这种结构允许嵌合分子抑制多种基因的表达、提供增加剂量的抑制性核酸结构域和/或提供多种不同的抑制性核酸结构域来靶向相同基因，从而允许更大的抑制。
在任何方面的一些实施方式中，其中，嵌合分子包含第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域，例如第二和任选的第三、第四、第五或更多个抑制性核酸结构域。
在任何方面的一些实施方式中，第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域包含相同的序列。在任何方面的一些实施方式中，第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，但各自抑制相同基因的表达。在任何方面的一些实施方式中，第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，并且各自抑制不同基因的表达。当使用三个以上抑制性核酸结构域时，抑制性核酸结构域的任何上述组合可以反映任何可能的成对组合。例如，在具有三个抑制性核酸结构域的嵌合分子中，在第一结构域和第二结构域包含相同序列的情况下，第三结构域可以包含：i)相同的序列；ii)抑制相同基因表达的不同序列；或iii)抑制不同基因表达的不同序列。
在任何方面的一些实施方式中，至少第二抑制性核酸结构域抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达。
如本文所使用的，“PLK1”或“polo样激酶1”是指编码属于CDC5/Polo亚家族的Ser/Thr蛋白激酶的基因。它在有丝分裂期间高度表达。许多物种的PLK1序列是本领域已知的，例如人PLK1(NCBI Gene ID：5347)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_005030.6)。
如本文所使用的，“MCL1”或“髓样白血病细胞分化蛋白1”是指编码调节细胞凋亡的Bcl-2家族成员的基因。许多物种的MCL1序列是本领域已知的，例如人MCL1(NCBI GeneID：4170)mRNA(NCBI Ref Seq：NM_001197320.1和NM_021960.5)。
在任何方面的一些实施方式中，本文描述了第一嵌合分子和第二嵌合分子，所述第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47；所述第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。在任何方面的一些实施方式中，本文描述了第一嵌合分子和第二嵌合分子，所述第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47；所述第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。在任何方面的一些实施方式中，本文描述了第一嵌合分子和第二嵌合分子，所述第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1和CD47；所述第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1、APE1、PD-L1和CD47。
在任何方面的一些实施方式中，本文描述了至少四种嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域：UPF2、PARP1和CD47。在任何方面的一些实施方式中，本文描述了至少六种嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域；UPF2、PARP1、MCL1、PD-L1和CD47。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子例如可以在结合EpCAM的结构域和抑制性核酸之间或在这些结构域中的一个或两个和另外的配体或部分之间包含一个或多个接头。接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”是指连接化合物的两个部分的部分(例如有机部分)。在任何方面的一些实施方式中，接头可以是用于连接两个结构域或部分的多肽或核酸。在任何方面的一些实施方式中，接头将5'结合EpCAM的结构域连接至至少一个3'抑制性核酸结构域。在任何方面的一些实施方式中，接头将3'结合EpCAM的结构域连接至至少一个5'抑制性核酸结构域。
接头可包含例如1-1000个核苷酸或更多个核苷酸。在任何方面的一些实施方式中，接头包含1-100、10-100、100-900、200-800、300-700、500-1000或700-1000个核苷酸。在任何方面的一些实施方式中，接头的长度可为1-10个核苷酸，例如长度为1-5个核苷酸或3个核苷酸。
可以针对一种或多种期望的特性(例如结构域的分离、防止自杂交等)优化接头的长度。
在任何方面的一些实施方式中，接头可包括直接键(direct bond)；或原子，例如碳、氧或硫；单元，例如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH；或原子链，例如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中，一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环间隔或终止；其中，R8为氢、酰基、脂肪基或取代的脂肪基。在任何方面的一些实施方式中，接头在1-24个原子之间，优选4-24个原子，优选6-18个原子，更优选8-18个原子，并且最优选8-16个原子。
可切割的连接基团是在细胞外足够稳定、但在进入靶细胞时被切割以释放由接头保持在一起的两个部分的连接基团。在任何方面的一些实施方式中，相比在受试者的血液中或在第二参考条件(例如可将其选择为模拟或代表血液或血清中的条件)下的情况，在靶细胞中或在第一参考条件(例如可将其选择为模拟或代表细胞内条件)下可切割的连接基团以至少快10倍或更多倍，优选至少快100倍的速度被切割。
可切割的连接基团易受切割剂的影响，例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在。通常，与血清或血液相比，切割剂在细胞内更普遍或以更高的水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：存在于细胞中的氧化还原剂，对该氧化还原剂进行选择以用于特定底物或氧化还原剂无底物特异性，包括例如氧化性或还原性酶、或还原剂(例如硫醇)，其可通过还原来降解氧化还原可切割的连接基团；酯酶；可创建酸性环境的试剂或内体，例如使pH为5以下的试剂或内体；可通过充当广义酸来水解或降解酸性可切割的连接基团的酶、肽酶(可为底物特异性的)和磷酸酶。
可切割的连接基团(例如二硫键)可以对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，约为7.1-7.3的范围。内体具有更酸性的pH，在5.5-6.0的范围内，而溶酶体具有甚至更酸性的pH，约为5.0。一些接头具有可切割的连接基团，该可切割的连接基团在优选的pH下被切割，从而在细胞内将阳离子脂质从配体释放，或释放到细胞的期望区室中。
接头可以包含可被特定酶切割的可切割的连接基团。并入接头中的可切割的连接基团的类型可以取决于待靶向的细胞。可切割的连接基团的其它实例包括但不限于氧化还原可切割的连接基团(例如二硫化物连接基团(-S-S-))、基于磷酸盐的可切割的连接基团、基于酯的可切割的连接基团和基于肽的可切割的连接基团。教导了RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469：5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928and5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；其中每一个都以引用方式并入本文。
通常，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估候选可切割的连接基团的适用性。还可取的是也测试候选可切割的连接基团在血液中或与其它非靶组织接触时耐受切割的能力。因此，可以确定第一种和第二种条件之间对切割的相对敏感性，其中，选择第一种以指示靶细胞中的切割，选择第二种以指示其它组织或生物体液(例如血液或血清)中的切割。可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行评估。可能有用的是在无细胞或培养条件下进行初步评估并通过在整个动物中进行进一步评估来进行确认。在任何方面的一些实施方式中，与血液或血清(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)以至少快2、4、10或100倍的速度被切割。
没有必要均匀修饰给定化合物中的所有位置，事实上，可以将超过一种上述修饰掺入单个化合物中或者甚至抑制性核酸内的单个核苷中。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含至少一个区域，其中，核酸被修饰以赋予抑制性核酸对核酸酶降解的增强的抗性、升高的细胞摄取和/或对靶核酸的增强的结合亲和力。抑制性核酸的额外的区域可用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。例如，RNase H是一种细胞核酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的活化导致RNA靶标的切割，从而大大提高了抑制性核酸对基因表达的抑制效率。因此，例如与杂交至相同靶区域的硫代磷酸脱氧dsRNA相比，当使用嵌合抑制性核酸时，通常可以用较短的抑制性核酸获得可比的结果。可以通过凝胶电泳和(如果需要)本领域已知的相关核酸杂交技术来常规检测RNA靶标的切割。
在某些情况下，抑制性核酸的核酸可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与抑制性核酸缀合以增强抑制性核酸的活性、细胞分布或细胞摄取，用于进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分包括：脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86:6553)；胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4:1053)；硫醚，例如己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533)；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.，1991，10:111；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259:327；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969)；或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651)；棕榈酰部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229)；或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923)。上文已经列出了教导这种核酸缀合物的制备的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置处合成带有氨基接头的核酸。然后使用适当的偶联剂或活化剂使氨基基团与待缀合的分子反应。可以在核酸仍然结合至固相支持物时或在核酸切割之后在溶液相中进行缀合反应。通过HPLC纯化核酸缀合物通常提供纯缀合物。
在任何方面的一些实施方式中，嵌合分子可以进一步包含第二链，例如可以与抑制性核酸结构域的至少一部分杂交的核酸链。在本文别处提供了示例性的第二链或互补(反义)链。
在任何方面的一些实施方式中，嵌合分子可以进一步包含与抑制性核酸结构域的至少一部分互补的结构域，例如可以与抑制性核酸结构域的至少一部分杂交的核酸序列。在本文别处提供了那些作为第二链或互补(反义)链的示例性序列。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含SEQ ID NO：127-SEQID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列；由SEQ ID NO：127-SEQ IDNO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列组成；或基本上由SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ IDNO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；由与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列；由与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列组成；或基本上由与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列组成。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含与如表4、表5或表6中所示的反义序列杂交的SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列；由与如表4、表5或表6中所示的反义序列杂交的SEQ ID NO：127-SEQ IDNO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列组成；或基本上由与如表4、表5或表6中所示的反义序列杂交的SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ IDNO：168中的一者的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ IDNO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列；由与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成；或基本上由与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的序列组成。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可包含与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列；由与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列组成；或基本上由与与如表4、表5或表6中所示的反义序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性的反义序列杂交的与SEQ ID NO：127-SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：163-SEQ IDNO：168中的一者的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性并且保留了参考序列的野生型活性(例如结合能力或癌症抑制活性)的序列组成。
表4：示例性的AsiC。注：粗体部分显示EpCAM适体序列；斜体部分(UUU)为接头区域；正常文本区域为siRNA区域
[f]表示2'氟-嘧啶修饰；{Phos(H).}表示5'磷酸；d表示2'脱氧碱基
Figure BDA0003512851930000481
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子可进一步包含例如缀合至所述嵌合分子的化疗剂。示例性的非限制性化疗剂包括紫杉醇和本文所述的其它化疗剂。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了药物组合物、试剂盒或组合，所述组合物、试剂盒或组合包含至少一种如本文所述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体。组合物、试剂盒或组合可包含多种序列不同的嵌合分子或单一嵌合分子的群。
在任何方面的一些实施方式中，组合物、试剂盒或组合包含至少两种嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。在任何方面的一些实施方式中，不同的抑制性核酸结构域识别不同的靶标。在任何方面的一些实施方式中，不同的抑制性核酸结构域具有不同的序列并识别相同的靶标。
在任何实施方式的一个方面，本文描述了药物组合物、试剂盒或组合，所述组合物、试剂盒或组合包含：i)如本文所述的第一嵌合分子，所述分子包含至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于如下基因的基因的表达：UPF2、PARP1、APE1、MCL1、PD-L1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47；以及ii)第二嵌合分子，所述分子包含如本文所述的嵌合分子，其中，所述第二嵌合分子的至少一个抑制性核酸结构域与所述第一嵌合分子相比抑制不同基因的表达和/或抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达。
试剂盒是包含至少一种本文所述的嵌合分子的材料或组分的集合。试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期用途。在任何方面的一些实施方式中，所述试剂盒被特别配置用于人类受试者。在进一步的实施方式中，所述试剂盒被配置用于兽医应用，对例如但不限于农场动物、家养动物和实验室动物的受试者进行治疗。
在任何方面的一些实施方式中，试剂盒包含使用说明。“使用说明”通常包括描述在使用试剂盒的组分以产生受试者的期望结果时所采用的技术的有形表现。仍然根据本发明，“使用说明”可包括描述以下内容的有形表现：通常用于预期目的的嵌合分子的制备和/或至少一个方法参数(例如剂量要求和给予说明等)。任选地，所述试剂盒还包含其它有用的组分，例如测量工具、稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器或将容易被本领域技术人员所认识到的其它有用的用具。
组装在试剂盒中的材料或组分可提供给从业者，并以保持其可操作性和实用性的任何方便且合适的方式储存。例如，所述组分可处于溶解、脱水或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。所述组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所使用的，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物(例如本发明的组合物等)的一种或多种物理结构体。包装材料通过众所周知的方法构建，优选地提供无菌的、无污染物的环境。包装还优选可提供免受光、湿气和氧影响的环境。如本文所使用的，术语“包装”是指能够保持个体试剂盒组分的合适的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯或Mylar)等。因此，例如，包装可为用于容纳适当量的组合物(其包含一定体积的本文所述的嵌合分子)的玻璃小瓶。所述包装材料通常具有外部标签，该外部标签指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的。
在多种嵌合分子的组合中，可以在混合物或单一制剂中提供不同的嵌合分子。或者，可以在被包装或提供为套装或试剂盒的单独的制剂中提供不同的嵌合分子。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的技术涉及包含至少一种如本文所述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。在任何方面的一些实施方式中，药物组合物的活性成分包含至少一种如本文所述的嵌合分子。在任何方面的一些实施方式中，药物组合物的活性成分基本上由至少一种如本文所述的嵌合分子组成。在任何方面的一些实施方式中，药物组合物的活性成分由至少一种如本文所述的嵌合分子组成。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。这些载体和稀释剂的使用在本领域中是众所周知的。可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和纤维素乙酸酯；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；以及(25)药学制剂中使用的其它无毒相容性物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于制剂中。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。在任何方面的一些实施方式中，载体抑制活性剂(例如至少一种本文所述的嵌合分子)的降解。
在任何方面的一些实施方式中，包含至少一种如本文所述的嵌合分子的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的给予通常绕过患者对抗污染物的天然防御，肠胃外剂型优选是无菌的或能够在给予患者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备好用于注射的溶液、准备好被溶解或悬浮于药学上可接受的溶媒中的用于注射的干燥产品、准备好用于注射的悬浮液和乳剂。另外，可以制备用于给予患者的控释肠胃外剂型，包括但不限于
Figure BDA0003512851930000511
型剂型和剂量倾卸(dose-dumping)。
可用于提供至少一种如本文所公开的嵌合分子的肠胃外剂型的合适溶媒对本领域技术人员是众所周知的。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；盐水溶液；葡萄糖溶液；水性溶媒，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸盐林格氏注射液；与水混溶的溶媒，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性溶媒，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯以及苯甲酸苄酯。改变或修饰本文公开的活性成分的药学上可接受的盐的溶解度的化合物也可以并入本公开的肠胃外剂型中，包括常规肠胃外剂型和控释肠胃外剂型。
还可以将包含至少一种嵌合分子的药物组合物配制成适于口服给予，例如作为分散剂型，例如但不限于片剂(包括但不限于刻痕片剂或包衣片剂)、丸剂、囊片、胶囊、可咀嚼片剂、粉末包装、扁囊剂、锭剂、糯米纸囊剂、气溶胶喷雾剂或液体，例如但不限于糖浆剂、酏剂、处于水性液体中的悬液剂或溶液剂、非水性液体、水包油乳剂或油包水乳剂。这样的组合物含有预定量的所公开的化合物的药学上可接受的盐，并且可以通过本领域技术人员熟知的药学方法制备。通常参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott，Williams，and Wilkins，Philadelphia PA(2005)。
常规剂型通常提供从制剂的快速或即时的药物释放。根据药物的药理学和药代动力学，常规剂型的使用会导致患者血液和其它组织中的药物浓度的大幅波动。这些波动可能影响许多参数，例如剂量频率、作用开始、功效持续时间、治疗血液水平的维持、毒性、副作用等。有利地，控释制剂可用于控制药物的作用开始、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和血液峰值水平。具体而言，可以使用控释剂型或制剂或者缓释剂型或制剂来确保实现药物的最大有效性，同时使潜在的不利影响和安全性问题最小化，这在药物剂量不足(即低于最低治疗水平)以及超过药物的毒性水平时都可能会发生。在任何方面的一些实施方式中，至少一种嵌合分子能够以持续释放制剂的形式给药。
控释药学产品具有改善药物治疗的共同目标，这优于其非控释对应物所达到的目标。理想的是，在药物治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征在于在最短的时间内通过使用最少量的药物物质来治愈或控制病症。控释制剂的优势包括：1)药物活性的延长；2)剂量频率的减少；3)患者依从性的增加；4)使用总量较少的药物；5)局部或全身性副作用的减少；6)药物积累的最小化；7)血液水平波动的减少；8)治疗功效的改善；9)药物活性丧失或强化的减少；以及10)疾病或病症的控制速度的改善。Kim,Cherng-ju,Controlled ReleaseDosage Form Design,2(Technomic Publishing,Lancaster,Pa.:2000)。
大多数控释制剂被设计为开始释放一定量的药物(活性成分)，其及时产生期望的治疗效果；然后逐渐并持续地释放另外量的药物以维持该水平的治疗或预防效果至延长的一段时间。为了在体内维持这种恒定的药物水平，药物必须从剂型中以代替从机体代谢和排泄的药物量的速度被释放。可以通过各种条件来刺激活性成分的控释，所述条件包括但不限于pH、离子强度、渗透压、温度、酶、水以及其它生理条件或化合物。
各种已知的控释或缓释剂型、制剂和装置可适用于本公开的盐和组合物。实例包括但不限于在美国专利No.3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,733,566以及6,365,185B1中描述的那些；将它们各自通过引用并入本文。这些剂型可以使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统(如
Figure BDA0003512851930000531
(AlzaCorporation，Mountain View，Calif.USA))或使用处于不同比例的提供期望的释放曲线的上述物质的组合来用于提供一种或多种活性成分的缓慢释放或控释。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的嵌合分子在试剂盒中提供；或与免疫检查点抑制剂(例如免疫检查点抑制剂抗体试剂)一起组合提供；或在进一步包含免疫检查点抑制剂(例如免疫检查点抑制剂抗体试剂)的组合物中提供；或与免疫检查点抑制剂(例如免疫检查点抑制剂抗体试剂)一起给药。
免疫检查点抑制剂抑制一种或多种免疫检查点蛋白。免疫系统具有多种抑制途径，这些途径对于维持自身耐受性和调节免疫应答至关重要。例如，在T细胞中，应答的幅度和质量是通过T细胞受体识别抗原而启动的，并由平衡共刺激和抑制信号的免疫检查点蛋白调节。在任何方面的一些实施方式中，用免疫检查点蛋白的至少一种抑制剂对受试者或患者进行处理。如本文所使用的，“免疫检查点蛋白”是指当有活性时表现出对免疫活性(例如T细胞活性)的抑制作用的蛋白。示例性免疫检查点蛋白可以包括：PD-1(例如NCBI GeneID：5133)；PD-L1(例如NCBI Gene ID：29126)；PD-L2(例如NCBI Gene ID：80380)；TIM-3(例如NCBI Gene ID：84868)；CTLA4(例如NCBI Gene ID：1493)；TIGIT(例如NCBI Gene ID：201633)；KIR(例如NCBI Gene ID：3811)；LAG3(例如NCBI Gene ID：3902)；DD1-α(例如NCBIGene ID：64115)；A2AR(例如NCBI Gene ID：135)；B7-H3(例如NCBI Gene ID：80381)；B7-H4(例如NCBI Gene ID：79679)；BTLA(例如NCBI Gene ID：151888)；IDO(例如NCBI Gene ID：3620)；TDO(例如NCBI Gene ID：6999)；HVEM(例如NCBI Gene ID：8764)；GAL9(例如NCBIGene ID：3965)；2B4(属于CD2分子家族，在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)(例如NCBI Gene ID：51744)；CD160(也称为BY55)(例如NCBI Gene ID：11126)；和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。
免疫检查点抑制剂的非限制性实例(在括号中注明检查点靶标和制造商)可以包括：MGA271(B7-H3；MacroGenics)；伊匹木单抗(ipilimumab)(CTLA-4；Bristol MeyersSquibb)；派姆单抗(PD-1；Merk)；纳武单抗(PD-1；Bristol Meyers Squibb)；阿特珠单抗(PD-L1；Genentech)；加利昔单抗(B7.1；Biogen)；IMP321(LAG3；Immuntep)；BMS-986016(LAG3；Bristol Meyers Squibb)；SMB-663513(CD137；Bristol-Meyers Squibb)；PF-05082566(CD137；Pfizer)；IPH2101(KIR；Innate Pharma)；KW-0761(CCR4；Kyowa Kirin)；CDX-1127(CD27；CellDex)；MEDI-6769(Ox40；MedImmune)；CP-870,893(CD40；Genentech)；tremelimumab(CTLA-4；Medimmune)；pidilizumab(PD-1；Medivation)；MPDL3280A(PD-L1；Roche)；MEDI4736(PD-L1；AstraZeneca)；MSB0010718C(PD-L1；EMD Serono)；AUNP12(PD-1；Aurigene)；阿维鲁单抗(PD-L1；Merck)；德瓦鲁单抗(PD-L1；Medimmune)；IMP321，可溶性Ig融合蛋白(Brignone等，2007，J.Immunol.，179：4202-4211)；抗B7-H3抗体MGA271(Loo等，2012，Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)；TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等，2010，J.Exp.Med.，207：2175-86；和Sakuishi等，2010，J.Exp.Med.207：2187-94)；美国专利No：5,811,097、5,811,097、5,855,887、6,051,227、6,207,157、6,682,736、6,984,720和7,605,238中描述的抗CTLA-4抗体；tremelimumab(ticilimumab，CP-675,206)；依匹木单抗(也称为10D1、MDX-D010)；美国专利No.7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149以及PCT公开专利申请No.WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699中描述的PD-1和PD-L1阻断剂；纳武单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO4538)；lambrolizumab(MK-3475或SCH 900475)；CT-011；AMP-224；和BMS-936559(MDX-1105-01)。通过引用将前述参考文献整体并入本文。
在任何方面的一些实施方式中，免疫检查点蛋白为PD-1或PD-L1。在任何方面的一些实施方式中，免疫检查点蛋白为PD-1。
在任何方面的一些实施方式中，免疫检查点抑制剂为派姆单抗(PD-1；Merk)；纳武单抗(PD-1；Bristol Meyers Squibb)；阿特珠单抗(PD-L1；Genentech)；pidilizumab(PD-1；Medivation)；MPDL3280A(PD-L1；Roche)；MEDI4736(PD-L1；AstraZeneca)；MSB0010718C(PD-L1；EMD Serono)；AUNP12(PD-1；Aurigene)；阿维鲁单抗(PD-L1；Merck)；德瓦鲁单抗(PD-L1；Medimmune)；或美国专利No.7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149以及PCT公开专利申请No.WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699中描述的PD-1和PD-L1阻断剂。在任何方面的一些实施方式中，免疫检查点抑制剂为派姆单抗(PD-1；Merk)；纳武单抗(PD-1；Bristol Meyers Squibb)；pidilizumab(PD-1；Medivation)；AUNP12(PD-1；Aurigene)；或美国专利No.7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149以及PCT公开专利申请No.WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699中描述的PD-1阻断剂。
如本文所使用的，术语“抗体试剂”是指多肽，所述多肽包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列，并特异性地结合给定抗原。抗体试剂可包括抗体或含有抗体的抗原结合结构域的多肽。在任何方面的一些实施方式中，抗体试剂可包括单克隆抗体或含有单克隆抗体的抗原结合结构域的多肽。例如，抗体可包含重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一示例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体试剂”涵盖了抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段和sFab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段以及完整抗体)。
如本文所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成的抗体以及包括全长抗体及其抗原结合部分在内的多种形式；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体(dAb)、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体，它们的功能活性表位结合部分和/或双功能杂交抗体。每条重链由所述重链的可变区(在本文缩写为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由所述轻链的可变区(在本文缩写为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL结构域组成。VH和VL区可以进一步分为被称为互补决定区(CDR)的高变区并散布有被称为框架区(FR)的保守区。因此，每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们从N端到C端按以下顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。该结构是本领域技术人员所公知的。
抗体和/或抗体试剂可包括免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、完全人抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单域抗体、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体，及它们的功能活性表位结合部分。
如本文所使用的，术语“纳米体(nanobody)”或单域抗体(sdAb)是指包含从骆驼科(camelid)和单峰骆驼(dromedary)获得的抗体的小的单个可变结构域(VHH)的抗体。已在尺寸、结构复杂性和对人受试者的抗原性方面，对从骆驼和单峰骆驼(Camelus baclrianus和Calelus dromaderius)家族的成员(包括新的世界成员，例如美洲驼物种(Lama paccos、Lama glama和Lama vicugna))获得的抗体蛋白进行了表征。自然界中发现的来自该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并因此在结构上不同于就来自其它动物的抗体而言的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公开的WO94/04678；以引用的方式将其内容整体并入本文)。
可通过基因工程获得鉴定为VHH的小的单个可变结构域的骆驼抗体的区域，以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，从而产生称为“骆驼纳米体”的低分子量抗体衍生的蛋白质。参见1998年6月2日发行的U.S.Pat.No.5,759,808；还参见Stijlemans，B.等，2004JBiol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等，2003Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等，2003Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等，2002Int J Cancer 89：456-62；以及Lauwereys,M.等，1998EMBO J.17：3512-3520；通过引用将它们各自整体并入本文。骆驼抗体和抗体片段的工程库可商购获得，例如来自Ablynx,Ghent,Belgium。与其它非人源抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列，以获得与人序列更像的序列，即纳米体可以“人源化”。因此，骆驼抗体对人的天然低抗原性可进一步降低。
骆驼纳米体的分子量约为人IgG分子的十分之一，并且该蛋白质的物理直径仅为几纳米。小尺寸的一个结果是骆驼纳米体能够结合到对于更大的抗体蛋白质而言在功能上不可见的抗原位点，即骆驼纳米体可用作使用传统免疫技术检测不到的抗原的检测试剂，并可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的另一结果是骆驼纳米体由于结合靶蛋白的沟(groove)或窄缝(narrow cleft)中的特异位点而因此可以抑制靶蛋白，因此与传统抗体的功能相比，可以发挥更像传统低分子量药物功能的能力。低分子量和紧凑的尺寸进一步导致骆驼纳米体极其热稳定，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，且抗原性弱。参见2004年8月19日公开的US专利申请20040161738；以引用的方式将其内容整体并入本文。这些特征与对人的低抗原性结合表明了巨大的治疗潜力。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法涉及用本文所述的组合物治疗患有或诊断为患有癌症的受试者。可通过使用目前诊断癌症的方法由医生来识别患有癌症的受试者。表征这些病症并有助于诊断的癌症的症状和/或并发症在本领域是众所周知的，包括但不限于例如在乳腺癌的情况下为乳房组织中的肿物或团块、乳房全部或部分肿胀、皮肤刺激、乳房凹陷、乳房或乳头疼痛、乳头内陷、乳房或乳头发红、鳞屑或刺激以及乳头溢液。可有助于诊断例如乳腺癌的测试包括但不限于乳房X光检查、X射线、MRI、超声、乳管造影、活检和导管灌洗、癌症家族史或暴露于癌症危险因素(例如吸烟、辐射、污染物、BRCA1突变等)。
在任何方面的一些实施方式中，例如，与仅直接杀死肿瘤细胞相反，本文所述的嵌合分子通过免疫疗法提供治疗效果。如本文所述，直接杀死肿瘤的某些嵌合分子还在肿瘤中诱导免疫应答，并且细胞毒性和免疫调节性AsiC的组合改善了肿瘤阻遏。
如本文所使用的，术语“癌症”通常涉及一类疾病或病症，其中异常细胞不受控制的分裂并且可以侵袭邻近的组织。癌症细胞也可以通过血液系统和淋巴系统扩散到机体的其它部分。存在多种主要类型的癌症。癌(carcinoma)是起始于皮肤或者内衬或覆盖内脏器官的组织中的癌症。肉瘤是起始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其它结缔组织或支持组织的癌症。白血病是始于例如骨髓的造血组织并且引起大量的异常血细胞产生并进入血液的癌症。淋巴瘤和多发性骨髓瘤是起始于免疫系统的细胞的癌症。中枢神经系统癌症是起始于脑组织和脊髓组织的癌症。
在任何方面的一些实施方式中，癌症是原发性癌症。在任何方面的一些实施方式中，癌症是恶性癌症。如本文所使用的，术语“恶性的”是指其中的一群肿瘤细胞显示出一种或多种不受控制的生长(例如超出正常限度的分裂)、侵袭(例如侵入并破坏邻近的组织)和转移(例如通过淋巴和血液扩散到机体的其它位置)的癌症。如本文所使用的，术语“转移”是指癌症从机体的一个部分扩散到另一部分。由已扩散的细胞形成的肿瘤称为“转移性肿瘤”或“转移瘤”。转移性肿瘤含有与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。如本文所使用的，术语“良性的”或“非恶性的”是指可以长得更大但不会扩散到机体其它部分的肿瘤。良性肿瘤是自限性的并且通常不会侵袭或转移。
“癌症细胞/癌细胞”或“肿瘤细胞”是指癌性生长物或组织的单个细胞。肿瘤通常是指由细胞的异常生长形成的肿块或病变，其可以是良性的、癌前病变的或者恶性的。大多数癌症细胞形成肿瘤，但一些(例如白血病)并不必然形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症细胞，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。
本文所使用的术语“赘生物(neoplasm)”是指组织(例如异常的组织块)的任何新的和异常的生长，其生长超过正常组织并且与正常组织不协调。因此，赘生物可以是良性赘生物、癌前赘生物或恶性赘生物。
患有癌症或肿瘤的受试者是具有存在于受试者体内的客观上可测量的癌症细胞的受试者。此定义包括恶性、活跃增殖性癌症，以及潜在的休眠肿瘤或微转移。从其原始位置迁移并播种另外的重要器官的癌症通过受影响的器官的功能恶化而最终导致受试者死亡。
癌症的实例包括但不限于恶性上皮肿瘤(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内赘生物、肾癌或肾脏癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的癌症、外阴癌以及其它恶性上皮肿瘤和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞NHL、大肿块病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性髓细胞白血病、以及移植后淋巴细胞增殖性紊乱(PTLD)；以及与斑痣病、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)以及Meigs综合征相关的异常的血管增殖。
“癌细胞”是体内、离体或组织培养中的癌性的、癌前的或转化的细胞，其具有并不必然涉及新遗传物质的摄取的自发的或诱导的表型改变。虽然转化可以产生自转化病毒的感染以及新基因组核酸的整合或外源核酸的摄取，但也可以自发地或暴露于致癌物后产生，从而使内源基因突变。转化/癌症与以下方面有关：例如形态学改变、细胞永生化、异常的生长控制、集落形成、锚定非依赖性、恶性、失去接触抑制和生长密度限制、生长因子或血清独立性、肿瘤特异性标志物、侵袭性或转移以及在合适的动物宿主(例如裸鼠)中的肿瘤生长。
在任何方面的一些实施方式中，癌症为上皮癌。在任何方面的一些实施方式中，癌症为乳腺癌、结肠癌或三阴性乳腺癌。在任何方面的一些实施方式中，癌症为HER2+癌症。在任何方面的一些实施方式中，癌症不是BRCA1缺陷型的，例如，患者不具有BRCA1突变或致癌突变。
可以将本文所述的组合物和方法给予患有或诊断为患有癌症的受试者。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法包括向受试者给予有效量的本文所述的组合物以减轻癌症症状。如本文所使用的，“减轻癌症症状”是指改善与癌症相关的任何病症或症状。与等同的未经处理的对照相比，如同通过任何标准技术测量的，该减轻为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％以上。用于向受试者给予本文所述组合物的多种方法是本领域技术人员已知的。此类方法可包括但不限于口服给予、肠胃外给予、静脉内给予、肌内给予、皮下给予、透皮给予、呼吸道(气雾剂)给予、肺部给予、皮肤给予、局部给予、注射给予或瘤内给予。给予可以是局部的或全身的。在任何方面的一些实施方式中，给予是皮下给予。
如本文所使用的术语“有效量”是指减轻疾病或紊乱的至少一种或多种症状所需的至少一种嵌合分子的量，并且涉及足以提供期望效果的药理学组合物的量。因此，术语“治疗有效量”是指当给予典型受试者时足以提供特定抗癌效果的至少一种嵌合分子的量。在各种情况下，本文所使用的有效量还将包括足以延迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不实际的。然而，对于任何给定情况，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定合适的“有效量”。
有效量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(对群体的50％而言致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的程序。剂量可以根据使用的剂型和使用的给予途径而变化。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比值LD50/ED50。表现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量可以从细胞培养物测定开始估算。另外，可以在动物模型中制定剂量以达到包括在细胞培养中或合适的动物模型中确定的IC50(即活性成分的浓度，其达到症状的半最大抑制)的循环血浆浓度范围。可以通过例如高效液相色谱来测量血浆中的水平。任何特定剂量的效果可以通过合适的生物测定法来监测，例如肿瘤生长测定等。剂量可由医师确定，并根据需要进行调整以适应所观察到的治疗效果。
有效量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定，例如用于确定最小有效剂量和/或最大耐受剂量。剂量可根据所采用的剂型和所采用的给药途径而变化。治疗有效剂量可以从细胞培养物测定开始估计。另外，可以在动物模型中制定剂量以达到最小有效剂量和最大耐受剂量之间的剂量范围。任何特定剂量的效果可以通过合适的生物测定法来监测，例如肿瘤生长和/或大小的测定等。剂量可由医师确定，并根据需要进行调整以适应所观察到的治疗效果。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的至少一种嵌合分子作为单一疗法给药，例如，不向受试者给予针对癌症的另一治疗。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法可以进一步包括向受试者给予第二试剂和/或治疗，例如作为组合疗法的一部分。在任何方面的一些实施方式中，第二试剂是紫杉醇。在本文所述的任何方面的一些实施方式中，第二试剂是紫杉烷(例如多西紫杉醇或紫杉醇)。
第二试剂和/或治疗的非限制性实例可包括放射疗法、手术、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂、硼替佐米、AMG479、伏立诺他、利妥昔单抗、替莫唑胺、雷帕霉素、ABT-737、PI-103；烷化剂，例如噻替哌和
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环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylmelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；多聚乙酰(acetogenins)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycins)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、novembichin、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosoureas)，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωIl(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；双膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycins)、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、caminomycin、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
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阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、quelamycin、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；地美可辛；亚胺醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类化合物(maytansinoids)，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；甲基苄肼；
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多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和anguidine)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类化合物(taxoids)，例如
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紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、
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紫杉醇的无Cremophor的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，I11.)和
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doxetaxel(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；
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吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE.RTM.长春瑞滨；盐酸米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨；combretastatin；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb.RTM.)；减少细胞增殖的VEGF-A和PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如厄洛替尼
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)，以及上述任一者的药学上可接受的盐、酸或者衍生物。
此外，治疗方法可以进一步包括使用放射或放射疗法。此外，治疗方法可以进一步包括使用手术治疗。
在某些实施方式中，可将有效剂量的包含至少一种本文所述的嵌合分子的组合物一次性给予患者。在某些实施方式中，可向患者重复给予有效剂量的包含至少一种嵌合分子的组合物。对于全身给药，可向受试者给予治疗量的包含至少一种嵌合分子的组合物，例如诸如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。
在任何方面的一些实施方式中，在初始治疗方案(initial treatment regimen)之后，可以基于较低频率给予治疗。例如，每两周治疗进行三个月后，可以每月重复一次治疗，持续六个月或一年或更长时间。根据本文所述方法的治疗可以使病症的症状或标志物的水平(例如肿瘤大小或生长速率)降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。
如本文所述的组合物的剂量可以由医师确定，并可根据需要进行调整以适合所观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，熟练的临床医生通常会监测受试者，以确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、增加或减少给药频率、中止治疗、恢复治疗或对治疗方案进行其它更改。取决于许多临床因素(例如受试者对至少一种嵌合分子的敏感性)，给药时间表(dosing schedule)可以从一周一次到每天一次。活化的期望剂量或量可以一次给予，或分为亚剂量(例如2-4个亚剂量)并在一段时间内(例如以一天中的适当间隔或其它合适的时间表)给予。在任何方面的一些实施方式中，给予可以是长期的，例如在数周或数月的时间内每天给予一次或多次剂量和/或治疗。给药和/或治疗时间表的实例是在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长的时间段内每天、每天两次、每天三次或每天四次或更多次给予。可以在一段时间内(例如在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟的时间段内)给予包含至少一种嵌合分子的组合物。
根据本文所述的方法，至少一种嵌合分子的给药剂量范围取决于例如至少一种嵌合分子的形式、其效力以及期望将本文所述病症的症状、标志物或指标减少的程度(例如就肿瘤大小或生长速率而言的期望的减少百分比)。剂量不应太大以致引起不良副作用。通常，剂量将随患者的年龄、状况和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可以由个体医师进行调整。
熟练的临床医生可以确定至少一种嵌合分子在例如治疗本文所述的病症或诱导本文所述的响应(例如肿瘤大小和/或生长速率的减小)中的功效。然而，如果在根据本文所述方法的治疗后，本文所述病症的一种或多种症状或迹象(signs)以有益的方式改变、其它临床上可接受的症状改善或甚至缓解、或诱导了期望的响应(例如至少10％)，则如本文所使用的术语，该治疗被视为“有效治疗”。可以例如通过测量根据本文所述方法治疗的病症的发生率、标志物、指标和/或症状或任何其它合适的可测量参数(例如癌细胞存活率)来评估功效。通过住院治疗或需要医学干预评估的个体恶化的失败(即疾病进展停止)也可以测量功效。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)恶化；或(2)减轻疾病的严重程度，例如引起症状消退。对于疾病治疗而言的有效量是指当给予有需要的受试者时足以产生对该疾病而言的如本文所定义的术语的有效治疗的量。可以通过评估期望的响应或病症的物理指标来确定试剂的功效。通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测给药和/或治疗的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。可以在本文所述病症的动物模型中评估功效，例如癌症的治疗。当使用实验动物模型时，当观察到标志物(例如在癌细胞中所靶向的基因)的统计学显著变化时，治疗的功效得以证明。
本文提供了体外和动物模型测定，使得能够评估给定剂量的至少一种嵌合分子。作为非限制性实例，可以通过癌细胞表达分析或存活率来评估至少一种嵌合分子的剂量的影响。还可以在动物模型(例如癌症小鼠模型)中评估给定剂量组合的功效。
为了方便起见，以下提供说明书、实施例和所附权利要求中使用的一些术语和短语的含义。除非另有说明或从上下文暗示，否则以下术语和短语包含下面提供的含义。提供这些定义是为了帮助描述特定实施方式，并且不旨在限制要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如果本领域术语的使用与本文提供的定义之间存在明显差异，以说明书中提供的定义为准。
为了方便起见，在此收集本文在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
术语“减少”、“降低”、“下降”或“抑制”在本文中全部用于意指统计学上显著的量的减少。在任何方面的一些实施方式中，“降低”、“下降”或“减少”或“抑制”通常表示与参考水平(例如不存在给定治疗或试剂)相比，降低至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所使用的，“减少”或“抑制”不包括与参考水平相比完全的抑制或减少。“完全抑制”是与参考水平相比的100％抑制。降低可以优选降低至在例如对没有给定紊乱的个体而言的正常范围内所接受的水平。
术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活/活化”在本文中全部用于意指统计学上显著的量的增加。在任何方面的一些实施方式中，术语“增加的”、“增加”、“增强”或“激活/活化”可以表示与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或直到并包括100％的增加，或者与参考水平相比在10％至100％之间的任何增加，或者至少约2倍、或者至少约3倍、或者至少约4倍、或者至少约5倍、或者至少约10倍的增加，或者与参考水平相比在2倍至10倍或更大倍数之间的任何增加。在标志物或症状的背景中，“增加”是这种水平的统计学上显著的增加。
如本文所使用的，“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家养动物或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家养动物和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛；猫科动物，例如家猫；犬科动物，例如狗、狐狸、狼；禽类，例如鸡、鸸鹋、鸵鸟；以及鱼类，如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在任何方面的一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物(例如人)。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。受试者可以是雄性或雌性。
受试者可以是先前已经诊断为或被认定正在遭受或患有需要治疗的病症(例如癌症)或者一种或多种与这种病症相关的并发症，并且任选已经接受了癌症或者与癌症相关的一种或多种并发症的治疗的受试者。或者，受试者也可以是先前未被诊断为患有癌症或者与癌症相关的一种或多种并发症的受试者。例如，受试者可以是显示出癌症或者与癌症相关的一种或多种并发症的一种或多种危险因素的受试者，或者可以是未表现出危险因素的受试者。
针对特定病症的“需要治疗的受试者”可以是患有该病症的受试者、被诊断为患有该病症的受试者或处于发展出该病症的风险中的受试者。
如本文所使用的，本文可以互换使用的术语“蛋白质”和“多肽”指代通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列氨基酸残基。术语“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，包括经修饰的氨基酸(例如磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物，不管其大小或功能。“蛋白质”和“多肽”通常用于提及相对大的多肽，而术语“肽”通常用于提及小的多肽，但是本领域中这些术语的使用重叠。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。因此，示例性的多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其它等价物、变体、片段和类似物。
在任何方面的一些实施方式中，在进一步考虑之列的是涵盖所描述的任何具体多肽的变体(天然存在的或其它的变体)、等位基因、同源物、保守修饰变体和/或保守置换变体。对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，当改变引起将氨基酸置换为化学上类似的氨基酸并保留了多肽的期望活性时，对经编码的序列中的单个氨基酸或低百分比的氨基酸进行改变的核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个置换、缺失或添加是“保守修饰变体”。此类保守修饰变体在与本公开相一致的多态变体、种间同源物和等位基因的基础之上另外存在，并且不排除与本公开相一致的多态变体、种间同源物和等位基因。
给定氨基酸可以被具有相似理化特性的残基替代，例如，将一个脂肪族残基置换为另一脂肪族残基(例如用Ile、Val、Leu或Ala互相置换)，或将一个极性残基置换为另一极性残基(例如Lys和Arg之间；Glu和Asp之间；或Gln和Asn之间)。其它这样的保守置换(例如置换具有类似疏水性特征的整个区域)是公知的。可以通过本文所述的任何一种测定法对包含保守氨基酸置换的多肽进行测试，以确认保留了期望活性(例如天然或参考多肽的结合活性和特异性)。
氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分组(在A.L.Lehninger，Biochemistry，第二版，pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)中)：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，可基于共同的侧链特性将天然存在的残基分为如下的组：(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。非保守置换牵涉到将这些类别之一的成员更换为另一类别。具体的保守置换包括例如：将Ala置换为Gly或置换为Ser；将Arg置换为Lys；将Asn置换为Gln或置换为His；将Asp置换为Glu；将Cys置换为Ser；将Gln置换为Asn；将Glu置换为Asp；将Gly置换为Ala或置换为Pro；将His置换为Asn或置换为Gln；将Ile置换为Leu或置换为Val；将Leu置换为Ile或置换为Val；将Lys置换为Arg、置换为Gln或置换为Glu；将Met置换为Leu、置换为Tyr或置换为Ile；将Phe置换为Met、置换为Leu或置换为Tyr；将Ser置换为Thr；将Thr置换为Ser；将Trp置换为Tyr；将Tyr置换为Trp；和/或将Phe置换为Val、置换为Ile或置换为Leu。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述多肽(或编码此类多肽的核酸)可以是本文所述氨基酸序列之一的功能片段。如本文所使用的，“功能片段”是根据本文在下文所述的测定保留了至少50％的野生型参考多肽的活性的肽的片段或节段。功能片段可包含本文公开序列的保守置换。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的多肽可以是本文所述的序列的变体。在任何方面的一些实施方式中，变体是保守修饰变体。保守置换变体可以通过例如天然核苷酸序列的突变获得。本文所指的“变体”是与天然多肽或参考多肽实质上同源的多肽，但该多肽由于一个或多个缺失、插入或置换而具有与天然多肽或参考多肽不同的氨基酸序列。编码变体多肽的DNA序列涵盖这样的序列：当与天然DNA序列或参考DNA序列相比时，所述序列包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或置换，但是该序列编码保留活性的变体蛋白或其片段。多种基于PCR的位点特异性诱变方法在本领域中是已知的，并且可被本领域普通技术人员应用。
变体氨基酸或DNA序列可以与天然或参考序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的同一性。天然序列和突变序列之间的同源性程度(同一性百分比)可以通过例如使用万维网上通常用于此目的的免费可用的计算机程序(例如具有默认设置的BLASTp或BLASTn)对两个序列进行比较来确定。
天然氨基酸序列的改变可通过本领域技术人员已知的多种技术的任一种来完成。例如，可通过合成含有突变序列的寡核苷酸(其侧接有允许与天然序列的片段连接的限制性位点)而在特定基因座处引入突变。连接后，所得到的重构序列编码具有期望的氨基酸插入、置换或缺失的类似物。或者，可使用寡核苷酸指导的位点特异性诱变方法来提供具有根据所需的置换、缺失或插入而改变的特定密码子的改变的核苷酸序列。用于进行此类改变的技术已经充分建立，包括例如由Walder等(Gene 42:133，1986)；Bauer等(Gene 37:73，1985)；Craik(BioTechniques，1985年1月，12-19)；Smith等(Genetic Engineering:Principles and Methods，Plenum Press，1981)；以及美国专利No.4,518,584和4,737,462公开的技术，通过引用将它们整体并入本文。通常还可用丝氨酸置换不参与维持多肽的适当构象的任何半胱氨酸残基，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至多肽，以改进其稳定性或促进寡聚化。
如本文所使用的，术语“核酸”或“核酸序列”是指掺入了核糖核酸、脱氧核糖核酸或它们的类似物的单元的任何分子，优选聚合物分子。核酸可为单链或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条核酸链。或者，单链核酸可为不源自任何双链DNA的单链核酸。在一方面，核酸可为DNA。在另一方面，核酸可为RNA。合适的DNA可包括例如基因组DNA或cDNA。合适的RNA可包括例如mRNA。
术语“表达”是指在产生RNA和蛋白质以及适当时产生分泌蛋白质中所涉及的细胞过程，包括(在可适用时)但不限于例如转录、转录加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。表达可以指源自本发明的一个或多个核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累；和/或可以指mRNA翻译成多肽。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的生物标志物、靶标或基因/多肽的表达是组织特异性的。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的生物标志物、靶标或基因/多肽的表达是全局的(global)。在任何方面的一些实施方式中，本文所述的生物标志物、靶标或基因/多肽的表达是全身性的(systemic)。
“表达产物”包括转录自基因的RNA以及通过转录自基因的mRNA的翻译而获得的多肽。术语“基因”意为当可操作地连接至合适的调控序列时，在体外或在体内转录(DNA)成RNA的核酸序列。基因可以包含或可以不包含编码区域之前和之后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)序列或“前导”序列以及3’UTR序列或“尾随”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
在本发明的上下文中，“标志物”是指这样的表达产物(例如核酸或多肽)：与取自对照受试者(例如健康受试者)的可比样本相比，该表达产物在取自患有癌症的受试者的样本中差异性地存在。术语“生物标志物”与术语“标志物”可互换使用。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的方法涉及测量、检测或确定至少一种标志物的水平。如本文所使用的，术语“检测”或“测量”是指观察来自例如探针、标记或靶分子的信号，以指示样品中分析物的存在。可以使用本领域已知的用于检测特定标记部分的任何方法进行检测。示例性的检测方法包括但不限于光谱方法、荧光方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法、电学方法、光学方法或化学方法。在任何方面的一些实施方式中，测量可以是定量观察。
在任何方面的一些实施方式中，可对本文所述的多肽、核酸或细胞进行工程化。如本文所使用的，“经工程化的/工程化”是指已进行人为操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面(例如其序列)已进行人为操纵以使该方面与天然存在的方面不同时，认为该多肽为“经工程化的”。作为通常实践并且本领域技术人员理解的是，即使实际操作是在先前的实体上进行，经工程化的细胞的后代通常仍称为“经工程化的”。
如本文所使用的术语“治疗”、“疗法”、“处理”或“缓解”是指治疗性的处理，其中目的是逆转、减轻、缓解、抑制、减缓或停止与疾病或紊乱(例如癌症)有关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减弱或减轻与癌症相关的病症、疾病或紊乱的至少一种不利作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减弱或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与没有治疗时预期的情况相比，停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、缓解或缓和疾病状态、舒缓(不论部分或全部)和/或降低死亡率，无论是可检测的或不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的救济(包括姑息治疗)。
如本文所使用的，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的载体(例如药学工业中常用的载体)联合。短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过多的毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是水以外的载体。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是乳膏(cream)、乳液、凝胶、脂质体、纳米颗粒和/或软膏(ointment)。在任何方面的一些实施方式中，药学上可接受的载体可以是人工载体或工程化载体，例如，不会发现活性成分天然存在或在自然中存在的载体。
如本文所使用的，术语“给予/给药”是指通过引起药剂在期望部位的至少部分递送的方法或途径将本文公开的化合物置于受试者中。包含本文公开的化合物的药物组合物可以通过任何产生受试者的有效治疗的适当的途径给予。在任何方面的一些实施方式中，给予包括人类的身体活动，例如注射、摄入动作、施用动作和/或对输送装置或机器的操纵。此类活动可以例如由医学专业人员和/或受治疗的受试者来进行。
如本文所使用的，“接触”是指用于将试剂递送或暴露于至少一个细胞的任何合适的方式，示例性的递送方法包括但不限于直接递送至细胞培养基、灌注、注射或本领域技术人员已知的其它递送方法。在任何方面的一些实施方式中，接触包括人类的身体活动，例如注射；分配、混合和/或倾倒的动作；和/或对递送装置或机器的操纵。
术语“统计学上显著”或“显著地”是指统计显著性，并且通常意指两个标准偏差(2SD)或更大的差异。
除了在操作实例中或另有指示的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比相连使用时，术语“约”可以表示±1％。
本文所使用的术语“包含/包括/含有”表示除了所呈现的限定要素之外，其它要素也可存在。“包含/包括/含有”的使用表明包括而非限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及它们的相应组件，其排除了在该实施方式的描述中没有列举的任何要素。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的实施方式的基础和新颖性或功能性特征的额外的要素的存在。
如本文所使用的，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的化学相互作用，其中，与第一实体结合至作为非靶标的第三实体相比，第一实体以更高的特异性和亲和力与第二靶实体结合。在任何方面的一些实施方式中，特异性结合可以指第一实体针对第二靶实体的亲和力是第一实体针对第三非靶实体的亲和力的至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更大。对于给定靶标具有特异性的试剂是在所使用的测定的条件下对该靶标表现出特异性结合的试剂。
除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一个/一种”和“该/所述”包括复数指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，词语“或”旨在包括“和”。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料，下面描述了合适的方法和材料。缩写“e.g.”源自拉丁文exempli gratia，并在此用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”同义。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可单独地提及和请求保护或者与本文出现的该组其它成员或其它要素任意组合地来提及和请求保护。出于方便和/或专利性的原因，组的一个或多个成员可被包含在组中或从组中删除。当任何此类包含或删除发生时，本文认为本申请文件包含经修饰的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
除非本文另有明确定义，与本申请相关使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。应理解的是，本发明不限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂等，并且这些可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不打算限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书所定义。免疫学和分子生物学中的常用术语的定义可见于The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第20版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2018(ISBN0911910190,978-0911910421)，RobertS.Porter等(编)；The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and MolecularMedicine，Blackwell Science Ltd.出版，1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及RobertA.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology byWerner Luttmann，由Elsevier出版，2006；Janeway's Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编)，W.W.Norton&Company，2016(ISBN 0815345054,978-0815345053)；Lewin's Genes XI，由Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.,USA(2012)(ISBN1936113414)；Davis等，Basic Methods in MolecularBiology，Elsevier Science Publishing Inc.，New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA，Jon Lorsch(编)，Elsevier，2013(ISBN0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)，Frederick M.Ausubel(编)，John Wiley and Sons，2014(ISBN 047150338X,9780471503385)；CurrentProtocols in Protein Science(CPPS)，John E.Coligan(编)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA MKruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe(编)John Wiley andSons,Inc.,2003(ISBN0471142735,9780471142737)；通过引用将它们的内容全部整体并入本文。
本领域技术人员可以容易地鉴别使用的化疗剂(例如参见Physicians'CancerChemotherapy Drug Manual 2014，Edward Chu，Vincent T.DeVita Jr.，Jones&BartlettLearning；Principles of Cancer Therapy,Chapter 85in Harrison's Principles ofInternal Medicine，第18版；Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era ofMolecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology，Chs.28-29in Abeloff’sClinical Oncology，2013Elsevier；以及Fischer D S(编):The Cancer ChemotherapyHandbook，第4版，St.Louis，Mosby-Year Book，2003)。
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的公开内容并不关注用于克隆人的方法、用于改变人生殖系遗传同一性的方法、人胚胎的工业或商业目的应用；或者可能导致动物痛苦而对人或动物没有任何实质性医疗益处的用于改变动物遗传同一性的方法；以及由这些方法产生的动物。
本文在本发明的各个方面的描述内定义了其它术语。
出于描述和公开的目的，将本申请全文中引用的所有专利和其它出版物，包括参考文献、授权专利、公开的专利申请以及共同未决的专利申请以引用的方式明确地并入本文，例如，在此类出版物中描述的可与本文所述技术关联使用的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面没有任何内容应被视作承认本发明人没有资格借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开提前。所有关于这些文件的日期的声明或关于这些文件的内容的表述是基于申请人可获得的信息，并不构成关于这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
本公开的实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文中出于说明的目的描述了本公开的具体实施方式和实例，但是相关领域的技术人员将认识到，在本公开的范围内的各种等同的修改是可能的。例如，虽然方法步骤或功能以给定顺序呈现，但替代实施方式可以以不同的顺序执行功能，或者可以实质上同时执行功能。本文提供的公开的教导可适当地应用于其它程序或方法。本文描述的各种实施方式可以组合以提供进一步的实施方式。如果需要，可以修改本公开的各方面以使用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的进一步的实施方式。此外，出于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物学作用或化学作用的种类或量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据具体描述对本公开做出这些改变以及其它改变。所有这些修改均旨在被包括在所附的权利要求的范围内。
任何前述实施方式的特定要素可以被其它实施方式中的要素结合或替代。此外，尽管已经在这些实施方式的上下文中描述了与本公开的某些实施方式相关的益处，其它实施方式也可以表现出这样的益处，并且并非所有实施方式都需要必须展现出此类益处才能落入本公开的范围内。
通过以下实例进一步说明本文所述的技术，所述实例不应以任何方式被解释为进一步限制。
本文所述技术的一些实施方式可以根据以下编号段落中任一者来定义：
1.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。
2.如段落1所述的分子，其中，所述分子为适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
3.如段落1-2中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸与所选基因的基因产物特异性结合。
4.如段落1-3中任一项所述的分子，其中，所述结合EpCAM的适体结构域包含SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列。
5.如段落1-4中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域包含选自于SEQID NO：1-SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126的序列或它们的反向互补序列。
6.如段落1-5中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域。
7.如段落6所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，但各自抑制相同基因的表达。
8.如段落6所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域各自抑制不同基因的表达。
9.如段落8所述的分子，其中，至少第二抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
PLK1和MCL1。
10.如段落1-9中任一项所述的分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO：127-SEQ IDNO：137中的一者的序列。
11.如段落1-10中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子的3'末端包含dTdT。
12.如段落1-11中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含至少一个2'-F嘧啶。
13.如段落1-12中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子进一步包含化疗剂。
14.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含如段落1-13中任一项所述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体。
15.如段落14所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少两种嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。
16.如段落15所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域识别不同的靶标。
17.如段落15所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域具有不同的序列并识别相同的靶标。
18.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含：
a.如段落1-13中任一项所述的第一嵌合分子；
b.第二嵌合分子，所述第二嵌合分子包含：i.如段落1-13中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第二嵌合分子的抑制性核酸结构域与所述第一嵌合分子相比抑制不同基因的表达；或者ii.嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达；以及
c.任选的药学上可接受的载体。
19.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予如段落1-18中任一项所述的嵌合分子、组合物、试剂盒或组合。
20.如段落19所述的方法，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌、结肠癌或三阴性乳腺癌。
21.如段落19-20中任一项所述的方法，其中，所述给予为皮下给予。
22.如段落19-21中任一项所述的方法，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
23.如段落22所述的方法，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
24.如段落1-18中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，所述嵌合分子、组合物或试剂盒用于在在有需要的受试者中治疗癌症的方法中使用，所述方法包括向所述受试者给予所述嵌合分子。
25.如段落24所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌、结肠癌或三阴性乳腺癌。
26.如段落24-25中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述给予为皮下给予。
27.如段落24-26中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
28.如段落24-26中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒在与所述嵌合分子相同或不同的制剂中进一步包含额外的癌症治疗。
29.如段落27-28中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
本文所述技术的一些实施方式可以根据以下编号段落中任一者来定义：
1.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。
2.如段落1所述的分子，其中，所述基因选自于由如下基因所组成的组：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
3.如段落1所述的分子，其中，所述基因选自于由如下基因所组成的组：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
4.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述分子为适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
5.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸与所选基因的基因产物特异性结合。
6.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述结合EpCAM的适体结构域包含SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列。
7.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域包含选自于SEQID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列或它们的反向互补序列。
8.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域。
9.如段落8所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，但各自抑制相同基因的表达。
10.如段落8所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域各自抑制不同基因的表达。
11.如段落10所述的分子，其中，至少第二抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
PLK1和MCL1。
12.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO：127-SEQ IDNO：137或SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列。
13.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述分子为单链核酸。
14.如段落1-12中任一项所述的分子，其中，所述分子包含双链部分。
15.如段落14所述的分子，其中，所述双链部分包含彼此杂交的两种独立的核酸或包含单一核酸；在所述单一核酸中，所述单一核酸的两个部分彼此杂交(例如发夹结构)。
16.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子的3'末端包含dTdT。
17.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含至少一个2'-F嘧啶。
18.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含2'糖修饰、硫代磷酸酯骨架修饰和5'未锁核酸修饰中的一种或多种。
19.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子与胆固醇、PEG或脂质体缀合或结合。
20.如前述段落中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子进一步包含化疗剂。
21.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含如段落1-20中任一项所述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体。
22.如段落21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少两种不同的如段落1-20中任一项所述的嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。
23.如段落21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域识别不同的靶标。
24.如段落21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域具有不同的序列并识别相同的靶标。
25.如段落21-24中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如段落1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47；并且
如段落1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。
26.如段落21-25中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如段落1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47；并且
如段落1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
27.如段落21-26中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少六种不同的如段落1-20所述的嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
28.如段落21-27中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如段落1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47；并且
如段落1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
29.如段落21-28中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少四种不同的如段落1-20所述的嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
30.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含：
a.如段落1-20中任一项所述的第一嵌合分子；
b.第二嵌合分子，所述第二嵌合分子包含：i.如段落1-20中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第二嵌合分子的抑制性核酸结构域与所述第一嵌合分子相比抑制不同基因的表达；或者ii.嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达；以及
c.任选的药学上可接受的载体。
31.如段落21-30中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合进一步包含免疫检查点抑制剂。
32.如段落31所述的组合物、试剂盒或组合，其中，免疫检查点蛋白为PD-1或PD-L1。
33.如段落32所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述免疫检查点蛋白为PD-1。
34.如段落33所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述免疫检查点抑制剂为派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab或AUNP12。
35.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予如段落1-34中任一项所述的嵌合分子、组合物、试剂盒或组合。
36.如段落35所述的方法，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌或结肠癌。
37.如段落36所述的方法，其中，所述乳腺癌为HER2+或三阴性乳腺癌(TNBC)。
38.如段落36所述的方法，其中，所述乳腺癌不是BRCA1缺陷型的。
39.如段落35-38中任一项所述的方法，其中，所述给予为皮下给予。
40.如段落35-39中任一项所述的方法，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
41.如段落40所述的方法，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
42.如段落1-34中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，所述嵌合分子、组合物或试剂盒用于在在有需要的受试者中治疗癌症的方法中使用，所述方法包括向所述受试者给予所述嵌合分子。
43.如段落42所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌或结肠癌。
44.如段落43所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述乳腺癌为HER2+或三阴性乳腺癌(TNBC)。
45.如段落44所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述乳腺癌不是BRCA1缺陷型的。
46.如段落42-46中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述给予为皮下给予。
47.如段落42-46中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
48.如段落42-47中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒在与所述嵌合分子相同或不同的制剂中进一步包含额外的癌症治疗。
49.如段落42-48中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
实施例
实施例1：使用EpCAM适体-siRNA介导的基因敲低增强三阴性和HER+2乳腺癌的免疫疗法。
本文描述了EpCAM适体和siRNA的缀合物，该缀合物为两个RNA分子。末端是互补的并且相互结合。一旦该缀合物进入细胞，Dicer酶就会破坏双链RNA，释放siRNA以敲除其互补mRNA——有效地关闭所靶向的基因。现有技术还无法很好地治疗三阴性和HER2乳腺癌，本文所述的组合物解决了这一需求。
三阴性(TNBC)和HER2+乳腺癌(BC)是预后最差的特别具有侵袭性的肿瘤。它们在化疗或靶向疗法后容易复发和转移。在某些癌症中已经取得显著治疗益处的免疫疗法为治疗预后不良的BC提供了一种有前途但未经证实的替代方法。BC具有相对较低的非同义突变率，这使得它们中的大多数免疫原性较差。增加BC细胞免疫原性并改善肿瘤抗原特异性T细胞应答的新策略对于提高BC免疫疗法的功效而言至关重要。
本文描述了通过利用携带EpCAM适体的小干扰RNA(AsiC)的独特力量来增加乳腺肿瘤的免疫原性的方法。EpCAM-AsiC可以选择性地在EpCAM+BC肿瘤细胞中特异性敲低任何基因产物，包括细胞内靶标和无成药性的靶标。免疫调节性EpCAM-AsiC靶向参与癌症-免疫循环的不同功能过程中的基因(这使得侵袭性BC对T细胞可见)，改善T细胞肿瘤募集和功能，并由此增强抗肿瘤免疫应答。
这些皮下(sc)给药的AsiC被机体中带有被适体识别的受体的远处部位的细胞选择性摄取。在细胞内，AsiC被RNA干扰核酸酶Dicer切割，释放出活性siRNA，从而导致有效的基因敲低。与正常的上皮细胞相比，EpCAM是在所有上皮癌(包括97％的BC及其“癌症干细胞”)上以高出若干log值的水平表达的肿瘤特异性抗原。本文描述了高亲和力EpCAM-AsiC，其使用以低纳摩尔亲和力结合小鼠和人类EpCAM的EpCAM适体。这些EpCAM-AsiC选择性地积聚在EpCAM+BC中，但不会在正常组织中积聚。为了在临床上有用，EpCAM-AsiC需要被远处的肿瘤摄取。在小鼠中，皮下注射的EpCAM-AsiC在远处的EpCAM+而非EpCAM-TNBC异种移植物中浓缩，并在那里持续至少4天。
通过敲低控制不同功能过程的基因，探索了EpCAM-AsiC用于BC免疫调节的用途。1)无义介导的mRNA衰变(NMD)是进化上保守的监控机制，其检测和降解包含提前终止密码子(PTC)的mRNA，PTC可能由不同的基因突变和移码引起。如果这些mRNA被翻译，则会产生具有异常功能的截短蛋白。UPF2是NMD中的关键酶。敲低EpCAM+BC细胞中的UPF2将导致它们表达和呈递T细胞识别的新抗原。如本文所述，UPF2 EpCAM-AsiC可以增强(boost)抗肿瘤T细胞应答。
2)PARP1参与DNA损伤的检测、DNA修复和基因组稳定性的维持。PARP1抑制导致染色体异常，并可能导致整体基因组不稳定。APE1的主要功能是修复碱基切除修复(BER)中的脱碱基位点。此外，APE1作为还原-氧化调节剂起作用，在肿瘤细胞存活中起关键作用。根据本文所述方法敲低肿瘤细胞中的DNA修复酶PARP1和APE1可以产生更多与DNA链断裂相关的突变，从而将肿瘤特异性新抗原引入免疫系统。此外，抑制APE1的氧化还原活性可以直接阻遏肿瘤生长。本文证明Parp1-AsiC和APE1-AsiC均显著阻遏肿瘤进展并增强CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的功能。PARP1-AsiC在进一步抑制4T1E(具有高EpCAM表达的4T1细胞系)乳腺肿瘤生长方面也优于FDA批准的药物奥拉帕尼。
3)肿瘤细胞通过上调CD47来逃避免疫监控，CD47结合至巨噬细胞和树突细胞(DC)上的信号调节蛋白(SIRP)a，抑制吞噬作用和抗原交叉呈递。动物研究表明抗CD47疗法通过促进TA向T细胞的交叉呈递而增强抗肿瘤免疫力、阻遏肿瘤生长并与化疗和放疗协同作用。本文证明CD47-AsiC提高CD8+TIL/调节性T细胞(Treg)的比例，降低共抑制剂表达并改善CM+TIL的功能，阻遏4T1E肿瘤生长。来自CD47-AsiC处理的肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)显示出改善的吞噬能力。这进一步证明CD47-AsiC在阻遏4T1E肿瘤生长方面优于抗CD47抗体。
4)本数据显示，靶向BC细胞赖以生存的必需基因PLK1和MCL1的EpCAM-AsiC直接杀死肿瘤细胞。PLK1是一种丝氨酸苏氨酸激酶，对有丝分裂和维持DNA完整性至关重要。MCL1通过隔离(sequestering)凋亡效应物Bak和其它促凋亡蛋白起作用，并且是TNBC中的关键生存因子。PLK1和MCL1在BC细胞中均过表达。PLK1或MCL1敲低诱导的肿瘤细胞死亡增加可以促进肿瘤细胞死亡和肿瘤抗原向CD8+T细胞的交叉呈递二者，从而改善抗肿瘤T细胞应答。本数据显示PLK1和MCL1EpCAM-AsiC减缓肿瘤生长并提高CD8+TIL的数量和功能。
最后，证明了与单一AsiC处理相比，UPF2、CD47、PARP1、PLK1和MCL1 AsiC协同工作以进一步延迟肿瘤生长并甚至导致肿瘤消退。联合疗法显著增加了CD8+TIL的量，减少了肿瘤中的Treg和髓源性抑制细胞(MDSC)，并改善了CD4+和CD8+TIL二者的功能。
据我们所知，AsiC不像抗体那样诱导免疫应答。通过调节肿瘤而不是系统性激活T细胞，我们可以避免将多种检查点抑制剂联合时出现的令人担忧的自身免疫副作用。靶向肿瘤依赖性基因的细胞毒性siRNA可以很容易地与免疫调节性siRNA联合。所有上皮癌及其干细胞均高度表达EpCAM。因此，本文描述的治疗乳腺癌的方法可应用于其它治疗不佳的实体瘤和任何上皮癌——即肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、食管癌、胆管癌。
免疫调节性EpCAM-AsiC对于重振免疫应答和治疗免疫原性较低的BC而言具有巨大潜力。重要的是，与检查点阻断抗体相比，EpCAM-AsiC缀合物具有高亲和力和肿瘤选择性，可降低毒性。此外，这些药物为小分子，可扩散到血管化不良的肿瘤中。本数据表明，与当前的检查点抑制剂药物相比，这些新型EpCAM-AsiC凭借其小尺寸和高选择性而具有提高治疗效果和降低BC患者毒性的巨大潜力。
实施例2
AsiC解决了肝以外的递送问题，并且仅在所靶向的细胞中提供精确的特异性药物摄取和敲低。就像小分子一样，皮下给药可渗透所有组织，而且AsiC在血清中可稳定数天。AsiC提供持久的敲低，具有与其它基于siRNA的药物相同的有利药效动力学，没有明显毒性或免疫原性。化学合成利用现有的可用制造法，并可使用相同的化学方法将超过1种siRNA、miRNA、mRNA、毒素或化疗药物连接起来以制造多功能药物。
本文所述的AsiC包含EpCAM特异性适体，EpCAM在上皮癌中高度表达(图1)。EpCAM-AsiC实现的敲低效果提供了与EpCAM表达相关的抗肿瘤作用(图2)，并且TNBC细胞以比正常乳腺组织更高的比率摄取EpCAM-AsiC(图3)。Alexa750-EpCAM-AsiC被选择性摄取到EpCAM+肿瘤中(图6)。EpCAM-AsiC在体外癌症干细胞测定中抑制EpCAM+乳腺癌细胞系(图4)。EpCAM+TNBC细胞的离体处理防止肿瘤发生(图5)。靶向PLK1的EpCAM-AsiC抑制EpCAM+TNBC肿瘤生长(图7)。
EpCAM-AsiC敲低上皮乳腺癌细胞和其中的肿瘤起始细胞中的基因，而不影响正常上皮细胞。皮下注射的EpCAM-AsiC定位于远处的肿瘤。PLK1 EpCAM-AsiC在体外和体内阻遏肿瘤生长并消除肿瘤起始细胞。AsiC不会触发先天免疫。最常见的上皮肿瘤是EpCAM+(结肠、肺、前列腺、胰腺)。在HCT116结肠癌异种移植物中获得了类似结果。
本文描述的某些AsiC试图操纵抗肿瘤免疫(图8)。敲低UPF2以抑制RNA质量控制通路增强抗肿瘤免疫(图9A-图9E)。在4T1肿瘤中观察到类似效果，其在UPF2 EpCAM-AsiC处理后CD8+TIL水平增加(图10)。
通过敲低PARP1和APE1破坏DNA修复改善了肿瘤免疫(图11)。PARP1-AsiC的效果优于PARP1抑制剂药物奥拉帕尼(一种已批准用于一小部分乳腺癌的药物)以及奥拉帕尼+检查点抑制剂(抗PDL1)。用PARP1-AsiC来处理导致CD8+TIL增加并且这些细胞产生更多细胞因子。
靶向磷酸酶PTPN2增强了肿瘤的干扰素信号传导(图12)。PTPN2阻遏干扰素信号传导，并且PTPN2的缺失改善肿瘤抗原呈递和对肿瘤的T细胞应答。用PTPN2-AsiC来处理阻遏肿瘤生长，诱导CD8+TIL，增加肿瘤抗原呈递，并增加CD8+和CD4+TIL的功能(图12A-图12E)。
AsiC介导的CD47抑制也减少肿瘤生长(图13)。CD47-AsiC提高4TE-eGFP肿瘤的TAM体内吞噬作用(图14)并诱导抗肿瘤应答(图15A-图15B)。此外，在CD47-AsiC处理后，TIL表达较少的抑制性受体(图16)。CD47-AsiC提供比抗CD47抗体(II期临床试验中)更有效的治疗(图17)。
当联合时，AsiC显示出预料不到的协同作用(图18A-图18E、图21)。这种协同作用在携带4T1E肿瘤的小鼠(图22)和ErbB2ΔEx16+小鼠(图23和图24)的治疗中也很明显。
因为仅靶向肿瘤，所以AsiC疗法既有效又耐受良好。此外，靶标选择可以根据患者的肿瘤进行定制。AsiC疗法没有显示出明显的耐药性迹象(例如，没有阻遏EpCAM(图19))，并可用于治疗现有疗法不足以应对的常见实体瘤。
EpCAM-AsiC是一种用于仅在肿瘤中(包括在最具侵袭性的癌症干细胞子集中)选择性地敲低基因表达的灵活平台。可以使用基因敲低直接杀死肿瘤(PLK1、MCL1)。这些AsiC还增强了免疫应答(数据未显示)。还可以敲低肿瘤中的基因以超越检查点阻断——来调节多种途径以诱导免疫识别、激活功能失调的免疫细胞以及减少干扰保护作用的免疫阻遏性细胞。AsiC的混合物易于组装，并且可以协同作用以改善肿瘤控制。如本文所示，AsiC比阻断抗体或抑制剂药物更有效。
实施例3：通过肿瘤中的EpCAM适体靶向基因敲低进行的乳腺癌免疫疗法
介绍
三阴性乳腺癌(TNBC)和HER2+乳腺癌(BC)是预后最差的最具侵袭性的BC1,2。TNBC没有靶向疗法，很大一部分患者在化疗后复发并发生转移3。尽管HER2靶向疗法从根本上改善了HER2+BC治疗，但超过20％的患者在5年内出现复发性疾病4,5。因此，迫切需要可以提高侵袭性BC治疗效果的新策略。癌症免疫疗法在具有多种类型的癌症的患者中已表现出显著且持久的应答6。应答性癌症具有高体细胞突变率(即黑色素瘤和非小细胞肺癌约为100/Mb)，认为这有助于它们的免疫原性7。BC以前被视为免疫静止，这与它们的低非同义突变负荷(约1/Mb)有关，其对免疫疗法的敏感性在临床上尚未得到很好的研究7-9。然而，大量证据表明，BC肿瘤微环境(TME)处于免疫监控之下，免疫疗法已在某些BC中显示出功效。BC的基因表达谱表明，肿瘤中淋巴细胞相关基因或与I型干扰素(IFN-I)激活相关的基因的表达与更好的预后相关10,11。重要的是，与其它BC子集相比，TNBC和HER2+BC都具有更高的突变负荷，更多患者具有强大的肿瘤免疫浸润12,13。在TNBC和HER2+BC中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)水平的增加与更好的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)相关，TIL数量每增加10％与减少15-25％的复发和死亡的风险相关14-16。此外，一些常规化疗药物、靶向疗法和放疗的长期有效性取决于它们触发抗肿瘤T细胞的能力11。这些发现突显了开发有效的免疫治疗方法以改善患有侵袭性BC的患者的治疗结果的机会。
使用免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1/PD-L1抗体)代表了用于治疗侵袭性BC的最有希望的免疫治疗方法之一。与化疗药物nab-紫杉醇联合的抗PD-L1抗体阿特珠单抗(atezolizumab)已于2019年获批用于具有转移性TNBC的患者。然而，治疗益处仅限于少数患者13。对检查点抑制剂的应答性与肿瘤基因组稳定性、肿瘤新抗原表达和免疫识别有关17-22。许多BC对检查点阻断没有应答，主要是因为它们的低突变率导致免疫系统不能很好地识别乳腺肿瘤细胞。此外，检查点抑制剂非特异性地系统性激活T细胞并可能导致自身免疫副作用23。为了优化免疫疗法对BC治疗的功效，必须克服癌症-免疫循环中的许多挑战才能引发有效的抗肿瘤免疫24,25。例如，肿瘤细胞需要表达可被释放并被抗原呈递细胞(APC)摄取/呈递的新抗原，以启动和激活肿瘤抗原(TA)特异性T细胞。活化的T细胞还需要浸润至TME中并有效杀死呈递TA的靶肿瘤细胞。
为了实现这个目标，本发明人利用了携带EpCAM适体的小干扰RNA(siRNA)的独特力量。EpCAM适体-siRNA嵌合体(AsiC)可以选择性地在EpCAM+乳腺肿瘤细胞中特异性敲低任何基因产物，包括细胞内靶标和无成药性的靶标，使得侵袭性BC对T细胞可见，并由此增强抗肿瘤免疫应答。作为肿瘤相关抗原，与正常的上皮细胞相比，EpCAM在所有上皮癌(包括97％的BC及其“癌症干细胞”)上以高出若干log值的水平表达31-34。EpCAM表现出致癌潜力，因为它的表达与增强的肿瘤进展、骨转移和不良预后相关32，这可能使肿瘤细胞难以通过下调EpCAM来产生耐药性。本文所述的高亲和力EpCAM适体能够以低纳摩尔亲和力结合小鼠和人EpCAM二者。为了在临床上有用，EpCAM-AsiC需要被远处的肿瘤摄取。本发明人发现，在小鼠中，皮下(s.c.)注射的靶向PLK1(对BC细胞存活必不可少的丝氨酸-苏氨酸激酶)的EpCAM-AsiC可以选择性地在远处的EpCAM+而非EpCAM-TNBC异种移植物或正常组织中浓缩，并在那里持续至少4天26。在这些小鼠中，所有EpCAM+肿瘤完全消退，而用对照AsiC处理的小鼠中的EpCAM+肿瘤和所有EpCAM-肿瘤继续生长。此外，EpCAM-AsiC不会在所处理的小鼠中引起可测量的毒性，也不会刺激先天免疫应答26。这些实验证明了开发EpCAM-AsiC作为针对BC的免疫调节疗法的前景。
在此，为了增强BC细胞免疫原性，本发明人使用EpCAM-AsiC平台在EpCAM+BC细胞中敲低参与癌症-免疫循环的不同功能过程的基因，目的是使侵袭性BC对免疫系统可见并提高抗肿瘤免疫力。这些靶标包括：(1)在无义介导的mRNA衰变(NMD)通路中起作用的无义转录物2调节因子(UPF2)以及DNA修复酶聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)和脱嘌呤/脱嘧啶脱氧核糖核酸内切酶1(APEX1)，从而引发肿瘤新抗原表达；(2)“不要吃我(don’t eat me)”信号CD47，从而促进癌细胞的吞噬作用以及树突状细胞(DC)和巨噬细胞对它们的抗原呈递；(3)TNBC中的关键存活因子髓样细胞白血病1(MCL1)35-37，从而直接杀死肿瘤细胞以促进TA交叉呈递来激活CD8+T细胞，从而提高抗肿瘤T细胞应答；以及(4)程序性死亡配体1(PD-L1)，从而提高肿瘤浸润性PD-1+T细胞的功能。如本文所证明的，这些EpCAM-AsiC可以在体外和体内以高效率和高选择性敲低EpCAM+乳腺肿瘤细胞中的靶基因表达。使用小鼠原位(orthotopic)TNBC模型证明了靶向UPF2、PARP1、CD47和MCL1的四种EpCAM-AsiC中的每一种均显著阻遏乳腺肿瘤生长。PARP1和CD47AsiC在抑制肿瘤生长方面分别优于FDA批准的PARP1抑制剂奥拉帕尼和抗CD47抗体(其已进入多项临床试验)。这些免疫调节性EpCAM-AsiC还通过提高CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与CD4+调节性T细胞(Treg)的比率并增加CD8+和CD4+TIL的功能而强烈增强抗肿瘤免疫。
在机制上，UPF2敲低降低了EpCAM+肿瘤细胞中的NMD途径活性并促进了可编码新抗原的剪接变体mRNA的产生。CD47敲低促进了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤细胞的吞噬作用，增加了肿瘤阻遏性M1TAM与肿瘤促进性M2 TAM的比率，还增加了肿瘤浸润DC的数量和成熟度，所有这些都可以促进抗原呈递以激活T细胞。MCL1敲低直接降低了肿瘤细胞活力，这可以增加TA释放以刺激TA特异性T细胞。此外，与单一AsiC处理相比，四种EpCAM-AsiC协同工作并导致肿瘤生长更显著减少，还强烈抑制肺转移性BC生长。单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究表明联合的AsiC同时提高了单核细胞/巨噬细胞和TIL二者的抗肿瘤潜力。联合的AsiC进一步与抗PD-1协同作用，导致更显著的肿瘤抑制。最后，我们展示了靶向六个基因UPF2、PARP1、APEX1、CD47、MCL1和PD-L的EpCAM-AsiC的混合物同时阻遏了高侵袭性HER2+BC转基因小鼠模型中的肿瘤生长，表明利用免疫调节性EpCAM-AsiC作为有效的免疫治疗方法来对抗侵袭性BC的潜力。
结果
EpCAM适体-siRNA在EpCAM+小鼠BC细胞系中选择性引起基因敲低
为了研究EpCAM适体用于BC免疫疗法的细胞特异性基因敲低的用途，本发明人首先证实了荧光标记的EpCAM适体被小鼠EpCAM+BC细胞系(4T1、4T1E、N202.1A)而非EpCAM-小鼠细胞系(L929、P815、B16-F10)摄取(数据未显示)。假设敲低小鼠BC细胞系中可能增加肿瘤新抗原表达(Upf2、Parp1、Apex)、导致肿瘤细胞死亡(Mcl1)、增强肿瘤细胞的吞噬作用(Cd47)或阻遏检查点抑制(Cd274，编码PD-L1的基因)的基因可以增强抗肿瘤免疫。为了检验这一假设，本发明人设计了EpCAM适体-siRNA嵌合体(AsiC)以使用siRNA来敲低这些基因中的每一个，这些siRNA在使用100nM siRNA转染的4T1E TNBC中各自引起约90％的敲低(图32A)。除Mcl1 siRNA外，所有这些siRNA的转染对细胞活力或增殖没有影响(图32B)。
为了构建EpCAM-AsiC，本发明人通过U-U-U接头将每个选择的siRNA的正义链(过客链或非活性链)连接到19nt EpCAM适体的3'末端(图25A，表5)。该RNA链通过化学合成而具有2'-氟嘧啶取代和3'-dTdT突出端以增强对RNase的抗性，然后将其与每个siRNA的反义链(引导链或活性链)退火，该链也用氟嘧啶和3'-dTdT突出端修饰。这种构造在体外血清中可稳定超过36小时，不会诱导先天免疫IFN或炎性细胞因子应答，并且在细胞中被Dicer切割以从适体释放活性siRNA。
当72小时后测量时，设计用于敲低Upf2、Parp1、Apex、Cd47、Mcl1或Cd274的EpCAM-AsiC在体外将EpCAM+4T1E肿瘤细胞中的靶基因表达敲低了50-90％。正如预期的那样，EpCAM-AsiC不影响EpCAM-L929中的靶基因表达(未显示)。注射72小时后测量时，在小鼠颈背中皮下注射125μg(5mg/kg)AsiC在原位植入第4乳腺中的4T1E肿瘤中使基因表达敲低了50-70％。敲低是特异性的，因为单独注射EpCAM适体或者针对eGFP的EpCAM-AsiC并不会敲低内源基因。此外，在肿瘤内的EpCAM-CD45-细胞中未发生敲低。
靶向UPF2或PARP1的EpCAM-AsiC抑制肿瘤生长并增强抗肿瘤T细胞免疫
敲低Upf2已被假定为诱导新抗原的肿瘤细胞表达以促进T细胞的肿瘤识别，Upf2编码结合至由多种基因突变产生的提前终止mRNA并触发无义介导的衰变的蛋白质。为了验证用EpCAM-AsiC(其降低了肿瘤UPF2 mRNA和蛋白)对携带4T1E原位肿瘤的小鼠进行体内处理降低了肿瘤细胞中的NMD活性，本发明人比较了针对四种已知的NMD靶向转录物(Gadd45α、Gadd45β、Cdkn1a、Nat9)的完全剪接mRNA与其前体pre-mRNA的比率。该比率的增加表明NMD活性降低39,40。在UPF2EpCAM-AsiC处理的小鼠的肿瘤中，所有四种基因的mRNA/pre-mRNA比率显著高于仅用适体处理的对照小鼠，表明NMD活性受损。
为了确定靶向Upf2的EpCAM-AsiC是否具有抗肿瘤活性，每3天用5mg/kg EpCAM适体或UPF2 EpCAM-AsiC来皮下处理携带可触及的原位4T1E肿瘤的小鼠。在用UPF2 EpCAM-AsiC处理的小鼠中，4T1E肿瘤生长被显著抑制(图25B)。通过对在3次AsiC或适体注射后第16天收获的肿瘤的单细胞悬液的流式细胞术分析和免疫组织化学(IHC)，评估肿瘤靶向Upf2对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的影响。UPF2 EpCAM-AsiC将通过IHC所测量的CD8+TIL的密度显著增加了3倍(图25C)。通过流式细胞术显示，在UPF2 AsiC处理的肿瘤中CD8+与CD4+Foxp3+Treg的比率(一个与抗肿瘤免疫和对侵袭性BC的免疫疗法的应答密切相关的参数43,44)也增加了3倍(图25D)。在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)和离子霉素进行离体刺激后，来自UPF2 AsiC处理的肿瘤的CD8+TIL也产生更多IFN-γ和TNF-α(图25E)。在与UPF2 siRNA处理的4T1E离体共孵育6小时后，如通过CD107a/b表面表达所测量的，这些CD8+TIL也更多地脱粒(图25F)，并且对细胞毒性效应分子颗粒酶B和穿孔素的染色更多(图25G)。事实上，与适体处理的肿瘤相比，来自UPF2 AsiC处理的肿瘤的CD8+TIL在杀死Upf2敲低的4T1E细胞方面的效率是其两倍。因此，UPF2 EpCAM-AsiC显著增强了抗肿瘤CD8+T细胞免疫并延迟了4T1E肿瘤生长。
UPF2敲低诱导新mRNA转录物
为了研究BC中的UPF2敲低是否产生新mRNA亚型，本发明人借助用非编码对照或UPF2 siRNA转染72小时的EpCAMhi MDA-MB-231人BC细胞系进行了大量RNA测序(RNA-seq)。本发明人在281个基因中鉴定了差异外显子使用(DEU)事件的222个实例(数据未显示)。例如，UPF2敲低显著减少了RINL mRNA(转录物ID ENSG00000187994)中外显子8的使用(log2倍数变化-15.2，调整后的p值＝0.03)并显著增强了ATP11B mRNA转录物(ENSG00000058063)中外显子6的使用(log2倍数变化14.5，调整后的p值＝0.02)，而这在对照细胞中几乎未检测到。这些DEU事件可能导致新多肽和新T细胞表位的表达。DEU的数量和多样性表明UPF2敲低可能导致新的可变剪接。
为了对此进行测试，对UPF2敲低介导的转录多样性进行解卷积(deconvoluted)以鉴定和估计转录亚型的丰度。鉴定了42个具有潜在差异亚型使用(DIU)的基因(数据未显示)。这些基因包括被鉴定为具有DEU的七个基因(CENPH、PFKFB4、UCN2、SNHG8、CDKAL1、TRIM4、TMEM242)。这些DIU事件包括可在例如DNAJC2和TMPRSS5 LAT2中编码新多肽的新mRNA亚型的例子(图33A)。此外，一些具有DIU的基因，如CENPH、SNRPA1和EBPL，增加了已知对NMD敏感的mRNA亚型的丰度。例如，UPF2敲低增加了CENPH亚型，其表明外显子跳跃事件预计具有使其对NMD敏感的提前终止密码子(图33B)。总的来说，该数据表明通过UPF2敲低来降低NMD活性诱导肿瘤新抗原的表达。
敲低Parp1减少肿瘤生长并增强抗肿瘤免疫
本发明人假设抑制肿瘤中的DNA修复可能是诱导肿瘤新抗原表达的另一种方式。PARP1是一种关键的DNA损伤修复蛋白，可感知单链和双链DNA断裂并在断裂位点招募和激活DNA修复机制45。敲低肿瘤细胞中的PARP1可能会导致更多与DNA断裂相关的突变，从而引入可被T细胞识别的肿瘤特异性新抗原。为了测试Parp1敲低是否激活抗肿瘤免疫，用EpCAM适体、PARP1 EpCAM-AsiC或FDA批准的PARP1抑制剂奥拉帕尼对携带可触及的原位4T1E肿瘤的小鼠进行处理。PARP1AsiC比奥拉帕尼(其显示出抑制趋势但未达到显著性)更有效地抑制4T1E肿瘤生长(图26A)。与奥拉帕尼相比，PARP1 AsiC对TIL的抗肿瘤特性也有更明显的影响。与对照适体处理的肿瘤相比，它诱导肿瘤中CD8+/CD4+Treg的有效和显著增加(图26B)，活化刺激了CD8+TIL产生IFNγ和TNFα(图26C)并增加了CD4+TIL产生的TNFα(图26D)。奥拉帕尼对抗肿瘤免疫有较不易察觉的影响，除了CD4+TIL产生的TNFα增加外，没有达到显著性。Parp1敲低比PARP1酶抑制具有更有效的作用的原因尚不清楚，但去除PARP1蛋白会干扰DNA损伤位点处修复蛋白的识别和组装，而抑制PARP1的PARylation活性只会在更下游发挥作用以抑制修复。其结果是，Parp1敲低后的未修复DNA损伤和基因组不稳定性可能比抑制PARP1酶活性后更广泛。
敲低Apex1影响肿瘤生长
APEX1是碱基切除修复(BER)中的关键核酸内切酶，其修复细胞中最常见的DNA损伤，即通过氧化性DNA损伤形成的脱碱基位点47,48。Apex1遗传缺陷导致早期胚胎致死(E4-6.5)，并且Apex1缺陷细胞系无法生长。值得注意的是，肿瘤不会使该必需基因发生突变。因此，本发明人研究了Apex1敲低，因为它可能具有直接的细胞毒性并且还诱导可以激活T细胞免疫的突变。也许是因为其为必需基因，EpCAM-AsiC的体内Apex1敲低仅为50％，不如其它EpCAM-AsiC有效。当以与其它EpCAM-AsiC相同的剂量和时间表给药时，靶向肿瘤的Apex1敲低减少了4T1E肿瘤生长，但与仅用适体处理的小鼠相比，差异没有达到显著性(图26E)。
CD47 EpCAM-AsiC促进巨噬细胞的EpCAM+BC细胞吞噬并增强抗肿瘤T细胞免疫
肿瘤细胞改变许多基因的表达以逃避免疫清除，这一过程称为肿瘤编辑。一种策略是表面糖蛋白CD47的肿瘤上调，CD47与巨噬细胞和DC上的信号调节蛋白SIRPα结合并作为有效的“不要吃我”信号来抑制吞噬作用和抗原交叉呈递49。为了评估Cd47敲低的抗肿瘤作用，用EpCAM适体或CD47 EpCAM-AsiC对携带原位4T1E肿瘤的小鼠进行处理。如CD8+/CD4+Treg TIL比率增加(图27B)以及CD8+和CD4+TIL产生IFN-γ的功能能力增加(图27C-图27D)以及GzmB表达CD8+TIL的功能能力增加(图27E)所表明的，与用EpCAM适体处理的小鼠相比，CD47EpCAM-AsiC抑制肿瘤生长(图27A)并促进抗肿瘤免疫。
接着，本发明人分析了肿瘤中Cd47敲低对肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和树突细胞(DC)的影响。响应于肿瘤环境线索，TAM可以极化为具有抗肿瘤特性的促炎性的经典激活的M1样巨噬细胞；或具有免疫阻遏性并与肿瘤进展、转移和不良预后相关的抗炎性的选择性激活的M2样巨噬细胞52-54。尽管CD47 EpCAM-AsiC没有显著改变TAM的数量(未显示)，但在CD47 EpCAM-AsiC处理的肿瘤中M1/M2 TAM的比率显著增加(图27F、图34B)。此外，与适体处理相比，CD47 EpCAM-AsiC处理后肿瘤中CD11c+DC205+DC和CD45+造血细胞的百分比显著更高(图27G)。Cd47 EpCAM-AsiC处理的肿瘤中的DC表达更多的共刺激CD80和CD86以及表面MHC-II，表明它们是更有效的APC(图27H)。为了确定在适体或CD47 EpCAM-AsiC处理后体内肿瘤细胞的TAM吞噬作用是否增加，本发明人用稳定表达eGFP的4T1E肿瘤(4T1E-eGFP)替代4T1E肿瘤并检查了TAM GFP荧光。在CD47 EpCAM-AsiC处理的肿瘤中，显著更多的TAM为GFP+，表明体内吞噬作用增加(图27I)。为了证实增强的TAM吞噬作用是由于肿瘤细胞上CD47表达的减少，本发明人将来自CD47 EpCAM-AsiC处理的肿瘤的TAM与4T1E-eGFP(该肿瘤用非靶向siRNA或Cd47 siRNA处理)共培养。CD47敲低的4T1E-eGFP的TAM吞噬作用是对照肿瘤的4倍(图27J)。
为了确定CD47 EpCAM-AsiC的肿瘤阻遏作用是否由TIL和/或TAM介导，在用CD47EpCAM-AsiC处理之前，本发明人使用分别针对CD4、CD8或CSF1R的抗体在携带原位4T1E肿瘤的小鼠中消耗了CD8+或CD4+T细胞或巨噬细胞(图35A-图35C)。CD8+T细胞的消耗完全消除了CD47EpCAM-AsiC的抗肿瘤作用，但CD4+T细胞或巨噬细胞消耗的影响较小(图27K)。然而，巨噬细胞消耗不如T细胞消耗完全，因为约30％的TAM在消耗后仍然存在。来自CD47 EpCAM-AsiC处理的肿瘤的CD8+TIL的增强的功能(通过响应于与4T1E孵育的脱粒以及IFN-γ和TNF-α产生进行评估)在消耗巨噬细胞的小鼠中降低到背景水平，表明TAM在CD47 AsiC处理的肿瘤中促进CD8+TIL抗肿瘤免疫的重要性(图27L)。
为了比较阻断抗体和用AsiC敲低的有效性，本发明人评估了CD47AsiC和抗CD47抗体的抗肿瘤作用。尽管两种处理都减小了肿瘤体积，但尤其是在较晚时间点，只有CD47AsiC处理显著抑制了肿瘤生长(图27M)。来自CD47 EpCAM-AsiC和抗CD47处理的小鼠的CD8+TIL在PMA和离子霉素刺激后均比对照肿瘤产生更多的IFN-γ，但只有CD47 AsiC显著增加了CD4+TIL的刺激的TNF-α产生。此外，与对照肿瘤相比，CD47EpCAM-AsiC(而非抗CD47)显著减少了肿瘤浸润免疫阻遏性多形核髓源性阻遏细胞(PMN-MDSC)和单核(MO)-MDSC的数量。因此，CD47EpCAM-AsiC在控制肿瘤生长和诱导抗肿瘤免疫方面比抗CD47更有效。
CD274(PD-Ll)EpCAM-AsiC对肿瘤生长具有适度影响
在一些癌症中，检查点抑制诱导具有显著且持久的应答的保护性免疫。虽然乳腺癌通常对检查点抑制剂不那么敏感，但去年证明了抗PD-L1与蛋白结合紫杉醇一起给药在肿瘤表达PD-L1的TNBC患者子集中改善了几个月的生存，并且是首个FDA批准用于该子集患者的检查点抑制疗法。4T1E强烈且均匀地表达PD-L1(图36A)。因此，本发明人评估了靶向PD-L1的CD274 EpCAM AsiC的抗肿瘤活性。CD274 EpCAM-AsiC抑制肿瘤生长，但该效果不是统计学显著的(图36B)，表明将CD274EpCAM-AsiC与其它疗法联合可能是提高抗肿瘤免疫所必需的。
MCL1 EpCAM-AsiC诱导抗肿瘤免疫
因为TNBC是通过排除而定义的异质性癌症，识别人类基底-A TNBC细胞系的共享依赖性的全基因组siRNA筛选识别出极少的共享依赖性基因26,35。最强命中(hit)之一是抗凋亡BCL-2家族基因MCL1，其通常在TNBC中扩增并且其过表达与不良预后相关36。本发明人假设由Mcl1敲低诱导的肿瘤细胞死亡(图32B)可能促进肿瘤抗原向CD8+T细胞的交叉呈递，从而提高抗肿瘤免疫。本发明人首先证实MCL1 EpCAM-AsiC在体外降低了4T1E活力(图37A)。在原位4T1E肿瘤变得可触及后，每3天s.q.注射的MCL1 EpCAM-AsiC显著减慢肿瘤生长(图37B)。MCL1EpCAM-AsiC还显著改善了肿瘤中的CD8+/CD4+Treg比率以及抗肿瘤CD4+和CD8+T细胞功能。本发明人还观察到使用另一种靶向必需基因Plk1(编码有丝分裂所需的激酶)的细胞毒性EpCAM-AsiC在抗肿瘤T细胞免疫方面的类似改善(数据未显示)。因此，一些具有细胞毒性的EpCAM-AsiC也能促进有效的抗肿瘤免疫应答。
EpCAM-AsiC的组合增强抗肿瘤活性
用于癌症的AsiC的优势之一在于将靶向多个基因的AsiC组合起来以产生药物混合物是相对容易的，该药物混合物可以通过敲低利用不同机制促进肿瘤免疫的基因而具有累加或协同效应来抑制肿瘤生长。为了研究EpCAM-AsiC组合的有效性，用靶向Upf2、Parp1、Cd47或Mcl1的最有效的4种EpCAM-AsiC(单独的或组合的)对携带4T1E原位肿瘤的小鼠进行处理，使用EpCAM适体或eGFP EpCAM-AsiC作为对照(图28A-图28B)。每种EpCAM-AsiC本身都显著延迟了肿瘤进展，但混合物显著更好。混合物使CD8+TIL数量增加了约4倍(图28C)，将CD8+/CD4+Treg TIL比率提高了约5倍(图28C)，并增加了CD8+和CD4+TIL的刺激产生的细胞因子和细胞毒性分子(图28E-图28G)。还在携带原位4T1E-eGFP肿瘤的小鼠中评估了联合的EpCAM-AsiC，其免疫原性外源蛋白的表达导致肿瘤植入后约两周开始肿瘤消退(图28H)。用AsiC混合物处理的小鼠中的肿瘤生长慢得多，并且更早开始消退。联合疗法还有效地增强了4T1E-eGFP肿瘤中的T细胞免疫(图28I)。重要的是，在5次注射EpCAM-AsiC组合后，4T1E-eGFP肿瘤上的EpCAM表达没有变化，表明肿瘤不会通过下调EpCAM而对EpCAM-AsiC产生抗性。
本发明人接下来研究了是否可以通过添加检查点抑制剂抗PD-1靶向耗竭的T细胞来改善针对肿瘤的EpCAM-AsiC混合物的肿瘤抑制。用抗PD-1对接受EpCAM适体的对照小鼠进行处理仅轻微地但没有显著地减缓4T1E肿瘤生长。然而，抗PD-1和EpCAM-AsiC混合物的组合比AsiC混合物自身更能显著降低肿瘤生长。尽管EpCAM-AsiC混合物显著降低CD44+CD8+TIL上的PD-1水平，当使用相同的抗体克隆(29F.1A12)进行检测时，加入α-PD-1进一步降低了PD-1染色，这可能是因为结合的治疗性抗体阻断了染色(图38A)。至于CD47 EpCAM-AsiC自身，联合的AsiC也显著降低了CD44 CD8+TIL上其它抑制性共受体(CTLA-4、TIM-3和LAG-3)的表达(图38B)。添加抗PD1对这些抑制性受体没有显著的额外影响。此外，与来自仅用混合物处理的小鼠的T细胞相比，添加抗PD1导致CD44+CD8+TIL中共刺激受体2B4(CD244)的表达降低，这可能降低T细胞应答。然而，与仅用AsiC混合物处理的小鼠相比，向AsiC混合物添加抗PD-1强烈增加了CD8+(图38C)和NK TIL数量并刺激了CD8+TIL的细胞因子产生。因此，靶向肿瘤细胞的免疫逃逸策略的AsiC混合物可以与针对T细胞抑制性受体的检查点抑制剂协同作用。
EpCAM-AsiC混合物广泛增强肿瘤浸润T细胞和巨噬细胞的抗肿瘤功能
为了无偏倚地评估通过用4种EpCAM-AsiC混合物处理而诱导的肿瘤浸润免疫细胞的变化，对来自用EpCAM适体或混合物处理的携带4T1E原位肿瘤的小鼠的CD45+肿瘤浸润细胞进行了scRNA-seq分析(图29A-图29F)。该分析关注肿瘤浸润增殖性T细胞和巨噬细胞(图29A-图29F)，其显示EpCAM-AsiC疗法具有最大变化。增殖的T细胞中差异表达基因(DEG)的基因本体分析揭示，与对照肿瘤相比，在EpCAM-AsiC处理的肿瘤中与迁移/趋化性、免疫突触形成、T细胞活化、增殖和代谢相关的基因标志(gene signatures)的表达显著增加(图29A-图29F)。
在EpCAM-AsiC处理的“M1”巨噬细胞亚群中，与单核细胞/巨噬细胞迁移、活化内吞作用相关的基因的表达显著上调；而在“M2”亚群中，参与炎症和I型IFN和趋化因子产生的基因(包括调节对肿瘤的免疫应答的基因)上调(图29A-图29F)。与对照组的那些相比，AsiC处理组中的T细胞表达更高水平的参与T细胞活化和效应物功能的基因(图29A-图29F)。簇1T细胞表达更高水平的参与T细胞活化的早期信号传导事件的基因(例如Cd69、Zap70、Fos和Junb)，其通过EpCAM-AsiC处理而进一步上调(图29A-图29F)。在AsiC处理的肿瘤中增殖的T细胞上调效应和记忆以及功能T细胞基因，例如效应分子Ifng、Tnf、Il2、Gzmb、Gzmk的转录物；共刺激基因Icos；IL-2受体复合体基因IL2ra、IL2rb和IL2rg；和促进CD8+记忆T细胞的长期持久性的Runx2。在EpCAM-AsiC处理后，许多T细胞功能基因(例如Gzmb、Gzmk、Prf1和Tnf)在簇1T细胞中也增加。相反，在来自AsiC处理的肿瘤的T细胞(特别是增殖的T细胞簇)中，编码共抑制分子的基因(例如Pdcd1、Ctla4、Tigit、Lag3和Havcr2以及Treg标志基因Foxp3)最大程度下调(图29A-图29F)，表明EpCAM-AsiC改善了T细胞耗竭。此外，在AsiC处理的肿瘤中巨噬细胞上调了与髓样细胞成熟(例如Cd74)；M1功能(例如Nos2、Fcgr1、Cd68、Il12a和Ccr7)；吞噬作用和抗原加工(例如Lgals3、Il1b、Apoe、Cd14和Ly75)；以及炎性细胞因子/趋化因子产生(例如Tnf、Ccl2、Cxcl2和Il12a)相关的基因的表达(图29A-图29F)，表明抗肿瘤功能得到改善。
EpCAM-AsiC减少转移性肿瘤的生长
迄今为止报道的所有实验都在原位肿瘤变得可触及后进行治疗。然而，BC患者通常会出现更难以治疗的更晚期的局部或转移性疾病。许多BC患者在转移性疾病变得临床明显之前也有显微转移的证据。此外，转移性疾病通常是导致患者死亡的原因。因此，靶向转移性肿瘤细胞的能力对于有效BC疗法至关重要。为了确定EpCAM-AsiC对转移性TNBC是否有活性，本发明人制备了可通过活体动物的生物发光成像进行检测的稳定表达萤火虫荧光素酶的4T1E细胞系(4T1E-Luc)。静脉内注射4T1E-Luc导致肿瘤细胞滞留(lodge)在肺中，并且7-10天后可以检测到肺中的肿瘤。将携带7日龄转移性4T1E-Luc肺肿瘤的小鼠用EpCAM适体或靶向Upf2、Cd47、Parp1和Mcl1的EpCAM-AsiC混合物进行处理。EpCAM-AsiC显著抑制肺中的乳腺肿瘤生长(图30A-图30K)。肿瘤攻击后20天，从肺中分离CD8+和CD4+T细胞，并分析PMA和离子霉素刺激的IFN-γ和TNF-α的产生。来自用EpCAM-AsiC处理的小鼠中的显著更多的CD4+和CD8+T细胞产生这些细胞因子。因此，EpCAM-AsiC抑制了转移性肿瘤的生长并增强了肺中转移部位处的抗肿瘤免疫。
EpCAM-AsiC在ErbB2ΔEx16转基因小鼠中抑制侵袭性乳腺癌
为了评估EpCAM-AsiC在作为侵袭性Her2+乳腺癌的挑战性GEMM中的有效性，本发明人采用了多西环素诱导型小鼠模型，该模型在MMTV启动子的控制下表达eGFP和截短的Her2基因(ErbB2ΔEx16，外显子16缺失，导致近膜(juxtamembrane)16aa缺失和组成型活性HER2受体)。这些小鼠中的至少80％在添加多西环素后约10-28天内发展出多灶性快速生长和转移性HER2+乳腺肿瘤，其均一地为EpCAM+(图31A-图31D)。在没有任何处理的情况下，这些肿瘤几乎没有浸润性CD4或CD8 T细胞(图31A-图31D)。本发明人在开始多西环素后3天开始并在此后每3天用作为对照的EpCAM适体或靶向Upf2、Parp1、Apex1、Cd47、Mcl1和Cd274的6种EpCAM-AsiC的组合处理这些小鼠(图31A-图31D)。尽管用EpCAM-AsiC混合物进行处理没有改变发展出可检测的肿瘤的小鼠的数量(每组6只小鼠中有4只在10天内发展出肿瘤)，但它在4周的处理中极大地抑制了肿瘤生长(图31A-图31D)。8次处理后，GFP+肿瘤的EpCAM表达没有变化(图31A-图31D)。此外，接受EpCAM-AsiC混合物的小鼠中抗肿瘤免疫功能显著增强。更多TAM为GFP+，表明肿瘤细胞吞噬作用增加(图31A-图31D)。尽管EpCAM-AsiC混合物没有改变自发产生的ErbB2ΔEx16肿瘤内的TIL数量(未显示)，但在CD8+、CD4+和NK TIL中，CD4+和CD8+TIL的刺激产生的IFN-γ和TNF-α(图31A-图31D)以及GzmB和PFN的表达(图31A-图31D)增加。因此，EpCAM-AsiC混合物在免疫“冷漠(cold)”的高侵袭性自发性GEMM乳腺肿瘤中阻遏了肿瘤生长并动员了抗肿瘤免疫。
讨论
在所有BC亚型中生存率最差并且缺乏有效治疗策略的高侵袭性TNBC代表了BC疗法的关键障碍66。幸运的是，与其它BC亚型相比，TNBC以及另一种易耐药和复发的侵袭性BC亚型HER2+BC更具免疫原性，具有更高水平的肿瘤突变负荷和TIL，这使它们成为癌症免疫疗法的更好靶标67-69。在这项研究中，本发明人示出了在小鼠TNBC和HER2+BC模型二者中，使用免疫调节性EpCAM-AsiC进行靶向肿瘤细胞的基因敲低可以有效提高肿瘤免疫原性并有效抑制肿瘤生长，表明EpCAM-AsiC的抗肿瘤活性为BC免疫疗法的有效方法。据我们所知，这是第一项说明EpCAM-AsiC对侵袭性BC的免疫激活效力的研究。在经处理的小鼠中没有检测到毒性或体重减轻的证据。此外，联合的AsiC与PD-1检查点抑制剂协同作用以进一步限制肿瘤进展，突出了其对于大多数BC患者(对免疫检查点抑制剂单药疗法的应答有限)的潜在临床益处。
EpCAM适体介导的siRNA递送系统利用EpCAM的肿瘤特异性表面过表达来选择性靶向上皮肿瘤细胞和干样肿瘤起始细胞34。正常上皮细胞在侧向界面(lateral interfaces)上表达水平低得多的EpCAM作为紧密连接复合体的一部分，因此不受EpCAM-AsiC靶向的影响。本发明人证明了EpCAM适体在体外和体内远处部位被人EpCAM+肿瘤选择性内化；此处证明EpCAM-AsiC可以以高亲和力和特异性结合并内化到小鼠EpCAM+BC细胞中来敲低靶基因。作为致癌信号传导蛋白，肿瘤相关抗原EpCAM对BC细胞增殖和迁移至关重要74。本文证明用EpCAM-AsiC处理多次的BC细胞不会下调EpCAM水平，这可能是由于其致癌特性。
EpCAM-AsiC也不会激活其受体，大概是因为它们不会使其交联28。
尽管有前景，但还可以进一步修饰AsiC以提高其治疗潜力。已开发出AsiC的各种生物化学修饰以优化其性能，例如降低全身清除并延长其体内半衰期、减弱核酸酶降解、增强其递送和细胞摄取以及避免激活免疫传感器70,78,79。本文所述的EpCAM-AsiC已在RNA适体和siRNA正义链中用2'-氟嘧啶取代进行化学修饰并具有3'-dTdT突出端，这有助于它们的RNase抗性、稳定性并有助于降低免疫激活。此外，AsiC通过皮下注射给药，显示出进入循环的释放速度较慢并且可以为介导摄取的细胞受体的再循环提供更多时间，以提高siRNA递送效率80,81。EpCAM-AsiC的其它修饰(例如siRNA引导链的2'糖修饰、硫代磷酸(PS)骨架修饰以及经典siRNA的5'未锁核酸修饰)具有进一步提高基因敲低效率、减少所需的AsiC剂量并降低脱靶RNAi活性的巨大潜力70,82。事实上，这种变化导致N-乙酰半乳糖胺(GalNac)缀合的siRNA的给药剂量降低了两个数量级，同时促进了试剂的RNAi活性并保持了低毒性特性83。内体逃逸是提高肝以外的RNAi功效的主要障碍84。在5mg/kg的剂量下，EpCAM-AsiC在体内在肿瘤细胞中表现出良好的基因沉默特性，表明一定数量的AsiC可以离开内体进行靶向敲低。此外，将EpCAM-AsiC与大体积化学物质(即胆固醇、脂质体或PEG)缀合可以进一步延长其循环半衰期并降低全身清除，从而为癌症患者实现卓越的治疗效果85-88。
通常由于肿瘤细胞的遗传不稳定性而产生的肿瘤新抗原是高度免疫原性的，因为它们不被正常组织表达。它们可以引发CD4+和CD8+抗肿瘤T细胞应答二者，并且是癌症免疫疗法的理想靶标89,90。因BC细胞中的非同义突变率低导致的肿瘤新抗原表达缺乏代表了BC免疫疗法的主要挑战。使用UPF2 AsiC，我们可以通过减少BC细胞中的NMD机制来引入肿瘤新抗原表达。NMD通常被视为mRNA质量控制的关键机制，NMD所靶向的转录物可能产生自导致PTC的各种mRNA变异。除了SMG1-7之外，核心NMD机制还包含三个反式作用因子UPF1-391。
UPF2是一种关键的NMD因子，它在UPF3/外显子连接复合物(EJC)和含有UPF1的复合物之间架起相互作用，其随后磷酸化UPF1以诱导mRNA衰变活性92,93。已显示缺乏NMD活性的细胞上调异常mRNA剪接变体94-96。在一项研究中，在N2A神经母细胞瘤细胞中通过UPF1敲低抑制NMD导致超过200个外显子的表达改变97。类似地，本文证明敲低UPF2降低了体外和体内生长的BC细胞中的NMD活性，在281个基因中诱导了DEU事件，并产生了许多可能编码肿瘤新抗原的新型mRNA亚型和NMD敏感转录物。这与CD8+TIL数量增加及其功能改善以及对乳腺肿瘤生长的强烈抑制有关。这些发现得到了一项研究的支持，该研究使用靶向PSMA的适体敲低UPF2或SMG1，其以T细胞依赖性方式阻遏PSMA-CT26/B16F10肿瘤生长98。尽管由NMD抑制诱导的许多新抗原会由于随机突变而产生并因此是肿瘤细胞特异性的，但也有一系列在NMD抑制后可以稳定化而表达新抗原的真正的NMD靶标39,42,99。特别是，据报道，NMD对许多涉及细胞应激应答和营养稳态途径的非突变转录物进行调节42,100,101。肿瘤中的氨基酸饥饿和ER应激抑制NMD活性，这可能是肿瘤细胞用来上调应激应答性转录物以适应这些环境挑战的策略42,95,101。有趣的是，这项研究利用UPF2敲低在PFKFB4、UCN2、CDKAL1和TRIM4基因中鉴定出DEU和DIU事件二者，所有这些都涉及氧化应激和ER应激调节途径102-105。在进行研究的所有三个样本中也观察到这些改变，表明NMD抑制可以诱导在其中的UPF2被下调的所有或至少部分肿瘤细胞中所共享的抗原的表达。
TNBC在TP53中呈现约80％的突变，这导致其高度的基因组不稳定性106,107。此外，大部分TNBC具有缺陷型同源重组(HR)，这是一种高保真DNA修复机制，对于有效修复双链DNA断裂(DSB)至关重要108。因此，TNBC代表了PARP1抑制剂(PARPi)的良好治疗靶标。PARP1以参与不同的DNA修复过程(例如BER、单链DNA断裂(SSB)修复和DSB修复)而闻名。奥拉帕尼主要作用于HR缺陷型BRCA突变BC，因为内源性产生的SSB在PARPi存在下不再被修复并在细胞复制过程中转化为DSB，这在BRCA缺陷时无法得到修复并导致细胞死亡109。
PARP1 AsiC可能存在类似的工作机制，其通过敲低BC细胞中的PARP1表达而促进体内癌细胞死亡。死细胞可能会释放更多TA并吸引T细胞肿瘤浸润。值得注意的，PARP1AsiC和奥拉帕尼也都可以在大部分TNBC(其为BRCA+但包含其它HR相关缺陷)中发挥抗肿瘤作用110。通过降低关键DNA修复酶的表达，PARP1 AsiC还可以引入更多DNA损伤，增加DNA突变负荷并促进肿瘤新抗原产生。本文证明PARP1 AsiC强烈增加CD8+TIL与CD4+Treg的比率以及CD8+和CD4+TIL二者的细胞因子产生，这可能归因于其触发肿瘤细胞死亡和肿瘤新抗原表达的能力。令人意外的是，奥拉帕尼在4T1E TNBC模型中没有达到显著肿瘤抑制，并且未能增强抗肿瘤T细胞免疫，这与其在BRCA1缺陷型肿瘤模型中的治疗功效形成反差111-113。奥拉帕尼的免疫调节作用取决于STING介导的IFN-I产生112,113，其在4T1E肿瘤中可能不足。PARP1 AsiC更好的稳定性和肿瘤穿透能力也可能有助于其提高功效。此外，PARP1是可诱导肿瘤炎症的NF-κB的一种已知的共激活剂114。PARP1敲除可以强烈减少炎症驱动的肿瘤形成115。PARP1 AsiC介导的基因敲低可以导致类似的效果，该效果可能无法通过奥拉帕尼介导的PARylation抑制来实现。
APC(巨噬细胞和树突细胞)介导的对垂死癌细胞的吞噬作用和TA交叉呈递对于启动有效的抗肿瘤T细胞免疫至关重要。肿瘤细胞普遍上调CD47表达，大概是为了逃逸在程序性细胞死亡和细胞去除过程中诱导的内源性“吃我”信号以及避免被免疫系统识别49,50。通过抗CD47抗体中和CD47的抗吞噬信号传导可以恢复巨噬细胞或DC对癌细胞的吞噬作用。尽管DC子集被视为向CD8+T细胞呈递外源性抗原的主要参与者，但在阻断CD47-SIRP轴的背景下，巨噬细胞和DC均已证明它们的抗原交叉引发能力能够刺激有效的CD8+T细胞应答50,116,117。本数据表明，CD47 AsiC的抗肿瘤功效取决于TAM，因为抗CSF1R介导的TAM消耗虽然仅将TAM的数量减少了70％，但有效地削弱了CD47 AsiC的抗肿瘤功能。来自TAM消耗肿瘤的CD8+TIL几乎完全消除了它们的效应功能，表明TAM在交叉引发CD8+TIL免疫中起关键作用。虽然抗CSF1R主要用于体内巨噬细胞消耗，但CSF1R也由浆细胞样和常规DC子集表达，并且CSF-1信号传导是最佳DC分化所必需的118。因此，抗CSF1R抗体也可能消耗了一定量的DC，这导致CD47 AsiC的肿瘤抑制和免疫刺激能力受损。事实上，CD47 AsiC增加了肿瘤中CD11c+DEC205+DC的百分比，这些DC专门摄取细胞外抗原并促进DC成熟。这些DC的抗原交叉呈递能力也可能通过CD47 AsiC处理得到改善。
此外，若干研究报道了CD47阻断的治疗潜力需要由宿主DC进行的STING介导的肿瘤DNA传感116。在抗体介导的CD47阻断后，肿瘤浸润DC(TIDC)和TAM均产生更多的IFN-I，这可以促进它们的抗原交叉呈递功能。CD47 AsiC处理后改善的DC成熟也可能取决于IFN-I信号传导增加。此外，通过促进DC成熟的CD47 AsiC处理也可能改变肿瘤的细胞因子环境，这有助于提高M1与M2 TAM的比率并减少MDSC的存在，产生具有肿瘤阻遏性和免疫刺激性的TME。有趣的是，CD47 AsiC在阻遏4T1E肿瘤生长方面优于抗CD47抗体。虽然两种疗法都增加了CD8+TIL的功能，但只有CD47 AsiC促进了CD4+TIL的功能并减少了肿瘤中MDSC的数量，表明其在4T1E肿瘤模型中具有优越的治疗潜力。抗CD47抗体疗法并未改善CD4+T细胞功能，这在之前已有报道50。另一方面，CD4+T细胞消耗显著削弱了CD47 AsiC的治疗效果，清楚地表明其对CD47 AsiC处理的重要性。有可能的是，通过基因敲低直接减少CD47信号传导而不是抗体介导的信号阻断以及具有更好的肿瘤穿透能力的更小尺寸的CD47 AsiC使其在肿瘤抑制方面更有效。
通过用EpCAM-AsiC靶向癌症-免疫循环中的每个因素而一致鉴定的生物标志物是上调的CD8+TIL与CD4+Treg的比率，据报道这是与患有不同类型的癌症(包括侵袭性BC)的患者中临床结果改善相关的良好预后标志物44,119-121，表明本文描述的治疗方法可以提供潜在临床益处。然而，尽管抗PDL1抗体对TNBC患者显示出临床功效，但靶向PD-L1的EpCAM-AsiC并未显著抑制整体肿瘤生长。实际上，PD-L1在TIC上的表达水平高于肿瘤细胞，只有TIC上的高PD-L1表达才是癌症患者的有利预后因素122,123。因此，通过EpCAM-AsiC仅靶向PD-L1+肿瘤细胞可能无法实现有效的抗肿瘤作用。当同时诱导肿瘤新抗原表达、触发癌细胞死亡以增加TA释放并且促进抗原摄取和交叉呈递时，AsiC混合物疗法在增强抗肿瘤免疫和阻遏肿瘤生长方面表现出最有效的功效。靶向超过一种基因的免疫调节性AsiC混合物对于癌症免疫疗法将是理想的，可减少产生耐药性的机会。
scRNA-seq数据进一步揭示了用AsiC混合物处理的肿瘤中CD8+TIL和单核细胞/巨噬细胞的活化状态和功能特性的改善，这佐证了鉴定出CD8+TIL增强的细胞因子产生和细胞毒性功能以及TAM增加的肿瘤细胞内吞作用的免疫学研究。在AsiC混合物疗法中表现出最显著的功能改善的增殖的TIL簇很可能是由主要识别TA的TIL组成的。AsiC混合物处理还降低了在增殖的TIL中编码不同共抑制分子的mRNA转录物的表达，表明它们受到保护而免于过度活化/耗竭。在来自AsiC混合物处理的肿瘤的经历抗原的CD44+CD8+TIL上也检测到PD-1蛋白表达降低。当将AsiC混合物与PD-1检查点抑制剂一起给予时，观察到共抑制剂表达进一步减少，同时CD8+和NK TIL的数量和功能提高，表明联合方法提供了额外的治疗益处。最后，诱导型基因工程小鼠(GEM)肿瘤对免疫治疗干预具有相当的抵抗力，部分原因是它们通常不携带许多基因突变并因此不能被很好地识别124,125。AsiC混合物方法在肺转移性TNBC和高侵袭性HER2+BC的GEM模型二者中均显示出有希望的抗肿瘤效力，显示出免疫调节性EpCAM-AsiC为侵袭性BC患者提供的巨大免疫治疗潜力。
材料和方法
细胞系
人MDA-MB-468、MCF7、T47D、SKBR3以及小鼠L929和P815细胞系获自ATCC。通过对4T1细胞进行高E-钙粘蛋白表达分选产生4T1E。用pCAG-eGFP慢病毒载体产生4T1E-eGFP细胞。在用EF1a-萤光素酶(萤火虫)-2A-RFP-Puro慢病毒载体(amsbio)感染后使用嘌呤霉素选择稳定表达萤火虫萤光素酶的4T1E细胞(4T1E-Luc)。将细胞系在DMEM(4T1、4TO7、4T1E、4T1E-eGFP、4T1E-Luc、L929、P815、MCF10CA1a、EpCAMhi MDA-MB-231细胞)、RPMI 1640(MDA-MB-468、T47D)、MEM(MCF7)、McCoy's 5A(SKBR3)培养基(Gibco，Thermo FisherScientific)中培养，所述培养基补充有10％热灭活FBS(Gemini Bioproducts)、6mMHEPES、1.6mM L-谷氨酰胺、50μM 2-巯基乙醇、100U ml-1青霉素G和100μg ml-1硫酸链霉素(Sigma-Aldrich)。所有细胞系均通过PCR验证为不含支原体，并通过形态学进行认证。
小鼠研究
所有动物实验均按照所有相关伦理规定进行，并得到哈佛医学院机构动物管理和使用委员会的批准。所有小鼠都饲养在哈佛医学院动物设施中。雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)购自The Jackson Laboratories。通过断尾试验(tail clipping)以及针对ErbB2ΔEx16(正向引物：5'-GTGA CCTGTTTTGGACCGGA-3'(SEQ ID NO：145)；反向引物：5'-TCTCCGCATCGTGTACTTCC-3'(SEQ ID NO：146))以及MTB(正向引物：5'-ACCGTACTCGTCAATTCCAAGGG-3'(SEQ ID NO：147)；反向引物：5'-TGCCGCCATTATTACGACAAGC-3'(SEQ ID NO：148))的基因分型确定转基因表达。在整个研究过程中，8周龄雌性ErbB2ΔEx16+/-MT B+/-小鼠在饮用水中接受2mg/ml多西环素(Sigma-Aldrich)来诱导肿瘤。诱导肿瘤三天的小鼠被随机分配到对照组或处理组，并每三天用EpCAM-AsiC混合物(PBS中各5mg/kg，总共30mg/kg)或EpCAM适体(30mg/kg)进行处理。通过触诊监测原位肿瘤(tumoronsite)，并每隔一天通过测量肿瘤的垂直直径来评估肿瘤生长。在第28天对小鼠实施安乐死。
对于原位肿瘤攻击，将4T1E(每只小鼠约105个细胞)细胞或4T1E-eGFP(每只小鼠约3×105个细胞)细胞注射到BALB/c小鼠的四个乳腺脂肪垫中。当肿瘤变得可触及时(肿瘤攻击后约3-4天)，每三天对小鼠皮下注射单独的培养基(模拟)、5mg/kg EpCAM适体或eGFPEpCAM-AsiC作为对照处理、或每种免疫调节性EpCAM-AsiC。通过每天测量肿瘤的垂直直径来监测肿瘤生长。当对照组肿瘤的平均直径达到约4-5mm(约两周)时，对实验中的所有小鼠实施安乐死并收集肿瘤进行分析。为了确定UPF2 EpCAM-AsiC的更长期抗肿瘤功效，用5×104个4T1E细胞攻击小鼠，并在肿瘤攻击后第8天开始处理。监测肿瘤生长25天。对于细胞消耗试验，将CD8抗体(克隆2.43)、CD4抗体(克隆GK1.5)、CSF1R抗体(克隆AFS98)或同种型对照抗体(均来自BioXCell)腹腔内(i.p.，300μg/小鼠)注射到用4T1E肿瘤细胞攻击的小鼠内。在肿瘤攻击后第2天开始连续三天给予CD8或CD4抗体，此后每五天给予。对于TAM消耗，从肿瘤攻击第0天开始注射抗CSF1R抗体，之后每隔一天注射。通过对CD4、CD8、CD11b、F4/80和MHCII进行染色并通过流式细胞术验证免疫细胞消耗(使用在肿瘤攻击后第7天获得的外周血单核细胞和/或在尸检时获得的肿瘤浸润免疫细胞)。对于抗CD47抗体(克隆MIAP410，BioXcell)处理，从肿瘤攻击第3天开始腹腔内注射(400μg/小鼠)抗体，此后每三天注射。对于PARP1抑制剂处理，将奥拉帕尼(LC Laboratories)溶解在DMSO中至50mg/ml。用10％2-羟基-丙基-环糊精/PBS(Sigma-Aldrich)进行进一步稀释，并在肿瘤攻击后第3天开始每天以50mg/kg通过i.p.注射给予小鼠，共注射12次。对于用PD-1抑制剂进行的免疫疗法，从肿瘤攻击后第10天开始给予(200μg/小鼠)抗PD-1抗体(克隆29F.1A12，BioXCell)，此后每三天给予。
为了评估EpCAM-AsiC对肺转移性乳腺肿瘤的抗肿瘤功效，首先将4T1E-Luc细胞与150μg/ml D-萤光素(PerkinElmer)混合，并使用IVIS Lumina II系统(Caliper LifeSciences)通过发光成像检查它们的萤光素酶活性。对BALB/c小鼠静脉内注射4T1E-Luc细胞(每只小鼠约3×105个细胞)，并在肿瘤攻击后第7天开始用EpCAM适体或EpCAM-AsiC混合物处理。i.p.注射150mg/kg D-萤光素后，在肿瘤攻击后立即拍摄全身的发光图像，此后每5天拍摄，持续20天。尸检时分离肺以用于分析。
RNA
将具有2'-氟嘧啶的19nt EpCAM适体和具有缀合至其5'末端的荧光Cy3的EpCAM适体(EpCAM-Cy3)(Trilink Biotechnologies或Dharmacon)用作对照RNA寡核苷酸。候选小鼠或人类基因特异性siRNA或者小鼠和人类基因交叉反应性siRNA是预先设计的ON-TARGETplus siRNA和/或使用siDESIGN工具设计(均来自Dharmacon)。通过使用qRT-PCR比较其在小鼠和/或人BC细胞系中的体外基因敲低效率来选择用于EpCAM-AsiC构建的siRNA。将ON-TARGETplus非靶向池siRNA用作阴性对照(Dharmacon)。选择具有最佳基因敲低能力和最低Tm值的siRNA序列。对于EpCAM适体-siRNA缀合，对具有EpCAM适体、U-U-U接头和siRNA正义链的AsiC的长链进行合成，使其具有2'-氟嘧啶和在其3'末端的dTdT突出端。使用2倍摩尔过量的短链(均来自Trilink Biotechnologies)将其与siRNA的反义链退火。长链RNA oligo最初被加热到95℃10分钟。然后加入短链RNA以与长链在65℃下退火7分钟。使混合物在室温下冷却20分钟。使用Illustra MicroSpin G-25柱(GE Healthcare LifeSciences)进一步纯化退火的EpCAM-AsiC双链体。表5和表6中提供了siRNA和EpCAM-AsiC序列。
小鼠和人BC细胞系的RNA摄取
以每孔30,000个细胞将小鼠和人BC细胞系铺板在96孔板中。在Opti-MEM培养基(补充有5mM MgCl2、0.1mg/ml tRNA和0.1mg/ml鲑鱼精子DNA)中将细胞与一系列浓度的EpCAM-Cy3(0-1000nmol/L)孵育6小时(全部来自ThermoFisher)。然后加入补充有20％FBS的完全培养基，并将细胞培养72小时。在4℃下通过孵育并用补充有5mM MgCl2、0.5M NaCl和0.2N乙酸的DPBS洗涤缓冲液洗涤来洗掉表面结合的EpCAM-Cy3。通过活/死固定aqua死细胞染色(ThermoFisher)对所得细胞悬浮液进行活细胞染色，并通过流式细胞术分析EpCAM-Cy3内化的量。使用GraphPad Prism8从单结合位点双曲线的非线性回归分析计算每个BC细胞系的EpCAM-Cy3摄取能力的动力学参数Kd。
基因敲低和qRT-PCR
对于体外siRNA介导的基因沉默，在96孔板中以每孔10,000个细胞接种后立即使用细胞。根据制造商方案(Dharmacon)，使用Dharmafect I用6.25nmol/L-100nmol/L的siRNA转染细胞。将细胞在无血清和无抗生素的培养基中转染6-8小时，然后添加补充有20％FBS的培养基。24-48小时后提取RNA，并通过qRT-PCR评估基因敲低。对于体外EpCAM-AsiC介导的基因沉默，将细胞与4μmol/L EpCAM适体或EpCAM-AsiC在WIT-T培养基中孵育。在处理后72-96小时分别通过qRT-PCR和流式细胞术测量mRNA和蛋白水平来评估基因敲低。如附图所示，在处理后24-96小时通过CellTiter-Glo(Promega)测量细胞活力。通过CellTiter 96Aqueous One Solution细胞增殖测定(MTS测定，Promega)测量细胞增殖。对于体内基因沉默实验，从用EpCAM适体或EpCAM-AsiC处理的小鼠收集肿瘤。通过肿瘤消化和匀浆制备单细胞悬液。根据制造商方案(Miltenyi Biotec)，通过使用CD45微珠进行负选择并使用CD326(EpCAM)微珠进行正选择来去除死细胞并富集CD45-EpCAM+肿瘤细胞。收集来自相同肿瘤的CD45-EpCAM-细胞作为对照。分别通过qRT-PCR和流式细胞术在mRNA和蛋白水平测量两个细胞子集中的基因敲低。对于qRT-PCR，使用TRIzol(ThermoFisher)和Direct-zolRNA miniprep试剂盒(ZYMO Research)提取总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)对RNA浓度进行定量。使用High Capacity cDNA反转录试剂盒(ThermoFisher)进行cDNA合成。使用对应于靶基因或看家基因GAPDH(IDT)的引物、SsoFastEvaGreen Supermix和Bio-rad C1000热循环仪(Bio-Rad)进行cDNA的qRT-PCR。
组织学、IHC和荧光显微术
用10％福尔马林固定肿瘤、储存在70％乙醇中并包埋在石蜡中。切下切片(5μm)、空气干燥、固定以进行苏木精和伊红(H&E)染色以及IHC染色(由Dana-Farbar CancerInstitute Rodent Histopathology Core和Dana-Farber/Harvard Cancer CenterSpecialized Histopathology Core如先前的描述进行)113,126。使用5μg/ml抗CD8抗体(克隆4SM15，ThermoFisher)。将切片扫描到Aperio图像分析平台中。然后使用ImageScope软件(Aperio Technology)在感兴趣区域(ROI，6个视野/切片)中可视化并数字注释CD8+T细胞的数量，并使用图像分析算法(Aperio Technology)分析ROI。
对于共聚焦显微术，将10,000个细胞接种在16孔室载玻片(chamber slide)(ThermoFisher)的每个孔中，并与在补充有5mM MgCl2、0.1mg/ml tRNA和0.1mg/ml鲑鱼精子DNA的Opti-MEM培养基中稀释的1000nmol/LEpCAM-Cy3共培养。6小时后加入补充有20％FBS的完全培养基。将细胞培养72小时，并用补充有5mM MgCl2、0.5M NaCl和0.2N乙酸的冰冷却DPBS高盐洗涤缓冲液洗涤，以去除表面结合的EpCAM-Cy3。然后将细胞用CellMaskDeep Red Plasma Membrane Stain(ThermoFisher)进行复染，用3％多聚甲醛和0.5％戊二醛固定，用Hoechst 33342复染并封片。使用Zeiss LSM 800共聚焦激光扫描显微镜检测荧光，并使用ZEN 2.3成像软件(Carl Zeiss)获取图像。
从小鼠分离免疫细胞
如所描述的127收集外周血单核细胞和TIC。简言之，通过下颌下穿刺收集血液并通过Histopaque梯度离心(SigmaAldrich)分离PBMC。用1×RBC裂解缓冲液裂解红细胞。为了分离TIC，将肿瘤切成小块，并在37℃下伴随搅拌用补充有2mg/ml胶原酶D、100μg/ml DNaseI(均来自SigmaAldrich)和2％FBS的RPMI消化缓冲液处理30min。然后将样本均质化并通过40μm过滤器过滤，通过Percoll梯度离心(GE Healthcare)纯化免疫细胞，并用Leibovitz’sL-15培养基(Gibco，ThermoFisher)洗涤。
抗体染色和流式细胞术
对从小鼠分离的免疫细胞用如下抗体染色：抗CD45-PerCPCy5.5或-PacBlue；CD3-PE-Cy7、-FITC或-APC；CD8-PacBlue、-PerCPCy5.5、-Alexa700、-FITC或-APC；CD4-PE-Cy7、-APC或-PerCPCy5.5；CD19-FITC；CD25-PE；CD44-PerCPCy5.5或PacBlue；Gr-1-FITC或-PE；CD11b-Alexa700；CD11c-APC或-PE-Cy7；DEC205-PE；CD49b-PerCPCy5.5、-PacBlue或FITC；NKp46-APC、F4/80-PE-Cy7；MHCII-PacBlue；CD206-APC；TCR-α-FITC；TER-119-FITC；EpCAM-PE-Cy7；CD47-FITC；CD40-APC；CD86-FITC；CD107a-APC；CD107b-APC；PD-1-PE-Cy7；2B4-FITC；CTLA-4-PE；LAG-3-APC；TIM-3-PerCPCy5.5(均来自Biolegend)。使用添加了细胞表面抗体的活/死固定aqua死细胞染色(ThermoFisher)排除死细胞。
小鼠TAM定义为：活+CD45+CD3-CD19-Ter119-TCRβ-CD11b+F4/80+128。M1 TAM定义为：活+CD45+CD3-CD19-Ter119-TCRβ-CD11b+F4/80+CD206-MHC+；M2 TAM定义为：活+CD45+CD3-CD19-Ter119-TCRβ-CD11b+F4/80+CD206+MHC+。注意：不遵守这些表达组(expression panel)中任一者的TAM不被归类为M1或M2 TAM。这与之前的研究一致，其表明小鼠乳腺肿瘤中的TAM主要表征为CD45+CD11b+F4/80+MHCII+细胞129。对于UPF2、颗粒酶B或穿孔素的细胞内染色，首先在4℃下用针对细胞表面标志物的抗体对细胞进行染色30分钟，然后用固定/透化缓冲液(BD Pharmingen)进行固定和透化，并用抗UPF2一抗(克隆D3B10，Cell SignalingTechnology)或兔单克隆IgG同种型抗体(Abcam)、抗颗粒酶B-PacBlue或-APC(ThermoFisher)和穿孔素-PE(Biolegend)进行染色。用山羊抗兔IgG H&L-APC二抗(Abcam)进一步检测UPF2。对于Foxp3染色，首先对细胞进行表面标志物染色，然后用Foxp3/转录因子染色缓冲液固定和透化，并用Foxp3-PercpCy5.5或-PE(ThermoFisher)进行染色。对于离体刺激的淋巴细胞的细胞内细胞因子染色，将每个样本大约106个细胞在含有2％FBS的RPMI培养基中培养并用PMA(50ng/ml，Sigma)、离子霉素(2μg/ml，Sigma)和Golgiplug(1.5μg/ml，ThermoFisher)刺激4小时。将用单独的Golgiplug和培养基培养的细胞作为阴性对照。然后在固定/透化后用针对IFN-γ-PacBlue或-APC和TNF-PE-Cy7的抗体对细胞进行染色。通过BD FACSCanto II(BD Biosciences)对细胞进行分析，并使用FlowJo V.10(TreeStrar)分析数据。
CD8+TIL脱粒和细胞毒性测定
使用CD45或CD8微珠(Miltenyi Biotec)对肿瘤浸润免疫细胞的单细胞悬液富集CD45+或CD8+细胞。对于脱粒测定，首先通过流式细胞术测定新鲜分离的CD45+细胞中CD8+TIL的数量。将CD8+TIL与一天前铺板在48孔板中的自体靶肿瘤细胞以1:3的比例在含有10％FBS的RPMI培养基中共培养。在共培养开始时加入针对CD107a-APC和CD107b-APC的抗体(各1mg/ml，Biolegend)和IL-2(100IU/ml)。阳性对照细胞用PMA(50ng/ml)和离子霉素(2μg/ml)处理，而阴性对照样本用培养基和IL-2处理。将共培养物在37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时，然后加入分泌抑制剂莫能菌素(1:1000，Biolegend)和Golgi Plug(1.5μg/ml)再孵育5小时。在刺激后将TIL从共培养物中洗出并重新铺板到96孔板中，对活细胞染色，然后在固定/透化后用针对CD8、IFN-γ和TNF的抗体染色。对于CD8+TIL细胞毒性测定，将自体靶肿瘤细胞用铬-51(51Cr)标记并提前一天铺板在96孔板中。将新鲜分离的CD8+TIL与靶肿瘤细胞以5:1的比例在含有10％FBS并补充有IL-2(100IU/ml)的RPMI培养基中共培养30小时。实现有效靶肿瘤细胞杀灭所需的共培养CD8+TIL的时间已由先前研究确定130。使用以1％SDS培养的CD8+TIL设置最大51Cr释放，使用在仅培养基和IL-2中培养的CD8+TIL设置自发51Cr释放。使用以下公式计算靶细胞裂解的百分比：特异性裂解％＝((测试51Cr释放)-(自发51Cr释放))/((最大51Cr释放)-(自发51Cr释放))×100。
离体吞噬作用测定
通过死细胞去除试剂盒(Miltenyi Biotec)去除死细胞并使用F4/80微珠(Miltenyi Biotec)从肿瘤浸润免疫细胞中富集TAM。首先通过流式细胞术确定新鲜分离的F4/80+细胞中活+CD11b+F4/80+TAM的数量。在72小时前用阴性对照或CD47 siRNA处理4T1E-eGFP肿瘤以敲低CD47表达。在37℃下将50,000个TAM与200,000个4T1E-eGFP细胞在RPMI无血清培养基中共培养3小时。然后将细胞用补充有0.5％BSA和2mM EDTA的DPBS洗涤3次，用抗CD45、CD11b和F4/80染色并通过流式细胞术进行分析。GFP高的TAM被认为是具有吞噬作用。
单细胞RNA测序
样本制备
用约105个细胞/每只小鼠原位攻击BALB/c小鼠。肿瘤攻击后三天，通过皮下注射每3天用EpCAM适体或靶向UPF2、PARP1、CD47和MCL1的EpCAM-AsiC混合物对小鼠进行处理。在第14天，收获肿瘤，在37℃下与在不含Ca2+和Mg2+的RPMI培养基(ThermoFisher)中稀释的100μg/ml Liberase TL(Roche)孵育15分钟，然后在37℃下振荡10分钟。然后用40μm过滤器将样本过滤两次。去除死细胞，并在4℃下用CD45微珠富集CD45+细胞。通过流式细胞术确认超过95％的细胞为CD45+。以200,000个细胞/ml将富集的细胞在含1％FBS的不含Ca2+和Mg2+的RPMI培养基中稀释，并保持在冰上直至细胞流入微流体装置。使用inDrop技术封装每个样本6,000个细胞，其中一半样本用于文库制备，另一半储存用于备份目的。独立处理每个条件下的两个生物学重复，并将来自两个样本的测序数据联合用于数据分析。如先前所发表的131在Harvard Medical School Single Cell Core进行InDrop平台上的单细胞封装和RNA捕获以及文库制备。在微流体液滴内将单细胞转录组条码化(barcoded)。在液滴逆转录后，将大约3,000个细胞的乳液破坏并用于文库制备。文库使用V3测序接头(adaptor)进行索引(indexed)，以等摩尔比率从不同样本中汇集，并在Illumina NextSeq 500系统上使用NextSeq 75High Output Kits使用标准Illumina测序引物进行测序，对于读段1为61个循环；对于读段2为14个循环；对于索引读段1和索引读段2为各8个循环。
数据处理
使用先前在Python(github.com/indrops/indrops)中发布的管道利用默认参数132来处理原始数据。简言之，通过相应的文库索引对读段进行过滤和分选。然后，对有效读段进行多路分解并通过细胞条码进行分选。包含少于250个总读段的细胞条码被舍弃，并将剩余的读段与参考小鼠转录组(Ensembl GRCm38 release 87)比对。然后，将比对的读段量化为用于所有下游分析的估算计数矩阵。
预聚类过滤、归一化和批量校正
使用Seurat包版本2.3133在R版本3.5.2中进行处理数据的分析。将所有样本合并在一起。计算每个细胞的线粒体转录物百分比(percent.mito)和每个基因的平均UMI(nUMI.nGene.ratio)。使用以下截止值过滤低质量细胞：nGene——min.50，max.2000；percent.mito——min.-Inf，max.0.25；nUMI.nGene.ratio——min.1，max.5。使用默认参数执行NormalizeData函数以消除跨细胞测序深度中的差异。将ScaleData函数用于消除由批次和线粒体基因表达驱动的基因表达中的细胞-细胞变异。
维数缩减和无监督聚类
在分析的三个阶段进行维数缩减：可变基因的选择、PCA以及均匀流形逼近和投影(UMAP)。将FindVariableGenes函数用于选择2274个高度可变基因，覆盖整个转录组中包含的大部分生物学信息。然后，将可变基因用于通过RunPCA函数实施的PCA。接下来，选择PC1-20作为输入以执行RunUMAP函数以获得每个细胞的二维坐标。我们使用基于与RunUMAP函数相同的PC的Louvain算法执行FindClusters函数(分辨率0.4)来对细胞进行聚类。
DEG的鉴定和GO分析
本发明人基于归一化数据使用FindMarkers或FindAllMarkers函数(test.use＝“t”，logfc.threshold＝log(1.6))来鉴定差异表达的基因(DEG)。基于数据集中的基因总数，使用Bonferroni校正进行P值调整。将调整后的p值>0.05的DEG过滤掉。通过使用R包clusterProfiler来进行基因本体(GO)分析134。
大量RNA测序(Bulk RNA sequencing)
用100nM阴性对照siRNA或ON-TARGETplus人UPF2 siRNA-SMARTpool(均来自Dharmacon)转染EpCAMhiMDA-MB-231细胞72小时。转染实现了超过80％的UPF2 mRNA敲低。使用TRIzol和Direct-zol RNA miniprep试剂盒从每个样本提取总RNA。将每个条件下的三个生物学重复用于RNA测序文库制备。所有样本的RNA完整指数(RIN)均由Harvard MedicalSchool Biopolymers Facility中的Agilent 2100生物分析仪确定。所有RNA样本的RIN均大于9。在polyA-mRNA分离(New England BioLabs)后使用
Figure BDA0003512851930001131
UltraTMII定向RNA文库制备试剂盒制备标准mRNA文库。将阴性对照和UPF2 siRNA转染样本的文库分别合并，并将每个合并在Illumina Hiseq X10 PE100系统的一个通道上运行，每个样本产生约2.4亿个映射的150bp双端读段。使用HISAT2将序列与参考基因组GRCh38(Ensembl release98)进行比对135。我们使用并入DEXSeq和HTSeq计数的管道借助参考GRCh38_98来鉴定差异外显子使用(DEU)事件136,137。DEU分析限于在至少3个样本中具有至少10个读段的外显子。如果DEU事件达到多重假设调整的p值<0.05，则它们是显著的。将StringTie用于在GRCh38_98参考上使用引导组装方法将读段组装成新的带注释的转录物138。然后使用StringTie的合并功能将每个样本的组装结果整合到统一的转录物参考中。将Kallisto用于量化来自StringTie生成的参考的转录物丰度139。使用IsoformSwitchAnalyzeR鉴定差异亚型使用事件(DIU)136,140。IsoformSwitchAnalyzer还提供提前终止密码子(PTC)的预测，用于读出潜在的NMD敏感性。如果亚型使用的变化达到q值<0.05，则该变化是显著的。
统计分析
将学生t检验(双尾)或Mann-Whitney检验用于确定两组之间的差异。将单因素或双因素ANOVA用于计算多个群之间的差异。通过如下方式来比较肿瘤生长曲线之间的差异：首先计算每个样本的曲线下面积值，然后使用学生t检验或单因素ANOVA对不同的组进行比较。通过具有I型误差校正的多重t检验确定随肿瘤生长的不同时间点处肿瘤体积的比较。I型误差通过Holm-Sidak方法进行校正。显著性设定为p值等于或低于0.05。对于所有附图，*p≤0.05、**p≤0.01、***p≤0.001、****p≤0.0001。所有统计分析均使用GraphPad Prism8进行。
参考文献
1.Kumar，P.&Aggarwal，R.An overview of triple-negative breastcancer.Arch.Gynecol.Obstet.293，247-269(2016).
2.Padmanabhan，R.，Kheraldine，H.S.，Meskin，N.，Vranic，S.&Moustafa，Al，A.-E.Crosstalk between HER2 and PD-1/PD-L1 in Breast Cancer：From ClinicalApplications to Mathematical Models.Cancers 12，636(2020).
3.Al-Mahmood，S.，Sapiezynski，J.，Garbuzenko，O.B.&Minko，T.Metastatic andtriple-negative breast cancer：challenges and treatment options.Drug DelivTransl Res 8，1483-1507(2018).
4.Wang，J.&Xu，B.Targeted therapeutic options and future perspectivesfor HER2-positive breast cancer.Signal Transduct Target Ther 4，34(2019).
5.Cameron，D.et al.11years′follow-up of trastuzumab after adjuvantchemotherapy in HER2-positive early breast cancer：final analysis of theHERceptin Adjuvant (HERA)trial.Lancet 389，1195-1205(2017).
6.Yang，Y.Cancer immunotherapy：harnessing the immune system to battlecancer.，J.Clin.Invest.125，3335-3337(2015).
7.Lawrence，M.S.et al.Mutational heterogeneity in cancer and thesearch for new cancer-associated genes.Nature 499，214-218(2013).
8.Banerji，S.et al.Sequence analysis of mutations and translocationsacross breast cancer subtypes.Nature 486，405-409(2012).
9.Stephens，P.J.et al.The landscape of cancer genes and mutationalprocesses in breast cancer.Nature 486，400-404(2012).
10.van de Vijver，M.J.et al.A Gene-Expression Signature as a Predictorof Survival in Breast Cancer.N Engl J Med 347，1999-2009(2002).
11.Kroemer，G.，Senovilla，L.，Galluzzi，L.，André，F.&Zitvogel，L.Naturaland therapy-induced immunosurveillance in breast cancer.Nat.Med.21，1128-1138(2015).
12.Kwa，M.J.&Adams，S.Checkpoint inhibitors in triple-negative breastcancer (TNBC)：Where to go from here.Cancer 9，457(2018).
13.Adams，S.et al.Current Landscape of Immunotherapy in Breast Cancer：A Review.JAMA Oncology 5，1205-1214(2019).
14.Disis，M.L.&Stanton，S.E.Triple-negative breast cancer：immunemodulation as the new treatment paradigm.Am Soc Clin Oncol Educ Book 35，e25-30(2015).
15.Dieci，M.V.et al.Prognostic and predictive value of tumor-infiltrating lymphocytes in two phase III randomized adjuvant breast cancertrials.Ann.Oncol.26，1698-1704(2015).
16.Gao，G.，Wang，Z.，Qu，X.&Zhang，Z.Prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in patients with triple-negative breast cancer：asystematic review and meta-analysis.BMC Cancer 20，179-15(2020).
17.Gubin，M.M.et al.Checkpoint blockade cancer immunotherapy targetstumour-specific mutant antigens.Nature 515，577-581(2014).
18.Van Allen，E.M.et al.Genomic correlates of response to CTLA-4blockade in metastatic melanoma.Science 350，207-211(2015).
19.Asaoka，Y.，Ijichi，H.&Koike，K.PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency.N Engl J Med 373，1979(2015).
20.Llosa，N.J.et al.The vigorous immune microenvironment ofmicrosatellite instable colon cancer is balanced by multiple counter-inhibitory checkpoints.Cancer Discovery 5，43-51(2015).
21.Rizvi，N.A.et al.Cancer immunology.Mutational landscape determinessensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer.Science 348，124-128(2015).
22.Xiao，Y.&Freeman，G.J.The Microsatellite Instable Subset ofColorectal Cancer Is a Particularly Good Candidate for Checkpoint BlockadeImmunotherapy.Cancer Discovery 5，16-18(2015).
23.Weinmann，S.C.&Pisetsky，D.S.Mechanisms of immune-related adverseevents during the treatment of cancer with immune checkpointinhibitors.Rheumatology (Oxford)58，vii59-vii67(2019).
24.Chen，D.S.&Mellman，I.Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.Nature 541，321-330(2017).
25.Chen，D.S.&Mellman，I.Oncology meets immunology：the cancer-immunitycycle.Immunity39，1-10(2013).
26.Gilboa-Geffen，A.et al.Gene Knockdown by EpCAM Aptamer-siRNAChimeras Suppresses Epithelial Breast Cancers and Their Tumor-InitiatingCells.Mol.Cancer Ther.14，2279-2291(2015).
27.Wheeler，L.A.et al.Durable knockdown and protection from HIVtransmission in humanized mice treated with gel-formulated CD4 aptamer-siRNAchimeras.Mol.Ther.21，1378-1389(2013).
28.Wheeler，L.A.et al.Inhibition of HIV transmission in humancervicovaginal explants and humanized mice using CD4 aptamer-siRNAchimeras.J.Clin.Invest.121，2401-2412(2011).
29.Berezhnoy，A.，Castro，I.，Levay，A.，Malek，T.R.&Gilboa，E.Aptamer-targeted inhibition of mTOR in T cells enhances antitumorimmunity.J.Clin.Invest.124，188-197(2014).
30.McNamara，J.O.et al.Cell type-specific delivery of siRNAs withaptamer-siRNA chimeras.Nat.Biotechnol.24，1005-1015(2006).
31.Spizzo，G.et al.EpCAM expression in primary tumour tissues andmetastases：an immunohistochemical analysis.Journal of Clinical Pathology 64，415-420(2011).
32.Huang，L.et al.Functions of EpCAM in physiological processes anddiseases (Review).Int.J.Mol.Med.42，1771-1785(2018).
33.Osta，W.A.et al.EpCAM is overexpressed in breast cancer and is apotential target for breast cancer gene therapy.Cancer Res.64，5818-5824(2004).
34.Imrich，S.，Hachmeister，M.&Gires，O.EpCAM and its potential role intumor-initiating cells.Cell Adh Migr6，30-38(2012).
35.Goodwin，C.M.，Rossanese，O.W.，Olejniczak，E.T.&Fesik，S.W.Myeloid cellleukemia-1 is an important apoptotic survival factor in triple-negativebreast cancer.Cell Death and Differentiation 201522：12 22，2098-2106(2015).
36.Campbell，K.J.et al.MCL-1 is a prognostic indicator and drug targetin breast cancer.Cell Death Dis9，19-14(2018).
37.Yang，L.et al.Wntmodulates MCL1 to control cell survival in triplenegative breast cancer.BMC Cancer 14，124-13(2014).
38.Berezhnoy，A.，Brenneman，R.，Bajgelman，M.，Seales，D.&Gilboa，E.ThermalStability of siRNA Modulates Aptamer-conjugated siRNA Inhibition.MolecularTherapy-Nucleic Acids1，e51(2012).
39.Popp，M.W.&Maquat，L.E.Attenuation of nonsense-mediated mRNA decayfacilitates the response to chemotherapeutics.Nature Communications 6，1-17(2015).
40.Lou，C.H.et al.Posttranscriptional control of the stem cell andneurogenic programs by the nonsense-mediated RNA decay pathway.Cell Reports6，748-764(2014).
41.Maquat，L.E.Nonsense-mediated mRNA decay：splicing，translation andmRNP dynamics.Nat Rev Mol Cell Biol 5，89-99(2004).
42.Gardner，L.B.Nonsense-mediated RNA decay regulation by cellularstress：implications for tumorigenesis.Mol.Cancer Res.8，295-308(2010).
43.Takada，K.et al.Use of the tumor-infiltrating CD8 to FOXP3lymphocyte ratio in predicting treatment responses to combination therapywith pertuzumab，trastuzumab，and docetaxel for advanced HER2-positive breastcancer.J Transl Med 16，86-11(2018).
44.Peng，G.-L.et al.CD8+ cytotoxic and FoxP3+ regulatory T lymphocytesserve as prognostic factors in breast cancer.Am J Transl Res 11，5039-5053(2019).
45.Bouchard，V.J.，Rouleau，M.&Poirier，G.G.PARP-1，a determinant of cellsurvival in response to DNA damage.Exp.Hematol.31，446-454(2003).
46.Malyuchenko，N.V.，Kotova，E.Y.，Kulaeva，O.I.，Kirpichnikov，M.P.&Studitskiy，V.M.PARP1 Inhibitors：antitumor drug design.Acta Naturae 7，27-37(2015).
47.Li，M.-X.et al.Human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1translocalizes to mitochondria after photodynamic therapy and protects cellsfrom apoptosis.Cancer Sci.103，882-888(2012).
48.Shah，F.et al.Exploiting the Ref-1-APE1 node in cancer signalingand other diseases：from bench to clinic.npj Precision Oncology 2017 1：1 1，19(2017).
49.Willingham，S.B.et al.The CD47-signal regulatory protein alpha(SIRPa)interaction is a therapeutic target for human solid tumors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109，6662-6667(2012).
50.Tseng，D.et al.Anti-CD47 antibody-mediated phagocytosis of cancerby macrophages primes an effective antitumor T-cell response.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，11103-11108(2013).
51.Liu，X.et al.CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction ofimmunogenic tumors.Nat.Med.21，1209-1215(2015).
52.Genard，G.，Lucas，S.&Michiels，C.Reprogramming of Tumor-AssociatedMacrophages with Anticancer Therapies：Radiotherapy versus Chemo-andImmunotherapies.Front Immunol8，828(2017).
53.van Dalen，F.J.，van Stevendaal，M.H.M.E.，Fennemann，F.L.，Verdoes，M.&Ilina，O.Molecular Repolarisation of Tumour-Associated Macrophages.Molecules24，9(2018).
54.Lee，C.et al.Targeting of M2-like tumor-associated macrophages witha melittin-based pro-apoptotic peptide.J Immunother Cancer 7，147(2019).
55.Willis，S.N.et al.Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xL，but not Bcl-2，until displaced by BH3-only proteins.Genes Dev.19，1294-1305(2005).
56.Marra，A.，Viale，G.&Curigliano，G.Recent advances in triple negativebreast cancer：the immunotherapy era.BMC Med 17，90-9(2019).
57.Mittendorf，E.A.et al.PD-L1 expression in triple-negative breastcancer.Cancer Immunol Res 2，361-370(2014).
58.Zitvogel，L.&Kroemer，G.Targeting PD-1/PD-L1 interactions for cancerimmunotherapy.OncoImmunology 1，1223-1225(2012).
59.Emens，L.A.et al.Long-term Clinical Outcomes and Biomarker Analysesof Atezolizumab Therapy for Patients With Metastatic Triple-Negative BreastCancer：A Phase 1 Study.JAMA Oncology5，74-82(2019).
60.Keenan，T.E.&Tolaney，S.M.Role of Immunotherapy in Triple-NegativeBreast Cancer.Journal of the National Comprehensive Cancer Network 18，479-489(2020).
61.Turpin，J.et al.The ErbB2ΔEx16 splice variant is a major oncogenicdriver in breast cancer that promotes a pro-metastatic tumormicroenvironment.Oncogene 35，6053-6064(2016).
62.Tseng，L.M.et al.Distant metastasis in triple-negative breastcancer.Neoplasma 60，290-294(2013).
63.Jin，L.et al.Breast cancer lung metastasis：Molecular biology andtherapeutic implications.Cancer Biol.Ther.19，858-868(2018).
64.Gennari，A.，Conte，P.，Rosso，R.，Orlandini，C.&Bruzzi，P.Survival ofmetastatic breast carcinoma patients over a 20-year period.Cancer 104，1742-1750(2005).
65.Dan，Z.et al.A pH-Responsive Host-guest Nanosystem LoadingSuccinobucol Suppresses Lung Metastasis of Breast Cancer.Theranostics 6，435-445(2016).
66.Anders，C.&Carey，L.A.Understanding and treating triple-negativebreast cancer.Oncology(Williston Park，N.Y.)22，1233-9-discussion 1239-40-1243(2008).
67.Tarantino，P.&Curigliano，G.Defining the immunogram of breastcancer：a focus on clinical trials.Expert Opin Biol Ther 19，383-385(2019).
68.Holgado，E.，Perez-Garcia，J.，Gion，M.&Cortes，J.Is there a role forimmunotherapy in HER2-positive breast cancer？NPJ Breast Cancer 4，21-3(2018).
69.Krasniqi，E.et al.Immunotherapy in HER2-positive breast cancer：state of the art and future perspectives.J Hematol Oncol 12，111-26(2019).
70.Setten，R.L.，Rossi，J.J.&Han，S.-P.The current state and futuredirections of RNAi-based therapeutics.Nat Rev Drug Discov 18，421-446(2019).
71.Scott，L.J.Givosiran：First Approval.Drugs 80，335-339(2020).
72.Lorenzer，C.，Dirin，M.，Winkler，A.-M.，Baumann，V.&Winkler，J.Goingbeyond the liver：progress and challenges of targeted delivery of siRNAtherapeutics.J Control Release 203，1-15(2015).
73.Wu，C.-J.，Mannan，P.，Lu，M.&Udey，M.C.Epithelial cell adhesionmolecule (EpCAM)regulates claudin dynamics and tightjunctions.J.Biol.Chem.288，12253-12268(2013).
74.Baeuerle，P.A.&Gires，O.EpCAM(CD326)finding its role in cancer.Br JCancer 96，417-423(2007).
75.Wu，S.Y.，Lopez-Berestein，G.，Calin，G.A.&Sood，A.K.RNAi therapies：drugging the undruggable.Sci Transl Med 6，240ps7-240ps7(2014).
76.Zhou，J.&Rossi，J.Aptamers as targeted therapeutics：currentpotential and challenges.Nat Rev Drug Discov 16，440-440(2017).
77.Zhou，G.et al.Aptamers：A promising chemical antibody for cancertherapy.Oncotarget 7，13446-13463(2016).
78.Robbins，M.et al.2′-O-methyl-modified RNAs act as TLR7antagonists.Mol.Ther.15，1663-1669(2007).
79.Bramsen，J.B.et al.A large-scale chemical modification screenidentifies design rules to generate siRNAs with high activity，high stabilityand low toxicity.Nucleic Acids Research 37，2867-2881(2009).
80.McLennan，D.N.，Porter，C.J.H.&Charman，S.A.Subcutaneous drug deliveryand the role of the lymphatics.Drug Discov Today Technol2，89-96(2005).
81.Nair，J.K.et al.Impact of enhanced metabolic stability onpharmacokinetics and pharmacodynamics of GalNAc-siRNA conjugates.NucleicAcids Research 45，10969-10977(2017).
82.Snead，N.M.，Escamilla-Powers，J.R.，Rossi，J.J.&McCaffrey，A.P.5′Unlocked Nucleic Acid Modification Improves siRNA Targeting.MolecularTherapy-Nucleic Acids 2，e103(2013).
83.Janas，M.M.et al.Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limitedoff-target-driven rat hepatotoxicity.Nature Communications9，723-10(2018).
84.Dowdy，S.F.Overcoming cellular barriers for RNAtherapeutics.Nat.Biotechnol.35，222-229(2017).
85.Farokhzad，O.C.et al.Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugatesfor cancer chemotherapy in vivo.Proceedings of the National Academy ofSciences 103，6315-6320(2006).
86.Xing，H.et al.Selective Delivery of an Anticancer Drug withAptamer-Functionalized Liposomes to Breast Cancer Cells in Vitro and inVivo.J Mater Chem B 1，5288-5297(2013).
87.Tan，L.，Neoh，K.G.，Kang，E.-T.，Choe，W.S.&Su，X.PEGylated anti-MUC1aptamer-doxorubicin complex for targeted drug delivery to MCF7 breast cancercells.Macromol Biosci 11，1331-1335(2011).
88.Zhou，W.et al.Aptamer-nanoparticle bioconjugates enhanceintracellular delivery of vinorelbine to breast cancer cells.J Drug Target22，57-66(2014).
89.Jiang，T.et al.Tumor neoantigens：from basic research to clinicalapplications.JHematol Oncol 12，1-13(2019).
90.Peng，M.et al.Neoantigen vaccine：an emerging tumorimmunotherapy.Mol.Cancer 18，128-14(2019).
91.Kervestin，S.&Jacobson，A.NMD：a multifaceted response to prematuretranslational termination.Nat Rev Mol(ell Biol 13，700-712(2012).
92.Chamieh，H.，Ballut，L.，Bonneau，F.&Le Hir，H.NMD factors UPF2 and UPF3bridge UPF1 to the exon junction complex and stimulate its RNA helicaseactivity.Nat.Struct.Mol.Biol.15，85-93(2008).
93.Bao，J.et al.UPF2-Dependent Nonsense-Mediated mRNA Decay Pathway IsEssential for Spermatogenesis by Selectively Eliminating Longer 3′UTRTranscripts.PLoS Genet 12，e1005863(2016).
94.Wittmann，J.，Hol，E.M.&
Figure BDA0003512851930001181
H.-M.hUPF2 silencing identifiesphysiologic substrates of mammalian nonsense-mediated mRNAdecay.Mol.Cell.Biol.26，1272-1287(2006).
95.Mendell，J.T.，Sharifi，N.A.，Meyers，J.L.，Martinez-Murillo，F.&Dietz，H.C.Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes ofmammalian transcripts and mutes genomic noise.Nat.Genet.36，1073-1078(2004).
96.Weischenfeldt，J.et al.Mammalian tissues defective in nonsense-mediated mRNA decay display highly aberrant splicing patterns.Genome Biol.13，R35-19(2012).
97.Ni，J.Z.et al.Ultraconserved elements are associated withhomeostatic control of splicing regulators by alternative splicing andnonsense-mediated decay.Genes Dev.21，708-718(2007).
98.Pastor，F.，Kolonias，D.，Giangrande，P.H.&Gilboa，E.Induction of tumoutimmunity by targeted inhibition of nonsense-mediated mRNA decay.Nature 465，227-230(2010).
99.Tani，H.et al.Identification of hundreds of novel UPF1 targettranscripts by direct determination of whole transcriptome stability.RNA Biol9，1370-1379(2012).
100.Weischenfeldt，J.et al.NMD is essential for hematopoietic stem andprogenitor cells and for eliminating by-products of programmed DNArearrangements.Genes Dev.22，1381-1396(2008).
101.Gardner，L.B.Hypoxic inhibition of nonsense-mediated RNA decayregulates gene expression and the integrated stressresponse.Mol.Cell.Biol.28，3729-3741(2008).
102.Yi，M.et al.6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3and 4：A pair of valves for fine-tuning of glucose metabolism in humancancer.Mol Metab 20，1-13(2019).
103.Tillinger，A.，Nostramo，R.，Kvetnansky，R.，Serova，L.&Sabban，E.L.Stress-induced changes in gene expression of urocortin 2 and other CRHpeptides in rat adrenal medulla：involvement ofglucocorticoids.J.Neurochem.125，185-192(2013).
104.Brambillasca，S.et al.CDK5 regulatory subunit-associated protein1-like 1(CDKAL1)is a tail-anchored protein in the endoplasmic reticulum(ER)ofinsulinoma cells.J.Biol.Chem.287，41808-41819(2012).
105.Tomar，D.et al.TRIM4；a novel mitochondrial interacting RING E3ligase，sensitizes the cells to hydrogen peroxide(H2O2)induced cell death.FreeRadic.Biol.Med.89，1036-1048(2015).
106.Cancer Genome Atlas Network.Comprehensive molecular portraits ofhuman breast tumours.Nature 490，61-70(2012).
107.Saravia，C.H.et al.Patterns of Mutation Enrichment in MetastaticTriple-Negative Breast Cancer.Clin Med Insights Oncol 13，1179554919868482(2019).
108.Telli，M.L.et al.Homologous recombination deficiency(HRD)statuspredicts response to standard neoadjuvant chemotherapy in patients withtriple-negative or BRCA1/2 mutation-associated breast cancer.Breast CancerRes.Treat.168，625-630(2018).
109.Dziadkowiec，K.N.，
Figure BDA0003512851930001191
E.，Nowak-Markwitz，E.&Jankowska，A.PARPinhibitors：review of mechanisms of action and BRCA1/2 mutation targeting.PrzMenopauzalny 15，215-219(2016).
110.Faraoni，I.&Graziani，G.Role of BRCA Mutations in Cancer Treatmentwith Poly(ADP-ribose)Polymerase(PARP)Inhibitors.Cancers 10，487(2018).
111.Jiao，S.et al.PARP Inhibitor Upregulates PD-L1 Expression andEnhances Cancer-Associated Immunosuppression.Clinical Cancer Research 23，3711-3720(2017).
112.Ding，L.et al.PARP Inhibition Elicits STING-Dependent AntitumorImmunity in Brca1-Deficient Ovarian Cancer.Cell Reports 25，2972-2980.e5(2018).
113.Pantelidou，C.et al.PARP Inhibitor Efficacy Depends on CD8+T-cellRecruitment via Intratumoral STING Pathway Activation in BRCA-DeficientModels of Triple-Negative Breast Cancer.Cancer Discovery 9，722-737(2019).
114.Mishra，M.&Kowluru，R.A.Role of PARP-1 as a novel transcriptionalregulator of MMP-9 in diabetic retinopathy.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease 1863，1761-1769(2017).
115.
Figure BDA0003512851930001201
B.et al.PARP-1 protects against colorectal tumorinduction，but promotes inflammation-driven colorectal tumorprogression.Proceedings of the National Academy of Sciences 115，E4061-E4070(2018).
116.Liu，X.et al.CD47 blockade triggers T cell-mediated destruction ofimmunogenic tumors.Nat.Med.21，1209-1215(2015).
117.Carbone，F.R.，Kurts，C.，Bennett，S.R.，Miller，J.F.&Heath，W.R.Cross-presentation：a general mechanism for CTL immunity and tolerance.Immunol.Today19，368-373(1998).
118.MacDonald，K.P.A.et al.The colony-stimulating factor 1 receptor isexpressed on dendritic cells during differentiation and regulates theirexpansion.The Journal of Immunology 175，1399-1405(2005).
119.Sideras，K.et al.Prognostic value of intra-tumoral CD8+ /FoxP3+lymphocyte ratio in patients with resected colorectal cancer livermetastasis.J Surg Oncol 118，68-76(2018).
120.Sato，E.et al.Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytesand a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorableprognosis in ovarian cancer.Proceedings of the National Academy of Sciences102，18538-18543(2005).
121.Sinicrope，F.A.et al.Intraepithelial effector(CD3+)/regulatory(FoxP3+)T-cell ratio predicts a clinical outcome of human coloncarcinoma.Gastroenterology 137，1270-1279(2009).
122.Lin，H.et al.Host expression of PD-L1 determines efficacy of PD-L1pathway blockade-mediated tumor regression.J.Clin.Invest.128，1708-1708(2018).
123.Kim，H.R.et al.PD-L1 expression on immune cells，but not on tumorcells，is a favorable prognostic factor for head and neck cancerpatients.Sci.Rep.6，36956-12(2016).
124.Pfirschke，C.et al.Immunogenic Chemotherapy Sensitizes Tumors toCheckpoint Blockade Therapy.Immunity 44，343-354(2016).
125.DuPage，M.&Jacks，T.Genetically engineered mouse models of cancerreveal new insights about the antitumor immune response.Curr.Opin.Immunol.25，192-199(2013).
126.Akbay，E.A.，Koyama，S.，Carretero，J.&Altabef，A.Activation of the PD-1pathway contributes to immune escape in EGFR-driven lung tumors.CancerDiscov 2013；3(12)：1355-63；PMID：24078774.
127.Zhang，Y.et al.Enhancing CD8+ T Cell Fatty Acid Catabolism withina Metabolically Challenging Tumor Microenvironment Increases the Efficacy ofMelanoma Immunotherapy.Cancer Cell32，377-391.e9(2017).
128.Gordon，S.R.et al.PD-1 expression by tumour-associated macrophagesinhibits phagocytosis and tumour immunity.Nature 545，495-499(2017).
129.Franklin，R.A.et al.The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.Science 344，921-925(2014).
130.Committing Cytomegalovirus-Specific CD8 T Cells to EliminateTumor Cells by Bifunctional Major Histocompatibility Class I Antibody FusionMolecules.Cancer Immunol Res 3，764-776(2015).
131.Single-cell barcoding and sequencing using dropletmicrofluidics.Nat Protoc 12，44-73(2017).
132.Klein，A.M.et al.Droplet barcoding for single-cell transcriptomicsapplied to embryonic stem cells.Cell 161，1187-1201(2015).
133.Butler，A.，Hoffman，P.，Smibert，P.，Papalexi，E.&Satija，R.Integratingsingle-cell transcriptomic data across different conditions，technologies，andspecies.Nat.Biotechnol.36，411-420(2018).
134.Yu，G.，Wang，L.-G.，Han，Y.&He，Q.-Y.clusterProfiler：an R package forcomparing biological themes among gene clusters.OMICS 16，284-287(2012).
135.Kim，D.，Paggi，J.M.，Park，C.，Bennett，C.&Salzberg，S.L.Graph-basedgenome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype.Nat.Biotechnol.37，907-915(2019).
136.Reyes，A.et al.Drift and conservation of differential exon usageacross tissues in primate species.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110，15377-15382(2013).
137.Anders，S.，Pyl，P.T.&Huber，W.HTSeq--a Python framework to work withhigh-throughput sequencing data.Bioinformatics 31，166-169(2015).
138.Pertea，M.et al.StringTie enables improved reconstruction of atranscriptome from RNA-seq reads.Nat.Biotechnol.33，290-295(2015).
139.Bray，N.L.，Pimentel，H.，Melsted，P.&Pachter，L.Near-optimalprobabilistic RNA-seq quantification.Nat.Biotechnol.34，525-527(2016).
140.Vitting-Seerup，K.&Sandelin，A.The Landscape of Isoform Switches inHuman Cancers.Mol.Cancer Res.15，1206-1220(2017).
表5
Figure BDA0003512851930001211
表6：粗体序列表示EpCAM适体
Figure BDA0003512851930001221
表7
Figure BDA0003512851930001222
Figure BDA0003512851930001231
序列表
<110> 儿童医疗中心有限公司
<120> 用于治疗癌症的方法和组合物
<130> 701039-095310WOPT
<140>
<141>
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<400> 28
cacaacaacu aaugagauuu u 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 29
auuccaagag agaggagaau u 21
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 30
ccuacuggca uuugcugaac gcauu 25
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 31
ggaaugugcu gcuggcuuuu u 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 32
ggaaugugcu gcuggcuuuu u 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 33
ggaaugugcu gcuggcuuuu u 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 34
ccaaggacac aaagccaauu u 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 35
gacgauguga aaucguugut t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 36
ccuuuguggc uaaacacuut t 21
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 37
gaaattcttt cacttcatt 19
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 38
cagaauaggu cuagaagaau u 21
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 39
gaauaggucu agaagaagau u 21
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 40
gaauaggucu agaagaagau u 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 41
uggagaaaga aucgguuaau u 21
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 42
ggagauucua guauacagau u 21
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 43
guacaggacu uuccucuaa 19
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 44
gaugaauggu ggagaguuau u 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 45
ccuuagaguu ccugagaaau u 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 46
gcagaaaggu gguugacaau u 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 47
gcaaacuacu ggaggaaauu u 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 48
guguaugugc gccaaaguat t 21
<210> 49
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 49
ccaggacacg aggaaacug 19
<210> 50
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 50
aaaucucggu gcacuagga 19
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 51
ccaagaccau cugcugucau u 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 52
acaaugguga ccgcuacgau u 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 53
agaaaugauu cgagaagaau u 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 54
aagagaagcu uaaggaaauu u 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 55
agacugggau ggagaauuau u 21
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 56
aaagagaagc uuaaggaaau u 21
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 57
gagaagaugu ccauggaaau u 21
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 58
ggaucaagaa gaaugaauau u 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 59
augaagaucu ggaggugaau u 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 60
caaccaaagu cgaauaugau u 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 61
aaccaguggu ucgagagaca g 21
<210> 62
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 62
aagggcggcu uugccaagug cuu 23
<210> 63
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 63
tgcggcacac acttctatct ttgcggaact cctgcggctc 40
<210> 64
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 64
acguaucccu uuucgcgu 18
<210> 65
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 65
cgcggaagcg tgctgggcca acagagggac aaacggggga agatttgacg tcgacgacac 60
ataacccaga ggtcgat 77
<210> 66
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 66
gcgacugguu acccggucgu 20
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 67
gcgacugguu acccggucg 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 68
gcgacugguu acccggucg 19
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 69
gcguuauguu ugguggaagt t 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 70
cuuccaccaa acauaacgct t 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 71
gcguuauguu ugguggaagt t 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 72
cuuccaccaa acauaacgct t 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 73
cggcaaaccu ggagaguauu u 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 74
uggaagaaga uaagagaaau u 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 75
gaucauagcu cuagcagaat t 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 76
uucugcuaga gcuaugauct t 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 77
gaucauagcu cuagcagaat t 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 78
uucugcuaga gcuaugauct t 21
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 79
gagaaaagcc cgugaagaau u 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 80
gcgcaaagca ccgaagaaau u 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 81
ccaaaggaau uccgagaaat t 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 82
uuucucggaa uuccuuuggt t 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 83
ccaaaggaau uccgagaaat t 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 84
uuucucggaa uuccuuuggt t 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 85
ccaaaggaau uccgagaaau u 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 86
gggcaagcac agugucaaau u 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 87
ggugauugug gcugaauuut t 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 88
aaauucagcc acaaucacct t 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 89
ggugauugug gcugaauuut t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 90
aaauucagcc acaaucacct t 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 91
cugcauugug ugacagcaau u 21
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 92
ccaacacugc uuacgcuuau u 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 93
agacguaagc aguguugaat t 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 94
uucaacacug cuuacgucut t 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 95
agacguaagc aguguugaat t 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 96
uucaacacug cuuacgucut t 21
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 97
ggaaaaggaa gaugagcaau u 21
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 98
aaacgaaggc gauguuaaat t 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 99
uuuaacaucg ccuucguuut t 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 100
aaacgaaggc gauguuaaat t 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 101
uuuaacaucg ccuucguuut t 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 102
aggaagagga cgaccuauau u 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 103
gagaauaggu ucagaagaut t 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 104
aucuucugaa ccuauucuct t 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 105
gagaauaggu ucagaagaut t 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 106
aucuucugaa ccuauucuct t 21
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 107
gagugauggu ugagaaguau u 21
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 108
gaaauggugu uuaaggaaau u 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 109
uuucaguguu agucauggct t 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 110
gccaugacua acacugaaat t 21
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 111
uuucaguguu agucauggct t 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 112
gccaugacua acacugaaat t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 113
cucagcaucu gucaguggat t 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 114
uccacugaca gaugcugagt t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 115
cucagcaucu gucaguggat t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 116
uccacugaca gaugcugagt t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 117
gaacuugaau ccagcgaaat t 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 118
uuucgcugga uucaaguuct t 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 119
gaacuugaau ccagcgaaat t 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 120
uuucgcugga uucaaguuct t 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 121
agacugggau ggagaguuau u 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 122
agaaaugauc cgagaagaau u 21
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 123
ugaagaagau cacccuccuu att 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 124
uaaggagggu gaucuucuuc att 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 125
ugaagaagau cacccuccuu att 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 126
uaaggagggu gaucuucuuc att 23
<210> 127
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 127
gcgacugguu acccggucgu uugcguuaug uuugguggaa gtt 43
<210> 128
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 128
gcgacugguu acccggucgu uugaucauag cucuagcaga att 43
<210> 129
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 129
gcgacugguu acccggucgu uuccaaagga auuccgagaa att 43
<210> 130
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 130
gcgacugguu acccggucgu uuggugauug uggcugaauu utt 43
<210> 131
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 131
gcgacugguu acccggucgu uuagacguaa gcaguguuga att 43
<210> 132
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 132
gcgacugguu acccggucgu uuaaacgaag gcgauguuaa att 43
<210> 133
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 133
gcgacugguu acccggucgu uugagaauag guucagaaga utt 43
<210> 134
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 134
gcgacugguu acccggucgu uuuuucagug uuagucaugg ctt 43
<210> 135
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 135
gcgacugguu acccggucgu uucucagcau cugucagugg att 43
<210> 136
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 136
gcgacugguu acccggucgu uugaacuuga auccagcgaa att 43
<210> 137
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 137
gcgacugguu acccggucgu uuugaagaag aucacccucc uuatt 45
<210> 138
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 138
Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala
1 5 10 15
Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys
20 25
<210> 139
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 139
Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala
1 5 10 15
Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys
20 25 30
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 140
Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala
1 5 10 15
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> 未知的描述：RFGF
肽
<400> 141
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> 未知的描述：RFGF类似物
肽
<400> 142
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 143
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 143
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 144
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蝇属（Drosophila sp.）
<400> 144
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 145
gtgacctgtt ttggaccgga 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 146
tctccgcatc gtgtacttcc 20
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 147
accgtactcg tcaattccaa ggg 23
<210> 148
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 148
tgccgccatt attacgacaa gc 22
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 149
gaucauagcu cuagcagaa 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 150
gagaaaagcc cgugaagaa 19
<210> 151
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 151
gcgcaaagca ccgaagaaa 19
<210> 152
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 152
uauccuaccu caagaaguu 19
<210> 153
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 153
ccaaaggaau uccgagaaa 19
<210> 154
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 154
gggcaagcac agugucaaa 19
<210> 155
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 155
ccaacacugc uuacgcuua 19
<210> 156
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 156
ggugauugug gcugaauuu 19
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 157
cugcauugug ugacagcaa 19
<210> 158
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 158
aaacgaaggc gauguuaaa 19
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 159
ccgaaaggcg gcugcauaa 19
<210> 160
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 160
aggaagagga cgaccuaua 19
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 161
agacguaagc aguguugaa 19
<210> 162
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 162
ggaaaaggaa gaugagcaa 19
<210> 163
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 163
gcgacugguu acccggucgu uugcguuaug uuugguggaa gtt 43
<210> 164
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 164
gcgacugguu acccggucgu uugaucauag cucuagcaga att 43
<210> 165
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 165
gcgacugguu acccggucgu uuccaaagga auuccgagaa att 43
<210> 166
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 166
gcgacugguu acccggucgu uuaaacgaag gcgauguuaa att 43
<210> 167
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 167
gcgacugguu acccggucgu uuggugauug uggcugaauu utt 43
<210> 168
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
寡核苷酸
<220>
<223> 联合的DNA/RNA分子的描述：合成的
寡核苷酸
<400> 168
gcgacugguu acccggucgu uuagacguaa gcaguguuga att 43
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 169
tgttgcagtc tcttgcacag c 21
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 170
ggatcaacgt ctcctcccac c 21
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 171
ccatcgacgt caactacgag 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 172
gtgcgtggta gcatgagtgt 20
<210> 173
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 173
aggagaaaag cccgtgaag 19
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 174
tggcaatggt gaaagaggtc 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 175
ttgtaaggac gaaacgggac 20
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 176
tctaggtcct gtacgtggaa g 21
<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 177
gggtgattgt ggctgaattt g 21
<210> 178
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
引物
<400> 178
gctgtcggta ttccagtctt ac 22
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
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<400> 179
ctcattgtag tgtccacggt c 21
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 180
acgatcagag ggttcaacac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccactcacgg caaattcaac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 182
ctccacgaca tactcagcac 20
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<400> 183
caagaacagg gatctaggtg ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 184
agaggctgta aacccatgaa g 21
<210> 185
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 185
aatcccatca ccatcttcca g 21
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<212> DNA
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<400> 186
aaatgagccc cagccttc 18
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<400> 187
agaccccgga cctgcactg 19
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ttcggatgcc atcaccgttc 20
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agaccccgga cctgcactg 19
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acccacgagc ttagacacgc 20
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gccaaactga tgaatgtgga cc 22
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agcagaacga ctggatcagg 20
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tctgacgacc ccctgacact c 21
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atgcctgata cccggacgat g 21
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cagatccaca gcgatatcca g 21
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agagacaacg gcacactttg 20
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<400> 197
tggccttgtc gctgtcttgc 20
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<212> DNA
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tttctccttc tctgctcctg tcc 23
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<223> 人工序列的描述：合成的
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<400> 199
ggagtatgag atgcagtgta gc 22
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<400> 200
caaggtctgt gaggaagagg 20
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agatcgaggt catgattgca g 21
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引物
<400> 202
acaatcagcc accatccag 19

Claims (49)

1.一种嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和至少一个抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。
2.如权利要求1所述的分子，其中，所述基因选自于由如下基因所组成的组：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
3.如权利要求1所述的分子，其中，所述基因选自于由如下基因所组成的组：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
4.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述分子为适体-siRNA嵌合体(AsiC)。
5.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸与所选基因的基因产物特异性结合。
6.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述结合EpCAM的适体结构域包含SEQID NO：63-SEQ ID NO：68中任一者的序列。
7.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述抑制性核酸结构域包含选自于SEQID NO：1-SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：69-SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：149-SEQ ID NO：162的序列或它们的反向互补序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含第一抑制性核酸结构域和至少一个额外的抑制性核酸结构域。
9.如权利要求8所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域包含不同的序列，但各自抑制相同基因的表达。
10.如权利要求8所述的分子，其中，所述第一抑制性核酸结构域和所述至少一个额外的抑制性核酸结构域各自抑制不同基因的表达。
11.如权利要求10所述的分子，其中，至少第二抑制性核酸结构域抑制选自于由如下基因所组成的组中的基因的表达：
PLK1和MCL1。
12.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO：127-SEQ IDNO：137或SEQ ID NO：163-SEQ ID NO：168中的一者的序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述分子为单链核酸。
14.如权利要求1-12中任一项所述的分子，其中，所述分子包含双链部分。
15.如权利要求14所述的分子，其中，所述双链部分包含彼此杂交的两种独立的核酸或包含单一核酸；在所述单一核酸中，所述单一核酸的两个部分彼此杂交(例如发夹结构)。
16.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子的3'末端包含dTdT。
17.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含至少一个2'-F嘧啶。
18.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子包含2'糖修饰、硫代磷酸酯骨架修饰和5'未锁核酸修饰中的一种或多种。
19.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子与胆固醇、PEG或脂质体缀合或结合。
20.如前述权利要求中任一项所述的分子，其中，所述嵌合分子进一步包含化疗剂。
21.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含如权利要求1-20中任一项所述的嵌合分子和任选的药学上可接受的载体。
22.如权利要求21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少两种不同的如权利要求1-20中任一项所述的嵌合分子，其中，所述嵌合分子具有不同的适体结构域或抑制性核酸结构域。
23.如权利要求21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域识别不同的靶标。
24.如权利要求21所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述不同的抑制性核酸结构域具有不同的序列并识别相同的靶标。
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如权利要求1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47；并且
如权利要求1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1、PTPN2、SMG1、TREX1、CMAS和CD47。
26.如权利要求21-25中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如权利要求1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47；并且
如权利要求1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
27.如权利要求21-26中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少六种不同的如权利要求1-20所述的嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PARP1、APE1、PD-L1、MCL1和CD47。
28.如权利要求21-27中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，
如权利要求1-20所述的第一嵌合分子包含抑制选自于如下基因的基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47；并且
如权利要求1-20所述的第二嵌合分子包含抑制选自于如下基因的不同的第二基因的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
29.如权利要求21-28中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合包含至少四种不同的如权利要求1-20所述的嵌合分子，共同包含抑制如下基因中的每一种的表达的抑制性核酸结构域：
UPF2、PD-L1、MCL1和CD47。
30.一种药物组合物、试剂盒或组合，所述药物组合物、试剂盒或组合包含：
a.如权利要求1-20中任一项所述的第一嵌合分子；
b.第二嵌合分子，所述第二嵌合分子包含：i.如权利要求1-20中任一项所述的嵌合分子，其中，所述第二嵌合分子的抑制性核酸结构域与所述第一嵌合分子相比抑制不同基因的表达；或者ii.嵌合分子，所述嵌合分子包含结合EpCAM的适体结构域和抑制性核酸结构域，所述抑制性核酸结构域抑制选自于由PLK1和MCL1所组成的组中的基因的表达；以及
c.任选的药学上可接受的载体。
31.如权利要求21-30中任一项所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述组合物、试剂盒或组合进一步包含免疫检查点抑制剂。
32.如权利要求31所述的组合物、试剂盒或组合，其中，免疫检查点蛋白为PD-1或PD-L1。
33.如权利要求32所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述免疫检查点蛋白为PD-1。
34.如权利要求33所述的组合物、试剂盒或组合，其中，所述免疫检查点抑制剂为派姆单抗、纳武单抗、pidilizumab或AUNP12。
35.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予如权利要求1-34中任一项所述的嵌合分子、组合物、试剂盒或组合。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌或结肠癌。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述乳腺癌为HER2+或三阴性乳腺癌(TNBC)。
38.如权利要求36所述的方法，其中，所述乳腺癌不是BRCA1缺陷型的。
39.如权利要求35-38中任一项所述的方法，其中，所述给予为皮下给予。
40.如权利要求35-39中任一项所述的方法，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
42.如权利要求1-34中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，所述嵌合分子、组合物或试剂盒用于在在有需要的受试者中治疗癌症的方法中使用，所述方法包括向所述受试者给予所述嵌合分子。
43.如权利要求42所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症为上皮癌、乳腺癌或结肠癌。
44.如权利要求43所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述乳腺癌为HER2+或三阴性乳腺癌(TNBC)。
45.如权利要求44所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述乳腺癌不是BRCA1缺陷型的。
46.如权利要求42-46中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述给予为皮下给予。
47.如权利要求42-46中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，进一步向所述受试者给予额外的癌症治疗。
48.如权利要求42-47中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒在与所述嵌合分子相同或不同的制剂中进一步包含额外的癌症治疗。
49.如权利要求42-48中任一项所述的嵌合分子、组合物或试剂盒，其中，所述癌症治疗为紫杉醇。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116726181A (zh) * 2023-08-09 2023-09-12 四川省医学科学院·四川省人民医院 抑制nat9基因表达的试剂的用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2803525A1 (en) * 2009-06-23 2011-01-13 University Of Miami Aptamer-targeted sirna to inhibit nonsense mediated decay
MX2015001441A (es) * 2012-08-02 2015-09-23 Univ Deakin Aptamero epcam para la deteccion de celulas madre cancerosas.
AU2015308721B2 (en) * 2014-08-29 2021-04-01 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for the treatment of cancer
EP3326641B1 (en) * 2015-04-22 2019-06-26 CureVac AG Rna containing composition for treatment of tumor diseases
US10590425B2 (en) * 2015-06-29 2020-03-17 Caris Science, Inc. Therapeutic oligonucleotides
US10689654B2 (en) * 2016-10-18 2020-06-23 Augusta University Research Institute, Inc. Bivalent siRNA chimeras and methods of use thereof
WO2018213791A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 Children's National Medical Center Compositions comprising aptamers and nucleic acid payloads and methods of using the same

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116726181A (zh) * 2023-08-09 2023-09-12 四川省医学科学院·四川省人民医院 抑制nat9基因表达的试剂的用途
CN116726181B (zh) * 2023-08-09 2023-10-20 四川省医学科学院·四川省人民医院 抑制nat9基因表达的试剂的用途

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